Extração de celulose com vista à produção de compostos antimicrobianos: síntese, caracterização e aplicações
Abstract
O processamento da celulose gera um grande volume de resíduos, com bilhões de toneladas de biomassa ao ano. A destinação destes, é uma das problemáticas ambientais que precisa ser tratada como um dos grandes desafios a serem solucionados. Em paralelo a isto, o emprego de recursos renováveis no desenvolvimento de novos materiais tem atraído a atenção de pesquisadores em todo o mundo, devido ao impacto ambiental a ser mitigado, a disponibilidade limitada de recursos naturais, o aumento da tecnologia empregada, e ainda a busca crescente por alternativas de recursos renováveis para aumentar a eficiência destas cadeias produtivas. Nesse contexto, devido à sua versatilidade química e estrutural, a celulose pode ser empregue para obtenção de novos materiais funcionais e inteligentes, pois a sua modificação química pode atribuir propriedades de interesse e ampliar sua aplicabilidade, de modo a inserir este recurso no contexto do desenvolvimento sustentável. Portanto, este projeto de dissertação objetivou o desenvolvimento de celulose modificada com propriedades antimicrobianas, sua síntese, caracterização e possíveis aplicações. Foram utilizados como pontos de partida para as reações químicas: celulose proveniente de resíduos (obtida e caracterizada neste trabalho), celulose regenerada, celulose comercial, nano-alfa celulose e carboximetilcelulose. Recorreu-se a três diferentes mecanismos de modificação química: esterificação para obtenção de aminocelulose, esterificação com recurso a lactamas e quaternização da celulose, a partir dos quais, foram obtidos dois derivados de celulose solúvel em água, um catiónico (16) e outro Zwitteriónico (36). As celuloses modificadas foram estudadas com o uso de técnicas de FTIR-ATR, análise elementar, análise termogravimétrica, espalhamento de luz eletroforética e ainda foi avaliada a capacidade antimicrobiana, que permitiram conhecer melhor a influência da modificação química nas propriedades da mesma. Este trabalho permitiu a obtenção de celulose microcristalina a partir de resíduos celulósicos e sua respetiva esterificação, com propriedades antimicrobianas.
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Jiullie Delany Bastos Monteiro Junho de 2022 UMinho | 2022 Jiullie Delany Bastos Monteiro Extração de celulose com vista à produção de compostos antimicrobianos: síntese, caracterização e aplicações Universidade do Minho Escola de Ciências Extração de celulose com vista à produção de compostos antimicrobianos: síntese, caracterização e aplicações
Jiullie Delany Bastos Monteiro Extração de celulose com vista à produção de compostos antimicrobianos: síntese, caracterização e aplicações Dissertação de Mestrado Biofísica e Bionanossistemas Trabalho efetuado sob a orientação de Professora Doutora Andreia Ferreira Castro Gomes e Mestre Catarina Dias Costa Universidade do Minho Escola de Ciências Junho de 2022
ii Direitos de autor e condições de utilização do trabalho por terceiros Este é um trabalho académico que pode ser utilizado por terceiros desde que respeitadas as regras e boas práticas internacionalmente aceites, no que concerne aos direitos de autor e direitos conexos. Assim, o presente trabalho pode ser utilizado nos termos previstos na licença abaixo indicada. Caso o utilizador necessite de permissão para poder fazer um uso do trabalho em condições não previstas no licenciamento indicado, deverá contactar o autor, através do Repositório UM da Universidade do Minho. Licença concedida aos utilizadores deste trabalho Atribuição CC BY
iii Agradecimentos Aprender é sobretudo saber pensar, para além da lógica retilínea e evidente, porque nem o conhecimento é reto, nem a vida é caminho linear (Norretranders, 1998). Como dito por Habermas (1988) “entre teoria e prática há o mundo da vida”, nesse sentido deixo aqui um agradecimento a todas as pessoas que direta e indiretamente contribuíram para o desenvolvimento deste trabalho e para o meu crescimento científico e pessoal. À minha família, pelo suporte, carinho e amor sempre; aos amigos pela motivação. Á minha Mãe Marcilene e aos meus companheiros de vida Élida e Pedro por toda a compreensão, paciência, carinho, apoio e incentivo, vocês foram essenciais para a superação das adversidades; Às minhas orientadoras pela contribuição sem a qual este trabalho não teria sido possível. À Catarina Dias Costa e ao Nuno Azoia, por todo acompanhamento, disponibilidade, ensinamentos, paciência e compreensão. À Professora Andreia Gomes e ao Mário Fernandes pela disponibilidade, acolhida e partilha de conhecimentos. Ao Centro de Nanotecnologia e Materiais Técnicos, Funcionais e Inteligentes (CeNTI), pela recção e oportunidade; E a todos os seus colaboradores e pesquisadores pelo acolhimento. Á Universidade do Minho, ao departamento de biologia, ao Centro de Biologia Molecular e Ambiental (CBMA) e ao Instituto de Ciência e Inovação para a Bio-Sustentabilidade da Universidade do Minho (IB-S) pelo apoio. Aos meus colegas de estágio e laboratório. Este trabalho é o resultado da confiança e da colaboração de cada um de vocês. “O sucesso não teria sido atingido se não tivéssemos pessoas capazes construindo nossos projetos”.
iv Declaração de integridade Declaro ter atuado com integridade na elaboração do presente trabalho académico e confirmo que não recorri à prática de plágio nem a qualquer forma de utilização indevida ou falsificação de informações ou resultados em nenhuma das etapas conducente à sua elaboração. Mais declaro que conheço e que respeitei o Código de Conduta Ética da Universidade do Minho.
v Extração de celulose com vista à produção de compostos antimicrobianos: síntese, caracterização e aplicações Resumo O processamento da celulose gera um grande volume de resíduos, com bilhões de toneladas de biomassa ao ano. A destinação destes, é uma das problemáticas ambientais que precisa ser tratada como um dos grandes desafios a serem solucionados. Em paralelo a isto, o emprego de recursos renováveis no desenvolvimento de novos materiais tem atraído a atenção de pesquisadores em todo o mundo, devido ao impacto ambiental a ser mitigado, a disponibilidade limitada de recursos naturais, o aumento da tecnologia empregada, e ainda a busca crescente por alternativas de recursos renováveis para aumentar a eficiência destas cadeias produtivas. Nesse contexto, devido à sua versatilidade química e estrutural, a celulose pode ser empregue para obtenção de novos materiais funcionais e inteligentes, pois a sua modificação química pode atribuir propriedades de interesse e ampliar sua aplicabilidade, de modo a inserir este recurso no contexto do desenvolvimento sustentável. Portanto, este projeto de dissertação objetivou o desenvolvimento de celulose modificada com propriedades antimicrobianas, sua síntese, caracterização e possíveis aplicações. Foram utilizados como pontos de partida para as reações químicas: celulose proveniente de resíduos (obtida e caracterizada neste trabalho), celulose regenerada, celulose comercial, nano-alfa celulose e carboximetilcelulose. Recorreu-se a três diferentes mecanismos de modificação química: esterificação para obtenção de aminocelulose, esterificação com recurso a lactamas e quaternização da celulose, a partir dos quais, foram obtidos dois derivados de celulose solúvel em água, um catiónico (16) e outro Zwitteriónico (36). As celuloses modificadas foram estudadas com o uso de técnicas de FTIR-ATR, análise elementar, análise termogravimétrica, espalhamento de luz eletroforética e ainda foi avaliada a capacidade antimicrobiana, que permitiram conhecer melhor a influência da modificação química nas propriedades da mesma. Este trabalho permitiu a obtenção de celulose microcristalina a partir de resíduos celulósicos e sua respetiva esterificação, com propriedades antimicrobianas. Palavras-chave: celulose catiónica; celulose Zwitteriónica; esteres de celulose; modificação química;
vi Cellulose extraction to produce antimicrobial compounds: synthesis, characterization, and applications Abstract Cellulose processing generates a large volume of waste, with billions of tons of biomass per year. The destination of these is one of the environmental problems that need to be addressed as one of the great challenges to be solved. In parallel to this, the use of renewable resources in the development of new materials has attracted the attention of researchers around the world, due to the environmental impact to be mitigated, the limited availability of natural resources, the increase in the technology used, and the growing search for alternative renewable resources to increase the efficiency of these production chains. In this context, due to its chemical and structural versatility, cellulose can be used to obtain new functional and intelligent materials, since its chemical modification can attribute properties of interest and expand its applicability, to insert this resource in the context of development sustainable. Therefore, this dissertation project aimed at the development of modified cellulose with antimicrobial properties, its synthesis, characterization, and possible applications. They were used as starting points for chemical reactions: cellulose from waste (obtained and characterized in this work), regenerated cellulose, commercial cellulose, nano-alpha cellulose and carboxymethyl cellulose. Three different chemical modification mechanisms were used: esterification to obtain aminocellulose, esterification using lactams and cellulose quaternization, from which two water-soluble cellulose derivatives were obtained, one cationic (16) and the other Zwitterionic (36). The modified celluloses were studied using techniques the FTIR-ATR, elemental analysis, thermogravimetric analysis, electrophoretic light scattering, and the antimicrobial capacity was also evaluated, which allowed a better understanding of the influence of chemical modification on its properties. This work made it possible to obtain microcrystalline cellulose from cellulosic residues and its respective esterification, with antimicrobial properties. Keywords: chemical modification; cationic cellulose; cellulose esters; Zwitterionic cellulose.
vii Índice Geral Direitos de autor e condições de utilização do trabalho por terceiros ........................ ii Agradecimentos ......................................................................................................... iii Resumo ....................................................................................................................... v Abstract ..................................................................................................................... vi Índice Geral .............................................................................................................. vii Lista de siglas e abreviatura ...................................................................................... xi Lista de Figuras ....................................................................................................... xiv Lista de Tabelas ..................................................................................................... xviii Prefácio ..................................................................................................................... 1 Apresentação das entidades de acolhimento ............................................................. 1 Centro de Nanotecnologia e Materiais Técnicos, Funcionais e Inteligentes (CeNTI) .. 1 Centro de Biologia Molecular e Ambiental (CBMA) ........................................................................ 1 Objetivos do trabalho ................................................................................................................... 2 I. Introdução ........................................................................................................ 4 1. Resíduos celulósicos e a importância da Sustentabilidade .............................................. 4 2. Celulose ........................................................................................................................ 6 2.1. Hidrólise Ácida ............................................................................................................ 10 2.2. Modificação química da celulose ................................................................................. 12 2.2.1. Carboximetilcelulose (CMC) ......................................................................................... 13 2.2.2. Celulose Catiónica ....................................................................................................... 14 2.2.2.1. Lactamas ................................................................................................................. 15 2.2.2.2. Cloreto de Glicidiltrimetilamónio (CHPTAC)................................................................ 17 2.2.2.3. AminoCelulose .......................................................................................................... 19
xiv Lista de Figuras Figura 1 – Unidade de repetição de cadeia única de celulose (celobiose), mostrando a direcionalidade da ligação 1 → 4 e ligação de H intracadeia (linha pontilhada) (Moon et al., 2011). ....................................................... 6 Figura 2 – Local específico, natureza anfifílica na estrutura química da celulose (adaptado de Kondo, 2007).. 7 Figura 3 – Estrutura esquemática do polímero celulose, mostrando as ligações glicosídicas e as interações de hidrogénio intra e inter cadeias presentes (Pinto, 2019). ................................................................................ 8 Figura 4 – Arquitetura morfológica da celulose, desde a microfibrila até a cadeia de celulose (Pinto, 2019). ... 9 Figura 5 – (a) Modelo Fibrilar Franjado. Regiões cristalinas e amorfas; (b) Organização esquemática de domínios cristalinos e amorfos em fibra de celulose (Mariano et al., 2014). .................................................................. 9 Figura 6 – Esquema hipotético do processo de pré-tratamento com ácido diluído para isolar os domínios cristalinos da celulose das regiões amorfas. Adaptado de (Tayeb & Tayeb, 2019). ....................................... 11 Figura 7 – Representação esquemática da introdução do grupo carboximetilo no anel de glucopiranose, com R=H ou CH2COO-Na+. ................................................................................................................................... 14 Figura 8 – Representação esquemática da conversão de álcoois (R – OH) com N -metil-2-pirrolidona na presença de cloreto de ácido ptoluenossulfónico (TsCl) para produzir grupo amino. Adaptado de Zarth et al., (2011).17 Figura 9 – Formação de celulose aniónica e conversão de CHPTAC em EPTAC (Correia et al., 2020). ......... 18 Figura 10 – Reação de celulose com EPTAC em solução alcalina (Correia et al., 2020). ............................... 18 Figura 11 – Esquema de via geral da estrutura de um novo tipo de amino celulose solúvel (Heinze et al., 2016). ................................................................................................................................................................... 20 Figura 12 – Etapas da extração de celulose, (1) Resíduos celulósicos em acido sob refluxo; (2) Arrefecimento; (3) Lavagem e filtração da celulose e (4) celulose em pó após secagem a temperatura ambiente. ................ 28 Figura 13 – Conversão de celulose com lactamas na presença de TsCl para obter ésteres de celulose catiónicos. Adaptado de Zarth et al., 2011. ................................................................................................................... 31 Figura 14 – (1, 2) Foto da realização de viscosimetria capilar, usando o viscosímetro de tubo em U Ubbelohde e (3) foto das soluções de celulose diluídas. ................................................................................................ 36 Figura 15 – Passo a passo ilustrativo do protocolo de MIC e MBC. (Adaptado de Pharma, n.d.). .................. 40 Figura 16 – Passo a passo ilustrativo do protocolo de MBIC. (Adaptado de Pharma, n.d.). ........................... 41 Figura 17 – Micrografias obtidas utilizando microscópio eletrônico de varrimento da celulose A. Cujas magnificações são (A1 e A2) 10000 x, (A3, A4 e B1) 2500 x, (B2) 500 x e (B4) 250 x; ................................ 43
xv Figura 18 – Espectros FTIR das diferentes fontes de celulose utilizadas. ...................................................... 44 Figura 19 – Termograma da celulose A. ...................................................................................................... 46 Figura 20 – Espetros de FTIR da celulose A e seus derivados, CMC e zwitteriónico (36). .............................. 51 Figura 21 – Espetros de FTIR da celulose A e seu derivado quaternizado (16). ............................................. 52 Figura 22 – Termograma comparativo da celulose A, celulose catiónica (16) e celulose (36). ....................... 53 Figura 23 – Potencial Zeta das amostras de celulose catiónica (16) e zwitteriónica (36). .............................. 54 Figura 24 – Micrografias de microscopia eletrónica de varrimento de celulose catiónica (16). Cujas magnificações são (A1, B1 e C1) 10000x, (A2, B2 e C2) 2500 x, (A3, B3 e C3) 1000x, (A4, B4 e C4) 500x; ................................................................................................................................................................... 55 Figura 25 – MIC da CMC, do derivado catiónico (16) e zwitteriónica (36) para Staphylococcus aureus. ........ 58 Figura 26 – MIC da celulose E (CMC), do derivado catiónico (16) e zwitteriónica (36) para Escherichia coli. . 59 Figura 27 – MIC da celulose E, do derivado catiónico (16) e zwitteriónico (36) para Pseudomonas aeruginosa. ................................................................................................................................................................... 60 Figura 28 – Fotos das placas do ensaio MBC para a celulose quaternizada (16). ......................................... 60 Figura 29 – Fotos das placas do ensaio MBC para a celulose zwitteriónica (36). .......................................... 61 Figura 30 – Fotos das placas do ensaio MBC para a carboximetilcelulose (Celulose E). ................................ 61 Figura 31 – MBIC da CMC, do derivado catiónico (Q16) e zwitteriónica (36) para Staphylococcus aureus. .... 62 Figura 32 – MBIC da CMC, do derivado catiónico (16) e zwitteriónico (36) para Pseudomonas aeruginosa. .. 63 Figura 33 – Gráfico de viscosidade reduzida, celulose A............................................................................... 78 Figura 34 – Micrografias de celulose A obtidas por microscopia ótica, com magnificações 10 x e 20 x. ........ 79 Figura 35 – Micrografias de celulose A obtidas por microscopia eletrónica de varrimento, com magnificações 250 x e 1000 x. .......................................................................................................................................... 79 Figura 36 – Micrografias de celulose A obtidas por microscopia eletrónica de varrimento, com magnificações 5000 x e 2500 x. ........................................................................................................................................ 80 Figura 37 – Micrografias de celulose catiónica (16) obtidas por microscopia eletrónica de varrimento, com magnificações 80 x e 10000 x..................................................................................................................... 80 Figura 38 – Micrografias de celulose catiónica (16) obtidas por microscopia eletrónica de varrimento, com magnificações 5000 x e 1000 x. ................................................................................................................. 81 Figura 39 – Micrografias de celulose catiónica (16) obtidas por microscopia eletrónica de varrimento, com magnificações 2500 x e 5000 x. ................................................................................................................. 81
xvi Figura 40 – Espetro experimental de TGA para a amostra de celulose A, com derivada. ............................... 82 Figura 42 – Espetro experimental de DSC para a amostra de celulose A, aquecimento. ............................... 83 Figura 44 – Espetros de FTIR da celulose A e seu derivado nº 03. ............................................................... 84 Figura 45 – Espetros de FTIR da celulose A e seu derivado nº 05. ............................................................... 84 Figura 46 – Espetros de FTIR da celulose A e seu derivado nº 06. ............................................................... 85 Figura 47 – Espetros de FTIR da celulose A e seu derivado nº 07. ............................................................... 85 Figura 48 – Espetros de FTIR da celulose A e seu derivado nº 08. ............................................................... 86 Figura 49 – Espetros de FTIR da celulose A e seu derivado nº 09. ............................................................... 86 Figura 50 – Espetros de FTIR da celulose A e seu derivado nº 10. ............................................................... 87 Figura 51 – Espetros de FTIR da celulose A e seu derivado nº 11. ............................................................... 87 Figura 52 – Espetros de FTIR da celulose A e seu derivado nº 13. ............................................................... 88 Figura 53 – Espetros de FTIR da celulose A e seu derivado nº 15. ............................................................... 88 Figura 54 – Espetros de FTIR da celulose A e seu derivado nº 17. ............................................................... 89 Figura 55 – Espetros de FTIR da celulose A e seu derivado nº 18. ............................................................... 89 Figura 56 – Espetros de FTIR da celulose A e seu derivado nº 19. ............................................................... 90 Figura 57 – Espetros de FTIR da celulose A e seu derivado nº 20. ............................................................... 90 Figura 58 – Espetros de FTIR da celulose E e seu derivado nº 21. ............................................................... 91 Figura 59 – Espetros de FTIR da celulose E e seu derivado nº 23. ............................................................... 91 Figura 60 – Espetros de FTIR da celulose A e seu derivado nº 28. ............................................................... 92 Figura 61 – Espetros de FTIR da celulose D e seu derivado nº 29. ............................................................... 92 Figura 62 – Espetros de FTIR da celulose E e seu derivado nº 30. ............................................................... 93 Figura 63 – Espetros de FTIR da celulose C e seu derivado nº 32. ............................................................... 93 Figura 64 – Espetros de FTIR da celulose E e seu derivado nº 33. ............................................................... 94 Figura 65 – Espetros de FTIR da celulose E e seu derivado nº 36. ............................................................... 94 Figura 66 – Espetros de FTIR da celulose A e seus derivados tosilcelulose nº 12 e aminocelulose I (14)....... 95 Figura 67 – Espetros de FTIR da celulose A e seus derivados tosilcelulose nº 25 e aminocelulose II (27). ..... 95 Figura 68 – Espetros de FTIR da celulose A e seus derivados tosilcelulose nº 12 e 25 e aminocelulose I (14) e II (27). ........................................................................................................................................................ 96 Figura 69 – MIC da CMC, do derivado catiónico (16) e zwitteriónica (36) para Staphylococcus aureus. ........ 96
xvii Figura 70 – MIC da celulose E, do derivado catiónico (16) e zwitteriónico (36) para Pseudomonas aeruginosa. ................................................................................................................................................................... 97 Figura 71 – MIC da celulose E (CMC), do derivado catiónico (16) e zwitteriónica (36) para Escherichia coli. . 97
xviii Lista de Tabelas Tabela 1 – Lista geral de reagentes. ............................................................................................................ 26 Tabela 2 – Pureza, massa molar e estrutura química do agente de modificação usados nas modificações químicas. .................................................................................................................................................... 27 Tabela 3 – Culturas celulares e bactérias utilizadas. .................................................................................... 28 Tabela 4 – Resultados da análise de viscosimetria, cálculo de massa molar e grau de polimerização (DP). ... 45 Tabela 5 – Percentagem de cristalinidade das celuloses extraídas A e B. ..................................................... 47 Tabela 6 – Condições e proporções das reações realizadas com lactamas, bem como dados referentes a sua solubilidade em água. ................................................................................................................................. 49 Tabela 7 – Resultados de análise elementar para a celuloses funcionalizadas. ............................................. 56 Tabela 8 – Valores de MIC e MBC para a celulose E e para os derivados catiónico (16) e zwitteriónico (36). 58 Tabela 9 – Resultados de BMIC para a celulose E e para os derivados obtidos. ............................................ 62 Tabela 10 – Cálculos de tempo de escoamento médio de soluções de celulose em diferentes concentrações para a amostra Celulose A. ......................................................................................................................... 77 Tabela 11 – Densidade de soluções de celulose em diferentes concentrações para a amostra Celulose A. ... 77 Tabela 12 – Cálculo de viscosidade, massa molar e grau de polimerização da amostra de Celulose A. ......... 77 Tabela 13 – Constantes utilizadas no cálculo de viscosidade. ...................................................................... 78 Tabela 14 – Cálculo de cristalinidade das celuloses A e B. ........................................................................... 83
1 Prefácio Apresentação das entidades de acolhimento Centro de Nanotecnologia e Materiais Técnicos, Funcionais e Inteligentes (CeNTI) O trabalho desenvolvido no âmbito deste estágio foi realizado no CeNTI, que se trata de um centro de investigação e de transferência de tecnologia sem fins lucrativos, com sede em Portugal, localizado em Vila Nova de Famalicão. Este foi fundado em 2006, como resultado de uma parceria estreita de 3 Universidades, 2 Centros Tecnológicos e 1 Instituto de Novas Tecnologias, todos reconhecidos pela sua relevância nacional e internacional: a Universidade do Minho, a Universidade do Porto, a Universidade de Aveiro, o CITEVE (Centro Tecnológico das Indústrias Têxtil e do Vestuário de Portugal), o CTIC (Centro Tecnológico das Indústrias do Couro), e o CEIIA (Centro para a Excelência e Inovação na Indústria Automóvel). A equipa de investigação do CeNTI dedica-se ao estudo e desenvolvimento de novos produtos nas áreas de nanotecnologia e materiais inteligentes, com enfoque na transferência de tecnologia e criação de produtos de valor acrescentado para o mercado. O trabalho desenvolvido no âmbito desta dissertação enquadra-se em projetos de I&D do CeNTI. Tendo em conta que todos os projetos de I&D e Inovação desenvolvidos no CeNTI são executados de forma a não colocar em causa os direitos de propriedade intelectual referentes aos resultados obtidos, a informação apresentada neste relatório poderá estar condicionada. Centro de Biologia Molecular e Ambiental (CBMA) Parte do trabalho realizou-se no Centro de Biologia Molecular e Ambiental, que é uma Unidade de Investigação da Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), criada em 2008 e sediada no Campus de Gualtar em Braga, Portugal, com instalações no Edifício da Escola de Ciências da Universidade do Minho e no Instituto de Ciência e Inovação para a Bio-Sustentabilidade da Universidade do Minho (IB-S). A missão do CBMA é proporcionar excelência na investigação e formação pós-graduada em Ciências Biológicas, promovendo a literacia científica e a transferência de conhecimento aos stakeholders a nível nacional e internacional. Sua equipa é composta por pesquisadores e alunos de doutorado e mestrado, que desenvolvem investigação orientada para a resolução de problemas, criação de novas ferramentas e estratégias, com impacto nos setores ambiental, biotecnológico, saúde, agroalimentar e industrial. Ao abordar a complexidade dos sistemas biológicos a diferentes níveis de organização, das moléculas à biosfera, a investigação realizada no CBMA permite uma abordagem holística para tratar de questões de biossustentabilidade, que abrangem diferentes perspetivas da biodiversidade.
2 Objetivos do trabalho Este projeto de dissertação teve por objetivo geral a investigação e o desenvolvimento de celulose modificada com propriedades antimicrobianas, sua síntese, caracterização e possíveis aplicações. Para atingir o objetivo geral, este projeto dividiu-se em objetivos específicos: • Extração de celulose microcristalina a partir de resíduos celulósicos da indústria portuguesa, sua respetiva caracterização em termos de grau de polimerização e cristalinidade, através de técnicas como microscopia, DSC (Calorimetria Exploratória Diferencial), FTIR (Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier) e viscosimetria. • Modificação química da celulose extraída, por diferentes vias de reação química. • Caracterização físico-química e microbiológica dos derivados sintetizados identificados como mais promissores relativamente às suas propriedades antimicrobianas e solubilidade em água;
3 I. Introdução
4 I. Introdução 1. Resíduos celulósicos e a importância da Sustentabilidade A industrialização deu-se a partir da revolução industrial devido às inovações tecnológicas, a produção que antes era lenta, pouco intensiva e com baixo volume, deu lugar a uma nova lógica de mercado com produção em larga escala, o que tornou os impactos do processo produtivo no ambiente muito mais intensos. As mudanças significativas provocadas por esta revolução tecnológica e pela lógica de mercado linear que foi instaurada, marcou o processo produtivo, pois a cadeia de bens e serviços interage com o meio ambiente, sobretudo, durante as entradas e saídas de matéria e energia (Foster et al., 2016). O modelo de produção linear, em que se extrai a matéria-prima, e produz-se um bem, e este é consumido e em seguida descartado, gera um grande volume de resíduos e rejeitos, ou seja, há dissipação de energia ao longo do processo produtivo. Esse modelo de produção pressupõe a depleção contínua de recursos naturais e também se caracteriza pelo descarte acelerado e precoce dos bens consumidos. Assim, como consequência do aumento da produção e do consumo ocorre o aumento da extração de recursos naturais e da deposição de resíduos, provenientes do processo produtivo e do pós-consumo (Foster et al., 2016). Esta lógica industrial encontra-se ameaçada, devido à disponibilidade limitada de recursos naturais ao longo do tempo e aos efeitos adversos na cadeia produtiva e no ambiente. Portanto, um dos maiores desafios do século XXI é a inovação de produtos, serviços, sistemas produtivos e modelos de negócio, a partir de um novo paradigma de sustentabilidade para gerar crescimento económico, bem-estar social e restauração ecológica dentro dos limites dos ecossistemas (Leitão, 2015). Nesse cenário, tornam-se cada vez mais necessários modelos de produção voltados aos ideais de sustentabilidade, que se insiram no âmbito da economia circular 1 . Diante do uso abusivo dos recursos naturais, este modelo permite repensar as práticas económicas da sociedade atual e inspira-se no funcionamento da própria natureza, buscando ser capaz de neutralizar os desequilíbrios que atualmente se acumulam entre a oferta e a demanda destes (EMF, 2013). Deste modo, é essencial um adequado planeamento de produtos e processos por meio de ações que resultem no prolongamento da vida útil daquilo que será produzido ou ainda que sejam voltadas 1 A Economia Circular base-se no princípio de “fechar o ciclo de vida” dos produtos, o que permite a redução no consumo de matérias-primas, energia e água, ou seja, atua como fonte de inovação, além de permitir a redução da procura de recursos naturais com a recuperação de desperdícios e resíduos (Leitão, 2015).
5 ao reprocessamento de subprodutos para a sua reintegração à cadeia de produção, de modo a aumentar o ciclo de vida destes (EMF, 2013; Oliveira et al., 2019). Com um olhar sempre no futuro e na crescente conscientização sobre o impacto da cadeia produtiva no meio ambiente e no entendimento de que o padrão de produção de bens e consumo não teria possibilidade de se manter, aumentou o interesse na busca por alternativas de recursos renováveis, como biocombustíveis, bioquímicos e biomateriais. Neste sentido, estudos sobre os biopolímeros, veem sendo realizados, pois estes intrigam a humanidade desde o início da civilização (Habibi et al., 2010). De todos os biopolímeros existentes no planeta Terra, a celulose é o mais abundante com capacidade de produção anual de 50 bilhões de toneladas. Devido à sua bio-renovabilidade, abundância e baixo custo de produção, tem sido explorada como matéria-prima sustentável para a conceção e fabricação de novos produtos tecnológicos. Apesar da celulose ser uma matéria-prima renovável, esta também representa um elevado volume na produção de resíduos no contexto das produções industriais, seja na indústria de papel, de têxteis, de embalagens, de alimentos, cosmética, farmacêutica, médica e muitas outras. Todos os anos, bilhões de toneladas de biomassa são gerados em todo o mundo, espera-se que o tamanho do mercado global aumente US $ 305,08 bilhões até 2026, com uma taxa composta de crescimento anual (CAGR) de 4,2% (Annamalai et al., 2021; Insights, 2020). A biomassa celulósica derivada de diferentes recursos naturais oferece um alto potencial para funcionar como um precursor sustentável, propício para um ambiente mais ecológico e limpo, através do uso de técnicas avançadas de síntese e fabricação, tem aplicações em tratamento de água, biomédico, remediação de solo, filtragem de poluição (Thakur et al., 2022) e muitos outros. Por estar presente em uma infinidade de materiais no quotidiano, torna-se crucial a busca por processos produtivos sustentáveis em circuito fechado, que visem otimizar o uso destes recursos e possibilitar ciclos contínuos de reconversão. Nesse sentido, a modificação química de polissacarídeos, como a celulose, é um dos meios mais importantes para conferir propriedades e inserir este recurso renovável no contexto do desenvolvimento sustentável (Dogsa et al., 2014). Dessa forma, a utilização de matérias-primas como a biomassa celulósica ou resíduos celulósicos, vem se popularizando e novas aplicações industriais para obtenção de produtos funcionais estão sendo uma aposta em constante crescimento, devido a sua disponibilidade e bio-renovabilidade. Portanto, este projeto de dissertação objetivou o desenvolvimento de celulose modificada com propriedades antimicrobianas, sua síntese, caracterização e possíveis aplicações.
12 2.2. Modificação química da celulose A celulose apresenta boas propriedades mecânicas e térmicas, sendo igualmente biodegradável e biocompatível, mas também apresenta algumas desvantagens, como por exemplo a sua insolubilidade na maioria dos solventes comuns, incluindo a água. Outros fatores limitantes são a falta de termoplasticidade, alta hidrofilicidade e ausência de propriedades antimicrobianas. Uma forma de ultrapassar estas desvantagens é modificar quimicamente a celulose introduzindo-lhe grupos funcionais, que podem estender a empregabilidade da celulose e, assim, ampliar seu escopo de aplicação (Medronho et al., 2012). Nesse sentido, muitos esforços foram feitos para entender a natureza da celulose, dos seus derivados, bem como copolímeros e misturas de celulose. Atualmente ela pode ser modificada por métodos químicos, enzimáticos ou microbiológicos para obter novos derivados e materiais. Por exemplo os seus derivados podem ser produzidos em larga escala (com base na esterificação e eterificação de grupos hidroxilo na celulose para a preparação de derivados orgânicos solúveis) e materiais regenerados (ou seja, fibras, filmes, invólucros de alimentos, membranas e esponjas, entre outros) que encontram aplicações em várias áreas comerciais importantes, como nas indústrias de membrana, polímeros, têxteis e tintas (Dieter Klemm et al., 2005; Medronho et al., 2012; Wu & Kuga, 2006). Estas reações de modificações químicas podem ser classificadas em homogéneas ou heterogéneas. As reações heterogéneas são mais fáceis de aplicar pois não requer a solubilização completa da celulose, no entanto, não permite prever as condições da celulose modificada resultante (como por exemplo o seu grau de substituição), pois comumente são utilizadas quantidades superestequiométricas de reagentes, bem como ácidos ou bases para a ativação da celulose, gerando assim grandes quantidades de resíduos (Hummel, 2004; Dieter Klemm et al., 2005; Onwukamike et al., 2019). As modificações por reações homogéneas apresentam um melhor controlo sobre o grau de substituição e regiosseletividade, tanto em relação aos grupos OH primários e secundários, quanto em termos de uma distribuição homogénea dos grupos funcionais ao longo da cadeia polimérica, resultando em derivados de celulose com propriedades de material aprimoradas e ajustáveis (Hummel, 2004; Dieter Klemm et al., 2005; Onwukamike et al., 2019). Este tipo de reação apresenta as condições necessárias para a obtenção de derivados solúveis, pois o polímero se encontra altamente dilatado ou dissolvido. Assim, a maioria dos derivados de celulose solúveis em água, são obtidos por meio da eterificação da celulose, que envolve a reação com espécies orgânicas, como unidades de metilo e etilo em condições de reação homogéneas (Liesiene, 2010).
13 Os principais aspetos da molécula de celulose responsáveis pelas suas características químicas são os três grupos álcool presentes em cada unidade de AGU e as ligações glicosídicas, pois conferem grande estabilidade à celulose por serem difíceis de quebrar. No entanto, estes três grupos OH podem ser modificados permitindo que a celulose adquira diversos derivados sem que prejudique as suas propriedades intrínsecas (Dieter Klemm et al., 2005). Dessa forma durante a modificação química da celulose, os átomos de hidrogénio nos grupos hidroxilo são substituídos por qualquer substituinte quando as ligações de hidrogénio são quebradas (Liesiene, 2010). As propriedades dos derivados dependem principalmente do tipo de distribuição e uniformidade dos grupos de substituição. Dessa forma, o Grau de Substituição (DS - do inglês Degree Substitution ) para derivados da celulose é definido como número médio de grupos hidroxilo substituídos por outros grupos químicos nas unidades de anidroglucose, o que pode variar livremente dentro do intervalo entre zero – para uma celulose não substituída – até três – para um derivado celulósico trissubstituído. O DS é influenciado ainda pelo ajuste da razão molar de reagente derivatizante/AGU e condições reacionais (tempo e temperatura, por exemplo) (Thomas Heinze et al., 2018; Dieter Klemm et al., 2005). A literatura descreve vários novos polímeros celulósicos solúveis em água que foram sintetizados e estudados para diversas aplicações nas últimas décadas. Dentre eles, destacam-se derivados catiónicos, como éteres de celulose que contém nitrogénio quaternizado produzidos por eterificação de material celulósico com haloidrinas quaternárias ou epóxidos quaternários (Zhang, 2001). É nesse cenário que no decorrer deste trabalho foram realizadas modificações químicas na estrutura da celulose com vistas a inserção de grupos azoto, de modo a estudar suas possíveis propriedades antimicrobianas. 2.2.1. Carboximetilcelulose (CMC) A carboximetilcelulose é um polieletrólito linear aniónico, biocompatível, sendo um dos principais derivados da celulose solúveis em água, que apresenta grupos carboximetil (-CH2-COOH) ligados a alguns dos grupos hidroxil dos monómeros de glucopiranose que constituem a espinha dorsal da celulose. É frequentemente usado na forma de sal de sódio - carboximetilcelulose sódica (Lavanya et al., 2015). A CMC apresenta uma infinidade de aplicações em diferentes ramos da indústria, sendo encontrada no processamento de alimentos, de produtos farmacêuticos, adesivos, tintas, couro, papel, têxteis, cerâmicas, produtos agrícolas, detergentes, entre muitos outros. Dentre as suas aplicações industriais, a CMC é usado
14 principalmente para controlar a viscosidade de um produto e, ao mesmo tempo, evitar a gelificação, atuando como espessante, estabilizador de fase e emulsão e/ou agente de suspensão (Dogsa et al., 2014). Esta é sintetizada pela reação catalisada por álcali da celulose com ácido cloroacético (Figura 7). Os grupos carboxilo polares tornam a celulose solúvel e quimicamente reativa, e as suas propriedades funcionais dependem do grau de substituição na estrutura da celulose (ou seja, quantos grupos hidroxilo participaram da reação de substituição), bem como da sua concentração, força iónica e valor de pH (Lavanya et al., 2011; Zuidam & Nedović, 2010). Figura 7 – Representação esquemática da introdução do grupo carboximetilo no anel de glucopiranose, com R=H ou CH2COO-Na+. As modificações químicas da CMC podem oferecer propriedades adicionais que melhoram as suas características gerais. Por ser solúvel em água ela pode ser utilizada como material de partida para a obtenção de materiais melhorados. Dessa forma a CMC foi utilizada neste trabalho como uma das matérias-primas, a celulose E, empregadas nas reações de esterificação de modo a obter derivados de celulose solúveis em água com propriedades antimicrobianas. 2.2.2. Celulose Catiónica Os derivados catiónicos da celulose apresentam grande importância industrial devido às suas características úteis, como hidrofilicidade, biodegradabilidade e propriedades antibacterianas. Por conta disso, esses são utilizados numa variedade de campos, como indústrias de papel, têxtil, alimentícias, cosméticas, químicas e farmacêuticas, bem como agentes antibacterianos em vários sistemas de água (Hasani et al., 2008; Zhang et al., 2015). Agentes catiónicos, como grupos amino, amónio, sulfónio e fosfónio, são convencionalmente usados para modificar as estruturas de celulose (Iqbal et al., 2020; Khalil-Abad et al., 2009). Uma das principais estratégias para a cationização da celulose compreende a fixação de várias estruturas pré-construídas de nitrogénio quaternário à estrutura da celulose ou a quaternização de grupos amino previamente ligados. A
15 principal rota é por meio da eterificação com introdução das estruturas quaternárias pré-construídas. Os compostos mais conhecidos são os de amónio quarternário, como a celulose quaternizada, que é sintetizado a partir da reação da celulose com cloreto de glicidiltrimetilamónio (CHPTAC), em solução aquosa de hidróxido de sódio com uréia. Esta pode recorrer ao uso de sais de epoxipropilou 3-cloro-2-hidroxipropiltrialquilamónio como agentes de eterificação e ativação alcalina de grupos hidroxilo da celulose. Os derivados catiónicos de celulose solúveis em água por serem obtidos por reação com compostos que contêm grupos amina terciária por eterificação de acetatos de celulose com N , Ndietilpoxipropilamina (Gruber, 2002; Hasani et al., 2008; Liesiene, 2010). Estes agentes catiónicos, incluindo derivados de sais de amónio quaternário, são biocidas importantes e são conhecidos pela sua ação antisséptica e desinfetante eficaz. São ativos contra um amplo espectro de microrganismos, como bactérias gram-positivos e gram-negativas, fungos e certos tipos de vírus (Bracone et al., 2016). Neste trabalho o interesse em celulose catiónica diz respeito à sua atividade antimicrobiana atribuída a presença do átomo de azoto de carga positiva em sua estrutura. Assim a sua função antimicrobiana é devida a interações entre os grupos catiónicos e a membrana celular carregada negativamente dos microrganismos, o que resulta numa série de danos na membrana celular e desnaturação das proteínas. Ou seja, estas interações provocam grandes alterações na superfície da célula e na sua permeabilidade, levando à dispersão de substâncias intracelulares. Este composto tem ainda a vantagem dos átomos de azoto ficarem intactos mesmo após a inativação dos microrganismos, mantendo a suas propriedades antimicrobianas (Bracone et al., 2016). Entretanto esta depende do comprimento da cadeia alquil e o número de grupos catiónicos na molécula. 2.2.2.1. Lactamas As lactamas (contração de lactona + amida) são amidas cíclicas de aminoácidos alifáticos que formam uma extensa série homóloga de monômeros, com uma grande variedade de exemplos não substituídos cujo tamanho até agora varia de 4 a 21 átomos no anel. Elas consistem em um grupo amida polar e uma porção de hidrocarboneto não polar formada por uma sequência de grupos - (CH2)-(Russo & Casazza, 2012). A família lactama pode ser amplamente estendida se os membros portadores de substituintes no átomo C e / ou N forem considerados, com grande variedade de outros tipos de análogos de lactamas (lactamas contendo heteroátomos, dilactamas, lactamas bicíclicas, tiolactamas, oxalactamas bicíclicas, etc.). E para além de sua utilização industrial na produção de algumas poliamidas alifáticas, algumas lactamas encontram
16 aplicações muito significativas na medicina, em particular para a preparação de antibióticos (antibióticos βlactâmicos) (Gondal & Buisson, 2016; Russo & Casazza, 2012). São uma classe importante de compostos amplamente distribuídos entre compostos naturais e sintéticos de interesse biológico, sendo ainda intermediários altamente versáteis para uso potencial em sínteses orgânicas, caracterizando-se como importantes pontos de partida para numerosos compostos naturais que são amplamente empregados para obter novas moléculas por meio de modificações químicas adicionais (Gondal & Buisson, 2016). Nesse sentido, um caminho alternativo para a síntese de ésteres de celulose catiónicos é a abertura do anel das lactamas na presença de cloreto de ácido p-toluenossulfónico (cloreto de tosilo - TsCl). Neste tipo de reção podem ser utilizados como solventes da celulose N-metil-2-pirrolidona (NMP), Cloreto de lítio (LiCl), cloreto de 1-butil-3-metilimidazólio (BMIMCl), Dimetilacetamida (DMA), e pode ter como produto um derivado de biopolímero catiónico aplicando NMP, N metil-2-piperidona, ε-caprolactama e N -metil-ε-caprolactama (Thomas Heinze et al., 2019; Zarth et al., 2011). A lactama e NMP, forma um intermediário reativo na presença de TsCl de acordo com a reação de Vilsmeier-Haack (Figura 8). Assim, um éster de celulose catiónico é formado na segunda etapa, isto é, o íon imínio reage com os grupos hidroxilo do biopolímero e ocorre a abertura subsequente do anel pela água. Dependendo da lactama usada, porções de éster com diferentes comprimentos de cadeia de alquil (C4 a C6 ) podem ser ligadas à estrutura da celulose (Thomas Heinze et al., 2019; Zarth et al., 2011).
17 Figura 8 – Representação esquemática da conversão de álcoois (R – OH) com N -metil-2-pirrolidona na presença de cloreto de ácido ptoluenossulfónico (TsCl) para produzir grupo amino. Adaptado de Zarth et al., (2011). 2.2.2.2. Cloreto de Glicidiltrimetilamónio (CHPTAC) O cloreto de 3-cloro-2-hidroxipropiltrimetilamónio (CHPTAC) tem sido empregue na cationização de celulose e tem mostrado potencial para utilização em escala industrial. Este agente organo-catiónico, eco friendly, económico e pode facilmente reagir com as fibras de celulose (Khalil-Abad et al., 2009). O CHPTAC em si não é prontamente reativo com a celulose, primeiramente, ele é convertido em cloreto de 2,3-epoxipropiltrimetilamónio (EPTAC), também identificado como cloreto de glicidiltrimetilamónio, por reação com o álcali (Figura 9). Em seguida, o EPTAC reage com os grupos hidroxilo da celulose sob condições alcalinas para cationização (Figura 10). Ou seja, na presença de álcali, o CHPTAC é convertido em EPTAC juntamente com a dissociação parcial do grupo hidroxilo da celulose (Farrell et al., 2013).
18 Figura 9 – Formação de celulose aniónica e conversão de CHPTAC em EPTAC (Correia et al., 2020). Figura 10 – Reação de celulose com EPTAC em solução alcalina (Correia et al., 2020).
19 Os processos de cationização devem ser projetados para introduzir CHPTAC e o álcali necessário para a conversão do EPTAC, seguido por sua reação subsequente com a celulose. Assim, o processo geral de cationização deve ser projetado numa quantidade que o EPTAC seja consumido ao máximo, para garantir a liberação mínima do EPTAC para o meio ambiente (Farrell et al., 2013). 2.2.2.3. AminoCelulose Derivados de celulose funcionalizados com grupos amino, geralmente são chamadas de amino celuloses, e podem apresentar uma grande variedade de produtos sob medida (Berlin et al., 2000). Eles são solúveis em água, desde que C2 e C3 possuam principalmente grupos hidroxilo, enquanto a solubilidade em solventes orgânicos aparece se essas posições contiverem substituintes hidrofóbicos. As aminoceluloses, são particularmente interessantes devido ao seu potencial para aplicações biofuncionais (Thomas Heinze, Siebert, et al., 2016). A 6-desoxi-6-amino celulose pode ser obtida por reação de múltiplas etapas por reações de deslocamento nucleofílico (SN) de éster de ácido p-toluenossulfónico de celulose (tosilcelulose) com aminas ou por conversão de tosilcelulose com azida de sódio e redução subsequente da azida à porção amina (Petzold-Welcke et al., 2009; Zieger et al., 2015). Ou seja, esta reação tem como ponto de partida a tosilcelulose, onde as reações de SN podem ser realizadas na posição primária 6 aplicando di-eoligo-aminas. Para evitar qualquer reticulação, é empregue um excesso de amina bi ou multifuncional. A esterificação dos grupos hidroxilo secundários podem ser aplicadas para ajustar a solubilidade dos derivados deste biopolímero. As variações na estrutura da amina são: os comprimentos do espaço ajustável, diferentes valores de pKa, as distribuições de carga, o equilíbrio hidrofílico/lipofílico e propriedades cromogénicas redox (Heinze, Siebert, et al., 2016; Heinze et al., 2019). Segundo Heinze, et al., ( 2016), após a transformação dos grupos hidroxilo em bons grupos de saída, em particular para tosilar, uma reação SN pode ocorrer quase exclusivamente na posição primária da AGU. A reação de uma porção tosilato ocorre através de um mecanismo de SN, ou seja, um estado de transição aparece contendo cinco átomos que dificilmente são formados nas posições secundárias da AGU modificada, sendo necessária a utilização de reagente em excesso de 10–25 mol por mol de AGU por repetição modificada para evitar qualquer reticulação. Os derivados de aminocelulose solúveis podem ser formados pelo procedimento geral representado na Figura 11.
20 Figura 11 – Esquema de via geral da estrutura de um novo tipo de amino celulose solúvel (Heinze et al., 2016). Conforme o ilustrado no esquema da Figura 11, segundo Heinze et al. (2016), esta reação dá-se em três etapas principais: I. Tosilação de celulose (1) produzindo 6 (2) -O-tosil celulose (2); II. Reação de deslocamento nucleofílico de 2 com diou oligoaminas produzindo 6-desoxi-6-amino celulose (tosilato de amino celulose) 3, ou III. Esterificação dos restantes grupos OH da celulose de tosilo (2) obtendo-se 6 (2) -O-tosilo celulose éster (4) anterior S N reacção por oligoaminas die que conduzem a éster AC (5). Em que a síntese de tosilcelulose (2) é realizada preferencialmente em DMA/LiCl como solvente sob condições de reação homogéneas com TsCl na presença de trietilamina (Th Heinze & Rahn, 1996; McCormick et al., 1990).
21 3. Importância dos acabamentos antimicrobianos nos têxteis Os têxteis são reconhecidos há muito tempo como um meio propicio ao crescimento de microrganismos, principalmente bactérias e fungos, pois proporcionam um ambiente excelente para o crescimento e proliferação destes. O crescimento microbiano em têxteis durante o uso e armazenamento impõe uma série de efeitos indesejáveis para os têxteis, bem como para os usuários. Esses efeitos incluem geração de odores desagradáveis, descoloração, formação de mofo, degradação do vestuário, infeção dérmica, respostas alérgicas e outras doenças relacionadas (Shahid et al., 2013). A contaminação de materiais têxteis é resultado da aderência microbiana na superfície, e é uma das complicações clínicas vitais, o que justifica o desenvolvimento de novos compostos ou a modificação dos compostos já disponíveis (Dias et al., 2021; Fernandes & Filgueiras, 2008; Y. Zhang et al., 1999). O elevado número de casos de infeções causadas por microrganismos resistentes a fármacos ocasiona o aumento da mortalidade, dos riscos dos procedimentos médicos e dos custos com a saúde. Nesse cenário, o alto crescimento de patógenos nocivos tem desafiado os pesquisadores para a investigação de reagentes antimicrobianos (Fernandes & Filgueiras, 2008; Y. Zhang et al., 1999). Essa problemática é de particular importância em hospitais, onde grandes esforços são necessário no combate as infeções (Pan et al., 2019). Vários antibióticos foram descobertos e utilizados para a prevenção de infeções bacterianas patogénicas, sejam elas gram-positivas ou gram-negativas, no entanto o uso excessivo e até mesmo o abuso de antibióticos aceleram a variação da resistência antibiótica das cepas bacterianas, o que leva à redução significativa da sensibilidade destas à maioria dos antibióticos (Lv et al., 2020; Ning et al., 2020). Geralmente, essas infeções são combatidas com agentes antimicrobianos, que são suscetíveis à sua ação, no entanto os microrganismos resistentes são particularmente problemáticos pois sofrem mutação de forma rápida e fácil, dificultando sua eliminação e aumentando sua multiplicação (Pan et al., 2019). Pois o uso excessivo de antibióticos aceleram a variação da resistência antibiótica das cepas bacterianas, e à redução significativa de sensibilidade à maioria dos antibióticos (Fernandes & Filgueiras, 2008; Y. Zhang et al., 1999). Como por exemplo, a bactéria Pseudomonas aeruginosa, (uma das maiores causadoras de infeções leves e graves que necessitam de assistência à saúde) tem-se tornando cada vez mais resistente a alguns antibióticos. Outra bactéria comum na pele e mucosa humana é o Staphylococcus aureus , que pode ser problemático e ainda, ocasionar doenças leves, graves e até ser potencialmente fatal, seja pelo contacto com cortes na pele, de feridas, eczema infetado, infeções por abcessos e outras (Pan et al., 2019).
28 Na Tabela 3 são listadas as culturas celulares e bactérias empregadas nos testes microbiológicos. Tabela 3 – Culturas celulares e bactérias utilizadas. Identificação Culturas celulares ATCC 6538 Staphylococcus aureus ATCC 11303 Escherichia coli ATCC 10145 Pseudomonas aeruginosa ATCC 23235 Staphylococcus aureus (Biofilmes) PAO1 Pseudomonas aeruginosa (Biofilmes) *As estirpes bacterianas utilizadas provêm da ATCC ( American Type Culture Collection ). 2. Extração de celulose A Foram coletados resíduos celulósicos provenientes de uma indústria portuguesa, os mesmos foram submetidos à seleção e limpeza. Para realizar a hidrólise ácida (Figura 12), utilizou-se 20 g de massa celulósica para 300 mL de ácido nítrico a 1 g∙mol-1, na proporção de 1:15. Esta mistura permaneceu em refluxo por aproximadamente 7-9 h, sem agitação. Após a hidrólise completa o material foi filtrado e lavado duas vezes com acetona e etanol em funil de placa porosa. Posteriormente realizou-se secagem em temperatura ambiente. Figura 12 – Etapas da extração de celulose, (1) Resíduos celulósicos em acido sob refluxo; (2) Arrefecimento; (3) Lavagem e filtração da celulose e (4) celulose em pó após secagem a temperatura ambiente.
29 3. Sínteses / Modificações químicas da celulose São descritos os procedimentos genéricos para as reações de modificação química da celulose, de forma a melhor compreender as influências das diferentes características do polímero na sua derivatização. Foram empregues cinco tipos de celulose, sendo elas celulose A (Celulose proveniente de resíduos - DP≈153~178), celulose B (Celulose Regenerada, DP≈63), celulose C (celulose comercial - DP≈134), Celulose D (nano-alfa celulose, DP≈50), celulose E (derivado de celulose: carboximetilcelulose, DS = 0,36). O uso da carboximetilcelulose teve como objetivo verificar a possibilidade de se obter um composto zwitteriónico - com carga negativa proveniente da CMC e carga positiva proveniente do grupo amina introduzido. 3.1. Tosilcelulose (Amostra 25) Para a síntese da tosilcelulose empregou-se a metodologia descrita por Heinze et al., (2016). Portanto, uma mistura de 5,0 g de celulose A (0,031mol) em 150 mL de DMA permaneceu em agitação por 2 h a 120 °C. Posteriormente arrefeceu-se a temperatura para os 100 °C, adicionou-se 9 g de LiCl e manteve-se a agitação até a obtenção de uma solução de celulose límpida e viscosa. Após a completa solubilização da celulose, a solução foi arrefecida até os 8 °C, e então sob agitação adicionou-se uma mistura de 17,3 mL trietilamina e 17,5 mL de DMA. De seguida adicionou-se uma solução com 11,9 g de TsCl em 25 mL de DMA e manteve-se em agitação durante 24 h a 8 °C. Após este tempo de reação, o polímero foi recuperado por precipitação em 750 mL de água gelada, sendo ainda filtrado, lavado cinco vezes com água destilada e duas vezes com etanol. Por fim a tosilcelulose foi seca em estufa a 60 °C até se obter massa constante. 3.2. Carboximetilcelulose (CMC) Para a síntese de carboximetilcelulose (celulose E), sob intensa agitação adicionou-se 5 g de celulose A e 133 mL de 2-propanol, acrescentou-se gota a gota uma solução de 13 mL de NaOH a 30% (m/v). A mistura permaneceu 1 h em agitação. Após elevar a temperatura a 55 °C, adicionou-se lentamente 6 g de ácido cloroacético (ClCH2COOH), que se manteve 5h em agitação a essa temperatura. A CMC obtida foi filtrada, lavada com etanol e purificada, em uma solução aquosa de etanol a 80 % (v/v), sob agitação por 1 h. O polímero foi então filtrado, lavado com etanol e seco a temperatura ambiente.
30 4. Aminocelulose 4.1. Aminocelulose I (amostra 14) Para obtenção de Aminocelulose I (6-desoxi-6-aminoetilamino), conforme o relatado por Heinze et al. (2016), misturou-se 1,0 g (0,0028 mol) de tosilcelulose (amostra 25) com 4,7 mL (0,7 mol, 12,5 mol / mol unidade de AGU modificada) de etilenodiamina a 100 °C por 5h. Após a mistura arrefecer para a temperatura ambiente, a celulose foi precipitada em 100 mL de acetona, filtrada em funil de placa porosa, lavada 2 vezes com acetona, 2 duas vezes com 2 ‐ propanol e secou a temperatura ambiente. A aminocelulose seca passou ainda por diálise em solução aquosa de 50% etanol (v/v) por 24 h, e então foi submetida à filtração e secagem à temperatura ambiente. 4.2. AminoCelulose II (amostra 34) Para conversão da tosilcelulose em Aminocelulose II (6-desoxi-6-aminoetilamino) recorreu-se a metodologia descrita por Zieger et al., 2015. Para tal, uma mistura de 0,5 g (1,6 mmol) de tosilcelulose (amostra 25) em 10 mL de DMSO foi agitada por 5 minutos, então adicionou-se 2,7 mL (40,5 mmol, 25 mol por mol por AGU) de etilenodiamina. A mistura permaneceu em agitação por 6 h a 100 °C. Após o resfriamento a temperatura ambiente, o polímero foi recolhido por precipitação em acetona (300 mL), lavado 3 vezes com acetona e 2 vezes com etanol e então seco a 60 °C a temperatura ambiente.
31 5. Modificação com recurso a lactamas Neste trabalho foram realizadas reações homogéneas e heterogéneas para a conversão de celulose com lactamas - ε-caprolactama, 1-Metil-2-pirrolidinona e 2-pirrolidinona - na presença de TsCl para obter ésteres de celulose com funções catiónicas, em diferentes condições de tempo e temperatura, conforme o ilustrado na Figura 13. Figura 13 – Conversão de celulose com lactamas na presença de TsCl para obter ésteres de celulose catiónicos. Adaptado de Zarth et al., 2011. 5.1. Épsilon-caprolactama (ε-caprolactama) 5.1.1. Reação com - ε-caprolactama com solubilização (amostra 03) Para realizar uma reação homogénea, fundiu-se 4,5 g de BMIMCl (Cloreto de 1-butil-3-metilimidazólio) a 90 ºC e adicionou-se 0,5 g de celulose A (3,1 mmol). A mistura permaneceu em agitação por 6 h para total solubilização da celulose. Posteriormente, adicionou-se 10 mL de dimetilacetamida (DMA), reduziu-se a temperatura para os 40 °C e adicionou-se 1,18 g de TsCl (6,2 mmol, 2 mol/mol AGU) e 0,701 g de εcaprolactama (6,2 mmol, 2 mol/mol AGU). A solução permaneceu em agitação por 16h a 40°C. Em seguida, adicionou-se 0,5 mL de água destilada gota-a-gota para abertura do anel da lactama e agitou-se por 30 minutos. A celulose modificada foi isolada por precipitação em solução de etanol:acetona (1:1 v/v), lavada com acetona e seca a temperatura ambiente (Zarth et al., 2011). 5.1.2. Reação com - ε-caprolactama com CMC (amostra 36) Uma mistura de 10 mL de DMA e 0,5 g de carboximetilcelulose (Celulose E) foi agitada por 30 minutos a 90 °C, e então adicionou-se uma solução com 1,18 g de TsCl (6,2 mmol, 2 mol/mol AGU) e 0,701 g de εcaprolactama (6,2 mmol, 2 mol/mol AGU) em 3 mL de DMA. A reação permaneceu em agitação por 5h, a
32 90°C. Após esse tempo adicionou-se 0,5 mL de água destilada gota-a-gota para abertura do anel da lactama e agitou-se por 30 minutos, o polímero foi precipitado em clorofórmio, filtrado, lavado 3 vezes com acetona e seco a temperatura ambiente. Esta metodologia foi desenvolvida neste trabalho e utilizada para a obtenção de celulose zwitteriónica (36). 5.2. 1-Metil-2-pirrolidinona (NMP) 5.2.1. Reação com NMP (amostra 19) Fundiu-se 4,5 g de BMIMCl (Cloreto de 1-butil-3-metilimidazólio) a 90 ºC e adicionou-se 0,5 g de celulose A (3,1 mmol). A mistura permaneceu em agitação por 16 h para total solubilização da celulose. Posteriormente, adicionou-se 10,6 mL de NMP e 1,18 g de TsCl (6,2 mmol, 2 mol/mol AGU) e a solução de reação homogénea permaneceu em agitação por 2h, à temperatura ambiente. Em seguida, adicionou-se 0,5 mL de água destilada gota-a-gota para abertura do anel da lactama e agitou-se por 30 minutos. O polímero foi isolado por precipitação em solução de etanol:acetona (1:1 v/v), e ainda lavado cinco vezes com acetona, realizou-se diálise por 72h e liofilização, metodologia adaptada de Zarth et al., (2011). 5.2.2. Reação com NMP / TsCl em NMP / LiCl como solvente (amostra 28) Agitou-se por 2 h, a 120 °C, uma mistura de 1 g (6,2 mmol) de celulose A em 100 mL NMP. Após este tempo a temperatura foi reduzida para os 80 °C e adicionou-se 9g de Cloreto de lítio (LiCl). A mistura permaneceu em agitação sem aquecimento por 16 h, produzindo uma solução oticamente límpida. Posteriormente adicionou-se 2,7 mL de piridina (34 mmol, 5 mol/mol, AGU) e agitou-se por 10 minutos. Depois, adicionou-se 6,47 g (34 mmol, 5 mol / mol AGU) de TsCl e a reação permaneceu 5 h, à temperatura ambiente, sob agitação constante. Adicionou-se 10 mL de água destilada gota-a-gota para abertura do anel da lactama e agitou-se por 30 min. Isolou-se a celulose por precipitação em 800 mL de acetona/etanol (1: 1, v / v), filtrouse, realizou-se cinco lavagens com acetona e o polímero foi seco à temperatura ambiente (Zarth et al., 2011). 5.3. 2-pirrolidinona (amostra 20) Para realizar uma reação homogénea, fundiu-se 4,5 g de BMIMCl (Cloreto de 1-butil-3-metilimidazólio) a 90 ºC e adicionou-se 0,5 g de celulose A (3,1 mmol). A mistura permaneceu em agitação por 6 h para total solubilização da celulose. Posteriormente, adicionou-se 10 mL de dimetilacetamida (DMA), deixou-se arrefecer
33 à temperatura ambiente, e adicionou-se uma mistura de TsCl (1,18 g, 6,2 mmol, 2 mol / mol AGU) e 2pirrolidinona (0,5 mL, 6,2 mmol, 2 mol/mol AGU). A mistura de reação homogénea permaneceu sob agitação por 2 h. Adicionou-se 0,5 mL de água destilada gota-a-gota para abertura do anel da lactama e agitou-se por 30 minutos. A celulose foi isolada por precipitação em solução de etanol:acetona (1:1 v/v), foi lavada cinco vezes com acetona e seca a temperatura ambiente, metodologia adaptada de Zarth et al., (2011). 6. Reação de quaternização com cloreto de glicidiltrimetilamónio (CHPTAC) Na obtenção de celulose quaternizada catiónica por eterificação empregou-se a metodologia descrita por (Li et al., 2015). Portanto, arrefeceu-se uma solução de 100 mL de NaOH-Uréia-H2O (7–12–81%) e adicionouse 2 g de celulose A. Esta mistura permaneceu 5 minutos sob intensa agitação antes de ser submetida a congelamento, por 24 h. Posteriormente, a mistura foi aquecida até temperatura ambiente e então, sob agitação constante, foram adicionadas 21 mL de CHPTAC lentamente. A reação de eterificação teve duração de 24 h a temperatura ambiente, sendo que depois a mistura foi neutralizada com HCl e o produto foi submetido a diálise por 3 dias (Mw cutoff = 14000) e liofilização. Este foi procedimento empregado para obter o derivado catiónico (16). 7. Técnicas de Caracterização A celulose A extraída foi caracterizada em termos de grau de polimerização e cristalinidade, através de técnicas como FTIR-ATR, análise termogravimétrica, calorimetria diferencial de varrimento microscopia, que atuaram como base para o estudo da estrutura e propriedades da celulose utilizada. As celuloses modificadas foram avaliadas através das seguintes técnicas: FTIR-ATR, análise elementar, análise termogravimétrica, espalhamento de luz eletroforética e ainda foi avaliada quanto a capacidade antimicrobiana, que permitiram conhecer melhor a influência da modificação química nas propriedades da mesma. 7.1. Viscosimetria capilar para determinação da massa molar e grau de polimerização Viscosimetria é o método mais empregado para a determinação do peso molecular médio da celulose em aplicações industriais. Os polímeros são, em geral, menos solúveis do que seus monómeros correspondentes. No entanto a dissolução de polímeros em solventes leva a um aumento da viscosidade e quanto maior o comprimento médio da cadeia das moléculas de polímero, mais a viscosidade muda (conhecida
34 como viscosidade positiva). Dessa forma, a viscosidade de uma solução pode ser facilmente medida, utilizada no cálculo de massa molar média da viscosidade e posteriormente na determinação do DP médio da celulose (Oberlerchner et al., 2015). A viscosidade de uma solução aumenta pela presença de solutos macromoleculares devido ao elevado atrito intermolecular, este efeito é notável, mesmo em concentrações baixas, pois as moléculas de grande porte alteram o escoamento do fluido ao longo de extensas regiões nas vizinhanças delas (Atkins et al., 2014). Esse aumento da viscosidade, numa solução devido ao soluto, pode ser expresso pela viscosidade cinemática: cin = din/ρ = k*t (1) onde din é a viscosidade dinâmica, expressa em mPa.s, ρ é a densidade do fluido, expressa em Kg/m³, k é a constante geométrica do viscosímetro, expressa em mm²/s², e t é o tempo de escoamento, expresso em segundos. Pelo mesmo procedimento, é possível obter o tempo de escoamento e a viscosidade do solvente puro. Com isso, relacionando a viscosidade dinâmica da solução com a do solvente, é possível obter a viscosidade relativa: r = s (2) onde s é a viscosidade dinâmica da solução e a do solvente puro. Com esse dado, obtém-se a viscosidade específica: esp = r – 1 (3) Com esse parâmetro, relacionando-o com a concentração da solução, é possível obter a viscosidade reduzida: red = esp /c (4)
35 Onde c é a concentração do polímero. Outro parâmetro importante é a viscosidade intrínseca do polímero , que é uma função única para massa molecular para um determinado sistema polímero/solvente. Esta é obtida através da regressão linear da viscosidade específica em função da concentração de polímero. E a partir da aplicação da equação Mark-Houwink-Sakurada (MHS), é possível relacioná-la com a massa molar média viscosimétrica Mv, sendo que o sistema polímero/solvente deve estar a uma temperatura específica: = K * Mv a (5) onde K e a são constantes empíricas que dependem, exclusivamente do sistema polímero/solvente/temperatura de trabalhado. Assim a viscosidade de fluidos newtonianos pode ser medida em viscosímetros capilares, onde se mede o tempo de escoamento do fluido através do capilar e relaciona-se esse tempo ao do escoamento do solvente. Este método é conveniente para a medida de [η], pois a razão entre a viscosidade da solução e a do solvente puro é proporcional à razão entre os tempos de escoamento t e t0, realizando as correções das densidades (Budtova & Navard, 2015; Oberlerchner et al., 2015; Zhou et al., 2004) Nesse sentido um viscosímetro capilar ubbelohde foi utilizado para determinar massa molar viscosimétrica e o grau de polimerização das amostras de celulose, foram utilizadas soluções com concentrações de 0,50%, 0,75%, 1,0% e 2,0% (m/v), e como solvente uma solução aquosa de 4% de hidróxido de sódio (m/v) e 6% de ureia (m/v). Misturou-se a celulose em 25 mL de solvente e após agitação das mesmas, foram submetidas a congelamento por 24 horas para completo intumescimento e solubilização da celulose. As amostras foram descongeladas até atingirem a temperatura ambiente para a realização da medição do tempo de escoamento (segundos) em triplicato, a temperatura de 25 °C (controlada por banho termostatizado). Após a determinação do tempo de escoamento, determinou-se através das equações (1) - (4) as viscosidades cinemática, relativa, específica, reduzida e a intrínseca (Anexo 1). Através da equação (5), equação de Mark-Houwink-Sakurada, foi possível determinar a massa molar viscosimétrica e o grau de polimerização da celulose A (Figura 14).
36 Figura 14 – (1, 2) Foto da realização de viscosimetria capilar, usando o viscosímetro de tubo em U Ubbelohde e (3) foto das soluções de celulose diluídas. 7.2. Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier com Reflexão Total Atenuada (FTIR-ATR) Todas as amostras de celulose e os seus derivados modificados foram analisadas por espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier com Reflexão Total Atenuada (FTIR-ATR) num equipamento PerkinElmer Spectrum 100 Versão 10.4.00. Foram obtidos espectros na faixa de 4000 a 600 cm-1. Este recurso analítico não destrutivo para análise molecular qualitativa, é uma das técnicas mais empregadas para a identificação de materiais poliméricos, visto que diferentes grupos funcionais que compõem as moléculas absorvem a radiação na região do infravermelho do espectro eletromagnético em comprimentos de onda característicos, permitindo identificação e elucidação estrutural de substâncias orgânicas (Skoog et al., 2002). Portanto, auxiliou no estudo das modificações realizadas na celulose e na avaliação dos grupos funcionais presentes. 7.3. Termogravimétria (TGA) A análise termogravimétrica, é uma técnica que permite avaliar perda de massa de um polímero em função da temperatura ou tempo, de uma amostra que é submetida a um programa com temperatura e atmosfera controladas. O conhecimento do perfil térmico das amostras de celulose, o conteúdo dos componentes voláteis, o comportamento de decomposição e conteúdo de cinzas são importantes, pois a cinética destes processos são fundamentais para determinar a curva de estabilidade térmica e envelhecimento
37 devido a processos térmicos e termo oxidativos, bem como a relação destes com modificação química da estrutura da celulose (Prime et al., 2008). As curvas termogravimétricas das amostras de celulose A e de seus derivados (Catiónico 16 e zwitteriónico 36) foram obtidas em equipamento TGA 209 F1 Libra da Netzsch, com fluxo de ar sintético e programação de aquecimento de 30 a 700 °C, com velocidade de aquecimento de 20 °C por minuto. 7.4. Calorimetria Diferencial de Varrimento (DSC) para determinação do índice de cristalinidade O DSC consiste numa técnica na qual a diferença de fluxo de calor entre a amostra e uma referência é monitorada em função do tempo ou da temperatura, enquanto a temperatura média da amostra, em atmosfera específica, é controlada. As medidas no DSC relacionam fluxo de calor com as transições do material, sendo diretamente proporcional à mudança na energia interna (entalpia) da amostra, obtendo informações qualitativas e quantitativas sobre variações químicas e físicas associadas a processos exotérmicos e endotérmicos e sobre a capacidade calorífica (Lucas et al., 2001). Dessa forma a cristalinidade da celulose pode ser estimada por DSC, uma vez que há uma relação direta entre a área do pico endotérmico e a cristalinidade da amostra, pois nas zonas cristalinas a celulose não absorve água, e o pico endotérmico obtido no DSC corresponde às zonas amorfas da celulose. Para tanto, assumindo que as zonas amorfas são diretamente proporcionais à acessibilidade para absorver água, deduz-se que a energia necessária para desidratar a amostra está diretamente relacionada com as frações amorfas da celulose. Neste trabalho fez sentido caracterizar a nível de índice de cristalinidade somente a amostra de celulose A, uma vez que esta foi obtida através de um procedimento de extração interno do CeNTI. Resumidamente, a amostra de celulose A foi seca em estufa a 100 °C por 3 h para garantir que não continha água e as medições calorimétricas foram obtidas num Power compensation Diamond DSC ( Perkin Elmer ), com um Intracooler ILP , em atmosfera de Azoto, 20 mL/min, com razão de aquecimento de 20 °C/min. A amostra, de aproximadamente 5 mg em cadinho de alumínio, foi submetida a um ciclo de aquecimento/arrefecimento: o primeiro de 30 a 200 °C, ao qual permaneceu 1 minuto, e o segundo ciclo de 200 °C a 30 °, com velocidade de varrimento a 20 °C/minuto. A análise foi realizada em duplicado e o índice de cristalinidade foi determinado pela seguinte equação:
44 1.1. Espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier com reflexão total atenuada A Figura 18 demonstra os espectros obtidos na análise de espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier com Reflexão Total Atenuada para as diferentes fontes de celulose empregadas nas reações de modificação química. De forma comparativa, observa-se pela construção dos espectros que há poucas diferenças nas bandas de absorção das celuloses A, B, C e D. Figura 18 – Espectros FTIR das diferentes fontes de celulose utilizadas. A celulose A obtida por hidrolise, correspondeu em 99% de semelhança a um espectro típico de celulose pura do banco de dados da PerkinElmer Spectrum Versão 10.4.00. Pode-se identificar nos respetivos espectros as bandas de absorção características. No caso das celuloses A, B, C e D, os picos observados na faixa do número de onda de 3330 - 2800 cm-1 são característicos da vibração de alongamento das ligações OH e CH em polissacarídeos. Este pico largo em 3336 cm-1 é característico para a vibração de estiramento do grupo hidroxilo e inclui também vibrações de ligações de hidrogénio inter e intramoleculares na celulose. A banda em 2894 cm-1 é atribuída à vibração de estiramento CH de todos os constituintes de hidrocarbonetos em polissacarídeos. São observadas bandas típicas atribuídas à celulose na região de 1642 - 1051 cm-1. A banda localizada em 1642 cm-1 corresponde à vibração das moléculas de água absorvidas na celulose. E as bandas de absorção em 1428, 1361, 1335, 1315, 1160 e 1027 cm-1 pertencem a vibrações de alongamento e flexão
45 de ligações -CH2 e -CH, -OH e CO na celulose. O pico em torno de 1400 cm-1 está associado à estrutura cristalina da celulose, enquanto a banda em 984 cm-1 é atribuída à região amorfa da celulose (Poletto et al., 2011, 2014; Popescu et al., 2011; Rosa et al., 2010). Em relação a celulose E, a carboximetilcelulose, o aparecimento de picos em 1700 - 1500 cm −1 (estiramento da ligação C O ) e 1400 cm −1 (estiramento da ligação C-O ) no espectro de IR é a indicação de que a reação de eterificação foi bem-sucedida (Hivechi et al., 2015). 1.2. Determinação da massa molar e grau de polimerização A viscosimetria capilar foi utilizada para determinar a viscosidade intrínseca, posteriormente a massa molar e por fim estimar o grau de polimerização (DP) da cadeia celulósica. Os valores de DP das amostras de celulose diferem amplamente, dependendo origem e pré-tratamento. A Tabela 4 apresenta os valores do grau de polimerização das celuloses utilizadas e observa-se que o maior valor de DP é atribuído a celulose comercial (C). Ou seja, é a que apresenta maior massa molar, a seguir a celulose A, obtida por hidrolise de resíduos celulósicos, com DP de 175, a celulose B com DP de 63 e por fim a menor cadeia polimérica refere-se a nanoalfacelulose (D) com DP de 50. Tabela 4 – Resultados da análise de viscosimetria, cálculo de massa molar e grau de polimerização (DP). Amostra Viscosidade Intrínseca (mL.g-1) Massa Molar (kDa) DP Celulose A 0,104 28,27 ± 0,05 174,52 ± 0,03 Celulose B 0,046 10,3 ± 0,3 63 ± 5 Celulose C 0,146 24,5 ± 4 266 ± 15 Celulose D 0,037 8,1 ± 0,3 50 ± 2 As celuloses B e D apresentam um DP baixo pois foram obtidas a partir de hidrólise ácida de fibras de celulose regenerada e α-celulose, respetivamente. Se por um lado as fibras de celulose regenerada já apresentam um DP baixo, quando submetidas a um processo de hidrólise obter-se-á um pó com um DP ainda mais baixo. Por outro lado, e apesar da α-celulose apresentar um DP maior, esta foi sujeita a uma hidrólise muito extensa para originar nano-alfacelulose e por isso era expectável obter-se valores de DP mais baixos. Ambas já se encontravam no laboratório do CeNTI sendo que neste trabalho apenas se extraiu a celulose A,
46 que apresenta um DP dentro dos valores de qualidade internos do laboratório do CeNTI para este tipo de fonte (resíduos celulósicos). Como era de esperar, após a clivagem hidrolítica ácida o DP da celulose diminui, no entanto segundo Zarth (2011), o DP da celulose usada como material de partida não desempenha um papel muito significativo na síntese química. Mas, quanto maior o DP, maior é a viscosidade da mistura de reação e, portanto, pode torna-se mais difícil o controlo de temperatura da reação. Tendo em consideração este facto, neste trabalho foram usadas as diferentes celuloses de forma a averiguar qual seria a melhor fonte para obtenção de celulose antimicrobiana. 1.3. Termogravimetria (TGA) Em relação análise termogravimétrica é de notar que apenas se analisou a celulose extraída neste trabalho (celulose A) pois as restantes já tinham sido analisadas anteriormente e o perfil térmico é extremamente semelhante ao observado para a celulose A. Assim, apenas está representada a curva para a celulose A. Pela Figura 19, observou-se que a decomposição da celulose A ocorreu em três etapas conforme o descrito por Zhang et al., (2015), em que na primeira etapa na faixa de 25 °C a 300 °C ocorreu a perda de peso inicial devido à perda de humidade superficial e água interna de celulose. A temperatura de degradação da celulose foi identificada por volta dos 300 °C na e a segunda etapa, onde a perda de peso aconteceu devido à decomposição da celulose. A terceira etapa da perda de peso foi causada pela oxidação de parcialmente celulose decomposta a 400 °C e carbonização (Anexo 3). Figura 19 – Termograma da celulose A.
47 1.4. Calorimetria Diferencial de Varrimento (DSC) / Cristalinidade A cristalinidade da celulose resulta parcialmente das ligações de hidrogénio entre as cadeias de celulose, entretanto algumas ligações de hidrogénio também ocorrem na fase amorfa embora a sua organização seja baixa. Nesse sentido, a cristalinidade da celulose pode variar de acordo com o conteúdo inicial de estruturas amorfas determinado pelas mudanças induzidas nas cadeias de celulose devido aos processos de extração (Moon et al., 2011). Dessa forma recorreu-se a análise de Calorimetria Diferencial de Varrimento para obter-se os valores de cristalinidade da celulose A e B (Tabela 5). Neste caso, a celulose B foi escolhida para comparação pois por ser uma celulose que já passou por um processo de regeneração (logo é celulose II) apresentaria um índice de cristalinidade diferente. Tabela 5 – Percentagem de cristalinidade das celuloses extraídas A e B. Amostra ∆Hc (J/g) Cristalinidade (%) Celulose A 97 ± 6 52,7 Celulose B 141 ± 14 34,7 O percentual de cristalinidade das celuloses A e B são inferiores a celuloses comerciais por volta de 6070%, bem como celuloses nano estruturadas com ~90%. O teor de cristalinidade encontrado para a celulose A (52%) é desejável, considerando que este influencia no grau de “inchamento” da celulose, pois, a água não penetra na região cristalina (Gharehkhani et al., 2015; Kongdee et al., 2004; Wan et al., 2011). Outro parâmetro a se ter em conta, é que a acessibilidade dos grupos hidroxilo nas regiões amorfa e cristalina são diferentes, e as AGUs das regiões amorfas tendem a ser mais substituídas do que suas contrapartes nas regiões cristalinas (Klemm et al., 1998; Law, 2004). No entanto, quanto maior a cristalinidade, maior será a área de superfície que poderá ser modificada. Os espetros experimentais de DSC originais estão dispostos no Anexo 4.
48 2. Modificação química da celulose Nesta secção primeiramente serão apresentadas as informações referentes as reações de modificação química com diferentes condições e protocolos. Antes de analisar os resultados faz-se o esclarecimento de alguns conceitos como os tipos de solventes utilizados. Existem apenas alguns solventes que dissolvem a celulose fisicamente, ou seja, sem formar uma ligação covalente, podem ser referidas as soluções alcalinas e os líquidos iónicos. A maioria dos solventes moleculares causa inchaço na celulose em graus variados, mas não a dissolução completa (El Seoud et al., 2013). O solvente empregue durante as reações com celulose deve romper as ligações de hidrogénio intramoleculares na AGU, as ligações de hidrogénio intermoleculares entre as cadeias do biopolímeros e as interações de van der Waals presentes pois a celulose é anfifílica e tem uma superfície interna relativamente hidrofóbica (Lindman et al., 2017; Medronho et al., 2012). De acordo com a literatura, solventes de celulose eficientes são fortemente dipolares ou iónicos e são utilizados puros ou como soluções, geralmente dipolares apróticas. Assim a rutura dessas interações pode ser prontamente alcançada usando eletrólitos fortes (como por exemplo LiCl) em solventes apróticos dipolares (como por exemplo N,N-dimetilacetamida, DMAC, N -metilpirrolidin-2-ona e DMSO) (El Seoud et al., 2013). Resumidamente, esses eletrólitos fortes dissociam-se dos solventes apróticos dipolares devido às suas altas polaridades e permissividades relativas. Assim, uma combinação de interações do sistema biopolímerosolvente, incluindo aquelas com os iões não solvatados, e/ou seus complexos com os solventes rompem a rede de ligações de hidrogénio presente, levando à dissolução do biopolímero (El Seoud et al., 2013). Enquanto que os líquidos iónicos são bons solventes para celulose, devido ao seu caracter altamente anfifílico (podem ser caracterizados como tensoativos fracos), eles se encaixam bem no quadro de interações hidrofóbicas (Lindman et al., 2017; Medronho et al., 2012). Nas reações com lactamas, o NMP atua tanto como solvente quanto reagente pois é capaz de introduzir a fração de éster catiónico numa só etapa sem precisar de isolamento e purificação de intermediários (Zarth et al., 2011). Dessa forma, nas sínteses desenvolvidas foram utilizados solventes duplos e co-solventes, ou seja, um sistema binário com o uso de líquidos iónicos e solventes apróticos dipolares ou eletrólitos fortes. Como por exemplo as combinações de BMIMCl/DMA; NMP; NMP/LiCl. Uma vez que a celulose esteja solubilizada, temse condições de reação homogéneas, facilitando assim a acessibilidade aos seus sítios reacionais o que permite uma derivatização mais eficiente.
49 2.1. Reações com Lactama Foram realizadas reações homogéneas e heterogéneas para a conversão de celulose com lactamasεcaprolactama, 1-Metil-2-pirrolidinona e 2-pirrolidinona - na presença de TsCl para obter ésteres de celulose solúveis em água. Na Tabela 6 estão listadas as diferentes condições usadas nas sínteses com variação de tipo de celulose utilizada, solventes, razão molar, tempo, temperatura e solubilidade em água. Em relação a origem da celulose usada, foram realizadas sínteses com celulose A, B, C, D e E, com as mesmas condições de reação, no entanto os derivados não apresentaram solubilidade em água. Com exceção das amostras 3, 5 e 18, foram obtidos esteres de celulose, confirmados por FTIR-ATR (Espectros no Anexo 5). Tabela 6 – Condições e proporções das reações realizadas com lactamas, bem como dados referentes a sua solubilidade em água. Celulose * Solvente Lactama ** Razão molar*** Temperatura (°C) **** Tempo (h) Nº Amostra Solubilidade em Água Lactama TosCl Py Sim Não B BMIMCl/DMA 1 2.0 2.0 - 40 16 3 X A BMIMCl/DMA 1 2.0 2.0 - 80 8 5 X A BMIMCl/DMA 1 2.0 2.0 - 80 8 6 X A DMA 1 2.0 2.0 - 60 5 7 X A DMA 1 2.0 2.0 - 80 5 8 X A BMIMCl/DMA 1 2.0 2.0 - 80 3 9 X B DMA 1 2.0 2.0 - 80 5 10 X A DMA 1 2.0 2.0 - 80 16 11 X A DMA 1 2.0 2.0 - 90 5 13 X B DMA 1 2.0 2.0 - 90 5 15 X A DMA 1 2.0 2.0 - 90 8 17 X A BMIMCl/DMA 1 2.0 2.0 - 40 16 18 X A BMIMCl/NMP 2 Excesso 2.0 - TA 2 19 X A BMIMCl/DMA 3 2.0 2.0 - 40 2 20 X E DMA 1 2.0 2.0 - 90 5 21 X E DMA 1 2.0 2.0 - 90 5 23 X E DMA 1 2.0 2.0 - 90 5 24 X
50 A NMP/LiCl 2 Excesso 5.5 5.5 TA 5 28 X IV NMP/LiCl 2 Excesso 5.5 5.5 TA 5 29 X E NMP/LiCl 2 Excesso 5.5 5.5 TA 5 30 X C NMP/LiCl 2 Excesso 5.5 5.5 TA 5 32 X E DMA 1 2.0 2.0 - 90 5 33 X E NMP/LiCl 2 Excesso 5.5 5.5 TA 5 35 E DMA 1 2.0 2.0 - 90 5 36 X * A - Celulose proveniente de resíduos; B - Celulose Regenerada; C - Celulose comercial; D - Nano-alfa celulose; E - Carboximetilcelulose; ** 1: ε-caprolactama; 2: NMP - N-metil-2-pirrolidona; 3: 2-pyrrolidone; ***Razão molar unidade de anidroglucose: Lactama: TosCl - Cloreto de ácido ptoluenossulfônico: Py - Piridina; **** TA - Temperatura ambiente. Após várias tentativas não foi possível obter um derivado solúvel em água, pelo que se optou por usar a celulose E como ponto de partida para a reação. As condições reacionais foram semelhantes às usadas anteriormente (DMA como solvente, com razão molar de 2:2 para lactama e TsCl, com temperatura de 90 °C) e obteve-se um derivado catiónico (amostra 21) solúvel em água. O uso de carboximetilcelulose possibilitou reduzir o tempo de reação visto que esta é solúvel em água, não sendo necessário uma etapa de solubilização longa como para a celulose. No entanto, a referida amostra apresentou elevada perda de composto nas etapas de lavagem e recuperação da celulose. Dessa forma, as etapas finais do protocolo foram adaptadas e com a recuperação da celulose em clorofórmio foi possível obter um derivado funcionalizado e solúvel em água (amostra 36). 2.2. Reações de Aminocelulose Para atender aos objetivos deste trabalho desejava-se que o derivado celulósico catiónico fosse solúvel em água, uma vez que esse material poderia ser aplicado num processo de acabamento de têxteis. Apesar da presença de grupos amino no material, a 6-Desoxi-6-(2-aminoetil) Aminocelulose obtida neste trabalho não apresentou solubilidade em água e dessa forma este pode vir a apresentar alguma outra aplicabilidade em outras aplicações.
51 3. Espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier com reflexão total atenuada (FTIR-ATR) Os derivados obtidos foram submetidos a análise por espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier com reflexão total atenuada para comparar as mudanças estruturais causadas pela modificação química e identificar a inserção do grupo amino de interesse na estrutura da celulose. As sínteses obtidas que apresentaram solubilidade em água foram submetidas a uma análise detalhada para melhor compreender suas características. 3.1. Celulose Zwitteriónica Na Figura 20 são apresentados os espectros de FTIR-ATR onde é possível observar as características típicas da celulose (celulose A), sua modificação química em carboximetilcelulose principalmente pela presença dos picos em 1500 e 1400 cm −1 (C=O estiramento de ácido carboxílico) no espectro, que indica a realização bem-sucedida da reação de eterificação dando origem à celulose E, usada posteriormente (Hivechi et al., 2015). Figura 20 – Espetros de FTIR da celulose A e seus derivados, CMC e zwitteriónico (36). Comparativamente a Celulose E, a celulose zwitteriónica (36) apresenta deslocamento do estiramento de ácido carboxílico (C=O) de 1500 para 1700 cm −1 , característica corroborada por Zarth et al. (2011) em amino ésteres de celulose. Nota-se ainda uma redução nas bandas na zona dos 3300 - 2800 cm-1, característicos da vibração de alongamento das ligações OH e CH. Isto significa que houve uma redução destes
52 grupos devido à sua substituição pelo grupo funcional. Observa-se ainda os picos em torno de 1500-1000 cm1 associado à estrutura cristalina da celulose (Poletto et al., 2011, 2014; Popescu et al., 2011; Rosa et al., 2010). 3.2. Celulose Catiónica Na Figura 21 é apresentado o espectro de FTIR-ATR para a celulose catiónica (16) por eterificação, com recurso ao agente derivatizante CHPTAC. É possível realizar uma análise comparativa entre a celulose A e o seu derivado, onde se observa a presença de um novo pico a 1715 cm−1 correspondente ao estiramento de ácido carboxílico (C=O), conforme corroborado por Zarth et al. (2011) em amino ésteres de celulose. Apesar de menos evidente, denota-se diferenças entre os espectros nos picos 1230 e 1307 cm −1, que podem ser atribuídas aos grupos metil do amónio e a vibração de estiramento C-N. Dessa forma, os espectros de FTIR fornecem uma evidência da introdução dos grupos catiónicos, de sal de amónio quaternário na estrutura da celulose. Figura 21 – Espetros de FTIR da celulose A e seu derivado quaternizado (16).
53 4. Termogravimetria (TGA) Em relação análise termogravimétrica da celulose A (Figura 22), celulose Catiónica (16) e zwitteriónica (36), observou-se que as decomposições das celuloses derivadas ocorreram de forma diferente. A primeira etapa da perda de massa da celulose zwitteriónica iniciou em aproximadamente 180 °C, enquanto a perda de peso da celulose catiónica começou mais cedo. A primeira etapa em aproximadamente 60 °C com evaporação de água ou humidade presente nas estruturas. A segunda etapa de perda de massa na curva TGA da celulose catiónica a 200 °C. Ou seja, ao observar o perfil térmico da celulose catiónica, identifica-se que a temperatura de degradação deste derivado é inferior ao da celulose A e ao derivado de celulose zwitteriónica, o que demonstra que a termoestabilidade da celulose diminuiu após a modificação química. Ambos derivados apresentaram maior taxa residual do que a celulose devido à presença de sais (contra-iões de cada derivado) ou resíduos da reação. Figura 22 – Termograma comparativo da celulose A, celulose catiónica (16) e celulose (36). Segundo Zhang et al. (2015), diferenças de resultados de TGA entre a celulose original e derivados podem ser causadas pelas alternâncias do grau de cristalinidade e morfologias da celulose antes e depois da reação catiónica e celulose zwitteriónica, sendo consequência da degradação química e da quebra das ligações hidroxilo durante a reação. Ou seja, a celulose A apresenta maior número de ligações de hidrogénio quando comparada com os produtos funcionalizados.
60 Figura 27 – MIC da celulose E, do derivado catiónico (16) e zwitteriónico (36) para Pseudomonas aeruginosa . Os agentes antibacterianos podem ter função bactericida, que matam as bactérias, ou bacteriostáticos, que inibem o crescimento dos microrganismos. Nesse sentido, ao comparar os valores de MIC e MBC, o crescimento microbiano nas concentrações de MIC no ensaio de MBC podem ser atribuídas a um efeito bacteriostático dos compostos. Nas figuras 28, 29 e 30 são apresentadas as fotos referentes ao ensaio de MBC (No Anexo 6 podem ser observados valores para menores concentrações). Figura 28 – Fotos das placas do ensaio MBC para a celulose quaternizada (16).
61 Figura 29 – Fotos das placas do ensaio MBC para a celulose zwitteriónica (36). Figura 30 – Fotos das placas do ensaio MBC para a carboximetilcelulose (Celulose E).
62 8.2. Protocolo de inibição de produção de biofilme O crescimento prolífico de micróbios cria um biofilme que protege os micróbios incorporados, tornandoos mais resistentes à desinfeção. Esses biofilmes geralmente excretam produtos químicos que são tóxicos ou degradam o material subjacente. Eles também tornam a troca genética entre células microbianas mais eficiente, favorecendo a formação de estirpes bacterianas com resistência a antibióticos (Lode, 2009; Siedenbiedel & Tiller, 2012). Dessa forma o ensaio de inibição de produção de biofilme foi realizado com S. aureus e P. aeruginosa , para os derivados e para a celulose E. Na Tabela 9, são apresentados os valores de BMIC. Tabela 9 – Resultados de BMIC para a celulose E e para os derivados obtidos. MBIC (mg/mL) Descrição do organismo 16 36 CMC Staphylococcus aureus 25 mg/mL >60 mg/mL >60 mg/mL Pseudomonas aeruginosa 25 mg/mL 25 mg/mL >60 mg/mL *Catiónico – 16; Zwitteriónico – 36 e CMC – Celulose E. O derivado quaternizado 16, apresentou atividade antimicrobiana efetiva contra a produção de biofilmes tanto para a S. aureus quanto para P. aeruginosa , com de inibição de 92% e 96% respetivamente, a 25 mg/mL. No entanto o derivado Zwitteriónico 36 não apresentou inibição ao crescimento de biofilmes para S. aureus . No caso da P. aeruginosa , este apresentou 88% de inibição a concentração de 25 mg/mL. Conforme o esperado a celulose E não apresentou nenhuma atividade microbiana para as bactérias testadas (Figuras 31 e 32). Figura 31 – MBIC da CMC, do derivado catiónico (Q16) e zwitteriónica (36) para Staphylococcus aureus.
63 Figura 32 – MBIC da CMC, do derivado catiónico (16) e zwitteriónico (36) para Pseudomonas aeruginosa .
64 IV. Conclusões gerais e perspetivas futuras
65 IV. Conclusões gerais e perspetivas futuras O presente trabalho consistiu na obtenção de celulose a partir de resíduos de indústria portuguesa, síntese de derivados de celulose com propriedades antimicrobianas e no estudo de suas características físicoquímicas e microbiológicas dos respetivos derivados. A obtenção de celulose A por hidrólise ácida foi bem-sucedida, sua caracterização foi realizada com recurso a algumas técnicas como FTIR-ATR, Viscosimetria capilar, DSC, Termogravimetria, microscopias ótica e eletrónica de varrimento, onde foi possível conhecer melhor as propriedades da celulose empregadas nas reações deste trabalho. A mesma apresenta uma grande possibilidade de reaproveitamento de resíduos celulósicos e se enquadra no requisito de sustentabilidade prementes para indústria celulósica, visto que apresentou características semelhantes a outras fontes de celulose comercial. Em relação as sínteses com recurso a lactamas, ε-caprolactama, 1-Metil-2-pirrolidinona e 2-pirrolidinona, na presença de cloreto de ácido p-toluenossulfônico para obter ésteres de celulose com funções amino catiónicas, em diferentes condições de tempo e temperatura, originaram alguns esteres derivados de celulose A, B, C e D, não solúveis em água. No entanto, foi possível obter derivado Zwitteriónico (36) com grupos catiónicos e solúvel em água com uso de ε-caprolactama, tendo com ponto de partida a carboximetilcelulose (celulose E). A reação de esterificação foi comprovada por FTIR-ATR, análise elementar e TGA, com uso do ELS foi identificada a carga superficial do composto 36. As sínteses para obtenção de Aminocelulose a partir de tosilcelulose em etilenodiamina, foram caracterizadas por FTIR-ATR. As mesmas não originaram produtos solúveis em água, logo não encontraram aplicação no presente trabalho, pelo qual optou-se por não seguir com sua caracterização com técnicas complementares. Apesar de insolúveis em água, os derivados obtidos podem vir a apresentar alguma outra aplicabilidade em outros estudos. O derivado celulósico catiónico 16, obtido a partir do agente CHPTAC e celulose A, apresentou solubilidade em água. A presença de grupos amino e sua respetiva carga positiva foi confirmada por FTIR-ATR, análise elementar, TGA, SEM, EDX e ELS. Como consequência da modificação química e substituição dos grupos hidroxilo, os derivados 16 e 36 apresentaram menor estabilidade térmica em relação a celulose microcristalina, empregada como ponto de partida.
66 Em relação as propriedades antimicrobianas das celuloses funcionalizadas, ambos compostos apresentaram inibição de crescimento microbiano, MIC e MBC, para bactérias Gram negativas e Gram positivas. No entanto o derivado 16 apresentou maior inibição a menores concentrações, comparativamente ao composto Zwitteriónico 36, para S. aureus e E. coli . No que se refere a inibição da formação de biofilmes, o composto 16 mostrou ser altamente eficaz na inibição de biofilmes para as bactérias S. aureus e P. aeruginosa. Dessa forma, os resultados deste trabalho demonstraram que os ésteres de celulose catiónico (16) e Zwitteriónico (36) sintetizados tem atividade inibitória contra bactérias Gram-positivas e Gram negativas, podendo ser usado como agente antibacteriano. Este trabalho permitiu a obtenção de celulose microcristalina a partir de resíduos celulósicos e sua respetiva esterificação, com propriedades antimicrobianas. No entanto faz-se necessário a realização de estudos aprofundados no que se refere aos graus de substituição dos compostos obtidos, a otimização das sínteses, nomeadamente aos vários parâmetros de reação e mecanismos envolvidos. Uma sugestão seria a de otimizar as sínteses referidas e monitorar a influencia do DS na atividade antimicrobiana, bem como investigar a sua atividade frente a outros microrganismos. Será ainda fundamental um estudo de aplicação em têxteis por métodos convencionais de incorporação, para verificar a viabilidade de sua atuação como a gente antimicrobiano, a concentração necessária de inibição, bem como seu tempo de ação e um estudo das reações envolvidas na fixação, com recurso a normas AATCC Test Method 147, AATCC test Method 100 e ensaio de lavagens norma ISO 105:C06 A1S (AATCC, 2018; AATCC, 2010; ISO, 2010).
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77 Anexos 1. Cálculos de Viscosimetria/Grau de polimerização A fundamentação teórica utilizada para a realização os cálculos de viscosidade e grau de polimerização que constam nas tabelas abaixo são descritos no capítulo de metodologia. Tabela 10 – Cálculos de tempo de escoamento médio de soluções de celulose em diferentes concentrações para a amostra Celulose A. Concentração das Solução de celulose (%) Solvente 0,5 0,75 1 NaOH 6% + Ureia 4% Tempo de escoamento (s) 37 45 55 25 38 45 56 25 39 46 58 25 Tempo médio de escoamento (s) 38 45 56 25 Desvio Padrão 0,8 0,5 1,2 0,0 Tabela 11 – Densidade de soluções de celulose em diferentes concentrações para a amostra Celulose A. Densidade (Kg/m³) Solvente 0,5 % 0,75 % 1,00% 1 1,0415 1,0467 1,0490 1,0423 2 1,0216 1,0658 1,0590 1,0469 3 1,0599 1,0570 1,0732 1,0739 1,0415 1,0570 1,0590 1,0469 Desvio Padrão 0,0156 0,0078 0,0099 0,0139 Tabela 12 – Cálculo de viscosidade, massa molar e grau de polimerização da amostra de Celulose A.
78 Concentração (g.L-1) TME (s) Densidade (Kg/m³) cin (mm²/s) VD (mPa.s) VR Viscosidade específica Viscosidade reduzida VI (mL.g-1) Massa Molar (Da) Massa Molar (kDa) DP solvente 25 1,042 1,372 1,429 1,000 0,000 5 38 1,057 2,086 2,205 1,543 0,543 0,109 0,106 28941,511 28,942 178,496 8 45 1,059 2,470 2,616 1,830 0,830 0,111 10 56 1,047 3,074 3,219 2,252 1,252 0,125 *TME - Tempo médio de escoamento (s); VC - viscosidade cinemática (mm²/s); Viscosidade dinâmica (mPa.s); VR - Viscosidade relativa; VI - Viscosidade Intrínseca (mL.g-1); DP – Grau de polimerização. Tabela 13 – Constantes utilizadas no cálculo de viscosidade. Constantes Constante viscosímetro ubbelohde (mm²/s² - 1B) 0,054899 a 0,815 K 0,0000245 Figura 33 – Gráfico de viscosidade reduzida, celulose A.
79 2. Micrografias 4.2.1. Micrografias de celulose A Nas figuras abaixo são apresentadas outras micrografias originais de microscopia ótica e microscopia eletrónica de varrimento referente a celulose A. Figura 34 – Micrografias de celulose A obtidas por microscopia ótica, com magnificações 10 x e 20 x. Figura 35 – Micrografias de celulose A obtidas por microscopia eletrónica de varrimento, com magnificações 250 x e 1000 x.
80 Figura 36 – Micrografias de celulose A obtidas por microscopia eletrónica de varrimento, com magnificações 5000 x e 2500 x. 4.2.2. Micrografias de celulose catiónica Nas figuras abaixo são apresentadas outras micrografias originais de microscopia eletrónica de varrimento referente a celulose catónica (16). Figura 37 – Micrografias de celulose catiónica (16) obtidas por microscopia eletrónica de varrimento, com magnificações 80 x e 10000 x.
81 Figura 38 – Micrografias de celulose catiónica (16) obtidas por microscopia eletrónica de varrimento, com magnificações 5000 x e 1000 x. Figura 39 – Micrografias de celulose catiónica (16) obtidas por microscopia eletrónica de varrimento, com magnificações 2500 x e 5000 x.
82 3. TGA Figura 40 – Espetro experimental de TGA para a amostra de celulose A, com derivada.
83 4. DSC Figura 41 – Espetro experimental de DSC para a amostra de celulose A, aquecimento. Tabela 14 – Cálculo de cristalinidade das celuloses A e B. ∆Hc (J/g ) MED Desvio Padrão Cristalinidade (%) Celulose A (02) 90,5189 96,660 6,141 55,258 102,8015 Celulose A (04) 107,8465 102,122 5,724 52,730 96,3979 Celulose B 155,44 140,970 14,470 34,748 126,5 *Entalpia celulose "pura“ J/g (∆Hf) = 216,039
84 5. Espectros de FITR-ATR 4.5.1. Reações com lactama Figura 42 – Espetros de FTIR da celulose A e seu derivado nº 03. Figura 43 – Espetros de FTIR da celulose A e seu derivado nº 05.
85 Figura 44 – Espetros de FTIR da celulose A e seu derivado nº 06. Figura 45 – Espetros de FTIR da celulose A e seu derivado nº 07.
92 Figura 58 – Espetros de FTIR da celulose A e seu derivado nº 28. Figura 59 – Espetros de FTIR da celulose D e seu derivado nº 29.
93 Figura 60 – Espetros de FTIR da celulose E e seu derivado nº 30. Figura 61 – Espetros de FTIR da celulose C e seu derivado nº 32.
94 Figura 62 – Espetros de FTIR da celulose E e seu derivado nº 33. Figura 63 – Espetros de FTIR da celulose E e seu derivado nº 36.
95 4.5.2. Reações de amino celulose Figura 64 – Espetros de FTIR da celulose A e seus derivados tosilcelulose nº 12 e aminocelulose I (14). Figura 65 – Espetros de FTIR da celulose A e seus derivados tosilcelulose nº 25 e aminocelulose II (27).
96 Figura 66 – Espetros de FTIR da celulose A e seus derivados tosilcelulose nº 12 e 25 e aminocelulose I (14) e II (27). 6. MIC Figura 67 – MIC da CMC, do derivado catiónico (16) e zwitteriónica (36) para Staphylococcus aureus .
97 Figura 68 – MIC da celulose E, do derivado catiónico (16) e zwitteriónico (36) para Pseudomonas aeruginosa . Figura 69 – MIC da celulose E (CMC), do derivado catiónico (16) e zwitteriónica (36) para Escherichia coli .