Avaliação da resposta da comunidade microbiana de solos à aplicação de um biocida (EucaBio)

Universidade do Minho Escola de Ciências Carla Filipa Amorim Flores Avaliação da resposta da comunidade microbiana de solos à aplicação de um biocida (EucaBio) Março de 2024 Avaliação da resposta da comunidade microbiana de solos à aplicação de um biocida (EucaBio) Carla Flores UMinho | 2024 Universidade do Minho Escola de Ciências Dissertação de Mestrado Mestrado Biologia Molecular, Biotecnologia e Bioempreendedorismo em Plantas Trabalho efetuado sob a orientação da Professora Doutora Teresa Lino Neto e Doutora Daniela Costa Março de 2023 Carla Filipa Amorim Flores Avaliação da resposta da comunidade microbiana de solos à aplicação de um biocida (EucaBio) ii DIREITOS DE AUTOR E CONDIÇÕES DE UTILIZAÇÃO DO TRABALHO POR TERCEIROS Este é um trabalho académico que pode ser utilizado por terceiros desde que respeitadas as regras e boas práticas internacionalmente aceites, no que concerne aos direitos de autor e direitos conexos. Assim, o presente trabalho pode ser utilizado nos termos previstos na licença abaixo indicada. Caso o utilizador necessite de permissão para poder fazer um uso do trabalho em condições não previstas no licenciamento indicado, deverá contactar o autor, através do RepositóriUM da Universidade do Minho. Atribuição-NãoComercial-SemDerivações CC BY-NC-ND https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ iii Agradecimentos Com a finalização deste trabalho, não poderia deixar de referir o meu enorme agradecimento a todos aqueles que contribuíram para o meu percurso, não só a nível académico mas também pessoal, ao longo deste tempo. As minhas orientadoras, a Professora Doutora Teresa Lino Neto e Doutora Daniela Costa, um enorme obrigada pelo acompanhamento, por toda a disponibilidade e, principalmente, pela paciência. Obrigada por todo o apoio e força para a conclusão desta etapa, não seria possível sem vocês. Um agradecimento os meus colegas de laboratório que todos os dias estavam presentes para ajudar em todos os aspetos relacionados com este trabalho. As amigas que a universidade me deu, Catarina e Joana, um abraço muito apertado. Obrigada por me ouvirem, por deixarem-me repetir mil conversas sobre este trabalho e mais importante por me apoiarem sempre de forma incondicional. A ela, Sara, o maior dos agradecimentos por todo carinho, cuidado, paciência e principalmente pelo incentivo para a conclusão deste projeto. Obrigada por aturares todos os meus momentos de pânico e ansiedade, por estares sempre presente e por acreditares sempre em mim, mesmo quando eu não conseguia fazer o mesmo. E por último, quero agradecer aos meus pais e a minha irmã pelo apoio incondicional para a realização desta etapa tão importante da minha vida. Muito obrigada a todos! Este trabalho contou com o apoio de fundos nacionais atribuídos pela Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) através do projeto PCIF/GVB/0150/2018 (PEST(bio)CIDE) e pelo programa estratégico ao CBMA (UIDB/04050/2020). iv DECLARAÇÃO DE INTEGRIDADE Declaro ter atuado com integridade na elaboração do presente trabalho académico e confirmo que não recorri à prática de plágio nem a qualquer forma de utilização indevida ou falsificação de informações ou resultados em nenhuma das etapas conducente à sua elaboração. Mais declaro que conheço e que respeitei o Código de Conduta Ética da Universidade do Minho. v Resumo Avaliação da resposta da comunidade microbiana de solos à aplicação de um biocida (EucaBio) Eucalyptus globulus é uma espécie invasora, que se encontra amplamente difundida nas florestas portuguesas. Apesar da enorme importância da substituição do eucalipto por espécies nativas, existem diversos fatores económicos, sociais e políticos que dificultam a sua implementação. Por esta razão, são necessárias soluções alternativas para reduzir a expansão espontânea da área de eucalipto em Portugal. As folhas de eucalipto têm potencial fitotóxico e o seu uso como herbicida sustentável pode ajudar a reduzir a biomassa de eucalipto presente nas florestas. Neste trabalho foi realizada a avaliação do impacto nas comunidades microbianas de solos agrícolas do EucaBio_sólido, um herbicida ecológico, por sequenciação de alto rendimento ( Illumina ). Este trabalho contribui para a validação do EucaBio_sólido como uma alternativa aos herbicidas sintéticos. A comunidade microbiana presente nas amostras de solo com diferentes concentrações de EucaBio_sólido (0 %, 2,5 %, 5 % e 10 %) e em três tempos diferentes (T0, T1 e T2) foi avaliada por metabarcoding da região 16S e ITS do rRNA . Foram identificados 14.914 amplicon sequence variants bacterianos e 5.607 amplicon sequence variants fúngicos, onde os filos com maior abundância foram Proteobacteria , Actinobacteria e Acidobacteria para a comunidade bacteriana, e os filos Ascomycota e Basidiomycota para a comunidade fúngica. De entre todas as amostras, o controlo revelou ter uma comunidade microbiana mais rica e diversa, principalmente na comunidade bacteriana, enquanto que a concentração de 10 % foi a que apresentou menor riqueza e diversidade microbiana, mostrando assim, um maior impacto na comunidade. A concentração de EucaBio_sólido foi o fator mais significativo na variabilidade da composição das comunidades das diferentes amostras. Assim, este trabalho permitiu identificar os grupos taxonómicos com maiores alterações devido à aplicação do bio-herbicida EucaBio. Este impacto foi tanto maior quanto mais alta a concentração de EucaBio_sólido, o que evidencia que a aplicação deve ser realizada a concentrações mais baixas. Palavras-chave: Eucalyptus globulus; EucaBio ; Comunidade fúngica e bacteriana vi Abstract Assessment of the response of the soil microbial community to the application of a biocide (EucaBio) Eucalyptus globulus is an invasive species, widely distributed in Portuguese forests. Although there is a great importance on the replacement of eucalyptus with native plant species, the existence of several economic, social, and political factors difficult its implementation. For this reason, alternative solutions to reduce the spontaneous expansion of eucalyptus area in Portugal are needed. Eucalyptus leaves have phytotoxic potential and their use as an environmentally friendly herbicide could help reduce the eucalypt biomass in forests. In this work, the assessment of the impact of EucaBio_solid (eco-friendly herbicide) application on microbial communities of agricultural soil was performed by high-throughput sequencing ( Illumina ). This work contributes to validate EucaBio_solid as a sustainable alternative to synthetic herbicides. The soil microbial community was assessed using different concentrations of EucaBio_solid (0 %, 2.5 %, 5 % and 10 %) and three collection times (T0, T1 and T2) using metabarcoding of 16S and ITS rRNA regions. Overall, 14,914 bacterial amplicon sequence variants and 5,607 fungal amplicon sequence variants were identified, with a high abundance of the phyla Proteobacteria , Actinobacteria and Acidobacteria in the bacterial community, and Ascomycota and Basidiomycota in the fungal community. Microbial communities from control samples revealed a higher richness and abundance, mainly in the bacterial community, while microbial communities in the 10 % samples displayed the lowest. EucaBio_solid concentration was the most significant factor for the variability of microbial community’s composition. This work allowed the identification of taxonomic groups that are most affected by the bioherbicide application. This impact is greater in the highest concentration of EucaBio_solid, being advisable to perform the application in a lower concentration. Keywords: Eucalyptus globulus ; EucaBio; Fungal and bacterial community vii Índice Geral Índice de Figuras .............................................................................................................................. viii Índice de Tabelas ............................................................................................................................... ix Lista de abreviações .......................................................................................................................... x 1. Introdução ............................................................................................................................. 1 1.1. O eucalipto-comum ................................................................................................................ 2 1.2. Eucalipto e os incêndios ......................................................................................................... 3 1.3. Eucalipto e os compostos aleloquímicos ................................................................................. 5 1.4. Herbicidas sintéticos e as novas perspetivas ........................................................................... 6 1.5. Microrganismos presentes no solo .......................................................................................... 8 1.6. Objetivos da tese ..................................................................................................................11 2. Material e Métodos ...............................................................................................................12 2.1. EucaBio_sólido ....................................................................................................................12 2.1.1. Efeito do EucaBio_sólido em ensaios em vaso ..............................................................13 2.1.2. Extração de DNA ..........................................................................................................13 2.1.3. Preparação e sequenciação das amostras de solos ......................................................14 2.1.4. Análise de sequências usando ferramentas de bioinformática .......................................16 2.1.5. Análise de dados ..........................................................................................................17 3. Resultados e discussão ........................................................................................................18 3.1. Extração e amplificação de DNA ...........................................................................................18 3.2. Sequenciação e controlo de qualidade ..................................................................................19 3.3. Comunidades microbianas no solo: diversidade e composição ..............................................19 3.3.1. Comunidade bacteriana ...............................................................................................19 3.3.2. Comunidade fúngica ....................................................................................................26 3.3.3. Comparação das comunidades bactérias e fúngicas .....................................................31 4. Conclusão ............................................................................................................................33 5. Referências ..........................................................................................................................33 6. Anexos .................................................................................................................................45 4 Uma vez que no seu território nativo (Austrália) o eucalipto está naturalmente exposto à ocorrência de fogos (Booth, 2012), esta espécie desenvolveu várias características adaptativas ao fogo (dos Santos et al ., 2015). Estas potenciam a sua regeneração, assim como um rápido recrutamento e estabelecimento de eucaliptos em zonas de pós-fogo (dos Santos et al., 2015). Isto ocorre devido à capacidade apresentada pelo eucalipto em emitir rebentos, a partir da base do tronco, assim como devido ao aumento da libertação de sementes (deiscência) para o solo após um incêndio (Catry et al., 2013; dos Santos et al., 2015; Silva et al., 2021). Este processo ocorre uma vez que as pseudocápsulas lenhosas (frutos) desidratam após a ocorrência de um fogo, abrindo e libertando as sementes (dos Santos et al., 2015; Silva et al., 2016). Embora este processo não seja exclusivamente dependente do fogo, pois também ocorre de forma natural em períodos de seca, após a ocorrência de um fogo, a libertação de sementes ocorre de uma forma massiva num curto período (Vega et al., 2008; dos Santos et al., 2015). As pseudocápsulas também têm a capacidade de proteger as sementes do calor, permitindo que continuem viáveis mesmo depois de um fogo (Silva et al., 2016; Águas, 2019). Para além disso, o fogo cria condições que facilitam a germinação, pois remove a vegetação circundante resultando numa maior disponibilidade de luz, nutrientes e água, diminuindo a competição entre espécies (Águas et al., 2014; dos Santos et al., 2015). O fogo também afeta a composição do solo, tanto a nível de nutrientes, devido a acumulação de cinzas, como a nível dos microrganismos existentes, devido às temperaturas que o solo atinge (Águas et al., 2014; dos Santos et al., 2015). Apesar de tudo que foi referido anteriormente, o efeito benéfico da ocorrência de fogos para o eucalipto está fortemente dependente da sua intensidade e da época do ano em que ocorrem (Águas et al., 2014; dos Santos et al., 2015). A maior incidência dos incêndios nas florestas onde predominam eucaliptos, quando comparada com outras florestas, pode estar relacionada com as características inflamáveis das folhas, que resultam principalmente dos compostos voláteis que acumulam (Bowman et al. , 2014; Kalabokidis & Palaiologou, 2019). A maior ocorrência de fogos nestas florestas é também uma consequência da acumulação de folhas e cascas que o eucalipto vai libertando (Oliveira et al ., 2021). Este último fator está diretamente relacionado com a gestão das áreas florestais, onde a inclusão de medidas de gestão regulares como desbastes, seleções de varas e limpezas de matos, podem reduzir os combustíveis que potenciam incêndios (Oliveira et al., 2021). Em contrapartida, uma boa gestão florestal resulta numa menor área ardida. Exemplo disso são as zonas de florestação controladas por empresas da indústria papeleira associadas à CELPA, que entre 2008 e 2019 registaram uma média anual de área de eucalipto ardida de apenas 1,3 %, valor esse 5 bastante inferior à média nacional de 17,4 % para o mesmo período (CELPA, 2019; Oliveira et al ., 2021). 1.3. Eucalipto e os compostos aleloquímicos A ocorrência de fogo na sua região nativa, desenvolveu no eucalipto características adaptativas também associadas com a sua elevada inflamabilidade (dos Santos et al., 2015). Isto deve-se aos compostos que o eucalipto produz a partir do seu metabolismo secundário (Guerrero et al., 2022). Os metabolitos secundários são uma vasta e diversificada variedade de compostos orgânicos, sendo que a maioria não parece participar diretamente no crescimento e desenvolvimento da planta. Não são assim essenciais para o desenvolvimento da planta, mas promovem a sua sobrevivência e proteção contra vários fatores abióticos ou bióticos (Zhang et al ., 2010; Hussain et al., 2012; Guerrero et al., 2022). Os metabolitos secundários não são produzidos aleatoriamente, tendo sido otimizados ao longo da evolução das plantas. Por exemplo, muitos estão envolvidos em processos de alelopatia, intervindo na defesa química das plantas (Guerrero et al., 2022). Alguns exemplos de alelopatia são os compostos produzidos para proteger a planta da radiação UV, do stress hídrico e aqueles que evitam a presença e desenvolvimento de vegetação circundante (Souto et al ., 2001; Tomé et al., 2019; Guerrero et al., 2022). Este último processo ocorre porque alguns aleloquímicos podem interferir de forma negativa com os processos fisiológicos e morfológicos de outras plantas, impedindo a normal divisão celular, alterando a estruturação da parede celular, a permeabilidade da membrana ou algumas atividades enzimáticas (Morsi & Abdelmigid, 2016). Para além do que já foi referido, os compostos aleloquímicos produzidos e libertados pelo eucalipto também afetam outros organismos, como fungos, bactérias e insetos, tendo já sido demonstrada atividade antifúngica e antimicrobiana por alguns compostos (Souto et al., 2001; Sadlon & Lamson, 2010; Xu et al., 2020). Especificamente no eucalipto, os aleloquímicos estão presentes nas folhas, cascas, raízes, flores e frutos (Morsi & Abdelmigid, 2016). No entanto, alguns estudos referem um maior impacto alelopático por parte de extratos de folhas (Maharjan et al., 2007; Morsi & Abdelmigid, 2016), em específico de folhas jovens (O'Reilly-Wapstra et al., 2007). Nos últimos anos, tem aumentado o interesse em direcionar estas propriedades aleloquímicas de compostos do eucalipto para o controlo de pragas e doenças que afetam plantas com valor económico (Puig et al., 2013; Puig et al., 2018). Desta forma, existe a possibilidade do desenvolvimento de novos produtos que contribuam para melhorar a produtividade agrícola, enquanto promovem a sustentabilidade, 6 reduzindo o impacto no ambiente e nos ecossistemas pela redução do uso de pesticidas/herbicidas sintéticos (Puig et al., 2018). 1.4. Herbicidas sintéticos e as novas perspetivas O crescimento da população mundial continua a ocorrer de forma acentuada e, segundo as Nações Unidas, estima-se que até 2050 a população mundial possa chegar aos 9,7 mil milhões ( United Nations Department of Economic and Social Affairs, Population Division , 2022). Este aumento, embora menor do que se esperava devido à pandemia que afetou o mundo em 2020, irá resultar num aumento do número de pessoas afetadas por fome e desnutrição (FAO et al. , 2022). Desde 2015, que a prevalência de desnutrição permanecia relativamente inalterada, mas a partir de 2019 tem vindo a aumentar (FAO et al. , 2022). Estima-se que, em 2021, entre 702 e 828 milhões de pessoas foram afetadas pela fome e cerca de 2,3 mil milhões sofreram devido a uma insegurança alimentar moderada ou grave (FAO et al. , 2022). A maior demanda de alimentos e produtos, principalmente derivados do setor agrícola, resulta numa agricultura muito dependente no uso de agroquímicos, na tentativa de aumentar a rentabilidade das culturas (Sharma et al. , 2019). Agroquímicos são substâncias utilizadas para facilitar o controlo de ecossistemas agrícolas ou de comunidades de organismos em áreas de cultivo, e podem ser: pesticidas, reguladores de crescimento de plantas, fertilizantes, condicionadores de solo e produtos químicos usados na pecuária (Koli et al ., 2019). Podemos classificar os pesticidas como qualquer substância ou mistura de substâncias usadas para matar, repelir ou controlar uma “praga”, incluindo insetos, caracóis, roedores, fungos, bactérias e ervas daninhas (Bolognesi, 2003; Maksymiv, 2015). De entre todos os pesticidas, os mais utilizados são os herbicidas, que representam cerca de 47,5 %, seguidos pelos inseticidas e os fungicidas (17,5 % e 5,5 %, respetivamente) (De et al. , 2014). Previamente à descoberta dos herbicidas sintéticos, as ervas daninhas eram controladas através de monda, corte, remoção manual, aplicação de uma cobertura morta, rotação de culturas e uso de produtos químicos não sintéticos, como compostos de arsénio, sódio e enxofre (Osteen et al., 2016; Duke & Dayan, 2018). Com a sua descoberta no início dos anos 40, os herbicidas sintéticos começaram a ser amplamente utilizados na agricultura e a sua aplicação continua a aumentar até aos dias de hoje (Duke & Dayan, 2018). Os herbicidas compreendem uma vasta gama de compostos químicos, geralmente identificados por meio de ensaios de triagem de atividade herbicida. Caso esta seja detetada, são posteriormente realizados ensaios adicionais em culturas com interesse económico para determinar a sua eficácia, seletividade, impacto ambiental 7 e efeitos fitotóxicos (Rebeiz et al., 1984). Os herbicidas tendem a afetar processos específicos de plantas, como as vias bioquímicas, processos fisiológicos relacionados com a fotossíntese e a formação de biomoléculas fundamentais, sendo estes os açúcares, aminoácidos e ácidos gordos, ou a formação de macromoléculas (Dayan, 2019). Como é expectável, interferir com estes processos pode causar danos no desenvolvimento das ervas daninhas ou até mesmo conduzir à sua morte (Sherwani et al. , 2015). Existem mais de 200 compostos ativos que servem de base para herbicidas, como glifosato, glufosinato, flazassulfurão e atrazina (Forouzesh et al ., 2015). O glifosato [N- (fosfonometil) glicina] é um herbicida pós-emergente, não seletivo e de ação sistémica, que inibe a enzima sintetase do 5-enolpiruvilchiquimato 3-fosfato (EPSPS) (Duke & Powles, 2008). Esta enzima está presente na via metabólica do chiquimato, que é responsável pela produção de aminoácidos aromáticos, como triptofano, tirosina e fenilalanina (Duke & Powles, 2008; Sherwani et al. , 2015). O glufosinato é um herbicida de contacto e não seletivo que, por se ligar a glutamina sintase, inibe a fotossíntese (Takano & Dayan, 2020). Para além destes, existe uma ampla gama de mecanismos de ação dos herbicidas, desde inibidores da acetil-CoA carboxilase, até inibidores da síntese de ácidos nucleicos e de proteínas (Roman et al., 2007). À utilização de herbicidas, não estão apenas associados efeitos positivos para o controlo de ervas daninhas, dado que a maioria é altamente persistente no ecossistema. Não sendo biodegradável, os efeitos prejudiciais verificados no desenvolvimento de plantas permanecem por um longo período (Basu & Rao, 2020). Existem também evidências que apenas parte dos herbicidas aplicados são efetivamente utilizados no controlo local das plantas-alvo, sendo que a maior parte acaba por contaminar o ar, solo, água, podendo até afetar negativamente plantas nãoalvo (Kudsk & Streibig, 2003; Marin-Morales et al., 2013; Balderrama-Carmona et al., 2020). Assim, o uso generalizado de herbicidas ao longo dos anos, resultou na acumulação de resíduos no meio ambiente, causando contaminações nos ecossistemas e provocando efeitos negativos à biota (Marin-Morales et al., 2013). O solo é bastante afetado pelo uso de herbicidas, devido a processos de lixiviação, retenção, escorrimento superficial ou absorção (Duke, 1989; Prince & Kelton, 2013). Com a ocorrência de todos estes processos, é expectável que os microrganismos presentes no solo também sejam bastante afetados nas suas atividades enzimáticas, quer qualitativamente ou quantitativamente (Latha & Gopal, 2010). Devido aos impactos negativos causados pelos herbicidas sintéticos, o estudo de alternativas sustentáveis tem aumentado, principalmente nos últimos anos. Os bio-herbicidas 8 constituem uma alternativa aos herbicidas, podendo ser constituídos por organismos vivos (microrganismos) ou derivados de organismos vivos (extratos vegetais e aleloquímicos) produzidos durante o seu crescimento e desenvolvimento (Bailey, 2014; de Souza Barros et al., 2021). Além de terem de ser eficientes e consistentes (formulações adequadas), os bio-herbicidas devem igualmente ser competitivos no preço para terem sucesso (de Souza Barros et al., 2021). Deste modo, os compostos aleloquímicos produzidos por Eucalyptus globulus apresentam relevância como uma alternativa sustentável, tendo sido bastante explorados pela comunidade científica nos últimos anos (Puig et al ., 2013; Aragão et al., 2015; Abou El-Ghit, 2016; Ibáñez Jaime & Blázquez Ferrer, 2018; Pinto et al., 2021). 1.5. Microrganismos presentes no solo O solo é a base de todos os ecossistemas terrestres e acolhe uma grande diversidade de bactérias, fungos, insetos, anelídeos e outros invertebrados, assim como plantas e algas (Aislabie et al., 2013). Este é um sistema dinâmico complexo, que incluí componentes abióticos e bióticos, que se encontram relacionados por processos biológicos, físicos e químicos (Dominati et al., 2010). Nele ocorrem vários processos, que estão no centro da sua formação, como, por exemplo, a reciclagem de água e nutrientes, ou atividades biológicas por parte das comunidades nele presentes (Dominati et al., 2010). As comunidades biológicas existentes no solo compreendem espécies de praticamente todos os principais grupos taxonómicos encontrados em ecossistemas terrestres (Swift et al., 1979; Decaëns, 2010) e podem interagir de forma benéfica, nociva ou neutra com as plantas (Santoyo et al., 2017). As interações benéficas possuem um particular interesse, uma vez que, podem ser direcionadas para melhorar e promover o crescimento, desenvolvimento e saúde das plantas em diversos contextos, em especial em plantas agrícolas (Santoyo et al., 2012; Santoyo et al., 2017; Khatoon et al., 2020). Um exemplo de bactérias que têm características benéficas, são as Plant Growth Promoting (Rhizo)Bacteria (PGPR ou PGPB), que realizam associações de simbiose com as raízes na rizosfera (Miransari et al., 2016) ou vivem livremente no solo (Shameer & Prasad, 2018). AS PGPR/PGPB podem apresentar diferentes mecanismos de ação, como a fixação de nitrogénio, solubilização de fosfato, sequestro de metais pesados, produção de fitohormonas [por exemplo, ácido indolacético (IAA), giberelinas ou citocininas], mineralização da matéria orgânica do solo, decomposição de resíduos de culturas, supressão de fitopatógenos, entre outros (Shameer & Prasad, 2018; He et al. , 2019; Khatoon et al., 2020). Estes mecanismos tornam as PGPR úteis para as plantas crescerem mesmo em solos deficientes em nutrientes 9 (Khatoon et al., 2020). Além disso, tal como evidenciado na Figura 2, algumas das fito-hormonas produzidas por estes microrganismos tem diferentes efeitos no desenvolvimento das plantas, podendo causar germinação de sementes, alongamento das raízes, crescimento de frutos, crescimento aéreo e radicular, entre outros (Khatoon et al., 2020). O género Rhizobium é dos grupos de bactérias que recebe mais destaque como PGPR e é caraterizado pela sua relação de simbiose com plantas hospedeiras específicas, como as leguminosas, nas quais promove a formação de nódulos com capacidade de fixar nitrogénio atmosférico (Rodríguez‐Díaz et al., 2008, Miransari et al. , 2016). Bactérias do género Azospirillum apresentam também capacidade de fixar nitrogénio em condições microaeróbicas, assim como capacidade de produzir hormonas de crescimento vegetal, como o ácido indol-acético (IAA) (Jha & Saraf, 2015; Miransari et al. , 2016). Este género apresenta crescimento abundante, sobretudo na rizosfera de gramíneas. Outros géneros de PGPR muito predominantes são membros de Pseudomonas e Bacillus , que produzem algumas variedades de antibióticos, entre outras caraterísticas de alguma importância (Miransari et al. , 2016; Muthukumar et al., 2022). Figura 2: Representação das diversas fito-hormonas produzidas por PGPR e as alterações que estas podem induzir no desenvolvimento de plantas (Khatoon et al. , 2020). No solo existem também bactérias fitopatogénicas, que causam doenças nas plantas. Alguns dos sintomas que estas podem provocar são manchas, cancros, apodrecimento de tecidos, desequilíbrios hormonais (que podem levar ao crescimento excessivo), atrofia no desenvolvimento, ramificação de raízes e epinastia foliar, entre outros, sendo o mais grave a morte da planta (Kannan et al., 2015; Martins et al., 2018). Exemplos deste tipo de bactérias são as espécies presentes na Lista dos 10 Principais Patógenos Bacterianos de Plantas , sendo eles: Pseudomonas syringae pvs, Ralstonia solanacearum , Agrobacterium tumefaciens, Xanthomonasoryzae pv . oryzae, 10 Xanthomonas, campestres pvs , Xanthomonas axonopodis pv. Manihotis, Erwinia amylovora, Xylella fastidiosa, Dickeya ( dadantii e solani ) e, por fim, Pectobacterium carotovorum ( e P. atrosepticum ) (Mansfield et al., 2012). Tal como nas bactérias, os fungos também apresentam características benéficas, sendo que os fungos saprófitas e os micorrízicos encontram-se em elevada abundância nos solos. Os fungos saprófitas são extremamente importantes para o ecossistema do solo, pois sendo decompositores libertam nutrientes importantes para o crescimento sustentado das plantas (Dighton, 2007; Pereira et al. , 2012). As micorrizas resultam da associação mutualística entre fungos e raízes de plantas, sendo que ocorre em quase 80 % das plantas terrestres (Sylvia, 2005). Existem quatro tipos principais de micorrizas, com base nos critérios de diferenciação morfológica dos tecidos radiculares e também dos grupos taxonómicos das plantas hospedeiras: micorrizas arbusculares, ectomicorrizas, micorrizas ericáceas e micorrizas orquidóides (Brundrett & Tedersoo, 2018). As micorrizas arbusculares são caracterizadas por colonizarem o interior das células e formarem estruturas ramificadas, também conhecidas por arbúsculos (Brundrett & Tedersoo, 2018). São conhecidas por auxiliarem a eficiência da planta hospedeira de diversas maneiras – por exemplo, melhorando o crescimento e a biomassa das raízes, assim como dos rebentos das plantas, regulando positivamente a absorção de nutrientes e água e aumentando a sobrevivência sob stress ambiental (Denton, 2007; Smith e Read, 2008). Os fungos arbusculares encontram-se principalmente no filo Glomeromycota . Os fungos ectomicorrízicos são caracterizados pela presença de um manto fúngico que envolve as raízes do hospedeiro e a rede Hartig (hifas que penetram no espaço intercelular no córtex radicular para formar uma rede de micélio fúngico) que envolve as células epidérmicas ou corticais da raiz (Johnson & Gehring, 2007; Marschner, 2023). Estas estruturas são muito eficientes ao fornecerem uma extensa área de superfície para troca de recursos entre planta e fungo, o que faz com que as ectomicorrizas desempenhem um papel importante no ciclo de nutrientes e na composição do solo, providenciando serviços necessários para o crescimento de plantas lenhosas, incluindo benefícios nutricionais e tolerância a vários stresses ambientais (Smith e Read 2008). Os fungos ectomicorrízicos representam um conjunto diversificado de pelo menos 6.000 espécies pertencentes aos filos Basidiomycota , Ascomycota e Zygomycota (Johnson & Gehring, 2007; Smith and Read, 2008). Para além de muitos fungos apresentarem múltiplos efeitos benéficos, muitos apresentam fitopatogenicidade, principalmente membros dos filos Ascomycota e Basidiomycota (Doehlemann et al., 2017). Estes patógenos podem ser separados em dois grupos principais: patógenos biotróficos, que formam interações íntimas com plantas, nutrindo-se dos tecidos vivos 11 da planta hospedeira, e patógenos necrotróficos, que matam o tecido para extrair nutrientes (Doehlemann et al., 2017). Um exemplo de patógeno necrotrófico é o fungo Fusarium graminearum , causador da fusariose da espiga que afeta plantações de trigo e de cevada (Quarantin et al., 2019; Rauwane et al., 2020). Este patógeno é conhecido por produzir enzimas e toxinas que degradam a parede celular, fazendo com que o tecido vegetal perca firmeza, ocorra a sua maceração e o vazamento do conteúdo celular (Rauwane et al., 2020). Outra espécie pertencente ao género Fusarium, Fusarium oxysporum, é considerada um patógeno hemibiotrófico porque começa o seu ciclo de infeção como biotrófico, mas mais tarde muda para necrotrófico (Lyons et al., 2015). Este é conhecido por causar murchidão nas plantas hospedeiras, habitando no solo por muito tempo na forma de clamidósporos, os quais após germinação conduzem à penetração do fungo nas raízes, proliferação nos tecidos vegetais e colonização dos vasos do xilema, que causa o amarelamento sistémico, a murchidão e até mesmo a morte da planta (Arie, 2019). Esta espécie afeta variadas culturas agrícolas com importância económica como, por exemplo, as culturas de tomate, banana, algodão, entre outras (Arie, 2019; Carmona et al ., 2020; Asai et al ., 2021). A presença de muitas destas espécies patogénicas é devastadora para as culturas agrícolas, tendo um enorme impacto económico, com perdas em todo o mundo, todos os anos (Kannan et al., 2015; Martins et al., 2018). 1.6. Objetivos da tese Este trabalho enquadram-se no projeto FCT - PEST(bio)CIDE (PCIF/GVB/0150/2018) que visa, através da valorização da biomassa foliar do eucalipto-comum, oferecer uma resposta para melhorar a gestão das áreas de eucalipto regeneradas após um incêndio florestal. Propõe a utilização da biomassa foliar de eucalipto como bio-herbicida, denominado EucaBio, baseando-se no potencial fitotóxico das folhas do eucalipto. Têm como objetivo principal avaliar os efeitos da aplicação de um herbicida natural, obtido através de folhas de eucalipto (designado de EucaBio_sólido), nas comunidades microbianas (fungos e bactérias) presentes no solo. Para atingir este objetivo foram realizados ensaios experimentais com a aplicação de diferentes concentrações de EucaBio_sólido, de forma a conseguir avaliar que concentrações de herbicida apresentam maior impacto nas comunidades microbianas. A microbiota do solo foi caracterizada por sequenciação de alto rendimento, utilizando a sequenciação por Illumina dos amplicões ITS2 (para fungos) e 16S rRNAs (para bactérias). Após a caracterização das comunidades bacterianas e fúngicas dos solos tratados com EucaBio_sólido, é pretendido avaliar especificamente quais as concentrações de herbicida que 12 podem afetar negativamente os serviços ecológicos fornecidos pela microbiota do solo. De igual modo, utilizando uma amostragem ao longo do tempo, é igualmente pretendido avaliar a persistência dos efeitos do EucaBio_sólido no solo, após a sua aplicação. 2. Material e Métodos 2.1. EucaBio_sólido O herbicida (EucaBio_sólido) utilizado neste trabalho foi, gentilmente, cedido pelo grupo de investigação da GreenUPorto – Centro de Investigação em Produção Agroalimentar Sustentável (Universidade do Porto), parceiros no projeto PEST(bio)CIDE (PCIF/GVB/0150/2018), financiado pela Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT). O EucaBio_sólido consiste em rebentos de Eucalyptus globulus , que brotaram em zonas de ocorrência de incêndios no Verão de 2020, mais precisamente numa área florestal de Sobrado, perto do Porto (N 41.200402, W 8.476306). As folhas foram manualmente retiradas desses rebentos, sendo posteriormente secas numa estufa a 60 °C, até atingir peso constante. As folhas desidratadas foram reduzidas a pequenos fragmentos e utilizadas como bio-herbicida (denominado como EucaBio_sólido), por incorporação no solo (Figura 3). Figura 3: Metodologia experimental utilizada para a elaboração deste trabalho. Folhas jovens de eucalipto foram desidratadas e posteriormente incorporadas em solo agrícola a diferentes concentrações, foram realizadas recolhas de amostras de solo em 3 tempos diferentes (com intervalos de 2 semanas) e, posteriormente, realizou-se a extração de DNA com a utilização de kits apropriados, sequenciação por Illumina e análise dos dados com recurso a ferramentas bioinformáticas. 13 2.1.1. Efeito do EucaBio_sólido em ensaios em vaso O herbicida biológico, EucaBio_sólido, foi incorporado em solo agrícola recolhido em Vairão (Vila do Conde, Portugal), de forma a testar o seu efeito na comunidade microbiana (Figura 3). Para isso, foram misturados 400 g de solo e diferentes quantidades (g) de EucaBio_sólido, de modo a estudar diferentes concentrações (p/p), sendo as misturas depois colocadas em vasos de plástico (750 ml) (Tabela 1). Para cada condição foram realizadas cinco réplicas. Após a introdução em vaso, as misturas de solo foram deixadas a estabilizar por duas semanas, numa sala de crescimento de culturas com temperatura de 20 °C e fotoperíodo de 16 h dia/8 h noite. Os vasos foram regados em dias alternados, de modo a evitar a desidratação do solo. Após o período de estabilização (14 dias) foi realizada uma amostragem do solo (T0), tendo sido então semeada aveia (10 sementes por vaso). As sementes de aveia tinham sido previamente desinfetadas para prevenir o desenvolvimento de doenças, por submersão em álcool etílico (70 % v/v) por 10 minutos, seguida de submersão em lixívia comercial (20 % v/v) durante 7 minutos e de lavagens com água destilada (pelo menos 5 lavagens). Uma segunda amostragem do solo (T1) foi realizada 14 dias após a sementeira e uma terceira amostragem (T2) foi realizada 14 dias após a anterior, para avaliar o efeito do EucaBio_sólido na comunidade microbiana ao longo do tempo. Em cada um dos tempos de amostragem e em cada vaso, a recolha de amostras foi realizada em triplicado com um cilindro coletor com 10 cm de altura e 2 cm de diâmetro. Por cada vaso, todas as réplicas (recolhidas em pontos equidistantes) foram colocadas em tubos Falcon® de 50 mL estéreis e misturadas por homogeneização. Apenas uma parte da mistura foi guardada em 2 tubos Eppendorf de 2 mL e armazenada a - 80 °C. Tabela 1: Quantidades de EucaBio_sólido e de solo agrícola previamente recolhido em Vairão (Vila do Conde, Portugal), para preparação das diferentes concentrações de EucaBio_sólido a serem estudadas. Concentrações EucaBio_sólido (g) Solo (g) Controlo 0 400 2,5% 10 5% 20 10% 40 2.1.2. Extração de DNA O DNA do solo foi extraído de cada amostra utilizando o kit de extração DNeasy PowerSoil Pro Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha), seguindo as recomendações do fabricante. Após 20 amostradas, as curvas tendem a estabilizar, atingindo-se um plateau . Se a curva de rarefação atingir o plateau , significa que a profundidade na amostragem foi adequada, indicando que o número de amostras ( reads sequenciadas) é suficiente e o seu incremento não teria um efeito significativo no número ASVs. A maioria das curvas de rarefação relativas aos dados das bactérias (Figura 6) aparentam estar perto de atingir plateau, principalmente às curvas referentes à concentração 10 %, indicando que a profundidade na amostragem foi adequada. É igualmente evidente uma diferença a nível da riqueza bacteriana nas diferentes concentrações de EucaBio_sólido. A situação controlo, sem bio-herbicida adicionado, apresenta uma maior riqueza, vindo esta a diminuir com concentrações crescentes de EucaBio_sólido. Apenas pela observação das curvas de rarefação, é possível constatar a existência de quatro conjuntos de curvas, sugerindo que a condição que terá maior impacto na riqueza bacteriana será a concentração de bio-herbicida. Figura 6: Curvas de rarefação da comunidade bacteriana obtidas por sequenciação da região 16S do rRNA presente nas amostras de solo com diferentes concentrações de EucaBio_sólido. A variação na diversidade da comunidade bacteriana foi determinada por diferentes índices de diversidade (Figura 7). Os índices de diversidade mostraram diferenças estatisticamente significativas na comunidade bacteriana presente nas amostras de solo com diferentes concentrações de bio-herbicida. O controlo apresenta uma riqueza ( S ) e diversidade ( 1-D e H ´) superior, seguindo-se das concentrações de EucaBio_sólido de 2,5 %, 5 % e 10 %. Quando é considerada a variação temporal, verificam-se diferenças menos significativas, apesar de haver uma tendência para uma redução da diversidade ao longo do tempo (Figura 7; Anexo 2). No seu conjunto, os resultados indicam que o aumento da concentração de bio-herbicida apresenta um impacto negativo na riqueza e diversidade da comunidade bacteriana, que se acentua quanto 21 maior o período de contacto. Resultados semelhantes são encontrados em estudos realizados com herbicidas sintéticos (Moretto et al ., 2017; Wang et al., 2022; Bhardwaj et al., 2024). Em termos da composição da comunidade bacteriana no conjunto de todas as amostras analisadas, verificou-se que os ASVs se distribuíram por 13 filos, 36 classes, 74 ordens, 142 famílias, 224 géneros e 134 espécies. De salientar que muitos ASVs não foram classificados nos níveis taxonómicos mais específicos. No conjunto das comunidades bacterianas analisadas (Figura 8), os filos que apresentam maior riqueza são Proteobacteria (37 % das ASVs), Actinobacteria (21 %), Acidobacteria (10 %), seguido de Planctomycetes (7 %), Bacteroidetes (5 %) e Verrucomicrobiae (5 %). No que diz respeito ao filo Proteobacteria foram identificadas três classes muito representadas, Alphaproteobacteria (47 % das ASVs de membros de Proteobacteria ), Gammaproteobacteria (41%) e Deltaproteobacteria (12 %). Para o filo Actinobacteria mais de metade dos membros pertencem à classe Actinobacteria (51 % das ASVs de membros de Actinobacteria ), enquanto os restantes pertencem às classes Thermoleophilia (36 %) e Acidimicrobiia (9 %). O filo Acidobacteria é caracterizado pela predominância da classe Acidobacteriia (60 % das ASVs de membros do filo). No filo Planctomycetes , a classe Figura 7: Diversidade da comunidade bacteriana encontrada nas amostras de solos. S: riqueza microbiana, 1–D: índice de Gini-Simpson e H´: índice de Shannon. Diferentes letras significam diferenças estatisticamente significativas, onde as letras maiúsculas (A-D) se referem à diferença entre concentrações de EucaBio_sólido e as minúsculas (a-c) entre os tempos de aplicação de cada concentração(Anexo 2). 22 Planctomycetacia é a mais expressiva (54 % das ASVs de membros do filo), sendo no filo Bacteroidetes a classe Bacteroidia (88 %). Figura 8: Riqueza das bactérias isoladas do solo agrícola com incorporação de EucaBio_sólido, considerando todas as amostras. Gráfico criado em Krona (Ondov et al ., 2011). Em termos de abundância, a maioria das ASVs pertenceram ao filo Proteobacteria (58 % do número de sequências analisadas), sendo as restantes pertencentes aos filos Actinobacteria (13 %), Acidobacteria (9 %) e Bacteroidetes (4 %) (Figura 9). Uma estrutura semelhante das comunidades bacterianas foi descrita em solos agrícolas (Lee et al., 2020), solos de cultura de milho (Peiffer et al., 2013) e de cultura de soja (Mendes et al ., 2014). O filo Proteobacteria é dominado pelas classes Gammaproteobacteria (63 % das sequências de Proteobacteria ), Alphaproteobacteria (33 %) e Deltaproteobacteria (4 %). O filo Actinobacteria é representado maioritariamente pela classe Actinobacteriia (57 % das sequências do filo), assim como o filo Acidobacteria pela classe Acidobacteria (78 %) e, por fim o filo Bacteroidetes pela classe Bacteroidia (91 %). Os resultados revelam assim que o filo Proteobacteria é o mais rico e abundante na comunidade bacteriana presente nas amostras de solo, sendo as classes Alphaproteobacteria e Gammaproteobacteria as mais representativas em termos de riqueza e abundância. A prevalência deste filo vai de acordo com estudos realizados em diversos tipos de 23 solos, entre eles solo agrícola e solo florestal (Lladó et al ., 2017). Importa ainda destacar a dominância de membros da família Burkholderiaceae. Figura 9: Abundância relativa das bactérias isoladas do solo agrícola com incorporação de EucaBio_sólido, considerando todas as amostras. Gráfico criado em Krona (Ondov et al ., 2011). A abundância relativa de cada filo e família foi comparada nas comunidades bacterianas, provenientes de amostras com diferentes concentrações de EucaBio_sólido e tempos de amostragem (Figura 10). A abundância de bactérias pertencentes ao filo dominante Proteobacteria aumenta com a concentração do bio-herbicida. Nas amostras de solo sem bio-herbicida, a abundância de Proteobacteria é aproximadamente 40 %. É verificado um aumento para 54 %, 64 % e 73 % com o aumento de 2,5 %, 5 % e 10 % de EucaBio_sólido, respetivamente. O aumento da abundância relativa deste filo com o aumento da concentração de bio-herbicida vai de acordo com vários estudos realizados com herbicidas sintéticos (Liu et al., 2020; Pertile et al., 2021; Wang et al., 2022). Pertile et al. (2021) indica que este aumento é devido à potencial capacidade dos membros deste filo metabolizarem os herbicidas sintéticos. Esta pode ser também uma hipótese para explicar o aumento de Proteobacteria com o aumento da concentração de EucaBio. Os filos Acidobacteria e Actinobacteria alternam entre os segundos e terceiros filos mais abundantes. Enquanto que o filo Acidobacteria não apresenta uma alteração significativa com o aumento da concentração do bio-herbicida, o filo Actinobacteria apresenta uma diminuição da sua abundância 24 com o aumento da concentração de EucaBio_sólido. O mesmo acontece com os filos Bacteroidetes , Verrucomicrobia , Planctomycetes , Patescibacteria entre outros. Em relação à abundância relativa das famílias (Figura 10 (B)), verifica-se que a família Burkholderiaceae ( Proteobacteria ) vai aumentando com as diferentes concentrações do bioherbicida. Na ausência de EucaBio_sólido (controlo), a abundância relativa de Burkholderiaceae é aproximadamente 6,5 %, mas esta aumenta com a concentração de bio-herbicida (18,5 %, 26,3 % e 33,7 % nas concentrações de 2,5 %, 5 % e 10 % de EucaBio_sólido, respetivamente). Já a condição “tempo” apresenta o efeito contrário nas concentrações 5 % e 10 %, no qual a sua abundância em T0 é 28,0 % e 41,0 %, em T1 é 27,5 % e 31,7 % e em T2 é 23,4% e 28,5%. A família Burkholderiaceae é caracterizada pela presença de organismos ecologicamente diversos e contém organismos saprófitos, fitopatógenos, patógenos oportunistas, bem como patógenos primários para humanos e animais (Coenye, 2014). O género mais proeminente dentro desta família, é o género Burkholderia, caraterizado pelas suas propriedades biorremediadoras e biopesticidas, pela capacidade de sintetizar uma ampla gama de compostos antimicrobianos e, para além disso é capaz de fixar nitrogénio, formar nódulos radiculares e pode atuar como patógenos de plantas (Coenye, 2014; Depoorter et al., 2016). Outro género importante é o género Pseudomonas, que desempenha um papel fundamental no solo para promoção do crescimento das plantas e no controlo de patógenos (Sah & Singh, 2016). Este também possui membros que são patógenos de plantas, insetos e humanos (Silby et al., 2011). Esta família exerce um papel importante na biologia do solo, nas relações planta-microrganismo e na saúde humana, e pode ser benéfica ou prejudicial, dependendo da espécie e do contexto em que se encontra. O mesmo efeito é observado para a família Rhodonobacteraceae ( Proteobacteria ), que também se apresenta mais abundante nas concentrações mais elevadas de EucaBio_sólido, sendo aproximadamente 0,3 % no controlo, 3,4 %, 8,5 % e 17 % nas concentrações de 2,5 %, 5 % e 10 % de EucaBio_sólido, respetivamente. Esta família é caraterizada por estar profundamente envolvida no ciclo biogeoquímico do enxofre e do carbono e na simbiose com micro e macrorganismos aquáticos (Pujalte et al ., 2014). Encontra-se ainda envolvida no ciclo de nitrogénio, promovendo assim o crescimento vegetal por meio da fixação de nitrogénio, que é essencial para o desenvolvimento das plantas (Hirsch & Mauchline, 2015; Li et al., 2018). Apesar de não ser tão evidente, outras famílias são igualmente afetadas positivamente pela maior concentração de EucaBio_sólido, como é o caso de Acidobacteriaceae ( Subgroup 1 ) ( Acidobacteria ) e Rhizobiaceae ( Proteobacteria ). Em contraste, as famílias Pedosphaeraceae ( Verrucomicrobia ) e Xanthobacteraceae ( Proteobacteria ) são afetadas negativamente pelo bio-herbicida, uma vez que a sua abundância diminui com as 25 concentrações crescentes de herbicida. Na ausência de bio-herbicida (controlo), a família Pedosphaeraceae apresenta aproximadamente 5,2 % de abundância, valor esse que diminui para 1,8 %, 0,9 % e 0,6 %, com as concentrações de 2,5 %, 5 % e 10 % de bio-herbicida, respetivamente. Já a abundância da família Xanthobacteraceae reduz 3,8 %, 2,8 %, 2 % e 1,1 %, nas mesmas amostras, respetivamente. A família Xanthobacteraceae , possui o género Azorhizobium que consiste inteiramente em simbiontes fixadores de nitrogénio que vivem em associação com plantas leguminosas (Oren, 2014). Esta diminuição indica um potencial efeito negativo da aplicação de EucaBio_sólido na sua maior concentração (10 %) no desenvolvimento das espécies agrícolas. Figura 10: Abundâncias relativas dos filos bacterianos (A) e das principais famílias bacterianas (B) reveladas pela sequenciação do amplicão 16S das amostras de solo em diferentes condições. São representadas também os filos a que pertencem cada família. Other - restantes famílias presentes em menor percentagem. Gráficos criados no Microsoft Excel (Microsoft Corporation, 2018). A B Abundâ ncia (%) Abundâ ncia (%) 26 3.3.2. Comunidade fúngica Assim como para a comunidade bacteriana, a diversidade da comunidade fúngica foi comparada entre as amostras de solo com diferentes concentrações de EucaBio_sólido, através da preparação de curvas de rarefação e determinação de índices de diversidade, ambos normalizados para o número mínimo de sequências em todas as amostras (n = 14.002). Tal como verificado para as comunidades bacterianas, as curvas de rarefação aparentam atingir plateau (Figura 11) , principalmente no caso das comunidades fúngicas provenientes das amostras com maior concentração de EucaBio_sólido, indicando que o esforço de amostragem foi suficiente para representar estas comunidade. Já as curvas das condições com menor percentagem de bio-herbicida, não aparentam estar a atingir plateau demostrando que a profundidade da amostragem deveria ter sido maior para ter uma boa representação da comunidade fúngica. As curvas de rarefação também indicam uma diferença na riqueza entre as condições, ocorrendo uma redução da riqueza com o aumento da concentração de EucaBio_sólido. Figura 11: Curvas de rarefação da comunidade fúngica obtidas por sequências da região ITS do rRNA das amostras de solo com diferentes concentrações de EucaBio_sólido. A variação na diversidade da comunidade fúngica foi feita pela determinação dos parâmetros de diversidade (Figura 12), que se alteram significativamente nas comunidades presentes nas amostras de solo agrícola. A riqueza ( S ) e a diversidade ( 1-D e H) são superiores para o controlo e vão diminuindo com o aumento da concentração de EucaBio_sólido. Esta diminuição é concordante com estudos que avaliaram atividade antifúngica de diferentes concentrações de óleos essenciais de eucalipto (Kouki et al., 2023; Ayed et al., 2023). Uma diminuição da riqueza e diversidade das comunidades fúngicas foi também observada em estudos 27 realizados com herbicidas sintéticos (Wang et al ., 2022; Bhardwaj et al ., 2024). Entre as diferentes condições existentes neste trabalho, concentração e tempo, esta análise indica que a concentração é o fator com maior impacto na riqueza e diversidade fúngica. A variação temporal apresenta um impacto menor, sendo ainda assim possível observar uma redução da diversidade ao longo do tempo em alguns casos (Figura 12). Figura 12 : Diversidade da comunidade fúngica encontrada nas amostras de solos. S : riqueza microbiana, 1–D : índice de Gini-Simpson e H´ : índice de Shannon. Diferentes letras significam diferenças estatisticamente significativas, onde as letras maiúsculas (A - D) se referem à diferença entre concentrações e as minúsculas (a - c) entre os tempos de cada concentração (Anexo 2). A comunidade fúngica total é composta por ASVs que são referentes a 27 filos, 74 classes, 142 ordens, 196 famílias, 337 géneros e 33 espécies. É importante referir que muitos ASVs não foram classificados até aos níveis taxonómicos mais específicos. Nas comunidades fúngicas analisadas, os filos que apresentam maior riqueza são Ascomycota (68 % das ASVs), Basidiomycota (12 %), Glomeromycota (8 %), Mortierellomycota (5 %), Mucoromycota (4 %) (Figura 13). Dentro do filo Ascomycota, o maior número de ASVs é encontrado na classe Sordariomycetes (43 % das ASVs) e Eurotiomycetes (27 %), seguida de Dothideomycetes (20 %), Leotiomycetes (6 %) e Saccharomycetes (2 %). O filo Basidiomycota é representado por Agaricomycetes (40 % das ASVs), Tremellomycetes (40 %), Atractiellomycetes (13 %) e Microbotryomycetes (6 %). O filo Glomeromycota é representado em grande parte pela classe Glomeromycetes (63 %), enquanto Mortierellomycota é representado pela classe Mortierellomycetes (100 %) e Mucoromycota pela classe Mucoromycetes (81 %). 28 Figura 13: Riqueza dos fungos isolados do solo, considerando todas as amostras. Gráfico criado em Krona (Ondov et al ., 2011). A abundância relativa revelou que o filo mais abundante é Ascomycota (58 % do número de sequências analisadas), seguido de Basidiomycota (27 %), Mortierellomycota (7 %), Mucoromycota (4 %) e Glomeromycota (3 %) (Figura 14). As classes Sordariomycetes (46 % das sequências), Eurotiomycetes (28 %) e Dothideomycetes (14 %) são as mais abundantes no filo Ascomycota. No que diz respeito ao filo Basidiomycota, as classes Tremellomycetes (46 % das sequências) e Atractiellomycetes (25 %) são as mais representativas. No geral, o filo Ascomycota apresentou maior riqueza e abundância relativa na comunidade fúngica presente nas amostras de solo, seguindo-se pelo filo Basidiomycota. A predominância destes filos no solo está de acordo com estudos anteriores sobre o solo (Lim et al., 2010; Fierer, 2017), incluindo solos agrícolas (Choudhary et al., 2022). As classes Sordariomycetes e Eurotiomycetes são as mais ricas e abundantes. 29 Figura 14: Abundância relativa dos fungos isolados do solo, considerando todas as amostras. Gráfico criado em Krona (Ondov et al ., 2011). As abundâncias relativas de cada filo e família foi comparada nas comunidades fúngicas entre as diferentes condições experimentais (Figura 15). É possível observar que os filos mais abundantes em todas as condições são Ascomycota e Basidiomycota, e ambos apresentam um ligeiro aumento entre o controlo e as restantes condições. Isto é, no controlo têm aproximadamente 44 % (Ascomycota) e 15 % (Basidiomycota) de abundância relativa, enquanto que nas condições 2,5 %, 5 % e 10 % têm aproximadamente 62 %/30 %, 61 %/31 % e 59 %/32 % (Ascomycota/Basidiomycota), respetivamente. Alguns estudos sobre o impacto de herbicidas no microbioma demostram efeitos semelhantes nos dois filos anteriormente referidos (Wang et al., 2022; Ma et al., 2023). Outro filo que se torna mais abundante é Mucoromycota, que tinha uma abundância relativa muito reduzida no controlo (aproximadamente 0,5 %) e aumenta para aproximadamente 3 %, 5 % e 7 % nas concentrações 2,5 %, 5 % e 10 %, respetivamente. Os filos Chytridiomycota, Glomeromycota e Mortierellomycota revelam ser afetados negativamente pelo bio-herbicida, sendo isto demonstrado pela diminuição da sua abundância com o aumento da concentração do EucaBio_sólido. Uma análise semelhante foi realizada quanto à abundância relativa das famílias presente nas amostras de solo (Figura 15(B)). As famílias Aspergillaceae (Ascomycota), Trichocomaceae 36 Comeau, A. M., Douglas, G. M., & Langille, M. G. I. (2017). Microbiome helper: a custom and streamlined workflow for microbiome research. MSystems, 2(1). Costa, D., Fernandes, T., Martins, F., Pereira, J. A., Tavares, R. M., Santos, P. M., ... & Lino-Neto, T. (2021). Illuminating Olea europaea L. endophyte fungal community. Microbiological Research, 245, 126693. Costa, D., Tavares, R. M., Baptista, P., & Lino-Neto, T. (2020). Cork oak endophytic fungi as potential biocontrol agents against Biscogniauxia mediterranea and Diplodia corticola . Journal of Fungi, 6, 287 Costa, D., Tavares, R. M., Baptista, P., & Lino-Neto, T. (2022). The influence of bioclimate on soil microbial communities of cork oak. BMC microbiology, 22, 163. Costa, P. S., Reis, M. P., Ávila, M. P., Leite, L. R., de Araújo, F. M., Salim, A. C., ... & Nascimento, A. M. (2015). Metagenome of a microbial community inhabiting a metal-rich tropical stream sediment. PLoS One, 10, e0119465. Dayan, F. E., Barker, A., Bough, R., Ortiz, M., Takano, H., & Duke, S. O. (2019). Herbicide mechanisms of action and resistance. De A, Bose R, Kumar A, Mozumdar S (eds) (2014) Worldwide pesticide use. In: Targeted delivery of pesticides using biodegradable polymeric nanoparticles. Springer, Berlin, pp 5–6 de Souza Barros, V. M., Pedrosa, J. L. F., Gonçalves, D. R., Medeiros, F. C. L. D., Carvalho, G. R., Gonçalves, A. H., & Teixeira, P. V. V. Q. (2021). Herbicides of biological origin: A review. The Journal of Horticultural Science and Biotechnology, 96, 288-296. Decaëns, T. (2010), Macroecological patterns in soil communities. Global Ecology and Biogeography, 19: 287-302. Denton, B., (2007). Advances in phytoremediation of heavy metals using plant growth promoting bacteria and fungi. MMG 445. Basic Biotechnol. 3, 1-5. Depoorter, E., Bull, M. J., Peeters, C., Coenye, T., Vandamme, P., & Mahenthiralingam, E. (2016). Burkholderia : an update on taxonomy and biotechnological potential as antibiotic producers. Applied microbiology and biotechnology, 100, 5215-5229. Dhakad, A. K., Pandey, V. V., Beg, S., Rawat, J. M., & Singh, A. (2018). Biological, medicinal and toxicological significance of Eucalyptus leaf essential oil: a review. Journal of the science of food and agriculture, 98, 833–848. Dighton J. (2007). Nutrient cycling by saprotrophic fungi in terrestrial habitats. In: Kubicek CP, Druzhinina IS (eds) The Mycota IV Environmental and microbial relationships, 2nd edn. Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, pp 287-300 Doehlemann, G., Ökmen, B., Zhu, W., & Sharon, A. (2017). Plant pathogenic fungi. Microbiology spectrum, 5, 5-1. Dominati, E., Patterson, M., & Mackay, A. (2010). A framework for classifying and quantifying the natural capital and ecosystem services of soils. Ecological economics, 69, 18581868. dos Santos P, Matias H, Deus E, Águas A, Silva JS (2015) Fire effects on capsules and encapsulated seeds from Eucalyptus globulus in Portugal. Plant Ecology 216: 1611-1621 37 Duke SO (1988) Polycyclic alkanoic acids. In: Herbicides Chemistry, Degradation and Mode of Action, Vol. 3 (eds PC Kearney & DD Kaufman), 71–116. Marcel Dekker, New York, USA Duke, S. O., & Powles, S. B. (2008). Glyphosate: a once‐in‐a‐century herbicide. Pest Management Science: formerly Pesticide Science, 64, 319-325. Duke, S.O. and Dayan, F.E. (2018) Herbicides. John Wiley & Sons, Chichester. Edgar, R. C. (2013). UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nature methods, 10, 996-998. Ezequiel, J., Valente, C., Ferreira, D., Marques, C., Monteiro, R., Alarico, L., ... & Máguas, C. A Regeneração natural do eucalipto em Portugal-desafios e constrangimentos. Título: as plantações de eucalipto e os recursos naturais em portugal: avanços recentes e desafios, 133. Fabião A, Carneiro M, Lousã M, Madeira M (2007) Os impactes do eucaliptal na biodiversidade da vegetação sob coberto. In AM Alves, JS Pereira, JMN Silva, eds. O Eucaliptal em Portugal: Impactes Ambientais e Investigação Científica, Lisboa: ISAPress, 177-208 Fairman, Thomas A.; Nitschke, Craig R.; Bennett, Lauren T. (2015). Too much, too soon? A review of the effects of increasing wildfire frequency on tree mortality and regeneration in temperate eucalypt forests. International Journal of Wildland Fire. FAO, IFAD, UNICEF, WFP and WHO, (2022) The State of Food Security and Nutrition in the World 2022. Repurposing food and agricultural policies to make healthy diets more affordable. Rome, FAO. Fernandes, P. A. T. (2016). Natural regeneration and expansion capacity of forestry species: Pinus pinaster and Eucalyptus globulus (Doctoral dissertation, Universidade de Lisboa (Portugal)). Fierer, N. (2017). Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nature Reviews Microbiology, 15, 579-590. Flannigan M, Cantin AS, de Groot WJ, Wotton M, Newbery A, Gowman LM (2013) Global wildland fire season severity in the 21st century. Forest Ecology and Management 294: 54-61 Frisvad, J. C., & Samson, R. A. (2004). Polyphasic taxonomy of Penicillium subgenus Penicillium . A guide to identification of food and air-borne terverticillate Penicillia and their mycotoxins. Studies in mycology, 49, 1-174. Guerrero, F., Carmona, C., Hernández, C., Toledo, M., Arriagada, A., Espinoza, L., Bergmann, J., Taborga, L., Yañez, K., Carrasco, Y., & Muñoz, A. A. (2022). Drivers of Flammability of Eucalyptus globulus Labill Leaves: Terpenes, Essential Oils, and Moisture Content. Forests, 13, 908. He, Y., Pantigoso, H. A., Wu, Z., & Vivanco, J. M. (2019). Co‐inoculation of Bacillus sp. and Pseudomonas putida at different development stages acts as a biostimulant to promote growth, yield and nutrient uptake of tomato. Journal of applied microbiology, 127, 196-207. Helander, M., Saloniemi, I., & Saikkonen, K. (2012). Glyphosate in northern ecosystems. Trends in plant science, 17, 569-574. Hirsch, P. R., & Mauchline, T. H. (2015). The importance of the microbial N cycle in soil for crop plant nutrition. Advances in applied microbiology, 93, 45-71. 38 Hughes, J. B., & Bohannan, B. J. (2004). Section 7 update: application of ecological diversity statistics in microbial ecology. In Molecular microbial ecology manual. Hussain, M. S., Fareed, S., Ansari, S., Rahman, M. A., Ahmad, I. Z., & Saeed, M. (2012). Current approaches toward production of secondary plant metabolites. Journal of pharmacy & bioallied sciences, 4, 10–20. Ibáñez Jaime, M. D., & Blázquez Ferrer, M. A. (2018). Post-emergent herbicidal activity of Eucalyptus globulus Labill. essential oil. Nereis, 10, 25-36. ICNF, 2019. IFN6 – Principais resultados – relatório sumário, 34 pp, Instituto da Conservação da Natureza e das Florestas. Lisboa. Illumina. (2013). 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation Preparing 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. Illumina Technical Document. Jha, C. K., & Saraf, M. (2015). Plant growth promoting rhizobacteria (PGPR). J. Agric. Res. Dev, 5, 108-119. Johnson, N. C., & Gehring, C. A. (2007). Mycorrhizas: symbiotic mediators of rhizosphere and ecosystem processes. In The Rhizosphere (pp. 73-100). Academic Press. Joshi NA, Fass JN (2011) Sickle: a sliding-window, adaptive, quality-based trimming tool for FastQ files (Version 1.33). Kalabokidis K, & Palaiologou P. 2019. Mediterranean Forest Fuels. Encyclopedia of Wildfires and Wildland-Urban Interface (WUI) Fires; Manzello, SL, Ed, 1-13. Kannan, V. R., Bastas, K. K., & Devi, R. S. (2015). 20 Scientific and Economic Impact of Plant Pathogenic Bacteria. Sustainable approaches to controlling plant pathogenic bacteria, 369. Kassambara A (2023). ggpubr: 'ggplot2' Based Publication Ready Plots. R package version 0.6.0. Keeley J (2012) Fire in Mediterranean ecosystemsa comparative overview. Israel Journal of Ecology and Evolution 58: 123-135 Khatoon, Z., Huang, S., Rafique, M., Fakhar, A., Kamran, M. A., & Santoyo, G. (2020). Unlocking the potential of plant growth-promoting rhizobacteria on soil health and the sustainability of agricultural systems. Journal of environmental management, 273, 111118. Kõljalg, U., Nilsson, H. R., Schigel, D., Tedersoo, L., Larsson, K. H., May, T. W., ... & Abarenkov, K. (2020). The taxon hypothesis paradigm—On the unambiguous detection and communication of taxa. Microorganisms, 8, 1910. Kouki, H., Amri, I., Souihi, M., Pieracci, Y., Trabelsi, I., Hamrouni, L., ... & Mabrouk, Y. (2023). Chemical composition, antioxidant, herbicidal and antifungal activities of leaf essential oils from three Tunisian Eucalyptus species. Journal of Plant Diseases and Protection, 130, 14111422. Kudsk, P. and Streibig, J.C. (2003), Herbicides – a two-edged sword. Weed Research, 43: 90-102. Latha, P. C., & Gopal, H. (2010). Effect of herbicides on soil microorganisms. Indian Journal of Weed Science, 42, 217-222. 39 Lear, G., Dickie, I., Banks, J., Boyer, S., Buckley, H. L., Buckley, T. R., ... & Holdaway, R. (2018). Methods for the extraction, storage, amplification and sequencing of DNA from environmental samples. New Zealand Journal of Ecology, 42, 10-50A. Lee, S. A., Kim, J. M., Kim, Y., Joa, J. H., Kang, S. S., Ahn, J. H., ... & Weon, H. Y. (2020). Different types of agricultural land use drive distinct soil bacterial communities. Scientific Reports, 10, 17418. Lahti, L., Shetty, S., Blake, T., & Salojarvi, J. (2017). Tools for microbiome analysis in R. Version, 1, 28. Li, Y., Tang, K., Zhang, L., Zhao, Z., Xie, X., Chen, C. T. A., ... & Zhang, Y. (2018). Coupled carbon, sulfur, and nitrogen cycles mediated by microorganisms in the water column of a shallowwater hydrothermal ecosystem. Frontiers in microbiology, 9, 2718. Lim, Y. W., Kim, B. K., Kim, C., Jung, H. S., Kim, B. S., Lee, J. H., & Chun, J. (2010). Assessment of soil fungal communities using pyrosequencing. The Journal of Microbiology, 48, 284-289. Liu, W., Zhao, Q., Zhang, Z., Li, Y., Xu, N., Qu, Q., ... & Qian, H. (2020). Enantioselective effects of imazethapyr on Arabidopsis thaliana root exudates and rhizosphere microbes. Science of The Total Environment, 716, 137121. Liu, Y., Stanturf, J., Goodrick, S. (2010). Trends in global wildfire potential in a changing climate. Forest Ecol. Manage. 259, 686–697 Lladó, S., López-Mondéjar, R., & Baldrian, P. (2017). Forest soil bacteria: diversity, involvement in ecosystem processes, and response to global change. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 81, e00063-16. Lyons, R., Stiller, J., Powell, J., Rusu, A., Manners, J. M., & Kazan, K. (2015). Fusarium oxysporum triggers tissue-specific transcriptional reprogramming in Arabidopsis thaliana . PLoS one, 10, e0121902. Ma, Q., Li, Q., Wang, J., Parales, R. E., Li, L., & Ruan, Z. (2023). Exposure to three herbicide mixtures influenced maize root-associated microbial community structure, function and the network complexity. Environmental Pollution, 336, 122393. Magurran, A. E. (1988). Ecological diversity and its measurement. Princeton university press. Maharjan, S., Shrestha, B. B., & Jha, P. K. (2007). Allelopathic effects of aqueous extract of leaves of Parthenium hysterophorus L. on seed germination and seedling growth of some cultivated and wild herbaceous species. Scientific World, 5, 33-39. Maksymiv, I. (2015). Pesticides: benefits and hazards. Journal of Vasyl Stefanyk Precarpathian National University, 2, 70-76. Mansfield, J., Genin, S., Magori, S., Citovsky, V., Sriariyanum, M., Ronald, P., ... & Foster, G. D. (2012). Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Molecular plant pathology, 13, 614-629. Marchante, H., Morais, M., Freitas, H., & Marchante, E. (2014). Guia prático para a identificação de plantas invasoras em Portugal. Imprensa da Universidade de Coimbra/Coimbra University Press. 40 Marin-Morales, M. A., de Campos VenturaCamargo, B., & Hoshina, M. M. (2013). Toxicity of herbicides: impact on aquatic and soil biota and human health. In A. J. Price, & J. A. Kelton (Eds.), Herbicides - Current Research and Case Studies in Use. IntechOpen. Marschner, P. (2023). Rhizosphere biology. In Marschner's Mineral Nutrition of Plants (pp. 587-614). Academic Press. Martins, P. M., Merfa, M. V., Takita, M. A., & De Souza, A. A. (2018). Persistence in phytopathogenic bacteria: do we know enough? Frontiers in Microbiology, 9, 1099. McMurdie PJ, Holmes S (2013) phyloseq: An R Package for Reproducible Interactive Analysis and Graphics of Microbiome Census Data. PLOS ONE 8(4): e61217. Mendes, L. W., Kuramae, E. E., Navarrete, A. A., Van Veen, J. A., & Tsai, S. M. (2014). Taxonomical and functional microbial community selection in soybean rhizosphere. The ISME journal, 8, 1577-1587. Microsoft Corporation. (2018). Microsoft Excel. Miransari, M. (2016). Soybeans, stress, and plant growth-promoting rhizobacteria. In Environmental Stresses in Soybean Production (pp. 177-203). Academic Press. Moço, VEDOPM. 2019. Impactes da intensidade de mobilização do solo em plantações de eucalipto. Dissertação doutoral, Escola Superior Agrária de Coimbra, IPC Morais, M.C., Marchante, E. & Marchante, H. (2017) – “Big troubles are already here: risk assessment protocol shows high risk of many alien plants present in Portugal”. Journal for Nature Conservation 35: 1–12. Moretto, J. A. S., Altarugio, L. M., Andrade, P. A., Fachin, A. L., Andreote, F. D., & Stehling, E. G. (2017). Changes in bacterial community after application of three different herbicides. FEMS Microbiology Letters, 364, fnx113. Morsi, M. M., & Abdelmigid, H. M. (2016). Allelopathic activity of Eucalyptus globulus leaf aqueous extract on Hordeum vulgare growth and cytogenetic behavior. Aust J Crop Sci, 10, 15511556. Mousavi, B., Hedayati, M. T., Hedayati, N., Ilkit, M., & Syedmousavi, S. (2016). Aspergillus species in indoor environments and their possible occupational and public health hazards. Current medical mycology, 2, 36. Muthukumar, A., Raj, T. S., Prabhukarthikeyan, S. R., Kumar, R. N., & Keerthana, U. (2022). Pseudomonas and Bacillus : A biological tool for crop protection. In New and Future Developments in Microbial Biotechnology and Bioengineering (pp. 145-158). Elsevier. Naveh, Z. (1975). The evolutionary significance of fire in the Mediterranean region. Vegetatio 29,199-208. Nelson, K. M., Bisbing, S., Grossenbacher, D. L., Ritter, M., & Yost, J. M. (2021). Testing an invasion mechanism for Eucalyptus globulus : Is there evidence of allelopathy? In American Journal of Botany, 108, 607-615. Nikolenko, S. I., Korobeynikov, A. I., & Alekseyev, M. A. (2013, January). BayesHammer: Bayesian clustering for error correction in single-cell sequencing. In BMC genomics (Vol. 14, No. 1, pp. 1-11). BioMed Central. 41 Nji, Q. N., Babalola, O. O., & Mwanza, M. (2023). Soil Aspergillus species, pathogenicity and control perspectives. Journal of Fungi, 9, 766. Nurk, S., Bankevich, A., Antipov, D., Gurevich, A., Korobeynikov, A., Lapidus, A., ... & Pevzner, P. A. (2013). Assembling genomes and mini-metagenomes from highly chimeric reads. In Research in Computational Molecular Biology: 17th Annual International Conference, RECOMB 2013, Beijing, China, April 7-10, 2013. Proceedings 17, 158-170. Springer Berlin Heidelberg. O’Reilly-Wapstra, J. M., Humphreys, J. R., & Potts, B. M. (2007). Stability of genetic-based defensive chemistry across life stages in a Eucalyptus species. Journal of Chemical Ecology, 33, 1876-1884. Oksanen J, Simpson G, Blanchet F, Kindt R, Legendre P, Minchin P, O'Hara R,Solymos P, Stevens M, Szoecs E, Wagner H, Barbour M, Bedward M, Bolker B,Borcard D, Carvalho G, Chirico M, De Caceres M, Durand S, Evangelista H,FitzJohn R, Friendly M, Furneaux B, Hannigan G, Hill M, Lahti L, McGlinn D,Ouellette M, Ribeiro Cunha E, Smith T, Stier A, Ter Braak C, Weedon J (2022)._vegan: Community Ecology Package_. R package version 2.6-4. Oliveira T, Ezequiel J, Marques C, Muñoz L, Maggiolli S, Teixeira C, Bandeira J, Pereira J. (2021)"O Eucalipto e o Fogo em Portugal nos Últimos 40 Anos" in Pestana M. (editor). As plantações de eucalipto e os recursos naturais em Portugal. Sétimo caderno técnico da Revista Silva Lusitana, Edição INIAV, ISBN 978-972-5797. Ondov, B. D., Bergman, N. H., & Phillippy, A. M. (2011). Interactive metagenomic visualization in a Web browser. BMC bioinformatics, 12, 1-10. Oren, A. (2014). The Family Xanthobacteraceae. In: Rosenberg, E., DeLong, E.F., Lory, S., Stackebrandt, E., Thompson, F. (eds) The Prokaryotes. Springer, Berlin, Heidelberg. Bowman, D. M., Williamson, G. J., Keenan, R. J., & Prior, L. D. (2014). A warmer world will reduce tree growth in evergreen broadleaf forests: evidence from Australian temperate and subtropical eucalypt forests. Global ecology and biogeography, 23, 925-934. Osteen, C. D., Fernandez-Cornejo, J. (2016). Herbicide use trends: A backgrounder. Choices 31 (4). Agricultural and Applied Economics Association. Ozimek E, Hanaka A. (2021). Mortierella species as the plant growth-promoting fungi present in the agricultural soils. Agriculture (Switzerland) 11: 7. Peiffer, J. A., Spor, A., Koren, O., Jin, Z., Tringe, S. G., Dangl, J. L., ... & Ley, R. E. (2013). Diversity and heritability of the maize rhizosphere microbiome under field conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences, 110, 6548-6553. Pereira, E., Coelho, V., Tavares, R.M., Lino-Neto, T., and Baptista, P. (2012) Effect of competitive interactions between ectomycorrhizal and saprotrophic fungi on Castanea sativa performance. Mycorrhiza 22: 41–49. Pertile, M., Sousa, R. M. S., Mendes, L. W., Antunes, J. E. L., de Souza Oliveira, L. M., de Araujo, F. F., ... & Araujo, A. S. F. (2021). Response of soil bacterial communities to the application of the herbicides imazethapyr and flumyzin. European Journal of Soil Biology, 102, 103252. Pinto, M., Soares, C., Martins, M., Sousa, B., Valente, I., Pereira, R., & Fidalgo, F. (2021). Herbicidal effects and cellular targets of aqueous extracts from young Eucalyptus globulus Labill. Leaves. Plants, 10, 1159. 42 Pinto, M., Sousa, B., Martins, M., Pereira, C., Soares, C., & Fidalgo, F. (2023). Unveiling the efficacy of pre-emergent application of young Eucalyptus globulus leaves as a weed control strategy: Bridging macroscopic effects and cellular responses. Plant Physiology and Biochemistry, 203, 108010. Potts BM, Vaillancourt RE, Jordan G, et al ., (2004) Exploration of the Eucalyptus globulus gene pool. In: Borralho N, Pereira JS, Marques C, Coutinho J, Madeira M and Tomé M (eds) Eucalyptus in a changing world - IUFRO Conference. RAIZ, Instituto de Investigação de Floresta e Papel, Aveiro, pp. 46-61 Potts, B. M., McGowen, M. H., Williams, D. R., Suitor, S., Jones, T. H., Gore, P. L., & Vaillancourt, R. E. (2008). Advances in reproductive biology and seed production systems of Eucalyptus : the case of Eucalyptus globulus . Southern Forests: a Journal of Forest Science, 70, 145-154. Price, A., & Kelton, J. (Eds.). (2013). Herbicides: Current Research and Case Studies in Use. BoD–Books on Demand. Puig, C. G., Álvarez-Iglesias, L., Reigosa, M. J., & Pedrol, N. (2013). Eucalyptus globulus leaves incorporated as green manure for weed control in maize. Weed science, 61, 154-161. Puig, C. G., Gonçalves, R. F., Valentão, P., Andrade, P. B., Reigosa, M. J., & Pedrol, N. (2018). The consistency between phytotoxic effects and the dynamics of allelochemicals release from Eucalyptus globulus leaves used as bioherbicide green manure. Journal of Chemical Ecology, 44, 658-670. Pujalte, M. J., Lucena, T., Ruvira, M. A., Arahal, D. R., & Macián, M. C. (2014). The family Rhodobacteraceae . Springer. Quarantin, A., Hadeler, B., Kröger, C., Schäfer, W., Favaron, F., Sella, L., & MartínezRocha, A. L. (2019). Different hydrophobins of Fusarium graminearum are involved in hyphal growth, attachment, water-air interface penetration and plant infection. Frontiers in Microbiology, 10, 751. Quast, C., Pruesse, E., Yilmaz, P., Gerken, J., Schweer, T., Yarza, P., ... & Glöckner, F. O. (2013). The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and webbased tools. Nucleic acids research, 41, D590-D596. R Core Team (2022). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. Rauwane, M. E., Ogugua, U. V., Kalu, C. M., Ledwaba, L. K., Woldesemayat, A. A., & Ntushelo, K. (2020). Pathogenicity and virulence factors of Fusarium graminearum including factors discovered using next generation sequencing technologies and proteomics. Microorganisms, 8, 305. Rebeiz, C. A., Montazer-Zouhoor, A., Hopen, H. J., & Wu, S. M. (1984). Photodynamic herbicides: 1. Concept and phenomenology. Enzyme and microbial technology, 6, 390-396. Reis, M. (2018). A floresta em Portugal: gestão, monoculturas (eucaliptização) e incêndios. Cerna: Revista galega de ecoloxía e medio ambiente, 79, 8-10. Rodríguez‐Díaz, M., Rodelas‐Gonzalés, B., Pozo‐Clemente, C., Martínez‐Toledo, M. V., & González‐López, J. (2008). A review on the taxonomy and possible screening traits of plant growth 43 promoting rhizobacteria. Plant‐Bacteria Interactions: Strategies and Techniques to Promote Plant Growth, 55-80. Roman, E. S., Beckie, H., Vargas, L., Hall, L., Rizzardi, M. A., & Wolf, T. M. (2007). Como funcionam os herbicidas: da biologia à aplicação (p. 152). Passo Fundo: Berthier. Romdhane, S., Devers-Lamrani, M., Barthelmebs, L., Calvayrac, C., Bertrand, C., Cooper, J. F., ... & Martin-Laurent, F. (2016). Ecotoxicological impact of the bioherbicide leptospermone on the microbial community of two arable soils. Frontiers in Microbiology, 7, 775. Ruuskanen, S., Fuchs, B., Nissinen, R., Puigbò, P., Rainio, M., Saikkonen, K., & Helander, M. (2023). Ecosystem consequences of herbicides: the role of microbiome. Trends in Ecology & Evolution. Sadlon AE, Lamson DW (2010) Immune-modifying and antimicrobial effects of Eucalyptus oil and simple inhalation devices. Alternative Medicine Review 15: 33-43 Sah, S., & Singh, R. (2016). Phylogenetical coherence of Pseudomonas in unexplored soils of Himalayan region. 3 Biotech, 6, 1-10. Santoyo, G., Orozco-Mosqueda, M. D. C., & Govindappa, M. (2012). Mechanisms of biocontrol and plant growth-promoting activity in soil bacterial species of Bacillus and Pseudomonas : a review. Biocontrol Science and Technology, 22, 855-872. Santoyo, G., Pacheco, C.H., Salmeron, J.H., Leon, R.H., 2017. The role of abiotic factors modulating the plant-microbe-soil interactions: toward sustainable agriculture. A review. Span. J. Agric. Res. 15, 13. Schmieder, R., & Edwards, R. (2011). Quality control and preprocessing of metagenomic datasets. Bioinformatics, 27, 863–864. Shameer, S., & Prasad, T. N. V. K. V. (2018). Plant growth promoting rhizobacteria for sustainable agricultural practices with special reference to biotic and abiotic stresses. Plant Growth Regulation, 84, 603-615. Sharma, A., Kumar, V., Shahzad, B., Tanveer, M., Sidhu, G. P. S., Handa, N., & Dar, O. I. (2019). Worldwide pesticide usage and its impacts on ecosystem. SN Applied Sciences, 1, 1446. Shemshura, O. N., Sadanov, A. K., Shemsheyeva, Z. N., Lozovicka, B., Kamzolova, S. V., & Morgunov, I. G. (2018). Antifungal potential of organic acids produced by Mortierella alpina . International Journal of Engineering and Technology (UAE), 7, 1218-1221. Sherwani SI, Arif IA, Khan HA (2015) Modes of action of different classes of herbicides. In A Price, J Kelton, L Sarunaite, eds, Herbicides, Physiology of Action, and Safety. IntechOpen: 165186 Silby, M. W., Winstanley, C., Godfrey, S. A., Levy, S. B., & Jackson, R. W. (2011). Pseudomonas genomes: diverse and adaptable. FEMS microbiology reviews, 35, 652-680. Graphpad software (1994). Graphpad software. San Diego, CA, USA Silva JN, Feith H, Pereira J C. 2007. Exploração e silvicultura pós-fogo em eucaliptais. O eucaliptal em Portugal-Impactes ambientais e investigação científica. ISAPress, Lisboa, 285-312 Silva JS., dos Santos P, Sério A, Gomes F (2016) Effects of heat on dehiscence and germination in Eucalyptus globulus Labill. International Journal of Wildland Fire 25, 478-483. 44 Silva, J. S., Nereu, M., Pinho, S., Queirós, L., Jesús, C., & Deus, E. (2021). Post-fire demography, growth, and control of Eucalyptus globulus wildlings. Forests, 12, 156. Smith, S.E. and Read, D.J. (2008) Mycorrhizal Symbiosis. 3rd Edition, Academic Press, London. Smith, S.E., Read, D.J., (2008). Mycorrhizal Symbiosis. third ed. Academic Press, San Diego Soares P, Tomé M, Pereira JS (2007) A produtividade do eucaliptal. In AM Alves, JS Pereira, JMN Silva, eds, O Eucaliptal em Portugal – Impactes Ambientais e Investigação Científica. ISAPress: 28-56 Souto XC, Bolaño JC, González L, Reigosa MJ (2001) Allelopathic effects of tree species on some soil microbial populations and herbaceous plants. Biol Plant 4:269–275. Sylvia, D.M. (2005). Mycorrhizal symbiosis. In: Sylvia, D.M., Fuhrmann, J.J., Hartel, P.G., Zuberer, D.A. (Eds.), Principles and Applications of Soil Microbiology. Pearson/Prentice Hall, Upper Saddle River, NJ, pp. 263282. Takano, H.K. and Dayan, F.E. (2020), Glufosinate-ammonium: a review of the current state of knowledge. Pest Manag Sci, 76: 3911-3925. Tedersoo, L., Bahram, M., Polme, S., Koljalg, U., Yorou, N. S., Wijesundera, R., ... Abarenkov, K. (2014). Global diversity and geography of soil fungi. Science, 346, 1256688– 1256688. Tomé, M., Almeida, M. H., Barreiro, S., Branco, M. R., Deus, E., Pinto, G., ... & RodríguezSoalleiro, R. (2021). Opportunities and challenges of Eucalyptus plantations in Europe: The Iberian Peninsula experience. European Journal of Forest Research, 140, 489-510. United Nations Department of Economic and Social Affairs, Population Division (2022). World Population Prospects 2022: Summary of Results. UN DESA/POP/2022/TR/NO. 3. Vega JA, Fernández C, Pe´rez-Gorostiaga P, Fonturbel T (2008) The influence of fire severity, serotiny, and post-fire management on Pinus pinaster Ait. recruitment in three burnt areas in Galicia (NW Spain). For Ecol Manag 256:1596–1603 Wang, Z., Wang, X., & Wang, T. (2022). Effects of imazethapyr on soybean root growth and soil microbial communities in sloped fields. Sustainability, 14, 3518. Warnes G, Bolker B, Bonebakker L, Gentleman R, Huber W, Liaw A, Lumley T, Maechler M, Magnusson A, Moeller S, Schwartz M, Venables B (2022). _gplots: Various R Programming Tools for Plotting Data_. R package version 3.1.3. White, T. J., Bruns, T., Lee, S. J. W. T., & Taylor, J. (1990). Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: a guide to methods and applications, 18, 315-322. Xu, J., Liu, B., Qu, Z. L., Ma, Y., & Sun, H. (2020). Age and species of Eucalyptus plantations affect soil microbial biomass and enzymatic activities. Microorganisms, 8, 811. Zhang, D. J., Zhang, J., Yang, W. Q., & Wu, F. Z. (2010). Potential allelopathic effect of Eucalyptus grandis across a range of plantation ages. Ecological Research, 25, 13-23. 45 6. Anexos Anexo 1: Processamento das reads fúngicas e bacterianas sequenciadas pelo Illumina MiSeq , utilizando DNA obtido de amostras de solo com diferentes concentrações de EucaBio conforme descrito na secção Material e Métodos. Fungos Bactérias Amostras Raw reads Merged reads Sequences clusted into ASVs Fungal sequences Raw reads Merged reads Sequences clusted into ASVs Bacterial sequences Control_T0_R1 47 497 33 293 28 222 22 359 79 995 62 187 29 928 29 637 Control_T1_R1 91 182 73 440 62 220 50 026 215 458 164 089 83 252 82 745 Control_T2_R1 85 943 67 736 57 428 45 197 68 714 53 003 25 885 25 751 Control_T0_R2 53 859 39 470 33 893 28 043 83 180 64 359 31 749 31 531 Control_T1_R2 88 939 71 701 60 249 48 293 70 555 52 722 26 947 26 738 Control_T2_R2 110 949 89 068 75 469 58 850 73 056 56 162 28 388 28 193 Control_T0_R3 51 628 38 125 32 272 28 117 96 169 74 437 37 743 37 503 Control_T1_R3 73 958 59 968 50 547 41 116 117 162 89 082 45 685 45 348 Control_T2_R3 93 369 76 821 64 056 52 174 83 044 63 929 32 842 32 668 Control_T0_R4 31 262 20 725 17 285 14 002 101 371 77 832 37 122 36 872 Control_T1_R4 83 016 62 563 51 714 41 920 82 295 61 673 31 763 31 555 Control_T2_R4 73 435 47 810 50 709 41 771 65 827 49 761 24 754 24 637 Control_T0_R5 47 276 34 790 29 600 19 531 60 246 46 246 23 005 22 801 Control_T1_R5 107 790 79 921 67 370 50 107 94 843 73 036 37 835 37 476 Control_T2_R5 71 775 58 683 49 786 38 276 62 788 55 191 29 661 29 476 2.5%_T0_R1 111 005 92 948 81 482 78 015 44 131 33 154 17 023 16 932 2.5%_T1_R1 161 068 135 542 118 196 113 273 76 392 59 028 32 437 32 226 2.5%_T2_R1 141 185 121 259 104 289 99 013 40 982 31 129 16 862 16 807 2.5%_T0_R2 76 021 61 170 53 470 51 604 76 261 59 366 32 035 31 909 2.5%_T1_R2 217 773 183 529 159 937 154 978 59 977 40 591 20 517 20 426 2.5%_T2_R2 108 196 92 686 79 674 77 319 48 618 37 690 20 710 20 624 2.5%_T0_R3 118 903 92 948 81 065 77 086 92 534 71 045 37 722 37 590 2.5%_T1_R3 135 663 113 635 98 023 90 855 97 209 74 569 40 125 39 816 2.5%_T2_R3 111 121 94 488 81 940 78 750 74 583 57 683 31 812 31 735 2.5%_T0_R4 71 690 58 456 50 827 48 660 74 168 58 103 29 815 29 632 2.5%_T1_R4 147 643 124 058 107 846 101 713 15 950 71 768 39 562 39 142 2.5%_T2_R4 96 003 80 956 69 596 66 635 81 114 62 507 32 784 32 639 2.5%_T0_R5 133 153 108 175 91 705 89 047 82 756 61 532 32 461 32 288 2.5%_T1_R5 155 883 129 890 112 616 104 959 67 409 51 149 27 999 27 761 2.5%_T2_R5 93 073 77 889 67 776 63 923 73 221 56 066 30 350 30 230 5%_T0_R1 136 188 114 481 99 875 92 184 99 354 78 231 44 147 44 046 5%_T1_R1 158 609 95 897 119 077 111 732 62 395 49 029 29 009 28 918 5%_T2_R1 110 868 94 098 82 359 79 832 94 482 74 203 43 277 43 197 5%_T0_R2 113 313 95 556 82 676 76 103 89 065 69 469 38 425 38 298 5%_T1_R2 204 143 172 269 150 527 141 925 90 742 70 567 35 604 35 507 5%_T2_R2 48 933 39 993 34 834 34 126 111 280 85 004 48 229 48 114 5%_T0_R3 119 264 101 838 89 256 80 550 68 655 54 243 30 826 30 748