Las manchas negras de la cueva de Lascaux: origen, evolución y caracterización de un brote fúngico

Pedro María Martín Sánchez Origen, evolución y caracterización de un brote fúngico Las manchas negras de la cueva de Lascaux: Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla © Pedro María Martín Sánchez Diseño y maquetación: Pedro María Martín Sánchez Portada: Fotografía del panel izquierdo de la Sala de los Toros, © Ministerio de Cultura y Comunicación, Francia. Diseño de Pedro María Martín Sánchez. Editado por: Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla, IRNASCSIC, España, Abril 2012. I.S.B.N.:978-84-695-3499-1 Impreso en España – Printed in Spain T odos los derechos reservados. La totalidad o una parte de este libro no puede ser reproducida o utilizada en cualquier forma o medio, electrónico o mecánico, incluyendo copias o grabaciones o por cualquier medio de almacenar información y sistema de recuperación, sin previo permiso por escrito del IRNAS-CSIC. Las manchas negras de la cueva de Lascaux: origen, evolución y caracterización de un brote fúngico 18 de Abril de 2012 Memoria que presenta Pedro María Martín Sánchez para optar al título de Doctor en Biología por la Universidad de Sevilla Las manchas negras de la cueva de Lascaux: origen, evolución y caracterización de un brote fúngico Visado en Sevilla, a 18 de Abril de 2012 EL DIRECTOR LA TUTORA Dr. D. Cesáreo Sáiz Jiménez Profesor de Investigación Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla CSIC Dra. Dña. Carolina Sousa Martín Profesora Titular Departamento de Microbiología y Parasitología Facultad de Farmacia Universidad de Sevilla DOCTOR. D. CESÁREO SÁIZ JIMÉNEZ, PROFESOR DE INVESTIGACIÓN DEL INSTITUTO DE RECURSOS NATURALES Y AGROBIOLOGÍA DE SEVILLA DEL CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS Certifica: Que la presente Memoria de Investigación titulada “Las manchas negras de la cueva de Lascaux: origen, evolución y caracterización de un brote fúngico”, presentada por D. Pedro María Martín Sánchez para optar al grado de Doctor en Biología, ha sido realizada en el Departamento de Geoecología, Biogeoquímica y Microbiología Ambiental, bajo mi dirección reuniendo todos los requisitos exigidos. Y para que así conste, se expide y firma el presente certificado En Sevilla, a 18 de Abril de 2012 Fdo: Prof. Dr. D. Cesáreo Sáiz Jiménez DOCTOR D. JOSÉ MANUEL PARDO PRIETO, DIRECTOR DEL INSTITUTO DE RECURSOS NATURALES Y AGROBIOLOGÍA DE SEVILLA DEL CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS Certifica: Que la presente Memoria de Investigación titulada “Las manchas negras de la cueva de Lascaux: origen, evolución y caracterización de un brote fúngico”, presentada por D. Pedro María Martín Sánchez para optar al grado de Doctor en Biología, ha sido realizada en el Departamento de Geoecología, Biogeoquímica y Microbiología Ambiental, bajo la dirección del Prof. Dr. D. Cesáreo Sáiz Jiménez, reuniendo todas las condiciones exigidas a los trabajos de Tesis Doctorales. Y para que así conste se expide y firma el presente certificado En Sevilla, a 18 de Abril de 2012 Fdo: Dr. D. José Manuel Pardo Prieto El trabajo presentado en esta memoria ha sido financiado por: Proyecto: “Écologie microbienne de la grotte de Lascaux”. Ministerio de Cultura y Comunicación, Francia. Proyecto CONSOLIDER CSD2007-00058: “Programa de Investigación en Tecnologías para la conservación y revalorización del Patrimonio Cultural (TCP)”. Ministerio de Ciencia e Innovación, España. i Agradecimientos En primer lugar, me gustaría agradecer a Cesáreo Sáiz el haberme ofrecido la posibilidad de realizar esta Tesis Doctoral, gracias por tu confianza y reconocimiento durante estos años. Sin duda, tus directrices y aportaciones han hecho posible el desarrollo de esta investigación y la consecución de los objetivos marcados. Eres un ejemplo de dedicación científica, cualquiera que te conozca puede confirmarlo. A Carolina Sousa, del Departamento de Microbiología y Parasitología de la Universidad de Sevilla, por la ayuda prestada. A todos los que han colaborado haciendo posible este trabajo: Claude Alabouvette y Fabiola Bastian, del INRA de Dijon, responsables de las relaciones establecidas entre Sevilla-Dijon-Lascaux. Gracias por vuestra valiosa aportación: muestras, cepas, organización de muestreos, traducción, información de la cueva, etc. El personal encargado de la conservación de la cueva de Lascaux: Muriel Mauriac, Sandrine Van Solinge, Stéphane Konik, Elena Man-Estier, Alina Moskalik-Detalle y el equipo de restauración, por su colaboración en los muestreos y la información aportada. Ha sido un verdadero placer trabajar en Lascaux, espero que los resultados obtenidos en esta investigación contribuyan a su conservación. Alena Nováková, del ISB AS de la República Checa, por su colaboración en el estudio morfológico de los hongos, y su atención durante mi estancia en České Budějovice. Santiago Sánchez y Eduardo López, del IEM-CSIC de Madrid, por los análisis SERS. Mariona Hernández, de la Universidad de Barcelona, por los análisis TEM. Mis compañeras, Ana, Valme y Estefanía, por su aportación a este trabajo, y su ayuda siempre que la he necesitado. ii Gracias a todo el grupo de Microbiología y Patrimonio Cultural del IRNAS-CSIC de Sevilla, con los que he compartido estos últimos años. A los que ya estaban, por haberme acogido como lo hicieron y por su apoyo desde mis comienzos. A los que fueron llegando, por la alegría e ilusión que aportaron. A todos, por vuestra amistad y los buenos momentos vividos. También quiero agradecer a mis antiguos compañeros fitopatólogos, Rosa, Tere y Eduardo, todo lo que me enseñaron. Sin duda, este trabajo se ha enriquecido con vuestras influencias. Gracias a mi familia, por la educación que me ha dado, por su cariño y apoyo incondicional en todos los momentos de mi vida. Por último, me gustaría dedicar este trabajo a Laura, tú conoces mejor que nadie los esfuerzos realizados. Gracias por tus consejos, apoyo y sacrificio. Juntos hemos finalizado esta etapa, será un placer afrontar las siguientes a tu lado. La cueva de Lascaux 3 de las cavidades de la región, donde más de 400 cuevas han sido inventariadas. En el valle del Vézère, estas cuevas se hallan colgadas del acantilado y difícilmente accesibles, ya desmanteladas por la erosión, características que explican las pocas cavidades contabilizadas. En cambio, en la zona del río Beune, afluente principal del Vézère, el recorte de estos acantilados en escalones facilita el acceso y registro de las cuevas. Figura 1. a. Localización de la cueva de Lascaux. b. Mapa de la cueva donde se detallan las distintas zonas. La cueva de Lascaux se desarrolló por la erosión kárstica de las rocas calizas del piso geológico Coniaciense Superior. Este estrato geológico aflora por encima de la cueva, dejando a ambos lados los depósitos de arcillas y arenas que sustentan el bosque de robles, pinos y castaños que La cueva de Lascaux 4 ocupa la cima de la colina. Estos depósitos presentan abundantes vetas de óxidos de hierro y manganeso (Lastennet y col. 2011). La zona de entrada a la cueva, cuando se descubrió en 1940, estaba totalmente bloqueada por depósitos sedimentarios milenarios, estando comunicada con el exterior por una pequeña grieta por donde se deslizaron los descubridores. Estos depósitos amortiguaban los efectos del clima exterior sobre la atmósfera interna, desempeñando la función de tampón térmico e hídrico. Poco después del descubrimiento, las obras de adaptación para las visitas eliminaron totalmente estos depósitos provocando el desequilibrio climático de la cueva (Geneste 2006). En la roca donde se encaja la cueva se pueden apreciar ocho capas calcáreas superpuestas que se distinguen en función de la abundancia de aportes detríticos y del estado de compactación. Estratigráficamente, la sucesión de depósitos sedimentarios se vio alterada por la presencia de intercalaciones, tres de las cuales son visibles en la primera parte de la cueva. Las rocas calizas de las paredes son más compactas en la Sala de los Toros y Divertículo Axial, presentando diferentes estados de cohesión y rugosidad. La bóveda del Pasaje presenta areniscas calcáreas menos cimentadas. La roca conserva evidencias de múltiples episodios diagenéticos (disolución y precipitación), como manifiesta el relleno de las grietas de forma discontinua. En la Sala de los Toros en particular, el sustrato está cubierto por una concreción de carbonato de naturaleza similar a la roca adyacente. Gran parte de la cueva está ocupada por los depósitos arcillosos, que componen las zonas bajas de las paredes, desarrollando unos bancos laterales en la mayoría de las galerías. Estos materiales son altamente reactivos debido a su elevada capacidad de retención del agua y de intercambio catiónico. El conjunto de las arcillas encontradas en las distintas zonas de la cueva tienen características similares, su análisis por difracción de rayos X puso de manifiesto la presencia caolinita, ilita y esmectita (Lastennet y col. 2011). Estos minerales son muy sensibles a las pequeñas variaciones climáticas provocándose fenómenos de expansión y contracción. La cueva de Lascaux 5 La colina de Lascaux es un macizo kárstico que presenta diversas salidas de agua. Aparecen algunas pequeñas fuentes en sus alrededores (“Bleue Font”, “Haute Fageotte”, “Régourdou”, “Madeleine” y “Fontaine Reynault”), por otro lado, hay que tener en cuenta la difusión del agua hacia los estratos inferiores del Coniaciense, aunque no debe ser muy relevante ya que estas capas son menos permeables. Los estudios de la zona indican que toda la cueva se puede considerar un sistema epikárstico, cuya salida principal de agua se sitúa a la altura de la tercera sala de entrada (SAS1-C3) (Fig. 1b). Esta salida no es única, ya que aparecen otros puntos de la cueva donde el agua se hace visible: Cámara de los Felinos, zona superior de la Galería del Moonmilk y otras zonas de intercalaciones (Fig. 1b). Las aguas que se recogen a nivel de SAS1-C3 son transportadas hasta un tanque situado en la sala de máquinas, desde donde se bombean al exterior. Parámetros ambientales El clima de la zona es principalmente de tipo oceánico. La pluviosidad es de grado medio, del orden de 880 mm/año, repartidos en dos épocas principales, otoño y primavera. La temperatura atmosférica media es de 12,6ºC, con temperaturas medias que fluctúan entre los 3ºC en invierno y los 20ºC en verano. Sin embargo, la temperatura en el interior de la cueva es muy estable, con una media de 12,5ºC, y una humedad relativa entorno al 99% (Orial y col. 2011). Los mecanismos responsables del equilibrio climático en el interior de la cueva son complejos. La situación de la cueva evoluciona de un modo natural; el seguimiento climático realizado desde 1963 muestra que durante seis meses al año el vapor del agua del aire se condensa sobre las paredes de la cueva, y el resto del año son posibles los procesos de evaporación. Estos mecanismos, provocados por los cambios de temperatura del aire y de la superficie de la roca, pueden causar la corrosión o el depósito de la calcita como resultado de la presencia de dióxido de carbono (Malaurent y col. 2011). La cueva de Lascaux 6 Contexto arqueológico El Perigord conserva vestigios arqueológicos muy antiguos, que abarcan cerca de 350.000 años. Los principales yacimientos prehistóricos se desgranan a lo largo del valle del río Vézère: “La Madeleine”, “Le Moustier”, “La Micoque” y “Tayac”, éstos dieron respectivamente su nombre a las culturas materiales del Magdaleniense, Musteriense, Micoquiense, Tayaciense, y más tarde, del Perigordiense. Otros yacimientos marcaron la investigación arqueológica, sobre todo “Laugerie-Haute” y “La Ferrassie”, que junto con “La Madeleine”, permitieron establecer la totalidad de la cronología del Paleolítico Superior, que en la actualidad, sirven aún de referencia para cualquier estudio sobre este período. La cueva de Lascaux, desde su descubrimiento, ha gozado del reconocimiento mundial de la prensa y el público en general. Su patrimonio artístico es de excepcional calidad, compuesto por 1.963 presentaciones, con 915 figuras de animales y numerosos signos geométricos, según el inventario realizado por Aujoulat (2004). Reducir el valle del Vézère a un sólo lugar de interés sería injusto, pues existen numerosos lugares con pinturas rupestres y grabados notables: “Font de Gaume”, “Les Combarelles”, “Cap-Blanc”, etc. Sin embargo, ninguno de ellos ha ejercido tanta fascinación como Lascaux. Se han realizado diferentes dataciones del patrimonio artístico que alberga la cueva de Lascaux. Inicialmente, Henry Breuil y Denis Peyrony lo relacionaron con la cultura material Gravetiense. Según Séverin Blanc, la mayoría de los indicios atribuían un origen Solutrense-Magdaleniense. Las primeras dataciones con radiocarbono se realizaron en los años 50 sobre fragmentos de carbones de madera encontrados en las zonas del Pasaje y del Pozo, obteniéndose unas edades comprendidas entre los 15.500 y los 17.190 años de antigüedad, que los situaba en la cultura Magdaleniense. Dos dataciones radiocarbónicas posteriores (1998 y 2002), a partir de fragmentos de varillas de cuerno de reno hallados en las excavaciones de Henri Breuil y Severin Blanc, establecieron una edad aproximada de 18.600-18.900 años de antigüedad. Esta época se sitúa en el límite de las culturas Solutrense La cueva de Lascaux 7 Superior y Magdaleniense Inferior (Geneste 2011). El análisis formal de las figuras encontradas en la cueva de Lascaux hace pensar que este arte pertenecería a la tradición Solutrense. Salas de la cueva y patrimonio artístico que albergan La cueva está compuesta por un conjunto de galerías accesibles al ser humano que no supera los 235 m de longitud. La cavidad se desarrolla en dirección paralela al eje principal del valle, lo que hace muy probable la existencia de varias entradas. El volumen total de la cueva es de 3.300 ± 500 m3 (Malaurent y col. 2011). Tradicionalmente, la cueva se divide en siete sectores ornados, la Sala de los Toros, el Divertículo Axial, el Pasaje, el Ábside, la Nave, la Cámara de los Felinos y el Pozo (Figs. 1b y 2). En su distribución se distinguen claramente tres ejes. El primero asocia la zona de entrada (compuesta por cuatro vestíbulos: SAS1-C1, C2 y C3, y SAS2), la Sala de los Toros y el Divertículo Axial, con una longitud de unos 60 m. El segundo sería el eje derecho de la cueva, conectando la Sala de los Toros con el Pasaje, la Nave, la Galería del Moonmilk y el Divertículo de los Felinos, con una longitud de unos 110 m desde la entrada. Finalmente, el último eje parte del Ábside conectando con el Pozo y la Gran Diaclasa, más allá, un importante desprendimiento marca el cruce con la Sala Enarenada. La entrada de la cueva se sitúa a 185 m de altitud, el suelo de la cavidad presenta cierta pendiente, con un desnivel de -13 m en la extremidad del Divertículo Axial y de -19 m en la parte baja del Pozo. El Pozo y la Cámara de los Felinos se sitúan a una profundidad respecto a la superficie topográfica de 24 y 25 metros, respectivamente. La Sala de los Toros es una prolongación de la galería de entrada, siendo la sala de mayor tamaño (320 m3), con una longitud de 20 m, una anchura que varía entre 5,5 y 7,5 m, y una altura máxima de 6 m (Fig. 2a). Las paredes situadas a ambos lados de la sala agrupan la casi totalidad de la decoración, que se desarrolla de manera continua sobre una treintena de La cueva de Lascaux 8 metros. La roca se encuentra frecuentemente cubierta por concreciones carbonatadas. Los motivos de esta sala son los más famosos de la cueva, considerados unos de los más imponentes de todo el arte paleolítico. Existen un total de 130 figuras en la sala, incluyendo 36 representaciones animales (17 caballos, 11 vacas y toros, seis ciervos, un uro, un oso y un “unicornio”) (Fig. 3a) y 50 signos geométricos. El Divertículo Axial es un conducto de unos 30 m de longitud, situado a continuación de la Sala de los Toros (Fig. 2b). La decoración se distribuye cubriendo las dos paredes y la bóveda, agrupando 161 entidades gráficas: 58 representaciones figurativas, esencialmente de animales (vacas y toros, caballos, ciervos, íbices y un bisonte), 46 signos geométricos y 57 figuras indeterminadas que pueden vincularse a signos o esbozos de figuras animales (Fig. 3b,c). El Pasaje es un pasillo de unos 20 m de longitud, que conecta la Sala de los Toros con el Ábside y la Nave (Fig. 2c). En él aparecen una gran cantidad de figuras, que a menudo son difíciles de interpretar. Se identificaron un total de 385 figuras grabadas o pintadas, entre ellas se distinguen numerosas figuras animales (caballos, bisontes, íbices, bóvidos y ciervos) y signos geométricos. Tras el Pasaje, la cueva se bifurca en dos, siguiendo el mismo eje discurre la Nave, la Galería del Moonmilk y el Divertículo de los Felinos, y a la derecha encontramos el Ábside que comunica con el Pozo. El Ábside y la Nave son salas mucho más amplias, con un volumen conjunto de 1.300 m3. La Nave tiene una longitud de unos 20 m, presenta en su pared izquierda cuatro paneles situados a distintos niveles por la pendiente descendente de esta galería, en la pared derecha sólo aparece un panel (Fig. 2d). En la decoración de esta sala predominan las figuras animales (27 caballos, nueve íbices, seis ciervos, cinco bisontes, y un uro) (Fig. 3d,e), aunque también aparecen signos geométricos relevantes (blasones bajo la Gran Vaca Negra, Fig. 3d). Esta sala se estrecha considerablemente atravesando la Galería del Moonmilk, que recibe su nombre por las características formaciones geológicas de sus paredes. La cueva de Lascaux 9 Figura 2. Sectores ornados de la cueva de Lascaux. a. Sala de los Toros. b. Divertículo Axial. c. Pasaje. d. Nave. e. Ábside. f. Cámara de los Felinos. g. Pozo. Fuentes: http://www.lascaux.culture.fr/; http://donsmaps.com/lascaux.html La cueva de Lascaux 10 Figura 3. Figuras representativas de la cueva de Lascaux. a. Panel izquierdo de la Sala de los Toros. b. Gran Toro Negro (Divertículo Axial-izquierda). c. Tercer Caballo Chino (Divertículo Axial-derecha). d. Gran Vaca Negra (Nave-izquierda). e. Friso de los Ciervos Nadando (Nave-derecha). f. Felino (Cámara de los Felinos). g. Escena del Pozo. Fuente: http://www.lascaux.culture.fr/ La cueva de Lascaux 11 El Divertículo de los Felinos tiene una longitud aproximada de 25 m, esta galería se estrecha considerablemente alcanzando una altura máxima de un metro en la Cámara de los Felinos (Fig. 2f). Más de 80 figuras han sido censadas en esta zona, el 90% de ellas se sitúan en los primeros metros del conducto, segmento más estrecho de este sector. Se distinguen 51 figuras animales (29 caballos, nueve bisontes, cuatro íbices, tres ciervos y seis felinos, que dan nombre a la sala; Fig. 3f) y abundantes símbolos. El Ábside es un espacio de aproximadamente 30 m2, su suelo está elevado respecto el nivel del Pasaje y de la Nave, y tiene una altura media de 3,5 m (Fig. 2e). Esta sala contiene más de mil figuras distribuidas sobre las paredes laterales y el techo en forma de cúpula, siendo principalmente grabados. Entre ellas, cerca de 500 representaciones de animales y 600 signos geométricos o trazos diversos. Tal exuberancia gráfica se explica en parte por su blando soporte calcáreo. Al fondo de esta sala se encuentra el acceso al Pozo, bajando una escalera metálica (Fig. 2g). El Pozo sólo presenta ocho figuras, cuatro de ellas corresponden a animales (caballo, bisonte, pájaro y rinoceronte), otras tres son símbolos geométricos, y en la zona central aparece la única representación humana de la cueva. Exceptuando la figura del caballo situada en la pared derecha, el resto de figuras están agrupadas en unos 3 m2 de la pared izquierda, constituyendo la llamada Escena del Pozo por su potencial narrativo difícil de interpretar (Fig. 3g). La notoriedad de la cueva de Lascaux se basa esencialmente en las pinturas de la Sala de los Toros, Divertículo Axial y Nave (Fig. 3a-e). Sin embargo, por la elevada cantidad de figuras representadas en el Ábside, así como en el Pasaje, la Nave y el Divertículo de los Felinos, el arte de Lascaux está dominado por el grabado. La cueva de Lascaux 12 Revisión histórica de los principales acontecimientos e investigaciones Descubrimiento y exposición al turismo La cueva se descubrió el 12 septiembre de 1940 por cuatro jóvenes, Jacques Marsal, Georges Agniel, Simon Coëncas y Marcel Ravidat, tras inspeccionar una fisura en el terreno, pensando que podía tratarse del pasadizo secreto que conducía a la casa solariega de Lascaux, según narra una conocida leyenda local. Avisaron inmediatamente a su profesor Léon Laval, quien comunicó el hallazgo al prehistoriador Henri Breuil (Fig. 4a). Éste, un mes después, dirigió los primeros trabajos de registro fotográfico y dibujo de las figuras. Pocos días después de su descubrimiento la cueva ya recibió una gran afluencia de visitantes. En diciembre de 1940 se clasificó con el título de Monumento Histórico con el acuerdo de su propietario, el Conde de la Rochefoucauld-Montbel. Tras la Segunda Guerra Mundial, a partir de 1947, el propietario comenzó los trabajos de acondicionamiento de la cueva para hacerla accesible al público (Fig. 4b,e). La entrada de la cavidad fue objeto de importantes nivelaciones y se destruyeron los depósitos calcáreos que bloqueaban el acceso y amortiguaban los efectos del clima exterior sobre la atmósfera interna (Geneste 2006). Se creó una monumental puerta de bronce, así como escaleras para descender hasta la Sala de los Toros; el nivel de los suelos se rebajó con el fin de construir un camino para las visitas y se instaló el alumbrado. El 13 julio de 1948 la cueva de Lascaux se abrió al público. Las primeras excavaciones arqueológicas, realizadas por el abad Breuil y Séverin Blanc, comenzaron al año siguiente en la zona del Pozo. En 1952, el abad André Glory comenzó el registro de los numerosos grabados localizados en el Pasaje, Divertículo de los Felinos y principalmente en el Ábside (Fig. 4c). Estas tareas se prolongaron hasta 1963, identificando cerca La cueva de Lascaux 19 contaminación fúngica, aparecida inmediatamente después de la instalación, condujo a suprimir el aislamiento térmico de gran parte de sus componentes, modificando su eficacia (Fig. 5a). En julio de 2001, aparecieron colonizaciones de micelio fúngico blanco, inicialmente en la sala de entrada SAS2 y se dispersó rápidamente alcanzando los bancos laterales y paredes de la Sala de los Toros (Fig. 5b). El hongo responsable de este brote se identificó en septiembre de 2001 por el LRMH como Fusarium solani, muy frecuente en zonas agrícolas. Las masas de micelio se desarrollaron rápidamente en la cavidad e invadieron muy deprisa los suelos, bancos, paredes y bóvedas de la Sala de los Toros, Divertículo Axial, Pasaje y Nave. Por ello, el LRMH diseñó un plan de tratamientos biocidas muy agresivo como medida de urgencia (Orial y Mertz 2006, Orial y col. 2011) (Tabla 1). Inicialmente, entre julio y septiembre de 2001, las zonas afectadas se pulverizaron con una solución al 5% del biocida Vitalub QC50 (cloruro de benzalconio al 50%), primero disuelto en etanol al 90% y después en agua. Estos tratamientos no consiguieron frenar el avance del brote, por ello, entre noviembre de 2001 y julio de 2002, se cubrieron las zonas afectadas con gasas embebidas en Vitalub QC50 al 5% (Fig. 5c). Adicionalmente, en octubre y noviembre de 2001, se aplicó cal viva a los suelos y bancos laterales de la cueva, aproximadamente unos 1.360 kg repartidos en unos 250 m2 (Fig. 5d) (Sire 2006). El objetivo de aplicar este producto fue reducir la humedad y producir un efecto antifúngico por el “secado” de las hifas, para frenar la dispersión del brote rápidamente. Las pulverizaciones con Vitalub QC50 fueron una práctica habitual en los años sucesivos (2002 y 2003) en la lucha contra el brote de F. solani. Los suelos y bancos laterales permanecieron cubiertos de cal viva hasta diciembre de 2005. El 22 agosto de 2002 se creó, por el Ministerio de Cultura y Comunicación de Francia, un Comité Científico para el estudio y conservación de la cueva, presidido por el inspector general de Arqueología Marc Gauthier. La cueva de Lascaux 20 Figura 5. Crisis biológica causada por Fusarium solani. a. Sistema de asistencia climática instalado en el 2000, justo antes de la aparición del brote. b. Masas de micelio blanco cubriendo los bancos laterales en octubre de 2001. c. Tratamientos con gasas embebidas en biocidas, aplicados entre noviembre de 2001 y julio de 2002, la imagen corresponde al Divertículo Axial-derecha. d. Esparcimiento de cal viva en los suelos y bancos laterales, en octubre y noviembre de 2001, la imagen corresponde a la sala SAS2. Fuente: http://www.lascaux.culture.fr/;Geneste (2008). El hábitat de la cueva continuó claramente perturbado a lo largo del periodo de tratamientos, surgiendo nuevos problemas microbiológicos (Allemand 2003, Allemand y Bahn 2005, Graff 2006). Aparecen colonizaciones mucosas locales asociadas a la bacteria Pseudomonas fluorescens, las cuales se trataron durante varias semanas con los antibióticos sulfato de estreptomicina al 0,2% y sulfato de polimixina al 0,15% (Orial y Mertz 2006, Bastian y col. 2007). A partir de diciembre de 2001, cinco meses después del La cueva de Lascaux 21 inicio de los tratamientos, fueron apareciendo las primeras manchas negras localizadas en las paredes y techo de la Sala de Maquinas y de la sala SAS2 (Sire 2008), extendiéndose progresivamente, en tan sólo siete meses, a las bóvedas de la Sala de los Toros, Divertículo Axial, Ábside, Nave y Galería del Moonmilk. Las manifestaciones de este nuevo brote se trataron con los mismos biocidas (pulverizaciones de Vitalub QC50). A partir de enero de 2004, se interrumpieron las aplicaciones con biocidas y se pasó a combatir las colonizaciones blancas y negras mediante limpieza mecánica utilizando esponjas, bisturí, y un equipo mecanizado (inyector-extractor; Gregomatic) (Fig. 6a,b) Figura 6. Intervenciones realizadas en la cueva de Lascaux. a, b. Limpieza mecánica de las manchas negras: uso en octubre de 2003 del inyectorextractor Gregomatic en la bóveda de la Sala de los Toros (a), uso de esponjas en mayo de 2005 en la misma zona (b). c. Eliminación de la cal viva de los suelos del Ábside en 2006. d. Nuevos tratamientos biocidas aplicados en enero de 2008 contra las manchas negras de la Nave. Fuentes: Sire (2006, 2008). La cueva de Lascaux 22 En marzo de 2004, el Comité Científico organizó un plan global de conservación para gestionar las intervenciones e investigaciones necesarias en la cueva. En ese sentido, se establecieron una serie de acciones prioritarias: (1) Modelización 3D del conjunto de la cavidad, que se llevó a cabo por el Gabinete Perazio en los años 2004-2005. Esta herramienta sirve hoy en día de base de geo-referencia para el conjunto de las observaciones realizadas en la cueva y ha permitido también precisar la situación exacta de la cavidad en la parcela que la alberga. (2) Elaboración continúa de un acta del estado, registrando todos los datos sobre el estado de los suelos, bancos, paredes y bóvedas de la cavidad, disponiendo así de una herramienta útil que pueda servir de referencia a todas las observaciones posteriores. Esta labor se confió a un equipo de restauradores dirigidos por Patrick Jallet y Françoise Joseph, con la ayuda del geólogo François Rassineux, y del fotógrafo Philippe Dubarry. (3) Puesta en marcha de un simulador digital, para prever el impacto de cualquier tipo de perturbación vinculada con las circulaciones del aire, introducción de nuevos materiales o número de horas de presencia humana. Este dispositivo tiene por objetivo contribuir a definir el sistema de regulación de aire que necesita la cavidad, y modificar en consecuencia el dispositivo actual. Este programa de investigación se puso en marcha en junio de 2005 gracias a un convenio cuatripartito entre el Ministerio de Cultura y Comunicación, la Fundación EDF, el Centro Nacional de Investigación Científica (CNRS) y la Universidad de Burdeos. (4) Estudio de las aguas de Lascaux, encargado al hidrogeólogo Roland Lastennet y al doctorando Benjamin López, del Centro de Desarrollo de Geociencias Aplicadas (CDGA) de la Universidad Burdeos. Se trataba de intentar comprender cómo se organizan las aguas de infiltración y condensación, y que papel han podido desempeñar en la difusión de los brotes de manchas blancas y negras. La cueva de Lascaux 23 (5) Programa de investigación Microbiología-Microclima, con el objeto de caracterizar las comunidades microbianas de la cueva de Lascaux y buscar las posibles correlaciones entre el desarrollo de los microorganismos y los parámetros físicos de la atmósfera y los sustratos. Este proyecto comenzó en el 2006 con la participación de los microbiólogos Claude Alabouvette y Fabiola Bastian, del Instituto Nacional de la Investigación Agronómica (INRA), Dijon, Francia; la especialista en climatología Adriana Bernardi, del Instituto de Ciencias Atmosféricas y Clima, Consejo Nacional de la Investigación (ISAC-CNR), Padua, Italia; y el LRMH. (6) Extracción de la cal viva, que fue esparcida en 2001 sobre suelos y bancos laterales. Estas labores se llevaron a cabo entre diciembre de 2005 y octubre de 2006 (Fig. 6c). (7) Continuación de las labores de seguimiento y limpieza mecánica de las manchas, según la intensidad del fenómeno y su localización (Fig. 6a,b). Dupont y col. (2007) realizaron un estudio molecular de 36 cepas de Fusarium, aisladas principalmente en los años 2004 y 2005, de las colonizaciones blancas que cubrían los bancos de distintas salas de la cueva. Todas las cepas se identificaron como miembros del complejo de especies F. solani, el cual está compuesto por más de 45 especies distintas en sentido filogenético y/o biológico (Zhang y col. 2006). La caracterización molecular de las cepas, basada en el análisis PCR-RFLP del gen del Factor de Elongación 1α (EF-1α), sugiere que éstas pertenecen a tres especies filogenéticas distintas, todas ellas incluidas dentro del Clado 3 establecido por Zhang y col. (2006). Esta variabilidad genética encontrada en la cueva de Lascaux puede ser indicativa de que se han producido diferentes eventos de introducción a lo largo del tiempo. Las vías de entrada en la cueva pudieron ser diversas: desde los suelos situados encima de la cueva a través del agua o de pequeños animales, o desde el exterior por la elevada afluencia humana encargada de sustituir el equipo de asistencia climática justo antes de la aparición del brote (Dupont y col. 2007). La cueva de Lascaux 24 Adicionalmente, Dupont y col. (2007) también aisló de esas colonizaciones otros géneros fúngicos: Chrysosporium, Gliocladium, Gliomastix, Paecilomyces, Trichoderma y Verticillium. Durante todo este periodo se continuaron realizando por el LRMH los controles periódicos de la contaminación microbiológica del aire de la cueva, aumentando considerablemente los puntos de control y la frecuencia de los análisis. Se observaron importantes fluctuaciones a lo largo de estos años de estudio, se detectó un aumento significativo de la polución aérea a finales de 2004 y comienzo de 2005. Respecto a los hongos, aumentaron fundamentalmente los géneros Penicillium y Aspergillus, debido a la abundante presencia humana para el control y mantenimiento (Orial y Mertz 2006). Del mismo modo, a lo largo de estos años, el LRMH realizó numerosos análisis microbiológicos de las distintas colonizaciones que iban apareciendo, para aislar e identificar los hongos asociados. La mayoría de las colonizaciones analizadas fueron de color blanco, y los aislamientos predominantes pertenecieron al género Fusarium. Sin embargo, frecuentemente se aislaron colonias de otros géneros: Verticillium, Penicillium, Aspergillus, Gliomastix, Gliocladium, Cladosporium y Alternaria (Orial y col. 2011). Con el paso de los años, el brote de las colonizaciones blancas se redujo progresivamente hasta alcanzar una situación estable en los años 2005 y 2006. En estas fechas el brote estaba principalmente localizado en las salas: SAS1-C1, Pasaje, Ábside y Nave. En la actualidad aún persisten algunas colonizaciones en estas zonas, pero su evolución parece estar controlada. Tercera crisis biológica (2006-Actualidad) El brote de las manchas negras surgió a finales de 2001, tras los primeros tratamientos biocidas de urgencia. A partir de esta fecha, este tipo de colonizaciones fue progresando constantemente coexistiendo con las colonizaciones blancas, incluso apareciendo asociadas a ellas en muchas La cueva de Lascaux 25 zonas de la cueva. Sin embargo, fue a partir de 2006 cuando el brote de las manchas negras desarrolló un crecimiento explosivo, convirtiéndose en el principal problema que amenaza a la cueva de Lascaux. Para una mayor comprensión del fenómeno de las manchas negras, de su diversidad y evolución, conviene diferenciar la morfología y ubicación de las manchas. En función de la morfología que presentan las colonizaciones y el tipo de sustrato donde aparecen, se distinguen: manchas en paredes y bóvedas de roca caliza y manchas en paredes y bancos de sedimentos arcillosos. Esta clasificación fue propuesta por el equipo encargado del seguimiento y tratamiento de los brotes, dirigido por Alina Moskalik-Detalle (Comité Científico, 19 de noviembre de 2007). Manchas negras en paredes y bóvedas de roca caliza Primera etapa: A ella corresponden las primeras manchas que aparecieron en la cueva a partir de diciembre de 2001. Éstas se extienden muy rápidamente, colonizando la mayoría de las bóvedas en sólo siete meses, siguiendo la siguiente dispersión: Sala de Máquinas, sala SAS2 (Fig. 7a), Sala de los Toros, Divertículo Axial, Ábside, Nave y Galeria del Moonmilk, excluyendo el Pasaje. Este tipo de manchas se localizan sobre la roca caliza desnuda. En las bóvedas recubiertas por calcita se restringen a las regiones donde la cubierta calcárea está rota. Algunas de estas colonizaciones aparecieron sobre pinturas de la Sala de los Toros, y sobre grabados del Ábside. Generalmente presentan dos morfologías: formadas por pequeños puntos negros incrustados en el sustrato, o bien, constituyendo un sombreado de color gris-negro con aspecto pulverulento y localización más superficial. Los análisis iniciales realizados por el LRMH, sobre algunas de estas manchas localizadas en la Sala de los Toros, las asociaron a los hongos Gliomastix murorum y Cladosporium sp. (Orial y col. 2011). La cueva de Lascaux 26 Figura 7. Brote de las manchas negras. a. Primeras manchas detectadas en la bóveda de la sala SAS2. b, c. Manchas sobre los bancos laterales arcillosos de la Sala de los Toros (b) y del Ábside (c), observadas en febrero de 2007. d, e. Manchas sobre la roca caliza afectando a las pinturas: cornamenta del Ciervo Abatido del Ábside (d), agosto de 2007; y cuernos de la Gran Vaca Negra de la Nave (e), marzo de 2008. f, g. Zona C del ensayo de eficiencia de tratamientos, antes de limpieza en julio de 2008 (f) y después de ella en octubre de 2008 (g). Fuentes: Geneste (2008), Sire (2008), Ministerio de Cultura y Comunicación de Francia. La cueva de Lascaux 27 Estas manchas se trataron inicialmente con el mismo biocida que se estaba aplicando a las colonizaciones blancas. A partir de enero de 2004, sólo se combatieron a través de protocolos de limpieza mecánica, siempre y cuando no se pusiera en riesgo la conservación de alguna figura artística. Segunda etapa: A partir de marzo de 2006, aparecieron de nuevo abundantes colonizaciones con características similares en las bóvedas del Pasaje, la Nave y el Ábside (Fig. 7d-f). Al igual que en la primera etapa, este tipo de manchas surgieron muy rápidamente aunque su evolución posterior fue bastante lenta. Sin embargo, en verano de 2007, se desarrollaron notablemente poniendo en riesgo la conservación de algunas pinturas y grabados. En este sentido, destacaron las colonizaciones cercanas a la cornamenta del Ciervo Abatido (Fig. 7d), a los cuernos de la Gran Vaca Negra (Fig. 7e), y al Friso de los Ciervos Nadando. La aparición de estas manchas pudo estar relacionada con el aumento de la actividad humana en esas salas desde noviembre de 2005, debido a las labores de control, tratamientos y extracción de la cal viva. Por otro lado, en diciembre de 2006 se desmontó la puerta “SAS Bauer” situada entre la Sala de los Toros y el Pasaje, que desde el 1965 separaba los dos ejes principales de la cavidad. Esta actuación incrementó notablemente los niveles de condensación del agua en la cueva, lo cual pudo influir en el aumento posterior de las manchas negras. Manchas negras en paredes y bancos de sedimentos arcillosos Primera etapa: Entre 2001 y 2004, aparecieron manchas negras en los bancos laterales de todas las salas de la cueva. Inicialmente, estas colonizaciones se interpretaron como micelios necrosados de las colonizaciones blancas tras los tratamientos químicos, pues frecuentemente los dos tipos de colonizaciones se encontraban asociados. Por ello, los tratamientos La cueva de Lascaux 28 efectuados fueron idénticos. También se observó una asociación de estas manchas negras con las zonas húmedas. Como se ha mencionado, la mayoría de los aislamientos microbiológicos efectuados en esta época por el LRMH estuvieron centrados en las colonizaciones blancas, identificando principalmente hongos de los géneros Fusarium y Penicillium, y algunos Cladosporium y Aspergillus. Un análisis puntual realizado sobre una de las primeras manchas negras encontrada sobre un banco de la Sala de los Toros (13 noviembre de 2001), identificó en ella un hongo del género Phialophora (Dosier con información sobre la contaminación biológica de la cueva, LRMH, julio de 2002). Segunda etapa: A partir de 2004 aparecieron manchas negras independientes de las colonizaciones blancas en los bancos laterales de gran parte de la cueva. Estas colonizaciones se incrementaron progresivamente alcanzando en 2006 y 2007 una gran relevancia (Fig. 7b,c). El fenómeno más llamativo se produjo en el Pasaje, cuyos bancos sufrieron un ennegrecimiento progresivo cubriendo gran parte de su superficie. Del mismo modo que las manchas de las bóvedas, el incremento observado en estas fechas pudo estar relacionado con el aumento de la actividad humana y el desmontaje de la puerta “SAS Bauer”. En este sentido, cabe destacar, que en salas con una afluencia mucho menor, Galería del Moonmilk y Cámara de los Felinos, las manchas que aparecieron sobre el sustrato arcilloso siguieron una evolución muy diferente, atenuándose en este periodo. Una vez detallada esta clasificación, se continúa mencionando cronológicamente los principales acontecimientos e investigaciones: La presencia de insectos cavernícolas en la cueva de Lascaux está directamente relacionada con los brotes fúngicos que se han sucedido. En enero de 2004 se detectaron insectos en el Divertículo Axial, bancos del Pasaje y suelo de la Galería del Moonmilk. Un año después, en junio de La cueva de Lascaux 35 Objetivos planteados La finalidad de esta Tesis Doctoral fue profundizar en el estudio del brote de las manchas negras, que actualmente representa la principal amenaza para el patrimonio artístico de la cueva de Lascaux. Con este estudio se pretendía: identificar las comunidades fúngicas implicadas en la formación de las manchas negras y establecer el papel que juegan; conocer los factores que ocasionaron el brote, y aquellos que influyen en su evolución. Para ello, se plantearon los siguientes objetivos: 1- Identificar las especies de los géneros Ochroconis y Scolecobasidium aisladas de las manchas negras de la cueva de Lascaux, y caracterizar sus fuentes nutricionales. 2- Conocer la distribución en la cueva de las especies de los géneros Ochroconis y Scolecobasidium, y su asociación con el fenómeno de las manchas negras. 3- Estudiar las comunidades fúngicas asociadas a las manchas negras, prestando especial atención a los hongos que se encuentran metabólicamente activos en la actualidad. 4- Caracterizar la morfología y composición química de las manchas negras, conocer el papel que juega la melanina de Ochroconis y Scolecobasidium en su formación, y el posible papel de otros hongos. 37 CAPÍTULO 2 IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE ESPECIES DE OCHROCONIS-SCOLECOBASIDIUM Con el fin de concretar la identificación de aquellas cepas de Ochroconis-Scolecobasidium que se aislaron de la cueva de Lascaux, se llevaron a cabo distintos estudios a nivel molecular y morfológico. Posteriormente, se caracterizaron algunos aspectos fisiológicos relevantes de las especies identificadas, como el perfil de ácidos grasos, la tolerancia al cloruro de benzalconio, y las fuentes nutricionales. Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium 38 Introducción a los géneros Ochroconis y Scolecobasidium El género Scolecobasidium fue descrito por primera vez por Abbott (1927), incluyendo las especies S. terreum (especie tipo) y S. constrictum, ambas aisladas de suelos de cultivos de algodón y caña de azúcar. Desde entonces un total de 44 especies han sido descritas para este género. Barron y Busch (1962) describieron las especies S. humicola y S. variabile, también aisladas de muestras de suelos. Roy y col. (1962) describieron S. verruculosum y S. macrosporum, aisladas de pastizales. Graniti (1963) describió S. anellii como la especie causante de manchas negras que recubrían las estalactitas de la cueva de Castellana, Bari, Italia. El género Ochroconis fue establecido por de Hoog y Arx (1973) incluyendo aquellas especies de Scolecobasidium con conidios elipsoidales, claviformes o fusiformes (la mayoría de las especies descritas), mientras que el género Scolecobasidium quedó reducido a las especies con conidios trilobulados (entre ellas S. terreum). McGinnis y Ajello (1974, 1975) describieron la nueva especie S. tshawytschae, incluyendo la cepa tipo de Heterosporium tshawytschae, aislada por Doty y Slater (1946) de salmón, y sus sinónimos S. variabile y S. macrosporum. Kirilenko y Al-Akhmed (1977) reclasificó esta especie dentro del género Ochroconis, describiendo la nueva combinación O. tshawytschae. Los géneros Ochroconis y Scolecobasidium se aíslan frecuentemente de suelos y restos vegetales (Abbott 1927, Barron y Busch 1962, Roy y col. 1962, Grandi y Gusmão 2002). Algunas especies han sido aisladas de otros ambientes, como aire (Lugauskas y col. 2003, Nováková 2009), plantas acuáticas (Orłowska y col. 2004.), alimentos (Comerio y col. 2005), y lavadoras y baños (Hamada 2005a,b; Hamada y Abe 2008). Scolecobasidium constrictum fue descrito como hongo parásito de diversos nematodos (Upadhyay 1966, Trifonova y Karadjova 2003). Las especies O. humicola y O. tshawytschae han sido descritas en diversas ocasiones como agente causal de infecciones sistémicas, principalmente en peces (Doty y Slater 1946, Ajello y col. 1977). O. humicola también ha sido Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium 39 detectada en tortuga (Weitzman y col. 1985) y gato (VanSteenhouse y col. 1988), y O. tshawytschae ha sido descrita recientemente como patógeno humano causando feohifomicosis subcutánea (Ge y col. 2012). Ochroconis gallopava causa enfermedades importantes en los seres humanos (de Hoog y col. 2000), asociada a diversas patologías, tales como feohifomicosis subcutánea, endocarditis, feohifomicosis cerebral, principalmente en pacientes inmunodeprimidos (Horré y de Hoog 1999). Material y métodos Identificación molecular de especies de Ochroconis-Scolecobasidium Cepas estudiadas Se estudiaron un total de 30 cepas de Ochroconis-Scolecobasidium de la cueva de Lascaux (Fig. 9, Tabla 2), en su mayoría aisladas en años anteriores a este estudio (2007-2009) por el INRA de Dijon, Francia. La mayor parte de éstas proceden de las manchas negras que aparecieron sobre las paredes y bóvedas de caliza del Ábside (cornamenta del Ciervo Abatido, agosto de 2007) y del Pasaje (zonas A-D utilizadas en el ensayo de evaluación de los tratamientos de control, agosto de 2008-febrero de 2009). Sin embargo, el INRA también aisló algunas cepas de manchas desarrolladas sobre los sedimentos arcillosos de la Sala de los Toros (LX CH24), Divertículo Axial (LX CH40 y LX CH50) y Pasaje (LX 7.2). Adicionalmente, se incluyó para su comparación e identificación, una cepa (LX PDA) aislada de la cueva, en localización desconocida, e identificada como Ulocladium sp. por el LRMH. Además, se incluyeron siete cepas aisladas de manchas desarrolladas sobre los bancos arcillosos y de muestras de aire recogidas en este estudio (2010-2011); las características de estas muestras y la metodología para los aislamientos se detallan en los capítulos 3 y 4 respectivamente. Para realizar las comparaciones oportunas que nos permitieran identificar las cepas de la cueva, se incluyeron cinco cepas de referencia (Tabla 3), procedentes de la Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium 40 colección internacional de hongos del “Centraalbureau voor Schimmelcultures” (CBS), Utrecht, Holanda. Figura 9. Mapa de la cueva de Lascaux localizando los puntos de muestreo donde se aislaron las cepas de Ochroconis-Scolecobasidium incluidas en este estudio, se detalla el tipo de muestra analizada y la fecha de recolección. Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium 41 Tabla 2. Cepas de Ochroconis-Scolecobasidium, procedentes de la cueva de Lascaux, utilizadas en este estudio. Cepas CMFISB aMuestra, sustrato Localización Fecha LX CH2 g 1859 Mancha gris, caliza Á bside Superior- i z q uierda 23/08/2007 LX CH3 dg 1860 Mancha gris, caliza Á bside Superior- i zquierda 23/08/2007 LX CH7 deg 1861 Mancha gris, caliza Á bside Superior- i zquierda 23/08/2007 LX CH8 Mancha gris, caliza Á bside Superior- i zquierda 23/08/2007 LX CH9 Mancha gris, caliza Á bside Superior- i zquierda 23/08/2007 LX CH13 1943 Puntos negros, caliza Pasaje- i zquierda 23/08/2007 LX CH15 Puntos negros, caliza Pasaje- i zquierda 23/08/2007 LX CH16 cdfg 2031 Mancha negra, caliza Pasaje- i zquierda 23/08/2007 LX CH24 Mancha negra, arcilla Sala de los Toros-derecha 23/08/2007 LX CH40 cdeg 1866 Colonia fúngica, arcilla Divertículo Axial-derecha 23/08/2007 LX PDA b Desconocida Desconocida 2008 LX 7.2 deg Mancha negra-rosa, arcilla Pasaje-derecha 09/04/2008 LX CH50 Mancha negra, arcilla Divertículo Axial-derecha 09/07/2008 LX A 1 cdeg 1862 Mancha negra, caliza Pasaje- i zquierda 26/08/2008 LX A3 dg 1863 Mancha negra, caliza Pasaje- i zquierda 26/08/2008 LX B1 Mancha negra, caliza Pasaje- i zquierda 26/08/2008 LX B2 Mancha negra, caliza Pasaje- i zquierda 26/08/2008 LX B4 Mancha negra, caliza Pasaje- i zquierda 26/08/2008 LX C1 Mancha negra, caliza Pasaje- i zquierda 26/08/2008 LX D1 Mancha negra, caliza Pasaje-derecha 26/08/2008 LX CC3 Mancha negra, caliza Pasaje- i zquierda 07/10/2008 LX DDD1 Mancha negra, caliza Pasaje-derecha 05/11/2008 LX CCCC2 Mancha negra, caliza Pasaje- i zquierda 12/02/2009 LX 7G-2 A ire Pozo 16/02/2010 LX 21T-2 A ire Pasaje 16/02/2010 LX 40LL-6 A ire Sala de los Toros 16/02/2010 LX 101 R -6 deg 1865 Mancha negra, arcilla Pasaje-derecha 17/02/2010 LX 101 R -7 2033 Mancha negra, arcilla Pasaje-derecha 17/02/2010 LX 107X-8 Mancha verde-amarillo, arcilla Nave-derecha 17/02/2010 LX M1-3 2083 Mancha negra, arcilla Pasaje-derecha 01/02/2011 Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium 42 Tabla 2 (Continuación). a: CMF ISB: Colección de Hongos Microscópicos, Instituto de Biología del Suelo, Academia de Ciencias, Ceské Budejovice, República Checa. Se depositaron las cepas estudiadas en la identificación morfológica y descripción taxonómica de las nuevas especies. b: La cepa LX PDA se aisló e identificó previamente como Ulocladium sp. por el LRMH, Francia. c: Cepas estudiadas para caracterizar la tasa de crecimiento a distintas temperaturas y la tolerancia al cloruro de benzalconio. d: Cepas estudiadas en la caracterización del perfil de ácidos grasos. e: Cepas estudiadas en la caracterización de las fuentes de carbono (Sistema Biolog). f: La cepa LX CH16 se utilizó para evaluar el cloruro de benzalconio y los productos de su degradación como fuentes nutricionales. g: Cepas estudiadas en la caracterización de las enzimas degradativas (Sistema API ZYM). Tabla 3. Cepas de referencia de Ochroconis-Scolecobasidium procedentes de la colección de hongos del Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS). Cepas (CBS) Identificación Muestra Origen Especie tipo (referencia) 100438 O. tshawytscha e Pez ( salmón) Desconocido T ipo Heterosporiu m tshawytschae (Doty y Slater 1946). 284.64 O. anelli i Estalactita ennegrecida Cueva de Castellana, Bari, Italia T ipo S. anelli i ( Graniti 1963 ) 211.53 O. constricta Suelo A ncastar, Ontario, Canada T ipo Heterosporium terrestr e (Atkinson 1952) 116655 O. humicola T urba Guelph, Ontario, Canada T ipo S. humicola ( Barron y Busch 1962) 536.69 S. terr e um Suelo de bosque Ontario, Canada A islado e identificado por G.L. Barron en 1962 Se seleccionaron las cuatro especies de los géneros Ochroconis y Scolecobasidium más relevantes en cuanto a su distribución e impacto en la Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium 43 bibliografía, O. tshawytschae, O. constricta, O. humicola y S. terreum. Se descartó la especie O. gallopava por su potencial patogénico en humanos, tras verificar su lejanía filogenética del resto. Adicionalmente, se seleccionó la especie O. anellii por estar descrita en cuevas causando manchas negras en estalactitas (Graniti 1963). Cuatro de las cepas de referencia corresponden a las cepas tipo, exceptuando S. terreum CBS 536.69, la cual se seleccionó tras comprobar que la cepa tipo CBS 203.27 conservada en colección estaba mal identificada, como confirman los estudios realizados por Horré y col. (1999). Para su conservación, todas las cepas se cultivaron en tubos con medio MEA (extracto de malta 20 g/l, agar 20 g/l) inclinado, y se incubaron a 25ºC en oscuridad hasta completar su crecimiento. Posteriormente, los cultivos se conservaron en colección a 5ºC hasta su uso. Extracción de ADN genómico de cepas fúngicas Todas las cepas detalladas en las Tablas 2 y 3 se incluyeron en el análisis molecular. La extracción de ADN se realizó a partir del micelio de las colonias crecidas durante un mes a 25ºC en oscuridad sobre placas de MEA. Un centímetro cuadrado de micelio se transfirió a un tubo Eppendorf de 1,5 ml que contenía 500 µl del tampón de extracción TNE (Tris-HCl 10 mM, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM; pH 8) y perlas de vidrio de 2 y 4 mm de diámetro. La mezcla se homogenizó utilizando un equipo Fast- Prep 24 (MP Biomedicals), aplicando dos ciclos de 45 segundos a una velocidad de 4,5 m/s. Se eliminaron las proteínas añadiendo 50 µl de dodecilsulfato sódico (10% p/v) y 70 µl de proteinasa K (10 mg/ml), y para ello, se incubó la mezcla a 50ºC durante una hora. El ADN se purificó con 750 µl de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1). La mezcla se centrifugó a 8.000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante obtenido se sometió a una purificación adicional con 450 µl de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1). Se repitió la centrifugación en idénticas condiciones y se recogió el sobrenadante. La precipitación del ADN se realizó añadiendo 50 Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium 44 µl de acetato de sodio (3M) y 1 ml de etanol absoluto. Para estimular la precipitación se incubó la mezcla a -20ºC durante 30 minutos y se centrifugó a 13.000 rpm durante 10 minutos. El precipitado se lavó con etanol (70%) y se dejó secar a temperatura ambiente. Finalmente, el ADN precipitado se disolvió en 100 µl de agua ultra pura estéril y se cuantificó la concentración resultante utilizando un equipo NanoDrop 1000 (Thermo Scientific), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los productos de la extracción se conservaron a -80ºC hasta su uso. Amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Se utilizaron dos marcadores para la caracterización molecular de las cepas. En primer lugar, las regiones del ADN ribosómico que corresponden a los espaciadores internos transcritos 1 y 2 (ITS1 e ITS2). Estas son regiones no codificantes situadas entre los genes ribosómicos 18S y 5.8S (ITS1), y entre 5.8S y 28S (ITS2), por ello son zonas muy variables que acumulan mutaciones y resultan especialmente útiles para diferenciar especies dentro de un mismo género. Se utilizaron los cebadores universales ITS1 (5'-TCC GTA GGT CCT GAA GCG G-3 ') e ITS4 (5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3') descritos por White y col. (1990), que amplifican en eucariotas la región ITS1-5.8S-ITS2 de longitud variable según el organismo, generalmente comprendida entre los 400 y 900 pares de bases (pb). El segundo marcador utilizado fue una región del gen de la enzima ARN polimerasa II subunidad B (RPB2), la cual también ha sido ampliamente utilizada en estudios filogenéticos de ascomicetos. Generalmente, este marcador suele emplearse para comparar niveles taxonómicos superiores: orden, familia y género. Sin embargo, también ha demostrado su variabilidad entre distintas especies del género Scolecobasidium (dela Cruz 2006a). Se utilizaron los cebadores específicos de hongos fRPB2- 5F (5'-GAY MGW GAT CAY TTY GG-3 ') y fRPB2-7CR (5'-CCC ATR GCT TGY TTR CCC AT-3') descritos por Liu y col. (1999), que amplifican una región codificante de aproximadamente unos 1.100 pb. Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium 45 Cada reacción de PCR se desarrolló en un volumen final de 50 µl. La mezcla de reacción estuvo compuesta por 5 µl de tampón de reacción 10X [Tris-HCl 750 mM (pH 9), KCl 500 mM, (NH4)2SO4 200 mM], 2 µl de MgCl2 50 mM, 0,5 µl de cada primer 50 µM (Invitrogen Life Technologies), 5 µl de la mezcla de desoxiribonucleótidos (dNTPs) (Bioline GC Biotech), 2 mM cada uno, 0,25 µl de la enzima Taq polimerasa (5 U/µl) (Biotools M&B Labs), 10-20 ng de ADN molde, y se completó el volumen de reacción con agua ultra pura estéril. Todas las muestras se analizaron por duplicado y se incluyeron dos controles negativos, que contenían agua ultra pura estéril reemplazando el ADN molde, para cada tanda de reacciones. Las reacciones de PCR se realizaron en un termociclador iCycler (Bio- Rad). El protocolo utilizado para la amplificación de las regiones ITS consistió en: 2 minutos de desnaturalización inicial a 95ºC; 35 ciclos compuestos por 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 50ºC, y 1 minuto a 72ºC; seguidos de 5 minutos de extensión final a 72ºC. El protocolo utilizado para la región del gen RPB2 fue el descrito por Liu y col. (1999), compuesto por: 5 minutos de desnaturalización inicial a 95ºC; 35 ciclos compuestos por 1 minuto a 95ºC, 2 minutos a 55ºC, y 1,5 minuto a 72ºC; seguidos de 10 minutos de extensión final a 72ºC. La amplificación de cada muestra analizada se comprobó mediante electroforesis horizontal en geles de agarosa (1% p/v) con tampón TAE 0,5X (Tris 20 mM, ácido acético glacial 10 mM, EDTA 0,5 mM). Para cada reacción se cargaron 5 µl del producto de PCR homogenizado con 3 µl de tampón de carga de electroforesis [Tris-HCl 50 Mm, sacarosa 0,25 g/ml, azul de bromofenol 1 mg/ml, SDS 5 mg/ml, SYBR Green I 2µl/ml (Roche Diagnostics)]; el SYBR Green I emite fluorescencia al unirse con el ADN amplificado. La electroforesis se desarrolló en un equipo Sub-Cell GT Cell (Bio-Rad) a 80 V durante 25 minutos. Los geles se observaron con un transiluminador ECX-26.MX (Vilber Lourmat) que emite luz U.V. a una longitud de onda de 312 nm. Las imágenes de los geles se captaron con un equipo Kodak EDAS-290 (Kodak) utilizando el programa “Kodak 1D v. 3.5.4. Imaging Scientific System” (Kodak). Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium 52 Caracterización de fuentes de carbono Se analizaron cinco de las cepas aisladas de la cueva de Lascaux (Tabla 2) y las cinco cepas de referencia del CBS (Tabla 3). Para determinar las fuentes de carbono asimilables por ellas, se utilizaron las placas multipocillos FF-MicroPlate (Biolog) (Fig. 10). Con ellas se evaluaron 95 fuentes de carbono distintas, siendo un sistema útil para caracterizar un amplio rango de hongos filamentosos y levaduras (dela Cruz y col. 2006b). La preparación del inóculo fúngico se realizó a partir de cultivos en placas de MEA con papel de celofán estéril en su superficie, permitiendo la recuperación del micelio libre de medio de cultivo. Aproximadamente un centímetro cuadrado de micelio se transfirió a tubos Eppendorf que contenían 1 ml de la solución de inoculación FF [Phytagel (Sigma-Aldrich) 2,5 g/l; Tween 40 0,3 g/l] estéril y perlas de vidrio de 2 y 4 mm de diámetro. La mezcla se homogenizó durante dos minutos a una velocidad de 5,5 m/s en el equipo Fast-Prep 24. La suspensión resultante se transfirió a tubos de borosilicato y se ajustó a un 75% de turbidez utilizando el turbidímetro de Biolog, añadiendo solución de inoculación FF. Las placas multipocillo se inocularon siguiendo las instrucciones del fabricante, se añadió a cada pocillo 100 µl de la suspensión micelial del hongo a evaluar. Las placas se incubaron en oscuridad a 22ºC durante 10 días. Cuando se oxidaron las fuentes de carbono se incrementó la actividad mitocondrial y se produjo un pigmento rojo anaranjado que aumenta la densidad óptica a 490 nm. Además, el crecimiento del hongo en el pocillo incrementó la turbidez aumentando la densidad óptica medida a 490 y 750 nm. Se realizaron medidas de absorbancia a 490 y 750 nm a los 3, 6 y 10 días, y se comprobó que los resultados más significativos se obtenían comparando las medidas de absorbancia a 490 nm a los 10 días de incubación. Para interpretar los resultados se estableció una escala para las medidas de absorbancia a 490 nm: los valores comprendidos entre 0 y 1 correspondieron a las reacciones negativas o dudosas y los valores mayores de 1 se consideraron reacciones positivas. Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium 53 Figura 10. Métodos empleados para caracterizar los requerimientos nutricionales de las especies de Ochroconis-Scolecobasidium. a. Sistema Biolog para caracterizar las fuentes asimilables de carbono. b. Sistema Api Zym para evaluar la actividad de una serie de enzimas degradativas. c y d. Ensayos de evaluación de distintos productos como fuentes de carbono y nitrógeno: cultivos (c) y recuperación de la biomasa resultante por filtración (d). En un experimento adicional, se evaluó la capacidad de la cepa LX CH16 de utilizar como fuente de carbono el BC o algunos de los productos de su degradación. Se seleccionaron los siguientes productos de degradación descritos por Patraucham y Oriel (2003): benzildimetilamina (BDAM), benzilamina (BAM) y ácido benzoico (BA); este último compuesto se cambió por el benzoato de sodio (BNa) por su solubilidad en agua. Se ensayaron tres concentraciones de BC, 100, 500 y 1.000 mg/l. Las concentraciones de los productos de degradación BDAM, BAM y BNa fueron 0,5 y 1 mmol/l, basadas en los ensayos de Patraucham y Oriel Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium 54 (2003). Previamente se comprobó que ninguno de estos tres subproductos, a estas concentraciones, inhibió el crecimiento de este hongo en placas de MEA. El ensayo se basó en el cultivo del hongo en solución Czapek sin sacarosa como fuente de carbono [NaNO3 2 g/l, K2HPO4 1 g/l, KCl 0,5 g/l, MgSO4 0,5 g/l, FeSO4 0,01 g/l] (Atlas, 2010), al cual se añadió el producto a evaluar como única fuente de carbono. Se añadieron controles negativos (sin fuente de carbono) y positivos (solución Czapek convencional, con sacarosa 30 g/l). Se ensayaron dos réplicas para cada uno de los tratamientos. Se prepararon un total de 22 matraces Erlenmeyer con 100 ml del medio cultivo esterilizado en autoclave a 121ºC durante 20 minutos. Se enfriaron hasta alcanzar la temperatura ambiente y se añadieron los diferentes productos a ensayar, previamente esterilizados por filtración con filtros de acetato de celulosa de 0,2 µm de diámetro de poro. Para preparar el inóculo fúngico, micelio de la cepa LX CH16 en crecimiento activo se cultivó en 150 ml de ME en un matraz Erlenmeyer, a 22ºC en agitación constante (150 rpm) durante un mes. La abundante biomasa obtenida se centrifugó a 3.500 rpm eliminando el medio de cultivo. Se realizaron dos lavados con agua destilada estéril para eliminar cualquier resto del medio de cultivo que pudiera aportar fuente de carbono al experimento, y la biomasa se resuspendió en 150 ml de agua destilada estéril. Cada uno de los 22 matraces del experimento se inoculó con 5 ml de la suspensión homogénea de micelio, correspondiente a un 1 mg de biomasa (peso seco)(Fig. 10c). Adicionalmente, se sembraron con el mismo inóculo dos placas de MEA para verificar que éste no se hubiera contaminado con la manipulación. Los matraces se incubaron en agitación continua (150 rpm) a 22ºC durante un mes. La biomasa resultante se recuperó por filtración con bomba de vacío (Fig. 10d), se secó y se calculó el incremento de biomasa para cada tratamiento. Los valores medios, para cada uno de los tratamientos, se compararon estadísticamente aplicando el Test de Fisher utilizando el programa SPSS (IBM). Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium 55 Adicionalmente, se evaluó la capacidad de las cepas LX A1 y LX CH40 de utilizar distintos compuestos aromáticos (ácido vaníllico, ptoluensulfonato sódico y tolueno) como fuentes de carbono. En éstos ensayos también se evaluaron otras especies de hongos aisladas de manchas negras en este estudio, por ello, la metodología y los resultados obtenidos en este experimento se detallan en el capítulo 4. Caracterización de fuentes de nitrógeno Para determinar las fuentes de nitrógeno asimilables por la cepa LX CH16 se realizó un ensayo siguiendo la metodología anteriormente descrita (Fig. 10 c,d), los cultivos se desarrollaron en solución Czapek sin nitrato sódico como fuente de nitrógeno, a la cual se añadió el producto a evaluar. Se evaluaron distintos tipos de fuentes de nitrógeno: nitrato (NaNO3), nitrito (NaNO2) y amonio [(NH4)2SO4]. Además, se analizaron dos de los productos de la degradación del BC: BDAM y BAM. La concentración de los productos evaluados se ajustó para aportar la misma cantidad de nitrógeno (0,32 g/l) que los 2 g de nitrato sódico que presenta la solución Czapek convencional. Se ensayaron tres réplicas para cada uno de los tratamientos, y se añadieron controles negativos (sin fuente de nitrógeno). Se prepararon un total de 18 matraces Erlenmeyer con 100 ml del medio cultivo, añadiendo las sales a evaluar, NaNO3, NaNO2 y [(NH4)2SO4], a los matraces correspondientes. Éstos se esterilizaron en autoclave a 121ºC durante 20 minutos. La BDAM y BAM se esterilizaron por filtración y se añadieron sobre el medio estéril a temperatura ambiente. La inoculación, incubación, registro y procesamiento de los datos se realizó como se detalla para el experimento anterior. Enzimas degradativas Se caracterizó la presencia de distintas enzimas en las diferentes especies de Ochroconis y Scolecobasidium. Se analizaron nueve de las cepas aisladas de la cueva de Lascaux (Tabla 2), y las cinco cepas de referencia del Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium 56 CBS (Tabla 3). Se utilizó el sistema Api Zym (BioMérieux), un método semicuantitativo para evaluar 19 actividades enzimáticas (Fig. 10b), siguiendo las instrucciones del fabricante, con algunas modificaciones. Se añadió a cada pocillo 65 µl de una suspensión micelial de la cepa a evaluar. Este inóculo fúngico se preparó siguiendo la metodología descrita para el sistema Biolog, con la única diferencia de usar agua destilada estéril en lugar de la solución de inoculación FF. Las galerías se incubaron a 30ºC en oscuridad durante 4h. Tras ello, se añadió una gota de los reactivos Zym A y Zym B, y se esperó diez minutos, bajo luz blanca, a que se desarrollara la reacción colorimétrica. Los resultados se registraron de acuerdo con una escala del 0-4, según la intensidad de color, pudiendo extrapolarse a la siguiente escala semicuantitativa, según la cantidad de substrato hidrolizado: 0 (no hay hidrólisis), 1 (<20 nmol), 2 (20-40 nmol), 3 (40-80 nmol), y 4 (>80 nmol) (dela Cruz y col. 2006b). Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium 57 Resultados y discusión Identificación de especies de Ochroconis-Scolecobasidium En este estudio, mediante el análisis molecular de los marcadores filogenéticos ITS y RPB2, y el análisis morfológico, se determinó la identificación de los hongos anteriormente descritos como Scolecobasidium o Ulocladium (Bastian y col. 2009d, Orial y col. 2011), principalmente asociados a las manchas negras que aparecieron sobre las paredes y bóvedas de roca caliza del Pasaje, Nave y Ábside. Los resultados obtenidos permitieron la descripción molecular y morfológica de dos nuevas especies del género Ochroconis, a las que pertenecen las cepas aisladas de la cueva de Lascaux. Se estimó la variabilidad genética de estas especies y sus relaciones filogenéticas con las especies de referencia incluidas en este estudio. Identificación molecular Comparando las secuencias ITS y RPB2 de las 30 cepas de Ochroconis- Scolecobasidium procedentes de la cueva de Lascaux, se diferenciaron claramente dos grupos (Figs. 11 y 12). El primero de ellos incluye 28 de las cepas y el segundo está compuesto por las cepas LX CH40 y LX M1-3. Dentro del grupo mayoritario se encuentra la cepa LX PDA, anteriormente identificada como Ulocladium sp. por el LRMH, lo que demuestra que pertenece a la misma especie que el resto de las cepas incluidas en este grupo. Las secuencias ITS de este grupo fueron muy homogéneas, con una longitud aproximada de 620 pb. Tan sólo se apreciaron ligeras diferencias en algunas de las cepas, de uno a dos pares de bases en longitud y de uno a cuatro nucleótidos en secuencia. Basándose en ellas, como muestra la Figura 11, se diferenciaron siete subgrupos y se seleccionó una cepa representativa de cada uno de ellos para incluirla en los posteriores análisis filogenéticos. Sólo se depositaron en GenBank las secuencias de estas cepas representativas, evitando así la redundancia de datos idénticos. La cepa LX Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium 58 A1 fue representativa de 16 cepas con secuencia idéntica. En cuanto al gen RPB2 (Fig. 12), las 28 cepas de este grupo tuvieron secuencias con longitud comprendida entre 1.051 y 1.133 pb, 23 de las cuales fueron idénticas (incluyendo la secuencia de LX A1), tres difieren tan sólo en un nucleótido (LX 7.2, LX 21T-2 y LX PDA), y las dos restantes acumulan un total de 31 nucleótidos diferentes (LX 101R-6 y LX 107X-8). Sin embargo, al comparar las secuencias de aminoácidos de RPB2 todas fueron idénticas. Dentro del segundo grupo, las cepas LX CH40 y LX M1-3, tuvieron idénticas secuencias para ambos marcadores, cuya longitud fue de 736 pb para ITS y de 1.033 pb para RPB2. Cuando las secuencias resultantes del grupo mayoritario se compararon con las depositadas en GenBank mediante el algoritmo BLASTn (NCBI), los resultados fueron idénticos para 28 de las cepas. Las secuencias de GenBank que presentaron los mayores porcentajes de identidad nucleotídica correspondieron a S. tshawytschae (83% de identidad con respecto a un 88% de cobertura de alineamiento, en el análisis del marcador ITS) y S. variabile (84% de identidad con respecto a un 75% de cobertura de alineamiento, en el análisis del marcador RPB2); ambas nomenclaturas son actualmente consideradas sinónimas de la especie O. tshawytschae. El resultado BLASTn de las secuencias RPB2 de LX CH40 y LX M1-3 fue similar, siendo las secuencias de S. variabile las más parecidas (85% de identidad con un 77% de cobertura). Sin embargo, sus secuencias ITS no alinearon significativamente con ninguna de las secuencias depositadas en GenBank, ya que distintas especies de Scolecobasidium dieron porcentajes de cobertura de alineamiento menores al 54%. Cabe destacar, que los porcentajes de identidad obtenidos para los dos grupos de cepas aisladas de la cueva de Lascaux fueron bastante bajos (83-85%), indicando que esos grupos pertenecen a especies distintas de aquellas depositadas en GenBank. Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium 59 Figura 11. Relaciones filogenéticas entre las cepas de Ochroconis- Scolecobasidium aisladas de la cueva de Lascaux, basadas en el análisis de la región ITS. El árbol no enraizado se obtuvo aplicando el método “Neighbour-Joining” y el modelo de substitución Kimura 2-parámetros. Los valores “bootstrap” se expresan como porcentajes de 1.000 réplicas. Los asteriscos indican los nudos del árbol que también se obtuvieron utilizando los algoritmos de Mínima-Evolución y Máxima-Parsimonia. La barra representa 0,02 cambios de nucleótidos por posición. Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium 60 Figura 12. Relaciones filogenéticas entre las cepas de Ochroconis- Scolecobasidium aisladas de la cueva de Lascaux, basadas en el análisis de la región RPB2. El árbol no enraizado se obtuvo aplicando el método “Neighbour-Joining” y el modelo de substitución Kimura 2-parámetros. Los valores “bootstrap” se expresan como porcentajes de 1.000 réplicas. Los asteriscos indican los nudos del árbol que también se obtuvieron Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium 61 utilizando los algoritmos de Mínima-Evolución y Máxima-Parsimonia. La barra representa 0,02 cambios de nucleótidos por posición. Inicialmente, se analizaron las relaciones filogenéticas entre las diferentes cepas de Ochroconis aisladas de la cueva y las secuencias homólogas más cercanas procedentes de GenBank (no se muestran). Los árboles filogenéticos obtenidos no fueron coherentes. El problema que planteó esta aproximación es que las secuencias depositadas en GenBank de los géneros Ochroconis y Scolecobasidium eran muy escasas y con una identificación poco fiable, como muestra la filogenia elaborada por Hamayun y col. (2009). Por ello, se incluyeron en los análisis las cepas de referencia obtenidas de la colección del CBS, y sólo se utilizaron las siguientes secuencias de GenBank: una secuencia ITS de la cepa IFM 52605 de Ochroconis gallopava (AB125284) para establecer su posición filogenética dentro del género, y tres secuencias de la cepa NRRL 4791 de Aspergillus versicolor (ITS, EF652478; RPB2, EF652214/ABW72415, nucleótidos/aminoácidos respectivamente) utilizada como grupo externo para enraizar los árboles filogenéticos. Las regiones ITS de las cinco cepas de referencia mostraron longitudes variables, comprendidas entre los 574 pb para S. terreum (CBS 536.69) y los 729 pb para O. tshawuyschae (CBS 100438). Además, cuando se realizó el alineamiento múltiple comparando las cepas representativas de la cueva de Lascaux con las cepas de referencia de distintas especies, se introdujeron numerosos “gaps”, principalmente localizados en las regiones ITS1 e ITS2. Éstos pueden deberse a eventos de inserción-delección frecuentes en estas regiones variables. En los análisis filogenéticos, las posiciones que contenían “gaps” se eliminaron previamente y el árbol resultante estuvo basado en la comparación de 398 posiciones nucleotídicas alineadas (Fig. 13). Sin embargo, aunque las secuencias del gen RPB2 de las distintas especies tuvieron longitud variable (entre los 759 pb de O. constricta CBS 211.54 y los 1.110 pb para O. anellii CBS 284.64), éstas se alinearon perfectamente sin introducir “gaps” relevantes y los árboles filogenéticos se generaron basándose en la comparación de 688 nucleótidos y 225 Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium 68 14,4 x 1,8-2,25 μm. Conidia olivaceo-brunnea, 2-3 septata, in denticlae epiphysae crescerae, facile constricta ad septa, verrucosa vel tuberculosa, cum apiculate basis et residua denticlae 11,2-14,1 x (2,8-)3,5(-4,2) μm. Chlamydosporae absentae. Descripción: Colonias crecidas durante 14 días sobre MEA a 25ºC con diámetros comprendidos entre 13 y 22 mm, aspecto plano, superficie de aterciopelada a flocosa, algunas colonias con superficie granular o apariencia funiculosa en la zona central, con margen sumergido 0,5 mm, de color verde oliva-verde oliva grisáceo en el anverso y las mismas tonalidades pero oscurecidas al reverso con la parte central de color oliva grisáceo. Las colonias crecidas sobre PDA tuvieron unos diámetros comprendidos entre 9 y 25 mm, aspecto plano, superficie de aterciopelada a flocosa con apariencia funiculosa en la zona central, de color verde oliva grisáceo en el anverso y verde oliva oscuro en el reverso con la parte central de color oliva oscuro. Las colonias crecidas sobre V8A tuvieron unos diámetros comprendidos entre 17 y 25 mm, aspecto plano, superficie predominantemente flocosa y/o funiculosa, con el margen sumergido 1-2,5 mm, de color verde oliva grisáceo-verde oliva grisáceo oscuro en el anverso y verde oliva oscuro en el reverso con la parte central de color oliva oscuro (Fig. 16a-c). Hifas subhialinas de color pardo. Conidióforos rectos y cilíndricos, frecuentemente algo flexuosos, formados por una sola célula o septados, con superficie lisa, de color oliva pálido a veces con la zona superior hialina, tamaño de 12,6-14,4 x 1,8-2,25 μm. Conidios producidos sobre pequeños dentículos en la zona superior del conidióforo, forma cilíndrica con ligeras constricciones en los 2-3 septos que presentan, con parte del dentículo del conidióforo unido a la base, ligeramente apiculada, superficie de verrucosa a tuberculada de acuerdo con la observaciones en el microscopio electrónico de barrido, color oliva pálido-marrón oliváceo, tamaño de 11,2-14,1 x (2,8- )3,5(-4,2) μm. Clamidosporas ausentes (Figs. 16d-h y 17) Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium 69 Figura 16. Ochroconis lascauxensis, cepa LX A1 (holotipo). Colonias tras 10 días de incubación a 25ºC sobre MEA (a), PDA (b) y V8A (c). Conidióforos y conidios observados por microscopía óptica (d-f; barra de escala: 10 μm) y microscopía electrónica de barrido (g y h; barra de escala: 1 μm). Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium 70 Figura 17. Características microscópicas de Ochroconis lascauxensis. Conidióforos y conidios. Holotipo: LX A1 (=CMF ISB 1862), aislado por Fabiola Bastian de una muestra de mancha negra sobre la roca caliza, recogida el 26 de agosto de 2008, de la pared izquierda del Pasaje de la cueva de Lascaux, Montignac, Francia (45° 3′ 13.3″ N, 1° 10′ 12″ E). Hábitat: Paredes, bóvedas, sedimentos y aire de la cueva de Lascaux, frecuentemente asociado a las manchas negras desarrolladas en superficie. Material examinado: Cepas aisladas de la cueva de Lascaux: LX CH2, LX CH3, LX CH7, LX CH13, LXCH16, LX A1, LX A3, LX 101R-6 y LX 101R-7. Cepas de referencia: O. tshawytschae CBS 100438 y O. anellii CBS 284.64. Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium 71 Ochroconis anomala A. Nováková y P.M. Martin-Sanchez, sp. nov. Código Mycobank: MB561939 Etimología: el epíteto específico es el adjetivo que hace referencia a la conidiogénesis anómala que desarrolla esta especie, distinta de la típica del género Ochroconis. Descripción en latín: Coloniae in MEA, ad 25ºC, 17-22 mm in diametro post 14 dies, planae, velutinae ad floccosae in partis centralis, colonia margin tincto 1,5 mm, olea viridae cum olicavaceo-cinereus in partis centralis, reversum olivaceo-viride nigricans. Coloniae in PDA 20-22 mm, planae cum 2-2.5 mm margo submerse, reversum olivaceo-viride nigricans. Hyphae subhyalinae ad pallide brunnae, conidiophorae erectae aut flexuosae, dilucide olivaceo-viridae cum terminae hyalinae, glabrae, 12,6-25,2 x 2,8-3,6 μm. Conidiogenesis duo modi – conidia penetretibus ad partis apical in catella breve et sequentia in denticulis, conidia pallide olivacea, 2-5- cellularia, majorem partem 1-2- septata, 1-septata 7,8 x 2,4 µm, 2-septata 10,2-12,0 x 3,6 µm, 3-septata 12,0-12,6 x 3,6 µm, ± glabra, in microscopo SEM rugosa neque verrucosa aut echinata. Chlamydosporae absentae. Descripción: Colonias crecidas durante 14 días sobre MEA a 25ºC con diámetros comprendidos entre 17 y 22 mm, aspecto plano con abultamiento central, superficie velutinosa, con margen sumergido 1,5 mm, de color gris oliva con la zona central oliva grisáceo en el anverso y verde oliva profundo al reverso. Las colonias crecidas sobre PDA tuvieron unos diámetros comprendidos entre 20 y 22 mm, aspecto plano, superficie velutinosa, con margen sumergido 2-2,5 mm, de color verde oliva grisáceo en el anverso y verde oliva oscuro en el reverso. Las colonias crecidas sobre V8A tuvieron unos diámetros comprendidos entre 17 y 19 mm, aspecto plano, superficie velutinosa con la zona central granular, con el margen sumergido 2 mm, de color verde oliva grisáceo en el anverso y verde oliva oscuro en el reverso (Fig. 18a-c). Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium 72 Figura 18. Ochroconis anomala. Colonias tras 10 días de incubación a 25ºC sobre MEA (a), PDA (b), y tras un mes sobre V8A (c). Conidióforos y conidios observados por microscopía óptica (d-f; barra de escala: 10 μm) y microscopía electrónica de barrido (g y h; barra de escala: 1 μm). Hifas subhialinas de color pardo. Conidióforos rectos o flexuosos, con forma cilíndrica, simples o ramificados, presentan 0-2 septos, superficie lisa, de color oliva pálido, disminuyendo en la zona superior hialina, tamaño de 12,6-25,2 x 2,8-3,6 μm. Muestra dos tipos de conidiogénesis, en una de ellas los conidios proliferan desde la zona apical de la célula conidiógena Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium 73 formando cadenas cortas (conidiogénesis anómala), en el otro tipo los conidios se producen sobre dentículos en la zona superior del conidióforo (conidiogénesis frecuente en el género Ochroconis). Conidios con forma cilíndrica, con 2-4 septos predominando aquellos que tienen 2, con superficie aproximadamente lisa al microscopio óptico, pero de aspecto áspero de acuerdo con la observaciones en el microscopio electrónico de barrido, tamaño variable según el número de células que la formen, con 2 células 7,8 x 2,4 µm, con 4 células 10,2-12 x 3,6 µm y con 5 células 12-12,6 x 3,6 µm. Clamidosporas ausentes (Figs. 18d-h y 19). Figura 19. Características microscópicas de Ochroconis anomala. Conidióforos y conidios. Holotipo: LX CH40 (=CMF ISB 1866), aislado por Fabiola Bastian de una muestra de colonización fúngica blanca sobre el sustrato arcilloso, recogida el 23 de agosto de 2007, de la pared derecha a la entrada del Divertículo Axial de la cueva de Lascaux, Montignac, Francia (45° 3′ 13.3″ N, 1° 10′ 12″ E). Hábitat: Paredes de la cueva de Lascaux, asociado a colonizaciones fúngicas y manchas negras. Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium 74 Material examinado: Cepas aisladas de la cueva de Lascaux: LX CH40 y LX M1-3. Cepas de referencia: O. tshawytschae CBS 100438 y O. anellii CBS 284.64. En cuanto al tipo de conidiogénesis y morfología de los conidios, las dos nuevas especies descritas pertenecen al género Ochroconis. El género Scolecobasidum está restringido a aquellas especies que desarrollan conidios trilobulados (de Hoog y von Arx 1973). Los conidios de O. lascauxensis tienen mayoritariamente 2-3 septos mientras que O. anomala tan sólo uno. Su forma es más cilíndrica en O. lascauxensis, y su superficie se muestra diferente al observarse con el microscopio electrónico de barrido, con tubérculos en O. lascauxensis y aspecto rugoso en O. anomala. Las especies más próximas a las aisladas en la cueva de Lascaux son O. tshawytschae (Doty et Slater) Kirilenko & Al-Akhmed 1977, y O. anellii (Graniti) de Hoog & Arx 1973. Estas dos especies desarrollan conidios similares, principalmente con dos septos y superficie tuberculada (Fig. 20). Sin embargo, éstas dos especies tipo desarrollan conidios que alcanzan una mayor longitud que las especies aisladas de la cueva de Lascaux. Los conidios de O. tshawytschae presentan una forma más cilíndrica, y los de O. anellii son más elípticos, con una mayor anchura (4-7,5 µm). Además O. anellii desarrolla conidióforos más robustos. En este estudio se incluyó la cepa LX PDA, identificada como Ulocladium sp. por el LRMH, años antes, y a la que atribuyeron la formación de las manchas negras. Esta era representativa de las abundantes colonias melanizadas aisladas de las manchas negras que aparecieron sobre la roca caliza: en la cornamenta del Ciervo Abatido del Ábside (agosto de 2007, Fig. 7d), y en las zonas A-D del Pasaje, utilizadas en el ensayo de los tratamientos de control (agosto de 2008-febrero de 2009, Fig. 7f,g) (Orial y Mertz 2006, Orial y col. 2011). Tras su análisis, la cepa LX-PDA se identificó como O. lascauxensis, poniendo de manifiesto que su anterior identificación fue claramente errónea. El género Ulocladium, aunque puede desarrollar colonias con morfología algo similar a las de Ochroconis, posee Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium 75 características microscópicas y posición filogenética muy diferente (Barron 1968, de Hoog y col. 2000, Domsch y col. 2007). Ulocladium pertenece a la familia Pleosporaceae, muy distante filogenéticamente de Ochroconis, sus conidios son ovoides en lugar de cilíndricos como O. lascauxensis, irregularmente divididos con septos transversales, oblicuos y longitudinales, mientras que O. lascauxensis sólo presenta septos transversales. Por sus características microscópicas, el género Ulocladium podría confundirse con Alternaria, pero en ningún caso con Ochroconis (Barron 1968). Figura 20. Comparativa entre conidióforos y conidios de Ochroconis anellii CBS 284.64 (a y b) y O. tshawytschae CBS 100438 (c y d). Barras de escala: 10 μm (microscopía óptica) y 1 μm (microscopía electrónica de barrido). Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium 76 La especie O. lascauxensis, en función de sus características morfológicas y de los resultados moleculares iniciales, análisis BLAST de sus secuencias ITS, puede llegar a confundirse con S. tshawytschae (sinónimo de O. tshawytschae), como ocurrió en los primeros estudios llevados a cabo por Bastian y col. (2010). Sin embargo, en el presente estudio, los análisis filogenéticos y el estudio comparativo de sus caracteres morfológicos, incluyendo el análisis SEM, permitieron diferenciar las dos nuevas especies aisladas de la cueva de Lascaux de las especies más próximas, O. tshawytschae y O. anellii. De acuerdo con Domsch y col. (2007), S. tshawytschae (= O. tshawytschae) es la segunda especie más común del género Scolecobasidium, y ha sido aislada a partir de sustratos muy variados: suelo, turba, hojarasca, rizosfera, acículas de pino, invernaderos tropicales, compost, aguas de acuarios, marismas, etc. (Roy y col. 1962, de Hoog y col. 2000, Grandi y Gusmão 2002, Orłowska y col. 2004, Liu y Zhang 2004, Piontelli y col. 2005, Domsch y col. 2007). Pinholt y col. (1979) asoció esta especie a suelos enriquecidos con petróleo, demostrando su capacidad de asimilar hidrocarburos. Recientemente ha sido descrita como patógeno humano causando feohifomicosis subcutánea (Ge y col. 2012). Esta especie también ha sido aislada del aire de la cueva Domica, Eslovaquia (Nováková 2009). La especie O. anellii fue inicialmente descrita en manchas negras desarrolladas sobre las estalactitas de la cueva de Castellana, Bari, Italia (Graniti 1963), y también ha sido aislada del sedimento de la cueva Javoříčko, República Checa (Bosák y col. 2001), y de muestras de suelo procedentes de la Cordillera Dahingganling, Mongolia, China (Wu y Zhang 2008). La abundancia de las especies de Ochroconis en la cueva de Lascaux fue muy diferente, O. lascauxensis se encontró ampliamente distribuida (28 de las 30 cepas estudiadas), mientras que la presencia de O. anomala fue bastante restringida, ya que sólo se aislaron dos cepas. O. lascauxensis estuvo principalmente asociada a las manchas negras que aparecen sobre la roca caliza de las paredes y bóvedas, 19 de las 28 cepas analizadas se aislaron de Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium 77 este tipo de sustrato (Tabla 2). Sin embargo, su distribución parece ser mucho más amplia, aislándose también de manchas con distinta coloración que cubren los sedimentos arcillosos de los bancos laterales, e incluso de muestras de aire. Actualmente no tenemos datos suficientes para determinar la distribución de O. anomala; LX CH40 se aisló de una colonización fúngica del Divertículo Axial y LX M1-3 de una mancha negra sobre un banco arcilloso del Pasaje. Caracterización de especies de Ochroconis Crecimiento a distintas temperaturas Las tasas de crecimiento a distintas temperaturas de las dos cepas ensayadas de O. lascauxensis se muestran en la Tabla 5. La temperatura óptima de crecimiento para ambas cepas fue de 22ºC (Fig. 21a), con tasas de crecimiento en medio MEA de 38,5 ± 1,5 mm/mes (LXA1) y 39,7 ± 0,2 (LXCH16). Por debajo de esta temperatura, las colonias tuvieron un crecimiento considerable a los 13ºC (temperatura media de la cueva), que disminuyó notablemente a los 5ºC (Fig. 21b), con valores en torno a los 8 mm/mes. A las temperaturas superiores ensayadas (30 y 35ºC) ninguna de las cepas fue capaz de crecer. Tabla 5. Tasas de crecimiento de O. lascauxensis a diferentes temperaturas, expresadas (mm/mes) Cepas 5ºC 13ºC 22ºC 30ºC 35ºC LX A1 8,2 ± 0,2 22,7 ± 0,7 38,5 ± 1,5 - - LX CH16 9,7 ± 0,5 25,2 ± 1,7 39,7 ± 0,2 - - Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium 84 Tabla 9. Fuentes de carbono de las distintas especies de Ochroconis y Scolecobasidium. Resultados obtenidos con el sistema Biolog (FF MicroPlate). Fuentes carbono Ol a Oa Ot Oan Oc Oh St Tween 80 + + + + + + + N-Acetil-D- galactosamina - - - - - - - N-Acetil-D- glucosamina + + + + + + + N-Acetil-D- manosamina - - - - - - - Adonitol + + + - + + + Amigdalina + + + + + + - D-Arabinosa + + + - - - - L-Arabinosa + + + - + + + D-Arabitol + + + + + - + Arbutina + + + - + + + D-Celobiosa + + + + + + + α-Cyclodextrina - - - - - - - β-Cyclodextrina - - - - - - - Dextrina + + + + + + + i-Eritritol - - - + + - - D-Fructosa + + + + + + + L-Fucosa +b + - - - - - D-Galactosa + + + - + + + Ácido D-galacturónico - - - - - - - Gentiobiosa + + + + + + + Ácido D-glucónico - - - - + - + D-Glucosamina - - - - - - - α-D-Glucosa + + + + + + + Glucosa-1-fosfato + + + + + + + Glucuronamida - - - - - - - Ácido D- glucurónico + - - - - - - Glicerol + + + + + + + Glicógeno - - - - - - - m-Inositol - - - - - - - Ácido 2-ceto- D-glucónico - - - - - - - α-D-Lactosa + + + - + + + Lactulosa - - - - + + - Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium 85 Tabla 9 (Continuación). Fuentes carbono Ol a Oa Ot Oan Oc Oh St Maltitol + + + + + + + Maltosa + + + + + + + Maltotriosa + + + + + + + D-Manitol + + + + + + + D-Manosa + + + + + + + D-Melezitosa + + + + + + + D-Melibiosa + + + - + - + α-Metil-D- galactosidasa - - - - + - + β- Metil-D- galactosidasa - - - - + - - α- Metil-D- glucósido - - - - - - - β- Metil-D- glucósido + + + + + + - Palatinosa + + + + + + + D-Psicosa - - - - - - - D-Rafinosa + + + + + - + L-Ramnosa + + + - + + + D-Ribosa + + - + + - + Salicina + + + + + + - Sedoheptulosa - - - - + - - D-Sorbitol + + + + + + + L-Sorbosa - - - - - - - Estachiosa + + + + + - + Sacarosa + + + + + + + D-Tagotosa - - - - - - + D-Trehalosa + + + + + + + Turanosa + + + + + + + Xilitol + + + + + + + D-Xilosa + + + + + + + Ácido γ-amino- butírico + + - - + + + Ácido bromosuccínico + + - + + + + Ácido fumárico + + + + + - + Ácido β-Hidroxi- butírico + + + + + + + Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium 86 Tabla 9 (Continuación). Fuentes carbono Ol a Oa Ot Oan Oc Oh St Ácido γ -hidroxi- butírico - + - - - - - Ácido phidroxifenil-acético + + - - + + + Ácido α-ceto- glutárico + + - + + + + Ácido metil ester D-láctico - - - - - - + Ácido L-láctico + + - + + + + Ácido D-málico + + + - + - + Ácido L-málico + + + + + + + Ácido quínico + + + - + + + Ácido D-sacárico +c + + + + - - Ácido sebácico + + + - - - - Ácido succinámico + - - - + - + Ácido succínico + + + + + + + Ácido mono-metil ester succínico - - - - - - - Ácido N-acetil- L-glutámico - - - - + + + Alaninamida + + - - + + + L-Alanina + + + + + + + L-Alanil-glicina + + + + + - + L-Asparagina + + + + + + + Ácido L-aspártico + + + + + + + Ácido L-glutámico + + + + + + + Ácido glicil-L- glutámico + + + + + - - L-Ornitina + + - + + + + L-Fenilalanina + + + + + + + L-Prolina + + + + + + + Ácido L- piroglutámico + c + + - + + + L-Serina + + + + + + + L-Treonina - - - - + - + 2-Amino etanol - - - - + - + Putrescina + - - - + - + Adenosina - - - - - - - Uridina - - - - + - - Adenosina-5´- monofosfato - - - - - - - Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium 87 Tabla 9 (Continuación). Abreviaturas: Ol: O. lascauxensis; Oa: O. anomala; Ot: O. tshawytschae; Oan: O. anellii; Oc: O. constricta; Oh: O. humicola; St: S. terreum. Las casillas sombreadas indican resultados diferentes entre las cepas estudiadas. a: Resultado basado en el análisis de cuatro cepas: LX A1, LX CH7, LX 7.2 y LX 101R6 b: Resultado positivo solo en la cepa LX 101R6 c: Resultado positivos en la cepas: LX A1, LX CH7 y LX 7.2 Cloruro de benzalconio y sus productos de degradación como fuentes de carbono Se evaluó la capacidad de O. lascauxensis LX CH16 de utilizar como fuente de carbono el BC o algunos de sus productos de degradación. Los resultados de este ensayo se detallan en la Figura 23. Las distintas concentraciones evaluadas de BC y BDAM no mostraron diferencias significativas con respecto al control negativo, el cual presenta un incremento de biomasa de 10,5 ± 1.08 mg debido a las reservas nutricionales que mantiene el micelio inoculado. Sin embargo, los subproductos BAM y BNa muestran un incremento de biomasa significativamente superior al control negativo. Los incrementos detectados con estos productos (en torno a 13-15 mg) pueden parecer muy débiles en relación con el incremento de biomasa producido en el control positivo (sacarosa), 87,25 ± 1.05 mg (no se muestra en el gráfico), pero hay que tener en cuenta que la concentración testada de éstos compuestos es muy baja (aprox. 50-100 µl/l del producto puro) en relación con la cantidad de sacarosa que contiene el control positivo (30g/l). Si se calculan las concentraciones necesarias de estos productos para que aporten la misma cantidad de carbono que esa cantidad de sacarosa (12,6 g/l de carbono), las concentraciones de BDAM, BAM y BNa deben ser unas 200 veces superiores (aprox. 16-17-30 ml/l, respectivamente). Se intentó repetir el ensayo con estas condiciones, pero no fue posible metodológicamente pues estos compuestos no son solubles a concentraciones tan elevadas, además de que su toxicidad es desconocida. Teniendo en cuenta estas consideraciones, se estableció que los resultados obtenidos fueron válidos Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium 88 para demostrar que O. lascauxensis es capaz de utilizar como fuente de carbono la benzilamina (BAM) y el ácido benzoico (BA). Figura 23. Utilización de fuentes de carbono por Ochroconis lascauxensis LXCH16. Los datos son medias de dos replicas. (*) Los valores acompañados por la misma letra no son significativamente diferentes de acuerdo con el Test de Fisher (P=0,05). Fuentes de nitrógeno Se caracterizaron las fuentes de nitrógeno asimilables por O. lascauxensis LX CH16. Los resultados de este ensayo se muestran en la Figura 24, en la que se detallan los incrementos de biomasa ya relativizados, restando el incremento medio producido en el control negativo. Se observó que todos los productos ensayados se utilizaron como fuentes de nitrógeno Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium 89 por este hongo. Las fuentes de nitrato (NaNO3) y amonio [(NH4)2SO4] son las que asimiló con mayor eficiencia, mientras que la fuente de nitrito (NaNO2), y los subproductos del cloruro de benzalconio BDAM y BAM, produjeron un incremento de biomasa significativamente inferior. Sin embargo, estos tres productos fueron claramente utilizados como fuente de nitrógeno, provocando el doble de incremento biomasa que el control negativo. Figura 24. Utilización de fuentes de nitrógeno por Ochroconis lascauxensis LXCH16. Los datos son medias de tres replicas, relativizadas con el valor medio obtenido en el control negativo (solución Czapek sin nitrógeno). (*) Los valores acompañados por la misma letra no son significativamente diferentes de acuerdo con el Test de Fisher (P=0,05). Los resultados obtenidos en estos ensayos demuestran que los tres productos de degradación del cloruro de benzalconio, BDAM, BAM y BA, aportan carbono o nitrógeno asimilable por O. lascauxensis. La influencia de los tratamientos biocidas en el origen y evolución de las especies de Ochroconis se discute en el capítulo 4, junto con otras especies Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium 90 de hongos que se encontraron asociadas al fenómeno de las manchas negras. Lastennet y col. (2011) encontraron abundantes sales nitrogenadas en los sedimentos y aguas de goteo de la cueva, lo que indica la amplia disponibilidad de fuentes de nitrógeno que tienen estos hongos para el desarrollo de su metabolismo. Enzimas degradativas Se caracterizaron las enzimas degradativas presentes en ocho cepas de O. lascauxensis, una cepa de O. anomala, y las cinco cepas de referencia del CBS (Tabla 10). Todas las cepas ensayadas producen cinco de las 19 enzimas evaluadas con el sistema Apy Zym: fosfatasa alcalina, esterasa (C4), leucina arilamidasa, fosfatasa ácida y naftol-AS-BI-fosfohidrolasa. Además, algunas de las cepas aisladas de la cueva de Lascaux tienen la actividad esterasa lipasa (C8) y α-galactosidasa. Por lo demás, las actividades enzimáticas de las cepas de la cueva son bastante homogéneas, sólo muestran leves diferencias en cuanto a la cantidad de sustrato hidrolizado. Las especies O. humicola y S. terreum poseen algunas actividades enzimáticas que las diferencian del resto. Identificación y caracterización Ochroconis-Scolecobasidium Tabla 10. Actividades enzimáticas detectadas en especies de Ochroconis-Scolecobasidium, resultados del sistema Api Zym expresados en cantidad de substrato hidrolizadoa. a: La cantidad de substrato hidrolizado correlaciona con la producción de enzimas. No hay substrato hidrolizado (0), < 20 nmol (1), 20-40 nmol (2), 40-80 nmol (3), > 80 nmol (4). b: De las 19 enzimas ensayadas, sólo se muestran aquellas que dieron reacción positiva (en negrita) con alguna de las cepas analizadas. Las siguientes enzimas no se sintetizaron por ninguna de las cepas: lipasa (C4), valina arilamidasa, cistina arilamidasa, tripsina, α-quimotripsina, βglucuronidasa, α-glucosidasa, y α-fucosidasa. c: Abreviaturas: Oa: O. anomala; Ot: O. tshawytschae; Oan: O. anellii; Oc: O. constricta; Oh: O. humicola; St: S. terreum. Enzimas ensayadasb Ochroconis lascauxensis (cepas de Lascaux, LX) Oa c Cepas de referencia c A1 A3 CH2 CH3 CH7 CH16 7.2 101R-6 LXCH40 Ot Oan Oc Oh St 2. Fosfatasa alcalina 2 2 2 1 2 2 2 3 1 1 2 2 3 1 3. Esterasa (C4) 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4. Esterasa lipasa (C8) 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 6. Leucina arilamidasa 2 2 2 2 2 1 2 1 2 1 2 3 3 2 11. Fosfatasa ácida 3 2 2 2 3 3 3 3 4 2 4 4 4 4 12. Naftol-AS-BI- fosfohidrolasa 2 3 3 2 2 2 2 2 3 2 2 2 2 2 13. α-galactosidasa 0 0 1 1 2 0 2 3 0 0 0 0 0 0 14. β-galactosidasa 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 17. β-glucosidasa 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 18. N-acetil-β- glucosaminidasa 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 19. α-mannosidasa 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 93 CAPÍTULO 3 DISTRIBUCIÓN DE OCHROCONIS LASCAUXENSIS EN LA CUEVA DE LASCAUX El objetivo de este capítulo fue desarrollar un protocolo específico para la detección y cuantificación de O. lascauxensis, especie de Ochroconis que ha sido aislada de forma mayoritaria en la cueva de Lascaux. Para ello, se utilizó la técnica de PCR a tiempo real. Una vez puesto a punto el protocolo, se aplicó en el análisis de muestras ambientales de distinto origen, recogidas de la cueva en diferentes fechas. Se analizaron muestras de manchas sobre caliza o arcilla, sedimentos y aire. Con los resultados obtenidos pudo conocerse la distribución y evolución de este hongo en la cueva, y determinar su contribución al fenómeno de las manchas negras. Distribución Ochroconis lascauxensis 94 Material y métodos Puesta a punto del protocolo de detección-cuantificación de Ochroconis lascauxensis Técnica de PCR a tiempo real Las reacciones se llevaron a cabo utilizando el producto “SsoFast EvaGreen Supermix” (Bio-Rad), que utiliza el fluoróforo EvaGreen, que al igual que SYBR Green I, emite fluorescencia a 530 nm de longitud de onda cuando se une a la doble cadena de ADN. Por lo tanto, en aquellas reacciones que se produce la amplificación del ADN se genera una señal de fluorescencia. El tiempo que tarda en aparecer esta señal, a lo largo de los ciclos de PCR, será indicativo de la cantidad inicial de ADN diana que posee una muestra, siendo ésta la base de la PCR cuantitativa (qPCR). Al final del programa de PCR, los productos se someten a un incremento progresivo de temperatura hasta su completa desnaturalización. Las medidas de fluorescencia a distintas temperaturas generan la llamada curva de disociación (“melting curve”), donde cada fragmento amplificado tiene una temperatura de disociación específica. Al trabajar con EvaGreen, al igual que con SYBR Green I, siempre hay que estudiar la curva de disociación para verificar la especificidad de la secuencia amplificada. El producto comercial utilizado incluye la enzima “Sso 7d-fusion polymerase”, la cual permite acortar considerablemente los ciclos de PCR y el tiempo total del análisis, sin perjudicar la sensibilidad, eficiencia y reproducibilidad de la técnica. Cada reacción de PCR se desarrolló en un volumen final de 20 µl, tal y como detallan las instrucciones del fabricante. La mezcla de reacción estuvo compuesta por 10 µl de “SsoFast Evagreen Supermix” 2X [Tampón de reacción que incluye la enzima polimerasa, la mezcla de desoxiribonucleótidos (dNTPs), MgCl2, y el fluoróforo EvaGreen; concentraciones no especificadas por el fabricante], 0,2 µl de cada cebador 50 µM (Invitrogen Life Technologies), 7,6 µl de agua ultra pura estéril y 2 µl Distribución Ochroconis lascauxensis 101 Tabla 12. Descripción de las muestras recogidas en los años 2008 y 2009. Muestras Características Localización Fecha A 08 Mancha negra A, antes del ensayo limpieza-biocidas, caliza Pasaje a la izquierda 26/08/2008 C08 Mancha negra C, antes del ensayo limpieza-biocidas, caliza Pasaje a la izqu i erda 26/08/2008 M-LX1 Mancha negra, zona húmeda, arcilla Sala de los Toros, plano inclinado derecho 07/10/2008 M-LX3 Mancha negra, zona muy húmeda, arcilla Sala de los T oros, plano inclinado derecho 07/10/2008 A 09 Sedimento A , tras el ensayo (limpieza superficial y biocidas), caliza Pasaje a la izquierda 17/02/2009 C09 Sedimento C, tras el ensayo (limpieza profunda y biocidas), caliza Pasaje a la izqu i erda 12/02/2009 M-LX6 Mancha negra seca, con colémbolos, arcilla Sala de los T oros, a la i zquierda 20/10/2009 M-LX10 Mancha negra, abundantes colémbolos, arcilla Divertículo A xial, al fondo a la derecha, a continuación del Caballo Invertido 20/10/2009 M-LX11 Mancha negra-rosa, arcilla Pasaje, al comienzo a la derecha 20/10/2009 M-LX13 Mancha negra, aspecto de excrementos, en placa de arcilla sobre roca Pasaje, final a la izquierda 20/10/2009 M-LX14 Mancha negra-rosa, arcilla Encima del Pozo, cota derecha al fondo 20/10/2009 M-LX15 Mancha negra plana y húmeda, arcilla Encima del Pozo, cota derecha al fondo 20/10/2009 M-LX16 Mancha negra seca, arcilla Nave, cota derecha bajo el Friso de Ciervos Nadando 20/10/2009 Distribución Ochroconis lascauxensis 102 Tabla 13. Descripción de las muestras recogidas en el año 2010. Muestras Características Localización Fecha a M1 Mancha negra homogénea, presencia de colémbolos, arcilla Pasaje, al comienzo, en la banqueta derecha F, S M2 Mancha negra homogénea, arcilla Pasaje, al comienzo, en la banqueta derecha F, S M3 Mancha negra-rosa, arcilla Pasaje, a mediación, en la banqueta derecha F, S M4 Mancha negra homogénea, arcilla Pasaje- Á bside, banqueta derecha F, S M5 Mancha negra circular, con abundantes colémbolos, arcilla Á bside superior, pared izquierda F, S M6 Mancha negra con forma de anillo, que reapareció tras limpieza, arcilla Á bside superior, pared izquierda F, S M7 Mancha verde-amarillo, presencia de colémbolos, arcilla Nave, a mediación, en la banqueta derecha F, S M8 Mancha negra homogénea en zona muy húmeda, arcilla Sala de los Toros-Divertículo Axial, en la banqueta derecha F, S S3 Sedimento Sala de los Toros F, S S4 Sedimento Divertículo Axial, al comienzo F, S S5 Sedimento Divertículo Axial, al final F, S S6 Sedimento Pasaje F, S S7 Sedimento Nave F, S S8 Sedimento Cámara de los Felinos F, S S9 Sedimento Pozo F, S A 1 A ire Exterior de la cueva S A 2 A ire Sala SAS2 S A 3 A ire Sala de los Toros S A 4 A ire Divertículo Axial, al comienzo S A 5 A ire Divertículo Axial, al final S A 6 A ire Pasaje S A 7 A ire Pasaje- Á bside-Nave S A 8 A ire Cámara de los Felinos S a: F: 16 y 17 de febrero; S: 21 de septiembre. Distribución Ochroconis lascauxensis 103 Figure 26. Detalle de las manchas muestreadas en febrero y septiembre de 2010 (M1-M8). Distribución Ochroconis lascauxensis 104 Extracción de ADN de muestras ambientales La extracción de ADN de estas muestras se realizó utilizando el “FastDNA SPIN Kit for Soil” (MP Biomedicals), siguiendo las instrucciones del fabricante. Previamente, se pesó con exactitud la cantidad de partida de cada muestra de mancha o sedimento para los posteriores cálculos de cuantificación. Las muestras de aire recogidas en Triton-X se filtraron utilizando filtros de 0,22 µm de diámetro de poro (Millipore). A partir de estos filtros se realizó la extracción de ADN utilizando el kit especificado, con alguna modificación del protocolo. Tras la homogenización de los filtros en tampón fosfato sódico, utilizando un equipo Fast-Prep24, se incubaron durante 20 minutos a 65ºC y se repitió el paso de homogenización, con ello se incrementó la eficiencia del protocolo de extracción de ADN. El volumen de agua ultra pura estéril en el que se resuspendió el ADN extraído varió según el tipo de muestra, 100 µl para muestras de mancha o sedimento y 50 µl para muestras de aire. La concentración de ADN resultante se cuantificó utilizando un equipo NanoDrop 1000, siguiendo las instrucciones del fabricante. Los productos de la extracción se conservaron a -80ºC hasta su uso. Cuantificación de Ochroconis lascauxensis El análisis por PCR a tiempo real se realizó como se detalló anteriormente. Para cada una de las muestras se analizaron por duplicado el producto de la extracción de ADN y distintas diluciones de ellos. El grado de las diluciones realizadas dependió del tipo de muestra, siendo mayor en las muestras de manchas y sedimento (mayor cantidad de ADN extraído y posibles inhibidores), y menor en las muestras de aire. Las diluciones analizadas para las muestras de manchas fueron 1:10, 1:25, y otra fijando la concentración de ADN a 5 ng/µl. Para las muestras de sedimento, 1:5, 1:10, y otra fijando la concentración de ADN a 5 ng/µl. Para las muestras de aire, 1:5, y otra fijando la concentración de ADN a 5 ng/µl. Además, para las muestras de aire se añadieron reacciones en las que se Distribución Ochroconis lascauxensis 105 aumentó el volumen del extracto de ADN analizado (4 y 8 µl por reacción), incrementando la posibilidad de detectar las bajas concentraciones de esporas en este tipo de muestras. La cuantificación se realizó extrapolando los valores medios de Ct en la recta patrón y llevando a cabo los cálculos oportunos considerando la cantidad inicial de muestra procesada y la dilución correspondiente. Aquellos valores Ct que no fueron coherentes con el resto de medidas obtenidas para las distintas diluciones no se tuvieron en cuenta, ya que éstos podían deberse a la presencia de inhibidores u otros errores experimentales. Las cuantificaciones de O. lascauxensis se expresaron como cantidad de ADN del hongo presente en cada muestra (pg ADN/mg de mancha o sedimento; pg ADN/m3 aire). Además, se calcularon los porcentajes de ADN que representa dicho hongo, dividiendo el ADN de O. lascauxensis entre el ADN total de la muestra. Estos valores se consideraron una estimación de la abundancia de este hongo con respecto a la microbiota total de una muestra. Distribución Ochroconis lascauxensis 106 Resultados y discusión Puesta a punto del protocolo de detección-cuantificación de Ochroconis lascauxensis Especificidad de cebadores La especificidad de los cebadores diseñados se evaluó por PCR a tiempo real, analizando la misma cantidad de ADN (10 ng) de cada uno de los hongos seleccionados. Los resultados de estos análisis se detallan en la Tabla 14. Como se puede observar, las tres parejas de cebadores que amplifican en las regiones ITS (Olx1F/R, Olx2F/R y Olx3F/R), presentaron numerosas reacciones cruzadas con otros hongos, aunque todas ellas aparecieron mucho más tarde (Ct>26) que en O. lascauxensis (valores Ct comprendidos entre 15,4 y 18,3 según la pareja utilizada). Respecto las parejas de cebadores que amplifican en la región RPB2, 376F/493R también presentó numerosas reacciones cruzadas (Ct>25), aunque muchas de ellas se debieron a fragmentos amplificados de forma inespecífica que se distinguieron analizando su curva de disociación. La pareja 151F/391R sólo presentó reacciones cruzadas específicas con O. tshawytschae, O. humícola y Cladosporium sp. (valores Ct: 35,4; 23,4; y 35,2; respectivamente), aunque algunos otros hongos ocasionaron señales inespecíficas. Claramente, los mejores resultados se obtuvieron con los cebadores 347F/493R, que tan sólo dieron reacciones cruzadas con O. anomala, O. tshawytschae y O. constricta, y en ciclos muy tardíos (valores Ct: 35,8; 34,9 y 35,7; respectivamente); mientras que la misma cantidad de ADN (10 ng) de O. lascauxensis tuvo un Ct de 20,7. Esta gran diferencia, de aproximadamente 15 ciclos, es más que suficiente para validar el uso de estos cebadores despreciando estas reacciones cruzadas, que en ningún caso van a influir en el análisis de muestras naturales, en las condiciones experimentales descritas. Por lo tanto, se seleccionó esta pareja de cebadores para llevar a cabo los siguientes análisis. Distribución Ochroconis lascauxensis 107 Tabla 14. Evaluación de la especificidad de los cebadores, analizando ADN de hongos por PCR a tiempo real. Detección PCR tiempo-real (valores Ct) c Cepas evaluadas ab Olx1F Olx1R Olx2F Olx2R Olx3F Olx3R 376F 493R 151F 391R 347F 493R O. lascauxensis LX CH2 (10 ng) 18,3 15,4 15,5 21 20 20,7 O. lascauxensis LX CH2 (1 ng) 22,3 19,3 19,6 25,2 23,9 24,5 O. lascauxensis LX CH2 (0,1 ng) 26,9 23,8 23,8 29 27,7 28 O. anomala LX CH40 33,6, 32,6 26,5 28,3 - 35,8 O. tshawytschae CBS 100438 30,4 d - 38,1 d 30,1 d 35,4 34,9 O. anellii CBS 284.64 34,3 d 33,9 27,8 d 27,8 - - O. constricta CBS 211.53 36,7 d 36,2 d 36,1 37,5 d - 35,7 O. constricta CMF 1161 37,9 d 31 d - 25,3 - - O. humicola CBS 116655 33,2 30,8 31,7 - 23,4 O. humicola CMF 1005 36,3 d 30,9 d 36,4 25,2 - - Geosmithia namyslowski CCF 3049 34,4 31,8 33,6 36,8 d 38 d - Geosmithia putterilli CCF 3052 33,9 33,9 33,9 33,0 d 38,6 d - Isaria farinosa CI P3 37,8 31,9 32,6 28,7 d - - Tolypocladium cylindrosporum CMF 1445 31,1 28,6 26,5 d 29 d 37,9 d - Geomyces pannorum CMF 1597 36,2 d 34,4 34,1 d 38 d - - Geomyces pannorum LX TR 35 31,7 31,9 34,4 d - - Geomyces pannorum LX PR4-2 34,3 30,8 30 34,9 - - Engyodontium album CMF 1467 32,9 26,1 d 31,5 33,8 33,5 d - Cladosporium sp. LX ST 33,8 31,5 32,8 36 35,2 - Cladosporium sp. CI 16P2 34,2 29,6 33,2 31 d - - Aspergillus ustus CI J9 32,6 29,1 29,2 - 37 d - Pochonia chlamydosporia CI4D1 35,6 d 32,7 33,5 32,8 - - Doratomyces microsporus CI 33G3 - 37,1 35,2 36,4 37,3 d - Penicillium commune CI66N1 - 35,8 - 35,7 38,2 d - Fusarium solani CI T1H1 33,1 35,8 38,4 34,6 - - M ucor circinelloid e s CI0303091 - 36,6 34,7 37,2 - - Distribución Ochroconis lascauxensis 108 Tabla 14 (Continuación). a: Se analiza una cantidad de ADN idéntica (10 ng) para cada una de las cepas evaluadas. Sólo para la cepa de O. lascauxensis se analizaron también cantidades menores de ADN: 0,1 y 1 ng. b: Procedencia de cepas: LX y CI, cepas aisladas respectivamente de la cueva de Lascaux y de la cueva de Castañar de Ibor (Cáceres, España), depositadas en la colección de hongos del Laboratorio del Prof. Cesáreo Sáiz Jiménez, Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla (España); CBS, “Centraalbureau voor Schimmelcultures” (Utrecht, The Netherlands); CMF, Colección de Hongos Microscópicos del Instituto de Biología del Suelo (Ceské Budejovice, República Checa); CCF, Colección de Cultivos de Hongos del Departamento de Botánica, Universidad Carlos (Praga, República Checa) c: Los valores Ct mostrados son medias de dos reacciones independientes. d: Valores Ct que corresponden a reacciones inespecíficas distinguibles analizando la curva de disociación. Las temperaturas de disociación específicas de los fragmentos amplificados con cada pareja de cebadores fueron: 85ºC (Olx1F/R), 90ºC (Olx2F/R), 91ºC (Olx3F/R), 87ºC (376F/493R), 88ºC (151F/391R) y 87ºC (347F/493R). Recta patrón Para la posterior cuantificación en muestras ambientales, se elaboró una recta patrón con los cebadores seleccionados (347F/493R) (Figura 27). La recta patrón obtenida tuvo un buen ajuste lineal, con un coeficiente de correlación (R2) de 0,996; y una elevada eficiencia de PCR (E=92,7%). Utilizando estos cebadores se alcanzó una sensibilidad de un 1 pg de ADN (mínima cantidad detectable), y se obtuvieron reacciones positivas en las tres réplicas analizadas con esta cantidad, con un valor medio de Ct de 35,58. La cantidad de ADN de 0,1 pg tan sólo se detectó en una de las réplicas (Ct=37), este valor no se tuvo en cuenta a la hora de elaborar la recta definitiva. Por lo tanto, utilizando esta recta patrón, se pudieron cuantificar de un modo fiable las concentraciones de ADN del hongo diana comprendidas entre 10 ng y 1 pg (Ct: 20,69-35,58). Los valores Ct≥36 no se tuvieron en cuenta en los posteriores análisis, pues éstos correspondieron a cantidades de ADN no detectables bajo las condiciones experimentales establecidas. Distribución Ochroconis lascauxensis 109 Figura 27. Recta patrón elaborada utilizando la pareja de cebadores 347F/493R, siendo R2 el coeficiente de correlación, y E la eficiencia de PCR. Cuantificación de Ochroconis lascauxensis en muestras ambientales de la cueva de Lascaux Manchas negras recogidas en 2008 y 2009 Se detectó ADN de O. lascauxensis en todas las muestras de manchas recogidas en 2008 y 2009 (Fig. 28a). Los niveles encontrados en estas muestras, excepto en las muestras de sedimento de las manchas limpiadas (A09 y C09), oscilaron generalmente entre 0,1 y 10 ng/mg. Las máximas concentraciones se detectaron en la mancha M-LX6, presente en la Sala de los Toros (7,4 ng/mg; 9,8% del ADN total), y en las dos manchas que aparecían sobre las paredes de caliza del Pasaje, antes de ser limpiadas y tratadas con biocidas, A08 (6,05 ng/mg; 3,9% del ADN total) y C08 (19,6 ng/mg; 7,5% del ADN total). Tras la limpieza y tratamiento de estas dos manchas, las muestras de sedimento (A09 y C09) aún presentaron ADN del Distribución Ochroconis lascauxensis 110 hongo, aunque sus niveles se habían reducido considerablemente (54,1 y 51,4 pg/mg; 0,003 y 0,005% del ADN total; respectivamente). Manchas recogidas en 2010 Al igual que ocurrió en las muestras de años anteriores, se detectó ADN de O. lascauxensis en todas las muestras de manchas recogidas en febrero y septiembre del 2010 (Fig. 28b). Los niveles encontrados fueron aproximadamente un orden de magnitud inferior, oscilando entre 0,01 y 1 ng/mg. La máximas cantidades detectadas correspondieron a las siguientes muestras: manchas negras M5 y M6 recogidas en febrero de zonas cercanas entre sí del Ábside (2,1 y 4,2 ng/mg; 2,6 y 2,5% del ADN total; respectivamente), y de nuevo en la muestra M6 recogida en septiembre (7,9 ng/mg; 3,1% del ADN total). La menor cantidad apareció en la mancha negra M4 recogida en febrero de la zona del Pasaje que comunica con el Ábside (1 pg/mg; 0,0008% del ADN total), cantidad cercana al límite de detección. Respecto a las dos manchas con distinta coloración, M3 (negra-rosa), situada en el Pasaje cerca de las manchas negras M1 y M2, y M7 (verdeamarilla), situada en la Nave, también se detectó O. lascauxensis en ambas, con una concentración considerablemente superior en la mancha M3. Si se analiza la evolución de O. lascauxensis en las ocho manchas estudiadas, comparando los recuentos en febrero y septiembre, se pudo observar que las poblaciones permanecieron bastante estables a lo largo del año de estudio. Se produjo un incremento en seis de las ocho muestras, siendo especialmente relevante en la mancha negra M4, cuya cantidad aumentó en dos órdenes de magnitud. Por el contrario, en las manchas negras M1 y M5 disminuyó la cantidad. 117 CAPÍTULO 4 ESTUDIO DE LAS COMUNIDADES FÚNGICAS DE LAS MANCHAS DE LA CUEVA DE LASCAUX El objetivo de este capítulo fue caracterizar las comunidades fúngicas mayoritarias de las manchas de la cueva de Lascaux, centrando la atención en aquellas manchas negras que actualmente persisten en determinadas áreas de la cueva, principalmente desarrolladas sobre los sedimentos arcillosos de las paredes y bancos laterales. Para ello, se utilizaron diferentes técnicas moleculares y de aislamiento en medios de cultivo. Se analizaron muestras recogidas en distintas fechas con el objeto de conocer la evolución de estas comunidades, y se evaluó el efecto de los tratamientos biocidas. Además se identificaron las comunidades fúngicas metabólicamente activas en las manchas negras. Aquellos hongos que mostraron una asociación clara con las manchas negras fueron identificados y caracterizados. Comunidades fúngicas de manchas 118 Material y métodos Caracterización molecular de las comunidades fúngicas Muestras y análisis realizados Inicialmente, se caracterizaron por electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) una selección de hongos previamente aislados de la cueva de Lascaux, principalmente de muestras de manchas. Entre ellos, fueron analizadas todas las cepas de O. lascauxensis y O. anomala (Tabla 2), cuyos resultados se compararon con las cepas de referencia de los géneros Ochroconis y Scolecobasidium (Tabla 3), obtenidas de la colección de hongos del CBS. Se obtuvieron los perfiles DGGE correspondientes a las comunidades fúngicas de las 21 muestras de manchas analizadas en el capítulo 3; sus características y localización se detallan en las Tablas 12 y 13, y en la Figura 25. Éstas se recogieron, como se indica en el capítulo 3, de distintas áreas de la cueva durante tres años de estudio (2008-2010), permitiendo caracterizar la evolución de las comunidades fúngicas. Cuatro de las muestras recogidas en 2008 y 2009 (A08, A09, C08 y C09) procedieron del ensayo de evaluación de los protocolos de limpieza y biocidas, aplicados sobre dos manchas negras de las paredes de roca caliza del Pasaje. Para determinar las comunidades de hongos que estaban metabólicamente activas en las manchas, se seleccionaron tres muestras de manchas negras con diferente apariencia (M1, M6 y M8) y una mancha negra-rosa (M3), localizadas sobre el sustrato arcilloso de distintas salas. Todas ellas se recogieron en septiembre de 2010 (Tabla 13, Fig. 25). Se realizó un análisis comparativo ADN-ARN por DGGE, donde el ADN representa la totalidad de hongos de una muestra, estén activos o no (incluyendo las esporas), y el ARN representa sólo a los hongos metabólicamente activos. Comunidades fúngicas de manchas 119 Adicionalmente, para conocer si los hongos de las manchas se dispersan por el aire, se analizaron los perfiles DGGE de las comunidades fúngicas de las ocho muestras de aire recogidas en septiembre de 2010 (Tabla 13). Con los resultados de los análisis de DGGE, posteriormente se construyeron nueve genotecas correspondientes a algunas muestras representativas, con el objeto de profundizar en el estudio de sus comunidades fúngicas (Fig. 30). Figura 30. Muestras de manchas negras utilizadas para la construcción de genotecas. a. Muestra C08 localizada sobre la roca caliza de la pared izquierda del Pasaje, antes de los tratamientos de limpieza y biocidas. b. Muestra M1 en el banco derecho del Pasaje. c. Muestra M6 en la pared izquierda del Ábside superior, con forma circular. c. Muestra M8 en un área de percolación de agua en la Sala de los Toros, situada entre el Pasaje y el Divertículo Axial. Comunidades fúngicas de manchas 120 Para evaluar la eficacia de los tratamientos de control aplicados, se construyeron genotecas con los extractos de ADN de las muestras C08 y C09. Las principales comunidades metabólicamente activas de las manchas negras actuales se identificaron con las genotecas correspondientes a los extractos de ADN y ARN de las muestras M1, M6 y M8, recogidas en septiembre de 2010. Además, se construyó la genoteca de la muestra de aire del Pasaje (A6), con objeto de concretar que hongos se dispersan por el aire en la principal zona afectada de manchas negras. Extracción de ácidos nucleicos La extracción de ADN de las cepas fúngicas se realizó siguiendo el protocolo detallado en el capítulo 2. La extracción de ADN de las muestras de manchas y aire se realizó utilizando el “FastDNA SPIN Kit for Soil” (MP Biomedicals), como se detalló en el capítulo 3. Para aquellas muestras de manchas utilizadas en el análisis de los hongos metabólicamente activos, la extracción de los ácidos nucleicos totales se realizó siguiendo el método de Griffiths y col. (2000), con algunas modificaciones, permitiendo el análisis en paralelo del ADN y ARN. Para evitar la degradación del ARN, durante todo el proceso de extracción las muestras se mantuvieron en hielo, se utilizó una centrífuga refrigerada a 4ºC, y todo el material de plástico y las soluciones empleadas fueron previamente esterilizados en autoclave. Se partió de unos 100-150 mg de muestra recogida en un tubo Eppendorf de 1,5 ml, a los que se añadieron perlas de vidrio de 2 y 4 mm de diámetro, 500 µl de tampón de extracción CTAB [Tris 100 mM, NaCl 1,4 M, EDTA 20 mM, bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB) 2%; pH 8] y 500 µl de fenol-cloroformo- alcohol isoamílico (25:24:1) para la purificación de los ácidos nucleicos. La mezcla se homogenizó utilizando un equipo Fast-Prep 24 (MP Biomedicals), aplicando un ciclo de 30 segundos a una velocidad de 5,5 m/s. Se centrifugó a 12.500 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante obtenido se sometió a una purificación adicional con 500 µl de cloroformoalcohol isoamílico (24:1). La mezcla se agitó durante 5-10 s, se repitió la Comunidades fúngicas de manchas 121 centrifugación en idénticas condiciones y se recogió el sobrenadante. La precipitación de los ácidos nucleicos se realizó añadiendo 50 µl de acetato de sodio (3M) y 500 µl de isopropanol frío. Para estimular la precipitación se agitó suavemente, se incubó a -20ºC durante 15 minutos y se centrifugó a 12.500 rpm durante 30 minutos. El precipitado se lavó con etanol (70%) y se dejó secar a temperatura ambiente. Finalmente, el precipitado se disolvió en 80 µl de agua ultra pura estéril y se cuantificó la concentración de ADN y ARN resultante utilizando un equipo NanoDrop 1000 (Thermo Scientific), siguiendo las instrucciones del fabricante. La calidad de los ácidos nucleicos extraídos también se evaluó mediante electroforesis horizontal en geles de agarosa (1% p/v), como se detalla en el capítulo 2. Una alícuota de 50 µl del producto de la extracción se utilizó para la purificación del ARN, el resto se conservó a -80ºC hasta su utilización en el análisis del ADN. Para el aislamiento del ARN, en primer lugar se procedió a eliminar el ADN utilizando la enzima “RNase-Free DNase” (Quiagen GmbH). Para ello, se ajustó la mezcla de reacción a 200 µl: 50 µl del extracto de ácidos nucleicos, 20 µl del tampón de reacción RDD (suministrado con la enzima), 5 µl de la enzima ADNsa y 125 µl de agua ultra pura libre de ARNsa. La reacción enzimática se llevó a cabo incubando la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, se purificó el ARN empleando el “RNeasy Minielute Cleanup Kit” (Quiagen), siguiendo las instrucciones del fabricante, recuperando el ARN puro en 14 µl de agua ultra pura libre de ARNsa. La calidad del ARN obtenido se evaluó mediante electroforesis horizontal en geles de agarosa (1% p/v). Para el análisis de las comunidades fúngicas metabólicamente activas, presentes en el ARN, fue necesaria la síntesis del ADN complementario (ADNc) mediante la retro-transcripción catalizada por la enzima “SuperScript II Reverse Tanscriptase” (Invitrogen Life Technologies). Para ello, se siguió el protocolo detallado por el fabricante, utilizando el cebador ITS4 (White y col. 1990) para garantizar la síntesis del ADNc de las regiones ITS, como describieron Anderson y Parkin (2007). Comunidades fúngicas de manchas 122 Amplificación por PCR La amplificación por PCR de las regiones ITS del ADN ribosómico se llevó a cabo utilizando los cebadores ITS1 e ITS4 (White y col. 1990), siguiendo las condiciones detalladas en el capítulo 2. Para cada reacción, como ADN molde se añadió unos 10-20 ng de extracto de ADN, mientras que para el análisis del ARN, se añadió 1-2 µl de una dilución 1:10 del ADNc obtenido. Los resultados de las reacciones de PCR se comprobaron mediante electroforesis horizontal en geles de agarosa (1% p/v) y los productos amplificados se purificaron usando el kit JETquick Spin (Genomed), y conservados a -20ºC hasta su uso en los análisis DGGE y la construcción de genotecas. Para el análisis por DGGE, fue necesaria una segunda PCR sobre el producto amplificado de las regiones ITS. Los cebadores utilizados fueron el ITS1-GC (contiene una cola rica en GC de 37 bases en su extremo 5') y el ITS2 (5'-GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3') (White y col. 1990), que amplifican la región ITS1, con una longitud aproximada de unos 200 pb. La composición de la mezcla de reacción fue idéntica a la utilizada con los otros cebadores (capítulo 2), utilizando como ADN molde 1 µl del producto de PCR purificado de las regiones ITS. El protocolo de PCR utilizado fue el descrito por Michaelsen y col. (2006), compuesto por los siguientes pasos: 5 minutos de desnaturalización inicial a 94ºC; 35 ciclos compuestos por 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 58ºC, y 1 minuto a 72ºC; seguidos de 10 minutos de extensión final a 72ºC. La amplificación de cada muestra analizada se confirmó por electroforesis horizontal en geles de agarosa (1% p/v). Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) La técnica de DGGE ha sido ampliamente utilizada para caracterizar las comunidades de bacterias y hongos presentes en muestras naturales de origen diverso. Esta técnica es especialmente útil en el estudio de la Comunidades fúngicas de manchas 123 microbiota de cuevas, debido a la esperable baja diversidad de estos ambientes oligotrofos. Recientemente, Jurado y col. (2010) aplicó esta técnica al seguimiento de las comunidades responsables de un brote fúngico en la cueva de Castañar de Ibor, Cáceres, España. Esta técnica permite separar los productos de PCR que tienen tamaños parecidos o idénticos, en base a las diferencias mínimas que presentan sus secuencias, incluso se ha demostrado que esta técnica permite distinguir diferencias de tan sólo un nucleótido (Muyzer y col. 1993, Muyzer y Smalla 1998). La separación de los fragmentos está basada en la reducción de su movilidad electroforética al desnaturalizarse parcialmente la doble cadena de ADN en un gel de poliacrilamida con un gradiente químico de urea y formamida. Por ello, es necesario que los productos de PCR que se analizan incluyan una cola rica en GC en alguno de los cebadores, lo cual aporta estabilidad a la doble cadena evitando su completa desnaturalización. El resultado de la DGGE es un patrón de bandas que representa a la comunidad microbiana de la muestra analizada. En teoría, cada banda corresponde a un microorganismo diferente, aunque se ha comprobado que un mismo microorganismo puede desarrollar más de una banda. Esto puede deberse a la variabilidad genética que presenten las distintas copias de la región analizada, y a las condiciones experimentales utilizadas, ya que cuando se aumenta el tiempo del análisis se incrementa la probabilidad de encontrar más de una banda. La técnica se desarrolló como describió Muyzer y col. (1993), con algunas modificaciones. Se utilizaron geles de 20 x 16 x 0,1 cm que contenían un 8% (p/v) de acrilamida:bisacrilamida (37,5:1) (Bio-Rad) en tampón TAE 0,5X (Tris 20 mM, ácido acético glacial 10 mM, EDTA 0,5 mM), con un gradiente de agentes desnaturalizantes [urea 7M, formamida desionizada 40% (v/v)] de 25-45%, que resultó ser el rango más adecuado para caracterizar las comunidades fúngicas en estudios anteriores (Jurado y col. 2010). Para generar este gradiente, se prepararon independientemente dos soluciones de acrilamida con distintas concentraciones de agentes desnaturalizantes (25 y 45%), éstas se vertieron en el molde utilizando el Comunidades fúngicas de manchas 124 equipo “Gradient Delivery System 475” (Bio-Rad) que posibilita la creación de un gradiente homogéneo. La zona superior del gel, donde se sitúan los pocillos para cargar las muestras, se completó con una solución de acrilamida sin agentes desnaturalizantes. La polimerización de los geles se catalizó añadiendo a cada una de las soluciones, antes de ser vertida, N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina (TEMED) (0,7 µl/ml en zona con gradiente desnaturalizante, 0,5 µl/ml en la zona superior sin agente desnaturalizante) y una solución al 10% de persulfato amónico (APS) (5 µl/ml en zona con gradiente desnaturalizante, 3,5 µl/ml en la zona superior sin agente desnaturalizante). Una vez preparado el gel, se mantuvo dos horas a temperatura ambiente hasta su completa polimerización. La electroforesis se realizó en tampón TAE 0,5X utilizando el equipo de electroforesis vertical D-Code System (Bio-Rad), conectado a una fuente de alimentación Consort E-865 (Consort NV). Antes de cargar las muestras, los geles ya polimerizados se sometieron durante 20 minutos a las condiciones electroforéticas determinadas para estos experimentos (“prerun”): 60ºC de temperatura y 100 V de voltaje. Tras ello, se cargaron las muestras a analizar, que consistieron en 20 µl del producto amplificado con los cebadores ITS1-GC/ITS2 mezclados con 5 µl de tampón de carga de electroforesis (Tris-HCl 50, sacarosa 0,25 g/ml, azul de bromofenol 1 g/l, SDS 5 mg/ml). La electroforesis de las muestras se realizó durante 16 horas a las condiciones anteriormente detalladas (60ºC, 100 V), descritas por Jurado y col. (2010). Una vez terminada la electroforesis, los geles se tiñeron en una solución de bromuro de etidio (10 µg/ml) durante cinco minutos seguidos de un lavado en agua destilada durante un minuto. Los geles se observaron con un transiluminador EX-26.MX (Vilber Lourmat) que emite luz U.V. a 312 nm de longitud de onda. Las imágenes de los geles se captaron con un equipo Kodak EDAS-290 (Kodak) utilizando el programa “Kodak 1D v. 3.5.4. Imaging Scientific System” (Kodak). Comunidades fúngicas de manchas 125 De acuerdo con los resultados de DGGE obtenidos al analizar las cepas de hongos aisladas de la cueva de Lascaux, se seleccionaron algunos de éstos para ser utilizados como marcadores de migración en los posteriores análisis DGGE de las muestras naturales. El uso de estos marcadores hizo posible la comparación de los resultados obtenidos en distintas electroforesis, y la identificación aproximada de algunas de las bandas. Tras obtener los patrones DGGE de las muestras naturales, algunas de las bandas relevantes se secuenciaron con el objeto de identificar los hongos a los que pertenecían. Para ello, éstas se recortaron del gel utilizando un escalpelo estéril, se purificó su ADN utilizando el “QIAEX II Gel Extraction Kit” (Quiagen), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se reamplificó el fragmento de ADN por PCR utilizando los cebadores universales ITS1 e ITS2 (White y col. 1990), se purificó el producto de la PCR y se secuenció. La metodología seguida para cada uno de estos análisis fue idéntica a la detallada para el estudio de las regiones ITS de las cepas de Ochroconis (capítulo 2). La identificación se efectuó comparando la secuencia obtenida con las depositadas en GenBank (utilizando el algoritmo BLAST del NCBI) y con aquellas pertenecientes a las distintas cepas de hongos aisladas. En aquellas muestras en las que se construyeron genotecas, sus perfiles DGGE también se compararon con los generados por los clones representativos de las unidades taxonómicas operacionales (OTUs) mayoritarias. Con ello se pretendió identificar con mayor precisión las principales comunidades presentes en estas manchas negras. Construcción de genotecas Con el objeto de identificar las principales comunidades fúngicas de las muestras de manchas negras seleccionadas, se construyeron genotecas a partir de los productos de PCR purificados de las regiones ITS. Para la clonación se utilizó el vector pGEM T-Easy (Promega), siguiendo las Comunidades fúngicas de manchas 126 instrucciones del fabricante con algunas modificaciones. La ligación del fragmento amplificado en el interior del vector se realizó en tubos de 200 µl, en un volumen de reacción de 12 µl, compuesto por el tampón de ligación 2X (6 µl), el vector pGEM T-Easy (1 µl = 50 ng), el producto de PCR purificado (5 µl) y la enzima T4 DNA ligasa (1 µl = 3 unidades Weiss). Las reacciones se incubaron toda la noche a 4ºC. El vector con el fragmento ya ligado en su interior se utilizó para transformar las células competentes de Escherichia coli “One Shot Max Efficiency DH5α-T1” (Invitrogen Life Technologies), siguiendo las instrucciones del fabricante con algunos cambios. Las células competentes (30 µl) se pusieron en contacto con el vector ya ligado (4 µl) y la mezcla se incubó en hielo durante 30 minutos. Tras ello, se sometió a un choque térmico de 30 segundos a 42ºC y se pasó a hielo. Se añadieron 250 µl de medio de cultivo SOC (triptona 2%, extracto de levadura 0,5%, glucosa 20 mM, NaCl 10 mM, KCl 2.5 mM, MgCl2 10 mM, MgSO4 10 mM) y se incubó durante 1,5 horas en posición horizontal a 37ºC y agitación a 250 rpm. A continuación, todo el contenido del tubo se dividió en tres alícuotas (dos de 100 µl y una de 80 µl) que fueron distribuidas homogéneamente con un asa de Drigalski sobre placas de medio Luria Bertani (LB) (triptona 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l, NaCl 10 g/l, agar bacteriológico 20 g/l; pH 8) con ampicilina (Amp., 100 mg/l), isopropil tio-β-galactosidasa (IPTG, 0,5 mM) y 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido (Xgal, 80 mg/l). El IPTG es un inductor de la β-galactosidasa y el Xgal es un indicador de las células que expresan esta enzima. El Xgal se hidroliza por la β-galactosidasa produciendo galactosa y 5-bromo-4-cloro-3-hidroxindol, que se oxida a 5,5'- dibromo-4,4'-dicloro-índigo, un compuesto azul insoluble. La células competentes de E. coli inicialmente son sensibles a la ampicilina y no pueden producir la enzima β-galactosidasa. El vector plasmídico pGEM T-Easy porta, entre otros, el gen lacZα que sintetiza la enzima β-galactosidasa, y los genes de resistencia a algunos antibióticos como la ampicilina. Por ello, una vez transformadas, las células de E. coli portan el plásmido que las convierte en resistentes al antibiótico y capaces Comunidades fúngicas de manchas 133 Identificación y caracterización de hongos relevantes Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en los anteriores apartados: caracterización molecular de las comunidades fúngicas y aislamiento en medios de cultivo, se puso de manifiesto la presencia de determinados hongos que pudieran ser relevantes por su abundancia en las manchas negras. Este apartado centra la atención en ellos, tratando de concretar su identificación al nivel de especie y caracterizando distintas propiedades que pudieran ser importantes en su asociación con el fenómeno de las manchas negras. Identificación morfológica Para confirmar la identificación de las principales especies de hongos encontradas se llevó a cabo un estudio morfológico de algunas de las cepas aisladas. Macroscópicamente, se caracterizó la apariencia de las colonias desarrolladas en distintos medios de cultivo, así como, se estudiaron las características microscópicas de su micelio y estructuras de reproducción. Las cepas se cultivaron en placas de MEA y PDA, que se incubaron a 24ºC durante 3 meses y se describió la morfología de las colonias desarrolladas. Cuando éstas desarrollaron abundantes estructuras maduras de reproducción se realizaron las preparaciones microscópicas. El micelio teñido con lacto-fucsina se observó directamente con un microscopio óptico Axioskop 2 (Carl Zeiss). Las características morfológicas observadas se compararon con las descritas en la bibliografía taxonómica, concretando la identificación a nivel de especie, siempre que fue posible. Relaciones filogenéticas de “levaduras negras” Diversas especies de la familia Herpotrichiellaceae, a la que pertenecen las principales “levaduras negras”, resultaron ser los hongos más abundantes en las manchas de la cueva de Lascaux de acuerdo con la Comunidades fúngicas de manchas 134 caracterización molecular de las comunidades fúngicas. Por ello, para concretar la posición taxonómica de estos aislamientos, se establecieron las relaciones filogenéticas basadas en el análisis de las regiones ITS. Se incluyeron en el análisis las secuencias de los clones representativos de los OTUs, de las cepas aisladas, y aquellas de GenBank que pertenecen a los homólogos más cercanos, eligiendo, siempre que fue posible, las secuencias de especies tipo. El alineamiento múltiple se realizó utilizando la aplicación Muscle (Edgar 2004) incluida en el EMBL-EBI. A partir de éste, se establecieron las relaciones filogenéticas con el programa Mega 5 (Tamura y col. 2011), utilizando el algoritmo “Neighbour-Joining” (Saitou y Nei 1987), basado en la matriz de distancias del alineamiento en cuestión. El modelo de substitución empleado fue Kimura-2 parámetros (Kimura 1980). Las posiciones del alineamiento que presentaban “gaps” no se tuvieron en cuenta. Para estimar el peso relativo que tienen cada una de las ramas del árbol, se realizó un análisis “bootstrap” con 1.000 repeticiones. La topología resultante se comparó con la obtenida utilizando dos algoritmos diferentes: Máxima-Probabilidad y Máxima-Parsimonia. Tolerancia al cloruro de benzalconio Se evaluó la tolerancia al BC de las distintas cepas seleccionadas siguiendo la metodología detallada en el capítulo 2. Se sembraron por duplicado placas de MEA de 6 cm de diámetro que contenían concentraciones crecientes de BC (100, 500, 1.000, 5.000 y 10.000 mg/l) con discos de 4 mm de diámetro que contenían micelio de colonias en crecimiento activo. Las placas se incubaron en oscuridad durante un mes a 24ºC. Tras ello, se midió el crecimiento axial de las colonias y se calculó la tasa media de crecimiento expresada en milímetros por mes (mm/mes), estimando el efecto de las distintas concentraciones de BC sobre el crecimiento del hongo. Comunidades fúngicas de manchas 135 Capacidad de utilizar compuestos aromáticos como fuentes de carbono Se diseñaron distintos ensayos para evaluar las cepas seleccionadas en este capítulo, así como, las cepas holotipo de las dos especies de Ochroconis descritas en el capítulo 2 (LX A1 y LX CH40). El objetivo fue conocer la influencia de determinados compuestos aromáticos en el origen y evolución de estas especies. Se evaluaron tres compuestos aromáticos: el ácido vaníllico (AV), que es un ácido fenólico derivado de la degradación de la lignina, el ptoluensulfonato sódico (pTSS) es un detergente que posee una estructura aromática similar al cloruro de benzalconio, y el tolueno es un alquilbenceno frecuentemente utilizado para el aislamiento selectivo de hongos asociados a ambientes ricos en compuestos aromáticos. Estos ensayos se basaron en el cultivo de las distintas cepas en placas de Czapek agar (solución Czapek adicionando 15 g/l de agar) sin sacarosa como fuente de carbono, al cual se añadía el producto a ensayar como única fuente de carbono. Los compuestos AV y pTSS (Sigma-Aldrich) se incluyeron en el medio de cultivo, mientras que el aporte de tolueno (Panreac) se realizó incubando las placas de cultivo en una atmósfera enriquecida en dicho compuesto en estado gaseoso (Fig. 31). Se añadieron controles negativos (sin fuente de carbono) y positivos (Czapek agar con sacarosa). Se evaluaron tres concentraciones distintas de AV y pTSS, con un aporte de carbono equivalente a los tres controles positivos de sacarosa (0,01; 0,05 y 0,25%). Estas concentraciones se seleccionaron de acuerdo con los experimentos desarrollados por Hamada y Abe (2009a,b). En el ensayo del tolueno se utilizaron dos controles positivos con sacarosa al 0,25%, uno de ellos se sometió a la atmósfera de tolueno para evaluar el efecto de este compuesto sobre el crecimiento de los hongos. Los medios de cultivo sin fuente de carbono se esterilizaron en autoclave a 121ºC durante 20 minutos. Tras ello, cuando su temperatura disminuyó hasta unos 50ºC, se añadieron los diferentes productos a ensayar Comunidades fúngicas de manchas 136 previamente esterilizados por filtración utilizando un filtro de acetato de celulosa de 0,2 µm de diámetro de poro. A continuación se homogenizó el contenido y se vertieron en placas Petri estériles de 6 cm de diámetro. Figura 31. Ensayo diseñado para evaluar la utilización del tolueno, desarrollando una atmósfera hermética en el interior de un desecador (a), donde se cultivan los distintos hongos seleccionados (b). Para preparar el inóculo fúngico, las cepas seleccionadas se hicieron crecer sobre placas de PDA hasta desarrollar colonias con abundante micelio aéreo, siempre que fue posible. A partir de estas colonias se inocularon los distintos medios de cultivo, traspasando una cantidad mínima de biomasa (algunos conidios y/o fragmentos de hifas) desde la superficie de la colonia. Para ello, se utilizaron palillos de madera previamente esterilizados, evitando la presencia de restos de medio de cultivo en el inóculo. Con cada una de las cepas se sembraron dos placas por tratamiento. La atmósfera de tolueno se realizó como describe Zhao y col. (2010). Se utilizó un desecador donde se introdujo un vaso de precipitado con 10 ml de una solución de tolueno al 5% (v/v) en dibutilftalato, posibilitando la evaporación gradual de este compuesto en una atmósfera hermética. Se añadieron en el fondo gasas impregnadas con una solución de cloruro sódico (140 g/l) para mantener la humedad relativa del sistema (90%). Las Comunidades fúngicas de manchas 137 placas sometidas a la atmósfera de tolueno se incubaron abiertas en el interior del desecador (Fig. 31). Todos los cultivos se incubaron en oscuridad durante 40 días a 22ºC. Tras ello, se estimó el crecimiento de las colonias desarrolladas en presencia de los distintos compuestos evaluados, en relación con el crecimiento basal que tuvieron en el control negativo (sin fuente de carbono). Comunidades fúngicas de manchas 138 Resultados y discusión Caracterización molecular por DGGE Cepas de hongos Inicialmente se aplicó esta técnica a distintos aislamientos fúngicos en cultivo puro, con el objeto de conocer el patrón de migración de las distintas especies de Ochroconis y Scolecobasidium estudiadas en el capítulo 2, así como de otros hongos frecuentemente aislados de la cueva de Lascaux. El gel resultante se muestra en la Figura 32. Tras analizar por DGGE todas las cepas de Ochroconis de la cueva de Lascaux, las 28 cepas de la especie O. lascauxensis mostraron un patrón similar compuesto por tres o cuatro bandas. Se diferenciaron tres grupos que coinciden con las mínimas diferencias encontradas en las secuencias de la región ITS1 (capítulo 2). En la Figura 32 se muestran los patrones obtenidos en tres de sus representantes, LX A1, LX CH2 (un nucleótido más) y LX 101R-6 (un nucleótido menos y una diferencia de nucleótido). Estos resultados confirman la elevada sensibilidad de la técnica DGGE. Las cepas de referencia O. anellii CBS 284.64 y S. terreum CBS 536.69 desarrollaron un patrón muy parecido al de O. lascauxensis. Por el contrario, los patrones de migración de O. anomala LX CH40, O. tshawytschae CBS 100438, O. constricta CBS 211.53 y O. humicola CBS 116655 fueron diferentes. Bajo las condiciones experimentales descritas, los patrones de las especies de Ochroconis aisladas de la cueva aparecen situados en la zona media-inferior de los geles, sin solaparse con ninguna de las bandas producidas por otros hongos aislados de la cueva (Fig. 32), por lo cual, las condiciones empleadas demostraron ser válidas para caracterizar las comunidades fúngicas de las manchas negras. Comunidades fúngicas de manchas 139 Figura 32. Perfiles DGGE de hongos en cultivo puro. Cepas de O. lascauxensis (LX A1, LX CH2 y LX 101R-6) y O. anomala (LX CH40). Cepas de referencia: O. tshawytschae (CBS 100438), O. anellii (CBS 284.64), O. constricta (CBS 211.53), O. humicola (CBS 116655) y S. terreum (CBS 536.69). Otras hongos aislados de la cueva de Lascaux: Cladosporium spp. (LX 53Y-1, LX 59E-2 y LX 59E-3), Geomyces pannorum (LX 103T-3), Gliomastix murorum (LX 26), Plectosphaerellaceae sp. (LX CH41), Exophiala castellanii (LX CH60), Mortierella alpina (LX 101R-1), Penicillium sp. (LX 107X-1), Volutella citrinella (LX 107X-4) y Alternaria sp. (LX 12L-1). Comunidades fúngicas de manchas 140 En los posteriores análisis DGGE se utilizaron como marcadores varias combinaciones de estos hongos. El uso de marcadores es imprescindible al analizar muestras naturales, permitiendo comparar los resultados de distintos geles. La técnica DGGE presentó algunas limitaciones que dificultaron la interpretación de los resultados, ya que determinadas especies de hongos desarrollaron más de una banda, entre ellas O. lascauxensis (Fig. 32), y en algunos casos, una misma banda podía contener más de una especie. Por ello, la identificación de los hongos más relevantes se realizó secuenciando las bandas más frecuentes. A pesar de estos inconvenientes, la técnica resultó útil para obtener una aproximación inicial de la composición de las comunidades mayoritarias. Manchas negras recogidas en 2008 y 2009 Se llevó a cabo un primer estudio de las comunidades fúngicas de las manchas negras mediante análisis DGGE de nueve de las 13 muestras recogidas en 2008 y 2009 (Tabla 12), todas ellas desarrolladas sobre sedimentos arcillosos. Las otras cuatro muestras (A08, A09, C08 y C09) pertenecieron al ensayo deevaluación de tratamientos antifúngicos, llevada a cabo sobre dos manchas negras sobre la roca caliza de la pared izquierda del Pasaje. Los resultados del análisis DGGE de estas cuatro muestras se detallarán posteriormente, con los resultados de las genotecas. En la Figura 33 se observó que la especie O. lascauxensis no se detectó en ninguna de las nueve muestras analizadas, procedentes de diferentes salas de la cueva (Sala de los Toros, Divertículo Axial, Pasaje, Ábside, Nave y Pozo). Sin embargo, por PCR a tiempo real (Fig. 28a), se detectó ADN de este hongo en todas ellas. Esto indica que aún estando presente, O. lascauxensis no alcanzó la concentración suficiente para ser detectado por DGGE. Comunidades fúngicas de manchas 141 Figura 33. Perfiles DGGE de muestras de manchas negras recogidas en 2008 y 2009. Marcador Mix 1: E. castellanii (a), G. pannorum (b), Cladosporium sp. (c) y O. anomala (d). Marcador Mix 2: V. citrinella (e), Penicillium sp. (f) y Plectosphaerellaceae sp. (g). Cepas de O. lascauxensis (LXA1, LX CH2 y LX 101R-6). Comunidades fúngicas de manchas 142 Por el contrario, en las manchas A08 y C08, antes de limpiar y aplicar los biocidas, O. lascauxensis fue el hongo mayoritario de acuerdo con los perfiles DGGE obtenidos. Además, esta identificación se confirmó secuenciando cuatro de las bandas que componían estos patrones. Después de los tratamientos la diversidad fúngica aumentó, apareciendo una serie de bandas comunes en ambas muestras. Cuatro de ellas se identificaron como especies de los géneros Alternaria, Cladosporium, Gymnascella y Aspergillus. Además, en C09 sigue apareciendo un patrón similar a O. lascauxensis.  Estos resultados concuerdan con las cuantificaciones de O. lascauxensis por PCR a tiempo real (Fig. 28a), ya que antes de los tratamientos se registraron valores elevados y después de ellos se detectaron niveles muy inferiores. Es decir, en las muestras A09 y C09 seguía habiendo O. lascauxensis pero no se pudo detectar claramente por DGGE. En la Figura 33 se observa que las comunidades fúngicas de las manchas recogidas entre 2008 y 2009 son bastante variables entre sí, sin embargo cabe destacar algunas similitudes entre ellas. En al menos seis de las nueve manchas se observa una banda en la zona inferior del gel cuyo punto de migración coincide con un hongo identificado tentativamente como Plectosphaerellaceae sp., incluido en el marcador Mix 2 (g). Al analizar la secuencia ITS de esta cepa, las secuencias de GenBank más próximas resultaron ser: Acremonium nepalense (97%) y Plectosphaerella cucumerina (96%). Las tres muestras de la Sala de los Toros (M-LX1, M-LX3 y M-LX6) presentaron un perfil similar con un hongo desconocido claramente predominante. Las muestras del fondo del Divertículo Axial (M-LX10) y de la derecha del Pasaje (M-LX11) mostraron una clara similitud entre sí. Lo mismo ocurrió con las muestras del Pozo (M-LX14 y M-LX15) y del Ábside (M-LX13). Bibliografía 247 Centeno S, Shamir J (2008). Surface enhanced Raman scattering (SERS) and FTIR characterization of the sepia melanin pigment used in works of art. Journal of Molecular Structure 873: 149-159. Chaturvedi S, Rudd RJ, Davis A, Victor TR, Li X, Appler KA, Rajkumar SS, Chaturvedi V (2011). Rapid real-time PCR assay for culture and tissue identification of Geomyces destructans: the etiologic agent of bat geomycosis (white nose syndrome). Mycopathologia 172: 247-256. Chelius MK, Moore JC (2004). Molecular phylogenetic analysis of Archaea and Bacteria in Wind Cave, South Dakota. Geomicrobiology Journal 21: 123-134. Chemidlin Prévost-Bouré N, Christen R, Dequiedt S, Mougel C, Lelièvre M, Jolivet C, Shahbazkia HR, Guillou L, Arrouays D, Ranjard L (2011). Validation and application of a PCR primer set to quantify fungal communities in the soil environment by real-time quantitative PCR. PLoS ONE 6: (DOI: 10.1371/journal.pone.0024166). Comerio RM, Pildain MB, Romero AI (2005). Nuevos contaminantes fúngicos de productos alimenticios en Argentina. Revista Iberoamericana de Micología 22: 50-53. Cortesia C, Lopez GJ, de Waard JH, Takiff HE (2010). The use of quaternary ammonium disinfectants selects for persisters at high frequency from some species of non-tuberculous mycobacteria and may be associated with outbreaks of soft tissue infections. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 65: 2574-2581. Cox HHJ, Houtman JHM, Doddema HJ, Harder W (1993). Growth of the black yeast Exophiala jeanselmei on styrene and styrenerelated compounds. Applied Microbiology and Biotechnology 39: 372-376. Bibliografía 248 dela Cruz TEE (2006a). Marine Dendryphiella species from different geographical locations: an integrated, polyphasic approach to its taxonomy and physioecology (PhD thesis). Technischen Universität Carolo-Wilhelmina, Braunschweig. dela Cruz TEE, Schulz BE, Kubicek CP, Druzhinina IS (2006b). Carbon source utilization by the marine Dendryphiella species D. arenaria and D. salina. FEMS Microbiology Ecology: 58: 343-353. Cunningham KI, Northup DE, Pollastro RM, Wright WG, LaRock EJ (1995). Bacteria, fungi and biokarst in Lechuguilla Cave, Carlsbad Caverns National Park, New Mexico. Environmental Geology 25: 2-8. Daxboeck F, Stadler M, Assadian O, Marko E, Hirschl AM, Koller W (2005). Characterization of clinically isolated Ralstonia mannitolilytica strains using random amplification of polymorphic DNA (RAPD) typing and antimicrobial sensitivity, and comparison of the classification efficacy of phenotypic and genotypic assays. Journal of Medical Microbiology 54: 55-61. Doty MS, Slater DW (1946). A new species of Heterosporium pathogenic on young chinook salmon. The American Midland Naturalist Journal 36: 663-665. Di Piazza M (2007). The crisis in Lascaux: update March 2007. Rock Art Research 24: 136-137. Docampo S, Trigo MM, Recio M, Melgar M, García-Sánchez J, Cabezudo B (2011). Fungal spore content of the atmosphere of the Cave of Nerja (southern Spain): diversity and origin. Science of the Total Environment 409: 835-843. Bibliografía 249 Domsch KH, Gams W, Anderson T-H (2007). Compendium of soil fungi. Vol 1, 2nd ed. Academic Press, London. Dupont J, Jacquet C, Dennetiere B, Lacoste S, Bousta, F, Orial G, Cruaud C, Couloux A, Roquebert M.-F (2007). Invasion of the french paleolithic painted cave of Lascaux by members of the Fusarium solani species complex. Mycologia 99: 526-533. Edgar RC (2004). MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Research 32: 1792-1797. Ertl A, Pertlik F, Prem M, Pos, JE, Kim SJ, Brandstätter F, Alfschuster R (2005). Ranciéite crystals from Friesach, Carinthia, Austria. European Journal of Mineralogy 17: 163-172. Felsenstein J (1993). PHYLIP (Phylogeny Inference Package), version 3.5c; Department of Genetics, University of Washington, Seattle. Feng XH, Zhu M, Ginder-Vogel M, Ni C, Parikh SJ, Sparks DL (2010). Formation of nano-crystalline todorokite from biogenic Mn oxides. Geochimica et Cosmochimica Acta 74: 3232-3245. Fernandez-Cortes A, Cuezva S, Sanchez-Moral S, Cañaveras JC, Porca E, Jurado V, Martin-Sanchez PM, Saiz-Jimenez C (2011). Detection of human-induced environmental disturbances in a show cave. Environmental Science Pollution Research 18: 1037-1045. Fox JL (2008). Some say Lascaux Cave paintings are in microbial ‘‘crisis’’ mode. Microbe 3: 110-112. Bibliografía 250 Frierdich AJ, Hasenmueller EA, Catalano JG (2011). Composition and structure of nanocrystalline Fe and Mn oxide cave deposits: Implications for trace element mobility in karst systems. Chemical Geology 284: 82-96. Gams W (1975). Cephalosporium-like Hyphomycetes: Some tropical species. Transactions of the British Mycological Society 64: 389-404. García-Martos P, Márquez A, Gené J (2002). Infecciones humanas por levaduras negras del género Exophiala. Revista Iberoamericana de Micología 19: 72-79. Ge YP, Lv GX, Shen YN, Li M, Deng SW, de Hoog GS, Samerpitak K, Liu WD (2012). First report of subcutaneous phaeohyphomycosis caused by Ochroconis tshawytschae in an immunocompetent patient. Medical Mycology. (DOI: 10.3109/13693786.2011.653834) Geneste J-M (2006). De la découverte à la première crise bioclimatique de 1963. Monumental 2: 62-67. Geneste J-M (2008). Lascaux. Conservation d’une grotte ornée. Les Dossiers d’Archéologie 15: 68-79. Geneste J-M (2011). The major phases in the conservation of Lascaux Cave. In: Coye N (ed). Lascaux and Preservation Issues in Subterranean Environments. Proceedings of the International Symposium (Paris 26 and 27 february 2009). Documents d'archéologie française 105: 51-71. Éditions de la Maison des sciences de l’home, Paris, France. van Ginkel G, van Dijk JB, Kroon AG (1992). Metabolism of hexadecyltrimethylammonium chloride in Pseudomonas strain B1. Applied and Environmental Microbiology 17: 1145-1151. Bibliografía 251 Glory A, Delluc B, Delluc G (2008). Les recherches à Lascaux (1952–1963). Gallia Préhistoire XXXIX: 201. Godoy G, Rodríguez-Kábana R, Morgan-Jones G (1982). Parasitism of eggs of Heterodera glycines and Meloidogyne arenaria by fungi isolated from cysts of H. glycines. Nematropica 12: 111-119. Gorbushina AA, Lyalikova NN, Vlasov DY, Khizhnyak TV (2002). Microbial communities on the monuments of moscow and St. Petersburg: Biodiversity and trophic relations. Microbiology 71: 350-356 (Translated from Mikrobiologiya 71: 409–417). Graff J (2006). Saving beauty. Time, 15 May 2006, 36–42. Grandi RAP, Gusmão LFP (2002). Decomposing Hyphomycetes on leaf litter of Tibouchina pulchra Cogn. Revista Brasileira de Botânica 25: 79- 87. Graniti A (1963). Scolecobasidium anellii n. sp., agente di annerimenti superficiali di stalattiti. Bollettino della Società Botanica Italiana 69: 360- 365. Griffiths RI, Whiteley AS, O’Donnell AG, Bailey MJ (2000). Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition. Applied and Environmental Microbioloy 66: 5488-5491. Hall TA (1999). BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series 41: 95-98. Bibliografía 252 Hamada N (2005a). Characteristics of fungi growing inside washing machines. Journal of Urban Living Health Association 49: 108-113. Hamada N (2005b). Growth on various detergent components of fungi found in washing machines. Journal of Urban Living Health Association 49: 161-167. Hamada N, Abe N (2008). Characteristics of recent fungal contamination in bathrooms. Journal of Urban Living Health Association 52: 98-106. Hamada N, Abe N (2009a). Fungal growth on anion surfactant medium. Biocontrol Science 14: 177-180. Hamada N, Abe N (2009b). Physiological characteristics of 13 common fungal species in bathrooms. Mycoscience 50: 421-429. Hamayun M, Khan SA, Kim HY, Chaudhary MF, Hwang YH, Shin DH, Kim IK, Lee BH, Lee IJ (2009). Gibberellin production and plant growth enhancement by newly isolated strain of Scolecobasidium tshawytschae. Journal of Microbiology and Biotechnology 19: 560-565. Hasegawa M, Kishino H, Yano T (1985). Dating the human-ape split by a molecular clock of mitochondrial DNA. Journal of Molecular Evolution 22: 160-174. Haugland RA, Varma M, Wymer LJ, Vesper SJ (2004). Quantitative PCR analysis of selected Aspergillus, Penicillium and Paecilomyces species. Systematic and Applied Microbiology 27: 198-210. Bibliografía 253 Hegstad K, Langsrud S, Lunestad BT, Scheie AA, Sunde M, Yazdankhah SP (2010). Does the wide use of quaternary ammonium compounds enhance the selection and spread of antimicrobial resistance and thus threaten our health? Microbial Drug Resistance 16: 91-104. de Hoog GS, von Arx, JA (1973). Revision of Scolecobasidium and Pleurophragmium. Kavaka 1: 55-60. de Hoog GS, Hermanides-Nijhof EJ (1977). The black yeasts and allied Hyphomycetes. Studies in Mycology 15: 1-222. de Hoog GS, Guarro J, Gené J, Figueras MJ (2000). Atlas of clinical fungi. CBS/Universitat Rovira i Virgili, Utrecht & Reus. Horré R, de Hoog GS (1999). Primary cerebral infections by melanised fungi: a review. Studies in Mycology 43: 176-193. Horré R, de Hoog GS, Kluczny C, Marklein G, Schaal KP (1999). rDNA diversity and physiology of Ochroconis and Scolecobasidium species reported from humans and other vertebrates. Studies in Mycology 43: 194-205 Iwatsu T, Nishimura K, Miyaji M (1984). Exophiala castellanii sp. nov. Mycotaxon 20: 307-314. Iwatsu T, Udagawa S, Takase T (1991). A new species of Exophiala recovered from drinking water. Mycotaxon 41: 321-328. Jurado V, Sanchez-Moral S, Saiz-Jimenez C (2008). Entomogenous fungi and the conservation of the cultural heritage. A review. International Biodeterioration and Biodegradation 62: 325-330. Bibliografía 254 Jurado V, Fernandez-Cortes A, Cuezva S, Laiz L, Cañaveras JC, Sanchez- Moral S, Saiz-Jimenez C (2009). The fungal colonisation of rock-art caves: experimental evidence. Naturwissenschaften 96: 1027-1034. Jurado V, Porca E, Cuezva S, Fernandez-Cortes A, Sanchez-Moral S, Saiz- Jimenez C (2010). Fungal outbreak in a show cave. Science of the Total Environment 408: 3632-3638. Kaarakainen P, Rintala H, Vepsäläinen A, Hyvärinen A, Nevalainen A, Meklin T (2009). Microbial content of house dust samples determined with qPCR. Science of the Total Environment 407: 4673-4680. Kawaguchi T, Decho AW (2002). In situ analysis of carboxyl (-COOH) and sulfhydral (-SH) groups of extracellular polymeric secretions (EPS) by confocal scanning laser microscopy. Analytical Biochemistry 304: 266- 267. Kimura M. (1980). A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. Journal of Molecular Evolution 16: 111-120. Kirilenko TS, Al-Akhmed MA (1977). Ochroconis tshawytschae (Doty et Slater) comb. nov. Mikrobiologicheskyi Zhurnal 39: 303-306. Kiyuna T, An KD, Kigawa R, Sano C, Miura S, Sugiyama J (2010). Molecular assessment of fungi in ‘‘black spots’’ that deface murals in the Takamatsuzuka and Kitora tumuli in Japan: Acremonium sect. Gliomastix including Acremonium tumulicola sp. nov. and Acremonium felinum comb. nov. Mycoscience 52: 1-17. Bibliografía 255 Koilraj AJ, Marimuthu G, Natarajan K, Saravanan S, Maran P, Hsu MJ (1999). Fungal diversity inside caves of Southern India. Current Science 77: 1081-1084. Kroon AG, Pomper MA, van Ginkel G (1994). Metabolism of dodecyldimethylamine of Pseudomonas MA3. Applied Microbiology and Biotechnology 42: 134-139. Krumbein WE, Urzì C (1991). Biologically induced decay phenomena of antique marbles – some general considerations. In: Decrouez D, Chamay J, Zezza F (eds.). Proceedings of the 2nd International Symposium on the conservation of monuments in the Mediterranean Basin, Geneve (Switzerland): 219-235. Ville de Geneve-Museum d'Histoire Naturelle & Musee D'Art et d'Histoire. Lane DJ (1991). 16S/23S rRNA sequencing. In: Stackenbrandt E, Goodfellow M (eds.) Nucleic acid techniques in bacterial systematic: 115-175. John Wiley & Sons Ltd. Chichester, UK. Langsrud S, Sundheim G (1997). Factors contributing to the survival of poultry associated Pseudomonas spp. exposed to a quaternary ammonium compound. Journal of Applied Microbiology 82: 705-712. Langsrud S, Sundheim G, Borgmann-Strahsen R (2003). Intrinsic and acquired resistance to quaternary ammonium compounds in foodrelated Pseudomonas spp. Journal of Applied Microbiology 95: 874-882. Lastennet R, Lopez B, Denis A, Mertz J-D (2011). Hydrogeology, infiltration water characteristics and support properties at Lascaux. In: Coye N (ed). Lascaux and Preservation Issues in Subterranean Environments. Proceedings of the International Symposium (Paris 26 and 27 february 2009). Documents d'archéologie française 105: 95-120. Éditions de la Maison des sciences de l’home, Paris, France. Bibliografía 256 Lefévre M (1974). La maladie verte de Lascaux. Studies in Conservation 19: 126-156. Lichfield J (2008). Six months to save Lascaux. The Independent, 12 July 2008. Liu YJ, Whelen S, Hall BD (1999). Phylogenetic relationships among ascomycetes: Evidence from an RNA polymerse II subunit. Molecular Biology and Evolution 16:1799-1808. Liu HM, Zhang TY (2004). A preliminary report of soil dematiaceous hyphomycetes from the Yellow River delta I. Mycosistema 23: 338-344. Lugauskas A, Krikstaponis A, Seskauskas V (2003). Species of conditionally pathogenic micromycetes in the air of dwellings and occupational premises. Indoor and Built Environment 12: 167-177. Malaurent P, Lacanette D, Brunet J, Riss J (2011). Climatology of the subterranean environment at Lascaux: from a global study to the microclimatology of the cave walls. In: Coye N (ed). Lascaux and Preservation Issues in Subterranean Environments. Proceedings of the International Symposium (Paris 26 and 27 february 2009). Documents d'archéologie française 105: 121-142. Éditions de la Maison des sciences de l’home, Paris, France. Maraun M, Martens H, Migge S, Theenhaus A, Scheu S (2003). Adding to ‘the enigma of soil animal diversity’: fungal feeders and saprophagous soil invertebrates prefer similar food substrates. European Journal of Soil Biology 39: 85-95. Bibliografía 263 Sire M-A (2008). Lascaux. À la recherche d’une nouvelle stratégie de conservation préventive. Les Dossiers d’Archéologie 15: 54-63. Smith CJ, Osborn AM (2009). Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiology Ecology 67: 6-20. Snaidr J, Amann R, Huber I, Ludwig W, Schleifer K-H (1997). Phylogenetic analysis and in situ identification of bacteria in activated sludge. Applied and Environmental Microbiology 63: 2884-2896. Spilde MN, Northup DE, Boston PJ, Schelble RT, Dano KE, Crossey LJ, Dahm CN (2005). Geomicrobiology of cave ferromanganese deposits: a field and laboratory investigation. Geomicrobiology Journal 22: 99-116. Stelzmueller I, Biebl M, Wiesmayr S, Eller M, Hoeller E, Fille M, Weiss G, Lass-Floerl C, Bonatti H (2006). Ralstonia pickettii –innocent bystander or a potential threat? Clinical Microbiology and Infection 12: 99-101. Takano K, Itoh Y, Ogino T, Kurosawa K, Sasaki K (2006). Phylogenetic analysis of manganese-oxidizing fungi isolated from manganese-rich aquatic environments in Hokkaido, Japan. Limnology 7: 219-223. Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S (2011). MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology and Evolution 28: 2731-2739. Tebo BM, Bargar JR, Clement BG, Dick GJ, Murray KJ, Parker D, Verity R, Webb SM (2004) Biogenic manganese oxides: Properties and mechanisms of formation. Annual Review of Earth and Planetary Sciences. 32: 287-328. Bibliografía 264 Tebo BM, Johnson HA, McCarthy JK, Templeton AS (2005). Geomicrobiology of manganese (II) oxidation. Trends in Microbiology 13: 421-428. Tezel U, Pavlostathis SG (2009). Transformation of benzalkonium chloride under nitrate reducing conditions. Environmental Science and Technology 43: 1342-1348. Timonin MI, Illman WI, Hartgerink T (1972). Oxidation of manganous salts of manganese by soil fungi. Canadian Journal of Microbiology 18: 793-799. Trifonova Z, Karadjova J (2003). Fungal parasitism of the cysts and eggs of the Globodera rostochiensis. Journal of Agricultural Sciences 48: 103-110. Upadhyay HP (1966). Soil fungi from North-East Brazil V. Two fungi parasitic on nematodes. Instituto de Micologia, Universidade do Recife, No. 493. Urzì C (2004). Microbial deterioration of rocks and marble monuments in Mediterranean Basin: A review. Corrosion Reviews 22: 441-457. Vaneechoutte M, De Baere T, Wauters G, Steyaert S, Claeys G, Vogelaers D, Verschraegen G (2001). One case each of recurrent meningitis and hemoperitoneum infection with Ralstonia mannitolilytica. Journal of Clinical Microbiology 39: 4588-4590. VanSteenhouse JL, Padhye AA, Ajello L (1988). Subcutaneous phaeohyphomycosis caused by Scolecobasidium humicola in a cat. Mycopathologia 102: 123-127. Bibliografía 265 Vaughan MJ, Maier RM, Pryor BM (2011). Fungal communities on speleothem surfaces in Kartchner Caverns, Arizona, USA. International Journal of Speleology 40: 65-77. Wang W, Maa X, Maa Y, Maoa L, Wu F, Maa X, An L, Feng H (2010). Seasonal dynamics of airborne fungi in different caves of the Mogao Grottoes, Dunhuang, China. International Biodeterioration and Biodegradation 64: 461-466. Weitzman I, Rosenthal, SA, Shupack JL (1985). A comparison between Dactylaria gallopava and Scolecobasidium humicola: first report of an infection in a tortoise caused by S. humicola. Sabouraudia 23: 287-293. White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J (1990). Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ (eds.). PCR Protocols: a guide to methods and applications: 315–322. Academic Press, USA. Wollenzien U, de Hoog GS, Krumbein WE, Urzì C (1995). On the isolation of microcolonial fungi occurring on and in marble and other calcareous rocks. The Science of the Total Environment 167: 287-294. Wu ZM, Zhang, TZ (2008). Soil dematiaceous hyphomycetes from Dahingganling Mountain Range, Inner Mongolia, China I. Mycosystema 27: 5-15. Young ME, Alakomi HL, Fortune I, Gorbushina AA, Krumbein WE, Maxwell I, McCullagh C, Robertson P, Saarela M, Valero J, Vendrell M (2008). Development of a biocidal treatment regime to inhibit biological growths on cultural heritage: BIODAM. Environmental Geology 56: 631-641. Bibliografía 266 Zabielska-Matejuk J, Czaczyk K (2006). Biodegradation of new quaternary ammonium compounds in treated wood by mould fungi. Wood Science and Technology 40: 461-475. Zeng JS, Sutton DA, Fothergill AW, Rinaldi MG, Harrak MJ, de Hoog GS (2007). Spectrum of clinically relevant Exophiala species in the United States. Journal of Clinical Microbiology 45: 3713–3720. Zhang N, O’Donnell K, Sutton DA, Ameena Nalim F, Summerbell RC, Padhye AA, Geiser DM (2006). Members of the Fusarium solani species complex that cause infections in both humans and plants are common in the environment. Journal of Clinical Microbiology 44: 2186-2190. Zhao J, Zeng J, de Hoog GS, Attili-Angelis D, Prenafeta-Boldú FX (2010). Isolation and identification of black yeasts by enrichment on atmospheres of monoaromatic hydrocarbons. Microbial Ecology 60: 149-156.