Filtros óticos baseados em filmes finos para implementação num sistema de espectroscopia para o diagnóstico de malária

Filtros óticos baseados em filmes finos para implementação num sistema de espectroscopia para o diagnóstico de malária Mariana Silva dos Santos Costa Janeiro 2021 Janeiro 2021 Filtros óticos baseados em filmes finos para implementação num sistema de espectroscopia para o diagnóstico de malária Mariana Silva dos Santos Costa Dissertação de Mestrado Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica Dissertação orientada por Doutora Susana Oliveira Catarino Doutora Maria Isabel Veiga Janeiro 2021 Mariana Silva dos Santos Costa Filtros óticos baseados em filmes finos para implementação num sistema de espectroscopia para o diagnóstico de malária ii DIREITOS DE AUTOR E CONDIÇÕES DE UTILIZAÇÃO DO TRABALHO POR TERCEIROS Nome: Mariana Silva dos Santos Costa Título da dissertação: Filtros óticos baseados em filmes finos para implementação num sistema de espectroscopia para o diagnóstico de malária Orientadores: Doutora Susana Catarino e Doutora Maria Isabel Veiga Ano de conclusão: 2021 Designação do mestrado: Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica Ramo de mestrado: Eletrónica Médica Este é um trabalho académico que pode ser utilizado por terceiros desde que respeitadas as regras e boas práticas internacionalmente aceites, no que concerne aos direitos de autor e direitos conexos. Assim, o presente trabalho pode ser utilizado nos termos previstos na licença abaixo indicada. Caso o utilizador necessite de permissão para poder fazer um uso do trabalho em condições não previstas no licenciamento indicado, deverá contactar o autor, através do RepositóriUM da Universidade do Minho. Licença concedida aos utilizadores deste trabalho Atribuição CC BY https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ iii AGRADECIMENTOS Em primeiro lugar, queria fazer um agradecimento especial à minha orientadora, Doutora Susana Catarino, por ter proporcionado a minha participação neste projeto e por todo o apoio, incentivo e disponibilidade para me auxiliar tanto a nível prático como teórico. Além disso, gostaria de enaltecer os conselhos e as aprendizagens transmitidas, que foram essenciais ao longo de todas as etapas, tendo elevado as minhas competências. Mais uma vez, muito obrigada pela excelente orientação e solicitude. Queria agradecer, à Doutora Isabel Veiga por toda a cooperação, partilha das amostras utilizadas no desenvolver da atividade prática e contributo na revisão da dissertação. Agradeço à Professora Doutora Graça Minas a ajuda e o acompanhamento facultados no desenvolvimento de todo o trabalho, que se revelaram fundamentais para a elaboração desta dissertação e para o enriquecimento da minha aprendizagem. Grata também aos meus colegas do grupo de investigação, em especial à Vitória Baptista e ao Duarte Lima, por toda a disponibilidade, partilha e ótimo trabalho colaborativo. Agracio ainda todos os meus amigos, que me acompanham desde sempre e os que fui conhecendo ao longo da minha vida académica, pois com a vossa amizade todo este percurso foi mais fácil e feliz. Nunca esquecerei os bons momentos vividos. Finalmente, à minha família, muito obrigada pela vossa presença e motivação. Em especial aos meus pais, expresso a minha mais sincera gratidão por todo o amor, conselhos e apoio incondicional nas minhas decisões. A eles devo todo o sucesso alcançado ao longo da vida e a conclusão de mais uma etapa. O trabalho desenvolvido foi apoiado pelo projeto MalariaChip, NORTE-01-0145-FEDER028178, financiado pelo Programa Operacional Regional do Norte (NORTE 2020), sob o Acordo de Parceria PORTUGAL 2020, através do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) e pela Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), IP. Assim, gostaria de agradecer pelo apoio financeiro concedido pela bolsa ao abrigo do referido projeto. iv DECLARAÇÃO DE INTEGRIDADE Declaro ter atuado com integridade na elaboração do presente trabalho académico e confirmo que não recorri à prática de plágio nem a qualquer forma de utilização indevida ou falsificação de informações ou resultados em nenhuma das etapas conducente à sua elaboração. Mais declaro que conheço e que respeitei o Código de Conduta Ética da Universidade do Minho. Universidade do Minho, janeiro 2021 Assinatura: ____________________________________________________________ Assinado por : Mariana Silva dos Santos Costa Num. de Identificação: BI14464221 Data: 2021.02.05 15:09:55+00'00' v RESUMO A malária é uma doença infeciosa com elevada prevalência em regiões com condições de saúde debilitadas. Atualmente, o diagnóstico de malária baseia-se principalmente na microscopia e nos testes de diagnóstico rápidos, sendo limitados pela parasitémia que permitem detetar e pela necessidade de amostras de sangue dos pacientes. Assim, é urgente desenvolver novos métodos de diagnóstico precisos, independentes do utilizador, portáteis e de baixo custo, sem requererem amostras de sangue. A presente dissertação integra um projeto de investigação que pretende desenvolver um método inovador e não invasivo de diagnóstico, baseado em espectrofotometria de reflectância ótica, para a quantificação de parasitas da malária, através da identificação de hemozoína, sem necessidade de amostras sanguíneas. O dispositivo integrará um conjunto de filtros óticos, com elevada transmitância e baixa largura a meia altura (FWHM, do inglês low full width at half maximum), para a reconstrução completa dos espectros de reflectância, de modo a distinguir entre glóbulos vermelhos saudáveis e infetados com o parasita da malária. Neste trabalho propõe-se o desenho, simulação e otimização de 16 filtros óticos passa-banda de largura de banda estreita e altamente seletivos, baseados em multicamadas de filmes finos de SiO2/TiO2, para a gama espectral entre 400 nm e 800 nm. As propriedades óticas dos materiais constituintes dos filmes finos, em particular os índices de refração, constituíram o foco deste estudo, pelo que três índices de refração diferentes foram considerados. Os resultados mostram que os filtros simulados são sensíveis a estas propriedades. Cada filtro, para um único comprimento de onda, apresenta uma FWHM <25 nm e um pico de transmitância >90%. A reconstrução dos espectros de reflectância originais foi verificada experimentalmente, a partir de um conjunto de 8 filtros óticos baseados em filmes finos, na mesma gama espectral, tendo sido possível distinguir entre diferentes parasitémias, até um limite de deteção de 12,5 parasitas/μL de glóbulos vermelhos. Os resultados obtidos exibem o potencial destes filtros óticos para integração no dispositivo ótico proposto, contribuindo para uma tecnologia disruptiva e inovadora de diagnóstico não invasivo de malária. Palavras-chave: Filtros óticos, índice de refração, malária, reflectância, TFCalc. vi ABSTRACT Malaria is an infectious disease, highly prevalent in world regions with lacking healthcare conditions. Nowadays, malaria diagnostic is mainly based on microscopy and rapid diagnostic tests by immunochromatographic assays, being limited by the parasitaemia that they can detect and by the need for patients’ blood samples. Thus, it is urgent to develop new accurate, user-independent, portable and low-cost diagnosis methods, without the need for blood samples. This dissertation is part of a research project that aims to develop an innovative and non-invasive diagnostics method, based on optical reflectance spectrophotometry, for the quantification of malaria parasites, through the identification of hemozoin, without the need for blood samples. The device will comprise a set of optical filters, with high transmittance and low full width at half maximum (FWHM), for the complete reconstruction of the reflectance spectra, in order to distinguish between healthy and malaria-infected red blood cells. In this work, it is proposed the design, simulation and optimization of 16 narrowband and highly selective optical bandpass filters, based on multilayer SiO2 / TiO2 thin films, for the spectral range between 400 nm and 800 nm. The optical properties of the thin films’ materials, in particular the refractive indices, were the focus of this study, so three different refractive indices were considered. The results show that the simulated filters are highly sensitive to these properties. Each filter, for a single wavelength, shows a FWHM <25 nm and a transmittance peak >90%. The reconstruction of the original reflectance spectra was experimentally verified, using a set of 8 thin-film optical filters, in the same spectral range of the simulated ones, and it was possible to distinguish between different parasitaemia, up to a detection limit of 12.5 parasites/μl of red blood cells. The obtained results enhance the potential of these optical filters for integration in the proposed optical device, supporting this disruptive and innovative technology for non-invasive malaria diagnosis. Keywords: Malaria, optical filters, reflectance, refractive index, TFCalc. vii ÍNDICE 1 Introdução ............................................................................................................................. 1 Enquadramento............................................................................................................. 2 Motivação ...................................................................................................................... 4 Objetivo ......................................................................................................................... 7 Estrutura da Dissertação ............................................................................................... 8 2 Estado de Arte ..................................................................................................................... 10 Métodos de diagnóstico de malária ............................................................................ 11 Diagnóstico clínico ............................................................................................... 12 Microscopia ......................................................................................................... 12 Testes de diagnóstico rápidos (TDR) ................................................................... 14 Diagnóstico molecular ......................................................................................... 15 Outras abordagens inovadoras ........................................................................... 17 Deteção de malária por espectroscopia ótica ............................................................. 18 Revisão de literatura de métodos de espectroscopia ótica para a deteção de hemozoína ........................................................................................................................... 18 Reflectância ótica na quantificação de hemozoína ............................................. 20 Filtros óticos ................................................................................................................ 23 Tipos de filtros óticos .......................................................................................... 23 Aplicações de filtros óticos .................................................................................. 24 3 Teoria dos Filtros ................................................................................................................. 27 Filtros óticos baseados em filmes finos ...................................................................... 28 Conceitos básicos da propagação da luz num meio ............................................ 30 Reflectância numa estrutura simples de um filme fino ...................................... 34 Reflectância numa estrutura multicamada de filmes finos ................................ 37 Exemplo de filtros óticos com multicamadas de filmes finos dielétricos ................... 39 Matriz característica para uma espessura ótica de um quarto ou metade do comprimento de onda ......................................................................................................... 40 Desenho de um filtro ótico baseado em multicamada com espessura ótica de um quarto ou metade do comprimento de onda ............................................................... 41 Caraterísticas estruturais de um filtro ótico baseado em multicamada de filmes finos………………………………………………………………………………………………………………………………..42 4 Metodologia ........................................................................................................................ 47 Desenho dos filtros óticos baseados em filmes finos ................................................. 48 Projeto dos filtros óticos ..................................................................................... 48 Simulação de filtros óticos de filmes finos .................................................................. 50 xiv QT-NASBA Sequências de ácidos nucleicos quantitativos RCP Reação em cadeia da polimerase RNA Ácido ribonucleico rRNA Ácido ribonucleico ribossómico SEM Microscópio eletrónico de varrimento (do inglês Scanning Electron Microscope) SIDA Síndrome de Imunodeficiência Adquirida SiO2 Dióxido de silício SMD Dispositivo de tecnologia de montagem superficial (do inglês surface-mount device) TDR Testes de diagnóstico rápidos TiO2 Dióxido de titânio UV Ultravioleta VIS Visível xv LISTA DE SÍMBOLOS Símbolo Descrição Unidade A Absorvência ótica - 𝐵 󰇍 Vetor de indução magnética T B Campo elétrico normalizado V.m-1 C Campo magnético normalizado A.m-1 c Velocidade da luz no vazio m.s-1 𝐷 󰇍 󰇍 Vetor de deslocamento elétrico C.m-2 d Espessura do filme m dr Espessura da cavidade de ressonância m ds Espessura da camada m 𝐸 󰇍 Vetor do campo elétrico V.m-1 f Frequência da onda eletromagnética Hz H Elevado índice de refração - 𝐻 󰇍 󰇍 Vetor do campo magnético A.m-1 𝐽 Vetor de densidade de corrente elétrica A.m-2 𝑘 󰇍 Vetor de onda rad m-1 L Baixo índice de refração - n/ ns/ nm/ nr/ n0/ n1/ n2 Índice de refração - OPL Comprimento do caminho ótico m Q Qualquer número inteiro de camadas - q Ordem de interferência do filtro ótico - R Reflectância ótica - Re Componente real - R1/ R2/ R3/ R4 Feixe de luz refletido - r Número da fronteira - 𝑟 vetor de posição m T Transmitância ótica - T1/ T2/ T3/ T4 Feixe de luz transmitido - u Densidade de energia eletromagnética W·m−2 xvi v Velocidade de propagação da luz num meio m.s-1 Y Admitância ótica S δ Desvio de fase do filme fino rad ɛ Permissividade elétrica do meio F.m-1 ɛ0 Permissividade elétrica F.m-1 θ/𝜃0 Ângulo de incidência graus 𝜃𝑟 Ângulo reflexão graus λ Comprimento de onda m µ Permeabilidade magnética do meio H.m-1 µ0 Permeabilidade magnética H.m-1 𝜌𝑟 Amplitude do coeficiente de reflexão - ρ Densidade de carga elétrica C.m-3 σ Condutividade elétrica S. m-3 𝜙 Fase de onda rad 𝜔 Frequência angular rad 1 INTRODUÇÃO FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 2 A introdução contém o enquadramento, a motivação, os objetivos desta dissertação e um resumo da sua organização estrutural. No enquadramento, será abordado o tema geral desta investigação, na motivação justifica-se a sua relevância e originalidade e, na secção de objetivos, serão detalhadas as metas esperadas com a realização do presente trabalho. ENQUADRAMENTO A malária é uma doença infeciosa com um impacto mundial severo1. Atualmente, a doença da malária é um grave problema de saúde pública em cerca de 91 países2, sendo que constitui a principal causa de morte nas regiões endémicas da África Subsaariana, do Pacífico Ocidental, da América do Sul e Central, do Sudeste Asiático e do Mediterrâneo Oriental3. Além disso, as infeções da malária nas áreas não endémicas, importadas por viajantes oriundos das regiões endémicas, têm aumentado significativamente1,4. Segundo o último relatório emitido pela Organização Mundial de Saúde (OMS), no ano de 2020, aproximadamente 229 milhões de pessoas ficaram infetadas com malária e, desta doença, resultaram 409 mil mortes5. As regiões endémicas constituem um desafio no combate à doença, uma vez que carecem de infraestruturas, atendimento médico apropriado e de condições de vida condignas, o que agrava a probabilidade de infeção por malária junto da população6. Aproximadamente metade da população mundial corre o risco de ficar infetada com a doença da malária4. No entanto, existem grupos populacionais mais vulneráveis, isto é, que apresentam maior risco de contrair a doença: bebés, crianças até aos 5 anos, mulheres grávidas, pacientes com o Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) ou com o Síndrome de Imunodeficiência Adquirida (SIDA), viajantes não imunes, populações nómadas e migrantes5,7. De acordo com a OMS, os sintomas de malária, normalmente, têm início entre 7 e 15 dias após a contaminação infeciosa, em casos em que nenhum medicamento preventivo da malária tenha sido previamente ministrado. O sintoma mais característico da doença da malária é a febre cíclica8, que se deve ao conjunto de estadios sincronizados que o parasita apresenta, e que serão descritos adiante. Particularmente, quando ocorre a rutura dos esquizontes nos glóbulos vermelhos (GV), libertando os merozoítos na corrente sanguínea, o sistema imunitário é ativado FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 3 desencadeando a febre. Por outro lado, quando estes invadem os novos GV, ocorre redução da febre8. No geral, os primeiros sintomas a surgir são semelhantes aos de uma gripe comum, sendo aconselhado, sempre que possível, que o diagnóstico clínico seja acompanhado de um diagnóstico laboratorial9. Um tratamento inapropriado com terapias antimaláricas em pacientes sem um diagnóstico confirmado para a doença, pode desencadear o aumento da resistência do parasita aos medicamentos, tornandoos cada vez menos eficazes10, uma problemática bem assente atualmente. A malária é uma doença transmitida por mosquitos, apresentando como agentes causadores os parasitas protozoários do género Plasmodium7. Este parasita contém mais de 200 espécies diferentes, tendo vários hospedeiros como os répteis, pássaros, anfíbios e mamíferos11. Nos seres humanos, o Plasmodium é transmitido através da picada do mosquito fêmea Anopheles7. Até ao momento, existem 6 espécies deste parasita que infetam os humanos, nomeadamente: Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, Plasmodium knowlesi e Plasmodium cynomolgi12. No entanto, a possibilidade de infeção, desta última espécie, nos seres humanos ainda se encontra pouco documentada. A espécie mais virulenta e fatal é a P. falciparum, especialmente em crianças pequenas, com imunidade protetora insuficiente, ou em mulheres grávidas. Embora as restantes espécies também possam causar problemas graves na saúde humana, a sua taxa de mortalidade é significativamente menor13. Nos seres humanos, o ciclo de vida bastante complexo do Plasmodium inicia-se com a picada do mosquito Anopheles infetado, em que os parasitas na forma de esporozoítos, presentes nas glândulas salivares do mosquito, são inoculados na corrente sanguínea do hospedeiro12. Os esporozoítos migram até ao fígado, onde ocorre a fase do ciclo exoeritrocítico. As células do fígado são infetadas, ocorrendo maturação dos esporozoítos para a forma de esquizontes e o rompimento dos esquizontes, libertando milhares de parasitas na forma de merozoítos na corrente sanguínea. De seguida, iniciase o ciclo eritrocítico, fase sintomática da doença, em que merozoítos infetam os GV desencadeando a multiplicação assexuada do parasita13. Dentro dos GV, os merozoítos desenvolvem-se em trofozoítos e estes amadurecem para esquizontes, que irão romper e libertar mais merozoítos para infetar mais GV. Dependendo da espécie, este ciclo pode FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 4 demorar entre 48 e 72 horas. Alguns merozoítos, nesta fase, diferenciam-se em gametócitos, parte fundamental para completar o ciclo do parasita, uma vez que serão ingeridos pelo mosquito Anopheles, aquando da sua alimentação. Desta forma, é iniciado o ciclo esporogónico, em que o mosquito, ao ingerir os gametócitos masculinos e feminino, permite que ocorra a formação de zigotos no seu estômago, que se desenvolvem em oocinetes, tornando-se longos e móveis. Por sua vez, os oocinetes invadem a parede intestinal do mosquito e evoluem para oocistos, que rompem e libertam esporozoítos, que se deslocam para as glândulas salivares do mosquito. Assim, o ciclo de vida da malária é perpetuado com a nova inoculação dos esporozoítos no novo hospedeiro4,6,12,14. A infeção dos glóbulos vermelhos pelos parasitas, que desencadeia o desenvolvimento intracelular supramencionado, origina a degradação da hemoglobina (Hb)15, fonte de nutrientes para o parasita, mas leva à libertação do grupo heme, tóxico, tanto para o hospedeiro humano como para o parasita, e impossível de digerir por este. De forma a remover o heme livre, o parasita promove a formação de um cristal anisotrópico, a hemozoína (Hz), também conhecida como o pigmento da malária16. Com a progressão da doença, desencadeia-se o aumento da concentração de Hz e a diminuição de Hb nos GV. A formação de Hz é um produto intrínseco ao parasita, pelo que o sangue humano não infetado não apresenta Hz, apresentando, assim, um potencial para ser utilizada como um biomarcador para a deteção de malária14. Desta forma, alcançar um método de diagnóstico baseado na deteção e quantificação de Hz, capaz de ultrapassar as limitações dos atuais métodos de diagnóstico, descritas no capítulo 2, será uma mais valia6,14. MOTIVAÇÃO Atualmente, existem diversos métodos disponíveis para o diagnóstico de malária, que se baseiam na deteção dos parasitas no sangue. Os métodos mais usados são baseados na microscopia ótica de lâminas de esfregaço de sangue corado com Giemsa17, no diagnóstico molecular por reação em cadeia da polimerase (RCP)18 e em vários testes de diagnóstico rápidos (TDR), com base na imunocromatografia19. FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 5 A microscopia ótica permite a quantificação e distinção de espécies, contudo requer equipamentos laboratoriais e técnicos qualificados para a utilização dos materiais, o que pode levar a uma interpretação subjetiva dos resultados20. Por outro lado, os TDR têm uma sensibilidade comparável com a microscopia e podem ser utilizados na maioria dos locais remotos. Porém, os TDR são caros e não permitem a quantificação de parasitas, apenas a deteção da presença dos mesmos21. No geral, em termos de sensibilidade, o melhor método é o RCP22, no entanto este método implica laboratórios equipados, pelo que não pode ser utilizado como diagnóstico de rotina. Além disso, todos estes métodos são invasivos, uma vez que requerem a colheita de amostras de sangue (ainda que em pequenas quantidades) e reagentes descartáveis e/ou consumíveis. É importante realçar que os casos diagnosticados com a doença de malaria têm diminuído ao longo dos anos. No entanto, desde 2016, esta redução tem vindo a desacelerar, mantendo-se constante o número de casos registados. Esta estagnação pode relacionar-se com a impossibilidade dos métodos de diagnóstico atuais de detetarem baixas parasitémias, que circulam na população assintomática e são suficientes para serem transmitidas pela picada do mosquito. Assim, torna-se claro que o diagnóstico de malária necessita urgentemente de ser melhorado, devido ao défice de dispositivos capazes de auxiliar na fase de eliminação de malária. Os avanços tecnológicos emergentes, nomeadamente as microtecnologias e a microeletrónica, em conjunto com o conhecimento detalhado do ciclo de vida do parasita, podem desencadear o desenvolvimento de novos dispositivos de diagnóstico com resultados precisos e independentes do utilizador, portáteis e de baixo custo, visando soluções inovadoras, sem necessitarem de reagentes ou amostras de sangue e, portanto, não invasivos. A presente dissertação integra o projeto de investigação financiado (MalariaChip, referência NORTE-01-0145-FEDER-028178) cujo principal objetivo consiste no desenvolvimento de um dispositivo de diagnóstico inovador e não invasivo, baseado em espectrofotometria de reflectância ótica para deteção e quantificação de parasitas da malária, através da identificação de Hz, sem ser necessária a recolha de amostras de sangue do paciente infetado. Esta última característica constitui uma enorme vantagem, uma vez que permitirá detetar os parasitas em qualquer estadio da doença e com uma FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 6 sensibilidade alcançável elevada. Isto é, os métodos convencionais, ao recorrerem a amostras sanguíneas, detetam apenas os parasitas no estadio de anel, que são os únicos que circulam na corrente sanguínea. À medida que o ciclo do parasita avança e os parasitas, com mais quantidade de Hz, aderem às células endoteliais, deixam de ser detetados pelos métodos convencionais, podendo ser na mesma detetados pelo método proposto nesta dissertação. Adicionalmente, o dispositivo, ao ser não invasivo e automático, permite levar os testes de diagnóstico a zonas remotas onde, normalmente por falta de condições, é impossível chegarem, diminuindo os tratamentos sem diagnóstico confirmado. Desta forma, para implementar o dispositivo de reflectância ótica, com um limite de deteção até 12,5 parasitas/µl de glóbulos vermelhos, o valor esperado a ser alcançado para se tornar comparável com os melhores métodos de diagnóstico no mercado, é necessário que este dispositivo contenha filtros óticos passa-banda. Estes filtros deverão ser específicos para comprimentos de onda selecionados (descritos na secção 2.2.2), com alta transmitância ótica e baixa largura a meia altura (FWHM, do inglês full width at half maximum), com a finalidade de reconstruir, quando depositados sobre uma matriz de fotodíodos, os espectros de reflectância ótica das amostras dos pacientes, de modo a permitir a sua distinção entre GV saudáveis e infetados com malária. O dispositivo ótico previsto no projeto incluirá uma fonte de luz branca, que emite e direciona a luz para a amostra. Além da fonte de luz, o dispositivo incluirá uma matriz de fotodíodos capaz de receber e converter a luz refletida pela amostra em corrente elétrica, e um conjunto de filtros óticos (16, como será posteriormente detalhado), projetados para selecionar e filtrar a luz em diferentes comprimentos de onda, ajudando a reconstruir, a partir de 16 pontos discretos, o espectro original de cada amostra. O espectro originado pela reflexão da luz na amostra será específico para a sua composição química e molecular. Os filtros óticos a incluir no dispositivo devem ser constituídos por filmes finos distribuídos em multicamada, capazes de serem depositados, durante a fase de fabrico, no topo de uma matriz de 16 fotodíodos de silício (4x4), fabricados em tecnologia CMOS (do inglês complementary metal-oxide-semiconductor) e incluídos no dispositivo ótico. Os filtros óticos de filmes finos são altamente sensíveis às propriedades e espessura dos FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 7 materiais que os constituem, pelo que a principal motivação deste trabalho será estudar a resposta espectral de diferentes materiais dielétricos, com diferentes propriedades óticas, visando a sua caracterização completa antes do fabrico. Acredita-se que a tecnologia apresentada para o dispositivo não invasivo para diagnóstico de malária, através de reflectância ótica, medida diretamente na pele do paciente, é totalmente inovadora, não havendo trabalhos na literatura que se baseiem em tal abordagem. Assim, este trabalho de dissertação, ao realizar a simulação e desenho dos filtros óticos para implementação no dispositivo referido, compreende um passo essencial para a concretização do objetivo primordial do projeto, realçando a sua novidade e originalidade. OBJETIVO Com base na secção anterior, onde é apresentada a motivação do problema, o principal objetivo da dissertação é o desenho, simulação e otimização de 16 filtros óticos passabanda, baseados em estrutura multicamada de filmes finos, para utilização na gama espectral entre 400 nm e 800 nm (radiação visível e próxima do infravermelho). Os filtros deverão possibilitar a reconstrução dos espectros de reflectância de diferentes amostras (saudáveis e com diferentes parasitémias), de modo a permitir o diagnóstico de malária num dispositivo portátil, automático e miniaturizado. No sentido de concretizar o objetivo principal, o presente trabalho contém os seguintes objetivos intermédios: • Estudar as diferentes configurações, presentes na literatura, de filtros óticos passa-banda baseados em filmes finos multicamada; • Simular os filtros óticos utilizando como ferramenta o software TFCalc; • Estudar o dióxido de silício (SiO2) e o dióxido de titânio (TiO2) como materiais para integrar em filtros óticos passa-banda altamente seletivos; • Otimizar, no software TFCalc, a transmitância e FWHM dos filtros óticos desenhados; • Estudar o efeito da espessura dos materiais selecionados para os filmes finos nos 16 espectros de transmitância obtidos; FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 14 elevada complexidade, e que permite o acompanhamento dos pacientes após o tratamento31. TESTES DE DIAGNÓSTICO RÁPIDOS (TDR) Os TDR têm vindo a ser cada vez mais utilizados no diagnóstico de malária, devido à sua simplicidade de utilização e rapidez de deteção4. Estes são dispositivos point-of-care capazes de detetar a doença da malária em pequenas amostras de sangue através de ensaios imunocromatográficos, detetando imunologicamente os diferentes antigénios da malária38. Este método utiliza anticorpos monoclonais marcados com corante para se ligarem aos antigénios do parasita da malária, presentes numa tira com a amostra13. A interação do complexo antigénio-anticorpo resulta numa reação colorimétrica que produz uma linha colorida visível13,31. Os TRD podem demorar entre 5 e 20 minutos, dependendo das suas características. Além disso, estes testes não requerem energia elétrica, são portáteis, simples de realizar e não necessitam de nenhum conhecimento específico para interpretação dos resultados6. Atualmente, existem cerca de duzentos TRD disponíveis para diagnóstico em campo. Em relação à sua utilidade, alguns TRD apenas detetam uma espécie de Plasmodium (P. falciparum ou P. vivax), enquanto que outros são capazes de detetar várias espécies (P. falciparum, P. vivax, P. malariae e P. ovale). Alguns dos testes permitem ainda diferenciar entre infeções P. falciparum e não P. falciparum, ou entre espécies específicas, o que poderá ser relevante no tratamento a administrar ao paciente39. No entanto, os TRD, apesar de acessíveis e fáceis de utilizar, são relativamente caros e sujeitos a resultados falsos positivos, uma vez que o antigénio da malária mantém-se no sangue até duas semanas após a eliminação13 do parasita. Além disso, o limite de deteção (LOD) para um TDR convencional é de cerca de 100 parasitas/µL de sangue31 e não fornecem valores de parasitémia. Relativamente à sensibilidade e especificidade, os TDR apresentam valores similares aos da microscopia38. Finalmente, os benefícios destes testes em comparação com outros métodos incluem a utilização simples e a interpretação de resultados independente do utilizador, não sendo FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 15 necessário investigadores nem técnicos altamente treinados, nem laboratórios especializados para os realizar39. DIAGNÓSTICO MOLECULAR As técnicas de diagnóstico molecular são consideradas as mais sensíveis e específicas para o diagnóstico de malária. No entanto, requerem infraestruturas adequadas, técnicos e equipamentos altamente especializados e de elevado custo, o que limita a sua utilização nas regiões economicamente debilitadas. Por este motivo, as técnicas de diagnóstico molecular são utilizadas apenas em investigação e desenvolvimento, não sendo utilizadas em diagnóstico de campo4. Nesta secção são abordadas três técnicas diferentes de diagnóstico molecular, baseadas na amplificação do ácido nucleico (NAAT, do inglês nucleic acid amplification test): RCP22, LAMP40 e NASBA31. 2.1.4.1 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (RCP) Em 1983, foi desenvolvido o método RCP, que se baseia nas propriedades termoestáveis de polimerases do ácido desoxirribonucleico (ADN) para a amplificação de pequenos fragmentos de ADN7. A técnica é considerada das mais eficientes para o diagnóstico de malária, atingindo elevada precisão, especificidade e sensibilidade. Para detetar diferentes espécies de Plasmodium existem várias abordagens de RCP: nested RCP; semi-nested RCP; single step multiplex RCP; ensaios em tempo real ou quantitativos de RCP e RCP direta13. Todos estes métodos baseiam-se na identificação de sequências de nucleótidos específicas do genoma do parasita, na sua amplificação e na repetição de ciclos de amplificação para gerar várias cópias de fragmentos específicos de material genético, juntamente com uma posterior deteção e análise dos produtos resultantes do processo de amplificação41. A RCP é capaz de detetar parasitas com um limite de deteção entre 1 e 5 parasitas/μL de sangue, para as seis espécies de parasitas infeciosos31. Embora este método apresente claras vantagens, baseia-se em sequências de nucleótidos complementares entre o primer (sequência conhecida) e o ADN alvo homólogo (sequência desconhecida), pelo que os parasitas com várias sequências FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 16 genéticas na região alvo do iniciador são propensos a falhas de deteção ou a uma diminuição na eficácia de amplificação, o que reduzirá a sensibilidade do teste de RCP42. Além disso, esta técnica tem um elevado custo devido ao material e equipamento necessário, assim como à exigência de técnicos especializados e ao elevado tempo necessário para a análise7. 2.1.4.2 AMPLIFICAÇÃO ISOTÉRMICA MEDIADA POR LOOP (LAMP) Os ensaios LAMP amplificam material genético a uma única temperatura (isotérmica) em menos de uma hora, através de polimerases. O precipitado resultante deste processo aumenta a turbidez da solução, simplificando a identificação visual de amostras positivas43. A LAMP apresenta uma precisão equivalente à RCP. Relativamente à sensibilidade e especificidade, diversos estudos na literatura31 indicam que estas são muito elevadas para a deteção de diferentes espécies de parasitas Plasmodium. A técnica LAMP apresenta um limite de deteção de aproximadamente 1 parasita/µL de sangue, no entanto pode atingir valores entre 0,025 e 0,1 parasitas/µL de sangue. Além disso, a sua execução experimental requer material menos sofisticado que o RCP, tempos de resposta mais curtos e apresenta custos mais reduzidos que RCP40. Assim, a LAMP pode ser uma boa alternativa ao método RCP, uma vez que a reação que a constitui pode ser facilmente conduzida num tubo a temperatura constante, sendo um fator importante para um possível diagnóstico rápido da malária em regiões remotas7. 2.1.4.3 AMPLIFICAÇÃO BASEADA NAS SEQUÊNCIAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS (NASBA) Em 1997, a NASBA foi utilizada pela primeira vez para detetar o parasita da malária com base na amplificação do 18S ácido ribonucleico ribossómico (do inglês rRNA). Este método de diagnóstico baseia-se na combinação de três enzimas para alcançar a amplificação de ácido ribonucleico (RNA), sem necessitar de um ciclo térmico44. Ao longo do tempo têm vindo a ser desenvolvidas diferentes versões desta técnica, como os ensaios de amplificação baseada nas sequências de ácidos nucleicos quantitativos (QT-NASBA), sendo, cada vez mais, investigados para utilização em tempo FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 17 real45. Estes são utlizados na deteção de espécies distintas de Plasmodium, contendo um limite de deteção entre 0,01 e 0,1 parasitas/µL de sangue46. Além disso, considerase que ultrapassam os TDR e o RCP ao nível da sensibilidade e especificidade. Finalmente, as tecnologias NASBA são uma alternativa vantajosa, no sentido em que não requerem equipamentos de ciclos térmicos, são de rápida execução, utilizam um procedimento de preparação de amostras simples, requerem quantidades pequenas de sangue e não interferem com o ADN31. OUTRAS ABORDAGENS INOVADORAS Os métodos de diagnóstico referidos anteriormente são os mais comuns para o diagnóstico de malária, quer para atuação em campo (diagnóstico clínico, microscopia e TRD) quer na investigação em laboratório (métodos moleculares). No entanto, de modo a ultrapassar as limitações dos métodos existentes e com o progresso emergente em novas tecnologias, têm vindo a ser desenvolvidas outras técnicas, em que a deteção do parasita difere dos métodos presentes. Alguns exemplos são: a deteção de atividade enzimática através de um círculo rotativo6, sendo que a atividade catalítica da enzima Plasmodium topoisomerase I é transformada em produtos de ADN amplificados isotermicamente; a deteção serológica do parasita Plasmodium utilizando soro sanguíneo de pacientes com malária6; os dispositivos baseados em microfluídica47; citometria de fluxo para classificação através de laser e a identificação de glóbulos vermelhos infetados48 e diagnóstico específico de parasitas Plasmodium mediado por aptâmeros ou anticorpos químicos7. Mais recentemente, muitos investigadores têm vindo a explorar o potencial de Hz no diagnóstico de malária, focando-se nas suas propriedades magnéticas49, superparamagnéticas50, acústicas51,52 ou óticas53. Um destes exemplos, é um método de deteção foto-acústica, baseado em nanobolhas de vapor52, criadas através da estimulação, por um laser pulsado, da Hz presente no sangue do paciente infetado. Particularmente, os métodos óticos têm vindo a ser desenvolvidos para diagnóstico de malária a partir da quantificação de Hz por espectroscopia, tal como será detalhado na secção seguinte, constituindo o ponto de partida para o presente trabalho. FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 18 DETEÇÃO DE MALÁRIA POR ESPECTROSCOPIA ÓTICA Assim como referido previamente na motivação do trabalho (secção 1.2), a presente dissertação enquadra-se num projeto de investigação financiado (MalariaChip, referência NORTE-01-0145-FEDER-028178) que tem como principal objetivo o desenvolvimento de um dispositivo não invasivo, baseado em espectrofotometria de reflectância ótica para a deteção do parasita da malária, através da identificação de Hz (um subproduto da digestão do parasita da malária), sem ser necessário uma recolha de amostras de sangue de pacientes infetados. Assim, no seguimento da revisão de literatura apresentada na secção anterior (secção 2.1), e focando nos principais objetivos do trabalho de investigação, esta secção apresenta, por sua vez, uma revisão dos atuais métodos de espectroscopia ótica em desenvolvimento para o diagnóstico de malária com base na deteção da Hz. Apresenta-se, ainda, uma breve descrição da espectrofotometria de reflectância ótica, o método utilizado neste trabalho para a deteção de Hz e diagnóstico de malária. REVISÃO DE LITERATURA DE MÉTODOS DE ESPECTROSCOPIA ÓTICA PARA A DETEÇÃO DE HEMOZOÍNA O parasita Plasmodium, agente causador da doença da malária, quando presente nos glóbulos vermelhos, origina um conjunto de alterações bioquímicas e morfológicas no interior destas células. A degradação da Hb constitui uma das alterações ocorrentes do metabolismo do parasita durante o seu desenvolvimento intracelular54. O produto resultante da digestão da Hb é o grupo heme, que é tóxico e o parasita armazena na sua forma metabolicamente cristalizada não toxica, denominada de Hz. A Hz é, desta forma, um produto exclusivo do parasita, podendo servir como um biomarcador para o diagnóstico de malária7. Assim, têm vindo a ser desenvolvidas várias técnicas de espectroscopia ótica para o estudo das propriedades físicas e químicas da Hz, que podem ser integradas em dispositivos cada vez mais miniaturizados, automatizados e não invasivos, com o objetivo de ajudar a diagnosticar esta doença na sua fase inicial55. De uma forma genérica, a espectroscopia estuda a interação entre a radiação eletromagnética e as biomoléculas numa determinada amostra, sendo a mais utilizada FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 19 de todas as técnicas analíticas disponíveis em laboratório. Desta forma, a espectroscopia tem a capacidade de identificar uma biomolécula específica, assim como a caracterizar estruturalmente, quantificar a sua concentração e determinar uma atividade enzimática56. A espectroscopia permite a identificação de substâncias através da reflexão ou absorção da luz em diferentes comprimentos de onda do espectro ótico. O processo caracterizase pela incidência de um feixe de radiação eletromagnética que passa pela amostra, fazendo com que a intensidade de radiação transmitida e/ou refletida diminua em determinadas frequências da radiação incidente57. A seleção destas frequências e, consequentemente dos comprimentos de onda, depende das substâncias presentes na amostra em questão, uma vez que cada substância absorve energia de radiação a diferentes comprimentos de onda6. Entre as diversas técnicas espectroscópicas em desenvolvimento para deteção de Hz, podem destacar-se a espectroscopia ultravioleta-visível (UV/VIS)58, a espectroscopia de Raman59 e a espectroscopia foto acústica60. A primeira permite distinguir entre diferentes fases da maturação do parasita61. A espectroscopia de Raman permite a medição do comprimento de onda e da intensidade da luz, emitida por uma molécula espalhada inelasticamente. Esta emissão ocorre devido a interações da luz incidente com as energias vibracionais da molécula, possibilitando a identificação da substância e a observação das suas alterações moleculares62. Especificamente, a espectroscopia de Raman de superfície aumentada é utilizada na deteção da Hz, durante a replicação assexuada, uma vez que, sendo a Hz um subproduto paramagnético que contém ferro da digestão da Hb, usando nanopartículas de prata, ocorre um aumento do sinal Raman da Hz7. Finalmente, a espectroscopia foto acústica permite o estudo das propriedades óticas e termoelásticas da Hz. A absorção ótica causa expansão termoelástica e contração dos cristais de Hz, criando ondas de pressão que se propagam através dos tecidos mais profundos, quando comparadas com as ondas de luz63. Desta forma, a Hz, devido às suas elevadas propriedades de absorção ótica, pode ser estudada através desta espectroscopia em comprimentos de onda óticos, e em frequências de ultrassom diagnóstico61. FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 20 No presente trabalho, como já referido, a quantificação de Hz será efetuada a partir de espectrofotometria por reflectância ótica no espectro UV/VIS, seguidamente descrita. REFLECTÂNCIA ÓTICA NA QUANTIFICAÇÃO DE HEMOZOÍNA Quando a luz incide numa superfície ou meio ocorrem três fenómenos: a transmissão, a absorção e a reflexão. Nesta secção será feita uma análise da luz que é refletida numa superfície ou meio, sendo que a figura 1 é representação esquemática desse fenómeno em condições ideais, incluindo os fenómenos de reflexão especular e difusa64. Figura 1: Representação esquemática do processo físico de reflexão da luz. A reflectância é uma fração de luz que retorna à superfície ou meio onde incidiu, sendo por isso refletida65. Normalmente, a luz refletida depende da direção, da frequência ótica e do comprimento de onda da luz incidente. Além disso, constitui uma propriedade ótica intrínseca de um filme fino, permitindo obter-se informações sobre transparência, estrutura de banda de energia, frequência do plasma, espessura do filme e qualidade da superfície65,66. A figura 1 permite observar que no fenómeno de reflectância pode ocorrer reflexão difusa e/ou especular64. A reflexão especular ocorre quando a luz incide numa superfície muito lisa (metal polido ou vidro), fazendo com que o feixe de luz incidente seja refletido num único feixe com ângulo de reflexão igual ao ângulo de incidência67. Por outro lado, a reflexão difusa é produzida através de superfícies rugosas e de espalhamento no interior do material refletor, caracterizando-se segundo a reflexão da luz por uma ampla distribuição de ângulos68. Especificamente, o presente trabalho baseia-se no princípio de que a Hz e a Hb possuem espectros óticos característicos diferentes, principalmente na faixa do visível, com picos FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 21 de absorbância e reflectância distintos, sendo que se modificam consoante as concentrações de Hb e Hz no sangue. Quando o parasita da malária está presente no organismo humano, a Hz aumenta e a Hb diminui, o que possibilita a deteção do parasita por espectrofotometria de reflectância ótica e permite detetar o progresso da infeção. O grupo de investigação CMEMS (Unidade de Investigação em Microssistemas Eletromecânicos da Universidade do Minho), tem vindo desde 2018 a aplicar, em cooperação com o Laboratório Associado ICVS (Instituto de Investigação em Ciências da Vida e Saúde) /3B's, também da Universidade do Minho, este princípio para deteção de Hz por reflectância ótica69,70. A figura 2 representa um exemplo de espectros normalizados de reflectância ótica de glóbulos vermelhos saudáveis e glóbulos vermelhos infetados com o parasita da malária, em diferentes níveis de parasitémia, nos estados iniciais (anéis) e avançados (trofozoitos) da doença. As medições dos espectros foram realizadas num setup espectrofotométrico composto por uma fonte de luz de halogênio de tungstênio de quartzo com 200 W de potência ótica (modelo 66881, Oriel Newport), fibras óticas, um suporte para cuvetes e um espetrofotómetro AvaSpec-ULS2048XL EVO (Avantes). Figura 2: Espectros de reflectância normalizada entre os 400 nm e os 800 nm, de glóbulos vermelhos saudáveis e glóbulos vermelhos infetados in vitro com diferentes parasitémias (12,5 a 50 parasitas/μL de glóbulos vermelhos) de P. falciparum, nos estados inicial (anéis) e avançado (trofozoitos) da doença. FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 22 Os dados dos espectros, com intervalos de 1 nm, foram recolhidos utilizando o software AvaSoft 8.11 e foi usado sulfato de bário como referência para as medições. As amostras de GV infetado com Plasmodium falciparum referidas, foram cultivadas in vitro nas instalações do ICVS69. Os dados do trabalho de investigação, representado no gráfico da figura anterior, obtidos nos laboratórios do grupo de investigação CMEMS, permitiram selecionar, no espectro ótico, 16 comprimentos de onda relevantes que, por si só, possibilitam a reconstrução dos espectros contínuos de reflectância das amostras69. Os comprimentos de onda selecionados, identificados por pontos no gráfico, são: 400, 435, 520, 590, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 700, 720, 740 e 800 nm. As amostras, utilizadas para a obtenção do gráfico mencionado, foram medidas numa cuvete de caminho ótico de 1 mm com 40% de hematócrito para representar a quantidade de glóbulos vermelhos no sangue humano. A partir dos espectros de reflectância apresentados e da seleção de 16 comprimentos de onda, é possível desenvolver um dispositivo ótico inovador com base em reflectância ótica para deteção de Hz. Com a finalidade de reconstruir os espectros de reflectância ótica das amostras a partir de um conjunto de 16 pontos discretos, é necessário que este dispositivo seja constituído por: uma fonte de luz branca capaz de emitir e direcionar a luz para as amostras; uma série de filtros óticos passa-banda (16 filtros, no caso particular do trabalho em desenvolvimento), específicos para selecionar e filtrar a luz em comprimentos de onda selecionados, com alta transmitância e baixa FWHM e um conjunto de 16 fotodíodos em silício, fabricados em tecnologia CMOS, que vão receber a luz refletida e convertê-la em corrente elétrica. Os filtros devem ser filmes finos de multicamadas, capazes de ser depositados, durante a fabricação, no topo da matriz de 16 fotodíodos. Desta forma, o desenho e a simulação dos filtros óticos, baseados em filmes finos de multicamada, constituem um avanço no estado de arte da técnica, permitindo contribuir de modo fulcral para o desenvolvimento do dispositivo inovador de diagnóstico de malária que se espera obter. A secção que se segue apresenta, assim, um resumo do estado de arte de filtros óticos, que será o ponto de partida para o desenho e simulação dos 16 filtros óticos pretendidos. FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 23 FILTROS ÓTICOS No sentido de implementar o dispositivo proposto para o diagnóstico de malária, baseado na espectroscopia de reflectância ótica, é necessário, como supramencionado, um conjunto de 16 filtros óticos. Nesta secção, serão apresentados alguns exemplos de aplicações com base em filtros óticos, sendo que, no capítulo 3, serão abordados mais detalhadamente os princípios teóricos nos quais se baseiam. TIPOS DE FILTROS ÓTICOS Os filtros óticos são dispositivos ou materiais capazes de alterar a distribuição espectral de um feixe de luz espectralmente seletivo ou não seletivo, apresentando como vantagens a simplicidade, robustez e, na maioria dos casos, no seu relativo baixo custo71. Nos sistemas e nas comunicações óticas, são utilizados diferentes tipos de filtros óticos para transmitir ou bloquear seletivamente certos comprimentos de onda72. Desta forma, os filtros óticos transmitem luz a diferentes comprimentos de onda e eliminam a luz nas regiões espectrais indesejadas. Alguns exemplos de filtros óticos, comummente usados, são: filtros Fabry-Perot73; filtros de grade de Bragg de fibra74; filtros ajustáveis75; filtros absorventes72; filtros infravermelhos76; filtros ultravioleta76 e filtros dicroicos77. A estrutura típica de um filtro Fabry-Perot será a base dos filtros projetados no trabalho desenvolvido, pelo que será abordado mais aprofundadamente nas secções seguintes. Os filtros Fabry-Perot, ou também conhecidos como filtros de filmes finos multicamada, são constituídos por dois espelhos altamente refletores separados por uma cavidade. Neste caso, a luz pode ser transmitida atravessando a cavidade ou pode ser refletida para o meio78. Os filtros de grade de Bragg de fibra são filtros refletores com largura de banda muito estreita, constituindo um elemento chave nos sistemas de fibras óticas. Neste caso, a luz propaga-se através de regiões com índice de refração elevado e baixo, alternadamente, sendo parcialmente refletida em cada interface das regiões. Para comprimentos de onda específicos, quando a distância entre as regiões mencionadas é FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 30 camadas com índices de refração, alternadamente, elevados e baixos, sendo depositada num substrato73, como representado no esquema da figura 4. Figura 4: Representação esquemática de estrutura multicamada de filmes finos. A luz incidente na multicamada é alvo de sucessivas reflexões nas fronteiras de cada camada. As camadas, ao serem constituídas por materiais com índice de refração elevado e baixo, alternadamente, permitem que os feixes de luz refletidos se combinem construtivamente num só feixe, uma vez que surgem todos em fase na superfície das diferentes fronteiras. Assim, a reflexão efetiva da estrutura formada é otimizada para ser elevada, sendo que aumenta com o número de camadas90. No entanto, esta reflectância mantém-se elevada dentro de uma gama limitada de comprimentos de onda, pelo que a combinação de vários filmes com espessuras específicas resulta num espectro de reflectância com máximos e mínimos, em comprimentos de onda específicos. A característica do filtro na reflexão será complementar à da transmissão, quando a absorbância é zero88. CONCEITOS BÁSICOS DA PROPAGAÇÃO DA LUZ NUM MEIO Na subsecção que se segue serão apresentados os cálculos matemáticos que ajudam na compreensão da propagação da luz incidente num determinado meio. FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 31 3.1.1.1 EQUAÇÕES DE MAXWELL E ONDAS ELETROMAGNÉTICAS A luz é uma onda eletromagnética, pelo que as suas características eletromagnéticas podem ser matematicamente descritas segundo as seguintes equações de Maxwell, considerando o meio isotrópico e uniforme80,88: 𝛻 󰇍 ∙𝐷 󰇍 󰇍 =𝜌 (3) 𝛻 󰇍 ∙𝐵 󰇍 =0 (4) 𝛻 󰇍 ×𝐸 󰇍 =−𝜕 𝜕𝑡𝐵 󰇍 (5) 𝛻 󰇍 ×𝐻 󰇍 󰇍 =𝐽 +𝜕 𝜕𝑡𝐷 󰇍 󰇍 (6) 𝐷 󰇍 󰇍 representa o vetor de deslocamento elétrico, ρ a densidade de carga elétrica, 𝐵 󰇍 o vetor de indução magnética, 𝐸 󰇍 o vetor de campo elétrico, 𝐻 󰇍 󰇍 o vetor de campo magnético e, finalmente, 𝐽 corresponde ao vetor de densidade de corrente elétrica. Por sua vez, a densidade de corrente elétrica e o deslocamento elétrico relacionam-se com o campo elétrico através das seguintes equações92: 𝐽 =𝜎𝐸 󰇍 (7) 𝐷 󰇍 󰇍 =ɛ𝐸 󰇍 (8) onde σ e ɛ representam a condutividade elétrica e a permissividade elétrica do meio, respetivamente. Além disso, a indução magnética pode ser relacionada com a intensidade do campo magnético segundo a equação (9), onde µ corresponde à permeabilidade magnética do meio93: 𝐵 󰇍 =µ𝐻 󰇍 󰇍 (9) No vácuo, os valores da permissividade elétrica (ɛ0) e da permeabilidade magnética (µ0) são, respetivamente: FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 32 ɛ0=10−9 36𝜋𝐹/𝑚 (10) µ0=4𝜋×10−7𝐻/𝑚 (11) As duas componentes relacionam-se segundo a seguinte expressão, sendo c a velocidade da luz no vazio (c=2,997925×108 m/s): ɛ0=1 µ0𝑐2 (12) Seguidamente, serão apresentados matematicamente um conjunto de fenómenos, tendo em conta a literatura 80,88,90,92, de forma a auxiliar uma melhor compreensão do modo de propagação da luz. Os campos magnético e elétrico podem ser considerados duas componentes de um único fenómeno físico, o campo eletromagnético. Quando ocorre uma variação eletromagnética, esta prolonga-se independentemente da fonte que a originou. Considere-se um meio livre de fontes, ou seja, onde J=0 e ρ=0. Neste caso, a equação 5 pode ser resolvida através da combinação das equações (3), (6), (8) e (9), obtendo-se a expressão que se segue: 𝛻2𝐸 󰇍 =µɛ𝜕2 𝜕𝑡2𝐸 󰇍 (13) Recorrendo ao mesmo procedimento, é possível obter-se a equação (14) para a indução magnética: 𝛻2𝐵 󰇍 =µɛ𝜕2 𝜕𝑡2𝐵 󰇍 (14) As equações (13) e (14) são equações de onda, sendo que o produto µɛ presente pode relacionar-se com a velocidade de propagação da luz num meio (v), através da expressão: 𝑣= 1 √µɛ (15) FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 33 Como anteriormente referido, o índice de refração de um meio é determinado pela razão entre a velocidade de propagação da luz no vazio (c) e a velocidade de propagação da luz nesse meio (v), podendo ser calculado através da equação 16: 𝑛=𝑐𝑣=√ɛµ ɛ0µ0 (16) Normalmente, o efeito das propriedades magnéticas do meio na velocidade de propagação da luz é insignificante, sendo que se pode considerar µ≈µ0. Assim, o índice de refração é determinado apenas pela permissividade do meio, que depende da frequência da onda eletromagnética incidente. No caso de ondas planas, isto é, ondas com fase constante, cujas frentes de onda são planos infinitos e paralelos, as equações (13) e (14) têm a seguinte solução: 𝐸 󰇍 =𝑅𝑒{𝐸0 󰇍 󰇍 󰇍 󰇍 𝑒𝑖(𝜔𝑡−𝑘 󰇍 ∙𝑟 +𝜙)} (17) 𝐵 󰇍 =𝑅𝑒{𝐵0 󰇍 󰇍 󰇍 󰇍 𝑒𝑖(𝜔𝑡−𝑘 󰇍 ∙𝑟 +𝜙)} (18) Nas equações anteriores, Re indica a componente real, 𝐸0 󰇍 󰇍 󰇍 󰇍 e 𝐵0 󰇍 󰇍 󰇍 󰇍 correspondem aos vetores da amplitude de oscilação, 𝜔 é a frequência angular, 𝑟 e 𝑘 󰇍 são os vetores de posição e de onda, respetivamente, e 𝜙 é a fase de onda. A frequência (f) e o comprimento de onda (λ) da onda eletromagnética são calculados através das seguintes equações: 𝑓=𝜔 2𝜋 (19) 𝜆=2𝜋 |𝑘 󰇍 | (20) A onda eletromagnética é uma forma de transportar energia, sendo possível calcular a sua densidade de energia eletromagnética (u): 𝑢=1 2(𝐸 󰇍 ∙𝐷 󰇍 󰇍 +𝐵 󰇍 ∙𝐻 󰇍 󰇍 ) (21) FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 34 Finalmente, outra característica importante a ser analisada no desenho de estruturas com filmes finos é a admitância ótica, uma vez que define a maior ou menor facilidade que a luz apresenta em atravessar um filme. Assim, a admitância ótica de um material é numericamente igual ao índice de refração do meio (n) e relaciona os campos magnético (𝐻 󰇍 󰇍 ) e elétrico (𝐸 󰇍 ): 𝐻 󰇍 󰇍 =𝑛𝐸 󰇍 (22) Todas as equações supramencionadas constituem o princípio base teórico para a realização deste trabalho. REFLECTÂNCIA NUMA ESTRUTURA SIMPLES DE UM FILME FINO Nesta secção serão abordados conceitos importantes para um caso da medição da reflectância ótica numa estrutura formada por um filme fino, apresentando duas fronteiras, como observado no esquema da figura 5. Figura 5: Representação esquemática da propagação da luz numa estrutura com um filme fino depositado num substrato. Numa análise da propagação da luz, e em particular nesta estrutura de filme fino, é necessário definir a direção de incidência da onda, usando-se o símbolo “+” (sentido positivo) para as ondas que estão na direção de incidência e o símbolo ”–“ (sentido negativo) para as ondas na direção oposta91,94. Na fronteira b, entre o filme fino e o substrato, apenas são formadas ondas no sentido positivo no substrato. Por outro lado, no filme fino verifica-se a presença de ondas tanto FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 35 no sentido negativo como no sentido positivo, pelo que os campos elétrico e magnético totais podem ser definidos através da soma de ambas as ondas80,95: 𝐸𝑏=𝐸1𝑏 ++𝐸1𝑏 − (23) 𝐻𝑏=𝑛1𝐸1𝑏 +−𝑛1𝐸1𝑏 − (24) Obtendo-se: 𝐸1𝑏 +=1 2(𝐻𝑏 𝑛1+𝐸𝑏) (25) 𝐸1𝑏 +=1 2(𝐻𝑏 𝑛1+𝐸𝑏) (26) 𝐻1𝑏 +=𝑛1𝐸1𝑏 +=1 2(𝐻𝑏+𝑛1𝐸𝑏) (27) 𝐻1𝑏 −=−𝑛1𝐸1𝑏 −=1 2(𝐻𝑏−𝑛1𝐸𝑏) (28) Na fronteira a, no mesmo instante e num ponto com coordenadas x e y semelhantes, os campos elétrico e magnético podem ser definidos alterando a fase da onda, permitindo a mudança da coordenada z de 0 para d1. Desta forma, pode ser calculado o desvio de fase (δ), que representa a mudança de fase da onda quando esta atravessa a distância d1, através da seguinte expressão88,90,92: 𝛿=2𝜋𝑛1𝑑cos𝜃 𝜆 (29) Na equação anterior, d representa a espessura do filme e θ o ângulo de incidência. Além disso, é possível obter-se, através da equação (30), o comprimento do caminho ótico (OPL), ou seja, a distância que a luz percorre no filme fino92: 𝑂𝑃𝐿=𝑛1𝑑1cos𝜃 (30) Os campos elétricos e magnéticos na fronteira a são calculados pelas seguintes expressões: 𝐸1𝑎 +=𝐸1𝑏 +𝑒𝛿=1 2(𝐻𝑏 𝑛1+𝐸𝑏)𝑒𝛿 (31) 𝐸1𝑎 −=𝐸1𝑏 −𝑒−𝛿=1 2(−𝐻𝑏 𝑛1+𝐸𝑏)𝑒−𝛿 (32) FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 36 𝐻1𝑎 +=𝐻1𝑏 +𝑒𝛿=1 2(𝐻𝑏+𝑛1𝐸𝑏)𝑒𝛿 (33) 𝐻1𝑎 −=𝐻1𝑏 −𝑒−𝛿=1 2(𝐻𝑏−𝑛1𝐸𝑏)𝑒−𝛿 (34) A partir destas equações obtém-se: 𝐸𝑎=𝐸1𝑎 ++𝐸1𝑎 −=𝐸𝑏(𝑒𝛿+𝑒−𝛿 2)+𝐻𝑏(𝑒𝛿+𝑒−𝛿 2𝑛1)=𝐸𝑏cos𝛿+𝐻𝑏sin𝛿 𝑛1 (35) 𝐻𝑎=𝐻1𝑎 ++𝐻1𝑎 −=𝐸𝑏𝑛1(𝑒𝛿+𝑒−𝛿 2)+𝐻𝑏(𝑒𝛿+𝑒−𝛿 2𝑛1)=𝐸𝑏𝑛1sin𝛿+𝐻𝑏cos𝛿 (36) As equações anteriores podem ser escritas sob notação matricial: [𝐸𝑎 𝐻𝑎]=[cos𝛿sin𝛿𝑛1 ⁄ 𝑛1sin𝛿 cos𝛿][𝐸𝑏 𝐻𝑏] (37) Esta equação relaciona as componentes tangenciais de 𝐸 󰇍 e 𝐻 󰇍 󰇍 na fronteira a, fronteira de incidência, com as componentes tangenciais de 𝐸 󰇍 e 𝐻 󰇍 󰇍 na fronteira b, pelo que a matriz 2x2 é definida como a matriz característica de um filme fino93,96. Adicionalmente, através dos campos elétrico e magnético da fronteira a, é possível definir a admitância ótica do filme fino: 𝑌=𝐻𝑎 𝐸𝑎 (38) Finalmente, um conceito, ainda importante, a compreender é a reflectância da fronteira entre o meio incidente, de admitância igual a n0, e o meio incidente, de admitância igual a Y, que pode ser calculada segundo a seguinte equação: 𝑅=(𝑛0−𝑌 𝑛0+𝑌)(𝑛0−𝑌 𝑛0+𝑌) (39) A equação (37) pode ser normalizada dividindo todas as variáveis por Eb: [𝐸𝑎𝐸𝑏 ⁄ 𝐻𝑎𝐸𝑏 ⁄]=[𝐵 𝐶]=[cos𝛿sin𝛿𝑛1 ⁄ 𝑛1sin𝛿 cos𝛿][1 𝑛2] (40) FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 37 As componentes B e C correspondem aos campos elétricos e magnéticos normalizados na superfície incidente, sendo que são utilizados para extrair as propriedades óticas dos filmes finos, através da manipulação das equações (38) e (40): 𝑌=𝐻𝑎 𝐸𝑎=𝐶 𝐵=𝑛2cos𝛿+𝑛1sin𝛿 cos𝛿+(𝑛2 𝑛1)sin𝛿 (41) Assim, a reflectância pode ser calculada através de B e C segundo as equações (39) e (41), pelo que, como referido, a matriz [𝐵 𝐶] constitui a matriz característica da estrutura de filmes finos. REFLECTÂNCIA NUMA ESTRUTURA MULTICAMADA DE FILMES FINOS Na secção anterior foi efetuada uma revisão dos conceitos importantes para a compreensão do fenómeno de reflectância ótica numa estrutura com apenas um filme de fino. Da mesma forma, uma metodologia semelhante pode ser aplicada para estruturas em multicamadas de filmes finos. A figura 6 apresenta uma representação esquemática de uma estrutura constituída por duas camadas de filmes finos entre o substrato e o meio de incidência. Figura 6: Representação esquemática da propagação da luz numa estrutura multicamada constituída por dois filmes finos depositados num substrato. FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 38 Considerando as expressões apresentadas na secção anterior, a matriz característica do filme fino 2 será: [cos𝛿2sin𝛿2𝑛2 ⁄ 𝑛2sin𝛿2cos𝛿2] (42) Aplicando a equação (37) para este filme fino, e tendo em conta os parâmetros das fronteiras 1 e 2, obtêm-se: [𝐸𝑏 𝐻𝑏]=[cos𝛿2sin𝛿2𝑛2 ⁄ 𝑛2sin𝛿2cos𝛿2][𝐸𝑐 𝐻𝑐] (43) [𝐸𝑎 𝐻𝑎]=[cos𝛿1sin𝛿1𝑛1 ⁄ 𝑛1sin𝛿1cos𝛿1][cos𝛿2sin𝛿2𝑛2 ⁄ 𝑛2sin𝛿2cos𝛿2][𝐸𝑐 𝐻𝑐] (44) Assim, a matriz característica da estrutura constituída por dois filmes finos será dada por: [𝐵 𝐶]=[cos𝛿1sin𝛿1𝑛1 ⁄ 𝑛1sin𝛿1cos𝛿1][cos𝛿2sin𝛿2𝑛2 ⁄ 𝑛2sin𝛿2cos𝛿2][1 𝑛3] (45) No caso em que a estrutura é constituída por multicamadas de filmes finos, a matriz anterior pode ser generalizada e estendida para um número Q de camadas. Desta forma, a matriz característica de qualquer estrutura de filmes finos pode ser obtida pelo produto das matrizes individuais de cada filme, segundo uma ordem correta, definida a partir da superfície de incidência até à superfície do substrato. A equação (46) corresponde ao cálculo da matriz característica de uma estrutura em multicamada com Q filmes finos, em que nm representa o índice de refração no substrato e r o número da fronteira. [𝐵 𝐶]={∏[cos𝛿𝑟sin𝛿𝑟𝑛𝑟 ⁄ 𝑛𝑟sin𝛿𝑟cos𝛿𝑟] 𝑄 𝑟=1 }[1 𝑛𝑚] (46) O desvio de fase é, neste caso, calculado a partir da seguinte expressão: FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 39 𝛿𝑟=2𝜋𝑛𝑟𝑑𝑟cos𝜃𝑟 𝜆 (47) Quando o ângulo de incidência (𝜃0) é conhecido, consegue-se determinar o valor de 𝜃𝑟 recorrendo às leis de Snell: 𝑛0sin𝜃0=𝑛𝑟sin𝜃𝑟=𝑛𝑚sin𝜃𝑚 (48) Além disso, através da equação (46) é, ainda, possível calcular três características óticas fundamentais, que se relacionam entre si: a reflectância (R), transmitância (T) e absorbância (A). É importante realçar que, para que as expressões seguintes sejam fisicamente corretas e coerentes, o meio incidente deve ser transparente e o substrato opaco: 𝑅=(𝑛0𝐵−𝐶 𝑛0𝐵+𝐶)(𝑛0𝐵−𝐶 𝑛0𝐵+𝐶) (49) 𝑇= 4𝑛0𝑅𝑒(𝑛𝑚) (𝑛0𝐵+𝐶)(𝑛0𝐵+𝐶) (50) 𝐴= 4𝑛0𝑅𝑒(𝐵𝐶−𝑛𝑚) (𝑛0𝐵+𝐶)(𝑛0𝐵+𝐶) (51) A absorbância é um fenómeno que ocorre quando a luz incidente é convertida noutra forma de energia, normalmente em calor, no interior do filme fino, podendo-se relacionar com a reflectância e a transmitância segundo a seguinte expressão: 1=𝑅+𝑇+𝐴 (52) A transmitância, por sua vez, consiste na razão entre a luz transmitida e a luz incidente num determinado substrato. EXEMPLO DE FILTROS ÓTICOS COM MULTICAMADAS DE FILMES FINOS DIELÉTRICOS De seguida, serão apresentados alguns conceitos teóricos para a compreensão do funcionamento dos filtros óticos formados por filmes finos, assim como os cálculos necessários para o seu desenvolvimento na presença de multicamadas. FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 46 Além disso, o valor da FWHM está diretamente relacionado com o número de camadas do filtro ótico, uma vez que quanto maior for o número de camadas da estrutura, menor será o valor da FWHM, mais estreita é a largura de banda dos comprimentos de onda e maior será a seletividade do filtro ótico. No entanto, quanto menor for o número de camadas do filtro ótico, mais simples e eficaz é o seu fabrico, pelo que tem que haver um compromisso entre o valor da FWHM e o número total de camadas de cada filtro56. 4 METODOLOGIA FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 48 Neste capítulo, será apresentada a metodologia do trabalho desenvolvido, que sustenta a investigação realizada nesta dissertação. Desta forma, inicialmente, serão abordados os requisitos tomados como ponto de partida para a construção dos filtros óticos, baseados em multicamadas de filmes finos. De seguida, serão apresentadas técnicas de desenho e simulação computacional dos filtros óticos, em relação ao seu desempenho. Por fim, será explicada a metodologia e protocolo utilizados para um ensaio experimental preliminar, com o objetivo de demonstrar, tendo por base filtros óticos passa-banda pré-existentes no laboratório, o que se pretende obter com os filtros idealizados na aplicação pretendida de diagnóstico de malária. DESENHO DOS FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS No trabalho realizado, foram propostos 16 filtros óticos passa-banda de largura de banda estreita, baseados em estruturas multicamada de filmes finos, centrados em diferentes comprimentos de onda do espectro ótico (selecionados de acordo com a figura 2 presente na secção 2.2.2). Nesta secção, será estudada a estrutura selecionada para a idealização dos filtros óticos, assim como identificados os materiais que a constituem. PROJETO DOS FILTROS ÓTICOS Os 16 filtros óticos, baseados em multicamadas de filmes finos, foram desenhados segundo a estrutura de interferómetro Fabry-Perot (analisada na secção 3.2.3), contendo 11 camadas de materiais dielétricos com índice de refração elevado e baixo, alternadamente, e centrados em comprimentos de onda específicos. Considerando os requisitos supramencionados, os comprimentos de onda selecionados foram 400, 435, 520, 590, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 700, 720, 740 e 800 nm. Idealmente, para cada um destes valores, o seu espectro ótico apresentará o pico de transmitância com o maior valor possível (pelo menos o dobro da intensidade de qualquer pico de ruído que possa existir no espectro em análise) e uma FWHM menor que 10. Neste sentido, é necessário proceder ao estudo do melhor desenho, que permitirá obter estas características no filtro ótico, para isso as espessuras de cada camada e os índices de refração dos materiais serão alterados conforme o filtro ótico projetado. FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 49 4.1.1.1 SELEÇÃO DOS MATERIAIS A estrutura em multicamada selecionada requer, como abordado extensamente no capítulo 3, que as camadas sejam constituídas por filmes finos formados por dois materiais dielétricos diferentes, uma vez que produzem elevadas taxas de transmitância e baixas perdas por absorção. Desta forma, procedeu-se à escolha dos dois materiais, um com índice de refração elevado e outro com índice de refração baixo, como referido nas secções teóricas. Para o efeito, optou-se pelo dióxido de silício (SiO2), como material com índice de refração baixo, e pelo dióxido de titânio (TiO2), como material com índice de refração elevado. Esta seleção deve-se às características vantajosas que apresentam estes materiais, a saber: são duros, tornando-se extremamente difíceis de serem removidos do substrato após a sua deposição; apresentam, na zona espectral de interesse, boas propriedades; têm elevada compatibilidade com o processo de fabrico CMOS e são comummente depositados por IBD (do inglês Ion Beam Deposition), um processo usado no fabrico de filtros óticos. Individualmente, o SiO2 foi escolhido porque apresenta uma dependência, praticamente constante, do índice de refração, na gama visível do espectro ótico de luz. O TiO2 foi escolhido por apresentar uma maior facilidade de fabrico, visto que o seu processo de deposição se encontra bem caracterizado100. A figura 11 representa a estrutura final selecionada para a construção e projeção de cada filtro ótico, centrado no comprimento de onda específico mencionado. Figura 11 - Representação esquemática da estrutura em multicamada de um filtro ótico, baseado no interferómetro de Fabry-Perot, constituído por 11 camadas alternadas de SiO2 e TiO2. FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 50 SIMULAÇÃO DE FILTROS ÓTICOS DE FILMES FINOS No sentido de averiguar a eficácia dos 16 filtros óticos projetados, recorreu-se ao software TFCalc 3.5, utilizado para proceder ao desenho e simulação computacional perante diferentes modificações nos materiais. As simulações permitem identificar a espessura que as camadas de cada filtro devem adquirir para que a transmitância ótica seja a maior possível e a FWHM o mais próximo de 10. Assim, foram realizados três tipos de simulações: na primeira, utilizaram-se índices de refração da base de dados de Sopra S.A., considerados como ideais para os materiais selecionados; na segunda, usaram-se índices de refração considerados próximos dos seus valores reais de fabrico, considerando a base de dados refractiveindex.info101 e, na terceira, utilizaram-se índices de refração para os materiais, medidos de acordo com a espessura projetada para cada uma das camadas, e de acordo com trabalho prévio de Pimenta et al.82. SOFTWARE DE SIMULAÇÃO TFCALC 3.5 Os 16 filtros óticos foram desenhados e simulados computacionalmente, utilizando o software TFCalc 3.5, baseado em métodos de elementos finitos, fornecido pela Software Spectra Inc102. O software em questão foi desenvolvido especialmente para os cálculos óticos pretendidos e caracterizados na secção teórica desta dissertação. O principal objetivo destas simulações é utilizar técnicas de otimização computacional que partem de uma estrutura grosseira em direção a uma estrutura melhorada, através da variação dos diversos parâmetros existentes56. Para o estudo e compreensão das etapas a concretizar na realização de todas as simulações recorreu-se ao manual de instruções de utilização do referido software103. De forma a otimizar o projeto e os futuros processos de fabrico, os 16 filtros foram divididos em três regiões espectrais: ultravioleta/visível (UV/VIS), dos 400 nm aos 435 nm; visível (VIS), dos 520 nm aos 620 nm e visível/infravermelho (VIS/IR), dos 620 nm aos 800 nm. Deste modo, é possível centrar os filtros óticos em diferentes bandas espectrais, ajustando apenas a espessura da cavidade de ressonância de SiO2. As espessuras das restantes camadas de filmes finos, em ambos os espelhos, são mantidas FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 51 iguais. A figura 12 corresponde à janela inicial do programa, que surge com os parâmetros a definir para o ambiente de simulação. Figura 12: Janela de definição de parâmetros iniciais, no TFCalc 3.5. Para todas as simulações, são indicadas as propriedades que influenciam a resposta ótica dos filtros. No presente trabalho, o material escolhido para o substrato e para o meio de saída é o vidro e, por sua vez, o material selecionado para o meio incidente é o ar. Além disso, são definidos comprimentos de onda de referência para cada uma das regiões espectrais supramencionadas: 420 nm para a região UV/VIS; 550 nm para a região VIS e 680 nm para a região VIS/IR. Para todas as simulações apresentadas, nas secções seguintes, as variáveis supracitadas mantêm-se fixas, sendo que os únicos parâmetros de entrada que são alterados são os diferentes índices de refração, em análise, de cada material (SiO2 e TiO2). ÍNDICES DE REFRAÇÃO IDEAIS Nas primeiras simulações realizadas, utilizaram-se os índices de refração da base de dados de Sopra S.A., dado que são considerados os valores ideais para ambos os materiais (SiO2 e TiO2) e dependem apenas do comprimento de onda ótico para o qual o filtro ótico é projetado. A empresa Sopra S.A. (França) disponibilizou o acesso a esta base de dados ótica, assim como à conversão destes valores para o formato do software TFCalc. Deste modo, os índices de refração de Sopra S.A. encontram-se pré-definidos no FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 52 programa e são gerados automaticamente, quando se introduz o comprimento de onda para o qual se pretende projetar o filtro ótico. Na tabela 1, estão identificados os valores dos índices de refração usados para o projeto e simulação de cada filtro ótico. Tabela 1: Índices de refração dos materiais retirados da base de dados de Sopra S.A. Comprimento de onda (nm) Índices de refração (n) SiO2 TiO2 400 1,4701 3,2860 435 1,4668 3,2192 520 1,4613 3 590 1,4584 2,91 610 1,4577 2,8893 620 1,4574 2,88 630 1,4571 2,8750 640 1,4568 2,87 650 1,4565 2,86 660 1,4563 2,85 670 1,456 2,8443 680 1,4558 2,84 700 1,4553 2,83 720 1,4549 2,82 740 1,4544 2,81 800 1,4533 2,79 Posteriormente, procedeu-se à simulação de cada filtro ótico. A tabela 2 apresenta a combinação das espessuras de cada camada, que constituem os 16 filtros óticos desenhados no TFCalc. Os valores das espessuras estão otimizados de forma a que a transmitância resultante, associada a cada comprimento de onda, seja a maior possível. Desta forma, na tabela que se segue, observa-se que os filtros óticos passa-banda dividem-se em quatro conjuntos para as diferentes gamas de comprimentos de onda: os 400 nm e os 435 nm; entre os 520 nm e os 620 nm; entre os 630 nm e os 720 nm e os 740 nm e os 800 nm. Em cada uma destas quatro regiões, verifica-se que as espessuras das camadas constituintes dos espelhos refletores são simetricamente iguais, isto é, cada um dos espelhos é formado por 5 camadas alternadas de SiO2 e TiO2, em que as camadas com o mesmo material apresentam igual espessura. Por exemplo, para o comprimento de onda 400 nm, as espessuras das camadas de TiO2 são 33 nm, enquanto que as espessuras de SiO2 são 73 nm. FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 53 Tabela 2: Filtros óticos nas regiões UV/VIS, VIS, VIS/IR e respetiva espessura das camadas, constituídas por SiO2 e TiO2 com índices de refração ideais (Sopra S.A.). Pico de transmitância máxima por λ (nm) 400 435 520 590 610 620 630 640 650 660 670 680 700 720 740 800 Espessura da camada (nm) TiO2 33 46 60 70 SiO2 73 94 117 121 TiO2 33 46 60 70 SiO2 73 94 117 121 TiO2 33 46 60 70 SiO2 (RC) 127 151 168 219 235 243 196 204 211 219 226 233 247 262 248 291 TiO2 33 46 60 70 SiO2 73 94 117 121 TiO2 33 46 60 70 SiO2 73 94 117 121 TiO2 33 46 60 70 Por outro lado, a espessura da camada da cavidade de ressonância é diferente para todos os comprimentos de onda em análise. A semelhança nos valores das espessuras das camadas facilita o desenho das máscaras no processo de fabrico dos filtros óticos, baseados em filmes finos. Salienta-se que, assim como verificado nesta simulação, para todas as seguintes, os 16 comprimentos de onda estão divididos em quatro regiões; os espelhos refletores apresentam simetria entre si e as espessuras das cavidades de ressonância são sempre diferentes em todos os comprimentos de onda. Esta última característica surge porque o ajuste da espessura da cavidade de ressonância permite a obtenção de uma transmitância mais elevada. APROXIMAÇÃO DOS ÍNDICES DE REFRAÇÃO AOS VALORES REAIS As simulações que se seguem são semelhantes às anteriores, no entanto os índices de refração dos materiais, que constituem as camadas dos 16 filtros óticos, são alterados para valores considerados próximos dos reais. Desta forma, recorreu-se à base de dados refractiveindex.info101 para recolher estes valores, segundo cada comprimento de onda FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 54 e material em análise, apresentado na tabela 3. Estes dados são considerados próximos dos valores reais que se obtêm quando se procede ao fabrico dos filtros óticos. Tabela 3: Índices de refração dos materiais retirados da base de dados refractiveindex.info101. Comprimento de onda (nm) Índices de refração (n) SiO2 TiO2 400 1,4841 2,3379 435 1,481 2,2690 520 1,4759 2,1824 590 1,4733 2,1456 610 1,4727 2,1379 620 1,4724 2,1344 630 1,4722 2,1311 640 1,4719 2,128 650 1,4717 2,1251 660 1,4715 2,1223 670 1,4713 2,1197 680 1,4711 2,1172 700 1,4707 2,1126 720 1,4703 2,1084 740 1,47 2,1046 800 1,4692 2,0951 Assim, a tabela 4 representa a configuração resultante das novas simulações dos 16 filtros óticos, baseados em filmes finos. De acordo com o referido na secção anterior, para cada uma das quatro regiões, as camadas dos espelhos refletores assumem valores iguais, enquanto que a cavidade de ressonância é diferente em todos os comprimentos de onda. Em comparação com a tabela 2, na tabela 4 verifica-se que as camadas constituídas por TiO2 aumentam de espessura para todos os comprimentos de onda. Da mesma forma, a espessura das camadas formadas por SiO2 também aumenta nos comprimentos de onda da segunda região, apesar do aumento ser pouco significativo. Por outro lado, na primeira região (400 nm e 435 nm), as espessuras mantém-se iguais e, nas duas últimas regiões, as espessuras das camadas diminuem ligeiramente. É de realçar que os valores da espessura obtidos são selecionados para que a transmitância seja a maior possível e a FHWM próximo de 10, em todos os filtros óticos. FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 55 Tabela 4: Filtros óticos nas regiões UV/VIS, VIS, VIS/IR e respetiva espessura das camadas, constituídas por SiO2 e TiO2 com índices de refração próximos dos reais (refractiveindex.info101). Pico de transmitância máxima por λ (nm) 400 435 520 590 610 620 630 640 650 660 670 680 700 720 740 800 Espessura da camada (nm) TiO2 44 64 78 96 SiO2 73 98 114 120 TiO2 44 64 78 96 SiO2 73 98 114 120 TiO2 44 64 78 96 SiO2 (RC) 125 159 149 218 238 248 192 201 211 218 231 240 260 280 234 293 TiO2 44 64 78 96 SiO2 73 98 114 120 TiO2 44 64 78 96 SiO2 73 98 114 120 TiO2 44 64 78 96 IMPACTO DAS ESPESSURAS DAS CAMADAS NOS ÍNDICES DE REFRAÇÃO DOS MATERIAIS O desenho dos 16 filtros óticos baseados em filmes finos, que será apresentado de seguida, foi realizado com o intuito de averiguar o comportamento dos filtros simulados quando o índice de refração varia com a espessura da camada. Assim, neste conjunto de simulações, utilizaram-se os índices de refração presentes na tabela 5, tendo sido obtidos através da interpolação dos dados facultados pela investigação experimental de Pimenta et al. (2016)82. Para a obtenção dos índices de refração pretendidos, segundo os comprimentos de onda e as espessuras das camadas especificas em análise, foi necessário o cálculo da interpolação dos valores medidos experimentalmente. Isto deve-se ao facto de a investigação em causa apresentar características óticas diferentes, nomeadamente ao nível das espessuras das camadas e dos comprimentos de onda selecionados. FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 62 luz utilizada. O projeto em que esta dissertação se insere pretende a implementação dos filtros óticos num dispositivo automático e portátil para deteção de malária, para isso optou-se por efetuar também a caracterização da transmitância dos filtros óticos recorrendo a um protótipo preliminar de uma placa PCB miniaturizada para a emissão de luz. Assim, em substituição da fonte de luz branca, foi também utilizada uma placa PCB constituída por um conjunto de 13 LEDs (9 LEDSW50, 2 LED405L e 2 LED800L, todos da Thorlabs), que operam na gama do infravermelho, do visível e do ultravioleta. As figuras 16 (a) e (b) correspondem, respetivamente, a uma fotografia da placa impressa com os 13 LEDs, e à representação esquemática do circuito de atuação da mesma placa. (a) (b) Figura 16: (a) Fotografia da placa PBC para a atuação dos 13 LEDs; (b) Representação esquemática do circuito impresso na placa PBC. A placa impressa em PCB é constituída pelos 13 LEDs e o mesmo número de resistências, assim como conectores para a ligação de fios. Os LEDs distinguem-se da seguinte forma: nas extremidades existem 4 LEDs dual in line package (DIP), dois com um pico de emissão no comprimento de onda de 405 nm e os outros dois com um pico de emissão no comprimento de onda de 800 nm; no centro encontra-se o conjunto dos 9 LEDs em tecnologia de montagem superficial (SMD, do inglês surface-mount device) que emitem na zona do visível, na gama espectral entre 425 nm e 725 nm. A placa é ligada a um microcontrolador Arduíno (ATMEGA2560), por sua vez conectado a um computador com o software Arduino IDE (do inglês Arduino Integrated Development Environment). FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 63 A placa é alimentada e controlada através do software, por meio de uma onda modulada por largura de pulso (PWM, do inglês Pulse Width Modulation), que varia entre 0 e 5 V, com uma frequência de 490 Hz e com duty cycle variável. Para a leitura dos espectros de transmitância, recorrendo a esta fonte, utilizou-se o setup, presente na figura 17, que é constituído por: placa PCB com o conjunto de LEDs; um Arduíno; um suporte para a colocação dos filtros óticos; uma fibra ótica; um espectrofotómetro AvaSpec-ULS2048XL EVO (Avantes), com monocromador e detetor integrado, e um computador com os softwares AvaSoft 8.11 e Arduino IDE. Figura 17: Fotografia do setup experimental quando é utilizada como fonte de luz uma placa PCB com um conjunto de 13 LEDs. Na montagem representada, a placa de LEDs é colocada na parte superior do cilindro preto do suporte ótico, permitindo que a luz incida sobre o conjunto dos filtros óticos, colocados numa placa de suporte na parte inferior deste mesmo cilindro. A fibra ótica é conectada à placa onde se encontram os filtros óticos, possibilitando a entrada da luz transmitida. De seguida, esta luz é encaminhada pela fibra ótica até ao espectrofotómetro, com monocromador interno, onde a luz transmitida é medida em cada comprimento de onda do espectro. O espectrofotómetro, através de uma conexão USB, envia a informação adquirida ao software AvaSoft 8.11, onde é possível visualizar os espectros de transmitância. 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 65 Nesta secção apresentam-se, tanto os resultados obtidos nas simulações dos 16 filtros óticos, baseados em filmes finos, como os resultados dos ensaios laboratoriais dos 8 filtros óticos experimentais. Além disso, será realizada uma análise e discussão destes resultados. Finalmente, serão apresentados exemplos da influência dos filtros óticos no espectro de reflectância dos parasitas da malária, discutindo o potencial dos mesmos para esta aplicação. SIMULAÇÕES DOS 16 FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS De seguida, apresentam-se os principais resultados obtidos nas simulações dos 16 filtros óticos para os três diferentes grupos de índices de refração utilizados, descritos no capítulo anterior. O desempenho dos 16 filtros óticos, obtido das simulações no TFCalc, pode ser analisado através dos seus espectros de transmitância ótica. Cada gráfico resultante (figuras 18, 19 e 20) apresenta os picos de máxima transmitância ótica nos comprimentos de onda selecionados (secção 2.2.2) e para os quais os filtros foram desenhados, com um valor de FWHM específico. A figura 18 representa os espectros de transmitância ótica dos 16 filtros óticos de largura de banda estreita, quando os índices de refração de Sopra S.A. foram considerados para a realização das simulações. Figura 18: Transmitância ótica (%) vs comprimento de onda (nm), para a matriz de 16 filtros óticos (representação estrutural na tabela 2), utilizando os índices de refração da base de dados Sopra S.A.. FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 66 As percentagens dos picos de máxima transmitância são elevadas (valores próximos de 100%) e as FWHM são baixas (menores que 10 nm, como se pode observar na figura 21 e na tabela 9 do anexo 1), o que permite aferir que estas simulações apresentam resultados considerados como ideais para o desempenho dos filtros óticos pretendidos. No entanto, uma vez que se baseiam em valores de índices de refração ideais, que não têm em conta os desvios de fabricação nem o efeito das espessuras das camadas, os espectros resultantes não refletem a realidade na sua totalidade, isto é, não são uma aproximação real do comportamento que os filtros apresentarão aquando do seu fabrico. A figura 19 representa os espectros de transmitância ótica dos 16 filtros óticos, quando é considerada a base de dados refractiveindex.info101 para os índices de refração utilizados nas simulações. Comparativamente com os resultados anteriores (figura 18), os espectros dos filtros óticos nestas simulações apresentam uma ligeira diminuição na percentagem do pico de máxima transmitância ótica (entre 90% a 100%) e uma FWHM significativamente mais elevada, sendo em todos os casos superior a 10 nm, como se observa na figura 21 (ver também anexo 1). Apesar do desempenho dos filtros óticos simulados não corresponder ao ideal (segundo a abordagem teórica do capítulo 3), estes resultados são os que mais se aproximam da realidade e são os que melhor descrevem o comportamento dos materiais, pelo que serão fundamentais numa fase de microfabricação. Figura 19: Transmitância ótica (%) vs comprimento de onda (nm), para a matriz de 16 filtros óticos (representação estrutural na tabela 4), utilizando os índices de refração da base de dados refractiveindex.info101. FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 67 A figura 20 ilustra os espectros de transmitância ótica dos 16 filtros óticos, quando são considerados os índices de refração dos materiais dos filmes finos, calculados a partir das espessuras das suas camadas. Este gráfico, quando comparado com o da figura 19, apresenta melhores resultados ao nível da FWHM, como se observa na figura 21 (e no anexo 1), uma vez que os seus valores são menores e mais próximos do valor ideal de referência (10 nm). Relativamente aos picos de máxima transmitância ótica, os seus intervalos de valores são semelhantes, mantendo-se entre os 90% e os 100%. Figura 20: Transmitância ótica (%) vs comprimento de onda, para a matriz de 16 filtros óticos (representação estrutural na tabela 6), utilizando os índices de refração do grupo de investigação Pimenta et al82. No geral, para as diferentes simulações apresentadas, o desempenho dos filtros, compostos por 10 multicamadas de SiO2/TiO2 e uma camada central de SiO2 (a cavidade de ressonância), demonstra que esta configuração é uma opção adequada para o desenho de filtros óticos baseados em filmes finos com largura de banda estreita. Os resultados obtidos para os três conjuntos de índices de refração permitiram concluir que cada filtro passa-banda, desenhado para uma banda espectral específica, é capaz de alcançar uma transmitância elevada próxima ou superior a 90% e uma FWHM próxima de 10 nm. Estes últimos resultados, relativos à FWHM, são particularmente observados quando são utilizados os índices de refração considerados ideais e os dependentes da espessura da camada, como se pode concluir pela análise da figura 21. FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 68 Figura 21: FWHM (nm) dos 16 filtros óticos, para cada um dos conjuntos de índices de refração simulados. Adicionalmente, a partir das simulações, verificou-se que uma pequena variação nos índices de refração dos materiais pode conduzir a uma mudança significativa no comportamento dos filtros óticos de filmes finos, verificando-se, ainda, que uma modificação nas espessuras das camadas desses filmes pode dificultar a obtenção de um pico de máxima transmitância ótica na banda espectral desejada. Salienta-se que, embora as figuras anteriores apresentem picos de transmitância focados apenas nas regiões de interesse, a simulação dos filtros no TFCalc gera regiões de transmitância elevadas noutras zonas do espectro ótico, como se pode observar nas figuras presentes no anexo 2. Esta limitação da resposta espectral produzida, implica a necessidade de, na prática, adicionar filtros óticos passa-alto e passa-baixo a cada filtro de modo a limpar o espectro e limitar a região de transmitância da luz. É, assim, fundamental ter em consideração estas características durante o processo de fabrico. EXEMPLOS DA INFLUÊNCIA DOS FILTROS ÓTICOS SIMULADOS NO ESPECTRO DE REFLECTÂNCIA DE AMOSTRAS COM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DO PARASITA DA MALÁRIA Pretendeu-se verificar se os 16 filtros óticos, previamente simulados, apresentam potencial para a deteção e distinção de diferentes concentrações do parasita da malária, obtidos a partir de espectros de reflectância ótica (previamente apresentados na secção FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 69 2.2.2). Neste sentido, os espectros de transmitância ótica, obtidos para cada um dos 16 filtros óticos simulados, considerando a base de dados refractiveindex.info101 (figura 19), foram multiplicados pelos espectros de reflectância ótica normalizada (figura 2) de amostras com glóbulos vermelhos saudáveis e glóbulos vermelhos infetados com o parasita da malária, em diferentes níveis de parasitémia, quer no estadio inicial (anéis) quer no estadio avançado (trofozoitos) da doença. A figura 22 representa o espectro resultante da multiplicação mencionada, para diferentes amostras. Figura 22: Espectro representativo da multiplicação dos espectros de transmitância ótica dos 16 filtros óticos simulados pelos espectros de reflectância ótica normalizada de glóbulos vermelhos saudáveis (GV) e GV com diferentes níveis de parasitémia (12,5 a 50 parasitas/μL de glóbulos) de P. falciparum, nos estados inicial (anéis) e avançado (trofozoitos) da doença. Os espectros resultantes são distinguíveis entre si, apresentando pequenas variações nas amplitudes dos picos, resultantes do efeito dos espectros de reflectância para as várias amostras (saudáveis e com parasitémia). A figura 23 apresenta os espectros resultantes da superposição dos espectros de transmitância de todos os 16 filtros óticos simulados (a partir da base de dados refractiveindex.info101) em cada comprimento de onda (obtidos pela soma da área sob a curva de cada filtro), multiplicados pelos espectros de reflectância de GV e de GV infetados com o parasita da malária (figura 2). FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 70 Assim, o gráfico apresenta o efeito cumulativo da influência dos 16 filtros óticos, em cada comprimento de onda do espectro. Figura 23: Espectro do efeito cumulativo resultante da superposição dos espectros de transmitância de todos os filtros óticos simulados em cada comprimento de onda (obtidos pela área sob a curva de cada filtro), multiplicado pelo espectro de reflectância normalizada de GV saudáveis e de GV infetados com o parasita da malária com diferentes níveis de parasitémia (12,5 a 50 parasitas/μL de glóbulos vermelhos) de P. falciparum, nos estados inicial (anéis) e avançado (trofozoitos) da doença. A título de exemplo, enquanto que em 435 nm apenas um filtro permite que a luz seja transmitida (o filtro de 435 nm), em 620 nm, todos os filtros óticos entre os 590 nm e os 640 nm permitem que alguma luz seja transmitida (existe sobreposição nos espectros de transmitância de cada um dos filtros, como se observou na figura 19), aumentando a quantidade total de luz a ser recebida pelo fotodíodo. Da mesma forma, o elevado número de filtros óticos apresentados na faixa entre 570 nm e 750 nm desencadeia um aumento na amplitude total do espectro nessa mesma região. Os resultados mostram que, entre os 400 nm e os 550 nm, não se observam diferenças significativas entre os GV saudáveis e os GV infetados com malária. Porém, nos comprimentos de onda entre 600 nm e 650 nm, há um elevado aumento na amplitude dos espectros obtidos, e o declive das curvas entre 550 nm e 650 nm é maior à medida que a parasitémia diminui. Assim, em particular nesta região do espectro, é possível visualizar e distinguir as curvas espectrais de GV saudáveis e infetados. A curva vermelha (saudável) é notoriamente mais elevada, seguindo-se as curvas relativas aos parasitas em estadio inicial da doença FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 71 (anéis, a azul) e, por fim, as curvas relativas aos parasitas em estadio avançado da doença (trofozoitos, a verde). Conclui-se que, a partir destes resultados, é possível inferir que, na sua generalidade, o sistema projetado tem a capacidade de distinguir entre amostras saudáveis e infetadas com o parasita da malária, evidenciando o seu potencial como ferramenta de diagnóstico. O anexo 3 apresenta os espectros individuais resultantes da multiplicação entre os espectros de reflectância, de GV e GV com diferentes níveis de parasitémia, e os espectros de transmitância de cada um dos 16 filtros óticos. CARACTERIZAÇÃO EXPERIMENTAL DOS FILTROS ÓTICOS De seguida serão apresentados os resultados obtidos na caracterização experimental da transmitância ótica dos 8 filtros óticos abordados na secção 4.3. Inicialmente, serão discutidos os resultados quando é utilizada uma fonte de luz branca e, posteriormente, quando é utilizada uma placa PCB constituída por 13 LEDs, com o intuito de analisar o potencial do sistema para miniaturização e portabilidade. Finalmente, serão apresentados exemplos da influência dos 8 filtros óticos nos espectros de reflectância de amostras com diferentes concentrações do parasita da malária. RESULTADOS EXPERIMENTAIS UTILIZANDO FONTE DE LUZ BRANCA O setup apresentado na secção 4.3.2 foi utilizado para caracterizar a resposta espectral da transmitância ótica dos 8 filtros óticos nos comprimentos de onda de interesse, tendo sido utilizada uma fonte de luz branca para o efeito. A figura 24 apresenta o espectro da luz branca incidente, ou seja, representa a quantidade de luz, gerada pela fonte, que incide nos filtros óticos, em função do comprimento de onda. A partir da figura 24, verifica-se que nos comprimentos de onda iniciais, entre 350 nm e 500 nm, a quantidade de luz incidente é menor, tendendo a aumentar à medida que o comprimento de onda aumenta. FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 78 cumulativo da influência de todos os filtros óticos, em cada comprimento de onda do espectro. (a) (b) Figura 30: Espectro do efeito cumulativo resultante da superposição dos espectros de transmitância de todos os filtros óticos caracterizados experimentalmente, em cada comprimento de onda (obtidos pela área sob a curva de cada filtro), multiplicado pelo espectro de reflectância de GV e de GV infetados com o parasita da malária com diferentes níveis de parasitémia (12,5 a 50 parasitas/μL de glóbulos vermelhos) de P. falciparum, nos estados inicial (anéis) e avançado (trofozoitos) da doença: (a) fonte de luz branca; (b) fonte de luz com LEDs. FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 79 Os resultados de ambos os gráficos mostram que, entre 400 nm e 500 nm, não há diferença significativas entre as curvas relativas a GV saudáveis e GV infetados com malária. Nos comprimentos de onda entre 550 nm e 800 nm, começa a ser visível a distinção entre as curvas espectrais de GV saudáveis (vermelho) e GV infetados na fase inicial (azul) e avançada (verde) da doença, apesar desta diferenciação ser reduzida. De forma a clarificar os resultados apresentados nas figuras anteriores (29 e 30), avaliar a possibilidade de desenvolver algoritmos de deteção e diagnóstico, com base nos dados apresentados, e analisar o seu potencial para diagnóstico de malária, procedeu-se ao cálculo dos declives das retas entre alguns intervalos de comprimentos de onda, presentes nos dois gráficos da figura 29. Estes comprimentos de onda, diferentes para cada um dos casos, foram escolhidos através da observação dos gráficos acima referidos, tentando compreender intervalos nos quais as variações nos espectros fossem mais significativas entre as diferentes amostras. A figura 31 apresenta dois gráficos onde se apresentam os resultados desta abordagem: (a) corresponde aos declives das retas retirados do gráfico resultante quando é utilizada a fonte de luz branca (figura 29 (a)) e (b) contém os declives das retas do gráfico obtido quando a fonte de luz é a placa de LEDs (figura 30 (b)). (a) FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 80 (b) Figura 31: Gráfico de barras representativo dos declives das retas entre intervalos de comprimentos de onda obtidos a partir da figura 29, quando é utilizada: (a) a fonte de luz branca; (b) a placa de LEDs. Na figura 31 (a) verifica-se uma grande discrepância nos valores dos declives entre intervalos de comprimentos de onda, sendo que o primeiros e o terceiro intervalos apresentam valores mais elevados em comparação com o segundo e o último intervalos. Além disso, é possível visualizar-se uma variação nos declives em função das amostras, averiguando-se, em todos os casos, uma diminuição dos declives à medida que aumenta a concentração do parasita da malária nas amostras de GV. É de notar que esta variação é mais acentuada no intervalo de comprimentos de onda de 649 nm – 701 nm, onde se distinguem com maior facilidade as diferentes parasitémias. Uma análise semelhante pode ser realizada para o gráfico da figura 31 (b), em que se observa que o primeiro e o terceiro intervalos surgem com valores mais baixos, para os seus declives, relativamente aos valores do segundo e quarto intervalos. Neste caso, a diferenciação entre as várias concentrações de parasitas é mais visível, havendo, nos três últimos intervalos de comprimentos de onda, uma diminuição gradual dos valores dos declives em função do aumento da parasitémia. Por outro lado, no intervalo de 419 nm – 516 nm, a situação oposta é verificada, ocorrendo um aumento do declive com o aumento das concentrações do parasita. FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 81 Ao comparar os resultados obtidos nos dois gráficos averigua-se que, apesar das limitações encontradas na utilização da placa de LEDs previamente referidas, ambas as fontes de luz, com maior ou menor detalhe, permitem efetuar uma diferenciação das amostras de GV saudáveis e infetados, mostrando o potencial deste método para ser integrado num algoritmo de decisão para a deteção e diagnóstico de malária, baseados em declives nos espectros de reflectância. No entanto, é importante referir que um algoritmo de deteção deverá compreender, não só 4 intervalos entre comprimentos de onda, mas sim o máximo de informação possível entre os diversos comprimentos de onda disponíveis, de modo elevar, o mais possível, a sensibilidade e especificidade do algoritmo. Outros algoritmos poderiam ser considerados, nomeadamente com base na área sob a curva dos espectros. Os resultados obtidos permitem prever que, a partir de um número reduzido de filtros óticos, seja possível reconstruir parcialmente os espectros de reflectância de amostras saudáveis e infetadas com malária em diferentes parasitémias, apresentando elevado potencial para aplicação no dispositivo proposto. Nesta fase, recorde-se que a eficiência da deteção foi limitada pela baixa intensidade da luz emitida pela placa PCB com LEDs, o que poderá ser um foco de trabalho futuro a desenvolver neste trabalho. 6 CONCLUSÃO E TRABALHO FUTURO FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 83 Neste último capítulo, descrevem-se as considerações finais e as principais conclusões a reter de todo o trabalho realizado e apresentado nos capítulos anteriores. Além disso, são abordadas e propostas algumas etapas a serem consideradas como trabalho futuro, a realizar no âmbito da continuação do tema desta dissertação. CONCLUSÃO A presente dissertação integrou o projeto de investigação MalariaChip, pretendendo implementar um dispositivo ótico de reflectância, para diagnóstico de malária, com um limite de deteção até 12,5 parasitas/µL de glóbulos vermelhos, comparável com os melhores métodos de diagnóstico utilizados em campo. No trabalho realizado nesta dissertação, foi proposto o desenho, simulação e otimização de 16 filtros óticos passa-banda com largura de banda estreita e elevada seletividade num conjunto de comprimentos de onda específicos: 400, 435, 520, 590, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 700, 720, 740 e 800 nm. Cada um dos filtros óticos foi constituído por um conjunto de multicamadas alternadas de filmes finos de SiO2/TiO2, compatíveis com CMOS, capazes de serem depositados no topo de uma matriz de 16 fotodíodos de silício. Os filtros óticos de filmes finos são altamente sensíveis às propriedades e espessura dos materiais que os constituem, pelo que estas variáveis foram controladas, de modo a obter cada filtro ótico centrado no comprimento de onda pretendido. Para cada filtro ótico, estudou-se a sua resposta espectral, para diferentes índices de refração. As simulações realizadas para os filtros óticos, permitiram avaliar três tipos diferentes de índices de refração para SiO2 e TiO2. Inicialmente, foram utilizados índices de refração da base de dados de Sopra S.A., considerados como ideais para os materiais selecionados, tendo sido obtidas transmitâncias próximas de 100% e valores de FWHM menores que 10 nm. De seguida, procedeu-se ao desenho e simulação de filtros óticos utilizando os índices de refração considerados próximo dos seus valores reais de fabrico, adquiridos na base de dados refractiveindex.info101, tendo sido obtidos picos de máxima transmitância entre 90% e 100%, ligeiramente inferiores ao caso anterior, e FWHM superiores a 10 nm. Por fim, realizaram-se simulações utilizando índices de refração medidos em função da espessura projetada para cada camada, tendo sido adquiridas FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 84 transmitâncias óticas superiores a 90% e FWHM próximo de 10 nm. Finalmente, no sentido de verificar se os 16 filtros óticos, do segundo caso em estudo, viabilizariam a deteção de diferentes concentrações do parasita da malária, procedeu-se à combinação dos seus espectros de transmitância com os espectros de reflectância de glóbulos vermelhos saudáveis e glóbulos vermelhos infetados com níveis de parasitémia distintos. Com os resultados alcançados, concluiu-se que o sistema teria capacidade para distinguir entre amostras saudáveis e infetadas em diferentes estadios da doença, evidenciando o seu potencial como ferramenta de diagnóstico. Na impossibilidade de realizar o fabrico dos 16 filtros óticos simulados, e com o objetivo de confirmar as configurações e simulações efetuadas, procedeu-se à caracterização experimental da transmitância ótica de 8 filtros óticos passa-banda baseados em filmes finos, já existentes no laboratório do CMEMS, centrados em comprimentos de onda com valores próximos dos selecionados (397, 419, 516, 585, 603, 649, 701 e 746 nm). Para o efeito, foram medidas as respostas espectrais da sua transmitância ótica, em duas montagens experimentais diferentes, utilizando uma fonte de luz branca e uma placa constituída por 13 LEDs. A transmitância resultante é significativamente menor do que seria expectável e os valores de FWHM muito superiores a 10 nm. Uma vez mais, os espectros de transmitância resultantes dos ensaios experimentais foram combinados com os espectros de reflectância de amostras com diferente parasitémia, e os resultados comprovaram a distinção entre glóbulos vermelhos saudáveis e glóbulos vermelhos infetados com a doença, quer num estadio inicial, quer num estadio avançado. Assim, a capacidade de reconstruir parcialmente os espectros de reflectância originais foi verificada experimentalmente, a partir de um conjunto reduzido de filtros óticos baseados em filmes finos, na mesma gama espectral dos filtros simulados, tendo sido possível distinguir entre diferentes parasitémias, até um limite de deteção de 12,5 parasitas/μL de glóbulos vermelhos. Em suma, apesar de alguns desvios nos resultados simulados para as diferentes experiências dos filtros óticos (principalmente nos valores FWHM), o seu desempenho foi avaliado com sucesso, uma vez que foi possível obter alta transmitância ótica para cada um dos comprimentos de onda selecionados, tendo sido também possível distinguir os espectros óticos das diferentes amostras de GV. FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 85 TRABALHO FUTURO No seguimento do trabalho realizado na presente dissertação, para que o dispositivo a ser desenvolvido para o diagnóstico de malária seja bem sucedido, existe um conjunto de etapas a executar, desde o fabrico e caracterização experimental dos 16 filtros óticos desenhados e simulados, a implementação de um microssistema CMOS contendo uma matriz de 16 fotodíodos, a deposição dos filtros óticos sobre a matriz de fotodíodos e integração de todo o sistema de iluminação e controlo num mesmo sistema miniaturizado. Será ainda necessário ultrapassar as limitações do presente trabalho, nomeadamente: 1) Melhoria do protótipo da placa PCB de iluminação por LEDs, de modo a garantir uma iluminação em todo o espectro ótico de interesse. Esta melhoria poderá ser conseguida por alteração do número e tipo de LEDs a utilizar para cada região do espectro, ou ajuste no duty cycle no controlo por PWM. 2) Ensaios experimentais de reflectância, considerando os filtros óticos posicionados sobre um fotodíodo. No presente trabalho, foram considerados conjuntos de ensaios experimentais distintos (transmitância dos filtros óticos e reflectância das amostras), pelo que, no seguimento desta análise, será importante averiguar experimentalmente se os filtros óticos mantêm a capacidade de selecionar a luz para os comprimentos de onda de interesse, continuando a permitir distinguir as amostras quando se mede a sua reflectância. Foram efetuados, no decorrer do trabalho, alguns ensaios preliminares desta montagem experimental. No entanto, os resultados obtidos foram inconsistentes, tendo sido observada alguma reflectância dos filtros óticos (não expectável) pelo que será importante ultrapassar esta limitação. Uma vez ultrapassadas as limitações descritas, o fabrico dos 16 filtros óticos estudados consistirá no passo seguinte do desenvolvimento. Neste sentido, os filtros óticos simulados poderão ser depositados por técnicas de PVD (do inglês Physical Vapor Deposition)104, como por exemplo sistemas de pulverização catódica105 ou sistemas de deposição por feixe de iões (IBD)100. No primeiro caso, ocorre deposição física de vapores através do bombardeamento do alvo com um feixe de iões para extrair FILTROS ÓTICOS BASEADOS EM FILMES FINOS PARA IMPLEMENTAÇÃO NUM SISTEMA DE ESPECTROSCOPIA PARA O DIAGNÓSTICO DE MALÁRIA 86 moléculas da sua superfície e depositá-las no substrato105. A segunda técnica consiste no processo de aplicar materiais a um alvo através da incidência de um feixe de partículas carregadas de iões, permitindo que outros iões sejam acelerados, focados ou desviados usando altas tensões ou campos magnéticos106. Esta técnica inclui uma fonte integrada de iões com sputtering para a realização da pré-limpeza e a limpeza in-situ, o etching e uma deposição controlada100. Todos estes processos deverão ser cuidadosamente monitorizados e controlados, com o intuito de obter camadas uniformes e com espessura o mais próximo possível da desejada. A caracterização final dos filtros óticos, ao nível da sua estrutura, morfologia e qualidade das interfaces, poderá ser realizada através de imagens SEM (do inglês Scanning Electron Microscope)82. A etapa que se seguirá, e que está atualmente sob desenvolvimento por outros investigadores do grupo de investigação do projeto, consiste no fabrico de uma matriz de 16 fotodíodos (4x4) utilizando a tecnologia CMOS81. No mesmo microchip, será integrada a eletrónica de leitura, e por cima da matriz de fotodíodos serão depositados os respetivos filtros óticos. Finalmente, a miniaturização do sistema vai permitir a criação de um dispositivo de deteção automática com LEDs específicos, desencadeando novas perspetivas nos métodos de diagnóstico de malária e alcançando limites de deteção inferiores aos comercialmente existentes. 87 REFERÊNCIAS 1. Costa MS, Baptista V, Minas G, Veiga MI, Catarino SO. Effect of the materials ’ properties in the design of high transmittance and low FWHM SiO2 / TiO2 thin film optical filters for integration in a malaria diagnostics device. In: Proceedings of Biodevices 2021. ; 2021. 2. Pham NM, Karlen W, Beck HP, Delamarche E. Malaria and the “last” parasite: How can technology help? Malaria Journal. 2018;17(1):1-16. doi:10.1186/s12936-0182408-0 3. Karnad DR, Nor MBM, Richards GA, Baker T, Amin P. Intensive care in severe malaria: Report from the task force on tropical diseases by the World Federation of Societies of Intensive and Critical Care Medicine. Journal of Critical Care. 2018;43:356-360. doi:10.1016/j.jcrc.2017.11.007 4. Mer M, Dünser MW, Giera R, Dondorp AM. Severe malaria. Current concepts and practical overview: What every intensivist should know. Intensive Care Medicine. 2020;46(5):907-918. doi:10.1007/s00134-020-06019-0 5. World Health Organization. WHO, World Malaria Report 2020. Geneva, Switzerland; 2020. 6. Silva I. Study and Spectrophotometric Characterization of Malaria Biomarkers. Mestrado em Micro e Nanotecnologias, Universidade do Minho, Braga; 2016. 7. Gitta B, Kilian N. Diagnosis of Malaria Parasites Plasmodium spp. in Endemic Areas: Current Strategies for an Ancient Disease. BioEssays. 2020;42(1):1-12. doi:10.1002/bies.201900138 8. Ives J. Malaria’s characteristic cycle of fever and chills is a result of parasite’s own influence. 2020. https://www.news-medical.net/news/20200515/Malariascharacteristic-cycle-of-fever-and-chills-is-a-result-of-par asites-owninfluence.aspx. 9. Kochar DK, Tanwar GS, Khatri PC, et al. Clinical features of children hospitalized with malaria - A study from Bikaner, Northwest India. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 2010;83(5):981-989. doi:10.4269/ajtmh.2010.09-0633 10. White NJ. Artesunate versus quinine for treatment of severe falciparum malaria: A randomised trial. Lancet. 2005;366(9487):717-725. doi:10.1016/S01406736(05)67176-0 11. Luo Z, Sullivan SA, Carlton JM. The biology of plasmodium vivax explored through genomics. Annals of the New York Academy of Sciences. 2015;1342(1):53-61. doi:10.1111/nyas.12708 94 doi:10.1117/1.2931078 90. Macleod A. Optical Thin Films. Handbook of Thin Film Deposition: Fourth Edition. 2018:379-416. doi:10.1016/B978-0-12-812311-9.00012-8 91. Brown JQ, Vishwanath K, Palmer GM, Ramanujam N. Advances in Quantitative UV-Visible Spectroscopy for Clinical and Pre-clinical Application in Cancer. Current Opinion in Biotechnology. 2009;20:pp.119-131. 92. M. F. S. Ferreira. Óptica e Fotónica. Lisboa: Lidel; 2003. 93. Pimenta S. Optical Microsystem for Spectroscopy Signals Extraction Applied to Gastrointestinal Dysplasia Detection. PhD em Engenharia Biomédica, Universidade do Minho, Braga; 2016. 94. D. Evers, Hendriks B, Lucassen G, Ruers T. Optical spectroscopy: current advances and future applications in cancer diagnostics and therapy. Future oncology. 2012;8:307-320. 95. Erdogan T, Wang L, Clarke G. Optical filter and fluorescence spectroscopy system incorporation the same, US 6,809859 B2. 2004. 96. Ferreira DS dos S. Spectroscopy Systems for the Detection of Gastrointestinal Dysplasia. PhD em Bioengenharia, Universidade do Minho, Braga; 2011. 97. Correia JHG. Optical Microsystems in Silicon Based on a Fabry-Perot Resonance Cavity.; 1999. 98. Barybin A, Shapovalov V. Substrate effect on the optical reflectance and transmittance of thin-film structures. International Journal of Optics. 2010;2010:20-27. doi:10.1155/2010/137572 99. K. L. Chopra. Thin Film Phenomena. 1st ed. McGraw-Hill Book Company; 1969. 100. Pimenta S, Cardoso S, Castanheira EMS, Minas G. Advances towards a miniaturized optical system for gastrointestinal cancer detection using diffuse reflectance and fluorescence spectroscopies. Gastrointestinal Cancers: Prevention, Detection and Treatment. 2016;1:313. 101. Polyanskiy M. Refractive Index Database. https://refractiveindex.info/. Accessed May 20, 2020. 102. Software Spectra I. Software Spectra, Inc. 103. TFCalc. Thin Film Design Software for Windows. 2002;(503). 104. Mattox DM. Handbook of Physical Vapor Deposition (PVD) Processing: Film Formation, Adhesion, Surface Preparation and Contamination Control. Noyes Publications; 1998. 105. Carmo JP, Correia JH. Introdução Às Microtecnologias No Silício. LIDEL; 2020. 106. Stout DA, Durmus NG, Webster TJ. Synthesis of Carbon Based Nanomaterials for Tissue Engineering Applications. Woodhead Publishing Limited; 2013. doi:10.1533/9780857097231.1.119 95 ANEXOS ANEXO 1 A tabela que se segue apresenta os valores de FWHM dos 16 filtros óticos simulados, quando são aplicados os índices de refração de Sopra S.A., de refractiveindex.info101 e os que são calculados com dependência da espessura das camadas. Tabela 9: Cálculo da FWHM dos espectros de máxima transmitância para cada um dos 16 filtros óticos simulados (representação estrutural na tabela 4), utilizando os índices de refração de Sopra S.A., de refractiveindex.info e do trabalho desenvolvido por Pimenta et al.82. Filtro ótico (nm) Sopra S.A. refractiveindex.info n VS espessura Metade do valor do pico máximo (%) FWHM (nm) Metade do valor do pico máximo (%) FWHM (nm) Metade do valor do pico máximo (%) FWHM (nm) 400 47,862 2 47,944 11 48,216 8 435 47,874 2 47,967 13 47,875 7 520 47,889 3 48,185 22 48,125 12 590 47,968 6 47,979 25 47,925 13 610 48,084 7 48,168 28 48,049 15 620 48,153 8 48,287 31 48,132 22 630 47,996 6 48,016 28 48,079 18 640 47,936 6 47,948 30 47,998 15 650 47,903 6 47,898 30 47,939 16 660 47,888 6 47,877 29 47,899 16 670 47,870 6 47,874 28 47,877 16 680 47,863 7 47,892 29 47,870 15 700 47,882 7 47,988 32 48,216 8 720 47,917 7 48,147 37 47,875 7 740 47,878 8 47,939 34 48,125 12 800 47,918 9 47,949 39 47,925 13 96 ANEXO 2 As figuras que se seguem correspondem às respostas espectrais da transmitância ótica resultante de cada um dos 16 filtros óticos após a sua simulação no TFCalc. As figuras 32, 33 e 34 correspondem aos gráficos com as respostas dos filtros óticos simulados considerando, respetivamente, os índices de refração da base de dados de Sopra S.A., da base de dados refractiveindex.info101 e os índices de refração calculados a partir da espessura de cada camada de filme fino. (a) (b) (c) (d) (e) (f) 97 (g) (h) (i) (j) (k) (l) (m) (n) 98 (o) (p) Figura 32: Resposta espectral dos 16 filtros óticos simulados, utilizando os índices de refração de Sopra S.A.. Cada filtro é centrado: (a) 400 nm; (b) 435 nm; (c) 520 nm; (d) 590 nm; (e) 610 nm; (f) 620 nm; (g) 630 nm; (h) 640 nm; (i) 650 nm; (j) 660 nm; (k) 670 nm; (l) 680 nm; (m) 700 nm; (n) 720 nm; (o) 740 nm; (p) 800 nm. (a) (b) (c) (d) (e) (f) 99 (g) (h) (i) (j) (k) (l) (m) (n) 100 (o) (p) Figura 33: Resposta espectral dos 16 filtros óticos simulados, utilizando os índices de refração de refractiveindex.info101. Cada filtro é centrado: (a) 400 nm; (b) 435 nm; (c) 520 nm; (d) 590 nm; (e) 610 nm; (f) 620 nm; (g) 630 nm; (h) 640 nm; (i) 650 nm; (j) 660 nm; (k) 670 nm; (l) 680 nm; (m) 700 nm; (n) 720 nm; (o) 740 nm; (p) 800 nm. (a) (b) (c) (d) (e) (f) 101 (g) (h) (i) (j) (k) (l) (m) (n) 102 (o) (p) Figura 34: Resposta espectral dos 16 filtros óticos simulados, utilizando os índices de refração experimentais retirados de Pimenta et al.82. Cada filtro é centrado: (a) 400 nm; (b) 435 nm; (c) 520 nm; (d) 590 nm; (e) 610 nm; (f) 620 nm; (g) 630 nm; (h) 640 nm; (i) 650 nm; (j) 660 nm; (k) 670 nm; (l) 680 nm; (m) 700 nm; (n) 720 nm; (o) 740 nm; (p) 800 nm. 103 ANEXO 3 Espectros resultantes da multiplicação dos espectros de transmitância ótica dos 16 filtros óticos simulados (indicados nas legendas) pelos espectros de reflectância de GV saudáveis e GV infetados com diferentes concentrações do parasita da malária em dois estados da doença, em particular o inicial (anéis) e avançado (trofozoitos). Considerouse, para os resultados seguintes, o conjunto de índices de refração da base de dados refractiveindex.info101. (a) (b) (c) (d) (e) (f)