Influencia de los parámetros mitocondriales en el agradamiento gingival inducido por ciclosporina y nifedipina: ensayo sobre modelo animal
Abstract
El agrandamiento gingival es una entidad patológica englobada dentro de la clasificación de la enfermedad periodontal. Las causas más comunes son en primer lugar como manifestación secundaria al consumo de fármacos - hidantoínas, ciclosporina y bloqueantes de los canales del calcio – y en segundo lugar, la forma idiopática asociada a un síndrome denominado fibromatosis gingival hereditaria. La clínica de este agrandamiento gingival está bien definida, pero las vías moleculares no quedan del todo claras a pesar del gran número de ensayos que la han abordado. En general se habla de una etiopatogenia multifactorial en la que se asocian proliferación de fibroblastos con descenso en su apoptosis, disminución de la degradación de la matriz con aumento de su depósito y la presencia de diversos factores de crecimiento. En el presente estudio hemos tratado de aclarar el papel que juega la mitocondria en este proceso. Se conoce la importancia que esta organela toma en procesos como la inflamación y distintas enfermedades sistémicas, entre ellas la enfermedad periodontal. Además, al tratarse de fármacos cuya diana principal no va a ser la encía pero que actúan a este nivel, queremos ver cómo afectan a otro órgano de vital importancia, pero del que no tenemos una visión clínica directa, como es el corazón. Para lograr nuestros objetivos hemos usado en primer lugar un modelo animal en el que inducimos la patología con fármacos (ciclosporina A o nifedipina) comparándolos con un grupo control, y en segundo lugar hemos evaluado el tejido gingival de dos pacientes diagnosticados de fibromatosis gingival hereditaria. Así, hemos estudiado los tejidos a nivel histológico, ultraestructural y bioquímico con diversas técnicas. Analizando los resultados hemos encontrado que los cambios morfológicos y funcionales en la mitocondria y el estrés oxidativo podrían estar involucrados en la etiopatogenia de este proceso. El tratamiento con ciclosporina produjo un incremento del estrés oxidativo a nivel cardiaco, por lo que el paciente podría beneficiarse de un cotratamiento con antioxidantes para el control de este efecto secundario al fármaco. Seguimos necesitando más estudios que nos permitan aclarar las vías moleculares en este proceso.
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INFLUENCIA DE LOS PARÁMETROS MITOCONDRIALES EN EL AGRADAMIENTO GINGIVAL INDUCIDO POR CICLOSPORINA Y NIFEDIPINA: ENSAYO SOBRE MODELO ANIMAL. LOURDES VICTORIA ROMAN MALO DEPARTAMENTO DE ESTOMATOLOGÍA UNIVERSIDAD DE SEVILLA 2016 DIRECTORES: Dr. PEDRO BULLÓN FERNÁNDEZ Dr. MANUEL DE MIGUEL RODRÍGUEZ Dr. MARIO DAVID CORDERO MORALES TESIS DOCTORAL
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Lourdes Victoria Román Malo | 3 CERTIFICADO Departamento de Estomatología. Facultad de Odontología. C/Avicena, s.n. D. Pedro Bullón Fernández. Doctor en Medicina y Cirugía y Catedrático en Periodoncia y Medicina Bucal del Departamento de Estomatología de la Universidad de Sevilla, D. Manuel de Miguel Rodríguez. Doctor en Biología y Profesor titular en el Departamento de Citología e Histología Normal y Patológica de la Universidad de Sevilla. D. Mario David Cordero Morales. Doctor en Ciencias de la Salud. Certifican: Que el trabajo de investigación titulado: “INFLUENCIA DE LOS PARÁMETROS MITOCONDRIALES EN EL AGRANDAMIENTO GINGIVAL INDUCIDO POR CICLOSPORINA Y NIFEDIPINA: ENSAYO SOBRE MODELO ANIMAL”, desarrollado por Dª Lourdes Victoria Román Malo para optar al título de Doctor en Odontología, ha sido realizado bajo su dirección y cuenta con los requisitos para ser presentado y defendido como tesis doctoral, al encontrarlo acorde a la normativa actual aprobada por la Universidad de Sevilla. Y para que así conste, firman el presente documento en Sevilla a 15 de mayo de 2016. Fdo: Pedro Bullón Fernández Fdo: Manuel de Miguel Rodríguez Fdo: Mario David Cordero Morales
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Lourdes Victoria Román Malo | 5 El presente trabajo de investigación ha sido desarrollado gracias a la financiación del V Plan Propio de Investigación de la Universidad de Sevilla, gracias a un Contrato predoctoral II.2 o de Personal Investigador en Formación (PIF) concedido a Dª. Lourdes Victoria Román Malo.
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Lourdes Victoria Román Malo | 7 A mi familia A Fran
8 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival
Lourdes Victoria Román Malo | 9 Gracias a mis directores. Gracias Pedro por depositar en mí tu confianza y continuar haciéndolo. Gracias Mario por guiar mis primeros pasitos dentro del laboratorio y “despertar la ciencia que hay en mí”, has sido jefe y compañero. Es un placer pertenecer a vuestro equipo. Gracias Manolo por estar desde el principio y siempre hacerme un huequito en tu agenda. Gracias a Pepe Quiles y su fantástico equipo, que han participado activamente del desarrollo de esta investigación. Gracias a todos mis compis del L.I.B.O. (Fabi, Eli, Diego, Ángel, Lucho, Rafa y Jessica), hacéis que las jornadas de trabajo sean más cortas y disfrute de cada día. En especial a Fabi, por ser una amiga, por su apoyo y su paciencia, y aguantar tanto mi buen como mi mal humor. No puedo olvidar a Lucía Maestre, parte fundamental de este equipo y un gran apoyo para mí, gracias por tener tu puerta siempre abierta y por tus buenos días de cada mañana. Gracias a mis compis de master. Belén, Esther, Karina; echo de menos todos los “malos” y buenos ratos con vosotras. Gracias a “los juernes” por existir, pero sobre todos a las personas que formáis parte de ello, porque dan sentido a las semanas y hacen que estas sean más cortas. Gracias Mario y Fati, sé que siempre cuento con vosotros. Sois geniales. Gracias a mi familia. A mis padres, por demostrarme lo orgullosos que se sienten de mí y apoyar todos mis proyectos. A Gelli, que aun estando ocupada y lejos, siempre tiene un huequito para preguntarme como estoy. A Carmela, no podría tener mejor compi de piso, aunque me queje (mucho), no te cambiaría por nadie. Teniéndoos a vosotros todo se hace mucho más fácil. Os quiero. Gracias a Fran, mi mitad, esta tesis también es tuya. Te amo. Y gracias a todas aquellas personas que de una forma u otra me han ayudado en el desarrollo de este proyecto. A todos vosotros. GRACIAS. AGRADECIMIENTOS
16 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival 5.3 Determinación bioquímica de masa mitocondrial mediante la actividad de la citrato sintasa 125 5.4 Niveles de ATP 125 5.5 Producción de nuevo colágeno 126 5.6 Peroxidación lipídica 127 5.7 Western blot en tejido gingival 127 5.8 Western blot en tejido cardíaco 128 5.9 Pacientes con fibromatosis gingival hereditaria 129 - Descripción del caso clínico 129 - Hallazgos histopatológicos en la H&E 133 - Análisis de los PBMC 134 - Evaluación de la síntesis de colágeno 135 - Influencia de las ROS en la síntesis de colágeno 135 6 Discusión 137 7 Conclusiones 149 8 Bibliografía 155
Lourdes Victoria Román Malo | 17 RESUMEN El agrandamiento gingival es una entidad patológica englobada dentro de la clasificación de la enfermedad periodontal. Las causas más comunes son en primer lugar como manifestación secundaria al consumo de fármacos - hidantoínas, ciclosporina y bloqueantes de los canales del calcio – y en segundo lugar, la forma idiopática asociada a un síndrome denominado fibromatosis gingival hereditaria. La clínica de este agrandamiento gingival está bien definida, pero las vías moleculares no quedan del todo claras a pesar del gran número de ensayos que la han abordado. En general se habla de una etiopatogenia multifactorial en la que se asocian proliferación de fibroblastos con descenso en su apoptosis, disminución de la degradación de la matriz con aumento de su depósito y la presencia de diversos factores de crecimiento. En el presente estudio hemos tratado de aclarar el papel que juega la mitocondria en este proceso. Se conoce la importancia que esta organela toma en procesos como la inflamación y distintas enfermedades sistémicas, entre ellas la enfermedad periodontal. Además, al tratarse de fármacos cuya diana principal no va a ser la encía pero que actúan a este nivel, queremos ver cómo afectan a otro órgano de vital importancia, pero del que no tenemos una visión clínica directa, como es el corazón. Para lograr nuestros objetivos hemos usado en primer lugar un modelo animal en el que inducimos la patología con fármacos (ciclosporina A o nifedipina) comparándolos con un grupo control, y en segundo lugar hemos evaluado el tejido gingival de dos pacientes diagnosticados de fibromatosis gingival hereditaria. Así, hemos estudiado los tejidos a nivel histológico, ultraestructural y bioquímico con
18 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival diversas técnicas. Analizando los resultados hemos encontrado que los cambios morfológicos y funcionales en la mitocondria y el estrés oxidativo podrían estar involucrados en la etiopatogenia de este proceso. El tratamiento con ciclosporina produjo un incremento del estrés oxidativo a nivel cardiaco, por lo que el paciente podría beneficiarse de un cotratamiento con antioxidantes para el control de este efecto secundario al fármaco. Seguimos necesitando más estudios que nos permitan aclarar las vías moleculares en este proceso.
Lourdes Victoria Román Malo | 19 ABREVIATURAS ADN Ácido desoxirribonucleico. AGEs Productos finales de la glicación avanzada. ARN Ácido ribonucleico. ATP Adenosin-5-trifostato. BSA Albúmina de suero bovino. Ca2+ Calcio. CEJ Límite amelocementario. CoA Coenzima A. CoQ Coenzima Q. CO2 Dióxido de carbono. CO3Li2 Carbonato de litio. CIP Coctel inhibidor de proteasas. CsA Ciclosporina A. CT Tejido conectivo. CTGF o CNN2 Factor de crecimiento del tejido conectivo. CTL Control. CTP Papilas del tejido conectivo. DMEM Medio Eagle modificado de Dulbecco. DTNB 5,5′-dithiobis(ácido 2-nitrobenzoico). E Epitelio. EMT Transición de epitelio a mesénquima. ER Crestas epiteliales.
20 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival FAD Flavina adenín dinucleótido. FN ED-A Fibronectina con ensamblaje alternativo. FSP-1 Proteína 1 fibroblasto-específica. GAPDH Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa. HLA Antígeno linfocitario humano. HPLC Cromatografía líquida de alta resolución. HRP Peroxidasa de rábano. Hsp47 Proteína de choque térmico 47. H2O Agua molecular. H2Od Agua destilada. H&E Hematoxilina y eosina. IGF Factor de crecimiento semejante a la insulina. IL-1 Interleuquina-1. IL-2 Interleuquina-2. IL-6 Interleuquina-6. JE Epitelio de unión. LB Tampón de carga. MDA Malondialdehido. MetOH Metanol. MMPs Matriz de metaloproteinasas. MMP-1 Metaloproteinasa 1. MMP-2 Metaloproteinasa 2. MMP-9 Metaloproteinasa 9.
Lourdes Victoria Román Malo | 21 MMP-12 Metaloproteinasa 12. MMP-13 Metaloproteinasa 13. MnSOD Manganeso superóxido dismutasa. mTOR Mammalian target of rapamycin. N Nifedipina. NaCl Cloruro sódico. NAD Nicotinamida adenín dinucleótido. NaOH Hidróxido de sodio. NFAT Factores nucleares de células T activadas. NH3 Hidróxido de amonio. OE Epitelio oral. OGG 8-oxoguanina DNA glicosilasa. OSE Epitelio del surco. OsO4 Tetraóxido de osmio. O2 Oxígeno molecular. PBMC Células mononucleares periféricas. PBS Tampón fosfato salino. PMSF Fluoruro de fenilmetilsulfonilo. ROS Especies reactivas del oxígeno. SDS Dodecilsulfato sódico. TBARS Sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico. TBS Tampón tris salino. TCA Ácido tricloroacético.
22 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival TEMED Tetrametiletiléndiamina. TFAM Factor A de transcripción mitocondrial. TG Tampón de tris y glicina. TGF-β Factor de crecimiento transformante beta. TGF-β1 Factor de crecimiento transformante beta 1. TIMPs Inhibidores de metaloproteinasas. TrisHCl Tris(hidroximetil)aminometano y ácido clorhídrico. VEGF Factor de crecimiento vascular endotelial.
Lourdes Victoria Román Malo | 23 Introducción
24 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival
Lourdes Victoria Román Malo | 25 1. INTRODUCCIÓN 1.1 ENFERMEDAD PERIODONTAL Concepto Suponen un conjunto de patologías que afectan a los tejidos de sostén del diente o periodonto; incluyendo como tal a la encía, el ligamento periodontal, el cemento radicular y el hueso alveolar. Clasificación Las primeras clasificaciones de la enfermedad periodontal surgen ante la necesidad de facilitar el trabajo a los clínicos en cuanto a identificación y tratamiento. Esta clasificación a lo largo del tiempo ha ido sufriendo cambios para adaptarse a los nuevos conocimientos sobre la etiología y patogénesis de la enfermedad periodontal e incluir nuevas categorías. Así, surge en 1999 una completa clasificación de la enfermedad periodontal, la cual deberá seguir en revisión y actualizarse según los nuevos descubrimientos y necesidades clínicas que surjan en un futuro. Con la actual clasificación de 1999 propuesta por Armitage ( 1 ): “the International Workshop for a Classification of Periodontal Diseases and Conditions” ya se incluye a la patología objeto de nuestro estudio; y se divide a la enfermedad periodontal en: I. Gingivitis: a. Inducida por placa dental. i. Inducida por placa dental sólo.
32 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival b. Deformidades y condiciones mucogingivales en el dentado. i. Recesión gingival y de tejidos blandos. 1. Superficie vestibular o lingual. 2. Interproximal (papila). ii. Falta de encía queratinizada. iii. Disminución de la profundidad de vestíbulo. iv. Frenillo aberrante. v. Excesos gingivales. 1. Pseudobolsa. 2. Margen gingival inconsistente. 3. Pantalla gingival excesiva. 4. Agrandamientos gingivales (ver I.a.iii y I.b.iv). vi. Alteraciones del color. c. Deformidades y condiciones mucogingivales sobre el reborde desdentado. i. Deficiencia del reborde vertical y/o horizontal. ii. Falta de encía queratinizada. iii. Agrandamiento de la encía y tejidos blandos. iv. Frenillo aberrante.
Lourdes Victoria Román Malo | 33 v. Disminución de la profundidad de vestíbulo. vi. Alteraciones del color. d. Trauma oclusal. i. Trauma oclusal primario. ii. Trauma oclusal secundario. 1.2 MORFOLOGÍA DE LA ENCÍA SANA Anatomía macroscópica La encía es la parte de la mucosa masticatoria que recubre la apófisis alveolar y rodea la porción cervical de los dientes. Adquiere su forma y textura definitivas con la erupción dental. Se extiende desde el margen gingival libre hasta la línea mucogingival, donde se continúa con la mucosa alveolar (esto no ocurre a nivel palatino, donde toda la mucosa es de tipo queratinizado), y su anchura varía entre 1 y 9 mm, aumentando con la edad (Figura 1). Está formada por: - Encía libre (desde el margen gingival libre, hasta la línea de encía libre - que corresponde horizontalmente con el límite amelocementario -). De color rosa coralino, opaca y de consistencia firme. Incluye también a las papilas interdentales.
34 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival - Encía adherida (desde la línea de encía libre, hasta la línea mucogingival). De color rosa coralino, textura firme y punteada (debido a las fibras conectivas que se anclan al cemento y hueso adyacente). Anatomía microscópica La encía está formada por epitelio y tejido conectivo/lámina propia. En primer lugar tenemos el epitelio bucal, que es el que apunta a la cavidad oral, siendo un epitelio plano, estratificado y queratinizado. El componente celular principal son los queratinocitos (90%), pero también encontramos los siguientes tipos celulares: melanocitos, células de Langerhans, células de Merkel y células inflamatorias. El límite con el tejido conectivo subyacente presenta una serie de proyecciones que se denominan papilas de tejido conjuntivo o papilas coriales, que están separadas unas de otras por las crestas epiteliales o papilas dérmicas. Figura 1. Anatomía macroscópica de la encía. Imagen modificada de “Periodontología clínica e implantología odontológica”, Tomo 1. 5º edición. Punto de contacto interproximal Papila interdental Epitelio de unión Encía libre Encía adherida Línea mucogingival Mucosa alveolar
Lourdes Victoria Román Malo | 35 El epitelio bucal se continúa a partir del margen gingival libre con el epitelio dentogingival, formado por el epitelio del surco (con células cúbicas y superficie queratinizada), que enfrenta al diente sin estar en contacto con la superficie del esmalte) y el epitelio de unión (con células más grandes y separadas, con menos uniones entre ellas -desmosomas- y ausencia de papilas coriales), que provee el contacto entre la encía y el diente, presentando sus células hemidesmosomas en unión con el esmalte (similar a la membrana basal entre epitelio-conectivo) (Figura 2). Por otro lado, el componente tisular predominante en la encía es el tejido conectivo, lámina propia o corion; cuyos componentes principales son: - Fibras. Colágenas en su mayoría (producida por fibroblastos, cementoblastos y osteoblastos), aunque también encontramos fibras de reticulina, de oxitalano y elásticas. Figura 2. Anatomía microscópica de la encía. Observamos el epitelio (E), dividido en epitelio oral (OE), epitelio del surco (OSE) y epitelio de unión (JE). Bajo el epitelio vemos el tejido conectivo (CT). Tenemos una línea que divide la encía a nivel del límite amelocementario (CEJ). A mayor aumento observamos las papilas de tejido conectivo (CTP) y las crestas epiteliales (ER), formando un entramado que permite que un tejido penetre en otro. Imagen modificada de “Periodontología clínica e implantología odontológica”, Tomo 1. 5º edición.
36 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival - Células. Siendo predominante el fibroblasto (65% de la población celular total y encargado de la síntesis de diversos tipos de fibras además de algunos componentes de la matriz del tejido conectivo). También encontramos mastocitos (responsables de la síntesis de algunos componentes de la matriz y productora de sustancias vasoactivas), macrófagos (derivados de los monocitos sanguíneos, con funciones fagocíticas y de síntesis), y células inflamatorias de distintos tipos: granulocitos neutrófilos o polimorfonucleares, linfocitos y plasmocitos. - Matriz. Producida principalmente por los fibroblastos, algunos componentes por los mastocitos y otros derivan de la sangre. Compuesta por complejos macromoleculares de proteínas e hidratos de carbono, que se clasifican generalmente en proteoglucanos (contienen glucosaminoglucanos, determinantes de la presión osmótica e importantes en la elasticidad y consistencia del tejido) y glucoproteínas ( 2 ). 1.3 AGRANDAMIENTO GINGIVAL Concepto Se refiere, en esencia, a un aumento de encía adherida a nivel de la encía libre que sobrepasa el límite amelocementario con engrosamiento del tejido. La literatura usa una amplia gama de terminología para referirse a esta situación: hiperplasia, hipertrofia, aumento o agrandamiento. Los términos agrandamiento o aumento, son clínicamente descriptivos; mientras que hiperplasia e hipertrofia son términos histológicos.
Lourdes Victoria Román Malo | 37 Hiperplasia describe el aumento de tamaño de un órgano debido a un incremento en el número de sus células. Esta debería distinguirse del término hipertrofia, el cual es exceso de crecimiento del tejido debido a un aumento en el tamaño de las células ( 3 ). “Agrandamiento” (“overgrowth”) es el término preferido para referirnos a muchas de estas situaciones en relación con medicamentos, previamente etiquetadas como “hiperplasia gingival” e “hipertrofia gingival”, ya que estos términos no reflejan nuestro conocimiento actual sobre el aumento macroscópico de una encía histológicamente alterada ( 4 ). Por lo tanto, con los conocimientos actuales, definir a esta situación con el término de agrandamiento gingival es lo que nos parece más adecuado. Clasificación El agrandamiento gingival puede ser clasificado en función del grado de crecimiento clínico del tejido gingival (3): - Grado 0, no hay signos clínicos de agrandamiento. - Grado 1, el agrandamiento está confinado a la papila interdental. - Grado 2, el agrandamiento se extiende más allá de la papila por el resto de tejido queratinizado. - Grado 3, el tejido gingival llega a cubrir tres cuartas partes o más del diente. Principales causas
38 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival La causa más común de aumento del tejido gingival es una inflamación inducida por placa. Pero tenemos una serie de situaciones de aumento del tamaño del tejido en las que el factor etiológico no va a ser puramente inflamatorio, y estas son, de mayor a menor frecuencia: 1. Agrandamiento gingival por medicamentos. 2. Fibromatosis gingival hereditaria. 3. Neurofibromatosis I. 4. Infiltrado leucémico gingival. 5. Agrandamiento gingival como manifestación del linfoma de Hodgkin. 6. Síndrome de Sweet. 7. Síndrome de Schinzel-Giedion (3). Fármacos comúnmente asociados El agrandamiento gingival asociado a medicamentos se produce como un efecto secundario a fármacos que son usados principalmente para tratamientos no dentales, en los que la encía no es su órgano diana. Estos fármacos asociados con el aumento gingival pueden ser categorizados en general dentro de tres grandes grupos, de acuerdo a su acción terapéutica (4): 1. Anticonvulsivantes (especialmente fenitoína - Dilantina®, Epanutín®, Neosidantoína®, Sinergina®). 2. Inmunosupresores (principalmente ciclosporina A - Neoral®, Sandimmune®).
Lourdes Victoria Román Malo | 39 3. Antagonistas de los canales de calcio (principalmente nifedipina - Adalat®, Nifelat®- aunque también se ha descrito con otros principios activos de la misma familia – amlodipino, diltiazem, verapamilo, etc). El tratamiento con ciclosporina se sigue prescribiendo a una gran proporción de los pacientes trasplantados o con patologías autoinmunes, y se estima que irá en aumento debido a la alta eficacia de la terapia ( 5 ). Por otro lado, según datos de la Organización Mundial de la Salud de 2012, uno de cada tres adultos presentaba hipertensión arterial, siendo factor de riesgo de infarto y otras enfermedades cardiovasculares. Muchos de estos pacientes logran controlar su tensión gracias a la administración de antagonistas de los canales del calcio. 1.4 CICLOSPORINA A La ciclosporina A (CsA) fue aislada por primera vez en Suiza en 1970, como un metabolito del hongo Tolypocladium inflatum gams. En un principio se utilizó como antifúngico demostrando tener poco valor; sin embargo, sus polipéptidos cíclicos poseen una potente acción inmunosupresora ( 6 ), permitiendo prolongar la supervivencia de los trasplantes alogénicos que involucran a piel, corazón, riñón, hígado, páncreas, médula ósea, intestino delgado y pulmón. La ciclosporina A (SandimmuneTM; NeoralTM) ha demostrado suprimir algo la inmunidad humoral (linfocitos B), y en un grado mucho mayor, la inmunidad celular (linfocitos T), ayudando a tratar el rechazo de aloinjertos, hipersensibilidad retardada, la enfermedad de injerto contra huésped y enfermedades autoinmunes ( 7 ). Mecanismo de acción y farmacodinámica
40 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival Se trata de un fármaco que inhibe la transmisión de señales de activación, uniéndose selectivamente a las inmunofilinas del citoplasma celular (moléculas que participan en el plegamiento de proteínas implicadas en el crecimiento celular), en concreto a la ciclofilina, formando un complejo que facilita la acción del fármaco sobre su molécula diana: la calcineurina ( 8 ). La farmacodinamia de la ciclosporina principalmente envuelve al linfocito T; su respuesta y papel en el rechazo a trasplantes, que puede ser resumida en: - Reconocimiento de antígeno del tejido extraño. - Procesamiento de los antígenos por macrófagos con la posterior producción y liberación de interleuquina-1 (IL-1). - Activación por parte de la IL-1 de precursores de linfocitos T-citotóxicos, los cuales adquieren receptores para interleuquina-2 (IL-2). - Activación de linfocitos T-helper con la producción y liberación de IL-2, la cual es acentuada por la IL-1. - Amplificación clonal de linfocitos T-citotóxicos que causan lisis mediada por células y rechazo al tejido extraño. La ciclosporina inhibe muchos de estos estadios, actuando tanto a nivel celular como molecular. Específicamente, la ciclosporina inhibe la síntesis de IL-2 con concentraciones de entre 10 y 20ng/mL. Tal inhibición, limita la amplificación clonal de linfocitos T-citotóxicos. A altas concentraciones (100ng/mL), inhibe la capacidad de los linfocitos T-citotóxicos de responder a IL-2. Se piensa que el mecanismo por el cual se produce esta inhibición es debido al bloqueo de los receptores de IL-2 en estas células. Por otro lado, la ciclosporina tiene un “efecto ahorro” sobre los linfocitos T-supresores.
Lourdes Victoria Román Malo | 41 La acción de la ciclosporina parece ser selectiva de los linfocitos T. Los linfocitos T-supresores parecen ser resistentes a la ciclosporina, mientras que los T- citotóxicos y T-helper son sensibles. Esta diferencia puede ser debida a las propiedades de unión entre fármaco y célula, y a la posterior internalización de las moléculas de ciclosporina dentro de la estructura celular ( 9 ). Una vez introducida en el citoplasma del linfocito T, la ciclosporina se une a la ciclofilina, formando un complejo capaz de unirse a la calcineurina y provocar así la inhibición de su actividad. El resultado final de este complejo formado por tres proteínas es la incapacidad de activación de los genes que están involucrados en la activación de la célula T ( 10 ). Farmacocinética La ciclosporina puede ser administrada por vía oral, intramuscular o intravenosa. Tras la administración oral, el fármaco es absorbido a nivel del tracto gastrointestinal mostrando gran variación interindividual. La concentración plasmática máxima la alcanza a las 2 o 3 horas después de la dosis, teniendo una vida media en suero de entre 17 y 40 horas. La ciclosporina es metabolizada en el hígado y este metabolismo es principalmente mediado por el sistema enzimático citocromo P450 monoxidasa; incluyendo N-desmetilación, hidroxilación y ciclación. Siendo identificados algunos de sus metabolitos. Muchos de estos metabolitos son excretados por vía biliar a través de las heces. Sólo el 10% son excretados por vía renal (9). Posología Para el mantenimiento de la inmunosupresión se requieren unas dosis orales diarias de entre 10 y 20mg por kilogramo de peso. Estas dosis permiten una
48 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival Ocurre habitualmente durante los tres primeros meses de estar recibiendo terapia con ciclosporina o nifedipina. Se produce un incremento de tamaño de la encía adherida que comienza a nivel de la papila interdental, siendo más frecuente a nivel vestibular de la región anterior que en lingual o palatino. Gradualmente, puede llegar a extenderse en sentido vestíbulo-lingual y coronal, pudiendo llegar a cubrir la corona dental por completo (11, 20 ) (Figura 3 ( 21 )). Esto va a causar problemas estéticos, dificultades funcionales (masticación, habla y contacto oclusal), además de dificultar al paciente el mantenimiento de una higiene oral adecuada, favoreciendo el acumulo de placa y la aparición de complicaciones inflamatorias en un paciente con un problema sistémico de base (3). Factores de riesgo No todos los pacientes que consuman estos fármacos van a desarrollar el agrandamiento, de hecho, en la literatura se habla de pacientes “susceptibles” y pacientes “no-susceptibles”. De ahí que se estén tratando de identificar todos los posibles factores relacionados con la aparición y la severidad de este agrandamiento ( 22 , 23 , 24 ). Entre ellos encontramos: Figura 3. Imagen clínica de un paciente con agrandamiento gingival inducido por medicamentos (Nakib & Ashrafi, 2011).
Lourdes Victoria Román Malo | 49 - Edad. Reconocida como un factor de riesgo importante para la ciclosporina, siendo los niños y adolescentes más susceptibles ( 25 ). Numerosos estudios se han centrado la prevalencia dentro de pacientes pediátricos trasplantados, observándose valores significativamente más altos con respecto a los adultos ( 26 ). Esto sugiere que un componente hormonal contribuiría a la sensibilidad del fibroblasto al fármaco. Para la nifedipina, la edad no es aplicable ya que el uso de este fármaco está principalmente confinado a adultos de la tercera y mediana edad. Por lo que no se establece a la edad como factor de riesgo para desarrollo de agrandamiento gingival por nifedipina. - Género. Muchos de estos estudios presentan sesgo debido a que los pacientes trasplantados son con más frecuencia hombres que mujeres. Parece que existe una mayor predilección por hombres que por mujeres, además de afectarse estos con mayor severidad ( 27 ). Respecto a los bloqueantes de los canales del calcio, se habla de que el hombre presenta tres veces más de probabilidad de desarrollar el agrandamiento que la mujer ( 28 ). Parece que el umbral mínimo de fármaco en suero es menor para el hombre. - Variables del fármaco. Una gran cantidad de variables farmacocinéticas han sido estudiadas (dosis, duración, concentración en suero, saliva y fluido crevicular) sin encontrarse hallazgos consistentes. Varía mucho de un estudio a otro la manera de clasificar el agrandamiento, el momento de obtención de la muestra sanguínea, el número de pacientes y la evaluación de la farmacocinética del propio fármaco. No parecen ser datos útiles a la hora de ver cómo el paciente podría responder a uno de estos fármacos. En lo que sí parecen coincidir la mayoría de los estudios es que se requiere superar un
50 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival umbral de concentración del fármaco para que se produzcan los cambios gingivales, y este varía de un individuo a otro. - Medicación concomitante. Es bastante común la asociación de ciclosporina con nifedipina en el paciente trasplantado para controlar la hipertensión secundaria al inmunosupresor. Existe bastante evidencia de que la combinación de ambos fármacos produce mayor agrandamiento gingival que si se administrasen de manera individual ( 29 , 30 , 31 ). Sugiriéndose que la prevalencia de este efecto no deseado aumenta significativamente, pero no la severidad ( 32 ). Por otro lado, prednisolona y azitromicina parecen proporcionar cierto grado de protección frente al desarrollo del agrandamiento; pudiendo ser derivada de su acción antiinflamatoria ( 33 ). - Variables periodontales. Los cambios inflamatorios inducidos por placa parecen exacerbar la expresión del agrandamiento, independientemente del fármaco inductor. Esto sugiere una relación de causalidad entre la higiene oral del paciente y el desarrollo del agrandamiento gingival (25, 28). Debemos tener en cuenta que muchos de estos estudios son transversales, y es difícil de determinar si el acumulo de placa es factor inductor o consecuencia del cambio gingival. En otras circunstancias, donde hay estructuras adicionales, tales como aditamentos ortodóncicos que interfieren con la limpieza, la prevalencia del agrandamiento es alta ( 34 ). Un ensayo en ratas sugiere que la nifedipina por sí sola no es capaz de inducir el agrandamiento, sino que requeriría la presencia de algún factor irritante como es la inflamación del periodonto ( 35 ).
Lourdes Victoria Román Malo | 51 En el caso de la ciclosporina, se ha observado que el estado periodontal previo al inicio del tratamiento en pacientes trasplantados está relacionado con mayor probabilidad de desarrollar el agrandamiento ( 36 ). Analizando la higiene durante el tratamiento en otro grupo de pacientes trasplantados se observó también, que esta no previene su aparición (25). Por otro lado, un estudio en niños trasplantados concluyó que el factor más relacionado con la aparición y severidad del agrandamiento era el índice de placa ( 37 ). De lo que no existe duda es que la mejora de la higiene y la reducción del componente inflamatorio, parecen minimizar la severidad del agrandamiento inducido por ciclosporina. Aunque seguimos observando a un grupo de pacientes en los que se va a desarrollar el agrandamiento independientemente de su higiene y condición periodontal, aquí otro tipo de factores deben tener mayor importancia. - Tabaco y enfermedades sistémicas subyacentes. En un estudio epidemiológico en el que se evaluaron un amplio número de sujetos pareció tener importancia la relación entre agrandamiento gingival, tabaco, enfermedad cardiovascular y periodontitis ( 38 ). Para los bloqueantes de los canales de calcio, es interesante como los cambios gingivales son más pronunciados en pacientes que los toman por desórdenes cardiovasculares que los que los toman por otros motivos. - Factores genéticos. Un factor clave ha sido atribuido a la heterogenicidad en los fibroblastos en los estudios in vitro, pero se ha tenido poco éxito a la hora de extrapolar clínicamente estos hallazgos valorando el riesgo para el paciente. Se habla de una predisposición genética del paciente que podría tener su explicación en el citocromo P450, que participa en el metabolismo
52 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival hepático de ambos fármacos, pero es poco práctico a la hora de la evaluación en clínica ( 39 ). También se ha evaluado el polimorfismo en el gen que codifica al transportador de ciclosporina: P-glucoproteína. Otros estudios se han centrado en la expresión del antígeno linfocitario humano (HLA). EL fenotipo de este marcador es determinado previamente al trasplante en todos los pacientes. El mecanismo no está claro, pero se ha postulado una posible relación entre la expresión de HLA y la incidencia del agrandamiento, identificándose un desequilibrio entre los genes HLA y no- HLA en el cromosoma humano 6 ( 40 ). Un estudio sobre pacientes sometidos a trasplante y bajo terapia con ciclosporina habla de una triada que explicaría la mayor parte de la variabilidad del agrandamiento gingival. Incluyendo en esta triada a la inflamación gingival, el nivel del fármaco en saliva y la actividad residual de los factores nucleares de células T activadas (NFAT; el cual es activado por la calcineurina, la diana de nuestro inmunosupresor) ( 41 ). Etiopatogenia Muchos estudios han intentado clarificar el mecanismo de acción por el cual se va a producir este efecto adverso a determinados fármacos que tienen características farmacológicas tan dispares. Por tanto, aunque su farmacología es muy diferente debe existir un mecanismo biológico común.
Lourdes Victoria Román Malo | 53 Se trata de un efecto indeseado secundario a la administración sistémica de un medicamento cuya diana no es el periodonto pero sí que va a afectar al tejido periodontal. En general, en el agrandamiento gingival inducido por fármacos se va a producir una acumulación de componentes de la matriz extracelular en el tejido conectivo gingival con diferentes grados de infiltrado inflamatorio, acompañado de engrosamiento del epitelio correspondiente y elongación de las redes de cresta. Y aunque a grandes rasgos se trate de la misma entidad patológica, parece que a nivel molecular y celular las lesiones causadas por nifedipina y ciclosporina presentan características diferentes ( 42 ). Evaluación del papel de los fibroblastos, su muerte y proliferación Respecto a los hallazgos sobre los fibroblastos son, en su mayoría, inconsistentes. Parece que los fibroblastos susceptibles de sufrir agrandamiento gingival responden de manera diferente a estos fármacos en comparación con células gingivales sanas, sugiriendo unas variaciones fenotípicas que dan lugar a una respuesta diferente frente al agente farmacológico ( 43 ). Tomando juntos todos los estudios, se podría decir que el mecanismo primario no va a derivar de la regulación directa sobre el metabolismo extracelular y la proliferación de los fibroblastos, pudiendo contribuir de una manera más significativa en el desarrollo y mantenimiento del agrandamiento los desequilibrios en las citoquinas ( 44 ). Algunos estudios se han centrado en evaluar el equilibrio entre proliferación y apoptosis, observándose una disminución de la apoptosis asociada a un aumento en la proliferación celular en todas las formas de
54 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival agrandamiento gingival inducido por fármacos ( 45 ). Aunque existe una tendencia general a encontrar una disminución de la apoptosis con aumento de la proliferación, existen algunos autores que no encuentran una relación concluyente ( 46 ). Evaluación de los marcadores de fibrosis Lo más característico del agrandamiento gingival es el proceso de fibrosis e inflamación que tiene lugar en el tejido, de ahí que muchas investigaciones se centren en el análisis de los factores relacionados con este proceso como pueden ser el colágeno, las citoquinas y los factores de crecimiento. En este desequilibrio de la homeostasis del tejido, se han registrado alteraciones en la matriz de metaloproteinasas (MMPs) - una familia de proteínas de degradación muy en relación con la periodontitis -, los inhibidores de metaloproteinasas (TIMPs) y catepsina-L (enzima proteolítica). En un estudio mediante PCR en pacientes con agrandamiento gingival por antagonistas del calcio y periodontitis se detectaron niveles elevados de MMP-1 y MMP-12 junto con aumento de la catepsina-L; y contradictoriamente, no encontraron aumento de los factores de crecimiento TGF-β1 y keratin-10 ( 47 ). En ese mismo estudio se analizaron biopsias de 4 pacientes con agrandamiento gingival por antagonistas del calcio, y a la principal conclusión que llegaron fue la gran variabilidad individual que presentaba esta patología. En contraposición, encontramos otro estudio en el que el nivel de esta MMP-1 se encuentra disminuido ( 48 ).
Lourdes Victoria Román Malo | 55 Cuando se han intentado analizar las variaciones en la MMPs y otras enzimas proteolíticas a nivel del fluido crevicular ( 49 ), los estudios han tenido poco éxito. Al igual que otros estudios relacionados con la composición salival ( 50 ). Respecto a las factores de crecimiento, se ha evaluado el papel del factor de crecimiento transformante β (TGF-β), cuya expresión se encuentra elevada en respuesta a la presencia de una herida ( 51 ). Existe amplia literatura que analiza las vías de señalización de TGF-β y su relación con los procesos de fibrosis ( 52 , 53 ). Existen 3 isoformas del TGF-β: 1, 2 y 3. Sabemos que TGF-β tiene un importante papel en la activación de los fibroblastos, siendo capaz de inducir la expresión de genes que promueven el depósito de componentes de la matriz extracelular y de aquellos de inhiben la MMPs ( 54 , 55 ). Por otro lado, varios ensayos in vitro han observado que la ciclosporina es capaz de aumentar la expresión de TGF-β1, hecho que explicaría el efecto fibrogénico de este fármaco a nivel celular ( 56 , 57 ). Por otro lado, está tomando gran importancia la presencia del factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF o CCN2); se trata de un polipéptido rico en cisteína secretado por las células del endotelio vascular y que pertenece a una familia de factores conocidos como CCN; los cuales se encargan de coordinar complejos procesos biológicos, entre los que se encuentran procesos de diferenciación y reparación. CTGF tiene su propia función como molécula de señalización celular y se asocia con la estimulación del acumulo y depósito de colágeno además de haberse establecido una relación directa con los procesos de fibrosis (43). Este CTGF es un marcador establecido de fibrosis, estudios in vivo muestra su presencia
56 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival en tejido fibrótico pero no en tejido normal ( 58 ). CTGF está fuertemente inducido por TGF-β1 ( 59 ), contribuyendo ambos a la regulación de los genes que controlan la matriz extracelular ( 60 ). Podemos considerar que TGF-β1 y CTGF/CCN2 van a crear un ambiente favorable para el desarrollo de la fibrosis ( 61 ), aunque ambos por sí solos no son capaces de explicar la formación de un tejido fibroso persistente, viéndose la necesidad de implicación de otros factores. Comparando a los fibroblastos del tejido gingival con las células del hígado y el pulmón, parece que las vías de señalización de CTGF y TGF-β presentan un comportamiento diferente en función del tejido ( 62 ). En estrecha relación con TGF-β, también encontramos la periostina, una proteína de la matriz celular claramente relacionada con procesos fibróticos ( 63 ). En un estudio realizado sobre biopsias de pacientes sanos y con agrandamiento gingival inducido por nifedipina se observó un incremento de la periostina mediante técnicas de inmunohistoquímica de estos respecto a los controles, además de valorar la presencia de periostina in vitro en cultivo celulares tratados con el fármaco ( 64 ). Hasta lo que se conoce, la presencia de periostina no se ha valorado en el agrandamiento gingival inducido por ciclosporina. Otro factor de los factores estudiado es el factor de crecimiento semejante a la insulina (IGF). Su acción sobre el fibroblasto incluye la inducción de la producción de colágeno y la inhibición de la producción de colagenasas ( 65 ). Ensayos sobre fibroblastos de ratas han observado como la
Lourdes Victoria Román Malo | 57 ciclosporina es capaz de inducir la proliferación de receptores de IGF junto a un aumento de la síntesis de matriz extracelular ( 66 ). Un paso esencial para un aumento de un tejido es el desarrollo de nuevos vasos o angiogénesis. La estrecha relación de CTGF y TGF-β con el endotelio vascular podría estar relacionada con la inducción de la angiogénesis. Ensayos clínicos en ratones han demostrado el papel proangiogénico tanto de la nifedipina como de la ciclosporina sobre el tejido conectivo, relacionando al agrandamiento, principalmente en el caso de la ciclosporina, con el aumento de la microvasculatura junto con la acumulación de colágeno ( 67 ). A nivel vascular se estudia el papel de la angiotensina y endotelina. La angiotensina es una enzima capaz de causar vasoconstricción y aumentar la presión sanguínea. Parece que el papel de la angiotensina en el agrandamiento gingival está ligado a TGF-β ( 68 ), observándose in vivo como angiotensina II no es capaz de inducir fibrosis en ausencia de TGF-β ( 69 ). También, en estrecha relación con TGF-β parece estar la endotelina ( 70 ), un potente vasoconstrictor con capacidad para inducir fibrosis mediante la estimulación de la replicación, migración y contracción del fibroblasto, aumento de la fibronectina, inducción de la síntesis de colágeno, y disminución de la destrucción de colágeno ( 71 ). Teoría de la transición de epitelio a mesénquima Otras hipótesis relacionan la patogénesis del agrandamiento con un proceso similar al que ocurre en algunos cánceres o enfermedades fibróticas;
64 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival subepitelial. Parece que presenta las características habituales de un tejido gingival libre con infiltrado inflamatorio (Figura 4 ( 91 )). Las características histológicas parecen no ser específicas, y el diagnóstico debe basarse en los hallazgos clínicos y la historia familiar del paciente ( 92 ). Mecanismo biológico Hasta la fecha, los mecanismos biológicos involucrados en la etiopatogenia de la fibromatosis gingival hereditaria siguen siendo desconocidos, pero al igual que con el agrandamiento gingival inducido por fármacos, se han analizado ciertos factores que se pudiesen relacionar con el crecimiento del tejido. Proliferación celular Los resultados de los primeros ensayos en cultivos celulares son contradictorios, principalmente debido a que en el pasado no se diferenciaba la fibromatosis gingival hereditaria como entidad única de otros síndromes que cursaban con fibromatosis (92), pero los últimos estudios parecen indicar que los fibroblastos procedentes de pacientes con fibromatosis gingival Figura 4. Corte histológico de la biopsia gingival de un paciente con fibromatosis. Hematoxilina y eosina a 10x y 50x. Se observa elongación en la crestas e infiltrado inflamatorio en el tejido conectivo (Sabina et al, 2015).
Lourdes Victoria Román Malo | 65 hereditaria presentan mayores tasas de proliferación ( 93 , 94 ). Concretamente, de Andrade (93) evaluó la proliferación celular - incluyendo cuatro técnicas diferentes - en 12 líneas celulares de distintos pacientes pero pertenecientes a la misma familia, y demostró la existencia de una proliferación de los fibroblastos de los pacientes con fibromatosis significativamente superior a los de un tejido gingival normal. Se ha observado que una alta tasa de proliferación de fibroblastos produce unos niveles elevados de síntesis de ácidos grasos y receptores andrógenos, lo que explicaría el factor hormonal dentro de la fibromatosis ( 95 ). Colágeno Respecto a la síntesis de colágeno, los resultados parecen ser inconsistentes, observándose tanto aumento como disminución del mismo ( 96 ). La tendencia es a observar mayor síntesis de colágeno en el fibroblasto del paciente con fibromatosis - entre un 30 y un 40% más de síntesis de colágeno ( 97 ). Esto se une a un aumento de la presencia de una molécula específica tipo chaperona: la proteína de choque térmico 47 (Hsp47) que se asocia a una mejor maduración y agregación del colágeno tipo I, y presenta cierto efecto inhibidor de la degradación de colágeno. La presencia de esta Hsp47 se ha encontrado significativamente elevada en los cultivos de fibroblastos de los pacientes con fibromatosis (95). Degradación de la matriz extracelular
66 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival Parece que otro de los mecanismos que contribuyen al agrandamiento es una menor degradación de la matriz extracelular. Esta se realiza a través de dos procesos: 1) fagocitosis por parte del fibroblasto ( 98 ) y 2) degeneración en el espacio extracelular por la acción de la familia de proteasas MMPs ( 99 ). Al igual que ocurre en el agrandamiento gingival inducido por medicamentos, se ha visto un descenso en los niveles de la actividad de la MMPs ( 100 ). Este descenso va a contribuir al aumento de los niveles de colágeno. Citoquinas y factores de crecimiento Los más estudiados son la IL-6 y el TGF-β, la expresión de ambos puede sustentar la aparición de gran parte de las características fenotípica de la fibromatosis gingival hereditaria ( 101 , 102 ). Ambos se asocian a una mayor cantidad de colágeno y Hsp47, y a una disminución de la MMP (97). Parece que esta característica también es compartida con el agradamiento gingival inducido por fármacos ( 103 ). El efecto que TGF-β tiene sobre los fibroblastos parece depender de su capacidad de inducir la transdiferenciación del mismo a miofibroblasto, a través del CTGF ( 104 ). Los miofibroblastos son células altamente especializadas que tiene un fenotipo entre un fibroblasto y una célula musculas lisa, caracterizándose por la expresión de α-actina ( 105 ). Estas células aparecen durante procesos de cicatrización de heridas, donde la contracción del tejido para el cierre y curación de la herida juega un papel esencial ( 106 ). Estos miofibroblastos quedan presentes de manera
Lourdes Victoria Román Malo | 67 permanente en lesiones fibróticas, llevando a una acumulación excesiva de colágeno ( 107 ). Por lo que parece que pudieran tener un papel importante en la fibromatosis gingival hereditaria. La fibromatosis gingival hereditaria se trata de una patología principalmente pediátrica en la que se debe descartar la presencia de un síndrome. Aunque esta patología de manera aislada no compromete la vida del paciente, sí que va a afectar en gran medida a la calidad de vida del mismo pudiendo conllevar problemas psicosociales y funcionales. 1.8 DISFUNCIÓN MITOCONDRIAL Y ESTRÉS OXIDATIVO Estudios anteriores han tratado de relacionar el proceso de agrandamiento gingival con cambios a nivel de la mitocondria, es necesario conocer esta estructura para poder valorar como puede llegar a influir en la aparición y persistencia del agrandamiento gingival. El oxígeno es esencial para todos los mamíferos. Lo obtienen a través de sus pulmones y es usado para oxidar moléculas ricas en carbono e hidrógeno y producir las diferentes formas de energía. Esta energía la va a usar el organismo para llevar a cabo todas las reacciones bioquímicas necesarias para el desarrollo de su vida. La energía se produce en forma de adenosin-5-trifostato (ATP), siendo su principal fuente de producción la mitocondria, que produce este ATP a partir de los productos del ciclo de Krebs, la oxidación de ácidos grasos, y la oxidación de aminoácidos, mediante la cadena de transporte de electrones y la fosforilación
68 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival oxidativa. Este procedimiento implica un proceso de oxidación en el que el oxígeno supone el principal combustible. Toda esta producción de energía en la mitocondria implica respiración celular, esta, a su vez, la componen reacciones metabólicas y procesos que tienen lugar en las células para finalmente convertir, bioquímicamente, a la energía contenida en los nutrientes en una forma molecular que pueda ser utilizada por la célula: ATP. Estos nutrientes incluyen azúcares, aminoácidos y ácidos grasos; y tienen en común al oxígeno molecular (O2) como agente oxidante, usándose como aceptor final del electrón. Así se produce la respiración aeróbica. La energía producida y almacenada en forma de ATP será utilizada en todos aquellos procesos celulares dependientes de energía; como son la biosíntesis, el movimiento o el transporte de moléculas a través de la membrana celular ( 108 ). Para hablar de disfunción mitocondrial, es importante conocer la estructura y función de la mitocondria. Sabemos que es un constituyente esencial en la mayoría de células eucariotas y que su diámetro oscila entre 0,5 y 10µm. Como se ha dicho anteriormente, supone una fuente de energía química para la célula; pero esta no es su única función, también está involucrada en los procesos de señalización a través de la homeostasis del calcio, diferenciación celular, apoptosis, crecimiento celular, mantenimiento del gradiente iónico transmembrana, síntesis proteica y transporte vesicular ( 109 ). Espacio intermembrana Membrana externa Membrana interna Matriz Crestas Lado exterior de la membrana externa Figura 5. Estructura de la mitocondria.
Lourdes Victoria Román Malo | 69 Estructuralmente, se encuentra cubierta por una doble membrana, es decir, dos bicapas lipídicas que separan cuatro compartimentos (Figura 5): I. Membrana externa. Es lisa y supone el límite entre la mitocondria y el citosol. Contiene las porinas mitocondriales y una proteína canal voltaje-dependiente selectiva de aniones. Esta membrana es altamente selectiva, dejando pasar por difusión simple a las moléculas de tamaño inferior a 500 Da mientras que previene el paso de moléculas mayores. II. Espacio intermembrana. Contiene iónes y moléculas esenciales para los procesos que se van a desarrollar en la mitocondria. III. Membrana interna. Forma una serie de invaginaciones hacia la matriz mitocondrial conocidas como crestas. La densidad de estas crestas varía en función del tejido. Esta membrana es poco permeable, sólo permite la difusión simple de algunos compuestos como agua, O2, CO2 y NH3; el resto de moléculas de importancia biológica necesitan la ayuda de canales específicos y proteínas transportadoras para traspasar la membrana. A diferencia de la membrana externa, esta membrana se encuentra libre de colesterol en su composición. Aquí en la membrana interna es donde se aloja el complejo megadalton de la cadena de transporte de electrones y la síntesis de ATP mediante la fosforilación oxidativa. IV. Matriz mitocondrial. Es donde tiene lugar el ciclo de krebs, la β-oxidación, y la síntesis de colesterol y lípidos. En la matriz también encontramos al ADN mitocondrial; se trata de un ADN circular compuesto por 37 genes. Este ADN codifica un número limitado de proteínas mitocondriales específicas, ARN
70 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival ribosómico y ARN de transporte; el resto de proteínas son producidas en el núcleo. Este ADN, para una mayor protección, se empaqueta en forma de nucleótidos compuestos por una o más copias asociado a proteínas. Lo característico del ADN mitocondrial es que su herencia es vía materna y acumula un gran número de mutaciones debido a que no está protegido por las histonas, es ineficazmente reparado y está más expuesto al daño oxidativo producido por los radicales libres. Las copias del ADN mitocondrial en una única célula pueden ser de cientos o miles; por ello, cuando todo este ADN es idéntico, prevalece una situación conocida como homoplasmia; mientras que cuando prevalecen dos o más genomas mitocondriales resulta en heteroplasmia; esa heteroplasmia supone un importante factor de severidad a tener en cuenta en las patologías mitocondriales. La población mitocondrial es dinámica y muestra variaciones en número, tamaño y masa durante las distintas etapas del desarrollo, diferenciación celular y diversas situaciones tanto fisiológicas como patológicas ( 110 ). Dentro de esta dinámica toma importancia el fenómeno de biogénesis mitocondrial en el que confluyen: 1) proliferación mitocondrial, que consiste en el aumento del número de mitocondrias por célula, y 2) diferenciación, mediante la cual este orgánulo adquiere sus características estructurales y funcionales específicas anteriormente descritas ( 111 ). Este fenómeno de biogénesis mitocondrial permite adaptar la población de mitocondrias a las demandas energéticas a través de la dinámica y la bioenergética mitocondrial, siendo unos de los moduladores más importante de la biogénesis
Lourdes Victoria Román Malo | 71 mitocondrial el factor A de transcripción mitocondrial (TFAM), a través de la interacción directa con el ADN mitocondrial ( 112 ). El número de mitocondrias por células está fuertemente relacionado con las demandas energéticas del tejido, pudiendo contener desde una docena a varios miles de mitocondrias por célula. Los órganos con mayor actividad metabólica contienen un mayor número de mitocondrias, así ocurre en músculo (liso, esquelético y cardíaco), hígado y cerebro. Siendo, por tanto, más susceptibles a la actuación de fármacos sobre la mitocondria y a las patologías mitocondriales. En muchos tejidos el estudio de la mitocondria mediante microscopía electrónica ha demostrado la existencia de las denominadas redes mitocondriales, en las que estas, forman fragmentos y ramificaciones de estructuras mayores. Otros datos hablan de un comportamiento célula/tejido-específico de la mitocondria en su dinámica, morfología, regulación y organización intracelular. Lo que indicaría una integración de la mitocondria dentro del citoesqueleto, el núcleo y el retículo endoplásmico ( 113 ). La visión de la mitocondria como productora de energía ha cambiado desde que se tiene conocimiento de su comportamiento dinámico en respuesta a señales intracelulares. Ahora sabemos que la mitocondria forma un retículo funcional cuyo estado estable morfológico es regulado por una dinámica de acontecimientos de fisión, fusión y movilidad ( 114 ). Como hemos comentado anteriormente, la estructura mitocondrial es altamente dinámica en función del tipo celular e incluso en una misma célula, pudiendo tener una amplia variedad de formas que van desde pequeñas esferas o bastones cortos a túbulos largos. Hay estudios que afirman que la mitocondria está
72 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival en constante movimiento y transiciones estructurales. Los túbulos mitocondriales se mueven con su ejes longitudinales alineados con el tracto citoesqueletal. Las mitocondrias aisladas pueden reconocerse entre sí durante estos movimientos y sufrir fusión, dando como resultado la fusión de las dobles membranas y la mezcla de ambas bicapas lipídicas y el contenido de la matriz mitocondrial. Por otro lado, una única mitocondria puede dividirse por fisión y dar lugar a dos o más mitocondrias más pequeñas. La mitocondria está en continua fusión y división, teniendo consecuencias importantes sobre su forma, función y distribución. Esta dinámica permite: - Controlar la forma, longitud y número de mitocondrias. - El intercambio del contenido de las membranas lipídicas e intramitocondrial (esencial para el mantenimiento de una población mitocondrial sana). - Afectar a la habilidad celular para distribuir sus mitocondrias en localizaciones subcelulares específicas. De hecho, las células especializadas presentan diferentes poblaciones mitocondriales con características estructurales y funcionales específicas para desempeñar tareas especializadas. - Con la fisión se facilita la apoptosis celular regulando la liberación de proteínas desde el espacio intermembrana hacia el citosol. - El envejecimiento de la mitocondria la hace más fácilmente detectable en células con baja tasa de recambio (como la neurona). Esta dinámica mitocondrial representa el mecanismo central de adaptación bioenergética a las necesidades metabólicas de la célula. La morfología mitocondrial afecta a la producción de ATP y eficiencia energética, y esta morfología cambia en
Lourdes Victoria Román Malo | 73 función de las demandas de ATP y disponibilidad de sustrato. Así, ante una baja demanda con sustrato suficiente, las mitocondrias serán más fragmentadas y numerosas, mientras que ante una mayor demanda con baja disponibilidad de sustrato, las mitocondrias se fusionarán y alargarán para mantener los niveles de ATP y la viabilidad celular ( 115 ). Podemos decir que dentro del funcionamiento celular, la dinámica mitocondrial tiene consecuencias en el desarrollo, la enfermedad y la apoptosis ( 116 ). Así, se conoce que la mitocondria está fuertemente involucrada a gran cantidad de procesos biológicos debido a sus dos características únicas: 1) a su elevada dinámica y cambios morfológicos, y 2) a su capacidad de detectar e influenciar las señales intracelulares (iones y moléculas como el Ca2+, ATP, pH y el potencial reductor) ( 117 , 118 ). El flujo intracelular de Ca2+ está altamente asociado con la mitocondria. Esta contribuye eficazmente a dar forma a la señal de Ca2+ a través de su absorción y liberación ( 119 , 120 , 121 ). Existen multitud de trasportadores de Ca2+ en las membranas mitocondriales ( 122 ). Las señales de Ca2+ en la matriz mitocondrial actúan sobre una serie de vías de señalización relacionadas con la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y es capaz de cambiar el estado oxidativo y controlar la función mitocondrial, oxidación de nutrientes, permeabilidad mitocondrial, muerte celular y morfología mitocondrial ( 123 ). El estudio de estas señales in vivo está constituyendo todo un desafío ( 124 ), tomando gran interés el efecto del Ca2+ en la generación de ROS y la regulación energética celular ( 125 ). La función mitocondrial también se ha relacionado con la inmunidad innata. Recientemente se han descubierto vías de señalización mediadas por la mitocondria
80 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival localizada, a irritación crónica e inflamación. Se están desarrollando diversos tratamientos antiinflamatorios para combatir al cáncer ( 146 ). Respecto al papel de la disfunción mitocondrial en la diabetes, existe una “hipótesis unificada” de que la sobrecarga de glucosa podría dañar a la célula a través del estrés oxidativo. Siendo esto responsable de la etiopatogenia de la mayoría de las complicaciones que tienen lugar en el paciente diabético ( 147 , 148 ). Como consecuencia del exceso de radicales libre se produciría la formación de productos finales de la glicación avanzada (AGEs), estos a su vez mediante la activación de diferentes vías moleculares proinflamatorias. Se ha observado que la administración de antioxidantes al paciente diabético previene de la aparición de complicaciones como la retinopatía, nefropatía y cardiomiopatía ( 149 ); en cambio, fallan como tratamiento de estas complicaciones ( 150 ). En el caso de la aterosclerosis, una patología caracterizada por la inflamación, junto a una alteración de la respuesta inmune y por ser un proceso proliferativo, se ha determinado una “deleción mitocondrial común” en el ADN mitocondrial que frecuentemente se asocia a esta patología ( 151 ). Esta deleción provoca una mala reparación del ADN mitocondrial dañado, quedando más expuesto a las especies reactivas del oxígeno. En lesiones de pacientes con aterosclerosis se ha observado un cúmulo de alteraciones tanto en el ADN nuclear como el mitocondrial en asociación directa con el grado de la lesión ( 152 ). Parece que se produce un daño progresivo de la cadena respiratoria mitocondrial que va a reducir el aporte energético a la célula alterando su actividad ( 153 ). Además se ha observado que los fármacos comúnmente usados para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares tienen cierto efecto antioxidante ( 154 ). También parece ser que este tipo de paciente se ven muy
Lourdes Victoria Román Malo | 81 beneficiados por los cambios en su alimentación con una dieta que incluya el consumo de frutas y verduras ricas en antioxidantes ( 155 ). En nuestro siglo, cada vez existe una mayor demanda de consumo de alimentos antioxidantes con la esperanza de mantenerse saludables y libre de enfermedad ( 156 ). Estando ya establecido el potencial efecto beneficioso de los antioxidantes frente a distintas patologías. El consumo exógeno supone la mayor fuente de antioxidantes del organismo ( 157 ). Cada vez tenemos mayor evidencia del papel que el daño o disfunción mitocondrial tiene dentro del envejecimiento y las patologías. Las alteraciones de su dinámica normal van a manifestarse de manera sistémica ( 158 ). Enfermedad periodontal y disfunción mitocondrial La entidad más ampliamente estudiada debido a su alta prevalencia en la población general es la periodontitis crónica, afectando alrededor del 40% de la población a partir de los 50 años ( 159 , 160 ). Ensayos clínicos demuestran la relación entre la periodontitis y el incremento del estrés oxidativo con la disminución de la capacidad antioxidante ( 161 ). Un ensayo sobre un amplio número de pacientes con y sin periodontitis demostró que en los paciente con periodontitis la existencia de una relación directa entre el estrés oxidativo y el acortamiento de telómeros ( 162 ) - regiones no codificantes del ADN que dan estabilidad estructural al cromosoma y están muy asociados con procesos de envejecimiento y carcinogénesis. Análisis mediante microscopía electrónica de fibroblastos del tejido gingival de pacientes con periodontitis crónica han observado anormalidades morfológicas en
82 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival un 60% de los pacientes, junto a un incremento en la producción de ROS, y a una reducción del potencial de membrana mitocondrial y el consumo de oxígeno. Además, se detectaron mutaciones en el ADN mitocondrial de los fibroblastos del tejido gingival que no parecían a nivel de células sanguíneas ( 163 ). Estas mutaciones parecen que se acumulan en el ADN mitocondrial de los fibroblastos gingivales por una acción directa de las ROS ( 164 ). En análisis mediante microscopía electrónica de pacientes con agrandamiento inducido por bloqueantes de los canales del calcio con una patología cardiovascular de base se observa una restauración de la morfología mitocondrial respecto a los pacientes con patología cardiovascular no tratados con estos fármacos ( 165 ). En esta relación entre enfermedad periodontal y mitocondria se habla de la existencia de un estado proinflamatorio en el que la respuesta inflamatoria del individuo se ve modificada por el estrés oxidativo/disfunción mitocondrial. 1.10 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA En los últimos años la investigación de la etiopatogenia de la enfermedad periodontal se ha centrado en la búsqueda de su relación con distintas patologías sistémicas como son la enfermedad cardiovascular, la diabetes o el bajo peso del niño al nacer entre otras. Uno de los aspectos estudiados ha sido el del papel que juega el estrés oxidativo, y en relación directa con este, la mitocondria. Debido a la cantidad de funciones que se van atribuyendo a esta organela, está adquiriendo un papel protagonista como responsable de muchas patologías entre las que encontramos aterosclerosis, hipertensión, resistencia a la insulina, fallo cardíaco, cáncer y procesos de envejecimiento.
Lourdes Victoria Román Malo | 83 Una de las vías para el estudio de esta relación es la evaluación de la cavidad oral de los enfermos cardiovasculares, y dentro de ellos destacan los efectos que sobre la homeostasia de la encía pueda tener tanto la enfermedad en sí como la medicación que puedan estar tomando. Los efectos secundarios de distintos fármacos a nivel de la encía, como el agrandamiento gingival, ha sido objeto de estudio en los últimos años, destacando a la ciclosporina y la nifedipina. Se trata de fármacos que una vez prescritos, van a acompañar al paciente por el resto de su vida. La ciclosporina se utiliza como medicamento modulador de la respuesta inmune en pacientes trasplantados principalmente, pero tiene efectos cardíacos secundarios. Por otro lado, la nifedipina se utiliza como medicamento vasodilatador en la hipertensión. Se ha intentado ver el mecanismo etiopatogénico involucrado en este proceso que parece compartir ciertas características tanto clínicas como subclínicas con la fibromatosis gingival hereditaria, pero no se ha llegado a conclusiones evidentes. Por ello, vamos a estudiar el mecanismo por el cual se va a producir este agrandamiento que en tantas ocasiones se ha tratado en la literatura, buscando incorporar los nuevos conocimientos de la biología molecular que se han adquirido en los últimos años. Nos centraremos en el análisis de los parámetros mitocondriales alterados en la encía de manera secundaria a los fármacos, además indagaremos en ver si la alteración de estos parámetros se da también a nivel del miocardio. Con ello intentaremos correlacionar las alteraciones mitocondriales en ambos tejidos: el miocardio y la encía.
84 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival
Lourdes Victoria Román Malo | 85 Hipótesis
86 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival
Lourdes Victoria Román Malo | 87 2. HIPÓTESIS El agrandamiento gingival inducido por fármacos conlleva cambios estructurales y morfológicos que podrían estar asociados a alteraciones oxidativas y mitocondriales. Además, estos cambios podrían tener una correlación con otros tejidos sistémicos como el tejido cardíaco. Por último, la disfunción mitocondrial y el estrés oxidativo podrían estar también involucrados en el agrandamiento gingival asociado a fibromatosis gingival hereditaria.
88 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival
Lourdes Victoria Román Malo | 89 Objetivos
96 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival guillotina. Se Tomaron entonces muestras de encía, músculo cardíaco y una hemimandíbula para su análisis con microscopía óptica, microscopía electrónica y bioquímica. 4.2 ESTUDIO MORFOLÓGICO Microscopía óptica Una vez extraídas las muestras de mandíbulas se fijaron en formaldehído al 4% durante 12 horas. Tras la fijación se sumergieron en 15mL de solución descalcificadora OsteoSoft® (Merck, Darmstadt, Alemania) durante 15 días, antes de proceder a la técnica habitual de inclusión en parafina. Al 5º día del inicio de la descalcificación se les practicó una incisión transversal con bisturí frío, de manera que obtuvimos un bloque de unos 5mm de grosor que contenía los molares de la rata con su encía alrededor. Procedimos entonces a la técnica habitual de inclusión en parafina realizada por un procesador de tejidos (STP-120, ESPECIALIDADES MÉDICAS MYR, S.L). Obtenidos los bloques se realizaron cortes al micrótomo de entre 4 y 5 µm de espesor. Los cortes se colocaron en un baño de 37ºC, se recogieron con portaobjetos silanizados, y se conservaron durante 60 minutos en la estufa a 60ºC. Realizamos entonces la tinción con la técnica de Hematoxilina-Eosina (H&E): - Hidratación del tejido: - Xilol 1 durante 10 minutos. - Xilol 2 durante 10 minutos.
Lourdes Victoria Román Malo | 97 - Batería de alcoholes decrecientes: 30 pases en etanol de 100º. 30 pases en etanol de 100º. 30 pases en etanol de 90º. 30 pases en etanol de 80º. 30 pases en etanol de 70º. 5 minutos en agua destilada. - Tinción: - Hematoxilina (colorante básico), durante 2 minutos. - Lavar con agua de grifo y escurrir en papel de filtro. - 2 pases en carbonato de litio (CO3Li2) - Lavar con agua de grifo y escurrir en papel de filtro. - Eosina (colorante ácido), durante 2 minutos. - Lavar con agua destilada y escurrir en papel de filtro. - Deshidratación: - Batería de alcoholes crecientes: 30 pases en etanol de 70º. 30 pases en etanol de 80º.
98 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival 30 pases en etanol de 90º. 30 pases en etanol de 100º. 30 pases en etanol de 100º. - Xilol 1 durante 10 minutos. - Xilol 2 durante 10 minutos. Se montaron los cristales echando una gota de resina para pegar el cubre y se dejó secar. Análisis morfométrico de la microscopía óptica Se tomaron fotografías de las tinciones de H&E para la medición del agrandamiento gingival, valorándose este con dos medidas: A. Altura del tejido gingival: como la distancia entre la cresta ósea marginal y el margen gingival de la encía libre siguiendo el eje axial del diente. B. Anchura del tejido gingival: como la distancia entre la superficie dental y la superficie del epitelio a nivel del límite apical del epitelio de unión en sentido perpendicular al eje axial del diente. Se seleccionaron para ello solamente aquellos cortes en los que la encía y el diente aparecían íntegros. Para la medición se realizaron microfotografías a una magnificación de 10x, tomándose como referencia una cuadrícula micrométrica colocada en el ocular del microscopio óptico (Olympus). Las fotografías se calibraron y midieron con la ayuda del software ImageJ 1.46r, programa de dominio público del U.S. National Institutes of Health (Rasband WS. ImageJ. U.S. National
Lourdes Victoria Román Malo | 99 Institutes of Health, Bethesda, Maryland. 2008) (Figura 6). Se realizaron tres mediciones distintas por el mismo operador y se realizaron las medias. Microscopía electrónica Realizamos técnicas de microscopía electrónica en las muestras de encía y músculo cardíaco siguiendo la técnica previamente descrita por Quiles et al en 2010 ( 166 ). Para ello, fueron inmediatamente seccionadas en piezas pequeñas y fijadas en una solución de formaldehído al 1,5% en tampón de cacodilato al 1%, pH7,4 durante 2 horas. Posteriormente se realizaron 3 lavados con un tampón de cacodilato, continuándose la fijación con tetraóxido de osmio (OsO4) al 1% durante 60 minutos. La temperatura de la muestra durante el procesado se mantuvo en 4ºC. Lavamos con agua destilada y procedemos a la deshidratación de la muestra mediante una escala de etanoles creciente: A B Figura 6. Análisis morfométrico del tejido gingival. A) Altura del tejido gingival, B) Anchura del tejido gingival.
100 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival 15 minutos de etanol al 30%. 15 minutos de etanol al 50%. 2 horas de etanol al 70%. 15 minutos de etanol al 90%. 15 minutos de etanol al 100%. 15 minutos de etanol al 100%. La muestra entonces es embebida en una resina Epon, y tras permanecer incubando toda la noche a 65ºC, se realizan los cortes con un ultramicrotomo (Ultracut S). Primero se practica un corte semifino de 1µm perpendicular a la superficie del epitelio y el tejido conectivo subyacente de manera que nos permita escoger el corte adecuado para nuestro estudio de las ultraestructuras del fibroblasto y célula muscular cardíaca. Posteriormente se realizan cortes ultrafinos de 70nm de espesor con una hoja de diamante usando el ultramicrotomo Ultracut S y estos cortes se recogen en una rejilla de cobre. Todas las secciones se tiñeron sumergiéndolas durante 5 minutos en acetato de uranilo en solución acuosa y durante 3 minutos en una contratinción de citrato. Los cortes se visualizaron con el microscopio electrónico de transmisión Carl Zeiss EM10C (Oberkochen, Germany) a 4000x, 7500 y 40000x aumentos en el Centro de Investigación Biomédica de la Universidad de Granada. El software ImageJ 1.46r fue usado para determinar el área y perímetro de las mitocondrias. Análisis morfométrico de la microscopía electrónica
Lourdes Victoria Román Malo | 101 Para su análisis morfométrico, se consideraron sólo aquellos fibroblastos del tejido conectivo superficial y células musculares cardíacas en las que se apreciaba el núcleo. Se tomaron imágenes con el microscopio electrónico de transmisión y se estudiaron mediante un software analizador de imágenes ImageJ 1.46r y se determinaron el área y el perímetro de las mitocondrias. 4.3 DETERMINACIONES BIOQUÍMICAS Se determinarán tanto en las muestras de encía como en las de corazón. Preparación de los homogenados de las muestras Las muestras de tejidos de encía y corazón debidamente identificados, fueron seccionados en trozos más pequeños y homogenados usando sobre un eppendorf un mezclador (VWRTM Pellet Mixer, VWR International), y añadiendo 300 μl de tampón de lisis por cada 5 μg de tejido (tampón de lisis: 0,9% NaCl, 20mM TrisHCL pH 7’6, 0,1% Tritón x-100), al que se le incluyó un cóctel inhibidor de proteasas (1% PMSF, 1% CIP). Las muestras se sonicaron para liberar las proteínas de las membranas celulares con pulsos de 4 segundos y manteniendo la cadena de frío usando un sonicador (Bandelin, Sonoplus de LABOLAN). Los eppendorf se centrigaron durante 5 min a 10000rpm a 4ºC y se recogió el sobrenadante. Estos homogenados se conservaron a -80ºC hasta su uso. Cuantificación de la cantidad de proteínas en los homogenados Se determinó la cantidad de proteína del homogenado usando el método de Bradford ( 167 ).
102 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival El ensayo se realiza añadiendo en una placa multipocillo: 10μL de NaOH 1M, 1μL de la muestra y 200µL de reactivo de Bradford. Se usa como blanco un pocillo con NaOH y reactivo de Bradford. Después de dejar incubar la mezcla durante 5 minutos a temperatura ambiente y protegida de la luz, se mide la absorbancia a 595nm en un lector de microplacas para absorbancia iMark (Bio-Rad). La cantidad de proteína se determinó mediante una recta patrón realizada con cantidades conocidas (0-28μg) de inmunoglobulina G. Análisis de la masa mitocondrial Para ello, medimos la actividad de la citrato sintasa, una enzima de la matriz mitocondrial encargada de catalizar la primera reacción del ciclo de Krebs cuya cantidad permanece altamente constante en la mitocondria y es considerada un marcador de contenido en mitocondrias ( 168 ). Por ello permite normalizar su actividad a la cantidad relativa de mitocondrias, usándose como marcador de masa mitocondrial. La actividad específica de la citrato sintasa en los extractos de tejidos homogeneizados será medida a 412nm utilizando 5,5-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid) para detectar los grupos sulfidrilos libres del coenzima A. Para ello seguimos el método que ya ha sido descrito anteriormente por Garrabou ( 169 ). Por duplicado y en el siguiente orden añadimos a la cubeta: - Tris-HCl 0,75M pH8 100μL 75mM. - DTNB 1mM 100μL 100μM. - Triton 1% 100μL 0,1%.
Lourdes Victoria Román Malo | 103 - Acetil CoA (7mg/mL) 50μL 350μg/mL. - Homogenado de la muestra 5μL. - Agua destilada (H2Od) 595μL. Agitamos e incubamos durante 2 minutos a 30ºC, para finalmente añadir: - Oxalacetato 10mM 50μL 0,5mM. Volvemos a agitar e incubamos durante 30 segundos a 30ºC. Pondremos entonces a leer los datos durante 2 minutos a una longitud de onda de 412nm usando para ello un espectofotómetro (DU 800UV/Vis Spectrophotometer) (Cálculos: ε = 13,6 mM-1cm-1 (Abs/min) = Abs / min con Oxalacetato). Niveles de ATP Los niveles de ATP se determinaron en los homogenados de tejido mediante un ensayo de bioluminiscencia utilizando un kit de determinación de ATP (Molecular Probes). Este kit se basa en el requerimiento de ATP por parte de la luciferasa para la producción de luz, de manera que a mayor contenido de ATP de la muestra, mayor será la emisión de luz. De acuerdo con las instrucciones de fabricante, en los ensayos se mezclaron cantidades proporcionales de una solución de reacción que contenía luciferasa de luciérnaga recombinante y su sustrato D-luciferina con los homogenados de tejido, para medir posteriormente la luminiscencia emitida con un luminómetro (GloMax®- Multi Jr, Promega). Detección de colágeno
104 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival La cantidad de colágeno en los homogenados de muestra se determinó por espectofotometría utilizando un kit comercial Sircol Collagen Assay (Biocolor). Por este método de unión a colorante se pretende analizar el colágeno soluble en ácido y peptina. El ensayo evalúa la tasa de colágeno recién sintetizado que se produce durante los periodos de crecimiento y desarrollo rápido, pero también el producido por procesos de inflamación, cicatrización de heridas y desarrollo de tumores. Para la determinación se siguen las instrucciones del fabricante, para finalmente medir a 595nm con un lector de microplacas para absorbancia iMark (Bio- Rad). Peroxidación lipídica Lo que se pretende es analizar los niveles de TBARS (thiobarbituric acid reactive substances) en los tejidos usando un método basado en la reacción del mismo con los lipoperóxidos a 90–100ºC. Preparación del TBARS: - 20mL H2Od. - 5mL ácido Sulfúrico. - 0,2gr ácido Tiobarbitúrico (Sigma-Aldrich). Se añade en un eppendorf el mismo volumen de muestra y de ácido ticloroacético (TCA) al 20%, entre 100-200µL. Se centrifugan 5 minutos a 3000rpm a 15ºC, recogiéndose el sobrenadante en otro eppendorf, para añadir un volumen aproximado al obtenido de TBARS al 0,67%.
Lourdes Victoria Román Malo | 105 La mezcla se hierve a 90ºC durante 15 minutos y se deja enfriar a temperatura ambiente. Trasladamos las muestras a compartimentos para el espectofotómetro de un tamaño acorde al tamaño de la muestra usando como blanco una mezcla de TCA+TBARS a partes iguales. Pondremos entonces a leer los datos a una longitud de onda de 532nm en el espectrofotómetro (DU 800UV/Vis Spectrophotometer). Los resultados obtenidos se corresponden a equivalentes de malondialdehido (MDA) utilizando un coeficiente de extinción de 1,56β 105 M-1 cm-1. Aplicamos la siguiente fórmula: 𝑛𝑚𝑜𝑙 𝑀𝐷𝐴 𝑔𝑃𝐹 =( 𝐴535 − 𝐴600) × 𝑚𝑚𝑜𝑙 1,56 ×105𝑚𝑙 ×106𝑛𝑚𝑜𝑙 1𝑚𝑚𝑜𝑙 ×1𝑚𝑙 0,1𝑔𝑃𝐹 Análisis de proteínas mediante western blot Vamos a utilizar los siguientes anticuerpos primarios preparados a una concentración de 1:250 en una solución de TBS 1x (5% de BSA + 0,1% Tween20). - GAPDH (Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa), que nos a servir como control de carga (GAPDH (FL-335): sc-25778, Santa Cruz Biotechnology, INC.). - TFAM, (Factor A de transcripción mitocondrial) (TFAM Sygma Aldrich). - OGG1/2 (8-oxoguanina DNA glicosilasa) (OGG1/2 (G-5):sc-376935, Santa Cruz Biotechnology, INC.).
112 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival Transcurrido este tiempo se echó medio de cultivo. Estos fibroblastos se cultivaron con medio de cultivo DMEM (4,5mg/L de glucosa, L- glutamina, piruvato – Gibco, Invitrogen) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS, Gibco, Invitrogen) y 0,5% de antibiótico (Sigma Chemical Co.). Las células se incubaron a 37ºC en una atmósfera de CO2 al 5% y se dejaron crecer. La recolección de los fibroblastos para los distintos ensayos se realizó recogiéndose con tripsina (0,25% Trypsin-EDT Solution, Sigma), centrifugándose a 2000rpm durante 5 minutos a 4ºC y resuspendiéndose en tampón de lisis (0,9% NaCl, 20mM TrisHCL pH 7’6, 0,1% Tritón x-100). Evaluación de los lípidos peróxidos Se evaluó en los PBMCs usando la misma técnica descrita en el aparatado 5.3. Evaluación de la síntesis de colágeno Se determinó la síntesis de colágeno en los homogenados de tejido gingival. Se quiso evaluar la influencia del estrés oxidativo sobre los fibroblastos en cuanto a la síntesis de colágeno, diseñándose un ensayo en el que los fibroblastos sanos permanecieron 48h en las siguientes condiciones: Sin tratamiento H 2 O 2 100µM H 2 O 2 100µM + CoQ10 30µM
Lourdes Victoria Román Malo | 113 El colágeno se evaluó de la misma manera que se describe en el apartado 5.3, tanto en los homogenados de tejidos como en los homogenados de fibroblastos tratados. Determinación de los niveles de CoQ10 en los PBMC El estudio de los niveles de CoQ se realizó en dos pasos: 1) Extracción del CoQ de las membranas biológicas. Sin romper la cadena de frío (4ºC) se toman 100μL del homogenado de la muestra y se resuspende en 500μL de PBS. Esto se pasa a un tubo de vidrio de 15mL con tapón de rosca (Pirex) y se le añade Q9 como estándar interno de la extracción. La concentración del estándar se determinó por espectrofotometría, a una longitud de onda de 275nm (εCoQ9=14,7mM-1). La solución celular con el estándar interno se mantuvo en hielo 5 minutos para después añadir 500μL de SDS al 2% y agitar con un vortex durante un minuto a máxima potencia. A continuación se añaden 2mL de una mezcla etanol:isopropanol 95:5 y se vuelve a vortear durante un minuto. Seguidamente, añadimos a la mezcla 5mL de hexano, se agita con el vortex y se centrifuga a 1000g durante 5 minutos a 4°C para separar la fase orgánica (compuesta por los lípidos) de la fase soluble. Tras esta centrifugación, la fase orgánica se transfiere a una ampolla de rotavapor de 25mL, volviendo a repetirse la extracción con
114 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival hexano dos veces más. El hexano de las ampollas se seca en un rotavapor (R-3000, B·U·CHI), en condiciones de vacío, a 35ºC y con un una potencia de rotor del 50%. El residuo seco se reconstituye en 333μL de etanol (calidad HPLC) y se pasa a un Eppendorf limpio, repitiendo el lavado dos veces más. El etanol se evapora por vacío (SPD121P, Savant) durante 2-3 horas a 50°C, guardando finalmente el residuo seco a -20°C para ser reconstituido en el volumen adecuado de etanol (calidad HPLC) antes de la medida cromatográfica. 2) Determinación de los niveles de CoQ por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). El proceso de separación de los componentes lipídicos de las muestras se lleva a cabo en un HPLC Beckmann 166-126, equipado con una columna sílica de fase reversa 15-cm Kromasil C-18, con horno a 40 ºC, flujo de 1mL/min en una fase móvil compuesta de metanol:isopropanol (60:40) y 1,42 mM de perclorato de litio. Los niveles de CoQ se analizan por detectores ultravioleta (System Gold 168; Beckman Coulter, Brea, CA, USA) y electroquímico (Coulochem III ESA). Los datos obtenidos fueron referidos a mg de proteínas.
Lourdes Victoria Román Malo | 115 4.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO Se realizará un estudio estadístico descriptivo de las variables analizadas en los tres grupos (porcentaje, media, desviación estándar). Se comprobarán las diferencias entre grupos comprobando la normalidad con el test de Kolmogorov. Posteriormente se usará el test de ANOVA con el test post hoc de Bonferroni para ver las diferencias entre grupos. El nivel de significación que se utilizará será p<0,05. Todos los datos se tabularán y serán procesados con el paquete estadístico SPSS.
116 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival
Lourdes Victoria Román Malo | 117 Resultados
118 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival
Lourdes Victoria Román Malo | 119 5. RESULTADOS 5.1 ANÁLISIS DEL GRADO DE AGRANDAMIENTO GINGIVAL MEDIANTE MICROSCOPÍA ÓPTICA Los cortes histológicos teñidos con H&E (Figura 7) muestran de forma total o parcial al primer molar mandibular de la rata rodeado por todo el complejo periodontal dentro del maxilar inferior. Se puede apreciar la pulpa dental y el tejido óseo. A nivel gingival vemos como las crestas epiteliales disminuyen en el grupo N. Las mediciones en estos cortes fueron realizadas por duplicado, por el mismo operador y en días distintos, obteniéndose las medias y desviaciones estándar. Se valoró tanto la anchura como la altura del tejido. El análisis de las mediciones nos muestra que en el grupo CsA se ha producido un aumento significativo del tejido en altura, no siendo así para el grupo N, cuyos valores son equiparables a los del grupo CTL. En el caso de la anchura, no existen diferencias significativas de los grupos de tratamiento respecto a los CTL (Figura 8).
120 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival CONTROLES (CTL) NIFEDIPINA (N) CICLOSPORINA (CsA) Figura 7. Cortes histológicos teñidos con hematoxilina y eosina de los tres grupos de tratamiento. A la izquierda se observa el primer molar rodeado por su periodonto a 4x, y a la derecha vemos en detalle la encía vestibular a 10x.
Lourdes Victoria Román Malo | 121 5.2 ANÁLISIS ULTRAESTRUCTURAL DE LAS MITOCONDRIAS Al igual que en el caso anterior, en el grupo que se observan más cambios es en el CsA, cuyas mitocondrias a nivel del tejido gingival presentan mayor área y perímetro respecto al grupo CTL y N, las mitocondrias son significativamente mayores. En el caso del tejido cardiaco no se observan diferencias entre grupos (Figura 9). 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 CTL N CsA A) Altura del tejido gingival (µm) 0 100 200 300 400 500 600 700 CTL N CsA B) Anchura del tejido gingival (µm) Figura 8. Evaluación morfométrica del tejido gingival vestibular en altura (A, a la izquierda) y en anchura (B, a la derecha). * = p<0.05. *
128 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival 5.8 WESTERN-BLOT EN TEJIDO CARDÍACO Respecto a OGG, se encuentra significativamente disminuída en el grupo CsA. La biogénesis mitocondrial, marcada por TFAM, se mantiene en valores estables, existiendo diferencias entre N y CsA pero no de ambas respecto a los CTL. La alteración más marcada se produce a nivel de los antioxidantes, con un comportamiento diferente en el grupo N y en el CsA. Se produce un descenso significativo de MnSOD y catalasa en el grupo CsA, mientras que para el grupo N la MnSOD se mantiene en niveles equiparables a los CTL, y la catalasa ligeramente inferiores (Figura 17). Analizando las proteínas de disfunción mitocondrial y estrés oxidativo vemos que existe un comportamiento diferente según los tejidos y según los fármacos. CTL N CsA MnSOD Catalase GAPDH TFAM OGG 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 CTL N CsA OGG 1-2/GAPDH 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 CTL N CsA TFAM/GAPDH 0 0,2 0,4 0,6 0,8 CTL N CsA Catalasa/GAPDH 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 CTL N CsA MnSOD/GAPDH Figura 16. Western-blot en tejido gingival. *p˂0.05, ** p˂0.01. * * * * ** ** **
Lourdes Victoria Román Malo | 129 5.9 PACIENTES CON FIBROMATOSIS GINGIVAL HEREDITARIA Una vez realizados los análisis en nuestro modelo animal, quisimos valorar el comportamiento a nivel estructural y molecular de este agrandamiento gingival en un modelo de patología en humanos, como es el agrandamiento idiopático que se produce en la fibromatosis gingival hereditaria. Descripción del caso clínico Un señor de 50 años de edad acude al área clínica de la Facultad de Odontología de la Universidad de Sevilla aquejando la presencia de “una hinchazón de las encía en toda su boca” que le causaba dificultades en el habla y que comenzó 4 o 5 años atrás habiendo progresado lentamente. El paciente presentaba salud MnSOD CTL1 CTL2 N2 N1 CsA1 CsA2 Catalase GAPDH TFAM OGG 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 CTL N CsA OGG 1-2/GAPDH 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 CTL N CsA TFAM/GAPDH 0 0,5 1 1,5 2 CTL N CsA MnSOD/GAPDH 0 0,5 1 1,5 2 2,5 CTL N CsA Catalasa/GAPDH Figura 17. Western-blot en tejido cardiaco. *p˂0.05, ** p˂0.01. ** **
130 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival sistémica y tras el correspondiente análisis clínico y radiológico no se le diagnosticó ninguna otra patología (Figura 18). Le propusimos al paciente realizar un análisis intraoral a su familia. El paciente tenía dos hijas, una de las cuales, con 12 años de edad, presentaba características gingivales similares a las del padre pero menos acentuadas (Figura 19). En ambos podía observarse un agrandamiento gingival que involucraba tanto a maxilar como a mandíbula, afectando a toda la encía alrededor de la dentición permanente y temporal. En el paladar del padre se puede observar que el tejido crecido forma un túnel que dificultaba el habla y la higiene. En las ortopantomografías no se observan lesiones óseas en las ortopantomografías. Observando la presencia de este agrandamiento gingival idiopático, no asociado al consumo de fármacos o a síndromes, la presencia de salud sistémica y el patrón hereditario del agradamiento, fueron diagnosticados de fibromatosis gingival hereditaria.
Lourdes Victoria Román Malo | 131 El tratamiento consistió en la instauración de unas rigurosas medidas de higiene oral y revisiones periódicas. Para el padre, que era quien presentaba el agrandamiento más severo e incapacitante, la gingivectomía a bisel externo fue la técnica quirúrgica de elección realizada en dos pasos y asociada a una rigurosa técnica de higiene oral. Se realizaron incisiones en el paladar para eliminar el tejido gingival sobrante en ambos cuadrantes del maxilar. El tejido total extirpado consistió en cuatro fragmentos de 100g, de superficie brillante y blanquecina, con consistencia densa y homogénea (Figura 20). Figura 18. Fotos intraorales y ortopantomografía del padre. Se aprecia la mordida abierta anterior derecha, rotaciones y migraciones dentarias, diastemas y un agrandamiento severo que compromete la masticación, dificulta la higiene y afecta al habla. Ausencia de 36 asociada a una gran caries.
132 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival Durante el postoperatorio y cicatrización no se produjo ningún tipo de complicación o incidencia (Figura 21). Los pacientes continuaron con sus revisiones periódicas. Figura 19. Fotos intraorales y ortopantomografía de la hija. Paciente en fase de dentición mixta. Se aprecia también la mordida abierta anterior derecha. Existe un retraso en el recambio dentario y falta de erupción pasiva. Grosor de tejido queratinizado aumentado alrededor de los dientes permanentes erupcionados.
Lourdes Victoria Román Malo | 133 Hallazgos histopatológicos en la H&E Los cortes teñidos con H&E muestran la presencia de infiltrado inflamatorio, e imágenes de falta de continuidad de la lámina basal, migración celular desde el epitelio y células de aspecto mesenquimatoso en el interior del tejido conectivo (Figuras 22 y 23). Estas imágenes son compatibles con la teoría de “Epithelial to Mesenchymal Transition”. Figura 20. Gingivectomía. Figura 21. Retirada de sutura a los 15 días y cicatrización tras 6 semanas.
134 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival A nivel ultraestructural del tejido, se observan imágenes compatibles con autofagosomas y acumulación de vesículas en la célula (Figura 24). Análisis de los PBMC En el caso del paciente que manifestaba los signos clínicos más severos (el padre) se observó una mayor presencia de peroxidación lipídica y una disminución de los niveles de CoQ10, un importante antioxidante y transportador de electrones mitocondrial (Figura 25). Lo que es indicativo de presencia de estrés oxidativo. Figura 23. Hematoxilina y eosina en la hija. Las flechas incidan rotura de la lámina basal con migración celular, y las puntas la presencia de células de aspecto mesenquimatoso. Figura 22. Hematoxilina y eosina en el padre. Se puede observar el infiltrado inflamatorio. Figura 24. Microscopía electrónica de las biopsias gingivales, a la izquierda el padre, y a la derecha la hija.
Lourdes Victoria Román Malo | 135 Evaluación de la síntesis de colágeno Se observó que la presencia de nuevo colágeno en el tejido gingival de los pacientes era significativamente mayor que en los controles. Y la cantidad se relacionaba directamente con el grado de agrandamiento clínico (Figura 26). Influencia de las ROS en la síntesis de colágeno Para comprobar la relación entre el incremento de estrés oxidativo y la síntesis de colágeno, realizamos un modelo experimental in vitro. Para ello, sometimos a estrés oxidativo a fibroblastos sanos, así como a un potente antioxidante. La presencia de H2O2, precursor de la peroxidación lipídica, indujo la síntesis de colágeno en los fibroblastos gingivales del donante sano, restaurándose a los valores normales cuando se administraba junto a CoQ10 (Figura 27). Figura 26. Evaluación de la síntesis de colágeno. * = p<0.05, **=p>0.001. 0 5 10 15 20 25 30 CTL Paciente 1 (padre) Paciente 2 (hija) Niveles de MDA nMol/millón de células 0,00 50,00 100,00 150,00 200,00 250,00 300,00 350,00 Control Paciente 1 (padre) Paciente 2 (hija) pMo de CoQ10/mg de proteinas Figura 25. Evaluación del estrés oxidativo en células mononucleares periféricas, a la izquierda vemos los niveles de lípidos peróxidos (MDA), y a la derecha los niveles de coenzima Q (CoQ10). * = p<0.05, **=p>0.001. ** **
136 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 Control H2O2 H2O2+CoQ10 Niveles de colágeno (ng/mL) * Figura 27. Ensayo sobre la influencia del estrés oxidatico (H 2 O 2 ) sobre la síntesis de colágeno. * = p<0.001.
Lourdes Victoria Román Malo | 137 Discusión
144 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival exhaustivo de los parámetros mitocondriales, por ello planteamos este estudio sobre modelo animal, que nos permita acercarnos un poco más a la evidencia científica. Los niveles de peroxidación lipídica nos van a resultar un indicador útil del estrés oxidativo, ya que la presencia de lipoperoxidación es una de las consecuencias más conocidas de la generación de ROS ( 191 ). Los lípidos, principales componentes estructurales de las membranas celulares, son compuestos muy susceptibles a la oxidación, de ahí que los lípidos peróxidos se usen como biomarcadores del estrés oxidativo ( 192 ). El malondialdehido (MDA) es uno de los productos finales de bajo peso molecular formados durante la descomposición de los ácidos grasos polinsaturados inducida por ROS ( 193 ). MDA reacciona rápidamente con el ácido tiobarbitúrico produciendo un pigmento rojo que puede ser fácilmente medido por espectofotometría en forma de sustancia reactiva del ácido tiobarbitúrico (TBARS) (193). Aunque este ensayo es criticado debida a su baja especificidad y variación según las condiciones del ensayo ( 194 ), estas parece que son debidas a las variaciones individuales de concentración de MDA ( 195 ), de ahí que siempre refiramos nuestros resultados a la cantidad de proteína de la muestra detectada mediante el método Bradford. Observando nuestros resultados, en el grupo N hay un ligero aumento de los niveles sólo a nivel del tejido gingival, mientras que en el grupo CsA hay un aumento significativo de lípidos peróxidos respecto a los controles tanto para encía como para tejido cardíaco. A través de la evaluación de los lípidos peróxidos con una técnica similar, Josephine et al ( 196 ) han relacionado los daños renales secundarios a la administración de CsA con el estrés oxidativo. Esto parece indicar que la mitocondria trata de mantener el rendimiento energético (niveles de ATP) con una dinámica que
Lourdes Victoria Román Malo | 145 la lleva aumentar los niveles de lípidos peróxidos y consecuente, mayor estrés oxidativo en el tejido. Para completar el análisis del funcionamiento mitocondrial hemos evaluado varias proteínas mediante técnicas de western blot. Esta técnica está universalmente extendida como el método más idóneo para detección de proteínas, ya que nos aporta datos fiables tanto de cuantificación como de actividad proteica. Lo que nos interesa saber es cuánto se están expresando las proteínas relacionadas con el daño mitocondrial y antioxidantes. Para ello hemos evaluado la presencia de OGG-1/2, un enzima reparadora del ADN que actúa como protectora de los ácidos nucleicos frente al daño oxidativo, siendo la forma OGG1 más prevalente en el núcleo, mientras que OGG2 es una forma específica de la mitocondria ( 197 ); TFAM, es una proteína mitocondrial que a través de su interacción con el ADN mitocondrial está directamente relacionada con la biogénesis mitocondrial; MnSOD, antioxidante específico mitocondrial; y catalasa, antioxidante regulador de estrés oxidativo e inflamación. Todo ello normalizado mediante un control de carga con GAPDH. En cuanto al tejido gingival, se ha observado que tanto N como CsA van a incrementar la presencia de OGG, su acumulación es indicativo de que se está produciendo daño oxidativo. Por otro lado observamos que TFAM también se encuentra aumentado, pero sólo de forma significativa para CsA, en este grupo, ante una situación de estrés reflejada por los cambios ultraestructurales, presencia de ROS y daño oxidativo, se observa una mayor demanda de biogénesis mitocondrial. Otra forma de valorar la respuesta al daño oxidativo es mediante la presencia de antioxidantes, observamos que en ambos grupos de tratamiento existe mayor presencia de catalasa y MnSOD en respuesta a la situación de estrés oxidativo. En el caso del grupo CsA la presencia de MnSOD es menor que en N, al ser específica
146 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival mitocondrial puede asociarse que en este grupo las mitocondrias presenten mayor desestructuración en sus crestas. Respecto a los datos de western blot en el tejido cardiaco, los cambios más llamativos se producen en el grupo tratado con CsA, donde se produce un descenso significativo en los niveles de ambos antioxidantes respecto a los grupos N y CTL. Esto, unido al aumento significativo de ROS (en forma de lípidos peróxidos) en este grupo indica una clara presencia de estrés oxidativo en el tejido cardiaco, no siendo así para el corazón de las ratas tratadas con N. Comparando nuestros datos con los de ensayos anteriores, no existen estudios previos que hagan un análisis exhaustivo en tejido gingival y cardiaco del daño oxidativo de estos fármacos. Otros autores han demostrado que CsA induce estrés oxidativo a dosis superiores a 1µM en cultivos de células endoteliales de aorta bovina ( 198 ), parece que estas dosis son las que se suelen manejar en los pacientes en tratamiento que sufren agrandamiento gingival secundario. Otros ensayos en cultivos celulares han observado que el tratamiento con CsA aumenta el estrés oxidativo, viéndose una disminución en el nivel de antioxidantes, en este caso de glutatión reductasa, con un aumento concomitante en los niveles de ROS en forma de glutatión peroxidasa, asociando al estrés oxidativo como posible factor determinante en la incidencia del agrandamiento gingival (190). Battino et al ( 199 ), tratando con las mismas dosis de CsA a ratas wistar y analizando las mitocondrias hepáticas encontró que estas también presentaban anomalías morfológicas en sus crestas y que los niveles de antioxidantes de tipo lipofílico estaban ligeramente aumentados (vitamina E, CoQ9 y CoQ10). Otros autores han evaluado también en ratas el estrés oxidativo producido por CsA en otros órganos como el riñón (196) y el hígado ( 200 ), llegando a resultados similares sobre el estrés oxidativo. Queda bien establecida la relación
Lourdes Victoria Román Malo | 147 directa entre la nefrotoxicidad de la CsA con el daño oxidativo ( 201 ). Como podemos ver, son mayores los estudios que relacionan a CsA con el daño oxidativo, en cambio, y en concordancia con nuestros datos, se ha observado que una de las vías de actuación de la N para mejorar la patología cardiaca del paciente es a través del control del estrés oxidativo, ofreciendo una protección al paciente frente a este a nivel cardiaco ( 202 ).Tal como apoyan otros estudios, las vías de señalización molecular que conducen al agrandamiento gingival son diferentes en función del fármaco (42). Respecto a los datos de los pacientes con fibromatosis, la histología de las biopsias muestran ciertas características que han sido previamente asociadas con la teoría de EMT, como son la falta de continuidad en la lámina basal, migración de células epiteliales hacia el conectivo y presencia en tejido conectivo de células epitelioide ( 203 ). Comparando los resultados en las ratas con los de los pacientes con fibromatosis gingival hereditaria, observamos que al contrario de lo que sucede en las ratas tratadas con N y CsA, en estos sí existe un aumento en la producción de colágeno asociado a la severidad clínica del agrandamiento. Otros autores han observado que en estos pacientes se produce un aumento en la síntesis de colágeno ( 204 , 97), que unida a una disminución en la degradación de la matriz extracelular (100) produce un gran acumulo de colágeno en el paciente. En general, se ha observado que existe gran variabilidad individual en los pacientes con fibromatosis ( 205 ). Queda claro que las vías moleculares de uno y otro proceso son diferentes. Por otro lado, hemos evaluado in vitro, mediante el uso de fibroblastos gingivales de un donante sano, como el estrés oxidativo puede influir la producción de colágeno, a través de la aplicación de H2O2. Parece que este estrés oxidativo
148 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival induce un aumento en la producción de colágeno y que esta se restaura a niveles normales cuando se aplican antioxidantes. No tenemos constancia de ensayos similares anteriores. Algunos autores defienden que existe aumento de la matriz de colágeno a consecuencia de un descenso en su degradación (206). En general, la aparición de este efecto no deseado a nivel gingival, no suele ser motivo suficiente para cambiar el fármaco que ayuda a tratar una patología sistémica que sí llega a comprometer la vida del paciente. Además, se espera que la prescripción de estos fármacos continúe aumentado en los próximos años. Se hace necesario identificar la etiopatogenia del proceso para llevar a cabo un manejo adecuado del mismo y mejorar la calidad de vida de estos pacientes médicamente comprometidos. En el presente estudio, y a pesar de un periodo experimenatal de tan sólo 6 semanas, los datos parecen indicar que existe cierto grado de disfunción mitocondrial como consecuencia de la administración de N y CsA, además de observarse que en una situación de agrandamiento idiopático como es el caso de la fibromatosis gingival hereditaria, parece tener cierta influencia el estrés oxidativo. Por otro lado, y observando los datos en el tejido cardiaco, podríamos considerar un cotratamiento con antioxidantes en los pacientes a los que se administra CsA, para mejorar los efectos secundario al fármaco a nivel cardiaco. Se siguen necesitando más ensayos que terminen de aclarar todas las vías moleculares que tienen lugar en este proceso.
Lourdes Victoria Román Malo | 149 Conclusiones
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Lourdes Victoria Román Malo | 151 7. CONCLUSIONES I. El estrés oxidativo y los cambios en el metabolismo mitocondrial podrían estar relacionados con la etiopatogenia del agradamiento gingival. II. El agrandamiento gingival inducido por CsA en ratas, presenta una clínica más severa en cuanto al grado de aumento en la altura del tejido respecto a N, y esta clínica se asocia a cambios más severos en la morfología mitocondrial y desestructuración interna, y a mayores valores de estrés oxidativo y biogénesis mitocondrial. III. El agrandamiento gingival inducido por N en ratas, no llegó a producir un agrandamiento significativo del tejido, ni cambios a nivel ultraestructural. El tratamiento con N se asoció a mayor daño oxidativo y mayor presencia de antioxidantes. IV. El rendimiento energético celular en forma de ATP se mantuvo en valores adecuados a pesar de los tratamientos. V. La síntesis de colágeno no se ve afectada por el tratamiento con N y CsA en ratas. VI. El tratamiento con CsA induce estrés oxidativo a nivel cardiaco, por lo que el paciente podría beneficiarse de un cotratamiento con antioxidantes para mejorar los efectos secundarios a nivel cardiaco. VII. El tratamiento con N induce mayores niveles de antioxidantes a nivel cardiaco.
152 |Parámetros mitocondriales en el agrandamiento gingival VIII. En la fibromatosis gingival hereditaria se produce un aumento del estrés oxidativo, y este está directamente relacionado con la severidad en manifestación clínica del agrandamiento gingival. IX. Los pacientes con fibromatosis presentaron mayores niveles de síntesis de colágeno. X. La presencia de ROS induce una mayor tasa de producción de colágeno en fibroblastos sanos, y esta es capaz de ser restaurada con el tratamiento con antioxidantes. XI. El tratamiento con antioxidantes podría ser un posible enfoque terapéutico en el agrandamiento gingival de los pacientes con fibromatosis gingival hereditaria. XII. El estrés oxidativo está aumentado en la fibromatosis gingival hereditaria de forma directamente proporcional a la severidad de la clínica. XIII. Aunque fibromatosis gingival hereditaria, CsA y N comparten la misma entidad clínica, presenta vías moleculares muy diferentes y se comportan de distinta manera en función del tejido. Es crítico entender cómo se desarrolla este proceso a nivel tisular, celular y molecular para poder desarrollar estrategias terapéuticas específicas que reduzcan la incidencia de este agrandamiento gingival y mejoren la calidad de vida de estos pacientes que, en general, ya se encuentra comprometida por los motivos que los llevan al consumo de estos fármacos.
Lourdes Victoria Román Malo | 153 Un manejo eficaz de estos pacientes reside en la colaboración activa del médico especialista y el odontólogo, logrando minimizar la aparición de posibles complicaciones.