Detección de Gram negativos productores de carbapenemasas y betalactamasas de espectro extendido en las aguas residuales de Sevilla

FACULTAD DE ODONTOLOGÍA UNIVERSIDAD DE SEVILLA Detección de Gram negativos productores de carbapenemasas y betalactamasas de espectro extendido en las aguas residuales de Sevilla Manuel María Jurado Quijano 1 FACULTAD DE ODONTOLOGÍA UNIVERSIDAD DE SEVILLA Trabajo de fin de Grado Investigación Detección de Gram negativos productores de carbapenemasas y betalactamasas de espectro extendido en las aguas residuales de Sevilla Manuel María Jurado Quijano Tutora: Marina Rosa Pulido Toledano Departamento de Microbiología. Facultad de Medicina 2 ÍNDICE 1. RESUMEN……………………………………………………………………….…………4 2. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………………..5 2.1. Resistencia antimicrobiana y bacterias multirresistentes ……..….....5 2.2. Contexto histórico ……………………………………………………….…..6 2.3. Aparición de resistencia en Gram negativos. Enterobacterias ……...7 2.4. Mecanismos de resistencia bacteriana…………………………………...8 2.5. Betalactamasas……………………………………………………………....10 2.5.1. ß-lactamasas de espectro extendido…………………………10 2.5.2. Carbapenemasas………………………………………………....11 2.6. Betalactámicos……………………………………………………………..…12 2.6.1. Carbapenémicos………………………………………………….12 2.6.2. Mecanismo de acción en carbapenémicos…………………..13 2.7. Consecuencias socioeconómicas ………………………………………..13 2.7.1. Impacto económico ……………………………………………...13 2.7.2. Impacto social……………………………………………………..14 2.8. One Health……………………………………………………………………..15 3. MATERIA DE ESTUDIO…………………………………………………………………..16 3.1. Antecedentes del proyecto………………………………………………….17 4. OBJETIVOS………………………………………………………………………………...18 5. METODOLOGÍA……………………………………………………………………………18 5.1. Extracción de ADN y secuenciación………………………………………19 5.2. Antibiogramas………………………………………………………………….19 6. RESULTADOS………………………………………………………………………………21 6.1. Determinantes genéticos de la resistencia a los antimicrobianos……22 6.2. Plásmidos………………………………………………………………………..25 7. DISCUSIÓN……………………………………………………………………….……….…27 8. CONCLUSIÓN …………………………………………………………………………...….30 9. BIBLIOGRAFÍA …………………………………………………………………..…….…...31 3 1. RESUMEN La producción y el uso de antibióticos nos ha conducido hacia un nuevo problema que afecta al mundo entero. Las infecciones producidas por bacterias resistentes son una amenaza cada vez más extendida, afectando no solo a la salud de las personas, sino también a la economía mundial. El origen y la base molecular de la resistencia bacteriana es la presencia de genes de resistencia a los antibióticos. El presente trabajo hace un repaso de los fundamentos sobre los mecanismos de resistencia bacteriana y se enfoca en el papel de los carbapenémicos. Debido a que estos antibióticos han representado la última línea de batalla para combatir las infecciones producidas por bacterias resistentes, el estudio que se ha realizado intenta reflejar con detalle la situación en la que nos encontramos. Para ello, se han analizado muestras obtenidas en las aguas residuales de la ciudad de Sevilla. Las aguas residuales van a parar a unas plantas de tratamiento donde se concentran diversas especies de patógenos, los cuales, al entrar en contacto con bajas concentraciones de antibióticos y con otros microorganismos, son sometidos a procesos de selección y al intercambio de material genético, aumentando así las posibilidades de generar resistencia a los medicamentos con los que contamos para tratar enfermedades. Las especies bacterianas extraídas de estos lugares han mostrado un porcentaje alto de resistencia, tanto a carbapenémicos como a otros antimicrobianos. Se ha detectado y analizado la presencia de genes que codifican a carbapenemasas y a betalactamasas de espectro extendido (BLEEs). Tras un análisis de los resultados finales se hace patente la necesidad de promover una nuevo enfoque para erradicar el problema de la resistencia bacteriana. The production and use of antibiotics has led to a new problem affecting the entire world. Infections caused by resistant bacteria are an increasingly widespread threat, affecting not only human health but also the global economy. The origin and molecular basis of bacterial resistance is the presence of antibiotic resistance genes. This work reviews the fundamentals of bacterial resistance mechanisms and focuses on the role of carbapenemics. Since these antibiotics have represented the last line of battle to combat infections caused by resistant bacteria, the study that has been carried out attempts to reflect in detail the situation in which we find ourselves. To this end, samples obtained from the wastewater of the city of Seville have been analyzed. The wastewater ends up in treatment plants where various species of pathogens are concentrated, which, when they come into contact with low concentrations of antibiotics and other microorganisms, are subjected to selection processes and the exchange of genetic material, thus increasing the chances of generating resistance to the drugs we have to treat diseases. Bacterial species extracted from these sites have shown a high percentage of resistance, both to carbapenemics and to other antimicrobials. The presence of genes encoding carbapenemases and extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs) has been detected and analysed. After an analysis of the final results, the need to promote a new approach to eradicate the problem of bacterial resistance is evident. 4 2. INTRODUCCIÓN 2.1. Resistencia antimicrobiana y bacterias multirresistentes El mundo de la medicina y de las ciencias biosanitarias se enfrenta a un reto sin precedentes. Los antibióticos, que durante los últimos ochenta años han salvado millones de vidas, están perdiendo su eficacia debido a que muchas bacterias se están volviendo insensibles a ellos. El aumento del número de estas bacterias resistentes es ya un problema preocupante. Poco a poco se va apreciando cómo los medios de comunicación se van haciendo eco de los avisos que va lanzando la comunidad científica sobre el abuso de estos medicamentos y sus consecuencias, pero lo cierto es que aún existe un gran desconocimiento por parte de la población general. La Organización Mundial de la Salud (OMS) incluyó la resistencia antimicrobiana en su lista de 2019 como una de las diez amenazas más importantes de salud pública a nivel global1. Según la OMS, «en la actualidad mueren más de 700.000 personas cada año debido a enfermedades resistentes a los medicamentos y, si no se toman medidas urgentes, estas enfermedades podrían causar diez millones de muertes anuales para el año 2050, además de provocar daños económicos tan catastróficos como la crisis financiera global de 2008-2009. Además, para el año 2030, la resistencia a los antimicrobianos podría empujar a 24 millones más de personas a la pobreza extrema»2. La comprensión en profundidad de los mecanismos de resistencia bacteriana y el uso racional de los antibióticos necesitan ser abordados con urgencia desde todos los frentes de las ciencias biomédicas. En los últimos años hemos sido más conscientes que nunca del efecto que puede tener en las sociedades modernas la aparición de epidemias a raíz de la evolución de nuevos patógenos. Si la emergencia sanitaria de la COVID-19 ha supuesto un cambio de paradigma en la forma que tenemos de relacionarnos con el mundo, es de importancia capital que comencemos a concienciar a la población global sobre la que podría ser la próxima gran pandemia: la de las bacterias multirresistentes. El mismo Alexander Fleming era consciente de la problemática que podía desencadenar el uso incorrecto de los antibióticos, y así lo reflejó en su discurso de aceptación del Nobel en el año 1945: «Llegará un día en que cualquiera podrá comprar penicilina. Entonces existirá el peligro de que un hombre ignorante pueda fácilmente tomar una dosis insuficiente y que al exponer sus microbios a cantidades no letales del fármaco los haga resistentes»3. 5 2.2. Contexto histórico La era moderna de los antibióticos comenzó con el descubrimiento de la penicilina por Sir Alexander Fleming en 1928. Desde entonces, los antibióticos han transformado la medicina moderna y salvado millones de vidas. Los antibióticos se recetaron por primera vez para tratar infecciones graves en la década de 1940. La penicilina logró controlar las infecciones bacterianas entre los soldados de la Segunda Guerra Mundial4. Sin embargo, poco tiempo después, la resistencia a la penicilina se convirtió en un problema clínico sustancial, por lo que, en la década de 1950, muchos de los avances de la década anterior se vieron amenazados5. En respuesta, se descubrieron, desarrollaron y desplegaron nuevos antibióticos betalactámicos, lo que restableció la confianza. Sin embargo, el primer caso de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA) se identificó durante esa misma década, en el Reino Unido en 1962 y en los Estados Unidos en 19684. Debido al uso masivo que se le dio a la penicilina desde mediados de los años 40 y a lo largo de toda la década de los 50, los médicos empezaron a darse cuenta de que su efectividad iba disminuyendo. El problema era que se estaban seleccionando cepas de estafilococos resistentes a la penicilina, es decir, donde se utilizaba mucha penicilina aparecían cepas resistentes. En el año 2001, el doctor Henry Chambers del hospital general de San Francisco publicó un artículo en la revista Emerging Infectius Diseases sobre la evolución que experimentaron las cepas de Staphylococcus aureus resistentes a la penicilina desde 1940 hasta finales de siglo6. Tanto las bacterias que se aislaban en los hospitales como las que más tarde comenzaron a aparecer en la población eran resistentes a la penicilina [Figura 1]. En el año 2000, prácticamente todas las cepas de esta especie que se aislaban en ambos escenarios eran ya resistentes al antibiótico primogénito. 6 Buscando una solución a este problema se llegó al descubrimiento de las penicilinas sintéticas. Los laboratorios ingleses Beecham produjeron la meticilina en 1959, que se puso en circulación al año siguiente con el nombre comercial de Celbenin. Muchos creyeron que este compuesto era la solución al problema de la resistencia bacteriana, pero no fue así. En 1961, Patricia Jevons, investigadora del Centro de Referencia para Estafilococos de Colindale en Londres, encontró tres cepas de Staphylococcus resistentes al Celbenin7. Estas cepas fueron aisladas a partir de las muestras obtenidas de diferentes pacientes y se descubrió que también eran resistentes a la Penicilina G, a la estreptomicina y la tetraciclina. Las bacterias resistentes presentaban mutaciones en los genes que producían las proteínas que hacían de diana de la meticilina, impidiendo de esta forma su acción. Las proteínas normales encargadas de formar la pared celular eran presa fácil del antibiótico, pero al estar cambiadas, aunque sea solo ligeramente, el antibiótico ya no les hacía efecto8. Hoy sabemos que el gen que codifica a la proteína (beta-lactamasa) de resistencia a la meticilina ya existía en algunos estafilococos antes de que se comenzara a utilizar estos antibióticos en los pacientes de los hospitales. Es decir, la meticilina no creó la resistencia, sino que la resistencia apareció como respuesta a la presión selectiva que siguió a la administración de este medicamento. 2.3. Aparición de resistencia en Gram negativos. Enterobacterias La prevalencia de organismos multirresistentes continúa aumentando a nivel mundial y se asocia con una morbilidad y mortalidad significativas. Históricamente, han afectado a pacientes en entornos hospitalarios, donde la exposición a antibióticos, la hospitalización frecuente y/o prolongada, el uso de dispositivos internos y los factores del huésped generan riesgos de adquisición. Sin embargo, la distinción entre las infecciones bacterianas multirresistentes adquiridas en el cuidado de la salud y las que se inician en la comunidad se ha vuelto borrosa en las últimas dos décadas, con una explosión en los genes de resistencia a los antibióticos ubicados en elementos genéticos móviles capaces de propagarse eficientemente entre bacterias y huéspedes dentro y fuera de los hospitales 9. Estas tendencias se destacan en Enterobacteriaceae, una familia de bacterias Gram negativas (GNB) responsable de una variedad de infecciones comunitarias y adquiridas en el cuidado de la salud. En GNB, la principal fuerza impulsora de la resistencia es la presencia de β-lactamasas, enzimas hidrolizantes de β-lactámicos [Figura 2]. Muchos de estos organismos 7 el año 205017. La pérdida acumulada de producción económica para los países de la OCDE (Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos) podría ascender hasta los 35 billones de dólares para ese mismo año18. Solamente en Estados Unidos, se espera que la carga económica total alcance los 20 mil millones para la atención sanitaria y aproximadamente 35 mil millones por la pérdida de productividad debido a la crisis de la resistencia antimicrobiana19. Además, según las investigaciones llevadas a cabo por el propio Banco Mundial, la resistencia a los antibióticos aumentará los niveles de pobreza y tendrá mayor impacto en los países en vías de desarrollo20. En general, el alto coste de la atención médica debido a la resistencia antimicrobiana se hace notar con mayor fuerza en los países de bajos ingresos. Esto se debe a las altas tasas de incidencia de casos infecciosos y a la mayor dependencia de los ingresos laborales en estas regiones20. A esto habría que sumarle el hecho de que los tratamientos eficaces para combatir la resistencia antimicrobiana estarán fuera del alcance de estos países debido a la mala distribución de los medicamentos, la falta de aplicación de reglamentos y protocolos adecuados, la baja conciencia sobre el uso responsable de los antibióticos y la distribución inadecuada de las pautas de tratamiento21. Los estudios avisan de que el crecimiento anual del producto interior bruto (PIB) puede llegar a disminuir en un 1% a nivel global y entre un 5% y un 7% en los países en desarrollo para 2050. Todo esto aceleraría la brecha existente entre los países desarrollados y los que están en desarrollo, aumentando con ellos los niveles de desigualdad20, 22. 2.7.2. Impacto social La resistencia bacteriana es un problema a gran escala que afecta al mundo entero. Según los últimos datos facilitados por la AEMPS (Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios) y el PRAN (Plan Nacional frente a la Resistencia a los Antibióticos), las bacterias multirresistentes provocan unas 3000 muertes al año en España, 33000 muertes al año en Europa y unas 700000 muertes al año en todo el mundo. Además, hacer frente a este problema genera un gasto sanitario adicional de unos 1500 millones de euros23, 24. Existe la hipótesis de que el uso excesivo de antibióticos se correlaciona con la prescripción y administración inadecuadas de la terapia antibiótica. Un estudio reciente realizado en los EE.UU. analizó los datos de las recetas de antibióticos escritas entre 2010 y 2011 y mostró que aproximadamente el 30 % de las recetas de antibióticos administrados por vía oral eran innecesarias25. Además, como afirmó la Organización Mundial de la Salud en 2015, “la venta de antibióticos y otros medicamentos antimicrobianos sin receta médica sigue 14 siendo habitual, pues muchos países carecen de directrices terapéuticas normalizadas, lo que aumenta la posibilidad de que el público y los profesionales médicos usen en exceso los medicamentos antimicrobianos”26. Por lo tanto, es probable que el fácil acceso a los antibióticos haya promovido el uso excesivo de estos medicamentos y haya contribuido al problema actual de la resistencia a los antibióticos Otro factor que se cree que contribuye a la resistencia a los antibióticos es el uso extensivo de antibióticos en la agricultura, empleados principalmente para promover el crecimiento y para prevenir infecciones en el ganado. La mayor parte del consumo de antibióticos es para fines agrícolas, lo que representa entre 63 000 y más de 240 000 toneladas de uso mundial anual de antibióticos27. Este gran uso de antibióticos tuvo una influencia positiva en la aparición de cepas resistentes que podrían transferirse directamente de animales a humanos a través de la cadena alimentaria. Un informe de la OMS de 2013 mostró que es probable que los niveles de resistencia de Campylobacter a varios antibióticos estén relacionados con el consumo de aves de corral infectadas en muchas partes del mundo28. También se cree que el uso excesivo de antibióticos daña el microbioma ambiental. Los antibióticos pueden llegar al medio ambiente no solo por el uso directo de conservantes para plantas, sino también a través de la orina y las heces excretadas por animales tratados con antibióticos. De esta manera, las especies ambientales no patógenas u oportunistas podrían estar expuestas a los antibióticos y actuar como reservorio de genes de resistencia29, 30. 2.8. One Health El concepto One Health es un nuevo enfoque acuñado para desarrollar e implementar soluciones al problema de la resistencia a los antibióticos, y tiene sus raíces en el proceso de toma de conciencia de la relación existente entre la salud humana y animal, el medio ambiente y el sector de producción de alimentos, teniendo en cuenta las 15 consecuencias económicas y sociales que pueden provocar31. La idea que promueve One Health es la unión de los esfuerzos entre las múltiples profesiones de las ciencias de la salud (ingenieros, ambientólogos, políticos, etc.) para lograr una salud óptima para las personas, los animales domésticos y el medio ambiente32. La mayoría de antimicrobianos utilizados para tratar infecciones bacterianas en humanos también se utilizan en animales. Se estima que hasta el 75% de las enfermedades infecciosas humanas que han surgido o resurgido en las últimas décadas son zoonóticas, es decir, tienen su origen en los animales33. A esto habría que sumarle que la contaminación por el tratamiento inadecuado de los desechos industriales, residenciales y agrícolas está expandiendo el resistoma en el medio ambiente32. One Health promueve la visión de que, con el crecimiento de la población humana en constante aumento, el cambio climático, el aumento de la contaminación y el agotamiento de los recursos de la tierra, todas las disciplinas relacionadas con la salud deben trabajar juntas para garantizar la salud y el bienestar de los seres humanos, los animales y el medio ambiente34. Dadas las importantes e interdependientes dimensiones humanas, animales y ambientales de la resistencia a los antimicrobianos, es lógico plantear un enfoque global que abarque este problema en todas sus dimensiones. Esto incluye tomar medidas para preservar la eficacia continua de los antimicrobianos existentes eliminando su uso inapropiado y limitando la propagación de infecciones. 3. MATERIA DE ESTUDIO El presente trabajo se nutrirá de los estudios y análisis recogidos a partir de un proyecto de investigación realizado por el Departamento de Microbiología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Sevilla. Dicho proyecto se ha llevado a cabo durante 30 meses, de los cuales 12 se han dedicado al análisis de muestras de agua extraídas antes y después del tratamiento de 4 depuradoras de la ciudad de Sevilla. La línea de investigación se acotará a la detección de Gram negativos productores de carbapenemasas y betalactamasas de espectro extendido en las aguas residuales de la ciudad de Sevilla. El motivo por el cual nos centramos en esta clase de microorganismos viene dado por la creciente emergencia relativa a la resistencia a los antimicrobianos betalactámicos y carbapenémicos, los cuales suponen, en muchas ocasiones, el último recurso terapéutico en las infecciones producidas por bacterias Gram negativas. Estudiar la presencia de estos 16 microorganismos en las aguas residuales podría servir como punto de partida para determinar la colonización por bacterias que contienen estos determinantes de resistencia de una población. Asimismo, con este estudio se abrirá la posibilidad de señalar los posibles puntos críticos que pudieran existir, además de poner a prueba la eficacia de las plantas de depuración en relación a su capacidad de eliminación de estos microorganismos. 3.1. Antecedentes del proyecto Desde un punto de vista sociosanitario, el aumento de bacterias multirresistentes es uno de los retos más importantes a los que tendrá que enfrentarse la comunidad científica en los próximos años. Los antimicrobianos de la familia de los carbapenémicos han soportado el peso de ser la última línea de batalla contra las infecciones producidas por Gram negativos. Esto es debido a que las bacterias capaces de producir esta enzima no solo muestran resistencia a todos los betalactámicos, sino que además, es habitual que los genes que codifican carbapenemasas sean vehiculizados en plataformas genéticas junto a determinantes de resistencia a varias familias de antibióticos, como inhibidores de betalactamasas, aminoglucósidos, tetraciclinas, colistina, quinolonas e incluso metales pesados. Por lo tanto, nos encontramos ante un grupo de organismos dotados de una multirresistencia o panresistencia altamente preocupante que afectará cada vez más a la salud de la población mundial35. Diferentes datos reflejan la realidad a la que nos enfrentamos. En Grecia, el 62% de aislados de Klebsiella pneumoniae mostraron resistencia a carbapenémicos en el año 201636; en India, un 65% de los aislados de E. coli mostraron el mismo patrón37. Según datos del año 2019, en la comunidad andaluza, la prevalencia de estas bacterias resistentes se situaba en 0,08 casos/1000 estancias hospitalarias. Para poder llevar a cabo un análisis detallado, es necesario abordar la situación desde dos frentes: por un lado, habrá que estudiar las fuentes originales donde estos determinantes de resistencia se están generando y, por otra parte, se deben analizar las actividades humanas que facilitan la transmisión. De aquí surge la importancia de poner el foco en las aguas residuales de origen humano. Estos lugares reúnen las condiciones ideales para diseminar microorganismos con resistencia. La razón reside en que las aguas que aquí confluyen acumulan restos de antibióticos, desinfectantes e incluso metales, y además constituyen un nicho donde se junta una alta densidad de patógenos humanos de origen intestinal con bacterias ambientales. 17 La gestión de aguas residuales tiene como fin disminuir la carga de patógenos de origen humano, labor llevada a cabo por las plantas de tratamiento (PT). Se estima que estas plantas son capaces de reducir la carga bacteriana de las aguas de 10 a 100 veces, pero, por muy efectivos que sean estos datos, lo cierto es que no consigue eliminarlas del todo. El grupo de investigación que lleva a cabo el presente proyecto investigó la presencia de bacterias productoras de BLEEs y carbapenemasas en las aguas del río Guadalquivir después de pasar por las PT de San Jerónimo, Tablada, Ranilla y Copero de Sevilla. Tomar como muestra de estudio las aguas residuales presenta varias ventajas frente a los estudios en pacientes, ya que estos últimos son costosos y sus criterios de selección suelen estar sesgados. Existen algunos precedentes en lo que se refiere a la búsqueda de bacterias multirresistentes en aguas residuales, pero no son demasiados. En Europa se han realizado estudios parecidos, pero centrados sobre todo en vertidos hospitalarios, por lo que quedaría excluida gran parte de la población. Los que se han llevado a cabo en España se han centrado en detectar solamente la presencia de genes que codifican carbapenemasas sin establecer si estos genes están asociados a bacterias ambientales o potencialmente patógenas38. A través del proyecto de investigación sobre el que versa este trabajo, se pretende conocer la dimensión de la transmisión actual de bacterias productoras de BLEEs y carbapenemasas en una ciudad, Sevilla, que reúne las características adecuadas para sacar las conclusiones apropiadas gracias a su densidad de población y su situación socioeconómica. 4. OBJETIVOS 1. Evaluar la eficacia de las plantas de tratamiento de aguas residuales en el control de bacilos productores de carbapenemasas y BLEEs en efluentes. 2. Análisis de la sensibilidad antimicrobiana de los aislados. 3. Determinar qué genes codificantes de carbapenemasas son más frecuentes en los efluentes, sus plataformas genéticas y elementos móviles que los vehiculizan. 5. METODOLOGÍA Para llevar a cabo este estudio se tomaron muestras a la entrada y a la salida de cuatro depuradoras situadas en diferentes puntos de la provincia de Sevilla: San Jerónimo, Copero, Ranilla y Tablada. Dichas muestras se sembraron mediante diluciones seriadas utilizando un método de siembra logarítmica (Spiral Platter) en medios selectivos cromogénicos para productores de 18 carbapenemasas y BLEEs (ChromID Carba, ChromID OXA y ChromID ESBL). Al mismo tiempo se empleó una placa de TSA como medio de control de bacterias aerobias totales. Se realizaron recuentos de las distintas colonias y se identificaron mediante espectrometría de masas (Maldi TOF, Bruker), realizando un despistaje de los productores de carbapenemasas mediante disco difusión con carbapenémicos, un test colorimétrico de hidrólisis de imipenem (ß Carba test) y un ensayo inmunocromatográfico de detección genética (NG-Test CARBA 5). Por su parte, la identificación de los productores de BLEEs se llevó a cabo mediante doble disco difusión con cefalosporinas. Finalmente, los aislados que presentaban actividad carbapenemasa y BLEE se conservaron a una temperatura de -80º C para, más adelante, proceder a su caracterización molecular. 5.1. Extracción de ADN y secuenciación Para llevar a cabo la caracterización molecular se recurrió a la secuenciación masiva con extracción genómica manual y se realizó una librería con Nextera Flex para un secuenciador Ilumina MiSeq y ensamblado de novo con CLC genomics. Para la anotación de los ensamblados se recurrió a diferentes bases de acceso público como las del Centro para Epidemiología Genética (CGE, DTU Campus), en concreto, los genes de resistencia adquiridos con ResFinder y CARD (Comprehensive Antibiotic Resistence Database). El secuenciotipo se analizó mediante MLST (https://cge.food.dtu.dk/services/MLST/) y los plásmidos mediante PlasmidFinder (https://cge.food.dtu.dk/services/PlasmidFinder/). 5.2. Antibiogramas De los aislados obtenidos en este proyecto de investigación, se sometieron a estudio diferentes cepas de enterobacerias (Klebsiella pneumoniae,Citrobacter freundii y Escherichia coli yEnterobacter spp.). Dichas bacterias crecieron en placas de Petri, y como medio de cultivo se empleó Mueller Hinton II agar. Los antibióticos empleados fueron meropenem, fosfomicina, ertapenem, amikacina, tobramicina, ciprofloxacino, piperacilina/tazobactam y gentamicina. Se utilizó glucosa-6-fosfato a una concentración de 25 µg/ml cuando se analizó la sensibilidad a fosfomicina. Todos los antibióticos fueron conservados a 4ºC y la glucosa-6-fosfato a -20ºC. El stock de estos antimicrobianos fue dividido en alícuotas que se guardaron a -80ºC. Para poder confirmar la calidad de los antimicrobianos empleados, se utilizó la cepa de referencia Escherichia coli ATCC 25922, cuyos rangos de concentración mínima inhibitoria (MIC) in vitro se encuentra bien estandarizados. Para acceder a la información 19 referente a estos rangos se acudió a los portales web del Comité Europeo de Pruebas de Susceptibilidad a los Antimicrobianos (EUCAST) y al del Instituto de Normas Clínicas y de Laboratorio (CLSI). El método escogido para determinar la concentración mínima inhibitoria fue la de microdilución seriada en un medio Mueller-Hinton II. Mediante esta técnica se hicieron diluciones seriadas de concentraciones decrecientes con todos los antimicrobianos. El inóculo se ajustó con espectrofotómetro a una turbidez estándar de 0,5 en la escala de McFarland, que se corresponde aproximadamente con 1 x 108CFU/ml. Una vez ajustado, se inocularon 5 x 105CFU/ml, siguiendo las indicaciones de las guías EUCAST/CLSI. La cepa fue incubada a 35 +/- 1ºC durante 18 +/- 2 horas. El último paso consistió en hacer la lectura de la MIC, interpretándose como la mínima concentración de antimicrobiano a la que se produjo la inhibición completa del crecimiento bacteriano. La MIC de los antimicrobianos utilizados en estas pruebas resultaron dentro del rango establecido. A través de las guías puestas a disposición al público del portal web de EUCAST, se pudo consultar los puntos de corte MIC de las bacterias analizadas. Partiendo de esta información se determinó si las bacterias analizadas eran sensibles (S) o resistentes (R) a los antibióticos. 20 6. RESULTADOS Para el análisis de este trabajo se han utilizado siete muestras de las cuales, cuatro fueron tomadas en la entrada de las depuradoras y tres en las salidas. Del total de estas muestras se extrajeron 44 aislados que fueron seleccionados por su resistencia a los carbapenémicos (36 de ellos se encontraron en la entrada de las depuradoras y 8 en las salidas). 17 aislados corresponden al tipo de bacteria Escherichia coli, 10 son de Citrobacter freundii, 9 de Klebsiella pneumoniae, 4 de Enterobacter cloacae, 1 de Citrobacter farmeri, 1 de Enterobacter asburiae, 1 de Klebsiella oxytoca y 1 de Klebsiella variicola. Atendiendo al secuenciotipo (ST) de las bacterias recolectadas, algunas de las citadas anteriormente son consideradas importancia clínica. En la entrada de la depuradora de San Jerónimo se encontraron dos clones ST131 de E. coli. Asimismo, distintos clones de Klebsiella pneumoniae, ST15 y ST307, aparecieron en las muestras obtenidas en la entrada de la depuradora de Copero. De los aislados que se encontraron a la salida de las depuradoras, es decir, después de que las aguas fueron tratadas, predominan E. coli, ya que cinco de los ocho aislados obtenidos en esta parte del proceso pertenecen a esta especie. Las otras tres bacterias encontradas en estos puntos son Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae yCitrobacter farmeri. 21 En la tabla anterior [Tabla 1] se muestran los resultados obtenidos a partir del estudio mediante antibiogramas sobre la resistencia que mostraron los aislados frente a los distintos antimicrobianos empleados. Se puede apreciar cómo las Enterobacter spp mostraron un alto grado de resistencia a la mayoría de los antibióticos, exceptuando a la amikacina. Frente a este antimicrobiano, la mayoría de bacterias estudiadas mostraron una gran sensibilidad (sólo el 9% mostró algún tipo de resistencia). De todos los antibióticos, el que menos efectividad demostró fue el ciprofloxacino (a las concentraciones testadas, un 80% de los aislados mostraron crecimiento en su presencia). Los aislados de Citrobacter spp fueron resistentes en un alto grado a varios de los antibióticos: ciprofloxacino (91%), ertapenem (91%), tobramicina (82%) y piperacilina/tazobactam (91%). Llama la atención la forma en que respondieron las especies de Klebsiella, ya que fueron sensibles a la mayoría de antimicrobianos exceptuando a fosfomicina y ciprofloxacino, ante los que presentó una gran resistencia (100% y 82% respectivamente). Cabría señalar que dos de las ocho bacterias obtenidas a la salida de las depuradoras mostraron resistencia a todos los antibióticos excepto a la amikacina. Estos dos aislados responden a cepas de Citrobacter freundii yEnterobacter cloacae (captadas, ambas, en las salidas de la depuradora de San Jerónimo). Y en un caso inverso, dos aislados se mostraron sensibles a todos los antibióticos a la salida de la depuradora de Copero, siendo los dos Escherichia coli. 6.1. Determinantes genéticos de la resistencia a los antimicrobianos De los genes que codifican a carbapenemasas, el que más se encontró, tomando como muestra la totalidad de los aislados, fue blaKPC-2 (27% del total). Este gen se pudo encontrar, sobre todo, en Citrobacter spp (64%). De hecho, fue en esta especie bacteriana donde se encontraron mayor número de genes codificadores de carbapenemasas. El segundo gen con más presencia fue el blaOXA-1054, que pudo encontrarse en una proporción importante tanto en Citrobacter spp (36%), como en Enterobacter spp (60%) [Tabla 2]. Poniendo el foco en la capacidad de depurar las aguas de cada una de las plantas de tratamiento, se apreció cómo en San Jerónimo, estos genes están presentes tanto a la entrada como a la salida [Figura 4]. En las otras tres depuradoras se pudo apreciar la ausencia de 22 dichos genes después del depurado de las aguas. [Figuras 5, 6, 7]. En la depuradora de Ranilla no se detectó nada, ni en la entrada, ni en la salida [Figura 7]. 23 relación existente entre los genes de carbapenemasas, BLEEs y los plásmidos que confieren resistencia es cada vez más clara. 8. CONCLUSIÓN - A pesar de no ser una eliminación por completo, la mayoría de las plantas de tratamiento estudiadas en el presente trabajo son capaces de eliminar o, al menos disminuir, el número de bacterias con genes de resistencia. Cabe destacar que la planta de tratamiento de San Jerónimo ha supuesto una excepción ya que ha presentado un mayor problema para reducir el número de productores de carbapenemasas, lo cual podría guardar relación con el hecho de ser la depuradora más antigua de todas las estudiadas. - Tras analizar los resultados de este trabajo y compararlos con otros estudios podemos concluir que nos encontramos ante una realidad que afecta a la población mundial y a todo su entorno. Las aguas residuales de las ciudades estudiadas parecen compartir características en lo que a bacterias resistentes se refiere. La relación entre los genes, plásmidos y especies resistentes es cada vez más clara y la necesidad de un seguimiento más amplio se vuelve urgente. - En una era en la que la propagación de la resistencia a los antimicrobianos no va acompañada del desarrollo de nuevos antibióticos, mejorar la eliminación de los microorganismos resistentes a los antimicrobianos de las aguas residuales parece ser una política razonable para poner en práctica, y se deben hacer más esfuerzos para monitorear y controlar aún más la diseminación de bacterias resistentes en el medio ambiente. - La idea que trae consigo el concepto One Health nos sugiere una nueva mirada que nos aleje del antropocentrismo a la hora de entender los efectos de los nuevos patógenos que están empezando a colonizar nuestro medio ambiente. No es posible un avance en materia sanitaria si no entendemos la biomedicina como un todo donde personas, animales y medio ambiente comparten vías de propagación que los microorganismos aprovechan para crecer y desarrollarse. - Si bien es cierto que ya hace tiempo que se están tomando medidas de concienciación dirigidas al uso racional de los antibióticos, en este trabajo se ha intentado demostrar que la responsabilidad no puede recaer solo en unos pocos. Es necesario aumentar los esfuerzos para comprender mejor el problema al que nos enfrentamos y, con ello, evitar problemas futuros. 30 9. BIBLIOGRAFÍA 1. World Health Organitation. Ten health issues WHO will tackle this year [Internet]. Who Press; 2019 [citado el 20 de marzo de 2023]. Disponible en: https://www.who.int/news-room/spotlight/ten-threats-to-global-health-in-2019 2. Jano Medicina y Humanidades. Elsevier Espana S. A. 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