Participación de la mitocondria en la biología de los progenitores neurales y la sensibilidad al oxígeno en los quimiorreceptores arteriales

Instituto de Biomedicina de Sevilla F acuitad de Medicina Departamento de Fisiología Médica y Biofísica TESIS DOCTORAL Participación de la mitocondria en la biología de los progenitores neurales y la sensibilidad al oxígeno en los q uimiorreceptores arteriales Trabajo de investigación presentado por DANIEL CABELLO RIVERA para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla Sevilla, 2021 IB1S INSTITUTODEBIOMEDICINADESEVILLA El Dr. José López Barneo, Catedrático, y la Dra. Ana María Muñoz Cabello, Profesora Contratada Doctora, ambos del Departamento de Fisiología Médica y Biofísica de la Universidad de Sevilla, CERTIFICAN: que la presente Tesis Doctoral titulada "Participación de la mitocondria en la biología de los progenitores neurales y la sensibilidad al oxígeno en los quimiorreceptores arteriales", presentada por el doctorando Daniel Cabello Rivera, Graduado en Biología y Máster Universitario en Investigación Biomédica, ha sido realizada bajo su dirección y cumple las condiciones exigidas para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla. Sevilla, 2 de noviembre de 2021 Fdo.: Dr. José López Bameo Fdo.: Dra. Ana María Muñoz Cabello II PUBLICACIONES Parte de los resultados de esta Tesis Doctoral han sido publicados: Artículo en revista peer review: Cabello-Rivera, D., Sarmiento-Soto, H., López-Barneo, J., and Muñoz-Cabello, A.M. (2019). Mitochondrial Complex I Function Is Essential for Neural Stem/Progenitor Cells Proliferation and Differentiation. Front. Neurosci., 13:664. doi: 10.3389/fnins.2019.00664. III ÍNDICE 1. RESUMEN …………………...……………………………………………..….. 2 2. INTRODUCCIÓN 2.1. Metabolismo intermediario en células de mamíferos. Metabolismo mitocondrial …..................................................................................................…. 4 2.1.1. Glucólisis y metabolismo celular aeróbico 2.1.2. Mitocondria y bioenergética celular 2.1.2.1. Cadena de transporte de electrones y fosforilación oxidativa 2.2. El linaje neural; neurogénesis y gliogénesis .................................................... 11 2.2.1. Formación de neuronas y glía durante el desarrollo embrionario 2.2.2. Formación de neuronas y glía en el mamífero adulto 2.2.3. Metabolismo mitocondrial y linaje neural 2.3. Adaptación a la hipoxia en mamíferos ............................................................ 21 2.3.1. Respuestas adaptativas a la hipoxia aguda mediadas por los quimiorreceptores arteriales 2.3.1.1. Organización celular y función del cuerpo carotídeo 2.3.1.2. Regulación de la respiración por el oxígeno: mecanismos moleculares 2.3.2. Respuestas adaptativas a la hipoxia crónica 3. OBJETIVOS ...................................................................................................... 35 4. MATERIALES Y MÉTODOS 4.1. Animales de experimentación ........................................................................... 37 4.1.1. Mantenimiento, cuidados generales y eutanasia 4.1.2. Ratones modificados genéticamente 4.1.2.1. Modelos hGFAP-NDUFS2 y hGFAP-NDUFS2/NDI1 4.1.2.2. Modelo hGFAP-tdTomato IV 4.1.2.3. Modelo TH-RISP 4.2. Estudios in vivo .................................................................................................. 41 4.2.1. Medida de la frecuencia respiratoria mediante pletismografía 4.2.1.1. Mezclas de gases y equipamiento de registro 4.2.1.2. Proceder experimental 4.2.1.3. Análisis de los registros 4.2.2. Tratamiento en cámara de hipoxia 4.2.3. Medida de hematocrito 4.2.4. Procesamiento de tejidos y análisis histológico 4.2.4.1. Perfusión intracardiaca, inclusión y corte de tejidos 4.2.4.2. Inmunodetección en secciones de parafina 4.2.4.3. Inmunofluorescencia en secciones de criostato 4.3. Preparaciones celulares ..................................................................................... 47 4.3.1. Cultivo primario de neuroesferas de la zona subventricular 4.3.1.1. Ensayo de diferenciación celular en neuroesferas de la zona subventricular 4.3.2. Cultivos primarios de cuerpo carotídeo 4.3.2.1. Preparación de rodajas de cuerpo carotídeo 4.3.2.2. Cultivo de células dispersas de cuerpo carotídeo 4.4. Técnicas de biología molecular y bioquímicas ................................................ 52 4.4.1. Genotipado de líneas de ratón 4.4.1.1. Extracción de ADN 4.4.1.2. Reacción de PCR 4.4.1.3. Electroforesis en gel de agarosa 4.4.2. Análisis cuantitativo de la expresión génica 4.4.2.1. Extracción y amplificación de ARN 4.4.2.2. Retrotranscripción 4.4.2.3. PCR cuantitativa 4.4.3. Actividad del complejo mitocondrial I 4.4.4. Medida de los niveles de ATP 4.4.5. Medida de los niveles de hormona del crecimiento 4.5. Ensayos de fisiología celular ............................................................................. 57 4.5.1. Medida de la actividad secretora mediante amperometría 4.5.1.1. Soluciones de registro y mezclas de gases V 4.5.1.2. Equipamiento de registro y proceder experimental 4.5.1.3. Análisis de los registros 4.5.2. Medida de los niveles de Ca2+, NADH y ROS por microfluorimetría 4.5.2.1. Soluciones de registro y mezclas de gases 4.5.2.2. Equipamientos de registro 4.5.2.3. Medida de los cambios en la concentración citosólica de Ca2+ 4.5.2.4. Medida de los cambios en la concentración intracelular de NAD(P)H 4.5.2.5. Medida de los cambios en los niveles de ROS en el espacio intermembrana y la matriz mitocondrial 4.5.2.6. Análisis de los registros 4.6. Análisis estadístico ............................................................................................. 66 5. RESULTADOS 5.1. Efecto de la disfunción del complejo mitocondrial I en el mantenimiento y la diferenciación de las células troncales y los progenitores neurales ................ 68 5.1.1. Alteraciones encefálicas producidas por la ablación del gen Ndufs2 del complejo mitocondrial I 5.1.2. Alteraciones en la biología de las células troncales y los progenitores neurales centrales 5.1.2.1. Producción de ATP y proliferación celular 5.1.2.2. Diferenciación neuronal y glial 5.1.3. Recuperación del déficit de complejo mitocondrial I mediante la expresión heteróloga de una NADH deshidrogenasa de levadura. 5.1.4. Estudio del sistema nervioso periférico 5.2. Interrupción genética del transporte de electrones mitocondrial y regulación de la respiración por el oxígeno .......................................................................... 89 5.2.1. Caracterización del modelo knockout del complejo mitocondrial III en las células catecolaminérgicas 5.2.2. Respuestas sistémicas a la hipoxia aguda 5.2.3. Respuestas de las células quimiorreceptoras a la hipoxia aguda 5.2.3.1. Respuestas celulares VI 5.2.3.2. Respuestas mitocondriales 5.2.4. Adaptaciones sistémicas a la hipoxia crónica 6. DISCUSIÓN 6.1. Disfunción mitocondrial y biología de las células troncales y progenitores neurales ............................................................................................................... 109 6.1.1. Disfunción mitocondrial y desarrollo del sistema nervioso 6.1.2. Rol del complejo mitocondrial I en la neurogénesis y gliogénesis posnatal 6.1.3. Regeneración de aceptores de electrones por el complejo mitocondrial I y desarrollo del sistema nervioso 6.2. Regulación de la respiración por el oxígeno y cadena de transporte de electrones mitocondrial ..................................................................................... 119 6.2.1. Disfunción mitocondrial y supervivencia celular 6.2.2. Integridad de la cadena de transporte de electrones mitocondrial y sensibilidad aguda al oxígeno 6.2.3. Papel de las células quimiosensoras en la aclimatación a la hipoxia crónica 7. CONCLUSIONES ......................................................................................... 129 8. ANEXOS 8.1. Anexo I: índice de figuras ................................................................................ 132 8.2. Anexo II: índice de tablas ................................................................................ 135 8.3. Anexo III: documento/s correspondiente/s al dictamen favorable del CEI/Consejería de Agricultura, Pesca y Desarrollo Rural de la Junta de Andalucía ..................................................................................................................................... 136 9. BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................... 153 VII ABREVIATURAS a CB alfa-cetobutirato ADNc ADN complementario ADNg ADN genómico Aif apoptosis-inducing factor (factor de inducción de la apoptosis) AM acetoxymethyl ester (éster acetoximetílico) ANOVA analysis of variance (análisis de la varianza) ATP adenosine triphosphate (adenosín trifosfato) BSA bovine serum albumin (albúmina de suero bovino) CC cuerpo carotídeo c-casp3 cleaved caspase-3 (caspasa-3 escindida) CM complejo mitocondrial CTN célula troncal neural CTPNs células troncales/progenitores neurales CTE cadena de transporte de electrones DAB diaminobenzidina DAPI 4’,6-diamidino-2-phenylindole (4’,6-diamidino-2-fenilindol) DEPC diethyl pyrocarbonate (pirocarbonato de dietilo) DMEM Dulbecco's modified Eagle medium (medio de Eagle modificado de Dulbecco) E día de desarrollo embrionario EBSS Earle’s balanced salt solution (solución salina balanceada de Earle) EDTA ethylenediaminetetraacetic acid (ácido etilendiaminotetraacético) FADH2 flavín adenín dinucleótido reducido FBS fetal bovine serum (suero fetal bovino) Flox floxeado FosOx fosforilación oxidativa Gapdh glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa) GCS ganglio cervical superior GTP guanosine trifhosphate (guanosín trifosfato) hGFAP human glial fibrillary acidic protein (proteína ácida fibrilar glial humana) HIF hypoxia inducible factor (factor inducible por hipoxia) l longitud de onda VIII MA médula adrenal MCCC medio de cultivo de cuerpo carotídeo MCN medio de cultivo de neuroesferas NADH nicotinamida adenina dinucleótido reducido NADPH reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido) NDI1 NADH deshidrogenasa interna 1 O2- anión superóxido P día posnatal pb pares de bases PBS phosphate-buffered saline (tampón fosfato salino) PCR polymerase chain reaction (reacción en cadena de la polimerasa) PCX piruvato carboxilasa PFA paraformaldehído pO2 presión parcial de O2 PpiA peptidylprolyl isomerase A (ciclofilina A) PHD prolilhidroxilasa Q/QH2 ubiquinona/ubiquinona reducida. qPCR quantitative PCR (PCR cuantitativa) RISP Rieske iron-sulfur protein (proteína sulfo-férrica de Rieske) roGFP reduction-oxidation sensitive green fluorescent protein (proteína fluorescente verde sensible a la oxidación-reducción) ROS reactive oxygen species (especies reactivas de oxígeno) Rps14 ribosomal protein S14 (proteína ribosómica S14) SEM standard error of the mean (error estándar de la media) SNC sistema nervioso central TFAM mitochondrial transcription factor A (factor de transcripción mitocondrial A) TH tirosina hidroxilasa Vegf vascular endothelial growth factor (factor de crecimiento endotelial vascular) VHL Von Hippel-Lindau ZSG zona subgranular ZSV zona subventricular Introducción 7 ADN, la mayoría (> 1200, incluidas casi todas las que componen la CTE) están codificadas por el genoma nuclear. En cuanto a su sistema de membranas, la membrana mitocondrial externa y la membrana mitocondrial interna son muy diferentes entre sí en lo que se refiere a sus propiedades y funciones. La membrana mitocondrial externa presenta unas proteínas de membrana de gran tamaño, denominadas porinas, que la hacen permeable a pequeñas moléculas (hasta 5000 daltons) e iones, mientras que la membrana mitocondrial interna es impermeable a estas especies químicas, suponiendo una barrera a su libre difusión, y permitiendo el paso solo a aquellas para las que existe transportador específico. La membrana mitocondrial interna es muy extensa, y forma unas estructuras alargadas características de las mitocondrias denominadas crestas mitocondriales (Figura 2). En estas crestas es donde se encuentran embebidos los complejos mitocondriales que conforman la CTE, los cuales funcionan conjuntamente para llevar a cabo la FosOx (ver apartado 2.1.2.1. “Cadena de transporte de electrones y fosforilación oxidativa”). Este sistema de membranas garantiza la existencia de dos compartimentos mitocondriales comunicados selectivamente; por un lado, el espacio intermembrana, comprendido entre las membranas mitocondriales externa e interna y, por otro lado, la matriz mitocondrial, delimitada por la membrana mitocondrial interna (Figura 2). Las enzimas implicadas en las rutas de oxidación de ácidos grasos y aminoácidos, y en el ciclo de Krebs, se encuentran en la matriz mitocondrial (Alberts y cols., 2015; Nelson y Cox, 2017; Khacho y cols., 2019). Clásicamente se ha identificado a la mitocondria como el orgánulo sobre el que recae la función bioenergética en la célula, por ser donde tiene lugar la FosOx. Este método de producción de energía permite a la célula obtener 15 veces más ATP a partir de glucosa que si ésta se degrada únicamente mediante glucólisis. El desarrollo de la vida tal y como lo conocemos se debe fundamentalmente a ello, al haber permitido aprovechar el O2 acumulado en la atmósfera terrestre en el transcurso de las primeras etapas de la evolución biológica (Alberts y cols., 2015). No obstante, como se hará hincapié en el desarrollo de esta Tesis Doctoral, la mitocondria es un orgánulo multifunción que asume tareas muy diversas y de gran relevancia para la homeostasis celular (apoptosis, homeostasis del Ca2+, señalización celular), además de presentar un importante dinamismo, con ciclos de fusión/fisión entre ellas que las hace constituir una red intracelular altamente variable en la célula (Pernas y Scorrano, 2016). Introducción 8 Figura 2. Estructura de la mitocondria. (A) Representación de una mitocondria de una célula animal, donde pueden apreciarse los diferentes compartimentos que delimitan sus dos membranas, así como las crestas mitocondriales (Cooper, 2019). (B) Micrografía de una célula ependimaria de los ventrículos laterales en un ratón silvestre. Apréciese el tamaño y la abundancia de las mitocondrias (puntas de flecha roja). Escala: 0,5 µm. (C) Esquema de una mitocondria con algunos metabolitos mitocondriales fundamentales, la CTE simplificada y algunas de las principales rutas del metabolismo intermediario (Cooper, 2019). 2.1.2.1. Cadena de transporte de electrones y fosforilación oxidativa La CTE de mamíferos está constituida por los complejos mitocondriales (CM) I (NADH deshidrogenasa), II (succinato deshidrogenasa), III (ubiquinol-citocromo c reductasa) y IV (citocromo c oxidasa), la ubiquinona (Q) y el citocromo c. Los complejos mitocondriales son macromoléculas formadas por diversas subunidades proteicas con grupos prostéticos asociados (fundamentalmente iones metálicos) que les permiten donar y/o aceptar 1 o 2 electrones y proteínas integrales de membrana. Los complejos I, III y IV tienen varias subunidades que son proteínas integrales de la Introducción 9 membrana mitocondrial interna, mientras que el CMII se encuentra asociado a dicha membrana desde la matriz mitocondrial. Por su parte la Q y el citocromo c son también moléculas capaces de donar y aceptar electrones, transportándolos entre complejos mitocondriales. La Q es liposoluble por lo que se encuentra dentro de la bicapa lipídica, por donde difunde libremente, mientras que el citocromo c es hidrosoluble y se encuentra en el espacio intermembrana de la mitocondria (Figura 3), si bien puede asociarse transitoriamente a la membrana como proteína periférica (Alvarez-Paggi y cols., 2017). La entrada de electrones a la CTE puede tener lugar desde los complejos I y II. El NADH, producido fundamentalmente en el ciclo de Krebs, puede ceder electrones al CMI, regenerando a su vez NAD+. A continuación, desde el CMI los electrones se transfieren a la Q, y desde ésta siguen el recorrido CMIII - citocromo c - CMIV, pasando finalmente al O2, el aceptor final de electrones, que se reduce y produce H2O. Los electrones llegan al CMII a través del succinato, un intermediario del ciclo de Krebs, que puede oxidarse cediendo electrones al CMII (concretamente al FAD) y produciendo fumarato. Desde el CMII los electrones pasan a la Q, siguiendo el mismo recorrido que los electrones procedentes de NADH, hasta el O2 (Figura 3). Este flujo de electrones es posible debido a que cada componente de la CTE tiene mayor afinidad por los electrones que su predecesor, siendo el O2 el componente con mayor afinidad por estos. Sin embargo, algunos electrones pueden ser transferidos directamente al O2, generando especies reactivas de oxígeno (ROS) (Figura 1), las cuales tienen funciones de señalización celular, pero también pueden ocasionar un estrés oxidativo perjudicial para la célula al alterar irremediablemente el ADN o provocar peroxidación de lípidos o carbonilación de proteínas (Xu y cols., 2013; Ito y Suda, 2014). Durante el trasiego secuencial de electrones a través de la CTE, cada electrón libera una pequeña cantidad de energía que se usa para translocar protones desde la matriz mitocondrial al espacio intermembrana. Esta translocación de protones, llevada acabo a través de los complejos I, III y IV, genera un gradiente electroquímico a través de la membrana mitocondrial interna conocido como fuerza protón-motriz. En la membrana mitocondrial interna se encuentra una proteína integral de membrana, la ATP sintasa (a veces denominada complejo V), que puede usar este gradiente electroquímico para sintetizar ATP a partir de adenosín difosfato y fosforo inorgánico, al permitir el flujo de protones de forma pasiva a su través de regreso a la matriz mitocondrial (Figura 3). Este mecanismo de generación de energía, como se comentaba anteriormente, se Introducción 10 conoce como FosOx. Además, los CMs juegan otros papeles relevantes en el metabolismo. Por ejemplo, el CMII también forma parte del ciclo de Krebs y regenera, junto al CMI, los aceptores de electrones (FAD y NAD+) (Figura 3), fundamentales para que el ciclo de Krebs continúe funcionando, participando en la oxidación de glúcidos, ácidos grasos y aminoácidos, y en la biosíntesis de precursores de diversas biomoléculas (Mitchell, 1961; Alberts y cols., 2015; Nelson y Cox, 2017; Zhao y cols., 2019). Figura 3. Teoría quimiosmótica. Representación de los componentes de la CTE y la fosforilación oxidativa en una mitocondria de mamífero. Pueden observarse los complejos mitocondriales, la ubiquinona, el citocromo c y la ATP sintasa. Las flechas azules muestran el recorrido que siguen los electrones hasta el O2, mientras que las flechas rosas ilustran la dirección en la que los protones son translocados a través de los complejos I, III y IV (Nelson y Cox, 2017). Cyt c, citocromo c; Q, ubiquinona. Por otro lado, la composición de los CMs no es idéntica en todas las células del organismo. Se han descrito diferentes isoformas de proteínas que forman parte de los complejos mitocondriales (en particular del CMIV) y que guardan relación con la función fisiológica del tipo celular en el que se han detectado (Zhou y cols., 2016; Gao y cols., 2017a). En el desarrollo de esta Tesis Doctoral se comentará la relevancia biológica de la existencia de diferentes isoformas en las proteínas constituyentes de los Introducción 11 complejos mitocondriales (ver apartado 2.3.1.2. “Regulación de la respiración por el oxígeno: modelo de señalización de mitocondria a membrana”). 2.2. El linaje neural; neurogénesis y gliogénesis La neurogénesis y la gliogénesis pueden definirse como la formación de neuronas y células gliales, respectivamente. Ambos procesos tienen lugar durante el desarrollo embrionario y también en el individuo adulto. La neurogénesis y la gliogénesis son fundamentales para el desarrollo del sistema nervioso, y por ende del individuo completo, por lo que están estrechamente reguladas en el tiempo y en el espacio. Estos procesos son totalmente dependientes de la actividad de las células troncales neurales (CTNs), la cual está finamente modulada por señales extracelulares procedentes del nicho circundante y por mecanismos intrínsecos de la propia célula troncal, donde intervienen múltiples vías de señalización celular dependientes a su vez de programas transcripcionales específicos y señales epigenéticas (Taverna y cols., 2014; Bond y cols., 2015; Jessen y Mirsky, 2019; Khacho y cols., 2019; Long y cols., 2020). Las CTNs son específicas de tejido, con el potencial de producir cualquier tipo de neurona o célula glial (Figura 4). Se trata por lo tanto de células troncales multipotentes, que pueden autorrenovarse o diferenciarse dando lugar a cualquier célula del linaje neural (y no a otras estirpes celulares). En un paso previo a la diferenciación, las CTNs pueden dar lugar a los progenitores intermedios, que presentan una alta capacidad proliferativa, fundamental para la expansión en número de células. En un estadio de diferenciación más avanzado se situarían los progenitores neuronales y gliales, células ya comprometidas con el linaje neuronal y glial, respectivamente (Figura 4) (Gage, 2000; Alvarez-Buylla y cols., 2001; Temple, 2001; Kandel y cols., 2013). Las neuronas se han considerado clásicamente la unidad básica de funcionamiento del sistema nervioso. Estas células de origen ectodérmico son capaces de comunicarse rápidamente y de forma precisa con otras células situadas en puntos muy distantes gracias a ser excitables eléctricamente, tener restringida la transmisión de potenciales de acción a una única dirección, y tener capacidad secretora. Las neuronas reciben, procesan y transmiten información fundamental para la supervivencia y adaptación de los seres vivos. Basándose en sus características morfológicas se conocen más de 100 tipos de neuronas, aunque estudios recientes empleando secuenciación de ARN indican que la variabilidad molecular es mucho mayor. La glía o células gliales Introducción 12 tienen como función asegurar la homeostasis del sistema nervioso (Kandel y cols., 2013). Éstas suelen clasificarse en microglía y macroglía. La microglía tiene origen mesodérmico y funciones vinculadas a la defensa frente a patógenos y tumores en el sistema nervioso central (SNC), entre otras (Kettenmann y cols., 2013; Sirerol-Piquer y cols., 2019). La macroglía, de origen ectodérmico, se compone de células como los astrocitos, los oligodendrocitos, las células ependimarias o las células de Schwann (Kandel y cols., 2013). Figura 4. El linaje neural. Esquema que representa los diferentes estadios de diferenciación en el linaje neural de mamíferos e imágenes de fluorescencia de un oligodendrocito, un astrocito y una neurona (Kandel y cols., 2013). Introducción 13 Los astrocitos representan la fracción más abundante de células gliales en el encéfalo adulto y contribuyen a la homeostasis y desarrollo del SNC en numerosos aspectos (suministro de nutrientes a las neuronas, mantenimiento de la barrera hematoencefálica, participación en sinapsis tripartitas). Por su parte, los oligodendrocitos se encargan principalmente de producir la vaina de mielina que recubre los axones de las neuronas en el SNC. Durante el desarrollo embrionario, neurogénesis y gliogénesis ocurren de manera secuencial, de manera que la neurogénesis precede a la formación de los astrocitos y los oligodendrocitos (Frisén, 2016). En los últimos años, ha habido un considerable avance en la comprensión de los roles de la macroglía en el desarrollo y la función del SNC, así como en la neurofisiología de los diferentes tipos de neuronas y circuitos neurales. Sin embargo, la mayoría de los mecanismos subyacentes y señales que regulan la gliogénesis y muchos aspectos de la neurogénesis están aún sin resolver (Reemst y cols., 2016; Kempermann y cols., 2018). 2.2.1. Formación de neuronas y glía durante el desarrollo embrionario En el desarrollo temprano de mamíferos, el ectodermo se compartimentaliza en ectodermo no neural, placa neural (neuroectodermo) y los bordes de la placa neural. Durante un proceso denominado neurulación (Figura 5), los bordes de la placa neural se pliegan y originan junto al neuroectodermo el tubo neural, que dará lugar al SNC. Un grupo de células del borde de la placa neural se delamina tras la formación del tubo neural, dando lugar a las células de la cresta neural, que producirán estructuras tan relevantes como las que componen el linaje simpatoadrenal, las células de Schwann o el sistema nervioso periférico sensorial (Langley y Grant, 1999; Gammill y Bronner- Fraser, 2003; Sauka-Spengler y Bronner-Fraser, 2008; Saito y cols., 2012; Shparberg y cols., 2019). Introducción 14 Figura 5. Neurulación. Ilustración del proceso de neurulación. El pliegue de la placa neural origina el tubo neural. Algunas células de los bordes de la placa neural se separan de ésta y originan las células de la cresta neural (Gammill y Bronner-Fraser, 2003). En el desarrollo temprano de mamíferos las células neuroepiteliales del tubo neural actúan como CTNs primarias. Estas CTNs primarias originan a su vez a las células de la glía radial, las principales CTNs del sistema nervioso en desarrollo (Figura 6). Durante la embriogénesis, las células de la glía radial proliferan, migran y se diferencian en primer lugar en neuroblastos (también denominados progenitores neuronales o neuronas inmaduras) y en una segunda ola en glioblastos (progenitores gliales). Además, estas células gliales radiales también sirven de guía a los neuroblastos para que estos migren hacia su destino final en el sistema nervioso (Figura 6). Por su parte, los neuroblastos también presentan capacidad proliferativa, siendo capaces de dar lugar a más neuroblastos, si bien pierden esta capacidad cuando terminan de diferenciarse a neuronas. Durante el desarrollo se va tejiendo una interconexión entre neuronas y células gliales que permite al SNC funcionar de manera estable, y al mismo tiempo otorgándole plasticidad, que facilita la adaptación al ambiente cambiante y la Introducción 15 formación de nueva memoria (Alvarez-Buylla y cols., 2001; Götz y Huttner, 2005; Kriegstein y Álvarez Buylla, 2009; Kandel y cols., 2013; Frisén, 2016; Khacho y cols., 2019). Figura 6. Desarrollo temprano del SNC de mamíferos: neurogénesis cortical. Representación esquemática de la zona germinal dorsal. Las células neuroepiteliales (en amarillo) dan lugar a las células de la glía radial (en verde, con procesos largos). Las células de la glía radial generan a los progenitores intermedios (en verde, con forma redondeada) y estos a su vez a los neuroblastos (en naranja), que usan las prolongaciones de la glía radial para desplazarse hasta su destino. Los neuroblastos acaban diferenciándose en neuronas (en azul) (Vasistha y Khodosevich, 2021). CP, placa cortical; IPC, progenitores intermedios; MZ, zona marginal; oRGCs, células de la glía radial externas; RGCs, células de la glía radial; SVZ, zona subventricular; VZ, zona ventricular. 2.2.2. Formación de neuronas y glía en el mamífero adulto Históricamente se ha considerado que en el individuo adulto no había generación de nuevas neuronas (Ramón y Cajal, 1928). Sin embargo, numerosos estudios llevados a cabo en las últimas décadas avalan que la neurogénesis ocurre en la vida adulta, aunque no en el mismo grado que ocurre durante la embriogénesis y limitada a unas áreas concretas centrales y periféricas (Altman, 1962; Ming y Song, 2005; Pardal y cols., 2007; Frisén, 2016). Actualmente se puede hablar fundamentalmente de dos regiones cerebrales aceptadas como nichos neurogénicos en mamíferos adultos: la zona subependimaria o zona subventricular (ZSV) de los ventrículos laterales, y la zona subgranular (ZSG) del giro dentado del hipocampo (Figura 7) (Kriegstein y Álvarez-Buylla, 2009; Dimou y Götz, 2014; Gonçalves y cols., 2016). En ambas regiones se han conseguido identificar CTNs con características similares a las de la glía radial (Falk y Götz, 2017), que Introducción 16 parecen derivar de éstas (Fuentealba y cols., 2015). En el encéfalo adulto las CTNs suelen encontrarse en estado de quiescencia. No obstante, determinados estímulos activarían a estas células, que pueden autorrenovarse o dar lugar a progenitores intermedios (también conocidos como transient amplifying cells). Los progenitores intermedios pueden proliferar y diferenciarse en neuroblastos, los cuales migran a otras regiones limitadas para dar lugar a interneuronas maduras capaces de integrarse en circuitos preexistentes (Gage, 2000; Zhao y cols., 2008; Obernier y cols., 2018; Adusumilli y cols., 2021). En ratones, los neuroblastos de la ZSG migran distancias cortas y se integran en circuitos de la capa de células granulares del giro dentado, mientras que los neuroblastos generados en la ZSV recorren una distancia mayor, siguiendo la ruta migratoria rostral, hacia el bulbo olfatorio (Lim y Álvarez-Buylla, 2014) (Figura 7). Figura 7. Nichos neurogénicos en el mamífero adulto. (A) Ubicación de los nichos neurogénicos de la ZSV y la ZSG en un corte sagital de encéfalo de ratón. Los neuroblastos generados en la ZSV viajan tangencialmente por la ruta migratoria rostral hasta el bulbo olfatorio. (B, C) Ilustración detallada de los componentes del nicho de la ZSV (B) y la ZSG (C) (Schneider y cols., 2019). IPC, progenitores intermedios; NB, neuroblastos; RMS, ruta migratoria rostral; SEZ, zona subependimaria (o zona subventricular); SGZ, zona subgranular. Existen diferencias filogenéticas considerables relativas a la neurogénesis adulta, de tal forma que el grado de neurogénesis adulta y su relevancia fisiológica varía entre las diferentes especies de mamíferos (Amrein y cols., 2011; Frisén, 2016; Kempermann Introducción 23 hipoxia liberan catecolaminas a la sangre, capaces de inducir adaptaciones cardiovasculares mediante la estimulación simpática (García-Fernández y cols., 2007; Weir y cols., 2005). Por otro lado, también se encuentran las células de músculo liso de las arterias sistémicas, que sufren vasodilatación ante una bajada de la pO2 arterial, favoreciendo el aporte de sangre hacia las zonas más hipóxicas, y las células de músculo liso de las arterias pulmonares, que experimentan vasoconstricción durante la hipoxia para redirigir el torrente circulatorio hacia las regiones del pulmón con mayor disponibilidad de O2 (Franco-Obregón y López-Barneo, 1996; Weir y cols., 2005). 2.3.1.1. Organización celular y función del cuerpo carotídeo El CC es un órgano par ubicado en la bifurcación de la arteria carótida (Figura 9A). Como se ha indicado anteriormente, este quimiorreceptor periférico es el principal responsable de los reflejos cardiorrespiratorios durante la hipoxia aguda (hiperventilación y activación simpática), hasta tal punto que su resección bilateral evita que tenga lugar la respuesta ventilatoria a la hipoxia (Timmers y cols., 2003). El parénquima de esta pequeña glándula, de aproximadamente 20 mm3 de volumen en humanos (Ortega-Sáenz y López-Barneo, 2020), está constituido por varios tipos de células. Las más abundantes son las células quimiorreceptoras, denominadas células glómicas o células tipo I, con capacidad neurosecretora. Estas células, de unos 10-15 µm de diámetro y forma ovoide, con abundantes mitocondrias, se organizan agrupándose en conjuntos de 4 a 8 células, formando unas estructuras distinguibles conocidas como glomérulos, que se encuentran próximos a una amplia red de capilares fenestrados, e inervados principalmente por fibras sensoriales aferentes, procedentes del nervio del seno carotídeo, y por fibras eferentes del sistema nervioso autónomo (fundamentalmente simpáticas) procedentes del ganglio cervical superior (GCS) (Figuras 9A, B) (Fidone y Gonzalez, 1986; Nurse y Piskuric, 2013; Ortega-Sáenz y López-Barneo, 2020; Ortega-Sáenz y cols., 2020). Las células glómicas presentan corrientes de Na+, K+ y Ca2+ voltaje-dependientes propias de células excitables y son capaces de generar potenciales de acción (Duchen y cols., 1988; Ureña y cols., 1989). En estrecho contacto con las células tipo I, se hallan las células sustentaculares o células tipo II, que se encuentran en una proporción de ~1:4 respecto a las células glómicas (Figura 9B). Las células tipo II proyectan prolongaciones que envuelven a los glomérulos y pueden actuar como células troncales multipotentes, siendo en parte las Introducción 24 responsables de la hipertrofia del CC como respuesta adaptativa a la hipoxia crónica (ver apartado 2.3.2. “Respuestas adaptativas a la hipoxia crónica”) (Pardal y cols., 2007). Además de estos dos tipos celulares, estudios recientes han revelado la presencia de neuroblastos en el parénquima del CC (Figura 9B). Estas células se localizan en la periferia de los glomérulos y, a diferencia de las células glómicas (que son posmitóticas), pueden sufrir divisiones celulares antes de concluir su proceso de maduración. Los neuroblastos también parecen participar en la hipertrofia del CC en condiciones de hipoxia crónica (Sobrino y cols., 2018, 2019). Por otro lado, el CC como órgano se encuentra muy vascularizado, y presenta abundante tejido conectivo y adiposo. El CC tiene su origen embrionario en progenitores de la cresta neural que parecen proceder tanto de la pared medial del tercer arco arterial (precursores de las células sustentaculares) como del GCS (precursores de las células glómicas). De esta forma, el CC formaría parte del linaje simpatoadrenal, junto al GCS y la MA, entre otros (Saito y cols., 2012; Kameda, 2014). Tras el nacimiento, el CC experimenta una maduración final durante las primeras semanas posnatales (Carroll y Kim, 2013), que implica el aumento en tamaño del parénquima, del número de células glómicas y de la funcionalidad de las mismas. Las células glómicas se comunican entre ellas, con las células vecinas y con las fibras aferentes, y se consideran elementos presinápticos capaces de secretar una amplia variedad de transmisores (acetilcolina, ATP, dopamina, endotelina-1, opioides, serotonina, sustancia P, etc.) con diversas funciones (Kirby y McQueen, 1986; Ureña y cols., 1994; Buttigieg y Nurse, 2004; Ortega-Sáenz y López-Barneo, 2020). La capacidad de secretar catecolaminas (dopamina) hace que las células glómicas sean positivas para el marcador tirosina hidroxilasa (TH). Las sinapsis que se establecen entre las células glómicas y las fibras aferentes se denominan sinapsis quimiosensoras (Figura 9B), y las que se forman entre células tipo I y tipo II, sinapsis quimioproliferativas (Figura 9B). Las células tipo II pueden activarse por el ATP secretado por las células tipo I (induciendo su proliferación y diferenciación), y a su vez secretar también ATP, que puede potenciar las sinapsis quimiosensoras, estableciéndose de esta forma sinapsis tripartitas (Nurse, 2014; Murali y Nurse, 2016). Además, las células glómicas están estrechamente conectadas entre sí mediante sinapsis eléctricas (uniones tipo gap) (Figura 9B), si bien se desconoce su función en este contexto (Ortega-Sáenz y López-Barneo, 2020). Introducción 25 Figura 9. Organización celular y función del CC. (A) Ubicación e inervación del CC en la bifurcación carotídea. (B) Representación detallada del CC, donde pueden observarse los diferentes componentes estructurales y celulares. Las sinapsis quimiosensoras y quimioproliferativas están indicadas. (C) Esquema que representa la activación de las células glómicas por diferentes estímulos. (D-F) Relación hiperbólica entre la concentración de Ca2+ citosólico (D), la secreción de catecolaminas (E) y la frecuencia de disparo de las fibras aferentes (F) en células glómicas en función de la pO2. Modificado de Ortega-Sáenz y cols. 2020. ECA, arteria carótida externa; EGTA, ácido egtázico (quelante de Ca2+); H, hipoxia; ICA, arteria carótida interna. Actualmente el CC se considera un órgano sensor multimodal (Figura 9C), que puede ser activado por cambios en la concentración de gases en la sangre (O2 y CO2), acidemia, cambios en los niveles plasmáticos de determinados metabolitos (lactato, glucosa) y hormonas (leptina, insulina) o hipertemia. Un amplio espectro de canales iónicos participa en las respuestas secretoras a los diferentes estímulos (Buckler y Vaughan-Jones, 1994; Nurse, 1990; García-Fernández y cols., 2007; Ortega-Sáenz y López-Barneo, 2020; Torres-Torrelo y cols., 2021). En relación a la hipoxia, las células glómicas poseen un grupo heterogéneo de canales de K+ que se inhiben (de forma reversible) en respuesta a una bajada de la pO2 arterial y se denominan de manera genérica “canales de K+ sensibles a O2”. El cierre transitorio de estos canales de K+ durante la hipoxia provoca la despolarización de la membrana plasmática, apertura de canales de Ca2+ voltaje-dependientes y la exocitosis de las vesículas secretoras por aumento citosólico de Ca2+ (Figuras 9D, E) (López- Introducción 26 Barneo y cols., 1988; López-López y cols., 1989; Ganfornina y López-Barneo, 1992; López-Barneo y cols., 2001; 2016a). Las vesículas sinápticas contienen neurotransmisores que activan a las fibras aferentes del nervio del seno carotídeo (sinapsis quimiosensoras). El soma de las fibras aferentes se localiza en el ganglio petroso, el cual proyecta también axones hacia el núcleo del tracto solitario en el tronco del encéfalo, a través del nervio glosofaríngeo, permitiendo la comunicación CC-SNC (de Castro, 1929; Fidone y Gonzalez, 1986). El núcleo del tracto solitario conecta con los centros de control de la respiración y activación simpática (López-Barneo y cols., 2016a). De esta forma, la información transmitida en forma de potenciales de acción (Figura 9F) hasta el SNC se traduce en un aumento de la frecuencia respiratoria (respuesta ventilatoria a hipoxia) y en una activación simpática como respuesta adaptativa a la hipoxia. 2.3.1.2. Regulación de la respiración por el oxígeno: mecanismos moleculares Si bien el modelo de quimiotransducción comentado en el apartado anterior está bien establecido, aún se desconoce cómo las células glómicas son capaces de detectar la hipoxemia y cuál es el mecanismo mediante el que la hipoxia inhibe las corrientes de salida de K+. A continuación, se detalla un modelo propuesto por nuestro grupo de investigación durante los últimos años (modelo de “señalización de mitocondria a membrana”) que integra prácticamente toda la información disponible hasta la fecha. Estudios recientes centrados en el análisis del perfil de expresión génica de las células glómicas (Zhou y cols., 2016; Gao y cols., 2017a), así como de los fenotipos funcionales de nuevos ratones modificados genéticamente con disfunción mitocondrial, nos han llevado a proponer este modelo, en el que la mitocondria desempeñaría una función esencial en la detección de la hipoxia en las células glómicas. Desde hace varias décadas se han propuesto diferentes hipótesis para explicar cómo las células glómicas detectan un descenso en la tensión de O2: activación de la AMP kinasa, modulación de la NADPH oxidasa, activación de un receptor olfativo atípico sensible al lactato (Olfr78), producción de CO y SH2, entre otros (López-Barneo y cols., 2016a). Sin embargo, ninguno de estos supuestos mecanismos parece ser esencial para la detección aguda de O2 en las células glómicas. Modelos murinos con deleción de genes que codifican para estas enzimas o para Olfr78, presentan respuestas normales a la hipoxia Introducción 27 (López-Barneo y cols., 2016a; Torres-Torrelo y cols., 2018). En contraste, al modelo de “señalización de mitocondria a membrana” le respalda la evidencia experimental, que se detalla en este apartado. Uno de los estudios cruciales que llevaron a posicionar al sensor de O2 en la mitocondria fue el empleo de inhibidores de la CTE, como la rotenona o el cianuro. Estos inhibidores mitocondriales inducen una fuerte activación del CC, bloqueando corrientes de K+ y dando lugar a una respuesta secretora de transmisores dependiente de Ca2+ extracelular (Ortega-Sáenz y cols., 2003; Wyatt y Buckler, 2004). De manera llamativa, se observó que, en presencia de rotenona, un inhibidor del CMI que actúa en el sitio de unión de la Q, se ocluía la respuesta a hipoxia del CC (Ortega-Sáenz y cols., 2003). Estas observaciones sugerían que el sitio de unión de la Q en el CMI podría estar involucrado en la sensibilidad aguda a O2 en las células glómicas. Para indagar en ello, en nuestro grupo de investigación se generó un modelo de ratón knockout condicional para NDUFS2 en el linaje simpatoadrenal, mediante el sistema Cre/loxP y el uso del promotor de la TH. Este modelo se denominó ratón TH-NDUFS2. Como se comentó en el apartado 2.2.3. “Metabolismo mitocondrial y linaje neural”, la subunidad NDUFS2 es una de las tres proteínas que forman el sitio de unión de la Q (Figura 8). La rotenona se une a este mismo sitio, impidiendo la reducción de la Q y la continuidad de la CTE por esta vía. A pesar de no tener un CMI funcional, la vía CMII-CMIV estaría potencialmente operativa. Fernández-Agüera y cols. (2015) demostraron que en este modelo knockout las células glómicas no producían respuesta secretora frente a hipoxia y se perdía la respuesta hiperventilatoria. Además, este modelo también sirvió para identificar a NADH y ROS como moléculas señalizadores de la hipoxia, lo cual ya se venía apuntando en estudios previos que describían que ambas especies químicas veían alterados sus niveles durante una exposición a hipoxia, en el caso del NADH en las células glómicas (Duchen y Biscoe, 1992a), y en el caso de ROS en células de músculo liso vascular (Waypa y cols., 2010). De manera que, en normoxia, el CMI consume NADH regenerando NAD+, y da lugar a cierta producción de ROS (al interaccionar algunos de los electrones que se transportan a su través directamente con el O2), como ya ha sido descrito anteriormente, mientras que en hipoxia, el CMI que se encontraría en un estadio más reducido, provocado por un enlentecimiento de la CTE (se detalla más adelante), disminuye su actividad NADH deshidrogenasa, acumulándose NADH, e incluso puede llegar a revertir su actividad, produciendo NADH a partir de NAD+. Este estado más reducido del CMI hace más probable que los electrones interaccionen Introducción 28 directamente con el O2, aumentando la producción de ROS en el espacio intermembrana. Las ROS producidas en el espacio intermembrana pueden atravesar la membrana mitocondrial externa a través de canales aniónicos voltaje-dependientes y llegar al citosol (Han y cols., 2003; Chandel, 2010). Los aumentos de NADH y ROS mitocondriales durante hipoxia se traducirían en un aumento proporcional de estas especies químicas en el citosol, ocasionando la inhibición de los canales de K+ sensibles a O2. En línea con este modelo, en las células glómicas de los ratones TH-NDUFS2 no se apreciaron cambios en la concentración de ROS en el espacio intermembrana ni de NADH durante la exposición a hipoxia. Estos estudios pusieron de manifiesto que el CMI juega un papel primordial en la señalización de la hipoxia a los canales iónicos de membrana, mediante la generación de ROS y acumulación de NADH (Fernández- Agüera y cols., 2015). Al objeto de avanzar en el análisis de los mecanismos moleculares responsables de la sensibilidad aguda a la hipoxia, varios grupos han realizado análisis de expresión génica utilizando microarrays o mediante secuenciación de célula única. De entre estos estudios destaca uno reciente en el que se observó una alta expresión en células glómicas de Epas1, el gen que codifica para HIF2α, una proteína fundamental para la respuesta adaptativa a hipoxia crónica (ver apartado 2.3.2. “Respuestas adaptativas a la hipoxia crónica”), y genes que codifican isoformas atípicas de subunidades del CMIV: NDUFA4L2 y COX4I2 (Zhou y cols., 2016). En paralelo a este trabajo, nuestro grupo llevó a cabo un análisis comparativo de la expresión génica mediante microarray en tejidos con similar origen embrionario pero diferente capacidad de detectar la hipoxia (CC > MA > GCS) (Gao y cols., 2017a). Este estudio confirmó que los genes comentados anteriormente estaban sobre-expresados en las células glómicas del CC en comparación con las neuronas del GCS y las células cromafines de la MA, además de detectar la sobre-expresión de otros genes, como el que codifica para COX8B, otra isoforma atípica de una subunidad del CMIV, y el gen que codifica para la piruvato carboxilasa (PCX), una enzima fundamental para la anaplerosis en el ciclo de Krebs, que sintetiza oxalacetato a partir de piruvato (Owen y cols. 2002). Este análisis sugería que probablemente la sensibilidad a la hipoxia aguda dependería de un “perfil metabólico definido” en las células quimiorreceptoras (Gao y cols., 2017a). Este perfil metabólico seguramente guarde relación con el hecho de que las células glómicas puedan presentar un metabolismo mitocondrial muy activo (Ortega-Sáenz y cols., 2020). Un ciclo de Krebs muy activo requeriría de una anaplerosis potenciada que Introducción 29 garantice el reabastecimiento de los intermediarios del ciclo de Krebs. Estudios llevados a cabo por nuestro grupo en un modelo de ratón knockout inducible para Epas1, mostraron que HIF2α es esencial para la respuesta aguda del CC a hipoxia (Moreno- Domínguez y cols., 2020). También se detectó cómo la expresión de los genes que codifican NDUFA4L2, COX4I2, COX8B y PCX descendía en el CC de los ratones knockout para Epas1, demostrando que HIF2α regula la expresión de estos genes (Moreno-Domínguez y cols., 2020). Estas observaciones sugerían que la dependencia de HIF2α para la sensibilidad aguda a O2 en el CC se debe a su implicación en la regulación transcripcional de determinadas enzimas que participan en el metabolismo mitocondrial (PCX) y de las subunidades atípicas del CMIV señaladas anteriormente (NDUFA4L2, COX4I2 y COX8B), y que podrían desempeñar un papel importante para la función quimiorreceptora del CC (Moreno-Domínguez y cols., 2020). Siguiendo esta línea, se observó cómo en el modelo de ratón knockout TH-COX4I2 las células glómicas del CC no eran capaces de señalizar la hipoxia aguda y no se producía la respuesta hiperventilatoria adecuadamente (Moreno-Domínguez y cols., 2020). Por lo tanto, es probable que COX4I2 (y posiblemente también COX8B) favorezca la asociación del CMIV con otros CM de la CTE, así como su actividad enzimática, haciendo que su tasa de oxidación sea muy sensible a las disminuciones en la pO2 y explique la función del CMIV como sensor de O2 a concentraciones de O2 fisiológicamente relevantes (Moreno-Domínguez y cols., 2020). De esta forma, la sensibilidad especial al O2 de las células glómicas se debería a una baja “afinidad aparente” del CMIV por el O2 y un ciclo de Krebs muy activo, que resulta en una CTE acelerada y un elevado consumo de O2. De esta manera, el flujo de electrones en la CTE se modula en un rango fisiológico de tensiones de O2 (Ortega-Sáenz y cols., 2020). Teniendo en cuenta los estudios indicados anteriormente, nuestro grupo ha propuesto recientemente el modelo de “señalización de mitocondria a membrana”, que trata de ofrecer una explicación al proceso de quimiotransducción de la hipoxia en el CC. Este modelo considera que la especial sensibilidad a la hipoxia de las células glómicas puede deberse al efecto combinado de poseer un potente metabolismo mitocondrial (ciclo de Krebs y CTE muy activos) y a una baja “afinidad aparente” de la citocromo c oxidasa (CMIV) por el O2 (debido a la presencia de varias isoformas atípicas). La baja afinidad del CMIV por el O2 otorgaría a este complejo el papel de “sensor de O2”, de manera que, en una situación de hipoxemia (pO2 < 90 mmHg en sangre arterial), el CMIV bajaría su actividad, provocando una acumulación de Introducción 30 electrones en la CTE y alterando el estado redox de sus componentes. El CMIII pasaría a un estado más reducido, con la consecuente acumulación de ubiquinona reducida (QH2). El incremento en la ratio QH2/Q ocasionaría un enlentecimiento del CMI, o incluso su reversión, dando lugar a la acumulación de ROS en el espacio intermembrana y de NADH. Estas moléculas inhibirían las corrientes de K+, provocando la despolarización de la membrana plasmática y activación de las células glómicas (Figura 10) (Ortega-Sáenz y López-Barneo, 2020). Así, en el modelo “señalización de mitocondria a membrana” el CMI actúa como “efector de la hipoxia”. Es probable que el CMIII también participe en la señalización de la hipoxia, ya que un estado más reducido de este complejo podría provocar una mayor fuga de electrones y producción de ROS dirigido hacia el espacio intermembrana (Waypa y cols., 2016; Moreno- Domínguez y cols., 2020). Figura 10. Modelo de “señalización de mitocondria a membrana” de la sensibilidad aguda al O2 en las células glómicas del CC. La hipoxia ocasiona el enlentecimiento de la CTE en las células glómicas, con los complejos mitocondriales más reducidos, el incremento de la razón QH2/Q y la consecuente acumulación de NADH y producción de ROS. Estos señalizadores mitocondriales (ROS y NADH) modulan canales iónicos en la membrana celular. Es posible que en las células glómicas las mitocondrias se posicionen cerca de estos canales, formando microdominios de sensibilidad al O2. Modificado de Ortega-Sáenz y López-Barneo, 2020. DVm, despolarización de la membrana celular; IMS, espacio intermembrana mitocondrial; MCI-IV, complejos mitocondriales I-IV; Q, ubiquinona; QH2, ubiquinona reducida. Con el propósito de avanzar en el conocimiento de la función de la mitocondria en la sensibilidad aguda a la hipoxia hemos estudiado un modelo de disfunción del CMIII (Figura 11) en el CC. Para ello, se ha utilizado un modelo animal cedido por el Prof. Paul Schumacker (Northwestern University Chicago, USA) que permite la Introducción 31 delección condicional del gen Uqcrfs1 en el linaje simpatoadrenal (ver apartado 4. “Materiales y Métodos”). Uqcrfs1 codifica la proteína hierro-azufre de Rieske (RISP), que forma parte de la familia de subunidades de 26 kDa del CMIII. En la CTE, la QH2 transfiere a RISP los electrones procedentes del CMI y CMII (Rieske y cols., 1964; Snyder y cols., 1999; Waypa y cols., 2013). Por lo tanto, en un modelo de deleción de RISP la transferencia de electrones desde el pool de quinona reducida hacia el CMIV está impedido. En el contexto de las células glómicas, la inactivación del CMIII implicaría la desconexión entre el sensor (CMIV) y el efector (CMI) de la respuesta a hipoxia, y el estado redox de los elementos de la CTE mitocondrial estaría disociado de los cambios en la tensión de O2. Como consecuencia, según nuestra hipótesis, la señalización de la hipoxia estaría impedida. El análisis del modelo TH-RISP se detalla en el apartado 5.2. “Interrupción genética del transporte de electrones mitocondrial y regulación de la respiración por el oxígeno” y constituye uno de los objetivos de esta Tesis Doctoral. Figura 11. Estructura del CMIII. Representación esquemática del CMIII bovino. Pueden observarse la posición de RISP, los sitios de unión de la ubiquinona (QP y QN) y del citocromo c. Los electrones llegarían desde la ubiquinona, siendo transferidos en primer lugar al centro sulfoférrico de RISP desde QN (Nelson y Cox, 2017). 2.3.2. Respuestas adaptativas a la hipoxia crónica Como se ha indicado anteriormente, las respuestas adaptativas a la hipoxia crónica se producen en el transcurso de horas o días y desencadenan cambios en la Introducción 32 expresión de genes implicados en procesos clave para la tolerancia a la hipoxia, como la eritropoyesis y la angiogénesis entre otros, y en favorecer el metabolismo glucolítico (Semenza, 1999; 2014). La principal vía de señalización que desencadena este tipo de respuestas depende de factores de transcripción inducibles por hipoxia (HIFs) y las prolilhidroxilasas (PHDs), enzimas dependientes de O2 implicadas en su degradación (Kaelin y Ratcliffe, 2008). Los HIFs son complejos heterodiméricos, formados por una subunidad HIFα reguladora y una subunidad HIFβ constitutiva. Las isoformas reguladoras mejor caracterizadas son HIF1α y HIF2α. En presencia de oxígeno, HIFα se hidroxila por las PHDs en residuos específicos de prolina (Appelhoff y cols., 2004). La hidroxilación de HIFα facilita su interacción con la proteína supresora de tumores Von Hippel-Lindau (VHL), que promueve su ubiquitinización y posterior degradación por el proteosoma. En hipoxia, las PHDs no pueden modificar a HIFα, evitándose su degradación y permitiendo la interacción con HIFβ. El heterodímero HIFα-HIFβ se traslada al núcleo, donde se une a secuencias específicas en el ADN y ejerce su función de modificación del programa transcripcional de las células (Kaelin y Ratcliffe, 2008; Semenza, 2014). En particular, uno de los genes que ve aumentada su expresión en hipoxia crónica es el que codifica para la eritropoyetina. Esta hormona, sintetizada en el riñón, es esencial para que tenga lugar la eritropoyesis en la médula ósea, de manera que, durante una hipoxia prolongada, se produce un incremento en el número de glóbulos rojos en el torrente sanguíneo, encaminado a aumentar el suministro de O2 a nivel sistémico. De igual modo, se activan otros genes, como Vegf, que potencia la angiogénesis, o Gapdh, que favorece la glucólisis (Semenza, 2012; Ratcliffe, 2013; López-Barneo y Simon, 2020). Otra de las respuestas adaptativas a la hipoxia crónica es la hipertrofia del CC. Este mecanismo es muy relevante para la tolerancia a la hipoxia en los mamíferos, ya que la hiperplasia de células glómicas permite generar más conexiones con las fibras aferentes y aumentar el envío de señales al SNC con el fin de mantener una frecuencia ventilatoria elevada en el tiempo, asegurando la aclimatación del animal. De hecho, se ha descrito que ratones sin CC presentan una mayor intolerancia a una hipoxia prolongada que sus controles con CC (Macías y cols., 2018). La hipertrofia del CC, que puede llegar a suponer un aumento de su tamaño de 2 a 3 veces, implica un crecimiento en número de células, aumentando el número de glomérulos y de vasos sanguíneos. En los últimos años se ha demostrado que el CC de individuos adultos contiene progenitores inmaduros comprometidos con los linajes neurogénicos o angiogénicos, Materiales y Métodos 39 4.1.2.1. Modelos hGFAP-NDUFS2 y hGFAP-NDUFS2/NDI1 Los ratones knockout hGFAP-NDUFS2 (genotipo Ndufs2flox/- hGFAP-Cre) se obtuvieron al cruzar la cepa Ndufs2-flox, generada anteriormente en nuestro laboratorio (Fernández-Agüera y cols., 2015), con una cepa de ratón transgénica hGFAP-Cre (Zhuo y cols., 2001). Los sitios loxP delimitan el exón 2 del gen Ndufs2, el cual codifica para la subunidad proteica NDUFS2 del CMI, por lo que dicha región es la que se escinde cuando recombina por efecto de la Cre. El ratón hGFAP-NDUFS2 se trata de un modelo embrionario específico de tejido, ya que la Cre se expresa principalmente en las células de la glía radial. Los ratones sobre los que se realizaron los experimentos eran híbridos F1 resultantes del cruce entre animales C57BL/6 y animales 129/SV. Se usaron ratones recién nacidos (P0) y P7. Para simplificar, en los experimentos donde así se indica, los resultados procedentes de ratones hermanos de camada con genotipo Ndufs2flox/+, Ndufs2flox/- o Ndufs2flox/+ hGFAP-Cre, se agruparon y se asignaron a un grupo control, ya que no se detectaron diferencias entre ellos. El modelo hGFAP-NDUFS2/NDI1 resultó del cruce entre las cepas Ndufs2- NDI1-LSL-flox y hGFAP-Cre. La cepa Ndufs2-NDI1-LSL-flox fue generada en nuestro laboratorio mediante el cruce entre la cepa Ndufs2-flox y la cepa NDI1-LSL (McElroy y cols., 2020) cedida por el Dr. Navdeep S. Chandel, de la Universidad Northwestern (EE.UU.). La cepa NDI1-LSL es un modelo de ratón knock-in que, en presencia de la Cre, permite la expresión heteróloga del gen NDI1 de Saccharomyces cerevisiae, que codifica una NADH deshidrogenasa de una sola subunidad, y el reportero EGFP (Figura 13). En el ratón hGFAP-NDUFS2/NDI1 (genotipo Ndufs2flox/- NDI1LSL/+ hGFAP-Cre), la deleción del gen Ndufs2 y la expresión de NDI1 tiene lugar en aquellas células en las que el promotor hGFAP está activo. Se usaron ratones C57BL/6. Materiales y Métodos 40 Figura 13. Generación del modelo knock-in NDI1-LSL. Esquema de la construcción NDI1-LSL que se inserta mediante recombinación homóloga en el locus Rosa26 para generar el ratón knock-in NDI1-LSL. La recombinación mediada por Cre entre los sitios LoxP conduce a la deleción del casete STOP de transcripción y a la expresión de NDI1 y eGFP (McElroy y cols., 2020). 4.1.2.2. Modelo hGFAP-tdTomato Los ratones hGFAP-tdTomato se generaron al cruzar ratones Ai14 (Madisen y cols., 2010), cedidos por el Prof. Rafael Fernández Chacón, con la cepa transgénica hGFAP-Cre, y se emplearon en experimentos de trazado de linaje. Los ratones Ai14 constituyen una cepa de ratón knock-in que presenta el reportero tdTomato en el locus Rosa26. tdTomato codifica una proteína fluorescente roja básica derivada de Discosoma sp. (Shaner y cols., 2004). Cuando esta línea se cruza con otra línea que exprese la recombinasa Cre, desaparece una señal de parada de la transcripción y se permite la expresión de la proteína tdTomato, la cual tiene una emisión de fluorescencia máxima a una longitud de onda (l) de 581 nm al ser excitada con una l de 554 nm (Shaner y cols., 2004). Éste es un modelo embrionario y específico de tejido al expresarse bajo el promotor hGFAP-Cre. Los experimentos se llevaron a cabo con ratones P7 y P21 con fondo genético C57BL/6. Materiales y Métodos 41 4.1.2.3. Modelo TH-RISP Los ratones knockout TH-RISP (genotipo Uqcrfs1flox/flox TH-IRES-Cre o Uqcrfs1flox/- TH-IRES-Cre) se generaron al cruzar la cepa Uqcrfs1-flox, cedida por el Dr. Paul T. Schumacker, de la Universidad Northwestern (Waypa y cols., 2013) con una cepa de ratón que expresa la recombinasa Cre bajo el control del promotor endógeno del gen Th (línea TH-IRES-Cre) (Lindeberg y cols., 2004). En estos ratones, el exón 2 del gen Uqcrfs1, que codifica para RISP, está flanqueado por dos sitios loxP, y se escinde en presencia de la recombinasa Cre (Waypa y cols., 2013). El ratón TH-RISP es un modelo embrionario y condicional al expresarse solo en los tejidos del linaje TH+ (tejidos catecolaminérgicos del sistema simpatoadrenal y el SNC). Los ratones empleados en los experimentos se encontraban entre P40 y P45 y tenían un fondo genético C57BL/6. 4.2. Estudios in vivo 4.2.1. Medida de la frecuencia respiratoria mediante pletismografía El estudio de la actividad respiratoria en el animal completo se llevó a cabo mediante la técnica de pletismografía, registrándose tanto los valores basales (en normoxia) como las variaciones en la frecuencia y volúmenes respiratorios durante la exposición a estímulos gaseosos (hipoxia e hipercapnia) y su recuperación tras la aplicación de estos estímulos. A continuación, se hace una descripción de la técnica, si bien para más detalles se puede consultar el capítulo metodológico de Ortega-Sáenz y cols. (2018). 4.2.1.1. Mezclas de gases y equipamiento de registro Durante los registros de pletismografía se emplearon diferentes mezclas de gases con la siguiente composición: - Control o normoxia (21% O2, 0,04% CO2 y resto de N2). - Hipoxia (10% O2, 0,04% CO2, y resto de N2). - Hipercapnia (21% O2, 5% CO2 y resto de N2). El equipamiento o set-up usado para llevar a cabo los registros pletismográficos consta de un pletismógrafo (EMKA Technologies) compuesto por dos cámaras de registro de metacrilato (Figura 14, panel de la izquierda), cerradas herméticamente, que permiten medir los parámetros respiratorios de forma simultánea en dos ratones. Este Materiales y Métodos 42 medidor se compone además de una red de tubos que garantiza la entrada y salida controlada de las diferentes mezclas de gases a 1L/min, que mantiene un volumen de gases constante dentro de las cámaras, e impide cambios de presión dentro de las cámaras. No obstante, las cámaras cuentan con unos sensores que detectan los sutiles cambios de presión ocasionados por la ventilación de los ratones o sus movimientos. Una de las cámaras presenta además un sensor de la concentración de O2 oxy 3690 MP (GHM Messtechnik) y otro de la concentración de CO2 NS:MCO (Cibertec). La información detectada por los sensores se traslada a un amplificador, que emite unas señales de flujo (mL/s) que se digitalizan y graban (Figura 14, panel de la derecha). Figura 14. Equipo de pletismografía. Se muestran las dos cámaras de registro, donde se introducen los ratones a estudiar, así como el sistema de tubos que permite la entrada y salida de las distintas mezclas de gases. Cada cámara de registro tiene acoplado un sensor de presión, mientras que tan solo una de ellas tiene conectados los sensores de O2 y CO2. La digitalización de los datos registrados por dichos sensores se consigue mediante el software Iox2. Modificado de Ortega-Sáenz y cols. (2018). 4.2.1.2. Proceder experimental Cada ratón a estudiar se expuso tres veces a hipoxia (estímulos de al menos 5 minutos con un O2 ambiental al 10%). Tras cada estímulo se mantuvo a los animales durante al menos 15 minutos en normoxia (21% O2) antes del siguiente estímulo (Figura 15, línea continua azul). Al final de cada registro, se expuso a cada ratón a hipercapnia (aproximadamente 1 minuto a 4-5% CO2; Figura 15, línea continua roja). Materiales y Métodos 43 Este estímulo se empleó como control positivo de la función ventilatoria de los ratones. La Figura 15 muestra un ejemplo de registro de la frecuencia respiratoria mediante pletismografía. Figura 15. Respuesta hiperventilatoria frente a hipoxia e hipercapnia de un ratón silvestre registrada mediante pletismografía. Registro de la frecuencia respiratoria (punteado azul). Las líneas continuas azul y roja se corresponden con el %O2 y el %CO2 en la cámara, respectivamente. Durante la exposición a hipoxia e hipercapnia se produce un aumento de la frecuencia respiratoria en el animal completo. En hipoxia la concentración de O2 disminuye desde un 21% hasta aproximadamente un 10%. En hipercapnia la presión de CO2 aumenta desde 0,04% hasta aproximadamente un 5%. Modificado de Ortega-Sáenz y cols. (2018). 4.2.1.3. Análisis de los registros El programa usado para monitorizar y digitalizar los registros fue Iox2 (EMKA Technologies). Mediante este software, se consiguió generar a partir de las señales de flujo respiratorio y las concentraciones de O2 y CO2 medidas de forma simultánea, un conjunto de valores que representan los parámetros respiratorios de los animales ordenados en el tiempo. Estos valores se almacenaron cada 2 segundos durante el registro. Además, este programa tiene un sistema automático que permite discriminar entre los cambios de presión que ocurren en las cámaras de registro debidos a movimientos voluntarios o involuntarios del animal, como por ejemplo el grooming (acicalamiento), y los ocasionados por la respiración rítmica de los ratones. El parámetro que refleja este sistema automático de discriminación es la tasa de éxito, que se halla tras el análisis de un número concreto de respiraciones consecutivas, a las cuales se les asignaría un valor de tasa de éxito del 100% si siguen una cinética similar. 200 250 300 350 frecuencia respiratoria (respiraciones/min) 150 100 21 % 10% %O2 0,04% 5% %CO2 5 min Materiales y Métodos 44 Sólo se consideraron como válidos los valores en los que la tasa de éxito era del 100% y se mantenía al menos en 3 puntos en el tiempo. Para calcular la frecuencia respiratoria basal se usaron los valores grabados en normoxia antes de exponer a los ratones por primera vez a cualquier estímulo, durante aproximadamente 2 minutos y medio de registro. Por otro lado, para cuantificar la frecuencia respiratoria durante la hipoxia se usaron los valores grabados en los que la concentración de O2 descendió al menos hasta el 10%, durante aproximadamente 5 minutos de registro. Por último, cuando se cuantificó la frecuencia respiratoria durante la hipercapnia se usaron los valores grabados en los que la concentración de CO2 era entre 4-5%, durante aproximadamente 1 minuto de registro. 4.2.2. Tratamiento en cámara de hipoxia Para la realización de determinados estudios, algunos ratones se expusieron a hipoxia crónica entre 10 y 14 días. Para ello, se introdujeron en bateas dentro de una cámara isobárica hermética (Coy Laboratory Products) a una concentración de O2 de 10%. El resto de las condiciones ambientales se mantuvieron igual (ver apartado 4.1.1. “Mantenimiento, cuidados generales y eutanasia” para más detalles). Para estos experimentos se emplearon ratones P25 TH-RISP y controles Uqcrfs1flox/+ de la misma camada. Los niveles de O2, CO2 y humedad se monitorizaron de manera continuada, así como el bienestar general de los animales, supervisando posibles muestras de dolor, sufrimiento o angustia. 4.2.3. Medida de hematocrito Para las medidas de hematocrito se emplearon capilares de vidrio heparinizados (Brand). Una vez llevada a cabo la eutanasia del animal, se abrió la caja torácica, se perforó rápidamente la aurícula derecha y se recogió una muestra de sangre aproximando el capilar a la aurícula perforada. A continuación, se centrifugó 5 minutos a 5000 rpm en una centrífuga Centrolit II (JP Selecta). Una vez separada en dos fases, fracción líquida (plasma) y fracción sólida (hematocrito), se cuantificó el porcentaje de fracción sólida respecto al total de sangre midiendo las respectivas longitudes que ocupaban en el capilar. Materiales y Métodos 45 4.2.4. Procesamiento de tejidos y análisis histológico En función del tejido o el tipo de análisis a llevar a cabo, se usaron diferentes técnicas de procesamiento y marcaje, que se detallan en los siguientes subapartados. 4.2.4.1. Perfusión intracardiaca, inclusión y corte de tejidos Los ratones P40 o mayores se sometieron a una perfusión intracardiaca con el fin de retirar la sangre y fijar los diferentes tejidos de interés. En primer lugar, se les administró vía intraperitoneal tiopental sódico a una dosis de 120 mg/kg de peso del animal, con el fin de anestesiarlos sin detener el bombeo del corazón. Tras ello, se abrió la caja torácica, se perforó la aurícula derecha y se introdujo un catéter en el ventrículo izquierdo del corazón, a través del cual se administró tampón fosfato salino (PBS) (GIBCO), unos 50 mL durante 5 minutos, con la ayuda de una bomba peristáltica (Thermo Scientific), mientras la sangre iba saliendo por la pequeña incisión que se realizó previamente en la aurícula derecha. Tras observar cómo los diferentes órganos perdían su color característico (sobre todo el hígado) por la práctica ausencia de sangre, se comenzó a administrar por la misma vía una solución de paraformaldehído (PFA) (Sigma) al 4% en PBS, unos 50 mL durante 5 minutos. Tras la perfusión, se extrajeron los tejidos de interés, siendo en algunos casos necesario el uso de una lupa binocular SZX16 (Olympus). En el caso de ratones P0 y P7 no se llevó a cabo la perfusión y se continuó con el protocolo como sigue a continuación. Las muestras de cerebro disecadas se fijaron durante toda la noche en PFA al 4% en PBS a 4ºC. Al día siguiente, se deshidrataron en el procesador de tejidos automático (Leica), sumergiéndolos en diluciones de etanol de gradación creciente y en xilol. A continuación, se incluyeron manualmente en parafina, y tras dejarlos endurecer, se obtuvieron secciones de 20 µm de grosor con la ayuda de un microtomo (Leica). Las secciones se dejaron secando sobre portaobjetos a 37ºC unas 2-3 horas y tras ello, se conservaron a temperatura ambiente. Las bifurcaciones carotídeas y las glándulas suprarrenales disecadas se fijaron durante 3 horas con PFA al 4% en PBS a 4ºC. A continuación, se sumergieron en una solución de sacarosa (30% m/v en PBS) a 4ºC hasta su decantación (1-3 días). Tras ser crioprotegidos con la solución de sacarosa, los tejidos se incluyeron en una resina criopreservante (OCT Tissue Tek, Sakura), en moldes de plástico (Cryomold Tissue Tek, Sakura) sobre nieve carbónica. Después de la inclusión, los bloques de OCT se Materiales y Métodos 46 conservaron a -80ºC hasta su procesamiento. Los cortes (10 µm de grosor) se llevaron a cabo con la ayuda de un criostato (Leica) con una temperatura establecida entre -16°C y -20°C. Las secciones se depositaron sobre portaobjetos con tratamiento adherente (Superfrost Plus, Thermo Scientific), y se dejaron secar a temperatura ambiente un par de horas, tras lo cual se conservaron a -20ºC. 4.2.4.2. Inmunodetección en secciones de parafina Sobre las secciones de cerebro en parafina se realizaron técnicas de inmunohistoquímica con peroxidasa frente a diferentes marcadores: NeuN, GFAP, ki67, caspasa-3 escindida o TH. Se usó un protocolo experimental ya empleado en trabajos previos (Díaz-Castro y cols., 2015). En primer lugar, las secciones de cerebro se sumergieron en xilol, soluciones de etanol de gradación decreciente y H2O destilada con el fin de rehidratarlas. Tras ello, se bloqueó la peroxidasa endógena con H2O2 (Sigma) al 3% 15 minutos, se permeabilizaron con 0,1% Tritón X-100 (Sigma) en PBS (2 x 5 minutos) y fueron tratadas durante 30-60 minutos con solución de bloqueo. La solución de bloqueo se componía de 0,1% Tritón-PBS, 10% (v/v) suero fetal bovino (FBS) (GIBCO), 1 mg/mL albúmina de suero bovino (BSA) (Sigma). Las secciones se incubaron durante toda la noche a 4ºC con alguno de los siguientes anticuerpos diluidos en solución de bloqueo: rabbit anti-GFAP (Dako; 1:200), rabbit anti-cleaved caspase-3 (Cell Signaling; 1:100), rabbit anti-ki67 (Thermo Scientific; 1:200), mouse anti-NeuN (Millipore; 1:200) o rabbit anti-TH (Novus; 1:1000). Cuando se emplearon los anticuerpos anti-NeuN, anti-ki67 y anti-cleaved caspase-3 se hizo un desenmascaramiento antigénico a los cortes, tras la deshidratación de estos, con citrato sódico 10 mM a pH 6 hirviendo durante 15 minutos. Para la detección de los marcadores se usó el kit de EnVision + System-HPR 3,3´- diaminobenzidina (DAB) (Dako), que contiene la solución con el anticuerpo secundario (anti-rabbit o antimouse) conjugado con la peroxidasa de rábano. Tras la incubación con los anticuerpos secundarios (1 hora a temperatura ambiente) se continuó con el revelado con DAB, siguiendo las instrucciones del fabricante. Finalmente, las secciones se deshidrataron en soluciones de etanol de gradación creciente y en xilol, y se montaron con medio DPX. Los portaobjetos, ya cubiertos con cubreobjetos, se conservaron a temperatura ambiente. Las secciones fueron visualizadas usando un microscopio directo Olympus BX61 (Olympus) en campo claro. Materiales y Métodos 47 Para el análisis cuantitativo de las células GFAP+ en secciones de cerebro se empleó la técnica de inmunofluorescencia. Tras la rehidratación de los tejidos, se llevó a cabo la detección del marcador usando un anticuerpo primario rabbit anti-GFAP (Dako; 1:100), y un anticuerpo secundario Alexa Fluor 568 goat-anti-rabbit IgG. Los núcleos celulares fueron detectados por una contratinción con 0,5 µg/mL de 4’,6-diamidino-2- fenilindol (DAPI). Las secciones fueron montadas con medio de montaje para fluorescencia (Dako) y visualizadas usando un microscopio directo Olympus BX61 en epifluorescencia. Las imágenes se adquirieron usando el programa DP Controller (Olympus). El programa ImageJ (National Institutes of Health, EE.UU.) se utilizó para el análisis cuantitativo de las células GFAP+. 4.2.4.3. Inmunofluorescencia en secciones de criostato La detección por inmunofluorescencia del marcador TH en las secciones de criostato se llevó a cabo siguiendo protocolos ya descritos anteriormente en otros trabajos (Platero-Luengo y cols., 2014; Díaz-Castro y cols., 2015). Las secciones fueron permeabilizadas con 0,1% Tritón-PBS (3 x 5 minutos) y tratadas durante 30-60 minutos con solución de bloqueo antes de incubarlas con el anticuerpo primario rabbit anti-TH (Novus; 1:1000) diluido en solución de bloqueo durante toda la anoche a 4ºC. Al día siguiente se incubaron durante 2 horas con el anticuerpo secundario Alexa Fluor 568 donkey-anti-rabbit IgG o Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG. Para marcar los núcleos celulares se usó una contratinción con 0,5 µg/mL de DAPI. Las secciones se montaron con medio de montaje para fluorescencia y se visualizaron usando un microscopio directo Olympus BX61 en epifluorescencia. Las imágenes fueron adquiridas usando el programa DP Controller. El programa ImageJ se utilizó para el recuento de células a ciegas y la cuantificación del área marcada. El principio de Cavalieri se aplicó para la estimación del volumen. En los experimentos donde se indique, se adquirieron imágenes con un microscopio confocal Leica SP2-AOBS y el software Leica Confocal. 4.3. Preparaciones celulares Las diferentes preparaciones celulares empleadas en este trabajo se elaboraron en condiciones de esterilidad, usando para ello una cabina de seguridad biológica Materiales y Métodos 48 Telstar Bio IIA. Los cultivos celulares se mantuvieron en un incubador (Thermo) con atmósfera humidificada, a 37ºC y 5% de CO2, 20% de O2. 4.3.1. Cultivo primario de neuroesferas de la zona subventricular Los cultivos primarios de neuroesferas se realizaron como se ha descrito anteriormente (d’Anglemont de Tassigny y cols., 2015). En primer lugar, se procedió a la disección de los cerebros de los ratones a estudiar. Se realizaron cortes coronales de los cerebros sumergidos en PBS frío con la ayuda de un bisturí (Braun), en las posiciones que se indica en la Figura 16A. En las rodajas número 2 y 3 la región correspondiente a la ZSV (véase Figura 16B) fue aislada de las paredes de los ventrículos laterales con una lanceta ultrafina (F.S.T. 10316-14) y mantenida en PBS frío. Figura 16. Disección de la ZSV. (A) Se muestra un encéfalo de ratón y se indican las posiciones de corte (flechas discontinuas) para generar secciones coronales que permitan la disección de la ZSV. (B) Corte coronal (aproximadamente +1,10 mm < bregma < -0,10 mm) en fresco, donde se indica la región cerebral que debe disecarse (en rojo) en uno de los hemisferios. Los fragmentos de tejido se mantuvieron en el incubador durante 20 minutos en una solución de papaína: 22 UI/mL de papaína (Sigma), 0,5 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (Sigma), 1 mM de L-cisteína (Sigma) y 0,5 mg/mL de DNasa I (Sigma), en solución salina equilibrada de Earle (EBSS) (GIBCO). Después de la digestión con papaína, los fragmentos de tejido, que contenían ZSV, se disociaron mecánicamente, mediante ciclos de aspirado/expulsión (aproximadamente 10 ciclos), con una pipeta Pasteur de vidrio de 230 mm de largo con la punta pulida al fuego, en una solución que contenía 2,5 mg/mL de inhibidor de tripsina (Sigma), 25 mg/mL de BSA, 20 mM de glucosa y 23 mM de NaHCO3 en EBSS, para inhibir la papaína. Las Materiales y Métodos 55 genotipo. Para el análisis de expresión en CC a nivel de individuo, el ARN se amplificó utilizando el Kit GeneChipTM WT Pico (Thermo Fisher Scientific). En cada caso, se siguieron las instrucciones del fabricante. El ARN se resuspendió o eluyó en agua libre de nucleasas y se cuantificó usando el espectrofotómetro Nanodrop 2000 (Thermo Scientific). Las muestras se conservaron a -80ºC. 4.4.2.2. Retrotranscripción La transcripción inversa de ARN a ADNc se realizó con el Kit QuantiTect Reverse Transcription (Qiagen), siguiendo las indicaciones del fabricante. Para sintetizar el ADNc se usaron 500 ng de ARN purificado de las muestras de interés. Las muestras de ADNc se diluyeron hasta un volumen final de 100 μL y se conservaron a -20ºC. 4.4.2.3. PCR cuantitativa Para cuantificar la expresión de los genes Ndufs2, Uqcrfs1 y Sdhd, se realizaron qPCRs con un sistema 7500 Fast Real Time PCR (Thermo Fisher Scientific) usando una sonda de expresión génica TaqMan (Thermo Fisher Scientific) para cada gen específico (Tabla 2). Diferentes genes de expresión constitutiva fueron empleados para normalizar las muestras: gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (Gapdh), ciclofilina (PpiA) y el gen de la proteína ribosómica S14 (Rps14) (Tabla 2). Las reacciones de qPCR se llevaron a cabo en un volumen final de 20 μL: 10 μL de tampón TaqMan Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems), 1 μL de sonda TaqMan 20X (Applied Biosystems), 5 μL de ADNc de la muestra de interés y 4 μL de agua libre de nucleasas (Promega). Las mezclas se cargaron por duplicado en una placa de 96 pocillos MicroAmp Fast de 0,1 mL (Applied Biosystems). Se usó el programa Fast del equipo. El nivel de expresión del gen de estudio se analizó mediante cuantificación relativa (método ΔΔCt). Materiales y Métodos 56 Tabla 2. Sondas TaqMan empleadas en las qPCRs. Gen Sonda TaqMan Ndufs2 (exones 2-3) Mm00467601_g1 Uqcrfs1 (exones 1-2) Mm00481849_m1 Sdhd Mm00546511_m1 Gapdh Mm99999915_g1 PpiA Mm2342430_g1 Rps14 Mm00849906_g1 4.4.3. Actividad del complejo mitocondrial I La corteza dorsal se aisló con la ayuda de un bisturí a partir de rodajas coronales de cerebros recién disecados y sumergidos en PBS frío. Dichas muestras de corteza se almacenaron a -80ºC hasta su procesamiento. Para la medida de la actividad del CMI empleó el Kit Complex I enzyme activity dipstick assay (Abcam), siguiendo las instrucciones del fabricante. En primer lugar, las muestras de corteza dorsal se lisaron mediante homogeneización mecánica (Dounce homogenizer) en 200 µL de tampón de extracción del kit complementado con cócteles de inhibidores de proteasas y fosfatasas (Sigma). El tejido homogeneizado se incubó durante 20 minutos en hielo y a continuación se centrifugó durante 30 minutos a 16000 x g. Tras ello, se recogió el sobrenadante para el ensayo enzimático. La concentración de proteínas se determinó mediante un ensayo Bradford (BIO-RAD). Para medir la actividad del CMI se utilizaron 5 µg de cada extracto de proteína. Tras llevar a cabo los diferentes pasos indicados por el fabricante, se adquirieron imágenes de las tiras utilizadas (ImageQuant LAS 4000 mini, GE Healthcare) y la intensidad de la señal se cuantificó usando el programa ImageQuant TL (GE Healthcare). Se realizó una interpolación a partir de una curva estándar. La actividad del CMI se normalizó respecto a los ratones control (flox/+). 4.4.4. Medida de los niveles de ATP Las neuroesferas de la ZSV cultivadas durante una semana se recolectaron y centrifugaron 5 minutos a 300 x g (centrífuga 5424R), el sobrenadante se descartó y se resuspendió el pellet de neuroesferas en una solución de homogeneización (100 mM Tris, 4 mM EDTA, pH 7,75). A continuación, las células se rompieron con un Materiales y Métodos 57 homogeneizador Omni 2000 (Omni International) y se hirvieron durante 3 minutos. Tras 2 minutos en hielo, las muestras se centrifugaron durante 1 minuto a 1000 x g a 4ºC y se recogió el sobrenadante. Los niveles de ATP se determinaron utilizando el Kit ATP Bioluminescence Assay CLS II (Roche Applied Science), siguiendo las instrucciones del fabricante. El kit se basa en la actividad de la luciferasa, una enzima que requiere ATP para metabolizar su sustrato (luciferina) en un producto luminiscente. De esta forma, la señal detectada (lector Glomax, Promega) sería proporcional a la cantidad de ATP. Las muestras se normalizaron respecto a la absorbancia medida a 280 nm (Nanodrop 2000). 4.4.5. Medida de los niveles de hormona del crecimiento Para las medidas de los niveles plasmáticos de la hormona del crecimiento se recolectaron muestras de sangre en unos tubos colectores (MiniCollect). Para ello, tras la eutanasia del animal, se abrió la caja torácica y se provocó una escisión en la aurícula derecha. Aproximando los tubos colectores a dicha escisión, se tomó una muestra de sangre (entre 50-100 µL), que se dejó coagular durante 30 minutos a temperatura ambiente y, tras ello, se centrifugó a 3000 x g durante 15 minutos a 4ºC. A continuación, se recogió el sobrenadante (suero) y se conservó a -80ºC. La cuantificación de los niveles de hormona del crecimiento en las muestras de suero se llevó a cabo mediante un ensayo ELISA tipo sándwich, concretamente se empleó el kit rat/mouse growth hormone ELISA (Cat. EZRMGH-45K, Millipore), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizaron 10 μL de suero por duplicado para cada muestra y se empleó el espectrofotómetro Multiskan Spectrum (Thermo). La concentración de hormona del crecimiento para cada muestra se estimó a partir de una recta patrón generada con muestras de concentración conocida de hormona del crecimiento. 4.5. Ensayos de fisiología celular Para estudiar la fisiología de las células glómicas del CC y de las células troncales y progenitores neurales de nuestros modelos animales, se emplearon técnicas biofísicas de electrofisiología y microfluorimetría en preparaciones de rodajas de CC, células dispersas de CC o neuroesferas de la ZSV. Materiales y Métodos 58 4.5.1. Medida de la actividad secretora mediante amperometría La amperometría es una técnica electroquímica que se empleó para registrar la secreción de catecolaminas (en concreto dopamina) por parte de las células glómicas del CC, en respuesta a los distintos estímulos a los que se exponían las rodajas de CC, como “alto potasio”, hipoxia, hipercapnia o hipoglucemia. 4.5.1.1. Soluciones de registro y mezclas de gases Las rodajas de CC se perfundieron con diferentes soluciones externas mientras se registraba su actividad secretora. Las soluciones presentaban una osmolaridad de 300 mOsm/Kg. La solución externa control se componía de (en mM): 125 NaCl, 23 NaHCO3, 5 Glucosa, 5 Sacarosa, 4,5 KCl, 2,5 CaCl2, y 1 MgCl2. Dicha solución era burbujeada con una mezcla de gases de 5% de CO2 (que lograba mantener el pH de la solución en 7,4), 20% de O2 y resto de N2 (control o normoxia). Para conseguir una solución externa en hipoxia se burbujeaba solución control con una mezcla de gases de 5% de CO2 y resto de N2, mientras que para conseguir una solución externa en hipercapnia se burbujeaba solución control con una mezcla de gases de 20% de CO2, 20% de O2 y resto de N2. Con respecto a la hipoglucemia, la solución externa se componía de (en mM): 125 NaCl, 23 NaHCO3, 10 Sacarosa, 4,5 KCl, 2,5 CaCl2, y 1 MgCl2, y era burbujeada con la mezcla de gases control. La solución “alto potasio” se usó para despolarizar y comprobar el estado fisiológico de las células glómicas. Dicha solución se componía de (en mM): 81,5 NaCl, 40 KCl, 23 NaHCO3, 5 Glucosa, 5 Sacarosa, 2,5 CaCl2, y 1 MgCl2, y era burbujeada con la mezcla de gases control. 4.5.1.2. Equipamiento de registro y proceder experimental Para la detección de las catecolaminas secretadas por las rodajas de CC se usó un electrodo de fibra de carbono polarizado a un voltaje fijo positivo de +750-800 mV, por encima del potencial redox de la dopamina, la principal catecolamina secretada por las células glómicas del CC. El electrodo de fibra de carbono se construyó manualmente a partir de una fibra sintética de grafito (AMOCO). La fibra, con un diámetro de 10 μm, se introdujo en un pequeño tubo de polietileno (Portex). Uno de los dos extremos del tubo de polietileno se fundió, aplicando calor, con la fibra de carbono dentro, para conseguir que en el extremo la fibra de carbono quedara totalmente cubierta por polietileno y aislada eléctricamente (salvo por la punta), mientras que el otro extremo se Materiales y Métodos 59 introdujo en un capilar de vidrio Kimax-51 (Kimble products). Se aplicó Sylgard® para sellar el extremo del polietileno al capilar de vidrio, y poder así rellenarlo con una solución conductora de la corriente eléctrica (3M KCl). Esta estructura garantizó que el electrodo de plata del head-stage (preamplificador) del set-up conectara con la fibra de carbono a través del capilar de vidrio, quedando sumergidos en la solución conductora tanto el electrodo de plata del head-stage del amplificador como un extremo de la fibra de carbono. Tras colocar la fibra de carbono en el set-up, ésta se polarizó al potencial deseado gracias a un generador de voltaje (npi Electronics, GMBH) que estaba conectado al amplificador operacional EPC-8 (HEKA Electronics) (Figura 17A, panel de la izquierda). Este amplificador estaba configurado como un convertidor corrientevoltaje, de manera que la corriente generada en la fibra era proporcional al voltaje de salida del amplificador (Chow y Von Rüden, 1995). Las rodajas se colocaban en una cámara de registro, situada sobre un microscopio invertido Axiovert 35 (Zeiss) (Figura 17A, panel de la derecha). Los experimentos se realizaron a 30-33ºC. Tras producirse la secreción de dopamina por parte de la rodaja de CC, ante un determinado estímulo, la dopamina se oxida al contactar con la fibra de carbono (que se posiciona muy próxima a los glomérulos), y los electrones liberados resultantes de dicha oxidación se transfieren a la fibra de carbono (Figura 17B), generando una corriente eléctrica detectada por el head-stage. La señal se amplificó, y se filtró a través de un filtro de paso bajo con una frecuencia de corte de 100 Hz. Se digitalizó gracias a un convertidor analógico-digital ITC-16 (Instrutech Corporation) a 250 Hz y se almacenó en el ordenador. La adquisición de datos y su posterior análisis se llevó a cabo con los programas Pulse 8 (HEKA Electronics) e Igor Pro (Wavemetrics), respectivamente. 4.5.1.3. Análisis de los registros Tras la digitalización, la corriente que se genera por la oxidación de la dopamina procedente de la exocitosis de una vesícula secretora queda registrada como una espiga amperométrica (Figura 17C). Según las leyes de Faraday de la electrólisis, existiría una correlación entre el número de moléculas oxidadas y la corriente generada, siendo ambas variables directamente proporcionales, como queda reflejado en la ecuación: Materiales y Métodos 60 ∫ I(t) dt = Q = n F N Siendo: I la intensidad de corriente eléctrica (en amperios), t el tiempo transcurrido (en segundos), Q la carga eléctrica (en coulombios), n el número de electrones transferidos por la dopamina al oxidarse (2 electrones), F la constante de Faraday (96485 C/mol) y N el número de moles de dopamina oxidada. La actividad secretora de las rodajas de CC se cuantificó haciendo uso del programa Igor Pro, usando como parámetros el porcentaje de células que responden a cada estímulo, la tasa de secreción y la secreción acumulada. El porcentaje de células que responden a cada estímulo se normalizó respecto a aquellas células que eran sensibles a “alto potasio”, y por lo tanto consideradas excitables. La tasa de secreción se halló al sumar la carga de las espigas amperométricas que se registraron durante el último minuto de exposición al estímulo en cuestión, y se expresó en fC/min. La secreción acumulada se calculó sumando la integral en el tiempo de espigas amperométricas sucesivas, y se expresó en pC. Para más detalle consultar Ureña y cols. (1994) y el capítulo metodológico correspondiente (Ortega-Sáenz y cols., 2018). 4.5.2. Medida de los niveles de Ca2+, NADH y ROS por microfluorimetría La técnica de microfluorimetría permite la detección de cambios en las concentraciones intracelulares de diferentes especies químicas de interés mediante indicadores fluorescentes o mediante el registro de la autofluorescencia de la molécula en cuestión. Para ello, las muestras se excitan con una l concreta, de manera que cuando la concentración de la molécula de estudio cambia, se altera la fluorescencia emitida, la cual queda registrada por el sistema (Ureña y cols., 1994; Muñoz-Cabello y cols., 2018). En concreto en este trabajo, la microfluorimetría se ha usado para medir los cambios en la concentración citosólica de Ca2+ y de NAD(P)H en células dispersas de CC, los niveles basales de NAD(P)H en neuroesferas de la ZSV y los cambios en las concentraciones mitocondriales (espacio intermembrana y matriz mitocondrial) de ROS en rodajas de CC. Materiales y Métodos 61 Figura 17. Equipo de amperometría. (A) La imagen ilustra los diferentes componentes del set-up o equipamiento de amperometría. En la fotografía puede apreciarse la fibra de carbono cerca de las células glómicas del CC, agrupadas en glomérulos. (B) Representación de la detección por parte de la fibra de carbono de las catecolaminas liberadas por las células glómicas del CC. (C) Ejemplo de espiga amperométrica, resultante del registro de la exocitosis de catecolaminas por parte de las células glómicas de CC. Modificado de Ortega-Sáenz y cols. (2018). 4.5.2.1. Soluciones de registro y mezclas de gases Las células dispersas de CC, las neuroesferas de la ZSV y las rodajas de CC fueron continuamente perfundidas con las diferentes soluciones de registro y mezclas de gases detalladas en el apartado 4.5.1. “Medida de la actividad secretora mediante amperometría”. Para la medida de los niveles de NAD(P)H se usó, cuando correspondía, 1 mM alfa-cetobutirato (aCB), preparado en solución externa control y Materiales y Métodos 62 burbujeada con la mezcla de gases control. En el caso de las medidas de los niveles de ROS se usó 200 µM H2O2, igualmente cuando correspondía y preparada en solución control y burbujeada con la mezcla de gases control. 4.5.2.2. Equipamientos de registro Para los registros de microfluorimetría en células dispersas de CC o neuroesferas de la ZSV se usó un set-up que contaba con un microscopio invertido (Nikon eclipse Ti) equipado con óptica convencional para epifluorescencia y fotometría, así como una cámara de registro donde se posicionaban las muestras. En particular este microscopio presentaba un objetivo 40x/0,60 AN (PlanFluoR). Como sistema de excitación se utilizó una lámpara de xenón de 150 W, un monocromador (un dispositivo óptico que permite seleccionar la l de excitación) Polychrome V (Till Photonics), y un espejo dicroico FF409-Di03 (Semrock). La fluorescencia emitida se detectó con una cámara CCD Orca Flash 4 (Hamamatsu Photonics). La lámpara de xenón emite un haz de luz con una amplia gama de l. El monocromador selecciona de este haz de luz una banda de λ más acotada, que viaja hasta el microscopio a través de una fibra óptica. En su trayecto incide en el espejo dicroico, que tiene una inclinación de 45º y, en el caso del espejo FF409-Di03, refleja hacia la muestra las λ por debajo de 409 nm, y deja pasar a su través aquellas superiores a 409 nm. El haz de luz llega hasta la muestra, que se excita y emite fluorescencia a una λ mayor de 409 nm, atravesando el espejo dicroico. La fluorescencia emitida es detectada con la cámara CCD tras pasar por un filtro de emisión FF01-510/84 (Semrock). La señal se digitaliza, pudiendo ser visualizada en un ordenador (Figura 18). El monocromador, la cámara CCD y la adquisición de imágenes fueron controlados por el programa AquaCosmos 2.0 (Hamamatsu Photonics). Para los registros de microfluorimetría en rodajas de CC se usó un equipo diferente, pero su funcionamiento tiene el mismo fundamento que el descrito anteriormente. En este caso el set-up contaba con un microscopio directo (Olympus Bx51), igualmente equipado con óptica convencional para epifluorescencia y fotometría, y una cámara de registro donde se posicionaban las rodajas de CC. Este microscopio presentaba en particular un objetivo 60x/0,90 AN (Olympus). Se empleó una lámpara de xenón de 150 W, un monocromador Polychrome V (Till Photonics) y un espejo dicroico DiO2-R488 (Semrock) como sistema de excitación. Como sistema de detección se usó una cámara CCD iXon3 (Andor technology). En este caso, el espejo dicroico DiO2- Materiales y Métodos 63 R488 refleja hacia la muestra las λ por debajo de 488 nm, y deja pasar a su través aquellas superiores a 488 nm. La fluorescencia emitida por la muestra pasa por un filtro de emisión FF01-520/35 (Semrock) antes de ser detectada por la cámara CCD (Figura 18). El monocromador, la cámara CCD y la adquisición de imágenes estaban coordinados por el programa Live Adquisition (Till Photonics). En ambos casos los experimentos se realizaron a 30-33ºC. Figura 18. Equipo de microfluorimetría. Representación de los diferentes componentes del set-up o equipamiento de microfluorimetría. El monocromador emite una banda estrecha de λ de excitación (azul) que el espejo dicroico refleja, permitiendo que llegue a la muestra, con lo que el fluoróforo o la especie química autofluorescente se excita y emite fluorescencia (verde). El espejo dicroico y el filtro dejan pasar a su través la fluorescencia emitida, la cual es registrada por la cámara CCD y monitorizada en el ordenador. Modificado de Muñoz-Cabello y cols. (2018). 4.5.2.3. Medida de los cambios en la concentración citosólica de Ca2+ Con el fin de medir los cambios en la concentración citosólica de Ca2+ frente a diferentes estímulos en las células dispersas de CC, se usó el marcador ratiométrico Fura-2 éster acetoximetílico (AM) (TefLabs MW 1002), que se une al Ca2+ intracelular libre. Este indicador es permeable a través de la membrana plasmática. Una vez llega al citosol, esterasas intracelulares escinden el grupo -AM, quedando atrapado el fluoróforo en el interior celular. Fura-2 presenta dos picos de excitación, a 340 nm y 380 nm, y un pico de emisión a 510 nm. Cuando se excita a 340 nm, la fluorescencia emitida es Materiales y Métodos 64 directamente proporcional al aumento de la concentración de Ca2+, mientras que, al excitarse a 380 nm, el cambio en la fluorescencia emitida es inversamente proporcional a la concentración de Ca2+ citosólico. Un aumento en la ratio de las intensidades de fluorescencia emitidas a 510 nm al excitar a 340 nm y 380 nm, equivale a un incremento en la concentración citosólica de Ca2+. Esta medida ratiométrica (F340/F380) minimiza la aparición de artefactos relacionados con diferencias en la concentración del marcador dentro de las células, en la intensidad de la excitación, etc. (Ureña y cols., 1994; Muñoz-Cabello y cols., 2018). Las células dispersas de CC adheridas a cubres de poli-L-lisina se cargaron con 2 μM de Fura-2AM en DMEM-F12 durante 20 minutos en el incubador (ver apartado 4.3.2.2. “Cultivo de células dispersas de cuerpo carotídeo” para más detalles). Tras ello, los cubres con las células se lavaron en MCCC durante 10 minutos en el incubador. Una vez en la cámara de registro, las células cargadas con Fura-2 se excitaron con las λ de 340 nm y 380 nm. El protocolo de adquisición fue diseñado con una resolución espacial de 4 x 4 pixeles, un tiempo de excitación de 20 ms, y un intervalo de adquisición de 5 segundos. 4.5.2.4. Medida de los cambios en la concentración intracelular de NAD(P)H El NADH y el NADPH son moléculas autofluorescentes, por lo que no se requiere de la adición de ningún fluoróforo para medir sus niveles intracelulares mediante microfluorimetría. Debido a que mediante esta técnica no se puede discriminar entre cambios en la concentración intracelular de NADH o NADPH, en adelante los citaremos como NAD(P)H. Para medir la autofluorescencia de NAD(P)H se aplicó un protocolo no ratiométrico (Duchen y Biscoe, 1992; Buckler y Turner, 2013; Muñoz-Cabello y cols., 2018). El NAD(P)H tiene un pico de excitación a 360 nm y un pico de emisión a 460 nm. Un aumento en la fluorescencia emitida a 460 nm al excitar a 360 nm se correspondería con un incremento en los niveles intracelulares de NAD(P)H. En el caso de las células dispersas de CC, tras 24 horas en cultivo sobre cubres con poli- L-lisina, se transfirieron a la cámara de registro del set-up. Las neuroesferas de la ZSV, cultivadas en suspensión durante una semana, necesitaron sembrarse en cubres de vidrio tratados con fibronectina e incubarse durante al menos 2 horas en MCN para que se adhirieran a dichos cubres, antes de transferirlas a la cámara de registro del set-up. Las células se excitaron con una λ de 360 nm. El protocolo de adquisición fue diseñado con una resolución espacial de 4 x 4 pixeles, un tiempo de excitación de 150 ms, y un intervalo de adquisición de 5 segundos. La fluorescencia de fondo se restó en todos los Resultados 71 apreciaron sobre todo en la corteza cerebral dorsal, el hipocampo y el cerebelo (Figuras 22B-F). Además, los cerebros de los ratones knockout para Ndufs2 mostraban el cuerpo calloso atrofiado y los ventrículos laterales dilatados (ventriculomegalia) (Figura 22B). Figura 22. Estudio histológico del encéfalo de ratones hGFAP-NDUFS2 P7 y análisis de la efectividad del modelo hGFAP-NDUFS2. (A) Fotografías del encéfalo de un ratón hGFAP-NDUFS2 P7 (derecha) y un control Ndufs2flox/+ de la misma camada (izquierda). (B-F) Cortes coronales de encéfalo de ratones P7 knockout para Ndufs2 (paneles de la derecha) y controles Ndufs2flox/+ (paneles de la izquierda), teñidos para NeuN. Los paneles (C) y (E) son imágenes a mayor aumento de los paneles (B) y (D), respectivamente. (G) Niveles relativos de ARNm de Ndufs2 en el telencéfalo dorsal de ratones P7 (n = 3 ratones/grupo) para los genotipos indicados. Normalizado con el gen Gapdh. (H) Actividad del CMI en el telencéfalo dorsal de ratones P7 (n = 3-4 ratones/grupo) para los genotipos indicados. Los datos se presentan como la media ± SEM. **p < 0,01; ****p < 0,0001 (pruebas One Way ANOVA y Tukey’s post hoc). Cb, cerebelo; Ctx, córtex; CuC, cuerpo calloso; Hc, hipocampo; V, ventrículo. Con la intención de verificar la ablación de Ndufs2 en los ratones hGFAP- NDUFS2, se realizó un estudio de la expresión del gen mediante RT-qPCR en muestras de telencéfalo dorsal. En este análisis se observó que los niveles de ARNm de Ndufs2 disminuían hasta aproximadamente un 55 % (55,73 ± 0,02 %) en los heterocigotos (Ndufs2flox/-), y hasta aproximadamente un 35 % (36,58 ± 0,02 %) en los ratones hGFAP-NDUFS2, respecto a los valores del control Ndufs2flox/+ (Figura 22G). Con este Resultados 72 análisis se puso de manifiesto que la recombinación mediante hGFAP-Cre tenía lugar permitiendo la deleción del gen Ndufs2 con una eficiencia relativamente óptima. Además, también se analizó la actividad enzimática del CMI en los ratones hGFAP- NDUFS2 en muestras de telencéfalo dorsal mediante un ensayo colorimétrico tipo dipstick (para más detalles véase el apartado 4.4.3. “Actividad del complejo mitocondrial I”). En este análisis se mostró una inhibición casi completa de la actividad NADH deshidrogenasa del CMI (Figura 22H). La magnitud del descenso en el porcentaje de actividad enzimática del CMI se correlaciona con la de los niveles de ARNm de Ndufs2 (Figuras 22G, H). Una vez que se confirmó la caída en la expresión y la actividad del CMI, se realizaron experimentos para profundizar en las causas de las alteraciones estructurales observadas en el encéfalo de los ratones hGFAP-NDUFS2. La atrofia podría deberse tanto a una disminución de la proliferación como a un aumento de la muerte celular. Para aclarar este punto, se llevó a cabo un estudio in vivo de proliferación celular y apoptosis, realizando tinciones frente al marcador ki67, para identificar las células proliferantes, y frente al marcador c-casp3, para evaluar la apoptosis (Figura 23). Los ratones hGFAP-NDUFS2 mostraron una disminución significativa en el número de células ki67+ en la corteza cerebral dorsal (Figuras 23A, B) y un aumento del número de células c-casp3+ (Figuras 23C, D) respecto a la corteza cerebral de los ratones controles (Figuras 23A-D), lo que sugiere una disminución en la proliferación celular y una notable inducción de la apoptosis en la corteza de los ratones hGFAP-NDUFS2. En el hipocampo se observó la misma tendencia que en la corteza cerebral dorsal; los ratones knockout también presentaban una clara reducción de la proliferación celular y un aumento de la muerte celular programada respecto a los controles (Figuras 23E-H). Estos resultados revelan que la neurogénesis y/o la gliogénesis perinatal se interrumpe en ciertas regiones del encéfalo de los ratones hGFAP-NDUFS2 porque tanto el proceso de proliferación celular como el de apoptosis están alterados. Resultados 73 Figura 23. Alteraciones en la proliferación y muerte celular en la corteza y el hipocampo de los ratones hGFAP-NDUFS2. (A, C, E, G) Cortes coronales de cerebro de ratones P7 knockout para Ndufs2 (paneles de la derecha) y controles Ndufs2flox/+ (paneles de la izquierda), teñidos para ki67 (A, E) o ccasp3 (C, G). (B, D, F, H) Cuantificación de células corticales (B, D) o del hipocampo (F, H) ki67+ (B, F) o c-casp3+ (D, H) en ratones P7 (n = 3 ratones/grupo) para los genotipos indicados. Los datos se presentan como la media ± SEM. **p < 0,01; ***p < 0,001 (prueba t de Student para muestras desapareadas). c-casp3, caspasa-3 escindida; GD, giro dentado. Una observación bastante interesante fue que las células positivas para GFAP del encéfalo de los ratones hGFAP-NDUFS2 presentaban unos característicos procesos largos que no aparecían en el encéfalo de los controles (Figuras 24A-D). Estos procesos eran particularmente abundantes en el cuerpo estriado y se asemejaban al marcaje GFAP de las células de la glía radial durante las etapas embrionarias, pudiendo ser indicativo de un estadio intermedio de diferenciación. Por otra parte, y de manera muy llamativa, no se detectó marcaje GFAP+ en el cuerpo calloso de los ratones hGFAP- Resultados 74 NDUFS2. En esta región del telencéfalo abunda una subpoblación de astrocitos fibrosos, cuyo marcaje GFAP+ desaparece prácticamente al completo en los ratones knockout para Ndufs2 (Figuras 24B, D-F). Esta observación indicaría que la gliogénesis puede verse profundamente afectada en ausencia del CMI, al menos en determinadas subpoblaciones, como sería el caso de los astrocitos del cuerpo calloso. Figura 24. Afectación de las células GFAP+ en el cerebro de los ratones hGFAP-NDUFS2. (A-D) Cortes coronales de cerebro representativos de ratones P7 hGFAP-NDUFS2 (C, D) y controles Ndufs2flox/+ (A, B), teñidos para GFAP. Los paneles (B) y (D) son imágenes a mayor aumento de las áreas seleccionadas en los paneles (A) y (C), respectivamente. (E) Detección de las células GFAP+ (rojo) mediante inmunofluorescencia en el cuerpo calloso en cortes coronales de cerebro de un ratón P7 knockout para Ndufs2 (derecha) y un control Ndufs2flox/+ (izquierda). (F) Análisis cuantitativo expresado como porcentaje de área marcada para GFAP+ en relación con el total del área seleccionada, correspondiente al cuerpo calloso (líneas punteadas en las imágenes del panel E), de los ratones cuyos genotipos se indican. Los núcleos se detectaron por marcaje con DAPI (azul). Los datos se presentan como la media ± SEM (n = 3 ratones/grupo). ***p < 0,001 (prueba t de Student para muestras desapareadas). Ctx, córtex; CuC, cuerpo calloso; V, ventrículo. Resultados 75 5.1.2. Alteraciones en la biología de las células troncales y los progenitores neurales centrales Con el objetivo de analizar en detalle los efectos de la disfunción inducida genéticamente del CMI en la biología de las CTNs y su progenie, se realizaron estudios in vitro con células procedentes de la ZSV de ratones hGFAP-NDUFS2. Como se comentó anteriormente, el promotor hGFAP también está activo en las CTNs de la ZSV de roedores durante la vida posnatal (Pastrana y cols., 2009; Beckervordersandforth y cols., 2010). Para estos estudios in vitro se realizaron cultivos primarios de neuroesferas de la ZSV. Estas colonias de células no adherentes a sustrato resultan de la proliferación clonal de células troncales y progenitores neurales aislados de la ZSV y sembrados en un medio de cultivo sin suero con mitógenos a baja densidad celular (Reynolds y Weiss, 1992; Gritti, 2001) (véase el apartado de Materiales y Métodos 4.3.1. “Cultivo primario de neuroesferas de la zona subventricular”, para más detalles). Dado que las neuroesferas “primarias” de la ZSV están normalmente formadas por una población no homogénea de células, incluyendo CTNs y progenitores intermedios (Pastrana y cols., 2011; Gil-Perotín y cols., 2013), en adelante se empleará el término célula troncal/progenitor neural (CTPN) (Taverna y cols., 2014) cuando se describan y discutan los estudios realizados. La mayor parte de los experimentos in vitro que se detallan en los siguientes apartados se llevaron a cabo con neuroesferas de la ZSV procedentes de ratones hGFAP-NDUFS2 P7 y sus hermanos controles de la misma camada, cultivadas durante 7 días (Figuras 25A-C). La expresión del gen Ndufs2 también se comprobó en las muestras de neuroesferas de la ZSV midiendo los niveles de ARNm mediante qPCR. En este caso la disminución de los niveles de ARNm de Ndufs2 para las neuroesferas de ratones hGFAP-NDUFS2 respecto a sus controles (Figura 25F) fue aún más acusada que la disminución observada en las muestras de telencéfalo dorsal (Figura 23A), debido probablemente a que se partía de una muestra celular más homogénea. 5.1.2.1. Producción de ATP y proliferación celular El número de neuroesferas que llega a formarse en cultivo a partir de células aisladas de la ZSV, puede emplearse como un marcador de supervivencia y viabilidad de las CTNs. En los cultivos de neuroesferas incubadas durante 7 días se pudo observar que el número de neuroesferas formadas a partir de células de la ZSV aislada de ratones Resultados 76 hGFAP-NDUFS2 era sutilmente menor que el número de neuroesferas formadas partiendo de muestras de ratones control, aunque esta ligera diferencia no era estadísticamente significativa (Figura 25D). Estos resultados indican que la supervivencia de las CTPNs no se ve afectada severamente por la disfunción del CMI. No obstante, al medir el diámetro de estas mismas neuroesferas, se detectó que este parámetro era claramente menor en las neuroesferas procedentes de ratones mutantes para Ndufs2 en comparación con los controles (Figuras 25A-C, E), indicando que la tasa de proliferación celular podría estar drásticamente afectada en las CTPNs que carecen de CMI. Figura 25. Cultivos primarios de neuroesferas de la ZSV de ratones hGFAP-NDUFS2 y sus controles. La ausencia de CMI altera la tasa de proliferación celular in vitro de las CTPNs sin afectar a su supervivencia. (A-C) Imágenes de campo claro de neuroesferas derivadas de células de la ZSV de ratones P7 (tras 7 días de cultivo) de los genotipos indicados. Los recuadros insertados muestran una imagen a mayor aumento de neuroesferas representativas (señaladas a su vez con puntas de flecha rojas). Escala del recuadro insertado: 100 µm. (D, E) Análisis cuantitativo de neuroesferas derivadas de células de la ZSV (tras 7 días de cultivo) de ratones P7 para los genotipos indicados. (D) Eficiencia de la formación de neuroesferas (n = 4-7 ratones/grupo). (E) Diámetro del núcleo de las neuroesferas (n = 4-8 ratones/grupo). (F) Análisis cuantitativo de ARNm de Ndufs2 en neuroesferas derivadas de células de la ZSV (tras 7 días de cultivo) de ratones P7 para los genotipos indicados (n = 4-6 ratones/grupo). Normalizado con el gen Gapdh. Los datos se presentan como la media ± SEM. ***p < 0,001 (pruebas One Way ANOVA y Tukey’s post hoc). Al cuantificar el diámetro de las neuroesferas procedentes de ratones heterocigotos inducidos por la hGFAP-Cre (Ndufs2flox/+; hGFAP-Cre), se observó que su tasa de proliferación celular era intermedia entre las halladas en animales Ndufs2flox/+ Resultados 77 o Ndufs2flox/-, y en ratones hGFAP-NDUFS2 (Figuras 25A-C, E). Este resultado, junto con un análisis de la proliferación de células silvestres (Ndufs2+/+) que expresaban hGFAP-Cre (Figura 26), parecía indicar que la expresión de la hGFAP-Cre tenía un efecto secundario perjudicial que afectaba a la proliferación de las CTPNs (para más detalles, consultar apartado 6. “Discusión”). A pesar de este efecto, en las neuroesferas de la ZSV de los ratones hGFAP-NDUFS2, el descenso en la tasa de proliferación celular fue más acusado respecto al de los animales Ndufs2flox/+; hGFAP-Cre (Figuras 25A-C, E), lo que sugiere que la disfunción del CMI tiene un impacto negativo en la proliferación de CTPNs. Figura 26. Efecto de la expresión de la hGFAP-Cre sobre el diámetro de las neuroesferas de la ZSV en un fondo Ndufs2+/+. Diámetro de las neuroesferas de la ZSV de ratones silvestres y mutantes hGFAP- Cre (fondo Ndufs2+/+) tras 7 días en cultivo (n = 5-6 ratones/grupo, P17-P40). Los datos se presentan como la media ± SEM. ***p < 0,001 (prueba t de Student para muestras desapareadas). Para confirmar si la disfunción del CMI afecta a la proliferación de CTPNs, se llevaron a cabo experimentos de inhibición farmacológica del CMI. Para ello, neuroesferas de ZSV procedentes de animales silvestres P30 se incubaron con rotenona, un inhibidor selectivo del CMI. Tras 7 días de incubación, se observó que el diámetro de las neuroesferas incubadas con rotenona era significativamente menor que las controles (Figura 27). Este hallazgo apoya que el defecto en la proliferación de las CTPNs en el modelo hGFAP-NDUFS2 podría ser causado por la disfunción del CMI. Con el propósito de avanzar en la caracterización del modelo hGFAP-NDUFS2, se midieron los niveles de NADH de las neuroesferas de la ZSV de ratones hGFAP- NDUFS2 P7 y sus controles, tras 7 días en cultivo, mediante la técnica de microfluorimetría. Este análisis mostró que los niveles basales de NAD(P)H de las CTPNs de los ratones hGFAP-NDUFS2 son mayores que los niveles basales medidos en las neuroesferas de los demás grupos control (Figura 28). La actividad NADH Resultados 78 deshidrogenasa del CMI está ausente en estas células, interrumpiendo la regeneración NAD+ por esta vía, con el consecuente acúmulo de NADH. Se sabe que las células glómicas del modelo TH-NDUFS2 también sobreviven y presentaban niveles elevados de NADH respecto a sus controles (Fernández-Agüera y cols., 2015), siendo estas alteraciones características del modelo knockout para el CMI. Figura 27. Efecto de la rotenona en la proliferación de las CTPNs de la ZSV. Diámetro del núcleo de las neuroesferas de la ZSV de ratones silvestres P30 (n = 6 ratones/condición) tras 7 días en cultivo. Las neuroesferas se cultivaron en condiciones control o en presencia de rotenona 10 nM (n = 4 experimentos independientes). Los datos se presentan como la media ± SEM. **p < 0,01 (prueba t de Student para muestras desapareadas). Por otro lado, y dado que el CMI está involucrado en la síntesis mitocondrial de ATP, se midieron los niveles de ATP de las CTPNs deficientes en Ndufs2, las cuales carecerían de la función de bombeo transmembrana de protones del CMI (que contribuye a la FosOx). Para estas medidas se empleó un ensayo de bioluminiscencia basado en la reacción luciferasa-luciferina, a partir de neuroesferas de ZSV en cultivo durante 7 días. Como se ilustra en la Figura 28, las muestras procedentes de animales hGFAP-NDUFS2 presentaban unos niveles totales de ATP menores respecto a los controles. En las neuroesferas procedentes de animales heterocigotos (Ndufs2flox/- y Ndufs2flox/+; hGFAP-Cre) no se apreciaron diferencias significativas en los niveles de ATP totales en comparación con las de los ratones Ndufs2flox/+ (Figura 28). Resultados 79 Figura 28. La ausencia de NDUFS2 incrementa los niveles de NAD(P)H y reduce el contenido de ATP. (A, B) Análisis cuantitativo en neuroesferas derivadas de células de la ZSV (tras 7 días de cultivo) de ratones P7 hGFAP-NDUFS2 y sus controles para los genotipos indicados. (A) Cuantificación de los niveles de autofluorescencia basal de NAD(P)H en las neuroesferas (n = 28-51 células/grupo). (B) Contenido relativo de ATP en las neuroesferas (n = 5 ratones/grupo). Los datos se presentan como la media ± SEM. *p < 0,05; ***p < 0,001 (pruebas One Way ANOVA y Tukey’s post hoc). u.a., unidades arbitrarias. Esta observación contrasta con los datos obtenidos en el modelo TH-NDUFS2, donde los niveles totales de ATP en las células de CC deficientes en Ndufs2 no se veían afectados. Es posible que en ese caso la síntesis de ATP pudiera compensarse mediante glucólisis y/o un ciclo de Krebs muy activo, con un CMII altamente potenciado (Fernández-Agüera y cols., 2015; Arias-Mayenco y cols., 2018). Aunque es probable que el defecto proliferativo de las CTPNs de los ratones hGFAP-NDUFS2 se deba al déficit de ATP observado en estas células, no se pueden descartar otras causas, tales como el descenso en la ratio NAD+/NADH. Se ha descrito que, en células tumorales, en un contexto de disfunción mitocondrial en el que han perdido su capacidad de proliferar, el piruvato puede restablecer la tasa de proliferación de estas células al actuar como aceptor de electrones y regenerar el NAD+ necesario para el funcionamiento del ciclo de Krebs y la síntesis de aspartato. Este aminoácido es necesario para la síntesis de nuevos nucleótidos, cuya producción está incrementada en las células en proliferación (Birsoy y cols., 2015; Sullivan y cols., 2015). Teniendo en cuenta lo indicado en el párrafo anterior, se probaron diferentes protocolos de “rescate metabólico”, con el objetivo de corregir el defecto en la proliferación observado en los cultivos de neuroesferas de ZSV de ratones hGFAP- NDUFS2, y esclarecer el origen de dicha afectación (descenso en los niveles de ATP y/o el descenso en los niveles de NAD+). Por un lado, se incubaron neuroesferas procedentes de ratones hGFAP-NDUFS2 con piruvato, con el fin de aumentar los niveles de NAD+ y favorecer la síntesis de nucleótidos en las CTPNs, junto a uridina, Resultados 80 que es esencial para la síntesis de pirimidinas en los casos en los que la CTE no es funcional (Grégoire y cols., 1984). Sin embargo, este abordaje no logró estimular la proliferación de las neuroesferas sin CMI (Figura 29A). Por otra parte, también se probó a incubar las neuroesferas con diferentes dosis de dimetil succinato (un sustrato permeable del CMII) con el objetivo de potenciar esta vía de entrada en la CTE y compensar el déficit de producción de ATP en los ratones hGFAP-NDUFS2. No obstante, no se apreció ningún efecto significativo con este tratamiento, pues las neuroesferas incubadas con dimetil succinato presentaron el mismo diámetro que sus controles sin tratar, independientemente de la dosis usada (Figura 29B). La adición combinada de piruvato, uridina y dimetil succinato tampoco consiguió revertir las tasas de proliferación celular en el modelo hGFAP-NDUFS2 (Figura 29B). En conjunto, nuestros datos indican que las CTPNs de la ZSV requieren de un CMI funcional y una CTE activa para proliferar adecuadamente. 5.1.2.2. Diferenciación neuronal y glial En las condiciones adecuadas, las CTNs de la ZSV pueden llegar a diferenciarse in vitro a astrocitos, oligodendrocitos y neuronas (Reynolds y Weiss, 1992; Weiss y cols., 1996). Teniendo en cuenta esto, y el interés por estudiar la función del CMI en la neurogénesis y la gliogénesis, se llevaron a cabo ensayos de diferenciación con las neuroesferas de la ZSV de ratones hGFAP-NDUFS2 P7 y sus controles, tras 7 días en cultivo (para más detalles véase el apartado 4.3.3.1. “Ensayo de diferenciación celular en neuroesferas de la zona subventricular”). A continuación, mediante inmunofluorescencia, se estudió la presencia, morfología y número de astrocitos, oligodendrocitos y neuronas en las neuroesferas, a los 2, 5 y 7 días de iniciarse la diferenciación. En todos los puntos temporales analizados se hallaron astrocitos, neuronas y oligodendrocitos inmaduros en los cultivos procedentes de ratones hGFAP- NDUFS2 y en sus controles (Figuras 30A, B). Estos resultados indican que, a pesar de no contar con el CMI, las CTPNs pueden diferenciarse en los tres linajes neurales. No obstante, se encontraron diferencias significativas en la viabilidad de las neuronas y los oligodendrocitos en los cultivos procedentes de animales hGFAP-NDUFS2 y los controles (Figuras 30A, B). Resultados 87 Figura 33. Estudio de la disfunción del CMI en tejidos neurales periféricos. (A, D) Detección de las células TH+ (rojo) mediante inmunofluorescencia en cortes de GCS (A) y MA (D) de ratones P7 knockout para Ndufs2 (paneles de la derecha) y Ndufs2flox/+ (paneles de la izquierda) representativos. Los núcleos se detectaron por marcaje con DAPI (azul). (B) Volumen del GCS para los genotipos indicados (n = 4-9 ratones/grupo). (C) Niveles relativos de ARNm de Ndufs2 en el GCS (n = 3 experimentos a partir de muestras agrupadas; 3-4 ratones/réplica) para los genotipos indicados. Normalizado con el gen Gapdh. (E) Volumen de la MA para los genotipos indicados (n = 3-10 ratones/grupo). Los datos se presentan como la media ± SEM. ****p < 0,0001 (pruebas One Way ANOVA y Tukey’s post hoc). El análisis histológico del CC tampoco mostró alteraciones en la morfología (Figura 34A) ni el número de células TH+ (Figura 34B) de los ratones hGFAP-NDUFS2 P7 respecto a sus controles. Con el fin evaluar si en este órgano había tenido lugar la escisión de Ndufs2 mediada por hGFAP-Cre, se analizó la expresión del gen mediante qPCR en muestras de CC de ratones hGFAP-NDUFS2 y controles. Como se puede observar en la Figura 34C, las muestras procedentes de animales hGFAP-NDUFS2 presentaron niveles de expresión de Ndufs2 muy similares a las de los heterocigotos (Ndufs2flox/-). Estos resultados sugieren que la producción de células glómicas durante la primera semana posnatal no depende de progenitores GFAP+ o, como se ha indicado arriba, el promotor hGFAP no se activaría en las células precursoras. Resultados 88 Figura 34. Estudio de la histología del CC en el modelo hGFAP-NDUFS2. (A) Detección de las células TH+ (rojo) mediante inmunofluorescencia en cortes CC de ratones P7 knockout para Ndufs2 (paneles de la derecha) y controles Ndufs2flox/+ (paneles de la izquierda). Los núcleos se detectaron por marcaje con DAPI (azul). El parénquima del CC está delimitado por líneas blancas discontinuas. (B) Número de células TH+ (n = 3-9 ratones/grupo). (C) Niveles relativos de ARNm de Ndufs2 (n = 3 experimentos independientes a partir de muestras agrupadas; 3-4 ratones/réplica). Normalizado con el gen Gapdh. Los datos se presentan como la media ± SEM (pruebas One Way ANOVA y Tukey’s post hoc). Para confirmar estas observaciones acerca del crecimiento perinatal del CC, se realizaron experimentos de trazado de linaje empleando el modelo hGFAP-TdTomato, que contiene el transgén hGFAP-Cre y el reportero tdTomato en el locus Rosa26 (para más detalles véase el apartado 4.1.2. “Ratones modificados genéticamente”). En el CC de los ratones P7 se observó que las células tdTomato+ que se correspondían con las células sustentaculares o tipo II (GFAP+) eran relativamente numerosas (Figura 35A). No obstante, no se detectaron células tdTomato+ que fueran a su vez TH+ (Figuras 35A, B), lo que sugiere que el aumento de células glómicas en este punto del desarrollo perinatal (P7) no tiene lugar a partir de precursores GFAP+ (o con activación del promotor hGFAP). Cuando este análisis se llevó a cabo en ratones P21 hGFAP- TdTomato, sí se detectaron algunas células que eran doble positivas para TH y tdTomato (Figura 35C). Esta colocalización parece indicar que en edades más avanzadas algunas células glómicas derivan de células GFAP+. Resultados 89 Figura 35. Estudio de la histología del CC en el modelo hGFAP-TdTomato. (A) Imágenes de confocal detectando células tdTomato+ (rojo) y TH+ (verde) mediante inmunofluorescencia en cortes de CC de un ratón hGFAP-tdTomato P7 representativo. (B, C) Proyecciones ortogonales de imágenes confocales detectando células tdTomato+ (rojo) y TH+ (verde) mediante inmunofluorescencia en cortes de CC de un ratón hGFAP-tdTomato P7 (B) y P21 (C). Los núcleos se detectaron por marcaje con DAPI (azul). 5.2. Interrupción genética del transporte de electrones mitocondrial y regulación de la respiración por el oxígeno Con el propósito de avanzar en la compresión de los mecanismos moleculares responsables de la sensibilidad aguda al O2, y en particular comprobar la validez del modelo de “señalización de mitocondria a membrana” (Figura 36), en el que el CMIV actuaría como sensor, y el CMI (y probablemente también el CMIII) como efector de la respuesta aguda a la hipoxia (Arias-Mayenco y cols., 2018; Moreno-Domínguez y cols., 2020; Ortega-Sáenz y cols., 2020; Ortega-Sáenz y López-Barneo, 2020), se generó el modelo TH-RISP. Éste es un ratón knockout para el gen nuclear Uqcrfs1 (los animales portan los alelos Uqcrfs1flox/flox o Uqcrfs1flox/- y el transgén TH-IRES-CRE). Como se indicó en “Introducción”, el gen Uqcrfs1 codifica RISP, una subunidad del CMIII esencial para su funcionamiento (véanse Figuras 3 y 11) (Snyder y cols., 1999). Aunque no se ha descrito cómo la ablación genética de RISP afecta al ensamblaje y posicionamiento del CMIII en la membrana mitocondrial interna, la ausencia de RISP impide que se lleve a cabo la transferencia de electrones entre QH2 y el citocromo c (Waypa y cols., 2013). El modelo TH-RISP es un modelo condicional basado en el sistema Cre/loxP, donde la deleción del gen Uqcrfs1 solo afecta a las Resultados 90 células TH+, ya que la recombinasa Cre se encuentra bajo el promotor endógeno del gen de la TH (Figura 37A). Como se comentó en la “Introducción”, este gen codifica la enzima tirosina hidroxilasa, que es limitante en la síntesis de catecolaminas, y su promotor está activo en las células que producen catecolaminas (sistema simpatoadrenal, neuronas dopaminérgicas centrales, entre otras) (Lindeberg y cols., 2004). Si consideramos el modelo de “señalización de mitocondria a membrana” de sensibilidad aguda al O2 (ver Figura 36), en el modelo de ratón TH-RISP las células glómicas (TH+) tendrían una CTE mitocondrial interrumpida, en la que el trasiego de electrones entre el sensor (CMIV) y el efector (CMI) estaría impedido, al carecer de un CMIII capaz de transmitir electrones. En el contexto de la detección de la hipoxemia, el estado redox de los elementos de la CTE mitocondrial estaría por tanto disociado de los cambios en la tensión de O2. Una predicción de este modelo es que la pérdida de RISP debería abolir selectivamente la detección de O2 en las células glómicas, pero mantener la sensibilidad de éstas a otros estímulos como la hipercapnia o la hipoglucemia. Así, el modelo TH-RISP resultaba una herramienta de enorme interés para el estudio de la respuesta aguda a la hipoxia en el CC. Figura 36. Modelo de “señalización de mitocondria a membrana” de detección aguda del O2 en el CC. Esquema de la CTE que ilustra el modelo de “señalización de mitocondria a membrana” de sensibilidad aguda al O2 en las células glómicas del CC de mamíferos. Los cambios en el equilibrio químico inducidos por la hipoxia (Hx) se representan en rojo. Modificado de Ortega-Sáenz y cols. 2020. Cit C, citocromo C; CM(I-IV), complejos mitocondriales I-IV; CoQH2, ubiquinona reducida. Resultados 91 5.2.1. Caracterización del modelo knockout del complejo mitocondrial III en las células catecolaminérgicas En el momento del nacimiento los ratones TH-RISP son indistinguibles a simple vista de sus hermanos controles. De hecho, en las primeras dos semanas de vida estos animales parecen estar completamente sanos, sin presentar alteraciones en su morfología externa o en su comportamiento. Sin embargo, a las 3-4 semanas de edad los ratones TH-RISP muestran de forma progresiva un fenotipo bastante severo, caracterizado por un significativo menor tamaño (Figuras 37B, C), una extrema lordosis (Figura 37B) y alteraciones en la marcha, independientemente del sexo. Los ratones TH-RISP acaban muriendo entre P45-P50, motivo por el cual los experimentos se llevaron a cabo en torno a P40, antes del deterioro de su estado general. La disminución en tamaño y peso de animales con disfunción mitocondrial en el linaje simpatoadrenal estudiados previamente en nuestro laboratorio (Díaz-Castro y cols., 2012; Fernández-Agüera y cols., 2015), parece asociarse a la reducción en los niveles plasmáticos de hormona del crecimiento debido a daño degenerativo en neuronas del núcleo arcuato y la atrofia del lóbulo anterior de la hipófisis (datos no publicados). Teniendo en cuenta estos antecedentes, se midieron los niveles de hormona del crecimiento en muestras de suero de ratones TH-RISP y sus controles Uqcrfs1flox/+ mediante ELISA y pudimos comprobar que los niveles plasmáticos de hormona del crecimiento en los ratones TH-RISP eran significativamente menores en comparación con sus controles (Figura 37D), siendo seguramente ésta la causa del enanismo de los ratones TH-RISP. Por otro lado, para confirmar la deleción de Uqcrfs1 en el modelo TH-RISP, se midieron los niveles de ARNm en muestras de CC, demostrándose que había una disminución marcada y selectiva de su expresión en los ratones TH-RISP en comparación con sus controles Uqcrfs1flox/+. Los niveles de expresión de Ndufs2 y Sdhd, subunidades que forman parte de CMI y CMII, respectivamente, no se alteraron en el CC de los ratones TH-RISP (Figura 37E). Resultados 92 Figura 37. Modelo TH-RISP. (A) Representación esquemática de los alelos Uqcrfs1flox y Uqcrfs1(-). Los sitios loxP limitan el exón 2. Tras la recombinación mediada por Cre el exón 2 es delecionado. (B) Fotografía representativa de un ratón TH-RISP P40 (abajo) y un control Uqcrfs1flox/+ de la misma camada (arriba). (C) Peso corporal de machos y hembras de ratones P40 control Uqcrfs1flox/+ y TH-RISP (n = 9-16 ratones/grupo) (D) Niveles de GH en suero de ratones TH-RISP y control Uqcrfs1flox/+ (n = 10-12 ratones/grupo). (E) Niveles relativos de ARNm de Uqcrfs1, Ndufs2 y Sdhd en el CC de ratones control Uqcrfs1flox/+ y TH-RISP (n = 5 ratones/grupo, cada réplica consta de dos CCs del genotipo correspondiente). Normalizado con el gen Ppia. Los datos se presentan como la media ± SEM. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 (prueba t de Student para muestras desapareadas). E (1, 2, 3), exón (1, 2, 3); GH, hormona del crecimiento. Junto a los estudios moleculares, la caracterización de los animales TH-RISP se completó mediante el análisis histológico de los tejidos catecolaminérgicos. En las secciones de bifurcación carotídea de ratones TH-RISP, el CC presentó una estructura general típica, con células glómicas ovoides organizadas en glomérulos (Figura 38A), y con un número de células TH+ similar al de sus controles Uqcrfs1flox/+ (Figura 38B). En contraste, el GCS de los ratones TH-RISP se encontraba profundamente atrofiado, con un evidente descenso de la densidad de células TH+ (neuronas simpáticas) (Figura 38A) y una pronunciada disminución de su volumen (Figura 38C). Además, la intersección entre el CC y el GCS aparecía bastante difusa en los ratones TH-RISP, algo que también se observó durante la disección del CC para los pertinentes estudios moleculares y funcionales. En los controles Uqcrfs1flox/+ ambos órganos aparecían mucho mejor delimitados (Figura 38A). Resultados 93 Figura 38. Efecto de la deficiencia de RISP en las células TH+ del CC y el GCS. (A) Detección de las células TH+ (rojo) mediante inmunofluorescencia en cortes de bifurcación carotídea de un ratón TH-RISP (panel de la derecha) y un control Uqcrfs1flox/+ (panel de la izquierda). Los núcleos se detectaron por marcaje con DAPI (azul). El parénquima del CC está delimitado por líneas blancas punteadas. (B) Número de células TH+ en el CC para los genotipos indicados (n = 5 muestras/grupo). (C) Volumen del GCS (n = 5 muestras/grupo) para los genotipos indicados. Los datos se presentan como la media ± SEM. *p < 0,05 (prueba t de Student para muestras desapareadas). ACI, arteria carótida interna. En lo que se refiere a la MA, no se apreció ninguna alteración estructural en el conjunto de células TH+ (células cromafines) en los ratones TH-RISP respecto a sus controles Uqcrfs1flox/+ (Figura 39A), siendo el área de la glándula prácticamente igual en ambos grupos de animales (Figura 39B). No obstante, en la corteza de la glándula de los ratones TH-RISP se observó una menor densidad de células (Figura 39A). El análisis de expresión génica en la MA mostró una caída considerable de los niveles de ARNm de Uqcrfs1 en las muestras de ratones TH-RISP en comparación con los controles. Al igual que sucedía en el CC, los niveles de expresión de Ndufs2 y Sdhd, no se veían alterados en la MA de los ratones TH-RISP (Figura 39C). Por lo tanto, teniendo en cuenta el análisis histológico, podemos decir que las células glómicas y las cromafines son Resultados 94 resistentes al déficit de RISP al menos durante las primeras semanas de vida posnatal. Por el contrario, las neuronas simpáticas no sobreviven al déficit mitocondrial severo. Figura 39. Efecto de la deficiencia de RISP en la MA. (A) Detección de las células TH+ (rojo) mediante inmunofluorescencia en cortes de glándula adrenal de ratones knockout para Uqcrfs1 (TH-RISP, panel de la derecha) y controles Uqcrfs1flox/+ (panel de la izquierda). Los núcleos se detectaron por marcaje con DAPI (azul). (B) Volumen de la MA (n = 3-4 muestras/grupo) para los genotipos indicados. (C) Niveles relativos de ARNm de Uqcrfs1, Ndufs2 y Sdhd en la MA (n = 4-5 ratones/grupo, cada réplica consta de 2-3 MAs del genotipo correspondiente) para los genotipos indicados. Normalizado con el gen Rps14. Los datos se presentan como la media ± SEM. ***p < 0,001 (prueba t de Student para muestras desapareadas). En modelos de disfunción del CMI o del CMII en células TH+ desarrollados en nuestro grupo, se detectó una muerte progresiva de neuronas TH+ en regiones catecolaminérgicas del SNC (Díaz-Castro y cols., 2012; González-Rodríguez y cols. 2021). Debido a ello, surgió el interés de comprobar si en el ratón TH-RISP también tenía lugar algún proceso neurodegenerativo a nivel central. Para tal fin, se realizó un estudio histológico en determinadas regiones catecolaminérgicas del cerebro de los ratones TH-RISP y controles Uqcrfs1flox/+, observándose un descenso en el número de Resultados 95 neuronas TH+ en la sustancia negra (mesencéfalo) (Figura 40A), el estriado (telencéfalo) (Figura 40B) y el núcleo arcuato (hipotálamo) (Figura 40C). No se profundizó más en este fenotipo por no encontrarse dentro de los objetivos de este proyecto. Figura 40. Análisis de regiones cerebrales catecolaminérgicas en los ratones TH-RISP. (A, B, C) Cortes coronales de cerebro de ratones knockout para Uqcrfs1 (TH-RISP, paneles de la derecha) y controles Uqcrfs1flox/+ (paneles de la izquierda), teñidos para TH (n = 4 ratones/grupo). Arc, núcleo hipotalámico arcuato; ATV, área tegmental ventral; EM, eminencia media; Estr, estriado; SNpc, substancia negra pars compacta; SNr, substancia negra pars reticulata; VL, ventrículo lateral; 3V, tercer ventrículo. Resultados 96 5.2.2. Respuestas sistémicas a la hipoxia aguda Teniendo en cuenta que el CC es el principal órgano que contribuye a la respuesta hiperventilatoria a la hipoxia en mamíferos (Macías y cols., 2018; Ortega- Sáenz y López-Barneo, 2020), los ratones TH-RISP se sometieron a condiciones de hipoxia ambiental aguda (~10% O2), con el objeto de evaluar los reflejos ventilatorios mediante pletismografía. Como se ilustra en la Figura 41, los ratones TH-RISP no mostraron una hiperventilación frente a la hipoxia aguda. De hecho, durante la exposición a la hipoxia la frecuencia respiratoria de los ratones TH-RISP descendía respecto a los valores basales (hipoventilación). Este estado era reversible, pues tras dejar de aplicar el estímulo, los ratones TH-RISP recuperaban la frecuencia respiratoria que tenían previa a la exposición a la hipoxia (Figuras 41A, C, D). Curiosamente, la frecuencia respiratoria basal en los ratones TH-RISP era ligeramente menor en comparación con los controles Uqcrfs1flox/+ (Figuras 41A, C, D). Por otro lado, la respuesta hiperventilatoria frente a la hipercapnia (~5% CO2) aguda se mantuvo prácticamente inalterada en los ratones TH-RISP (Figuras 41B, C, D), poniendo de manifiesto que los órganos efectores implicados en la ventilación (por ejemplo, el diafragma o los músculos intercostales) no se encontraban afectados directa o indirectamente por la deleción de Uqcrfs1. 5.2.3. Respuestas de las células quimiorreceptoras a la hipoxia aguda Con el propósito de mostrar si la supresión de la hiperventilación en los ratones TH-RISP se debía a una alteración en la capacidad de las células glómicas para detectar y señalizar la hipoxia, se evaluaron los eventos de señalización celular implicados en la detección de la hipoxia aguda en el CC, como son la secreción de catecolaminas, la entrada de Ca2+ extracelular o el incremento de las señales mitocondriales (NADH y ROS en el espacio intermembrana). Resultados 103 para que tenga lugar el aumento en los niveles intracelulares de NADH durante la hipoxia. Figura 45. Cambios en los niveles de NADH en las células glómicas de los ratones TH-RISP. (A, B) Registros microfluorimétricos representativos de los cambios en la autofluorescencia de NADH, y por lo tanto de los niveles de NADH intracelulares, en células glómicas dispersas de CC procedentes de un ratón TH-RISP (B) y un ratón control Uqcrfs1flox/+ (A) durante la exposición a hipoxia (Hx, pO2 ~10-15 mmHg). Se usó αCB 1 mM como control positivo de la medida de NADH. (C) Autofluorescencia basal media de NADH en células glómicas procedentes de ratones controles Uqcrfs1flox/+ y TH-RISP (n = 33/7, 42/7 células/ratones, respectivamente). (D) Porcentaje de células con un cambio en los niveles de NADH en hipoxia respecto a los niveles basales. Las células glómicas procedían de ratones controles Uqcrfs1flox/+ (n = 34/7 células/ratones) y TH-RISP (n = 42/7 células/ratones). (E) Cuantificación del incremento en los niveles intracelulares de NADH durante hipoxia en células knockout para Uqcrfs1 (TH-RISP, n = 5/7 células/ratones) y controles Uqcrfs1flox/+ (n = 29/7 células/ratones). (F) Cuantificación del descenso en los niveles de NADH inducidos por αCB en células glómicas de ratones TH-RISP (n = 15/3 células/ratones). Los datos se presentan como la media ± SEM. *p < 0,05; ***p < 0,001 (prueba t de Student para muestras desapareadas). u.a., unidades arbitrarias. Posteriormente, se analizaron por microfluorimetría los cambios en los niveles de ROS durante hipoxia, tanto en el espacio intermembrana como en la matriz mitocondrial. Estas medidas se llevaron a cabo en rodajas de CC, mediante la transducción por adenovirus de sondas fluorescentes (roGFP) que se unen a ROS (Dooley y cols., 2004; Gao y cols., 2021). La fluorescencia emitida se registró a 400 y 480 nm, generando un valor ratiométrico. La medida se llevó a cabo en ambos compartimentos mitocondriales con el fin de estudiar la dinámica de ROS en la mitocondria en hipoxia y corroborar la compartimentalización descrita por otros autores Resultados 104 en músculo liso (Waypa y cols., 2010). De esta forma, en las rodajas controles se observaron las respuestas descritas en trabajos previos de nuestro grupo: un aumento en los niveles de ROS en el espacio intermembrana (Figura 46A), y un descenso en los niveles de ROS en la matriz mitocondrial, durante la exposición a hipoxia (Figuras 46E, C) (Fernández-Agüera y cols., 2015; Arias-Mayenco y cols., 2018; Moreno-Domínguez y cols., 2020). Sin embargo, en las células glómicas deficientes en RISP (n = 16 células analizadas) no se detectó variación en los niveles de ROS en el espacio intermembrana durante hipoxia (Figura 46B), mientras que la caída en los niveles de ROS en la matriz mitocondrial fue de similar magnitud respecto a la registrada en los ratones controles (Figuras 46F, G). Tan sólo en una célula glómica procedente de un ratón TH-RISP se detectó un leve aumento en los niveles de ROS intermembrana durante la exposición a hipoxia. Estos resultados indican que la producción de ROS en el espacio intermembrana durante la hipoxia requiere un CMIII funcional y de que exista comunicación entre el CMIV y el CMI en la CTE. Por su parte, los cambios en los niveles de ROS durante la hipoxia en la matriz mitocondrial parecen ser independientes a la CTE mitocondrial (ver apartado 6. “Discusión”). Resultados 105 Figura 46. Cambios en los niveles de ROS en las células glómicas de los ratones TH-RISP. (A-D) Registros microfluorimétricos representativos de los cambios de fluorescencia en la ratio 400/480 (niveles de ROS intracelulares) en células glómicas de rodajas de CC procedentes de ratones TH-RISP (B, D) y ratones control Uqcrfs1flox/+ (A, C) durante la exposición a hipoxia (Hx, pO2 ~10-15 mmHg). Cambios en los niveles de ROS en el espacio intermembrana (A, B) y en la matriz mitocondrial (C, D). (B; derecha) Respuesta a H2O2 200µM, usado como control positivo de la medida de ROS. (E) Porcentaje de células con un cambio en los niveles de ROS intermembrana en hipoxia respecto a los niveles basales. Las rodajas de CC procedían de ratones controles Uqcrfs1flox/+ (n = 30/21 células/ratones) y TH-RISP (n = 17/13 células/ratones). (F) Cuantificación de los cambios inducidos por hipoxia en los niveles de ROS intermembrana en células glómicas sensibles a hipoxia de ratones control Uqcrfs1flox/+ (n = 25/17 células/ratones) y TH-RISP (n = 1/1 célula/ratón). (G) Porcentaje de células glómicas con cambios en los niveles de ROS en la matriz mitocondrial respecto a los niveles basales durante hipoxia. Las rodajas de CC procedían de ratones controles Uqcrfs1flox/+ (n = 22/14 células/ratones) y TH-RISP (n = 10/6 células/ratones). (H) Cuantificación de los cambios en los niveles de ROS en la matriz mitocondrial durante la exposición a hipoxia en células glómicas sensibles a hipoxia de ratones control Uqcrfs1flox/+ (n = 18/10 células/ratones) y TH-RISP (n = 9/5 células/ratones). (F, H) Los datos se presentan como la media ± SEM. Resultados 106 5.2.4. Adaptaciones sistémicas a la hipoxia crónica Una vez estudiados los cambios en la respuesta de los ratones TH-RISP a la hipoxia aguda, se analizó el comportamiento de estos ratones durante la exposición a una hipoxia prolongada. Para realizar este estudio ratones TH-RISP y hermanos de la misma camada sin la mutación (Uqcrfs1flox/+) se expusieron a hipoxia (~10% O2) crónica entre 10 y 14 días. La mayoría de los ratones TH-RISP P25 sobrevivieron en la cámara de hipoxia al menos 14 días (un porcentaje relativamente bajo moría antes del final del tratamiento), si bien el deterioro de su estado en general se vio acentuado y acelerado en comparación con ratones TH-RISP mantenidos en normoxia. Como se comentó en la “Introducción”, la hipoxia crónica induce la eritropoyesis como mecanismo adaptativo ante una mayor demanda de O2, lo que se traduce en un aumento en el hematocrito. Este parámetro se midió tras el tratamiento en la cámara de hipoxia tanto en los ratones TH-RISP y Uqcrfs1flox/+ expuestos a hipoxia crónica como en los mantenidos en normoxia. Los ratones TH-RISP y Uqcrfs1flox/+ mantenidos en condiciones de normoxia presentaron unos niveles de hematocrito de en torno al 52- 53%, mientras que los ratones controles Uqcrfs1flox/+ expuestos a hipoxia crónica incrementaron el hematocrito hasta casi un 70% (69,58 ± 1,28). De forma llamativa, los ratones TH-RISP expuestos a hipoxia crónica alcanzaron un hematocrito de 81% (81,35 ± 1,35) (Figura 47) (ver apartado 6. “Discusión” para más detalles). Figura 47. Efecto de la hipoxia crónica en el hematocrito de los ratones TH-RISP. Hematocrito en condiciones basales de normoxia y después de 10-14 días en hipoxia (~10% O2) en ratones P25 TH-RISP comparados con sus controles Uqcrfs1flox/+ de la misma camada (n = 4-9 ratones/grupo). Los datos se presentan como la media ± SEM. ***p < 0,001 (prueba t de Student para muestras desapareadas). Resultados 107 En línea con lo que se describe en la literatura, los ratones controles sometidos a una hipoxia prolongada experimentaron esplenomegalia o hipertrofia del bazo, respecto a los animales controles mantenidos en normoxia (Kim y cols., 2010). No obstante, este agrandamiento del bazo fue insignificante en comparación con el que se observó en los ratones TH-RISP tratados en hipoxia crónica respecto a los ratones TH-RISP mantenidos en normoxia (Figura 48A). En normoxia, el tamaño del bazo de los ratones TH-RISP era menor que el de los controles Uqcrfs1flox/+ (Figura 48A), si bien cuando el peso de este órgano se normalizó respecto al peso del animal, desaparecieron estas diferencias (Figura 48B), indicando que probablemente el menor tamaño del bazo era debido al menor tamaño de los animales. El agrandamiento del bazo detectado en hipoxia se correlaciona con el aumento en el hematocrito, siendo mayor el tamaño de este órgano en aquellas condiciones en las que el hematocrito se incrementa en mayor medida (ver apartado 6. “Discusión” para más detalles). Figura 48. Efecto de la hipoxia crónica en el bazo de los ratones TH-RISP. (A, B) Fotografía de bazos (A) y análisis cuantitativo del peso de los bazos normalizado respecto al tamaño corporal (B) en condiciones basales o de normoxia y después de 10-14 días en hipoxia (~10% O2) en ratones P25 THRISP comparados con sus controles Uqcrfs1flox/+ de la misma camada (n = 4-5 ratones/grupo). Los datos se presentan como la media ± SEM. ***p < 0,001 (prueba t de Student para muestras desapareadas). DISCUSIÓN Discusión 109 6. DISCUSIÓN Las mitocondrias son orgánulos esenciales en la bioenergética de la mayoría de las células eucariotas, generando grandes cantidades de ATP, así como en la biosíntesis de una amplia variedad de precursores metabólicos (nucleótidos, grupo hemo, etc.) fundamentales para las diferentes funciones celulares. Además, están involucradas en mecanismos de señalización, participando en procesos como la muerte celular programada, y en la regulación de la expresión génica a través de mecanismos epigenéticos (Chandel, 2014; Khacho y cols., 2019). Las mitocondrias presentan una gran versatilidad en cuanto a sus funciones reguladoras, las cuales además varían dependiendo del tipo de célula, momento del ciclo celular o situación funcional en la que se encuentran. Por otro lado, cabe destacar el dinamismo y la plasticidad de estos orgánulos, los cuales se mueven continuamente por el interior de la célula (si bien suelen abundar en las zonas de mayor demanda energética, como en torno al flagelo en el caso de los espermatozoides), cambian de forma constantemente y experimentan de manera continua ciclos de fusión/fisión que se consideran de relevancia para la homeostasis de la célula (Alberts y cols., 2015; Khacho y cols., 2019). En esta Tesis Doctoral se profundiza en el papel que tiene la mitocondria (en particular la CTE) en los procesos esenciales vinculados a las CTPNs (autorrenovación, proliferación, diferenciación, etc.) y en la sensibilidad aguda al O2 de las células glómicas. En los siguientes apartados, se discuten los datos presentados previamente en la sección de “Resultados”, contrastándolos a su vez con otros estudios. Además, se proponen futuros abordajes para intentar aclarar determinadas cuestiones que aún persisten o experimentos que ayuden a corroborar nuestras propuestas. 6.1. Disfunción mitocondrial y biología de las células troncales y progenitores neurales En los últimos años ha surgido un creciente interés por esclarecer el rol de la función y la dinámica mitocondrial en la biología de las CTPNs. Está bien establecido que la CTE y la FosOx son cruciales en la diferenciación y la supervivencia neuronal (Homem y cols., 2014; Khacho y cols., 2016; Zheng y cols., 2016; Audano y cols., 2019). Sin embargo, el conocimiento acerca de la función mitocondrial en otros procesos neurales como la autorrenovación de las CTNs, la decisión de su destino Discusión 110 (autorrenovarse o diferenciarse) o la proliferación de los progenitores intermedios, sigue siendo limitado. Clásicamente se ha considerado que las células troncales en general presentan un metabolismo no dependiente del O2, para evitar una excesiva producción de ROS (estrés oxidativo) y el consecuente daño en el ADN y otros componentes celulares (Suda y cols., 2011; Xu y cols., 2013). En línea con esta idea, varios trabajos han mostrado la dependencia de las CTPNs de la glucólisis (Agathocleous y cols., 2012; Candelario y cols., 2013), por lo que de manera generalizada se ha asumido que el metabolismo mitocondrial no desempeña un papel relevante en las CTNs. No obstante, estudios recientes, basados en modelos genéticos con alteraciones mitocondriales, han puesto de manifiesto la participación de la función mitocondrial en los procesos esenciales vinculados a las CTNs y los progenitores intermedios del linaje neural. Entre ellos, cabe resaltar el análisis llevado a cabo por Khacho y cols. (2017) para estudiar las consecuencias de la disfunción mitocondrial en el desarrollo del encéfalo. Estos investigadores emplearon un modelo de ratón knockout condicional para el gen Aif, que codifica una proteína esencial para el funcionamiento de la mitocondria y cuyo déficit provoca su fragmentación y pérdida de funcionalidad (Germain y cols., 2013). El análisis de este modelo reveló que la disfunción mitocondrial inducida alteraba la capacidad de autorrenovación de las CTNs y la diferenciación a neuronas. Además, también se observó una desregulación (aumento) de la proliferación de los progenitores intermedios (Khacho y cols., 2017). Por su parte, en un abordaje similar, Beckervordersandforth y cols. (2017) usaron un modelo de ratón knockout condicional para el factor de transcripción mitocondrial A (Tfam). TFAM juega un papel fundamental en la biogénesis de las mitocondrias (Larsson y cols., 1998) y su ablación altera la morfología y la función de las mismas. Esta disfunción compromete la supervivencia y altera (disminuye) la proliferación de los progenitores intermedios en el hipocampo adulto (Beckervordersandforth y cols., 2017). Asimismo, van den Ameele y Brand (2019) han mostrado in vivo, en un modelo de Drosophila, que la disfunción de la FosOx en CTNs provoca una disminución de su tasa de proliferación celular y defectos en el patrón temporal de diferenciación. Curiosamente, estos autores indicaron que la inhibición de la glucólisis no afectaba al desarrollo normal del sistema nervioso. En conjunto, los datos señalan que las CTPNs necesitan del correcto funcionamiento de la mitocondria. No obstante, los estudios describen observaciones contradictorias en lo que se refiere a la proliferación de los progenitores intermedios en un contexto de Discusión 111 disfunción mitocondrial (aumento de la proliferación en el knockout para Aif frente a la disminución de la proliferación observada en el knockout para Tfam). Las discrepancias comentadas anteriormente, junto al hecho de que sigue sin conocerse con exactitud cuál es la contribución específica del metabolismo mitocondrial, y más concretamente de la CTE y/o la FosOx, en los procesos esenciales vinculados a las CTPNs, hacen necesarios análisis más precisos. Los modelos murinos de disfunción antes citados tienen efectos excesivamente drásticos en las mitocondrias, impidiendo un estudio más específico que permita analizar en detalle los diferentes circuitos metabólicos. En este trabajo se ha intentado avanzar en ello, alterando en este caso únicamente el CMI, y dejando operativa el resto de la CTE. Con este fin se ha generado el modelo hGFAP-NDUFS2, en el que la deleción del gen nuclear Ndufs2, mediante el sistema Cre/loxP, ocasiona la disfunción del CMI en las células del linaje neural. No obstante, a pesar de que con la deleción de Ndufs2 se evita el ensamblaje y la función del CMI, la CTE quedaría operativa por la vía CMII-CMIV (Fernández-Agüera y cols., 2015; Arias-Mayenco y cols., 2018), permitiendo estudiar la contribución específica de la función del CMI a la neurogénesis y la gliogénesis. Como se ha mostrado en “Resultados”, la deleción de Ndufs2 se comprobó a nivel de ARNm y de actividad enzimática del CMI en el telencéfalo dorsal de los ratones hGFAP-NDUFS2 respecto a sus controles, detectándose un claro descenso en ambos en las muestras obtenidas de los ratones knockout. 6.1.1. Disfunción mitocondrial y desarrollo del sistema nervioso Para determinar si la disfunción del CMI ocasiona alteraciones en el desarrollo del SNC, se llevó a cabo un análisis histológico del encéfalo de los ratones hGFAP- NDUFS2 y controles tanto a P0 como a P7. A P0 ya comenzaban a verse ciertos defectos en el encéfalo de los ratones hGFAP-NDUFS2, en concreto una leve disminución de la corteza dorsal y una sutil atrofia del hipocampo. En los estudios histológicos llevados a cabo a P7, se observó como el encéfalo de los ratones knockout estaba drásticamente afectado, apreciándose ventriculomegalia y una profunda atrofia de la corteza dorsal, el cuerpo calloso, el hipocampo y el cerebelo. Estos animales solían morir en torno al décimo día de edad, si bien no se ha estudiado la causa precisa de la muerte. Probablemente la agenesia detectada en el encéfalo tenga consecuencias funcionales nefastas para el organismo. A nivel celular, in vivo, pudo verse cómo la falta de actividad del CMI afecta gravemente a los procesos de proliferación y muerte Discusión 112 celular programada. El análisis en corteza e hipocampo mostró un aumento significativo de apoptosis y una clara disminución de la proliferación celular, aunque el tipo celular específico que sufre apoptosis no ha sido determinado. La disfunción del CMI también afectó a las células GFAP+, observándose cambios en su morfología, adquiriendo un aspecto más alargado en determinadas regiones, y llegando incluso a desaparecer el marcaje de astrocitos en el cuerpo calloso, hecho que se discute con detalle en el apartado siguiente. Estos hallazgos en su conjunto indican que el CMI desempeña una función fundamental en el desarrollo del SNC. En nuestro modelo (ratón hGFAP- NDUFS2) el telencéfalo ventral estaba mucho menos afectado que el dorsal, al menos en su apariencia macroscópica. Este hecho se debe a que el promotor hGFAP se activa en la corteza en torno a E12.5, mientras que en las eminencias ganglionares lo hace en torno a E14.5, no afectando de esta forma a las células progenitoras GFAP+ que originan el telencéfalo ventral (Malatesta y cols., 2003; Anthony y Heintz, 2008). Además de analizar los efectos de la deleción de Ndufs2 en el SNC, se estudió el impacto de la disfunción del CMI en los procesos neurogénicos que tienen lugar en el CC durante los primeros días de vida. Para ello, se analizó la histología del CC y se midió la expresión de Ndufs2 en muestras de CC de ratones P7 hGFAP-NDUFS2 y controles. Los niveles de ARNm de Ndufs2 no disminuyeron en las muestras de CC procedentes de ratones hGFAp-NDUFS2 y no se encontraron diferencias histológicas. Además, se realizó un experimento de trazado de linaje en ratones hGFAP-TdTomato P7. En el citado abordaje no se detectó la presencia de células glómicas doble positivas para tdTomato (origen GFAP+) y TH. Estas observaciones indican que durante la primera semana posnatal la generación de células glómicas no depende de las células multipotentes GFAP+, o que el promotor hGFAP no se activa en estos progenitores. Curiosamente, el análisis de trazado de linaje en ratones hGFAP-TdTomato P21 reveló la presencia de algunas células positivas para tdTomato y TH en el CC, poniendo de manifiesto la participación de las células tipo II o sustentaculares en el crecimiento posnatal del CC. No obstante, debido a la ventana de tiempo tan estrecha que permite el modelo hGFAP-NDUFS2, no se pudo analizar el efecto de la deleción de Ndufs2 en la generación posnatal de células glómicas en edades superiores a P7. Discusión 119 NDUFS2/NDI1 deberían tener un diámetro similar a las procedentes de ratones Ndufs2flox/+ hGFAP-Cre (al tener en cuenta el efecto tóxico de la Cre) así como ser insensibles a rotenona, al no presentar CMI (NDI1 es insensible a rotenona). Los procesos neurales tratados en esta Tesis Doctoral son fundamentales en el desarrollo y la regeneración de tejidos, de ahí que su estudio sea sumamente relevante en el campo de la medicina regenerativa. Un mayor conocimiento de la biología de las CTNs puede conducir a una mejor comprensión de la etiología de enfermedades neurodegenerativas (Khacho y cols., 2017) o desmielinizantes (Capilla-Gonzalez y cols., 2014), así como en la recuperación tras la isquemia cerebral (Martí-Fàbregas y cols., 2010). También se ha demostrado su utilidad en la prevención y/o tratamiento de enfermedades que cursan con déficit cognitivo (Khacho y cols., 2019) o desorden depresivo (Berger y cols., 2020). En suma, la comprensión de los mecanismos que regulan la neurogénesis pre y posnatal así como el metabolismo de neuronas y glía tiene un enorme potencial traslacional. 6.2. Regulación de la respiración por el oxígeno y cadena de transporte de electrones mitocondrial. Aunque durante los últimos 30 años se ha avanzado en el conocimiento de la fisiología celular de los quimiorreceptores arteriales, los mecanismos moleculares que subyacen a la detección aguda de los cambios en los niveles de oxígeno han permanecido oscuros hasta fecha reciente. Ha sido el uso de ratones modificados genéticamente lo que ha permitido enunciar un modelo robusto, que puede ser puesto a prueba experimentalmente. El modelo de “señalización de mitocondria a membrana”, propuesto por nuestro grupo, posiciona en el centro de la ruta de señalización celular a la CTE mitocondrial, y presenta como componentes esenciales el CMIV, que actuaría como sensor (Moreno-Domínguez y cols., 2020), y el CMI, que actuaría como efector (Fernández-Agüera y cols., 2015; Arias-Mayenco y cols., 2018). Según este modelo, para detectar la hipoxia aguda las células glómicas cuentan con un CMIV con una baja “afinidad aparente” por el O2, además de una CTE acelerada gracias a un ciclo de Krebs muy activo con altos niveles de anaplerosis. Las células glómicas consiguen este peculiar perfil metabólico gracias a la sobreexpresión de determinados genes, como el que codifica la PCX, la principal enzima anaplerótica, o los que codifican unas subunidades alternativas del CMIV (NDUFA4L2, COX4I2 y COX8B) (Zhuo y cols., Discusión 120 2016; Gao y cols. 2017a). Uno de los objetivos de este trabajo ha sido dilucidar si la integridad de la CTE es fundamental en la sensibilidad aguda al O2 en las células glómicas. Para tal fin se generó el modelo TH-RISP, en el que la deleción del gen Uqcrfs1 (que codifica la proteína RISP) ocasiona la pérdida de función del CMIII en las células catecolaminérgicas, donde se incluyen las células glómicas del CC. De esta manera, al interrumpir la CTE, el sensor (CMIV) y el efector (CMI) de la respuesta a hipoxia quedan incomunicados funcionalmente. 6.2.1. Disfunción mitocondrial y supervivencia celular Los ratones TH-RISP nacieron sin ninguna alteración aparente. Sin embargo, a las 3-4 semanas de edad comenzaron a experimentar lordosis, presentando un menor tamaño que sus hermanos control y dificultades en la marcha. Normalmente los ratones knockout para Uqcrfs1 morían entre P45-P50. El análisis histológico del encéfalo de estos ratones reveló que determinadas regiones catecolaminérgicas, como el núcleo arcuatus hipotalámico o la pars compacta de la sustancia negra en el mesencéfalo, estaban drásticamente afectadas, mostrando una clara disminución de células TH+. La degeneración de neuronas del núcleo arcuatus es probablemente la responsable de la disminución de los niveles plasmáticos de hormona del crecimiento y el enanismo observado en estos animales (Decourtye y cols., 2017). Igualmente, la muerte neuronal en la sustancia negra, región del SNC fundamental en la coordinación motora, podría estar relacionada con las dificultades en la marcha que presentan los ratones TH-RISP. No obstante, no se realizaron estudios de comportamiento motor para indagar en este fenotipo, al alejarse de los objetivos planteados. Dentro del sistema nervioso periférico se realizó un análisis histológico de órganos del linaje simpatoadrenal: el GCS, el CC y la MA. El GCS de los ratones THRISP estaba profundamente atrofiado, presentando una disminución significativa de su volumen. Por el contrario, la estructura del CC, así como el número de células glómicas, parecía inalterado. El tamaño del CC era incluso ligeramente superior a los controles, a pesar de que la deleción del gen Uqcrfs1 en el CC se confirmó por qPCR. Estos resultados muestran la diferente sensibilidad de las neuronas del GCS y las células glómicas del CC a la disfunción del CMIII. En cuanto a las células cromafines de la MA, tampoco se encontraron diferencias significativas en la histología entre ratones knockout y controles Uqcrfs1flox/+, a pesar de que en este órgano también se evidenció un descenso en los niveles de ARNm de Uqcrfs1 en los ratones TH-RISP. La causa Discusión 121 (causas) de la muerte prematura de los ratones TH-RISP se desconocen. No parece probable que ésta se deba a la disfunción de los tejidos catecolaminérgicos, sino más bien a las alteraciones que tengan lugar en aquellos tejidos no catecolaminérgicos en los que la construcción TH-IRES-Cre también es activa (Lindeberg y cols., 2004). En base a los varios modelos de disfunción mitocondrial estudiados en nuestro laboratorio, es interesante resaltar la diferente afectación que experimentan el GCS y el CC a la ausencia de la función del CMI, el CMII y el CMIII. En el caso del modelo knockout para CMII (ratón TH-SDHD) tanto el GCS como el CC sufren una pronunciada atrofia (Díaz-Castro y cols., 2012), lo que pone de manifiesto la relevancia en estos tejidos de la succinato deshidrogenasa para el ciclo de Krebs y por consiguiente el metabolismo en general. Sin embargo, ambos órganos no parecen verse afectados (a nivel de supervivencia) por la deleción de Ndufs2 en el modelo knockout para CMI THNDUFS2, probablemente al presentar potenciados la glucólisis y la actividad del CMII (Fernández-Agüera y cols., 2015). En contraste, como se comentaba anteriormente, las células quimiorreceptoras del CC de los ratones TH-RISP, y no las neuronas simpáticas del GCS, sobrevivieron, adaptándose a la alteración ocasionada en la CTE por la deleción de Uqcrfs1. Estos datos indican que las células glómicas presentan una mayor plasticidad metabólica que las neuronas del GCS y las neuronas dopaminérgicas centrales estudiadas, lo que les permite adaptarse con mayor eficacia a un cambio disruptivo en su metabolismo. La supervivencia de las células glómicas con déficit de RISP implica el mantenimiento del potencial de membrana mitocondrial, el funcionamiento del ciclo de Krebs y que esté satisfecha la demanda energética de la célula (síntesis de ATP). El mantenimiento del potencial de membrana mitocondrial no sólo es necesario para la síntesis de ATP mediante FosOx, sino que es esencial para la viabilidad de las mitocondrias (Zorova y cols., 2018). Es posible que en las células glómicas de los ratones TH-RISP el potencial de membrana mitocondrial se mantenga gracias a una reorganización del metabolismo que implique la reversión de la reacción catalizada por la ATP sintasa, hidrolizando ATP en ADP y fosforo inorgánico, y transportando protones al espacio intermembrana. Esta reacción reversa puede tener lugar en las células en situaciones fisiológicas (Vinogradov y cols., 2019). Por otro lado, estudios funcionales preliminares en células dispersas de CC, empleando rotenona, parecen indicar que el CMI de las células glómicas de los ratones TH-RISP se encuentra operativo. Un CMI muy activo contribuiría igualmente al mantenimiento del potencial Discusión 122 de membrana mitocondrial debido al bombeo de protones. Un dato que avala la existencia de un CMI muy activo, es el menor nivel de NADH basal registrado en las células knockout para Uqcrfs1 con respecto a las controles. En cuanto a la demanda energética, probablemente las células glómicas de los ratones TH-RISP tengan potenciada la glucólisis, permitiéndole producir gran parte del ATP necesario para sobrevivir mediante esta vía, aunque de momento no se ha llevado a cabo un estudio detallado de los cambios en los niveles de ATP en esta preparación. Asimismo, un correcto funcionamiento del ciclo de Krebs es esencial para las células glómicas del CC. De hecho, como se ha comentado anteriormente, la ablación del CMII, fundamental en el ciclo de Krebs, tiene drásticos efectos en las células glómicas (Díaz-Castro y cols., 2012). En el caso del modelo TH-RISP, los cambios en los niveles de ROS medidos en la matriz mitocondrial durante una exposición a hipoxia (resultados que se discuten en el siguiente apartado) son muy similares a los medidos en los controles, indicando que probablemente las deshidrogenasas que catalizan reacciones del ciclo de Krebs están operativas. Estas enzimas, sobre todo la a-cetobutirato deshidrogenasa, parecen contribuir en gran medida a la producción de ROS en la matriz mitocondrial (Starkov y cols., 2004). En las células con déficit de RISP, los electrones procedentes de la oxidación del succinato por parte del CMII no podrían ser transferidos al CMIII, quedándose retenidos en el pool de QH2 junto a los electrones procedentes del CMI, con el consecuente detenimiento de la actividad de ambos CMs y del ciclo de Krebs. Una alternativa que podría garantizar la supervivencia de estas células podría ser el funcionamiento reverso del CMII. Esta función reversa de la succinato deshidrogenasa es posible en condiciones fisiológicas. De hecho, ha sido descrita en células de músculo esquelético que tienen inhibido el CMIII (Quinlan y cols., 2012). En esta situación, el fumarato actuaría como aceptor final de electrones, reduciéndose a succinato, de forma similar a como ocurre en las células de la retina, las cuales se encuentran en un entorno hipóxico constante (Bisbach y cols., 2020). Así, el CMII revertido podría emplear los electrones acumulados en el pool de QH2, procedentes de la actividad del CMI, y permitir el bombeo de protones por el CMI y la supervivencia mitocondrial. En hipoxia, los helmintos parásitos de la especie Echinococcus multilocularis presentan un mecanismo similar, denominado sistema “NADH-fumarato reductasa” (Matsumoto y cols., 2008). Igualmente, en tumores hipovascularizados el sistema “NADH-fumarato reductasa” Discusión 123 podría ser fundamental para mantener el metabolismo energético mitocondrial y con ello la supervivencia celular (Tomitsuka y cols., 2010). En base a las observaciones comentadas anteriormente, y la posibilidad del funcionamiento del CMII de manera reversa en condiciones fisiológicas, se propone un modelo que explicaría la supervivencia de las células glómicas de los ratones TH-RISP (Figura 49). En la CTE de las células glómicas de los ratones TH-RISP únicamente estarían operativos el CMI y el CMII. El CMI consumiría NADH y generaría NAD+, cediendo los electrones resultantes de la oxidación al pool de QH2, y translocaría protones al espacio intermembrana, contribuyendo a mantener el potencial de membrana mitocondrial. El CMII actuaría de forma reversa, empleando los electrones del pool de QH2 para producir succinato a partir de fumarato. Por su parte, el CMV o ATP sintasa, podría funcionar de manera reversa, hidrolizando ATP (de origen glucolítico) y bombeando protones al espacio intermembrana para contribuir al mantenimiento del potencial de la membrana mitocondrial interna. Quizás algunos CMV de la misma mitocondria actuasen de manera directa, sintetizando ATP. El fumarato, fundamental para este sistema reverso del ciclo de Krebs procedería del malato (reversión de la fumarato hidratasa), y este a su vez del oxalacetato. La síntesis de malato a partir de oxalacetato consumiría NADH y produciría NAD+. Por su parte, el oxalacetato procedería del piruvato, en una reacción catalizada por la PCX. La fuente de piruvato seguramente sería la glucólisis, que debería estar potenciada en estas células, para producir grandes cantidades de piruvato y ATP. Como se comentaba en la “Introducción”, el gen que codifica la PCX está más expresado en el CC que en el GCS (Gao y cols., 2017a), por lo que probablemente éste sea uno de los motivos por los que las células glómicas pueden adaptarse al déficit de RISP y no las neuronas del GCS. Para determinar si la expresión de PCX contribuye a la supervivencia de las células glómicas con déficit de RISP, se ha generado un modelo de doble knockout para Pcx y Uqcrfs1 cuya caracterización está en progreso. Discusión 124 Figura 49. Modelo de “reversión del CMII” en las células glómicas del CC de los ratones TH-RISP. Esquema que ilustra el modelo de “reversión del CMII” en las células glómicas del CC de los ratones THRISP, que explicaría la supervivencia de estas células. En gris se detallan los protones o cargas positivas, y en rojo los electrones o cargas negativas y la inhibición del CMIII. CM(I-V), complejos mitocondriales I-V; ΔΨm, potencial de membrana mitocondrial; PCX, piruvato carboxilasa; Q, ubiquinona; QH2, ubiquinona reducida. Discusión 125 6.2.2. Integridad de la cadena de transporte de electrones y sensibilidad aguda al oxígeno Según el modelo de “señalización de mitocondria a membrana”, en las células glómicas del ratón TH-RISP la inhibición del CMIII implicaría la desconexión entre sensor (CMIV) y efector (CMI) de la respuesta a hipoxia y, por tanto, el estado redox de los elementos de la CTE estaría disociado de los cambios en la tensión de O2, impidiendo la detección aguda de la hipoxemia en estas células. Confirmando esta idea, la respuesta ventilatoria a la hipoxia está prácticamente abolida en los ratones TH-RISP. De hecho, estos ratones sufren incluso un descenso en la frecuencia respiratoria (hipoventilación) durante la exposición a hipoxia que posiblemente se debe a una depresión del centro respiratorio bulbar por la falta de oxígeno (Wasicko y cols., 1990; Chae y cols., 1993). La respuesta ventilatoria a hipercapnia permanece inalterada en los ratones TH-RISP, demostrando que la ausencia de hiperventilación durante la hipoxia en los ratones TH-RISP no se debe a que los órganos efectores (musculatura torácica, etc.) estén alterados en este modelo. En paralelo a los estudios pletismográficos en animales completos, los estudios funcionales en células quimiorreceptoras (registro de la actividad secretora mediante amperometría y medida de los cambios en los niveles de Ca2+ citosólico mediante microfluorimetría) mostraron que las células con déficit de RISP son insensibles a la hipoxia. Sin embargo, estas células responden a la hipercapnia o la hipoglucemia. Igualmente, las señales mitocondriales características de la respuesta a la hipoxia (NADH y ROS) también están inhibidas en las células glómicas procedentes de ratones knockout para Uqcrfs1. No obstante, los cambios de ROS en la matriz mitocondrial durante la hipoxia están inalterados en las células con disfunción del CMIII. La producción de ROS en la matriz mitocondrial parece depender de las deshidrogenasas del ciclo de Krebs, el CMI y el CMII, este último especialmente en su modo reverso (Starkov y cols., 2004; Quinlan y cols., 2012; Waypa y cols., 2016). Por lo tanto, estos datos apoyan nuestra hipótesis relativa a que las células glómicas knockout para Uqcrfs1 tienen operativas las reacciones del ciclo de Krebs, el CMI y CMII. La necesidad de la integridad de la CTE mitocondrial para la sensibilidad aguda a O2 en las células glómicas, demostrada con la caracterización del modelo TH-RISP, pone de manifiesto que el CMI per se no es el sensor de O2, sino que actúa como efector, donde se generan las señales mitocondriales hipóxicas. En conjunto estos resultados apoyan firmemente el papel esencial de la CTE mitocondrial en la detección Discusión 126 aguda de O2 por los quimiorreceptores arteriales. Además, una visión holística de los resultados mostrados en esta Tesis Doctoral y los últimos estudios llevados a cabo en torno al modelo de “señalización de mitocondria a membrana”, parecen indicar que no es una molécula específica sino más bien toda la mitocondria en su conjunto la que contribuye a la sensibilidad aguda al O2 en las células quimiorreceptoras del CC. 6.2.3. Papel de las células quimiosensoras en la aclimatación a la hipoxia crónica. Dado que las células quimiorreceptoras del CC de los ratones TH-RISP son insensibles a la hipoxia, y consecuentemente está abolida la respuesta ventilatoria a la hipoxia, se analizó la forma en la que estos ratones se adaptan a la hipoxia crónica. Los ratones TH-RISP expuestos a una hipoxia prolongada experimentan un acentuado aumento de hematocrito en comparación con sus controles, lo que refleja una eritropoyesis potenciada como mecanismo adaptativo para atender a la elevada demanda de O2 y compensar la ausencia del reflejo ventilatorio agudo. Asimismo, los ratones con disfunción del CMIII expuestos a hipoxia crónica presentaron una marcada esplenomegalia y cambios histológicos en el bazo (datos no mostrados), que podrían ser indicativos de que está teniendo lugar una hematopoyesis extramedular desempeñada por el bazo, reforzando la producción de hematíes (Kim y cols., 2010; Macías y cols., 2018). Por otra parte, análisis preliminares parecen señalar que el ventrículo derecho del corazón de los ratones TH-RISP tratados con hipoxia crónica aumenta su tamaño (datos no mostrados), en comparación con los ratones mantenidos en normoxia. Se ha descrito que probablemente la hipertrofia del ventrículo derecho en condiciones de hipoxia crónica se debe a una contracción de las arterias pulmonares, ocasionada a su vez por un aumento en el grosor de la capa de músculo liso de estas arterias en respuesta a la hipoxia crónica (Macías y cols., 2018). La contracción y remodelado de las arterias pulmonares ofrecería una mayor resistencia al trasiego de sangre, con el consecuente aumento de tamaño del ventrículo derecho para vencer dicha resistencia. Estos cambios tan drásticos observados en los ratones TH-RISP (esplenomegalia exagerada, aumento excesivo del hematocrito, hipertrofia ventricular) son similares a los detectados en otro modelo analizado en nuestro grupo, el ratón TH-EPAS1 (Macías y cols., 2018). Los ratones TH-EPAS1 presentan una deleción en el gen que codifica HIF2a en el linaje simpatoadrenal, carecen de CC y de respuesta ventilatoria a la hipoxia. Además, estos Discusión 127 ratones padecen de hipertensión pulmonar, causada por la contracción de las arterias pulmonares, por lo que es bastante probable que los ratones TH-RISP en hipoxia también presenten este mismo cuadro de hipertensión pulmonar. Otro aspecto interesante a estudiar en detalle es cómo influye la afectación de la detección aguda de hipoxia de las células glómicas a la expansión del CC durante la hipoxia crónica. Estudios previos sugieren que la diferenciación de las células sustentaculares a células glómicas, endoteliales y de músculo liso requiere de la activación por hipoxia de las células glómicas, las cuales liberarían al medio extracelular mediadores que inducirían la proliferación y diferenciación de las células sustentaculares (Platero-Luengo y cols., 2014; Sobrino y cols., 2020). Las células glómicas de los ratones TH-RISP son insensibles a hipoxia, por lo que se podría esperar que el CC de los ratones TH-RISP tratados con hipoxia crónica sufrieran una hipertrofia menor que en el caso de los controles Uqcrfs1flox/+. Estos estudios están en progreso y pensamos que podrán suponer un avance en la comprensión del papel de las sinapsis quimioproliferativas en la hipertrofia del CC durante la hipoxia crónica. CONCLUSIONES Anexos 135 8.2. Anexo II: índice de tablas Materiales y Métodos Tabla 1. Alelos amplificados, tamaño del producto de PCR, temperatura de annealing y secuencia de los cebadores empleados en el genotipado de las líneas de ratón por PCR ....................................................................................................................................... 60 Tabla 2. Sondas TaqMan empleadas en las qPCRs ..................................................... 62 Anexos 136 8.3. Anexo III: documento/s correspondiente/s al dictamen favorable del CEI/Consejería de Agricultura, Pesca y Desarrollo Rural de la Junta de Andalucía Comité Ético de Experimentación Animal de la Universidad de Sevilla Examen de las situaciones y excepciones previstas en los artículos 6, 7, 9.1, 19, 20, 21, 22, 23, 25.3, 25.5, 26 y 29 del RO 53/2013 {Utilizar el espacio necesario) Excepciones: No Evaluación conformidad 3R: El proyecto está conforme con las 3 R Análisis daños/beneficios: Hay poca afectación del bienestar animal Determinación de si el proyecto debe evaluarse de forma retrospectiva: Resultado: Evaluación retrospectiva: NO Fecha evaluación retrospectiva: Documentación para realizar la evaluación retrospectiva (en caso afirmativo): -Grado de consecución de los objetivos. -Evaluación del daño infringido a los animales, incluido el número y las especies de animales utilizados, y la severidad de los procedimientos. -Cualquiera de los elementos que puedan contribuir a una mejor aplicación del requisito de reemplazo, reducción y refinamiento. POR TODO LO ANTERIORMENTE EXPUESTO, CONFIRMO QUE EL PROYECTO SOMETIDO A ESTE INFORME DEL ÓRGANO HABILITADO: l. Se clasifica como: Tipo 11 2. Que la evaluación del proyecto sometido a este informe del Órgano Habilitado, resulta ser: FAVORABLE 3. Observaciones: Debe evaluar el bienestar animal en los modelos transgénicos nuevos generados. 4. Que este documento tiene una vigencia máxima de 5 años. Elaborado por: Secretario Órgano Habilitado Nombre: C. Osear Pintado Sanjuán Fecha: 26/06/2015 Revisado y aprobado por: Presidente Órgano Habilitado Nombre: Javier Vitorica Fecha: 26/06/2015 Firma Vicerrectorado de Investigación Pabellón de Brasil e.e.: [email protected] JUflTJ\ D[ UllUU.Jiu;.J�lt;:-c;::-:;:¡;:.;--::;;.-:¡-¡;�=tf\l SEJERÍA DE AGRICULTURA, PESCA Y DESARROLLO RURAL S w•Jm�,M l!�}\�D,!,;}�E� l ir¡c ión General de la Producción Agrícola y Ganadera Fecha: 28/09/201 A L----� f '•-' 1, l�:��::::•_::::í1::;:El::.:; JIE �---t L 3 O SET 2015 � 'l�tk .. 4--J,-.......,..-; >. ;::�[i!%i:J:cc,on SPITAL UNIVERSITARIO VIRGEN MACARENA -; . �ócolayG2nad�ra IDAD DE INVESTIGACIÓN 2ª PLANTA Ref.: SSA/SIS/MD/jv Att. Carlos García FBrez Asunto: Rem. Resolución experimentación. Avda. Dr. Fedriani, nº 3 41009 SEVILLA Se adjunta resolución de la Dirección General de la Producción Agrícola y Ganadera, por la que se autoriza a D. José López Barneo, un proyecto de experimentación animal denominado: "Mecanismos molecular de la sensibilidad aguda al oxígeno (Molecular machanisms of acute oxygen sensing)". Tabladilla, s/n Teléfono 95 5032000 41071 -Sevilla Cuarto. El proyecto para el que se solicita la autorización ha de ser considerado dentro del tipo 11, puesto que implica procedimientos clasificados como leves y no utiliza primates. Además, el centro donde se desarrollará tiene la correspondiente autorización y la persona encargada de la realización del proyecto tiene capacitación para ello. A ello se une el carácter favorable de los informes emitidos al respecto, por lo que cumpliendo con los requisitos previstos ha de procederse a su autorización y no debe someterse a evaluación retrospectiva. En consecuencia, de conformidad con los preceptos citados y demás de general aplicación, RESUELVO Primero. Autorizar a, D. José López Barneo, el proyecto denominado: "Mecanismos molecular de la sensibilidad aguda al oxígeno (Molecular machanisms of acute oxygen sensing)", con un periodo de 5 años. Segundo. Asignar el número 22-09-15-332, al proyecto a los efectos de cumplir con lo requerido en el art. 41.1 del RO 53/2013 de 1 de febrero y la Decisión 2012/707 /UE, sobre la regulación y transmisión de información referente al uso de los animales. Tercero. Ordenar la notificación de la presente Resolución a la persona interesada, con indicación de que contra la misma, que no pone fin a la vía administrativa, podrá interponer recurso de alzada ante la persona titular de la Consejería de Agricultura, Pesca y Desarrollo Rural, en el plazo de un mes contado a partir del día siguiente al de la notificación, según lo previsto por los artículos 114 y 115 de la Ley 30/ 1992, de 26 de noviembre, de �gimen Jurídico de las Administraciones Públicas y del Procedimiento Administrativo Común. Comité de Ética de la Investigación de los HH.UU. Virgen Macarena – Virgen del Rocío Comité de Ética de Experimentación Animal 6ª planta Edificio de Laboratorios Avda. Manuel Siurot, s/n - 41013 Sevilla Tel. 600 162 458 - Fax 955923101 ANEXO VIII MODELO DE INFORME DEL ORGANO HABILITADO (Art. 34 del RD 53/2013, de 1 de febrero, por el que se establecen las normas básicas aplicables para la protección de los animales utilizados en experimentación y otros fines científicos, incluyendo la docencia) COMITÉ ÉTICO DE EXPERIMENTACIÓN ANIMAL (CEEA), COMITÉ DE ÉTICA DE LA INVESTIGACIÓN DE LOS HOSPITALES UNIVERSITARIOS VIRGEN MACARENA – VIRGEN DEL ROCÍO DE SEVILLA. Órgano habilitado para la evaluación de proyectos de Experimentación Animal, mediante resolución del 9 de Agosto de 2013 de la Dirección General de la Producción Agrícola y Ganadera de la Consejería de Agricultura, Pesca y Medio Ambiente de la Junta de Andalucía. Reunido en la Sesión celebrada el día 31 de marzo de 2020 y según consta en el acta 04/2020, ha valorado el estudio Presentado por José López Barneo Con D.N.I. 25915727V y Patricia Ortega Sáenz con DNI: 27308786N, ambos Categorías (s) (según RD 1201/2005): B y C Titulado: Ref Interna: 0659-N-20 Titulo: “Sensibilidad al oxígeno y neurodegeneración” Que tiene una duración de: 36 meses INFORMA 1. El proyecto, ha sido evaluado de forma apropiada al tipo de proyecto y la evaluación ha consistido en verificar que el proyecto se realizará de acuerdo al artículo 34 del REAL DECRETO 53/2013, de 1 de febrero, por el que se establecen las normas básicas aplicables para la protección de los animales utilizados en experimentación y otros fines científicos, incluyendo la docencia. 2. El proyecto está justificado dados los beneficios que se prevén alcanzar desde el punto de vista de vista científico o educativo. 3. La finalidad del proyecto justifica la utilización de animales y está diseñado de manera que los procedimientos se realicen de la forma más humanitaria y respetuosa con el medio ambiente que sea posible, así como tendiendo a los principios de reemplazo, reducción y refinamiento. FIRMADO POR CRISTINA PICHARDO GUERRERO 01/04/2020 11:02:29 PÁGINA 1/4 VICTOR MANUEL SANCHEZ MARGALET 31/03/2020 17:12:11 VERIFICACIÓN UUM32872MKVJQL1VcU2qQzLknmim33 https://ws050.juntadeandalucia.es/verificarFirma/