Globulinas de semilla de uva como moduladores del color de antocianos. Aproximación in silico molecular y colorimétrica a las interacciones proteína-pigmento

Globulinas de semilla de uva como moduladores del color de antocianos. Aproximación in silico molecular y colorimétrica a las interacciones proteína-pigmento Francisco Chamizo González Área de Nutrición y Bromatología. Facultad de Farmacia c/ P. García González 2. 41012 SEVILLA (Spain). Tel. (34) 954 55 67 61 Fax (34) 954 55 70 17 La tesis titulada “Globulinas de semilla de uva como moduladores del color de antocianos. Aproximación in silico molecular y colorimétrica a las interacciones proteína-pigmento”, presentada por D. Francisco Chamizo González para optar al grado de Doctor, ha sido realizada en el Á rea de Nutricio n y Bromatologí a del Departamento de Nutricio n y Bromatologí a, Toxicologí a y Medicina Legal (Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla), bajo la direccio n de los Doctores D. Francisco José Heredia Mira, Catedra tico de la Universidad de Sevilla y Dª. Belén Gordillo Arrobas, Profesora Titular de la Universidad de Sevilla. Considerando que se han alcanzado los objetivos inicialmente previstos, y que el trabajo reu ne los requisitos necesarios, autorizan su presentacio n. En Sevilla, a 20 de julio de 2023. Fdo. Francisco Jose Heredia Mira Francisco Chamizo Gonza lez Fdo. Bele n Gordillo Árrobas Este trabajo ha sido realizado con el apoyo institucional de la Universidad de Sevilla mediante un Contrato Predoctoral PIF FPI-2018 (Ministerio de economí a y competitividad) y con la ayuda para la realizacio n de dos estancias breves en los extranjeros realizados en el an o 2022 y 2023, gracias a la cual ha sido posible optar a la Mencio n Internacional del Tí tulo de Doctor. El trabajo se ha desarrollado en el a mbito del proyecto I+D+i del Ministerio de Economí a y Competitividad del Gobierno de Espan a: “Fracciones Peptí dicas de Semilla de Uva Como Estabilizantes del Color de Vinos Tintos. Aproximacio n Molecular a las Interacciones con los Compuestos Feno lico” (AGL2017-84793-C2-2-R), del que el doctor Francisco Jose Heredia Mira es el investigador principal. ÍNDICE ÍNDICE PRODUCCIÓN CIENTÍFICA ................................................................................................. 13 RESUMEN ................................................................................................................................ 17 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 23 1.1. COMPUESTOS FENÓLICOS DE VINO ............................................................... 27 1.1.1. Flavanoles ...................................................................................................................28 1.1.2. Flavonoles ...................................................................................................................29 1.1.3. Antocianos ..................................................................................................................30 1.1.4. Relación entre estructura química y color .....................................................32 1.2. LAS PROTEÍNAS DE LA SEMILLA DE UVA ..................................................... 38 1.2.1. Proteínas del endospermo de semillas ...........................................................38 1.2.2. Extracción, purificación y análisis proteómico de globulinas de fuentes vegetales .......................................................................................................................41 1.3. INTERACCIONES PROTEÍNACOMPUESTOS FENÓLICOS ....................... 43 1.3.1. Tipos de interacciones proteína-compuesto fenólico ...............................43 1.3.2. Factores que afectan a la interacción proteína-fenol ................................45 1.3.3. Interacciones proteína-antociano .....................................................................47 1.4. TÉCNICAS COMPUTACIONALES ....................................................................... 49 1.4.1. Tipos de modelización de las estructuras 3D de proteínas .....................52 1.4.2. Modelado basado en plantillas por homología ............................................53 1.4.3. Modelado sin plantillas .........................................................................................55 1.4.4. Parámetros para la evaluación de las estructuras 3D de proteínas ....56 1.4.5. Docking molecular ...................................................................................................58 1.4.5.1. Docking proteína-ligando .................................................................................59 1.4.5.2. Docking proteína-proteína...............................................................................60 1.4.6. Simulaciones de dinámica molecular ..............................................................61 1.4.7. Métodos cuánticos. Cálculos basados en la Teoría del Funcional de la Densidad .......................................................................................................................................66 2. OBJETIVOS ...................................................................................................................... 71 3. MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................................... 75 3.1. MUESTRAS ................................................................................................................. 77 3.1.1. Fuente vegetal proteica .............................................................................................77 3.1.2. Extractos proteicos de globulinas de semilla de uva .......................................77 RESUMEN 19 RESUMEN La estabilizació n q uí mica de lós pigmentós del vinó, y pór tantó del cólór, cónstituye una de las lí neas de investigació n ma s impórtantes en el campó de la enólógí a y, en particular, es unó de lós principales próblemas cón lós que sigue enfrenta ndóse el sectór enóló gicó, especialmente en climas ca lidós. Un mecanismó de particular intere s para la estabilizació n de lós pigmentós antócia nicós són las interacciónes que e stós establecen cón una gran variedad de cómpuestós órga nicós cómó las próteí nas. El estudió de las interacciónes próteí na-antócianó y sus bases móleculares es crucial en el desarrólló de estrategias en óló gicas para cómpensar las deficiencias de estabilidad de cólór de vinós tintós, basadas en la aplicació n de agentes estabilizadóres de naturaleza próteica. En esta Tesis Dóctóral, se própóne abórdar este desafí ó cientí ficótecnóló gicó, mediante el apróvechamientó de un subpróductó de la própia industria enóló gica, la semilla de uva, cómó fuente natural y sóstenible de próteí nas cón pótenciales própiedades estabilizadóras de lós pigmentós del vinó y su cólór. El principal ó bjetivó ha sidó cómprender lós mecanismós móleculares implicadós en las interacciónes entre próteí nas de semilla de uva (glóbulinas) y el pigmentó antócia nicó mayóritarió del vinó, la malvidina-3-O-glucó sidó (mv3glc), así cómó eval uar su impactó en el cólór, pór aplicació n de metódólógí as cómputaciónales, próteó micós, espectróscó picós y cólórime tricós. Ha sidó pósible, pór primera vez, módelizar y caracterizar las estructuras tridimensiónales (3D) de las glóbulinas 7S y 11S de semilla de uva, mediante te cnicas cómputaciónales de módeladó pór hómólógí a. Lós módelós cónstruidós, validadós y óptimizadós, cónfirmarón que las glóbulinas 7S y 11S de semilla de uva, de similar pesó mólecular, difieren en su puntó isóele ctricó y són ricas en α he lices y la minas β estabilizadas pór puentes disulfuró. A su vez, lós estudiós de docking han permitidó esclarecer lós tipós de interaccióne s (fuerzas hidrófó bicas y puentes de hidró genó, principalmente), así cómó las distancias que se establecen en lós cómplejós móleculares fórmadós entre estas glóbulinas y la mv3glc. 20 En lós estudiós experimentales, se caracterizó la fracció n de glóbulinas 11S de semilla de uva aplicandó distintas cóndiciónes de extracció n, así cómó el estudió de las interacciónes móleculares entre e stas y lós antócianós del vinó en disóluciónes módeló, y su efectó en el cólór. La extracció n cón tampó n fósfató salinó a pH 7, cómbinadó cón dia lisis a 14 kDa, permitió óbtener una fracció n de glóbulinas de mayór riqueza prótei ca. Pór su parte, lós estudiós de fluórescencia cónfirmarón que la glóbulina 11S interaccióna cón la mv3glc mediante un mecanismó esta ticó cuya KS fue de 8.5×104 M, dandó cómó resultadó un efectó cólórime tricó visualm ente apreciable en el pigmentó, dependiente de la cóncentració n de próteí na. Cón un enfóque metódóló gicó, se ha desarrólladó una te cnica de “Cólórimetrí a Triestí muló in silico”, mediante ca lculós meca nicó-cua nticós aplicadós a las estructuras módelizadas, para la predicció n de cambiós de cólór próducidós en la mv3glc debidó a variaciónes estructurales, cómó puede ser la módificació n del a nguló diedró del anilló B, y a la interacció n establecida cón un p e ptidó de semilla de uva. 21 ABSTRACT The chemical stabilizatión óf the pigments óf wine, hence the cólór, cónstitutes óne óf the móre impórtant research areas in the field óf óenólógy; specifically, it is óne óf the main p róblems still facing the wine industry in warm climates. The interactións óf anthócyanic pigments with a wide variety óf órganic cómpóunds, such as prótei ns, are mechanisms óf particular interest fór their stabilizatión. The study óf prótein-an thócyanin interactións and thei r mólecular basis is critical tó develóp winemaking strategies aimed at cómpensating fór deficiencies in the cólór stability óf red wines based ón the applicatión óf stabilizing agents óf a prótein nature. This Dóctóral Thesis próp óses tó face this scientific and technólógical challenge by using a by-próduct fróm the wine industry itself, the grape seeds, as a natural and sustainable sóurce óf próteins, with pótential próperties tó stabilize the wine pigments and the cólór. The main óbjective has been tó understand the mólecular mechanisms invólved in the interactións between grape seed próteins (glóbulins) and the majór anthócyanic pigment óf red wines, the malvidin-3-O-glycóside (mv3glc), as well as tó asse ss their impact ón the cólór, by ap plying cómputatiónal, próteómic, spectróscópic and cólórimetric methódólógies. Fór the first time, it has bee n póssible tó módel and characterize the threedimensiónal structure (3D) óf 7S and 11S glóbulins óf the grape seed using cómputatiónal techniques óf módeling by hómólógy. The m ódels óbtained, validated and óptimized, cónfirmed that the 7S and 11S glóbulins óf grape seeds have similar weights, are different in isóelectric póint and are rich in α-helices and β-sheets stabilized by disulfide bridges. Móreóver, the docking studies have allówed clarifying the types óf interactións (mainly hydróphóbic interactións and hydrógen bónds), as well as the distances stablished in the mólecular cómplexes fórmed between these glóbulins and the mv3glc. The 11S glóbulins fractión óf grape seeds has been characterized in experimental studies using different extractión cónditións; the mólecular interactións between these glóbulins and the an thócyanins óf wine, and their effect ón the cólór have been alsó studied in módel sólutións. The extractión with 22 saline phósphate buffer at pH 7 cómbined with dialysis at 14 kDa yielded a glóbulin fractión óf high prótein richness. The fluórescence studies cónfirmed that 11S glóbulin interacts with mv3glc by a static mechanism (KS 8.5×104 M), resulting in an effect ón the pigment cólór, which was visually perceptible depended ón the prótein cóncentratión. With a methódólógical appróach, an “in silico Tristimulus Cólórimetry” has been develóped by means óf mechanical-quantum calculatións applied tó the módeled struct ures, tó predict the cólór changes próduced in the mv3glc due tó structural módificatións, such as the changes in the dihedral angle óf the B-ring and the interactión stablished with a grape seed peptide. INTRODUCCIÓN 25 1. INTRODUCCIÓN El color es la primera cualidad que afecta la aceptabili dad de los alimentos, ya que puede indicar el grado de madurez del alimento, así como de hacerlo ma s atractivo para el consumidor. Algunos pigmentos naturales como las antocianinas, procedentes de fuentes vegetales, pueden ser susceptibles de degradacio n debido a factores ambientales y quí micos como el pH, la exposicio n a la luz, la presencia de iones meta licos, oxí geno, enzimas o el calor, lo que puede provocar la descomposicio n, el deterioro y, por t anto, la pe rdida de color. El contenido de pigmentos antocia nicos en frutas, verduras y tube rculos se ve afectado por las variaciones en el clima, las condiciones del suelo y los me todos de cosecha (Rodrí guez-Mena et al., 2022). En este sentido, se esta observando una mayor evidencia de los efectos del cambio clima tico en el medio ambiente, lo que ha llevado a la bu squeda de estrategias para adap tarse a esta situacio n. En el caso de la vitivinicultura espan ola y, en particular. en las regiones de clima ca lido como Andalucí a, existe un mayor impacto clima ti co con repercusio n en la productividad de la vid y en la calidad del vino (Malheiro et al., 2010; Mira de Ordun a, 2010). Debido a las consecuencias clima ticas, las uvas tintas maduran con rapidez, acumulando altas concentraciones de azu car, mientras que la sí ntesis de compuestos feno licos en las semillas y los hollejos no se ve tan acelerada (copigmentos), provocando un desfase entre la madurez tecnolo gica y la madurez feno lica de la uva (Mori et al., 2005). Esto conduce a una deficiencia en el color de los vinos elaborados con dichas uvas, segu n sen alan estudios como el de Gordillo et al. (2012). Este de ficit de pigmentos y copigmentos feno licos ha dificultado los mecanismos por el cual se lleva a cabo la estabilizacio n del color mediante las reacciones de copigmentacio n en las cuales se produce la proteccio n del an tociano por compuestos no coloreados (Boulton et al., 2001; Escribano-Bailo n et al., 2012; Trouillas et al., 2016). Para abordar este problema, se han aplicado te cnicas de elaboracio n innovadoras, como la maceracio n prefermentativa en frí o, así como la adicio n de fuentes naturales de copigmentos durante la vinificacio n para reforzar la estructura feno lica y estabilizar la materia colorante del vino tinto. Estas te cnicas han sido estudiadas y aplicadas en el sector enolo gico para obtener vinos con caracterí sti cas 32 compuestos presentes en la madera q ue se extraen durante el envejecimiento del vino (Gambuti et al., 2010). Estos pigmentos de nueva formacio n o pigmentos antocia nicos derivados, aunque se consideran compuestos minoritarios, presentan caracterí sticas quí micas y espectrosco picas que justifican su importancia sensorial, especialmente en etapas ma s avanzadas de la vinificacio n (De Freitas y Mateus, 2011). 1.1.4. Relación entre estructura química y color El color rojo, naranja, pu rpura o azul que exhiben los pigmentos antocia nicos se deben a la estructura resonante de su grupo cromo foro, el catio n flavilio, el cual fue explicado por Pauling (1940). Espectralmente, lo s antocianos muestran una absorcio n intensa en el intervalo UV entre 250-270 nm; y particularmente en el intervalo visible entre 520-560 nm (λma x=520 nm). La distinta tonalidad, intensidad y estabilidad que p resenta el catio n flavilio es muy variable dependiendo de numerosos factores intrí nsecos y extrí nsecos como las caracterí sticas estructurales particulares de cada tipo de antociano, el pH del medio, o las interacciones moleculares que establecen con otros compuestos, entre otros. La influencia de estos factores en el comportamiento espectral y colorime trico de las antocianinas ha sido ampliamente estudiada. Diferencias en la estructura de los antocianos producen ligeros desplazamientos espectrales, hipsocro micos o batocro micos, en torno a la λma x. En medio a cido, las antocianinas con dos sustituyentes en el anillo aroma tico B (peonidina y cianidina) presentan una λma x cercana a 512 nm, y las que poseen tres sustituyentes (delfinidina, petunidina y malvidina) presentan λma x entre 518 y 520 nm. Con respecto al color, en 1976 la CIE (Comission Internationale de l´Éclairage) recomienda internacionalmente el sistema de especificacio n del color CIE 1976- (L*a*b*) (CIELAB), como el ma s apropiado para la especificacio n del color en la industria alimentaria, debido a su uniformidad, precisio n y exactitud. La aplicacio n de la Colorimetrí a Triestí mulo en el espacio CIELAB a la caracterizacio n de disoluciones de an tocianos puros extraí dos de la uva puso de manifiesto las diferencias de color q ue existen entre ellos debido a la estructura 33 quí mica (Heredia et al., 1998). Así , es posible diferenciar las distintas antocianinas ya que su color varí a segu n las metilaciones, glicosilaciones o acilaciones. Segu n los valores de claridad (L*), croma (C*ab) y tono (hab) de los extractos, los antocianos esta n situados en el 1er y 4o cuadrante del diagrama de color (a*b*), en torno a los 0° de tono, es decir, en la zona de los rojos, pudiendo tener ligeros matices anaranjados (tonos ma s altos) o azulados (tonos ma s bajos). Mientras que peonidina y cianidina exhiben un color rojo-anaranjado, delfinidina, petunidina y malvidina son rojo-azuladas (Fig. 5). Adema s, cuanto mayor es el nu mero de grupos hidroxilo y metoxilo en la mole cula, menor es la estabilidad del pigmento (Delgado-Vargas et al., 2000). Por tanto, de las antocianinas presentes en el vino tinto, cianidina y peonidina, con menor nu mero de sustituyentes en el anillo aroma tico B, son las ma s estables. Figura 5. Antocianinas de las uvas. El nivel de glicosilacio n tambi e n ha demostrado tener un claro efecto en la estabilidad; en este sentido, los antocianos digluco sidos son ma s estables que los monogluco sidos. De la misma mane ra, las acilaciones de los antocianos, particularmente con a cidos cina micos, incrementa su estabilidad (Wrolstad et al., 2005). La a cilacio n del grupo cromo foro dificulta la hidro lisis del catio n flavilio, manteniendo ma s intensidad de color a valores de pH elevados que sus correspondientes formas no aciladas y, adema s, presentan mayor estabilidad a otros factores como la temperatura, la luz o el SO2. Los grupos de acilacio n permiten al antociano adoptar Antocianos 1er. y 4ocuadrante (Heredia et al.,1998) 506 (naranja-rojo)HOCH3 Peonidina Espectro visibleR2R1 OCH3 OH OH H 508 (azul-rojo)OH Delfinidina 508 (azul-rojo)OCH3 Petunidina OCH3 OH Substitución 510 (azul-rojo) 506 (naranja-rojo) λmáx (nm)Aglicona Cianidina Malvidina 506 (naranja-rojo)HOCH3 Peonidina Espectro visibleR2R1 OCH3 OH OH H 508 (azul-rojo)OH Delfinidina 508 (azul-rojo)OCH3 Petunidina OCH3 OH Substitución 510 (azul-rojo) 506 (naranja-rojo) λmáx (nm)Aglicona Cianidina Malvidina 34 una conformacio n plegada que lo protege de los factores de degradacio n, adema s de facilitar su intervencio n en reacciones de copigmentacio n. Una caracterí stica comu n de los pigmentos antocia nicos derivados es la mayor resistencia que presentan a reacciones de degradacio n con respecto a los antocianos libres, especialmente aquellos que tienen las posiciones C-2 y C-4 del grupo cromo foro protegida con sustituyentes de distinta naturaleza (Go mez- Cordove s et al., 1995; Pe rez-Prieto et al., 2003; Berke y De Freitas, 2007). A su vez, el color y estabilidad de los antocianos esta fuertemente influenciado por el pH del medio. En disolucio n acuosa, los antocianos se encuentran en diversas formas quí micas con distintas propiedades croma ticas, cuyo equilibrio depende directamente del pH (Heredia et al., 1998). A pH muy a cido (1- 2) predominan los cationes flavilio, de color rojo. Entre pH 2 y 4, la especie predominante es la anhidrobase quino nica, de color azul. Entre p H 5 y 6, predominan dos especies, la pseudobase carbinol y la chalcona, ambas incoloras. A valores de pH superiores a 7, los an tocianos son degradados dependiendo de su estructura quí mica, mostra ndose de color amarillo o pardo. En una disolucio n hidroalcoho lica, como es el v ino tinto, con valores medios de pH comprendidos entre 3 y 4, aproximadamente el 80% de los an tocianos se encuentran en forma hidratada incolora, excep to si tienen lugar algu n tipo de mecanismo quí mico estabilizador del color. Por lo tanto, para mejorar la estabilidad de los antocianos es necesaria la aplicacio n de diferentes estrategias encaminadas a favorecer las reacciones de copigmentacio n. A pesar de los numerosos factores que afectan negativamente a la estabilidad de los antocianos, generalmente, e stos se encuentran en asociacio n con otras mole culas q ue intervienen protegie ndolos de su degradacio n, gracias a reacciones de copigmentacio n. El fenómeno de copigmentación es un mecanismo de proteccio n asociado exclusivamente a la familia de los pigmentos antocia nicos, que ocurre tí picamente en medio acuoso y que esta ampliamente extendido en la naturaleza (Delgado-Vargas et al., 2000; Cavalcanti et al., 2011). La copigmentacio n es un equilibrio que implica la asociacio n preferencial y no covalente de las formas coloreadas de los antocianos con otros compuestos, 35 generalmente incoloros, que se denominan copigmentos o cofactores de copigmentacio n (Mazza y Bruillard, 1990). Desde el punto de vista molecular, la copigmentacio n consiste en la formacio n de un complejo en el que un p igmento se apila con un copigmento, establecie ndose de biles interacciones entre las nubes ele ctro nicas de los an illos aroma ticos de ambos. Como copigmentos pueden actuar sustancias muy distintas: compuestos feno licos, p olisaca ridos, pe p tidos, aminoa cidos, alcaloides, a cidos orga nicos, e incluso los mismos antocianos asociados entre sí (Trouillas et al., 2016). El u ni co requisito que deben cumplir estas mole culas es p oseer o poder adoptar una configuracio n estructural espacial plana para poder formar complejos de apilamiento vertical (Fig. 6). Figura 6. Formación de complejos de copigmentación. Aunque el catio n flavilio es la forma antocia nica que participa p rincipalmente en las reacciones de copigmentacio n, la forma hemiacetal tambie n puede formar estos complejos, pero de manera minoritaria (Trouillas et al., 2016). La copigmentacio n puede, a su vez, subdividirse en tres categorí as, segu n la naturaleza del copigmento implicado (Fig. 7): autoasociación (antocianos entre sí ), copigmentación intramolecular (entre el grupo acilado y el grupo cromo foro del mismo antociano) y copigmentación intermolecular (entre antocianos y otras mole culas incoloras). 36 Figura 7. Distintos tipos de copigmentación (Fuente: Castañeda-Ovando et al., 2009) El resultado global del feno meno de copigmentacio n se caracteriza por dos efectos positivos sobre el color del antociano: 1) la modificacio n de sus propiedades espectrales originales, consistentes en un incremento de la absortividad (efecto hipercro mico, Δ A) y generalmente un desplazamiento en la λma x de absorcio n hacia valores superiores (efecto batocro mico, Δλ); y 2) la estabilizacio n del antociano en su forma col oreada catio n flavilio (Dangles y Brouillard, 1992). De esta manera, se explica la intensidad de color y variedad de matices que presentan los antocianos a valores de pH donde son normalmente incoloros. En los u ltimos an os, los estudios realizados en disoluciones modelo han demostrado que la eficacia y la intensidad de la copigmentacio n depende de distintos factores, incluyendo las concentraciones de pigmentos y copigmentos, la relacio n molar copigmento/pigmento, sus estructuras quí micas, el pH del medio, o la temperatura (Mazza y Brouillard, 1990; Gonza lez-Man zano et al., 2009; Cruz et al., 2010; Trouillas et al., 2016). En cuanto a la estructura quí mica de los antocianos, el efecto es ma s pronunciado para los 3,5-digluco sidos que para los monogluco sidos, ya que aumenta con el grado de glucosilacio n (Scheffledt y Hrazdina, 1978). Adema s, los antocianos que contienen grupos acil-aroma ticos forman complejos de copigmentacio n mucho ma s estab les que los antocianos no acilados (Goto y Kondo, 1991). Por otro lado, tambie n se han estudiado las interacciones entre los antocianos y otros compuestos de mayor peso molecular como los biopolí meros, como por ejemplo las proteí nas del suero de la leche (Ren et al., 2021). En particular, Miyagusuku-Cruzado et al. (2021) han estudiado la interaccio n de las proteí nas de suero de la leche con antocianos procedentes de diferentes fuentes vegetales (uva, IntramolecularAutoasociación Intermolecular 37 maí z morado, zanahoria negra y col roja) en disoluciones modelo de pH 3. Se constata que la adicio n de proteí n as del suero da lugar a un aumento de las absorbancias en el intervalo visible y que dicho au mento depende de la concentracio n de proteí na an adida a la disolucio n de antocianos, sie ndo estos resultados similares a los obtenidos por Ren y Giusti (2021). Adema s, Miyagusuku- Cruzado et al. (2020) encontraron que la adicio n de los biopolí meros provoco una disminucio n significativa tanto de la claridad, lo que significa que las disoluciones de antocianos presentaron colores notablemente ma s oscuros despue s de la adicio n de las proteí nas. Por otro lado, Rocha et al. (2018) encontraron q ue estas proteí nas muestran un efecto protector contra la degradacio n de los antocianos durante sesenta dí as en condiciones de pH 4 y temperatura de 5 ± 2 °C. Otros autores como Chung et al. (2 01 5) descubrieron que la adicio n de las proteí nas del suero de la leche podí a prolongar la estabilidad del color de los antocianos en disoluciones modelo en condiciones de almacenamiento aceleradas (40 °C durante 7 dí as). 38 1.2. LAS PROTEÍNAS DE LA SEMILLA DE UVA 1.2.1. Proteínas del endospermo de semillas Las semillas de las plantas se componen de un endospermo, un embrio n y un pericarpio, todo ello necesario p ara el crecimiento de las pla ntulas. Durante el desarrollo de la semilla, se sintetizan y se almacenan carbohidratos, lí pidos y proteí nas. Los genes que codifican las “proteí nas de almacenamiento o reserva” (seed storage proteins; SSPs) son inducidos y controlados especí ficamente por una red gene tica compleja durante las fases de llenado y maduracio n del gran o (McCarty, 1995; Li y Song, 2020). Las proteí nas de reserva j uegan un pap el meta bo lico y estructural muy importante, y suponen del 1 0% al 40% de la materia seca de la semilla, dependiendo de la especie vegetal (Shewry et al., 1995). Las proteí nas de reserva de semilla se acumulan en el embrio n o en el endospermo segu n la especie vegetal. En el caso de dicotiledo neas como Arabidopsis (Arabidopsis thaliana L.), las ce lulas embrionarias desarrollan estructuras de vacuolas de almacenamie nto de proteí nas (PSV) para la acumulacio n de SSPs. Por otro lado, en monocotiledo neas como el maí z (Zea mays L.) y el arroz (Oryza sativa L.), las SSPs se sintetizan en el embrio n o en el endospermo, sin embargo, este u ltimo es el principal o rgano de almacenamiento y ocupa una proporcio n relativamente grande del espacio de la semilla (Liu et al., 2022; Zheng et al., 2022). El uso de proteí nas vegetales en aplicaciones de la industria alimentaria es muy comu n, destacand o la proteí na de guisante, la de patata y, especialmente, la de soja, ampliamente estudiada. Otro caso, aunque menos estudiado, es la semilla de uva, que puede considerarse una fuente rica en proteí nas de reserva (6-13%) (Gazzola et al., 2014; Mora-Garrido et al., 2022), por lo que su aprovechamiento es de gran intere s para el desarrollo de numerosas aplicaci ones tecnolo gicas en la industria alimentaria. Por ejemplo, podrí a utilizarse para la modulacio n de atributos sensoriales de los alimentos (viscosidad, elasticidad, plasticidad, aroma, sabor o color, entre otros) y, así , mejorar su calidad global (Tomadoni et al., 2020). En este contexto, el uso de proteí nas de semilla de uva representa una nueva alternativa frente a otros biopolí meros vegetales, y a los de origen animal o sinte ticos (sujetos 39 a mayores restricciones legales), debido a la gran disponibilidad y abundancia generada en determinadas regione s por la industria vitiviní cola (Baca-Bocanegra et al., 2021; Gordillo et al., 2021). Las proteí nas del endospermo se clasifican en cuatro fracciones: albúminas, prolaminas, glutelinas y globulinas que se diferencian entre sí por su solubilidad secuencial en distintos disolventes (Osborne, 1924). Las albúminas se definen como proteí nas globulares solubles en agua q ue son coagulables por calor (Boulter y Derbyshire, 2013; Shewry y Pandya, 1999). Dentro de ellas, el tipo ma s abundante son las albu minas 2S. Es importante tener en cuenta que los pesos moleculares pueden variar entre diferentes isoformas de albuminas, segu n la especie vegetal de la q ue provengan. En el caso de las nueces brasilen as (Bertholletia excelsa Humb. & Bonpl.), se han descrito albuminas 2S cuyo peso molecular aproximado es de 8 kDa, mientras que para la colza (Brassica napus L.), se han descrito albuminas 2S de 12 kDa. En el caso de la semilla de uva (Vitis vinifera L.) se han caracterizado tambi e n albu minas 2S con un peso molecular sobre 15 kDa (Souza, 2020; Li et al., 2005). Las prolaminas son una familia de proteí nas que se encuentra principalmente en semillas de cereales como el trigo, la cebada, el centeno, el maí z, el sorgo y la avena. Se caracterizan por un alto contenido de glutamina y prolina. Son solubles en disoluciones alcoho licas, disoluciones ligeramente a cidas y alcali nas (Shewry y Casey, 1999; Yang et al., 2022). Por otro lado, las glutelinas son proteí nas presentes en varios alimentos, incluyendo el trigo, que desempen an un papel importante en la estructura y propiedades del gluten. Estas proteí nas se caracterizan por su solubilidad en soluciones alcalinas y por la presencia de enlaces disulfuro intermoleculares. Adema s, poseen una alta proporcio n de glutamina y prolina, así como motivos repetitivos (he lices alfa y la minas beta) en sus dominios centrales (Shewry et al., 1995; Belitz et al., 1986; Johanssons et al., 2013; Shang et al., 2005). Las globulinas son una familia de proteí nas solubles en condiciones salinas y que se encuentran en mayor cantidad en las semillas de las leguminosas (Marcone et al., 1997; Pickardt et al, 2015). En te rminos generales, las globulinas se dividen en 40 dos grupos principales: leguminas y vicilinas. Adema s, las globulinas se clasifican segu n su sedimentacio n en tres grupos: bajo peso molecular (<7S), peso molecular intermedio (7S-11S) y alto peso molecular (>11S). Las globulinas 7S son proteí nas glicosiladas que tienen una masa molecular entre 150 y 200 kDa, y se componen de tres subunidades, cada una con masas moleculares comprendidas entre 40 y 70 kDa. Las globulinas 11S son proteí nas hexa meras de masa molecular de 300 a 400 kDa, compuestas por seis mono meros, cada uno de ellos tiene una masa molecular entre 50 y 60 kDa (Nielsen et al., 1995; Bojo rquez-Vela zquez et al., 2016). Adema s, entre las 7S y las 11S hay diferencias estructurales con respecto a la existencia de puentes disulfuro intercadena e intracadena. L os mono meros de globulinas 11S se componen de dos cadenas polipeptí dicas (una a cida y otra ba sica) unidas por un enlace de puente disulfuro. S in embargo, las globulinas 7S carecen de este tipo de enlaces disulfuro en su estructura (Bojo rquez-Vela zquez et al., 2016; Tandang-Silvas et al., 2010). En particular, las globulinas de soja (Glycine max L.) reciben nombres especí ficos y han sido ampliamente estudiadas en la semilla debido a su importancia como fuente de proteí na vegetal en la dieta humana y animal, así como otros usos en la industria alimentaria. Para esta especie vegetal, debido a su abundancia y disponibilidad, tienen mayor relevancia las glob ulinas β-conglicinina (7S) y glicinina (11S), que constituyen aproximadamente el 40 % y el 30 % de la proteí na total, respectivamente. Atendie ndo a las caracterí sticas estructurales de la proteí na de soja, la globulina 7S consta de homo y heterotrí meros de tres subunidades, α (~67 kDa), α’ (∼71 kDa) y β (∼50 kDa), que no esta n asociadas covalentemente (Singh et al., 2015). Por otro lado, la glicinina, tambie n llamada proteí na de soja 11S, representa casi un tercio de las proteí nas totales de las semillas. Esta proteí na tiene una masa molecular de 300-380 kDa. Adema s, se ha confirmado que tien e una estructura hexa mera, lo que significa que esta formada por seis subunidades ide nticas o simila res. Cada subunidad de la glicinina consta de varias cadenas polipeptí dicas que se pliegan y se ensamblan para formar el hexa mero. Estas subunidades se unen entre sí mediante interacciones no covalentes, como enlaces de hidro geno y fuerzas de Van der Waals. Cada subunidad esta compuesta por un polipe ptido a cido y un polipe ptido ba sico unidos entre sí por un enlace disulfuro (Adachi et al., 2003). 41 Cada polipe ptido de glicinina tiene propiedades caracterí sticas que pueden utilizarse de forma independiente en diferentes aplicaciones ali mentarias. Por ejemplo, las subunidades ba sicas de las proteí nas 11S son solubles en el intervalo de pH de las bebidas a cidas lo que posibilita su uso en bebidas, mayonesa y aderezos para ensaladas (Kinsella, 1979; Ud Din et al., 2021). Sin embargo, en comparacio n con las globulinas de soja y otras fuentes vegetales, la mayorí a de los estudios llevados a cabo sobre las proteí nas de reserva de la semilla de uva son recientes y consisten principalmente en la identificacio n cualitativa de algunos polipe ptidos pertenecientes a la familia de las globulinas 11S de Vitis vinifera L. (Zhou et al., 2010; Gazzola et al., 2014). En este sentido, a pesa r del potencial valor tecnolo gico y la abundancia de este tipo de proteí nas (especialmente de semillas de uva procedentes de subproductos enolo gicos), son escasos los estudios disponibles sobre el efecto de los me todos de extraccio n, solubilizacio n y aislamiento, en la identificacio n, caracterí sticas estructurales y de estabilidad de los distintos tipos de globulinas presentes en la semilla de uva (Vincezi et al., 2013; Zhou et al., 2011). 1.2.2. Extracción, purificación y análisis proteómico de globulinas de fuentes vegetales Se ha descrito una amplia variedad de me todos ra pidos para la extraccio n de distintos tipos de proteí nas de semilla de diversas especies vegetales, utilizando diferentes disolventes (de base acuosa, salina, detergente, alcalina, alcoho lica o a cida), en funcio n de la naturaleza de la muestra proteica y de su uso final (Kumar et al., 2021). Las disoluciones salinas se utilizan habitualmente para la solubilizacio n preferente de globulinas vegetales modulando la fuerza io nica y el pH del medio (Gravel et al., 2023). Tambie n, el pH, el tipo de sal y la concentracio n utilizada influyen en la pureza y la estabilidad de las proteí nas extraí das. En el caso de las globulinas de semilla de girasol, el uso de una mayor concentracio n salina (2 M frente a 1.3 M NaCl) dio lugar a un mayor rendimiento proteico (23-26 % frente al 15 %) (Pickardt et al., 2015). Por otro lado, Tavano et al. (2022) en contraron que el NaCl 1 M era el disolvente de extraccio n ma s eficaz para las globulinas de las semillas de quinoa, con un rendimiento proteico del 64 %. Otros estudios demuestran que las globulinas 11S extraí das con disoluciones salinas (0.5 -1 M NaCl) en tampo n fosfato presentan mayor estabilidad estructural cuanto mayor sea la fuerza io nica (Marcone 48 Tabla 1. Condiciones, métodos de caracterización y fuerzas de interacción Tipo de Antociano Tipo de Proteína Calentamiento previo pH Métodos de caracterización Fuerzas intermoleculares Referencias Cianidina 3- gluco sido Pupa de gusano seda Sí 6.5 UV–Vis; FTIR; CD; FS Hidrofo bicas Attaribo et al., 2020 Proteí na de soja Sí 7.4 UV–Vis; FTIR; CD; FS Hidrofo bicas Chen et al., 2019 Ovoalbu mina No 2.4 y 7.1 FS; CD; MDM Enlaces de hidro geno; Van der Waals Fu et al., 2020 Malvidina-3- gluco sido α y β-caseí na No 6.3 FTIR; CD Enlaces de hidro geno; Van der Waals; hidrofo bica He et al., 2016 βlactoglobulina Sí 6.3 FTIR; CD; FS; Hidrofo bica He et al., 2016 Suero de leche No 7.4 UV-vis; FTIR; CD; FS; MDM Enlaces de hidro geno; hidrofo bicas Zang et al., 2021 Extracto de Patata morada Suero de leche No 6.8 FTIR; CD; FS; MDM Enlaces de hidro geno y Van der Waals Gong et al., 2021 Extracto de Mora Suero de leche No 3.2 FTIR; CD; SDL; FS; MDM; Fluorescencia de sonda ANS Enlaces de hidro geno; Van der Waals; hidrofo bicas Khalifa et al., 2018 Cianidina-3-O- gluco sido Globulina 7S de soja No 7.0 FS; DC; ITC Interacciones hidrofo bicas y electrosta ticas Re en tal., 2019 Cianidina-3-O- gluco sido Globulina 11S de soja No 7.0 FS; DC; ITC Interacciones hidrofo bicas y electrosta ticas Ren et al., 2019 Cianidina-3-O- gluco sido Glutelina de arroz No 3.5 FS; DC; ITC; SDS-PAGE; UV-vis Interacciones hidrofo bicas y electrosta ticas. Li et al., 2021 En diversos estudios se ha investigado el impacto de la temperatura de las proteí nas en su interaccio n con los antocianos. Se ha observado que el precalentamiento de las proteí nas de la leche mejora de manera efectiva la estabilidad te rmica, la resistencia a la oxidacio n y la sensibilidad a la luz de los antocianos procedentes de la uva. L os resultados ma s favorables se han obtenido al precalentar las proteí nas del suero durante un perí odo de 15 minutos a una temperatura de 50 °C, mientras que, en el caso de la caseí na, se ha encontrado que un precalentamiento de 15 minutos a una temperatura de 60 °C resulta ma s beneficioso (He et al., 2016). De manera similar, se ha demostrado recientemente que el concentrado de proteí na de gusano de seda precalentado a una temperatura de 80 °C durante 10 minutos muestra la mayor afinidad de unio n con cianidina-3-O- 49 gluco sido y mej ora significativamente su estabilidad te rmica y su resistencia a la oxidacio n (Attaribo et al., 2020). En cuanto a proteí nas vegetales, cabe destacar las investigaciones realizadas por Chen et al. (2020), donde observaron que el aislado de proteí n a de soja precalentado a una temperatura de 121 °C durante 15 minutos muestra una alta afinidad de unio n con cianidina 3-O-gluco sido a trave s de una interaccio n hidro foba, lo que conlleva una proteccio n dra stica de la estabilidad te rmica, la resistencia a la oxidacio n y el color del antociano (Adrar et a l., 2019). Desde el punto de vista molecular, numerosos estudios han demostrado que la relacio n entre los polifenoles y las proteí nas se basa principalmente en una interaccio n hidro foba no covalente (Adrar et al., 2019). En un estudio realizado p or Fu et al. (2020), se examino la interaccio n entre cianidina-3-O-gluco sido y ovoalbu mina en diferentes condiciones de pH, especí ficamente en entornos a cidos (pH 2.4) y neutros (pH 7.1), y se observo que los enlaces de hidro geno y las fuerzas de Van der Waals eran las principales fuerzas implicadas en la interaccio n. Por otro lado, S ui et al. (2018) ll evaron a cabo un estudio sobre la interaccio n entre los antocianos del arroz negro y un concentrado de proteí na de soja, en condiciones no covalentes (a pH 7.0) y covalentes (a p H 9.0), y como era esperado, observaron que los complejos covalentes presentaban una interaccio n ma s fuerte con la proteí na. 1.4. TÉCNICAS COMPUTACIONALES Las técnicas in silico se refieren al uso de herramientas computacionales y modelos matema ticos para el ana lisis, interpretacio n y prediccio n de datos biolo gicos, como por ejemplo en el estudio estructural de proteí nas, así como en el ana lisis de interacciones moleculares y la simulacio n de procesos biolo gicos, lo que las convierte en una herramienta potencialmente muy valiosa para complementar a las te cnicas experimentales (Ekins et al., 2007). En la actualidad, se emplean diversos me todos experimentales para la identificacio n y caracterizacio n de proteí nas. Entre las te cnicas ma s ampliamente utilizadas se encuentran la cristalografí a de rayos X (Shi, 20 14) y la espectroscopí a de resonancia magne tica nuclear (RMN) (Go bl et al., 2014), que permiten 50 determinar las estructuras tridimensionales de las proteí nas. Esta metodologí a tiene gran importancia y ha contribuido significativamente al conocimiento de las estructuras moleculares tanto de proteí nas como de mole culas orga nicas de menor taman o. Sin embargo, existen desafí os te cnicos que dificultan su empleo, tales como la expresio n y purificacio n de proteí nas propensa s a la agregacio n, la obtencio n de cristales de alta calidad y las limitaciones en el taman o de las proteí nas para el ana lisis por RMN, lo que, en ocasiones, hace que sean te cnicas laboriosas y lentas. Debido a estas limitaciones y dado q ue todaví a no es posible realizar una caracterizacio n experimental de alto rendimiento de las interfaces de proteí nas, las aproximaciones computacionales se han vuelto especialmente valiosas para la identificacio n de residuos interfaciales de manera confiable (Xue et al., 2015). Disponer de modelos estructurales obtenidos por te cnicas experimentales permite utilizarlos como archivos de entrada en estudios computacionales para evaluar los mecanismos de interaccio n molecular de esas proteí nas con otras mole culas. En el caso concreto de las globulinas vegetales, pra cticamente todas las estructuras 3D registradas en bases datos como Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/) se basan en la difraccio n de rayos X. Las globulinas de semillas de leguminosas fueron las primeras proteí nas de almacenamiento en someterse a cristalizacio n y evaluacio n por difraccio n de rayos X (Henning et al., 1992; 1994; Ko et al., 1993; Lawren ce et al., 1994). Desde entonces, el modelado por homología se ha utilizado como herramienta para disen ar otras globulinas que no han sido caracterizadas por las te cnicas experimentales mencionadas an teriormente, por ejemplo, la vicilina en el cacao, basa ndose en estructuras cristalinas de globulinas de leguminosas como canavalina de frijol jack y faseolina de frijol france s (Warwicker y Connor, 1995). Adema s, las te cnicas computacionales han supuesto un gran apoyo para el conocimiento estructural de otras proteí nas, como por ejemplo de la globulina 7S en soja y globulina 11S en guisante (Yoshizawa e t al., 2011; Tandang-Silvas et al., 2010; Rasheed et al., 2020). Los estudios de acoplamiento (docking) proporcionan una base cientí fica para determinar el mecanismo de interaccio n molecular entre dos mole culas, así como las conformacion es ma s estables de las especies implicadas. En este contexto, los estudios de acoplamiento de la β -lactoglobulina (βLG) con diferentes a cidos han 51 demostrado una interaccio n ma s fuerte de los derivados del a cido cina mico con βLG que los derivados del a cido benzoico (en orden, a cido cafeico > a cido c loroge nico > a cido feru lico > a cido sirí ngico > a cido 3,4-dihidroxibenzoico > a cido ga lico). Adema s, los resultados obtenidos mediante simulaciones de dina mica molecular entre estos a cidos feno licos y βLG muestran que la proteí na acomoda el ligando en su cavidad central hidrofo bica, interactuando principalmente a trave s de fuerzas hidrofo bicas (Li et al., 2020). Estas te cnicas tambie n han sido ampliamente utilizadas en proteí nas vegetales. En ese sentido, cabe destacar los estudios realizados por Dai et al. (2019), que permitieron esclarecer el modo de unio n entre el a cido ga lico y la superficie de glutelina de arroz. Tambie n, otros autores como Chen et al. (2019) estudiaron la interaccio n entre la globulina 7S de soja y catequina procedente del te , lo que determino que, en te rminos generales, dichas especies quí micas establecen interacciones mediante enlaces por puente de hidro geno e hidrofo bicas y, en p articular, se establece una interaccio n π-π entre los anillos aroma ticos de los compuestos feno licos y las proteí nas globulares. Por otro lado, los métodos de química cuántica, como los basados en la Teorí a Funcional de la Densidad Dep endiente del Tiempo (TD-DFT), son apropiados para predecir los espectros o pticos de un gran grupo de compuestos, como por ejemplo de los polifenoles. Para estos compuestos se han empleado diferentes condiciones de ca lculo como el funcional B3P86 en combinacio n con el set de base 6-311+G(d,p), que permite obtener energí as y estructuras moleculares con una buena precisio n. En estos casos, se recomiendan funciones polarizadas y difusas para describir correctamente los efectos de los sustituyentes quí micos (Gierschner et al., 2012). Adema s, los me todos cua nticos tambi e n permiten obtener estructuras y propiedades de los sistemas de copigmentacio n (Quartarolo y Russo, 2011; Di Meo et al., 2012; Kalisz et al. , 2013; Trouillas et al., 2015; 2016). En te rminos de metodologí a computacional, es necesario considerar en los ca lculos las correcciones de dispersio n de Grimme (Di Meo et al., 2015) para describir de manera adecuada las fuerzas de dispersio n entre el pigmento y el copigmento. La inclusio n de estas correcciones resulta imprescindible para ob tener una representacio n precisa de las propiedades energe ticas del sistema. En relacio n con los me todos de ca lculo, se ha encontrado que el empleo de la combinacio n CAM-B3LYP-D3, el cual considera las interacciones de dispersio n, con un modelo de disolvente implí cito del tipo IEFPCM 52 (Integral Equation Formalism Polarizable Continuum Model) que, en combinacio n con los conjuntos de base 6-311++G(d,p) o aug-cc-pVDZ, resultan suficientemente adecuados para proporcionar valores de energí as de enlace e interaccio n razonab les (Li et al., 2018). 1.4.1. Tipos de modelización de las estructuras 3D de proteínas La estructura tridimensional de una proteí na esta directamente relacionada con su funcio n biolo gica, por lo que es fundamental comprenderla para avanzar en la investigacio n en numerosos campos de estudio, como la biologí a molecular y celular, disen o de fa rmacos, investigacio n de enfermedades, así como en industrias alimentaria y biotecnolo gica. En este aspecto, la b ioinforma tica de proteí nas es una disciplina que utiliza herramientas y te cnicas computacionales para la identificacio n y ana lisis de secuencias de proteí nas, estructuras tridimensionales, interacciones proteí na-proteí na, sitios de unio n de ligandos y otras caracterí sticas estructurales y fisicoquí micas importantes ( De Almeida Paiva et al., 2022). Especialmente en el caso de la industria alimentaria, estudiar la estructura de las proteí nas es fundamental para entender el impacto que e stas tienen en las propiedades sensoriales y tecnolo gicas de distintos alimentos, como el color, la textura, capacidad de emulsificacio n y de gelificacio n, e tc. En ese sentido, comprender la estructura particular de distintas proteí nas permite conocer sus posibles usos tecnolo gicos y, así , mej orar la calidad de alimentos, dota ndolos de caracterí sticas u nicas (Tomadoni et al., 2020). En los u ltimos an os, el nu mero de secuencias de proteí nas conocidas ha aumentado de manera exponencial y actualmente hay alrededor de 150 millones de proteí nas en la base de datos UniProtKB (https://www.uniprot.org/). Sin embargo, la informacio n de la secuencia por sí sola no es suficien te para comprender la funcio n de la proteí na. Para ello, es necesario contar, adema s, con informacio n sobre la estructura de la p roteí na, a pesar de que conseguir dicha informacio n resulta ser un proceso costoso y complicado. Como consecuencia, existe una brecha entre la tasa de crecimiento de disponibili dad de la informacio n secuencial y estructural en el campo de la proteo mica. Por ej emplo, en la base de datos Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/) se encuentran disponibles en torno a 170 000 estructuras de proteí nas registradas. 53 Predecir la estructura de una proteí na a partir de su secuencia de aminoa cidos sigue siendo un problema con muchos desafí os por resolver en el campo de la bioinforma tica. Para ello, es necesario una evaluacio n crí tica de la prediccio n de la estructura de proteí nas basada en el desarrollo de me todos de prediccio n mediante herramientas computacionales. L a prediccio n de una estructura proteica se fundamenta en la premisa de que el estado nativo de la proteí na sera aq uel de menor energí a libre. Los me todos de prediccio n estructural combinan, para una proteí na, sus distintas conformaciones posibles y las clasifican mediante funciones de energí a, lo q ue permite conocer el estado energe ticamente ma s estable (de Almeida Paiva et al., 2022). Los me todos para predecir la estructura de las proteí nas se pueden clasificar en dos en foques: basad os en plant illas y sin plantillas (Kuhlman, et al., 2019). Los me todos basados en plantillas utilizan y comparan estructuras relacionadas previa mente determinadas en un archivo de coordenadas de proteí na (conocido como pdb) como “modelos” para modelar la secuencia objetivo. En caso de no encontrar proteí nas relacionadas, los me todos sin plantilla intentan predecir directamente la estructura de la proteí na a partir de su secuencia, utilizando funciones energe ticas combinadas con el muestreo conformacional. 1.4.2. Modelado basado en plantillas por homología El modelado basado en plantillas, tambie n conocido como modelado por homologí a (Homology modelling), utiliza muestras con alta identidad de secuencia con la proteí na de intere s para predecir modelos de proteí nas tridimensionales (3D). Este me todo es eficaz cuando la proteí na de in tere s comparte al menos un 30 % de identidad de secuencia con la proteí na modelo. Por lo general, las etapas de modelado esta ndar basados en plantillas incluyen: 1) la seleccio n de una plantilla estructural adecuada, 2) la alineacio n de la secuencia de la proteí na de intere s con la plantilla de la proteí na modelo, y 3) el ensamblaj e de la estructura 3D de la proteí na modelo en la alineacio n con la plantilla de intere s. Para el desarrollo computacional de estas etapas, destacan diferentes softwares como I-TASSER (Zhou et al., 2022) y Modeller (Fiser et al., 2000), ambos empleados para la modelizacio n de proteí nas. La principal diferencia entre los dos es que I-TASSER utiliza una estrategia de ensamblaje de fragmentos y varios algoritmos, mien tras que Modeller 54 se basa en la comparacio n de secuencias y la optimizacio n de estructuras a partir de modelos de referencia (Yang et al., 2015). Sin embargo, hay casos en los que la secuencia diana es distante de las plantillas de proteí nas relacionadas. En esta situacio n, se emplea el software RaptorX (Peng et al., 2011) que se fundamenta en un me todo de puntuacio n de entropí a de perfil, que analiza el nu mero de estructuras homo logas (Ka llberg et al., 2012). Tambie n destaca el servidor web Swiss-Model, que utiliza el modelado de homologí a, y esta basado en un alineamiento de la secuencia de aminoa cidos de la proteí na problema con la proteí na modelo (https://swissmodel.expasy.org/). En primer lugar, se utiliza una proteí na diana y su secuencia sirve como consulta p ara encontrar proteí nas relacionadas evolutivamente en la biblioteca de plantillas SWISS-MODEL SMT, la cual se act ualiza regularmente y contiene proteí nas de varios organismos y fuentes experimentales, incluidas las encontradas en Protein Data Bank, la mayor base de datos de proteí nas estructurales disponible pu b licamente (Biasini et al., 2014). Posteriormente, las plantillas se alinean con la secuencia objetivo para verificar si estas plantillas pueden representar estados conformacionales o cubrir diferentes regiones de la proteí na de consulta. Finalmente, se crea un modelo de proteí na 3D p ara cada plantilla seleccionada, adaptando las coordenadas ato micas almacenadas de acuerdo con la alineacio n de la plantilla de destino (Fig. 9) (Waterhouse et al., 2018). Figura 9. Elaboración de un modelo 3D de una proteína desconocida por modelado de homología basado en plantillas. (Fuente: Adaptada de Hillisch et al., 2004). 55 1.4.3. Modelado sin plantilla La base para la modelizacio n de proteí nas sin plantilla es la hipo tesis termodina mica de Anfinse n (1972), que afirma que el estado nativo de una proteí na es el que tiene la energí a libre ma s baja. Los me todos para modelar proteí nas sin plantillas tambi e n son conocidos como me todos de novo. Los softwares ma s representativos p ara este tipo de modelizacio n son Rosseta (Leman et al., 2020) Quark (Xu et al., 2012) y ModPipe (Narayanan et al., 2003). Existen varios me todos para modelar proteí nas sin plantillas. Uno de los ma s utilizados es el ensamblaje de fragmentos, donde se utilizan secciones de estructuras proteicas conocidas para ensamblar una estructura tridimensional completa. Otro es el me todo ab initio, en el que se utiliza la fí sica molecular para predecir la estructura de una proteí na en funcio n de su secuencia de aminoa cidos. En general, los me todos de novo son ma s complejos y menos precisos que los me todos basados en plantillas, pero resultan u tiles cuando no se dispone de estructuras proteicas similares. Actualmente, esta n cobrando gran importancia los me todos de prediccio n de estructuras de proteí nas basados en inteligencia artificial. En este aspecto destaca el software AlphaFold (https://alphafold.ebi.ac.uk/), un me todo de coevolucio n que logra excelentes resultados segu n los esta ndares establecidos para la Evaluacio n Crí tica de las Te cnicas para la Prediccio n Estructural de Proteí nas, siendo sus siglas en ingle s CASP (AlQuraishi, 2019). AlphaFold ut iliza una red ne uronal convolucional, es decir, es un tipo de red artificial que permite procesar datos en forma de matrices. En relacio n con la prediccio n de la estructura de la proteí na, los datos de entrada son secuencias de aminoa cidos que pueden tratarse como una matriz unidimensional. Así , es posible analizar la secuencia de aminoa cidos de una proteí na y predecir su estructura tridimensional atendiendo a aspectos estereoquí micos. Finalmente, se emplea un me todo de optimizacio n para afinar la estructura tridimensional, minimizar la energí a potencial de la estructura y así obtener una estructura tridimensional ma s est able. La principal diferencia entre AlphaFold y el modelado por homologí a basado en plantillas radica en sus enfoques y fundamentos teo ricos. AlphaFold utiliza 56 te cnicas de aprendizaje automa tico y ana lisis de datos para p redecir la estructura de las proteí nas, mientras que el modelado por homologí a se basa en la comparacio n de secuencias y estructuras de proteí nas conocidas. AlphaFold ha demostrado ser especialmente exitoso en la prediccio n de estructuras de proteí nas sin homo logos conocidos (Jumper et al., 2021). 1.4.4. Parámetros para la evaluación de las estructuras 3D de proteínas Existen diferentes herramientas y servidores para evaluar la fiabilidad y precisio n de las estructuras proteicas tridimensionales obtenidas, teo rica o experimentalmente. E stas herramientas computacionales esta n basadas en la evaluacio n de distintos para metros de validacio n, los cuales se utilizan p ara detectar posibles errores o desviaciones en la estructura modelada. Esta valoracio n permite determinar si la estructura evaluada es adecuada para su uso en estudios posteriores, como por ejemplo de acoplamiento y dina mica molecular. Adema s, son importantes para la comparacio n y seleccio n de estructuras de proteí nas y, ma s ampliamente, para el desarrollo de me todos ma s precisos para mejorar las estructuras de proteí nas modeladas. En el caso del servidor Swiss-Model, los para metros de validacio n que suelen utilizarse para evaluar la precisio n de la estructura modelada, así como sus propiedades estereoquí micas son: la estimacio n de la calidad global del modelo (Global Model Quality E stimate, GMQE), el modelo cualitativo de ana lisis de la energí a (Qualitative Model Energy Analysis, QMEAN), y la relacio n con este u ltimo (QMEAN Z-score ana lisis). El para metro GMQE esta relacionado con una estimacio n global de la calidad del modelo (Waterhouse et al., 2018) mientras que el para metro QMEAN evalu a la estabilidad energe tica del modelo cualitativo (Benkert, Biasini y Schwede, 2010). El valor de GMQE resultante indica la precisio n esperada del modelo construido con la alineacio n y la plantilla, y la cobertura objetivo. Se expresa entre 0 y 1, de manera que valores cercanos a 1 indican una mayor fiabilidad del modelo construido. QMEAN, por su parte, es una funcio n de p untuacio n compuesta que evalu a los principales aspectos geome tricos de las estructuras protei cas. Junto 57 con QMEAN, el valor de QMEAN-Z proporciona una estimacio n del grado de conservacio n de las caracterí sticas est ructurales obtenidas en el modelo a escala global (Benkert et al., 2010). Los valores de QMEAN-Z se expresan entre -4 y 0, de forma que, cercanos a 0 indican una buena concordancia entre la estructura del modelo predicho y las estructuras experimentales de taman o similar, mientras que valores inferiores o cercanos a -4.0 indican modelos de baja calidad. A pesar de que Swiss-Model cuenta con para metros especí ficos para la evaluacio n de la calidad de las estructuras modeladas, existen servidores que permiten hacerlo a partir de otros para metros. A este respecto, cabe destacar el servidor UCLA-DOE LAB (https://saves.mbi .ucla.edu/) que aloja PROCHECK, VERIFY 3D y ERRAT, que permiten evaluar la calidad de las estructuras proteicas tridimensionales. PROCHECK es una herramie nta que realiza un ana lisis geome trico y estadí stico de la forma tridimensional de una proteí na. A partir de esta informacio n se p uede construir el denominado “diagrama de Ramachandran”, que p ermite evaluar la conformacio n de los enlaces peptí dicos en una proteí na. Este diagrama muestra las regiones permitidas y no permitida s de los aminoa cidos de una proteí na en funcio n de los a ngulos de torsio n ψ (psi) contra φ (phi) de los enlaces peptí dicos (Fig. 10). Las regiones permitidas del diagrama corresponden a los a ngulos de torsio n que son estables desde el punto de vista energe tico, mientras que las regiones prohibidas corresponden a los a ngulos de torsio n que son inestables y que podrí an indicar posibles errores en la estructura. En te rminos generales, valores sobre 90 % de residuos en regiones permitidas hacen aceptable esta evaluacio n. Figura 10. Ángulos de torsio n phi y psi del esqueleto peptídico de una proteína. VERIFY 3D evalu a la calidad de una estructura dada compara ndola con otras estructuras en la base de datos, considerando valores de aceptacio n comunes superiores al 80%. ERRAT evalu a la calidad de la estructura tridimensional de una 64 Los estudios de dina mica molecular no se limitan u nicamente a los sistemas proteí na-ligando, sino que tambie n abarca la interaccio n entre dos mole culas pequen as. En este sentido, destacan estudios sobre el comportamiento de autoasociacio n de malvidina 3-gluco sido utilizando el paq uete de simulaciones Amber 12.0 (Sa lomon-Ferrer et al., 2013) mediante una simulacio n de 50 ns. E ste estudio revelo las interacciones in termoleculares e in tramoleculares presentes en las mole culas de malvidina (Fernandes et al., 2015). Se encontro que el grupo aroma tico en malvidina 3-gluco sido ejerce un efecto positivo en la interaccio n hidrofo bica entre las mole culas. Este grupo puede generar apilamientos π-π con otros anillos, lo que contribuye a la estabilizacio n del conjunto. Estos resultados son consistentes con los experimentos de resonancia magne tica nuclear (RMN) (Fernan des et a l., 2015). El ana lisis de los resultados de las simulaciones de dina mica molecular puede ser muy complejo debido a la gran cantidad de datos que se generan. Por esta razo n, los programas de visualizacio n de dina mica molecular son herramientas muy u tiles para explorar y analizar los resultados de las simulaciones. Con ellos, es posible visualizar las estructuras moleculares en 3D, lo que facilita la comprensio n de las interacciones moleculares y la identificacio n de posibles errores en la simulacio n. Adema s, los programas de visualizacio n de dina mica molecular tambie n permiten realizar ana lisis cuantitativos de las simulaciones, como ca lculos de energí a, distancia entre a tomos y orientacio n de los grupos funcionales. E stos ana lisis son esenciales para comprender la dina mica molecular de las biomole culas y para identificar los mecanismos de interaccio n molecular. Existen varios p rogramas de visualizacio n para dina mica molecular, algunos de los ma s usados son: 1. VMD (Visual Molecular Dynamics): es uno de los programas ma s utilizados para la visualizacio n de estructuras moleculares. VMD es muy eficiente para la visualizacio n de grandes sistemas moleculares, como proteí nas y a cidos nucleicos. Tambie n puede utilizarse para la simulacio n de dina mica molecular. 2. PyMOL: es un programa de visualizacio n molecular muy emplea do y de fa cil uso. Es capaz de representar estructuras moleculares en 3D con gran detalle y 65 precisio n. Tambie n es capaz de realizar simulaciones de dina mica molecular (Fig. 11). 3. Chimera: es un programa de visualizacio n molecular que permite la visualizacio n de estructuras moleculares en 3D y la simulacio n de dina mica molecular. Chimera es muy versa til y permite la visualizacio n de una gran variedad de estructuras moleculares, incluyendo proteí nas, a cidos nucleicos, lí pidos y carbohidratos. 4. Avogadro: es un programa de visualizacio n molecular y modelado de estructuras moleculares, con el que ta mbie n se pueden representar estructuras moleculares en 3D y re alizar simulaciones de dina mica molecular. 5. NAMD: es un programa de simulacio n de dina mica molecular que incluye herramientas para la visualizacio n de estructuras moleculares en 3D. Es muy utilizado para el estudio de proteí nas y a cidos nucleicos. 6. Discovery Studio: es un software desarrollado por Dassault Syste mes BIOVIA que se utiliza para el ana lisis y la visualizacio n de datos moleculares, como la identificacio n de sitios de unio n, la determinacio n de propiedades fisicoquí micas, el ana lisis de conformaciones y la generacio n de ima genes y representaciones gra ficas. Figura 11. Visualizacio n de mole cul as en PyMOL. (a) Representacio n de los residuos de la proteí na qu e i nteraccionan con un ligando. b) Visualizacio n de una proteí na c) Sitio de unio n proteí na-ligando en el interior de la proteí na (Fuente: Yua n et al., 2017). 66 En esta tesis se han utilizado p rincip almente Discovery Studio, Chimera y PyMOL debido a su versatilidad y su capacidad para generar gra ficos, videos e ima genes de alta calidad, lo que facilita la comunicacio n y comprensio n visual de los resultados de la investigacio n. 1.4.7. Métodos cuánticos. Cálculos basados en la Teoría del Funcional de la Densidad La imposibilidad de resolver de forma exacta la ecuacio n de Schro dinger, debido a su extraordinaria complejidad para sistemas polielectro nicos como los polifenoles, ha llevado a introducir aproximaciones para conseguir una funcio n cercana a la verdadera funcio n de onda Ψ que describe el comportamiento de los electrones. Este es el caso de la funcio n de la densidad electro nica, y es la base de la Teoría del Funcional de la Densidad (DFT) (Parr et al., 1983). Para obtener la ecuacio n fundamental de esta teorí a, es necesario conocer la energí a total de un sistema de electrones y puede ser expresada como una funcio n de densidad electro nica 𝑛 (𝑟) en lugar de las complicadas funciones de onda de los electrones independientes. En este contexto, el comportamiento en cuestio n se describe utilizando la ecuacio n de Kohn-Sham: 𝐸𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙[𝑛 (𝑟)]=𝑇[𝑛(𝑟)]+𝑉𝑒𝑥𝑡[𝑛(𝑟)]+𝐸𝐻𝑎𝑟𝑡𝑟𝑒𝑒[𝑛(𝑟)]+𝐸𝑋𝐶[𝑛(𝑟)]+ ∫𝑛 (𝑟)𝜇(𝑟)𝑑𝑟 Donde: • 𝐸𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙[𝑛 (𝑟)] es la energí a total del sistema de electrones. • 𝑇[𝑛(𝑟)] es la en ergí a cine tica electro nica que depende de la densidad electro nica. • 𝑉𝑒𝑥𝑡[𝑛(𝑟)] es el potencial externo que incluye el potencial generado por los nu cleos ato micos y cualquier otro potencial externo presente. • 𝐸𝐻𝑎𝑟𝑡𝑟𝑒𝑒[𝑛(𝑟)] es la energí a de interaccio n electro nica de Hartree que describe la interaccio n electrosta tica entre los electrones. • 𝐸𝑋𝐶[𝑛(𝑟)] es la energí a de intercambio y correlacio n electro nica que representa los efectos de intercambio y correlacio n cua ntica entre los electrones. 67 • ∫𝑛 (𝑟)𝜇(𝑟)𝑑𝑟 es la integral de la densidad electro nica 𝑛 (𝑟)multiplicada por el potencial quí mico 𝜇(𝑟) en todo el espacio. El potencial quí mico 𝜇(𝑟) se relaciona con la densidad electro nica 𝑛 (𝑟) a trave s de la siguiente expresio n: 𝜇(𝑟)=𝛿𝐸𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙[𝑛(𝑟)] 𝛿𝑛(𝑟) 𝑣(𝑟) El potencial quí mico es una propiedad fundamental que describe la disponibilidad de los electrones para p articipar en reacciones quí micas y establecer equilibrios electro nicos. La relacio n entre el potencial quí mico y la densidad electro nica es esencial en la Teorí a del Funcional de la Densidad, ya que proporciona informacio n crucial sobre la distribucio n y comportamiento de los electrones en el sistema. A trave s de esta relacio n, es posible analizar y predecir propiedades y feno menos q uí micos, así como entender la estructura electro nica de los materiales y mole culas (Parr, 1983). La base de ca lculo que proporciona la DFT da lugar a numerosas aplicaciones en diferentes a reas del conocimiento como la fí sica y la quí mica y, especialmente en esta u ltima, a l estudio de las propiedades espectrales de pigmentos naturales y sinte ticos (Monzo n-Bensojo et al., 2019; Kimura et al., 2017; Di Meo et al., 2012). En cualquier ca lculo basado en esta metodologí a cua nt ica es necesaria la optimizacio n de la geometrí a mol ecular, que es la base para obtener las propiedades fisicoquí micas. En este aspecto, la DFT se usa ampliamente en espectroscopí a electro nica para la prediccio n y el ana lisis de UV-Vis, espectros de ab sorcio n y emisio n como los espectros de resonancia magne tica nuclear (RMN). Adema s de su aplicacio n en la espectroscopí a, la DFT se emplea en diversas a reas, como el estudio de la conductividad ele ctrica y te rmica de los materiales, la cata lisis de reacciones quí micas, y el ana lisis de propiedades o pticas, como la polarizabilidad y el í ndice de refraccio n. Estas aplicaciones demuestran la versatilidad de la DFT y su capacidad para abordar una amplia gama de feno menos y propiedades quí micas. En relacio n con la optimizacio n de la geometrí a molecular y el ca lculo del espectro UV-vis de compuestos feno licos, el software comercial Gaussian es ampliamente utilizado en quí mica teo rica. Este software resuelve la ecuacio n de 68 Schro dinger basa ndose en la Teorí a de Orbitales Moleculares (TOM). A partir de para metros iniciales, como el tipo de me todo ab initio (Hartree-Fock, Mo ller-Plesset, etc.), la Teorí a del Funcional de la Densidad (DFT) o me todos semiempí ricos (AM1, PM3, CNDO, etc.), funciones de base (STO-3G, 6-31G, 6-311+G*, etc.), coordenadas iniciales de la mole cula, carga y multiplicidad, Gaussian calcula la funcio n de onda molecular y proporciona una serie de p ropiedades fisicoquí micas de los a tomos y las mole culas. Para la determinacio n de las propiedades fisicoquí micas de los compuestos quí micos resulta u ti l la aplicacio n de los ca lculos DFT con funcionales hí bridos (expresiones matema ticas que relacionan la densidad electro nica con la energí a y otros observables del sistema). Estos ca lculos se consideran una herramienta valiosa para explicar la conjugacio n π en mole culas de taman o mediano, como los polifenoles, siendo el ma s representativo y utilizado el funcional hibrido B3LYP (Stephens, Devlin, Chabalowski & Frisch, 1994; Gierschner et al., 2012). Con respecto al conjunto de bases de triple ζ de tipo Pople es ampliamente utilizada el tipo 6-31+G(d,p) que permite una buena relacio n de compromiso entre precisio n y consumo de tiempo de ca lculo donde la consideracio n de la funcio n difusa (+) es necesaria para evaluar mejor la distribucio n de los electrones en estos sistemas altamente conjugados debido a la presencia de anillos aroma ticos (Anouar et al., 2012; Sinopoli et al., 2019). Un factor que hay que tener en cuenta en el ca lculo de la geometrí a molecular y del espectro visible de un compuesto es el modelo del disolvente, el cual debe ser adecuado, y su eleccio n depende del tipo de mole cula. En particular, para los polifenoles ha sido u til emplear el Modelo Continuo Polarizable (PCM, por sus siglas en ingle s) desarrollado originalmente por Tomasi et al. (2005). En el modelo PCM , el disolvente se trata como un continuo diele ctrico infinito, mientras que el soluto se encuentra en una cavidad rodeada por el solvente, el cual se describe implí citamente como un continuo diele ctrico caracterizado por su consta nte diele ctrica. Por ejemplo, se podrí a considerar como disolvente el agua (cuya constante diele ctrica, ε, tiene un valor de 78.5 a temperatura ambiente) ya que es el medio natural donde se encuentran los polifenoles en la naturaleza. 69 Adema s, al considerar los ca lculos dependientes del tiempo de la Teorí a del Funcional de la Densidad (TD-DFT), es posible calcular las energí as de excitacio n y obtener informacio n sobre la estructura y los espectros de absorcio n. Esta metodologí a se considera una forma precisa de describir los estados excitados de sistemas de aproximadamente hasta 200 a tomos en un tiempo computacion al aceptable (Anouar et al., 2012). En el caso concreto de los antocianos, resulta especialmente u til el ca lculo del espectro visible, ya que su estructura puede sufrir modificaciones mediante interacciones con otros compuestos, lo cual se refleja en cambios caracterí sticos en el esp ectro de absorcio n. Segu n la metodologí a de ca lcul o descrita para la optimizacio n de la geometrí a molecular y el ca lculo del espectro visible, se han empleado diferentes funcionales como PBE0, CAM-B3LYP, M06 y B3LYP, sie ndo B3LYP el ma s preciso en la obtencio n del espectro UVVis (Soto-Rojo et al., 2014). Con relacio n a los modelos de disolvente utilizados en el ca lculo del espectro, el modelo PCM (Polarizable Continuum Model) es ampliamente utilizado. Este modelo no considera la relajacio n temporal del disolvente, lo que imp lica asumir la ausencia de interacciones no covalentes entre el soluto y el disolvente. A pesar de esta limitacio n, el modelo PCM ha demostrado ofrecer una precisio n razonable en la p rediccio n de espectros (Gierschner et al., 2012; L i et al., 2018). Aplicando la metodologí a TD-DFT, Rustion i et al. (2013) calcularon los espectros de absorcio n visible simulados de las principales antocianinas del vino tinto (los 3-O- gluco sidos de cianidina, peonidina, delfinidina, petunidina y malvidina, y sus formas acetil, p-cumaroil y cafeoil e ster), y sus efectos de copigmentacio n intermolecular. Por otro lado, Li et al. (2018) han aplicado la DFT logrando una ra pida prediccio n de la capacidad de copigmentacio n entre la malvidina y la quercetina. Sin embargo, la aplicabilidad de los enfoques in silico para predecir las caracterí sticas colorime tricas en lugar de la interpretacio n del espectro de ab sorcio n teo rico de pigmentos sigue siendo escasa debido a los numerosos retos teo ricos q ue quedan por abordar. OBJETIVOS 73 2. OBJETIVOS El objetivo general de este trabajo es analizar el efecto en el color de malvidina 3-gluco sido cuando se encuentra en presencia de proteí nas de la semilla de uva, principalmente globulinas, y evaluar las interacciones quí micas entre estas proteí nas y el pigmento utilizando te cnicas espectrosco picas y modelizacio n molecular. El propo sito es comprender en detalle los mecanismos involucrados en la estabilizacio n del color en presencia de proteí nas de la semilla de uva y proporcionar informacio n relevante para la mejora y optimizacio n de la p roduccio n de vinos tintos. En concreto se han planteado los siguientes objetivos especí ficos: • Determinar la estructura de las globulinas 7S y 11S mediante te cnicas de modelizacio n molecular y evaluar la interaccio n de estas proteí nas con malvidina 3-gluco sido, para obtener informacio n detallada sobre la estructura tridimensional de las globulinas y co mprender co mo se relacionan con el pigmento para contribuir al conocimiento de los mecanismos de interaccio n entre las proteí nas de la semilla de uva y los compuestos feno licos en la estabilizacio n del color en vinos tintos. • Evaluar la interaccio n quí mica y determinar el efecto en el color de malvidina 3-glucosido cuando se encuentra en presencia de proteí nas de semilla de uva pertenecientes a la familia de las 11S globulinas. • Optimizar un me todo purificacio n sencillo y ra pido para aislar globulinas 11S de la semilla de uva que permita obtener dichas proteí nas con una alta pureza y rendimiento. • Aplicar te cnicas in silico que permita estimar de manera precisa y confiable el color de malvidina 3-gluco sido en base a su estructura molecular. Metodología MATERIAL Y ME TODOS 80 3.2. MÉTODOS 3.2.1. Preparación de extractos proteicos de globulinas de semilla de uva Todas las extracciones de las fracciones de globulinas a partir de harina GSE y GSBP se realizaron de acuerdo con una modificacio n del me todo de Osborne (1924). Obtención de fracciones de globulinas de harina GSE y GBSP mediante solubilización con 0.5 M NaCl, filtración por diálisis (3 kDa), y precipitación con TCA-acetona Las muestras de harina GSE y GSBP (1:10 p/v) se extrajeron individualmente con NaCl 0.5 M, en agitacio n constante durante 1 hora a temperatura ambiente (25 ± 0.2 °C), p or triplicado. En cada caso, el sobrenadante obtenido en la primera extraccio n, que contiene la fraccio n proteica soluble en sal (fundament almente globulinas), se centrifugo durante 10 min (8000 g). El residuo de harina se sometio dos veces ma s al mismo proceso de extraccio n, en agitacio n constante durante 30 min. Los tres sobrenadantes resultantes de cada replicado se combinaron, filtra ndose a trave s de un filtro de nailon de 0.45 µm. Las fracciones de globulinas filtradas se dializaron utilizando tubos de filtracio n centrí fuga Amicon® Ultra-15 (Millipore, Darmstadt, Alemania) con MWCO de 3 kDa. Posteriormente, las fracciones proteicas dializadas (1 ml) se sometie ron a un proceso de precipitacio n con TCA-acetona. Para ello, se agrego en primer lugar TCA a una concentracio n del 10 % (p/v) a cada muestra y se mantuvo 30 min a -20 °C. La fraccio n proteica precipitada se separo por centrifugacio n (8000 g, 5 min), y se sometio posteriormente a un lavado con 2 ml d e acetona frí a durante 1 hora a -20 °C. Tras el lavado, las fracciones proteicas se recuperaron mediante centrifugacio n (8000 g, 10 min), se secaron al aire y se disolvieron en 250 µl de tampo n Tris-HCl 0.8 M pH 7.5 para su ana lisis. Metodología MATERIAL Y ME TODOS 81 Obtención del aislado de globulina de harina GBSP mediante precipitación fraccionada con amonio de sulfato El aislado de globulina 11S de semilla se preparo a partir de la fraccio n de globulina de la harina GSBP descrita en el apartado anterior, y aplicando un me todo de precipitacio n fraccionada con sulfato de amonio (Burgess et al., 2009). Para ello, se prepararon distintas disoluciones de sulfato de amonio al 30 %, 40 %, 50 % y 60 %. Posteriormente, 10 ml de cada una de estas disoluciones se an adieron a 5 ml de la fraccio n de globulina GSBP, respectivamente, mantenie ndose duran te 30 min en un ban o de hielo para permitir la completa precipitacio n de las proteí nas. Los precipitados proteicos obtenidos se separaron por centrifugacio n (8000 g, 5 min), y se volvieron a disolver en tampo n Tris-HCl 0.8 M (pH 7.5) hasta su ana lisis. Obtención de la fracción de globulinas de harina GBSP mediante solubilización con 0.5 M NaCl y filtración por diálisis (6-8 kDa) La muestra de harina GSBP (1:10 p/v) se extrajo con NaCl 0.5 M, en agitacio n constante durante 1 hora a temperatura ambiente (25 ± 0.2 °C). El sobrenadante obtenido se centrifugo (8000 g durante 10 min) y el residuo de harina se sometio dos veces ma s al mismo proceso de extraccio n, en agitacio n constante durante 30 min. Los tres sobrenadantes resultantes de cada replicado se combinaron, filtra ndose a trave s de un filtro de nailon de 0.45 µm. La fraccio n de globulinas filtrada se dializo durante 48 h a una temperatura de 4 C con agua ultrapura, utilizando discos de membrana de celulosa regenerada Spectra/Por® 1, con MWCO de 6-8 kDa (Spectrum™, Fisher Scientific SL, Madrid, Espan a). Obtención de la fracción de globulinas “NaCl” de harina GBSP mediante solubilización con 0.5 M NaCl y filtración por diálisis (3.5 kDa) La muestra de harina GSBP (1:10 p/v) se extrajo con NaCl 0.5 M, en agitacio n constante durante 20 min a temperatura ambiente (25 ± 0.2 °C). El sobrenadante se centrifugo (1000 rpm, 5 min), repitiendo el mismo proceso de extraccio n sobre el Metodología MATERIAL Y ME TODOS 82 residuo de harina dos veces durante 20 min. Los tres sobrenadantes se combinaron, filtra ndose a trave s de filtros de nailon de 0.45 μm. La fraccio n filtrada se dia lizo durante 24 horas a 4 °C utilizando agua milli-Q y membranas de celulosa regenerada S pectra/Por™ con MWCO de 3.5 kDa (Spectrum Chemicals, NJ, EE. UU.). Obtención de la fracción de globulinas “WNaCl” de harina GBSP mediante solubilización en dos etapas (agua y 0.5 M NaCl), y filtración por diálisis (3.5 kDa) La muestra de harina GSBP (1:10 p/v) se extrajo aplicando un proceso de extraccio n en dos etapas, en agitacio n constante durante 20 min a temperatura ambiente (25 ± 0.2 °C). El proceso de extraccio n consistio en una primera solubilizacio n de proteí nas con agua (fraccio n que fue descartada), seguida de una segunda solubilizacio n del residuo de harina con NaCl 0.5 M. El sobrenadante se centrifugo (1000 rpm, 5 min), repitiendo el mismo proceso de solubilizacio n del residuo de harina con NaCl 0.5 M dos veces duran te 20 min. Los tres sobrenadantes se combinaron, filtra ndose a trave s de filtros de nailon de 0.45 μm. La fraccio n proteica filtrada se dializo durante 24 horas a 4 °C utilizando agua milli-Q y membranas de celulosa regenerada Spectra/Por™ con MWCO de 3.5 kDa (Spectrum Chemicals, NJ, EE. UU.). Obtención de la fracción de globulinas “PBS” de harina GBSP mediante solubilización con tampón fosfato salino (pH 7) y filtración por diálisis (3.5 kDa) La muestra de harina GSBP (1:10 p/v) se extrajo con tampo n fosfato salino (PBS, 0.067 M K2HPO4 pH 7.0), en agitacio n constante durante 20 min a temperatura ambiente (25 ± 0.2 °C). El sobrenadante se centrifugo (1000 rpm, 5 min), repitiendo el mismo proceso de extraccio n sobre el residuo de harina dos veces durante 20 min. Los tres sobrenadantes se combinaron, filtra ndose a trave s de filtros de nailon de 0.45 μm. Metodología MATERIAL Y ME TODOS 83 La fraccio n filtrada se dializo durante 24 horas a 4 °C utilizando agua milli-Q y membranas de celulosa regenerada S pectra/Por™ con MWCO de 3.5 kDa (Spectrum Chemicals, NJ, EE. UU.). Obtención de la fracción de globulinas “WPBS” de harina GBSP mediante solubilización en dos etapas (agua y tampón fosfato salino pH 7), y filtración por diálisis (3.5 kDa) La muestra de harina GSBP (1:10 p/v) se extrajo aplicando un proceso de extraccio n en dos etapas, en agitacio n constante durante 20 min a temperatura ambiente (25 ± 0.2 °C) cada una. El proceso de extraccio n consistio en una primera solubilizacio n de proteí nas con agua (fraccio n q ue fue descartada), seguida de una segunda solubilizacio n del residuo de harina con tampo n fosfato salino PBS pH 7. El sobrenadante se centrifugo (1000 rpm, 5 min), repitiendo el mismo proceso de solubilizacio n del residuo de harina con tampo n fosfato salino PBS pH 7 dos veces durante 20 min. Los tres sobrenadantes se combinaron, filtra ndose a trave s de filtros de nailon de 0.45 μm. La fraccio n proteica filtrada se dializ o durante 24 horas a 4 °C utilizando agua milli-Q y membranas de celulosa regenerada Spectra/Por™ con MWCO de 3.5 kDa (Spectrum Chemicals, NJ, EE. UU.). Obtención de la fracción de globulinas “WPBS14” de harina GBSP mediante solubilización en dos etapas (agua y tampón fosfato salino pH 7), y filtración por diálisis (14 kDa) La muestra de harina GSBP (1:10 p/v) se extrajo aplicando un proceso de extraccio n en dos etapas igual al descrito en el apartado anterior. La fraccio n proteica filtrada se dializo durante 24 horas a 4 °C utilizando agua milli-Q y membranas de celulosa regenerada Spect ra/Por™ con MWCO de 14 kDa (Spectrum Chemicals, NJ, EE. UU.). Metodología MATERIAL Y ME TODOS 84 Obtención de la fracción de albuminas “W” de harina GBSP mediante solubilización con agua y filtración por diálisis (3.5 kDa) La muestra de harina GSBP (1:10 p/v) se extrajo con agua, en agitacio n constante duran te 20 min a temperatura ambiente (25 ± 0.2 °C). El sobren adante se centrifugo (1000 rpm, 5 min), repitiendo el mismo proceso de extraccio n sobre el residuo de harina dos veces durante 20 min. Los tres sobrenadantes se combinaron, filtra ndose a trave s de filtros de nailon de 0.45 μm. La fraccio n filtrada se dializo durante 24 horas a 4 °C utilizando agua milli-Q y membranas de celulosa regenerada S pectra/Por™ con MWCO de 3.5 kDa (Spectrum Chemicals, NJ, EE. UU.). 3.2.2. Determinación del contenido total de proteínas El contenido total de proteí nas de las muestras se determino por trip licado utilizando el kit de ensayo de proteí nas BCA PierceTM (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA). Los ensayos se realizaron siguiendo las instrucciones del fabricante, utilizando un lector de microplacas. Los resultados se expresaron como porcentaje de proteí na, a partir de una curva de calibracio n preparada con un patro n comercial puro de albu mina se rica bovina esta ndar (BSA ≥ 98 %). 3.2.3. Análisis electroforéticos en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-page) El ana lisis del perfil electrofore tico y la distribucio n de pesos moleculares de las fracciones de globulinas se realizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), aplicando tres protocolos distintos. Protocolo 1 de electroforesis SDS-page El ana lisis electrofore tico se llevo a cabo en condiciones reductoras y no reductoras, usando un equipo Mini-Protean® 3 (BioRad, Hercules, CA, EE. UU.). Para ello, se disolvieron alí cuotas de 20 μl de las distint as muestras en tampo n Tris-HCl Metodología MATERIAL Y ME TODOS 85 0.8 M pH 7.5 y se mezclaron con 5 μl de tampo n de carga Tris-HCl 0.02 M pH 6.8 (compuesto por glicerol al 40 % p /v, SDS al 4.6 % p/v, ditiotreitol, DTT 10 mM, y azul de bromofenol al 0.01%). Para el ana lisis en condiciones no reductoras, se omitio el agente reductor DTT del tampo n de carga. Previo al ana lisis por electroforesis, las muestras proteicas se desnaturalizaron mediante calentamiento a 100 °C durante 5 min. Las muestras desnaturalizadas se cargaron en un gel de poliacrilamida al 14% (acrilamida:bisacrilamida, 29:1) de espesor de 1.5 mm, y se procedio al ana lisis electrofore tico como se ha indicado anteriormente. Los ana lisis se llevaron cabo a voltaje constante (170 V) durante 50-6 0 min, tras lo cual, las proteí nas se visualizaron manteniendo los geles durante 30 min en una disolucio n de tincio n de Coomassie (40 % de etanol v/v, 10 % de a cido ace tico v/v, 50 % de agua destilada y 0.01% de azul de Coomassi e R-250 p/v). Posteriormente, los geles se decoloraron en una disolucio n de etanol al 40 % v/v y a cido ace tico al 10% v/v, en agitacio n constante, hasta la visualizacio n de las bandas proteicas. El peso molecular de las bandas de las muestras se estimo por comparacio n con un esta ndar de proteí nas PageRuler™ (Thermo Fisher Scientific Inc., Vilnius, Lituania), de peso molecular entre 20 y 200 kDa. Protocolo 2 de electroforesis SDS-page El an a lisis electrofore tico se llevo a cabo en condiciones reductoras, usando un equipo Mini-Protean® 3 (BioRad, Hercules, CA, EE. UU.). Para ello, se disolvieron 10 mg del extracto proteico liofilizado en 1 ml de agua destilada. A continuacio n, se mezclaron 150 µl del extracto p roteico acuoso con 50 µl de tampo n de carga Tris- HCl 0.02 M, pH 6.8 (compuesto por glicerol al 40 % p/v, SDS al 5 % p/v, β-mercaptoetanol al 20 % y bromofen ol azul al 0 .01 %). Previo al ana lisis por electroforesis, las muestras proteicas se desnaturalizaron mediante calentamiento a 100 °C durante 5 min. Las muestras desnaturalizadas se cargaron en un gel de poliacrilamida al 14 % (acrilamida:bisacrilamida, 29:1) de espesor de 1.5 mm. Posteriormente, se procedio al ana lisis electrofore tico, tincio n y lavado de geles, siguiendo las mismas condiciones indicadas anteriormente; y usando el mismo esta ndar de proteí nas PageRuler™ (Thermo F isher Scientific Inc., Vilnius, Lituania), de peso molecular entre 20 y 200 kDa. Metodología MATERIAL Y ME TODOS 86 Protocolo 3 de electroforesis SDS-page El ana lisi s electrofore tico se llevo a cabo en condiciones reductoras y no reductoras en un equipo Mini-PROTEAN® Tetra Vertical Electrophoresis Cell (BioRad, Hercules, CA, USA). Las muestras proteicas (1.5 mg/ml) se disolvieron en tampo n de carga 5xSDS (NZYtech, Lisboa, Portugal) y posteriormente se desnaturalizaron mediante calentamiento a 90°C durante 5 min. Para el ana lisis en condiciones no reductoras, se omitio el agente reductor DTT del tampo n de carga. Las muestras desnaturalizadas se cargaron en un gel de p oliacrilamida al 16 % de espesor de 1.5 mm, y se procedio al ana lisis a un voltaje constante de 120 V. El tampo n usado en la electroforesis fue: 250 mM Tris-HCl a pH 8.3, glicina 1.92 M y SDS al 1 %. Una vez finalizado el ana lisis, los geles se tin eron con tincio n BlueSafe (reactivo basado en coloran te de azul de Coomassie) durante 2 horas. Posteriormente, los geles se decoloraron en una disolucio n de metanol/agua (50:50 v/v) durante 12 horas en agitacio n constante, hasta la visualizacio n de las bandas proteicas. El peso molecular de las bandas proteicas se estimo por comparacio n con un esta ndar de proteí nas Precision Plus ProteinTM Unstained S tandards (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), de peso molecular entre 11 y 180 kDa. 3.2.4. Cuantificación de bandas proteicas mediante densitometría de imagen La cuantificacio n de las bandas proteicas separadas por electroforesis se realizo aplicando un me todo basado en densitometrí a de imagen, mediante el software GelAnalyzer 2010a (www.GelAnalyzer.com). Para ello, se escanearon los geles sometidos a electroforesis, y las ima genes se digitalizaron y almacenaron para su ana lisis cuantitativo. El software GelAnalyzer 2010a permitio almacenar y analizar los patrones electrofore ticos, incluyendo la deteccio n automa tica de carriles, me todos de sustraccio n de fondo y calibracio n. Para la cuantificacio n de las bandas, se preparo una recta de calibrado de albu mina de suero bovino (BSA) a 12.5, 25.0, 50.0, 100.0 y 200.0 µg/ml, a p artir de una disolucio n patro n de BSA puro comercial (1.0 mg/ml). Los resultados del contenido de las bandas analizadas se expresaron en µg de proteí na, y se calcularon Metodología MATERIAL Y ME TODOS 87 las proporciones (%) de cada subunidad de globulina en relacio n con el contenido total proteico determinado. 3.2.5. Digestión enzimática “en gel” y “en disolución” de bandas proteicas La digestio n enzima tica de bandas proteicas “en gel” se llevo a cabo previamente al ana lisi s por espectrometrí a de masas MALDI-TOF/TOF. Para ello, las bandas de proteí na se escindieron de los geles y se some tieron a un proceso de lavado con 200 μl de agua milli-Q durante 15 min. Posteriormente, a cada muestra se le agregaron 50 μl de una disolucio n decolorante de acetonitrilo (ACN) al 50 %, duran te 10 min. El proceso de lavado se repitio hasta la completa decoloracio n de las bandas y finalmente los fragmentos de gel se secaron al vací o durante 15 min. Los fragmentos de gel se incubaron con 30 µl de DTT 10 mM en NH4HCO3 50 mM duran te 30 min a 56 ° C, tras lo cual se elimino la disolucio n an adida, y a continuacio n se an adieron 50 µl de ACN, descarta ndose tras 5 min. Posteriormente, se agregaron 30 µl de yodoacetamida 55 mM en NH4HCO3 durante 20 min en oscuridad a temperatura ambiente (25 ± 0.2 °C). Tras eliminar la disolucio n an adida, se an adio 50 μl de ACN durante 5 min, y posteriormente el fragmento de gel se seco al vací o duran te 15 min. La digestio n de los fragmentos de gel se realizo utilizando una disolucio n de tripsina. Para ello, se an adieron 15 µl de la disolucio n de tripsina (0.1 µg/ml en HCl 1 mM) y 100 µl de NH4HCO3 50 mM a los fragmentos de gel rehidratados. Las muestras se incubaron a 37 C durante 12 horas en oscuridad. Por u ltimo, los pe ptidos se recuperaron de los fragmentos de gel an adiendo 50 µL de una disolucio n de trifluoroace tico (TFA) al 0.5 % durante 15 min a temperatura ambiente (25 ± 0.2 °C), y se almacenaron hasta su ana lisis por espectrometrí a de masas. Para la digestio n enzima tica de bandas proteicas “en disolucio n”, una alí cuota de cada muestra proteica se disolvio en 50 mM NH4HCO3 a pH 8.0 hasta una concentracio n fina l de 2.0 mg/ml. 10 μl de cada muestra se transfirieron a tub os de microcentrí fuga y se an adieron 15 μl de 50 mM NH4HCO3 y 7 μl de agua milli-Q. Las muestras se incubaron a 95 °C durante 5 min y luego se enfriaron a temperatura ambiente (25.0±0.2 °C). Para la alquilacio n de proteí nas, se agregaron 3 μl de Metodología MATERIAL Y ME TODOS 88 iodoacetamida 100 mM a cada muestra, se incubaron en oscuridad durante 20 min, an adie ndose 1 μl de disolucio n de tripsina (1 mg/ml), mantenie ndose en agitacio n duran te la noche a una 30 °C. Las muestras de pe ptidos digeridas se concentraron finalmente en columnas C18 GL-Tips SDB (GL Sciences S.V., Eindhoven, Paí ses Bajos) y se almacenaron hasta su ana lisis por espectrometrí a de masas. 3.2.6. Análisis por espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF La separacio n e ident ificacio n de pe ptidos de las fracciones de globulinas se realizo por espectrometrí a de masas M ALDI-TOF/TOF, aplicando dos protocolos distintos. Protocolo 1 MALDI-TOF/TOF Se realizo siguiendo el me todo de Wang y Wan g (2015), utilizando un sistema AB Sciex TOF/TOF™ 5800 (AB Sciex, EE. UU.), equipado con un analizador de tiempo de vuelo e ionizacio n por desorcio n la ser asistida. Para ello, a 0.8 μl de cada muestra digerida se les agrego 0.8 μ l de a cido α-ciano- 4-hidroxicina mico solubilizado en 50% ACN y 0.1% TFA, como matriz. El ana lisis se llevo a cabo en modo lineal de iones positivos. Los iones fueron generados mediante un la ser pulsado UV (Nd:YAG 349 nm). Las condiciones de ana lisis MALDI-TOF/TOF fueron un voltaje de la fuente de iones de 15 kV y un tiempo de retardo de 140 ns. Los espectros de masas se obtuvieron en el intervalo de m/z 800-4000. La calibracio n de masa externa se realizo utilizando un patro n de calibracio n de proteí nas (SCIEX, EE. UU). La identificacio n de los pe ptidos en las muestras se realizo por comparacio n con los espectros teo ricos de las secuencias peptí dicas de Vitis vinifera registradas en la base de datos del Centro Nacional de Informacio n Biotecnolo gica (NCBI) con el motor de bu squeda Mascot (v.2.5.1, Matrix Science Inc., Boston, MA). Los para metros de bu squeda utilizados fueron: tipo de bu squeda: bu squeda de iones; enzima: tripsina; modificaciones fijas: carbamidometilo (C); modificaciones variables: oxidacio n (M); valores de masa: monoisoto pico; masa proteica: sin restricciones; tolerancia de masa peptí dica: ± 50 pp m; estado de carga del pe ptido: 1+; nu mero ma ximo de escisiones perdidas: 1. U nicamente se consideraron resultados significativos, segu n el ana lisis de probabilidad de Mascot (p< 0.05). Metodología MATERIAL Y ME TODOS 89 Protocolo 2 MALDI-TOF/TOF Se realizo utilizando un sistema cromatogra fico RSLCnano UltiMate 3000 acoplado a un espectro metro de masas LTQ-Orbitrap XL a trave s de una fuente de ionizacio n EASY-nano spray (Thermo Fisher Scientific MA, EE. UU.). Para la separacio n de los pe ptidos en las muestras se uso una columna PepMapTM C18 (3 μm x15 cmx150 μm, Thermo Fisher Scientific, MA, EE. UU.). Como solvente A se utilizo agua:a cido fo rmico (99:1, v/v) y como solvente B acetonitrilo:a cido fo rmico (99:1, v/v), con un flujo de 0.30 μ l/min. El gradiente lineal aplicado fue: 0-3 min 2 % B, 10 min 10 % B, 60 m in 35 % B, 65-75 min 95 % B, 77-90 min 2 % B. La interfaz ESI se opero utilizando los siguientes para metros: modo positivo, voltaje de capilar: 9 V, temperatura de capilar: 275.0 C, lente de tubo: 100 V, voltaje de pulverizacio n: 1.9 kV. Las condiciones de ana lisis fueron: exploracio n: mejorado esta ndar, redisolucio n: 120.000, intervalo de m/z: 300-2000, configuracio n de MS/MS : auto-MSn, gas de colisio n: helio, energí a de colisio n normalizada: 35. 0, tiempo de activacio n: 30.0, ancho de aislamiento (m/z): 4. Todos los espectros de MS y MS/MS se adquirieron en un modo dependiente del tiempo. Los para metros de exclusio n dina mica fueron: recuento de repeticiones: 1, duracio n de repeticio n: 30.0 s, taman o de lista de exclusio n: 500, duracio n de exclusio n: 45.0, ancho de masa de exclusio n: 1.5 (alto y bajo). Se rechazaron los estados de carga 1, mayores que 8 y los no asignados. El ana lisis de datos se llevo a cabo con el software Xcalibur™ (Thermo Fisher Scientific, Santa Clara, CA, EE. UU.). Los archivos generados por MS se cargaron en el software Proteome Discoverer 2.5 (Thermo Fisher S cientific, San Jose , CA, EE. UU.) y se analizaron usando el motor de bu squeda SequestHT con el algoritmo Perc olator. El para metro Delta Cn ma ximo para los Peptide Spectrum Matches (PSMs) se establecio en 0.05 y su puntuacio n mí nima en 1.0. La identificacio n de los p e ptidos en las muestras se realizo por comparacio n con los espect ros teo ricos de las secuencias peptí dicas de Vitis vinífera registradas en la base de datos UniProt (9 de junio de 2022; 176 640 entradas). Se selecciono tripsina como enzima y se permitieron hasta dos cortes fallidos. Los para metros de bu squeda utilizados fueron: tolerancia de masa para los iones precursor: 10 ppm; tolerancia de masa para los iones p roducto: 0.02 Da; modificacio n fija: cisteí na Metodología MATERIAL Y ME TODOS 96 Estudios de estabilidad de las estructuras 3D modelizadas y acoplamientos proteína-ligando mediante simulación de Dinámica Molecular Se realizaron distintos estudios de simulacio n de dina mica molecular para evaluar tanto la estabilidad de las globulinas de semilla de uva modelizadas, así como de diferentes complejos proteina-mv3glc y proteí na-proteí na. Todos los estudios de dina mica molecular se llevaron a cabo utilizando el software Gromacs 5.0.7. La energí a potencial del sistema se minimizo usando 1000 pasos de iteracio n. Posteriormente, se realizaron las dos etapas de equilibrio (100 ps cada una) p ara lograr las condiciones o ptimas de presio n y temperatura. Los valores de presio n y temperatura de referencia fueron 1 bar y 300 K, respectivamente. Una vez completadas las fases de equilibrio, el sistema ajusto la temperatura y la presio n deseadas. Luego, se ejecuto una simulacio n de dina mica molecular configurando un tiempo de simulacio n que varí a segu n el estudio El tiempo de simulacio n aplicado para las globulinas F6HZK 2 y F 6HZK3 fue de 1 ns, para los complejos p roteí na-mv3glc de 10 ns, y para el complejo proteí naproteí na de 10 ns. En todos los casos se aplico un algoritmo de paso de tiempo lics de 2 fs. La trayectoria resultante se analizo utilizando las herramient as proporcionadas por Gromacs, mediante el para metro de la desviacio n de la distancia cuadra tica media (RMSD). Para la Interaccio n entre los dos monomeros de globulina -11S, se utilizo el para metro RMSF (Root Mean Square Fluctuation), que es una medida de la flexibilidad local de una estructura en funcio n del tiempo. Estudios de acoplamiento molecular (docking) entre globulinas de semilla de uva-mv3glc Se llevaron a cabo distintos estudios de acoplamiento molecular (docking) proteina-mv3glc, con el objetivo de predecir en cada caso los sitios de unio n y el tipo de interaccio n entre el receptor y ligandos de los sistemas. Metodología MATERIAL Y ME TODOS 97 Los estudios de docking proteí nas-mv3glc se llevaron a cabo con el software AutoDock Vina (Trott & Olson, 2010), considerando la mv3glc como ligando y las globulinas de semilla de uva 7S y 11S (F6HZK y F6HZK23) como receptores. La estructura 2D de la mv3glc se obtuvo de la b ase de datos PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) y la estructura 3D se optimizo al mí nimo de energí a con el software Avogadro utilizando el campo de fuerza MM FF9 . A continuacio n, los hidro genos de la estructura se ajustaron a un pH de 3.5. En todos los casos, se utilizo una cuadrí cula (grid box) para cubrir toda la proteí na. En el docking realizado entre la globulina 7S y la mv3glc, se utilizo una cuadrí cula de 56×78×54 puntos, y se centro en las coordenadas X: -9.28, Y: 45.56, y Z: 4.04. En el caso del docking realizado entre la globulina 11S F6HZK2 y la mv3glc, se utilizo una cuadrí cula de 84×62×83 puntos, y se centro en las coordenadas X: 39.03, Y: 9.61, y Z: 84.47. De forma similar, en el caso del docking realizado entre la globulina 11S F 6HZK3 y la mv3glc, se utilizo una cuadrí cula de 81×79×73 puntos, y se centro en las coordenadas X: 65.28, Y: 8.21, y Z: 24.84. Entre las condiciones del docking se incluyeron como fijas las posiciones de los a tomos de la proteí na, y mo vil el a ngulo de torsio n del enlace glicosí dico del antociano. Finalmente, se calculo el acoplamiento para obtener diez posibles complejos con diferentes conformaciones y energí a, y los resultados se evaluaron con el software Autodock 4. Para visualizar las estructuras y analizar los resultados se uso el software UCSF Chimera, y las ima genes 2D de los sitios de in teraccio n entre las globulinas y la mv3glc se realizaron con el software Discovery Studio. Se llevo a cabo adema s un estudio de “acoplamiento dirigido” entre la globulina 11S de semilla de uva F6HZK3 y la mv3glc, aplicando la misma metodologí a de docking anteriormente explicada, y llevado a cabo especí ficamente en la regio n hidrofo bica mayoritaria de la proteí na modelizada. En este caso, se utilizo una cuadrí cula de 41×38×41 puntos, y se centro en las coordenadas X: -40.6, Y: -7.16, y Z: -29.04. Estudios de acoplamiento molecular (docking) proteína-proteína El estudio de docking proteí na-proteí n a, se realizo con el software FTDock del servidor pyDockWEB (https://life.bsc.es/pid/pydockweb). Metodología MATERIAL Y ME TODOS 98 El protocolo aplicado consistio en tres etapas. En primer lugar, los archivos pdb que contienen la informacio n estructural de las proteí nas se modificaron para eliminar heteroa tomos, hidro genos y cofactores. En el segundo paso, estos archivos simplificados se transformaron en archivos de entrada FTDock. Se seleccionaron las orientaciones ma s favorables en te rminos de energí a electrosta tica. A continuacio n, se modifican las coordenadas de los archivos generados de cada geometrí a individual predicha en un formato compatible para realizar una clasificacio n de las diferentes poses de acoplamiento proteí na-proteí na en funcio n del val or de energí a total. Estudios de Colorimetría in silico: obtención de espectros visibles de mv3glc y predicción de los cambios de color mediante cálculos mecánico-cuánticos La estimaci o n teo rica de los espectros visibles y el color de la mv3 gcl se realizo mediante el uso de ca lculos meca nico-cua nti cos aplicados a las estructuras 3D modelizadas, tanto del pigmento individual o del mismo en complejos de acoplamiento con pe ptidos de globulinas de semilla de uva. Los factores de estudio considerados en la prediccio n teo rica de los cambios espectrales y colorime tricos del pigmento fueron las variaciones estructurales (modificaciones en el a ngulo diedro del anillo B ) y el efecto de interacciones moleculares con otros compuestos (pe ptidos de globulinas de semilla). Todas las estructuras quí micas implicadas en este estudio se obtuvieron con el software GaussView 5.0. Los estados fundamentales correspondientes se optimizaron mediante ca lculos de la Teorí a del Funcional de la Densidad (DFT) con la funcio n hí brida B3LYP y con el conjunto de base triple-ζ tipo Pople, 6-31+G(d,p), considerando un Modelo de Continuo Polarizable (PCM) donde el disolvente utilizado fue agua. Para obtener la estructura de mv3glc, se realizo un ana lisis de frecuencia. A partir de esta estructura, se construyeron diferen tes confo rmeros del pigmento modificando el a ngulo diedro entre 0 y 180, tanto para valores positivos como negativos. A continuacio n, se aplico la Teorí a de la Densidad Funcional Dependiente del Tiempo (TD-DFT). Los espectros visibles de la mv3glc predichos teo ricamente (350-800 nm) se representaron mediante funciones gaussianas, donde las absorbancias molares y las Metodología MATERIAL Y ME TODOS 99 fuerzas osciladoras calculadas se expresaron como intensidades en funcio n de la longitud de onda. Para este propo sito, se considero una concentracio n de mv3glc de 5·10-5 M y un ancho de la celda de 1 cm. Un a vez obtenidos los espectros visibles en unidades de absorbancia frente la longitud de onda, se ajustaron estos valores al intervalo de longitud de onda de 380 a 770 nm, considerando Δλ = 2 nm. El pe ptido de globulina fue modelizado utilizando el software UCSF Chimera y posteriormente minimizado energe ticamente mediante ca lculos cua nticos basados en la teorí a DFT con el funcional hí brido B3LYP y con el conjunto de bases triple-ζ tipo Pople, 6-31+G(d,p). Se utilizo la herramienta AutoDock (versio n 4.2.6) para asignar las cargas de todos los a tomos de Kollman y se seleccionaron las dimensiones de la caja de acoplamiento. Finalmente, se obtuvieron diez complejos para cada tipo de interaccio n con diferen tes energí as de acoplamiento. Se utilizo el software Discovery Studio para visualizar las interacciones de los complejos. Para la obtencio n de espectros visibles teo ricos, se aplico la teorí a TD-DFT con el mismo el mismo nivel de ca lculo y procedimiento que en el estudio de las diferentes conformaciones de la mv3glc. A partir de los espectros teo ricos de mv3glc predichos en cada sistema, se aplicaron los fundamentos de la Colorimetrí a Triestí mulo utilizando el software original CromaLab© (Heredia, A lvarez, Gonza lez-Miret, Ramí rez, 2004) para el ca lculo de los para metros de color CIELAB (L*, a*, b*, C*ab, y hab), siguiendo las recomendaciones de la Comisio n Internacional de la Il uminacio n: el Observador Esta ndar CIE 1964 10° y el Iluminante Esta ndar D65 (CIE, 2018). La prediccio n de las variaciones de color de la mv3glc debidas a sus diferentes conformaciones, o a la interaccio n con el pe ptido de globulina, se interpret aron mediante Colorimetrí a Triestí mulo Diferencial, siguiendo la metodologí a de Gordillo, et al. (2012), descrita en el apartado 3.2.8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Modelización molecular de globulina 7S RESULTADOS Y DISCUSIÓN 103 Capítulo 1. ESTUDIO COMPUTACIONAL DE LA ESTRUCTURA 3D DE LA GLOBULINA 7S DE SEMILLA DE UVA Y SU INTERACCIÓN CON MALVIDINA 3-GLUCÓSIDO Chamizo-González, Francisco; Gordillo, Belén; Heredia, Francisco J. (2021). Elucidation of the 3D structure of grape seed 7S globulin and its interaction with malvidin 3-glucoside: a molecular modeling approach. Food Chemistry 347, 129014. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2021.129014 Antecedentes Las proteínas vegetales son biopolímeros con numerosas aplicaciones tecnológicas en la industria alimentaria debido a su capacidad de modular atributos sensoriales como la textura, viscosidad, elasticidad, aroma, sabor o el color, contribuyendo a mejorar la calidad de los alimentos (Tomadoni et al., 2020). La funcionalidad tecnológica de estos biopolímeros depende en gran medida de sus características estructurales, su capacidad para formar conformaciones tridimensionales (3D) específicas, y de la interacción con otras moléculas presentes en matrices alimentarias como por ejemplo los compuestos fenólicos (Ozdal et al., 2013). Recientemente, la semilla de uva (uno de los principales subproductos de la vinificación) ha sido propuesta como una fuente natural alternativa de proteínas de interés industrial. A pesar de su gran potencial tecnológico, aún se desconoce la estructura tridimensional de estas proteínas y su mecanismo de interacción con compuestos fenólicos, lo que es crucial para potenciar su utilización en aplicaciones industriales. En concreto, el estudio del mecanismo molecular implicado en la interacción entre las proteínas de semilla de uva y los pigmentos antociánicos de la uva y el vino es de interés para la industria alimentaria en general y para el sector enológico en particular, ya que representa una posible vía de estabilización de estos pigmentos y su color, como se ha comprobado para otras proteínas usadas con este fin (Fu et al., 2020). Se ha descrito que una de las principales proteínas de almacenamiento de la semilla de uva (Vitis vinífera L.) son las globulinas tipo 7S (Gianazza et al., 1989; Gazzola et al., 2014). Sin embargo, las estructuras tridimensionales de las proteínas del endospermo de semilla de uva aún se desconocen, por lo que el estudio de su conformación y el diseño de modelos 3D teóricos mediante técnicas computacionales, basadas en modelado por homología, supone un avance importante para potenciar el uso y la funcionalidad tecnológica de estas proteínas (Salmaso et al., 2018). Además, una vez conocida la estructura 3D, se pueden realizar ensayos computacionales de acoplamiento basados en docking molecular, los cuales permiten predecir el modelo de unión predominante entre ligandos y proteínas (Morris et al., 2008). La aplicación de otras técnicas, como las basadas en simulaciones de dinámica molecular, permite analizar computacionalmente la estabilidad de los complejos proteína-ligando a lo largo del tiempo. El objetivo general de este capítulo ha sido establecer, mediante técnicas computacionales (modelado por homología, docking, dinámica molecular), la estructura teórica 3D de la globulina 7S de semilla de uva (Vitis vinífera L.), y estudiar el mecanismo de interacción molecular entre ésta y el antociano mayoritario de uvas y vinos tintos (malvidina-3-glucósido), para aportar nuevos conocimientos que permitan avanzar en futuras aplicaciones de estas proteínas. Parte experimental En este estudio se ha estudiado por primera vez la estructura 3D de la globulina 7S de semilla de uva mediante una herramienta computacional de modelado por homología, a partir de la búsqueda de proteínas cristalizadas homólogas disponibles en bases de datos. Para obtener la secuencia primaria de la globulina 7S de semilla de uva se usaron los servidores PSI-BLAST (Altschul et al., 1990), HHpred (Söding et al., 2005) y Phyre (Kelley et al., 2009). Estos servidores permiten la búsqueda e identificación de posibles estructuras homólogas para ser usadas como plantilla en el modelado de otras proteínas, así como seleccionar el mejor modelo en base a diversos parámetros analíticos computacionales como el porcentaje de identidad y de cobertura, y el valor de E, los cuales son una medida de la similitud entre la secuencia de aminoácidos problema y la que se encuentra en la base de datos. Las posibles estructuras suficientemente homólogas fueron: un glucósido hidrolasa denominado 3VLA de zanahoria (Daucus carota), una globulina 7S de soja (Glycine max) y de altramuz (Lupinus), así como una catepsina D-hidrolasa de la especie Rattus norvegicus. Considerando los mayores porcentajes de identidad y cobertura obtenidos por los tres servidores, se seleccionó la estructura cristalina de la proteína de Daucus carota como la plantilla con mayor homología a la globulina 7S de semilla de uva. La información proporcionada por los tres servidores indicó que la proteína de Daucus carota es rica en alfa hélices y láminas beta, regiones estructurales bien organizadas, lo que aumenta su fiabilidad como plantilla homóloga para la modelización de la 7S globulina de semilla de uva. Una de las características de la secuencia de la globulina 7S de semilla de uva es que los primeros veintitrés aminoácidos no fueron incluidos en el modelo, lo que Modelización molecular de globulina 7S RESULTADOS Y DISCUSIÓN 105 podría indicar que actúan como péptido señal (PS). Para confirmar esta hipótesis se analizó la secuencia de aminoácidos de la globulina 7S de semilla de uva con el servidor Signal P-5.0, que permite identificar el PS en diversas clases de proteínas vegetales (Armenteros et al., 2019). Los resultados confirmaron que efectivamente la cadena corta de veintitrés aminoácidos podría considerarse un PS de la globulina 7S de semilla de uva. En la actualidad, uno de los métodos más usados y rápidos para la generación de modelos estructurales es el servidor bioinformático SWISS-MODEL, creado para el modelado por homología de estructuras 3D, que comparten hasta el 30 % de identidad en su secuencia de aminoácidos con otras proteínas de estructura conocida. La calidad de los modelos resultantes se evalúa con los parámetros bioquímicos: Global Model Quality Estimate (GMQE) y Qualitative Model Energy Analysis (QMEAN) y el gráfico Ramachandran. El modelo puede mejorarse al incluir el servidor SWISS-MODEL en una línea de trabajo, seguido del programa GROMACS, el cual minimiza la energía del modelo hasta alcanzar una estructura energéticamente estable, más cercana a como se encuentra en disolución o en el sistema biológico (Waterhouse et al., 2018). La evaluación del modelo generado se realizó en base a los parámetros computacionales GMQE y QMEAN. Los resultados indican que la puntuación GMQE para la globulina 7S de semilla de uva fue de 0.81 y la QMEAN –1.67, lo que indica una buena similitud estructural entre las dos proteínas. De forma complementaria, los parámetros obtenidos por el servidor PROCHECK proporcionan una evaluación detallada sobre la estereoquímica de la conformación de la cadena principal. A partir del diagrama de Ramachandran se visualizaron las combinaciones de ángulos ѱ y φ de los residuos en la proteína, los cuales definen su estructura tridimensional. Los residuos se clasifican en diferentes regiones: “favorecidas”, “permitidas”, “ligeramente permitidas” y “no permitidas”. Las regiones favorecidas y permitidas en este diagrama representan las combinaciones estables y energéticamente favorables de estos ángulos, siendo las regiones favorecidas las más comunes y estables. En este aspecto, se observó que el 90.1 % de los residuos estaban en regiones favorecidas, 7.7 % en regiones permitidas, 0.9 % en regiones generosas y 0.6 % en regiones no permitidas. Además, el servidor VERIFY 3D proporcionó un valor del 88.5 % de compatibilidad del modelo atómico 3D con su propia secuencia de aminoácidos, lo que indica una buena compatibilidad de un modelo atómico (3D) con su propia secuencia de aminoácidos (1D). El servidor ERRAT evalúa la estructura de la proteína detectando errores Food Chemistry 347 (2021) 129014 2 of grape seed endosperm (Vitis vinifera) is the 7S globulin. In this sense, the assessment of the molecular mechanism involved in the interaction between the grape seed 7S globulin and the color form of grape anthocyanins (flavylium cation) could be of interest to the food industry in general and to the winemaking sector in particular; as has been reported for other animal proteins (Fu, Belwal, He, Xu, Li, & Luo, 2020). For this purpose, firstly, the 3D structure of the grape seed 7S globulin and other surface properties should be well understood. In general, the three-dimensional molecular structure of a protein can be experimentally resolved by X-ray or NMR crystallography or a theoretically obtained by computational techniques such as homology modeling (Salmaso & Moro, 2018). In this way, computational chemistry are innovative tools for the development of theoretical models that allow the characterization of the three-dimensional structures of the protein and the prediction of molecular interactions with other compounds of interest and therefore deepen technological functionality. Molecular docking is one of the molecular coupling tools that aim to predict the predominant binding model of a ligand with a protein of known three-dimensional structure (Morris & Lim-Wilby, 2008). Molecular docking methods considers several possible conformations and orientations of the ligand within the protein binding. By using scoring functions, it searches for high-dimensional spaces and correctly ranks candidate dockings binding models. For this reason, the elucidation of the three-dimensional molecular structure of a target protein is a necessary condition to achieve a successful docking method, as the docking itself (Khatoon, Pandey, & Prajapati, 2017). Molecular coupling is mainly composed of two stages: conformation/ orientation search and a scoring function, which associates a score with each predicted pose (Huang & Zou, 2010). The sampling process must effectively search for the conformational space described by the free energy landscape, where the energy, in the coupling, is approximated by the scoring function. The scoring function should be able to associate the native bound conformation with the global minimum of the energy hypersurface. Molecular dynamics (MD) is a type of molecular computational simulation that allows the behavior or evolution of a system (physical, chemical or biological) to be analyzed over time. It is a method to generate the trajectories of a system composed of N particles by direct numerical integration of the equations of Newtons of motion, with specifications of an interatomic interaction potential of adequate initial and boundary conditions. MD is a modeling and simulation method at the atomistic level when the particles in question are the atoms that make up the material or system of study. The aim of this study is to establish, through a computational study, the theoretical structure of the grape seed 7S globulin from Vitis vinifera and to obtain a first approach that can demonstrate its interaction with the major anthocyanin of red grapes and wines in order to provide new insights to potential applications of grape seed proteins. 2. Materials and methods 2.1. Protein template search and selection of grape seed 7S globulin The amino acid sequence of the 7S globulin basic from grape seed (Vitis vinifera) was obtained from the UNIPROTKB database (Entry: A0A438KKJ2). Grape seed 7S globulin was subjected to a sequence similarity search using the servers PSI-BLAST (Altschul, Gish, Miller, Myers, & Lipman, 1990), HHpred (S¨ oding, Biegert, & Lupas, 2005) and Phyre (Kelley & Sternberg, 2009). This procedure allows finding the most similar protein sequence to use as a template for the homology modeling. Results of the three servers were compared and the best template was selected based on the following quality parameters: percentage of sequence, percentage of sequence identity, percentage of coverage and the E value. 2.2. Homology modeling of the grape seed 7S globulin Homology modeling was used to construct the three-dimensional (3D) structure of the grape seed 7S globulin. An extracellular dermal glycoprotein from carrot (EDGP, glycoside hydrolase) was selected as template among the structures available at the Protein Database (PDB ID: 3VLA; resolution 0.95 Å) for the model building, according to Yoshizawa, Shimizu, Hirano, Sato, & Hashimoto (2012). The 7S globulin protein sequence was aligned with the 3VLA protein sequence using the software Clustal W (Thompson, Higgins, & Gibson 1994). Then, the protein sequence alignment was used as input file to create the 3D protein model of the grape seed 7S globulin by using the SWISS-MODEL tool provided by the EXPASY server (Waterhouse et al., 2018). The validation parameters used for assessing the accuracy of the predicted model and its stereo chemical properties were the Global Model Quality Estimate (GMQE) (Waterhouse et al., 2018) and the Qualitative Model Energy Analysis (QMEAN) (Benkert, Biasini, & Schwede, 2010). The resulting GMQE score (expressed as values between 0 and 1) indicates the expected precision of the built model with the alignment and template, and the target coverage. GMQE scores close to 1 indicates greater reliability of the built model. QMEAN is a composite scoring function assessing the major geometrical aspects of protein structures. Together with the QMEAN, the QMEAN-Z score provides an estimation of the conservation degree of the structural characteristics obtained in the model on a global scale (Benkert et al., 2010). It indicates if the QMEAN score obtained in the model would be comparable to the expected values of similarly sized experimental structures. QMEAN Z scores close to 0 indicate good agreement between the predicted model structure and similarly sized experimental structures while scores lower or around to −4.0 indicate low-quality models. In addition, Procheck, Verify3D, and Errat servers were used to assess the quality of the 3D obtained structure. 2.3. Model refinement and validation structure of the grape seed 7S globulin The energy minimization of the obtained model was performed using the Gromacs 5.0.7 software (Hess, Kutzner, Van der Spoel, & Lindahl 2008) with the force field OPLS-AA. Grape seed 7S globulin was solvated in 1.0 nm cubic boxes by using single point charge water molecules, which were then replaced with counterions for electroneutrality. The minimization of energy was carried out in 50.000 interaction steps (Lemkul, 2018). The minimized energy structure was evaluated using the Procheck, Verify-3D and Errat servers. 2.4. Protein-Ligand interactions by docking and molecular dynamic (MD) simulation Docking studies were performed to predict the putative binding of malvidin-3-O-glucoside (Mv3glc, the major grape anthocyanin) as ligand to the grape seed 7S globulin constructed model. AutoDock Vina software (Trott & Olson, 2010) was used for the analysis. The initial Mv3glc structure was obtained from the PubChem data base and the 2D and 3D structure was constructed with the Avogadro software (Bolton,Wang, Thiessen, & Bryant, 2008). The 2D structure of Mv3glc was obtained from the PubChem database (Kim, Thiessen, Cheng, Yu, & Bolton, 2018) and was optimized to a minimum of energy using the MMFF9 force field. The structure’s hydrogens were then adjusted for a pH of 3.5. This was done with Avogadro software (Hanwell et al., 2012). Autodock Tools (Morris et al., 2009) was used to generate PDBQT files of receptor and ligands from their traditional PDB files to be used for docking in the AutoDock Vina. PDBQT file is an extended PDB format of coordinate file that includes atomic partial charges. Hydrogen atoms were added to the F. Chamizo-Gonz´ alez et al. Food Chemistry 347 (2021) 129014 3 macromolecule and partial atomic charges were calculated. A grid box with size of 56 ×78 ×54 points was used in the configuration file of the Autodock Vina software to cover the entire protein. The grid box was centered at the coordinate of X: −9.285, Y: 45.567, Z: 4.049. The positions of the protein atoms were kept fixed and the torsion angle of the glycosidic bond of the ligand was rotated until the rigid docking in software AutoDock Vina allowed the favorable docking. Other docking parameters were set to default. The docking results from AutoDock Vina were validate using Autodock 4 docking software (Morris et al., 2009). The binding free energy value (ΔG) obtained from the docking simulation was used to calculate the equilibrium dissociation constant (K i ) of the complex protein–ligand using the following Equation: K i =e ΔG/RT (1) where, ΔG is the binding energy (cal/mol), R is the gas constant (1.986 cal/mol*K), T is the temperature (298 K), and e is the Euler number. To evaluate the stability of the interaction between the Mv3glc and the Vitis vinifera 7S globulin, molecular dynamic (MD) simulations were carried out using the Gromacs software. Mv3glc topology file was obtained from the CGenFF server (Vanommeslaeghe et al., 2010) The protein–ligand complex was solvated into a box of explicit single point charge (SPC) water molecules and simulated using periodic boundary conditions (PBC) and particle mesh Ewald sum (PME) to improve electrostatic interactions. System power was minimized using 1000 steps. Two equilibrium stages of 100 ps each one were performed to reach the optimal conditions of the pressure and temperature. The reference pressure and temperature were 1 bar and 300 K (GROMACS 5.0.7 package). After the two balancing phases completed, the desired temperature and pressure was adjusted by the system. Then, a MD simulation was run 10 ns with a 2-fs lics time step algorithm. The resulting trajectory was analyzed using GROMACS earnings. The Root means square deviation parameter (RMSD) was used to calculate how much the position of the ligand varies relative to the protein during the simulation time. 2.5. Analysis of the grape seed 7S globulin structure and interaction studies Different softwares were used to visualize and analyze the results obtained in the protein modeling and in the docking and molecular dynamics studies. UCSF Chimera software was used to illustrate the 3D models (Pettersen et al., 2004). Two-dimensional (2D) illustrations of Mv3glc sites interacting with the 7S globulin amino acids were made using the Discovery Studio. 3. Results and discussion 3.1. Model building of grape seed 7S globulin protein The homology modeling method was applied to construct a 7S globulin protein atomic resolution model from the primary amino acid sequence and the crystal structure of a defined homologous protein. The primary grape seed 7S globulin protein sequence was sent to the PSIBLAST (Altschul et al., 1990), HHpred (S¨ oding et al., 2005) and Phyre (Kelley & Sternberg, 2009) servers to identify the possible homologous structure to use as a template for the homology modeling. Table 1 shows the results of the percentages of identity and coverage, as well as the E values for the different possible homologous protein structures to grape seed 7S globulin protein. Possible homologous protein structures given by the serves included a Daucus carota glucoside hydrolase (3VLA and 3VLB types), conglutin gamma from lupine seeds (7S globulin type), 7S globulin from soybean and from lupine seeds, endothiapepsin from Cryphonectria parasitica, and cathepsin D from Rattus norvegicus. Based on the highest percentage of identity and coverage obtained by the three servers, the crystal structure of Daucus carota glucoside hydrolase type A (3VLA) was chosen as the most homologous suitable template to the grape seed 7S globulin. The results of the percentage of identity given by the serves ranged from 68 to 69% and the percentages of coverage from 93 to 100%. Other valuable information given by the three servers indicate that 3VLA form Daucus carota protein is rich in alpha and beta helices, which increase its reliability as a homologous template for the grape seed 7S globulin. In addition, Yoshizawa et al., (2012) confirmed that the structure of Daucus carota glucoside hydrolase (3VLA) was similar to 7S globulin from soybean (Bg7S). It was observed that the first 23 amino acids of the grape seed 7S globulin protein sequence were not modeled in the structure, which could indicate that they act as signal peptides (SP). SP are short chain of peptides located at the N-terminal of proteins, which provides information for the protein secretion. In both prokaryotic and eukaryotic cells, proteins are allowed entering to the secretory pathway only if they contain specific addressing signal such as SP. In most cases, SP is a transient extension of the amino N-terminal of the protein, which is removed by peptidase signals once its targeting function has been carried out. To confirm this hypothesis, the amino acid sequence of the Vitis vinifera 7S globulin was analyzed by the server Signal P-5.0, which allows identifying SP in diverse classes of vegetal proteins, according to Almagro Armenteros et al., (2019). Results showed that the first amino acid of the primary structure of 7S globulin protein was alanine, with a probability of approximately 95%, as shown in Fig. S1. These results confirmed, therefore, that the short chain containing the 23 amino acids could be considered a SP of the grape seed 7S globulin. Secondary structure alignment of the grape seed 7S globulin and 3VLA showed consensus structure consisted of 7 α -helices and 23 β-sheet. The rest of the regions contained random coils, structural mismatches, and sequence gap (Fig. S2). Therefore, 3VLA was used as a valid template for the construction of the 3D model of Vitis vinifera grape seed 7S globulin. The coordinate file for the atoms was obtained from the Protein Data Bank at the Brookhaven National Laboratory (PDB ID: 3VLA). The alignment search results against the PDB Table 1 Alignment search results against the PDB database of multiple servers. Server Template (PDB code) Fold Identity% Coverage% E value PSI-BLAST Cadena A Daucus Carota, EDGP (3VLA_A) β-richwith several α -helices 68.37 93 0.0 Cadena A Daucus Carota, EDGP (3VLB_A) β-richwith several α -helices 68,28 94 0.0 PHYRE EDGP(3VLA) β-richwith several α -helices 68 94 0 Conglutin gamma, a unique basic 7 s globulin from lupine seeds Chain: B(C499hB) Tβ-richwith several α -helices 40 88 0 crystal structure of basic 7 s globulin from soybean(C3aupD) β-richwith several α -helices 41 90 0 Crystal Structure of the Triticum aestivum xylanase inhibitor I (Wheat)(d1t6ex) β-richwith several α -helices 32 90 0 HHpred EDGP, extracellular inhibition plant protein(3VLA) β-richwith several α -helices 69 100 1,5 ×10 −43 Basic 7 s globulin; Pepsin-like fold Glcyine max (Soybean)(3AUP_D) β-richwith several α -helices 40 100 1,9 ×10 −40 Conglutin gamma from legumes(4PPH_E) β-richwith several α -helices 41 100 6,4 ×10 −39 Endothiapepsin-Species Cryphonectria parasitica. Protein pepsin-like(5HCT_A) Tβ-richwith several α -helices 17 100 4,2 ×10 −36 Cathepsin D- hydrolase.Rattus norvegicus(5ux4_A) β-richwith several α -helices 15 100 5 ×10 −97 F. Chamizo-Gonz´ alez et al. Food Chemistry 347 (2021) 129014 4 database of various servers and the Swiss model using 3VLA as template generated the model. Swiss model performs a comparative protein modeling by satisfying the spatial constraints of alignment with a related structure (Waterhouse et al., 2018). The results for the evaluation of the generated model was carried out based on the following parameters: GMQE, QMEAN, Procheck, Verify3D and Errat. Results indicate that the GMQE score for the grape seed 7S globulin was 0.81 and the QMEAN −1.67, indicating good structural similarity between the two proteins. The Procheck parameter provides a detailed evaluation on the stereochemistry of the conformation of the main chain. It generates a graph of conformational angles of each residue: φ angle (rotation around the N-C α bond) and ψ angle (around the C α -C bond of the same C α atom, ψ ) and a complete list of the residues. The results revealed that 90.1% of the residues were in favored regions, 7.7% in allowed regions, 0.9% in generous regions and 0.6% in disallowed regions. Verify3D provided a value of 88.5%, which indicates a good validation of the protein structure. Therefore, there was a good compatibility of the 3D structure model with the amino acid sequence. Errat verifies the structure of the protein by detecting local errors based on the statistics of unbound atomic interactions and comparing them with statistics of highly refined structures to suggest an overall quality factor. Results showed a factor of 89.7%. The Procheck, Verify3D and Errat scores of the selected model are within the acceptable range. Therefore, the model obtained by the Swiss Model server was reliable and used for the refinement of the Vitis vinifera grape seed 7S globulin structure. 3.2. Model refinement and energy minimization The preliminary model generated by the Swiss Model is characterized by a high energy level (-367217.7 kJ /mol). This is because the generated model contained unfavorable bond lengths, bond angles, torsion angles, and contacts. Thus, the model was subjected to an energy minimization and geometry optimization using the steepest descent algorithm Gromacs (OPLS-AA force field). The energy minimization step is necessary to obtain a stable protein model, which provides a 3D conformation closer to its native state with effective functionality. Collisions and stearic stresses were reduced by relaxing close contacts in the geometric chain without significantly changing the overall structure (Messaoudi, Belguith, & Hamida, 2013). Table 2 shows the results of the energy minimization and geometry optimization process. The energy minimization reduced the potential energy of the grape seed 7S globulin model to −1409676.87 kJ/mol, which indicate better model packaging quality. On the other hand, the Verify3D score for the 7S globulin model did not change significantly but the model had a satisfactory quality value of 89.3%. The score indicated that 90.6% of the total 7S globulin amino acids were correctly positioned. Errat score did not improve significantly after the energy minimization, which indicate that local errors within the geometry in the model were largely unrepaired. A model with an Errat score greater than 50% is considered a highquality model. The Ramachandran (Procheck) plot also did not change significantly. Procheck analysis showed several residues located in the non-permitted region of the Ramachandran plot (Fig. 2), which were Ser 231, Arg96, Ser196, Ser417 and Arg52. The analysis of Procheck indicated that 90.6% of the amino acids were in the most favored region, 8.2% in the additional allowed region, and 0.3% in the generously allowed region. Residues in the favored region were free of steric interference, while some relaxation of steric interference was allowed in the allowed region. The residues that were in the not allowed region contained the error in their structures. Therefore, based on the aforementioned results, it can be confirmed that the 3D constructed model of the grape seed 7S globulin was satisfactory. 3.3. Structural analysis of grape seed 7S globulin protein The 7S globulin 3D model was determined using homology model computational techniques (Fig. 1). It was made up of a single chain that has α helices and β sheet and is roughly divided into a central slit. The 7S globulin model adopted all the structural characteristics of the EDGP, the model protein selected for the structural design. In order to mathematically verify its similarity, the 7S globulin model was superimposed with the EDGP structure and a mean square deviation (RMSD) of 0.161 was obtained. This result indicates that the 7S globulin model is an accurate presentation of the experimental structure. Theoretical results indicated that 7S globulin has six disulfide bonds, which could help to stabilize the tertiary structure. Especially interesting are the Cys92-Cys116 and Cys426-Cys204 bonds. It seems that they are important for the stabilization of the protein because it links α helices and β sheet. EDGP protein has been found to be similar to other plant proteins such as wheat TAXI-IA and soybean Bg7S. These two proteins are also largely stabilized by six disulfide bonds, which support the results found for the grape seed 7S globulin. Although the patterns of disulfide bridge formation are similar between EDGP and soybean Bg7S, they differ from those of wheat TAXI-IA (Yoshizawa et al., 2012). In addition, different physico-chemical parameters of the grape seed 7S globulin were obtained by the ProtScale server from the Expasy server. Results showed that grape seed 7S globulin has a molecular weight of 43.7 KDa. Likewise, Gazzola et al., (2014) reported the existence of a 43 KDa monomeric protein that showed a high homology to the 7S globulin from legume seeds. Results were also in accordance with Table 2 Evaluation of the 7sg protein model before and after the energy minimization (EM). Evaluation Before EM After EM Procheck 90.09% core 90.6% core 7.7% allowed 8.2% allowed 0.9% generous 0.3% generous 0.6% disallowed 0.9% disallowed Verify 3D 88.54% 89.27% Errat 89.744 89.270 Energy (kJ/mol) −367217.7 −1409676.8 Fig. 1. 7S globulin homology model. The model presents α helices in red and β chain in blue. (For interpretation of the references to color in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.) F. Chamizo-Gonz´ alez et al. Food Chemistry 347 (2021) 129014 5 the weight of soybean basic globulin 7S described by Yoshizawa et al., (2012). Also, 7S globulin has a stability index that classifies it as stable. The isoelectric point (pI) is the pH where the protein is not charged and therefore the pH at which 7S globulin could show a minimum of solubility. The computed pI value for the Vitis vinifera grape seed 7S globulin was 8.96 (pI >7), which indicate it basic nature. The computed isoelectric point (pI) is a useful parameter to develop and optimize purification methods of such as protein Extinction coefficient calculations were also performed, which is useful to have an estimation for spectrophotometric measurements. The extinction coefficient obtained was expressed as units of M −1 cm −1 , at 280 nm measured in water. The results obtained show that when all the pairs of Cys residues are considered they form cystines. In this case, the value obtained was 29630 M −1 cm −1 and if it is assumed that all Cys residues are reduced. The lifetime was 10 h, this parameter is the time (in vitro) that it takes for the protein to disappear once it is synthesized by the cell. The aliphatic index is the relative volume occupied by the aliphatic side chains that allows establishing a relationship with the thermostability of the protein. Also, ProtScale server made possible the knowledge of an average value of hydropathy (GRAVY) that indicates the possibility for 7S globulin to establish interactions with water. This finding suggests that 7S globulin may be highly hydrated in media aqueous. In this sense, the lower the general index of hydropathy, the greater the possibility of establishing this kind of interaction (Kyte & Doolittle, 1982). For this parameter, the value obtained was 0.110. ProtScale hydrophobic analysis (Fig. S3 A) revealed that 7S globulin exhibited two maximum hydrophobicity at amino acids 11 and 12 and a minimum at amino acid 399. Finally, for flexibility, the Bhaskaran scale was used, which gives flexibility values for each of the amino acids, with variations between 0.300 and 0.540 (Gasteiger, Hoogland, Gattiker, Wilkins, Appel & Bairoch, 2005). The high flexibility values suggest that they are flexible molecules (Fig. S3 B). 3.4. Docking and molecular dynamic of binding and subsite structure analysis It was performed to predict non-covalent binding of the 7S globulin receptor (protein) with malvidin-3-O-glucoside (ligand) and to determine the structure of the most favorable binding site. Molecular coupling was performed using AutoDock Vina (Trott & Olson, 2010), a software that uses a method to produce the best ligand conformations that have the lowest possible binding energies. The 3D structure of the grape seed 7S globulin obtained from the homology modeling was used as the receptor molecule. And the Malvidin-3-O-glucoside (Mv3glc) as ligand (Fig. S4). For the docking, it is necessary to prepare the files of the protein, the ligand and the conditions to carry out the interaction. The protein and ligand PDB files were edited using the AutoDock Tools software (Morris et al., 2009) For the 7S globulin, non-protein molecules such as water and ions were removed and Kollman charges and polar hydrogens were added to the protein structure. These hydrogen atoms are important because they participate significantly in the interaction of the ligand. For the ligand, the glycosidic bond was considered rotary and partial atomic charges in the form of Gasteiger charges were added to the structure. The edited 7S globulin PDB files and ligands were saved as PDBQT files as they will be the files needed to run the AutoDock Vina simulation. Finally, grid box was designed to define an interaction space of the ligand with the protein. In our case, dimensions were made to cover all the protein. The grid box was centered at the coordinate of X: −9.285, Y: 45.567, Z: 4.049. Nine resulting ligand conformations were generated in the protein environment after each run in the AutoDock Vina software. The results are showed in Table S1. The lowest energy conformation was chosen as the most favorable conformation at the binding site. The coupling that resulted in the lowest binding energy (−7.0 kcal/mol), indicating a high binding affinity. Fig. 3A shows the most favorable conformation of Mv3glc when interacts with Vitis vinifera grape seed 7S globulin, being stabilized mainly by hydrogen bonds. The results were corroborated with the coupling results of Autodock 4 (Morris et al., 2009) that produced a minimal energy conformation identical to that obtained by Autodock Vina. Therefore, it validates the Autodock Vina docking results. The equilibrium constant was also calculated through equation 1, and the result was K i =7.3×10 −3 . St˘ anciuc et al., (2017) carried out experimental studies on the interaction of anthocyanin compounds and different types of proteins such as β-lactoglobulin, which reported affinity constant values for a temperature of 278 K on the order of 10 −6 . This fact supports a good approximation through theoretical calculation. The binding of Mv3glc with the grape seed 7S globulin is illustrated as 2D drawings in Fig. 3B. The side chain atoms of the residue Arg155, Ser153 and Ser26 form hydrogen bonds with the hydroxyl group of the glucose (G). The ring A interacts through hydrogen bonds with the Ser139 residue in addition to establishing other interactions such as π -alkyl and alkyl. Ring B interacts primarily with residues of Arg150 and Thr25 via hydrogen bonds. Moreover, due to the aforementioned interactions, it was observed that the C ring was oriented towards Val151, an amino acid having hydrophobic characteristics. This finding is interesting since the oxygen in the C ring, being in a hydrophobic region, would be protected from hydration (Fig. 3C). Protecting the hydration of the flavyllium cation by a protein could represent a way of color protection similar to the copigmentation phenomenon, which suggest potential technological applications for the grape seed 7S globulin in the food industry. The coupled ligand remained stable at the 7S globulin active site throughout the simulation (Fig. S5). To assess the deviation of the structure, the RMSD was calculated during the simulation. A stable interaction between the protein and the pigment was observed since it reached rapid equilibrium approximately from 0.2 ns, from this value the RMSD values remain between approximately 0.5 and 0.65 (Fig. 4) and it exhibited low levels of RMSD. 4. Conclusions In this study, the structure of 7S globulin from Vitis vinifera grape seed was obtained for the first time from the amino acid sequence. The results show that 7S globulin is made up of α and β-sheet helices and has a great structural similarity with other plant globulin proteins such as Fig. 2. Ramachandran plot of the 7S globulin homology model. F. Chamizo-Gonz´ alez et al. Food Chemistry 347 (2021) 129014 6 soybean 7S globulin. The parameters that evaluate the quality of the protein morphology improved when the energy of the protein was minimized. In addition, the chemical interaction between the grape seed 7S globulin and malvidin-3-O-glucoside was demonstrated using docking techniques and molecular dynamics. Results showed that in this interaction, the flavylium cation is oriented towards a hydrophobic region of the protein, being protected from hydration. The findings open a new path of experimental studies focused on the protection of the color of anthocyanins, which could have a special interest in food industry applications. Funding sources This research was financially supported by the Ministerio de Economía y Competitividad, Spain, Gobierno de Espa˜ na (Project AGL2017- 84793-C2 and FPI grant PRE2018-087184) CRediT authorship contribution statement Francisco Chamizo-Gonz´ alez: Investigation, Writing - original draft. Bel´ en Gordillo: Writing - review & editing, Writing - original draft. Francisco J. Heredia: Conceptualization, Supervision. Declaration of Competing Interest The authors declare that they have no known competing financial interests or personal relationships that could have appeared to influence the work reported in this paper. Acknowledgment Authors thank the assistance of the technical staff of Biology Service (SGI, Universidad de Sevilla, Spain). Appendix A. Supplementary data Supplementary data to this article can be found online at https://doi. org/10.1016/j.foodchem.2021.129014. References Almagro Armenteros, J. J., Tsirigos, K. D., Sønderby, C. K., Petersen, T. N., Winther, O., Brunak, S., … Nielsen, H. (2019). SignalP 5.0 improves signal peptide predictions using deep neural networks. Nature Biotechnology, 37(4), 420–423. https://doi.org/ 10.1038/s41587-019-0036-z. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., & Lipman, D. (1990). Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology, 215(4), 3–4. Benkert, P., Biasini, M., & Schwede, T. (2010). Toward the estimation of the absolute quality of individual protein structure models. Bioinformatics, 27(3), 343–350. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btq662. Bolton, E. E., Wang, Y., Thiessen, P. A., & Bryant, S. H. (2008). Chapter 12 - PubChem: Integrated Platform of Small Molecules and Biological Activities. In: R. A. Wheeler & D. C. B. T.-A. R. in C. C. 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Proteomic and computational characterisation of 11S globulins from grape seed flour by-product and its interaction with malvidin 3-glucoside by molecular docking. Food Chemistry 386, 132842. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2022.132842 Antecedentes Las semillas de uva representan aproximadamente el 50 % de los subproductos sólidos que las industrias vitivinícolas generan durante el proceso de elaboración del vino (Yu et al., 2013), por lo que su aprovechamiento para la obtención de compuestos con propiedades tecnológicas de interés industrial implicaría ventajas económicas y medioambientales (Baca-Bocanegra et al., 2021; Gordillo et al., 2021). Diferentes estudios han descrito que las semillas de uva (Vitis vinifera L.) son una fuente natural de gran riqueza proteica (10-13%), siendo las globulinas unas de las principales proteínas de almacenamiento presentes en el endospermo (Osborne, 1984; Gianazza et al., 1989; Gazzola et al., 2014). Los distintos tipos de globulinas se clasifican en base a su coeficiente de sedimentación, y las globulinas 11S, entre las más abundantes, se han definido como proteínas hexaméricas de entre 275 y 450 kDa. Estos hexámeros se componen de monómeros de entre 50 y 60 kDa, que están constituidos a su vez por una subunidad ácida (30- 40 kDa) y una subunidad básica (20-25 kDa) unidas por un único enlace disulfuro (Bojórquez-Velázquez et al., 2016). Hasta ahora, se ha comprobado por técnicas proteómicas (electroforesis y espectrometría de masas) que la mayoría de los componentes polipeptídicos identificados en el endospermo de la semilla de uva presentan una alta homología con las globulinas 11S de otras especies vegetales (Zhou et al., 2010; Gazzola et al., 2014). Sin embargo, estos estudios son aún escasos y una mayor definición de la estructura de estas proteínas es crucial para comprender mejor su funcionalidad tecnológica. En el caso de otras proteínas más conocidas, son numerosas las aplicaciones descritas para la industria alimentaria, entre las que destaca su uso como agentes moduladores del color. Hay estudios recientes que han demostrado que las Modelización molecular de globulina 11S RESULTADOS Y DISCUSIÓN 120 proteínas animales, como la proteína de suero de leche, pueden mejorar la estabilidad de algunos colorantes, especialmente los antocianos procedentes de la uva (He et al., 2016; Ren et al., 2021; 2022). En cuanto al uso de proteínas vegetales en la industria de alimentos o bebidas, se han empleado una gran variedad de ellas como son la proteína de soja, guisante, lenteja, arroz, patata o semilla de uva. Dichas proteínas vegetales han sido evaluadas como clarificantes en ensayos de vinificación, demostrando tener una buena capacidad para mejorar algunas propiedades sensoriales como son la limpidez, el color y la estabilidad (Gazzola et al., 2017, Marangon et al., 2019). En relación con esto, hay estudios que ponen de manifiesto que este tipo de proteínas establecen diferentes tipos de interacciones no covalentes con los pigmentos del vino tinto y que dichas interacciones dependen del tamaño de la proteína, la hidrofobicidad y del sitio de unión (Granato et al., 2018). De forma complementaria, la elucidación de la estructura tridimensional de la proteína, así como la comprensión de las interacciones moleculares establecidas entre la proteína y el ligando es crucial para lograr una mejor comprensión de las relaciones estructura-función de la proteína y para definir con mayor precisión sus usos potenciales y aplicaciones tecnológicas (Rasheed et al., 2020; Gong et al., 2021). En este campo, la química computacional ofrece herramientas innovadoras para desarrollar modelos teóricos que permiten caracterizar las estructuras 3D y la conformación de proteínas desconocidas, así como para predecir posibles interacciones moleculares con otros compuestos de interés. Recientemente, la metodología computacional aplicada al diseño de la estructura de la globulina 7S de semilla de uva (Chamizo-González et al., 2021) ha permitido sentar las bases para la modelización estructural de otro tipo de globulinas, como la globulina 11S de semilla de uva. Así mismo, esta metodología es muy valiosa para evaluar y predecir el mecanismo molecular de interacción entre la globulina 11S y un ligando como la malvidina-3-glucosido, pigmento mayoritario de la uva y responsable del color de vinos tintos. El objetivo general de este estudio fue caracterizar y comparar, a través de un estudio proteómico, el perfil proteico y secuencias peptídicas de las globulinas 11S de semilla de uva (Vitis vinífera L.) obtenidas a partir de endospermo de semillas Modelización molecular de globulina 11S RESULTADOS Y DISCUSIÓN 121 de uva fresca (GSE, grape seed endosperm) y harina de semilla de uva desengrasada como subproducto de la industria enológica (GSBP, grape seed byproduct). Así mismo, se propuso establecer, mediante técnicas computacionales, la estructura 3D teórica de la globulina 11S de semilla de uva, y evaluar el acoplamiento molecular con la malvidina-3-glucósido mediante la técnica de docking. Parte experimental Las proteínas vegetales se pueden clasificar en función de su solubilidad en una serie de disolventes: solubles en agua (albúminas), solubles en condiciones salinas (globulinas), solubles en alcohol (prolaminas) y solubles en ácidos o bases (glutelinas) (Osborne, 1924). En este estudio se ha comparado el perfil proteico y las secuencias peptídicas de la fracción de globulinas obtenidas de dos materas primas procedentes de semilla de uva (Vitis vinifera L.): el endospermo de semillas frescas (GSE, variedad de uva blanca Zalema) y harina de semilla desgrasada obtenida industrialmente como subproducto enológico (GSBP; 50% variedades blancas/tintas; proporcionado por ALVINESA Natural Ingredients S.A., Daimiel, Ciudad Real, España). El fin de esta comparación ha sido evaluar posibles diferencias en la composición proteica entre la semilla de uva fresca y un subproducto industrial derivado de ésta y, por tanto, conocer la idoneidad de ambas materias primas para obtener proteínas con propiedades tecnológicas de interés industrial. En primer lugar, se analizó mediante electroforesis SDS-PAGE, en condiciones reductoras y no reductoras, el perfil proteico de ambas fracciones de globulina (GSE y GSBP), en base al patrón de los pesos moleculares de las bandas identificadas. Los resultados electroforéticos indicaron que la fracción de globulinas obtenidas de GSE y GSBP fue bastante similar, destacando algunas bandas proteicas de alto peso molecular (entre 120 y 300 kDa), y varias bandas polipeptídicas menores con rangos de peso molecular entre 50-80 kDa, 40-45 kDa, y 20-25 kDa. En condiciones no reductoras, la fracción de globulinas de GSE y GSBP reveló una banda polipeptídica principal de 60 kDa. En condiciones reductoras, se observó que la intensidad de la banda de 60 kDa desaparecía en ambas muestras, apareciendo dos bandas principales entre 40-43 kDa (doble) y 20 kDa, cuyas intensidades aumentan claramente respecto a las muestras analizadas en condiciones no reductoras. El peso molecular de la banda polipeptídica principal (60 kDa) y su patrón de disociación Modelización molecular de globulina 11S RESULTADOS Y DISCUSIÓN 128 subproducto de semilla de uva (GSBP), mediante análisis de espectrometría de masas MALDI-TOF. • Las dos globulinas 11S identificadas son estructuralmente muy similares, estando constituidas por dominios tipo barril. Computacionalmente se observa que cada uno de los monómeros de 60 kDa está constituido por dos subunidades (40 y 20 kDa) unidas por dos residuos de cisteínas mediante enlace disulfuro, tal y como se observa experimentalmente en el análisis de electroforesis en condiciones reductoras. • Los resultados del acoplamiento molecular sugieren que ambas globulinas 11S de semilla de uva podrían establecer diferentes tipos de interacciones (puentes de hidrógeno, alquilo y π-π) con la principal antocianina de uva (mv3glc). Food Chemistry 386 (2022) 132842 Available online 29 March 2022 0308-8146/© 2022 The Author(s). Published by Elsevier Ltd. This is an open access article under the CC BY license (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Proteomic and computational characterisation of 11S globulins from grape seed flour by-product and its interaction with malvidin 3-glucoside by molecular docking Francisco Chamizo-Gonz´ alez, Francisco J. Heredia, Francisco J. Rodríguez-Pulido, M. Lourdes Gonz´ alez-Miret * , Bel´ en Gordillo Food Colour and Quality Laboratory, Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla, 41012 Sevilla, Spain ARTICLE INFO Keywords: Grape seed proteins 11S globulin Proteomics Computational techniques Anthocyanin ABSTRACT Grape seed flour by-product (GSBP) is an economic and renewable source of proteins, increasingly being explored due to interesting technological application such as colour protection in rich-anthocyanins beverages. Globulin-like proteins from GSBP were characterised by proteomic and computational studies. MALDI TOF/TOF analysis revealed the presence of two 11S globulins (acid and basic), whose 3D structures have been elucidated for the first time in Vitis vinifera L. grape seeds by using homology models and molecular dynamics. The secondary structure showed 11 α -helices and 25 β-sheets for acid and 12 α -helices and 24 β-sheets for basic 11S globulins. Molecular docking results indicate that both grape seed 11S globulins could establish different types of non-covalent interactions ( π - π ) with malvidin 3-O-glucoside (wine anthocyanin), which suggest a possible colour protection similar to that occurring in copigmentation phenomenon. These findings provide valuable information of globulin family proteins that could be relevant in food industry applications. 1. Introduction Grape seeds count for about 5% of weight of the whole grape berry, representing approximately 40%-50% of the solid by-products generated by different wine industries during wine making process (Yu & Ahmedna, 2013). Grape seed is a rich source of proteins (10–13%) having interesting technological applications for the food and other industries such as textural and sensory attributes modulation (viscosity, gelation, elasticity, plasticity, emulsification, aroma, flavour, or colour, among others) to improve the food quality (Tomadoni, Capello, Valencia, & Guti´ errez, 2020). On the other hand, grape seed proteins represent a new alternative to the use of other biopolymers such as animalbased and synthetic counterparts which are subjected to legal restrictions (Baca-Bocanegra et al., 2021; Gordillo, Chamizo-Gonz´ alez, Gonz´ alez-Miret, & Heredia, 2021). According to their solubility in different solvents, plant seed proteins have been classified into albumins (soluble in water), globulins (soluble in salt), prolamines (soluble in aqueous alcohol), and glutelin (soluble in acidic or alkaline solution), respectively (Osborne, 1984). Characterisation of grape seed proteins has revealed that globulins are one of the steins from the Vitis vinifera L. seed endosperm with storage function (Gianazza et al., 1989; Gazzola et al., 2014). Based on their sedimentation coefficients, globulins can be classified into two main types (7S and 11S globulins), however, very little is still known concerning the structure of the major proteins present in grape seeds. Up to the moment, most of the polypeptide components identified by electrophoretic and LS/MS-MS analysis in the grape seed endosperm showed high homology with the 11S globulin-like seed storage proteins of other plant species (Zhou, Li, Zhang, Bai, & Zhao, 2010; Gazzola et al., 2014). In particular, Zhou et al. (2010) isolated and purified an 11S globulin-like protein (GSG) by two consecutive cation exchange and size exclusion chromatography and reported a yield of 10 mg the protein from 1 kg seeds. In comparison, protein components matching with 7S globulins of other plant species have been only identified by Gazzola et al. (2014). The ability of proteins to modulate food properties depends largely on their structural features as well as on their ability to form specific three-dimensional (3D) configurations/conformations, and the interaction with other molecules present in food matrices (Paramita, Panyoyai, & Kasapis, 2020). In the case of applications to protect colour, Gong * Corresponding author at: Food Colour & Quality Lab., ´ Area de Nutrici´ on y Bromatología. Facultad de Farmacia. Universidad de Sevilla. 41012 Sevilla, Spain. E-mail addresses: [email protected], [email protected], [email protected] (M.L. Gonz´ alez-Miret). Contents lists available at ScienceDirect Food Chemistry journal homepage: www.elsevier.com/locate/foodchem https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2022.132842 Received 24 August 2021; Received in revised form 25 March 2022; Accepted 26 March 2022 Food Chemistry 386 (2022) 132842 2 et al. (2021) demonstrated that casein and whey proteins could be used to improve the stability of the purple potato anthocyanins. Differences found in the binding sites and secondary structure of both proteins determined casein establishing stronger binding affinity for purple potato anthocyanins than whey protein. Other recent studies have also shown that whey proteins can prevent the thermal, oxidative and photo degradation of grape anthocyanins when used as food colorants, especially if proteins are preheated (He, Xu, Zeng, Qin, & Chen, 2016; He, Zhu et al., 2016; Ren, Jim´ enez-Flores, & Giusti, 2021; Ren & Giusti, 2022). The higher protective effect of preheated proteins was related to the conformational changes produced on the protein secondary structure after heat treatment, which led to a stronger binding affinity with grape anthocyanins. As regards to the use of plant proteins in the food or beverage industries, a great variety of them (from soybean, pea, lentil, rice, potato, or grape seed) have been assessed in as fining agents at experimental winemaking trials demonstrating good capacity to improve sensory properties as clarity or colour stability (Gazzola et al., 2017; Marangon, Vincenzi, & Curioni, 2019). At this respect, different affinity and selectivity of plant proteins for red wine components relevant to colour stability have been reported depending on the protein size and/or the number/accessibility of hydrophobic sites on the protein surface (Granato, Ferranti, Iametti, & Bonomi, 2018). These studies provided valuable experimental information on the protection mechanisms of anthocyanins through the interactions with different protein types, which have contributed substantially to promote their application in the food industry. Complementary, the elucidation of the protein morphology and the three-dimensional (3D) structure, as well as the molecular understanding of the protein–ligand interactions is crucial to better establish the protein structure–function relationships and to define more accurately their potential uses and technological applications (Rasheed, Markgren, Hedenqvist, & Johansson, 2020; Gong et al., 2021). In this way, computational chemistry offers innovative tools to develop theoretical models to characterise the 3D protein structures and predict molecular interactions with other compounds of interest and thus to deepen technological functionality. At this respect, the theoretical 3D structure of a type 7S globulin from grape seed has been recently elucidated by computational techniques (Chamizo-Gonz´ alez, Gordillo, & Heredia, 2021). However, the chemical structure of the 11S type globulins, one of the major proteins in grape seed, has not been well understood. The computational methodology to design the structure of 7S globulin from grape seed performed by Chamizo-Gonz´ alez et al. (2021) has allowed laying the foundations for the modeling of 11S globulins (identified by proteomic techniques) and comparing the parameters that evaluate the quality of the models of the different globulins. Considering these observations, the aim of this work was to characterise, through a proteomic and computational study, the protein profile and molecular structure of the grape seed 11S globulins from Vitis vinifera L. To provide new insights to potential applications of seed proteins, the globulin fractions obtained from grape seed endosperm (GSE) and grape seed by-product (GSBP, industrially processed) were compared. In addition, the interaction between grape seed 11S protein and the main anthocyanin of red grapes and wines will be explored by molecular docking to achieve a better understanding of the use of proteins for wine colour modulation. 2. Materials and methods 2.1. Reagents Reagents used were analytical grade: n-hexane (Carlo-Erba, Milan, Italy), sodium chloride (Fluka, Seelze, Germany), trichloroacetic acid (TCA) (Scharlau, Barcelona, Spain), cold acetone (Scharlau, Barcelona, Spain), tris-HCl (Sigma Aldrich, Steinheim, Germany), ammonium sulphate (Panreac, Barcelona, Spain), SDS–PAGE (sodium dodecyl sulphate–polyacrylamide gel electrophoresis) reagents (Bio-Rad Laboratories Hercules, CA, USA), dithiothreitol; DTT (Sigma Aldrich, Steinheim, Germany), acetonitrile (ACN) (Biosolve, Valkenswaard, The Netherlands), ammonium bicarbonate (NH 4 HCO 3 ) (Sigma Aldrich, Steinheim, Germany), trifluoroacetic acid (TFA) (Sigma Aldrich, Steinheim, Germany), trypsin (Sigma Aldrich, Steinheim, Germany), α -cyano-4-hydroxycinnamic acid (Bruker Daltonics GmbH, Bremen, Germany), iodoacetamide (Sigma Aldrich, Steinheim, Germany). 2.2. Plant material Two types of grape seed material (Vitis vinifera L.) were used in this study to extract seed proteins: grape seed endosperm flour obtained manually from ripe berries (GSE; var. Zalema) and defatted whole grape seed flour obtained industrially from wine by-products (GSBP; 50% mix of white/red varieties, provided by ALVINESA Natural Ingredients S.A. (Daimiel, Ciudad Real, Spain). To obtain the GSE flour, 100 ripe white grapes of Zalema variety (Vitis vinifera L.) were used (Condado de Huelva Designation of Origin D. O. (Andalusia, Spain). Seeds were manually removed from berries, washed with milliQ water and air-dried. Then, seeds were dissected, and the integuments were carefully removed from the endosperm with a sharp blade. The seed endosperm (1 g) was ground to fine flour in a glass mortar and defatted with n-hexane (1:50 w/v). The suspension was centrifuged 6500 g, and the defatted GSE flour was air-dried and stored at −20 ˚C until the protein extraction. Protein extractions (GSBP and GSE) were performed in triplicate. 2.3. Globulin extraction and purification According to the Osborne classification of proteins based on their solubility (Osborne, 1924), globulin fraction (salt soluble) was separately extracted from the GSE and GSBP defatted flours with 0.5 M Sodium chloride (1:10 w/v) with constant stirring for 1 h at room temperature (25 ±0.2 ◦C), in triplicate. In each case, the obtained salt soluble fraction was centrifuged (8000g for 10 min) and the flour residue was submitted to the same process twice (each stirring for 30 min). The three supernatants were combined, filtered through 0.45 µm nylon, and concentrated by using a 3 kDa MWCO cutoff dialysis tube (Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter Devices, Millipore, Darmstadt, Germany). The concentrated GSE and GSBP globulin fractions (1 mL) were precipitated using the TCA-acetone precipitation method for sample preparation prior to the proteomic analysis. First, TCA was added at a concentration of 10% (w/v) to each sample, mixed, and incubated for 30 min at −20 ◦C until the complete precipitation of the proteins. Then, the protein pellet, obtained by centrifugation at 8000g for 5 min, was washed with 2 mL of cold acetone for 1 h at −20 ◦C. Protein precipitates were recovered by centrifugation at 8000 g for 10 min, air-dried, and dissolved in 250 µL of 0.8 M Tris-HCl buffer pH 7.5 until proteomic analysis. On the other hand, a fractional precipitation method with ammonium sulphate was carried out (Burgess et al., 2009) to assess the viability of obtaining a protein isolate from the globulin fraction of the GSBP flour. For this purpose, ammonium sulphate was added at 30%, 40%, 50% and 60% of saturation to 5 mL of the GSBP globulin fraction in 0.5 M NaCl in different tubes. Protein solutions were mixed and incubated for 30 min in an ice bath to allow the complete protein precipitation. Each protein precipitate, obtained by centrifugation at 8000 g for 5 min, was dissolved in 0.8 M Tris-HCl buffer (pH =7.5) and analysed by SDS-page. 2.4. SDS-Page analysis The range of molecular weight (MW) of the GSE and GSBP globulin fractions, and the GSBP protein isolates with ammonium sulphate, were analysed by sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) using the Mini-Protean® 3 system (BioRad, Hercules, F. Chamizo-Gonz´ alez et al. Food Chemistry 386 (2022) 132842 3 CA, USA) under reducing and non-reducing conditions. Aliquots (20 μ L) of protein extracts in 0.8 M Tris-HCl buffer pH 7.5 were mixed with 5 μ L of 0.02 M Tris-HCl loading buffer pH 6.8 (containing glycerol 40% w/v, SDS 4, 6% w/v, in the presence or not of 10 mM dithiothreitol (DTT), and 0.01% Bromophenol Blue, all from Sigma- Aldrich, Milan, Italy). For analyses under non-reducing conditions, the reducing agent DTT was omitted from the loading buffer. Samples were then denatured at 100 ˚C for 5 min. Samples were loaded into 14% polyacrylamide gel 1.5 mm (acrylamide: bisacrylamide, 29:1) and electrophoresis was performed in constant voltage mode (170 V) for 50–60 min. Proteins were visualized after 30 min incubation while shaking with Coomassie staining solution (40% ethanol v/v, 10% acetic acid v/v, 50% distilled water and 0.01% Coomassie blue R-250 w/v). Subsequently, the gels were discoloured in a solution of 40% ethanol v/v and 10% acetic acid v/v, while stirring until the bands were adequately visualized. The standard molecular weight proteins (ranging from 10 to 200 kDa) used were the PageRuler ™ unstained protein ladder (Thermo Fisher Scientific Inc., Vilnius, Lithuania). 2.5. MALDI-TOF/TOF analysis and protein identification. Protein identification was carried out according to the method of (Wang & Wang, 2015) by using an AB Sciex TOF/TOF™ 5800 system (AB Sciex, USA) equipped with a time-of-flight analyser and matrixassisted laser desorption ionization (MALDI-TOF) with the ability to fragment peptides. The analysis was performed in the positive-ion linear mode. Ions were formed by a pulsed UV laser beam (Nd:YAG 349 nm). Other MALDI-TOF/TOF parameters were ion source voltage: 15 kV; delay time: 140 ns. Mass spectra from each spot were obtained in the m/z range from 800 to 4000, whereby up to 500 laser shots were accumulated per spectrum. External mass calibration was provided by the protein calibration standard (SCIEX, USA), checked daily. For the MALDI-TOF/TOF analysis, the protein bands were selected from the gel and washed with 200 μ L of milliQ water in different tubes for 15 min. In each tube, 50 μ L of 50% ACN decolourizing solution was added, the mixture was incubated for 10 min, and then the ACN solution was discarded. The washing process was repeated until the blue colour was completely removed, and the gel fragments were finally dried under vacuum for 15 min. The gel fragments were then incubated with 30 µL of 10 mM DTT in 50 mM NH 4 HCO 3 for 30 min at 56 ˚C and then the liquid was removed. Then 50 µL of 100% ACN was added, and removed after 5 min. Then 30 µL of 55 mM iodoacetamide in NH 4 HCO 3 was added for 20 min in darkness at room temperature, then the liquid is removed. It is then incubated with 50 μ L of ACN for 5 min. The solution was removed and the gel fragment was vacuum-dried for 15 min. The digestion of the gel fragments was carried out with a trypsin solution. The gel fragments were rehydrated with ice water, and 15 µL of the trypsin solution (0.1 µg/mL in 1 mM HCl) and 100 µL of 50 mM NH 4 HCO 3 were added. The samples were incubated at 37 ˚C overnight. Peptides were recovered from the gel pieces by incubating with 50 µL of 0.5% TFA extraction solution for 15 min at room temperature. After the trypsin digestion, 0.8 μ L of peptides for each sample was spotted on the MALDI plate, and 0.8 μ L of 5 mg/mL α -cyano-4- hydroxycinnamic acid solubilized in 50% ACN and 0.1% TFA as matrix were added on top of the dried samples. The samples were analysed in the MALDI-TOF system. After each MALDI-TOF/TOF analysis, peak lists (peptide m/z) were queried against Vitis vinifera L. sequences in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) database using the Mascot search engine (v.2.5.1, Matrix Science Inc., Boston, MA). Search parameters were as follows: type of search, ion search; enzyme: trypsin; fixed modifications, carbamidomethyl (C); variable modifications, oxidation (M); mass values: monoisotopic; protein mass: unrestricted; peptide mass tolerance: ±50 ppm; peptide charge state: 1+; max missed cleavages: 1. Only significant hits, as defined by the Mascot probability analysis (p <0.05) were accepted. 2.6. Homology modelling of grape seed 11S globulins A design was made from homology models based on protein structures characterised by experimental techniques to obtain an approximation of the 3D structures of the proteins. First, it was necessary to obtain the amino acid sequence of the 11S globulin from grape seed (Vitis vinifera L.) from the UNIPROTKB database. With the aim of finding the most similar proteins sequences to use as a template for the homology modelling, a sequence similarity search of the grape seed 11S globulins was carried out by using the servers PSI-BLAST (Altschul et al., 1990) HHpred (S¨ oding, Biegert, & Lupas, 2005) and Phyre (Kelley & Sternberg, 2009). Results of the servers were compared and the best template was selected based on the following quality parameters: percentage of cover, percentage of sequence identity, percentage of coverage and the E value. A homology model was used to construct the 3D structure of the grape seed 11S-type globulins. Two 11S globulins were designed from their respective amino acid sequences that code F6HZK2 and F6HZK3, which were obtained from the Uniprot database using the Mascot search engine (v.2.5.1, Matrix Science). The protein sequence alignment was used as the input file to create the 3D protein models of the grape seed 11S globulins using the SWISS-MODEL tool provided by the EXPASY server (Waterhouse et al., 2018). The validation parameters used to evaluate the accuracy of the predicted model and its stereochemical properties were the Global Model Quality Estimation (GMQE) (Waterhouse et al., 2018) and the Qualitative Model Energy Analysis (QMEAN) (Benkert, Biasini, & Schwede, 2010), as described in Chamizo-Gonz´ alez et al. (2021). 2.7. Minimization of energy, structure validation, and molecular dynamics simulation of the grape seed 11S globulins The minimization of energy and the molecular dynamics of the obtained model was carried out using the Gromacs 5.0.7 software (Hess, Kutzner, Van der Spoel, & Lindahl, 2008) with the OPLS-AA force field. For each model, the grape seed 11S globulin was solvated in 1.0 nm cubic boxes using single point charge water molecules, which were then replaced with counterions for electroneutrality. The energy minimization was carried out in 50.000 interaction steps (Lemkul, 2018).The minimized energy structure was evaluated using Procheck, Verify-3D and Errat servers. Subsequently, to assess the stability of the modelled structures, a molecular dynamic (MD) of each protein was carried out in aqueous solution were carried out using the Gromacs software. Two equilibrium stages (100 ps each one) were carried out to achieve the optimum pressure and temperature conditions. The reference pressure and temperature values were 1 bar and 300 K, respectively. After the equilibrium phases were completed, the system adjusted the desired temperature and pressure. Then, a 1 ns MD simulation was run with a 2- fs lics time step algorithm. The resulting trajectory was analysed using Gromacs earnings, based on the mean square distance deviation (RMSD). This parameter quantifies the distance between each residue after an alignment between two structures. RMSD has a value equal to 0 for identical structures and goes increasing as the two structures or conformations differentiate each other (Wu et al., 2021). 2.8. Protein-ligand docking studies Coupling studies were performed to predict the putative binding of malvidin-3-O-glucoside (mv3glc, the main grape anthocyanin) as a ligand to the model constructed for the grape seed 11S globulins. The AutoDock Vina software (Trott & Olson, 2010) was used for the analysis. The initial structure of mv3glc was obtained from the PubChem F. Chamizo-Gonz´ alez et al. Food Chemistry 386 (2022) 132842 4 database (Kim et al., 2018) and the two-dimensional (2D) and threedimensional (3D) chemical structure was built with the Avogadro software (Bolton, Wang, & Thiessen, 2008). Ligand (mv3glc) was optimized to a minimum of energy using the MMFF9 force field. The hydrogens of the framework were then adjusted to a pH of 3.5. This was done with the Avogadro software (Hanwell et al., 2012). Autodock Tools (Morris et al., 2009) were used to generate receptor and ligand PDBQT files from their traditional PDB files to use for docking in AutoDock Vina software. The PDBQT file is an extended PDB coordinate file format that includes atomic partial charges. Hydrogen atoms were added to the macromolecule and the partial atomic charges were calculated. In the case of F6HZK2, a grid box with size of 84 ×62 ×83 points was used in the configuration file of the Autodock Vina software to cover the entire protein. The grid box was centred on the coordinate of X: −39.03, Y: 9.61, Z: 82.47. For the F6HZK3, a grid box with size of 81 × 79 ×73 points was used in the configuration file of the Autodock Vina software to cover the entire protein. In this case, the grid box was centred on the coordinate of X: −65.28, Y: −8.21, Z: −24.84. Other coupling parameters such as the energy range was considered equal to 3, the completeness equal to 8 and the number of nodes equal to 9. The positions of the protein atoms were kept fixed and the twist angle of the glycosidic bond of the ligand was rotated until rigid coupling in AutoDock Vina software allowed favourable coupling. Different software was used to carry out the molecular modelling analysis. To visualize structures and analyse the results UCSF Chimera software were used to illustrate the 11Sglobulin an mv3glc models (Pettersen et al., 2004). 2D illustrations of the mv3glc sites interacting with the amino acids of the 11S globulins were made with Discovery Studio visualizer software. 3. Results and discussion 3.1. SDS-PAGE analysis of grape seed globulins Both globulin fractions extracted from the GSE and GSBP flours (grape seed endosperm and grape seed by-product, respectively) were analysed by SDS-PAGE, under both reducing and non-reducing conditions, for comparison. The SDS-PAGE results are shown in Fig. 1A (GSE) and 1B (GSBP). The protein profile of both globulin fractions was quite similar regardless the seeds were non-industrially processed (GSE) or processed as by-product (GSBP). It was characterized by high MW protein bands of 120–300 kDa and diverse polypeptides subunits in the ranges of 50–80 kDa, 40–45 kDa, and 20–25 kDa. Under non-reducing conditions, the globulin fraction of the GSE and GSBP flours revealed a main polypeptide band at 60 kDa (Fig. 1A and 1B). Under reducing conditions, the intensity of the 60 kDa band disappeared and was split in both cases into two major bands of 40–43 kDa (double) and 20 kDa, whose intensities clearly increase respect to the unreduced samples. The apparent MW of the main polypeptide band and its electrophoretic dissociation pattern agree to those described for the 11S globulin-like storage protein of Vitis vinifera L. grape seeds (Gianazza et al., 1989; Zhang, Liu & Zhao, 2010; Gazzola et al., 2014; Gazzola et al., 2017) and of seeds from other plant species such as legume, soybean, chan, and cowpea, among others (Liu, Xiao, Li, Geng, Ma, Liang, 2017; Song, Oehrle, Liu, & Krishnan, 2016; Abdel-Shafi et al., 2019). 11S globulins have been defined as hexameric proteins of 275–450 kDa consisting in 50–60 kDa monomers, which are composed of an acidic subunit (30–40 kDa) and a basic subunit (20–25 kDa) linked by a single disulphide bond (Boj´ orquez-Vel´ azquez et al., 2016). Considering this structure, the presence of minor bands of 20 and 40 kDa in both samples under non-reducing conditions may be attributed to the natural dissociation of a small proportion of the 60 kDa monomer during the Fig. 1. A) SDS-PAGE under non-reducing (nred) and reducing (red) conditions of the globulin fractions extracted from the GSE flour (grape seed endosperm). B) SDSPAGE under non-reducing (nred) and reducing (red) conditions of the globulin fractions extracted from the GSBP flour (grape seed by-product) F. Chamizo-Gonz´ alez et al. Food Chemistry 386 (2022) 132842 5 extraction procedure applied. On the other hand, other minor protein bands of higher MW of 120, 200, and ~ 300 kDa were also present in the GSBP flour under nonreducing conditions (Fig. 1B), being barely identified in the GSE flour (except to 200 kDa band; Fig. 1A). Zhou et al. (2011) have described two native proteins of 160 and 300 kDa in Vitis vinifera L. grape seeds while Gazzola et al. (2014) also identified a protein band of 200 kDa, which is consistent with our results. More in particular, Tan, Ying-Yuan, & Gan (2014) reported that the 11S globulin from soybean contains MW associations of ~ 120 kDa, corresponding to the not fully dissociated 60 KDa monomers. When reduced, it was observed that the high MW bands of GSBP disappear and 3 minor consecutive polypeptide bands of 60, 70 and ~ 75 kDa became visible in the gel. According to Song et al. (2016), a 7S globulin-like protein was identified in soybean, which is made up of three subunits ( α ′, α , and β) with apparent MW of approximately 76, 72 and 53 kDa, respectively. Analogous dissociation pattern was reported by (Liu et al., 2017) for a 7S globulin from soybean. These findings are comparable with the results observed in GSBP, suggesting that the 200 kDa protein band could correspond to a 7S globulin dissociated in three polypeptide bands of 60, 70 and ~ 75 kDa after reduction. However, to the best of our knowledge, a 7S globulin-like protein having this specific tryptic peptide structure has never been identified in grape seeds. Up to the moment, only Gazzola et al. (2014) confirmed for the first time the presence of a polypeptide band of about 43 kDa in V. vinifera seeds by SDS-page, which presented high homology with the 7S globulins of legume seeds. Thus, further work will be necessary to accurately elucidate the 200 kDa MW protein band and its polypeptide components observed in our study. The structural similarity found between the globulin fractions from the GSE and GSBP flours suggest comparable techno-functional properties and potential industrial applications. Therefore, the GSBP flour, an abundant wine by-product, could represent a promising source to obtain specific protein components from grape seed of interest for food and industrial applications (Mora-Garrido, Cejudo-Bastante, Heredia, & Escudero-Gilete, 2022). In this sense, the viability of obtaining a protein isolate of the main monomer identified in the GSBP globulin fraction (60 kDa band) was investigated. For this purpose, a fractional precipitation process with ammonium sulphate was carried out, which is a precipitating agent allowed by the food industry. SDS-page analysis showed that the best results to obtain a purified fraction comprised of only a 60 kDa band was achieved with a 50% saturation of ammonium sulphate (Fig. S1). These findings will allow assessing specific protein functionalities of grape seeds and proposing future chemical interaction studies with different compounds present in food matrices obtaining more precise results. 3.2. Identification of grape seed globulins by MALDI-TOF The main protein bands identified by SDS-PAGE under non-reducing conditions in the globulin fractions from GSE (60 kDa band) and GSBP (120 and 200 kDa bands) were excised from the corresponding gels, digested with trypsin, submitted to MALDI-TOF/TOF analysis. Protein search and putative identification was assigned by comparing the obtained peptide mass fingerprinting in the NCBI database using Mascot as a search engine (v.2.5.1, Matrix Science). The protein scoring algorithms used by Mascot rates proteins based on the probability that the identified proteins are a random hit within the database. Reported protein matches are scored using the Mascot algorithm, which requires a score threshold of 57 with the NCBI database used for 95% confidence (p <0.05). The MALDI mass spectrum of the 60 kDa band from the GSE flour is shown in Fig. S2. Results showed that it has three abundant peptide ions of m/z 2030.047, 1227.600, and 3005.375, followed by five peaks having lower intensities of m/z 149.731, 1320.719, 2094.023, 2534.247, and 2926.34. Other several weak peaks varied from m/z 985.527 to 2982.36. The matched peptides and their characteristic sequence identified from Mascot database are shown in Table 1, which corresponded with two different seed storage proteins belonging to the 11S globulin family from Vitis vinifera L. (CNBI accession numbers F6HZK2 and F6HZK3). According to the results, these two proteins are quite similar in terms of theoretical mass and number of amino acids. Table 1 Matched peptides of 60 kDa band (tryptic in-gel digests) of GSE globulin fraction and peptide sequences from MASCOT database search. F6HZK2 F6HZK3 Identification protein Observed m/z peptide sequence Identification protein Observed m/z peptide sequence Uncharacterized protein OS =Vitis vinifera OX = 29760 GN = VIT_07s0005g03410 PE =3 SV =1 821.4371 R.ADVYTPR.G Uncharacterized protein OS =Vitis vinifera OX =29760 GN =VIT_07s0005g03420 PE =3 SV =1 821.4371 R.ADVYTPR.G 1014.5921 R.LTAQKPSNR.I 1055.5750 R.LNAQRPSNR.I 1121.5305 R.QQNECSISR.L 1226.6689 R.LKQNIGDPWR.A 1226.6689 R.LKQNIGDPWR.A 1235.7120 R.VEGGLQAVLPPR.G 1249.7311 R.VEGGLQALLPPR.G 1320.7186 R.SSVTGYDLPILR.K 1355.6908 K.ARDSGFEYVAIK.T 1355.6908 K.ARDSGFEYVAIK.T 1364.6287 K.SRQQNECSISR.L 1636.8097 K.HNRQESTIAPPGSSR.S 1406.7419 R.SSVTGYDLPVLQK.L 1787.8694 K.QNIGDPWRADVYTPR.G 1596.7756 K.HNRQESTIGAPGSSR.S 1833.9833 R.VEGGLQAVLPPRGQQER.G 1787.8694 K.QNIGDPWRADVYTPR.GR. VEGGLQALLPPRGQQER.G 2077.0332 R.AMPLQVISSAYQVSNNQAR.Q 1848.0018 R.VEGGLQALLPPRGQQER.G 2093.0198 R.AMPLQVISSAYQVSNNQAR.Q + Oxidation (M) 2007.9767 R.AMPVQVIASAYQASNNEAK.Q + Oxidation 2890.3699 K.IREVEEGDVFAVPVGTGHFIYNNGDR. Q 2656.1770 R.EVEEGDAFAVPTGFGHYIYNNGNR.Q 3004.3716 R. IQSEAGVTEVFDHNNEQFQCAGVAVVR. Y 2925.3445 K.IREVEEGDAFAVPTGFGHYIYNNGNR.Q 2981.3552 R.GLQGILISGCPETFQSFQESQEGQQGR. E 3004.3716 R. IQSEAGVTEVFDHNNEQFQCAGVAVVR. Y F. Chamizo-Gonz´ alez et al. Food Chemistry 386 (2022) 132842 6 The F6HZK2 is identified with a protein score of 178 and coverage of 37% of the database sequence and has a theoretical molecular mass of 57.8 kDa (518 amino acids) whose computed isoelectric point was 6.14. The F6HZK3 is identified with a protein score of 118 and coverage of 30% of the database sequence and has a theoretical molecular mass of 57.3 kDa (508 amino acids) whose computed isoelectric point was 8.09. The computed isoelectric points indicate the acid (F6HZK2) and basic (F6HZK3) nature of both 11S globulins, which is a useful parameter to the protein characterisation as well to optimize purification methods. Despite the sequence of both proteins is defined in diverse database their 3D structure is still unknown. The Mascot database search for the MALDI spectra of GSBP 200 kDa and 120 kDa bands confirmed the same F6HZK2 and F6HZK3 amino acid sequence of the two 11S globulin protein previously identified in the GSE 60 kDa bands. The matched peptides and their characteristic sequence identified are shown in Table S1. In the case of F6HZK2 and F6HZK3 identified in the GSBP 200 kDa band, the scores were in the order of 132 and 80, respectively (~95% confidence). On the other hand, the F6HZK2 and F6HZK3 were identified in the GSBP 120 kDa band with a protein score of 85 and 81 with similar level of confidence. These findings confirmed that both the GSE and GSBP flours contain low MW protein components (60 kDa) belonging to the 11S globulin family that can form associations of higher MW (120 or 200 kDa), as reported in other plant seed species by Tan et al. (2014) and Boj´ orquez- Vel´ azquez et al., (2016). 3.3. Model building, refinement and energy minimization of grape seed 11S globulin structures The results provided by the servers (PSI-BLAST, HHpred and Phyre) to identify the possible homologous structure to use as a template for homology modelling are shown in Table S2 and S3. Shown here are the results of the identity and coverage percentages as well as the E-values for the different possible homologous protein structures to the grape seed 11S globulin proteins F6HZK2 and F6HZK3, respectively. The crystal structure of an 11S globulin seed from Amaranthus hypochondriacus (PDB ID: 3QAC; 2.27 Å resolution), according to Tandang-Silvas et al. (2012) was selected as the most homologous suitable template for the model construction of grape seed 11S globulin F6HZK2, as it corresponded to the highest values of percent identity and coverage (% identity: 45–56%; % coverage 94–100%). For model building of grape seed 11S globulin F6HZK3, the crystal structure of Prunin-1, an 11S-type globulin from Pronus dulcis, was selected (% identity: 47.5–61%; % coverage 92–100%). This structure is also available in the database (PDB ID: 3FZ3; resolution 2.40 Å, according to Jin et al. (2009). Regarding 3QAC and 3FZ3 they are α - and β-helix-rich proteins. Secondary structure alignment showed structures composed of 11 α -helices and 25 β-sheets for F6HZK2 and of 12 α -helices and 24 β-sheets for F6HZK3. These results show a good similarity between the results obtained for grape seed 7S globulin, especially in the number of β-sheet (7 α -helices and 23 β-sheet). The structures of 11S globulins show random coils and structural mismatches as in 7S globulin (Chamizo-Gonz´ alez et al., 2021). According to Dunwell et al., (2001), 11S globulins belong to the cupin superfamily having α -helix and β-barrel domains, which are structural features of seed storage proteins. After evaluating the quality parameters, 3QAC and 3FZ3 were used as suitable templates for the construction of the 3D models of 11S globulins from grape seeds of Vitis vinifera L. The templates were obtained from Protein Data Bank (PDB) of Brookhaven National Laboratory. Subsequently, the Swiss Model server (Waterhouse et al., 2018) was used to obtain the 3D models of each of the 11S globulins based on the following parameters: GMQE, QMEAN, Procheck, Verify3D, and Errat. These results indicate that the GMQE score to the constructed model of F6HZK2 was 0.59 and the QMEAN value was −1.62. In the case of F6HZK3, the GMQE score was 0.66 and the QMEAN value was −2.10. Both results indicate good structural similarity with their respective templates. The results for the constructed model of F6HZK2 (Table S4, before energy minimization, EM) revealed that 85.2% of the amino acid residues were in favoured regions, 13.5% in allowed regions, 0.8% in generous regions, and 0.5% in disallowed regions. Verify3D provided a value of 83.16%, indicating good validation of the protein structure. For the constructed model of F6HZK3 (Table S4, before energy minimization, EM), the results revealed that 83.8% of the amino acid residues were in favoured regions, 13.0% in allowed regions, 2.5% in generous regions, and 0.8% in disallowed regions. Verify3D provided a value of 80.4%, also indicating good validation of the protein structure. Therefore, there was a good compatibility of the 3D structure model with the amino acid sequence of both F6HZK2 and F6HZK3. The results provided by Errat (parameter related to the overall model quality) showed a factor of 91.5% for F6HZK2 and 89.1% for F6HZK3 (Table S4), suggesting that the established models are acceptable. It was necessary to apply a stage of energy minimization and geometry optimization to improve the structures obtained by Swiss Model, since these improvements provide a 3D conformation closer to its native state (Messaoudi, Belguith and Hamida, 2013). For this purpose, the most pronounced descent algorithm Gromacs (OPLS-AA force field) was used. Table S4 shows the results of the energy minimization and the geometry optimization process. The minimization calculation reduced the potential energy of the F6HZK2 model to −2421719.8 kJ/mol and to −2949302.5 kJ/mol for F6HZK3, indicating that this step is necessary to improve the quality of the model, as is the case for 7S globulin (Chamizo et al., 2021). On the other hand, Verify3D scores for the two models did not change much after energy minimization, showing acceptable quality values of 90% for F6HZK2 and 82.6% for F6HZK3. The Procheck parameter core indicated that 81.5% and 86.8% of the amino acids were correctly positioned (F6HZK2 and F6HZK3, respectively). Finally, the Errat score did not improve significantly after energy minimization. Fig. 2 shows the 3D structure of both grape seed Vitis vinifera 11S globulins: the basic monomer F6HZK2 is represented in Fig. 2A and the acid monomer F6HZK3 in Fig. 2B. Both 3D structures correspond to the minimum energy conformation after the energy minimization of the constructed models. From each structure, their respective Ramachandran diagrams were obtained. Results showed some amino acid residues located in the disallowed region of the Ramachandran plot for both monomers, which indicate some errors in the protein structure. They were Gln 252, Gln 47, Leu 315, Glu 144, Thr 508, Gln 244 and Asp 268 for F6HZK2 (Fig. 2A), and Gln 152, Val 365, Phe 154 and Leu 204 in the case of F6HZK3 (Fig. 2B). On contrast, most of the amino acid residues are located in the favoured region of the plots (81.5% in F6HZK2 and 86.8% in F6HZK3) indicating that they are free of steric interference. Therefore, based on the aforementioned results, it can be confirmed that the 3D models of both grape seed 11S globulins identified by proteomic analysis were satisfactory constructed and optimized. 3.4. Structural analysis of grape seed 11S globulin proteins and stability by molecular dynamics (MD) As for the structural analysis, the two 11S globulins present two disulphide bonds respectively. The presence of this type of bonds is evidenced by the results shown by electrophoresis, specifically under reduced conditions since DTT can reduce the disulphide bonds from protein cystines to cysteine residues. Theoretical results predict that in the case of F6HZK2 there are disulphide bonds to amino acids Cys126- Cys342 and Cys50-Cys 83 while for F6HZK3 to amino acids Cys-31- Cys 64 and Cys327-Cys 107. In addition, the ProtScale server provided a mean hydropathy value (GRAVY) suggesting that 11S globulins may be highly hydrated in aqueous media. In this sense, the lower the overall hydropathy index, the greater the possibility of establishing this type of interaction (Kyte & Doolittle, 1982). For this parameter, the value obtained was −0.626 for the acidic 11S Gb. and −0.719 for the basic 11S Gb. Negative values (kcal⋅mol −1 ) of GRAVY indicate fundamentally F. Chamizo-Gonz´ alez et al. Food Chemistry 386 (2022) 132842 7 hydrophilic proteins. ProtScale hydrophobic analysis revealed that acidic 11S Gb exhibited a maximum of hydrophobicity at amino acid 30 and several amino acid minima corresponding to residues: 237, 238, 239 and 240. Basic 11S Gb exhibited a maximum of hydrophobicity at amino acid 11 and two minima at amino acids 308 and 309. Finally, for flexibility, the Bhaskaran scale was used, which gives flexibility values for each of the amino acids, with variations between 0.340 and 0.540 at acidic 11S Gb and basic 11S Gb suggesting that these are flexible molecules (Gasteiger, Hoogland, Gattiker, Wilkins, Appel and Bairoch, 2005). These results agree to those from grape seed 7S globulin, which is also found hydrated in aqueous solution and is a flexible protein (Chamizo-Gonz´ alez et al., 2021). To assess the stability of the proteins, molecular dynamics (MD) simulations of 1 ns duration at room temperature (298 K) of the two identified 11S globulins were computed. Fig. 3A and 3B for F6HZK2 and F6HZK3, respectively, shows the RMSD values as a function of the time for the polypeptide backbones of each protein conformation with respect to their corresponding initial structure. This parameter was monitored at 300 K. The average values of RMSDs were 0.263 nm (F6HZK2) and 0.250 nm (F6HZK3). At the study temperature, these average values remain stable once the equilibrium state has been reached, around 0.30 nm for acid globulin and 0.25 nm for basic globulin. This fact indicates that the structure is stable along the trajectory. RMSD values versus time for balanced and unbalanced protein (crystal) are plotted on each graph. The subtle differences between the graphs indicate that the structure at the initial time is slightly different from this crystal structure. This is normal as the energy has been minimized and because the position restrictions are not totally perfect. 3.5. Molecular docking of binding and subsite structure analysis AutoDock Vina software (Trott & Olson, 2010) was used to investigate the possible coupling between malvidin 3-glucoside (mv3glc) and the two 11S globulins identified by mass spectroscopy (acidic and basic). Fig. 2. Grape seed 11S globulin homology model ( α helices in red and β sheet in blue) and Ramachandran plot. A) F6HZK2 (acid 11S globulin). B) F6HZK3 (basic 11S globulin). F. Chamizo-Gonz´ alez et al. Food Chemistry 386 (2022) 132842 8 The 3D structure of the F6HZK2 and F6HZK3 11S globulins (obtained by homology modelling) were used as the receptor molecules and mv3glc as ligand. The protein and ligand PDB files were edited using the AutoDock Tools software (Morris et al., 2009). Water molecules and ions were removed from the proteins, Kollman charges and polar hydrogens were added to the protein structures. For the ligand, the glycosidic bond was considered rotational and partial atomic charges in the form of Gasteiger charges were added to the structure. Finally, a grid box was designed to define a ligand–protein interaction space. In our case, the dimensions were made to cover the entire protein. Nine resulting ligand conformations were generated in the protein environment after each run in the AutoDock Vina software. The lowest energy conformation was chosen as the most favourable conformation at the binding site. The lowest binding energy to F6HZK2-mv3glc was −7.6 kcal/mol and −8.1 Kcal/mol to F6HZK3-mv3glc, indicating higher binding affinity between mv3glc and the grape seed basic 11S globulin. Fig. 4 and Fig. 5 shows the most favourable conformation of mv3glc Fig. 3. 11S globulin Molecular Dynamics simulations. RMSD of 11S globulin backbone in aqueous solution. A) F6HZK2 (acid 11S globulin). B) F6HZK3 (basic 11S globulin). F. Chamizo-Gonz´ alez et al. Food Chemistry 386 (2022) 132842 9 when interacts with F6HZK2 and F6HZK3 (respectively), where 3D and 2D illustrations can be seen. For F6HZK2, the side chain atoms of the residue Asn227, Gln235, Gly267 and Arg299 establish hydrogen bonds with the hydroxyl group of the glucose (Glc). There are also interactions by Van der Waals Forces, as shown in Fig. 4C. In the case of the F6HZK3 (Fig. 5C), the side chain atoms of the residue Pro208, Arg210 and Asn219 form hydrogen bonds with the hydroxyl group of the glucose. Also are noteworthy the π - π interactions of the Phe211 residue with mv3glc (binding distance of 5.5 Å), as well as Fig. 4. A) Mv3glc binding site on F6HZK2 (acid 11S globulin). B) More favourable 3D conformation of mv3glc inside of F6HZK2 (acid 11S globulin). Bond distances (Å) are shown in green. C) 2D illustration of mv3glc interacting with F6HZK2 (acid 11S globulin) residues showing the major interactions. Fig. 5. A) Mv3glc binding site on F6HZK3 (basic 11S globulin). B) More favourable 3D conformation of mv3glc inside of F6HZK3 (basic 11S globulin). Bond distances (Å) are shown in green and pink. C) 2D illustration of mv3glc interacting with F6HZK3 (basic 11S globulin) residues showing the major interactions. F. Chamizo-Gonz´ alez et al. Interacción experimental 11SGb-mv3glc RESULTADOS Y DISCUSIÓN 144 glucósido (mv3glc) a pH 3.5, y evaluar el impacto de tal interacción en el color del antociano, así como aplicar técnicas de docking y dinámica molecular para interpretar el mecanismo molecular específico de interacción y complementar los resultados experimentales. Con este objetivo se pretende aportar nuevos indicios que permitan potenciar el uso de las proteínas de semilla de uva en enología. Parte experimental Previamente a los estudios experimentales de la interacción entre la 11SGb de semilla de uva y la mv3glc (principal antociano del vino) y su efecto en el color del pigmento, se realizó en primer lugar la caracterización electroforética de un extracto purificado de globulina 11S, obtenido a partir de harina de semilla de uva industrial con cloruro de sodio 0.5 M y posterior diálisis, siguiendo la metodología descrita en Chamizo-González et al. (2022). En estudios anteriores, no se había realizado la cuantificación de los componentes proteicos del extracto de 11SGb (monómero principal de 60 kDa, y sus respectivas subunidades de 40 y 20 kDa). Sin embargo, esta información cuantitativa puede ser valiosa para futuras aplicaciones de estas proteínas o componentes proteicos, en la industria, por lo que en este estudio se procedió al análisis cuantitativo de las principales bandas mediante densitometría de imagen por comparación con un patrón de albúmina de suero bovino (BSA). Para ello, el análisis electroforético se realizó en condiciones reductoras ya que, de esta manera, se produce la ruptura del enlace disulfuro que une las dos subunidades (40 y 20 kDa) que constituyen el monómero de 60 KDa de la 11SGb. Para la cuantificación de cada banda (expresada como porcentaje, %) se preparó una recta de calibrado con un patrón de BSA (R2=0.950) y los resultados de las bandas se compararon con los obtenidos en el extracto de 11SGb, analizado en las mismas condiciones. Los resultados obtenidos confirmaron que la cantidad de la subunidad ácida (40 kDa), en el extracto purificado de 11SGb, fue de 2.15 ± 0.25 µg y de la subunidad básica (20 kDa) de 1.70 ± 0.12 µg, siendo estas diferencias significativas (p<0.05). Las proporciones para las subunidades ácida y básica correspondieron al 55.8 % y al 44.2 % del contenido total del monómero principal de 11SGb (60 kDa), siendo estos resultados similares a las proporciones descritas para las globulinas 11S en diferentes variedades de soja (Mujo et al., 2003). Interacción experimental 11SGb-mv3glc RESULTADOS Y DISCUSIÓN 145 Con relación a los estudios de interacción proteína-ligando, se calcularon las constantes de unión entre la 11SGb de semilla de uva y mv3glc mediante quenching de fluorescencia, tal y como se ha descrito en estudios previos (Ferrer-Gallego et al., 2016). En concreto, el estudio de fluorescencia se realizó en tampón citrato (0.2 M, pH 3.5, y fuerza iónica ajustada). Los espectros de emisión de fluorescencia se obtuvieron excitando las disoluciones de 11SGb en ausencia y presencia de concentraciones crecientes de mv3glc (de 20 µM a 100 µM) a una longitud de onda de 280 nm y temperatura de 25 °C. Además, se corrigió el correspondiente espectro de mv3glc en las disoluciones proteína-antociano para eliminar efectos no debidos a la formación de los complejos. Los espectros de emisión de fluorescencia de la 11SGb de semilla de uva tuvieron un máximo de emisión sobre 346 nm. Se observó que al aumentar la concentración de mv3glc en las disoluciones de 11SGb, la intensidad de emisión máxima disminuía gradualmente (de un 9 % hasta un 43 %), lo que sugiere que la mv3glc interacciona con la 11SGb, siendo el efecto de quenching observado más notable que el descrito por Casanova et al. (2018) entre la cianidina-3-glucósido y el caseinato de sodio. Para profundizar en el mecanismo de unión entre la 11SGb y la mv3glc, los espectros de fluorescencia se analizaron utilizando las ecuaciones de Stern-Volmer para determinar las constantes de la interacción (KSV y kq). El valor obtenido para la constante KSV fue 7.7x103 M-1 con un nivel de confianza del 99 % y el valor para la constante kq fue 7.7x1011. Como el valor de kq obtenido fue mayor que la constante máxima de extinción dinámica en agua (2x1010 M-1 s-1), se confirmó que la mv3glc interactúa con la 11SGb mediante un mecanismo estático causado predominantemente por la formación de un complejo. Este resultado coincide con los estudios publicados para la interacción entre la cianidina-3-glucósido y la globulina 11S de soja, donde se establece un mecanismo de quenching similar (Chen et al., 2019; Ren et al., 2019; Dumitrascu et al., 2020). Además, se determinó la constante de unión estática (KS) y el número de sitios de unión (n), relacionado con la estequiometría del complejo. Estos parámetros se calcularon con un nivel de confianza del 99 %, obteniendo un valor para kS de 8.5x104 M-1 y n=1.3. Los resultados fueron coherentes con los valores de Interacción experimental 11SGb-mv3glc RESULTADOS Y DISCUSIÓN 146 las constantes de afinidad y los sitios de unión descritos para complejos entre otras proteínas de origen vegetal (soja 11SGb) o animal (caseína) con otros antocianos, donde, en la mayoría de estos complejos, las constantes descritas son del orden de 104 M-1 (Chen et al., 2019; Li et al., 2020). Una vez, demostrado experimentalmente que la mv3glc interacciona con la 11SGb de semilla de uva mediante la formación de un complejo, se procedió a evaluar el efecto de 11SGb sobre el color de mv3glc mediante colorimetría diferencial. Para el estudio colorimétrico, se evaluó la influencia de concentraciones crecientes del extracto de 11SGb (1.5, 2.5 y 5.0 mg/ml) en los parámetros de color CIELAB (L*, a*, b*, C*ab, y hab) de las disoluciones de mv3glc (10-4 M). El estudio de color se realizó en tampón citrato 0.2 M a pH 3.5, con la fuerza iónica ajustada, y 12 % (v/v) de etanol, para simular condiciones similares a las del vino. Las adiciones crecientes del extracto de 11SGb dieron como resultado una ligera disminución de la claridad (L*) y un aumento de los valores de croma (C*ab), indicando que las disoluciones de mv3glc eran progresivamente más oscuras y con un color más intenso. Por tanto, se confirmó que la presencia de 11Gb en las disoluciones de mv3glc producía un ligero desplazamiento del equilibrio antociánico hacia su forma colorada catión flavilio, lo que queda reflejado en el color. Asimismo, se observó una ligera disminución del tono (hab) de las disoluciones hacia valores negativos, es decir, mv3glc exhibe una tonalidad más azulada en presencia de 11SGb. En cuanto a los parámetros CIELAB, se calculó la diferencia de color (ΔE*ab) para cada disolución (Mv3glc sin y con adición creciente de 11SGb) con respecto al color de una referencia acromática como puede ser el agua (L*=100, a*=0, b*=0; máxima claridad y ausencia de croma y tono), lo cual permite cuantificar mediante un valor numérico la cantidad de color que presenta la muestra, es decir, lo que se podría denominar su “Color Total (E)”. Por tanto, a partir de los valores de L*, a*, b* de cada disolución, se calculó su Color Total, con fines comparativos. Se obtuvo que los cambios positivos observados en los parámetros individuales CIELAB concordaban con el incremento gradual del parámetro Color Total (E) de las disoluciones, lo que indica que la 11SGb produce una intensificación global del color de la mv3glc. Interacción experimental 11SGb-mv3glc RESULTADOS Y DISCUSIÓN 147 Tanto para los parámetros CIELAB individuales como para el Color Total, se observó que el efecto de la globulina 11S de semilla de uva en el color de la mv3glc fue significativamente (p<0.05) dependiente de su concentración, es decir, a mayor cantidad de proteína añadida, mayor impacto en el color. Sin embargo, en términos generales, también se observó que las diferencias absolutas de claridad, croma y tono (ΔL*, ΔC*ab y Δhab), calculadas entre las disoluciones que contenían concentraciones crecientes de 11SGB con respecto a la disolución control de mv3glc, fueron pequeñas (ΔL* =-2.4, ΔC*ab = +1.7, y Δhab= -1, para 11SGb a 5 mg/ml). Para establecer si los cambios observados en los parámetros individuales del color de la mv3glc tras la adición de 11SGb podían ser visualmente apreciables, se calcularon las diferencias de color (∆E*ab) entre la disolución control de mv3glc y las mismas disoluciones que contenían concentraciones crecientes de 11SGb. Los resultados obtenidos mostraron que a medida que se añadía mayor cantidad de proteína a la disolución de mv3glc, los valores de ΔE*ab con respecto a la disolución control aumentaban (ΔE*ab= 2.0-3.0), confirmando que el efecto del color se hace más notable en función del contenido proteico. Además, se calcularon y compararon las contribuciones relativas de claridad (%ΔL), croma (%ΔC) y tono (%ΔH) que componen cada diferencia de color (ΔE*ab), con lo que fue posible evaluar qué atributo del color se veía más afectado en función de la concentración de proteína. Se confirmó que la modificación del color de mv3glc se debía principalmente a cambios cuantitativos (%ΔL = 52-60 % y %∆C=33-35 %, a 5.0 mg/ml de proteína) y en menor medida a cambios cualitativos (%∆H =7-13 %, a 5.0 mg/ml de proteína). Los valores de ΔE*ab más altos observados fueron de 3.5 u. CIELAB, a concentración de proteína añadida (5.0 mg/ml) lo que significa una modificación del color apreciable según el umbral de discriminación visual descrito para observadores no entrenados según Martínez, et. al. (2001). De forma complementaria, se llevaron a cabo estudios computacionales con el fin de apoyar las evidencias experimentales observadas para la interacción molecular entre la 11SGb de semilla de uva y la mv3gcl. En particular, se llevó a cabo un estudio de “docking dirigido” entre mv3glc y uno de los monómeros de 11SGb de semilla de uva identificados por espectrometría de masas (F6HZK3, 60 kDa) en un estudio previo (Chamizo et al., 2022). Para ello, se seleccionó específicamente la Interacción experimental 11SGb-mv3glc RESULTADOS Y DISCUSIÓN 148 región hidrofóbica mayoritaria del monómero de la 11SGB (60 kDa), estableciéndola como la región de la proteína más susceptible de interaccionar con la mv3glc (específicamente con el catión flavilio). En este ensayo de docking se utilizó el software AutoDock Vina, que permitió obtener nueve conformaciones posibles de mv3glc en el entorno hidrofóbico seleccionado. Para el análisis de las interacciones se eligió el complejo que implicaba la menor energía (-6.8 Kcal/mol), considerándose como la conformación más favorable en el sitio de unión. En relación con las interacciones no covalentes obtenidas en el análisis computacional entre los residuos de la proteína y la mv3glc, cabe destacar la participación de los aminoácidos Gly 151 y Gln 133, que establecen enlaces por puente de hidrógeno con los grupos hidroxilo de la glucosa y con el anillo A de la mv3glc, respectivamente. Además, el aminoácido aromático Phe153 establece interacciones del tipo π-π e hidrofóbicas de tipo alquilo con los anillos B y C de mv3glc (distancia de enlace 4.1 y 4.4 Å). También son destacables otras interacciones presentes como las fuerzas de Van der Waals que permiten la estabilización del complejo. Estas interacciones hidrofóbicas son similares a las descritas frecuentemente para diferentes asociaciones de copigmentación entre distintos antocianos y copigmentos fenólicos (Trouillas et al., 2016). Finalmente, para evaluar la estabilidad del complejo 11SGb-mv3glc modelizado, se llevó a cabo un estudio de simulación de dinámica molecular durante 10 ns en un sistema solvatado y equilibrado. Además, con fines comparativos, se evaluó también la estabilidad de la 11SGb y mv3glc modelizadas. Uno de los parámetros más utilizados en dinámica molecular para analizar la estabilidad conformacional de un complejo proteína-ligando es el parámetro RMSD, en este caso aplicado a los átomos de carbono α del esqueleto de la proteína. En general, valores bajos de RMSD con fluctuaciones constantes durante el tiempo de simulación indican que el sistema es estable, mientras que valores altos son típicos de sistemas inestables (Wu et al., 2021; Zhao et al., 2022). Los valores de RMSD obtenidos para el complejo 11SGb-mv3glc oscilaron entre 0.20 y 0.50 nm, mostrando pequeñas fluctuaciones. En el caso de la 11SGb libre, los valores de RMSD oscilaron entre 0.2 y 0.65 nm y para la mv3glc libre entre 0.10 y 0.20 nm. Así pues, el complejo 11SGb-mv3glc mostró valores menores de Interacción experimental 11SGb-mv3glc RESULTADOS Y DISCUSIÓN 149 RMSD que los de la proteína libre (11SGb), lo que sugiere que la unión de la mv3glc a la proteína de la semilla de uva mejoró la estabilidad conformacional del sistema. Además, los valores de RMSD más bajos encontrados para la mv3glc libre indican que el pigmento es estable en el sitio de unión de la proteína durante el tiempo de la simulación. También se calculó el número de enlaces de hidrógeno formados entre la 11SGb y la mv3glc, obteniéndose como resultado hasta tres enlaces de hidrógeno establecidos con el pigmento, y un valor medio de dos enlaces en la simulación. Por otro lado, se observó que los principales aminoácidos implicados en la interacción con los grupos hidroxilo del anillo A de la mv3glc mediante enlaces de hidrógeno eran Gln 133 y Glu 82, lo que concuerda con los resultados obtenidos en el docking. Estos resultados sugieren que el residuo Gln 133 de la semilla de uva 11SGb podría tener un papel clave en la estabilización de la mv3gcl. Conclusiones Las principales conclusiones que derivan de los resultados obtenidos son las siguientes: • La subunidad ácida (40 KDa) del monómero 11SGb está implicada en la interacción con la mv3glc, por lo que podría ser un componente proteico de la semilla de uva de especial interés para aplicaciones de protección del color en la industria alimentaria y, en particular, en el sector vinícola. • El efecto de quenching de fluorescencia, en combinación con estudios colorimétricos, confirmó que la 11SGb de la semilla de uva interactúa con la mv3glc mediante un mecanismo de unión estática que contribuye a modular positivamente las características de color del catión flavilio. • La 11SGb ejerce un efecto positivo sobre el color de la mv3glc, que consiste en incrementos de su intensidad cromática y tonalidad azulada dependientes de la concentración de proteína, y que pueden ser considerados ligeramente apreciables visualmente. • Los estudios de modelización molecular apoyaron los resultados experimentales sobre la formación de un complejo 11SGb-mv3glc estable en Interacción experimental 11SGb-mv3glc RESULTADOS Y DISCUSIÓN 150 una zona específica hidrofóbica de la 11SGb, impulsado por fuerzas intermoleculares como enlaces por puente de hidrógeno y de Van der Walls. Food Chemistry 413 (2023) 135591 Available online 31 January 2023 0308-8146/© 2023 Elsevier Ltd. All rights reserved. First insights into the binding mechanism and colour effect of the interaction of grape seed 11S globulin with malvidin 3-O-glucoside by fluorescence spectroscopy, differential colorimetry and molecular modelling Francisco Chamizo-Gonz´ alez a , Ignacio García Est´ evez b , Bel´ en Gordillo a , * , Elvira Manj´ on b , M.T. Escribano-Bail´ on b , Francisco J. Heredia a , M. Lourdes Gonz´ alez-Miret a a Food Colour & Quality Lab., ´ Area de Nutrici´ on y Bromatología, Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla, 41012 Sevilla, Spain b Grupo de Investigaci´ on en Polifenoles, Facultad de Farmacia, Universidad de Salamanca, Campus Miguel de Unamuno, E 37007 Salamanca, Spain ARTICLE INFO Keywords: Grape seed 11S globulin Winemaking by-product Malvidin3-O-glucoside Colour Fluorescence quenching Guided docking ABSTRACT Recently, the search for alternative proteins endogenous to grapes to be used as wine colour protecting agents became an important research trend. In this study, the molecular interaction between the grape seed 11S globulin from winemaking by-product and malvidin-3-O-glucoside was investigated by fluorescence, differential colorimetry and molecular modelling. Fluorescence studies revealed the formation of grape seed proteinpigment complex whose K S was 8.5 ×10 4 M −1 and binding sites, n =1.3. Malvidin-3-O-glucoside showed darker and more vivid bluish colour of in the presence of 11S globulin, suggesting the flavylium cation protection in a hydrophobic region of the protein. Docking analysis and molecular dynamics simulation indicated that malvidin- 3-O-glucoside interacts mainly with the acidic subunit (40 kDa) of the 11S globulin monomer (60 kDa). An average of two hydrogen bonds and Van der Wall forces were the main interaction forces found for the proteinpigment complex, whose stability was confirmed by root-means-square deviation. 1. Introduction Anthocyanins are natural flavonoid pigments responsible for orangered to purple-blue colours in many fruits, vegetables, and derived food products such as wines (Delgado-Vargas, Jim´ enez, & Paredes-L´ opez, 2000). As potent antioxidants, anthocyanins are of great interest for the food industry not only because they impact the sensory quality of foods but also for their multiple health benefits associated with their consumption in the diet (He & Giusti, 2010). In red wines, anthocyanins are the 3-O-monoglucosides of five major anthocyanidins (delphinidin 3-glucoside, cyanidin 3-glucoside, peonidin 3-glucoside, petunidin 3-glucoside, and malvidin 3-glucoside) with malvidin-3-O-glucoside (mv3glc) and their derivatives by far the most abundant pigments contributing for colour (Trouillas et al., 2016). The basic chromophore structure of anthocyanins consists in a flavylium cation that shows a vivid red coloration in very acidic solutions (pH ≤ 1). However, at moderately acid pH values, as those found in wines (3.5–4.2), the flavylium cation is relatively instable and very susceptible to decolouration and degradation against several factors (Pina, Oliveira, & de Freitas, 2015). In wines, its colour stability is affected by pH, anthocyanin chemical structure and concentration, exposure to temperature, oxygen, light, enzymes, and other wine components or additives such as ascorbic acid, sugars, or sulphites, among others (Escribano-Bail´ on, Rivas-Gonzalo, & García-Est´ evez, 2019). In this regard, many winemaking techniques and oenological strategies have been developed to preserve the anthocyanin stability and colour (Sacchi, Linda, Bisson, Douglas, & Adams, 2005; Soto V´ azquez, Río Segade & Orriols Fern´ andez, 2010). Moreover, natural pigment-stabilizing mechanisms exist in wines that protect the coloured flavyliym cation from the nucleophilic attack of water, pH changes, and decolouring agents; mainly copigmentation interactions, but also certain associations with biopolymers including polysaccharides or proteins (Boulton, 2001; Escribano-Bail´ on & Santos-Buelga, 2012; Trouillas et al., 2016; Fernandes et al., 2021). * Corresponding author. E-mail addresses: [email protected] (F. Chamizo-Gonz´ alez), [email protected] (I.G. Est´ evez), [email protected] (B. Gordillo), [email protected] (E. Manj´ on), escriban@ usal.es (M.T. Escribano-Bail´ on), [email protected] (F.J. Heredia), [email protected] (M.L. Gonz´ alez-Miret). Contents lists available at ScienceDirect Food Chemistry journal homepage: www.elsevier.com/locate/foodchem https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2023.135591 Received 22 July 2022; Received in revised form 16 January 2023; Accepted 26 January 2023 Food Chemistry 413 (2023) 135591 2 Over the last years, the researches on interactions between wine pigments and plant proteins have been steadily increasing. This recent approach has provided valuable information on the protection of anthocyanins through the interactions with different protein types contributing to promote their application in the wine industry (Granato, Ferranti, Iametti, & Bonomi, 2018; Marangon, Vincenzi & Curione, 2019; Gordillo, Chamizo-Gonz´ alez, Gonzalez-Miret, & Herdia, 2021). Plant seed-storage proteins include albumins, globulins, gliadins and glutenins fractions of which globulins comprise one the major fraction. Currently, some studies have shown that globulins from different vegetal sources present good functional properties to protect the stability and antioxidant activity of anthocyanin pigments. Li et al. (2020) assessed the complexation characteristics between different rice protein (RP) fractions and black rice anthocyanins (ACN) by fluorescence spectroscopy at pH 3. This study concluded that globulin-ACN complexes stablished strong binding interaction involving the flavylium cation, with quenching constants larger than albumin-ACN complexes due to the more hydrophobic areas of globulins. As well, the globulin- ACN complexes exhibited greater DPPH (1,1-diphenyl-2-pycrylhy- drazyl) and ABTS (2,2-azino-bis 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) radical scavenging in comparison to RP albumin, prolamin and glutelin due to the more flexible and unfolded structure of globulins resulting in a better capability to react with the free radicals. On the other hand, Ren, Xion, and Li (2019) compared the non-covalent binding mechanisms between cyanidin-3-O-glucoside and two main soy protein fractions: β-conglycinin (7S) and glycinin (11S) at pH 3, confirming the formation of spontaneous complexation processes between globulins and the flavylium cation driven by electrostatic forces. In comparison, cyanidin 3-glucoside showed a stronger binding affinity toward 11S globulin owing to more positive charges of 11S than 7S. Similarly, 7S and 11S globulins from soybean have also demonstrated a protective effect on the stability of cyanidin 3-glucoside and to improve its antioxidant capacity in simulated digestions. Again, the effects were stronger with the 11S globulin (Zheng, Zheng, Zhao, Yi, & Shengbao, 2021). Of special interest for the wine industry are proteins endogenous to grape like those obtained from grape seed wine by-products, which have been proposed as a sustainable alternative to the use of other biopolymers subjected to more legal restrictions (i.e. animal origin and synthetics) (Baca-Bocanegra, Nogales-Bueno, Hern´ andez-Hierro, & Heredia, 2021; Gordillo et al., 2021; Mora-Garrido, Cejudo-Bastante, Heredia, & Escudero-Gilete, 2022). At this respect, the 3D structure of 7S and 11S globulins from Vitis vinifera L. grape seed have been elucidated for the first time in our previous studies by combining proteomic and computational techniques (Chamizo-Gonz´ alez, Gordillo, & Heredia, 2021; Chamizo-Gonz´ alez, Heredia, Rodríguez-Pulido, Gonz´ alez-Miret, & Gordillo, 2022). In addition, we have confirmed by means of theoretical studies that both 7S and 11S grape seed globulins could stablish different types of interactions (hydrogen bonding, alkyl and π - π ) with the main grape anthocyanin (mv3glc). However, such as interactions has been scarcely studied and very little is still known concerning the real effect on the colour of wine anthocyanins. Although a basic molecular interaction mechanism similar to copigmentation has been suggested, many questions and experimental evidence remain unclarified for the promising functionality of grape seed globulins. Thus, this work aims to provide an improved understanding of the binding mechanism of the interaction between the major grape seed storage protein (11S globulin, 11SGb) and the major wine pigment (mv3glc) in relation to the effect on the anthocyanin colour. For this purpose, fluorescence quenching in combination with colorimetric studies were carried out in model solution to provide experimental evidence and fundamental information about the molecular interaction (affinity constant and the stoichiometry of the complex) as well as the potential colour effect. Complementary, molecular modelling studies based on directed docking techniques were developed to assess the specific binding site and the interaction forces of the proteinanthocyanin complex. This study is expected to contribute to the potential use of plant proteins endogenous to grape as potential colour protecting agents in wines. 2. Material and methods 2.1. Reagents Malvidin-3-O-glucoside (≥97 %) and Bovine Serum Albumin (BSA, ≥98 %) were purchased from Extrasynthese (Genay, France). SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate–polyacrylamide gel electrophoresis) reagents (Tris-HCl, dithiothreitol: SDS, bromophenol blue, β-mercaptoethanol, glycerol, acrylamide, and bisacrylamide) were purchased from Sigma- Aldrich (Steinheim, Germany). All other chemicals (ethanol, citric acid, sodium citrate, sodium chloride, and trizma hydrochloride) were of analytical grade and supplied by Panreac Química (Barcelona, Spain). 2.2. Extraction of grape seed globulins and purification Seed globulins were extracted from defatted grape seed flour (industrial wine by-product) supplied by ALVINESA Natural Ingredients, S. A. (Daimiel, Ciudad Real, Spain), following the previously described method by Chamizo-Gonz´ alez et al. (2022) with slight modifications. Globulin fraction (salt soluble) was extracted with 0.5 M Sodium chloride (1:10 w/v) with constant stirring for 1 h at room temperature (25 ± 0.2 ◦C). The obtained salt soluble fraction was centrifuged (8000 g for 10 min) and the flour residue was submitted to the same process twice (each stirring for 30 min). The three supernatants were combined, filtered through 0.45 μ m nylon, and dialyzed during 48 h at 4 ◦C against ultrapure water using a Spectra/Por® 1 regenerated cellulose dialysis membrane 6–8 kDa (Spectrum™ Labs.com Europe). The globulin extract obtained (mainly comprised by 11SGb) was freeze-dried (lyophilizer Cryodos-80, Telstar Varian DS 102) and stored at −20 ◦C for further analysis. 2.3. SDS-PAGE analysis of grape seed globulins and quantification of protein subunits by image densitometry The molecular weight and subunit composition of the grape seed globulin extract was analysed under reducing conditions by SDS-PAGE using the Mini-Protean® 3 system (BioRad, Hercules, CA, USA). Four replicates of the SDS-PAGE analysis were carried out as follows: 10 mg of lyophilized protein extract was dissolved in 1 ml of distilled water. Then, 150 µl of the aqueous protein extract was mixed with 50 µl of 0.02 M Tris-HCl loading buffer pH 6.8 (containing glycerol 40 % w/v, SDS 5 % w/v, β-mercaptoethanol 20 %, and 0.01 % Bromophenol Blue). Protein samples were then denatured at 100 ◦C for 5 min. Samples (15 μ l) were loaded into 14 % polyacrylamide gel 1.5 mm (acrylamide:bisacrylamide, 29:1) and electrophoresis was run at constant voltage (170 V) for 50–60 min. Proteins were visualized after incubation with Coomassie staining solution (40 % v/v ethanol, 10 % v/v acetic acid, 50 % distilled water and 0.01 % Coomassie blue R-250 w/v). Subsequently, the gels were decolorized in a solution of 40 % v/v ethanol and 10 % v/v acetic acid while stirring until the bands were adequately visualized. The standard molecular weight proteins (ranging from 20 to 200 kDa) used were the PageRuler ™ unstained protein ladder (Thermo Fisher Scientific Inc., Vilnius, Lithuania). For quantification of 11SGb fraction and their respective subunits the protein bands were analysed by image densitometry as described for other plant proteins (Mujoo, Trinh, & Perry, 2003), using the software GelAnalyzer 2010a (www.GelAnalyzer.com). Gel replicates (n =4) were scanned and the images were digitized and stored until needed for quantitative analysis. The software GelAnalyzer 2010a allows display, store, and analyse electrophoretic patterns covering all the main aspects of gel evaluation from automatic lane detection to background subtraction methods, and calibration. A solution of commercial standard BSA (1 mg/ml) was used as a protein standard for quantification F. Chamizo-Gonz´ alez et al. Food Chemistry 413 (2023) 135591 3 purposes. BSA solutions at increasing concentration (12.5, 25, 50, 100, and 200 µg/ml) was loaded into each gel to obtain a calibration curve to quantify (µg) the different globulin subunits. The proportions (%) of each globulin subunit relative to the sum of the total subunits identified in the respective gel lane were also calculated. 2.4. Fluorescence quenching The interaction between grape seed globulins and mv3glc was investigated using fluorescence quenching measurements. The intrinsic fluorescence of proteins is due to the presence of aromatic amino acids phenylalanine, tyrosine and tryptophan, the latter being predominant in proteins (Lakowicz, 2013). Intrinsic fluorescence of samples was carried out using a fluorescence spectrophotometer Perkin-Elmer LS 55 (Waltham, MA, USA) in 1-cm quartz cuvettes at controlled temperature (25 ◦C ±0.1). In all experiments, proteins and mv3glc stocks solutions were prepared in 0.2 M citrate buffer (pH 3.5) with the ionic strength adjusted with 0.5 M sodium chloride. The mixtures (final volume of 2 ml) were prepared at constant protein concentration (50 μ M, mainly comprised of 11SGb) and increasing concentrations of mv3glc (0–100 μ M). The assay was performed in triplicate. After mixing, the samples were transferred to the fluorimeter cell and the emission spectra were measured. The excitation wavelength was 280 nm and the emission spectrum was recorded between 290 and 450 nm. The excitation and emission slit widths were both 5.5 nm, the scanning speed was 1200 nm/min, and the voltage was 700 v. After each measurement, the cell was washed with ethanol and distilled water. The fluorescence quenching constants were analysed by the Stern- Volmer equation (1) (Wei et al., 2018). F0 F=1+KSV x[Q] = 1+Kqx τ 0x[Q](1) where, F 0 and F were the fluorescence intensities of proteins before and after the addition of the quencher, [Q] is the molar concentration of mv3glc; K SV is the Stern-Volmer quenching constant; K q is the bimolecular quenching rate constant; and τ 0 is the lifetime of the fluorophore in the absence of quencher (10 −8 s) (Wei et al., 2018). From the following Equation (2) it is possible to calculate K q (Rawel, Meidtner, & Kroll, 2005). Kq=Ksv τ 0 (2) When K q is greater than the diffusion-limited maximum extinction constant in water (2 ×10 10 M −1 s −1 ) indicates that static, and not dynamic, quenching was the main quenching mechanism (Casanova et al., 2018). In this circumstance the Stern-Volmer Eq. (1) is modified to the double logarithmic Stern-Volmer Eq. (3), where K S represents the “static quenching constant” (Lakowicz, 2013): log (F0−F) F=logKS+nlog[Q](3) Thus, for the static extinction mechanism, the number of binding sites n and the static quenching constant K S can also be determined by linear regression from a plot of log (F 0 −F/F) as a function of [Q]. The slope of the double logarithmic Stern-Volmer Eq. (3) represents the number of binding sites n and the intersection represents the binding constant. 2.5. Colour analysis by differential tristimulus colorimetry The effect of grape seed globulins on the colour of mv3glc was assessed in model solutions prepared in 0.2 M citrate buffer (12 % ethanol at pH 3.5) with the ionic strength adjusted with 0.5 M sodium chloride. Mixtures of anthocyanin/protein solutions were prepared by adding aliquots of 11SGb extracts (10 mg/ml) to mv3gl solutions (10 −4 M) at three protein concentration levels (1.5, 2.5 and 5 mg/ml). A solution of mv3glc at the same concentration without protein addition was prepared as control sample. The low pigment concentration used in all the solutions (10 −4 M) was intended to minimize self-association effects and to evaluate any effect of seed protein on mv3glc colour without interference (Fernandes, Br´ as, Oliveira, Mateus, & De Freitas, 2016). All solutions were prepared in triplicate (n =12), stored closed in darkness at 25 ◦C and left to equilibrate for 30 min before spectroscopic measurements. The absorption spectra (380–770 nm) of samples were recorded at constant intervals (Δλ =2 nm) with a plate reader spectrophotometer (Synergy HTX, Bio-Tek, Winooski, VT). The absorbance spectra of mv3glc solutions were corrected in the visible range by the absorbance spectra of 11SGb solutions at increasing concentrations to avoid any interference in the measurement of the colour effect of grape seed proteins (Fig. S2). CIELAB parameters were calculated from the absorption spectra by using the original software CromaLab© (Heredia, ´ Alvarez, Gonz´ alez-Miret, & Ramírez, 2004) following the recommendations of the Commission International de L’Eclariage: the CIE 1964 10◦Standard Observer and the Standard Illuminant D65 (CIE, 2004). CIELAB parameters calculated were: L* (the correlate of lightness; ranging from 0, black, to 100, white), and two colour coordinates, a* (which takes positive values for reddish colours and negative values for greenish ones) and b* (positive for yellowish colours and negative for the bluish ones). From the a* and b* coordinates, other colour parameters are defined: the hue angle (h ab , the correlate of chromatic tonality), and the chroma (C* ab , the correlate of saturation). The colour variations induced by grape seed globulins on mv3gcl colour was assessed by Differential Tristimulus Colorimetry according to the methodology described in Gordillo et al. (2015), which is based on the application of diverse colour difference formulas by using the scalar (L*, a*, b*) and cylindrical (L*, C* ab , h ab ) CIELAB colour parameters. First, colour-differences between mv3glc solutions and the same solutions containing increasing concentrations of grape seed 11SGb (1.5, 2.5, and 5.0 mg/ml) was calculated by applying the CIE76 colour difference formulae: ΔE* ab =[(ΔL*) 2 +(Δa*) 2 +(Δb*) 2 ] 1/2 . Moreover, the colour difference (ΔE* ab ) calculated between each solution (L*, a* and b*) with respect to distilled water (L* =100, a* =0, b* =0; as an achromatic reference) was referred as its “Total Colour” (named E = [(L* - 100) 2 +(a* - 0) 2 +(b* - 0) 2 ] 1/2 ). In this way, the Total Colour (E) of mv3glc solutions in absence and presence of grape seed 11SGb were compared. In order to assess the trend of the colour changes in mvglc solutions due to the effect of grape seed 11SGb, the absolute lightness, chroma and hue difference was calculated by pair of samples (ΔL*, ΔC* ab , Δh ab ). Also, the weight of the threecolour attributes for a given colour difference was calculated as the relative contribution of the lightness, chroma, and hue that make up the colour difference parameter (ΔE* ab ), as follows: - Relative contribution (%) of lightness: %ΔL =[(ΔL*) 2 /(ΔE* ab ) 2 ] × 100 - Relative contribution (%) of chroma: %ΔC =[(ΔC* ab ) 2 /(ΔE* ab ) 2 ] × 100 - Relative contribution (%) of hue: %ΔH =[(ΔH) 2 /(ΔE* ab ) 2 ] ×100, being ΔH mathematically deduced from: ΔH =[(ΔE* ab ) 2 - ((ΔL) 2 + (ΔC) 2 )] 1/2 . 2.6. Guided docking study between grape seed 11SGb and mv3glc Guide docking refers to docking approaches that incorporate some degree of chemical information to actively guide the orientation of the ligand into the binding site (Fitzjohn & Bates, 2003). In our previous study (Chamizo-Gonz´ alez et al., 2022), coupling assays using the AutoDock Vina software allowed predicting the putative binding of mv3glc with two grape seed 11SGb (F6HZK2 and F6HZK3), recently F. Chamizo-Gonz´ alez et al. 256 Kyte, J., & Doolittle, R. F. (1982). A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. Journal of Molecular Biology, 157(1), 105 –132. Lakowicz, J. R. (2013). Principles of fluorescence spectroscopy. Springer science & business media. Lawrence, M. C., Izard, T., Beuchat, M., Blagrove, R. J., & Colman, P. M. (1994). Structure of phaseolin at 2· 2 A resolution: implications for a common vicilin/legumin structure and the genetic engineering of seed storage proteins. Journal of molecular biology, 238(5), 748- 776. Le Bourvellec, C., & Renard, C. M. (2012). Interac tions between polyphenols and macromolecules: Quantification methods and mechanisms. Critical reviews in food science and nutrition, 52(3), 213-248. Leman, J.K., Weitzner, B.D., Lewis, S.M. et al. Macromolecular modeling and design in Rosetta: recent methods and frameworks. Nat Methods 17, 665–680 (2020). Lemkul, J. (2018). 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