Papel de la melatonina en los procesos inflamatorios mediados por mastocitos: Implicaciones clínica

FACULTAD MEDICINA Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular e Inmunología PAPEL DE LA MELATONINA EN LOS PROCESOS INFLAMATORIOS MEDIADOS POR MASTOCITOS: IMPLICACIONES CLÍNICAS. Tesis presentada por Dª Helena García Moreno para optar al grado de Doctor. Sevilla, 2018. Dª Mª DOLORES MALDONADO Y AIBAR, Doctora en Medicina y Cirugía, Profesora Titular de Universidad del Área de Inmunología del Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular e Inmunología de la Facultad de Medicina de Sevilla. CERTIFICA: Que Dª HELENA GARCÍA MORENO, Licenciada en Biología, ha realizado bajo mi dirección el trabajo titulado: PAPEL DE LA MELATONINA EN LOS PROCESOS INFLAMATORIOS MEDIADOS POR MASTOCITOS: IMPLICACIONES CLÍNICAS, reuniendo el mismo las condiciones necesarias para optar al grado de Doctor. Sevilla 9 de marzo de 2018, VºBº de la Directora de la Tesis La Doctoranda Dª Mª Dolores Maldonado y Aibar Dª Helena García Moreno UNIVERSIDAD DE SEVILLA Facultad de Medicina Dpto. Bioquímica médica y Biología Molecular e Inmunología Avda. Sánchez Pizjuán,4. 41009 Sevilla. A la memoria de mi Madre, María Isabel Moreno Ramírez. A la memoria de mi Tía, Ana María Moreno Ramírez. “En mitad del invierno aprendí, por fin, que había en mí un verano invencible”. Albert Camus (1913-1960) “Esperando, el nudo se deshace y la fruta madura”. Federico García Lorca (1898-1936) “Las promesas engañan, el tiempo decepciona, la muerte vence todos los cuidados, las ansias de la vida son nada”. Leonardo Da Vinci (1452-1519) “No levantes el velo pintado que los vivos llaman vida, aunque formas irreales represente, imagen engañosa de aquello que creemos con colores dispersos. Detrás acechan miedo y esperanza, destinos gemelos que entretejen sus sombras en la sima sombría y encubierta. A un hombre conocí de corazón sensible que levantó ese velo buscando algo que amar, pero no encontró nada, ni tampoco las cosas que contiene este mundo podían agradarle. Ignorado vivía, era luz en las sombras, una mancha brillante en esta escena turbia, un alma que luchaba por la verdad y nunca, como el predicador, la pudo hallar en nada”. Percy Bysshe Shelly (1792-1822) AGRADECIMIENTOS Fueron una duda y una moneda las que me llevaron a comenzar mi aventura en el mundo de la investigación. Sé que puede parecer extraño, pero así fue. La moneda respondió que me atreviera con la Inmunología. Así que, eso hice. Aunque para ser sincera, la idea que tenía en mente era mucho menor. De hecho, pensaba hacer una pequeña colaboración en el laboratorio, sin más. Sin embargo, poco a poco “mi aventura” fue tomando cuerpo y el resultado se puede leer en esta Tesis. Así que es, precisamente este comienzo, lo que me hace pensar en la manera curiosa en cómo llegan algunas oportunidades y que debemos dar gracias por ellas y por tantas cosas más. Es por ello, que tras el reto que ha sido esta Tesis quiero darle las gracias a las Instituciones y personas que me han apoyado, intelectual o emocionalmente, en su realización. Al Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular e Inmunología por su apoyo estructural y económico durante este tiempo. A la Dra. María Dolores Maldonado y Aibar, por confiar en mí y brindarme la oportunidad de realizar esta Tesis Doctoral bajo su dirección. Gracias por guiarme, enseñarme e inculcarme, durante todos estos años, la importancia de la disciplina y la voluntad tanto en el trabajo de laboratorio como en la escritura de esta Tesis, así como por tus sabios consejos que, junto con tu valiosa ayuda, me han permitido evolucionar tanto bajo tu dirección. Gracias por ser el mejor de los ejemplos a seguir. A la Dra. Carmen González Yanes por su ayuda a “cascoporro” y por su paciencia infinita, además de por guiarme con su “savoir faire” en mis quehaceres diarios. “Helgarmor hija de Larramor” siempre te estará agradecida. Al Dr. Juan Ramón Calvo Gutiérrez por su interés en mi evolución durante la realización de esta Tesis. A la Dra. Carmen Osuna Fernández, por nuestras interesantes charlas camino de su despacho que, junto con su cariño e interés durante este tiempo, la convierten en gran un ejemplo de amabilidad y buen trato. Al Dr. Antonio Manuel Carmona Fernández (“Ketama”), por su buena disposición y compañerismo. A los Dres. Enriqueta Tristán Clavijo y Rafael Camacho García por sus interesantes e instructivas conversaciones en el pasillo de los frigoríficos. A la Dra. Flora Sánchez Jiménez (Flori), por su dedicación al introducirme en el mundo de los Western y por el compañerismo demostrado durante mi estancia en el Departamento. A Verónica Carranco Galán, por su fuerza y vitalidad sin parangón de las que me he podido contagiar en tantas ocasiones. A la Dra. Maribel García Sánchez, por nuestras charlas inspiradoras y tan clarificadoras para mí. Por su amabilidad, positividad y simpatía sin límites. A Miriam Adorna Martínez, por nuestras confidencias y charlas desde cada “flanco” del laboratorio llenas de su risa tan maravillosa. A los Dres. Víctor Sánchez Margalet, Antonio Pérez Pérez y demás Compañeros del Departamento, por ofrecerme su ayuda y atención siempre que lo he necesitado. Y no me puedo olvidar de la Secretaría, ese “Reino del papeleo” de la planta superior donde tantas veces me han ayudado y animado en esta andadura por todas las vías posibles. Sólo nos ha faltado la paloma mensajera, ¿verdad? A Carmen Gómez Ávila por su simpatía, fuerza y dinamismo. Por los cafelitos que hemos compartido y por las ideas que me ha ofrecido y me han allanado tanto el terreno. A Mª José Barbero Santos por sus cariñosas explicaciones, que tantas veces han conseguido que la burocracia sea más llevadera. Por ofrecerme sosiego con su trato dulce y alegre. A Adoración Puente Carretero (Dora), por cada abrazo que me ha dado y porque tengo la suerte de que han sido muchos. Por tu sonrisa, amabilidad y cariño en cada segundo que hemos compartido juntas. Por todos y cada uno de los “momentazos” que hemos compartido en el comedor junto a Mª José y “La Naranjito”. ¡Es que a Mafalda siempre le quedarán claras las bondades del pollo empanado! Y, también, quiero agradecer todo el apoyo que me han ofrecido en la Secretaría de la Facultad de Biología, y en concreto: A Rocío Guerrero Macho por su cordial trato y esmero en su ayuda. A Ascensión Blasco Cortés (“Chon”) por ser tan extraordinaria y por celebrar cada uno de mis logros como si fuera propio. Por acompañarme desde el momento de mi matriculación en mi primer año y seguir haciéndolo y por aclararme el oscuro camino en infinitas ocasiones. También quiero acordarme de muchas otras personas que comparten mi caminar: A Sophia Quarenghi, mi “superprofesora” de violín. Por estar pendiente de mi evolución mientras escribía esta Tesis y ofrecerme su apoyo sincero, además de ser un ejemplo de calidad en su trabajo y una gran persona. A Mary Joplin, por comenzar siendo mi profesora de inglés y convertirse en una amiga y confidente. Por las charlas interesantes y los pensamientos geniales que hemos compartido y por conseguir que mi inglés descarriado volviera al redil en tantas ocasiones. Por los cafés y algún que otro desayuno en Valdelagrana o en La Moderna. A Toñi, por mandarme sus pensamientos positivos y su fuerza para llenarme de coraje en tantas ocasiones y por ser todo un ejemplo de lealtad. A Rocío por todos y cada uno de sus maravillosos mensajes. A “Mary Sea” por ser una bióloga con “Tronío”, ser tan generosa durante las asignaturas del máster y regalarme su amistad desde entonces. A María José Maillo Jiménez “Meryjou” por su alegría y entusiasmo al enterarse de que comenzaba esta andadura y por ofrecerme una amistad llena de tantos recuerdos alegres y maravillosos. A Mariola Jimena García “mi pequeña Lola”, por acompañarme durante tantos años ya y por todos los recuerdos maravillosos que compartimos. Por escucharme y apoyarme con paciencia infinita. Por cada mensaje, cada pregunta sobre los párrafos, la burocracia y tanto apoyo infatigable que han hecho el proceso mucho más llevadero. Por una extraordinaria amistad que supera la distancia, el paso del tiempo, los malos momentos y que espera en la retaguardia para ayudar sin reservas. Gracias de todo corazón. A María del Carmen Naranjo Gutiérrez, “Mi Naranjito”. Gracias por compartir conmigo tu maravillosa visión del mundo, porque por ella te envidio y admiro a partes iguales. Gracias por ayudarme a seguir cuando las cosas no tenían sentido, por todas las llamadas y momentos compartidos que han entretejido y entretejen una amistad que es un privilegio, por tanta comprensión, paciencia, bonitos detalles y por ser un ejemplo a seguir en cada uno de tus pasos. Gracias por todo. ¡Ah! Aprovecho y te aviso que seguiré molestándote…y sí, sé lo que estás pensando tras leer esta frase. A José Amate García “Bigote” por su incansable apoyo en los momentos duros y por su amistad inquebrantable. A mi tía Charo y mi tío Emilio, por soportar mi parloteo interminable sobre cada pequeño detalle durante el proceso de escritura. Gracias por vuestro interés infatigable y por acompañarme en mi caminar desde antes de que naciera. A mis tías Pepa y Lola por habernos ayudado tantas veces con tanta amabilidad 6 IP3 – Inositol 1,4,5- trifosfato IRAK – Quinasas asociadas al receptor de IL-1 IRF-3 – Factor regulador del interferón 3 ITAM – Motivo de activación del inmunoreceptor vía tirosina LAT 1, LAT2 – Estabilizador de células T activadas LCEII – Cadena ligera 3 de la proteína II asociada al microtúbulo LL37 – Catelicidina LPO – Lactoperoxidasa LPS – Lipopolisacárido LRR – Secuencia rica en leucina LTB4 – Leucotrieno B4 Lyn – Tirosin Kinasa Lyn LZD – Luzindol LZD+C* – Células preincubadas con LZD y estimuladas con PMACI MAO – Amino oxígeno reductasa MAPK – Proteína quinasa activada por mitógeno MEK – MAP quinasa quinasa MELn – Melatonina endógena MELx – Melatonina exógena MELx 100nM+C*– Células pretratradas con MELx 100nM (dosis fisiológica) y estimuladas con PMACI MELx 1mM+C*– Células pretratadas con MELx (dosis farmacológica) y estimuladas con PMACI MELx 100nM+LZD+C*– Células pretratadas con MELx 100nM y preincubadas con LZD 30´; lavadas y estimuladas con PMACI MELx 1mM+LZD+C*– Células pretratadas con MELx 1mM y preincubadas con LZD 30´; lavadas y estimuladas con PMACI MHC – Complejo mayor de histocompatibilidad (I y II) MMP9 – Matriz metalopeptidasa 9 MyD88 – Respuesta primaria de diferenciación mieloide 88 NAS – N-acetilserotonina NAT – N-acetiltransferasa NF-κβ – Factor de transcripción nuclear κβ NK – Natural Killers NO – Óxido nítrico NTAL – Ligando para la activación de miembros de la familia de células T O2- – Anión superóxido P300 HAT – Histona acetiltransferasa p300 PAF – Factor activador de plaquetas PAMPs – Patrones moleculares asociados a patógenos PGE2 – Prostaglandina E2 PI3K – Fosfoinositol 3-quinasa PIP2 – Fosfatidilinositol 4,5-bifosfato PIRE – Elemento regulador pineal 7 PKA – Proteína quinasa dependiente de AMPc PKC – Proteína quinasa C dependiente de calcio PLC – Fosfolipasa C PMA – forbol-12-miristato-13-acetato PMACI – forbol-12-miristato-13-acetato más calcio ionóforo PT – Pars Tuberalis QR2 – Quinona reductasa RBL-2H3 – Línea celular de leucemia basofílica de ratas RE – Retículo endoplásmico SAGE – Análisis en serie de la expresión génica SCAMP – Proteína de membrana secretora asociada a transportador SNC – Sistema nervioso central Syk – Tirosin Kinasa Syk TAK1 – Factor de crecimiento transformante β activado por la Kinasa 1 TGFβ – Receptores del factor de crecimiento transformante β THP (1 y 2) – Triptófano hidroxilasa THP-1 – Línea celular de monocitos mieloides humanos TLRs – Receptores Toll-like (2,3,4,6,8) TM I-VII – Hélices transmembrana TNF-α – Factor de necrosis tumoral α TRAM – Molécula adaptadora de TRIF TRIF – Adaptador para la activación de los receptores tipo Toll T-SNARES – Receptores de proteínas de fijación soluble de NSF en la diana VAMP (2,3,7,8) – Proteínas de membrana asociada a vesículas VEGFA- Factor de crecimiento endotelial vascular A VEGF – Factor de crecimiento endotelial vascular VIP – Péptido intestinal vasoactivo V-SNARES – Receptores de proteínas de fijación soluble de NSF en vesículas Zeb2 – Proteína con dedos de zinc de la caja E vinculantes con la caja homeótica 8 LISTADO DE FIGURAS Y TABLAS: Introducción: Fig.1: Origen de los mastocitos. Fig.2: Representación de un mastocito tipo con algunas de sus características moleculares más importantes. Fig.3: Estructura de la IL-6. Fig.4: Estructura del TNF-α. Fig.5: Estructura de los receptores de alta afinidad FcεRI. Fig.6: Estructura de los receptores Toll-Like. Fig. 7: Representación de los principales eventos del proceso de desgranulación del mastocito. Fig.8: Ruta de señalización típica de un receptor TLR, en este caso, TLR4. Fig.9: Representación esquemática de la fase aguda de la inflamación. Fig.10: Representación esquemática de la fase tardía de la inflamación. Fig.11: Estructura química de la melatonina. Fig.12: Esquema de la síntesis de la melatonina en pinealocitos. Fig.13: Esquema de la estructura de los receptores de la melatonina MT1 y MT2. Fig.14: Representación esquemática de la vía de señalización de la melatonina mediado por sus receptores MT1. Fig.15: Representación esquemática de la vía de señalización de la melatonina mediado por sus receptores MT2. Material y métodos: Fig.1: Esquema del diseño experimental para estudiar la activación de los mastocitos RBL-2H3. Fig.2: Diseño experimental para estudiar la citoprotección mediada por la melatonina. Fig.3: Diseño experimental para estudiar el efecto del LZD sobre la citoprotección ejercida por la MELx en células estimuladas. Fig.4: Representación esquemática para la medición de citoquinas en el sobrenadante del medio de cultivos enzimoinmunoanálisis (ELISA). Fig.5: Representación esquemática de la técnica de ELISA para la determinación de la melatonina. Fig.6: Representación esquemática del sistema de electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS usado. Fig.7: Representación esquemática del sistema usado para la transferencia de las proteínas a la membrana de nitrocelulosa. Fig.8: Representación esquemática del sistema usado para la detección y revelado de las proteínas presentes en la membrana de nitrocelulosa. 7 Tabla I: Kit comercial de radioinmunoensayo (IBL). 9 Resultados: Fig.1: Análisis de la cinética de tiempo para la citotoxicidad mediada por PMACI. Fig.2: Cambios morfológicos de los mastocitos RBL-2H3 tras su exposición durante 14h. con PMACI. Fig.3: Citoprotección ejeercida por la melatonina a dosis fisiológicas y farmacológicas en células expuestas a PMACI durante 2 horas. Fig.4: Citoprotección ejercida por la melatonina a dosis fisiológicas y farmacológicas en células expuestas a PMACI durante 12 horas. Fig.5: Efecto del luzindol sobre la citoprotección ejercida por la melatonina durante 2 horas. Fig.6: Efecto del luzindol sobre la citoprotección ejercida por la melatonina durante 12 horas. Fig.7: Estudio del efecto de la melatonina exógena (MELx) en la liberación de citoquinas y la melatonina endógena (MELn) en cultivos de RBL-2H3 sin estimulación química. Fig.8: Niveles de TNF-α e IL-6 en el sobrenadante de los cultivos celulares de RBL-2H3. Fig.9: Efecto inhibitorio de la MELx sobre la síntesis y liberación de la MELn, inducida por el estímulo con PMACI, fue bloqueada al usar luzindol. Fig.10: Resultados de la técnica de Western Blot al estudiar el efecto de la MELx, sobre la Miosina IIa, de los mastocitos estimulados con PMACI, durante 2h. Figura.11: Resultado de la ténica de Western Blot al estudiar el efecto inhibidor de la MELx sobre la fosforilación de los factores IKKα/β inducida por PMACI en cultivos de mastocitos durante 2h. Tabla I: Estudio del efecto de la melatonina exógena (MELx) sobre la liberación de citoquinas pro-inflamatorias y la MELn en cultivos celulares de RBL-2H3 con estimulación química (PMACI). 10 RESUMEN INTRODUCCIÓN: Los mastocitos son una población de células heterogéneas, localizadas en los tejidos conectivos del organismo, que desarrollan respuestas alérgicas y antiparasitarias mediadas por la IgE. Estas células generan reacciones urgentes donde la inflamación es, en sí, un mecanismo protector frente a la amenaza detectada, cuyo objetivo es restaurar la homeostasis en el tejido dañado eliminando o aislando el agente causante que la puso en marcha. Para ello, y tras apenas unos treinta minutos desde que se detectó el estímulo comienza su etapa aguda, durante la cual los mastocitos vierten al tejido las moléculas preformadas y almacenadas en sus gránulos, produciéndose en consecuencia cambios morfológicos y fisiológicos característicos de los procesos inflamatorios. Todo ello, se traduce en la aparición de sus signos característicos calor, rubor, dolor y tumor. Posteriormente, y si sigue actuando el instigador, se desarrolla la fase tardía (dos horas tras el estímulo) donde se sintetizan y liberan leucotrienos y prostaglandinas, así como citoquinas entre las que se encuentran: IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, TNF-α, IL-8, IL-10, IL-13. Dicho mecanismo es de gran importancia para el organismo, y es por ello que los tejidos, para asegurar su activación, establecen estrategias redundantes. Sin embargo, cuando la amenaza es eliminada resolver los diferentes frentes establecidos que activaron la inflamación puede convertirse en una empresa complicada. Es por ello, que la investigación en este campo se enfoca, al menos en parte, en la búsqueda o desarrollo de fármacos que permitan su resolución con éxito evitando su cronificación. Siguiendo esta línea, uno de los fármacos estudiados es la melatonina, la cual es una indolamina que presenta gran variedad de propiedades. Así, cabe destacar que durante el proceso inflamatorio desarrolla un papel dual por el cual funciona como una citoquina pro-inflamatoria más, y posteriormente, cuando ya no es necesario ayuda a la restitución de la homeostasis gracias a sus muchas capacidades como son la antioxidante, citoprotectora, inmunomoduladora y anti-inflamatoria. Concretamente, a través de ellas consigue reducir los radicales libres procedentes del metabolismo del oxígeno y del nitrógeno, mejorar la viabilidad celular, estimular o reducir la respuesta inmune e inhibir la activación del factor NF-κβ. OBJETIVOS: En nuestro estudio se establecieron dos objetivos principales: analizar el efecto del tratamiento exógeno de la melatonina, una molécula inmunomoduladora, sobre la línea de mastocitos RBL-2H3, modelo de inflamación in vitro, e identificar los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a estos efectos y, también, trasladar nuestros descubrimientos básicos a la clínica. 11 HIPÓTESIS: En función de nuestros objetivos establecimos las hipótesis en las que trabajamos. A través de ellas, queríamos conocer si la administración exógena de la melatonina: - Mejora la viabilidad celular y la regeneración del mastocito tras el estímulo químico. - Si inhibe la activación del mastocito reduciendo la síntesis y liberación de citoquinas pro-inflamatorias (TNF-α e IL-6). - Si interviene en la síntesis y liberación de la melatonina endógena por parte del mastocito. MATERIAL Y MÉTODOS: Se usaron cultivos de mastocitos RBL-2H3 que crecieron en medio con suero fetal bovino descomplementado, CO2 al 5% y 37ºC, los cuales fueron sometidos a diferentes tiempos de estimulación química mediante forbol-12-miristato-13-acetato más calcio ionóforo (PMACI) para conocer su inducción de citotoxicidad o su efecto sobre la liberación de las citoquinas pro-inflamatorias. Posteriormente, se realizaron pre-tratamientos con melatonina (durante 30 minutos) a concentraciones fisiológicas y farmacológicas para estudiar su capacidad citoprotectora y su efecto sobre la liberación de citoquinas y los niveles de melatonina endógena. Por otro lado, se estudió el efecto del antagonista selectivo luzindol sobre sus capacidades citoprotectoras. A su vez, estudiamos el efecto de la melatonina sobre la liberación de las citoquinas pro-inflamatorias y la propia melatonina endógena y sobre los mecanismos intracelulares responsables de la citoprotección. Para ello, se usó el ensayo MTT para estudiar la viabilidad celular, así como la técnica de enzimoinmunoanálisis (ELISA) para la medición de citoquinas en el sobrenadante del medio de cultivo. Para el estudio de la expresión proteica de la miosina IIa e IKKα/β se usó la técnica de western blotting, un sistema de transferencia semiseca y un sistema de detección de proteínas mediante quimioluminiscencia. RESULTADOS: El ensayo MTT nos permitió determinar que la citotoxicidad generada sobre los cultivos mastocitarios con el estímulo químico (PMACI) era tanto dosis como tiempo dependiente. Así, y de manera estadísticamente significativa, a mayor tiempo de exposición al PMACI, mayores eran los daños celulares detectados; los cuales fueron extremos ante periodos iguales o mayores a 14 horas. Detectamos, también, que dicha estimulación con PMACI produce un aumento en la liberación de las citoquinas pro-inflamatorias TNF-α e IL-6, así como de la melatonina endógena, los cuales disminuyeron si fueron precedidos del pre-tratamiento con melatonina. 12 Se observó que el pretratamiento con melatonina (30 minutos) mejoró la viabilidad celular de modo estadísticamente significativo, siendo mayor su capacidad a concentraciones farmacológicas; mientras que las concentraciones fisiológicas muestran esta capacidad citoprotectora tras 12 horas de experimentación. Aunque cabe destacar que en presencia del antagonista selectivo para los receptores MT1 y MT2 llamado luzindol, su capacidad citoprotectora disminuye, aunque no del todo. Por último, se detectó que el pretratamiento con melatonina disminuye la activación del complejo IKKα/β lo que le permite desarrollar su papel anti-inflamatorio. CONCLUSIONES: La estimulación química mediante PMACI activa a los mastocitos de manera tiempo y dosis dependiente. El pretratamiento con melatonina, sobre todo a concentraciones farmacológicas, ejerce protección celular cuando los mastocitos fueron estimulados con PMACI. La estimulación química mediante PMACI introduce al mastocito en un estado de hiperestimulación con un aumento de los niveles de TNF-α, IL-6 y de melatonina endógena; cuando se realizó el pretratamiento con melatonina disminuyó la síntesis y liberación de las mismas. Esta capacidad se revierte en presencia de luzindol. La melatonina exógena en ausencia de estimulación química no afecta los niveles de TNF-α, IL-6 o de melatonina endógena (MELn). El pretratamiento con melatonina, tanto a concentraciones fisiológicas como farmacológicas, en mastocitos estimulados, inhibe la activación de la ruta de activación mastocitaria IKK/NF-κβ de forma estadísticamente significativa. 13 SUMMARY INTRODUCTION: Mast cells are a population of heterogeneous cells, located in the connective tissues of the body, which develop allergic and antiparasitic responses mediated by IgE.These cells generate urgent reactions where inflammation is, in itself, a protective mechanism against the detected threat, whose objective is to restore homeostasis in damaged tissue by eliminating or isolating the causative agent that started it. For this, and after only about thirty minutes since the stimulus was detected, its acute stage begins, during which the mast cells discharge the preformed molecules stored in their granules into the tissue, resulting in morphological and physiological changes characteristic of the inflammatory processes. All this is translated in the appearance of its characteristic signs heat, flush, pain and tumor. Subsequently, and if the instigator continues to act, the late phase develops (two hours after the stimulus) where they are synthesized and released leukotrienes and prostaglandins, as well as cytokines among which are: IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, TNF-α, IL-8, IL-10, IL-13. This mechanism is of great importance for the organism, and that is why the tissues, to ensure their activation, establish redundant strategies. However, when the threat is eliminated resolving the different established fronts that activated the inflammation can become a complicated enterprise. That is why research in this field focuses, at least in part, on the search or development of drugs that allow its resolution successfully avoiding its chronification. Following this line, one of the drugs studied is melatonin, which is an indolamine that has a great variety of properties. Thus, it should be noted that during the inflammatory process develops a dual role by which it functions as a pro-inflammatory cytokine more, and later, when it is no longer necessary to help the restitution of homeostasis thanks to its many capabilities such as antioxidant, cytoprotective, immunomodulatory and anti-inflammatory. Specifically, through them it manages to reduce free radicals from the metabolism of oxygen and nitrogen, improve cell viability, stimulate or reduce the immune response and inhibit the activation of factor NF-κβ. OBJECTIVES: In our study, two main objectives were established: to analyze the effect of the exogenous treatment of melatonin, an immunomodulatory molecule, on the RBL-2H3 mast cell line, in vitro inflammation model, and to identify the cellular and molecular mechanisms underlying these effects and, also, to transfer our basic discoveries to the clinic. 14 HYPOTHESIS: Based on our objectives, we established the hypotheses in which we work. Through them, we wanted to know if the exogenous administration of melatonin: - If it improves cellular viability and regeneration of the mast cell after the chemical stimulus. - If it inhibits mast cell activation by reducing the synthesis and release of pro-inflammatory cytokines (TNF-α and IL-6). - If it is involved in the synthesis and release of endogenous melatonin by the mast cell. MATERIAL AND METHODS: Cultures of RBL-2H3 mast cells that grew in medium with decomplemented fetal bovine serum, 5% CO2 and 37ºC were used, which were subjected to different times of chemical stimulation by phorbol-12-myristate-13-acetate plus calcium ionophore(PMACI) to know its induction of cytotoxicity or its effect on the release of pro-inflammatory cytokines. Subsequently, pre-treatments with melatonin (for 30 minutes) were carried out at physiological and pharmacological concentrations to study its cytoprotective capacity and its effect on the release of cytokines and endogenous melatonin levels. On the other hand, the effect of the selective antagonist luzindol on its cytoprotective capacities was studied. In turn, we studied the effect of melatonin on the release of pro-inflammatory cytokines and endogenous melatonin itself and on the intracellular mechanisms responsible for cytoprotection. To do this, the MTT assay was used to study cell viability, as well as the enzyme immunoassay (ELISA) technique for the measurement of cytokines in the supernatant of the culture medium. For the study of the protein expression of myosin IIa and IKKα/β, the western blotting technique, a semi-dry transfer system and a chemiluminescence protein detection system were used. RESULTS: The MTT test allowed us to determine that the cytotoxicity generated on mast cell cultures with the chemical stimulus (PMACI) was both dose and time dependent. Thus, and in a statistically significant way, the longer the exposure to the PMACI, the greater the cellular damage detected; which were extreme before periods equal or greater than 14 hours. We also detected that this stimulation with PMACI produces an increase in the release of the pro-inflammatory cytokines TNF-α and IL-6, as well as endogenous melatonin, which decreased if they were preceded by pre-treatment with melatonin. It was observed that pretreatment with melatonin (30 minutes) improved the cell viability in a statistically significant way, being greater its capacity at pharmacological 15 concentrations; while physiological concentrations show this cytoprotective capacity after 12 hours of experimentation. Although it should be noted that in the presence of the selective antagonist for the MT1 and MT2 receptors called luzindol, its cytoprotective capacity decreases, although not completely. Finally, it was detected that pretreatment with melatonin decreases the activation of the IKKα / β complex, which allows it to develop its anti-inflammatory role. CONCLUSIONS: The chemical stimulation by PMACI activates the mast cells in a time and dose dependent manner. Pretreatment with melatonin, especially at pharmacological concentrations, exerts cellular protection when the mast cells were stimulated with PMACI. Chemical stimulation by PMACI introduces the mast cell in a state of hyperstimulation with an increase in the levels of TNF-α, IL-6 and endogenous melatonin; when the pretreatment with melatonin was carried out, the synthesis and release of them decreased. This capacity is reversed in the presence of luzindol. Exogenous melatonin in the absence of chemical stimulation does not affect the levels of TNF-α, IL-6 or endogenous melatonin (MELn). The pretreatment with melatonin, both at physiological and pharmacological concentrations, in stimulated mast cells, inhibits the activation of the mastocyte activation pathway IKK / NF-κβ in a statistically significant manner. 22 Figura 3. Estructura de la IL-6. En la cual, las hélices A y B se disponen paralelas y están unidas por un gran lazo. De manera análoga, las hélices C y D se unen mediante un lazo largo lo que determina que las hélices C-terminales se empaqueten de modo paralelo. Por último, las hélices B y C se unen por un lazo pequeño y son antiparalelas. En la imagen la hélice A es de color azul oscuro, la hélice B es de color azul claro, la hélice C es de color beige y la hélice D es de color rojo. Imagen tomada de Protein Data Bank, Xu et al., 1997. En humanos, su receptor (IL-6R) se ha definido como una glicoproteína de membrana perteneciente a la familia de receptores de citoquinas de tipo I con un peso molecular de 80 KDa al cual se une su ligando con baja afinidad [Papanicolau et al., 1998] Según Erta et al. (2012) se identificó como un factor de diferenciación de células B que inducía su maduración a células productoras de anticuerpos. En sí, sus funciones son muy variadas puesto que actúa a muchos niveles como, por ejemplo: el sistema inmune, la regulación de los hepatocitos, células progenitoras hematopoyéticas, así como a nivel del esqueleto, el sistema cardiovascular, la placenta y los sistemas endocrino y nervioso. En consecuencia, podemos decir que la IL-6 es una citoquina pluripotencial que, además, desempeña funciones tanto pro-inflamatorias como anti-inflamatorias ya que, por un lado, es la principal mediadora en la respuesta de fase aguda y, al mismo tiempo, controla a la IL-1 y al TNF-α de manera parcial [Choy, 2004; O`Malley and Moldawer, 2006]; y, también, libera antagonista para los receptores de ambas citoquinas [Choy, 2004]. Otra de sus funciones es la regulación de la termogénesis corporal puesto que es muy conocido su rol como pirógeno endógeno; tanto es así que resulta indispensable su intervención para las etapas finales que producen la fiebre [Mackowiak, 1998]. Habría que destacar también su actuación a nivel de las células endoteliales vasculares en las que promueve la expresión de la selectina-E, las ICAM, las VCAM, moléculas de adhesión que facilitan el tráfico leucocitario y la resdencia, además de 23 otros mediadores pro-inflamatorios [Gentiletti and Fava, 2003]. Por último, se ha descrito su capacidad para estimular la producción de VEGF en fibroblastos [Haynes and Fauci, 2006; Gentiletti and Fava, 2003]. Además, resulta destacable que su estructura sea compartida por otras citoquinas tales como: IL-11, IL-27, IL-31, factor inhibitorio de leucemia, oncostatina M, cardiotropina-1, neuropoyetina y dos análogos víricos de la IL-6; las cuales en su conjunto constituyen el grupo de las neuropoyetinas [Bazan, 1990; Bazan, 1991; Taga and Kishimoto, 1992; Heinrich et al., 2003; Bauer et al.,2007; Wang et al., 2009]. Como Anderson et al. (2013) explican, la activación de la IL-6 se desencadena a través de un factor de transcripción llamado Factor Nuclear κβ (NF-κβ). Del mismo modo, estos autores determinan que en la unión a su receptor (IL-6R) es necesaria la presencia de la glicoproteína 130 (gp130) y con ello se activan las vías JAk/STAT, MAPK y IP3K. Factor de necrosis tumoral-α (TNF-α): En 1975, Carswell et al. describieron por primera vez el TNF al intentar, durante sus experimentaciones, aumentar el nivel de dicho factor en suero de ratón que fueron tratados con un agente iniciador y lipopolisacárido (LPS). En sí, se define como una potente citoquina secretada por macrófagos que se aisló y definió en principio como caquexina [Eck and Sprang, 1989]. Entre sus características, cabe destacar que presenta un punto isoeléctrico de 5,3, que se mantiene estable ante pH comprendidos entre 5.5 y 10, es moderadamente hidrofóbica, y que es termoestable durante 40h al ser sometida a 37ºC. Principalmente, se detectó su síntesis en monocitos sanguíneos y macrófagos hísticos, aunque, también, puede ser sintetizado por otros tipos celulares [Beutler et al.,1987] como son las Natural Killer (NK) [Paya et al., 1988], los linfocitos T periféricos y macrófagos [Steffen et al., 1988] entre otros. Esta molécula media en diferentes dolencias, tales como: procesos febriles inducidos por endotoxinas [Dinarello et al., 1986], shock [Beutler et al., 1985; Tracey et al., 1986], y desarrollo de caquexia asociado a enfermedades crónicas, tales como el SIDA [Oliff et al., 1987]. Se debe agregar que sus funciones son llevadas a cabo mediante su unión a receptores de alta afinidad [Eck and Sprang, 1989], tras la cual se producen los siguientes efectos: - Inhibición del metabolismo de los triglicéridos en los adipocitos [Beutler et al., 1985; Kawakami and Cerami, 1981; Pekala et al., 1984; Torti et al., 1985] al suprimir la enzima lipoproteinalipasa y, por otro lado, el aumento de la 24 glucogenólisis en miocitos [Zentella et al., 1993]. - Inhibición del desarrollo de células progenitora hematopoyéticas en estudios in vitro [Broxmeyer et al., 1986] - Estimulación de la producción de factores de crecimiento hematopoyéticos en diferentes tipos celulares [ Munker et al., 1986; Zucali et al., 1988] - Activación de los neutrófilos [Shalaby et al., 1985; Klebanoff et al., 1986]. - Activación de los protooncogenes c-myc y c-fos en fibroblastos [Eck and Sprang, 1989]. Hay que mencionar que esta citoquina se encuentra codificada en el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) [Spies et al., 1986; Müller et al., 1987] y se clasifica junto con otras interleucinas e interferones en un grupo que carece de relación estructural entre sus componentes [Eck and Sprang, 1989]. Se sintetiza como prohormona que, para madurar, en el caso de los humanos, requiere de la escisión de un residuo formado por 76 aminoácidos presentes en el extremo amino terminal de su cadena. La hormona madura resultante presenta en su estructura un único puente disulfuro entre dos cisteínas en su superficie [Hsu et al., 1986]. En concreto, se forma a partir de la asociación de tres monómeros de entre 16-18 KDa que mediante uniones no covalentes dan lugar a una proteína de forma triangular [Wingfield et al., 1987], cuya estructura es de tipo sandwich de hojas β antiparalelas con topología de barril beta [Eck and Sprang, 1989]; a su vez, esta molécula se presenta, generalmente, en forma de trímero (Figura 4). En relación a la unión con su receptor se lleva a cabo a nivel de su base y, también, de manera no covalente. Figura 4. Estructura del TNF-α. La cual está formada por tres monómeros de entre 16-18 KDa. de cadenas-β antiparalelas que conforman una estructura de barril beta. Imagen tomada de Protein Data Bank, cuyos autores depositantes son Eck and Sprang, 1989. 25 Asímismo, como explican Wermesson and Pejler (2014) y retomando la composición de los gránulos en los mastocitos comentamos, a continuación, otros componentes que presentan: -Enzimas lisosomales: Donde encontramos a la β-hexosaminidasa, las β-glucoronidasa, N-acetil-β-glucosaminidasa y la β-galactosidasa junto a la arilsulfatasa A que, actúan en el proceso de degradación lisosomal; además de las catepsinas (A, B, C, L, D y E) las cuales actúan, también, en el proceso de degradación lisosomal, así como el procesamiento de pro-triptasas o pro-quimasas o de la CPA-3. -Factores de crecimiento: En este grupo están comprendidos: el factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF) y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) los cuales desarrollan eventos pro-angiogénicos; el factor de crecimiento transformante β (TGFβ) que produce tanto efectos pro-fibróticos como anti-inflamatorios, el factor de células madre y, por último, el factor de crecimiento de los nervios involucrado en la interacción de las terminaciones nerviosas con los mastocitos. -Proteínas asociadas a la membrana granular: En este grupo se encuentran las proteínas de membrana asociadas a vesículas (VAMP2, VAMP3, VAMP7 Y VAMP8) que actúan a nivel de la fusión de las vesículas en los mastocitos, la sintaxina 3 la cual interviene a nivel de la fusión entre los gránulos y, también entre éstos y la membrana plasmática, las sinaptotagmina II y sinaptotagmina III encargadas de testar el calcio presente y, además en el caso de ésta última está implicada en la regulación del tamaño granular, la MUNC 18-2 encargada del ensamblaje entre los gránulos y los microtúbulos del citoesqueleto, la MUNC 13-4 que está implicada en determinar el nivel de calcio que es, a su vez, promotor de la formación de los complejos SNARES, las proteínas de membrana secretoras asociadas a transportador (SCAMP 1, SCAMP 2) involucradas en los complejos de fusión entre los gránulos, el complejo de diferenciación 63 (CD63) que forma parte del proceso de desgranulación, la cadena ligera 3 de la proteína II asociada al microtúbulo (LC3-II) que están implicada en procesos de autofagia en las células cebada, el complejo mayor de histocompatibilidad de clase II (MHC clase II) lo que indicaría la posibilidad de que los mastocitos pudieran actuar en la presentación de antígenos, y las RAB3D, RAB5, RAB7, RAB9A, RAB18, RAB27A, RAB27B, RAB42, RAB43 encargadas de regular el tráfico de membrana. -Otros: En este grupo se comprenden la heparanasa encargada de la estructura de la heparina, la catelicidina (LL37) cuyos efectos son antibacterianos, la proteína básica de gránulos de eosinófilos cuya función aún es desconocida, así como la secretogranina III y la cromogranina A las cuales se encargan de la regulación del número de gránulos en las células RBL-2H3. 26 1.1.3- Receptores del mastocito. Los mastocitos pueden ser estimulados vía receptor dependiente o receptor independiente y por estímulos de diferente origen como físicos, químicos o biológicos. Sus receptores son glicoproteínas de membrana encargadas de la transducción de señales al interior celular, es decir, que tras unírseles su molécula señalizadora desencadenan las reacciones de la activación mastocitaria. En el caso de los mastocitos, encontramos numerosos receptores de la respuesta inmune y otros tipos de receptores que les confieren la capacidad de reaccionar frente a múltiples estímulos específicos e inespecíficos. De entre ellos destacaremos dos: -Los receptores de alta afinidad para la IgE (FcεRI): los cuales están relacionados con la activación específica producida tras la unión de un antígeno específico a las fracciones variables de la inmunoglobulina E, la cual está, a su vez, unida a través de sus fracciones constantes a un receptor de membrana denominado FcεRI. Según Abbas et al. (2002) cada uno de estos receptores presentan tres subunidades transmembrana que son (Figura 5): -Cadena α: lugar de unión de la inmunoglobulina E. -Cadena β: formada por cuatro dominios transmembrana que tiene un motivo de activación del inmunorreceptor vía tirosina (ITAM) cuya fosforilación da comienzo al proceso de degranulación. -Cadenas γ: son un dímero de cadenas idénticas unidas mediante un puente disulfuro y, junto a la cadena β, están involucradas en la señalización; puesto que también presentan dominios ITAM en sus porciones citoplásmicas. Para que este receptor se exprese en la membrana celular deben estar presentes tanto la cadena α como las cadenas γ; y es, específicamente, en los dominios Ig presentes en la región amino terminal de la cadena α donde se produce la unión de la IgE. Dicha inmunoglobulina regula de manera positiva las reacciones de hipersensibilidad por parte de los mastocitos, lo que conlleva la amplificación de las funciones efectoras llevadas a cabo por ella. Figura 5.- Estructura de los receptores de alta afinidad FcεRI. Está formada 27 por tres tipos de cadenas distintas, como son: la cadena α en cuyo dominio amino terminal se une la IgE, la cadena β que presenta cuatro dominios ITAM y un dímero de cadenas γ que, también, expresan dominios ITAM en sus porciones citoplásmicas. - Los receptores Toll-like (TLR2, TLR4, TLR6 y TLR8): Son una familia de receptores del sistema inmune innato relacionados con la activación inespecífica debida al reconocimiento, por parte del mastocito, de componentes bacterianos o patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs), los cuales son estructuras moleculares muy conservadas en familias enteras de patógenos como, por ejemplo; el LPS o la flagelina, entre otros. Son glicoproteínas transmembrana de tipo I que presentan, como se muestra en la figura 6, un dominio receptor Toll/IL-I (TIR) [Bowie and O´Neil, 2000] en el citoplasma que mediante la unión de otros dominios TIR propagan la señal que da comienzo a la vía de señalización, mientras que sus dominios N-terminales extracelulares presentan una secuencia rica en leucina (LRR) flanqueada por una secuencia rica en cisteínas [Kruithof et al., 2007]. Figura 6.- Estructura de los receptores Toll-like. Son glicoproteínas transmembrana que tras reconocer PAMPs desencadenan los procesos inflamatorios. Presentan un dominio TIR en su parte citosólica y en su extremo N-terminal una secuencia LRR flanqueada por una secuencia rica en cisteínas. 1.1.4-. Vías de activación del mastocito Los receptores FcεRI y TLR pueden activar al mastocito de forma cruzada, por lo que pueden confluir sus rutas internas de señalización. La activación del mastocito mediante la vía IgE/FcεRI desencadena los siguientes eventos: Según Krystel-Whittemore (2014), su ruta (Figura 7) comienza con la interacción del receptor FcεRI con la tirosin kinasa Lyn, provocándose así la activación de los motivos ITAMs al fosforilarse en las cadenas β y γ de dicho receptor [Kalesnikoff and Galli, 2008]. En el siguiente paso, la proteína Lyn fosforila 28 a la tirosin kinasa Syk que, a su vez, fosforila a las proteínas estabilizadoras de células T activadas (LAT1 y LAT2) [Iwaki et al., 2005]. Tras ello, la fosfolipasa C (PLCγ) fosforilada hidroliza el compuesto fosfatidilinositol-4,5-bifosfato obteniéndose, por consiguiente, los compuestos inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) y diacilglicerol (DAG). Dichos compuestos actúan como segundos mensajeros y producen la movilización de calcio del retículo endoplásmico (RE); siendo dicho aumento de calcio el causante de la translocación del factor NF-κβ al núcleo y comenzándose, en consecuencia, la transcripción de las siguientes citoquinas pro-inflamatorias: Il-13, Il-6 y TNF-α [Hitomi et al., 2004]. La regulación de esta vía se lleva a cabo mediante la proteína de Zeb2 [Barbu et al.,2012], mientras que la proteína Fyn regula la degranulación complementariamente a Lyn. En concreto, Fyn activa al fosfoinositol 3-quinasa (PI3K) que produce la activación de la proteína quinasa dependiente de calcio (PKC) al aumentar el calcio intracelular mediante la activación de la proteín quinasa B (Akt). A su vez, el ligando para la activación de miembros de la familia de células T (NTAL) también activa a PI3K y, con ello, regula la liberación de calcio intracelular. Con estos eventos se activa la desgranulación, así como la producción de citoquinas y mediadores lipídicos [da Silva et al., 2014]. Además, como explican Wernersson and Pejler (2014), la fase final de esta ruta requiere la fusión entre gránulos y entre la membrana de los gránulos o de la membrana plasmática; para ello, es necesaria la interacción de los receptores de proteínas de fijación soluble de NSF en vesículas (v-SNAREs) presentes en las vesículas que están en el citoplasma de los mastocitos y los receptores de proteínas de fijación soluble de NSF en la diana (t-SNAREs) presentes en los lugares de unión (otras vesículas o la membrana plasmática). En el caso de los mastocitos son predominantes las v-SNAREs: VAMP8 y VAMP7 [Puri and Roche, 2008, Tiwari et al., 2008, Sander et al., 2008]. Mientras que las t-SNAREs predominantes son: sintaxinas 3 y 4, y la proteína asociada al sinaptosoma (SNAP23) [Brochetta et al.,2014, Paumet et al., 2000, Guo et al., 1998, Sander et al., 2008]. Junto con ellas, otras proteínas están también involucradas en esta fusión de las membranas como son: complejo sensor de calcio II y las GTPasas de la familia RAB, siendo crucial para el desarrollo de la desgranulación la RAB27B [Tadokoro et al., 2005, Mizuno et al., 2007]. Durante este proceso, las sinaptotagminas son las encargadas de promover dicha fusión de membranas al testar el calcio intracelular, destacando entre ellas la sinaptotagmina II [Baram et al., 1999, Melicoff et al., 2009], así como las proteínas de la familia MUNC18 que también interfieren en la fusión entre membranas puesto que interaccionan con las sintaxina SNAREs. Revelándose la MUNC 18-2 con una importancia mayor en la interacción entre los gránulos y los microtúbulos [Brochetta et al., 2014]. Cuando los gránulos se dirigen hacia el exterior celular viajan a través de los microtúbulos [Nishida et al., 2005], con ello se inicia el proceso de exocitosis que en 29 este caso se conoce como “compuesto de exocitosis”. El cual necesita de la despolimerización de la actina cortical que está regulada por las proteínas coronin 1A y coronin 1B [Deng et al., 2009, Föger et al., 2011]. En concreto, en el caso de los mastocitos se ha descrito la “exocitosis por partes” (del término en inglés “piecemeal exocytosis”) consistente en la gemación de vesículas de pequeño tamaño a partir de los gránulos citoplásmicos [Dvorak, 2005]. Figura 7.- Representación de los principales eventos del proceso de desgranulación del mastocito. El mecanismo se desarrolla tras la interacción del receptor FcεRI con la tirosin kinasa Lyn, provocándose así la activación de sus motivos ITAMs. El siguiente paso consiste en la fosforilación de la proteína Lyn por la tirosin kinasa Syk; la cual, también, fosforila a las proteínas LAT1 y LAT2. Posteriormente, se obtienen los compuestos IP3 y DAG al hidrolizarse el fosfatidilinositol-4,5- bifosfato, los cuales, actúan como segundos mensajeros. En consecuencia, se produce la movilización de calcio del RE causándose la translocación del factor NF-κβ al núcleo y comenzándose así la transcripción de las siguientes citoquinas pro-inflamatorias: Il-13, Il-6 y TNF-α. Su fase final requiere la fusión entre gránulos y las membranas de los mismos y la membrana plasmática, es 30 decir, que se requiere la interacción de las proteínas v-SNARES y T-SNARES. Además, otras proteínas son necesarias como las coronin 1A y 1B y la actina entre otras. En el caso de los receptores TLR se desencadenan dos rutas de señalización que pueden ser: dependiente de la proteína adaptadora llamada, respuesta primaria de diferenciación mieloide 88 (MyD88) o MyD88-independiente, aunque esta situación sólo ocurre para los receptores TLR3. En el caso de los mastocitos, la ruta desencadenada es MyD88 dependiente. Tal y como explican Núñez Miguel et al., (2007), MyD88 es una proteína adaptadora, al igual que las proteínas Mal, el adaptador de receptores tipo Toll (TRIF) y la molécula adaptadora de TRIF (TRAM) (Figura 8). Así, Mal y TRAM funcionan como “puentes adaptadores” de las proteínas TRIF y MyD88. En concreto, Mal produce una activación rápida del factor NF-κβ mientras que TRAM activa al factor regulador del interferón (IRF-3) por lo que, en consecuencia, se producen citoquinas pro-inflamatorias, el interferón β y la quimiocina RANTES. Figura 8.- Ruta de señalización típica de un receptor TLR, en este caso, TLR4. Dicha ruta requiere la actuación de la proteína adaptadora MyD88 junto con otras proteínas como son MAL, TRIF y TRAM. Así, Mal y TRAM funcionan como “puentes adaptadores” de las proteínas TRIF y MyD88; en concreto, Mal produce una activación rápida del factor NF-κβ mientras que TRAM activa al IRF-3 por lo que, en consecuencia, se producen citoquinas pro-inflamatorias, el interferón β y la 31 quimiocina RANTES. En sí la ruta se desencadena por el reclutamiento de las quinasas de la familia IRAK mediante interacción directa con la proteína MyD88, las cuales se autofosforilan. Dicho reclutamiento es llevado a cabo por el dominio DD de la proteína adaptadora MyD88. Tras ello, la proteína TRAF-6 activa a MEK una vez se ha producido la interacción directa de las proteínas de la familia IRAK con ella. En consecuencia, el complejo IKK se activa por la fosforilación de la proteína TAK1 produciéndose, por tanto, la activación del factor NF-κβ al no estar bajo la influencia de su inhibidor Ikβ. Así, el factor NF-κβ puede acceder al núcleo celular, produciéndose con ello la transcripción de los genes para ciertas citoquinas inflamatorias tales como: IL-1, IL-6, IL-8; IL-12 y TNF-α. A su vez, TAK1 puede activar la ruta de AP-1 a través de las MAPK. Imagen adaptada de Núñez Miguel et al., 2007. La ruta, en sí, se desencadenan por el reclutamiento de las quinasas asociadas al receptor de IL-1 (familia IRAK) mediante interacción directa con la proteína MyD88 [Kopp et al.,1999], puesto que dispara la autofosforilación de IRAK [Burns et al., 2000]. Dicho reclutamiento es llevado a cabo por el dominio de muerte (DD) de la proteína adaptadora MyD88. En los siguientes pasos, la proteína TRAF-6 activa a una MAP quinasa quinasa (MEK) tras la interacción directa de las proteínas de la familia IRAK con ella [Chaudhary et al., 1998]. En consecuencia, el complejo IKK se activa por la fosforilación del factor de crecimiento transformante β activado por kinasa 1 (TAK1) produciéndose, por tanto, la activación del factor NF-κβ al no estar bajo la influencia de su inhibidor Ikβ [O´Neill and Dinarello, 2000]. Es decir, el factor NF-κβ puede acceder al núcleo celular, produciéndose con ello la transcripción de los genes para ciertas citoquinas inflamatorias tales como: IL-1, IL-6, IL-8; IL-12 y TNF-α. A su vez, TAK1 puede activar la ruta de la proteína activadora (AP-1) a través de las proteínas quinasa activada por mitógeno (MAPK). 1.1.5- Mastocito e inflamación. Los principales síntomas que se muestran al comienzo del proceso inflamatorio son: rubor, calor, dolor y tumor; presentándose, por tanto, eritema y habón. Su aparición nos indica que se están liberando los diferentes compuestos preformados y almacenados en los gránulos en su fase inicial (segundos y minutos) y, posteriormente, en su fase tardía (2-9 horas) se están liberando otros compuestos que provocan la inflamación general de la zona afectada; la cual pierde su función (functio laesa). Según Galli et al., (2008), la fase aguda comienza minutos después del reconocimiento cruzado entre la IgE y el receptor de alta afinidad FcεRI; lo que desencadena la liberación de los siguientes compuestos: mediadores lipídicos, quimiocinas, factores de crecimiento, citoquinas de nueva síntesis y los compuestos pre-formados y almacenados en los gránulos del mastocito. Entre los compuestos pre-formados que se liberan están: histamina, serotonina, heparina, condroitin sulfato, 38 al., 1980, Smith et al., 1981]. Dichas células ganglionares al alcanzar al quiasma óptico se separan y se dirigen al núcleo supraquiasmático, el cual proyecta la señal recibida al núcleo paraventricular de hipotálamo hasta que alcanzan el ganglio cervical superior a través de la columna intermediolateral de la médula espinal torácica [Cardinali et al., 1981]. Remarcamos que, a nivel del parénquima pineal la relación existente entre las fibras posganglionares y los pinealocitos es parecida a la estructura sináptica. Así, la luz diurna produce la hiperpolarización de los fotorreceptores lo que se traduce en el impedimento de la liberación de la noradrenalina por la vía nerviosa. En condiciones de oscuridad, en cambio, los fotorreceptores no están hiperpolarizados y su señal se transmite a los terminales sinápticos liberándose, en consecuencia, la noradrenalina; la cual se une en el pinealocito a sus receptores adrenérgicos α1 y β1. Con estos eventos se produce un aumento tanto de la expresión como de la actividad de la AA-NAT asociada, a su vez, con un aumento de los niveles de N-acetilserotonina y melatonina [Hardeland et al.,1993]. Stefulj y colaboradores han detectado la expresión de los genes codificantes de las enzimas NAT y HIOMT en prácticamente todos los tejidos del organismo lo que permitiría, por tanto, a cada uno de ellos ser autónomos a la hora de sintetizarla [Stefulj et al., 2001]. 1.2.3-Mecanismos de acción de la melatonina. Los mecanismos de acción llevados a cabo por la melatonina se pueden incluir dentro de dos grandes grupos que son los mediados por receptores y los independientes de receptores. Dentro del primer grupo se incluyen los receptores de membrana MT1 y MT2 asociados al control de los biorritmos y la reproducción; los cuales llevan a cabo su función mediante la disminución del AMPc y la fosforilación de la proteína CREB, así como, mediante la disminución de la actividad de la PKA. En cuanto a los receptores MT3, su mecanismo de acción produce la hidrólisis de fosfoinositol [Dubocovich et al., 2003]. Del mismo modo, dentro de este grupo se encuentran los receptores nucleares que regulan la actividad de la ARN polimerasa II [Laudet et al.,1992], además de regular la expresión de diversos genes encargados de la producción de enzimas antioxidantes entre las que se encuentran la glutatión peroxidasa (GPx), glutatión reductasa (GRd), superóxido dismutasa (SOD) y la catalasa (CAT); además de la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) y la ciclooxigenasa (COX2) que, por el contrario son enzimas prooxidantes y proinflamatorias [Gilad et al., 1997, Crespo et al., 1999; Escames et al.,2003; Mayo et al., 2005]. Gracias a dicha regulación en la expresión génica de las enzimas antes nombradas, la melatonina, en consecuencia, potencia la expresión de los sistemas endógenos antioxidantes del mismo modo que reduce los proinflamatorios. 39 Por otro lado, sus mecanismos independientes de receptor se relacionan con sus capacidades antioxidantes y antiinflamatorias. Gracias a su capacidad de interacción con los radicales libres como el anión superóxido (O2–•) [Poeggeler et al., 1994], el hidroxilo (•OH), el peróxido de hidrógeno (H2 O2) [Tan et al., 2000], y el peroxinitrito (ONOO-) [Zhang et al., 1999] la melatonina produce otros metabolitos que tienen, a su vez capacidad antioxidante, como son: el N-acetil-N-formil-5-metoxiquinuramina (AFMK), el N-formil-5-metoxiquinuramina (AMK) y la 6-hidroximelatonina [Hardeland et al., 1993;Tan et al., 2000;Qi et al.,2000]. Al mismo tiempo, se han descrito las funciones antioxidantes que la melatonina lleva a cabo a nivel mitocondrial donde previene la formación de radicales libres, aumenta la formación de ATP, estabiliza la membrana mitocondrial y previene la apoptosis [Martin et al., 2000; Karbownik et al., 2000; Baydas et al., 2005; Hardeland and Poeggeler, 2007]. De manera análoga, la melatonina interacciona con proteínas del citosol celular. En concreto, se ha descrito su interacción con la calmodulina y la calreticulina las cuales se unen a calcio. Así, mediante su unión a calmodulina regula el estado del citoesqueleto celular [Ouyang and Vogel, 1998] y, en cambio, su unión a calreticulina regula la acción de diferentes hormonas a nivel del núcleo celular [Platet et al.,2000; Holaska et al., 2001]. A su vez, también se ha descrito su interacción con la proteína citosólica PKC que es una quinasa de serina y treonina activada por Ca2+. En sí, la melatonina activaría a esta quinasa de forma dependiente de Ca2+ [Benítez-King et al., 1996] y ésta, luego, fosforila diferentes sustratos y modifica la estructura del citoesqueleto [Aderem, 1992]. Además, debido a sus capacidades hidrofílicas y lipofílicas [Reiter, 1991] puede acceder al citosol, a todos los compartimentos celulares que en él se encuentran [Abe et. al, 1994; Tan et al., 1993] y en las membranas [Melchiorri et al., 1995]. En relación con ello, se ha descrito la capacidad de la melatonina para inhibir la translocación del factor NF-κβ al interior del núcleo [Chaung et al., 1996]. 1.2.4-Interacciones de la melatonina con otros sistemas. La relación entre sistema inmune y el cerebro se establece a través del sistema nervioso autónomo y el flujo neuroendocrino de la pituitaria. En ella, las vías noradrenérgicas y las peptidérgicas liberan una serie de sustancias tales como: noradrenalina, somatostatina, y el péptido vasoactivo intestinal (VIP). Dichas sustancias mediante su unión a los receptores localizados tanto en órganos como en células linfoides actúan en la regulación del sistema inmune [Ader et al., 1995]. A su vez, el sistema inmune también se ve afectado por hormonas y neuropéptidos entre los que se encuentran: la hormona del crecimiento, prolactina, melatonina, factor liberador de corticotropina (CRF), la hormona adenocorticotropa (ACTH) y los opioides. Destacamos que estos cambios a nivel del sistema inmune producen cambios, a su vez, a nivel de sistema nervioso autónomo, así como en procesos 40 endocrinos que están mediados por las interleuquinas y que activan la fiebre, los estados de ánimo, el sueño y la conducta locomotora al activar el eje hipotálamo-hipofisario-adrenal (HPA) [Ader et al., 1995]. En consecuencia, se le considera un órgano sensorial y se le llama el “sexto sentido” [Blalock, 2005]. La comunicación entre los sistemas neuronendocrino e inmune es de tipo bidireccional y se establece mediante diferentes moléculas, como son: neurotransmisores, hormonas neuroendocrinas, citoquinas, así como, también, sus receptores [Ader et al., 1995, Blalock, 2005]. Un ejemplo de ello, se encuentra en el modo en que la corticoesterona influye en la síntesis de la melatonina en la glándula pineal de forma dual, ya que depende del tipo de adrenoreceptor que esté involucrado; así, la síntesis se estimula por el β-adrenoreceptor y se inhibe en presencia de su antagonista β-α1 [Fernandes et al., 1979]. 1.2.5-Papel de la melatonina sobre las células del Sistema Inmune. 1.2.5.1-Mecanismos de actuación vía receptor dependiente. Monocitos: En este tipo celular se ha confirmado la presencia tanto de los receptores de membrana de melatonina, como de sus receptores nucleares, si bien es cierto que en el caso de humanos su expresión está determinada por el estado de maduración del mismo [Barjavel et al., 1998; Pozo et al.,2004; García-Mauriño et al.,2000]. Varios estudios han demostrado que la melatonina estimula la producción de moléculas tales como: IL-6 [García-Mauriño et al., 1997] y la IL-12 [García-Mauriño et al., 1999]. A su vez y mediante la intervención de sus receptores nucleares se ha demostrado la estimulación de la producción tanto de IL-6 como del IFN-γ en monocitos humanos y células U937 [García-Mauriño et al., 1997; García-Mauriño et al.,2000]. La melatonina también consigue proteger a este tipo celular de sufrir apoptosis. Concretamente, lo consiguen mediante la activación de MT1, MT2, la proteína ERK y la ruta de las MAPK [Radogna et al., 2007, Radogna et al., 2008, Luchetti et al.,2009]. La protección se lleva a cabo a nivel mitocondrial porque se debilita la activación/dimerización de la proteína Bax (pro-apoptótica) aunque se permite su translocación. Con ello se dañan, también, otros pasos durante la apoptosis como son: la liberación del citocromo c, la activación de las caspasas 3 y 9 o la vesicularización nuclear; además, permite la relocalización de Bcl-2 a la mitocondria que es antagonista de Bax [Radogna et al., 2008]. Células dendríticas: A pesar de que en la literatura no se han descritos los posibles efectos de la 41 melatonina en estas células [Calvo et al., 2013]; cabe destacar, por otro lado, que en estudios con hámster sometidos a pinealectomía se ha constatado la supresión de los ritmos circadianos en relación al tránsito de estas células [Prendergast et al., 2013]. Macrófagos: Por lo que se refiere al caso de los macrófagos, se ha descrito la presencia de receptores para melatonina [Maestroni et al., 2002]. Constatándose, además, la inhibición de la enzima adenilato ciclasa por la unión de la melatonina a sus receptores en estudios de macrófagos peritoneales de ratones [García-Perganeda et al., 1999]. A su vez, se ha descrito que la melatonina es capaz de desarrollar capacidades anti-inflamatorias además de regular la expresión de genes relacionados con varios procesos inflamatorios [Ban et al., 2011]. En relación con esto, Kadena et al. (2017) mediante microarray y análisis de co-expresión de genes han descrito la capacidad anti-inflamatoria de la melatonina al inhibir la transcripción de factores de transcripción al alterar la dinámica de la actina. Como sabemos, los macrófagos son capaces de producir anión superóxido (O2-) y óxido nítrico (NO) [Seljelid and Eskeland, 1993]. Aunque cabe destacar, que en el caso de murinos se ha demostrado que en presencia de melatonina sus macrófagos activos ven inhibida la producción de iNOS debido a la inhibición del factor NF-κβ [Gilad et al., 1998], detectándose que disminuye su producción tanto de los ARNm como de proteínas en el caso de los macrófagos en murinos activos por LPS/IFN-γ (interferón-γ). En concreto, se detectó que la disminución se debía a varias consecuencias desencadenadas por la presencia de la melatonina, como son: la disminución de la nitración de IkB-α citosólica y de su degradación, así como la disminución de la translocación de p65/RelA [Zhang et al., 2004]. En relación con esto, Kang et al., (2013) han descrito la capacidad de la melatonina para suprimir el aumento en la expresión de iNOS en macrófagos que fueron estimulados con vistafina. En concreto, determinaron que la melatonina consigue este efecto al inhibir las rutas STAT3 y NF-κβ. Por último, la melatonina ha demostrado su capacidad para prevenir tanto la activación de la ciclooxigenasa 2 (COX-2) como de la prostaglandina E2 (PGE2) en macrófagos RAW 264.7 activados por LPS y que no tenían afectados los niveles de la ciclooxigenasa 1 (COX-1) [Mayo et al., 2005]. En cuanto a COX-2, sabemos que la melatonina consigue inhibirla a nivel transcripcional al impedir la actividad de la histona acetiltransferasa p300 (HAT p300) con lo que se para también la unión, la transactivación y la acetilación de p52 [Deng et al., 2006]. Neutrófilos: Se sabe que la administración in vivo de melatonina tras la realización de una pinealectomía aumenta su nivel circadiano lo que se asocia con la capacidad de esta 42 molécula para mantener la fagocitosis en los neutrófilos [Hriscu, 2005]. De hecho, se ha detectado la relación existente entre el ritmo circadiano de la melatonina y la capacidad fagocítica de los heterófilos en ratas y la tórtola rosigrís doméstica (Streptopelia risoria) [Rodríguez et al., 1999, Hriscu et al., 2002, Terron et al., 2004]. Detectándose, además, el descenso de células blancas cuando estas aves son sometidas a pinealectomía, así como también la alteración del proceso fagocítico [Rodríguez and Lea, 1994b]. Además, en estudios de paloma torcaz se ha demostrado la capacidad de la melatonina para inhibir la producción de la enzima SOD [Rodríguez et al., 1998]. Del mismo modo, en estudio en ratas se ha constatado la capacidad de la melatonina para impedir la pérdida de la actividad del enzima glutatión reductasa [Sewerynek et al., 1996]. Por otro lado, Ren et al. (2017) en estudios de pez cebra, han demostrado que mediante la melatonina endógena producida por los neutrófilos pueden promover sus migraciones rítmicas al inducir la producción de la IL-1β y la IL-8. Natural killers: En este tipo celular, en humanos, se ha detectado la presencia de los receptores nucleares de la melatonina, la presencia de la enzima HIOMT y del receptor MT1 [Pozo et al., 2004]. Cuando la melatonina se acompaña de IL-2, aumenta la presencia de NK en pacientes con cáncer [Lissoni et al., 1992, Lissoni et al., 1993] y en parte, el aumento de sus funciones se debe a la producción de citoquinas por las células T que también son estimuladas por melatonina [Lissoni et al., 1998, Currier et al., 2000]. En animales pinealectomizados, la melatonina consigue restablecer la actividad de las NK, así como restablecer las incapacidades de su respuesta inmune [Del Gobbo et al., 1989], a pesar de que en humanos suprime la actividad de este tipo celular [Lewinsky et al., 1989]. En animales pinealectomizados, la melatonina consigue restablecer la actividad de las NK, así como restablecer las incapacidades de su respuesta inmune [Del Gobbo et al., 1989], a pesar de que en humanos suprime la actividad de este tipo celular [Lewinsky et al., 1989]. Eosinófilos: Se ha determinado que, en cultivos celulares de médula ósea en ratas la melatonina afecta a la ritmicidad circadiana en la proliferación de las células de colonias formadoras de granulocitos y macrófagos (CFU-GM) en función de cuando se realizó la pinealectomía o se sustituyó a la melatonina [Haldar et al., 1992]. Mastocitos: Chen et al., en 1998, mediante análisis de expresión génica (SAGE) 43 demostraron la expresión de los genes de la melatonina tanto en mastocitos RBL-2H3 (una línea celular de mastocitos de rata) activos como no activos. En línea con este dato y también en cultivos de RBL-2H3 se ha demostrado ante estimulación química el aumento en la presencia de los receptores de melatonina MT1 y MT2, así como un ascenso en los niveles de síntesis de la melatonina y, por tanto, los enzimas AA-NAT y HIOMT, necesarias para su síntesis, activas [Maldonado et al., 2009]. Así, también, se ha constatado la presencia de ambos receptores en mastocitos localizados en los testículos de humanos [Rossi et al., 2014]. En el caso de las ratas, se detectan grandes poblaciones de mastocitos en todos los órganos linfoides [Ozkanlar et al., 2015]; y varios autores han descrito la presencia de los receptores MT1 y MT2 en dichos órganos incluyendo el timo y el páncreas [Calvo et al., 1995; Sánchez-Hidalgo et al., 2009]. A su vez, en aves se han detectado en la bolsa de Fabricio (órgano linfoide primario); hecho que podría ser indicativo de que la función llevada a cabo por la melatonina, a través de dichos receptores, estaría relacionada tanto con la regulación de los linfocitos, como con la respuesta inmune [Calvo et al., 1995]. Cabe destacar que esta molécula interfiere en la diferenciación y/o proliferación de este tipo celular mediante los receptores de estrógenos, in vivo o in vitro, en el tejido testicular de la especie Rana esculenta. En sí, produciría la activación de los receptores de estrógenos y desestabilizaría la unión de los compuestos estradiol-estrógeno a los mismos [Izzo et al., 2004]. A su vez, la melatonina protege frente a la degranulación mastocitaria generada ante una situación de estrés [Çikler et al.,2005]. 1.2.5.2-Mecanismos de actuación vía receptor independiente Monocitos: Cuando este tipo celular, en ratones, se ha tratado con melatonina exógena se detectado la estimulación de su producción en órganos como la médula ósea y el bazo [Currier et al., 2000]. Cabe destacar que en el caso de otras moléculas su función es inhibidora como ocurre con la IL-10 [Lissoni et al., 1996] o la producción de TNF-α en monocitos humanos [Fjaerli et al., 1999]. Sin embargo, y a través de la PKC, la melatonina consigue activar y estimular la producción de IL-1 [Morrey et al., 1994]. Varios autores han demostrado la capacidad de la melatonina para producir ROS en monocitos [Morrey et al., 1994]. Por otro lado, se ha descrito su capacidad antioxidante al disminuir ROS, siendo un ejemplo de ello su capacidad para depurar el peróxido de hidrógeno [Romero et al.,1999]. Asimismo, se ha descrito también su capacidad para interaccionar con la 44 proteína intracelular calmodulina. En concreto, en esta investigación se sugiere que es la interacción melatonina-calmodulina la que le permitiría a la melatonina tanto inducir como inhibir la producción de ROS [Radogna et al., 2009a]. En sí, en el proceso descrito se defiende que dicha unión produce la liberación de calcio independiente de PLA2 y, posteriormente, la enzima viaja hasta la membrana punto en el que libera ácido araquidónico que por acción de la 5-lipoxigenesa produce radicales libres [Radogna et al.,2009b]. Células dendríticas: Se conoce la capacidad estimulante de la melatonina en la producción y liberación de la IL-12 en este tipo celular, la cual a su vez inhibe la producción de melatonina [Lissoni, 1999]. Macrófagos: Ante la estimulación con melatonina, se genera el aumento en la producción IL-12 tanto en la línea celular de monocitos mieloides (THP-1) como en macrófagos activados por LPS [Cutolo et al., 1999]. La melatonina, también, disminuye la producción de TNF-α en macrófagos humanos y de ratón [Lissoni et al., 1994, Shin et al., 2000]. En diferentes casos de macrófagos activados con LPS y en presencia de melatonina se ha detectado que disminuye la producción de IL-12 [Cutolo et al., 1999], la producción de TNF-α mediada por TLR3 en macrófagos activados por el virus RAW 264.7 [Huang et al., 2008] o la producción de TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 e IL-10 mediada por TLR4 activados por LPS [Xia et al., 2012]. Sin embargo, ni en murinos ni en ratas el pretratamiento con melatonina afectó a la producción de TNF-α, IL-1β ni de IL-6 en sus macrófagos activados [Williams et al.,1998, Shafer et al., 2001]. Por otro lado, y debido a la producción de TNF-α e IL-1 junto con el incremento de la expresión de las moléculas de clase II del MHC por parte de macrófagos tras administrárseles melatonina, éstos aumentaron su capacidad de actuar como célula presentadora de antígenos a los linfocitos T [Pioli et al., 1993]. Así también, Cheng et al. (2017) al estudiar exosomas derivados de carcinoma hepatocelular tratados con melatonina han detectado la atenuación de la alta expresión de citoquinas (IL-1β, IL-10, IL-6, TNF-α) que se detecta en los exosomas que no han sido tratados con melatonina en macrófagos. La reducción de la actividad del factor NF-κβ mediada por la melatonina se ha detectado en una amplia variedad de tejidos y órganos como son: células T [Pedrosa et al., 2010], neuronas [Chang et al., 2012], hígado [Bruck et al., 2004], riñón [Ozbek et al., 2009], pulmón [Shang et al., 2009] y corazón [Veneroso et al., 2009]. Además, conviene subrayar que en estudios con macrófagos RAW264.7 es precisamente el factor NF-κβ a través de la inducción de la actividad de AA-NAT genera síntesis de melatonina que les permite su modulación autocrina [Muxel et al., 2012]. Igualmente, se ha descrito la capacidad del forbol-12-miristato-13-acetato 45 (PMA), el IFN-α, IFN-γ y el LPS para regular la síntesis de melatonina a partir de triptófano en macrófagos peritoneales de rata [Martins et al., 2004]. A su vez, y gracias a la capacidad antioxidante de la melatonina se ha demostrado que puede reducir la formación de peroxinitrito y prevenir los daños a nivel del DNA, en modelos de ratas con shock no tóxico [Cuzzocrea et al., 1998a] o en macrófagos J774 [Gilad et al., 1997; Bagchi et al., 2001]. Además, esta capacidad también le permite proteger, en cultivos U937 sometidos a radiación UV-B, la estructura y función mitocondrial lo que genera en una protección frente a la apoptosis [Luchetti et al., 2006]. De manera contraria, Albertini et al., (2006) al estudiar cultivos de U937 han demostrado que la melatonina a pesar de no modificar la actividad de la glutatión deshidrogenasa muestra actividad pro-oxidativa. Por último, Muxel et al., (2016) han descrito que la melatonina administrada exógenamente trabaja junto con la sintetizada por las células del sistema inmune en el control de la fase de resolución de la inflamación. Recientemente, Liu et al., (2017) han descrito un posible rol nuevo para la melatonina ya que parece establecer comunicación entre adipocitos y macrófagos, así como aliviar la inflamación metabólica. Neutrófilos: En diferentes estudios con neutrófilos humanos, se ha demostrado que la presencia de melatonina reduce la producción de anión superóxido [Fischer et al., 2001; Bouhafs and Jarstrand, 2002]. También se ha detectado la disminución de la producción de anión superóxido en neutrófilos estimulados con el compuesto forbol-12-miristato-13-acetato (PMA), siendo en este caso una reducción dependiente de dosis [Perianayagam et al., 2005]. Del mismo modo, se ha demostrado la capacidad de la melatonina para inhibir la producción de anión superóxido en estudios de paloma torcaz [Rodríguez et al., 1997; Rodríguez et al., 1998; Rodríguez et al., 2001], cuyos niveles correlacionan con el ritmo circadiano en la producción de melatonina [Rodríguez et al., 1999]. Por otro lado, en relación con los roles desarrollados por los neutrófilos durante la inflamación local se ha demostrado que la melatonina es capaz tanto de reducir la permeabilidad vascular que induce el leucotrieno B4 [Lotufo et al., 2006] así como de impedir la eliminación de la L-selectina [Recchioni et al., 1998]. Además, en estudios en ratas la melatonina ha sido capaz de neutralizar la presencia de glutatión reducido y, a la vez, aumentar la presencia del glutatión oxidado [Sewerynek et al., 1996]. En estudios basados en el mismo modelo experimental, se determinó su capacidad para reducir la formación de peroxinitrito [Cuzzocrea et al., 1998b]. Por otro lado, y en modelos de peritonitis inducida por shock séptico disminuye los niveles de NO en plasma, la concentración de IL-1β y los niveles aórticos de anión superóxido [Wu et al., 2008]. En estudios sobre pielonefritis, la melatonina revertió 46 las alteraciones histopatológicas asociadas como otros efectos de dicha patología como son el incremento en la producción de ROS o los niveles altos de TNF-α detectados en suero [Sener et al., 2006]. Por otro lado, cabe destacar que en modelos de experimentación en ratas y ratones para el estudio de daño pulmonar debido a radiación la melatonina inhibe la infiltración de los neutrófilos [Serin et al., 2007; Genovese et al., 2005]. A su vez, cabe destacar que entre los efectos desarrollados por la melatonina en los diferentes modelos de experimentación estudiados se encuentra su capacidad para regular la producción de mediadores inflamatorios entre otros efectos [Calvo et al., 2013]. En humanos, la melatonina es capaz de aumentar la expresión de quimiocinas [Peña et al., 2007]. A su vez, la melatonina puede actuar junto con su metabolito AFMK y en este caso, disminuye la actividad antimicrobiana de estas células [Silva et al., 2006] y la producción de TNF-α e IL-8 en humanos estimulados con LPS [Silva et al., 2004]. Por último, cabe destacar que la melatonina aumenta la producción de ROS en células tumorales para que desencadenen el proceso de apoptosis mientras que en el caso de células sanas previene el desarrollo de este proceso [Bejarano et al., 2011]. Recientemente, Yi and Kim (2017) en estudios sobre inflamación inducida por estrés han constatado que la melatonina es capaz mediante la upregulación de la expresión proteica de STAT3 reducir la inflamación al inducir el cambio del fenotipo M1 al M2 en los macrófagos estudiados. En humanos, la melatonina ha conseguido retrasar la apoptosis de neutrófilos en casos de pancreatitis aguda y alivió la inducción de su apoptosis al ser estimulados con calcio (Ca2+) [Chen et al., 2005, Espino et al., 2010a]. Siendo capaz de retrasar el estrés del RE inducido por la apoptosis del neutrófilo [Espino et al., 2011]. Eosinófilos: En estudios de asma en ratas, se ha detectado que la melatonina disminuye la presencia de eosinófilos [Wang et al., 2004]; mientras que en estudios de casos de poliposis nasal se describe un aumento tanto del nivel de síntesis de la melatonina, así como del número de eosinófilos [Evsiuskova et al., 2008]. Cabe destacar que, en humanos, se ha identificado la presencia de melatonina en eosinófilos en la submucosa estomacal [Kvetnoy et al., 1999]. Mastocitos: Kvetnoy and Yuzhakov (1997) explican que se ha constatado la presencia de la melatonina en este tipo celular. A su vez, se ha demostrado que tras la degranulación de las células enterocromoafines e inmunopositivas (EC) se detecta una fuerte reacción immunopositiva a melatonina en los mastocitos; sugiriéndose que, dichas células, en estos puntos absorben la melatonina hacia el citosol. 47 Cabe destacar la disposición de mastocitos activos en la zona localizada entre el borde de los tumores y los tejidos sanos circundantes, y que esta disposición junto con la acumulación de melatonina y serotonina les permite crear un campo protector alrededor de los mismos. Por ello, Kvetnoy et al., proponen que la melatonina ejerce su citoprotección al igual que lo hace la serotonina, puesto que es su metabolito directo, así como a través de la neutralización de radicales libres. Según sus experimentaciones, los mismos autores proponen una función hormonal para la melatonina en desórdenes homeostáticos [Kvetnoy et al., 1997]. Por otro lado, diferentes autores han hecho referencia a la capacidad de penetrar a través de las membranas celulares de la melatonina debido a su capacidad lipofílica, así como han hecho referencia a su capacidad para neutralizar radicales libres [Reiter et al.,1995]. Para mejorar el conocimiento sobre los mastocitos, en estos aspectos, se suelen usar las células RBL-2H3, las cuales expresan los genes necesarios para la síntesis de la melatonina [Chen et al., 1998]. Natural killers (NK): En ratones, la administración de melatonina produce aumento en la actividad de las células NK [Tian et al., 2003] incluso, cuando se dan condiciones de inmunotoxicidad por cadmio [Kim et al., 2000a] y plomo [Kim et al., 2000b]. Pudiéndose asociar el aumento de este tipo celular con la capacidad oncostática de la melatonina [Srinivasan et al., 2008]. 1.3-RELACIÓN MELATONINA Y MASTOCITOS 1.3.1-Receptores MT1, MT2, MT3 en los mastocitos. Los mastocitos presentan en su membrana periférica los receptores de melatonina MT1 y MT2 [Maldonado et al., 2009]. Estos receptores de melatonina pudieron ser localizados e identificados mediante el uso del compuesto 2-[125]-iodomelatonina (125-Mel) [Laudon and Zisapel, 1986, Pang et al., 1993, Morgan et al., 1994] proveniente de un potente agonista de la melatonina que es la 2-iodomelatonina. En concreto, fue el uso de métodos autorradiográficos para la detección de la 125-Mel la técnica usada para determinar su distribución en los tejidos [Duncan et al., 1989]. En el caso de los mamíferos, se detectó alta afinidad por dicho compuesto en el sistema nervioso central (SNC) y en Pars tuberalis (PT) [Weaver et al., 1993], y también en un amplio número de estructuras periféricas pertenecientes a los sistemas gastrointestinal, cardiovascular e inmune y en órganos tales como: hígado, pulmón, próstata, células sanguíneas y granulosas [Song et al., 1995, Yie et al., 1995, Mahle et al., 1997, Paul et al., 1999, Guerrero and Reiter, 2002, Yau et al.,2002]. Cabe destacar, que la clonación del primer receptor de alta afinidad para la 54 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS La inflamación es un mecanismo de defensa que el sistema inmune pone en marcha para evitar que seamos colonizados por patógenos. A veces, esta reacción es excesiva o se mantiene en el tiempo, o se genera en contra de sustancias inocuas ó propias, generando lesión en los tejidos donde actúa. En ella intervienen una gran cantidad de células y moléculas destacando como uno de los protagonistas al mastocito, célula que está localizada muy cerca de los vasos sanguíneos y de la interfase organismo-medio ambiente como por ejemplo la piel y las mucosas. Es una célula con capacidad para generar una respuesta inflamatoria potente en muy pocos segundos. La activación del mastocito, por múltiples agentes, es clave en la etiopatogenia de enfermedades inflamatorias donde se ven implicados tanto el sistema inmune innato como el específico, por lo que estrategias dirigidas a la inmunomodulación de su activación podrían ser claves en la recuperación del tejido en el que se está produciendo dicha inflamación. En esta Tesis se postulan las siguientes hipótesis: La administración exógena de melatonina mejora la viabilidad celular y la regeneración del mastocito secundario al estímulo químico. La administración exógena de melatonina inhibe la activación del mastocito reduciendo la síntesis y liberación de citoquinas pro-inflamatorias (TNF-α e IL-6). La administración exógena de melatonina interviene en la síntesis y liberación de melatonina endógena por el mastocito. Los objetivos de esta Tesis son: Analizar el efecto del tratamiento exógeno de melatonina, una molécula inmunomoduladora, sobre la línea celular de mastocitos RBL-2H3 e identificar los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a estos efectos y sus implicaciones clínicas. 55 MATERIAL Y MÉTODOS 56 3.-MATERIAL Y MÉTODOS: 3.1-EXPERIMENTOS PILOTO PREVIOS A LA TESIS Con anterioridad a la experimentación realizada para esta Tesis comprobamos que la estimulación química con PMACI de los mastocitos resulta más idónea de ejercer que la estimulación inmunológica para la realización final de los experimentos. Los beneficios a destacar de dicha estimulación química, con PMACI, son mayor activación celular, así como tiempos de incubación y manipulación más cortos. Teniendo en cuenta dichas propiedades nos decantamos por la estimulación química para la realización de los mismos. 3.2-MATERIAL BIOLÓCIGO 3.2.1-Línea celular: Durante nuestro trabajo usamos la línea celular denominada RBL-2H3 con ATCC: CRL-2256. Estas células, se usan como modelo experimental in vitro de mastocitos [Passante et al., 2009; Funaba et al.,2003; Crivellato et al.,2015]. Es una línea celular de leucemia basofílica aislada y clonada en 1978 en el Laboratorio de Inmunología del National Institute of Dental Research desde células basofílicas de ratas Wistar. Estas células tienen receptores de alta afinidad para IgE (FcεRI). Pueden ser activadas para secretar histamina y otros mediadores mediante agregación de estos receptores, o por el método químico mediante éster de forbol y calcio ionóforo. La liberación de histamina y otros mediadores vasoactivos las hace muy útiles para el estudio y conocimiento de procesos tales como la inflamación, las alergias o en enfermedades autoinmunes y autoinflamatorias. A menudo, aparecen referenciadas como mastocitos, aunque cabe destacar que crean cierta controversia dentro de la comunidad científica. Idea sustentada en que se originan a partir de basófilos. Sin embargo, basándonos en el hecho de que poseen características comunes tanto con mastocitos como con basófilos, creemos que son una herramienta útil para llevar a cabo nuestros experimentos. Todas las manipulaciones de las células fueron realizadas en cabina de flujo laminar vertical y en condiciones de esterilidad. 3.2.2-Procesamiento de la línea celular: 3.2.2.1-Procedimiento del subcultivo: Con este proceso mantenemos las células procedentes del cultivo primario en condiciones óptimas para su estudio, al controlar variables tales como: agotamiento del medio de cultivo, temperatura, nivel de CO2 o confluencia del cultivo. Protocolo: -Las condiciones de los cultivos fueron temperatura a 37ºC y 5% de CO2. El 57 medio se cambió cada 2-3 días para evitar su agotamiento y antes de añadir el nuevo medio se realizó un lavado con PBS. -Cuando las células alcanzaron la confluencia se establecieron nuevos subcultivos. Para ello se usó el método de la tripsinización, que permite resuspender las células al tratar al cultivo con: Tripsina/EDTA en proporción 0.25%/0.03%. (Nota: Durante este procedimiento se consigue evitar la aglomeración celular evitando agitar o golpear el frasco de cultivo). -Los subcultivos fueron re-sembrados en proporción 1:4 hasta 1:8. 3.2.2.2-Procedimiento de congelación: Con este proceso podemos mantener una reserva de células que, bajo congelación, está en estado latente a -80ºC. Las soluciones usadas permiten preservar la integridad de las membranas celulares al enfrentarse al choque térmico de ser congeladas a -80ªC y, también, en su posterior descongelación. Se deben preparar dos soluciones: Solución 1: 70% Suero fetal bovino + 30% medio de cultivo MEME. Solución 2: 95% de la solución 1 + 5% DMSO. Protocolo: -Se centrifugan las células RBL-2H3 en tubos de 15 mL. durante 15 minutos a 400xg, tras ello se retira el sobrenadante y colocamos los tubos boca abajo. El pellet celular se resuspende en 400 µl de la solución S1 y se pasan a eppendorfs debidamente rotulados. -Se toman 400 µl de la solución S2 y se administra, lentamente, gota a gota en el eppendorf. (Nota: Para que el proceso resulte aún más lento se puede tomar 100 µl y se administra a cada tubo eppendorf hasta completar el volumen de 400 µl). -Los tubos eppendorf se colocan en hielo picado, después a -20ªC y, finalmente a -80ºC. 3.2.2.3-Procedimiento de descongelación: Con este proceso pretendemos conseguir el mayor número de células viables al descongelar las células latentes a -80ºC para establecer los cultivos de las mismas. -Protocolo: -Se agita el vial de células (el tubo eppendorf que ha estado congelado a -80ºC) en el baño de agua a 37ºC hasta descongelar la suspensión celular. -Se lava el vial, externamente, con etanol para evitar contaminaciones y se coloca dentro de la campana de flujo laminar. En el mismo tubo eppendorf se administra un poco de medio y se resuspende. -Se transfiere la suspensión de células a un tubo de centrífuga de 10-15 ml. -Se añade un volumen igual de medio de cultivo precalentado (37ºC). Se 58 esperan 5 minutos a temperatura ambiente y se añade un volumen igual de medio precalentado y se esperan 5 minutos de nuevo. Repetir este paso hasta completar el volumen del tubo. -Se centrifugan las células a baja velocidad: 400xg durante 10 minutos. -Se resuspende el pellet de células en medio de cultivo precalentado y se transfieren a un frasco de cultivo de 25 cm2. 3.3-REACTIVOS QUÍMICOS USADOS Los diferentes compuestos usados durante la experimentación se obtuvieron en varias casas comerciales. A continuación, relatamos su uso durante la experimentación y los fabricantes de los mismos: 3.3.1-Medio de cultivo: Medio DMEM Dulbecco´s (modificación del medio BME, que es el medio basal Eagle) Antibióticos: - Penicilina (Gibco® BRL, USA). - Estreptomicina (Gibco® BRL, USA). - Anfotericina B (Gibco® BRL, USA). L-glutamina (Gibco® BRL, USA). Suero Fetal Bovino (Gibco® BRL, USA). 3.3.2-Estimulación química: Calcio ionóforo A23187 (CI) (Sigma®, St Louis, USA). Forbol 12-miristato-13 acetato (PMA) (Sigma®, St Louis, USA). PMACI: PMA 5.10-7M + CI 5.10-7M. 3.3.3-Preparación de soluciones: Dimetil sulfóxido (DMSO) (Sigma®, St Louis, USA). 3.3.4-Citoprotección: Melatonina (Sigma®, St Louis, USA). 3.3.5-Viabilidad celular: 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol, ensayo MTT (Sigma®, St Louis, USA). 3.3.6-Inhibición receptores de melatonina: Luzindol (Sigma®, St Louis, USA). 3.3.7-Soluciones y tampones: -Agua: Según los requerimientos de cada protocolo fue: agua destilada, esterilizada 59 en autoclave o MiliQ. -PBS 10x (Tampón fosfato salino) pH7.6: Solución usada para el lavado de las células RBL-2H3 en cultivo. Buffer de fosfato salino de Dulbecco´s con Ca2+ y Mg2+ (Sigma®, St Louis, USA). -Buffer de lisado: Tampón usado para lisar las células, así como para, también, solubilizar las proteínas asociadas a sus membranas. Composición: HEPES (Sigma®, St Louis, USA), EDTA (Sigma®, St Louis, USA), fluoruro sódico, Na PPi, Na3 VO4, H2O qsq, Tritón-X-100 (Sigma®, St Louis, USA), inhibidor de proteasas (Complete mini, Protease inhibitor Cocktail Tablets provided in EASYpack de Roche). -Tampón de carga de proteínas para electroforesis SDS-PAGE: Tampón que contiene agentes desnaturalizantes presentes para las proteínas que se separarán al ser cargadas negativamente, además, de un agente reductor de puentes disulfuro, junto con un marcador colorante que indica el frente de avance durante la realización de la electroforesis. Composición: Tris ácido 1M al 25% v/v; Glicerol al 50% v/v; SDS 10% p/v; DTT 100 mM; Azul de bromofenol 0.001% p/v; pH 6,8. -Tampón para la electroforesis en gel de poliacrilamida (“running buffer”): Solución que permite el desplazamiento anódico, en el gel de poliacrilamida, de las proteínas que, anteriormente, han sido desnaturalizadas y cargadas negativamente. Composición: Tris-Glicina al 10% v/v; (Tris Base 250mM; Glicina 1,92M); SDS en stock del 20% al 0.5% v/v final. -Solución de bloqueo: Encargada de bloquear las membranas una vez la transferencia ha sido realizada; evitando, en parte, que se produzcan interacciones inespecíficas entre los anticuerpos primario y secundario. Además, es usado como el medio donde se lleva a cabo la dilución del anticuerpo primario. Composición: Albúmina 3% p/v. -Tampón para la transferencia de las proteínas del gel de poliacrilamida: Solución que empapa el papel Whatman y la membrana de nitrocelulosa para facilitar la transferencia de las proteínas desde el gel de policacrilamida. Composición: Tris-Glicina al 10% v/v (Tris Base 250 mM; Glicina 1,92 M); Metanol 100% al 20% v/v; SDS 20% al 0.2% v/v final. -Tampón de lavado PBS-Tween: Solución usada tanto para lavar las membranas durante la transferencia de las proteínas desde el gel de poliacrilamida como para los lavados en las incubaciones con los anticuerpos durante el proceso de western blotting. Composición: PBS 10X con Ca2+ y Mg2+ y detergente Tween al 0.2%. 60 3.3.8-Geles: Geles de poliacrilamida de la marca InvitrogenTM (gradiente de 8-16%). 3.3.9-Western-Blotting: -Marcador de peso molecular de proteínas: Sigma Marker Wide Range MW 6,500-250,00 (Sigma Aldrich®). -Sistema de detección luminol/peroxidasa. Sistema quimioluminiscente Super Signal® West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Scientific Pierce®). -Liquido revelador/fijador Ilford ® y películas de autorradiografía Hyperfilm ECL (Amersham®). -Anticuerpo monoclonal de conejo IKKα/β (Ser 176/180) (16A6) Cell Signaling Technology. -Anticuerpo monoclonal para miosina IIa #3403 (Cell signaling Technology). -Tween 20 (Sigma-Aldrich®, St Louis, USA). -PBS (Gibco® BRL, USA). -Albúmina sérica bovina (BSA) (Sigma-Aldrich®, St Louis, USA). 3.3.10-Medición de citoquinas en el sobrenadante: -BD OptEIA™ Mouse TNF ELISA Kit. -BD OptEIA™ Mouse IL-6 ELISA Kit. -Fosfato sódico 0.2M. -Buffer de lavado: PBS/0.05%Tween 20. -Tampón de bloqueo: BSA en PBS/Tween 20. 3.3.11-Medición de la MELn producida en sobrenadantes: -Kit ELISA detector de melatonina (IBL-Hamburg Diagnostic, Germany). 3.4-MATERIAL Y APARATOS EMPLEADOS 3.4.1-Material usado: -Pipetas Pasteur Copan innovation, LTD. -Pipetas estériles de plástico de 5 y 10 ml (Greiner bio-one®, Cellstar®). -Tubos de polipropileno de 15 ml estériles y de 50 ml (BD FALCONTM y Greiner bio-one® CELLSTAR®). -Tubos estériles DeltaLab S.A. de 15 ml. -Frascos estériles de 100 ml. Sorian genlab. SA. -Tubos eppendorf® de 1,5-2 ml. -Placas Petri estériles 10 ml SARSTEDT S.A. -Placas de 6 pocillos NunclonTM Delta Surface. -Frascos de cultivo de 75 cm2 SARSTEDT S.A. -Parafilm “M”, Laboratory Film (American National CanTM, Chicago IL). 61 -Geles Tris-Glicina de poliacrilamida en gradiente de 8-16%, Novex InvitrogenTM. -Papel Whatman®. -Puntas de plástico para pipetas: blancas, amarillas pequeñas, azules: Greiner bio-one, DIFCO. -Membrana de nitrocelulosa para la transferencia de proteínas (Amersham ibérica S.A.). -Cubeta de electroforesis Mini Protean Tetra Cell, de BioRad Inc. -Cristales y Sistema de geles BioRad Inc. -Cassette para revelado Gevamatic AGFA® Gevaert. -Recipientes de cristal para las incubaciones de las membranas con los anticuerpos en los WB. -Probetas, vasos de precipitados, matraces y otros utensilios necesarios. 3.4.2-Aparatos: -Campana de flujo laminar vertical TETSTAR AV-100 S.A. -Baño de incubación: tipo 31AT, 1200W (Heto-Holten A/S). -Incubador de CO2 para cultivos celulares (REVCO®). -Fuente de alimentación para electroforesis y transferencia modelo Amersham Pharmacia Biotech® EPS 301. -Centrífuga eppendorf Centrifuge 5804R. -Microcentrífuga refrigerada modelo Biofuge Fresco Heraeus Instruments, aceleración máxima de 16000g (Heraeus Instruments®). -Sistema de transferencia de proteínas semi-seco (Invitrogen). -Espectrofotómetro Ultrospec IIE, LKB Biochrom (Amersham Pharmacia). -Microscopio de luz invertida WILD M-40 HEERBRUGG. -Medidor de pH de Crison Instruments S.A, modelo Micro pH 2002. -Termobloque incubador de mircrotubos (Stuart Scientific®). -Pipetas automáticas Biopipette® (0.5µL.,2-20µL.,10-200µL. y 100-1000µL). -Agitador de balanceo S.B.S Instruments S.A. -Agitador Vortex Heidolph Reax 2000. -Agitador de placas L.K.B Wallace® 1296-001. -Autoclave (Raypa SL). -Balanza Meltler PC 220 Delta Range®. -Balanza de precisión Sarturius®. -Centrífuga eppendorf® 5417R. -Congelador hasta -40 ºC REVCO. -Congelador hasta -80 ºC REVCO. -Detector de fluorescencia LS 40, Perkin Elmer, Buckinghamshire, UK. -Evaporador de tubos Unijet II Refrigerated Aspirator. -Fuente de Corriente Biorad Mini-SUB cell GT. -HP integrador Hewlett-Packard, Palo Alto, CA. -pH Meter Basic 20 Crison®. 62 3.5-CULTIVOS CELULARES Las células RBL-2H3 crecieron en medio DMEM suplementado con suero fetal bovino descomplementado al 15%, L-glutamina 2 mM, así como los siguientes antibióticos: 100 U/ml penicilina, estreptomicina 100 µg/ml y anfotericina B (antifúngico). Las condiciones de incubación fueron CO2 al 5% y la temperatura a 37ºC. Las células usadas durante la experimentación se encontraban entre los pases 5 y 10. 3.6-PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES DE MELATONINA Y LUZINDOL Las soluciones stock fueron melatonina 1M y luzindol 10 mM. En ambos casos, se prepararon en DMSO y se guardaron, hasta su uso, a -20ºC. Posteriormente, antes de ser utilizadas y a temperatura ambiente, se elaboraron las diferentes soluciones para la experimentación. Para ello, se diluyeron las soluciones stock en medio DMEM estéril donde las concentraciones finales de los solventes fueron menores al 0.5%. 3.7-DISEÑO EXPERIMENTAL: -3.7.1-Activación de los mastocitos: Para activar químicamente a los mastocitos RBL-2H3 procedimos a cultivarlos en placas de 24 pocillos y con una densidad de 5x105 células/ml. En un segundo paso, se usó el compuesto PMACI para generar la estimulación química. Para ello usamos una solución en cultivo de PMA 5x10-7M y CI a 5x10-7M. que se añadió a los pocillos, donde estuvo durante diferentes tiempos 1/2h, 2h, 12h, 14h (Figura 1). A su vez, estudiamos los cambios morfológicos sufridos por las células mediante microscopía óptica y los niveles de citoquinas pro-inflamatorias como indicador de una correcta estimulación. 3.7.2-Protocolo: -Se sembraron las células en placas de 24 pocillos, y con medio DMEM (1ml), hasta que alcanzaron la densidad de 5x105 células/ml. -Se produjo la estimulación química con medio de cultivo y estimulación a las concentraciones de PMA 5x10-7M y CI 5x10-7M. -Se incubaron las placas a 37ºC y CO2 al 5%. -Las células estuvieron sometidas al estímulo químico por periodos de tiempo de: 30 minutos, 2 horas, 12 horas y 14 horas. -Se estudiaron los cambios morfológicos en las células RBL-2H3 mediante microscopía óptica. -Se estudió la viabilidad celular usando el ensayo MTT. 63 Figura 1. Esquema del diseño experimental para estudiar la activación de los mastocitos RBL-2H3. Los mastocitos fueron cultivados con 24h de antelación en una placa de 24 pocillos en medio DMEM (1ml). Tras alcanzar una densidad celular de 5x105 células/ml procedimos a añadir el estímulo químico (PMACI) en diferentes tiempos de estimulación: 1/2h, 2h, 12h y 14h; excepto en los pocillos control (sin estimulación). La viabilidad celular se estudió mediante ensayo MTT y los cambios morfológicos mediante microscopía óptica. 3.8-ANÁLISIS DE LA CITOPROTECCIÓN MEDIADA POR LA MELATONINA Para estudiar el papel de la melatonina en los cultivos, procedimos a realizar un pre-tratamiento durante 30 minutos con melatonina (MELx) tanto a concentraciones fisiológicas (1 nM y 100 nM) como farmacológicas (100 µM y 1 mM) (Figura 2). Según los resultados que obtuvimos, seleccionamos las concentraciones 100 nM y 1 mM como representante de las dosis fisiológicas y farmacológicas respectivamente, así como los tiempos de estimulación de 2 y 12 h para la experimentación. 70 sitios de unión. Además, cabe destacar, que el antígeno biotinilado unido al anticuerpo resulta ser inversamente proporcional a la concentración del analito presente en la muestra. Así en una situación de equilibrio, el antígeno biotinilado libre es eliminado durante los lavados; mientras que el antígeno biotinilado adherido al anticuerpo se distingue usando una estreptavidina fosfatasa alcalina que actúa como marcador y el p-nitrofenil fosfato que actúa como sustrato. Para poder cuantificarlo se utiliza la comparación de la actividad enzimática detectada en cada muestra estudiada respecto a una curva de respuesta obtenida a partir de estándares conocidos. En pasos previos, realizamos la recogida de los sobrenadantes que fueron centrifugardos a 1100xg durante 10 minutos, para descartar las células arrastradas. Posteriormente, se reservaron dos alícuotas para determinar las citoquinas pro-inflamatorias objeto de estudio. Así, cuando los sobrenadantes se obtuvieron y se resuspendieron los estándares pasaron por las columnas Waters® activadas según los pasos siguientes: 3.12.1-Protocolo: Acondicionamiento de las columnas: -Se colocaron las columnas de extracción en tubos de vidrio o propileno (12x75mm). -Se añadieron 1x1 mL de metanol (sin diluir). Las columnas fueron centrifugadas durante 1 minuto a 120g para que el solvente pase a su través. -Se añadieron 1x1 mL de agua bidestilada a todas las columnas. Hacemos que el solvente pase a través de la columna mediante su centrifugación durante 1 minuto a 120xg. -Se aplicaron las muestras sin demora, para evitar que las columnas se sequen. Aplicación de las muestras y los estándares: -Se colocaron las columnas de extracción en tubos de vidrio o polipropileno (12x75mm) que fueron rotulados debidamente. -Se añadieron 0.5 mL de los estándares, las muestras y los controles a las columnas. -Se añadieron 0.5 mL de agua bidestilada a las columnas, y se centrifugaron las columnas durante 5 minutos a 120xg. -Se lavaron las columnas añadiendo 2 x 1 mL de metanol al 10% en agua bidestilada (v/v) a las columnas; el solvente pasó a su través mediante centrifugación durante 5 minutos a 120 xg. Elución del extracto: -Se colocaron las columnas de extracción en tubos de vidrio o polipropileno (12x75mm) que fueron debidamente rotuladas. -Se añadió 1 mL de metanol (sin diluir) a las columnas y se centrifugaron 71 durante 5 minutos a 120xg para que el solvente pasara a su través. -Se extrajeron las columnas de los tubos (evitando que queden las columnas con gotas). Evaporación y reconstitución del extracto: -Se evaporó el metanol usando una centrífuga evaporadora. -Se reconstituyeron las muestras con 0.15 mL de agua bidestilada. -Se sometieron las muestras a Vortex al menos 1 minuto y se procedió a ensayar. La valoración de los niveles de melatonina se determinó mediante un kit comercial de radioinmunoensayo (IBL) consistente en: Componentes Cantidad Preparación Ratio Especificaciones Placa revestida con Ac. Policl. 96 pocillos Lista para su uso Melatonina biotinada 3x2ml 2ml de Tp de ensayo diluido En el momento Antisuero (liofilizado) 3x2ml 2ml agua destilada. En el momento Estándares de melatonina A-F 1x6x2ml En 2 ml de agua destilada. 15 minutos de agitación Enzima conjugado 1x250µl 70µl en 5.6 ml Tp. Ensayo diluido 1:81 En el momento Control 1+2 1x2x2ml En 2 ml. de agua destilada. 15 minutos de agitación Solución Tampón 1x50ml 15ml en 150 ml agua destilada 1:10 Lista para usar 4ªC Substrato PNPP 1x9 3 past. En 8ml Tp. substrato En el momento Tampón de substrato (10x) 1x27ml Diluir en agua destilada (1x) Lista para usar 4ªC Solución de Stop 1x5ml Lista para usar 4ªC Columnas de extracción 2x10 Metanol 10 ml en 100 ml agua destilada 10% Tabla 1. Kit comercial de radioinmunoensayo (IBL). Relación de componentes usados para la determinación de melatonina. 3.12.2-Procedimiento del ensayo: 72 -Se pipetearon 50 µL de cada estándar, controles y muestras extraídas en los respectivos pocillos de la placa de microtitración. -Se pipetearon 50 µL de Melatonina Biotina en cada pocillo. -Se pipetearon 50 µL de antisuero de melatonina en cada pocillo y se agita la placa con cuidado. -Se cubrió la placa con folio adhesivo y se agitó con cuidado. Posteriormente, se incubaron durante 14-20 h de 2-8ºC. -Se quitó el folio adhesivo y se eliminó la solución de incubación. Se lavó la placa 3 veces usando 250 µL de solución buffer de lavado diluida. Posteriormente, se eliminó el exceso de la solución golpeando cuidadosamente la placa invertida sobre un papel. -Se pipeteó 150 µL de conjugado enzimático, preparado en fresco, a cada pocillo. -Se cubrió la placa con un folio adhesivo y se incubó durante 120 minutos a temperatura ambiente (18-25ºC) en un agitador. -Se extrajo el folio adhesivo y se eliminó la solución de incubación. Se lavó la placa 3 veces con 250 µL de solución buffer de lavado diluida y se removió el exceso de solución golpeando con cuidado la placa invertida sobre un papel. -Se pipetearon 200 µL de solución de substrato PNPP en cada pocillo. -Se incubó la placa durante 40 minutos a temperatura ambiente (18-25ºC) en un agitador. -Se detuvo la reacción del sustrato añadiendo 50 µL de solución stop en cada pocillo. -Se mezcló el contenido agitando la placa con cuidado. -Se midió la D.O. a 405 nm, mediante un lector de placa (siendo su intensidad inversamente proporcional a la concentración de melatonina presente en las muestras). 73 Figura 5.- Representación esquemática de la técnica de ELISA para la determinación de la melatonina. Los valores de D.O. de los estándares fueron representados frente a sus concentraciones. Los valores de las muestras problema se obtuvieron directamente de la curva estándar. Para el caso de las muestras diluidas, estos valores fueron multiplicados por sus correspondientes factores de dilución. Los resultados fueron finalmente expresados en pg/ml de proteína. 3.13- ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN PROTEÍCA DE LA MIOSINA E IKKα/β MEDIANTE WESTERN BLOTTING: Usamos esta técnica con idea de detectar el nivel de proteínas específicas en las muestras estudiadas: células RBL-2H3 estimuladas, sin estimular y pre-tratadas con melatonina. Con ella se detecta la expresión de proteínas tanto citosólicas como nucleares que estén presentes en las muestras objeto de estudio. Este objetivo se alcanza usando la electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato-sódico (SDS) que fue descrita, en 1970, por Laemy. La técnica permite la separación de proteínas desnaturalizadas en función de su peso molecular durante su migración, a través de un gel de poliacrilamida, hacia el ánodo. El paso posterior, conlleva la transferencia de dichas proteínas a un gel de nitrocelulosa donde serán detectadas mediante una reacción quimioluminiscente en la cual se usan anticuerpos específicos para dichas proteínas. 3.13.1-Tratamiento de las muestras para la obtención de las proteínas: Las células fueron lisadas con buffer de lisado, y los lisados resultantes se incubaron durante 20 minutos a 4ºC. Los homogeneizados se centrifugaron a 400 g durante 10 minutos y a 4ºC, posteriormente, se recogieron los sobrenadantes. Éstos se desnaturalizaron con buffer de carga, durante 5 minutos a 95ºC. 3.13.2-Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS: La separación de las proteínas desnaturalizadas se llevó a cabo mediante geles de poliacrilamida en gradiente de 8-16%. Las muestras fueron desnaturalizadas durante 5 minutos a 95ºC en presencia del tampón de carga de proteínas donde están presentes agentes reductores tales como SDS o DTT que les confieren cargas netas negativas. Buffer de lisado: HEPES, EDTA, fluoruro sódico, Na PPi, Na3 VO4, H2O qsq, Tritón-X-100 1%v/v, inhibidor de proteasas. Tampón de carga de proteínas para electroforesis SDS-PAGE: Tris ácido 1M al 25% v/v; Glicerol al 50% v/v; SDS 10% p/v; DTT 100 mM; Azul de bromofenol 0.001% p/v; pH 6,8. 74 Una vez las muestras han sido desnaturalizadas y presentaron la misma cantidad de proteínas (150-200µg), fueron cargadas en los diferentes pocillos para proceder a su separación a través del gel y según su peso molecular. Para ello, se añadió tampón de electroforesis en gel de poliacrilamida o “running buffer” y se sometieron los geles a una corriente de 70 voltios (V) aumentándose gradualmente hasta los 150 V cuando el frente de migración contactó con el gel de separación (Figura 6). Figura 6.- Representación esquemática del sistema de electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS usado. 3.13.3-Transferencia de las proteínas a la membrana de nitrocelulosa: Se realizó una transferencia electroforética de las proteínas desde el gel de poliacrilamida a la membrana de nitrocelulosa. El sistema de transferencia usado fue semi-seca semi-dry blotter (Sigma-Aldrich) según las pautas de dicha casa comercial. El proceso se llevó a cabo sobre una placa conductora-ánodo donde se colocaron tres papeles Whatmann, la membrana, el gel con las proteínas y sobre este conjunto tres papeles Whatmann más; todo ello humedecido con tampón de transferencia (Figura 7). La transferencia se llevó a cabo aplicando una corriente que varía en función de Tampón para la electroforesis en gel de poliacrilamida (“running buffer”): Tris-Glicina al 10% v/v; (Tris Base 250mM; Glicina 1,92M); SDS en stock del 20% al 0.5% v/v final. Tampón para la transferencia de las proteínas del gel de poliacrilamida: Tris-Glicina al 10% v/v (Tris Base 250 mM; Glicina 1,92 M); Metanol 100% al 20% v/v; SDS 20% al 0.2% v/v final. 75 la superficie del gel (0.8mA/cm2) a un tiempo determinado por el peso molecular de la proteína que quiere ser estudiada, en este caso 20 minutos. A su vez, la eficacia del proceso de transferencia se comprobó al teñir la membrana con una solución de Ponceau durante 1 minuto. Posteriormente, se llevaron a cabo varios lavados con PBS. Una vez realizado este paso, se saturó la membrana usando una solución de bloqueo (Albúmina 3% p/v) durante 1 hora, lo que permite evitar las uniones inespecíficas de los anticuerpos. Figura 7.- Representación esquemática del sistema usado para la transferencia de las proteínas a la membrana de nitrocelulosa. 3.13.4-Detección de las proteínas: Una vez las membranas fueron bloqueadas, se procedió a su incubación con los anticuerpos primarios específicos para las proteínas-receptor a estudiar en tampón de bloqueo, con las siguientes condiciones: durante 2 horas a temperatura ambiente y con agitación constante. Las membranas fueron lavadas (5 minutos) con tampón Tris Tween-20 para, posteriormente, incubarlas en presencia de los anticuerpos secundarios requeridos en las siguientes condiciones: 1 hora de incubación a temperatura ambiente. Tras este periodo de incubación se procedió a lavar las membranas del 76 anticuerpo secundario, y se procedió a la detección de los inmunocomplejos formados mediante una reacción de quimioluminiscencia. Esta técnica consiste en añadir sobre las membranas los reactivos del kit de Supersignal ®, que son: luminol y H2 O2 – en proporción 1:1- durante 5 minutos y en agitación. Durante este tiempo se produce la siguiente reacción: la catalización del proceso de oxidación del luminol por la enzima peroxidasa. Una vez finalizada esta fase, se produjo el revelado de dichas membranas al colocarlas entre dos acetatos que, en oscuridad, fueron expuestos a películas autorradiográficas (kodak Biomax XAR Film, Sigma Aldrich, EEUU) para detectar la señal (Figura 8). Figura 8.- Representación esquemática del sistema usado para la detección y el revelado de las proteínas presentes en la membrana de nitrocelulosa. 3.13.5Medida de la concentración proteica: Para detectar las proteínas, las membranas se incubaron durante 5 minutos en oscuridad y posteriormente, se procedió a su lectura a 595 nm usando un espectrofotómetro. 3.13.6-Protocolos: Para el anticuerpo de Misoina IIa (Myosin IIa antibody #3403 Cell signaling Technology): -Se lisaron las células con buffer de lisado. -Se incubaron los lisados resultantes durante 20 minutos a 4ºC. -Se desnaturalizaron los sobrenadantes solubles con buffer de carga durante 5 minutos a 95ºC (Preparación para SDS-PAGE y la transferencia electroforética a membranas de nitrocelulosa) -Se bloquearon las membranas durante 1 hora a temperatura ambiente con PBS-T. -Se incubaron con el primer anticuerpo de conejo, anti Myosin IIa fosforilada en Ser 1943, durante 3 horas a temperatura ambiente. 77 -Se lavó tres veces con PBS-T. -Se incubó 1 hora con el segundo anticuerpo de cabra, anti inmunoglobulina de conejo acoplada con peroxidasa de rábano (HRP). -Se detectó la actividad luminol/peroxidasa. Para el anticuerpo de conejo para IKKalpha/beta (IKK alpha/beta (Ser 176/180) (16A6) Rabbit mAb): -Se lisaron las células con buffer de lisado. -Se incubaron los lisados resultantes durante 20 minutos a 4ºC. -Se desnaturalizaron los sobrenadantes solubles con buffer de carga durante 5 minutos a 95ºC (Preparación para SDS-PAGE y la transferencia electroforética a membranas de nitrocelulosa). -Se bloquearon las membranas durante 1 hora a temperatura ambiente con PBS-T. -Se incubaron con el primer anticuerpo de conejo anti fosfo-IKKalpha/beta (Ser176/180) durante tres horas a temperatura ambiente. -Se lavó tres veces con PBS-T. -Se incubó 1 hora con el segundo anticuerpo de cabra, anti inmunoglobulina de conejo acoplada con peroxidasa de rábano (HRP). -Se detectó la actividad luminol/peroxidasa. 3.14-MÉTODOS ESTADÍSTICO: Los análisis estadísticos de los resultados obtenidos en las experiencias de cuantificación del contenido de citoquinas, melatonina, test de viabilidad celular y otros ensayos in vitro son expresados como la media aritmética ± el error estándar de la media (S.E.M.) del número de experimentos (n) indicado en cada caso. Las imágenes de western blotting son representativas de, al menos, cuatro experimentos realizados individualmente, en días diferentes. Los resultados se expresaron normalizados con la densidad optica (D.O.) expresada por las células control sin tratamiento de melatonina. El análisis estadístico ha sido realizado utilizando el programa informático GraphPad InStat statistical software package program 3.0. y la significación de las diferencias entre los grupos ha sido evaluada empleando el test de ANOVA seguido del test de comparaciones múltiples Tukey-Kramer y del t student test. La diferencia entre los valores obtenidos se consideró estadísticamente significativa a partir de P<0.05. 78 RESULTADOS 79 4.-RESULTADOS 4.1.- Inducción de citotoxicidad con PMACI Para conseguir dicho objetivo, sometimos los cultivos celulares a diferentes tiempos de exposición a PMACI: ½, 2, 12, y 14 horas. En todos los casos, la estimulación química condujo a la reducción de la viabilidad celular, dependiendo de los tiempos de exposición y observando que a mayor periodo de exposición detectamos menor viabilidad celular y viceversa. Cuando expusimos los cultivos al estímulo químico (PMACI) durante 14h detectamos la mayor reducción en la viabilidad celular. Como podemos observar en la figura 1, la disminución de los valores de viabilidad celular para las células estimuladas (C*) es estadísticamente significativa (**p<0.01) y (***p<0.001) con respecto a los valores obtenidos para las células sin estimular (C). Esta gráfica de tiempo nos permitió seleccionar las 2 y 12h, de exposición a PMACI, como los mejores tiempos para realizar el resto de los experimentos. Análisis de la cinética de tiempo para la citotoxicidad mediada por PMACI 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% 1/2h 2h 12h 14h Viabilidad celular Células sin estimular: C Células estimuladas: C* *** *** ** Figura 1. Análisis de la cinética de tiempo para la citotoxicidad mediada por PMACI. Los células RBL-2H3 crecieron en medio con suero fetal bovino descomplementado, CO2 al 5% y 37ºC. Posteriomente, fueron sometidas a diferentes tiempo de exposición (1/2h, 2h, 12h y 14h) a PMACI (estímulo químico) lo que produjo, en todas ellas, la disminución de la viabilidad celular con valores estadísticamente significativos (**p<0.01) y (***p<0.001) respecto a las células no estimuladas. La máxima citotoxicidad se alcanzó cuando el tiempo de exposición fue de 14h. Bajo estas condiciones, las células sufrían cambios extremos en su morfología a consecuencia de los cuales mostraban formas redondeadas, citoplasma 86 de TNF-α y de IL-6 generadas por la estimulación química (PMACI), pre-tratamos (1/2h) las células con diferentes concentraciones de melatonina. Tras esta experimentación, seleccionamos las concentraciones de melatonina, para el pretratamiento de las mismas, a 100 nM como dosis fisiológica y a 1 mM como dosis farmacológica. Tras el pretratamiento con melatonina, las células fueron lavadas varias veces y sometidas al estímulo químico con PMACI durante 12h. El análisis del sobrenadante de los cultivos, mediante técnicas de ELISA, nos permitieron conocer que MELx 100nM redujo la síntesis y liberación de TNF-α e IL-6 en los mastocitos estimulados con efectos inhibitorios del 30% y 40% respectivamente. Esta inhibición fue más marcada a mayores concentraciones de MELx usadas en el pretratamiento. Así, para MELx 1mM el efecto inhibitorio fue del 60% y 55%, respectivamente (Figura 8 y Tabla 1). Citoquinas Pretratamiento % Inhibicion secreción Melatonina 30 min. Preincubacion TNF- α 100nM 30% ± 2.8% 1mM 60% ± 1.7% IL-6 100nM 40% ± 3.3% 1mM 55% ± 2% MELn 100nM 24% ± 3.9% 1mM 33% ± 2.5% Tabla 1. Estudio del efecto de la melatonina exógena (MELx) sobre la liberación de citoquinas pro-inflamatorias y MELn en cultivos celulares de RBL-2H3 con estimulación química (PMACI). En esta tabla indicamos los porcentajes de inhibición de TNF-α, IL-6 y MELn procedentes de los mastocitos RBL-2H3 sometidos a 30 minutos de pretratamiento con MELx, dosis fisiológicas 100µM y farmacológicas 1 mM, antes de la estimulación con PMACI durante 12h. 4.8.-Estudio del efecto de la melatonina exógena (MELx) sobre la síntesis y liberación de melatonina endógena (MELn) en cultivos de RBL-2H3 en respuesta a PMACI Para conocer si el pretratamiento con MELx, a dosis fisiológicas y farmacológicas (100 nM y 1 mM), puede modular la producción de MELn inducida por la presencia de PMACI, añadimos luzindol, un antagonista de los receptores de membrana de melatonina MT1 y MT2 [Rivara et al.,2005], durante 30 minutos. Destacamos aquí, que después de esta pre-incubación las células fueron lavadas tres 87 veces y activadas con PMACI. La figura 9 y la tabla 1, nos muestra como los mastocitos pretratados con MELx 100nM y 1mM y estimulados con PMACI, redujeron la síntesis y liberación de MELn en un 24% y 33%, con valores estadísticamente significativos *p<0.05 y ***p<0.001 respectivamente. Cuando el antagonista luzindol fue usado concomitantemente con el pretratamiento MELx, el efecto inhibitorio de MELx (100 nM y 1 mM) sobre la síntesis y liberación de MELn fue bloqueado, aunque no enteramente, y sólo a la dosis farmacológica de MELx 1mM presentó valores estadísticamente significativos *p<0.05. Concentración de MELn en el sobrenadante de cultivos de RBL-2H3 0 50 100 150 200 250 300 350 Control Control Vehicle C C* MELx100nM+C* MELx1mM+C* LZD+C* MELx100nM+LZD+C* MELx1mM+LZD+C* Células RBL-2H3 estimuladas y no estimuladas *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001 % de cambio en la secreción de MELn (pg/ml) ** *** * *** * Figura 9. Efecto inhibitorio de la MELx sobre la síntesis y liberación de la MELn, inducida por el estímulo con PMACI, bloqueado al usar luzindol. Las células RBL-2H3, crerieron en medio con suero fetal bovino descomplementado, CO2 al 5% y 37ºC, fueron pretratadas con melatonina y, posteriormente, estimulados químicamente (PMACI) durante 12h. Tras estudiar el sobrenandante de dichos cultivos mediante ELISA constatamos que el pretratamiento con MELx (100nM y 1mM) redujo la sintesis y liberación de MELn por parte de los mastocitos estimulados, con valores estadisticamente significativos *p<0.05 y ***p<0.001 respectivamente. El uso de luzindol bloqueó estos efectos alcanzandose valores significativos con la dosis farmacológica de 1mM de MELx *p<0.05. 4.9-Estudio del efecto de la melatonina exógena (MELx) sobre los mecanismos intracelulares responsables de la citoprotección Para conocer los mecanismos intracelulares responsables de la citoprotección que la MELx ejerce sobre los mastocitos estimulados y sobre su capacidad para 88 reducir las citoquinas pro-inflamatorias, estudiamos el efecto que el pretratamiento MELx ejerce sobre: A) la proteína Miosina AII y B) El factor nuclear NF-κβ mediante técnicas de Western Blot. A) La Miosina AII: La miosina es una proteína que la encontramos formando parte del citoesqueleto de las paredes de los gránulos mastocitarios, donde se almacenan los mediadores solubles de la inflamación. Esta proteína puede ser fosforilada y activada por la proteína quinasa C (PCK), AMP-cíclico dependiente, permitiendo la movilidad y migración del gránulo hacia la membrana plasmática del mastocito generando la exocitosis del mismo. Al estimular químicamente los cultivos de mastocitos con PMACI durante 2h., se induce la activación de la PKC y la fosforilación de la Miosina, liberándose los mediadores inflamatorios. En nuestra experimentación, determinamos que el pre-tratamiento con MELx a concentración fisiológica 100 nM y farmacológica 1 mM, no interfirió en la modificación de esta ruta, ni la dosis fisiológica ni la farmacológica (Figura 10). Figura 10. Resultado de la técnica de Western Blot al estudiar el efecto de la MELx sobre la Miosina IIa, en los mastocitos estimulados con PMACI, durante 2h. Los resultados muestran que MELx no tuvo ningún efecto sobre dicha ruta de activación. B) Al estimular químicamente los cultivos de mastocitos con PMACI durante 2h., se induce la fosforilación de IKβ. IKβ forma parte del complejo IKKα/β necesario para la activación del factor NF-κβ que a su vez activa la transcripción 89 nuclear de los genes de las citoquinas TNF-α e IL-6, así como la síntesis de MELn en el proceso de liberación de mediadores inflamatorios mastocitarios. En nuestra experimentación determinamos que el pre-tratamiento con MELx a concentración fisiológica 100 nM y farmacológica 1 mM, interfiere, al menos en parte, en la fosforilación necesaria para la activación del complejo IKKα/β, inhibiéndola; por eso los niveles de IKK-α fosforilada son menores al aumentar la concentración de melatonina. En la figura 11 podemos observar como los niveles de mayor expresión de IKKα/β corresponden a los mastocitos estimulados con PMACI y no tratados. Estos niveles decaen proporcionalmente al pretratar con MELx 100nM (* p<0.05) y MELx 1mM (**p<0,01). pIKKa Tubulin PMA 5·10-7 M + CI 5·10-7 M - + + + [Melatonin] (mM) - - 0,1 1 Normalized O.D. WB: anti-phospho-IKK/(Ser176/180) PMA 5·10-7 M + CI 5·10-7 M - + + + [Melatonin] (mM) - - 0,1 1 Figura 11. Resultado de la técnica de Western Blot al estudiar el efecto inhibidor de la MELx sobre la fosforilación de los factores IKKα/β inducida por la estimulación con PMACI durante 2h en cultivos de mastocitos. Los resultados muestran que los niveles de expresión de IKKα/β decaen de manera proporcional tras el pretratamiento con MELx a concentraciones fisiológicas y farmacológicas en los cultivos. 90 DISCUSIÓN 91 5.- DISCUSIÓN La inflamación es un proceso defensivo que requiere la coordinación exhaustiva entre las diferentes fases de su desarrollo: inicio, mantenimiento y resolución. En cada una de estas fases están implicadas células y moléculas cuyo preciso control aún no está claramente establecido. En este sentido, hemos basado nuestro estudio en los mastocitos, células del sistema inmune innato en cuyo citoplasma se encuentran multitud de gránulos, repletos de histamina y otros mediadores, responsables de la inflamación. Están colocados en lugares estratégicos del organismo, en contacto con el exterior, como por ejemplo la piel y las mucosas respiratorias y digestivas. Poseen numerosos receptores de superficie que les permiten activarse y defendernos de patógenos y otros estímulos nocivos [Rich RR, 2013]. Los mediadores liberados por los mastocitos, poseen actividades pro y/o anti-inflamatorias que orquestan de forma mancomunada las diferentes fases del proceso. La presencia de moléculas con actividades contrapuestas es fundamental para la regulación de la inflamación en el tiempo y el espacio [Caelles et al., 2017]. En este sentido, hemos investigado el papel del PMACI, un estímulo químico, que provoca activación y citotoxicidad en la línea celular RBL-2H3, y lo hace dependiendo de la dosis y el tiempo de exposición. Esta citotoxicidad la hemos puesto de manifiesto por una disminución de la viabilidad celular y alteraciones morfológicas en las cuales se podía apreciar una pérdida de la forma fusiforme y la adhesividad celular, así como la presencia de cuerpos apoptóticos. Estos cambios eran tanto más pronunciados, cuanto mayor era el tiempo de exposición a PMACI (≥ 14h) [Maldonado et al., 2010, Maldonado et al.,2013; Maldonado et al.,2016]. Por otro lado, conocíamos la molécula de melatonina, liberada de la glándula pineal [Stehle et al., 2011] y otros lugares extrapineales entre los cuales se encuentran las células del sistema inmune [Das et al., 2008]. Aquí, está implicada en numerosas funciones fisiológicas entre las que se encuentran su papel antioxidante, inmunomulador o antiinflamatorio [Maldonado et al., 2010; Maldonado et al.,2012]. Numerosos investigadores habían puesto de manifiesto el papel de citoprotección de la melatonina en las células del sistema inmune como, por ejemplo, en los monocitos [Radogna et al., 2007; Radogna et al., 2010], en los linfocitos T CD4+ [Pedrosa et al., 2010], en los linfocitos B [Paternoster et al., 2009], etc., sin embargo, poco se sabía sobre su labor sobre los mastocitos. La mayoría de investigadores coincidían en la idea de que la melatonina ejercía sus funciones citoprotectoras por medio de la regulación del estrés oxidativo, la apoptosis y la homeostasis mitocondrial [Espino et al., 2010b, Reiter et al., 2012, Rosales-Corral et al., 2012b]. Algunas de estas actividades son mediadas por medio de los receptores específicos de melatonina [Imbesi et al., 2009; Shiu et al., 2010] y otras son receptores independientes [Reiter et al., 1996; Tan et al., 2002], incluimos también las interacciones de la melatonina con las especies reactivas del oxígeno (ROS) y aquellas mediadas por sus metabolitos bioactivos [Tan et al., 2007; Hardeland, 2009; Schaefer and Hardeland, 2009]. En previos estudios de esta línea de investigación, demostramos que los 92 mastocitos tienen la maquinaria suficiente para sintetizar y liberar melatonina, como si se tratara de una citoquina más y también la capacidad para expresar, en su superficie, los receptores de membrana MT1 y MT2 [Maldonado et al., 2010]. Además, encontramos que cuando los mastocitos son estimulados con PMACI, estos aumentan la síntesis y liberación de melatonina y citoquinas pro-inflamatorias, así como la expresión de sus receptores MT1 y MT2 [Maldonado et al., 2010; Maldonado et al., 2016]. Estos datos nos sugieren que los mastocitos pueden absorber la melatonina del espacio intercelular, tras su liberación, y por un mecanismo autocrino o paracrino, frenar así la excesiva activación mastocitaria [Maldonado et al., 2010]. Pensábamos que los mastocitos tras la sobrestimulación con PMACI, actuaban aumentando la producción de melatonina y los receptores de membrana como un mecanismo de contrabalanceo para compensar y mejorar la sobrestimulación y situación de citotoxicidad generada. Los hallazgos de nuestro trabajo, en esta tesis, confirmaron nuestras hipótesis y demuestran que el tratamiento con melatonina promueve la citoprotección sobre las células de la línea celular RBL-2H3 y que este efecto está directamente relacionado con la concentración de la melatonina utilizada. Así, las concentraciones farmacológicas de melatonina empleadas (1mM) aumentaron la citoprotección en los mastocitos con valores estadísticamente significativos en todos los casos (Figura 3 y 4). Mientras que las dosis fisiológicas de melatonina (100nM) sólo lo hicieron tras 12h de exposición (Figura 4). La citoprotección ejercida por la melatonina en los mastocitos fue llevada a cabo mayoritariamente a través de los receptores de membrana de alta afinidad MT1 y MT2 [Maldonado et al., 2010]. Considerando que la melatonina es conocida por su capacidad para neutralizar especies reactivas de oxígeno, aumentar la eficiencia del transporte mitocondrial de electrones y promover la actividad de enzimas anti-oxidantes como: glutatión peroxidada, superoxido dismutasa y catalasa [Rodríguez et al., 2004]; proponemos que un posible mecanismo por el que la melatonina ejercería su acción citoprotectora podría ser la generación de un campo endógeno citoprotector alrededor de los mastocitos, por acumulación de melatonina, y la actuación sobre los receptores MT1 y MT2 mastocitarios inhibiéndolos [Reiter et al., 2000; Maldonado et al., 2010]. Además, la melatonina es una molécula anfifílica [Shida et al.,1994; Ceraulo et al., 1999], lo que significa que puede cruzar libremente las bicapas lipídicas de las membranas celulares y distribuirse por los compartimentos acuosos entre los cuales podemos incluir el citosol, el núcleo o la mitocondria [Menendez-Pelaez et al., 1993, Acuña-Castro et al., 2001, Acuña-Castro et al., 2003]. Estas propiedades de anfifilicidad podrían explicar porque en la figura 6 el luzindol, un antagonista no selectivo de los receptores de la melatonina, bloquea la protección ejercida por la melatonina 1mM, aunque no enteramente. Probablemente, la melatonina está aún presente en los mastocitos, ejerciendo su citoprotección vía receptor independiente [Reiter et al., 2007; Maldonado et al., 2013]. 93 Todos estos datos nos sugieren que los mastocitos no sólo poseen un papel inicial en la respuesta inflamatoria defensiva, importantísima para la supervivencia, sino que también es clave, por su capacidad citoprotectora con la melatonina, en la restauración y recuperación de la homeostasis de los tejidos afectados. Numerosos agentes, externos o internos, pueden iniciar la respuesta inflamatoria mastocitaria a través de la activación de una red de rutas de señalización de entre las que se encuentra la activación del factor nuclear NF-kβ [Mohan et al.,1995; Baeuerle and Baichwal, 1997]. PMACI, el compuesto que hemos utilizado para activar a los mastocitos, está formado por la unión de PMA (forbol-12-miristato-13-acetato) y Ca++ (Calcio ionóforo A23187), dos compuestos que por sí solos inducen la activación de NF-kβ en los mastocitos [Mohan et al., 1995; Manna et al., 1998; Cikler et al., 2005; Kim et al., 2006]. Esta activación con PMACI conduce a la disociación del complejo NF-kβ/IkB y la migración de NF-kβ al núcleo, promoviendo la síntesis de citoquinas [Gosh and Baltimore, 1990; Mohan et al.,1995; Kim et al., 2014]. Un aumento de la actividad NF-kβ asociada a la secreción elevada de citoquinas pro-inflamatorias, como el TNF-α y la IL-6, han sido encontradas en las respuestas inflamatorias de carácter alérgico [Trefzer et al., 2003; Kim et al., 2013]. TNF-α e IL-6 median respuestas multifuncionales incluyendo supervivencia celular, crecimiento, diferenciación y la respuesta inflamatoria defensiva de los mastocitos [Lippert et al., 2000]. En los últimos años, se han puesto de manifiesto los beneficios terapéuticos que tienen los tratamientos con agentes anti-inflamatorios de enfermedades cuya base anatomopatológica no era otra que la inflamación crónica, pero que hasta recientemente no se había identificado este componente inflamatorio [Lippert et al., 2000; Gregor and Hotamisligil, 2011; Kim et al., 2013; Shalapour and Karin, 2015; Caelles et al., 2017]. Por ello, pensamos que, centrando nuestra atención en regular la producción de citoquinas pro-inflamatorias por los mastocitos, como TNF-α e IL-6, podría ayudar en el control temporo-espacial de la inflamación y a generar herramientas terapéuticas útiles para las enfermedades de base inflamatoria. En esta dirección, estudiamos los efectos de la melatonina administrada desde el exterior o exógena (MELx) sobre la hiperestimulación y liberación de TNF-α, IL-6 y melatonina endógena (MELn) o producida por los propios mastocitos. El PMACI estimuló a los mastocitos llevándolos a un estado de hiperactividad que se puso en evidencia por una disminución en la viabilidad celular y por la liberación de citoquinas como TNF-α, IL-6 y MELn en el medio (Figura 8, 9 y tabla 1). Cuando los mastocitos fueron pre-tratados con MELx, 100nM y 1mM, media hora antes del estímulo con PMACI, la viabilidad celular mejoró y significativamente se redujeron los niveles de producción de TNF-α, IL-6 y MELn (Tabla 1). Los efectos fueron dosis-dependientes, con resultados óptimos tanto a dosis fisiológicas (100nM) como farmacológicas (1mM) (Figuras 8 y 9). Así, el efecto inhibitorio de MELx sobre la producción de TNF-α e IL-6 fue del 30% y 40% para 94 la dosis fisiológica, y de 60% y 55% respectivamente, para la farmacológica (Tabla1). Curiosamente, nuestros resultados muestran (Figura 9) como los mastocitos, sin estimular, también secretan MELn y como la estimulación con PMACI aumentó la producción en un 63%. Probablemente los mastocitos de forma constitutiva sintetizan y liberan melatonina como una molécula inmunoreguladora implicada en el mantenimiento de la homeostasis oxidante-antioxidante o sincronizando los efectos pro-inflamatorios y anti-inflamatorios en condiciones forzadas y fisiológicas celulares. Luego, al activarse los mastocitos liberarían MELn como un mediador de inicio de la inflamación, posteriormente la propia MELn pondría en marcha mecanismos para mitigarla [Galli et al., 1996; Galli et al., 2005; Maldonado et al., 2010]. Estos resultados sugieren que la melatonina exógenamente añadida (MELx) puede interferir con la melatonina endogenamente generada MELn (Tabla 1). Parece ser que los efectos de MELx, sobre los mastocitos, son sólo relevantes cuando se producen situaciones de daño o agresión celular. Los mastocitos podrían estar actuando como sensores de dicho daño o lesión, detectando el riesgo celular y exacerbando la inflamación a través de la liberación adicional de MELn [Enoksson et al., 2011]. Como ocurre en otras muchas células del sistema inmune, la estimulación de los mastocitos activa la vía de señalización del NF-kβ, la cual juega un importante papel en la síntesis de MELn, por inducción de la activación de la enzima Arylakylamina-N-acetiltransferasa (AA-NAT) [Pontes et al., 2006; Muxel et al., 2012; Hu et al., 2013; Markus et al., 2013; Villela et al., 2014]. El mismo grupo de investigadores [Pontes et al., 2006; Muxel et al., 2012], completaron la hipótesis añadiendo que la trascripción de los genes que codifican la enzima AA-NAT podría estar bajo el control del factor NF-kβ, dado que los elementos KB están presentes en el promotor y en el primer intrón [Marcus et al., 2007]. Esto fue confirmado por el control de expresión de una proteína roja, con parte del promotor y el primer intrón de estos genes, en monocitos [Marcus et al., 2013; Pires-Lapa et al., 2013]. Los autores claramente muestran que cuando el NF-kβ se transloca al núcleo, por la acción de diferentes estímulos, los genes de la proteína roja y los de la enzima AA-NAT son transcritos y melatonina es detectada en el medio de cultivo. Esto mismo podría estar ocurriendo con los mastocitos cuando se les estimula con PMACI y aumentan los niveles de MELn en el medio de cultivo (Figura 9). MELn estaría actuando como un restaurador del balance fisiológico dentro y fuera del mastocito. Considerando que en la ruta de señalización del NF-kβ existen múltiples componentes, existirán también numerosos métodos y pasos en los que poder inhibir al NF-kβ activado [Zhang et al., 2015] (Figura 12). 95 Figura 12. Propuesta esquemática del posible efecto anti-inflamatorio de la melatonina sobre el proceso de la inflamación aguda. La activación de NF-kβ por estímulos pro-inflamatorios implica a la fosforilación de Ser 177 y 181 del IKKβ, y Ser176 y 180 del IKKα [Mercurio et al., 1997; Ling et al., 1998]. De acuerdo a nuestros resultados, las RBL-2H3 estimuladas con PMACI, presentan una profunda inducción de la fosforilación de la IKKα, comparadas con las células sin estimular (Figura 11). El pretratamiento con MELx, antes de la estimulación con PMACI, a concentraciones fisiológicas 100nM y farmacológicas 1mM, previene la fosforilación de IKKα y los efectos sobre la cascada IKK/IkB, contribuyendo a su vez al bloqueo de la activación del NF-kβ. Los efectos inhibitorios de la melatonina sobre la actividad NF-kβ han sido también encontrados en otras células del organismo como, por ejemplo: los macrófagos [Gilad et al., 1998], células musculares [Alonso et al., 2006], hepatocitos [Liang et al., 2009] o neuronas [Ali et al., 2015]. Así, este efecto inhibitorio del NF-kβ juega un papel primordial en la disminución del daño inflamatorio generado en células y tejidos [Li et al., 2005]. Aunque nuestros resultados demuestran que la melatonina reduce la fosforilación de IKKα, no podemos olvidar que no es la única subunidad catalítica implicada (IKKα e IKKβ) y todas ellas, con similares habilidades, para fosforilar la proteína IkB de forma redundante y solapada; algunos experimentos de mutagénesis dirigidos directamente al sitio proponen que IKKα e IKKβ pueden poseer funciones reguladoras distintas [Ghosh and Karin, 2002; Olivotto et al., 2015]. Las dos kinasas centrales IKKα e IKKβ activan al NF-kβ que puede translocarse al núcleo y desde allí regular la expresión de genes diana específicos. La ruta de señalización canónica conducida por IKKβ regula la mayoría de 102 Abbas, A. K., Lichtman, A. H., Baker, D. L., & Pober, J.S. (2002). Inmunología celular y molécular. 4º Ed. Iberoamericana-McGraw-Hill. Abrink, M., Grujic, M., & Pejler, G. (2004). Serglycin is essential for maturation of mast cell secretory granule. The Journal of Biological Chemistry, 279(39), 40897–905. https://doi.org/10.1074/jbc.M405856200 Acuña-Castroviejo, D., Escames, G., León, J., Carazo, A., & Khaldy, H. (2003). Mitochondrial regulation by melatonin and its metabolites. Advances in Experimental Medicine and Biology, 527, 549–57. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15206773 Acuña-Castroviejo, D., Martín, M., Macías, M., Escames, G., León, J., Khaldy, H., & Reiter, R. J. (2001). Melatonin, mitochondria, and cellular bioenergetics. 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