Implicación del sistema de secreción de tipo 3 de Sinorhizobium (Ensifer) fredii HH103 en la modulación de la respuesta de defensa de Glycine max cv. Williams y estudio de los efectores específicos secretados a través de este sistema
Abstract
Plants that interact with pathogenic bacteria in their natural environments have developed barriers to block or contain the infection. Phytopathogenic bacteria have evolved mechanisms to subvert these defenses and promote infection. Thus, some Gram-negative phytopathogenic bacteria use the type 3 secretion system (T3SS) to deliver proteins, called effectors, directly into the cytoplasm of the host cells. These effectors suppress plant defense responses to promote infection and growth of the pathogen (Galan and Collmer, 1999). The T3SS has also been found in some symbiotic rhizobial strains and the secreted effectors, collectively known as nodulation outer proteins (Nops), are involved in host-range determination and symbiotic efficiency. Sinorhizobium (Ensifer) fredii HH103 is a broad-host range bacterium able to nodulate dozens of legumes including soybean, which is considered its natural host plant. This bacterium secretes at least eight proteins through the T3SS in response to inducer flavonoids (Rodrigues et al., 2007) and the synthesis and secretion of Nops is controlled by the T3SS transcriptional regulator TtsI whose transcription is NodD- and flavonoids-dependent (Deakin and Broughton, 2009). In this thesis we show that the inactivation of the Ensifer (Sinorhizobium) fredii HH103 T3SS negatively affect soybean nodulation very early in the symbiotic process, which is associated with a reduction of the expression of early nodulation genes. This symbiotic phenotype could be the consequence of the bacterial triggering of soybean defense responses associated to the production of salicylic acid (SA) and the impairment of the T3SS mutant to suppress these responses. Interestingly, the early induction of the transcription of GmMPK4, which negatively regulates SA accumulation and defense responses in soybean, in plants inoculated with HH103 could be associated to the differential defense responses induced by the parental and the T3SS mutant strain (Jiménez-Guerrero et al., 2015). S. fredii HH103 secretes at least eight Nops through the T3SS. Some of them cannot be considered real effectors, since they are components of the extracellular appendages of the T3SS machinery. In this thesis, we described for the first time a new Rhizobium-specific effector, which we have called NopI. This effector, like NopL and NopP, was Rhizobium-specific and could be of great importance in the symbiosis with Glycine max (soybean) cv. Williams and Vigna unguiculata. Besides, while inactivation of nopL or nopP was beneficial for symbiosis with these plants, the absence of both NopL and NopP was detrimental, suggesting that these effectors could exert complementary functions in the symbiotic process. We also confirmed that the expression of both nopL and nopI was regulated by inducer flavonoids and by the transcriptional regulators NodD1 and TtsI. In addition, translocation of NopL within soybean root cells was confirmed by the adenylate cyclase assay. Furthermore, we characterized the S. fredii HH103 nopC gene and confirmed that its expression was regulated in a flavonoid-, NodD1- and TtsI-dependent manner. Besides, in vivo bioluminescent studies indicated that the S. fredii HH103 T3SS was expressed in soybean nodules and nodulation assays showed that NopC exerted a positive effect on symbiosis with soybean. Finally, adenylate cyclase assays confirmed that NopC was delivered directly into soybean root cells by means of the T3SS machinery. All these results indicate that NopC can be considered a Rhizobium-specific effector secreted by S. fredii HH103 and not a component of the T3SS machinery. NopL and NopP effectors are phosphorylated by plant kinases, but their exact function in symbiosis is yet unknown (Deakin and Broughton, 2009). However, some results indicate that NopL could be involved in the modulation of the host MAPK signaling and in the suppression of premature senescence of nodules. NopP is also phosphorylated by plant kinases but its exact function in symbiosis is still unknown. However, inactivation of the S. fredii HH103 nopP gene causes an increase in the number of nodules formed in soybean (Deakin and Broughton, 2009). In this thesis, we studied the function of the Rhizobium-specific effectors NopL and NopP secreted by S. fredii HH103 in the symbiosis with soybean, which is considered its natural host plant. Both NopL and NopP were phosphorylated by soybean root kinases and the phosphorylation cascade was Ca2+- and calmodulin-dependent. While the signaling pathway that culminates in the phosphorylation of NopL included ser/thr and MAPKK kinases, in the case of NopP this pathway was composed of ser/thr and tyr kinases but not MAPKK kinases. Transient expression in Nicotiana benthamiana leaves of both nopL and nopP fused to YFP and further confocal imaging indicated that these effectors localized to the nucleus of the host cell and accumulate in nuclear foci, suggesting a possible role in plant gene regulation or responses to DNA stress. In this sense, the use of a yeast based array to determine functions of effectors indicated that NopP could be involved in microtubule-related processes and nuclear localization and migration. Finally, co-immunoprecipitation analyses of N. benthamiana NopL- and NopP-interacting proteins showed that NopL binds to proteins related to the plant immune response and also with calreticulin and NopP interacts with proteins related to nucleic acids (e. g. histone H4) or proteins related to plant immunity (GRAS2 transcription factors or cyclophilin 40).
Full text
Departamento de Microbiología Facultad de Biología Implicación del sistema de secreción de tipo 3 de Sinorhizobium (Ensifer) fredii HH103 en la modulación de la respuesta de defensa de Glycine max cv. Williams y estudio de los efectores específicos secretados a través de este sistema Irene Jiménez Guerrero Sevilla, 2015
Departamento de Microbiología Facultad de Biología Implicación del sistema de secreción de tipo 3 de Sinorhizobium (Ensifer) fredii HH103 en la modulación de la respuesta de defensa de Glycine max cv. Williams y estudio de los efectores específicos secretados a través de este sistema Memoria presentada por la Licenciada en Biología Irene Jiménez Guerrero para optar al grado de Doctor. Sevilla, 2015
Departamento de Microbiología Facultad de Biología LOS DIRECTORES DE LA TESIS Fdo. Dr. Fco. Javier Ollero Márquez y Dr. Fco. Javier López Baena Catedrático y Contratado doctor Departamento de Microbiología Universidad de Sevilla Fdo. Irene Jiménez Guerrero
Mi agradecimiento al Plan Propio de la Universidad de Sevilla por haber hecho posible la realización de este trabajo.
“… S e debe hacer por sí mismo, por la belleza de la ciencia y, a continuación, siempre existe la posibilidad de que un descubrimiento científico pueda llegar a ser un beneficio para la humanidad.” M arie Curie
3. 1. Levaduras y plásmidos. ........................................................................................ 106 3. 2. Método y solución de congelación. ...................................................................... 106 3. 3. Medios de cultivo para S. cerevisiae. ................................................................... 107 3. 4. Transformación en S. cerevisiae. .......................................................................... 107 3. 5. Determinación de la función de efectores del T3SS mediante el uso de un array de levaduras. ...................................................................................................................... 108 Objetivos Objetivos ....................................................................................................................... 115 Resultados (Bloque I) 1. La interrupción de la secreción deefectores a través del T3SS de S. fredii HH103 genera una disminución y un retraso en la formación denódulos en sojaWilliams que están relacionados con una reducción de la expresión de los genes tempranos de nodulación GmNIN y GmENOD40. ............................................................................. 119 1. 1. Cinética de nodulación de S. fredii HH103 en soja Williams. ............................. 119 1. 2. Estudio de la expresión in vivo de los genes del T3SS de S.fredii HH103 en la simbiosis con la soja Williams. .................................................................................... 127 2. Moléculas de S. fredii HH103 inducen una respuesta de defensa primaria en soja Williams. ...................................................................................................................... 134 2. 1. La inoculación de la raíz de soja Williams con S. fredii HH103 induce la formación de depósitos de calosa................................................................................................... 134 2. 2. S. fredii HH103 induce la expresión de peroxidasas en la raíz de soja Williams. ...................................................................................................................................... 135 2. La respuesta de defensa inducida por S. fredii HH103 en soja Williams está mediada por la producción de SA y es suprimida por el T3SS. .................................................. 141 2. 1. El T3SS de S. fredii HH103 modula el balance hormonal de SA durante la simbiosis con soja Williams. ........................................................................................ 141
2.2. El incremento de los niveles de SA producido en respuesta al mutante HH103 ttsI::Ω induce la expresión del gen GmPR1 de la soja Williams.................................. 147 2. 3. El SA exógeno induce la expresión de los genes GmPR1 y GmPR2 y causa una reducción del número de nódulos en la simbiosis de S. fredii HH103 con la soja Williams. ...................................................................................................................... 150 2. 4. La inoculación de plantas de soja Williams con el mutante HH103 ttsI::Ω dispara una posible respuesta sistémica en la planta. ................................................................ 155 2. 5. El T3SS S. fredii HH103 induce de forma transitoria la expresión del gen GmMPK4 en las raíces de soja Williams...................................................................... 157 Resultados (Bloque II) 1. Caracterización del gen nopL de S. fredii HH103. ................................................... 163 1. 1. Análisis de las secuencias del gen nopL y de la proteína NopL de S. fredii HH103. ...................................................................................................................................... 163 1. 2. Construcción de un mutante en el gen nopL de S. fredii HH103. ........................ 164 1. 3. Estudio de la regulación de la expresión gen nopL. ............................................. 168 1. 4. Efecto de la mutación del gen nopL sobre la secreción de las proteínas Nop. ..... 169 1. 5. NopL es translocada al interior de las células de la raíz de soja. ......................... 171 2. Caracterización del gen nopI de S. fredii HH103. ................................................... 173 2. 1. Identificación y análisis de las secuencias del gen nopI y de la proteína NopI de S. fredii HH103, ................................................................................................................ 173 2. 2. Construcción de un mutante en el gen nopI de S. fredii HH103. ......................... 175 2. 3. Estudio de la regulación de la expresión del gen nopI. ........................................ 179 2. 4. Efecto de la mutación del gen nopI sobre la secreción de las proteínas Nop. ..... 180 3. Fenotipo simbiótico de los mutantes en los genes nopL, nopI ynopP de S. fredii HH103. ......................................................................................................................... 183 4. Caracterización del gen nopC de S. fredii HH103................................................... 192
4. 1. Análisis de las secuencias del gen nopC y de la proteína NopC de S. fredii HH103. ...................................................................................................................................... 192 4. 2. Construcción de un mutante en el gen nopC de S. fredii HH103. ........................ 193 4. 3. Estudio de la regulación de la expresión del gen nopC. ....................................... 195 4. 4. Efecto de la mutación del gen nopC sobre la secreción de las proteínas Nop. ... 198 4. 5. NopC es translocado al interior de la célula de la raíz de soja. ............................ 200 4. 6. Fenotipo simbiótico del mutante en el gen nopC. ................................................ 201 4. 6. 1. El gen nopC de S. fredii HH103 posee un efecto positivo en la nodulación con soja Williams. ............................................................................................................... 201 4. 6. 2. El gen nopC juega un papel importante en la nodulación de S. fredii HH103 en Lotus japonicus. ............................................................................................................ 203 Resultados (Bloque III) 1. Caracterización de la proteína NopL de S. fredii HH103. ........................................ 211 1. 1. La proteína NopL de S. fredii HH103 es fosforilada por una quinasa de raíz de soja. ............................................................................................................................... 211 1. 1. 1. Expresión in vitro y purificación de la proteína NopL de S. fredii HH103. ..... 211 1. 1. 2. Ensayos de fosforilación in vitro para caracterizar la quinasa que fosforila a NopL de S. fredii HH103. ............................................................................................. 213 1. 1. 3. Detección de la quinasa de soja responsable de la fosforilación de NopL. ...... 215 1. 2. La proteína NopL de S. fredii HH103 se localiza principalmente en el núcleo de la célula hospedadora. ...................................................................................................... 218 1. 3. Estudios para la identificación de la función del efector NopL de S. fredii HH103 en la célula eucariota. ................................................................................................... 220 1. 3. 1. Determinación de posibles dianas conservadas en células eucariotas para identificar la función de NopL. Uso de un array de levaduras. ................................... 220 1. 3. 2. Identificación de proteínas que interaccionan con NopL en hojas de la planta modelo Nicotiana benthamiana. .................................................................................. 222 2. Caracterización de la proteína NopP de S. fredii HH103. ........................................ 225
2. 1. La proteína NopP de S. fredii HH103 es fosforilada por una quinasa de la raíz de soja. ............................................................................................................................... 225 2. 1. 1. Expresión y purificación in vitro de la proteína NopP de S. fredii HH103. ..... 225 2. 1. 2. Ensayos de fosforilación in vitro para caracterizar la quinasa que fosforila a NopP de S. fredii HH103. ............................................................................................. 227 2. 1. 3. Detección de la quinasa de soja responsable de la fosforilación de NopP. ...... 229 2. 2. La proteína NopP de S. fredii HH103 se localiza en el núcleo y en el citoplasma de la célula hospedadora.................................................................................................... 231 2. 3. Estudios para la identificación de la función del efector NopP de S. fredii HH103 en la célula eucariota. ................................................................................................... 233 2. 3. 1. Determinación de posibles dianas conservadas en células eucariotas para identificar la función de NopP mediante el uso de un array de levaduras. .................. 233 2. 3. 2. Identificación de proteínas que interaccionan con NopP en hojas de la planta modelo Nicotiana benthamiana. .................................................................................. 235 Discusión Discusión ...................................................................................................................... 240 Conclusiones Conclusiones ................................................................................................................. 274 Bibliografía Bibliografía ................................................................................................................... 280 Anexos Anexos .......................................................................................................................... 316
Índice de Figuras
Figura 1. Proceso de nodulación a través de la vía dependiente e independiente de los factores Nod………………………………………………………………………......5 Figura 2. Sistemas de secreción de las bacterias Gram-negativas………………………7 Figura 3. Esquema general de la organización de las proteínas del T3SS…………….13 Figura 4. Esquema de la regulación de la secreción de Nops a través del T3SS de S. fredii HH103………………………………………………………………………...15 Figura 5. Representación de la función potencial de algunos efectores secretados a través del T3SS de los rizobios……………………………………………………...27 Figura 6. Modelo en zig zag que representala co-evolución dinámica dela interacción planta-microorganismo……………………………………………………………...32 Figura 7. Posibles interacciones que pueden darse ante el reconocimiento de un rizobio por parte de la leguminosa hospedadora…………………………………………….32 Figura 8. Esquema de la mutagénesis in vitro por deleción mediante PCR solapante...72 Figura 9. Sistema de hidroponía en vaso de precipitado………………………………84 Figura 10. Esquema del procesamiento de las muestras para la cuantificación de ácido salicílico……………………………………………………………………………..89 Figura 11. Hojas de N. benthamiana enumeradas por orden de altura………………102 Figura 12. Esquema de la determinación de la función de efectores del T3SS mediante el uso de un array de levaduras……………………………………………………109 Figura 13. Cinética de nodulación de soja Williams inoculada con las estirpes HH103, HH103 ttsI::Ω y HH103 ttsI::Ω (pMUS984)………………………………………120 Figura 14. Inhibición del crecimiento de la raíz principal de plantas de soja Williams tras la inoculación con un mutante que no secreta proteínas Nop. Cultivo en jarros Leonard…………………………………………………………………………….122 Figura 15. Inhibición del crecimiento de la raíz principal de plantas de soja Williams tras la inoculación con un mutante que no secreta proteínas Nop. Cultivo en hidroponía………………………………………………………………………….123
Figura 16. Cuantificación de los pigmentos fotosintéticos de las plantas de soja Williams inoculadas con las estirpes HH103, HH103 ttsI::Ω y HH103 ttsI::Ω (pMUS984)………………………………………………………………………...124 Figura 17. Cuantificación de la expresión relativa de los genes NIN de soja Williams en respuesta a la inoculación con las estirpes HH103, HH103 ttsI::Ω y HH103 ttsI::Ω (pMUS984)………………………………………………………………………...126 Figura 18. Cuantificación de la expresión relativa del gen ENOD40.2 de sojaWilliams en respuesta a la inoculación con las estirpes HH103, HH103 ttsI::Ω y HH103 ttsI::Ω (pMUS984)………………………………………………………………………...127 Figura 19. Determinación de la producción de luminiscencia por las estirpes HH103 (pMUS1199) (A), HH103 (pMUS1207) (B), HH103 nodD1::lacZ-GmR (pMUS1207) (C) y HH103 ttsI::Ω (pMUS1207) (D) en simbiosis con soja Williams…………..129 Figura 20. Medida de la expresión in vivo de genes regulados por la proteína TtsI mediante la producción de luminiscencia por el biosensor HH103 (pMUS1207) en la simbiosis con soja Williams………………………………………………………..130 Figura 21. Medida de la expresión in vivo de genes regulados por la proteína TtsI mediante la producción de luminiscencia por el biosensor HH103 (pMUS1207) en los nódulos de soja Williams………………………………………………………133 Figura 22. Depósitos de calosa en raíces de soja Williams inoculadas con las estirpes HH103, HH103 ttsI::Ω y HH103 nodA::Ω, a los 2 d.p.i…………………………..135 Figura 23. Cuantificación mediante qPCR de la expresión de genes que codifican enzimas peroxidasas en la raíz de soja Williams inoculada con las estirpes HH103, HH103 ttsI::Ω y su derivado complementado HH103 ttsI::Ω (pMUS984)………..136 Figura 24. Cuantificación de las actividades enzimáticas catalasa y SOD (en gel) de la raíz de soja Williams inoculada con las estirpes HH103, HH103 ttsI::Ω y HH103 ttsI::Ω (pMUS984)…………………………………………………………………138 Figura 25. Cuantificación de MDA de la raíz de soja Williams inoculada con las estirpes HH103 y HH103 ttsI::Ω…………………………………………………..140
Figura 26. Cuantificación de SA mediante el biosensor bioluminiscente Acinetobacter sp. ADP1_lux de la raíz (A) y de la hoja (B) de soja Williams inoculada con las estirpes HH103 y HH103 ttsI::Ω…………………………………………………..142 Figura 27. Cuantificación de SA mediante HPLC de la raíz de soja Williams inoculada con las estirpes HH103, HH103 ttsI::Ω y su derivado complementado HH103 ttsI::Ω (pMUS984)………………………………………………………………………...144 Figura 28. Cuantificación JA-ile mediante HPLC de la raíz de soja Williams inoculada con las estirpes HH103, HH103 ttsI::Ω y de su derivado complementado HH103 ttsI::Ω (pMUS984)………………………………………………………………...145 Figura 29. Cuantificación de ABA mediante HPLC de la raíz de soja Williams inoculada con las estirpes HH103, HH103 ttsI::Ω y su derivado complementado HH103 ttsI::Ω (pMUS984)………………………………………………………...146 Figura 30. Cuantificación de ET mediante cromatografía de gases de la raíz de soja Williams inoculada con las estirpes HH103, HH103 ttsI::Ω y su derivado complementado HH103 ttsI::Ω (pMUS984)………………………………………147 Figura 31. Cuantificación mediante qPCR de la expresión del gen GmPR1 en la raíz de soja Williams inoculada con las estirpes HH103, HH103 ttsI::Ω y su derivado complementado HH103 ttsI::Ω (pMUS984)………………………………………149 Figura 32. Cuantificación mediante qPCR de la expresión del gen GmPR2 en la raíz de plantas de soja Williams inoculada con la estirpesilvestre HH103, el mutante HH103 ttsI::Ω y su derivado complementado HH103 ttsI::Ω (pMUS984) a los 2 d.p.i…...150 Figura 33. Cuantificación mediante qPCR de la expresión de los genes GmPR1 (A) y GmPR2 (B) en la raíz de soja Williams tratada con SA a 1, 0,5 y 0,1 mM………..152 Figura 34. Recuento del número de células viables en el sistema de hidroponía en vasos de precipitado con soja Williams y 0,5 mM de SA………………………………..153 Figura 35. Fenotipo simbiótico de las plantas de soja Williams inoculadas con la estirpe parental HH103, el mutante HH103 ttsI::Ω y su derivado complementado HH103 ttsI::Ω (pMUS984) en ausencia o presencia de 1 mM de SA……………………..154
Tabla 1. Función, dianas, localización y mecanismo de orientación (usado para situarse en el orgánulo) de los efectores identificados en algunos géneros de bacterias patógenas de animales y plantas…………………………………………………….21 Tabla 2. Efecto de la mutación del T3SS y de algunos genes nop sobre el comportamiento simbiótico de distintas estirpes de rizobios en sus leguminosas hospedadoras………………………………………………………………………...28 Tabla 3. Respuestas de defensas activadas durante las respuestas PTI y ETI…………38 Tabla 4. Estirpes derivadas de Sinorhizobium fredii HH103 utilizadas en esta Tesis (A); Estirpes derivadas de Agrobacterium tumefaciens CV3101 utilizadas en esta Tesis (B); Estirpes derivadas de Escherichia coli DH5α, BL21 y DB3.1 utilizadas en esta Tesis (C); Otras estirpes utilizadas en esta Tesis (D)……………………………….49 Tabla 5. Cebadores utilizados en esta Tesis para amplificar fragmentos de ADN destinados para clonación…………………………………………………………...69 Tabla 6. Cebadores utilizados en esta Tesis para amplificar fragmentos de ADN para la mutagénesis in vitro por deleción mediante PCR solapante………………………...72 Tabla 7. Cebadores utilizados en esta Tesis para ensayos de qPCR de genes de S. fredii HH103……………………………………………………………………………….76 Tabla 8. Plantas utilizadas en esta Tesis……………………………………………….83 Tabla 9. Voltaje de cono y energías de colisión usados en el sistema HPLC para cuantificar las fitohormonas………………………………………............................90 Tabla 10. Cebadores utilizados en esta Tesis para ensayos de qPCR de genes de soja Williams……………………………………………………………………………..93 Tabla 11. Inhibidores de quinasas usados en esta Tesis……………………………….97 Tabla 12. Array de mutantes de S. cerevisiae BY4741 usados en esta Tesis………...106 Tabla 13. Respuesta de soja Williams al SA exógeno y a la inoculación con la estirpe parental HH103, el mutante HH103 ttsI::Ω y su derivado complementado HH103 ttsI::Ω (pMUS984)…………………………………………………………………155
Tabla 14. Respuesta de G. max cv. Williams a la inoculación con las estirpes S. fredii HH103 y diversos mutantes relacionados con el T3SS, afectados en los genes nopL, nopP y nopI………………………………………………………………………...184 Tabla 15. Respuesta de plantas de Sophora tomentosa a la inoculación con las estirpes S. fredii HH103 y diversos mutantes relacionados con el T3SS, afectados en los genes nopL, nopP y nopI…………………………………………………………..187 Tabla 16. Respuesta de plantas de V. unguiculata a la inoculación con las estirpes S. fredii HH103 y diversos mutantes relacionados con el T3SS, afectados en los genes nopL, nopP y nopI………………………………………………………………….189 Tabla 17. Respuesta de soja Williams a la inoculación con las estirpes de S. fredii HH103 y HH103 nopCΔ…………………………………………………………...201 Tabla 18. Respuesta de L. japonicus a la inoculación con S. fredii HH103 y diversos mutantes derivados afectados en genes relacionados con el T3SS………………...203 Tabla 19. Proteínas de soja resultantes de la comparación de los péptidos provenientes de la secuenciación a partir de la banda recortada del ensayo de fosforilación ―en gel‖, representado en la Figura 70 (A)……………………………………………..217 Tabla 20. Determinación de los genes de S. cerevisiae congruentes para NopL…….221 Tabla 21. Identificación de las proteínas del extracto de hojas de N. benthamiana que interaccionan con la proteína NopL que proceden de los ensayos de inmunoprecipitación……………………………………………………………….223 Tabla 22. Proteínas de soja Williams resultantes de la comparación de los péptidos provenientes de la secuenciación de las proteínas de las bandas de aproximadamente 75 y 68 kDa del ensayo de fosforilación ―en gel‖ (Figura 78)…………………….230 Tabla 23. Determinación de los genes de S. cerevisiae congruentes para NopP……..234 Tabla 24. Análisis de los procesos celulares a través de ―FuncAssociate 2.1‖ usando los genes congruentes para NopP……………………………………………………...235
Tabla 25. Secuenciación de las proteínas del extracto de hojas de N. benthamiana que interaccionan con la proteína NopP, procedentes de los ensayos de inmunoprecipitación……………………………………………………………….236 Tabla 26. Respuesta a la inoculación de soja Williams con las estirpes de S. fredii HH103 HH103 nodD1::Ω, HH103 nodD1::Ω (ttsI), HH103 nodA::Tn5-lacZ y HH103 (ttsI)………………………………………………………………………..243 Tabla 27. Efecto de la mutación del T3SS y de distintos genes nop sobre el comportamiento simbiótico de S. fredii HH103 en las leguminosas hospedadoras ensayadas en esta Tesis…………………………………………………………….261
Abreviaturas
ABA, ácido abscísico (del inglés, abscisic acid) AON, autorregulación de la nodulación (del inglés, autoregulación of nodulación) Avr, avirulencia (del inglés, avirulence) CCaMK, proteína quinasa dependiente de calcio-calmodulina (del inglés, calcium calmodulin-dependent protein kinase) CDPK, proteína quinasa dependiente de calcio (del inglés, calcium-dependent protein kinase) CPF, factor de corte y poliadenilación (del ingles, cleavage and polyadenylation factor) CRT, calreticulina (del inglés, calreticulin) DAMP, patrones moleculares asociados al daño (del inglés, damage-associated molecular patterns) ENOD, nodulina temprana (del inglés, early nodulin) EPS, exopolisacáridos ET, etileno ETI, inmunidad activada por efector (del inglés, effector-triggered immunity) ETS, suceptibilidad activada por efector (del inglés, effector-triggered susceptibility) GC, glucanos cíclicos HH103, S. fredii HH103 HR, respuesta hipersensible (del inglés, hypersensite response) HSP, proteína de choque térmico (del inglés, heat shock protein) IPTG, Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido ISR, resistencia sistémica inducida (del inglés, induced systemic resistance) JA-ile, ácido jasmónico-isoleucina (del inglés, jasmonic acid-isolecine) JA, ácido jasmónico (del inglés, jasmonic acid) KPS, polisacáridos capsulares tipo antígeno-K (del inglés, K-capsular polysaccharides) LCO, lipo-quito-oligosacárido (del inglés, lipochitooligosaccharide) LPS, lipopolisacárido (del inglés, lipopolysaccharides) LRR, dominio de repetición rico en leucina (del inglés, leucine-rich repeat)
LysM, motivo de lisina (del inglés, lysin motif) MAP, proteínas activadas por mitógenos (del inglés, mitogen-activated protein) MAPK, proteínas quinasas activadas por mitógenos (del inglés, mitogen-activated protein kinase/s) MAMP, patrones moleculares asociados a patógenos (del inglés, pathogen-associated molecular patterns) MDA, malondihaldehído (malondihaldehído) MeJA, metil jasmonato (del inglés, methyl jasmonate) MeSA, ádico metil salicílico (del inglés, methyl salicylic acid) MTI, inmunidad activada por microbio (del inglés, microbial-triggered immunity) NEL, tipo de ligasa E3 (del inglés, novel E3 ligase) NGR234, S. fredii NGR234 NIN: gen relacionado con el desarrollo del proceso de nodulación (del inglés, nodule inception) NO, óxido nítrico (del inglés, nitric oxide) Nod, nodulación (del inglés, nodulation) Nop, proteínas translocadas a través de la membrana externa vía sistema de secreción de tipo 3 (del inglés, nodulation outer protein) NLS, señal de localización nuclear (del inglés, nuclear localization signal) rhc, genes conservados de rizobios (del inglés, rhizobium conserved) PAMP, patrones moleculares asociados a patógenos (del inglés, pathogen-associated molecular patterns) PGPR, rizobacterias de promoción del crecimiento vegetal (del inglés, plant growth promoting rhizobacteria) PI: fosfatidilinositol (del inglés, phosphatidylinositol) PR, relacionado con la patogenicidad (del inglés, pathogenicity related) Proteínas R, proteínas de resistencia (del inglés, resistance proteins) PRR, receptores de reconocimiento de patrones (del inglés, pattern recognition receptors) RE, retículo endoplasmático
RK, receptor quinasa (del inglés, receptor kinase) ROS, especies reactivas de oxígeno (del inglés, reactive oxigen species) SA, ácido salicílico (del inglés, salicylic acid) SAR, resistencia sistémica adquirida (del inglés, systemic acquired resistance) SL, hace referencia a las interacciones sintéticas letales en levaduras (del inglés, synthetic lethality) SOD, superóxido dismutasa (del inglés, superoxide dismutase) Tat, translocación doble arginina (del inglés, twin-arginine translocation) T3SS, sistema de secreción de tipo 3 (del inglés, type 3 secretion system) USDA257, S. fredii USDA257
4 Introducción planta. De hecho, la simple adición de los factores Nod producidos por el rizobio compatible, sin la presencia de la bacteria, es capaz de inducir la organogénesis nodular originando un primordio nodular. Este reconocimiento desencadena la activación de varios mecanismos, entre los que se encuentra el aumento de calcio en el citoplasma y el núcleo de las células de la raíz. Por otro lado, los altos niveles de calcio provocan la activación de una proteína quinasa dependiente de calcio-calmodulina CCaMK (del inglés, Calcium Calmodulin-dependent protein Kinase), que conlleva a la activación de diversos genes, entre los que se encuentran los genes NIN y ENOD, lo que promueve la iniciación del programa de desarrollo nodular (Figura 1) (Gleason et al., 2006; Miller et al., 2013; Shimoda et al., 2012). Además, este tipo de quinasas se encuentran involucradas en las respuestas a patógenos y a daños mecánicos (Evangelisti et al., 2014). La división de las células del córtex culmina con la formación del primordio nodular, que es finalmente alcanzado por el tubo de infección que comienza a ramificarse y a extenderse. Una vez allí, las bacterias son liberadas al interior de las células vegetales mediante un proceso de endocitosis, por el que los rizobios se diferencian hasta bacteroides. Estos bacteroides se multiplican y se rodean, bien individualmente o en pequeños grupos, de una membrana de origen vegetal llamada membrana peribacteroidea, importante para el intercambio de metabolitos entre la célula vegetal y la bacteria, dando lugar a los denominados simbiosomas. En su última etapa de desarrollo, los bacteroides dejan de dividirse y se diferencian hasta bacteroides maduros, capaces de reducir el nitrógeno atmosférico a amonio por la acción del complejo enzimático denominado nitrogenasa (Figura 1). La excesiva formación de nódulos interfiere con el desarrollo de la planta, por lo que las leguminosas controlan el número y la masa de los nódulos a través del mayor sistema de autorregulación por retroalimentación negativa que se conoce en plantas. Este proceso se denomina autorregulación de la nodulación (AON, del inglés, Autoregulation Of Nodulation) (Kosslak y Bohlool, 1984; Soyano et al., 2014). La forma y la anatomía del nódulo dependen exclusivamente de la planta y tiene relación con la posición taxonómica (Sprent, 2007). Existen dos tipos de nódulos: indeterminados, habitualmente presentes en leguminosas de climas templados, como Sophora tomentosa, Medicago sativa o Pisum sativum, y determinados, habitualmente característicos de leguminosas (sub) tropicales, como los desarrollados por Glycine max, Lotus japonicus y Vigna unguiculata. En los nódulos indeterminados el primordio se
5 Introducción origina en el córtex interno de la raíz y da lugar a un meristemo apical persistente, de modo que contínuamente se generan nuevas células que van siendo infectadas, por lo que el nódulo adopta una forma cilíndrica. El primordio de los nódulos determinados se origina en el córtex externo y da lugar a un meristemo cuya actividad es transitoria, de modo que genera una masa esférica de células que se diferenciarán simultáneamente (Figura 1). Figura 1. Proceso de nodulación a través de la vía dependiente e independiente de los factores Nod.
6 Introducción 2. Sistemas de secreción de proteínas en bacterias Gram-negativas. Muchas bacterias Gram-negativas son capaces de secretar proteínas a través de la membrana externa mediante diversas estructuras denominadas sistemas de secreción. Hasta la fecha se han identificado nueve sistemas de secreción diferentes, T1SS-T9SS, del inglés Type (1-9) Secretion System (Desvaux et al., 2009; Glew et al., 2012) y se clasifican según la naturaleza molecular de la maquinaria de transporte y las reacciones que catalizan (Lee y Schneewind, 2001) (Figuras 2 y 3). Estos sistemas traslocan las proteínas directamente desde el citosol al exterior celular. Sin embargo, muchos de ellos dependen de otros sistemas (Sec y/o Tat), cuya función es translocar las proteínas desde el citosol al espacio periplásmico. El sistema Sec está compuesto por un conjunto de proteínas denominado traslocón, en el que la fuente de energía es el ATP. La proteína secretada a través de este sistema, a veces referida como pre-proteína por su estructura no plegada, contiene una secuencia señal en el extremo amino terminal que es eliminada por peptidasas cuando se trasloca (Ito y Mori, 2009; Papanikou et al., 2007). El sistema Tat, sin embargo, no está tan conservado como el anterior y se sirve del gradiente de protones como fuente de energía (Bogsch et al., 1998; Cline et al., 1992; Wu et al., 2000). Además, las proteínas que lo atraviesan se encuentran ya plegadas y presentan un motivo de doble arginina en su secuencia (Berks, 1996; Hynds et al., 1998). Entre los sistemas de secreción que traslocan proteínas a través de la membrana externa bacteriana se encuentran aquellos que liberan las proteínas al medio extracelular (T1SS, T2SS y T5SS), los que inyectan las proteínas al interior del citoplasma de las células de un hospedador eucariota (T3SS, T4SS y T6SS), o al de bacterias (T6SS), y otros que se requieren para la biosíntesis de apéndices en la superficie de la bacteria (T7SS, T8SS y T9SS) (Desvaux et al., 2009; Glew et al., 2012). Los sistemas T1SS, T3SS, T4SS, T6SS y T9SS se componen de un conjunto de proteínas que atraviesan las membranas interna y externa de la bacteria, promoviendo la secreción de las proteínas en un solo paso (Rego et al., 2010). Sin embargo, los sistemas T2SS, T5SS, T7SS y T8SS solo forman un canal en la membrana externa y son dependientes del sistema Sec. Además, el T2SS también puede secretar proteínas provenientes de la translocación mediante el complejo Tat (Dautin y Bernstein, 2007). A través de estos sistemas se traslocan moléculas de diversa naturaleza protéica, como proteasas, toxinas, lipasas, enzimas hidrolíticas; o no proteíca, como ácidos
7 Introducción nucleicos (solo mediado por el T4SS), entre otras (Lee y Schneewind, 2001; Thanassi y Hultgren, 2000). Figura 2. Sistemas de secreción de las bacterias Gram-negativas. MH, Membrana del hospedador. ME, Membrana externa bacteriana. MI, Membrana interna bacteriana.
8 Introducción 2. 1. El sistema de secreción de tipo 3 (T3SS). Una gran diversidad de bacterias Gram-negativas utilizan el T3SS para inyectar proteínas, denominadas efectores, directamente al interior de la célula hospedadora. Una vez dentro de la célula hospedadora, estas proteínas ejercen diferentes funciones que repercutirán en el propio beneficio de la bacteria (Galán et al., 2014). El T3SS se encuentra muy extendido en la naturaleza y lo poseen un gran número de microorganismos. Se ha estudiado en patógenos de animales, como Yersinia spp., Salmonella spp., Shigella spp., E. coli enteropatógenas (EPEC) o enterohemorrágicas (EHEC), Pseudomonas aeruginosa o Chlamydia spp. (Cornelis et al., 1998; Frankel et al., 1998; Galan y Collmer, 1999; Kalman et al., 2000; Van Nhieu et al., 1997). Además, se encuentra en la mayoría de las bacterias Gram-negativas patógenas de plantas, como Erwinia amylovora, P. syringae, Ralstonia solanacearum y Xanthomonas spp. (Alfano y Collmer, 1997; Galan y Collmer, 1999) y patógenas de hongos, como P. fluorescens NZI7 (Burlinson et al., 2008). Sin embargo, el T3SS no es exclusivo de bacterias patógenas. La secuenciación de multitud de genomas ha facilitado la identificación del T3SS en bacterias que establecen relaciones simbióticas con vertebrados, plantas e insectos (Buttner y He, 2009; Correa et al., 2012; Silver et al., 2007). En los rizobios, el T3SS está presente sólo en algunas especies y aún no se ha podido establecer ninguna correlación entre el género del rizobio y la presencia del T3SS. Aunque las proteínas que conforman la estructura de la maquinaria de este sistema se encuentran muy conservadas entre estos microorganismos, los efectores que son inyectados a través de él son específicos de cada microorganismo, ya sea patógeno o simbionte (Galán, 2009). Los análisis filogenéticos indican que el T3SS deriva de un proceso evolutivo de exaptación a partir del flagelo bacteriano, es decir, una adaptación del flagelo a una funcionalidad nueva y diferente a la que tenía (Pallen et al., 2005). Al parecer, este proceso evolutivo constó de dos fases (Abby y Rocha, 2012). La primera fue el establecimiento de una estructura que permitía la secreción de proteínas que sólo era capaz de llevar a cabo funciones de movilidad. La segunda se produjo cuando este flagelo modificado reclutó proteínas del tipo de las secretinas, que fueron responsables de controlar la secreción de ciertas proteínas a través de este sistema. Las secretinas, presentes en las bacterias Gram-negativas, incluyen proteínas de la membrana externa involucradas en el reconocimiento de fagos o en la secreción de proteínas. Finalmente,
9 Introducción surgió el T3SS, que supone uno de los mayores complejos proteicos de secreción conocidos hasta el momento. No se conoce cómo las bacterias simbióticas adquirieron el T3SS, pero se plantea la hipóteis de que se debe a la transferencia horizontal de material genético a partir de las bacterias patógenas (Nguyen et al., 2000). El descubrimiento de la existencia de un T3SS funcional en los rizobios se realizó a partir de la secuenciación del plásmido pNGR234a de S. fredii NGR234 por Viprey et al. (1998). La posterior secuenciación de los genomas y de los plásmidos de distintas especies de rizobios ha puesto en evidencia la presencia del T3SS en muchas, pero no en todas, las especies estudiadas. Hasta la fecha, el T3SS funcional se ha identificado, entre otras, en las estirpes HH103, USDA257 y NGR234 de S. fredii, en la estirpe USDA110 de Bradyrhizobium diazoefficiens (antes denominado B. japonicum y referida en esta Tesis como tal, Delamuta et al., 2013), en la estirpe MAFF303099 de Mesorhizobium loti y en B. elkanii USDA61 (de Lyra et al., 2006; Göttfert et al., 2001; Kaneko et al., 2000, 2002; Krause et al., 2002; Krishnan et al., 2003; Okazaki et al., 2010; Viprey et al., 1998). De forma similar a lo que ocurre en las bacterias fitopatógenas, los genes del T3SS de los rizobios se encuentran localizados en regiones de entre 30 y 47 kb, denominadas islas simbióticas. Éstas se localizan en el cromosoma o en los plásmidos simbióticos (pSym), donde también se encuentran los genes de nodulación y de fijación de nitrógeno (de Lyra et al., 2006; Freiberg et al., 1997; Göttfert et al., 2001; Kaneko et al., 2000; Krishnan et al., 2003; Marie et al., 2001; Viprey et al., 1998). En los rizobios, el conjunto de los genes del T3SS recibe el nombre de región tts (del inglés, type three secretion) (Troisfontaines y Cornelis, 2005). Los genes estructurales del T3SS de los rizobios se denominan rhc, del inglés, rhizobium conserved, mientras que las proteínas secretadas a través de éste reciben el nombre de Nop, del inglés Nodulation outer protein (Marie et al., 2001; Viprey et al., 1998). La región tts de las estirpes NGR234, USDA257 y HH103 de S. fredii presenta una organización idéntica y las secuencias de nucleótidos, tanto de los genes como de las secuencias intergénicas, se encuentran altamente conservadas (98-99%), mientras que las secuencias proteicas presentan un rango de similitud de entre el 94 y el 100%. Sin embargo, la correspondiente similitud en las secuencias proteicas con las estirpes M. loti MAFF303099 y B. diazoefficiens USDA110 se encuentra entre el 63-95% y el 41- 83%, respectivamente (Tampakaki, 2014).
10 Introducción En los rizobios, como ocurre en muchas bacterias fitopatógenas, se han identificado diferentes T3SS no canónicos, que se corresponden con aquellos que carecen de algún elemento estructural y/o regulador y cuya interacción con la planta se desconoce. Un caso muy peculiar es el T3SS de B. elkanii USDA61, ya que su T3SS posee una organización, regulación y función muy diferente del resto de los rizobios (Tampakaki, 2014). 2. 2. Estructura del T3SS. De forma general, el T3SS se diferencia en dos partes (Figura 3): i) una base cilíndrica, similar al cuerpo basal del flagelo, que atraviesa las dos membranas bacterianas y que asegura la estabilidad de toda la estructura sobre la cubierta celular; ii) una estructura extracelular alargada y hueca denominada aguja o needle en patógenos de animales, pilus Hrp en fitopatógenos y apéndice extracelular, similar al pilus, en los rizobios. Estos apéndices extracelulares poseen diferentes características: el pilus es una estructura flexible, delgada y alargada, mientras que la aguja es rígida y más corta. Ambas estructuras están físicamente unidas al cuerpo basal y se asume que ejercen funciones análogas. La estructura del T3SS se identificó por primera vez en S. thyphimurium (Kubori et al., 1998) y se ha comprobado que la mayor parte de los componentes están muy conservados entre los microorganismos que lo poseen. Las dimensiones de la base de S. thyphimurium son de aproximadamente 25 nm de ancho y 30 nm de largo y está compuesta por dos anillos asociados a la membrana interna, que se conectan con dos anillos externos, que se asocian a la membrana externa a través del cuello. Los anillos internos se encuentran formados por dos proteínas: PrgK/PrgH, en Salmonella spp., o HrcJ/HrpQ en Pseudomonas spp. En los rizobios, hasta ahora sólo se ha identificado la proteína RhcJ como componente de los anillos internos. Por otra parte, los anillos externos y el cuello del T3SS de patógenos están compuestos por una sola proteína, InvG, en Salmonella spp., HrcC en Pseudomonas spp., y por dos proteínas, RhcC1 y RhcC2, en los rizobios (Figura 3). Además, el T3SS de todos los organismos posee un grupo de cinco proteínas conservadas de la membrana interna, localizado en el centro de los anillos internos y que podría actuar como un canal para facilitar el paso de las proteínas secretadas a través de la membrana interna: InvA/SpaP/SpaQ/SpaR/SpaS, en Salmonella spp., HrcV/HrcR/HrcS/HrcT/HrcU en Pseudomonas spp. y
11 Introducción RhcV/RhcR/RhcS/RhcT/RhcU en los rizobios (Figura 3). Aunque normalmente se considera como un conjunto de proteínas, se piensa que cada una de ellas ejerce una función especializada (Galán et al., 1992; Wagner et al., 2010). Existen numerosas proteínas citosólicas muy conservadas entre los distintos T3SS, esenciales para la secreción, y que se encuentran unidas a la cara citoplasmática del sistema. Estas proteínas, posiblemente, conforman una estructura definida, como ocurre con el anillo C de la estructura flagelar, cuya función se relaciona con en el cambio de dirección de la rotación del flagelo (Abrusci et al., 2013; Driks y DeRosier, 1990). Sin embargo, no existen evidencias de que una estructura similar forme parte del T3SS. Otro de los componentes citosólicos del T3SS altamente conservado es una ATPasa, encargada del reconocimiento y desplegamiento de la proteína sustrato (InvC, HrcN y RhcN, en Salmonella spp., Pseudomonas spp. y los rizobios, respectivamente) (Galán et al., 2014) (Figura 3). La aguja de S. thyphimurium mide aproximadamente 50 nm de largo y el pilus Hrp de P. syringae puede alcanzar más de 2 µm (Tampakaki, 2014). Este apéndice se encuentra anclado a la base del sistema a través de la varilla interior, que descansa sobre una estructura de anclaje o socket, y está formada por una proteína de ~90 aminoácidos (PrgJ y HrpB, en Salmonella spp. y Pseudomonas spp., respectivamente) (Figura 3) (Lee y Galán, 2004). El conjunto de estas proteínas conforman un canal por donde son conducidas las proteínas secretadas, cuyo diámetro es de ~20 Å en Salmonella spp. (2 nm) y de 6-8 nm en P. syringae y en las estirpes de S. fredii estudiadas (Radics et al., 2014; Tampakaki, 2014). Al igual que el filamento del flagelo, la ajuga o el pilus es la consecuencia del ensamblaje de múltiples copias de una subunidad: PrgI en Salmonella spp., HrpA en Peudomonas spp. y NopA y NopB en los rizobios, dispuestos en forma de α-hélice (Figura 3) (Cordes et al., 2003; Galkin et al., 2010; Kubori et al., 2000; Loquet et al., 2012). Las proteínas NopA y NopB (Ausmees et al., 2004; Marie et al., 2004), de ~6 y ~21 kDa, respectivamente, se encuentran presentes en todos los rizobios que poseen el T3SS y la primera de ellas posee una estructura secundaria deducida similar a la de otras proteínas que son subunidades de los pili Hrp, con un posible contenido en α-hélice del 70 al 90% (Koebnik, 2001). El uso de anticuerpos específicos anti-NopA y anti-NopB han demostrado que estas dos proteínas son componentes del T3SS-pilus y que NopA podría ser el componente mayoritario (Deakin et al., 2005; Saad et al., 2007).
12 Introducción En el extremo de la ajuga o el pilus puede situarse una única proteína no muy conservada, conformando el complejo del extremo, que podría jugar un papel en el reconocimiento de la célula del hospedador y el despliegue de las proteínas traslocasas (Epier et al., 2012). Dependiendo de la estructura de la región amino terminal, las proteínas del extremo se clasifican en dos grupos: familia SipD/IpaD de Salmonella spp. y Shigella spp., respectivamente, y familia LcrV/PcrV de Yersinia spp. y Pseudomonas spp., respectivamente (Galán et al., 2014) (Figura 3). Sin embargo, existen otras variantes, como el T3SS de E. coli, que presenta en el extremo de la aguja otro filamento de mayor longitud que la propia aguja, de mayor flexibilidad y formado por una única proteína, y que podría funcionar como un anclaje a la célula hospedadora (Knutton et al., 1998). El último paso en la liberación de los efectores a través del T3SS es la translocación de proteínas bacterianas dentro de la célula eucariota a través de su membrana plasmática. Este paso está mediado por las enzimas traslocasas (SipBC y HrpK de Salmonella spp. y Pseudomonas spp., respectivamente) que se insertan en la membrana de la célula hospedadora donde, presumiblemente, forman un canal. Aunque estas proteínas no se encuentren muy conservadas a nivel de secuencia, todas ellas son proteínas con estructuras de α-hélices. NopX es una proteína de alrededor de 60 kDa que muestra un 48% de identidad con la proteína traslocadora HrpF de X.campestris pv. vesicatoria y se piensa que podría estar involucrada en la translocación de proteínas efectoras a través del T3SS rizobiano (Viprey et al., 1998) (Figura 3). Esta suposición está apoyada, además, por estudios de inmunolocalización de NopX en soja y Vigna unguiculata, que indican que NopX se encuentra en los tubos de infección pero no en los nódulos (Krishnan, 2002).
13 Introducción Figura 3. Esquema general de la organización de las proteínas del T3SS. Se indica con una flecha la situación de cada proteína y su posible función. Los asteriscos indican la pertenencia al grupo de proteínas exportadoras de la membrana interna. Entre paréntesis se representan la nomenclatura de las proteínas del T3SS del patógeno animal S. enterica (azul) (isla de patogenicidad de Salmonella 1 o SPI-1), del fitopatógeno P. syringae (verde) y de los rizobios (rojo). Figura modificada a partir de la publicada por Galán et al. (2014).
20 Introducción secuencia amino terminal una composición de aminoácidos similar a las de las proteínas eucariotas, también denominadas ―pre-secuencias‖ (Tabla 1). El núcleo de la célula eucariota supone otro destino para algunos de los efectores secretados a través de este sistema. La mayoría de las proteínas se dirigen desde el citoplasma eucariota hasta el núcleo de la célula viajando a través de los complejos del poro nuclear, formados por grandes estructuras en forma de poro que permiten el paso de proteínas cuyo tamaño no debe exceder los 50 kDa. Para la entrada en el núcleo de proteínas de mayor tamaño se requiere la presencia, en su secuencia, de la señal de localización nuclear (NLS, del inglés, Nuclear Localization Signal). La señal clásica consta de una o dos secuencias de aminoácidos cortas y ricas en los aminoácidos lisina y arginina, con cargas positivas y que son reconocidas por transportadores solubles de las superfamilias α y β importina de la célula eucariota (Mattaj y Englmeier, 1998). Muchos efectores presentan estas secuencias señales, como los activadores de la transcripción de las bacterias del género Xanthomonas, que se localizan en el núcleo para regular la expresión de los genes de la planta durante la infección (Tabla 1) (Bogdanove et al., 2010).
21 Introducción Tabla 1. Función, dianas, localización y mecanismo de orientación (usado para situarse en el orgánulo) de los efectores identificados en algunos géneros de bacterias patógenas de animales y plantas. Especie Efector Localización Mecanismo orientación Ligando Función Pseudomonas spp. AvrRpm1 Membrana plasmática N-miristoilación S-palmitoilación RINA4 Respuesta defensiva HopZ Membrana plasmática N-miristoilación S-palmitoilación HopZ1 de P. syringae interacciona con GmHID1 HopZ1 induce la expresión de gmhid1 y la producción de daidzeína en soja (Zhou et al., 2011) AvrPphB Membrana plasmática N-miristoilación S-palmitoilación Quinasa PBS1 Modulación de la respuesta de defensa de la planta dependiente de ácido jasmónico AvrPto Membrana plasmática N-miristoilación S-palmitoilación Quinasa Ser/Thr Pto Enzima de conjugación de la ubiquitina ligasa E3 / Inhibición de la muerte celular programada en las células vegetales ExoU Membrana plasmática Dominio de unión a Ptdlns(4,5)P2 fosfolipasa ExoU A2 de P. aeruginosa ExoU de P. aeruginosa actúa como fosfolipasa rompiendo la membrana celular eucariota (Anderson et al., 2013) Múltiples familias de efectores** Cloroplastos Mitocondria Pre-secuencias de cloroplastos y mitocondrias Salmonella spp. SseI Membrana plasmática S-palmitoilación IQGAP1 Media en la infección sistémica a largo plazo mediante la inhibición de la migración normal de la célula hospedadora (McLaughlin et al., 2009) SifA Vacuola que contiene a Salmonella Filamentos inducidos por Salmonella Prenilación SKIP y quinesina Reclutamiento de SKIP a la vacuola que contiene a Salmonella / Modulación del tráfico de vesículas SopA Mitocondria Desconocido Desconocido Ubicuitína ligasa parecida a HECT / Induce la respuesta inflamatoria SopB Vacuola que contiene a Salmonella Ubicuitilación Fosfoinosítidos e inositol fosfato Fosfoinositósido e inositol fosfato fosfatasa / Estimulación de la reorganización del citoesqueleto de actina y de la macropinocitosis; entrada de la bacteria en células no fagocíticas; modulación del tráfico de membranas
22 Introducción Tabla 1. Función, dianas, localización y mecanismo de orientación (usado para situarse en el orgánulo) de los efectores identificados en algunos géneros de bacterias patógenas de animales y plantas. Especie Efector Localización Mecanismo orientación Ligando Función Xhanthomonas spp. AvrBs3 Núcleo NLS monopartita Desconocido Factor de transcripción / Regula la expresión de genes de la planta XopD Núcleo Desconocido SUMOilación de proteínas desconocidas Suprime los síntomas de la enfermedad y modula la transcripción de los genes del hospedador reprimiendo la expresión de los genes responsables de la producción de SA y JA (Kim et al., 2008) AvrXa10 Núcleo NLS monopartita Induce la expresión del gen Xa10 La expresión de Xa10 induce la muerte celular programada en arroz, N. benthamiana y células Hela de mamíferos (Tiana et al., 2014) Shigella spp. IpaH1 Membrana plasmática S-palmitoilación Desconocido Ubiquitina ligasa E3 / ¿Interrumpe la respuesta inflamatoria? IpaH4.5 Membrana plasmática S-palmitoilación Desconocido Ubiquitina ligasa E3 / ¿Interrumpe la respuesta inflamatoria? E. coli Map Membrana plasmática Mitocondria Interacción proteínaproteína. Pre-secuencia de mitocondria EBP50 / NHERF1 Función desconocida / Induce la diarrea EspF Mitocondria Núcleo Membrana plasmática ¿Pre-secuencia de mitocondria? WASP; Abcf2; SNX9 Reclutamiento de WASP a la membrana plasmática /reclutamiento de Abcf2 a la mitocondria/Favorece la nucleación de la actina en la membrana plasmática, la unión íntima de las bacterias y las rutas de muerte mitocondrial Tir Membrana plasmática Desconocido Nck Receptor de intimina; reclutamiento de membrana de la señalización y de la maquinaría de nucleación de la actina / Nucleación de la actina en la membrana plasmática; unión íntima de la bacteria a las células hospedadoras **Localización intracelular de múltiples efectores de Pseudomonas syringae incluyendo miembros de las familias Avr, Hol, y Hrp predecidos por el programa TargetP. Tabla modificada de Galán, 2007 y Hicks y Galán, 2013.
23 Introducción Los efectores secretados a través del T3SS de S. fredii HH103. Hasta la fecha se han identificado numerosos efectores de rizobios, denominados Nop (del inglés, Nodulation outer protein), pero no todos están presentes en todas las especies e, incluso, algunos son específicos de algunas de estas bacterias simbiontes. Un ejemplo representativo de este hecho es NopJ, ya que se encuentra en la estirpe NGR234 y no en las estirpes HH103 y USDA257 de S. fredii. La estirpe HH103 posee, al menos, los genes que codifican los efectores NopC (~ 11 kDa), NopP (~ 30 kDa), NopL (~ 38 kDa), NopD (~ 149 kDa) y NopM (~ 65 kDa) (Viprey et al., 1998; Rodrigues et al., 2007). Otras proteínas que se encuentran en los sobrenadantes de HH103 inducidos con genisteína como NopA, NopB y NopX no son efectores, es decir, no son traslocadas dentro del citoplasma de la célula hospedadora, sino que conforman el pilus del T3SS de los rizobios (apartado 2. 2. de Introducción). El resto de las proteínas se consideran efectoras y, una vez que son traslocadas al citoplasma de la célula hospedadora, actúan sobre las funciones de la célula vegetal a través de numerosas vías. Muchas de estas proteínas, de patógenos o de simbiontes, ejercen funciones similares o actúan sobre dianas comunes en las células hospedadoras. Incluso, existen efectores homólogos que son secretados por distintos patógenos o rizobios. Algunos de los efectores, como NopL y NopP (Ausmees et al., 2004), son específicos de los rizobios. Ambos se fosforilan por quinasas de las plantas hospedadoras y se ha sugerido que pueden interferir en las rutas de señalización involucradas en respuestas de defensa. Los ensayos de fosforilación in vitro realizados por Bartsev et al. (2003) demostraron que la proteína NopL de S. fredii NGR234 es fosforilada por quinasas de Nicotiana tabacum y de Lotus japonicus. Además, estudios posteriores revelaron que NopL se fosforila en 4 residuos de serina que presentan un patrón serina/prolina típico de sustratos de MAP quinasas (MAPK, del inglés, Mitogen- Activated Protein Kinase) (Zhang et al., 2011). La utilización de extractos proteicos de tabaco y diferentes inhibidores de quinasas indicaron que la quinasa responsable de fosforilar NopL podría ser una serina/treonina MAP quinasa quinasa (MAPKK, del inglés, Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase), sugiriendo que NopL modula las rutas defensivas dependientes de MAPK (Bartsev et al., 2003). Los estudios realizados por Bartsev et al. (2004) en plantas transgénicas de tabaco demostraron que aquellas plantas que expresaban el gen nopL de S. fredii NGR234 no eran capaces de activar completamente las respuestas defensivas mediadas por proteínas PR (del inglés,
24 Introducción Pathogenicity Related), lo que las hace ser más susceptibles a la infección por un patógeno. Así, las plantas de tabaco que expresaron este efector y que fueron infectadas con el virus Y de la patata mostraron unos niveles muy bajos de las proteínas quitinasa y β-1,3-endoglucanasa. Además, las plantas transgénicas de L. japonicus que expresaban el gen nopL mostraron un crecimiento retardado y bajos niveles de quitinasa. Todos estos resultados parecen indicar que NopL, una vez traslocada al interior de la célula hospedadora, podría modular las rutas de transducción de señales a través de la vía de las MAPK que culminan en la expresión de las proteínas PR (Figura 5). Al igual que ocurre con la proteína NopL, NopP también es sustrato de proteínas con actividad quinasa de la planta. Los ensayos realizados por Skorpil et al. (2005) con la proteína NopP de S. fredii NGR234 demostraron que la fosforilación de este efector por las proteínas quinasas de los microsomas de la leguminosa Flamingia congesta se bloquea parcialmente cuando se usan inhibidores de proteínas de tipo tirosina y serina/treonina quinasa. Sin embargo, no se observó inhibición mediante la utilización del inhibidor de las proteínas MAPKK, como sucedía con el efector NopL. Curiosamente, en la leguminosa hospedadora F. congesta, NopP y NopL parecen tener efectos antagonistas. El mutante en nopP forma más nódulos fijadores que la estirpe silvestre, mientras que la eficiencia en la nodulación del mutante en nopL se ve severamente afectada (Ausmees et al., 2004; Marie et al., 2003). En soja Williams, el mutante en el gen nopP de S. fredii HH103 mejoró la capacidad simbiótica respecto a la estirpe parental, aumentando el número y masa fresca de los nódulos, además de la masa seca de la parte aérea. En cambio, este mismo mutante, alteró negativamente todos estos parámetros en la simbiosis con E. variegata (López-Baena et al., 2009) (Tabla 2 y Figura 5). NopC es otra proteína específica de los rizobios y en la literatura diversos autores han considerado esta proteína como parte de la estructura del T3SS, por su localización en el genoma y por su tamaño, muy similar a NopA, componente del apéndice extracelular o pilus del T3SS de los rizobios. Sin embargo, además de no existir trabajos experimentales sobre esta proteína, el análisis informático de la estructura de NopC indica que posee un porcentaje bajo en el contenido en α-hélice (30-50%) en su estructura secundaria, lo que parece incumplir los requisitos necesarios para ser incluida dentro de los componentes del pilus (Deakin y Broughton, 2009).
25 Introducción El resto de los posibles efectores secretados a través del T3SS de los rizobios presentan cierta identidad o son homólogos a otros efectores de bacterias patógenas de animales o plantas. NopM es una proteína rica en repeticiones de leucina (LRR, del inglés, Leucine-Rich Repeat) y fue identificada por primera vez por Rodrigues et al. (2007) a través de una aproximación proteómica, mediante la comparación de las proteínas extracelulares de la estirpe silvestre S. fredii HH103 y un mutante derivado deficiente en el T3SS, inducidos con un flavonoide inductor de los genes nod. Posteriormente, este efector se ha detectado en otras estirpes de rizobios, como S. fredii NGR234, B. japonicum USDA110 o B. elkanii USDA61. La comparación de la secuencia aminoacídica de esta proteína con otros genomas bacterianos que presentan el T3SS indica que NopM pertenece a la familia de efectores IpaH, como son IpaH9.8 e IpaH1.4 de Shigella flexneri, o SspH1, SspH2 y SlrP de S. enterica (Bernal-Bayard y Ramos-Morales, 2009; Quezada et al., 2009; Rohde et al., 2007; Singer et al., 2008; Zhu et al., 2008). Además, NopM también presenta similitud con el efector YopM del patógeno animal Yersinia pestis (Marie et al., 2004; Soundararajan et al., 2011). Incluso se han encontrado otras proteínas con secuencias similares, pero menos relacionadas, que corresponden a efectores no caracterizados en otras bacterias, como los de los fitopatógenos P. syringae y R. solanaceum (Mukaihara y Tamura, 2009). Aunque las proteínas de la familia IpaH-SspH-YopM no poseen señales de localización nuclear, se ha comprobado que, tanto IpaH9.8, como SspH1 y YopM se dirigen al núcleo de la célula hospedadora animal (Abramovitch et al., 2006; Benabdillah et al., 2004; Shan et al., 2008). IpaH9.8 de S. flexneri es una ubiquitina ligasa E3 que contiene un dominio NEL (del inglés, Novel E3 Ligase) y cuya actividad enzimática se ha confirmado en otros efectores de esta familia. Además, la estructura de estos efectores difiere del resto de proteínas de tipo ubiquitina ligasa E3, por lo que reciben el nombre de efectores con dominio NEL. Su función parece estar relacionada con la mimetización de la actividad ubiquitina ligasa E3 del hospedador para la consecuente ubiquitinación y degradación de dianas específicas vía proteosoma (Xin et al., 2012). De esta forma, distintos efectores pueden bloquear el sistema inmune del organismo hospedador o degradar proteínas como la tiorredoxina o REdj3, chaperona del retículo endoplasmático (RE) (Ashida et al., 2010; Bernal-Bayard et al., 2010). Los estudios realizados por Xin et al. (2012) indicaron que NopM de S. fredii NGR234 podría poseer actividad ubiquitina ligasa E3 y fue el primer efector
26 Introducción descubierto con dominio NEL presente en un microorganismo que interacciona con células vegetales (Figura 5). Además, los autores sugieren que este efector podría actuar durante la simbiosis ubiquitinando una o más proteínas dianas del hospedador, hecho que se correlaciona positivamente con la promoción de la nodulación en la leguminosa Lablab purpureus. Sin embargo, el efecto de la actividad de esta proteína en otras plantas leguminosas puede ser neutro o, incluso, afectar negativamente a la nodulación, lo que podría estar potencialmente relacionado con el reconocimiento de este efector por proteínas R (del inglés, Resistance proteins) específicas de la planta (Kambara et al., 2009; Xin et al., 2012; Yang et al., 2010) (Tabla 2). Por otro lado, los autores comprobaron que la expresión de NopM en células de tabaco inhibe la respuesta de defensa mediada por la producción de las especies reactivas de oxígeno (ROS, del inglés, Reactive Oxigen Species) y sugieren que la posible función de este efector es el mantenimiento de bajos niveles de ROS en el desarrollo de los tubos de infección de L. purpureus para no desencadenar las respuestas de defensa de la leguminosa (Xin et al., 2012). La proteína NopD se identificó por primera vez en la estirpe S. fredii HH103 por Rodrigues et al. (2007). El análisis de su secuencia aminoacídica indicó que NopD es homóloga a la proteína hipotética Blr1693 de B. japonicum y a la proteína Msi059 de M. loti, secretada a través del T4SS o T3SS por las estirpes R7A y MAFF303099, respectivamente (Hubber et al., 2004). Además, el gen nopD presenta homología con el gen MA20_12780 de B. japonicum Is-34. En la interacción Rhizobium-leguminosa entre esta estirpes y los cultivares de soja que presentan el gen Rj4, es MA20_12780 el responsable del bloqueo de la nodulación (Tsurumaru et al., 2014). Por otro lado, NopD comparte cierta similitud con el efector XopD de Xanthomonas spp., ya que ambas poseen un dominio cisteína proteasa C48. Los estudios realizados sobre el efector XopD indican que esta proteína actúa como proteasa en el núcleo de la célula vegetal modificando proteínas dianas ―SUMOiladas‖ (SUMO, del inglés, Small Ubiquitin-related MOdifier) (Figura 5). Su actividad proteasa le permite romper los precursores SUMO, eliminando esta etiqueta que se encuentra conjugada a proteínas de la célula, lo que podría ser un mecanismo utilizado para alterar las rutas de señalización del hospedador en beneficio del patógeno. El efector NopT (Dai et al., 2008) comparte similitud con la proteína ID797 de B. japonicum USDA110 y ambas, a su vez, con la de tipo Avr denominada AvrPphB del
27 Introducción fitopatógeno P. syringae y con YopT de Yersinia spp. (Jenner et al., 1991). Todos ellos forman parte de una superfamilia de proteínas caracterizadas por poseer un dominio cisteína proteasa C58 en el que se encuentra muy conservado una triada catalítica de aminoácidos, esenciales para su actividad proteasa (Shao et al., 2002). Estos efectores, incluido NopT, presentan actividad autoproteolítica y son capaces de retirar de su propia secuencia peptídica una serie de residuos de la parte amino terminal, dejando expuesta una secuencia consenso de miristoilación. Consecuentemente, los efectores son N- miristoilados (y S-palmitoilados) por enzimas de origen vegetal para así localizarse en la membrana plasmática de la célula hospedadora (Nimchuk et al., 2000; Puri et al., 1997; Tampakaki et al., 2002). Los estudios de mutagénesis han revelado que el dominio proteasa de este tipo de efectores es el responsable de activar las respuestas de defensa. El efector AvrPphB ejerce su actividad proteasa sobre la quinasa PBS1 de la membrana plasmática de las células de A. thaliana, siendo detectado por la planta a través de receptores específicos y, consecuentemente, disparando la respuesta inmune (Kambara et al., 2009; Shao et al., 2003) (Figura 5). Este hecho podría ser el responsable del efecto extremadamente negativo que ejerce NopT de S. fredii NGR234 en la nodulación con Crotolaria juncea (Tabla 2). Sin embargo, y a pesar de que existen muchos posibles efectores secretados al interior de la célula vegetal por los rizobios, solo se ha confirmado la translocación al interior del citoplasma de la célula vegetal de los efectores NopP de S. fredii USDA257 y NopE1 y NopE2 de B. japonicum USDA110 (Schechter et al., 2010; Wenzel et al., 2010). Figura 5. Representación de la función potencial de algunos efectores secretados a través del T3SS de los rizobios. Los efectores (Nop) están representados como círculos rosas y las proteínas de origen vegetal como cuadros verdes. Figura modificada a partir de la publicada por Deakin y Broughton (2009).
28 Introducción Tabla 2. Efecto de la mutación del T3SS y de algunos genes nop sobre el comportamiento simbiótico de distintas estirpes de rizobios en sus leguminosas hospedadoras. Tabla modificada a partir de la publicada por Deakin y Broughton (2009) y de López-Baena (2008). Estirpe Proteínas secretadas Mutación Ningún efecto Efecto positivo Efecto negativo S. fredii HH103 NopL, NopP, NopD, NopM, NopX (detectadas por LC-MALDI-MS), NopL, NopP y NopX, NopA y NopC (detectadas usando los anticuerpos procedentes de la estirpe NGR234) T3SS no funcional Cajanus cajan (D) Erythrina variegata (D) Glycine. max cv. Williams (D) G. max cv. Peking (D) G. max cv. Heinong 33 (D) G. max cv. Kochi (D) G. max cv. Tribune (D) Glycyrrizha uralensis (I) nopX G. max cv. Williams (D) G. max cv. Peking (D) nopP G. max cv. Williams (D) E. variegata (D) S. fredii NGR234 NopA, NopB, NopC, NopJ, NopL, NopM, NopP, NopT y NopX (identificadas por secuenciación amino terminal). NopB y NopC fueron detectadas por LC-MALDI- TOF-MS y NopB mediante phage display. T3SS no funcional Leucaena leucocephala (I) Lotus japonicus (D) Vigna unguiculata (D) Crotalaria juncea (I) Pachirhizus tuberosus (D) Phaseolus vulgaris cv. W.J.B. (D) P. vulgaris cv. P.Laraguet (D) P. vulgaris cv. W.J.D. (D) Lablab purpureus (I) Flaminga congesta (D) Tephrosia vogelii (I) nopA L. leucocephala (I) V. unguiculata (D) P. tuberosus (D) T. vogelii (I) nopB P. tuberosus (D) F. congesta (D) T. vogelii (I) nopL T. vogelii (I) P. tuberosus (D) F. congesta (D) nopP F. congesta (D) P. tuberosus (D) V. unguiculata (D) nopT Crotalaria juncea (I) P. vulgaris cv. Yudou (D) T. vogelii (I) nopJ Afecta negativamente sobre todas las relaciones simbióticas (Kambara et al., 2009)
29 Introducción Tabla 2. Efecto de la mutación del T3SS y de algunos genes nop sobre el comportamiento simbiótico de distintas estirpes de rizobios en sus leguminosas hospedadoras. Tabla modificada a partir de la publicada por Deakin y Broughton (2009) y de López-Baena (2008). Estirpe Proteínas secretadas Mutación Ningún efecto Efecto positivo Efecto negativo S. fredii USDA257 NopX (detección mediante un anticuerpo específico), NopP, NopA y NopB (identidicadas por secuenciación amino ternimal y por inmunodetección con anticuerpos específicos) T3SS no funcional V. unguiculata (D) G. max cv. McCall (D) Erythrina spp. (D) G. max cv. Peking (D) Macroptilium atropurpureum (D) nolWXBTUV G. max cv. Peking (D) G. max cv. McCall (D) Erythrina spp. (D) nopB V. unguiculata (D) G. max cv. McCall (D) G. max cv. Peking (D) M. atropurpureum (D) nopP G. max cv. McCall (D) B. japonicum USDA110 NopP, GunA2 (detectadas por MALDI-TOF-MS), NopC, NopL, NopF, NopH, NopZ, NopU, NopE1 y NopE2 (Tampakaki, 2014; Tsukui et al., 2013; Wenzel et al., 2010) T3SS no funcional V. unguiculata (D) G. max cv. Williams (D) M. atropurpureum (D) nopE1 Glycine max (D) M. atropurpureum (D) nopE2 Glycine max (D) M. atropurpureum (D) nopE1 nopE2 Glycine max (D) M. atropurpureum (D) M. loti MAFF303099 Posiblemente Mlr6316 T3SS no funcional Lotus corniculatus (D) L. leucocephala (I) B. elkanii USDA61 NopB, NopL, NopX, NopC, NopA y NopM (detectadas por secuenciación) (Okazaki et al., 2009) T3SS no funcional (USDA61) G. max cv. Hill (D) G. max cv. Clark-rj1 (D) (incapaz de reconocer a los factores Nod) (D), nódulos determinados. (I), nódulos indeterminados.
36 Introducción tipo NB-LRR, cuya estructura consta básicamente de una región amino variable, seguida de un dominio de unión a nucleótido (NB) en el centro y un dominio de repeticiones ricas en leucina (LRR) en el extremo carboxilo, estructura similar a la de los receptores intracelulares NLS del sistema inmune de animales (Bakker et al., 2006; Goff et al., 2002; Meyers et al., 2003; Spoel y Dong, 2012). Los efectores de patógenos pueden ser reconocidos directamentea través de las proteínas codificadas por los genes específicos de resistencia (R), pero también este reconocimiento puede darse indirectamente. La detección indirecta ha sido descrita mediante la hipótesis de ―la guardia‖ en la que se postula que las proteínas de resistencia R están asociadas constitutivamente a proteínas de la propia planta. La translocación de ciertos efectores Avr de los patógenos causa alteraciones en la estructura cuaternaria de estas proteínas vegetales, siendo detectadas por las proteínas R (Dangl y Jones, 2001; Van der Biezen y Jones, 1998). El ejemplo más conocido que se adapta a esta hipótesis se ha encontrado en Arabidopsis thaliana. Las proteínas R RPM1 y RPS2 interaccionan con la proteína guardián RIN4 y, cuando los efectores AvrRpm1, AvrB y AvrRpt2 de P. syringae son liberados al citoplasma de la célula vegetal, RIN4 es fosforilada en múltiples residuos de treonina, señal que activa a las proteínas R (Kim et al., 2005; Liu et al., 2011). De forma alternativa, las plantas pueden utilizar proteínas señuelo que comparten similitudes estructurales con las dianas de los efectores de patógenos y cuya interacción desencadena la activación de las proteínas R (Van der Hoorn y Kamoun, 2008). Aunque la determinación del rango de hospedador en la simbiosis Rhizobiumleguminosa se ha relacionado siempre con el reconocimiento de los factores Nod por parte de receptores transmembrana específicos de las leguminosas hospedadoras, existen estudios que demuestran la importancia del T3SS en este proceso. Se han identificado numerosos genes que codifican para proteínas R en diferentes variedades de soja, como Rj2 y Rfg1 (alelos de un mismo locus), Rj3 y Rj4. En algunos casos, el reconocimiento específico de ciertos efectores de rizobios por estas proteínas R desemboca en un bloqueo total de la nodulación (Hayashi et al., 2012; Yang et al., 2010). Así, B. elkanii USDA122 no es capaz de nodular la variedad Hardee de soja que presenta el gen Rj2 y algunas estirpes de S. fredii son incapaces de nodular las variedades de soja americanas que presentan el gen Rfg1 (Meinhardt et al., 1993; Tsukui et al., 2013). Estos dos genes codifican proteínas miembros de la clase TIR-
37 Introducción NBS-LRR (del inglés, Toll Interleukin Receptor – Nucleotide Binding Site-Leucine Rich Repeat), relacionados con la defensa contra patógenos (Yang et al., 2010). Al igual que ocurre con los receptores de membrana PRR, la elevada expresión de los genes R proporciona efectos negativos sobre la planta, por lo que esta expresión se encuentra muy controlada. Así, por ejemplo, en A. thaliana se ha determinado que la expresión de un determinado gen R es dependiente del ritmo circadiano y del momento de esporulación del hongo patógeno Hyaloperonospora arabidopsidis (Wang et al., 2011). La resistencia a la enfermedad mediada por los receptores o proteínas R de tipo NBLRR es efectiva contra los patógenos biotrofos obligados o hemibiotrofos, pero no para aquellos patógenos que matan a las células de los tejidos del organismo hospedador durante su colonización (Glazebrook, 2005). Algunos patógenos han conseguido suprimir las respuestas de defensa generadas por el reconocimiento de ciertos efectores por proteínas R a través de otros efectores traslocados mediante los sistemas de secreción. 3. 3. Respuestas de defensa activadas durante la PTI y la ETI. Como ya se ha comentado, el reconocimiento de los PAMP o MAMP dispara la PTI y, consecuentemente, se activan numerosas respuestas de defensas basales y transitorias (Tabla 3). Respecto a la relación simbiótica Rhizobium-leguminosa, algunos estudios han revelado que estos microorganismos deben poseer ciertos MAMP que activan las respuestas de defensa. Así, en las etapas más tempranas de la nodulación en los modelos L. japonicus y Medicago truncatula se inducen numerosos genes relacionados con la defensa y el estrés, lo que indica que en un primer momento la leguminosa reconoce a su hospedador como una potencial amenaza. Sin embargo, en etapas más avanzadas, estos genes se inhiben por mecanismos desconocidos hasta el momento y son activados los genes de nodulación (Maunoury et al., 2010; Moreau et al., 2011). Muchos patógenos se sirven de los efectores para suprimir estas respuestas de defensa y las plantas, a su vez, pueden reconocer ciertos efectores mediante las proteínas R dando lugar a la ETI, que es básicamente una respuesta PTI, pero más rápida y amplificada, y que suele dar lugar a una respuesta hipersensible (HR, del inglés Hypersensitive cell death Response). Algunos efectores mimetizan (y otros inhiben) las funciones celulares
38 Introducción eucariotas y ayudan a la supresión de uno a más componentes de la PTI o ETI. Existen muchos mecanismos que se solapan en las respuestas PTI y ETI. Sin embargo, se conoce que algunos efectores están dirigidos hacia la supresión de los mecanismos de respuesta producidos en la PTI y no en la ETI, y viceversa. El reconocimiento de los PAMP, MAMP (PTI) o de los efectores de los patógenos traslocados al interior de las células vegetales (ETI) dispara diversas respuestas de defensas tempranas, entre las que se incluyen el flujo de calcio, la activación de numerosas MAPK, la producción de ROS y la inducción de la síntesis de ET. A su vez, estos procesos se encuentran involucrados en la señalización de las respuestas intermedias y tardías que se dan durante el proceso de infección, como la expresión de numerosos genes de defensa, el engrosamiento de la pared celular, la biosíntesis de fitoalexinas, la respuesta hipersensible y, en ciertas ocasiones, la resistencia inducida. Además, en las partes de la planta que se encuentran alejadas de la zona de infección, puede desarrollarse una respuesta sistémica adquirida (SAR, del inglés, Systemic Acquired Resistance) que genera un aumento de la resistencia ante una posterior infección por el patógeno (Tabla 3) (Meng y Zhang, 2013). Tabla 3. Respuestas de defensas activadas durante las respuestas PTI y ETI. Respuestas de defensas activadas en la PTI y ETI Activación de las rutas de MAPK Activación de las cascadas de señalización intracelular asociadas al flujo de iones a través de la membrana plasmática Incremento del calcio intracelular Producción de ROS Producción de óxido nítrico Cambio en el estado de fosforilación de numerosas proteínas Deposición de calosa sobre la pared celular Cambios en el balance hormonal (etileno, ácido salicílico, etc.) Cierre de los estomas para evitar la entrada de patógenos por estas aberturas Reprogramación de la transcripción de numerosos genes de la planta, entre los que se encuentran genes de defensa Producción de compuestos antimicrobianos como las fitoalexinas Activación de la HR (normalmente asociada con la ETI) Activación de los genes PR Activación de la SAR (asociada principalmente con la ETI)
39 Introducción Activación de las rutas de MAPK. La inducción de las MAPK es uno de los primeros eventos de señalización disparado por los receptores PRR y las proteínas R tras el reconocimiento de los MAMP y los efectores, respectivamente. A su vez, este fenómeno se encuentra incluido en la compleja red de señalización que regula la activación de las respuestas de defensa a través de la fosforilación de proteínas diana, incluyendo diversas enzimas o factores de transcripción, controlando la síntesis y/o la señalización de las hormonas de defensa, reprogramando la expresión de diversos genes o dirigiendo el flujo metabólico hacia la síntesis de metabolitos antimicrobianos, entre otras respuestas. La activación de las MAPK se lleva a cabo por las MAPKK a través de la fosforilación de una treonina (Thr) y una tirosina (Tyr) sobre el dominio de activación Thr-X-Tyr. Al mismo tiempo, las MAPKK se encuentran reguladas mediante su activación por las MAPKK quinasas (MAPKKK, del inglés, Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase Kinase/s) a través de la fosforilación de dos residuos serina/treonina (Ser/Thr) en el bucle de activación Ser/Thr-X3−5-Ser/Thr de las MAPKK, aunque el conocimiento sobre este grupo de quinasas es muy escaso. Las cascadas que conforman estos tres grupos de quinasas, conocido como cascadas de las MAPK, son importantes en la modulación de la función tras el reconocimiento de las señales por los receptores o sensores, para así convertir estas señales en respuestas de señalización eucariotas. A. thaliana es la planta modelo en la que se ha estudiado más en profundidad las rutas de las MAPK. Así, entre las MAPK más conocidas se encuentran la MPK3 y la MPK6 (subgrupo A), que están implicadas en la respuesta a distintos estreses bióticos y abióticos y en el crecimiento y desarrollo de la planta. Estas proteínas son ortólogas a SIPK y WIPK de tabaco. Otro grupo de MAPK, MPK4 y MPK11 (subgrupo B), regulan las respuestas de defensa frente a patógenos, las respuestas abióticas y juega un papel esencial en la división celular (Kosetsu et al., 2010; Meng y Zhang, 2013). Entre las MAPKK mejor caracterizadas se encuentran MKK1 y MKK2 (subgrupo A), que activan a MPK4 en respuesta a patógenos, salinidad o frío. Otro grupo de estas quinasas son MKK4 y MKK5 (subgrupo C), que activan a MPK3 y MPK6 para regular el desarrollo de la planta y las respuestas de defensa. Incluso se ha observado que la activación de MPK6 a través de MKK3 (subgrupo B) está implicada en la regulación de la producción de ácido jasmónico (JA, del inglés, Jasmonic Acid) en A. thaliana.
40 Introducción En general, se han descrito dos rutas principales de MAPK involucradas en la defensa de la planta, aunque el efecto sobre la regulación de las respuestas de defensa por cada una de las rutas depende de la especie vegetal. Así, se ha establecido una de las vías como la interacción entre las quinasas MKK4/MKK5 y MPK3/MPK6 y, por el otro, la existencia de otra ruta comúnmente denominada MKK1-MKK2/2-MPK4. Ambas rutas regulan finalmente la actividad del factor de transcripción WRKY33, perteneciente a la familia de los reguladores WRKY, y que activa la transcripción de genes relacionados con la defensa. La quinasa MPK6 de A. thaliana y de N. tabacum regula positivamente las respuestas de defensa. Además, la quinasa MPK4 se considera un regulador negativo de la señalización mediante la producción de SA y ROS en las respuestas de defensa y como regulador positivo en el crecimiento y desarrollo de la planta en A. thaliana y en G. max (Liu et al., 2011; 2014). Numerosos receptores PRR activan la señalización por MAPK cuando éstos reconocen los PAMP o MAMP (PTI), como el receptor FLS2, que reconoce el péptido de 22 aminoácidos (flg22) procedente de la flagelina bacteriana (Gomez-Gomez y Boller, 2000), y el receptor EFR (del inglés, Elongation Factor EF-Tu Receptor), que reconoce al factor de elongación Tu (elf18) de bacterias. En A. thaliana los elicitores flg22 y elf18 tienen la capacidad de disparar una fuerte y transitoria activación de MPK3, MPK6, MPK4 y MPK11. Posteriormente, se describió que estas quinasas se activan también por la quitina de hongos y los peptidoglicanos de las bacterias, reconocidos por los receptores CERK1 y LYM1, respectivamente. Además, los estudios en tomate y en tabaco han revelado que la activación de las MAPK mediante la detección de los efectores de los patógenos por las proteínas R es un proceso esencial en la ETI, como ocurre con el efector Avr9 de hongos, que activa las MAPK SIPK y WIPK en plantas de tabaco transgénicas que expresan el gen de resistencia (R) Cf-9 (Oh y Martin, 2011). En A. thaliana, MPK3 y MPK6 también están implicadas en la ETI, ya que, por ejemplo, la presencia del efector AvrRpt2 de P. syringae dispara de forma prolongada la activación de estas dos MAPK (Underwood et al., 2007). Sin embargo, también existen efectores que interfieren en la ruta de las MAPK. Este es el caso del efector YopJ de Y. pestis, homólogo a NopJ de S. fredii NGR234, que posee función cisteína proteasa y se ha determinado que inhibe la ruta de las MAPK del organismo hospedador (Freiberg et al., 1997; Orth, 2002) Además, se trata de un efector Avr, ya que es reconocido por la célula eucariota, disparando la respuesta ETI, lo que parece
41 Introducción tener relación con el efecto altamente negativo que se produce sobre la nodulación cuando NopJ se encuentra presente. Por todo ello, NopJ podría ser también detectado por proteínas R de la célula eucariota (Yang et al., 2010). Incremento del calcio citosólico y producción de ROS. Tanto en la PTI como en la ETI se genera un rápido incremento del calcio citosólico, disparándose de forma más intensa en el segundo caso. La acumulación de calcio se puede producir a través de la entrada de este ión al interior de la célula o por la salida de éste desde orgánulos de reserva, como el retículo endoplasmático o la vacuola. El reconocimiento de los rizobios por sus plantas hospedadoras también dispara un incremento intracelular del calcio, sin embargo, éste es crucial para el desarrollo y la formación del nódulo, por lo que deben existir mecanismos específicos que deriven la señalización por calcio hacia la activación del proceso de nodulación sin desencadenar las respuestas de defensa. Tras la acumulación de calcio se suelen generan ROS, como el ión superóxido o el peróxido de hidrógeno. La función de las ROS no solo es la de romper la pared celular del patógeno para así frenar su colonización, sino que también se requerieren para la activación de la transcripción de numerosos genes de defensa (Wu et al., 2014). En el caso de la relación simbiótica Rhizobium-leguminosa, la acumulación del calcio citosólico y la producción de ROS (especialmente el peróxido de hidrógeno) forman parte del proceso de nodulación, aunque las ROS pueden actuar también como compuestos antimicrobianos para controlar las infecciones de los patógenos. La expresión de NopM de S. fredii NGR234 en células de tabaco inhibe la respuesta de defensa mediada por la producción de ROS, por lo que pueden existir mecanismos, como los efectores del T3SS, que modulen la intensidad de la respuestas a través de ROS (Xin et al., 2012). Balance hormonal. El SA y el JA son importantes moléculas de señalización en la defensa de las plantas contra los patógenos biotrofos y necrotrofos, respectivamente (Glazebrook, 2005). Incluso, se ha determinado que la señalización entre el JA y el SA pueden comprometerse recíprocamente, por lo que en los tejidos vegetales normalmente se activa la señalización por JA o SA, pero no ambas al mismo tiempo (Grant y Jones,
42 Introducción 2009). El JA, en solitario, activa las respuestas desencadenadas por heridas o por herbívoros, en cambio, si el JA y el ET se encuentran presentes al mismo tiempo, ambos actúan en las defensas contra los patógenos necrotrofos. Además, el ET se encuentra implicado en la activación de las respuestas de defensa contra algunos patógenos biotrofos y hemibiotrofos (Adie et al., 2007), lo que pone de manifiesto que la compleja red de señalización hormonal involucrada en la defensa varía dependiendo del tipo de interacción patógeno-planta y, posiblemente, de la especie vegetal y bacteriana (o patógenos eucariotas). Debido a que el balance entre JA y SA determina si la planta sucumbe o no a la infección por un patógeno, algunos de los microorganismos han evolucionado con el fin de poder cambiar los niveles de hormonas en la planta para su propio beneficio, ya sea actuando directamente sobre ellas o indirectamente a través de la modulación de su producción, de su actividad o de la señalización de otras hormonas. Así, el efector XopD, homólogo a NopD de los rizobios, modula la transcripción de los genes del hospedador, reprimiendo la expresión de los genes responsables de la producción de SA y JA (Hotson et al., 2003; Kim et al., 2008). En las leguminosas, las hormonas no solo juegan un papel importante en el crecimiento, desarrollo y defensa de la planta, sino que son esenciales en el proceso de la nodulación. El efecto negativo del SA sobre la nodulación ha sido documentado en multitud de trabajos y, de hecho, las leguminosas pueden responder a los rizobios no compatibles incrementando los niveles de SA (Martinez-Abarca et al., 1998). Stacey et al. (2006) demostraron que las rutas de defensa mediadas por SA juegan un papel importante en el control de la formación del nódulo, tanto en leguminosas que forman nódulos determinados como en las que forman nódulos indeterminados. Respuesta hipersensible o HR. La HR es una muerte rápida de las células vegetales y se encuentra ligada a los mecanismos de muerte celular programada y al refuerzo de la pared celular vegetal. La HR se localiza en la zona de infección y tiene como fin restringir la colonización del patógeno, limitando, entre otras cosas, la cantidad de nutrientes disponibles. Esta respuesta es precedida por el aumento de los niveles de calcio que se da en el citoplasma de la célula infectada y la posterior producción de óxido nítrico (NO, del inglés, Nitric Oxide) y de ROS, lo que finalmente conlleva al incremento de la concentración de SA
43 Introducción local y la expresión de proteínas PR (Delledone, 2005). Además, estudios recientes han determinado que durante la HR en plantas de tomate se requiere una gran demanda energética y que los factores de transcripción WRKY son los reguladores más importantes de esta respuesta (Etalo et al., 2013). Aunque las respuestas de tipo HR suelen asociarse a la respuesta ETI, se ha documentado que la acumulación de ROS puede generar una HR en interacciones Rhizobium-leguminosa con el fin de evitar la entrada de un gran número de bacterias o de otras especies no compatibles (Parniske et al., 1990; Santos et al., 2001; Vasse et al., 1993). Respuesta sistémica. La señalización dependiente de SA no sólo es fundamental para establecer la resistencia local frente a la infección por los patógenos como ocurre durante la HR, sino que es es también esencial para la resistencia sistémica. El mecanismo más extendido involucrado en la resistencia sistémica de las plantas es la resistencia sistémica adquirida o SAR, que se da en los tejidos alejados de la zona local de infección y que le confiere una mayor resistencia a la planta a futuras infecciones. Así, la infección local por un patógeno desencadena la producción de las señales inmunes móviles, como son el ácido metilsalicílico (MeSA, del inglés, Methyl Salicylic Acid), el ácido azelaico, el glicerol-3-fosfato (G3P) y las proteínas de transferencia de lípidos DIR1 y AZI1. Estas señales móviles son transportadas a través del sistema vascular hacia las zonas no infectadas y, mediante un mecanismo desconocido, inducen la acumulación de SA, que es la molécula señal necesaria para que se de la SAR. De esta forma, la acumulación de SA induce la secreción de las proteínas PR, con función antimicrobiana, en células de zonas no infectadas, y la metilación de las histonas y otras modificaciones de la cromatina, que prepara a los genes relacionados con la inmunidad para aumentar su expresión y establecer la memoria inmune, proceso que depende en gran medida del regulador transcripcional NPR1 (Dong, 2004). Este regulador transcripcional, además, reprime diversos genes implicados en procesos celulares básicos, como los responsables del proceso fotosintético, para así priorizar las respuestas del sistema inmune a costa del crecimiento de la planta, o la nodulación, en el caso de la relaciones simbióticas (Peleg- Grossman et al., 2009; Sugano et al., 2010).
44 Introducción Existe otro mecanismo de activación de la resistencia sistémica en plantas denominado respuesta sistémica inducida o ISR (del inglés, Induced Systemic Resistance) y, además, se ha probado que también protege de una posterior invasión de un agente patógeno. Este proceso, a diferencia de la SAR, puede ser independiente de SA y de la expresión de los genes PR y se suele desarrolladar en respuesta a ciertas bacterias no patógenas o PGPR (del inglés, Plant Growth Promoting Rhizobacteria) (Van der Ent et al., 2009; Van Wees et al., 2008). Kosslak y Bohlool (1984) observaron que la respuesta de defensa de la planta inducida por la infección con un rizobio se transmitía desde las raíces infectadas a las no infectadas, impidiendo una infección posterior. En la relación Rhizobium-leguminosa, el proceso de autorregulación de la nodulación o AON presenta ciertas similitudes con la ISR y la SAR, ya que, en todos los casos, la infección localizada en determinadas zonas de la planta (en los rizobios habitualmente localizada en la zona de los pelos emergentes de la raíz) desencadena una resistencia a posteriores infecciones en otras partes más alejadas de la planta (Durrant y Dong, 2004; Van Wees et al., 2008; Vlot et al., 2009). Existen evidencias que conectan la AON con la señalización de las respuestas de defensa, como la hipersensibilidad al ataque por patógenos o nematodos de numerosos mutantes afectados en la AON (Lohar y Bird, 2003; Tazawa et al., 2007). Además, en la soja se ha demostrado que la expresión de un conjunto de genes PR se encuentra regulado por el receptor de la AON GmNARK (Kinkema y Gresshoff, 2008). Parece evidente que el mecanismo de la AON permite a las leguminosas mantener el balance simbiótico, suprimiendo la invasión bacteriana y la nodulación excesiva a través de la activación de las respuestas de defensa para mantener el balance entre los beneficios y los costes de esta relación mutualista. Proteínas PR, proteínas relacionadas con la defensa. Entre las proteínas PR se incluyen enzimas (como la β-1,3 glucanasa y la quitinasa) y defensinas, las cuales poseen potentes actividades antimicrobianas mediante la hidrólisis de la pared celular de los patógenos o la rotura de sus membranas, respectivamente. Su síntesis está inducida por distintas señales sistémicas inmunes, ya sea a través de una infección o, por ejemplo, por el incremento de SA en ausencia de un patógeno. Además, se requiere la regulación de un gran número de proteínas del retículo
45 Introducción endoplasmático para asegurar el plegamiento, el transporte y la secreción de estas proteínas PR (Spoel y Dong, 2012). Existen 14 clases de proteínas PR (PR1-PR14) en las plantas. Sin embargo, el conjunto de proteínas PR que se expresa en una determinada planta varía dependiendo del patógeno y de la molécula señal. En general, la expresión de los genes PR de G. max, GmPR1 y GmPR5, es dependiente de SA, mientras que la del gen GmPR2 depende de ET y la del gen GmPR3 de JA y, en menor medida de ET (Mazarei et al., 2007). López-Baena et al. (2009) demostraron que un mutante de la estirpe HH103 de S. fredii incapaz de secretar efectores provoca el aumento de la expresión del gen de defensa PR1 en las raíces y las hojas de plantas de G. max, indicando que el conjunto de MAMP de esta estirpe es capaz de activar las respuestas de defensa de la planta de forma sistémica y que el T3SS es responsable de la supresión de estas respuestas. Además, el efector NopL de S. fredii NGR234 parece suprimir la expresión de proteínas PR en tabaco, indicando que ciertos efectores rizobianos pueden intervenir en la supresión de las respuestas defensivas de la planta (Bartsev et al., 2004).
52 Material y Métodos Tabla 4 (B). Estirpes derivadas de Agrobacterium tumefaciens CV3101 utilizadas en esta Tesis. Agrobacterium tumefaciens CV3101 Estirpe silvestre, RifR Rotino y Gleddie, 1990 Estirpe Características relevantes Referencia CV3101 (pEG100) CV3101 con el vector de transformación en plantas pEG100 que no expresa la proteína YFP ni el epitopo HA. Contiene el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor, RifR, KmR Cedido por la Dra. Ma CV3101 (pEG104) CV3101 con el vector de transformación en plantas pEG104 que expresa la proteína YFP. Contiene el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor, RifR, KmR Cedido por la Dra. Ma CV3101 (pMUS1253) CV3101 con el plásmido pEG101 que porta el gen nopI de S. fredii HH103, clonado a través del sistema Gateway (Invitrogen). Contiene los genes que codifican la YFP y el epitopo HA, RifR, KmR Esta Tesis CV3101 (pMUS1250) CV3101 con el plásmido pEG101 que porta el gen nopL de S. fredii HH103, clonado a través del sistema Gateway (Invitrogen). Contiene los genes que codifican la YFP y el epitopo HA, RifR, KmR Esta Tesis CV3101 (pMUS1252) CV3101 con el plásmido pEG101 que porta el gen nopP de S. fredii HH103, clonado a través del sistema Gateway (Invitrogen). Contiene los genes que codifican la YFP y el epitopo HA, RifR, KmR Esta Tesis * Epitopo HA (del inglés, Human influenza hemaglutinin): se utiliza para marcar en el extremo amino o carboxilo terminal de una determinada proteína, para ser analizada mediante métodos inmunológicos. El epitopo HA está definido por la secuencia de aminoácidos YPYDVPDYA.
53 Material y Métodos Tabla 4 (C). Estirpes derivadas de Escherichia coli utilizadas en esta Tesis. Escherichia coli DH5α SupE44, lacU169, 5hsdR17, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, relA1, NxR Sambrook et al., 1989 Estirpe Características relevantes Referencia DH5α (pAB2001) Plásmido que contiene el cassette lacZ-GmR, ApR, GmR Becker et al., 1995 DH5α (pGEM-T Easy) Vector de clonación de productos de PCR, ApR Promega (EEUU) DH5α (pHP45) Plásmido que contiene el interposón , SpcR/StrR, ApR Prentki y Krisch, 1984 DH5α (pK18mob) Vector de clonación suicida en los rizobios, KmR Schäfer et al., 1994 DH5α (pK18mobsac) Vector de clonación que contiene el gen de sensibilidad a la sacarosa. Suicida en los rizobios, KmR Schäfer et al., 1994 DH5α (pMP92) Vector de clonación de amplio rango de hospedador IncP, TcR Spaink et al., 1987 DH5α (pRK2013) Plásmido coadyuvante, KmR Figurski y Helinski, 1979 DH5α (pMBL-T) Vector de clonación de productos de PCR, ApR Dominion- MBL (España) DH5α (pBBR1 MCS-5) Vector de clonación de amplio rango de hospedador, GmR Kovach et al., 1995 DH5α (pBluescript II SK (+/-) phagemid) Vector de clonación de productos de PCR, ApR Stratagene (EEUU) DH5α (pGEX 4T-1) Vector de expresión en bacterias de proteínas de fusión a la GST, ApR GE Healthcare (Inglaterra)
54 Material y Métodos Tabla 4 (C). Estirpes derivadas de Escherichia coli utilizadas en esta Tesis. Estirpe Características relevantes Referencia DH5α (pGML10) Vector de expresión en S. cerevisiae. Contiene el epitopo Myc, ApR BioTechniqu es (EEUU) DH5α (FLUX) Vector que contiene los genes luxCDABE de V. fisheri Cedido por el Dr. Cámara DH5α (pMUS1205) Plásmido pGEM-T Easy que porta un fragmento de PCR de ~0,3 kb que contiene la caja tts del operón nopC-nopA de S. fredii HH103, ApR EstaTesis DH5α (pMUS1199) Plásmido pMP92 que porta un fragmento de ~3,3 kb que contiene los genes luxABCDEF proveniente del vector FLUX, TcR Esta Tesis DH5α (pMUS1207) Plásmido pMUS1199 que porta un fragmento EcoRI/HindIII proveniente de pMUS1205 de ~0,3 kb que contiene la caja tts del operón nopC-nopA de S. fredii HH103, TcR Esta Tesis Construcciones que portan el gen nopC DH5α (pMUS1163) Plásmido pGEM-T Easy que porta un fragmento de PCR de ~1,1 kb con dianas BamHI y HindIII en los extremos y que contiene el gen nopC delecionado de S. fredii HH103, ApR Esta Tesis DH5α (pMUS1192) Plásmido pK18mobsac que porta un fragmento BamHI/HindIII de ~1,1 kb procedente de pMUS1163 que contiene el gen nopC delecionado de S. fredii HH103, KmR Esta Tesis DH5α (pMUS986) Plásmido pMP92 que porta los genes nopC y nopA de S. fredii HH103, TcR López- Baena, 2008 DH5α (pMUS1239) Plásmido pDONR207 que porta un fragmento de ~0,3 kb que contiene el gen nopC de S. fredii HH103 sin codón de stop clonado a través del sistema Gateway (Invitrogen), GmR Esta tesis DH5α (pMUS1290) Plásmido pLMS150 que porta un fragmento de ~0,3 kb que contiene el gen nopC de S. fredii HH103 sin codón de stop a partir de pMUS1239 clonado a través del sistema Gateway (Invitrogen), TcR Esta tesis DH5α (pMUS1291) Plásmido pK18mob que porta un fragmento de ~1,5 kb que contiene la fusión nopC-cya clonada en el punto EcoRI/BamHI, KmR Esta Tesis
55 Material y Métodos Tabla 4 (C). Estirpes derivadas de Escherichia coli utilizadas en esta Tesis. Estirpe Características relevantes Referencia DH5α (pMUS1186) Plásmido pGML10 que porta un fragmento XbaI/KpnI de ~0,3 kb que contiene el gen nopC de S. fredii HH103, ApR Esta tesis Construcciones que portan el gen nopI (DH5α) pMUS1165 Plásmido pGEM-T Easy que porta un fragmento de PCR de ~0,9 kb con dianas para BamHI y HindIII que contiene el gen nopI delecionado de S. fredii HH103, ApR Esta Tesis (DH5α) pMUS1171 Plásmido pK18mobsac que porta un fragmento EcoRI de ~0,9 kb procedente de pMUS1165 que contiene el gen nopI delecionado de S. fredii HH103, KmR Esta Tesis (DH5α) pMUS1127 Plásmido pGEM-T Easy que porta un fragmento de PCR de ~1,7 kb que contiene el gen nopI de S. fredii HH103, ApR Esta Tesis (DH5α) pMUS1215 Plásmido pMP92 que porta un fragmento EcoRI de ~1,7 kb procedente de pMUS1127 que contiene el gen nopI de S. fredii HH103, TcR Esta Tesis (DH5α) pMUS1245 Plásmido pDONR207 que porta un fragmento de ~0,85 kb que contiene el gen nopI de S. fredii HH103 sin codón de stop clonado a través del sistema Gateway (Invitrogen), GmR Esta Tesis (DH5α) pMUS1253 Plásmido pEG101 que porta un fragmento de ~0,85 kb que contiene el gen nopI de S. fredii HH103 clonado a través del sistema Gateway a partir de pMUS1245, KmR Esta Tesis Construcciones que portan el gen nopL DH5α (pMUS1007) Plásmido pK18mob que porta un fragmento de ~1,1 kb que contiene el gen nopL de S. fredii HH103, KmR Cedido por la Dra. Cubo DH5α (pMUS1095) Plásmido pMUS1007 con el interposón Ω inserto en el punto EcoRV situado en el gen nopL, KmR, SpcR Esta Tesis DH5α (pMUS1145) Plásmido pMBL que porta un fragmento de PCR de ~2,2 kb que contiene el gen nopL de S. fredii HH103, ApR Esta Tesis DH5α (pMUS1191) Plásmido pMP92 que porta un fragmento BamHI/HindIII de 2,2 ~kb procedente de pMUS1145 que contiene el gen nopL de S. fredii HH103, TcR Esta Tesis
56 Material y Métodos Tabla 4 (C). Estirpes derivadas de Escherichia coli utilizadas en esta Tesis. Estirpe Características relevantes Referencia DH5α (pMUS1243) Plásmido pDONR207 que porta un fragmento de ~1,1 kb que contiene el gen nopL de S. fredii HH103 sin codón de stop, clonado a través del sistema Gateway (Invitrogen), GmR Esta Tesis DH5α (pMUS1250) Plásmido pEG101 que porta el gen nopL de HH103 clonado a través del sistema Gateway (Invitrogen), RifR, KmR Esta Tesis DH5α (pMUS1259) Plásmido pLMS150 que porta un fragmento de ~1,1 kb que contiene el gen nopL de S. fredii HH103 sin codón de stop a partir de pMUS1243 clonado a través del sistema Gateway (Invitrogen), TcR Esta tesis DH5α (pMUS1294) Plásmido pK18mob que porta un fragmento de ~2,2 kb que contiene la fusión nopL-cya clonada en el punto BamHI/HindIII, proveniente de la amplificación por PCR a partir de pMUS1259, KmR Esta Tesis DH5α (pMUS1183) Plásmido pGML10 que porta un fragmento XbaI/KpnI de ~1,1 kb procedente de pMUS1180 que contiene el gen nopL de S. fredii HH103, ApR Esta Tesis Construcciones que portan el gen nopP DH5α (pMUS1149) Plásmido pDONR207 que porta un fragmento de ~0,8 kb que contiene el gen nopP de S. fredii HH103 clonado a través del sistema Gateway (Invitrogen), GmR Esta Tesis DH5α (pMUS1157) Plásmido pGEX KG que porta un fragmento de ~0,8 kb que contiene el gen nopP de S. fredii HH103 clonado a través del sistema Gateway (Invitrogen) a partir de pMUS1149, ApR Esta Tesis DH5α (pMUS1238) Plásmido pDONR207 que porta un fragmento de ~0,8 kb que contiene el gen nopP de S. fredii HH103, sin codón de stop, clonado a través del sistema Gateway (Invitrogen), GmR Esta Tesis DH5α (pMUS1252) Plásmido pEG101 que porta un fragmento de ~0,8 kb que contiene el gen nopP de S. fredii HH103 clonado a través del sistema Gateway (Invitrogen) a partir de pMUS1238, KmR Esta Tesis
57 Material y Métodos Tabla 4 (C). Estirpes derivadas de Escherichia coli utilizadas en esta Tesis. Estirpe Características relevantes Referencia DH5α (pMUS1184) Plásmido pGML10 que porta un fragmento XbaI/KpnI de ~0,8 kb que contiene el gen nopP de S. fredii HH103, ApR Esta tesis * El epitopo Myc se utiliza para el marcaje de proteínas. Los anticuerpos anti c-Myc reconocen proteínas sobreexpresadas que están marcadas con el epitopo en su extremo amino o carboxilo terminal. Este epitopo se encuentra definido por la secuencia de aminoácidos EQKLISEEDL. Escherichia coli BL21 fhuA2 [lon] ompT gal [dcm] ΔhsdS Studier y Moffatt, 1986 Plásmido Características relevantes Referencia BL21 (pGEX 4T-1) Vector de expresión en bacterias de genes fusionados al gen gst, ApR Amersham (Reino Unido) BL21 (pMUS1135) Plásmido pGEX 4T-1 que porta un fragmentoBamHI/EcoRI de ~1,1 kb que contiene el gen nopL de S. fredii HH103 Esta Tesis BL21 (pMUS1157) Plásmido pGEX KG que porta un fragmento de ~0,8 kb que contiene el gen nopP de S. fredii HH103 clonado a través del sistema Gateway (Invitrogen) a partir de pMUS1149, ApR Esta Tesis BL21 (pMUS1261) Plásmido pGEX KG que porta un fragmento de ~0,85 kb que contiene el gen nopI de S. fredii HH103 clonado a través del sistema Gateway (Invitrogen) a partir de pMUS1148, ApR Esta Tesis BL21 (pMUS1263) Plásmido pGEX KG que porta un fragmento de ~0,16 kb que contiene la secuencia amino terminal previa a la secuencia aminoacídica EPPIYE del gen nopI de S. fredii HH103 clonado a través del sistema Gateway (Invitrogen), ApR Esta Tesis BL21 (pMUS1296) Plásmido pGEX KG que porta un fragmento de ~0,7 kb que contiene la secuencia de ADN correspondiente a la secuencia carboxilo terminal situada tras la secuencia aminoacídica EPPIYE del gen nopI de S. fredii HH103, clonado a través del sistema Gateway (Invitrogen), ApR Esta Tesis
58 Material y Métodos Tabla 4 (C). Estirpes derivadas de Escherichia coli utilizadas en esta Tesis. Escherichia coli DB3.1 F- gyrA462 endA1 glnV44 Δ(sr1-recA) mcrB mrr hsdS20(rB-, mB-) ara14 galK2 lacY1 proA2 rpsL20(Smr) xyl5 Δleu mtl1 Invitrogen (EEUU) Plásmido Características relevantes Referencia DB3.1 (pDONR207) Plásmido de clonación primaria para la reacción BP del sistema Gateway, GmR Invitrogen (EEUU) DB3.1 (pGEX KG) Plásmido de destino para la clonación mediante la reacción LR del sistema Gateway (Invitrogen) para la expresión de proteínas de fusión a GST, ApR Cedido por el Dr. Monreal DB3.1 (pEG100) Vector de transformación en plantas a través de Agrobacterium. No expresa ni la YFP ni el epitopo HA. Contiene el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor, KmR Earley et al., 2006 DB3.1 (pEG101) Vector de transformación en plantas a través de Agrobacterium para la expresión de proteínas de fusión a YFP y al epitopo HA. Contiene el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor, KmR Earley et al., 2006 DB3.1 (pEG104) Vector de transformación en plantas a través de Agrobacterium para la expresión de proteínas de fusión a YFP. Contiene el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor, KmR Earley et al., 2006 DB3.1 (pLMS150) Plásmido de destino para la clonación mediante la reacción LR del sistema Gateway (Invitrogen) para la expresión de proteínas de fusión a la adenilato ciclasa (Cya), TcR Cedido por la Dra. Schechter Ap: ampicilina, Gm: gentamicina, Km: kanamicina, Nx: ácido nalidíxico, Spc: espectinomicina, Str: estreptomicina, Tc: tetraciclina, Rif: rifampicina Tabla 4 (D). Otras estirpes utilizadas en esta Tesis. Otras especies Especie Estirpe Referencia Acinetobacter sp. ADPWH_lux Huang et al., 2006 Pseudomonas syringae pv. glycinea Fett y Sequeira (1981)
59 Material y Métodos 1. 1. 2. Agentes selectivos e identificativos y flavonoides. Para la selección e identificación de las diferentes estirpes bacterianas y plásmidos se utilizaron los siguientes agentes selectivos (Sigma Aldrich, EEUU): Agente selectivo Solución stock (mg mL-1) S. fredii (μg mL-1) E. coli (μg mL-1) A. tumefaciens CV3101 Ampicilina (Ap) 100 - 100 - Espectinomicina (Spc) 50 50 100 - Gentamicina (Gm) 50 5-50 10 - Kanamicina (Km) 30 60 30 50 Ácido nalidíxico (Nal) 10 10 20 - Rifampicina (Rif) 25 50 25 50 Tetraciclina (Tc) 10 1-2 10 - X-gal * 20 40 40 - Sacarosa 12,5% *(5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido) La rifampicina se disolvió en metanol, la tetraciclina en etanol al 70% y el ácido nalidíxico en una solución de NaOH 0,1 M. Los demás antibióticos se disolvieron en agua. La temperatura de almacenamiento de los antibióticos fue de -20 ºC. El X-gal (Roche, Suiza) se disolvió en N, N-dimetilformamida (20 mg mL-1) y también se conservó a -20 ºC. La isoflavona genisteína (Sigma Aldrich, EEUU) se preparó a una concentración de 1 mg mL-1 en etanol absoluto y se añadió a los cultivos para alcanzar una concentración final de aproximadamente 3,7 M. La temperatura de almacenamiento fue de -20 ºC. 1. 2. Medidas de pH, densidad óptica y solución de congelación. El pH de las soluciones se midió con un pH-metro modelo micropH 2001 (Crison, España). Para realizar las medidas espectrofotométricas se empleó el espectrofotómetro Novaspec II (Pharmacia LKB, Suecia) y el lector de placas Synergy HT (BioTek, EEUU). Para conservar las estirpes bacterianas durante largos periodos de tiempo se utilizó una solución de congelación. Tras cultivar las bacterias en los medios apropiados, la biomasa procedente de 5 mL de cultivo se resuspendió en 1,5 mL de una solución compuesta de peptona al 0,5% (m/v) y de glicerol al 15% (v/v) que se esterilizó en el autoclave durante 20 minutos a una atmósfera de sobrepresión (121 ºC). Las bacterias así preparadas se conservaron a -80 ºC.
60 Material y Métodos 1. 3. Medios de cultivo. 1. 3. 1. Medios de cultivo para Sinorhizobium. Las estirpes de Sinorhizobium se cultivaron en los medios que se detallan a continuación. Los cultivos líquidos se incubaron en agitación a 180 r.p.m.. Los medios se solidificaron, cuando fue necesario, añadiendo 20 g L-1 de agar. En ambos casos la temperatura de incubación fue de 28 ºC. Medio TY (Behringer, 1974) Extracto de levadura 3 g Triptona 5 g CaCl22H2O 0,65 g H2Odestilada Completar hasta 1 L El pH se ajustó a 6,8-7,0 y el medio se esterilizó en el autoclave durante 20 minutos a una atmósfera de sobrepresión (121 ºC). Medio YM (Vincent, 1970) K2HPO4 500 mg MgSO47H2O 200 mg NaCl 100 mg Extracto de levadura 400 mg Manitol 10 g H2O destilada Completar hasta 1 L El pH se ajustó a 6,8-7,0 y el medio se esterilizó en elautoclave durante 20 minutos a una atmósfera de sobrepresión (121 ºC). 1. 3. 2. Medios de cultivo para Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens CV3101 y Acinetobacter sp. ADP1. Para cultivar estas estirpes se utilizó el medio rico de Luria-Bertani (LB). Los cultivos líquidos se incubaron en agitación a 180 r.p.m.. Los medios se solidificaron, cuando fue necesario, añadiendo 20 g L-1 de agar. En ambos casos la temperatura de incubación fue de 37 ºC. LB (Maniatis et al., 1982) Extracto de levadura 5 g Triptona 10 g NaCl 5 g H2O destilada Completar hasta 1 L El pH se ajustó a 6,8-7,0 y el medio se esterilizó en elautoclave durante 20 minutos a una atmósfera de sobrepresión (121 ºC).
61 Material y Métodos 1. 4. Métodos relacionados con los ácidos nucleicos bacterianos. 1. 4. 1. Métodos de transferencia de ADN. 1. 4. 1. 1. Conjugación bacteriana. Conjugación usando el plásmido pK18mob. Se utilizó para transferir plásmidos desde distintas estirpes de E. coli a Sinorhizobium mediante la metodología descrita por Simon (1984). Para ello, se mezclaron en un tubo eppendorf los siguientes volúmenes de cultivos: 800 µL del cultivo de la estirpe de Sinorhizobium receptora, 200 µL de un cultivo en fase logarítmica de la estirpe de E. coli donadora del plásmido y 100 µL de un cultivo en fase logarítmica de la estirpe de E. coli, portadora del plásmido pRK2013, que actuó como coadyuvante en la transferencia de los plásmidos. A continuación, la mezcla se centrifugó durante 5 minutos a 11000 g. El sobrenadante se retiró con cuidado y las células se resuspendieron en 200 µL de agua destilada estéril, volviendo a centrifugar a 11000 g durante 2 minutos para retirar los restos de antibióticos. Seguidamente, se retiró el sobrenadante dejando alrededor de 75 µL para resuspender el pellet. Este pellet resuspendido se colocó en el centro de una placa con medio TY sin antibióticos. La placa se incubó a 28 ºC durante no más de 24 horas. La masa celular desarrollada se recogió y se resuspendió en 1 mL de glicerol-peptona. Posteriormente se realizaron las diluciones apropiadas para sembrar placas de TY con los antibióticos adecuados y así seleccionar las estirpes transconjugantes. Las colonias desarrolladas se purificaron por sucesivas siembras en el mismo medio selectivo. La construcción de los mutantes por deleción mediante PCR solapante (apartado 1. 4. 11. de Material y Métodos) se llevó a cabo utilizando el plásmido pK18mobsac. Una vez conjugados los plásmidos con el protocolo descrito anteriormente, se seleccionaron las estirpes transconjugantes de Sinorhizobium que fueron sensibles a sacarosa y resistentes a kanamicina (simples recombinantes). Estas estirpes se inocularon en 5 mL del medio TY y se incubaron durante alrededor de 4 días en agitación a 28 ºC. Transcurrido ese tiempo, se sembraron alícuotas de 100 µL, provenientes de diluciones seriadas del cultivo crecido, en placas de TY con sacarosa y éstas se incubaron a 28 ºC. Una vez que las colonias resistentes a sacarosa crecieron, se picaron en placas de TY en presencia o ausencia de kanamicina. De esta forma se seleccionaron los dobles recombinantes, es decir, aquellos que presentaron resistencia a la sacarosa y sensibilidad a la kanamicina.
68 Material y Métodos concentración de 0,2 μM, dNTPs a 0,2 mM, tampón de PCR 1X y 0,1 U de la enzima polimerasa. Las polimerasas usadas fueron: Taq polimerasa (New England Biolabs, EEUU), iTaq (Invitrogen, EEUU) y Velocity DNA polimerasa (Bioline, Inglaterra). Los cebadores utilizados para la amplificación de fragmentos de ADN para su posterior clonación (Tablas 5 y 6) se diseñaron con una longitud de alrededor de 20 pb, excepto los usados para clonaciones a través del sistema Gateway (Invitrogen) y para la deleción de genes mediante PCR solapante, que fueron de mayor longitud. En todos los casos, éstos fueron diseñados manualmente o utilizando el programa informático GeneFisher 1.22 (http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher/), teniendo en cuenta las siguientes características: a. El porcentaje de G + C estuviera comprendido entre 55-65%. b. La temperatura de fusión (Tm) estuviera comprendida entre 55-65 ºC. c. El no auto apareamiento de los cebadores.
69 Material y Métodos Tabla 5. Cebadores utilizados en esta Tesis para amplificar fragmentos de ADN destinados para clonación. Nombre Secuencia (5´- 3´) pb Tm (ºC) Omegaint-F GCGAGGGCTTTACTAAGCTGA 21 57 Omegaint-R GGGCCTTGATGTTACCCGAGA 21 59,1 ttsboxC_F AAAAAGCTTCAACTGCACACGTTAGCGTT 29 61,4 ttsboxC_R AAAGAATTCCAGCTACTCCTGCCTTAGCG 29 61,7 cya_XbaI ATATCTAGATCAGCTGTCATAGCCGGAAT 29 62 cya_BamHI ATAGGATCCTCAGCTGTCATAGCCGGAAT 29 62 nopCattB1 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT TAATGGTCGGAGTGATTGGA 49 67,8 nopCattB2sinstop GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT AGGCATCCTCTTCAGTTTC 48 68,3 nopC_EcoRI AAAGAATTCATGGTCGGAGTGATTGGAAG 29 58,9 nopP_pGML_F AAATCTAGAATGTACGGTCGAATTGATAG 29 54,8 nopP_pGML_R AAAGGTACCTCACATGAAGTCATCTTCGT 29 59,3 attB1nopP GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT TAATGTACGGTCGAATTGAT 49 66,2 attB2nopP GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT ATCACATGAAGTCATCTTC 48 66,6 nopPattB2sinstop-1 GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT ACATGAAGTCATCTTCGAT 48 67,1 nopIattb1 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT TAATGTATAGCAGTATCACT 49 65 nopIattB2ns GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT AGTCGGCCGGTCCTCCGCG 48 73,2 nopL_pGML_F AAATCTAGAATGGATATCAATTCAACCCG 29 55,3 nopL_pGML_R AAAGGTACCAATGTCAAAATCCAGCGATG 29 59,4 attB1NopL GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT TAATGGATATCAATTCAACC 49 64,9 attB2NopL GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT ATCAAATGTCAAAATCCAG 48 66,3
70 Material y Métodos Tabla 5. Cebadores utilizados en esta Tesis para amplificar fragmentos de ADN destinados para clonación. Nombre Secuencia (5´- 3´) pb Tm (ºC) nopLattB2sinstop GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT AAATGTCAAAATCCAGCGA 48 67,9 nopLF GTTGTCTCTATCATCATGGA 20 47,5 nopLR AACGCCTACTCTGCAGGAAA 20 57,0 nopLext-F CGACGCGACGTTCGAGCGAA 20 62,2 nopLext-R CGGCATCTCCAAGCAGGGAGA 21 61,6 nopLEX-F TTAGGATCCGATATCAATTCAACCCGC 27 58,5 nopLEX-R AACGAATTCTCAAATGTCAAAATCCAGC 28 56,7 nopL_HindIII (F) AAAAAGCTTATGGATATCAATTCAACCCG 29 55 nopCattB1 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT TAATGGTCGGAGTGATTGGA 49 67,8 nopCattB2sinstop GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT AGGCATCCTCTTCAGTTTC 48 68,3 nopC_EcoRI (F) AAAGAATTCATGGTCGGAGTGATTGGAAG 29 59 nopDok-F CCCCCTTTATTCCCAGGA 18 55,5 nopDok-R TAACCTTCCAAGAGGACCA 19 51,8 nopDB-F GAAAACTGGCAGTCGGCCAGA 21 60,1 nopDB-R CTGCCTCTTCGCTGGCCTCA 20 62,3 nopTFor ACATCATTCTCGGTCAGGA 19 51,6 nopTRer GACGAGGATTTACGTGGA 18 50,1 nopTHH_extF CAGGAGATCGCCAAGAATTG 20 53,6 nopTHH_extR ACGAGGATTTACGTGGACTT 20 53,6
71 Material y Métodos 1. 4. 11. Mutagénesisin vitro por deleción mediante PCR solapante. Esta técnica está basada en el método de Griffits y Long (2008). Se realizaron los siguientes pasos de amplificación por PCR (Figura 8): 1.-Amplificación de fragmentos de entre 500 a 700 pb de longitud de las regiones flanqueantes al gen que se desea mutagenizar. Para ello, se añadió en un volumen de 20 µL: 10 ng de ADN genómico, 0,2 µM de cada cebador [cebadores 1 y 2 para la PCR de la región flanqueante derecha y cebadores 3 y 4 para la PCR de la región flanqueante izquierda (Tabla 6)], 0,2 mM de dNTP y 0,1 U de una polimerasa de alta fidelidad. Se siguió el esquema general descrito anteriormente para la programación del termociclador. 2.- PCR solapante usando como ADN molde ambos productos amplificados en el paso anterior. A la mezcla de 20 µL de reacción se le añadió una concentración de 2 ng de cada fragmento de ADN molde, 0,2 μM de los cebadores 1 y 4, 0,2 mM de dNTP y 0,1 U de la polimerasa. En algunos casos la PCR comenzó con dos ciclos en los que las temperaturas de desnaturalización y polimerización fueron menores que la que se establece en el esquema general. De esta forma se favoreció que los dos fragmentos que se usaron como ADN molde se mantuvieran unidos. A continuación, se dieron 35 ciclos como sigue el esquema de PCR descrito anteriormente. Los cebadores 1 y 4 poseen dianas de restricción para BamHI y HindIII, respectivamente. Por lo tanto, el amplicón obtenido en este último paso contenía las regiones flanqueantes al gen delecionado y las dianas para BamHI y HindIII. Este fragmento se digirió con las enzimas BamHI y HindIII y se clonó en el plásmido pK18mobsac para su posterior transformación en E. coli y conjugación con la estirpe parental S. fredii HH103 RifR. Finalmente, se obtuvo la estirpe mutada por deleción mediante doble recombinación y selección en medio suplementado con la concentración de sacarosa adecuada.
72 Material y Métodos Figura 8. Esquema de la mutagénesis in vitro por deleción mediante PCR solapante. La homología entre los cebadores y el ADN molde se indica mediante el mismo color. Tabla 6. Cebadores utilizados en esta Tesis para amplificar fragmentos de ADN para la mutagénesis in vitro por deleción mediante PCR solapante. Nombre Secuencia (5´- 3´) pb Tm (ºC) nopC-1 ATTAAGCTTTGTCATGGACAGGGAACGAA 29 60,1 nopC-2 CAGTTTCTGCCATACCACTTCCAATCAC 28 59,6 nopC-3 GTGATTGGAAGTGGTATGGCAGAAACTG 28 59,6 nopC-4 AAAGGATCCGCGAAATGGCGTCGTTCACT 29 65,3 nopI-1 ATTAAGCTTTCTTCGTCTCGCTGATCTCG 29 60 nopI-2 CTGGACGAATCTGTTGATCCAGTGATAC 28 58,6 nopI-3 GTATCACTGGATCAACAGATTCGTCCAG 28 58,6 nopI-4 AAAGGATCCTTGCAGCGTAAATCACGACG 29 62,4
73 Material y Métodos 1. 4. 12. Hibridación ADN:ADN. Se empleó un sistema no radiactivo que se basa en el marcaje al azar de ADN con digoxigenina-UTP y la detección de los híbridos ADN:ADN-digoxigenina mediante enzimoinmunoensayo. Para ello se utilizó un anticuerpo conjugado (anti-digoxigenina conjugado con la enzima fosfatasa alcalina). El resultado de la hibridación se obtuvo por reacción colorimétrica en el mismo filtro de hibridación. Transferencia del ADN a filtros de nylon. Una vez realizada la electroforesis en gel de agarosa, los fragmentos de ADN, junto con el marcador de peso molecular marcado con digoxigenina (Roche, Suiza), se transfirieron a filtros de nylon (Southern, 1975) Hybond-N (Amersham Biosciences, Inglaterra). Para ello, inmediatamente después de la electroforesis, el gel se sumergió en HCl 0,25 M durante 20 minutos con agitación suave. Posteriormente, se lavó con agua destilada y se mantuvo en una solución de desnaturalización durante 30 minutos en agitación. La transferencia del ADN a los filtros se realizó por presión durante 15 horas en presencia del tampón de transferencia alcalino. Transcurrido ese tiempo, los filtros se lavaron en SSC 2X durante 5 minutos. Finalmente, el ADN se fijó al filtro por exposición a la luz ultravioleta durante 2 minutos. Soluciones empleadas SSC 20X NaCl 2,1 M, citrato de sodio 0,3 M. Ajustar el pH a 7 Solución de desnaturalización NaCl 1,5 M, NaOH 0,5 M Tampón de transferencia alcalino NaCl 1,5 M, NaOH 0,25 M Marcaje de la sonda. El marcaje de la sonda se realizó mediante una PCR en la que se añadió a la mezcla normal de PCR, 1 μL de dNTPs 10X que contiene UTP marcado con digoxigenina. Hibridación de la sonda al ADN del filtro. Al filtro de nylon se le añadió la solución de prehibridación (entre 1 y 10 mL, dependiendo del tamaño del filtro), que contenía esperma de salmón (100 µg mL-1)
74 Material y Métodos previamente desnaturalizado por calor (95 ºC durante 10 minutos y 5 minutos en hielo). El filtro se prehibridó con esta solución incubándolo de 2 a 6 horas a 42 ºC (en condiciones de homología entre la sonda y la muestra a hibridar). Transcurrido este tiempo, se retiró la solución de prehibridación y se añadió la sonda, previamente desnaturalizada por calor (95 ºC durante 10 minutos y 5 minutos en hielo) y diluida en 2,5 mL de solución de prehibridación. El filtro se incubó con esta nueva solución durante toda la noche a 42 ºC. Transcurrido este tiempo se procedió a lavar el filtro. Se lavó dos veces con una solución de SSC 2X, SDS 0,1% durante 5 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se lavó otras dos veces con SSC 1X, SDS 0,1% durante 5 minutos a temperatura ambiente y, por último, se realizaron dos lavados más con SSC 0,1X, SDS 0,1% durante 15 minutos a 68 ºC. Soluciones empleadas SSC 20X NaCl 2,1 M, citrato de sodio 0,3 M. Ajustar el pH a 7 SDS 20%a SDS 200 g L-1 Solución de prehibridaciónb 100 mL SSC 20X (v/v), 0,4 mL SDS 20% (m/v), 100 mL agua Milli- Q, 20 g de reactivo de bloqueo (Roche), 0,4 g N-laurilsarcosina aCalentar 800 ml de agua destilada, añadir el SDS, ajustar el pH a 7,2 y enrasar a 1 L con agua destilada. bDisolver el reactivo de bloqueo con agitación magnética y calor y añadir el mismo volumen de formamida desionizada. Se almacena a -20 ºC. Detección inmunológica. Después de realizar los lavados, el filtro se incubó durante 5 minutos en 100 mL de tampón 1 a temperatura ambiente y en agitación, para eliminar los restos de SDS. Posteriormente, el filtro se introdujo en bolsas de hibridación junto con 10 mL de tampón 2 y se incubó durante 90 minutos a temperatura ambiente con agitación suave. A continuación, se retiró el tampón 2 y se cambió por una nueva solución de tampón 2 que contenía el anticuerpo anti-digoxigenina en una proporción de 1:5000 (v/v). El filtro se incubó en esta solución durante 45 minutos a temperatura ambiente con agitación suave. Para eliminar el anticuerpo no fijado, el filtro se extrajo de las bolsas y se lavó dos veces durante 15 minutos en 100 mL de tampón 1 a temperatura ambiente con agitación. Finalmente, el filtro se equilibró en 50 mL de tampón 3 durante 5 minutos. Para visualizar el resultado se usó un método colorimétrico que consiste en introducir el filtro en bolsas de hibridación herméticamente selladas junto con una solución de revelado. Las bolsas se incubaron a temperatura ambiente y en oscuridad hasta que el
75 Material y Métodos resultado de la hibridación fuera claramente visible. Posteriormente el filtro se lavó con agua destilada y se secó al aire. Soluciones empleadas Tampón 1 Tris-HCl 100 mM pH 8 y NaCl 150 mM Tampón 2 Reactivo de bloqueo al 2% (m/v) disuelto en tampón 1 Tampón 3 Tris-HCl 80 mM pH 9,5, NaCl 100 mM y MgCl2 50 mM Solución de revelado 66 µL de solución NBT (75 mg mL-1 de nitroazul tetrazolio en dimetilformamida al 70%), 66 µL de solución BCIP (50 mg mL-1 de 5- bromo-4-cloro-3-indolil fosfato en dimetilformamida al 100%) en 10 mL de tampón 3 * Disolver el reactivo de bloqueo con agitación magnética y calor. Almacenar a 4 ºC. 1. 4. 13. Secuenciación del ADN. La secuenciación del ADN se llevó a cabo en los servicios de secuenciación de la empresa STAB VIDA (Portugal). 1. 4. 14. Análisis informático de secuencias de ADN. Para el análisis informático básico de las secuencias de ADN se empleó el programa de comparación de secuencias BLASTn disponible en la página web del NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). Para otro tipo de análisis de las secuencias de nucleótidos se utilizaron las aplicaciones informáticas disponibles en la página web deambulum (http://bioinfo.hku.hk/services/deambulum/english/prog2.html#TRAD). 1. 4. 15. Cuantificación de la expresión de genes bacterianos mediante qPCR. Se incubaron los cultivos de las estirpes de S. fredii a estudiar en medio YM (suplementado con flavonoides cuando fue necesario) a 28 ºC a 180 r.p.m. hasta que alcanzaron una densidad óptica a 600 nm de 0,5-0,8. La extracción del ARN bacteriano se realizó utilizando los kits RNAeasy kit (Qiagen, Suiza) y High pure RNA isolation kit (Roche, Suiza), siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Posteriormente, el ARN obtenido se cuantificó en el nanodrop Thermo Scientific NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, EEUU) y se retrotranscribió utilizando el kit Quantitect (Qiagen, Suiza), siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADNc obtenido se utilizó como
76 Material y Métodos molde para llevar a cabo reacciones de PCR utilizando los cebadores específicos adecuados (Tabla 7). Los cebadores utilizados para ensayos de qPCR se diseñaron teniendo en cuenta que la longitud del amplicón estuviera comprendida entre 140 y 180 pb y con las características descritas en el apartado 1. 4. 10. de Material y Métodos. Tabla 7. Cebadores utilizados en esta Tesis para ensayos de qPCR de genes de S. fredii HH103. Nombre Secuencia (5´- 3´) pb Tm (ºC) nopCq_F CAAAGGGGGGCATGGA 16 55,1 nopCq_R CAACCGATCGAAGAGCTA 18 51,4 nopLq_F GAGCTGGATCATGGCAA 17 52,3 nopLq_R ATGCTGCCAATCAAGCA 17 52,5 nopIq_F ACGTGGGTGGAAACGA 16 53,9 nopIq_R GACGAATCTGTCTCGACA 18 51,3 nopAq_F TGTCACGAGTGCAGTTGGA 19 56 nopAq_R TGTCTGGAGCTCGGTCGTAA 20 57,8 nodA_F CGTCATGTATCCGGTGCTGCA 21 60 nodA_R CGTTGGCGGCAGGTTGAGA 19 61 16S_F TAAACCACATGCTCCACC 18 52 16S_R GATACCCTGGTAGTCCAC 18 51 1. 5. Técnicas relacionadas con las proteínas. 1. 5. 1. Extracción de las proteínas extracelulares de S. fredii HH103. Se siguió el método descrito por Krishnan y Pueppke (1993) con ciertas modificaciones. Se inocularon matraces de 250 mL que contenían 50 mL de medio YM líquido (suplementado con 3,7 µM de genisteína cuando fue necesario) con 500 µL de cultivo de las estirpes a ensayar y se incubaron en agitación a 28 ºC durante 40 horas. Transcurrido este tiempo, los cultivos se centrifugaron a 10000 g durante 20 minutos a 4 ºC y se retiraron las células. Al sobrenadante obtenido se le añadieron 3 volúmenes de acetona fría y con la ayuda de una varilla se retiró el polisacárido precipitado. La mezcla se incubó a -20 ºC durante al menos 24 horas para que las proteínas precipitaran. Posteriormente, se centrifugó a 17000 g durante 45 minutos a 4 ºC y el pellet se lavó
77 Material y Métodos con 100 mL de acetona al 70% volviendo a centrifugar a 17000 g durante 45 minutos a 4 ºC. El sedimento obtenido se dejó secar completamente y se resuspendió en 300 µL de tampón de muestra 1X. Solución empleada Tampón de muestra 1X Tris-HCl 62,5 mM pH 6,8, SDS 2% (m/v), glicerol 20% (v/v), β-mercaptoetanol 5% (v/v), azul de bromofenol 0,05% (m/v) 1. 5. 2. Cuantificación de proteínas Se utilizó el método descrito por Bradford (1976). Para determinar la concentración de proteínas de una muestra se mezclaron 500 µL de agua destilada con 500 µL de la solución de Bradford (Sigma, EEUU) y 5 µL de la muestra. La densidad óptica se midió a 595 nm empleando el espectrofotómetro modelo Helios Alpha Thermo Spectronic (Wilkem Scientific, EEUU). El valor de la concentración de las proteínas de la muestra se obtuvo a partir de una recta patrón. 1. 5. 3. Electroforesis unidireccional de las proteínas La electroforesis unidireccional se realizó en condiciones desnaturalizantes, que separa las proteínas según su masa molecular, siguiendo el método descrito por Laemmli (1970). Las proteínas se resuspendieron en tampón de muestra 1X, se calentaron a 100 ºC durante 5 minutos y se mantuvieron en hielo. Posteriormente, las muestras se centrifugaron y el sobrenadante obtenido se cargó en el gel junto con el marcador de masa molecular de amplio rango suministrado por Bio-Rad (EEUU) o Fermentas (Thermo Fisher Scientific, EEUU). Se prepararon geles de separación de distinta concentración de acrilamida dependiendo del tamaño de las proteínas que se querían separar. Así, se utilizaron geles del 12% de acrilamida para separar proteínas de mayor tamaño y geles del 15% para separar proteínas más pequeñas. Posteriormente, los geles inmersos en tampón de electroforesis 1X se corrieron a 150 V en cubetas Mini Protean II y Protean II (Bio-Rad, EEUU), hasta que el colorante alcanzó el borde inferior del gel. Se utilizaron geles de empaquetamiento al 4% de acrilamida.
84 Material y Métodos 2. 3. Desinfección y germinación de semillas. Las semillas de G. max, V. unguiculata, S. tomentosa y L. japonicus se desinfectaron mediante un tratamiento con etanol de 96º durante 30 segundos, seguido de otro con hipoclorito sódico al 6% (m/v) durante 6 minutos. Tras ello, las semillas se lavaron seis veces con abundante agua destilada estéril. En el caso de las semillas de L. japonicus, éstas se escarificaron suavemente con una lija antes de su desinfección. Las semillas desinfectadas se colocaron en placas de Petri que contenían agar-agua al 1% (m/v) y se incubaron en oscuridad y a temperatura ambiente o a 28 ºC hasta su germinación. Las semillas de N. benthamiana se sembraron directamente sobre macetas que contenían sustrato orgánico. 2. 4. Inoculación y cultivo de plantas. Las semillas germinadas se transfirieron a diferentes sistemas según el experimento realizado: Jarro de Leonard (Vincent, 1970): El sistema consiste en un depósito de ~1,5 L que contiene solución de Fähraeus. Sobre este depósito se colocó una maceta que contenía 800 cm3 de vermiculita mezclada con perlita [vermiculita:perlita (4:1)] y humedecidas con 250 mL de la misma solución nutritiva. La maceta y el depósito se conectaron mediante una mecha de algodón de aproximadamente 20 cm de longitud. El jarro completo se esterilizó en el autoclave durante 20 minutos a una atmósfera de sobrepresión (121 ºC). En cada jarro se colocaron dos semillas. En el caso de L. japonicum los ensayos de nodulación se realizaron en minijarros de Leonard [aproximadamente 200 cm3 de vermiculita en la parte superior y un depósito de ~200 mL que contenía la solución nutritiva]. Cada semilla se inoculó con 1 mL de cultivo bacteriano crecido en medio YM que presentaban una densidad óptica a 600 nm de alrededor de 0,8. Sistema de hidroponía en vaso de precipitado: Se colocaron 10 semillas de soja Williams sobre una rejilla que descansaba sobre un depósito que contenía 150 mL de solución Fåhraeus 1X y 15 mL de un cultivo bacteriano crecido en medio Figura 9. Sistema de hidroponía en vaso de precipitado
85 Material y Métodos YM a una densidad óptica a 600 nm de alrededor de 0,8. Este sistema se encontraba en el interior de un vaso de precipitado de cristal de 2 L con tapa de cristal que contenía 100 mL de agua destilada estéril, para favorecer condiciones de alta humedad (Figura 9). Todos los componentes del sistema fueron esterilizados en el autoclave (20 minutos a 121 ºC a una atmósfera de sobrepresión). Cajón estéril: Cajas de plástico estériles, de 30 cm de largo, 23 cm de ancho y 18 cm de ancho, se rellenaron a la mitad con vermiculita esterilizada en el autoclave (20 minutos a 121 ºC a una atmósfera de sobrepresión) y 1 L de solución Fåhraeus 1X. Se colocaron en cada caja 30 semillas de soja Williams, se inocularon con 1 mL de cultivo cada una y se tapó el sistema con papel de película transparente para evitar problemas de contaminación y para mantener la humedad. Maceta: Las semillas de N. benthamiana se colocaron en macetas de 10 cm de diámetro que contenían sustrato vegetal. A las dos semanas, cada plántula se sembró en macetas individuales que contenían el mismo soporte. 2. 5. Ensayos de nodulación. Los ensayos de nodulación se realizaron para analizar las propiedades simbióticas de las distintas estirpes estudiadas en esta Tesis. Se llevaron a cabo en cámaras de plantas con un fotoperíodo de 16 horas de luz (con intensidad de 400 µE m-2 s-1) y 8 horas de oscuridad a 26 ºC y 18 ºC, respectivamente. El periodo de cultivo de las plantas varió dependiendo de la especie vegetal. Así, las plantas de soja y de V. unguiculata se cultivaron durante 7 semanas, mientras que el período de cultivo aproximado para las plantas de L. japonicus y S. tomentosa fue de dos meses. Los análisis estadísticos de los resultados fueron realizados con el programa Statistix for Windows Analytical software, usando el test adecuado. Secado de la parte aérea de la planta. La parte aérea de las plantas se secó en una estufa para desecación (J.P. Selecta, España) a 65-70 ºC durante 48 horas. Transcurrido ese tiempo se dejó otras 24 horas con el horno apagado y se pesó.
86 Material y Métodos Aislamientos de las bacterias de los nódulos. Los nódulos se separaron de las raíces y se desinfectaron mediante un tratamiento con hipoclorito al 12% durante 2 ó 3 minutos. A continuación, se enjuagaron abundantemente con agua destilada y se rodaron en cajas de medio TY para comprobar que la superficie del nódulo no presentaba bacterias. Posteriormente, los nódulos se machacaron en condiciones asépticas mediante el uso de una espátula estéril y su contenido se sembró en placas de TY para obtener colonias aisladas. Una vez crecidas, distintas colonias se picaron placas de TY suplementadas con los antibióticos apropiados para identificar las bacterias aisladas del nódulo. 2. 6. Extracción y cuantificación de los pigmentos fotosintéticos. Se siguió el método descrito por Buschmann et al. (1984) con ciertas modificaciones. Se seleccionaron dos hojas de cada planta que se encontraban a una altura determinada del tallo para minimizar el error. Las hojas se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ºC hasta su uso. Se trituraron 0,5 g de hojas en 10 mL de una solución de acetona al 80%. Esta mezcla se centrifugó durante dos minutos a 12000 g y se descartó el pellet. La absorbancia se midió a 663,2 nm, 646,8 nm y 470 nm, y se calculó la concentración de los distintos pigmentos mediante las siguientes fórmulas: Concentración de los pigmentos (ng/L) Fórmula para hallar la concentración Concentración de clorofila a (Ca) Ca = 12,25 x Abs663,2 – 2,79 x Abs646,8 Concentración de clorofila b (Cb) Cb = 21,50 x Abs646,8 – 5,10 x Abs663,2 Concentración total de clorofilas (Ca+b) Ca+b = 7,15 x Abs663,2 + 18,71 x Abs646,8 Concentración total de carotenoides (Cc+d) Cc+d = (1000 x Abs470 – 1,82 x Ca – 85,02 x Cb)/198 2. 7. Utilización de bioluminiscencia para el estudio de la expresión de promotores de S. fredii HH103 in vivo en simbiosis con soja Williams. Cuatro semillas de soja Williams, germinadas durante 48 horas en placas de agaragua al 1%, se colocaron en una placa de Petri de 16 x 16 cm estéril y se añadió una mezcla compuesta por 40 mL de un cultivo de S. fredii HH103 (pMUS1207) en fase
87 Material y Métodos estacionaria (crecido en medio YM con tetraciclina a 2,5 mg mL-1) y 80 mL de una mezcla al 50% (v/v) de medio YM 2X y Fåhraeus 2X, con agar al 2% (m/v). El plásmido pMUS1207 porta la caja tts del operón que contiene los genes nopC y nopA de S. fredii HH103 seguido de losgenes luxCDABE de Vibrio fisheri y permite estudiar la expresión del promotor tts mediante luminiscencia. Una vez que se solidificó la mezcla anterior, se cortó y retiró con la ayuda de un bisturí estéril el medio que cubría el hipocótilo de las plántulas. De este modo, la raíz de la plántula se encontraba totalmente sumergida en el medio y la parte aérea no tenía ningún impedimento para desarrollarse de forma natural. Las placas se sellaron con parafina para que no perdieran humedad y se cultivaron durante 6 días en una cámara de plantas, bajo las condiciones descritas en el apartado 2. 5. de Material y Métodos. La monitorización de la bioluminiscencia se realizó usando el equipo IVIS Lumina II (Japón) y el programa Living Image 4.0. Las placas se sometieron al recuento de fotones cada día, una hora antes de que terminase el periodo de luz y una hora antes de que terminase el periodo de oscuridad. El tiempo de exposición de cada captura fue de 10 segundos. 2. 8. Cuantificación de hormonas. 2. 8. 1. Extracción y cuantificación de ácido salicílico usando el biosensor Acinetobacter sp. ADP1. Extracción del ácido salicílico. El método que se siguió para la extracción del ácido salicílico se elaboró a partir de una serie de adaptaciones de los trabajos de Bowling et al. (1994) y Enyedi et al. (1992). Las raíces de soja Williams se pulverizaron en un mortero con nitrógeno líquido. 0,2 g de extracto de raíces de soja se pesaron y se realizó una extracción triturando el extracto en un mortero con 2 mL de una solución de 90:10 de metanol:agua. Seguidamente, el extracto se pasó a un tubo eppendorf de 2 mL y se sonicó en un baño (J. P. Selecta, España) durante 30 minutos a temperatura ambiente y la muestras se incubaron toda la noche a -20 ºC. Transcurrido este tiempo, se volvió a sonicar la muestra durante 30 minutos y se centrifugó a 12000 g durante 15 minutos. El sobrenadante se pasó a otro tubo eppendorf y se evaporó en un rotavapor (Heto Holten
88 Material y Métodos Ltd., Reino Unido) a 40 ºC. El residuo seco se resuspendió en una solución de acetato sódico 0,1 M a pH 4,5 y se incubó durante toda la noche a 37 ºC. Posteriormente, se añadió un volumen de acetato de etilo acidificado, se agitó la mezcla y se centrifugó a 12000 g durante tres minutos. La capa superior se recuperó en otro eppendorf y se evaporó en el rotavapor a temperatura ambiente. Finalmente, el pellet se resuspendió en 300 µL de una solución de metanol:agua (50:50 v/v) y el tubo eppendorf que contenía la muestra se dejó abierto hasta que se evaporó el metanol por completo, quedando el ácido salicílico disuelto en 150 µL de agua. Cuantificación del ácido salicílico. Se siguió el protocolo descrito por DeFraia et al. (2008) con algunas modificaciones. Se inoculó una colonia de Acinetobacter sp. ADP1 en 5 mL de LB sin antibióticos y se incubó durante toda la noche a 28 ºC en agitación. Al día siguiente, se inocularon los 5 mL del cultivo crecido en un volumen final de 100 mL de medio LB y se incubó a 37 ºC en agitación hasta que la densidad óptica a 600 nm alcanzó exactamente 0,3. En cada pocillo de una placa de microtítulo de 96 pocillos (Vision Plate 96, Reino Unido) se mezclaron 100 µL del cultivo, 50 µL de la muestra de extracción de ácido salicílico y 50 µL de una solución de MgCl2 a una concentración de 10 mM. La placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente y se midió la luminiscencia en un lector de placas Synergy HT (BioTek, EEUU) (Figura 10). A partir de los datos obtenidos se calculó la media (± la desviación típica de la media) de tres réplicas de dos muestras biológicas independientes. La curva de calibración se obtuvo a partir de concentraciones crecientes y conocidas de una solución que contenía ácido salicílico comercial. Para cada experimento se realizó una curva de calibrado. El valor del patrón sin ácido salicílico se le restó a los valores de las diferentes muestras ensayadas. La conversión de los valores de luminiscencia a concentración de ácido salicílico se obtuvo a partir de la pendiente de la recta patrón. La concentración final de ácido salicílico, o SA, se halló mediante la siguiente ecuación: ng SA / g masa fresca = A x B x C x DF A: Valor obtenido bajo las condiciones experimentales. Se expresó en μM SA/106 para la conversión de μM de SA a M de SA.
89 Material y Métodos B: Volumen de la muestra expresado en L = 50/106 C: Peso molecular del SA expresado en ng = 138,12 g/mol x 109 DF: Factor de dilución = [volumen del pocillo (200 μL) / volumen de la muestra (50 μL)] x [volumen total de la extracción de SA en el tubo eppendorf (150 μL) / volumen de la muestra (50 μL)] x (1 g de masa fresca de raíz de soja / 0,2 g usado para la extracción de SA). Figura 10. Esquema del procesamiento de las muestras para la cuantificación de ácido salicílico. 2.8. 2. Cuantificación de ácido salicílico, ácido abscísico y ácido jasmónicoisoleucina mediante HPLC. Extracción de las hormonas. Las raíces de plantas de soja Williams, no inoculadas o inoculadas con las estirpes adecuadas y cultivadas en cajones estériles, se congelaron en nitrógeno líquido, se pulverizaron en un mortero y se liofilizaron. Posteriormente, las muestras se procesaron y analizaron en el Departamento de Ciencias Agrarias y del Medio Natural de la Universitat Jaume I (Castellón, Valencia). Una alícuota de 0,5 g de tejido liofilizado se extrajo en 5 mL de agua destilada y se enriqueció la muestra con 50 µL de una mezcla de estándares: 5 ng de [2H2] IAA y 100 ng de [2H6] ABA, [2H4] SA, y [2H2] JA-Ile. La mezcla se centrigugó a 4000 g a 4 ºC, se recuperó el sobrenadante y se le ajustó el pH a 3 con ácido acético al 30%. Posteriormente, se trató la muestra dos veces con 3 mL de dietil éter. En cada paso la capa superior se recuperó y evaporó en una centrífuga de vacío (Speed vac, Jouan, Saint Herblain Cedex, Francia). El residuo seco se resuspendió en MeOH al 10% (v/v) mediante sonicación. Por último, se filtró la muestra usando una jeringuilla con filtro de celulosa de 0,22 µm (Albert S. A., España) e inyectando directamente en el sistema HPLC.
90 Material y Métodos Cromatografía y espectrometría de masas La cromatografía líquida de alta resolución se realizó con el sistema Waters Alliance 2690, que consiste en una bomba cuaternaria y un autosampler. Alícuotas de 20 µL se inyectaron en una columna de fase reversa Nucleosil ODS (50 x 2 mm diámetro interno, 1,8 µm, España). Las hormonas se eluyeron con un gradiente de metanol y ácido acético al 0,01% en agua, empezando desde la fracción 10:90 (v/v). Las condiciones isocráticas del 10:90 se conservaron durante los últimos dos minutos de la carrera. Las condiciones iniciales se restauraron permitiendo el equilibrado del sistema durante 3 minutos, de modo que el proceso duró 10 minutos para cada muestra. El ratio del flujo fue de 0,3 mL min-1 y la presión alrededor de 211-220 bares. Usando una interfaz de electrospray Z-spray ortogonal (Micromass, Reino Unido), los eluyentes que se obtuvieron por HPLC se introdujeron en un espectrómetro de masas triple-cuadrupolo (TQD, Micromass). Como gas seco se usó el nitrógeno. Para operar en el modo tándem MS (MS/MS), el gas de colisión fue argón puro al 99,995% (Carburos metálicos, España) y una presión de 2 x 10-3 mbar en la célula de colisión. La temperatura del gas de desolvación fue de 350 ºC, la temperatura de la fuente de 120 ºC y el voltaje capilar de -3 kV. El espectrómetro de masas se operó mediante el modo de monitorización múltiple (MRM). El voltaje de cono y las energías de colisión se resumen en la Tabla 9. Los cromatogramas se procesaron con el programa Masslynx NT 4.0 (Micromass). Tabla 9. Voltaje de cono y energías de colisión usados en el sistema HPLC para cuantificar las fitohormonas. Compuesto Voltaje de cono (V) Energía de colisión (eV) Ión precursor (m/z) Transición de diagnóstico (m/z) ABA 25 12 263 263 > 253 [2H6] ABA 25 12 269 269 > 159 IAA 20 10 174 174 > 130 [2H2] IAA 20 10 176 176 > 132 JA 40 15 209 209 > 59 DHJA 25 15 211 211 > 59 SA 20 20 137 137 > 93 [2H4] SA 20 20 141 137 > 97 JA-Ile 25 12 322 322 > 130 [2H2] JA-Ile 25 12 324 322 > 131
91 Material y Métodos 2.8. 3. Cuantificación de etileno por cromatografía de gases. Preparación de las muestras. Las semillas de soja Williams, germinadas en agar agua al 1% durante 48 horas, se sumergieron durante 10 minutos en 20 mL de un cultivo crecido de la estirpe S. fredii HH103 y sus derivados a una densidad óptica a 600 nm de 0,9, o en 20 mL de medio YM en el caso del control sin inocular. Transcurrido este tiempo, dos semillas germinadas del mismo tamaño se introdujeron en botes pequeños de cromatografía de 9 mL de volumen, que se taparon con un tapón de goma, se sellaron y se incubaron durante 24 horas en la cámara de cultivo. Cromatografía. Se realizó en colaboración con la Dra. Blanca Vioque Cubero (Instituto de la Grasa, CSIC, Sevilla). La determinación de la concentración de etileno se llevó a cabo por cromatografía de gases. Para ello, se utilizó un cromatógrafo Hewlett Packard modelo 5890, dotado de un detector de ionización de llama (FID) y una columna de alúmina activada F1 80-100 mallas (Supelco, Inc. Bellefonte, EEUU) de 2 m x 3 mm de diámetro interno. Como gas portador se utilizó nitrógeno, con un flujo de 30 mL min-1, manteniéndose el horno a 100ºC y el inyector y el detector a 150 ºC. En estas condiciones el etileno presenta un tiempo de retención de aproximadamente un minuto. La cuantificación del etileno se realizó mediante una recta de calibrado, obtenida con un patrón de concentración adecuada (87,4 pmoles mL-1), preparado a partir de una mezcla gaseosa comercial denominado Azethyl (5,04% de etileno en N2) de la Sociedad Española del Oxígeno (S.E.O.). La introducción del factor 2.8068 e-4 en un integrador Hewlett Packard modelo 3392A permite convertir el área del pico de etileno en picomoles. 2.9. Medida de la producción de ácido malondialdehído (MDA). La cuantificación de MDA se usó para determinar el grado de peroxidación de los lípidos del tejido radical de las plantas de soja Williams causado por los altos niveles de producción de ROS. Las raíces de soja Williams, no inoculadas o inoculadas con las estirpes adecuadas, se cultivaron en el sistema de cajones estériles. Las raíces de las
92 Material y Métodos plantas se pulverizaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ºC hasta su uso. Posteriormente, se trituraron 0,2 g del material en un mortero frío con 2 mL de una solución de ácido tricloroacético al 20% (m/v) y ácido tiobarbitúrico al 0,05% (m/v). La muestra se centrifugó a 12000 g durante 5 minutos a temperatura ambiente y el sobrenadante se incubó a 95 ºC durante 30 minutos. Finalmente, la muestra se incubó en durante 10 minutos hielo para detener la reacción, se centrifugó a 12000 g durante 5 minutos a temperatura ambiente y se midió la absorbancia a 532 nm. La concentración de MDA se calculó usando la siguiente ecuación: 64,52 x Abs532nm = nmol MDA g-1 masa fresca 2.10. Detección de depósitos de calosa. Las semillas germinadas de soja Williams, no inoculadas o inoculadas con las estirpes adecuadas, se colocaron en cajas de Petri de 10 x 10 cm que contenían 100 mL de solución Fåhraeus 1X. Las raíces se mantuvieron en oscuridad para evitar la excesiva exposición a la luz y las plántulas se cultivaron durante 48 horas en una cámara de cultivo, bajo las condiciones descritas en el apartado 2. 5. de Material y Métodos. Tras este tiempo, las raíces de las plántulas se fijaron durante toda la noche en la solución I. Seguidamente, las raíces se rehidrataron en concentraciones crecientes de etanol y se incubaron durante 3 horas a 37 ºC en la solución II. Por último, las raíces se tiñeron en la solución III. Las muestras se analizaron usando un microscopio confocal invertido LSM510 (Zeiss, Alemania) con un objetivo plano apocromático 10X. Se tomaron 10 imágenes para cada tratamiento de aquellas áreas de la raíz enriquecidas en pelos radicales jóvenes. Soluciones empleadas Solución I Etanol:ácido acético, en una proporción de 3:1 Solución II Hidróxido de potasio al 10% (m/v) Solución III 150 mM K2HPO4, pH 9.5 y 0.01% (m/v) de azul de anilina 2.11. Detección de tejidos necróticos en hojas de soja. Las plantas de soja Williams, no inoculadas o inoculadas con las estirpes de rizobios adecuadas, se cultivaron en el sistema de hidroponía en vasos de precipitado. 10 días
93 Material y Métodos después de la inoculación, a las hojas más verdes y tiernas se les realizó una pequeña herida con una aguja en el envés. Con una jeringuilla de 2 mL, sin aguja, se inoculó un volumen determinado de un cultivo de Pseudomonas syringae pv. glycinea en una solución de MgCl2 10 mM cuya densidad óptica a 600 nm fue de 1. Al mismo tiempo, se presionó el haz de la hoja para que el cultivo penetrara en las capas del tejido epidérmico. A las 24 y 48 horas se observó si existían zonas necróticas y se fotografiaron los resultados. 2. 12. Cuantificación de la expresión de genes de soja mediante qPCR. Alrededor de 10 semillas de soja Williams, germinadas en placas de agar-agua al 1% a 28 ºC y en oscuridad, se sembraron en un sistema de hidroponía en vaso de precipitado. Tras el cultivo de las plantas, se cortó el primer tercio de la raíces de las plantas, se envolvieron en papel de aluminio, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ºC hasta su uso. El ARN se extrajo utilizando el kit RNAeasy plant mini kit (Qiagen, Alemania), siguiendo las instrucciones del fabricante. Una vez extraído el ARN, se calculó su concentración mediante la medida de la absorbancia de la muestra a 260 nm utilizando un nanodrop Thermo Scientific NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, EEUU) o mediante el uso del fluorómetro Qubit (Invitrogen, EEUU) y se retrotranscribió utilizando el kit Quantitect (Qiagen, Alemania), siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADNc obtenido se utilizó como molde para llevar a cabo reacciones de PCR utilizando los cebadores específicos adecuados (Tabla 10). Los cebadores se diseñaron a partir de la zona del ADN codificante y teniendo en cuenta las características descritas en los apartados 1. 4. 10. y 1. 4. 15. de Material y Métodos. Tabla 10. Cebadores utilizados en esta Tesis para ensayos de qPCR de genes de soja Williams. Nombre Secuencia (5´- 3´) pb Tm (ºC) UBI qF GTGTAATGTTGGATGTGTTCCC 22 54 UBI qR ACACAATTGAGTTCAACACAAACCG 25 56,6 ELF1B_F GTTGAAAAGCCAGGGGACA 19 55,5 ELF1B_R TCTTACCCCTTGAGCGTGG 19 56,9 WRKY33qF2 CAAGAGAAGGAAATCTCGTGTG 22 53,4
100 Material y Métodos Solución empleada Tampón de extracción Tween20 1%, Tris HCl pH 7,5 100 mM, NaCl 150 mM, Glicerol 10% Unión del anticuerpo a la resina. La inmunoprecipitación se llevó a cabo usando el kit Pierce Spin Columns (Thermo Scientific, EEUU) con ciertas adaptaciones. Se depositaron 20 µL de resina (Aminolink plus) sobre el filtro de una columna del kit. La columna, colocada sobre un eppendorf sin tapón, se centrifugó a 1000 g durante un minuto y se retiró el eluyente. A continuación, la resina se lavó dos veces con 300 µL de Coupling Buffer (CB), centrifugando la muestra a 1000 g durante 1 minuto y retirando el eluyente. Tras esto, se colocó el tapón inferior de la columna y se añadió el anticuerpo diluido en CB. Se usaron 2 µg de IgG de ratón para el control negativo o 4 µg de anticuerpo anti-HA para la muestra a analizar. Se añadieron 6 µL de NaCNBH3 2,5 M a la columna, se colocó el tapón superior y se incubó la columna en el interior de un tubo Falcon de 50 mL en un agitador orbital a temperatura ambiente durante 2 horas y media. Tras la incubación, se retiró el tapón inferior y se aflojó el de la parte superior de la columna. A continuación, la columna se colocó en un eppendorf de 1,5 mL y se centrifugó a 1000 g durante un minuto. Seguidamente, se retiró de la columna el tampón superior, se añadieron 200 µL de CB, se centrifugó a 1000 g durante un minuto y se descartó el eluyente. Este paso se repitió una vez más. Tras esto, se añadieron 200 µL de Quenching Buffer (QB) y se volvió a centrifugar a 1000 g durante un minuto, descartando el eluyente y secando la parte inferior de la columna en un papel de filtro para eliminar los restos de tampón. En el siguiente paso, se colocó el tapón inferior, se añadieron 200 µL de QB, se resuspendió la resina con pipeta suavemente y se añadieron 8 µL de NaCNBH3 2,5 M. Se le colocó el tapón superior a la columna, se introdujo en un tubo Falcon de 50 mL y se incubó en un orbital durante 30 minutos. Posteriormente, se retiró el tapón inferior, se aflojó el superior, se colocó la columna en un tubo eppendorf de 1,5 mL y se centrifugó a 1000 g durante un minuto, descartando el eluyente. Este paso se repitió una vez más para asegurar el bloqueo de la resina. Finalmente, se lavó la resina dos veces con CB y seis veces con Wash Buffer (WB), centrifugando a 1000 g durante un minuto en cada paso.
101 Material y Métodos Inmunoprecipitación. La resina se lavó dos veces con tampón de extracción, el mismo que se usó para la extracción de proteínas de las hojas de tabaco, se centrifugó a 1000 g durante un minuto en cada lavado y se le colocó el tapón inferior. A continuación, se añadió un volumen de entre 300 y 600 µL del extracto de hojas de tabaco que contenía entre 500 y 1000 µg de proteínas. Se colocó el tapón superior a la columna y se incubó en el interior de un tubo Falcon de 50 mL en un agitador orbital a 4 ºC durante toda la noche. Al día siguiente, se retiró el tampón inferior a la columna y se aflojó el superior, se centrifugó a 1000 g durante un minuto y se descartó el eluyente. El tapón superior se retiró, se colocó la columna en un eppendorf limpio, se añadieron 200 µL de tampón de extracción y se centrifugó a 1000 g durante un minuto. Este último paso se repitió 8 veces para lavar la resina y estar seguros de retirar todas las proteínas que no estén unidas con gran afinidad a la proteína de fusión a YFP-HA. La resina se lavó 8 veces con 200 µL de una solución de bicarbonato amónico a una concentración de 50 mM para retirar las sales que puedan interferir con la posterior secuenciación de las proteínas. Por último, el tubo se centrifugó a 5000 g durante un minuto, se retiró el sobrenadante y se presionó el filtro hacia abajo con una punta amarilla para que la resina se depositase en el fondo de un eppendorf limpio y, finalmente, la muestra inmunoprecipitada se conservó en 200 µL de la solución de bicarbonato amónico a 4 ºC. Soluciones empleadas Coupling buffer (CB) Na2HPO4 2H2O 0,01 M, NaCl 0,15 M pH 7,2 Cianoborohydride solution* NaCNBH3 2,5 M en NaOH 1 M Quenching buffer (QB) Tris-HCl 1 M pH 7,4 Wash solution (WS) NaCl 1 M Tampón de extracción Tween20 1%, Tris HCl pH 7,5 100 mM, NaCl 150 mM, Glicerol 10% Tampón bicarbonato NH4HCO3 50 mM *Preparar al menos 1h antes de su uso 2. 13. 4. Secuenciación de las proteínas. Las bandas de los geles de poliacrilamida que contenían las proteínas de interés se recortaron con la ayuda de una cuchilla y se sumergieron en agua Milli-Q y se procesaron y se secuenciaron a través del servicio de la Unidad de Proteómica de la
102 Material y Métodos Universidad de Córdoba. En el caso de las muestras procedentes de las inmunoprecipitaciones, las proteínas inmunoprecipitadas unidas a la resina se procesaron y se secuenciaron en el servicio nombrado anteriormente. 2. 13. 5. Expresión transitoria de genes bacterianos en hojas de N. benthamiana. Preparación del cultivo de Agrobacterium tumefaciens CV3101 para infiltrar. Inicialmente, se preinoculó una colonia de A. tumefaciens CV3101 en 5 mL de medio LB con los antibióticos adecuados y se incubó a 28 ºC en agitación durante 48 horas. Posteriormente, se inocularon 100 µL del cultivo en 5 mL de LB con 10 mM de ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico (MES) y 40 µM de acetosiringona. La mezcla se incubó a 28 ºC, en agitación, durante alrededor de 16 horas, hasta que la densidad óptica a 600 nm fue de alrededor de 1. El cultivo se centrifugó a 4000 g durante 5 minutos a temperatura ambiente, se eliminó el sobrenadante, el pellet se lavó con 5 mL de MgCl210 mM y se volvió a centrifugar el tubo a 4000 g durante 5 minutos a temperatura ambiente. El pellet se resuspendió en un volumen de MgCl2 10 mM en el que la densidad óptica a 600 nm fue de 0,5-1 y se añadieron los compuestos MES a 10 mM y acetosiringona a 150 µM. La mezcla se incubó a temperatura ambiente, en estático, durante 3 horas. Infiltración de las hojas de N. benthamiana. Las plantas de tabaco se cultivaron en macetas durante alrededor de 3 semanas para que el tamaño y la consistencia de las hojas facilitaran la manipulación. A las hojas enumeradas como 3, 4 y 5 (Figura 11) se les realizó una pequeña herida con una aguja en el envés y con una jeringuilla de 2 mL (sin aguja) se inoculó un volumen determinado de cultivo presionando al mismo tiempo el haz de la hoja para que el cultivo penetrara en las capas del tejido epidérmico (Zhou et al., 2009). Posteriormente, las plantas se cultivaron en las condiciones apropiadas durante 48 horas. Transcurrido este tiempo, se tiñeron los núcleos de las células mediante la Figura 11. Hojas de N. benthamiana enumeradas por orden de altura.
103 Material y Métodos infiltración del colorante diamina fenil indol (DAPI), de la misma forma y en los mismos puntos de las hojas en los que se infiltró el cultivo días antes, usando un stock a 5 mg mL-1 diluido en tampón TBS a una concentración de 1:1000 (v/v). Este marcaje se realizó una hora antes de someter las muestras a microscopía confocal (Kapuscinski y Skoczylas, 1977). Solución empleada Tampón TBS Tris HCl pH 7,5 100 mM, NaCl 150 mM Uso del microscopio confocal. Se realizó en colaboración con Carlos Medina Morillas del Departamento de Microbiología. Centro Andaluz de Biología del Desarrollo o CABD de Universidad Pablo de Olavide. Se realizaron cortes de 1 cm x 1 cm de las zonas cercanas a los puntos de infiltración evitando las nerviaciones. Las muestras se colocaron en un portaobjetos con el envés hacia arriba. Se le añadió H2O destilada, se colocó un cubreobjetos y se selló. Las muestras se visualizaron en un microscopio Leica SP2 Laser Scanning Confocal Microscope (Leica Microsystems, Alemania). 2. 13. 6. Estudio de la translocación de los efectores riobianos al interior de la célula de la raíz de la planta. El estudio se realizó mediante la cuantificación de la concentración de AMP cíclico (AMPc), producto generado por la enzima adenilato ciclasa que usa como sustrato de la reacción el ATP. Para ello se siguió la metodología descrita por Schechter et al. (2010) y Wenzel et al. (2010) con ciertas modificaciones. En primer lugar se fusionó el dominio amino terminal de 1218 pb del gen de la adenilato ciclasa (cya) de Bordetella pertusis al extremo amino del gen que codifica para el efector de estudio. La fusión se clonó en el plásmido pK18mob y se integró en el genoma de HH103 mediante conjugación y recombinación simple. Posteriormente, 18 semillas de soja Williams germinadas se colocaron en vasos de precipitado de cristal estériles que contenían 500 mL de vermiculita y 150 mL de solución Fåhraeus 1X. Cada semilla germinada se inoculó con 1 mL de cultivo bacteriano crecido en medio YM que presentaban una densidad óptica a 600 nm de alrededor de 0,8. En estos estudios las semillas se inocularon con la estirpe silvestre HH103 y las estirpes HH103 y HH103 ttsI::Ω que
104 Material y Métodos contenían la fusión nop-cya integrada en el genoma bacteriano). La concentración de AMPc se midió en los nódulos de la raíz a los 18 d.p.i. utilizando el kit Cyclic AMP EIA (Cayman Chemical Company, EEUU), siguiendo las indicaciones del fabricante. La metodología desarrollada por el kit se basa en la competición del AMPc (producido en presencia de la enzima adenilato ciclasa) y de un conjugado (AMPc-AChE), cuya concentración celular es constante, por la unión a un anticuerpo primario específico para AMPc. Las placas de ensayo contenían a su vez un anticuerpo secundario capaz de unirse al primario, independientemente de que estuviera unido al AMPc o al AMPc- AChE. Posteriormente, la placa se lavó y se llevó a cabo la reacción de Ellman y, por último, se midió la absorbancia a 412 nm. La reacción de Ellman se basa en la producción de color amarillo como consecuencia de la presencia de AMPc-AChE en la placa. Por lo tanto, mientras más intenso sea el color amarillo menos AMPc se habrá acumulado, y viceversa. 2. 13. 7. Actividades enzimáticas. Medida de la actividad catalasa. La actividad catalasa se determinó usando el método de Beers y Sizer (1952), que mide la eliminación del H2O2 por el enzima catalasa dando lugar a H2O y O2. Las plantas de soja Williams, no inoculadas o inoculadas conlas estirpes adecuadas, se cultivaron en el sistema de hidroponía en vasos de precipitado. Tras el cultivo, las raíces de las plántulas o plantas se pulverizaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ºC hasta su uso. Posteriormente, se tomaron 0,2 g de extracto y se homogenizaron en un mortero con 2 mL de tampón de extracción, se centrifugó a 4 ºC a 11000 g durante 10 minutos, recuperando el sobrenadante en otro tubo eppendorf que contenía 0,58 g de SO4(NH4)2. La muestra se centrifugó a 4 ºC a 10500 g durante 5 minutos y se retiró el sobrenadante. El pellet se resuspendió en 220 µL de tampón de extracción. La actividad enzimática se midió con 1 mL de mezcla de reacción y 100 µL de la muestra. Se midió el descenso de la absorbancia a 240 nm que produce el consumo del H2O2 en la cubeta durante 2 minutos. La actividad catalasa se expresó en U/mg y se estimó utilizando el coeficiente de extinción molar del H2O2 (39,58 M-1 cm-1), el volumen de la muestra empleado y la concentración de proteínas obtenida con el método Bradford.
105 Material y Métodos Soluciones empleadas Tampón de extracción Tampón fosfato potásico 60 mM pH 7, EDTA 0,1 mM Mezcla de reacción Tampón fosfato potásico 60 mM pH 7, H2O2 30 mM, 100 µL muestra Medida de la actividad superóxido dismutasa (SOD) en gel. La actividad SOD en gel se determinó utilizando los métodos descritos por Beauchamp y Fridovich (1971) y Chipps et al. (2005) con ciertas modificaciones. Las plantas de soja Williams, no inoculadas o inoculadas con las estirpes adecuadas, se cultivaron en el sistema de hidroponía en vasos de precipitado. Tras el cultivo de las plantas, las raíces de las plántulas o plantas se pulverizaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ºC hasta su uso. Posteriormente, se tomaron 0,2 g de extracto y se homogenizó en un mortero con 2 mL de tampón de extracción, se centrifugó a 4 ºC a 11000 g durante 10 minutos, recuperando el sobrenadante en otro eppendorf que contenía 0,58 g de SO4(NH4)2. La muestra se centrifugó a 4 ºC a 10500 g durante 5 minutos y se retiró el sobrenadante. El pellet se resuspendió en 100 µL de tampón de extracción, se cuantificó la concentración de las proteínas mediante el método Bradford y se añadió a la muestra glicerol al 20 % (v/v) y azul de bromofenol al 0,05% (m/v). Seguidamente, se cargó en un gel de poliacrilamida al 12,5% la misma cantidad de proteínas de los diferentes tratamientos que se ensayaron. No se hirvieron las muestras para no desnaturalizar las proteínas. La electroforesis se llevó a cabo a 90 V hasta que el frente alcanzó la parte inferior del gel. Por último, se realizó la tinción con NBT, que consistió en incubar el gel durante 20 minutos en la solución I y los 15 minutos siguientes en la solución II, en condiciones de oscuridad y a 4 ºC. Para revelar el gel, éste se iluminó con luz blanca durante 5-15 minutos. Soluciones empleadas Tampón de extracción Tampón fosfato potásico 60 mM pH 7,8, 1 M NaCl, 0,1 mM EDTA Solución I NBT 2,45*10-3 M diluido en dimetilformamida al 70 % Solución II TEMED 0,028 M y rivoflavina 2,8*10-5 M (diluidos en tampón fosfato potásico 36 mM pH 7,8)
106 Material y Métodos 3. Material y Métodos relacionados con levaduras. 3. 1. Levaduras y plásmidos. Se usó una colección de mutantes derivados de la estirpe silvestre Saccharomyces cerevisiae BY474 dispuestos en una placa microtítulo de 96 pocillos (construida por el Dr. Eran Bosis y cedido por el Dr. Sessa del Departamento de Biología Molecular y Ecología de Plantas. Universidad de Tel Aviv. Israel (Tabla 12). Cada uno de estos mutantes y las distintas copias de la estirpe silvestre dispuestas en la placa (array) se transformaron con los plásmidos pGML10, pMUS1183 (nopL clonado en pGML10) y pMUS1184 (nopP clonado en pGML10), obtenidos mediante la extracción de ADN plasmídico a partir de las correspondientes estirpes de DH5α. Tabla 12. Array de mutantes de S. cerevisiae BY4741 usados en esta Tesis. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A dep1 ctf8 cin8 vps71 spo13 las21 nup133 nup2 sto1 chs1 top1 kes1 B ccr4 swf1 bim1 mad1 slt2 bck1 ric1 fks1 jnm1 rtt106 htz1 cbc2 C lte1 gim3 mot2 kem1 ire1 set2 arp6 dcr2 gas1 rpa49 bub3 alg5 D chs3 nbp2 kar3 spt4 lrp1 pfd1 hog1 cdc73 hda1 bni1 sti1 hsp82 E slx5 eaf1 swi4 pac10 WT hoc1 yke2 rps17a ydj1 cla4 dia2 ctf4 F rpn4 esc2 hac1 dbf2 arp1 nup120 ypt6 rad52 ras2 kre1 npt1 kre6 G arf1 WT psd1 smi1 air1 rad27 sec22 gim5 yaf9 rpd3 lge1 hda3 H gcs1 gim4 dst1 gcn5 mad2 cnb1 chs5 csm3 WT pop2 elp3 WT 3. 2. Método y solución de congelación. Tras cultivar las levaduras en las placas microtítulo en los medios apropiados, la biomasa procedente de 200 µL de cultivo de cada pocillo se resuspendió en 150 µL de una solución compuesta de peptona al 0,5% (m/v) y de glicerol al 15% (v/v) esterilizada en el autoclave durante 20 minutos a una atmósfera de sobrepresión (121 ºC). Las levaduras así preparadas se conservaron a -80 ºC.
107 Material y Métodos 3. 3. Medios de cultivo para S. cerevisiae. Para cultivar S. cerevisiae BY4741 se utilizó el medio rico Yeast Peptone Dextrose (YPD) y un medio completo selectivo suplementado con glucosa al 2% (medio represor), o sacarosa al 2% y rafinosa al 1 % (medio activador). Los cultivos líquidos se incubaron en agitación a 180 r.p.m.. Los medios se solidificaron, cuando fue necesario, añadiendo 20 g L-1 de Bacto-agar. En ambos casos la temperatura de incubación fue de 30 ºC. YPD (Ausubel et al., 1994) Extracto de levadura 10 g Peptona 20 g Glucosa 20 g H2O destilada Completar hasta 1 L El pH se ajustó a 7,0 y el medio se esterilizó en el autoclave durante 20 minutos a una atmósfera de sobrepresión (115 ºC). Medio completo sintético selectivo (Salomon y Sessa, 2010) (NH4)2SO4 5 g Yeast Nitrogen Base (YNB) 1,7 g Glucosa* 20 g Sacarosa* 20 g Rafinosa* 10 g Suplemento DO -Leu/-Trp 0,64 g Na2HPO4 2H2O 1,023 g NaH2PO4 2H2O 0,67 g H2O destilada Completar hasta 1 L El pH se ajustó a 7,0 usando NaOH 10 M y el medio se esterilizó en el autoclave durante 20 minutos a una atmósfera de sobrepresión (115 ºC). *Al medio se le añadió glucosa al 2 % o una mezcla de sacarosa al 2 % y rafinosa al 1 %. 3. 4. Transformación en S. cerevisiae. Se siguió el protocolo descrito por Bosis et al. (2011) con ciertas modificaciones. Se partió del array de S. cerevisiae que se presenta en la Tabla 12. Las levaduras se sembraron en una placa microtítulo de 96 pocillos que contenía 200 μL del medio YPD sólido y se incubó durante dos o tres días a 30 ºC. Posteriormente, se inoculó biomasa de cada pocillo en una nueva placa microtítulo de 96 pocillos que contenía 150 μL de YPD líquido en cada pocillo y se incubó durante toda la noche a 180 r.p.m. a 30 ºC. Transcurrido este tiempo, la placa se centrifugó a 700 g durante 5 minutos descartando el sobrenadante. Las levaduras se resuspendieron en 100 μL de agua destilada estéril y
108 Material y Métodos 25 μL de la resuspensión de cada pocillo se transfirió a otra placa microtítulo de 96 pocillos, a la que previamente se le añadió 75 μL de agua destilada estéril. La placa se centrifugó a 700 g durante 5 minutos descartando el sobrenadante. Seguidamente, las levaduras se resuspendieron en 50 μL de una mezcla de transformación (0,3 M LiAc pH 7,5, 1 mg mL-1 de esperma de salmón previamente hervido, y 4 ng μL-1 del plásmido) y se añadió a cada pocillo 100 μL de polietilenglicol al 50% (m/v). La placa se introdujo en una bolsa de plástico, se selló y se incubó en un baño a 42 ºC durante dos horas. Tras esto, se añadió a cada pocillo 10 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) estéril y se volvió a incubar en las mismas condiciones durante 30 minutos más. La placa se centrifugó a 1500 g durante 10 minutos descartando el sobrenadante. Se añadieron a cada pocillo 100 μL de agua destilada estéril y se centrifugó a 700 g durante 5 minutos, retirando el sobrenadante. Este último paso se realizó dos veces más para lavar las células antes de sembrarlas en el medio correspondiente. Tras el lavado, las levaduras se resuspendieron en 10 μL de agua destilada estéril y se sembraron en un medio completo selectivo (sin leucina) sólido y suplementado con glucosa al 2%. La placa se incubó a 30 ºC durante dos o tres días. 3. 5. Determinación de la función de efectores del T3SS mediante el uso de un array de levaduras. Fundamento de la técnica. Se utilizó la metodología descrita por Bosis et al. (2011) con ciertas modificaciones. La técnica se basa en la doble mutación deletérea de las levaduras o interacción sintética letal (SL, del inglés, Synthetic Lethality), que se define como aquella situación en la que dos genes, no vitales para la levadura cuando se encuentran mutados individualmente, causan letalidad cuando están mutados al mismo tiempo. Para ello se expresaron algunos genes de los efectores del T3SS de S. fredii HH103, clonados en el plásmido pGML10, en el array de levaduras de la Tabla 12. La colección de estirpes está compuesta por 4 réplicas de la estirpe silvestre S. cerevisiae y 92 cepas derivadas que poseen una mutación concreta. Cada mutación afecta a una ruta metabólica principal del microorganismo y cada uno de los genes afectados pueden presentar, al menos, una interacción SL conocida. Como se comentó con anterioridad, estas mutaciones aisladas no son deletéreas, sin embargo, si el efector expresado en dicho mutante afecta a la ruta
109 Material y Métodos alternativa que tiene una función vital junto al gen que se encuentra mutado, el crecimiento de esa cepa se verá comprometido. Finalmente, a partir de todos aquellos mutantes hipersensibles al efector, es decir, cuyo crecimiento se ve afectado debido a la expresión de éste, se buscaron aquellos genes que fuesen congruentes. Toda la información recogida deberá converger en una única ruta metabólica o diana en la que potencialmente puede interferir el efector de estudio (Figura 12). Figura 12. Esquema de la determinación de la función de efectores del T3SS mediante el uso de un array de levaduras. Basada en la figura publicada por Bosis et al. (2011). El medio represor contenía glucosa y el medio activador contenía sacarosa y rafinosa. Metodología. En primer lugar, se partió del array de levaduras dispuesto en una placa microtítulo de 96 pocillos transformado con el plásmido pGML10 vacío o portando los genes que codifican para los efectores del sistema del T3SS de HH103. A continuación, se
211 Resultados 1. Caracterización de la proteína NopL de S. fredii HH103. 1. 1. La proteína NopL de S. fredii HH103 es fosforilada por una quinasa de raíz de soja. Como se ha descrito anteriormente, la proteína NopL de S. fredii NGR234 es fosforilada por quinasas de la célula hospedadora. Los ensayos de fosforilación in vitro realizados por Bartsev et al, (2003) mostraron que este efector es fosforilado por una serina/treonina quinasa de tipo MAPKK o derivada de esta ruta. Para demostrar que la proteína NopL de S. fredii HH103 es fosforilada por quinasas de la raíz de soja, su hospedador natural, se realizaron ensayos de fosforilación in vitro utilizando extractos de proteínas de la raíz de soja Williams y una proteína recombinante compuesta por NopL de S. fredii HH103 fusionada a GST (NopL-GST). 1. 1. 1. Expresión in vitro y purificación de la proteína NopL de S. fredii HH103. En primer lugar, el gen nopL se amplificó mediante PCR usando los cebadores nopLEX-F y nopLEX-R (Tabla 5), que portan las dianas de restricción de las enzimas BamHI y EcoRI, respectivamente. El amplicón se secuenció para determinar que no existía ninguna mutación y se clonó en el vector de expresión de proteínas de fusión a GST pGEX 4T-1, previamente digerido con BamHI y EcoRI, generando el plásmido pMUS1135. Esta construcción contiene el gen gst situado en el extremo amino en fase con el gen nopL, cuya expresión está controlada por el promotor inducible del operón lac. El plásmido pMUS1135 se transformó en la estirpe BL21 de E. coli y la proteína de fusión (NopL-GST) se expresó mediante la activación del cultivo con isopropil-β-D-1- tiogalactopiranósido (IPTG) (Figura 66). La proteína de fusión NopL-GST se purificó para evitar interferencias en los ensayos de fosforilación in vitro que se realizaron posteriormente (Figura 67, A) y se detectó mediante inmunodetección usando un anticuerpo específico anti-GST (Cell Signalling Technology, EEUU) (Figura 67, B). Estos geles presentaban al menos dos bandas que daban señal con el anticuerpo anti- GST. Este hecho podría deberse a que la síntesis de la proteína de fusión se produce en todos los puntos de muestreo (de 0 a 6 horas después de la inducción con IPTG) y la
212 Resultados muestra contendría un gran número de polipéptidos que no se han sintetizado completamente. Figura 66. Expresión de la proteína de fusión NopL-GST en la estirpe BL21 (pMUS1135) tras la inducción del cultivo bacteriano con IPTG. A la derecha de la imagen se indica la banda correspondiente a la proteína de fusión NopL-GST y a la izquierda las masas moleculares (kDa) del marcador (Fermentas, EEUU). Figura 67. Purificación de la proteína de fusión NopL-GST. A, Gel de poliacrilamida teñido con el colorante Coomasie blue. B, Inmunodetección de la proteína NopL-GST. A la derecha de la imagen se indica la banda correspondiente a la proteína de fusión NopL-GST y a la izquierda las masas moleculares (kDa) del marcador (Fermentas, EEUU).
213 Resultados 1. 1. 2. Ensayos de fosforilación in vitro para caracterizar la quinasa que fosforila a NopL de S. fredii HH103. Una vez purificada la proteína recombinante NopL-GST, se realizaron ensayos de fosforilación in vitro para determinar si NopL es fosforilada por quinasas de la raíz de soja Williams. Para este fin se obtuvieron extractos proteicos procedentes de raíces de soja no inoculadas o inoculadas con la estirpe silvestre HH103 y cultivadas durante 4 días, debido a que se desconocía si la quinasa implicada podía ser inducible por la presencia del rizobio. La Figura 68 muestra que la proteína NopL se fosforila por una o más quinasas del extracto de raíz de soja Williams y que la intensidad de la señal obtenida tanto de extractos provenientes de raíces sin inocular o inoculadas con la estirpe silvestre HH103 es similar, por lo que se trata de una quinasa no inducible. En el ensayo se incluyó como control a la proteína GST purificada y se vio que ésta no se encontraba fosforilada (Figura 68). Además, se ensayaron por separado los extractos proteicos de las raíces no inoculadas e inoculadas con la estirpe silvestre para demostrar que la señal detectada no se debía a la fosforilación entre las proteínas presentes en los distintos extractos. En los carriles correspondientes a estos controles, mostrados en la Figura 68, no se detectó ninguna señal de fosforilación. Figura 68. Fosforilación in vitro de la proteína NopL por quinasas de la raíz de soja Williams. En todos los carriles se cargaron las mismas concentraciones de proteínas, tanto recombinante como del extracto de raíz vegetal (no inoculado o inoculado con HH103). A la derecha de la imagen se indican las bandas correspondientes a la proteína NopL-GST y a la GST. A la izquierda se indican las masas moleculares (kDa) del marcador (BioRad, EEUU).
214 Resultados La caracterización de la quinasa que fosforila a la proteína NopL se realizó mediante ensayos de fosforilación in vitro en los que se incubó la proteína NopL-GST con un extracto proteico de la raíz de soja Williams, previamente inoculado con la estirpe HH103 y una serie de inhibidores de quinasas. Se consideró que existía inhibición en los casos en los que la intensidad de la señal de la banda correspondiente a NopL-GST fosforilada presentó un valor menor o igual al 50% con respecto al control sin inhibidores. Los resultados mostrados en la Figura 69 indican que la quinasa involucrada no se inhibió con genisteína, que actúa como inhibidor de las quinasas tipo tirosina quinasa. En cambio, la fosforilación de NopL sí se redujo con un inhibidor de quinasas tipo serina/treonina quinasa (K252a). Este resultado, junto con la inhibición de la fosforilación que se observó tras añadir el compuesto PD98059, que inhibe aquellas quinasas de tipo MAP quinasa quinasa, son concordantes con los datos publicados en el trabajo de Bartsev et al. (2003) sobre la fosforilación de la proteína NopL de S. fredii NGR234. Para determinar si la quinasa que fosforila a NopL depende de calcio se añadieron diferentes compuestos. Entre ellos se usaron el EGTA, que actúa como quelante de calcio, impidiendo que la quinasa que fosforila a NopL disponga del calcio existente en el medio de incubación, el W7, quelante de calmodulina, y KN62, un inhibidor de la proteína calmodulina (CaM) kinasa II. El uso de todos estos compuestos dio como resultado una reducción significativa de la señal de fosforilación de NopL, por lo que la quinasa que fosforila a NopL depende de calcio y calmodulina, pudiendo ser directa o indirectamente una calmodulina (CaM) kinasa II.
215 Resultados Figura 69. Fosforilación in vitro de la proteína NopL por quinasas de la raíz de soja Williams usando distintos inhibidores de quinasas. En todos los carriles se cargaron las mismas concentraciones de proteínas, tanto recombinante como del extracto de raíz vegetal inoculado con HH103 a los 4 d.p.i. Los porcentajes se calcularon mediante el programa informático ImageJ e indican el grado de fosforilación. Se tomó como nivel máximo la intensidad de la señal del control positivo (sin inhibidor). Los valores por debajo del 50% se consideraron como inhibición de la fosforilación (asterisco). A la derecha de la imagen se indica la banda correspondiente a la proteína NopL-GST y a la izquierda las masas moleculares (kDa) del marcador (BioRad, EEUU). 1. 1. 3. Detección de la quinasa de soja responsable de la fosforilación de NopL. Posteriormente y gracias a que el genoma de soja se encuentra disponible en las bases de datos, se intentó determinar qué quinasa de la raíz de soja Williams es la que fosforila al efector NopL de HH103. Para ello se realizaron ensayos de quinasas "en gel", en los que la proteína NopL-GST se encontraba embebida en el gel de poliacrilamida. Las proteínas del extracto de la raíz de soja Williams inoculada con la estirpe HH103 y procesada a los 4 d.p.i., fueron separadas mediante electroforesis usando el gel de poliacrilamida que contiene a NopL-GST. De este modo, la señal de fosforilación detectada en el gel correspondía a la quinasa del extracto que fosforila al efector NopL. En la Figura 70 se observa una intensa señal de fosforilación correspondiente a una banda cuyo tamaño excede los 100 kDa que correspondería a la quinasa que fosforila a NopL. Comúnmente, los geles elaborados para el protocolo de fosforilación en gel se realizan en condiciones desnaturalizantes añadiendo SDS a la mezcla. Sin embargo, muchas quinasas no recuperan la actividad una vez que han sido incubadas con SDS, siendo la principal limitación de esta metodología (Heal et al., 2000). Así, los primeros ensayos se realizaron en condiciones desnaturalizantes sin obtener ningún resultado, por
216 Resultados lo que se decidió desarrollar el método usando geles nativos. Este hecho podría ser el responsable de que durante la electroforesis las proteínas del extracto no avanzaran con fluidez, por lo que la mayoría de ellas permanecieron en la parte superior del gel. Con todo ello, el tamaño real de la quinasa que fosforila NopL no tiene por qué ser diferente a lo indicado por el marcador del peso molecular. La zona enmarcada en la Figura 70, A, que corresponde al gel gemelo, teñido con Coomasie y sin tratar con radiactividad, se recortó, se procesó y las proteínas de la banda fueron secuenciadas. Figura 70. Ensayo de fosforilación "en gel". A, Gel de acrilamida en condiciones no desnaturalizantes (sin SDS) que contiene la proteína de fusión NopL-GST. La imagen de la derecha se corresponde con un gel gemelo teñido con azul de Coomasie (las proteínas del extracto de la raíz de soja no se aprecian con claridad debido a que la concentración que se cargó en cada pocillo fue muy baja). B, Gel de acrilamida en condiciones no desnaturalizantes (sin SDS) que contiene sólo la proteína GST. A la izquierda de cada figura se indican las masas moleculares (kDa) del marcador (gTPbio, gTPbio.com). Entre las proteínas identificadas a partir de la secuenciación de la porción del gel recortado no se identificó ninguna quinasa (Anexo 1). Sin embargo, debido al constante incremento en relación a la información sobre las funciones de los genes de soja, más tarde se realizó una comparación de los péptidos resultantes de la secuenciación frente al genoma de G. max (Tabla 19). Mediante este análisis se identificaron dos quinasas. Una de ellas es un receptor quinasa de tipo HSL1, cuya función en A. thaliana se encuentra relacionada con la actividad de tipo serina/treonina quinasa. La segunda
217 Resultados quinasa identificada en el estudio corresponde con una serina/treonina quinasa de tipo ATR de soja. La quinasa ATR y sus ortólogos juegan un papel fundamental en la regulación del ciclo celular, fosforilando múltiples sustratos para provocar la inhibición del ciclo celular en condiciones de estrés por daño en el ADN (Cortez, 2003). Así, en A. thaliana se ha descrito que esta proteína regula el punto de control de la fase G2 del ciclo celular (Culligan et al., 2004). Los puntos de control son mecanismos moleculares que verifican que se cumplen las condiciones necesarias para permitir el paso de una fase del ciclo celular a otra, impidiendo así que ciertos eventos, como daños en el ADN, trasciendan a lo largo del ciclo. Sin embargo, la función de estas proteínas ha sido ampliamente estudiada en animales y levaduras, mientras que la información que se dispone sobre la función de este tipo de quinasas de plantas es muy escasa. Tabla 19. Proteínas de soja resultantes de la comparación de los péptidos provenientes de la secuenciación a partir de la banda recortada del ensayo de fosforilación ―en gel‖ representado en la Figura 70 (A). Descripción de la proteína (G. max) Número de acceso (NCBI) Serina/treonina quinasa de tipo ATR XP_003535761 Glutamato sintetasa (NADH). Isoforma X3 de tipo amiloplástico XP_006581639 Lipoxigenasa AAA33988 Metionina sintetasa NP_001235794 5-metil-tetrahidropteroiltriglutamatohomocisteína metiltransferasa 1. Isoforma 1 XP_003554033 Linolato 9S-lipoxigenasa de tipo 4 XP_006599243 Proteína no caracterizada LOC100499763 NP_001235680 Posible β-1,3-galactosiltransferasa de tipo 20 XP_003524877 Triptófano sintetasa. Subunidad α BAE95381 Receptor quinasa de tipo HSL1 NP_001241340
218 Resultados 1. 2. La proteína NopL de S. fredii HH103 se localiza principalmente en el núcleo de la célula hospedadora. Hasta la fecha, no se conoce la localización de ningún efector del T3SS de S. fredii HH103 en la célula eucariota. Para intentar determinar la localización de NopL dentro de la célula vegetal, las células epidérmicas de las hojas de la planta N. benthamiana se transformaron con la estirpe A. tumefaciens CV3101 (pMUS1250), de forma que el efector NopL se co-expresa junto a la proteína de fluorescencia amarilla (YFP, del inglés, Yellow Fluorescent Protein) (NopL-YFP). El gen nopL se amplificó con los cebadores nopLattB1 y nopLattB2sinstop que contienen las secuencias necesarias para la clonación del amplicón mediante el sistema Gateway (Invitrogen). El producto de PCR de 1,1 kb se analizó mediante secuenciación y se clonó en el plásmido pDONR207 generando el plásmido pMUS1243. Posteriormente, el gen nopL procedente de pMUS1243 se clonó en el plásmido pEG101 y se fusionó al gen que codifica para la YFP, generándose el plásmido pMUS1250. Para confirmar que las células de las hojas de N. benthamiana expresaban de forma transitoria la proteína de fusión NopL-YFP, se realizó un ensayo de inmunodetección. Para ello se usó un anticuerpo específico del epitopo HA (Cell Signalling Technology, EEUU), ya que éste se coexpresa junto a la proteína de fusión NopL-YFP. Además, se incluyeron los extractos proteicos de hojas de N. benthamiana transformadas con las estirpes que se usaron como control negativo y positivo en los ensayos de microscopía confocal: CV3101 (pEG100), que no expresa la YFP, y CV3101 (pEG104), que sí expresa la YFP, aunque ninguna de estas dos estirpes expresan el epitopo HA. En ambos casos no se observó señal en el western blot, pero sí en el carril que corresponde al extracto de hojas de N. benthamiana en las que se expresó la proteína de fusión NopL-YFP a través de la estirpe CV3101 (pMUS1250) (Figura 71). Los datos obtenidos mostraron que en la mayoría de los ensayos la proteína NopL de S. fredii se localizaba en el núcleo de la célula vegetal (Figura 72 (A)), sin embargo, en otros casos, se observó en el citoplasma de la célula (Figura 72 (B)).
219 Resultados Figura 71. Inmunodetección de la proteína NopL en hojas de tabaco. Las proteínas de cada carril provienen de hojas de N. benthamiana transformadas con las estirpes CV3101 (pEG100), CV3101 (pEG104) y CV3101 (pMUS1250) de A. tumefaciens. A la derecha de cada imagen se indica la banda correspondiente a la proteína NopL-YFP y a la izquierda las masas moleculares (kDa) del marcador (BioRad, EEUU). Figura 72. Localización de la proteína NopL en células foliares de N. benthamiana. Las flechas de color blanco indican la localización de NopL-YFP en el núcleo. Las flechas de color amarillo indican la localización de NopL-YFP en el citoplasma de la célula. A, localización de NopL-YFP exclusivamente en el núcleo. B, localización de NopL-YFP en el núcleo y en el citoplasma. Se realizaron 3 ensayos independientes en los que se analizaron 3 hojas de cada planta.
220 Resultados Las células de las hojas de tabaco poseen una estructura peculiar, presentando una gran vacuola que empuja a todos los componentes del citoplasma hacia la periferia de la célula vegetal. Este fenómeno aumenta la complejidad de determinar la localización exacta de aquellas proteínas que se encuentran en el citoplasma. Sin embargo, tanto en el núcleo como en el citoplasma de la célula eucariota, NopL se encontraba localizada en focos muy claros (Figura 73). Figura 73. Localización de la proteína NopL en el núcleo de la célula foliar de N. benthamiana. 1. 3. Estudios para la identificación de la función del efector NopL de S. fredii HH103 en la célula eucariota. 1. 3. 1. Determinación de posibles dianas conservadas en células eucariotas para identificar la función de NopL. Uso de un array de levaduras. Para intentar identificar la función biológica del efector NopL de S. fredii HH103 en la célula eucariota se utilizó la levadura Saccharomyces cerevisiae, debido a que en los últimos años se han desarrollado metodologías basadas en el uso de este microorganismo para estudiar la implicación de los efectores del T3SS en las rutas conservadas de la célula eucariota (Curak et al., 2009; Jamir et al., 2004; Siggers y Lesser, 2008; Valdivia, 2004). En esta Tesis se utilizó la técnica desarrollada por Bossis et al. (2011) (apartado 3. 5. de Material y Métodos). Para ello, el gen nopL de S. fredii HH103 se amplificó por PCR con los cebadores nopL_pGML10_F y nopL_pGML10_R y el amplicón se clonó en el vector de expresión pGML10, generando el plásmido pMUS1183. Éste se transformó en cada una de las estirpes del array y se observó que la expresión de NopL afectaba al crecimiento de las estirpes de
227 Resultados 2. 1. 2. Ensayos de fosforilación in vitro para caracterizar la quinasa que fosforila a NopP de S. fredii HH103. Una vez que se obtuvo la proteína recombinante NopP-GST, se realizaron ensayos de fosforilación in vitro para determinar si NopP se fosforila por quinasas de la raíz de soja. Para este fin se obtuvieron extractos proteicos procedentes de raíces de soja no inoculadas o inoculadas con la estirpe HH103 a los 4 días de crecimiento. La Figura 76 muestra que la proteína NopP se fosforila por alguna quinasa de la raíz de soja proveniente de raíces no inoculadas o inoculadas, por lo que se trata de una quinasa no inducible. En el ensayo se incluyó como control a la proteína GST purificada y se vio que ésta no se encontraba fosforilada (Figura 76). Además, se ensayaron por separado los extractos proteicos de las raíces no inoculadas e inoculadas con la estirpe silvestre para demostrar que la señal detectada no se debía a la fosforilación entre las proteínas presentes en los distintos extractos. En los carriles correspondientes a estos controles, mostrados en la Figura 76, no se detectó ninguna señal de fosforilación. Por lo tanto, las bandas detectadas y mostradas en la Figura 76 se deben exclusivamente a la fosforilación del efector NopP. Figura 76. Fosforilación in vitro de la proteína NopP por quinasas de la raíz de soja. En todos los carriles se cargaron las mismas concentraciones de proteínas, tanto recombinante como del extracto de raíz vegetal (no inoculado o inoculado con HH103 a los 4 d.p.i.). A la derecha de la imagen se indican las bandas correspondientes a la proteína NopP-GST y a GST. A la izquierda se indican las masas moleculares (kDa) del marcador (BioRad, EEUU).
228 Resultados La caracterización de la quinasa que fosforila a la proteína NopP se realizó mediante ensayos de fosforilación in vitro en los que se incubó la proteína NopP-GST con un extracto proteico de raíz de soja inoculada con la estirpe HH103 y procesada a 4 días, y los mismos inhibidores de quinasas que se utilizaron en el apartado 1. 1. 2. del bloque III de Resultados. Se consideró que existía inhibición en los casos en los que la intensidad de la señal de la banda fosforilada presentó un valor menor o igual al 50% respecto al control positivo (sin inhibidor). La Figura 77 muestra que la quinasa que fosforila a NopP se inhibió por genisteína y, en menor medida, por el compuesto K252a, que actúan como inhibidores de las quinasas tipo tirosina quinasa y serina/treonina quinasa, respectivamente. Sin embargo, esta quinasa no se inhibió mediante la incubación con el compuesto PD98059, que inhibe la fosforilación por quinasas de tipo MAPKK. Los resultados obtenidos fueron muy similares a los publicados por Skorpil et al. (2005), por lo que parece probable que la proteína NopP de las estirpes HH103 y NGR234 de S. fredii sean sustrato de la misma quinasa. Además, se quiso determinar si la quinasa que fosforila a NopP es dependiente de calcio. Para ello se utilizaron los compuestos KN62 (inhibidor de calmodulina (CaM) quinasa II), EGTA (quelante de iones Ca++) y W7 (inhibidor de la calmodulina) y todos ellos redujeron parcialmente la señal de fosforilación. Figura 77. Fosforilación in vitro de la proteína NopP por quinasas de la raíz de soja Williams usando distintos inhibidores de quinasas. En todos los carriles se cargaron las mismas concentraciones de proteínas, tanto recombinante como del extracto de raíz vegetal (no inoculado o inoculado con HH103 a los 4 d.p.i.). Los porcentajes se calcularon mediante el programa informático ―ImageJ‖ e indican el grado de fosforilación. Se tomó como nivel máximo la intensidad de la señal del control positivo (sin inhibidor). Los valores por debajo del 50% se consideraron como inhibición de la fosforilación (asterisco) al igual que el valor 52% (doble asterisco). A la derecha de la imagen se indica la banda correspondiente a la proteína NopP-GST y a la izquierda las masas moleculares (kDa) del marcador (BioRad, EEUU).
229 Resultados 2. 1. 3. Detección de la quinasa de soja responsable de la fosforilación de NopP. Con el fin de tratar de identificar la quinasa que fosforila al efector NopP de S. fredii HH103 se realizaron ensayos de fosforilación en gel. Para ello se utilizó la misma metodología y condiciones que se detallan en el apartado 1. 1. 3. del bloque III de Resultados, descrito para la identificación de la quinasa que fosforila a NopL. En la Figura 78, A se observan dos bandas fosforiladas. La banda de mayor tamaño, de aproximadamente 75 kDa, presentó una señal intensa de fosforilación. La otra banda, de alrededor de 68 kDa, mostró una intensidad de la señal muy inferior a la anterior. Sin embargo, ambas se extrajeron del gel y se procesaron para su posterior secuenciación mediante la técnica LC-MALDI-MS/MS. Figura 78. Ensayo de fosforilación ―en gel‖. A, ensayo con la proteína NopP. La imagen de la derecha corresponde con el gel gemelo teñido con azul de Coomasie (las proteínas del extracto de la raíz de soja no se aprecian con claridad debido a que la concentración que se cargó en cada pocillo fue muy baja). B, Control negativo: ensayo con la proteína GST. A la izquierda de cada figura se indican las masas moleculares (kDa) del marcador (gTPbio, gTPbio.com). A partir de las proteínas resultantes de la secuenciación (Anexo 2), cuyos parámetros se encontraron dentro de los considerados como significativos, no se identificó ninguna quinasa. Por otro lado, se realizó una comparación de los péptidos resultantes de la
230 Resultados secuenciación frente al genoma de soja debido a la constante incremento de información sobre las funciones de los genes de esta planta (Tabla 22). Tabla 22. Proteínas de soja Williams resultantes de la comparación de los péptidos provenientes de la secuenciación de las proteínas de las bandas de aproximadamente 75 y 68 kDa del ensayo de fosforilación ―en gel‖ (Figura 78). Banda de ~ 75 kDa (G. max) Número de acceso 5-metil-tetrahidropteroil triglutamato homocisteína metiltransferasa 1 XP_003554033 Banda de ~ 68 kDa (G. max) Número de acceso Fructoquinasa de tipo 2 XP_003541157 Fosfoglicerato mutasa independiente de 2,3-bifosfoglicerato XP_003534616 Malato deshidrogenasa de tipo citoplasmática NP_001243291 Proteína no caracterizada LOC100500685 NP_001237941 El análisis de la secuenciación de las proteínas de la banda de mayor tamaño, en la que se observó la señal de mayor intensidad, dio lugar a la identificación de una sola proteína, de tipo metiltransferasa. Este hecho puede deberse a que la técnica que se utilizó es efectiva para secuenciar las proteínas más abundantes de la muestra y de esta forma enmascara el resto de las proteínas presentes en la misma, entre las cuales podría encontrarse la quinasa responsable de la fosforilación de NopP. Entre las proteínas identificadas en el ensayo solo se encontró una quinasa, procedente de la secuenciación de la banda de menor tamaño, una fructoquinasa de tipo 2. Los azúcares suponen un componente crítico en el metabolismo de la célula y estos productos, fruto de la fotosíntesis, intervienen en casi todos los procesos de la célula vegetal. Además, son importantes señales que intervienen entre el estatus metabólico y en la inducción de diversos estreses de origen biótico o abiótico (Lastdrager et al., 2014). De esta manera, las proteínas de tipo fructoquinasa, cuyo sustrato de fosforilación es la fructosa, sirven como parte de la maquinaria que censa los niveles de estos azúcares (Smeekens y Hellmann, 2014).
231 Resultados 2. 2. La proteína NopP de S. fredii HH103 se localiza en el núcleo y en el citoplasma de la célula hospedadora. Para determinar la localización del efector NopP en la célula eucariota las células epidérmicas de las hojas de la planta N. benthamiana se transformaron con la estirpe A. tumefaciens CV3101 (pMUS1252) para poder expresar la proteína NopP fusionada a la proteína fluorescente amarilla o YFP (NopP-YFP). El gen nopP se amplificó con los cebadores attB1nopP y attB2nopPsinstop (Tabla 5) que contienen las secuencias necesarias para la clonación del amplicón mediante el sistema Gateway (Invitrogen, EEUU). El producto de PCR de 0,8 kb se analizó mediante secuenciación y se clonó en el plásmido pDONR207 generando la construcción pMUS1238. Posteriormente, el gen nopP, subclonado en este plásmido, se clonó en el vector para la transformación de plantas pEG101, fusionándose al gen que codifica para la YFP y generándose el plásmido pMUS1252. Para confirmar que las células de las hojas de N. benthamiana expresaban de forma transitoria la proteína de fusión NopP-YFP se realizó un ensayo de inmunodetección en el que se utilizó un anticuerpo específico que reconoce el epitopo HA (Cell Signalling Technology, EEUU), ya que éste se coexpresa junto a la proteína de fusión NopP-YFP y se encuentra situado en su extremo carboxilo. Además, se incluyeron los extractos proteicos de hojas de N. benthamiana transformadas con las estirpes que se usaron como control negativo y positivo en los ensayos de microscopía confocal: CV3101 (pEG100), que no expresa la YFP, y CV3101 (pEG104), que sí expresa la YFP, aunque ninguna de estas dos estirpes expresan el epitopo HA. En ambos casos no se observó señal en el Western-blot, pero sí en el carril que corresponde al extracto de hojas de N. benthamiana en las que se expresó la proteína de fusión NopP-YFP (Figura 79).
232 Resultados Figura 79. Inmunodetección de la proteína NopP. Las proteínas de cada carril provienen de hojas transformadas con las estirpes CV3101 (pEG100), CV3101 (pEG104) y CV3101 (pMUS1252) de A. tumefaciens. A la derecha de la imagen se indica la banda correspondiente a la proteína NopP-YFP ya la izquierda las masas moleculares (kDa) del marcador (BioRad, EEUU). La Figura 80 muestra que la proteína NopP se localizaba tanto en el citoplasma como en el núcleo de la célula eucariota y, al igual que ocurrió en el caso del efector NopL, se observó en el núcleo en focos localizados (Figura 81). Figura 80. Localización de la proteína NopP en el núcleo y el citoplasma de la célula foliar de N. benthamiana. Las flechas de color blanco indican la localización de NopP- YFP en el núcleo y/o la posición de éste. Se realizaron 3 ensayos independientes en los que se analizaron 3 hojas de cada planta.
233 Resultados Figura 81. Localización de la proteína NopP en el núcleo de la célula foliar de N. benthamiana. 2. 3. Estudios para la identificación de la función del efector NopP de S. fredii HH103 en la célula eucariota. 2. 3. 1. Determinación de posibles dianas conservadas en células eucariotas para identificar la función de NopP mediante el uso de un array de levaduras. Para intentar identificar la función biológica del efector NopP de S. fredii HH103, al igual que NopL, se utilizó la técnica desarrollada por Bossis et al. (2011) (apartado 3. 5. de Material y Métodos). Para ello, el gen nopP de S. fredii HH103 se amplificó por PCR con los cebadores nopP_pGML10_F y nopP_pGML10_R (Tabla 5) y el amplicón se clonó en el vector de expresión pGML10, generando el plásmido pMUS1184. El plásmido se transformó en cada una de las estirpes del array y se observó que la expresión de NopP afectaba al crecimiento de las estirpes de levadura mutadas en los genes dep1, ccr4, csm3, chs1, bub3 y alg5 (estirpes hipersensibles al efector). Posteriormente, se analizaron los genes congruentes para NopP. Ya que un gen se define como congruente con un efector determinado si el conjunto de interacciones SL solapa con las estirpes hipersensibles para ese efector, se analizaron todos los genes que fueron sintéticos letales con alguna de las estirpes hipersensibles para el efector en estudio (Tabla 23) y mediante los análisis probabilísticos pertinentes se determinó que tanto taf1, como bim1 y cik1 son genes congruentes para el efector estudiado.
234 Resultados Tabla 23. Determinación de los genes de S. cerevisiae congruentes para NopP. Gen Solapamientos SL Total dep1 ccr4 csm3 chs1 bub3 alg5 Valor-p* Puntuación taf1 4 27 1 1 1 1 5,05E-07 6,3 bim1 4 29 1 1 1 1 6,82E-07 6,17 cik1 3 13 1 1 1 5,17E-06 5,29 kar3 3 23 1 1 1 3,16E-05 4,5 cln2 2 5 1 1 8,52E-05 4,07 stb5 2 5 1 1 8,52E-05 4,07 srb2 2 6 1 1 1,28E-04 3,89 soh1 2 7 1 1 1,78E-04 3,75 sic1 2 8 1 1 2,38E-04 3,62 lsm7 2 8 1 1 2,38E-04 3,62 lsm6 2 8 1 1 2,38E-04 3,62 nat1 2 9 1 1 3,05E-04 3,52 lsm1 2 9 1 1 3,05E-04 3,52 mrc1 2 10 1 1 3,81E-04 3,42 spt3 2 11 1 1 4,65E-04 3,33 vps72 2 11 1 1 4,65E-04 3,33 yke2 2 11 1 1 4,65E-04 3,33 vps71 2 12 1 1 5,57E-04 3,25 rad50 2 12 1 1 5,57E-04 3,25 cdc73 2 15 1 1 8,82E-04 3,05 arp6 2 15 1 1 8,82E-04 3,05 ctf8 2 16 1 1 1,01E-03 3 arp1 2 16 1 1 1,01E-03 3 * El valor p deriva de la distribución hipergeométrica y se calculó de acuerdo con Kramer et al. (2007). La puntuación hace referencia a la congruencia de cada gen con NopL y se define como el logaritmo negativo en base 10 del valor p. Los genes congruentes se estudiaron mediante la aplicación web ―FuncAssociate 2.1‖ para identificar los procesos celulares más probables en los que el efector pudiese estar implicado. De esta forma, se determinó que NopP podría estar involucrado en los procesos celulares que se llevan a cabo en el núcleo de la célula hospedadora, relacionándose su migración al núcleo de la célula con el transporte a través del citoesqueleto (Tabla 24).
235 Resultados Tabla 24. Análisis de los procesos celulares a través de ―FuncAssociate 2.1‖ usando los genes congruentes para NopP. N X LOD P P_adj Identidad del proceso celular Procesos celular 2 17 2,831 2,04E-05 0,014 GO:0005881 Microtúbulo citoplasmático 2 20 2,754 2,84E-05 0,014 GO:0010970 Transporte basado en microtúbulos 2 20 2,754 2,84E-05 0,014 GO:0030473 Migración nuclear a través de microtúbulos 2 20 2,754 2,84E-05 0,014 GO:0030705 Transporte intracelular a través del citoesqueleto 2 20 2,754 2,84E-05 0,014 GO:0072384 Transporte de orgánulos a través de microtúbulos 2 23 2,689 3,79E-05 0,018 GO:0007018 Movimiento basado en microtúbulos 2 24 2,669 4,13E-05 0,021 GO:0007097 Migración nuclear 2 24 2,669 4,13E-05 0,021 GO:0040023 Establecimiento de la localización nuclear 2 26 2,632 4,86E-05 0,026 GO:0006928 Movimiento del componente celular 2 37 2,470 9,95E-05 0,034 GO:0005819 Huso N, número de entidades cuestionadas que tiene la cualidad de la fila. X, número total de entidades que tiene la cualidad de la fila. LOD, logaritmo en base 10 de la probabilidad de que un proceso celular se relacione con los genes congruentes para un efector. P, valor p. P-adj. Valor p ajustado a partir del remuestreo. 2. 3. 2. Identificación de proteínas que interaccionan con NopP en hojas de la planta modelo Nicotiana benthamiana. Para conocer qué proteínas vegetales podrían interaccionar con NopP de HH103 se realizó un ensayo de inmunoprecipitación. Para ello, NopP se expresó de forma transitoria en las hojas de N. benthamiana que se transformaron con la estirpe A. tumefaciens CV3101 (pMUS1252). Las proteínas co-inmunoprecipitadas con NopP, es decir, aquellas que podrían interaccionar con el efector NopP, se secuenciaron y se obtuvieron una serie de candidatos que se encuentran recogidos en la Tabla 25. Estas proteínas provienen de una selección basada en la aparición de la proteína en las muestras analizadas, no identificada en el control negativo, además de encontrarse
236 Resultados altamente representada en cuanto a número de péptidos y no relacionarse con los procesos que ocurren en el cloroplasto. Tabla 25. Secuenciación de las proteínas del extracto de hojas de N. benthamiana que interaccionan con la proteína NopP, procedentes de los ensayos de inmunoprecipitación. Número de acceso Descripción de la proteína (Especie) AA kDa pI A0A9R6 Histona H4 (Nicotiana tabacum) 103 11,4 11,47 P46942 Proteína DB10 del tipo helicasa de ARN dependiente de ATP (Nicotiana sylvestris) 607 65,9 9,51 O23826 Proteína relacionada con quinesina de 125 kDa (Nicotiana tabacum) 1006 113,6 5,81 C1K125 Proteína de resistencia (quinasa) (Nicotiana repanda) 166 18,3 8,87 Q95DV4 NADH deshidrogenasa, subunidad ND1 (Nicotiana tomentosiformis) 158 18,1 6,67 Q9FVE9 Aconitato hidratasa (Nicotiana tabacum) 898 98,0 6,29 G5ELZ3 Ciclofilina 40 (Nicotiana tabacum) 362 40,3 6,67 Q93YE1 Proteína de cubierta (Nicotiana tabacum) 70 8,3 5,52 Q9SLX4 Factor Sigma Proteína de cubierta (Nicotiana tabacum) 508 57,4 9,01 Q6JBD8 Proteína tipo N (Nicotiana tabacum) 941 108,3 6,54 A2V6V3 Quinasa de tipo receptor lectina (Nicotiana tabacum) 677 76,2 6,62 Q5M9Y0 Proteína no caracterizada (Nicotiana tabacum) 155 17,9 9,99 Q5VJV0 ACC sintetasa ACS3b (Nicotiana attenuata) 485 54,7 6,47 A0A076FN02 GRAS2 (Nicotiana tabacum) 583 65,2 7,42 Q93XN0 Sununidad α de la CK2 (Nicotiana tabacum) 333 39,4 8,10 Se realizaron dos réplicas de este ensayo y se incluyeron únicamente las que se detectaron en ambas réplicas y las que no se encuentran relacionadas con los procesos que ocurren en el cloroplasto, además de descartar aquellas que se unieron a la inmunoglobulina G (IgG) o a la resina, usado como control negativo del método. AA, aminoácidos. pI, punto isoeléctrico.
243 Discusión de modelos Rhizobium-leguminosa. De hecho, en esta estirpe, la secreción de Nop es independiente de flavonoides y parece ser estas proteínas son secretadas de forma constitutiva. Aún así, para descartar esta hipótesis, se realizaron ensayos de nodulación con plantas de soja Williams inoculadas con una estirpe que posee un alto número de copias del gen que codifica el regulador transcripcional ttsI sobre un fondo genético mutante en nodD1 (incapaz de sintetizar factores Nod y, por tanto, de responder a los flavonoides, e incapaz de secretar proteínas Nop). Estos experimentos demostraron que la estirpe HH103 nodD1::Ω (ttsI) puede inducir la formación de nódulos en plantas de soja a través de la acción del T3SS independientemente de los factores Nod. Sin embargo, el número de nódulo fijadores formados fue muy bajo (alrededor de un 90% menos que la estirpe silvestre) y, además, no todas las plantas ensayadas fueron capaces de nodular (Tabla 26). Todos estos resultados indican que el efecto descrito del T3SS por Okazaki et al. (2013) no es el principal motivo de la menor expresión de los genes NIN y ENOD40 en la raíz de soja Williams inducida por la estirpe mutante HH103 ttsI::Ω con respecto a la estirpe parental HH103. Tabla 26. Respuesta a la inoculación de soja Williams con las estirpes S. fredii HH103, HH103 nodD1::Ω, HH103 nodD1::Ω (ttsI), HH103 nodA::Tn5-lacZ y HH103 (ttsI). Ensayo 1 Ensayo 2 Estirpe inoculada Plantas ensayadas Plantas noduladas Nódulos/ Planta nodulada Plantas ensayadas Plantas noduladas Nódulos/ Planta nodulada Sin inocular 6 0 0 6 0 0 HH103 6 6 46,3 ± 19,8 10 10 52,1 ± 12,6 HH103 nodD1::Ω 6 0 0 6 0 0 HH103 nodD1::Ω (ttsI) 6 4 4,25 ± 2,06* 10 4 6,5 ± 7,4* HH103 nodA::Tn5-lacZ 6 0 0 6 0 0 HH103 (ttsI) 6 6 63,83 ± 20,62 10 10 61,16 ± 17,03 Los valores se tomaron 6 semanas después de la inoculación. Las bacterias aisladas de los nódulos formados por cada inoculante mostraron los marcadores de resistencia esperados. Los valores del número de nódulos por planta de la estirpe HH103 nodD1::Ω (ttsI) se compararon individualmente con los de la estirpe parental usando el test no paramétrico de Mann-Whitney. Los números de la misma columna seguidos de un asterisco son significativamente diferentes a un nivel α = 5%.
244 Discusión Hasta el momento, los resultados obtenidos mostraron que existía una reducción del número de nódulos, un retraso en su aparición y una menor expresión de los genes de nodulación en las raíces de soja Williams inoculadas con la estirpe mutante HH103 ttsI::Ω con respecto a las inoculadas con la estirpe parental. Para estudiar si los efectos observados son debidos a la respuesta de defensa activada en la planta de soja tras el reconocimiento del rizobio y a la supresión de estos mecanismos de defensa por el T3SS, se realizaron numerosos ensayos relacionados con los diferentes mecanismos de defensa activados por los organismos fitopatógenos en sus plantas hospedadoras. Entre estas respuestas se estudiaron la producción de depósitos de calosa, la producción de ROS, los cambios en la expresión de genes relacionados con la defensa, los cambios en el balance hormonal y la activación de una respuesta de defensa sistémica. El reconocimiento de los MAMP suele inducir rápidamente la producción de depósitos de calosa, que se acumulan en el lugar de penetración del patógeno y tiene como finalidad el desarrollar una barrera física para evitar la colonización y dispersión del patógeno (Aist y Bushnell, 1991; He et al., 2007; Millet et al., 2010). La acumulación de calosa en las células epidérmicas de la raíz de soja Williams se estudió como una de las primeras aproximaciones para determinar si HH103 y sus derivados son capaces de activar las respuestas de defensa en soja. De esta forma se observó que tanto la estirpe silvestre HH103 como los mutantes derivados HH103 ttsI::Ω y HH103 nodA::Ω (incapaz de producir factores Nod) indujeron la acumulación de un número de depósitos de calosa similar en las raíces de soja entre los diferentes tratamientos (Figura 22). Estos resultados parecen indicar que el reconocimiento del rizobio por parte de la planta activa este mecanismo de respuesta de defensa, que no depende ni de los factores Nod, ni de la estructura y ni de los efectores del T3SS. Durante la patogénesis, el reconocimiento de las MAMP puede dar lugar a la producción de ROS. Estos compuestos se suelen acumular rápidamente durante la HR en un proceso llamado estrés oxidativo. Entre sus funciones se encuentran la de eliminar a los microorganismos, reforzar la pared celular e inducir la expresión de los genes relacionados con la respuesta de defensa. Sin embargo, en el caso de la simbiosis Rhizobium-leguminosa, la producción de ROS, especialmente el peróxido de hidrógeno, no solo tiene una función antimicrobiana, sino que también son necesarias para la organogénesis del nódulo, jugando un papel importante tanto en los primeros estadios
245 Discusión de la simbiosis como en la promoción del crecimiento de los pelos radicales (Apel y Hirt, 2004; Monshausen et al., 2007; Neill et al., 2002; Puppo et al., 2013). Para determinar los niveles de ROS producidas en las raíces de soja en respuesta a la inoculación con HH103 y el mutante afectado en el T3SS durante los primeros estadios de la nodulación, se cuantificó la actividad catalasa y la expresión de genes que codifican enzimas peroxidasas, ambos parámetros relacionados directamente con los niveles de peróxido de hidrógeno. Además, se midieron los niveles de MDA como indicador del daño producido por la producción y acumulación de ROS en los tejidos. En general, el reconocimiento de la estirpe HH103 y del mutante HH103 ttsI::Ω desencadenó la producción de ROS (actividad catalasa) rápidamente (2 h.p.i.), sin observarse diferencias significativas entre los tratamientos (Figura 24, A). Algunos autores indican que las ROS pueden formar parte de una respuesta de defensa para limitar la infección por el simbionte. Así se evitaría la entrada de un gran número de bacterias o de otras especies no compatibles, como han demostrado diversos trabajos en los que se produce una respuesta HR en interacciones Rhizobium-leguminosa (Parniske et al., 1990; Santos et al., 2001; Vasse et al., 1993). Con el paso del tiempo los niveles de ROS (expresión de los genes que codifican para peroxidasas, actividad catalasa y cuantificación de MDA) presentaron diferencias entre los tratamientos, siendo la acumulación mayor en las raíces inoculadas con la estirpe silvestre HH103 con respecto a las inoculadas con la estirpe mutante HH103 ttsI::Ω [Figuras 23, 24, (A, B y C) y 25]. El patrón diferencial en la producción de ROS entre la estirpe silvestre y el mutante se correlaciona positivamente con los niveles de expresión de los genes indicadores del proceso de nodulación, NIN y ENOD40 (Figuras 17 y 18). Estos resultados están en concordandia con los estudios en los que se sugieren que las ROS son moléculas necesarias para la formación y progresión del tubo de infección o son señales requeridas para la activación de diversos genes de la planta y/o el rizobio (Chang et al., 2009; Saeiki, 2011; Soto et al., 2011). La deposición de calosa y la producción de ROS son respuestas defensivas bien conocidas y son comunes en las plantas infectadas por patógenos e, incluso por bacterias simbiontes. Sin embargo, existen otros tipos de respuestas que principalmente se han descrito en las relaciones patogénicas, como es el caso de la producción de SA y la activación del gen PR1, procesos íntimamente ligados a la resistencia SAR (Wang et
246 Discusión al., 2005). En el caso de las relaciones simbióticas y de la interacción de las plantas con PGPR, se ha desmostrado que el reconocimiento de este tipo de microorganismos pueden desencadenar en la planta una resistencia similar, llamada ISR. Sin embargo, los mecanismos que desembocan en la ISR no dependen de SA y no se encuentran asociados con la acumulación de proteínas PR (Van Loon y Strein, 1999). Aunque estas diferencias se han establecido en los últimos años, la información sobre las respuestas de defensa relacionadas con la simbiosis Rhizobium-leguminiosa es muy escasa. Además, López-Baena et al. (2009) demostraron que el reconocimiento de la estirpe HH103 por la soja activa la transcripción del gen GmPR1 y que el T3SS suprime esta respuesta. El gen GmPR1 codifica la proteína PR1 y su activación es dependiente de SA (Mazarei et al., 2007). Por este motivo, se decidió realizar la cuantificación de la expresión de este gen y de la concentración de SA y así poder dilucidar si el reconocimiento de la estirpe simbionte HH103 dispara en la planta de soja una respuesta similar a la producida en el caso de las relaciones patogénicas y estudiar el papel del T3SS en la supresión de esta respuesta. Los resultados obtenidos mostraron que el gen GmPR1 presentaba un pico de expresión máximo a los 2 d.p.i. en las plantas que fueron inoculadas con la estirpe parental HH103, reduciéndose estos valores con el tiempo hasta ser similares al control sin inocular. Sin embargo, en las plantas inoculadas con la estirpe mutante HH103 ttsI::Ω el gen GmPR1 se expresó más que el control en todo momento, llegando a su máxima expresión a los 4 d.p.i. (Figura 31). Para comprobar si los niveles de expresión de este gen se correlacionan con los cambios en la producción de SA, se determinó la concentración de la hormona en las raíces de las plantas de soja Williams. La metodología que suele utilizarse para la extracción de SA resulta un proceso costoso, a nivel económico y de tiempo, y la cuantificación química de esta hormona requiere laboratorios especializados. Por esta razón, se decidió utilizar en primer lugar el biosensor Acinetobactersp. ADP1_lux, que ya había sido usado con anterioridad para la cuantificación de SA en las hojas de tabaco y que está considerado como un método eficaz, sencillo, rápido y de bajo coste (Huang et al., 2006). La utilización del biosensor para la cuantificación de SA reveló que la inactivación del gen ttsI causaba un incremento de la concentración de SA en las raíces y las hojas de soja Williams con respecto a las plantas control sin inocular y a las inoculadas con la
247 Discusión estirpe parental HH103 (Figura 26). Esta primera aproximación permitió descartar aquellos tratamientos que no afectaban a la producción de SA, facilitando la validación de la cuantificación de esta hormona mediante HPLC solo para aquellos tratamientos que fueron relevantes y así reducir el coste económico del estudio. Posteriormente, los resultados sobre la producción de SA mediante la utilización del biosensor se validaron mediante HPLC, obteniéndose resultados similares (Figura 27). Por lo tanto, el protocolo descrito detalladamente en esta Tesis demuestra que el uso del biosensor podría ser una buena herramienta para la determinación de la concentración de SA en las raíces de las plantas, especialmente en los estudios relacionados con las interacciones planta-patógeno, en los cuales las respuestas de defensa inducidas por un patógeno sobre la planta son más fuertes. Además, los análisis realizados mediante HPLC mostraron que el pico temprano de expresión del gen GmPR1 en las plantas inoculadas con la estirpe silvestre HH103 a los 2 d.p.i. podría estar relacionado con el previo incremento de la producción de SA que se produjo a las 2 h.p.i. en las plantas inoculadas con la misma estirpe y no con la estirpe mutante HH103 ttsI::Ω (Figuras 27 y 31). Esta rápida producción de SA inducida por la estirpe silvestre HH103 podría deberse a la presencia de una o más moléculas dependiente/s de TtsI que actúe/n como MAMP, activando las respuestas de defensa relacionadas con la MTI. Entre los candidatos a esta/s molécula/s podrían encontrarse las flagelinas, u otras moléculas secretadas a través del T3SS, e incluso las proteínas que conforman el pilus del T3SS. Por otro lado, este efecto podría deberse a los productos de degradación de la pared celular vegetal que se generan durante la inserción del pilus en la célula hospedadora (DAMP). Los genes gunA y gunA2, presentes en el cromosoma de B. japonicum USDA110, codifican enzimas endogluconasas, actividad responsable de la degradación de la pared celular eucariota. Además, el gen gunA también se ha identificado en la estirpe HH103 de S. fredii, presentando en su región promotora una caja tts (Vinardell et al., 2015), por lo que es posible que esta proteína sea secretada a través del T3SS. Con todo ello, GunA podría ser la proteína dependiente de TtsI responsable de la degradación de la pared eucariota para la inserción del pilus, lo que causaría la producción de DAMP y, consecuentemente, la activación de las respuestas relacionadas con la MTI. Los resultados descritos sobre el efecto del SA en la nodulación dependen de la concentración del SA aplicado, así como de la especie de leguminosa, el método de
248 Discusión aplicación y las condiciones de crecimiento usadas (Ferguson y Mathesius, 2014). Sin embargo, la mayoría de los estudios realizados con soja indican que el SA posee un efecto negativo sobre la nodulación, causando una reducción del número de nódulos y afectando al desarrollo de la planta (Lian et al., 2000; Sato et al., 2002). Los estudios realizados en esta Tesis mostraron que la adición exógena de SA directamente sobre la solución nutritiva de las plantas propicia la activación de la expresión del gen GmPR1 en las raíces de soja Williams. Además, el SA exógeno afectó al número de nódulos, reduciéndose significativamente con respecto al control sin tratar (Figura 35 y Tabla 13). Estos resultados se encuentran en concordancia con los descritos anteriormente y con aquellos en los que se expresó de forma transgénica el gen que codifica la enzima NahG en plantas que desarrollan nódulos determinados (L. japonicus) e indeterminados (M. truncatula). Ya que la NahG posee actividad salicilato hidrolasa, actuando sobre la degradación del ácido salicílico hacia piruvato y acetil CoA, se consiguió reducir el contenido de SA endógeno. Con ello se observó un incremento en la formación de los tubos de infección, en el crecimiento de la raíz y en el número de nódulos (Stacey et al., 2006). Algunos efectores de patógenos pueden promover la virulencia influyendo sobre el balance de las fitohormonas a través de la activación de las MAPK. Por ejemplo, el efector AvrB de P. syringae actúa en la MTI y en la ETI, a través de la fosforilación de RIN4 y MPK4 para inducir la transcripción de los genes responsables de la síntesis de JA en A. thaliana (He et al., 2004; Cui et al., 2010). La quinasa MPK4 de soja se considera un regulador negativo de la producción de SA, ROS y de la activación de los genes PR en las respuestas de defensa y, por otro lado, se considera un regulador positivo en el crecimiento y desarrollo de la planta (Liu et al., 2011; 2014). Aunque la mayoría de las MAPK se encuentran reguladas post-traduccionalmente a través de la activación mediante fosforilación, existen otras MAPK, como WIPK de tabaco, que se inducen a nivel transcripcional en respuesta a diversos estreses y al ataque por patógenos (Zhang y Klessig, 1998; Zhang et al., 2000). Por esta razón, se decidió medir la expresión del gen GmMPK4 en las raíces de soja inoculadas con las estirpes HH103 y el mutante derivado incapaz de secretar proteínas Nop, y estudiar así el papel del T3SS en la defensa. La inoculación de las plantas de soja Williams con la estirpe silvestre HH103 indujo transitoriamente la transcripción del gen GmMPK4 en las raíces inoculadas a los 2 d.p.i., reduciéndose los niveles de expresión con el tiempo. Por otro
249 Discusión lado, los niveles de transcripción de este gen en las plantas inoculadas con la estirpe mutante HH103 ttsI::Ω fueron similares a los de las plantas control sin inocular, sin embargo, a los 4 d.p.i. la expresión de este gen se redujo considerablemente (Figura 37). La expresión diferencial del gen GmMPK4 se correlaciona con los resultados observados sobre la producción de SA y la expresión del gen GmPR1 (Figuras 27, 31 y 37). Además, estos datos sugieren que los efectores secretados a través del T3SS de HH103 no solo promueven la activación de GmMPK4, sino que previenen la represión del gen. De esta forma se consigue evitar el aumento de SA, ROS y la activación de los genes PR, y a su vez se promueve el crecimiento y el desarrollo de la planta. En general, se han descrito dos rutas principales de MAPK involucradas en la defensa de la planta, aunque el efecto sobre la regulación de las respuestas de defensa por cada una de las rutas depende de la especie vegetal. En A. thaliana, ambas rutas regulan finalmente la actividad del factor de transcripción WRKY33, perteneciente a la familia de reguladores WRKY y que activa la transcripción de genes relacionados con la defensa. En soja, se han realizado estudios mediante el silenciamiento del gen GmMPK4, que codifica para la quinasa MPK4, quinasa que actúa en la ruta MKK1- MKK2/2-MPK4. Los autores observaron a través de este silenciamiento que el gen ortólogo a WRKY33 de A. thaliana se transcribía más que el resto de los genes que codifican los factores de transcripción de la familia WRKY (Liu et al., 2011). Este hecho pone de manifiesto la importancia de WRKY33 en la activación de las respuestas de defensa mediadas por unos bajos niveles de la quinasa MPK4 de soja. En nuestro caso, la inoculación de las plantas de soja Williams con la estirpe mutante HH103 ttsI::Ω indujo transitoriamente la transcripción del gen GmWRKY33 en las raíces inoculadas a los 8 d.p.i. Sin embargo, estos niveles de expresión no se observaron en las raíces de las plantas inoculadas con la estirpe parental HH103 (Figura 39). El balance de expresión de los genes GmMPK4 y GmWRKY33 puede correlacionarse debido a su regulación. Así, los efectores del T3SS promovieron a los 2 d.p.i. la expresión del gen GmMPK4 y previnieron su represión a los 4 d.p.i., para impedir por completo la producción de la quinasa MPK4 y la activación de las respuestas de defensas mediante la activación de la transcripción de GmWRKY33. En cambio, los efectos producidos como consecuencia de la ausencia del T3SS mediante la represión de este gen a los 4 d.p.i., se correlacionaron con la activación del gen GmWRKY33 a los 8 d.p.i. En el caso de las relaciones patogénicas se han descrito efectos similares. Así, la inoculación de
250 Discusión plantas de A.thaliana con un mutante del patógeno Salmonella enterica subsp. enterica serovar typhimurium 14028, que posee un T3SS no funcional, promovió a las 24 horas la expresión de una serie de genes relacionados con la defensa, entre los que se encuentra WRKY33 (Garcia et al., 2014; Schikora et al., 2011). El momento exacto en el que un rizobio es detectado por los mecanismos de defensa de la planta no se encuentra bien definido debido a los escasos estudios sobre el tema. Por este motivo, el momento de activación de algunos mecanismos de defensa en la relación simbiótica Rhizobium-leguminosa, como la activación del gen GmMPK4 y GmWRKY33, han sido descritos por primera vez en esta Tesis. Diversos estudios han demostrado que el ET juega un papel negativo en la nodulación, afectando a la formación del tubo de infección, la regulación del número total de nódulos, así como la morfología y la posición de éstos. Sin embargo, los efectos inhibitorios del ET sobre la nodulación en las plantas de soja no están claros, aunque sí se ha determinado que el ET afecta la arquitectura de la raíz de soja (Ferguson y Mathesius, 2014; Schmidt et al., 1999). También se ha descrito que las plantas de soja tratadas con altas dosis de ET desarrollan un engrosamiento del hipocótilo (Hoffman et al., 1999). Estos resultados podrían relacionarse con el fenotipo observado en las raíces de soja Williams inoculadas con la estirpe mutante HH103 ttsI::Ω, en las que se produjo una drástica interrupción del crecimiento de la raíz principal a los 8 d.p.i. (Figuras 14 y 15). Los resultados obtenidos en esta Tesis mostraron que los niveles de ET observados fueron mayores en las raíces de soja inoculadas con la estirpe mutante HH103 ttsI::Ω respecto a los valores de las inoculadas con la estirpe silvestre, pero estas diferencias no fueron estadísticamente significativas (Figura 30). Por otro lado, los altos niveles de SA se encuentran parcialmente asociados con la deformación y el escaso crecimiento de las plantas de soja (Liu et al., 2011). Es por ello, por lo que los efectos observados sobre la morfología de la raíz inducidos por la estirpe mutante HH103 ttsI::Ω podrían deberse a la alta producción de SA y/o al leve incremento de ET. Además, como ya se ha comentado, la expresión de GmMPK4 regula negativamente la expresión de los genes relacionados con la respuesta de defensa y positivamente la expresión de los genes relacionados con el crecimiento y desarrollo de la planta (Liu et al., 2011). Muchos mutantes de A. thaliana que presentan altos niveles de producción de SA tienen este mismo fenotipo de activación constitutiva de genes de defensa y aborto del crecimiento (Dietrich et al., 1997; Pitzschke et al., 2009; Wang et al., 2007; Yang et
251 Discusión al., 2007; Yang y Hua, 2004). Así, la inactivación del gen GmMPK4 que se produjo en ausencia del T3SS podría también ser responsable del aborto del crecimiento de la raíz principal de las plantas de soja Williams. El gen GmPR2 es inducible por ET y también por SA (Mazarei et al., 2007), por lo que el leve incremento de ET y/o el aumento significativo de SA en las raíces de soja inoculadas con el mutante HH103 ttsI::Ω podrían ser la causa principal de la expresión de este gen observado a los 2 d.p.i. (Figura 32). Además, la activación a través del incremento de SA endógeno, inducido por la estirpe mutante HH103 ttsI::Ω, se encuentra apoyada por la activación del gen GmPR2 en las raíces de las plantas de soja tratadas con SA exógeno (Figuras 32 y 33). El papel del JA en la nodulación no está claro, ya que se han descrito efectos contrapuestos dependiendo de la especie de leguminosa, del tipo de jasmonato utilizado, y de cuándo, dónde y cómo se aplica la hormona (Ferguson y Mathesius, 2014). Algunos estudios sugieren que esta hormona podría actuar como un regulador negativo de la nodulación. Así, el JA añadido de forma exógena sobre el medio de cultivo de las plantas inhibe la expresión de los genes de nodulación temprana (Sun et al., 2006). Además, otros derivados del JA, como el metiljasmonato (MeJA, del inglés Methyl Jasmonate) también ejercen un efecto negativo sobre la nodulación. En este caso la adición exógena sobre la parte aérea afecta negativamente al desarrollo de los tubos de infección y a la expresión de los genes de nodulación (Nakagawa y Kawaguchi, 2006). Sin embargo, algunos autores sugieren que la nodulación y el desarrollo del tubo de infección pueden verse promovidos tras el tratamiento con JA y bajo unas condiciones de crecimiento de luz específicas (Suzuki et al., 2011). Incluso otros autores demostraron que los jasmonatos activan la expresión de los genes nod de R. leguminosarum y B. japonicum e incrementa la producción de factores Nod en B. japonicum (Mabood y Smith, 2005; Mabood et al., 2006; Rosas et al., 1998). Otros estudios sugieren que el JA está involucrado en la AON en soja. Así, la inoculación de las raíces de soja con el rizobio desencadena una regulación negativa de los genes relacionados con la biosíntesis del JA en las hojas (no en las raíces) a través de la proteína receptora quinasa GmNARK, relacionada con la AON (Seo et al., 2007). La cuantificación del JA-ile endógeno mediante HPLC en las raíces de soja Williams mostró que durante los primeros 4 d.p.i. no existían grandes diferencias en la
252 Discusión concentración de JA-ile entre los tratamientos ensayados, salvo un ligero incremento de estos niveles a los 4 d.p.i. en las plantas inoculadas con la estirpe mutante HH103 ttsI::Ω. Sin embargo, a los 8 d.p.i. se obtuvo un pico muy claro de producción de esta hormona únicamente en las raíces de las plantas inoculadas con la estirpe silvestre HH103 (Figura 28). Ya que los estudios realizados en base a sus efectos sobre la nodulación son muy controvertidos, el incremento del nivel de esta hormona inducido por la estirpe silvestre HH103 no puede explicarse en estos términos. Sin embargo, se conoce que la señalización por JA antagoniza a la señalización por SA y que muchos patógenos biotróficos explotan esta propiedad para atenuar las respuestas de defensa del hospedador (Glazebrook, 2005). En las plantas que fueron inoculadas con la estirpe silvestre HH103, el incremento de JA-ile observado a los 8 d.p.i. se correlaciona con la baja concentración de SA. Además, aquellas plantas inoculadas con la estirpe mutante HH103 ttsI::Ω presentaron concentraciones muy bajas de JA-ile en todos los puntos ensayados, correlacionándose con los altos niveles de SA detectados (Figuras 27 y 28). Además, Liu et al. (2011) indicaron que la quinasa MPK4 podría regular positivamente la vía de señalización del JA en soja, lo que podría ser una razón de los altos niveles de producción de JA-ile en las raíces de soja Williams inoculadas con la estirpe silvestre HH103 a los 8 d.p.i. (Figuras 28 y 37). El ABA regula el estado hídrico, así como un gran número de procesos involucrados en el desarrollo de las plantas. En los últimos años se ha comenzado a darle mayor peso al papel del ABA en las respuestas de defensa activadas por estrés biótico (Asselbergh et al., 2008; Mauch-Mani y Mauch, 2005). Los estudios realizados sobre esta hormona en relación a la simbiosis Rhizobium-leguminosa han demostrado que el ABA reduce el número de tubos de infección y la inducción de la producción de calcio via factores Nod y de los genes que codifican para las nodulinas tempranas ENOD11 y RIP1 (Ding y Oldroyd, 2009). Sin embargo, también se le han atribuido efectos positivos sobre la nodulación. Así, Palma et al. (2014) demostraron que el ABA promovía la fijación biológica de nitrógeno en condiciones de estrés salino, mediante la inducción de enzimas antioxidantes. En general, los valores de concentración de ABA en las raíces de soja Williams se detectaron a las 2 h.p.i. y a los 2 d.p.i., descendiendo con el tiempo. Las escasas diferencias observadas se centraron en las raíces inoculadas con la estirpe mutante HH103 ttsI::Ω a las 2 h.p.i. y a los 2 d.p.i., en los que los valores fueron ligeramente mayores a los obtenidos en las raíces inoculadas con la estirpe parental
259 Discusión NopJ, homóloga al efector YopJ de Y. pestis, ejerce un efecto negativo en la simbiosis de NGR234 con todas las plantas hospedadoras ensayadas hasta el momento. Existen otros casos en los que la presencia de ciertos efectores del T3SS puede llegar incluso a bloquear completamente la nodulación, como ocurre en la simbiosis entre USDA257 y las variedades de soja americanas (Meinhardt et al., 1993). Por todo ello, en esta Tesis se estudió el efecto que genera la mutación del gen ttsI y de varios de los efectores de HH103 en la nodulación con diferentes plantas. Se ha demostrado que esta mutación hace que esta estirpe nodule en L. japonicus (Tabla 18 y Figura 65). Por lo tanto, deben existir uno o más efectores secretados a través del T3SS que son reconocidos por las proteínas R del sistema inmune de esta planta, lo que activaría una reacción de defensa tan fuerte como para bloquear por completo la nodulación, al igual que sucede en la simbiosis entre USDA257 y las variedades de soja americanas. Los ensayos de nodulación realizados mostraron que el gen nopC es el principal responsable del impedimento de la nodulación de la estirpe HH103 en Lotus japonicus, ya que la mutación en este gen proporcionó una eficiencia de nodulación muy similar a la que se obtuvo con el mutante HH103 ttsI::Ω (Tabla 18 y Figura 65). Por otro lado, la mutación puntual en el resto de los genes analizados (excepto nopI) indujo la capacidad de nodular L. japonicus por la estipe HH103, aunque la eficiencia que se alcanzó no fue tan alta como la que se observó con los mutantes HH103 ttsI::Ω y HH103 nopCΔ (Tabla 18). NopC es una proteína específica de los rizobios y, hasta la fecha, se ha considerado como parte estructural del T3SS debido a su localización en el genoma y a su pequeño tamaño, muy similar a NopA, componente del apéndice extracelular o pilus del T3SS de los rizobios. Sin embargo, los resultados obtenidos en esta Tesis, en los que se demuestra que NopC es translocado al interior de la célula hospedadora, apoyan la idea de que esta proteína es un efector, es decir, que la función de esta proteína se desarrolla en el interior de la célula hospedadora (Figura 63). En contraposición al fenotipo observado con el mutante nopC, el mutante afectado en el gen nopI no fue capaz de formar nódulos, no observándose ni siquiera la formación de pseudonódulos, como ocurrió con la inoculación de las raíces de L. japonicus con la estirpe silvestre HH103. Además, mientras que los simples mutantes afectados en los genes nopP y nopL fueron capaces de nodular esta leguminosa, los dobles mutantes en los que uno de los genes afectados fue nopI tampoco formaron nódulos o pseudonódulos (Tablas 18 y Figura 65). Todos estos resultados indican que la proteína
260 Discusión NopI parece estar involucrada de forma positiva en la formación de los nódulos en la simbiosis entre HH103 y L. japonicus, efecto que podría estar enmascarado por el reconocimiento de los efetores del T3SS, principalmente NopC, a través del sistema inmune de la planta, lo que desencadena un bloqueo total de la nodulación. Por otro lado, los estudios realizados en esta Tesis sobre el fenotipo simbiótico de los mutantes afectados en los genes que codifican los efectores NopL, NopP y NopI con diferentes plantas hospedadoras arrojan datos muy diversos (Tabla 27). La presencia de la proteína NopL afecta de forma negativa a la simbiosis de HH103 con leguminosas que forman nódulos determinados y de forma positiva a la simbiosis entre HH103 y S. tomentosa, planta que presenta nódulos indeterminados. En este último caso, la presencia de este efector ejerce un fuerte efecto positivo. Por un lado, la mutación simple determinó la incapacidad total de formar nódulos en esta leguminosa. Sin embargo, los dobles mutantes en los que uno de los genes afectados fue nopL no alteraron de ninguna forma esta simbiosis, mientras que el doble mutante afectado en los genes nopI y nopP mejoró en gran medida la capacidad simbiótica de la estirpe HH103 en S. tomentosa (Tabla 15). Por otro lado, se comprobó que la proteína NopI actúa de forma positiva en todas las relaciones simbióticas entre HH103 y las leguminosas ensayadas. Sin embargo, la presencia de la proteína NopP afecta de forma negativa en la simbiosis de esta estirpe con soja Williams y L. japonicus, mientras que actúa de forma positiva en la simbiosis con S. tomentosa y V. unguiculata. Curiosamente, los dobles mutantes, además del triple mutante, afectados en los genes nopL, nopP o nopI, presentaron un fenotipo fuertemente negativo en la simbiosis con soja Williams y V. unguiculata. Además, el triple mutante provocó efectos negativos en la simbiosis con S. tomentosa (Tabla 27). La variedad fenotípica observada a través de los simples, dobles y el triple mutante, afectados en los genes que codifican para las Nop específicas de los rizobios, ponen de manifiesto que los efectores no actúan de forma individual, sino que sus funciones se encuentran entrelazadas o relacionadas de alguna forma. Este hecho explicaría, por ejemplo, que las mutaciones individuales en los genes nopL y nopP generen un efecto positivo en la simbiosis de HH103 y que el doble mutante afectado en esos genes presente un fenotipo simbiótico contrario.
261 Discusión Tabla 27. Efecto de la mutación del T3SS y de distintos genes nop sobre el comportamiento simbiótico de S. fredii HH103 en las leguminosas hospedadoras ensayadas en esta Tesis. Mutación Ningún efecto Efecto positivo Efecto negativo T3SS no funcional Lotus japonicus (D) Erythrinavariegata (D) Glycine. max cv. Williams (D) nopL G. max cv. Williams (D) V.unguiculata (D) Lotus japonicus (D) Sophora tomentosa (I) nopI G. max cv. Williams (D) Sophora tomentosa (I) Vigna unguiculata (D) Lotus japonicus (D) nopP G. max cv. Williams (D) Lotus japonicus (D) Sophora tomentosa (I) Vignaunguiculata (D) nopP-nopL Sophora tomentosa (I) Lotus japonicus (D) G. max cv. Williams (D) Vigna unguiculata (D) nopI-nopP Sophora tomentosa (I) G. max cv. Williams (D) Vigna unguiculata (D) Lotus japonicus (D) nopI-nopL Sophora tomentosa (I) G. max cv. Williams (D) Vigna unguiculata (D) Lotus japonicus (D) nopI-nopP-nopL G. max cv. Williams (D) Sophora tomentosa (I) Vigna unguiculata (D) Lotus japonicus (D) nopC Lotus japonicus (D) nopD Lotus japonicus (D) nopT Lotus japonicus (D) G. max cv. Williams (D) (datos no mostrados) El proceso evolutivo que se da en las relaciones entre los microorganismos infecciosos y las plantas hospedadoras ejerce una presión sobre la aparición de nuevos efectores detinados a suprimir las respuestas de defensas activadas durante la ETI por el reconocimento de otros efectores traslocados por el mismo microorganismo. No es de extrañar que, en el caso de los rizobios, estos efectores sean los específicos de este grupo y que, además, esta función la puedan desempeñar varios efectores al mismo tiempo, como podría ser el caso de NopL y NopP e, incluso, NopI. Además, podrían estar directamente involucrados en el desarrollo del proceso de nodulación, lo que nos
262 Discusión plantea la necesidad de profundizar sobre las dianas de los efectores secretados a través de este sistema. De esta forma, no solo permitiría identificar los procesos vegetales y los mecanismos involucrados en la activación de las respuestas de defensa, sino también aquellos responsables de la organogénesis del nódulo. Los efectores mejores estudiados entre los rizobios son NopL y NopP, aunque, la información de la que se dispone no es muy extensa. Sin embargo, hasta la fecha no existe ningún estudio sobre la proteína NopI. La expresión de los genes nopI, nopL y nopP de HH103 dependen de flavonoides y de los reguladores NodD1 y TtsI (Figuras 45 y 53; López-Baena et al., 2009). La secuencia aminoacídica de NopL de USDA257 es idéntica a la de HH103 y ambas proteínas presentan una gran similitud con la homóloga de NGR234, por lo que posiblemente ejerzan funciones similares en las distintas estirpes (Figura 41). La secuencia de aminoácidos del efector NopP de HH103 es muy similar a la de las correspondientes proteínas homólogas de USDA257 y NGR234, pero distinta a la de B. japonicum USDA110 (López-Baena et al., 2009). La translocación de NopL y NopP se ha comprobado a través de la cuantificación de la actividad adenilato ciclasa, por lo que pueden considerarse efectores reales (Figuras 47 y 63; Schechter et al., 2010). Por otro lado, NopI solo se ha encontrado, además de en HH103, en la estirpe USDA257 y en Ensifer sp. TW10, compartiendo con éstas un 99% de identidad en cuanto a su secuencia aminoacídica. Además, NopI posee cierta similitud con la proteína NopP. Por ello, aunque no se haya comprobado su translocación al interior de la célula eucariota, su similitud con NopP podría indicar que, al igual que NopP y NopL, NopI podría ser un efector. Los primeros estudios sobre la caracterización de estos efectores se centraron en determinar si NopL y NopP (de NGR234) funcionan como sustrado de quinasas de la célula eucariota. NopI, al igual que NopL y NopP, posee aminoácidos suceptibles de ser fosforilados (Figura 49) y entre ellos se encuentra una tirosina situada en una secuencia similar al dominio EPIYA (EPPIYE en HH103) de ciertos efectores de bacterias patógenas como Helicobacter pilorii. Los efectores denominados EPIYA y aquellos que poseen un dominio similar son fosforilados en el aminoácido tirosina de este mismo dominio e interaccionan con diferentes proteínas que presentan un dominio SH2 y que intervienen en la señalización intracelular del organismo hospedador. De esta forma, las bacterias patógenas que poseen este efector manipulan las funciones de la célula para aumentar la efectividad de la infección y mejorar la colonización sobre el hospedador
263 Discusión (Backert et al., 2010; Hayashi et al., 2013; Selbach et al., 2009). Por lo tanto, si el dominio EPPIYE de NopI ejerce una función similar al dominio homólogo de los efectores de patógenos, ésta sería la primera vez que se decribe que este tipo de dominios también se encuentra en efectores de simbiontes. Estudios anteriores indicaron, mediante ensayos de fosforilación in vitro, que NopL es fosforilada por quinasas de N. tabacum y de L. japonicus y que, además, mediante el uso de extractos proteicos de tabaco se detalló que esta quinasa podría ser de tipo serina/treonina quinasa, además de ser una MAPKK u otra quinasa derivada de este tipo de rutas (Bartsev et al., 2003). Estudios posteriores enriquecieron esta idea, ya que se demostró que NopL de NGR234 posee en su secuencia proteica 4 residuos de serinas fosforilables, cuyo patrón Serina/Prolina es típico de sustratos de MAPK (Zhang et al., 2011). Además, los estudios realizados mediante la sobreexpresión del gen nopL de NGR234 en plantas de tabaco demostraron que NopL bloquea la expresión de las proteínas de defensa o proteínas PR de la planta tras la infección con un agente patógeno. Sin embargo, no se observó ningún efecto, salvo un menor desarrollo de la planta, cuando se transformaron plantas de L. japonicus (Bartsev et al., 2004). Por todo ello, los autores sugieren que la función del efector NopL podría ser la de modular las rutas de señalización de defensa de la planta a través de las rutas de las MAPK que culminan en la activación de los genes PR (Bartsev et al., 2004). Más recientemente, se ha descrito que la expresión transitoria de la proteína NopL en hojas de tabaco reduce los efectos de la quinasa SIPK, cuya expresión se induce por altos niveles de SA en presencia de un patógeno (Zhang y Klessig, 1998; Zhang et al., 2011), lo que conduce a pensar que este efector podría ser uno de los responsables de la supresión de la respuesta de defensa temprana observada en la soja tras el reconocimiento de HH103, como se comentó anteriormente. Por otro lado, al igual que ocurre con la proteína NopL, NopP también es sustrato de proteínas con actividad quinasa de la planta. Skorpil et al. (2005) demostraron que en la cascada de señalización que culmina en la fosforilación de NopP de NGR234 intervienen quinasas de tipo tirosina y serina/treonina quinasas de los microsomas de la leguminosa Flemingia congesta. Sin embargo, mediante los ensayos de fosforilación no se observó inhibición mediante la utilización del inhibidor de las proteínas MAPKK, como sucedía con el efector NopL. Los resultados obtenidos en esta Tesis demuestran que la proteína NopL de HH103 es fosforilada por una quinasa eucariota de tipo serina/treonina quinasa, mientras que
264 Discusión NopP es fosforilada por una de tipo serina/treonina quinasa y tirosina quinasa. Incluso, a partir de estos resultados se puede deducir que la quinasa que fosforila a NopL, pero no a NopP, podría ser de tipo MAPKK u otra relacionada con las rutas de las MAPK (Figuras 69 y 77). Todo ello indica que las quinasas que fosforilan a NopL y NopP de NGR234 son las mismas o de la misma naturaleza que las que fosforilan a NopL y NopP de HH103. Sin embargo, mediante la utilización de la soja como organismo modelo, se comprobó que ambas quinasas dependen de calcio, resultados que no se obtuvieron anteriormente por otros autores (Figuras 69 y 77). El calcio es primordial en los estadíos tempranos del proceso de nodulación, así como en las respuestas de defensa activadas en el hospedador tras el reconocimiento de un microorganismo infeccioso. Todo ello conlleva a pensar que la función de NopL y NopP dependen de los cambios fenotípicos desarrollados en los primeros estadíos de la nodulación, cuando también son activadas las respuestas de defensa y que, en conjunto, determinan el rumbo de la interacción simbiótica. Además de las MAPK, en las plantas existen otras quinasas que se encuentran involucradas en las rutas de traducción de las señales: las quinasas dependientes de calcio o CDPKs (del inglés, Calcium-Dependent Protein Kinases). Las CDPK son quinasas de tipo serina/treonina dependientes de calcio que pueden localizarse tanto en el citoplasma como en otros compartimentos celulares, tales como el RE o el núcleo (Boudsocq y Sheen, 2013). Algunos estudios han indicado que la regulación de la transcripción de los genes que codifican estas proteínas se encuentra contralada por las MAPK y que, además, algunas CDPK parecen estar involucradas en la respuesta de defensa que se da durante la ETI, como NtCDPK2 de N. benthamiana (Heinrich et al., 2012). Por lo tanto, NopL podría fosforilarse en el interior de la célula eucariota vegetal por una CDPK, interacción que podría depender de las MAPK, así como otra quinasa independiente de ésta. Para determinar qué quinasa fosforila NopL y NopP se realizaron ensayos de fosforilación ―en gel‖. A partir de este tipo de experimiento no se obtuvo ningún resultado para NopP (Tabla 22), sin embargo, para NopL se identificaron dos proteínas que comparten cierta similitud con quinasas de tipo serina/treonina, un receptor quinasa HSL1 (de tipo LRR) y la isoforma X1 de una serina/treonina quinasa de tipo ATR, relacionada con el ciclo celular (Tabla 19) (Cortez et al., 2003; Culligan et al., 2004). Por otro lado, mediante ensayos de inmunoprecipitación se determinó que NopL podría
265 Discusión interaccionar con MPK15 de tabaco, quinasa que en Arabidopsis se encuentra incluida en el grupo D y en arroz en el E, grupos de MAPK cuyas funciones están aún por dilucidar (Ichimura et al., 2002; Reyna y Yang, 2006). En cualquier caso, aunque estos efectores sean fosforilados o potencialmente fosforilables por quinasas de la célula de la raíz de soja, existe un profundo desconocimiento sobre la localización de ambos efectores en el interior de la célula eucariota así, como su interacción con proteínas dianas del hospedador. Para el estudio de la localización de los efectores NopL y NopP se fusionaron a la proteína fluorescente YFP, se expresaron en las células epidérmicas de las hojas de N. benthamiana y su localización se analizó mediante microscopía confocal. Finalmente, se comprobó que el efector NopI se localiza en el citoplasma eucariota y que los efectores NopL y NopP, una vez que son traslocados al interior de la célula eucariota, se dirigen principalmente hacia el compartimento nuclear, donde deben ejercer su función como nucleomodulinas (efectores que actúan en el núcleo) (Bierne y Cossart, 2012) (Figuras 72, 73, 80, 81 y 84). Comúnmente, los efectores acceden al núcleo debido a que poseen en su secuencia un dominio denominado NLS, que puede variar dependiendo del efector. Sin embargo, el mecanismo de entrada al núcleo de otros muchos efectores es desconocido, como ocurre con NopL y NopP. En el caso de NopP, los resultados obtenidos a partir de la utilización del array de S. cerevisiae indicaron que su localización en el compartimento nuclear podría estar ligada al citoesqueleto de la célula hospedadora (Tabla 24). Por otro lado, cómo los efectores son dirigidos a sus dianas específicas, una vez que llegan al núcleo, sigue siendo aún un enigna. La manipulación de las células hospedadoras a nivel nuclear se encuentra ampliamente extendido entre las bacterias, sin embargo, los conocimientos sobre las dianas y los procesos que se ven afectados por los efectores son muy escasos. El análisis genómico de multitud de especies bacterianas ha permitido la identificación de numerosos efectores relacionados estructuralmente e incluidos en diferentes familias relacionadas con las nucleomodulinas, como son los efectores TAL (del inglés, Transcription Activator-Like), IpaH, CDT (del inglés, Cyclolethal Distending Toxins), Cif (del inglés, Cycle Inhibiting Factors) y proteínas que contienen los dominios F-box, SET o Ank. Dependiendo de la familia, las nucleomodulinas pueden actuar como factores de transcripción, controlando o mimetizando factores regulatorios de la cromatina, como enzimas bacterianas que modifican a ciertos reguladores nucleares de
266 Discusión la expresión de genes eucariotas, o alterando el ciclo de la célula y la integridad del ADN. Los efectores TAL poseen ciertas características comunes, como son el requerimiento de la señal amino terminal para la secreción a través de la maquinaria del T3SS o el dominio de repeticiones en tándem de una secuencia peptídica de alrededor de 34 aminoácidos, necesarias para el reconocimiento de las zonas específicas del ADN a las que se unen estos efectores, las denominadas cajas TAL (Boch y Bonas, 2010; Bogdanove et al., 2010; Boch et al., 2009). En el caso de NopL de HH103 se da una única repetición de 34 residuos incluidos en una secuencia de 57 aminoácidos. Sin embargo, mediante la comparación de la secuencia aminoacídica de NopL frente al resto de secuencias de efectores bacterianos no se encontró la presencia del dominio TAL ni de ningún otro dominio proteico conocido hasta el momento. Curiosamente, se observó que los efectores NopL y NopP de HH103 se encontraban dispuestos en focos o cuerpos nucleares, al igual que ocurre con el efector XopD del microorganismo fitopatógeno Xanthomonas campestris. Los autores relacionan la localización de XopD en estas estructuras con la actividad de desSUMOilación que posee el efector. Además, se ha comprobado que el dominio HLH (Hélice-Lazo-Hélice) de XopD es necesario y suficiente para inducir la formación de los focos nucleares (Canonne et al., 2011). Sin embargo, NopL y NopP carecen de cualquier dominio estudiado hasta el momento. Por otro lado, algunos autores sugieren que los focos nucleares se localizan de forma múltiple en las células en proliferación. Ésto ocurre en respuesta a un estrés replicativo y podría ser una señal para marcar aquellos sitios en los que la cromatina duplicada está incompleta u otros tipos de lesiones del ADN o la cromatina que pueden ser reparados (Baranski et al., 2015; Harrigan et al., 2011; Lukas et al., 2011). Durante el proceso de nodulación, las células del córtex de la raíz del hospedador se dividen rápidamente, lo que puede llegar a generar un estrés replicativo, generando lesiones en el ADN o la cromatina y activando los mecanismos que culminan en la senescencia o la apoptosis. La disposición de los efectores NopL y NopP en focos nucleares apoya la idea de que ambos efectores puedan actuar conjuntamente mitigando el estrés replicativo y evitando la senescencia del nódulo. En cualquier caso, aunque la finalidad de estas estructuras se desconoce, el aumento local de las proteínas suele facilitar la función propia de la proteína, como las actividades enzimáticas o los procesos de traducción de la señal (Anderson et al., 2001).
267 Discusión Figura 84. Localización y fosforilación de NopL y NopP en la célula eucariota. Fosforilación de NopP en el citoplasma (1.1) o en el núcleo (1.2) de la célula por una quinasa dependiente de calcio de tipo tirosina y serina/treonina quinasa. Localización de NopP en el núcleo de la célula dispuesto en focos nucleares (interacción con otras proteína y/o unido al ADN o libre) (1.3). Fosforilación de NopL en el citoplasma (2.1) o en el núcleo (2.2) por una quinasa dependiente de calcio de tipo serina/treonina quinasa por. Localización de NopL en el núcleo de la célula dispuesto en focos nucleares (interacción con otras proteína y/o unido al ADN o libre) (2.3). A medida que avanzan los conocimientos sobre la localización y función de los diversos efectores del T3SS, se ha descrito que un gran número de ellos se dirigen al núcleo de la célula hospedadora, donde interaccionan con algún componente (o función) esencial en el establecimiento de la respuesta inmune de la planta (Deslandes y Rivas, 2011). Para la determinación de las proteínas que potencialmente pueden interaccionar con NopL y NopP en la célula eucariota, se realizó una secuenciación de las proteínas provenientes de extractos de hojas de N. benthamiana que co-inmunoprecipitaron con ambos efectores. Entre las proteínas de tabaco que podrían interaccionar con NopL, además de MPK15, se encontraron algunas relacionadas con la pared celular vegetal (pectinesterasas y proteína de membrana de la banda de Caspary), con el metabolismo, con los ácidos nucleicos (Myb) y con el sistema inmune, I2 y NTGP4 (AIG1) (Tabla 21). Las proteínas codificadas por los genes de resistencia R o I2, son receptores
268 Discusión intracelulares que reconocen los efectores translocados por las bacterias, mientras que NTGP4 pertenece a una familia de proteínas involucradas en el crecimiento y desarrollo, así como en el sistema inmune de la planta (Couch et al., 2006; Wang y Li, 2009). Por un lado NopL podría interaccionar con estas proteínas con el fin de secuestrarlas para evitar que éstas realicen su función. Por el otro, NopL podría ser detectada por los mecanismos de defensa de la planta de tabaco, efecto debido al uso de esta planta como hospedador. El ensayo también indicó la posible interacción entre NopL y una proteína denominada calreticulina. Existen numerosos estudios sobre la calreticulina que la describen como un tipo de proteína de unión a calcio, muy conservada entre los organismos eucariotas, y cuya función mejor descrita es la de actuar como chaperona en el RE. Sin embargo, las CRT se encuentran involucradas en diversos procesos, como la regulación intracelular de calcio, la señalización dependiente de calcio, la apoptosis o el sistema inmune (Jia et al., 2009). Aunque la investigación sobre estas proteínas se ha centrado en aquellas que actúan en el RE de las células de mamíferos, los estudios que existen sobre la función de las CRTs en plantas señalan que las CRT también pueden localizarse fuera de este compartimento. Así, se ha demostrado su localización en la envuelta nuclear, en el núcleo, en el citoplasma de la célula, así como en la superficie de la célula (Dedhar, 1994; Guo et al. 2003; Jia et al. 2008; Qiu et al., 2012). Además, se ha descrito que estas proteínas se relacionan con en el crecimiento de la planta, el desarrollo, así como con las respuestas a diversos estreses. En las plantas existen dos isoformas de CRT y ambas son importantes reguladores del sistema inmune. Los estudios relacionados con la CRT de A. thaliana indican que el dominio carboxilo terminal de unión a calcio de la isoforma AtCRT2 juega un papel fundamental en la regulación de la concentración de SA endógeno y que el dominio amino terminal de la misma proteína se relaciona con la supresión de las respuestas de defensa relacionadas con el aumento de los niveles de SA (Qiu et al., 2012). Por lo tanto, es posible que NopL se asocie a la CRT para así mantener bajos niveles de SA en la planta y/o actuar conjuntamente con ésta con el fin de suprimir de forma efectiva las respuestas de defensa relacionadas con el SA. Algunos estudios han aislado diversas proteínas en la membrana de origen eucariota que recubre al bacteroide, como en el espacio peribacteroideo, originado en el proceso de formación de los bacteroides durante la nodulación. La mayoría de esas proteínas son
275 Conclusiones 10. Las proteínas NopL y NopP de S. fredii HH103 se encuentran localizadas fundamentalmente en el núcleo de la célula hospedadora en forma de focos nucleares. 11. Los ensayos de inmunoprecipitación y/o de expresión en levaduras indican que NopP de S. fredii HH103 interacciona con proteínas relacionadas con los ácidos nucleicos y/o proteínas involucradas con en el sistema inmune, y que NopL de S. fredii HH103 interacciona con proteínas relacionadas con el retículo endoplasmático.
276 Conclusiones 1. S. fredii HH103 activate an early defense response in soybean Williams, maybe induced by bacterial surface molecules. This response is not T3SS dependent and it is not enought strong to block the nodulation process. 2. S. fredii HH103 T3SS inhibit the defense response produced by the bacterial recognition by soybean root cells, reducing SA levels. T3SS interferes with MKK1- MKK2/2-MPK4 signalling pathway, considered a negative regulator of the SA pathway. 3. Expression of the rhizobial specific nopC, nopI and nopL genes from S. fredii HH103 is regulated by inducing flavonoid, NodD1 and TtsI. Mutation of any of these genes does not abolish secretion of the rest of Nops. 4. S. fredii HH103 NopC is a real effector responsible of the nodulation with Lotus japonicus. 5. NopI protein improves symbiotic parameters in the interaction between S. fredii HH103 and host legumes. 6. NopL protein negatively affects symbiotic parameters in the interaction between S. fredii HH103 and host legumes with determinated nodules, and positively with host legumes with indeterminated nodules. 7. NopP protein negatively affects symbiotic parameters in the interaction between S. fredii HH103 and soybean Williams, and positively with S. tomentosa y V. unguiculata. 8. S. fredii HH103 NopL protein is phosphorylated by a soybean root kinase. The signalling cascade that ends in NopL phosphorylation is calcium dependent. A serine/threonine MAPKK is a component of this pathway. 9. S. fredii HH103 NopP is phosphorylated by a soybean root kinase. The kinase responsible of this reaction is a serine/threonine and tyrosine kinase and it is calcium dependent. 10. S. fredii HH103 NopL and NopP proteins are located mainly in host cell nucleous forming nuclear spots. 11. Inmunoprecipitations assays and/or yeast expression assays show that S. fredii HH103 NopP interacts with proteins related with nucleic acids and/or proteins envolved
277 Conclusiones in the immune system. S. fredii HH103 NopL interacts with reticulum endoplasmic proteins.
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