Estudio de las interacciones de nanopartículas aniónicas de oro con ADN y sus monómeros constituyentes

Tesis Doctoral Química Estudio de las Interacciones de Nanopartículas Aniónicas de Oro con ADN y sus Monómeros Constituyentes Autor: José María Carnerero Panduro Director: Rafael Prado Gotor Profesor Titular de la Universidad de Sevilla Dpto. de Química Física Facultad de Química Universidad de Sevilla Sevilla, 2016 ii iii Tesis doctoral: Estudio de las Interacciones de Nanopartículas Aniónicas de Oro con ADN y sus Monómeros Constituyentes. Autor: José María Carnerero Panduro Director: Rafael Prado Gotor El tribunal nombrado para juzgar el Proyecto arriba indicado, compuesto por los siguientes miembros: Presidente: Vocales: Secretario: Acuerdan otorgarle la calificación de: En Sevilla, a de septiembre de 2017 El Secretario del Tribunal iv v A todas aquellas personas que me han apoyado durante estos cuatro año.…… vi vii Resumen En la presente Tesis Doctoral se desarrolla un estudio exhaustivo de la agregación de nanopartículas de oro (AuNPs) provocada por la interacción con las distintas unidades monoméricas del ADN, así como el efecto protector de ADN polimérico tanto de hebra doble como simple a la aglomeración inducida por una sal inerte. Se ha establecido un orden de afinidad para las nucleobases a partir de la determinación de valores de energías libres correspondientes al proceso de adsorción, obtenidos por tres procedimientos diferentes. Dicho estudio se ha extrapolado también a la adenosina y a la adenosina monofosfato, donde la agregación fue menor conforme aumentó el grado de complejidad del monómero; sin embargo, el no observarse aglomeración de nanoclusters no es sinónimo de no adsorción, hecho que se ha comprobado en el caso del nucleótido. La fuerza impulsora que diferencia el grado de agregación entre la adenosina neutra o cargada y el AMP es de carácter marcadamente electrostático. Se ha desarrollado paralelamente un método colorimétrico de detección de ADN de cadena larga tomando como punto de referencia el color azul de la banda de plasmón correspondiente a nanopartículas agregadas. Para ello fue necesaria la optimización de la cantidad de sal a añadir para desestabilizar al coloide, el orden de adición de los diferentes componentes así como el tamaño de la nanopartícula. A diferencia de los oligonucleótidos, donde sólo hay protección contra la agregación inducida por un electrolito para los de cadena simple, se observó un aumento del grado de dispersión del sistema coloidal conforme aumentó la concentración del biopolímero. Así mismo, técnicas como la miscroscopía de fuerza atómica, medidas de viscosidad o de dispersión dinámica de luz, entre otras, confirman que la mera presencia de nanopartículas aniónicas provoca cambios estructurales en el polinucleótido. Estos cambios reducen la estabilidad del ADN, provocando una preferencia por interaccionar con los cationes sodios y protegiendo a las nanopartículas de la agregación. Por otro lado se han obtenido complejos ADN-nanopartículas similares en conformación y estructura a las histonas sin necesidad de funcionar la nanopartícula o dotarla de carga positiva, trabajando a diferentes temperaturas y corroborando a través de espectros de dicroísmo circular que el ADN mantiene una conformación similar a la nativa. viii ix In the present PhD. Thesis, a thorough study of gold nanoparticles’ (AuNPs) interaction, and the nanocluster aggregation induced by it, with different DNA monomeric units has been carried out. A protective effect of polymeric DNA, either double or single stranded, for inert salt-induced agglomeration has been found and explored. An affinity order has been established for the nucleobases based on the determination of their adsorption processes’ free energy values, calculated by three different methods. This study has been also extrapolated to adenosine and adenosine monophosphate (AMP), and a lesser aggregation grade was found as the complexity grade of the monomer increased. However, experimental results for adenosine prove that the absence of aggregation-induced color changes does not imply an absence of monomer-particle interactions. The reactivity differences between neutral or charged adenosine and AMP are distinctly charge-based. A colorimetric method for the detection of long DNA molecules has been concurrently developed, taking as reference point the blue color of plasmon band of aggregated NPs. The optimization of added salt concentrations, as well as the addition order for the different components and the nanoparticle size, were key parts of this study. In contrast to oligonucleotides, where a degree of electrolyte-induced aggregation protection has only been described for single stranded DNA, in our case an increase of the dispersion grade of the colloidal system was observed when the biopolymer concentration rose. Techniques like atomic force microscopy, viscosity measures or light scattering dynamic, among others, support that the mere presence of anionic nanoparticles induces structural changes in the polynucleotide. These changes reduce DNA stability, and in turn increase its affinity for Na+ cations, reducing their concentration on the medium and protecting the anionic-protected particles from aggregation. Finally, DNA-nanoparticles complexes with remarkable similarities in both conformation and structure to histones have been obtained, without the need to functionalize or change the particle’s charge. This work has been carried out at different temperatures, and the DNA has been found to present a conformation not dissimilar to its native form by employing circular dichroism measurements. Abstract xvi 6. Conclusions ......................................................................................................................... 183 7. Conclusiones ........................................................................................................................ 185 Referencias bibliográficas ...................................................................................................... 187 Publicaciones, aportaciones a congresos y estancias ........................................................... 199 Anexo 1: Cálculo del número de bases por nanopartícula participantes en la adsorción ................................................................................................................................ 201 Anexo 2: Estimación del peso molecular del ADN de calf thymus ..................................... 206 Índice de Figuras .................................................................................................................... 207 Índice de Tablas ...................................................................................................................... 223 17 1.1. Nanopartículas de oro 1.1.1. Importancia de las nanopartículas en la nanociencia La nanociencia y nanotecnología son actualmente los campos más prolíficos y prometedores de la ciencia e industria. Sin embargo, a pesar de ser un campo de estudio tan moderno, los beneficios de la nanotecnología han estado presentes en todo el mundo desde hace ya bastantes siglos. Así por ejemplo, la tinta china (2000 a.C.) no es más que una dispersión coloidal de nanopartículas de carbono en una mezcla de agua y gelatina.1 Otro curioso ejemplo es la copa de Licurgo (siglo IV d.C.), que presenta diferente color según la luz sea reflejada (verde) o trasmitida desde el interior de la copa (rojo) debido a la presencia de nanopartículas de plata y oro en el cristal de la misma.2 O así las famosas espadas de Damasco (siglo IX d.C.), cuyo filo era tan famoso como codiciado ya que podía atravesar armaduras y era considerado eterno, presentaban nanotubos de carbono.3 Una de las herramientas básicas de la nanociencia son las nanopartículas. Entendiendo nanopartícula (NP) como “cualquier partícula sólida que tiene al menos una dimensión en la nanoescala (de 1 a 100 nm), compuesta entre unos cien a unos miles de átomos”.4 El principal interés por las nanopartículas se debe a que las propiedades que presentan son intermedias a la de los átomos individuales y a la de su correspondiente estado macroscópico (bulk), además sus propiedades se rigen por las reglas de la mecánica cuántica por el tamaño que tienen. Por ejemplo, las nanopartículas de metales nobles (cobre, plata u oro) presentan colores totalmente diferentes a los de sus respectivos metales. Esta diferencia de propiedades hace a las NPs idóneas para la realización de complejas tareas como: rápida descomposición de agentes contaminantes, interacción selectiva y sensible con biomoléculas, mejora de la conversión de la luz en corriente eléctrica o almacenamiento de energía.5 Dada la ambigüedad de la definición de nanopartícula, existen múltiples formas para su clasificación. Sin embargo, el más habitual es clasificarlas por su composición química, ya que ésta afecta tanto a la estabilidad de la nanopartícula como a las propiedades ópticas y magnéticas.6 Según este criterio, se pueden distinguir en: metálicas, semiconductoras, 1. Introducción Capítulo 1: Introducción 18 dieléctricas, poliméricas, de carbono y de biomoléculas. Aunque el abanico de posibilidades que existen es bastante amplio, las nanopartículas de metales nobles (y más concretamente las de oro) han sido las más explotadas ya que se pueden adaptar a múltiples aplicaciones. 1.1.2. Propiedades de las nanopartículas de oro A pesar de las propiedades eléctricas, magnéticas y catalíticas que el oro coloidal (AuNP) presenta,7 son sus propiedades ópticas las que han provocado el interés por éstas, que combinadas con la facilidad química que tiene el oro para anclar diferentes grupos funcionales, han permitido el desarrollo de aplicaciones pioneras en el campo del bioanálisis y de la medicina. 1.1.2.1. Resonancia del Plasmón Superficial La banda de absorción tan intensa que caracteriza a las nanopartículas de los metales nobles recibe el nombre de Banda de Plasmón Superficial (SPB) o banda de la Resonancia del Plasmón Superficial (banda SPR); ambos nombres se pueden encontrar en la bibliografía científica, aunque bien es cierto que en los últimos años existe una tendencia a unificar el nombre a banda SPR. El origen de dicha banda radica en la interacción de los campos electromagnéticos de la luz con los electrones de la banda de conducción que se encuentra en la superficie, produciéndose la oscilación de esta nube electrónica (véase Figura 1.1). El principal interés de la banda SPR es que sus propiedades (intensidad, posición y anchura) están fuertemente influenciadas por el material, el tamaño, la forma, la polaridad del entorno e incluso la distancia entre partículas, lo que ha dado origen a multitud de aplicaciones de las nanopartículas metálicas. Figura 1.1. Oscilación de la nube electrónica de nanoesferas metálicas en presencia del campo eléctrico de un haz de luz incidente. Reimpreso con permiso de K. L. Kelly, E. Coronado, L. L. Zhao, G. C. Schatz, J. Phys. Chem. B, 2003, 107, 668-677.8 Copyright 2003 American Chemical Society. 19 Así por ejemplo, las AuNPs presentan una banda de absorción en torno a 520 nm mientras que las de plata (AgNPs) la tienen sobre 410 nm. Pero a pesar de que las AgNPs son las que exhiben una banda más estrecha e intensa entre todos los metales,9 son las de oro las que han sido ampliamente estudiadas y utilizadas debido a su naturaleza inerte y biocompatilidad,10,11 lo que hace a estas nanopartículas ser excelentes para aplicaciones biomédicas. Respecto al tamaño, ya Michael Faraday en 1857 postuló que el color de la dispersión depende del tamaño del coloide.12 De hecho, conforme mayor es la nanopartícula a longitudes de onda mayores se encontrará la banda SPR,13,14 mientras que partículas inferiores a los 2 nm no exhiben dicha banda.15 Por otra parte, controlar la forma permite ajustar el espectro de absorción desde el visible hasta el IR,16 ya que se modifica la polarización de la nanopartícula. Un aumento en el número de lados conlleva un desplazamiento a longitudes de onda mayores mientras que un aumento de la simetría implica potenciar la intensidad.9 Por ello las nanopartículas no esféricas tienden a exhibir diversas bandas a longitudes de ondas mayores a las que presentan las NP esféricas. Esta versatilidad ha proliferado en la obtención de triángulos, cubos, prismas, nanorods o nanocorazas, entre algunos ejemplos. En cuanto a la polaridad del entorno, ésta influye en el campo electromagnético que siente la nanopartícula como queda reflejado en la ley de Coulomb a través de la permitividad del medio: cuanto más hidrofóbico sea el disolvente, a mayor longitud de onda se encontrará la banda SPR.17 Dado que las nanopartículas en disolución no suelen estar desnudas (este aspecto se desarrollará más adelante en el apartado 1.1.2.3), se esperaría que la polaridad del agente protector que cubre la superficie de la molécula afecte a la banda SPR; sin embargo se ha comprobado experimentalmente que la influencia es casi despreciable.14 Más interesante resulta el efecto que ejerce el ligando, ya sea el que forma la capa protectora de la nanopartícula o un agente interaccionante externo, si provoca cambios según sea donador o aceptor de electrones. Dado a que la banda SPR es un efecto de la oscilación de la nube electrónica, la densidad electrónica que la compone juega un papel fundamental; de manera que una adición de electrones produce un desplazamiento de la banda SPR a longitudes de onda menores mientras la sustracción de electrones conlleva desplazamientos a longitudes de onda mayores.18,19 Por último, la influencia de la distancia entre partículas se debe al acoplamiento electromagnético que se provocan entre ellas, de manera que cuanto más cerca se encuentran éstas más complicado se vuelve el espectro de absorción (aparición de nuevas bandas) con desplazamientos de los espectros a mayores longitudes de onda.20 De hecho dicho acoplamiento llega a ser efectivo cuando la distancia es inferior a 5 veces el radio de las partículas (d ≤ 5r, donde d es la distancia entre partículas y r el radio de las mismas).21 Esta dependencia con la distancia de la banda SPR (y por lo tanto del color de la disolución coloidal) ha sido el pilar fundamental de gran parte de los sensores colorimétricos desarrollados con AuNPs.22 Capítulo 1: Introducción 20 1.1.2.2. Predicción del comportamiento de la banda SPR: teoría de Mie El entender tanto la naturaleza como la dependencia de la banda SPR con los parámetros que definen a la nanopartícula y al entorno es posible a través de la teoría de Mie. En 1908, Gustav Mie aplicó las ecuaciones de Maxwell para la difracción de la luz por una esfera, estableciendo las condiciones de contorno apropiadas.23 Dicha teoría atribuye la banda SPR de nanoesferas a oscilaciones de dipolos, los cuales son originados por la creación de carga en la superficie: zonas donde se concentre la nube electrónica genera puntos de carga negativa y su ausencia zonas de carga positiva.15 La solución obtenida por Mie no sólo ha permitido comprender la forma de la banda SPR, sino también la obtención de los espectros de absorción teóricos de las nanopartículas. Las suposiciones de partida que estableció Mie para la resolución de las ecuaciones de Maxwell fueron clave, sin embargo también son las que establecen las limitaciones de la propia teoría. Las principales consideraciones son las siguientes:20 I. Las partículas son esferas perfectas. Las ecuaciones de Maxwell se pueden resolver para diferentes formas, pero obviamente la solución obtenida para cada forma es diferente. Prueba de ello es la teoría de Gans, que no es más que una extensión de la teoría de Mie para partículas que se desvían de formas esféricas (como los nanorods).24,25 II. La partícula se encuentra aislada, en ausencia de otras partículas análogas a éstas, de manera que en su entorno cercano sólo se encuentran las moléculas de disolvente. Por ello, con la teoría de Mie se obtiene la sección eficaz de extinción de una esfera (σext). El motivo de este supuesto radica en que si las partículas se encuentran próximas, los campos electromagnéticos que generan sus propias nubes electrónicas afectarían a las partículas vecinas aumentando la complejidad del sistema. III. La partícula y el entorno son homogéneos de por sí y pueden describirse por las correspondientes funciones ópticas dieléctricas del material en forma macroscópica (bulk). En el caso del medio envolvente, dicho parámetro se puede considerar independiente de la velocidad angular de la radiación electromagnética incidente ( ) y por lo tanto, constante; sin embargo, en el caso de la partícula metálica, la función presenta una componente real y otra imaginaria, las cuales dependen de la velocidad angular del campo electromagnético: 1.1 Para expresar dicha función en parámetros conocidos, es necesario el modelo de Drude, el cual describe el movimiento de electrones libres en un metal.2,20 21 IV. El tamaño de la partícula es mucho menor que la longitud de onda de la radiación incidente (λ >> 2r), así todos los electrones confinados en la nanopartícula sienten el mismo campo eléctrico en un instante determinado t (aproximación cuasiestática).15 De esta forma se origina el dipolo mencionado en el apartado anterior (véase Figura 1.2). Figura 1.2. Influencia del tamaño de la nanopartícula en el campo eléctrico sentido por la nube electrónica, donde E representa la componente del campo eléctrico y x la dirección de propagación de la luz. Cuando la nanopartícula es mucho más pequeña que la longitud de onda de la luz incidente (λ >> 2r), se puede considerar que en cualquier punto de la nube electrónica el campo electromagnético es el mismo, formándose un dipolo (A). Sin embargo, cuando la nanopartícula no es lo suficientemente pequeña el campo no es homogéneo, originándose múltiples dipolos en lugar de un único dipolo. A partir de las aproximaciones antes mencionadas, la teoría de Mie se puede reducir a la siguiente ecuación:20,26 1.2 donde σext es la sección eficaz de extinción de la partícula, V es el volumen de la misma, c la velocidad de la luz, es la función óptica dieléctrica del medio, es la parte real y es la parte imaginaria de la función dieléctrica del metal que constituye a la partícula (véase ecuación 1.1). Si se tiene en cuenta la relación que existe entre la longitud de onda y la velocidad angular de la luz, así como la definición matemática del volumen de una esfera, se obtiene: 1.3 donde r es el radio de la partícula y λ es la longitud de onda de la luz incidente. Si el lector está interesado en profundizar más en el desarrollo de la ecuación 1.3, puede consultar la revisión (A) (B) Capítulo 1: Introducción 22 Interparticle Coupling Effect on the Surface Plasmon Resonance of Gold Nanoparticles: From Theory to Applications (referencia 20). Tanto la ecuación 1.2 como la 1.3, permite la justificación de las diferentes características que presenta la banda SPR según los parámetros que definen el sistema. Así por ejemplo, la posición del máximo viene determinada por la condición de resonancia (frecuencia de Fröhlich),2,9 la cual depende del material con el que está hecha la partícula. En el caso de las nanopartículas de oro y plata, dicha condición se produce en el rango visible del espectro electromagnético. La influencia del tamaño en la intensidad es fácilmente visible en dicha ecuación, ya que dicho parámetro está incluido a través del radio. Sin embargo, no es tan intuitivo el apreciar su efecto en la posición y en el ancho de la banda ya que se debe a modificaciones de la función dieléctrica del metal, lo que implica también un cambio en el valor de la frecuencia de Fröhlich. También se puede explicar la influencia de la polaridad del disolvente donde se encuentra dispersa la nanopartícula, no sólo por la presencia de la constante dieléctrica del medio en la ecuación ( ) sino por ser determinante a la hora de establecer la condición de resonancia.17 Respecto a la influencia de la capacidad oxidativa o reductora del ligando que interacciona con la NP, la interpretación no es directa e incluye cierta complejidad, ya que modificar la densidad electrónica de la NP conlleva cambiar la función dieléctrica óptica de la misma. En cualquier caso, la teoría de Mie también encaja con los resultados experimentales.2 A pesar de explicar con bastante exactitud los distintos cambios que puede sufrir la banda SPR, la teoría de Mie no se puede aplicar a todos los casos ya que, como se indicó anteriormente, las propias condiciones establecen unas determinadas limitaciones: I. La premisa de que la partícula se encuentra aislada sólo es válida para disoluciones muy diluidas así como la teoría de Mie no se puede aplicar para complejos formados por varias nanopartículas así ni tampoco puede considerar el efecto del proceso de acercamiento entre éstas. Para describir estructuras más complejas se han de recurrir a métodos más modernos como la Aproximación del Dipolo Discreto (DDA) o el Método del Dominio de Tiempo de Diferencia Finita (FDRD).20 II. Las partículas no son esferas perfectas debido a las irregulares en la forma y defectos que suelen presentan las nanoesferas. No obstante existen modificaciones de la teoría de Mie que permiten corregir la desviación de la esfericidad como la ya mencionada teoría de Gans. 24,25 III. El tamaño también limita bastante el empleo de la teoría de Mie. Por una parte, cuando las partículas son grandes, no se puede aplicar la aproximación de los dipolos (o del estado cuasiestático) ya que la componente electromagnética sería diferente según el 23 punto de la partícula, por no decir que la dispersión predominaría frente a la absorción (véase Figura 1.3). Por otra parte, conforme más pequeñas sean las nanopartículas más diferente será la función dieléctrica óptica de la correspondiente al bulk de dicho material, por ello no se puede aplicar a partículas muy pequeñas. Figura 1.3. Influencia del tamaño de esferas de oro en las secciones eficaces de extinción (línea continua verde), absorción (línea discontinua roja) y dispersión (línea punteada negra). El espectro A corresponde a un diámetro de 20 nm, donde la dispersión es nula; el espectro B es de AuNPs de 40 nm, donde la dispersión influye levemente; el espectro C muestra una dispersión casi similar a la absorción cuando el tamaño es 80 nm. Reimpreso con permiso de P. K. Jain, K. S. Lee, I. H. El-Sayed, M. A. El-Sayed, J. Phys. Chem. B, 2006, 110, 7238-7248.16 Copyright 2006 American Chemical Society. A pesar de todos estos inconvenientes, la solución de Mie a las ecuaciones de Maxwell es la más empleada en los estudios teóricos de los cambios en la banda SPR, ya que permite obtener los espectros de absorción de las nanopartículas en un amplio rango de tamaños, materiales y disolventes con bastante fiabilidad. En la subsección 3.5.2, correspondiente a los efectos provocados por alcoholes tetraédricos en fenómenos de agregación de AuNPs, se describe el uso de software específico basado en la ecuación de Mie para la simulación de los espectros de plasmones superficiales de las nanopartículas de oro. 1.1.2.3. Estabilidad de las nanopartículas Las AuNPs presentan una tendencia natural a agregarse ya que las fuerzas de van der Waals que las diferentes nanopartículas se ejercen entre sí favorece el contacto de sus superficies provocando la fusión de sus núcleos. Desde un punto de vista cinético, la agregación viene dominada por la facilidad que tendrán las partículas para colisionar entre ellas, las cuales presentan movimientos brownianos. Esta inestabilidad inherente de los coloides hace que sea Capítulo 1: Introducción 24 necesaria la adsorción (o al menos la presencia) de moléculas estabilizadoras en la superficie como aminas, tioles, fosfinas, etc…, que muchas veces llevan implícita la propia funcionalización de la nanopartícula.7 Los tipos de estabilización se pueden clasificar en tres: electrostática, estérica o electroestérica (véase Figura 1.4).22 Cuando pequeñas moléculas cargadas cubren la superficie de la NP se produce una estabilización electrostática, ya que las repulsiones originadas por las cargas de mismo signos mantienen a las partículas alejadas. Ésta es la estabilización más común, donde normalmente son moléculas de citrato las que se colocan en la superficie confiriéndole carga negativa.27 Sin embargo, si es una molécula voluminosa pero sin carga (como un polímero) lo que cubre la superficie, el impedimento estérico que generan las moléculas poliméricas hace que los núcleos del coloide no puedan llegar a estar en contacto previniendo así la agregación (estabilización estérica). Algunos ejemplos de moléculas que ejercen este tipo de estabilización son el poli(etilenglicol) (PEG) o los dendrímeros.28,29 Si se tratara de un polielectrolito, la estabilización sería una combinación de las dos antes citada; el ADN es la molécula por excelencia para estabilizar electroestéricamente.30,31 Figura 1.4. Diferentes tipos de estabilización de nanopartículas: a) estabilización electrostática a partir de moléculas cargadas; b) estabilización estérica a partir de la funcionalización de la NP con polímeros o macromoléculas; c) estabilización electroestérica a partir de la funcionalización de la NP con polielectrolitos. Reimpreso con permiso de W. Zhao, M. A. Brook, Y. Li, ChemBioChem, 2009, 9, 2363-2371.22 Copyright 2008 John Wiley and Sons. Una variación en las condiciones del medio, como un cambio en la polaridad del disolvente o de la fuerza iónica, o la introducción de un reactivo puede provocar la agregación del coloide. Este control de la aglomeración es el pilar de los múltiples sensores desarrollados con AuNPs. Según el mecanismo, se puede distinguir entre agregación por entrecruzamiento de partículas o agregación de no cruzamiento.22 La agregación de entrecruzamiento hace alusión cuando un reactivo con múltiples sitios de unión interacciona con las moléculas que cubren la NP, de manera que dicho reactivo hace de nexo para los diferentes clusters; aunque también se aplica este término cuando un grupo de NPs presenta en su superficie moléculas receptoras y el 25 otro grupo presenta la molécula que interacciona o molécula complementaria. Por otra parte, la agregación sin cruzamiento consiste en la destrucción de la estabilidad, es decir, a modo de ejemplo, en el caso de la estabilización electrostática, consistiría en el apantallamiento de las cargas o de la expulsión de la superficie de las moléculas cargadas; según la teoría Derjaguin- Landau-Vervey-Overbeek (DLVO), no es necesaria la pérdida total de la carga superficial, sino la suficiente cantidad para que las fuerzas de van der Waals superen la repulsión electrostática.32 En el caso de los polímeros, el desplazamiento de estos o la adición de algún agente que provoque la rotura o un cambio estructural puede inducir a la agregación. Es importante resaltar que la agregación inducida sin entrecruzamiento es más rápida que por entrecruzamiento, debido a los mecanismos por lo que tiene lugar la agregación. En la agregación de entrecruzamiento la cinética está dominada principalmente por las colisiones aleatorias entre partículas, las cuales dependen de un movimiento browniano lento, mientras que la agregación de no entrecruzamiento está dominada por las fuerzas atractivas de Van der Waals, las cuáles se ejercen desde una determinada distancia .20 1.1.3. Interés científico y tecnológico de las AuNPs Actualmente, las AuNPs presentan prometedoras aplicaciones en diversos campos. Así por ejemplo, la facilidad de controlar la posición de la banda SPR ha permitido la destrucción selectiva de tejidos cancerígenos en vivo sin necesidad de biopsias invasivas, cirugía, quimioterapia o radioterapia: se fijan las AuNPs en las células tumorales y estas partículas absorben radiación con ciertas longitudes de ondas del rango IR, lo que provoca un sobrecalentamiento de la AuNP que destruye la célula maligna sin afectar a la sana.33,34 Para ello es necesario AuNPs con baja dispersión pero con una alta absorción en el NIR.16 También resultan potencialmente útiles en el campo de la biología y medicina para la obtención de bioimagénes así como para la liberación controlada de fármacos.35–37 Otra de las metas es la optimización de materiales por inclusión de NPs en éstos. Por ejemplo, existe un gran interés en adsorber AuNPs en la pared lateral de los nanotubos de carbono ya que el nanocompuesto obtenido muestra prometedoras propiedades para el diseño de celdas fotoelectroquímicas, celdas de combustible o incluso sensores.38 O en el caso de la obtención de híbridos de grafeno con AuNPs, el nanoconjugado presentaría las propiedades físicas del grafeno con las ventajas del oro coloidal, lo que podría potenciar la absorción de la luz.39 No obstante, la aplicación más desarrollada de las AuNPs es la de su empleo como biosensor colorimétrico, la cual surge de la combinación de la banda SPR con la tendencia a la Capítulo 1: Introducción 32 repulsiones entre sí) las altas concentraciones de sales o la presencia de cationes polivalentes estabilizan la estructura. La tabla 1.2 resume algunas características de las tres estructuras. Otras estructuras pueden estar presentes, dependiendo de las características de la secuencia y de los elementos de simetría. Algunos ejemplos de éstas son el C-ADN, los cruciformes, las tripletes intramoleculares, el ADN cuádruplex, estructuras desemparejadas o las horquillas.53,58 Tabla 1.2. Resumen de algunas propiedades de las formas A, B y Z del ADN. Forma A Forma B Forma Z Sentido de la hélice Dextrógiro Dextrógiro Levógiro Diámetro ~ 26 Å ~ 20 Å ~ 18 Å Pares de bases por vuelta de hélice 11 10.5 11.6 Distancia entre pares de bases 2.6 Å 3.4 Å 3.8 Å Inclinación de las bases 20º 6º 7 º Conformación del enlace glucosídico Anti Anti Anti → dA, dG Syn → dT, dC Densidad de carga 0.77 e-/ Å 0.59 e-/ Å 0.54 e-/ Å Estable en Medios deshidratados Amplio rango Condiciones fisiológicas Altas concentraciones de sales Cationes polivalentes 1.3. Interacción del ADN con nanopartículas de oro 1.3.1. Interacciones entre monómeros del ADN y nanopartículas de oro El estudio de las interacciones entre los monómeros del ADN y las AuNPs es de gran importancia ya que la naturaleza y la fuerza de la adsorción del ADN en la superficie del oro depende de la secuencia.59–61 Aunque existe una extensa bibliografía sobre la adsorción de bases, nucleósidos y nucleótidos en diferentes superficies de metales como oro62–66 o plata67,68, en el 33 caso de nanopartículas los estudios son mucho más escasos. De hecho, diversos autores extrapolan los resultados de estos sistemas metálicos a las nanopartículas, considerando que la lámina del metal en cuestión es la superficie de una nanopartícula gigante (con un radio que tiende a infinito). Uno de los estudios más completos sobre cómo interaccionan las bases del ADN con las AuNPs es el realizado por el investigador Nak Han Jang.69 Aunque este estudio sólo implica nucleósidos, trabajos posteriores han demostrado que también los monómeros del ADN interaccionan por la base.70 La Figura 1.8 muestra la forma de interaccionar de las bases con AuNPs, figura propuesta por Jang y a la cual sólo se le ha realizado una leve modificación en la guanina.70 Figura 1.8. Estructuras propuestas para la interacción de las AuNP con: a) adenina, dA, dAMP;69 b) guanina, dG, dGMP;70 c) citosina, dC, dCMP;69 d) timina, dT, dTMP.69 Las líneas sólidas representan la interacción principal, mientras las líneas no continuas señalan una débil contribución. El primer estudio sobre la afinidad de la interacción de monómeros con AuNPs fue realizado en 2002 por Robert L. Letsinger, Chad A. Mirkin y colaboradores, donde determinaron cualitativamente la afinidad de adsorción de los desoxinucleósidos del ADN en la superficie de las AuNPs, tomando como referencia la posición de la banda SPR al producirse la agregación de éstas inducidas por la presencia del monómero.60 El orden obtenido fue: dC > dG > dA, donde para la dT no se produjo ningún cambio en la banda SPR a no ser que la concentración se aumentara 20 veces más respecto al resto de monómeros. Dicho orden también Capítulo 1: Introducción 34 se ha observado en la interacción de las nucleobases con AuNPs e incluso con AgNPs.71,72 Sin embargo, Jun Yang y colaboradores obtuvieron un orden diferente para los nucleótidos: dA > dG > dC > dT.49 Si bien es cierto que tanto las condiciones experimentales como la metodología empleada han sido bastante diferentes, lo cual puede justificar estas diferencias. En lo que todos los autores coinciden es que la timina es la base con menor afinidad para interaccionar con las AuNPs. 1.3.2. Interacciones entre oligonucleótidos y nanopartículas de oro La mayoría de trabajos publicados sobre sistemas ADN-NPs hace alusión a oligonucleótidos. La preferencia por cadenas cortas de ADN (entre 10 y 100 monómeros por pares de base) es debida a su gran versatilidad como sonda de ADN, ARN, proteínas y otras biomoléculas de potencial utilidad.48,73 El interés aumentó considerablemente con la publicación de dos trabajos en un número de la revista Nature del año 1996, uno por el grupo de Letsinger y Mirkin y otro por el grupo de A. Paul Alivisatos,30,31 donde describían la funcionalización de AuNPs con oligonucleótidos tiolizados. La presencia de un grupo tiol en la terminación de un oligonucleótido permite su anclaje en la superficie de la AuNP a través de un enlace covalente. Las moléculas adsorbidas apenas presentan diferencias termodinámicas para el proceso de hibridación respecto a las que se encontrarían en disolución.74 Dada la naturaleza covalente del enlace Au-S, se produce una clara preferencia por la formación de estos enlaces, por ello es más probable que las moléculas tiolizadas vayan a la superficie respecto a las no tiolizadas e incluso la pérdida de interacciones no específicas para permitir la creación de más enlaces S-Au.75,76 De gran importancia para el desarrollo de biosensores también fueron los estudios realizados por los investigadores Huixiang Li y Lewis J. Rothberg sobre la detección de oligos de ADN con AuNPs sin funcionalizar.77,78 Para ello tomaron como punto de partida la diferente capacidad que tiene una cadena de ADN simple para interaccionar con AuNPs aniónicas en comparación con ADN de doble cadena. Muchos de los biosensores que se han desarrollado con AuNPs se inspiran en los trabajos desarrollados por Li y Rothberg. 1.3.2.1. Interacciones de ADN de cadena sencilla con nanopartículas de oro La mayoría de estudios implican oligonucleótidos de cadena simple que son unidos a la nanopartícula vía tiol y estando disponibles para que el proceso de hibridación pueda tener lugar. Sin embargo, independientemente de si la moléculas se encuentran ancladas o no, las bases tienden a interaccionar no covalentemente (interacciones no específicas) con la superficie del 35 oro,60 y por lo tanto el complejo resultante es más estable a la agregación inducida por sal ya que se produce un aumento de la carga negativa neta.77–79 Diversos modelos se han sugerido para el mecanismo de la adsorción, aunque diferentes hechos experimentales hacen que no se haya podido establecer uno con certeza. Uno de los primeros se basaba en la formación de dipolos por parte de los grupos fosfatos de la cadena y de los citratos con sus respectivos contraiones,78 por lo que la interacción entre ellos estabilizaría el sistema. Sin embargo este planteamiento cae de por sí ya que el ADN de doble cadena no se adsorbe a la superficie de las AuNPs a pesar de que también puede formar dipolos con los cationes que se encuentran a su alrededor, por lo que se propuso un modelo basado en la hidrofobicidad.80 Un modelo más actual propone un mecanismo cuyo fundamento radica en la mera estabilización obtenida por las interacciones entre las nucleobases y la AuNP.76 Según este modelo, el ADN necesita aproximarse a la partícula para desplazar moléculas de citrato de la superficie y así poder adsorberse. Una vez adsorbido, el ADN puede cambiar su conformación para maximizar sus puntos de contacto con la superficie. Entonces las moléculas de ADN crean una zona de exclusión donde otras moléculas del biopolímero no pueden acercarse. Este proceso tendrá lugar hasta que se produzca la saturación de la superficie. Como se mencionó en la subsección 1.3.1, los monómeros que forman el oligonucleótido tienen diferentes afinidades para interaccionar con la AuNP.49,60,71 Obviamente estas interacciones influirán tanto en la forma en que el ssADN se extenderá sobre la superficie así como en la intensidad de la adsorción, que dependerá de los puntos de contactos. Conforme el número de bases con alta afinidad por el oro crece, mayor tendencia a pegarse a la superficie presentará la cadena, mientras que si crece la proporción de bases con baja afinidad, la cadena tenderá a encontrarse separada de la superficie permitiendo un mayor número de moléculas por NP. Esto se observa en la poli-T, donde hay una gran densidad de oligonucleótidos por NP en comparación con la poli-A o poli-C.60 Esta habilidad para adsorberse de diferentes formas al complejo AuNP-ssDNA le confiere una gran versatilidad, ya que el control tanto de las diferentes afinidades así como de sus posiciones en la cadena permite obtener diferentes conformaciones del ADN adsorbido (véase Figura 1.9).81 Es muy importante tener en cuenta esta situación para el diseño de los trabajos experimentales, ya que los resultados variarán según la forma en que esté adsorbida la cadena.82 La longitud del oligonucleótido también afecta a la interacción ya que el proceso de adsorción es más rápido conforme más corto es el oligonucleótido. Esto es debido a que cadenas cortas requieren la formación de menos puntos de contactos por molécula, aunque bien es cierto que más estable es la interacción cuanto más punto de contactos se producen.76,78,83 Capítulo 1: Introducción 36 Figura 1.9. Conformaciones adquiridas por oligonucleótidos adsorbidos a la superficie de una AuNP según donde se encuentren los monómeros con alta afinidad de interacción. Reimpreso con permiso de K. A. Brown, S. Park, K. Hamad-Schifferly, J. Phys. Chem. C, 2008, 112, 7517-7521.81 Copyright 2008 American Chemical Society. Obviamente, la longitud de persistencia (dependiente a su vez tanto de la composición de la cadena como de su longitud) también influye en la interacción. De por sí, la interacción del ADN con la NP ya provoca una curvatura en la estructura del biopolímero.84 Esto significa que cuanto más flexible sea la cadena más fácil será que se adapte a la curvatura de la NP para aumentar el número de puntos de contactos (Figura 1.10). Es este efecto de la curvatura el que hace que la superficie de las AuNPs sea diferente a las superficies planas de oro, donde no existe curvatura alguna. La gran influencia de la curvatura queda totalmente patente cuando se comparan las interacciones de distintos oligonucleótidos homogéneos con AuNPs de 5 nm, donde la adsorción del poli-T es similar a la del poli-A y poli C y es mayor que la del poli-G,49 tendencia totalmente opuesta a la observada en nanopartículas de mayor tamaño.60 El hecho de que el poli-T sea más flexible que el poli-A podría justificar dicho orden de interacción. Además, gracias a la curvatura que presentan las AuNPs de 5 nm, el complejo que se forma es muy estable (por encima de los 110 ºC) e inmune a la hibridación.85 Figura 1.10. Interacción de oligonucleótidos de diferente rigidez con AuNPs. A) se corresponde con ADN muy flexible (baja P), B) sería una situación intermedia, mientras que C) sería una molécula muy rígida (con una alta P). La molécula más flexible es la que presenta mayor puntos de contacto y por lo tanto es la que forma el complejo más estable. Reimpreso con permiso de J. Yang, B. Pong, J. Y. Lee, H. Too, J. Inorg. Biochem, 2007, 101, 824-830.49 Copyright 2008 Elsevier. Es importante resaltar que la adsorción del ADN de una sola cadena es sensible a la fuerza iónica y al pH. El principal efecto de la adición de cualquier sal es el apantallamiento de las cargas negativas tanto de los citratos adsorbidos en la superficie de las AuNPs como de los 37 grupos fosfatos del ADN, que conlleva a una disminución de la longitud de persistencia.56 Por lo tanto, puede debilitar las interacciones no específicas provocando la desorción, debido a que el ADN se compactaría haciendo a las bases menos accesibles para interaccionar con el oro.76 El pH por su parte afecta a las cargas de las moléculas de citrato y grupos fosfato. A pH bajo la agregación tiene lugar, pudiendo ser revertida aumentando el pH del medio, aunque conforme se aumenta el número de ciclos más se degrada el ADN.79 Que sea reversible la agregación se debe a que la neutralización de los fosfatos permite que los complejos se aproximen entre sí, efecto que se pierde si la cadena fosfatada del ADN adquiere su carga, manteniendo a los complejos separados por repulsiones electrostáticas. 1.3.2.2. Interacciones de ADN de doble cadena con AuNPs Debido a que el ADN de doble cadena presenta una mayor rigidez que las cadenas sencillas, es más difícil la interacción con la superficie de las nanopartículas. La tendencia del ADN de doble cadena con AuNPs aniónicas es la de repelerse. No obstante, las fuerzas de van der Waals también afectan debido a la presencia de regiones no polares en el ADN. Punto y seguido. Obviamente, en el caso de AuNPs catiónicas, las fuerzas electrostáticas favorecen la aproximación de las moléculas.86–88 La presencia de nanopartículas catiónicas causa la desnaturalización parcial de la hélice de ADN, dando lugar a una serie de estructuras intermedias entre ss y ds-ADN.88 La interacción electrostática provoca una curvatura en el ADN mientras que las interacciones hidrofóbicas con las bases en los surcos deforman la estructura del ADN.86,88 En el caso de nanopartículas aniónicas, la única forma de interacción previsible con dsADN sería a través de enlaces covalentes (S-Au) dadas las repulsiones electrostáticas, sin embargo algunos estudios han reportado débiles interacciones de AuNPs aniónicas con dsADN a través de los surcos.49,75 De hecho, en el caso de AuNPs aniónicas pequeñas (del orden de 5 nm) se produce la desnaturalización de la hélice formándose un complejo ADN-AuNP muy estable, ya mencionado en el apartado anterior.49 En el caso de moléculas de ADN ancladas covalentemente en la superficie de la AuNP, tanto la cantidad de moléculas adsorbidas como el tamaño de las mismas afecta directamente a la conformación hasta el punto de provocar la desnaturalización de la hélice (véase Figura 1.11).89 A bajas densidades el ADN tenderá a estableces interacciones no específicas dentro de sus posibilidades. La formación de enlaces S-Au es un proceso muy favorable en términos energéticos, lo que obliga a la NP a aceptar todas las moléculas tiolizadas hasta la saturación. Esto ocurre a altas densidades de ADN, donde las cargas negativas de las cadenas adsorbidas Capítulo 1: Introducción 38 previene la adsorción de más moléculas en la superficie. En esta situación, las cadenas dobles tenderán a abrirse para disminuir las repulsiones electrostáticas y así permitir la entrada de más moléculas tiolizadas. Obviamente, la estabilidad de la cadena compite con la creación de enlaces S-Au, de manera que si se desea obtener una nanopartícula con una alta densidad de dsADN (es decir, evitar la apertura del ADN) se deben usar oligonucleótidos con más de 50 pares de bases.89 La optimización de este sistema no es fácil ya que las repulsiones electrostáticas entre hebras tiene una fuerte influencia. Se observa baja estabilidad térmica respecto a una deshibridación a altas densidades debido a la proximidad de cargas del mismo signo,90 por lo que se requiere la adición gradual de una sal para disminuir las interacciones de repulsión y así aumentar la capacidad de anclaje.91 El tamaño del ión influye en los resultados: cationes pequeños permiten una mayor carga de moléculas de ADN por NP, ya que las hebras pueden estar más empaquetadas.92 Figura 1.11. Mecanismo de desnaturalización de moléculas de ADN de doble cadena ancladas en la superficie de la AuNP, donde la tendencia a formar enlaces covalentes Au-S domina el proceso provocando incluso la apertura de la hélice. Reimpreso con permiso de D. Peled, R. Naaman, S. S. Daube, J. Phys. Chem. B, 2010, 114, 8581-8584.89 Copyright 2010 American Chemical Society. 1.3.3. Interacciones entre ADN de larga cadena y nanopartículas de oro Dada la relativa flexibilidad del ADN cuando supera una longitud de 500 Å,52 los estudios de funcionalización y de las interacciones entre ADN polimérico y AuNPs no han sido de interés. Con poca rigidez el biopolímero puede adoptar conformaciones aleatorias o más compactadas que lo inhabiliten para el fin de su diseño; de hecho, incluso en el caso de oligonucleótidos es necesario incluir espaciadores entre el polímero y la cabeza con el grupo tiol, o moléculas que impidan la interacción del ADN con la superficie manteniendo recta la hebra.93 Sin embargo, por la capacidad de interaccionar que presenta el ADN con NPs metálicas, ha habido una especial predilección por su uso como molde, fundamentalmente en la obtención de nanoalambres.94 Ejemplo de ello es un reciente trabajo de Larisa I. Lopatina y colaboradores,95 donde según la proporción de NaBH4, HAuCl4 y ADN (de esperma de salmón, con 300-500 pbs) se obtienen distintos tamaños y distribuciones de las AuNPs. A la concentración más alta de ADN y con un exceso de NaHB4, se produce una disposición de nanoalambre, donde las 39 AuNPs se encontraban fusionadas y alineadas. Aunque es estas nanopartículas eran neutras, también se han conseguido desarrollar dichas estructuras con AuNPs aniónicas; a partir de NPs de oro cubiertas de tris (hidroximetil) fosfina y ADN de calf thymus (aproximadamente unos 10 kpbs).96 Sorprendentemente, a pesar de las cargas de mismo signo, la interacción ocurre a través de la cadena fosfatada del ADN de doble cadena; la formación de puentes de hidrógenos entre los grupos hidroxilos de la tris (hidroximetil) fosfina y los grupos fosfatos son clave para dicho proceso.96 1.4. Interés y aplicaciones de las interacciones entre los polinucleótidos y las nanopartículas de oro Como se ha indicado en secciones anteriores, el uso de las AuNPs como biosensor es el más desarrollado y aplicado en la actualidad; los cambios en los espectros de absorción, reflejados por cambios colorímetros tan diferentes (de rojo a azul), y la rapidez con la que se producen han sido los causantes de dicha preferencia.96 Gran repercusión tuvo también la funcionalización con ADN de la nanopartículas, hecho que tuvo como origen los trabajos de Letsinger y Mirkin,30 y Alivisatos;31 el proceso de hibridación con hebras complementarias permite el ensamblaje selectivo de AuNPs (véase Figura 1.12), siendo un método eficaz y “sencillo” de detección de hebras complementarias. Estos sistemas se han extendido en distintas variantes: i) creación de sistemas de nanopartículas con varias disposiciones, desde complejos “satélites” (una nanopartícula grande rodeada de nanopartículas más pequeñas)97 hasta colocar las AuNPs con posiciones propiamente cristalinas (véase Figura 1.13);98 ii) detección de defectos en la secuencia de oligonucleótidos,99 lográndose detectar diferencias de una base;100 iii) funcionalización de AuNPs con moléculas tiolizadas (aunque también existen otros puntos de anclaje) con una reactividad selectiva frente a un analito concreto.40,101,102 Figura 1.12. Esquema del uso de nanopartículas de oro funcionalizadas con ADN. Dos grupos de AuNPs funcionalizadas con diferentes hebras de ADN y no complementarias (a y b), tenderán a recobinarse al añadir una hebra complementaria a las dos adsorbida a la superficie (cadena a’b’). Este acercamiento se refleja en un cambio de color de azul a rojo. Reimpreso con permiso de C. S. Thaxton, D. G. Georganopoulou, C. A. Mirkin, Clinica Chimica Acta, 2006, 363, 120-126.103 Copyright 2006 Elsevier. Capítulo 1: Introducción 40 Figura 1.13. Programación de AuNPs funcionalizadas con hebras de ADN, cuyas terminaciones presentan diferentes combinaciones de bases, permitiendo la obtención de estructuras cristalinas de complejos de AuNPs. Reimpreso con permiso de S. Y. Park, A. K. R. Lytton-jean, B. Lee, S. Weigand, G. C. Schatz, A. Mirkin, Nature, 2008, 451, 553- 556.98 Copyright 2008 Nature Publishing Group. Por otra parte hay que reseñar que el método colorimétrico de detección de la hibridación de ADN desarrollado por Huixiang Li y Lewis J. Rothberg77,78 es la piedra angular del uso de AuNPs no funcionalizadas como biosensores. Dicho estudio se desarrollará más extendidamente en la sección 5.1, pero se podría simplificar indicando que, basándose en la diferencia de rigidez entre oligonucleótidos de cadena simple o doble y en la capacidad de interacción de estos con las AuNPs, el ADN de cadena simple protege al coloide de la agregación inducida por sal a diferencia del de doble hebra. La principal ventaja es el evitar la funcionalización de la nanopartícula, que conlleva el diseño de oligonucleótidos específicos encareciendo el coste del sensor. Con filosofías semejantes, donde la molécula a detectar protege a las AuNPs de la agregación, se han podido detectar diferentes tipos de moléculas y proteínas.104–106 En esta línea, nuestro grupo de investigación ha desarrollado un método colorimétrico de detección de la enzima lisozima el cual ha sido patentado.107,108 Sin embargo la detección no se ha limitado exclusivamente a moléculas, sino a procesos como la hibridación de ADN o la formación de micelas.85,109,110 Gracias a la versatilidad de las nanopartículas y a sus sorprendentes propiedades ópticas, las aplicaciones de las AuNPs quedan abiertas a la imaginación e ingenio de los investigadores. 41 La obtención de la información que contiene la banda de plasmón superficial es fundamental para conocer y entender los procesos que experimentan las nanopartículas en disolución. Por ello, para estudiar los efectos de la polaridad del entorno y del tamaño de la nanopartícula en el espectro de absorción, se aplicó la teoría de Mie haciendo uso del programa gratuito MiePlot. Por otra parte el análisis de las diferentes bandas que componen el espectro de absorción se llevó a cabo a través de una deconvolución de los espectros experimentales, a través del programa Fityk. Por último señalar que en el caso de nanopartículas, el uso de la absorbancia en lugar de la longitud de onda conlleva la pérdida de información de la distribución de tamaños e incluso de la presencia de otras fracciones de coloide. Además, en el caso de agregados la distorsión de la banda experimental no permite establecer con claridad la longitud de onda máxima que caracteriza la disolución coloidal. La cuantificación del color permite parametrizar el espectro de absorción entero, incluyendo toda la información del sistema; con este fin se aplicó el espacio de color CIELab para, a través de la cuantificación del color de las muestras obtener información sobre el grado de agregación del coloide. 2.1. MiePlot: obtención de espectros de absorción a través de la teoría de Mie MiePlot es un programa gratuito (http://www.philiplaven.com/mieplot.htm) que permite calcular la dispersión de la luz por esferas homogéneas según la teoría de Mie, aunque también admite otros modelos. La interfaz del programa es sencilla (véase Figura 2.1) y los resultados se pueden expresar en función de diferentes magnitudes. Para la simulación de los espectros, sólo es necesario conocer las características de la nanopartícula (material, tamaño y grado de dispersidad) y el índice de refracción del entorno. 2. Deconvolución y análisis espectral de las bandas SPR Capítulo 2: Deconvolución y análisis espectral de las bandas SPR 48 49 3.1. Motivación, antecedentes y objetivos En cualquier estudio que implique nanopartículas, la síntesis es una etapa clave. El método utilizado influye notablemente en las propiedades del coloide obtenido: forma, estabilidad e incluso la polidispersidad.27 La preparación de NPs se puede realizar a partir de dos formas: top down, cuando las nanoestructuras son hechas a partir del material macroscópico, y bottom up, si la síntesis se lleva a cabo a partir de átomos y/o moléculas.4 Entre estos dos caminos, el último es el que se está imponiendo debido a que permite un mejor control del tamaño y de la forma.27 El procedimiento más sencillo para la obtención de AuNPs es por reducción de una sal de oro, normalmente tetracloroaurato (III) de hidrógeno (HAuCl4), donde después se añade un agente estabilizante, que en muchos casos también es el que funcionaliza la NP.7 Dentro de este tipo de síntesis la más utilizada es la desarrollada por John Turkevich y colaboradores,121 donde una disolución de HAuCl4 es calentada hasta ebullición para añadirle a continuación citrato trisódico y agitar vigorosamente unos minutos. En dicho procedimiento, el citrato ejerce tanto de reductor como de agente protector de la NP a través del siguiente mecanismo (véase Esquema 3.1):122 I) el citrato reduce el Au (III) a Au (I), formándose el ión acetonadicarboxilato (DCA). Aunque también se forman otras especies oxidadas del citrato en la reacción,123 es el DCA el que participa en la formación de la AuNP,121,122 ya que forma un quelato con el Au (I) haciendo muy favorable la formación de dicha especie. II) El Au (I) se dismuta para formar Au (III) y oro metálico, siendo este último el que crea la nanopartícula ya sea formando el núcleo o provocando el crecimiento de un núcleo. 3. Síntesis y caracterización de nanopartículas de oro. Fenómenos de agregación. Efecto del disolvente en la banda SPR. Capítulo 3: Síntesis y caracterización de nanopartículas de oro. Fenómenos de agregación. Efecto del disolvente en la banda SPR. 50 Esquema 3.1. Mecanismo de formación de nanopartículas de oro protegidas por aniones citrato. Reimpreso con permiso de I. Ojea-Jimenez, N. G. Bastus, V. Puntes, J. Phys. Chem. C, 2011, 115, 15752-15757.122 Copyright 2011 American Chemical Society. Dada la sencillez del método de Turkevich, se han llevado a cabo múltiples variaciones del mismo que controlan las características finales de las AuNPs.27 Sin embargo, la síntesis requiere sumo cuidado ya que cualquier diferencia en las condiciones provoca cambios en la solución coloidal obtenida.122,124 La caracterización de las nanopartículas se puede realizar por diversas técnicas instrumentales. Normalmente, para describir a la AuNP, se emplea el diámetro y la posición del máximo de la banda SPR. Para la determinación del tamaño, la técnica más utilizada es la Microscopía de Transmisión Electrónica (TEM) que permite obtener fotografías de los núcleos de las AuNPs. Aunque debido al protocolo de preparación de la muestra (en la que se debe secar, pudiéndose dar fenómenos de agregación) otros investigadores se decantan por otras técnicas, como la medida de Dispersión Dinámica de Luz (DLS), donde se mide la señal de respuesta de una muestra en disolución. La espectroscopía electrónica de absorción permite determinar el máximo de la banda SPR. Reacción redox Complejo de acetonadicarboxilato Desproporción 51 La agregación de las AuNPs es un proceso fundamental cuando el coloide es empleado como sensor, ya que los cambios colorimétricos según el estado de la nanopartícula permiten discernir la presencia del analito.22 Uno de los métodos más comunes es el uso de una sal inorgánica (comúnmente NaCl), la cual provoca la agregación de las AuNPs en ausencia del analito mientras que si este último se halla en disolución, la agregación no tiene lugar. El proceso inverso como camino de detección es mucho menos empleado. A pesar de su importancia, escasos esfuerzos se han realizado en la optimización de las cantidades de sal a añadir centrándose fundamentalmente la atención en estudios cinéticos y teóricos, cuyos resultados son ajustados a la teoría DVLO.125,126 Incluso en el caso de las AgNPs, muy estudiadas en relación al oro debido a su bajo coste, la bibliografía se centra en estudios cinéticos de agregación con diferentes sales y diferentes moléculas adsorbidas en la superficie de la partícula.127,128 Sin embargo, es sabido que tanto la disposición de las partículas dentro del agregado como el tamaño del mismo afectan a las interacciones de la nube electrónica, caracterizando al espectro de absorción del coloide.129 Por ello, la optimización de la cantidad de sal necesaria para inducir la agregación es importante a la hora de controlar los cambios en la banda SPR e incluso la aparición de nuevas bandas. En referencia a los efectos del disolvente sobre la banda de SPR de las AuNPs los estudios son aún más escasos, de hecho casi inexistentes. Aunque es cierto que a partir de la teoría de Mie se podría predecir las alteraciones en la banda SPR, es necesario recordar que dicha teoría también presenta severas limitaciones. Uno de los pocos estudios sobre este punto es el realizado por Sylvia Underwood y Paul Mulvaney,17 en el que comparan la posición de la banda SPR de AuNPs transferidas a diferentes medios orgánicos con la teoría de Mie y en el que observaron desplazamientos al rojo conforme mayor era el índice de refracción del medio. Estudios similares han sido realizados por diferentes grupos científicos,130,131 aunque las nanopartículas utilizadas estaban funcionalizadas con estabilizantes poliméricos para prevenir la agregación. Por todo ello resulta de gran interés conocer el comportamiento de las AuNPs en medios diferentes al agua para poder extrapolar su empleo como biosensor en medios más hidrofóbicos que el agua como pueden ser los fluidos biológicos. Considerando todo lo expuesto, el principal objetivo del presente capítulo es la síntesis y caracterización de AuNPs de diferentes tamaños, así como un estudio exhaustivo del proceso de agregación en presencia de electrolito inerte y del efecto del disolvente provocado por disoluciones de distinto carácter hidrofóbico. Capítulo 3: Síntesis y caracterización de nanopartículas de oro. Fenómenos de agregación. Efecto del disolvente en la banda SPR. 52 3.2. Materiales y métodos 3.2.1. Materiales Todos los reactivos utilizados son de calidad analítica o superior. El tetracloroaurato (III) de hidrógeno trihidratado (HAuCl4·3H2O) y el citrato trisódico (Na3C6H5O7) fueron adquiridos de la casa comercial Sigma-Aldrich. El metanol, etanol, 2-propanol, terc-butanol y el cloruro sódico (NaCl) de Merck. Las disoluciones se prepararon en agua desionizada, siendo su conductividad menor a 10-6 S·m-1. 3.2.2. Espectros de absorción en el UV-vis 3.2.2.1. Espectros de absorción para el estudio de la agregación inducida por sal Los espectros de cada muestra fueron registrados cada cinco minutos después de la adición de NaCl. A los 30 minutos los espectros eran prácticamente invariables, tomándose este tiempo como límite máximo de la medida. Las experiencias se realizaron con AuNPs de 14.8 nm, a concentración fija [AuNPs] = 3.0x10-10 M, en presencia de distintas concentraciones de sal. 200 µl de la solución coloidal sintetizada fueron añadidos en una cubeta de cuarzo para posteriormente diluirlos con 1600 µl de agua. La adición de 200 µl de NaCl de diferente concentración se tomó como tiempo cero. Para otros tamaños de coloide, las concentraciones fueron: [AuNPs (27 nm)] = 4.7x10-11 M; [AuNPs (4.5 nm)] = 8.9x10-9 M. 3.2.2.2. Espectros de absorción en presencia de alcoholes tedraédricos Los espectros de cada muestra fueron tomados a los 8 minutos después de añadir el alcohol. Las nanopartículas en diferentes mezclas agua/codisolvente resultaron ser estables más de 20 minutos. Las experiencias se llevaron a cabo con AuNPs cuyo tamaño medio fue de 15.4 ± 1.5 nm, a una concentración fija de [AuNPs] = 2.9x10-10 M, en diferentes fracciones molares de distintas mezclas agua/alcohol. 200 µl de la solución coloidal se añadieron en una cubeta de cuarzo. Se tomó como tiempo cero la adición de 1800 µl de distintas disoluciones de alcohol de diferente concentración. 3.2.3. Medidas de potencial zeta Las medidas de potencial zeta fueron realizadas con el equipo Zetasizer Nano ZS de Malvern Instruments Ltd (UK). Se empleó como cubeta una celda de DTS 1060 de 53 policarbonato. Las medidas se llevaron a cabo medidas en presencia de diferentes fracciones molares de terc-butanol. [AuNPS] = 2.9x10-10 M en cada caso. 3.2.4. Medidas de TEM Para la obtención de imágenes de TEM, una simple gota (~10 µl) de la disolución a analizar fue colocada en una rendija de cobre cubierta por una película de carbono y dejada secar durante varias horas a temperatura ambiente. Las medidas se realizaron en un microscopio electrónico Philips CM trabajando a 200 kV y el análisis de las imágenes se llevó a cabo con el programa ImageJ. 3.2.5. Medidas de índice de refracción Las medidas de los índices de refracción de las disoluciones de AuNPs (2.9 x10-10 M) en presencia de diferentes mezclas agua/alcohol (a la mayor fracción molar de cada codisolvente) se realizaron con ayuda de un refractómetro digital Abbe “WYA-1S”. Basado en la calibración con disoluciones de índice de refracción conocido, el error absoluto en los índices de refracción estimado fue de ±0.0004. 3.2.6. Medidas de Dispersión Dinámica de Luz El tamaño y la distribución de AuNPs (2.9x10-10 M) a la mayor fracción molar de alcohol en diferentes mezclas agua/alcohol fueron determinados por medio de la técnica de DLS usando un Zetasizer Nano ZS de Malvern Instruments LTd (UK). La muestra fue iluminada con un láser con una disposición de 173º respecto al centro de la celda, y la intensidad de fluctuación en la luz dispersada fue analizada. Se llevaron a cabo al menos tres medidas de tamaño por cada muestra, siendo el error relativo para el diámetro hidrodinámico menor al 5%. 3.2.7. Análisis de las bandas de absorción por deconvolución La deconvolución de los espectros experimentales se realizó con el programa SigmaPlot 10.0. En todos los casos los espectros fueron ajustados a funciones gausianas: 3.1 Capítulo 3: Síntesis y caracterización de nanopartículas de oro. Fenómenos de agregación. Efecto del disolvente en la banda SPR. 54 donde A es la absorbancia, λmax es la posición del máximo y C es un parámetro relacionado con la anchura a la mitad del máximo (FWHM) de la banda acorde a: 3.2 La principal suposición de este modelo es que cada banda corresponde a una distribución de tamaño de AuNPs, lo cual se ha demostrado experimentalmente que se ajusta bastante bien a la realidad.114 Además se fijó una banda a 400 nm para corregir el efecto de dispersión de luz y de la transición entre bandas de las NPs metálicas.132 En todos los casos el error de análisis entre el espectro simulado y el experimental resultó ser menor del 5%. 3.3. Síntesis y caracterización de las AuNPs empleadas en el estudio En la presente Tesis Doctoral se han sintetizado AuNPs con tres tamaños (aproximados) diferentes: 5, 15 y 30 nm. En la bibliografía, las comprendidas entre 10 y 20 nm son las más asiduas y de hecho, han sido las de 15 nm las más empleadas en la presente investigación. 3.3.1. Síntesis y caracterización de nanopartículas de oro de 15 nm La obtención de AuNPs con un tamaño medio próximo a los 15 nm se ha llevado a cabo por reducción de un complejo de Au (HAuCl4) en fase líquida, optimizando por nuestra parte una variante del método de Turkevich133 para obtener disoluciones coloidales lo más estable posible en el tiempo. 3.3.1.1. Síntesis de AuNPs de 15 nm El material de síntesis se limpió con agua regia (mezcla 1:3 de HNO3 y HCl) para eliminar todo residuo metálico que pueda interferir en dicho proceso;134 posteriormente se aclaró con abundante agua destilada con un enjuague final de agua desionizada. Se preparó una disolución 0.01 % de HAuCl4, y 97 ml de ésta se calentaron en un vaso de precipitado con agitación. Cuando alcanzó los 90 ºC se añadieron 3 ml de una disolución de citrato trisódico (38.8 mM) y se mantuvo la reacción a temperatura constante (90ºC). Con el tiempo, la mezcla adquirió un tono grisáceo que evolucionó a rojo. Una vez adquirido el color rojo característico, se dejó a esta temperatura unos 10 minutos más. Transcurrido dicho tiempo, se dejó la disolución coloidal en agitación 24 horas a temperatura ambiente. 55 3.3.1.2. Caracterización de las AuNPs Como se ha indicado anteriormente, dos parámetros son los que caracterizan a las AuNPs: su banda SPR, más exactamente su posición, y el tamaño promedio, del cual se puede obtener la concentración de la disolución coloidal. La Figura 3.1. muestra la banda SPR para una dilución 1:10 de la síntesis obtenida, donde la posición del máximo se encuentra a 520 nm permitiendo estimar el diámetro en torno a los 15 nm.13 Longitud de onda / nm 400 500 600 700 800 Absorbancia 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 max = 520 nm A520 = 0.116 Figura 3.18. Espectro de absorción de las AuNPs sintetizadas (dilución 1:10) con un tamaño estimado de 15 nm. El máximo se posiciona en torno a 520 nm. La imagen en el interior del gráfico corresponde a una fotografía de la muestra sin diluir. Dada la sensibilidad que presenta la síntesis a pequeños cambios en su ruta, se ha repetido la obtención de nanopartículas hasta conseguir disoluciones coloidales que presentasen el mismo espectro. Una vez conseguida la reproducibilidad en la síntesis se procedió a la determinación del tamaño, que se realizó midiendo el diámetro de más de 200 partículas observadas por TEM (véase Figura 3.2), obteniéndose un tamaño promedio de 14.8 ± 1.8 nm. Capítulo 3: Síntesis y caracterización de nanopartículas de oro. Fenómenos de agregación. Efecto del disolvente en la banda SPR. 56 d / nm 910 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 % 0 10 20 30 40 Figura 3.19. A) Ejemplo de imagen de TEM utilizada para la estimación del tamaño promedio de las AuNPs de 15 nm. B) Histograma obtenido de la medida del tamaño de 220 nanopartículas. A partir del tamaño promedio estimamos la concentración de AuNPs en la disolución coloidal sintetizada siguiendo tres procedimientos:  A partir del volumen molar del oro macroscópico. Para nanopartículas esféricas, la relación que existe entre el volumen molar y el número de átomos de oro que componen a dicha partícula (n) viene dada por:135 (3.3) donde NA es el número de Avogadro, dm es el diámetro medio de las AuNPs (expresado en cm) y Vm es el volumen molar del oro macroscópico (10.215 cm3·mol-1).135 Para una AuNP con un tamaño de 14.8 nm se obtuvo que está compuesta por 100082 átomos de oro. Partiendo de la premisa de que todo el HAuCl4 se ha reducido y sabiendo que el volumen final de la disolución es 100 ml, se calculó que la concentración de Au0 es 2.84x10-4 M. Haciendo uso de la concentración de Au0 y del número de átomos que forman una NP, se pudo obtener la concentración de la disolución coloidal: 2.8x10-9 M.  A partir del volumen atómico del oro. El volumen de una nanoesfera rígida se expresa como: (3.4) siendo rNP el radio de las nanopartículas. Para AuNPs cuyo tamaño es 14.8 nm, se obtuvo que VNP = 1.7x106 Å3. Como el volumen del oro atómico es 17.81 Å3,135 se calculó el número de átomos que componen una NP a partir del volumen de la misma: A) B) 57 (3.5) siendo 95306 átomos de Au por NP. Al relacionar este dato con la concentración de oro metálico en disolución (2.84x10-4 M) se halló la concentración de AuNPs dispersas en agua: 3.0x10-9 M.  A partir del coeficiente de extinción molar en el máximo. El coeficiente de extinción (ε) se obtuvo del diámetro de las nanopartículas según la siguiente ecuación experimental:14 (3.6) Como el tamaño medio de las AuNPs del presente trabajo es 14.8 nm, ε = 3.76x108 dm3mol-1cm-1. De manera que a partir del valor de absorbancia en el máximo (Amax = 0.116, para una dilución 1:10), por la ley de Lambert-Beer se obtuvo la concentración: 3.1x10-9 M. Como los tres procedimientos para el cálculo de concentración son válidos, se ha considerado como concentración la media de todos ellos: 3.0x10-9 M. 3.3.2. Síntesis y caracterización de nanopartículas de oro de 30 nm A pesar de la existencia de estudios con las proporciones de HAuCl4 y de citrato trisódico a añadir para obtener el tamaño deseado,13,136 no ha sido posible reproducir los resultados reportados en los mismos; por ello ha sido necesario probar diferentes proporciones de reactivos hasta obtener la síntesis con las características deseadas. El procedimiento fue análogo al realizado para la síntesis de AuNPs de 15 nm, pero con la diferencia de que se añadió la mitad de citrato sódico (1.5 ml). En este caso la disolución adquirió un color rojizo levemente rosáceo (véase la fotografía insertada en la Figura 3.3). El espectro de absorción revela que la posición de la banda SPR se encuentra a 525 nm (Figura 3.3), lo cual coincide con la bibliografía.13 Capítulo 3: Síntesis y caracterización de nanopartículas de oro. Fenómenos de agregación. Efecto del disolvente en la banda SPR. 64 [AuNPs] / M 5.0e-10 1.0e-9 1.5e-9 2.0e-9 2.5e-9 A700/A520 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 [AuNPs] = 1.24 x 10-9 M Figura 3.27. Evolución del grado de agregación conforme aumenta la concentración de AuNPs (14.8 nm) a una fuerza iónica constante de 0.07 M. La línea roja discontinua indica la concentración de AuNPs a la que se produce la disminución de la agregación. Los datos de absorbancia fueron tomados a los 10 minutos de mezclar los reactivos. A la vista de los resultados queda demostrada la necesidad de optimizar las concentraciones de NaCl si el objetivo es la detección colorimétrica, ya que no se trata de maximizar la agregación sino de conseguir una agregación cuya banda esté en el rango visible, siendo lo suficientemente estrecha y evitando en todo momento su desplazamiento al infrarrojo o su desaparición debido a un fenómeno de coagulación. Para la optimización de la concentración de sal se decidió trabajar con una concentración de AuNPs de 3.0x10-10 M. Aunque al observar la Figura 3.10 se podría pensar que otras concentraciones serían más idóneas, por ejemplo [AuNPs] = 1.2x10-9 M (punto del máximo), la concentración fijada para el presente trabajo tiene la ventaja de implicar, desde un punto de vista experimental, la adición de una alícuota pequeña de la solución coloidal madre (200 µl) a la cubeta, permitiendo una mayor flexibilidad en los estudios con múltiples componentes. Considerando la Figura 3.9, la concentración óptima de sal para AuNPs de 14.8 nm debe estar entre 0.05 M y 0.1 M. Se decidió por ello estudiar la evolución con el tiempo de la banda SPR a las concentraciones de sal mencionadas y a una intermedia (0.075 M). Para la concentración más baja de NaCl (Figura 3.11A) se produce una leve agregación que a partir de los 20 minutos (línea azul) apenas cambia. Para [NaCl] = 0.075 M (Figura 3.11B), a partir del minuto 5 (línea roja) el espectro presenta dos bandas cuyos máximos están localizados (para el minuto 5: λ1 = 535 nm, λ2 = 660 nm) y que se desplazan hacia el IR como consecuencia del aumento de tamaño del aglomerado con el tiempo. Por último, a la concentración más alta considerada (Figura 3.11C) se aprecia una floculación parcial del agregado (reflejado en los valores bajos de absorbancia que presenta respecto a las Figuras 3.11A y B) así como la banda 65 Longitud de onda / nm 400 500 600 700 800 Absorbancia 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 Minuto 0 Minuto 5 Minuto 10 Minuto 15 Minuto 20 Minuto 25 Minuto 30 Longitud de onda / nm 400 500 600 700 800 Absorbancia 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 Minuto 0 Minuto 5 Minuto 10 Minuto 15 Minuto 20 Minuto 25 Minuto 30 Longitud de onda / nm 400 500 600 700 800 Absorbancia 0.065 0.070 0.075 0.080 0.085 0.090 0.095 0.100 Minuto 0 Minuto 5 Minuto 10 Minuto 15 Minuto 20 Minuto 25 Minuto 30 Figura 3.28. Evolución de los espectros de absorción de AuNPs (14.8 nm) con el tiempo a diferentes concentraciones de NaCl: A) 0.05 M; B) 0.075 M; C) 0.1 M. A) B) C) Capítulo 3: Síntesis y caracterización de nanopartículas de oro. Fenómenos de agregación. Efecto del disolvente en la banda SPR. 66 correspondiente a las AuNPs agregadas es bastante ancha perdiendo casi su condición de máximo. Dado que el interés de la agregación es emplear las AuNPs como sensor colorimétrico tomando como referencia el color azul, la concentración óptima de sal resultó ser de 0.075 M. Los cambios de colores rojo-azul se pueden apreciar a simple vista y además se puede obtener una banda de absorción mejor definida que a [NaCl] = 0.1 M. Por otra parte, se observa también que a partir del minuto 20 tras la mezcla, la agregación es tan lenta que se pueden considerar los espectros invariables en el intervalo de tiempo entre los 20 y 30 minutos, estableciéndose éste como el intervalo de tiempo de trabajo. Se comprobó también si esta concentración óptima es válida para las AuNPs de 27 y 4.5 nm. Los espectros de absorción de estos dos sistemas coloidales con NaCl se muestran en la Figura 3.12, donde se puede observar que para las nanopartículas de 27 nm es posible seguir utilizando dicha concentración a pesar de que la banda se posiciona cerca del IR; para las de 4.5 nm hubo que aumentar la concentración de sal debido a la alta estabilidad que presentan, utilizándose una concentración 0.25 M. Nanopartículas más grandes son menos estables debido a que las fuerzas atractivas de van der Waals son mayores y viceversa. Longitud de onda / nm 400 500 600 700 800 Absorbancia 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 Minuto 1 Minuto 10 Minuto 30 Longitud de onda / nm 400 500 600 700 800 Absorbancia 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 [NaCl] = 0.10 M [NaCl] = 0.25 M [NaCl] = 0.50 M Figura 3.29. A) Espectros de absorción de AuNPs (27 nm) en presencia de NaCl a diferentes tiempos. [AuNPs] = 4.7x10-11 M, [NaCl] = 0.075 M. B) Espectros de absorción de AuNPs (4.5 nm) a los 30 minutos de adicionar diferentes concentraciones. [AuNPs] = 8.9 x10-9 M. 3.5. Efecto del disolvente en la banda de plasmón. Aplicación de la teoría de Mie A pesar de los pocos estudios existentes, es importante conocer la influencia del disolvente en la intensidad y forma de la banda de plasmón. Debido a que por sí mismo el disolvente puede provocar modificaciones en la banda SPR17 se llevó a cabo un estudio sobre el efecto de alcoholes tetraédricos (véase Figura 3.13) como el metanol, etanol, 2-propanol y el A) B) 67 terc-butanol con diferente grado de hidrofobicidad en la banda de plasmones de las nanopartículas de oro. Figura 3.30. Estructura de los alcoholes tetraédricos utilizados en el presente estudio. Conforme se sustituyen hidrógenos por grupos metilos aumenta la hidrofobicidad del alcohol. 3.5.1. Efecto de alcoholes tetraédricos en la banda SPR de AuNPs La Figura 3.14 muestra los efectos en la banda SPR provocados por la adición de diferentes cantidades de metanol y de etanol en la disolución. En el caso del alcohol más sencillo donde ningún hidrógeno ha sido sustituido por ningún grupo metilo (Figura 3.14A) no se observa ningún cambio en el color del coloide ni se aprecia movimiento del máximo del plasmón a ninguna proporción de metanol añadida. El color de las AuNPs permaneció rojo y las disoluciones fueron estables durante varios días. Un comportamiento similar se observó en las mezclas etanol-agua con la salvedad de que la banda SPR se desplazó ligeramente (Δλ = 2 nm), incluso a bajas cantidades del alcohol (véase Figura 3.14B). El comportamiento es completamente diferente para el sistema 2-propanol/agua donde se observaron cambios en el espectro de absorción. Conforme aumenta la cantidad de 2- propanol, la posición del máximo de la SPR se desplaza a longitudes de ondas mayores y se genera un hombro a 620 nm (véase Figura 3.15A). Este cambio es incluso más pronunciado en las mezclas terc-butanol/agua, donde en lugar de un hombro se obtuvo una banda a 655 nm (véase Figura 3.15B) Capítulo 3: Síntesis y caracterización de nanopartículas de oro. Fenómenos de agregación. Efecto del disolvente en la banda SPR. 68 Longitud de onda / nm 460 480 500 520 540 560 580 600 Absorbancia 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 XMeOH = 0.00 XMeOH = 0.10 XMeOH = 0.40 XMeOH = 0.60 XMeOH = 0.80 Longitud de onda / nm 460 480 500 520 540 560 580 600 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 XEtOH = 0.00 XEtOH = 0.10 XEtOH = 0.40 XEtOH = 0.50 XEtOH = 0.60 XEtOH = 0.73 Figura 3.31. Espectros normalizados de AuNPs (15.4 nm) a diferentes proporciones de codisolvente: A) metanol; B) etanol. La línea discontinua marca la posición original de la banda SPR (Xs = 0.00), que corresponde con λ = 520 nm. [AuNPs] = 2.9x10-10 M. Longitud de onda / nm 400 500 600 700 800 Absorbancia 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 X2-prop = 0.00 X2-prop = 0.10 X2-prop = 0.40 X2-prop = 0.57 X2-prop = 0.65 X2-prop = 0.67 Longitud de onda / nm 400 500 600 700 800 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 Xt-Bu = 0.00 Xt-Bu = 0.10 Xt-Bu = 0.42 Xt-Bu = 0.45 Xt-Bu = 0.50 Xt-Bu = 0.60 Xt-Bu = 0.63 Figura 3.32. Espectros de absorción de AuNPs (15.4 nm) en presencia de diferentes fracciones molares de: A) 2- propanol, B) terc-butanol. [AuNPs] = 2.9x10-10 M. La Figura 3.16 muestra la tendencia del grado de agregación (A631/A520) respecto a la concentración de 2-propanol y terc-butanol. Se puede observar que la pendiente para el tercbutanol (ΔA/ΔXt-BuOH = 3.32) es mayor que la del 2-propanol (ΔA/ΔX2-prop = 2.88). Además se observa como la aparición de la segunda banda en el terc-butanol tiene lugar a una fracción molar menor (Xt-BuOH = 0.42) que el hombro en el caso del 2-propanol (X2-prop = 0.57). Como se ha indicado antes, estos cambios colorimétricos no se observaron en los alcoholes más hidrofílicos (metanol y etanol). La Figura 3.17 muestra los colores de las muestras con los diferentes codisolventes a distintas fracciones molares. Resulta evidente que el aumento del A) B) A) B) 620 nm 655 nm 69 número de metilos provoca que los desplazamientos a longitudes de ondas mayores de la banda SPR sean más pronunciados. x2-prop 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 A631/A520 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 Xt-BuOH 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 Figura 3.33. A631/A520 de las AuNPs (15.4 nm) en función de la concentración de alcohol: A) 2-propanol, cuyas fracciones molares son 0.00, 0.10, 0.20, 0.32, 0.40, 0.50, 0.53, 0.57, 0.60, 0.65 y 0.67; B) terc-butanol, cuyas fracciones molares son 0.00, 0.10, 0.23, 0.30, 0.40, 0.42, 0.44, 0.50, 0.55, 0.60 y 0.63. El color rojo corresponde a los espectros donde no se observaron hombro o segunda banda, mientras que el color azul corresponde a los espectros que presentaron hombro o bandas adicionales. Figura 3.34. Fotografía con muestras de AuNPs prepradas en diferentes mezclas alcohol-agua. La primera fila corresponde al terc-butanol, con fracciones molares de 0.00, 0.10, 0.42, 0.50, 0.60 y 0.63. La siguiente corresponde al 2-propanol, con fracciones molares de 0.00, 0.10, 0.40, 0.57, 0.65 7 0.67. La tercera fila corresponde al etanol, cuyas fracciones molares son 0.00, 0.10, 0.40, 0.50, 0.60 y 0.73. La última corresponde al metanol, con fracciones molares de 0.00, 0.10, 0.40, 0.50, 0.60 y 0.80. A) B) Capítulo 3: Síntesis y caracterización de nanopartículas de oro. Fenómenos de agregación. Efecto del disolvente en la banda SPR. 70 3.5.2. Análisis del efecto del disolvente a través de la teoría de Mie Las variaciones en los espectros de absorción causadas por los alcoholes pueden deberse a un descenso de la constante dieléctrica del medio envolvente de las NPs. Cuando las partículas están lo suficientemente apartadas unas de otras como para considerar que no interaccionan, la constante dieléctrica del medio presenta una gran influencia en la posición e intensidad de la banda SPR.17,130,131 Esta dependencia queda patente en la ecuación de Mie (Ecuación 1.2 ó 1.3). Por ello, con el fin de determinar la dependencia de la longitud de onda de la banda SPR con la polaridad del medio, se determinó la posición del máximo de la banda a diferentes índices de refracción (Figura 3.18) correspondientes a las mezclas alcohol-agua estudiadas. Concretamente se midieron los índices de refracción de las diferentes mezclas alcohol-agua a su máxima fracción molar (véase Tabla 3.2). Tomando dichos valores, se calcularon los espectros teóricos de acuerdo a la teoría de Mie (Figura 3.19). Como se puede observar, en el caso del metanol el espectro es idéntico al de las AuNPs en agua, mientras que en el caso del etanol se produce un leve ensanchamiento de la banda haciendo que el centro ésta quede desplazado unos 2 nm: estos datos coinciden con los obtenidos experimentalmente. Sin embargo los espectros obtenidos por la teoría de Mie para el 2-propanol y el terc-butanol distan considerablemente de los experimentales: no se observa hombro ni formación de una banda adicional y el desplazamiento batocrómico es mucho menor que el real (Δλteor ~ 3-4 nm). Índice de refracción 1.30 1.35 1.40 1.45 1.50 1.55 1.60 1.65 Posición del máximo de la banda SPR / nm 520 525 530 535 540 545 550 max = 404.2 + 86.8  Figura 3.35. Variación de la longitud de onda de la banda SPR con el índice de refracción. Las longitudes de ondas fueron calculadas con el programa informático MiePlot, utilizando las funciones dieléctricas del oro tomadas de Johnson y Christy.112 71 Tabla 3.4. Índices de refracción de soluciones coloidales de oro (15.4 nm) a la máxima fracción molar de los diferentes codisolventes estudiados. [AuNPs] = 2.9x10-10 M Codisolvente Xs n Agua 1.00 1.3299 Metanol 0.80 1.3228 Etanol 0.73 1.3622 2-Propanol 0.67 1.3701 Terc-butanol 0.63 1.3803 Longitud de onda / nm 400 450 500 550 600 650 700 Absorbancia 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 Agua Metanol Etanol 2-Propanol t-Butanol Figura 3.36. Espectros teóricos de AuNPs de 15.4 nm a la máxima fracción molar de cada codisolvente. Los espectros fueron calculados con el programa informático MiePlot, utilizando las funciones dieléctricas del oro tomadas de Johnson y Christy.112 Con los datos de la Figura 3.18, a partir de los índices de refracción se obtuvo la posición teórica de la banda para la máxima fracción molar de cada alcohol y se contrastó con la obtenida experimentalmente (Tabla 3.3). Al comparar los valores teóricos con los experimentales, resulta evidente que los cambios colorimétricos en la solución coloidal para el 2-propanol y terc-butanol no son debidos a modificaciones en la constante dieléctrica del medio dispersante, o por lo menos no exclusivamente. Capítulo 3: Síntesis y caracterización de nanopartículas de oro. Fenómenos de agregación. Efecto del disolvente en la banda SPR. 72 Tabla 3.5. Comparación de los desplazamientos de la banda SPR según la teoría de Mie con los obtenidos experimentalmente (en el caso de hombro o segunda banda, se considera el desplazamiento de la primera banda como referencia). Codisolvente Xs Δλteor / nm Δλexp / nm Metanol 0.80 0 0 Etanol 0.73 2 2 2-Propanol 0.67 3 ~ 10 Terc-butanol 0.63 4 ~ 25 3.5.3. Interacción de los alcoholes con la superficie de las nanopartículas de oro Como se indicó en el capítulo 1, la teoría de Mie no es aplicable si tienen lugar fenómenos de agregación ya que dicha teoría desprecia las interacciones entre los campos electromagnéticos de las NPs vecinas.20 Por ello la única explicación plausible a estos espectros es que tenga lugar una cierta agregación de las nanopartículas a altas concentraciones de 2- propanol o terc-butanol. La Figura 3.20 muestra las imágenes de TEM para las disoluciones coloidales a la más alta fracción molar de cada disolvente, las cuales confirman la premisa de que los cambios en los espectros experimentales se deben mayormente a procesos de agregación. En el caso del metanol, las nanopartículas están dispersas (Figura 3.20A1) con un tamaño lógico dentro de la distribución de tamaño de la solución coloidal original (Figura 3.20A2). La misma situación se puede observar para el etanol (Figura 3.20B). Sin embargo, en las muestras con 2- propanol las imágenes TEM muestran agregación, con unas estructuras que superan los 60 nm (Figura 3.20C2). La agregación es incluso mayor en el caso del terc-butanol (Figura 2.20D). Ciertamente Ning Gu y colaboradores han observado que NPs de 10 nm se agregan en forma de “racimos de uva” en vez de agregados lineales cuando éstas son dispersadas en etanol.138 Sin embargo estos autores retiran el exceso de moléculas de citrato de disolución para transferir las NPs al disolvente orgánico. Es importante resaltar que han demostrado también que las AuNPs no se agregan cuando la concentración es menor de 3.3x10-6 M, situación que coincide con nuestro estudio donde la concentración es 2.9x10-10 M. 73 Figura 3.37. Imágenes TEM de AuNPs (15.4 nm) en mezclas agua-alcohol. A) AuNPs en presencia de metanol (XMeOH = 0.80), B) AuNPs en presencia de etanol (XEtOH = 0.73), C) AuNPs en presencia de 2-propanol (X2-prop = 0.67), D) AuNPs en presencia de terc-butanol (Xt-BuOH = 0.63). [AuNPs] = 2.9x10-10 M. A1 B1 C1 D1 A2 B2 C2 D2 Capítulo 3: Síntesis y caracterización de nanopartículas de oro. Fenómenos de agregación. Efecto del disolvente en la banda SPR. 80 81 4.1. Motivación, antecedentes y objetivos La optimización de la adsorción del ADN en la superficie de las AuNPs ha generado un gran interés por doble motivo. Por una parte, la propia secuencia de un oligonucleótido afecta al grado de adsorción del mismo,60,81 el cual puede llegar a anular la capacidad de hibridación de las moléculas de ADN ancladas en AuNPs.82 Por otro lado, el diseño adecuado de la secuencia del oligonucleótido permite la adsorción de la molécula sin necesidad de enlaces covalentes. Así por ejemplo se ha demostrado que el uso de bloques de poliA genera un anclaje no covalente de los oligonucleótidos, siendo posible el control tanto de los parámetros cinéticos y termodinámicos de la hibridación como de la densidad de superficie según la longitud de los bloques poliA.140 Con el fin de explorar la capacidad de adsorción de oligonucleótidos anclados en la superficie de la AuNP (vía enlace S-Au), el grupo de Letsinger y Mirkin estudió la agregación producida por nucleósidos en el oro coloidal para establecer un orden de afinidad que extrapolar a ADN de cadena corta.60 Para una concentración fija de AuNPs, observaron que la desoxicitidina (dC) presentaba la banda de agregación a 693 nm mientras que la desoxitimidina (dT) no provocaba agregación alguna (λmax = 520 nm). Entre estas dos situaciones extremas, la desoxiguanosina (dG) y la desoxiadenosina (dA) presentaban la banda a 667 nm y a 650 nm, respectivamente. De manera que establecieron el siguiente orden de afinidad: dC > dG > dA >> dT. Por otra parte, el mismo orden de afinidad fue obtenido para las nucleobases por calorimetría de titulación isotérmica (CTI),71 lo cual es lógico si se considera que la interacción del monómero con las AuNPs tiene lugar por la base.69,70 En el caso de los nucleótidos, la adsorción de éstos produce un aumento en la estabilidad del coloide ya que se produce un aumento de la carga negativa en la superficie de la NP.141 Basándose en este hecho, Jun Yang y colaboradores estudiaron la protección ejercida por ellos al proceso de agregación de las AuNPs causado por el propio tampón del sistema (tampón 4. Interacción de monómeros del ADN con nanopartículas de oro Capítulo 4: Interacción de monómeros del ADN con nanopartículas de oro 82 fosfato salino, PBS).49 El orden de afinidad obtenido fue diferente al de los estudios anteriores: dAMP > dGMP > dCMP > dTMP. La diferencia en estos resultados puede ser justificada si se considera que las condiciones experimentales fueron diferentes en cada estudio: lo primero y más importante, se utilizaron nanopartículas de diferentes tamaños; el uso de diferentes tampones y trabajar a distinta fuerza iónica tiene una gran influencia en el monómero (véase capítulo 1), pudiendo alterar su interacción con las AuNPs;48 las concentraciones empleadas, la proporción ligando/NP e incluso el tamaño de las alícuotas y muestras fueron diferentes. Los detalles de estas condiciones quedan recogidos en la Tabla 4.1. Tabla 4.8. Condiciones experimentales de los estudios cualitativos de la interacción entre AuNPs y monómeros del ADN Ganesh y Sastry71 Letsinger y Mirkin60 Yang49 Tamaño de las AuNPs Tamaño de las AuNPs Tamaño de las AuNPs 6.5 nm 16.2 nm 5 nm [AuNPs] [Base] [AuNPs] [Nucleósido] [AuNPs] [Nucleótido] 86.4 µM 0.42 mM 6.4 nM 5 µM 0.21 µM 20.6 µM Orden de adición Orden de adición Orden de adición 300 µl B → 1.47 ml AuNPs 1 µl N → 1 ml AuNPs 130 µl N → 500 µl AuNPs Proporción Proporción Proporción 5:1 781:1 100:1 A pesar de la utilidad que presenta el conocer la interacción monómero-AuNPs, escasos estudios se han centrado en cuantificar dicha interacción así como en profundizar las diferencias entre las bases, nucleósidos y nucleótidos como acaba de describirse. Excluyendo un par de trabajos sobre la desorción de moléculas en películas finas de oro,142,143 en la bibliografía sólo se registra el trabajo antes mencionado por el equipo de Ganesh y Sartry.71 En éste, confirmaron por CTI que la interacción era exotérmica y dependiente del complejo formado; el rango de valores de energía comprendía desde -250 a -732 cal·mol-1, y el orden de interacción seguía la tendencia: C > G > A > T. Los valores resultaron bajos comparados a los obtenidos con películas de oro,142,143 según los autores consecuencia de la necesidad de remover las moléculas que se encuentran en la superficie de las nanopartículas.42 A raíz de lo expuesto queda patente que la necesidad de profundizar en el estudio de las interacciones monómeros-AuNPs, siendo el principal objetivo del presente capítulo el establecimiento de los órdenes de afinidad de forma cuantitativa. Además, ante la ausencia de trabajos donde se estudie la influencia de la complejidad del monómero en la interacción, se pretende determinar cuantitativamente la interacción de un nucleósido y de un nucleótido 83 monofosfato con el fin de compararlo con su respectiva base. Un último objetivo adicional del presente capítulo es el estudio de la influencia del pH en la interacción monómero-AuNPs. 4.2. Materiales y métodos 4.2.1. Materiales La adenina (A), citosina (C), guanina (G), timina (T), adenosina (Ad), adenosina monofosfato (AMP) y el NaCl fueron adquiridos de la casa comercial Merck. Todos los reactivos se utilizaron sin ninguna purificación previa. Las disoluciones se prepararon en agua desionizada, siendo su conductividad menor a 10-6 S·m-1. Las nanopartículas de 14.8 ± 1.8 nm fueron sintetizadas y caracterizadas como se describió en el Capítulo 3. 4.2.2. Espectros de absorción en el UV-vis 4.2.2.1. Espectros de absorción para la titulación de monómeros con AuNPs Los espectros de cada muestra fueron registrados una hora después de añadir el monómero a estudiar (base o nucleósido), tiempo en el que los espectros eran prácticamente invariables, tomándose éste como límite máximo de la medida. Las experiencias se realizaron con AuNPs de 14.8 nm, a concentración fija [AuNPs] = 3.0 x10-10 M, en presencia de distintas cantidades de monómero en el intervalo en el que se producía el cambio de color de las muestras. 200 µl de la solución coloidal sintetizada fueron añadidos en una cubeta de cuarzo para posteriormente añadirles 1800 µl de una alícuota con concentración variable del ligando, para posteriormente reservarla en un termobloque (a 298 K) hasta la determinación del espectro. Las titulaciones se realizaron un mínimo de tres veces para comprobar la reproducibilidad del sistema. Se comprobó el valor de pH y la posible variación a diferentes concentraciones de monómero, siendo ésta: pH = 6.2 ± 0.2. En el caso de las experiencias a diferente pH, en la cubeta se añadió 100 µl de HCl (2x10-3 M) o de NaOH (2x10-3 M) según el pH del sistema. Posteriormente se añadió 1700 µl de una alícuota con concentración variable de adenina. Por último se añadieron 200 µl de la solución coloidal para posteriormente reservarla en un termobloque (a 298 K) hasta la determinación del espectro. Capítulo 4: Interacción de monómeros del ADN con nanopartículas de oro 84 4.2.2.2. Espectros de absorción para el estudio de protección a la agregación del AMP Los espectros de cada muestra fueron registrados 30 minutos después de la adición de NaCl. A los 30 minutos los espectros eran prácticamente invariables, tomándose este tiempo como límite máximo de la medida. Las experiencias se realizaron con AuNPs de 14.8 nm, a concentración fija [AuNPs] = 3.0 x10-10 M y [NaCl] = 0.075 M y a distintas cantidades de AMP. 200 µl de la solución coloidal sintetizada fueron añadidos en una cubeta de cuarzo para posteriormente añadirles 1600 µl de una alícuota con concentración variable de AMP. Finalmente la adición de 200 µl de NaCl (0.75 M) se tomó como tiempo cero, y la muestra se reservó en un termobloque (a 298 K) hasta el registro del espectro. Los espectros se repitieron un mínimo de tres veces con diferentes muestras para comprobar la reproducibilidad del sistema. Se comprobó si la adición de AMP a diferentes concentraciones provocaba variaciones del pH, obteniéndose: pH = 6.2 ± 0.1. 4.2.2.3. Espectros de absorción para el estudio cinético de las interacciones de las bases con las AuNPs La reacción se siguió a través de los cambios de los valores de absorbancia a 520 nm (posición de la banda asociada a las nanopartículas dispersas) y a una longitud de onda asociada al agregado de mayor tamaño (λ = 671 nm para la adenina, λ = 635 nm para la timina y λ = 684 nm para la citosina) para el proceso de agregación de las AuNPs. La temperatura se mantuvo constante a 298 K. La concentración de oro se mantuvo constante: [AuNPs] = 3.0 x10-10 M. 4.2.3. Espectros de Resonancia Magnética Nuclear de protones Los espectros de cada muestra fueron registrados una hora después de añadir la base a estudiar, siendo la concentración de éstas 10-3 M .La temperatura de medición (a no ser que se indique lo contrario) fue 278 K. La muestra de oro coloidal en ausencia de las bases era de una concentración 2.7 x10-9 M (y por lo tanto 10-3 M de citrato); la concentración de nanopartículas en las muestras que contenían adenina o timina fue 9.1 x10-10 M (y de citrato 3.5 x10-4 M). Para los espectros que requirieron una señal de referencia, se añadieron a las muestras el ácido 3-(trimetilsilil)-2,2,3,3-tetradeuteradopropanoico (TMSP) como molécula referente. Todas las muestras en ausencia de TMSP se prepararon con 540 µl de disolución acuosa protonada y 60 µl de agua deuterada. Las muestras que necesitaron referente se prepararon con 540 µl de disolución acuosa protonada, 50 µl de agua deuterada y 6 µl de TMSP. 85 La secuencia de pulsos para los experimentos de excitation sculpting water suppression fue: zgesgp; p90º (12.7 W) = 8.45 µs (con forma SMSQ10.100). Se utilizaron gradientes en el eje Z de 1 ms de duración y amplitudes del 31% y 11% respectivamente para el módulo de excitation sculpting. El ancho espectral fue de 16 ppm (para los espectros de la adenina) y de 25 ppm (para los espectros de la timina) centrado en la señal del agua. La señal del agua se invirtió selectivamente mediante un pulso con forma (Sinc1.1000) de 2.4 ms. Y se registraron 16 scans. El espectro se procesó con un factor de ensanchamiento (lb) de 3 Hz con una función ventana exponencial. En el caso de los experimentos WaterLOGSY, la señal del agua se invirtió mediante un pulso gaussiano de 180º (Gaus1_180i.1000). El tiempo de mezcla waterLOGSY fue de 1.5 s durante el cual se aplicó un gradiente rectangular de baja intensidad (0.2%). La intensidad de la señal del agua se suprimió mediante una secuencia de excitation sculpting. El ancho espectral fue de 16 ppm en el caso de la adenina o de 25 ppm en el caso de la timina, y se registraron 32 scans. El espectro se procesó con un factor de ensanchamiento (lb) de 3 Hz con una función ventana exponencial. 4.2.4. Medidas de índice de refracción Las medidas de los índices de refracción de las disoluciones a diferentes cantidades de base se realizaron con ayuda de un refractómetro digital Abbe “WYA-1S”. Basado en la calibración con disoluciones de índice de refracción conocido, el error absoluto estimado fue ±0.0004. 4.2.5. Obtención de los parámetros CIELab La conversión de las medidas de transmitancia a los parámetros del sistema cromático CIELab se llevó a cabo por el uso de ecuaciones estándares CIE para convertir medidas experimentales de transmitancia a valores cromáticos XYZ, y entonces a L*a*b*. 4.2.6. Análisis de deconvolución La deconvolución de los espectros experimentales se realizó con la ayuda del programa Fityk.115 En todos los casos las bandas asociadas a la Resonancia del Plasmón Superficial de las nanopartículas fueron ajustadas a funciones Voigt. El modelo de deconvolución considera que la banda de las AuNPs dispersas es la centrada alrededor de 522 nm, mientras que las bandas Capítulo 4: Interacción de monómeros del ADN con nanopartículas de oro 86 con mayores longitudes de onda se asocian a diferentes estructuras de aglomerados. Además se fijó una banda (función gaussiana) a 400 nm para corregir el efecto de dispersión de luz y de la transición entre bandas de las NPs metálicas.132 En todos los casos el error de análisis entre el espectro simulado y el experimental resultó ser menor del 5%. 4.3. Interacción de las nucleobases con nanopartículas de oro 4.3.1. Adenina La gran capacidad del oro coloidal como biosensor queda reflejada en la Figura 4.1, que muestra la evolución de la banda SPR y los cambios colorimétricos de AuNPs (14.8 nm) en presencia de diferentes concentraciones de adenina. A bajas concentraciones (1.00 x10-7 a 3.50 x10-7 M) se detectó un leve ensanchamiento de la banda, sin causar cambio colorimétrico alguno en las muestras (celdas 1-4 en la Figura 4.1). Sin embargo, cuando se generó el hombro (línea discontinua roja, [adenina] = 3.75 x10-7 M) se observó que las muestras adquirieron un tono morado que se torna azul conforme la definición de la banda de agregación mejoraba. Longitud de onda / nm 400 500 600 700 800 Absorbancia 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 Figura 4.42. A) Titulación espectroscópica de AuNPs con adenina. Los espectros fueron tomados 1 hora después de añadir la base y corresponden a un intervalo de [adenina] = 1.00 x10-7 a 1.00 x10-6 M. B) Fotografías de las muestras 1 hora después de mezclar la adenina con las AuNPs. Cada casilla tiene una concentración diferente de adenina: 1) 0.00 M; 2) 3.00 x10-7 M; 3) 3.25x 10-7 M; 4) 3.5 x10-7 M; 5) 3.75 x10-7 M; 6) 4.00 x10-7 M; 7) 4.25 x10-7 M; 8) 4.50 x10-7 M; 9) 4.75 x10-7 M; 10) 5.00 x10-7 M; 11) 5.25 x10-7 M; 12) 1.00 x10-6 M. La Figura 4.2 muestra la evolución del grado de agregación (A671/A520: proporción de la absorbancia a 671 nm, donde se posiciona la banda asociada a las AuNPs agregadas con la absorbancia de las AuNPs libres, cuya banda se encuentra a 520 nm) a distintas cantidades de adenina. La tendencia obtenida fue sigmoidal: a altas concentraciones se produce la saturación 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A) B) 671nm 87 de las AuNPs. Sin embargo se puede observar un ligero descenso en los últimos puntos. Al medir los espectros de las AuNPs a concentraciones más altas de adenina ([A]>10-6 M) se observó que se producía un retroceso en la agregación de 9 nm en la posición de la banda (Figura 4.3). Este fenómeno puede deberse a la formación de dímeros de adenina,144 que conllevaría a que la concentración de adenina en disolución no fuese la real que interacciona con las nanopartículas. [adenina] / M 0 2e-7 4e-7 6e-7 8e-7 1e-6 A671/A520 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 Figura 4.43. Evolución del grado de agregación (A671/A520) de AuNPs con la concentración de adenina. Longitud de onda / nm 550 600 650 700 750 Absorbancia 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 Figura 4.44. Espectros de UV-visible de AuNPs en el rango de concentración de adenina donde se produce la reversión en la agregación (1.00 x10-6 a 9.00 x10-6 M). Las marcas indican la posición de la banda de agregación antes y después de la reversión. 671 nm 662 nm Capítulo 4: Interacción de monómeros del ADN con nanopartículas de oro 88 La variación de absorbancia a 671 nm por cada nanopartícula (ΔAbs/[AuNPs]) con la proporción ligando/receptor ([adenina]/[AuNPs]) mostró dos partes lineales (Figura 4.4), de cuya intersección se obtuvo el número de moléculas de adenina por NP implicadas en el proceso.145 Por el mismo procedimiento, con tres valoraciones diferentes de adenina con AuNPs, se obtuvo un valor medio de 1900 ± 100 moléculas de adenina por NP. Aunque sería posible obtener dicho valor a partir del punto de saturación (véase Figura 4.2), este procedimiento requiere establecer dicho punto con mucha precisión ya que de lo contrario se obtendrían valores distantes al mencionado (véase Anexo 1 para una discusión en mayor profundidad). [adenina]*[AuNPs]-1 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 (Abs)*[AuNPs]-1/M-1 -1e+8 0 1e+8 2e+8 3e+8 4e+8 5e+8 Figura 4.45. Determinación del número de moléculas de adenina que interaccionan (n) por diferencias de absorbancia a 671 nm. La intersección de las dos líneas proporciona n. La concentración de AuNPs fue fijada a 3.0 x10-10 M. La Figura 4.5 muestra la cinética del proceso de agregación para tres concentraciones diferentes de adenina, donde se puede observar que la velocidad de dicha agregación aumenta conforme lo hace la concentración de adenina. De hecho a la concentración más alta (10-6 M) se observa que la agregación se ha completado sobre los 10 minutos al considerar los valores de absorbancia a 671 nm (Figura 4.5B); sin embargo cuando se contrasta con la misma serie de datos pero a 520 nm se observa que la cantidad de AuNPs libres sigue disminuyendo. Esto es debido a que la agregación no sólo afecta a la intensidad de la banda, sino a la anchura de la misma como se pudo observar en la Figura 3.11B y 3.11C; de manera que realmente se siguen formando agregados, aumentando la distribución del tamaño aunque la posición de la banda se mantenga. Por ello para una concentración 4x10-7 M se sigue observando un consumo de reactivo (AuNPs libres) aunque la producción de agregados es casi despreciable, ya que se están formando estructuras de un tamaño inferior a las que le corresponden una banda SPR asociada a los 671 nm. 89 t / min 010 20 30 40 50 60 70 Absorbancia a 520 nm 0.085 0.090 0.095 0.100 0.105 0.110 0.115 t / min 010 20 30 40 50 60 70 Absorbancia a 671nm 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 Figura 4.46. Cambios en las intensidades de absorbancia de soluciones de oro coloidal ([AuNPs] = 3.0 x10-10 M) en presencia de diferentes concentraciones de adenina. Las concentraciones de adenina son: 4.00 x10-7 M (círculos negros), 5.00 x10-7 M (estrellas rojas) y 1.00 x10-6 M (triángulos verdes). Los datos de absorbancia son a: A) 520 nm, que corresponde a las nanopartículas libres; B) 671 nm, que corresponde a las nanopartículas agregadas. Para la cuantificación de la interacción entre la adenina y las AuNPs se utilizó la ecuación de Benesi-Hildebrand como método de ajuste:146 4.1 donde Kf es la constante de formación del complejo, P es la propiedad medida, ε es un coeficiente que depende de P, y S hace alusión a la biomolécula que actúa como sustrato, en este caso adenina. Para un uso correcto de dicha ecuación es necesario que exista una correlación de primer orden entre la propiedad P y la concentración del complejo; de hecho, la ecuación original se aplica para la absorbancia, siendo P ésta y ε el coeficiente de absorción molar a la longitud de onda a la que se tomó la absorbancia. Si se considera que el sistema a estudiar viene descrito por la siguiente expresión: 4.2 a partir de los datos de la banda SPR correspondiente a las AuNPS agregadas se puede obtener la constante de unión y por extensión la energía libre del proceso (ΔG0) para el complejo AuNPs/adenina, ya que las diferentes bandas SPR están directamente asociadas a la concentración del complejo (a través de la ley de Lambert-Beer). La Figura 4.6 muestra el ajuste de las relaciones de absorbancia a 671 y 520 nm (A671/A520) para el intervalo de [adenina] = 3.25 x10-7 - 5.25 x10-7 M, rango en el que se produce la linealidad. Del ajuste se obtuvo un valor medio de Kf = (2.0 ± 0.2) x 106 dm3mol-1, que corresponde a una energía libre de unión ΔG0 = -35.9 ± 0.2 kJmol-1. Se utilizó el grado de A) B) Capítulo 4: Interacción de monómeros del ADN con nanopartículas de oro 96 [timina] / M 0.0 2.0e-6 4.0e-6 6.0e-6 8.0e-6 1.0e-5 1.2e-5 1.4e-5 1.6e-5 A635/A520 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 [timina]*[AuNPs]-1 010000 20000 30000 40000 50000 60000 Abs)*[AuNPs]-1/M-1 0 5e+7 1e+8 2e+8 2e+8 3e+8 3e+8 Figura 4.53. A) Evolución del grado de agregación (A635/A520) de AuNPs con la concentración de timina. B) Determinación del número de moléculas de timina que interaccionan (n) por diferencias de absorbancia a 635 nm. La intersección de las dos líneas proporciona n. La concentración de AuNPs fue fijada a 3.0 x10-10 M. La Figura 4.13 muestra la cinética del proceso de agregación para tres concentraciones diferentes de timina, de las cuales una es muy superior a las utilizadas en la titulación (10-4 M). A esta concentración se observa que la reacción no terminó en el intervalo de tiempo estudiado, lo que significa que el proceso de agregación por la timina es más lento que en el caso de la adenina. t / min 010 20 30 40 50 60 70 Absorbancia a 520 nm 0.096 0.098 0.100 0.102 0.104 0.106 0.108 0.110 0.112 0.114 0.116 t / min 010 20 30 40 50 60 70 Absorbancia a 635 nm 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 Figura 4.54. Cambios en las intensidades de absorbancia de soluciones de oro coloidal ([AuNPs] = 3.0 x10-10 M) en presencia de diferentes concentraciones de timina. Las concentraciones de timina son: 3.0 x10-6 M (círculos negros), 1.0 x10-5 M (estrellas rojas) y 1.0 x10-4 M (triángulos verdes). Los datos de absorbancia son a: A) 520 nm, que corresponden a las nanopartículas libres; B) 635 nm, que corresponde a las nanopartículas agregadas. A) B) A) B) 97 A partir del ajuste de las proporciones de absorbancia a 635 nm y 520 nm (A635/A520) con la ecuación de Benesi-Hildebrand para el intervalo de [timina] = 3.0 x10-6 a 9.0 x10-6 M (véase Figura 4.14), se obtuvo un valor medio de Kf = (4.0 ± 1.8) x104 dm3mol-1, que corresponde a una energía libre de unión ΔG0 = -26.1 ± 1.1 kJ mol-1. Al igual que en la adenina, se observaron errores muy grandes para los valores que se obtendrían si se ajustasen los datos de absorbancia a 520 nm, mientras que los datos de las nanopartículas agregadas (A635) se ajustaron proporcionando el mismo valor [(4 ± 2) x104 dm3mol-1] que se obtuvo con el grado de agregación. [timina]-1/M-1 1.0e+5 1.5e+5 2.0e+5 2.5e+5 3.0e+5 3.5e+5 [AuNPs]*(A520/A635)/M 0.0 5.0e-10 1.0e-9 1.5e-9 2.0e-9 2.5e-9 Figura 4.55. Ajuste por la ecuación de Benesi-Hildebrand para la relación de absorbancia A635/A519 en el intervalo [timina] = 3.0 x10-6 M a 9.0 x10-6 M. La evolución de los parámetros colorimétricos (a* y b*) con la concentración de timina se muestran en la Figura 4.15. A diferencia del caso anterior, la componente roja (a*> 0) se mantiene positiva en todo el rango de estudio, lo que significa que las muestras en el caso de la timina son más rojas (o menos verdes) que las que contiene adenina. La aparición del color morado coincide con el punto en que comienza a disminuir a* (4.0 x10-6 M) mientras que el predominio de la componente azul se produjo a partir de 1.0 x10-5 M, donde las muestras son totalmente azules. El parámetro L* osciló entre 92 y 94 de nuevo. La Figura 4.16 muestra los ajustes de a* y b* según la ecuación de Benesi-Hildebrand. Aunque en el parámetro a* no se producen variaciones de signo, debido a la dispersión de sus puntos (observada en las diferentes muestras), se obtuvieron valores de la constante de unión mayores a los calculados por absorbancia [Kf = (1.6 ± 0.7) x105 dm3mol-1). Sin embargo, en el caso de b*, a pesar de producirse la asíntota mencionada en la subsección anterior, los valores de la constante de formación fueron próximos a los esperados: Kf = (5.7 ± 0.3) x104 dm3mol-1. Capítulo 4: Interacción de monómeros del ADN con nanopartículas de oro 98 [timina] / M 0.0 2.0e-6 4.0e-6 6.0e-6 8.0e-6 1.0e-5 1.2e-5 1.4e-5 1.6e-5 X* -4 -2 0 2 4 6 8 10 a* b* Figura 4.56. Variación de los parámetros coloriméticos a* y b* a diferentes concentraciones de timina. Dichos parámetros se obtuvieron según la teoría de espacios del color CIElab, siendo L* = 93 ± 1. [timina]-1 / M-1 8.0e+4 9.0e+4 1.0e+5 1.1e+5 1.2e+5 1.3e+5 1.4e+5 1.5e+5 [AuNPs] (a*)-1 / M 0.0 5.0e-11 1.0e-10 1.5e-10 2.0e-10 2.5e-10 [timina]-1 / M-1 9.0e+4 1.0e+5 1.1e+5 1.2e+5 1.3e+5 1.4e+5 1.5e+5 1.6e+5 1.7e+5 [AuNPs] (b*)-1 / M -7e-10 -6e-10 -5e-10 -4e-10 -3e-10 -2e-10 -1e-10 Figura 4.57. Ajustes de los parámetros colorimétricos obtenidos por la teoría CIElab a la ecuación de Benesi- Hildebrand. A) Ajuste lineal del parámetro a* en el intervalo [timina] = 6.0x10-6 - 1.0x10-5 M. B) Ajuste lineal del parámetro b* en el intervalo [timina] = 6.0 x10-6 – 1.0 x10-5 M. Al igual que para la adenina, se obtuvo también el valor de la constante de unión con las áreas de las bandas asociadas a las AuNPs agregadas tras el análisis de deconvolución. La Tabla 4.4 muestra la posición de las diferentes bandas obtenidas y sus correspondientes áreas, así como la proporción de áreas de las AuNPs libres y las agregadas. La Kf obtenida por la ecuación de Benesi-Hildebrand fue de (3.2 ± 1.7) x 104 dm3mol-1 (véase Figura 4.17), lo que es igual a ΔG0 = -25.5 ± 1.4 kJmol-1. A) B) 99 Tabla 4.11. Parámetros obtenidos por la deconvolución de los espectros experimentales a diferentes concentraciones de timina. El subíndice 1 se refiere a las nanopartículas libres mientras que los subíndices 2 y 3 se refieren a los diferentes complejos de AuNPs agregadas. [Timina]/ M λ1/nm Área1 λ2/nm Área2 λ3/nm Área3 Alibre Aagre 0 523 11.842 - - - - 1.000 0.000 1.0 x10-6 523 11.683 - - - - 1.000 0.000 2.0 x10-6 523 6.686 - - - - 1.000 0.000 3.0 x10-6 522 5.293 592 1.617 - - 0.766 0.234 4.0 x10-6 522 4.408 598 4.649 - - 0.487 0.513 5.0 x10-6 521 3.538 597 3.353 - - 0.513 0.487 6.0 x10-6 520 3.189 598 4.654 - - 0.407 0.593 7.0 x10-6 520 2.443 605 5.663 - - 0.301 0.699 8.0 x10-6 521 2.263 572 0.194 624 10.262 0.178 0.822 9.0 x10-6 522 2.383 576 0.47 631 10.820 0.174 0.826 1.0 x10-5 522 2.386 575 1.159 636 11.556 0.158 0.842 1.1 x10-5 522 2.040 573 0.734 641 8.879 0.175 0.825 1.2 x10-5 520 1.725 618 7.857 654 4.522 0.122 0.878 1.3 x10-5 522 2.236 584 3.663 647 10.862 0.133 0.867 1.4 x10-5 520 3.916 595 5.118 653 9.751 0.208 0.792 1.5 x10-5 525 2.321 608 7.342 660 6.448 0.144 0.856 [timina]-1 /M-1 1.0e+5 1.2e+5 1.4e+5 1.6e+5 1.8e+5 2.0e+5 2.2e+5 2.4e+5 2.6e+5 [AuNPs]*(Aagre)-1 / M 3e-10 4e-10 5e-10 6e-10 7e-10 8e-10 9e-10 1e-9 Figura 4.58. Ajuste de la proporción de áreas correspondientes a las AuNPS agregadas por la ecuación de Benesi- Hildebrand. El ajuste se realizó en el intervalo [timina] = 4.0 x10-6 a 8.0 x10-6 M. Capítulo 4: Interacción de monómeros del ADN con nanopartículas de oro 100 4.3.3. Citosina La desoxicitidina es el nucleótido que provoca desplazamientos a mayores longitudes de onda de la banda SPR de AuNPs de 16.2 nm.60 Por otro lado la citosina presenta la mayor energía de interacción (determinada por calorimetría de titulación isotérmica) para nanopartículas de oro con un tamaño de 6.5 nm.71 La Figura 4.18 muestra los espectros de absorción de AuNPs de 14.8 nm a diferentes concentraciones de citosina y los cambios colorimétricos de las muestras. A concentraciones superiores a 4 x10-7 M se observó una reversión de 6 nm de la posición de la banda SPR (véase Figura 4.19), la cual responde también a la tendencia a formar dímeros que presenta la adenina.144 A concentraciones superiores a 5.0 x10-7 M dicha reversión se estabiliza, posicionándose la banda a 684 nm. Longitud de onda / nm 400 500 600 700 800 Absorbancia 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 Figura 4.59. A) Titulación espectroscópica de AuNPs con citosina. Los espectros fueron tomados 1 hora después de añadir la base y corresponden a un intervalo de [citosina] = 1.0 x10-7 a 5.0 x10-7 M. B) Fotografías de las muestras 1 hora después de mezclar la citosina con las AuNPs. Cada casilla tiene una concentración diferente de citosina: 1) 0.0 M; 2) 1.0 x10-7 M; 3) 2.0x 10-7 M; 4) 2.4 x10-7 M; 5) 2.6 x10-7 M; 6) 2.8 x10-4 M; 7) 3.0 x10-7 M; 8) 3.2 x10-7 M; 9) 3.4 x10-7 M; 10) 3.6 x10-7 M; 11) 4.0 x10-7 M; 12) 5.0 x10-7 M. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A) B) 101 Longitud de onda / nm 600 650 700 750 800 Absorbancia 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 Longitud de onda/ nm 600 650 700 750 800 Absorbancia 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 Figura 4.60. A) Espectros de UV-visible de AuNPs en el rango de concentración de citosina donde se produce la reversión en la agregación (3.2 x10-7 a 5.0 x10-7 M). Las marcas indican la posición de la banda de agregación antes y después del proceso de reversión. B) Espectros de UV-visible de AuNPs a concentraciones de citosina superiores a 5.0 x10-7 M. Como en los casos anteriores, el grado de agregación (A684/A520) mostró una tendencia sigmodial respecto a la concentración de nucleobase (Figura 4.20A). El cálculo del número de moléculas de citosina que participan en el proceso de agregación se realizó a partir de las variaciones de absorbancia a 684 nm por AuNP (ΔA / [AuNPs]), obteniéndose un valor de n = 1050 ± 65 moléculas de citosina por NP (figura 4.20B). [citosina] / M 0 1e-7 2e-7 3e-7 4e-7 5e-7 6e-7 A684/A520 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 [citosina]*[AuNPs]-1 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 Abs)*[AuNPs]-1/M-1 0 1e+8 2e+8 3e+8 4e+8 5e+8 Figura 4.61. A) Evolución del grado de agregación (A684/A520) de AuNPs con la concentración de citosina. B) Determinación del número de moléculas de citosina que interaccionan (n) por diferencias de absorbancia a 684 nm. La intersección de las dos líneas proporciona n. La concentración de AuNPs fue fijada a 3.0 x10-10 M. A) B) 690 nm 684 nm A) B) Capítulo 4: Interacción de monómeros del ADN con nanopartículas de oro 102 t / min 010 20 30 40 50 60 70 Absorbancia a 520 nm 0.08 0.09 0.10 0.11 0.12 0.13 t / min 010 20 30 40 50 60 70 Absorbancia a 684 nm 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 Figura 4.62. Cambios en las intensidades de absorbancia de soluciones de oro coloidal ([AuNPs] = 3.0 x10-10 M) en presencia de diferentes concentraciones de citosina. Las concentraciones de citosina son: 2.3 x10-7 M (círculos negros), 3.0 x10-7 M (estrellas rojas) y 1.0 x10-6 M (triángulos verdes). Los datos de absorbancia son a: A) 520 nm, que corresponden a las nanopartículas libres; B) 684 nm, que corresponde a las nanopartículas agregadas. La Figura 4.21 muestra cómo evoluciona la absorbancia a dos longitudes de onda con el tiempo: a 520 nm para seguir la cinética de las AuNPs no agregadas y a 684 nm para seguir la formación de agregados. Conforme aumenta la concentración de citosina el proceso de agregación es más rápido (compárese las pendientes de las tres curvas). A la concentración más alta (10-6 M), la agregación continúa ya que no se produce estabilización de la absorbancia a 520 nm, debido al ensanchamiento de la banda por la formación de agregados de mayor tamaño. La Figura 4.22 muestra el ajuste obtenido por la ecuación de Benesi-Hidelbrand de los valores de A684/A520 según la concentración de citosina en el intervalo de 2.0 x 10-7 a 2.8 x10-7 M. La constante obtenida presentó un valor de Kf = (3.2 ± 0.2) x106 dm3mol-1, que corresponde a ΔG0 = -37.2 ± 0.1 kJ mol-1. Al igual que en los casos anteriores, el uso de la absorbancia a 520 nm para obtener las constantes proporcionó valores muy dispares mientras que en el caso de la absorbancia a 684 nm se obtuvieron valores coherentes [(3.1 ± 0.3) x106 dm3mol-1]. A) B) 103 [citosina] -1 / M-1 3.4e+6 3.6e+6 3.8e+6 4.0e+6 4.2e+6 4.4e+6 4.6e+6 4.8e+6 5.0e+6 5.2e+6 [AuNPs]*(A519)*(A684)-1/M 0 5e-10 1e-9 2e-9 2e-9 3e-9 3e-9 Figura 4.63. Ajuste por la ecuación de Benesi-Hildebrand para la relación de absorbancia A684/A520 en el intervalo [citosina] = 2.0 x10-7 a 2.8 x10-7 M. Al igual que en el caso de la adenina, los parámetros colorimétricos presentaron un cambio de signo (Figura 4.23): a partir de 2.2 x10-7 M el parámetro b* pasa a ser negativo, mientras que la transición a valores negativos para a* se produce en 2.8 x10-7 M. Hasta 2.5 x10-7 M la componente del color rojo predomina, aunque se observan colores morados en las muestras debido a la influencia de b*; a partir de ese punto la componente azul sobrepasa al parámetro a* tomando las muestras colores violáceos y azules. El parámetro L* osciló entre 91.5 y 92. Como consecuencia de ello, la tendencia de dichos parámetros al ajustarlos a la ecuación de Benesi-Hildebrand es asintótica (Figura 4.24). A pesar de producirse una desviación de la linealidad, el ajuste a la ecuación de una recta en un intervalo pequeño de concentraciones (véase las ampliaciones de los gráficos de la Figura 4.24) proporcionó valores bastante similares a los obtenidos con las absorbancias, aunque con un error muy considerable [para a* se obtuvo Kf = (3 ± 2) x106 dm3mol-1 y para b* fue Kf = (2.8 ± 1.5) x106 dm3mol-1]. Capítulo 4: Interacción de monómeros del ADN con nanopartículas de oro 104 [citosina] / M 0 1e-7 2e-7 3e-7 4e-7 5e-7 6e-7 X* -4 -2 0 2 4 6 8 10 a* b* Figura 4.64. Variación de los parámetros coloriméticos a* y b* a diferentes concentraciones de citosina. Dichos parámetros se obtuvieron según la teoría de espacios del color CIElab, siendo L* = 91.75 ± 0.25. [citosina]-1 / M-1 0.0 2.0e+6 4.0e+6 6.0e+6 8.0e+6 1.0e+7 1.2e+7 [AuNPs] (a*)-1 /M -1.5e-9 -1.0e-9 -5.0e-10 0.0 5.0e-10 1.0e-9 1.5e-9 2.0e-9 2.5e-9 [citosina]-1 / M-1 3.6e+6 3.8e+6 4.0e+6 4.2e+6 4.4e+6 4.6e+6 [AuNPs] (a*)-1 /M 0.0 5.0e-11 1.0e-10 1.5e-10 2.0e-10 2.5e-10 [citosina]-1 / M-1 0.0 2.0e+6 4.0e+6 6.0e+6 8.0e+6 1.0e+7 1.2e+7 [AuNPs] (b*)-1 /M -2e-9 -2e-9 -1e-9 -5e-10 0 5e-10 [citosina]-1 / M-1 3.6e+6 3.7e+6 3.8e+6 3.9e+6 4.0e+6 4.1e+6 4.2e+6 [AuNPs] (b*)-1 /M -1.8e-10 -1.7e-10 -1.6e-10 -1.5e-10 -1.4e-10 -1.3e-10 -1.2e-10 Figura 4.65. Ajustes de los parámetros colorimétricos obtenidos por la teoría CIElab. A) Ajuste del parámetro a* y ampliación del ajuste lineal en el intervalo [citosina] = 2.2x10-7 - 2.7x10-7 M. B) Ajuste del parámetro b* y ampliación del ajuste lineal en el intervalo [citosina] = 2.4x10-7 - 2.7x10-7 M. A) B) 105 Tabla 4.12. Parámetros obtenidos por la deconvolución de los espectros experimentales a diferentes concentraciones de citosina. El subíndice 1 se refiere a las nanopartículas libres mientras que los subíndices 2 y 3 se refieren a los diferentes complejos de AuNPs agregadas. [Citosina]/ M λ1/nm Área1 λ2/nm Área2 λ3/nm Área3 Alibre Aagre 0.00 522 7.512 - - - - 1.000 0.000 1.0 x10-7 523 9.131 - - - - 1.000 0.000 1.5 x10-7 522 7.688 - - - - 1.000 0.000 2.0 x10-7 523 6.512 585 0.084 - - 0.987 0.013 2.2 x10-7 522 4.726 596 2.697 - - 0.637 0.363 2.3 x10-7 520 3.401 590 3.016 - - 0.530 0.470 2.4 x10-7 520 2.700 594 4.285 - - 0.386 0.613 2.5 x10-7 520 2.271 612 6.375 - - 0.263 0.737 2.6 x10-7 520 2.406 604 5.672 630 0.676 0.275 0.725 2.7 x10-7 520 1.525 613 6.286 647 3.488 0.135 0.865 2.8 x10-7 521 1.661 638 8.473 664 2.034 0.137 0.863 2.9 x10-7 521 1.542 632 7.022 667 4.632 0.117 0.883 3.0 x10-7 521 1.342 642 8.050 669 5.002 0.093 0.907 3.1 x10-7 522 1.045 636 4.482 677 9.329 0.070 0.930 3.2 x10-7 522 1.197 657 10.02 677 2.164 0.089 0.911 3.3 x10-7 521 2.050 643 9.595 668 2.311 0.147 0.853 3.4 x10-7 521 4.235 612 5.843 633 0.462 0.402 0.598 3.6 x10-7 524 1.195 655 10.961 680 2.481 0.082 0.918 3.8 x10-7 522 1.145 644 10.600 676 3.634 0.074 0.926 4.0 x10-7 523 1.322 648 12.060 677 2.556 0.083 0.917 5.0 x10-7 526 1.028 655 9.801 691 5.000 0.065 0.935 Capítulo 4: Interacción de monómeros del ADN con nanopartículas de oro 112 ya mencionada constante aparente determinada. El procedimiento realizado en el presente estudio permite establecer los órdenes de afinidad a partir de las constantes obtenidas, que se muestran en la Tabla 4.8. Tabla 4.15. Parámetros obtenidos por titulación espectroscópica de AuNPs (14.8 nm) con las diferentes bases del ADN. Los valores de Kap son los calculados a partir de los datos de absorbancia. Base Adenina Timina Citosina Guanina* (λmax)ag / nm 671 635 684 - n / molécula NP-1 1900 30700 1050 - Kap / dm3mol-1 2.0 x106 4 x104 3.2 x106 - (ΔG0)ap / kJmol-1 -35.9 -26.3 -37.2 - * No ha sido posible su obtención debido a problemas de solubilidad La base con mayor afinidad es la citosina, aunque la constante aparente de la adenina es muy próxima; la timina es la base con menor afinidad de las interacciones cuantificadas. Si no se considera la guanina, el orden obtenido (C > A >> T) coincide con el de otros autores siguiendo la interacción mediante los desplazamientos de la banda SPR o bien por calorimetría de titulación isotérmica.60,71 Si se considera el cambio obtenido de la interacción guanina/AuNPs, se produce una gran discrepancia: según Mirkin y Letsinger la guanina debería presentar una agregación mayor que la adenina (ya que el orden de afinidad que estimaron es: dC > dG > dA > dT).60 No obstante la Figura 4.27B muestra una banda de nanopartículas agregadas para la adenina mientras que la guanina a la misma concentración únicamente produjo un leve ensanchamiento de la banda. Una justificación plausible a esta diferencia de afinidad en nuestros resultados es que el monómero usado en dicho trabajo era el correspondiente desoxinucleósido (dG), el cual es más soluble en agua que su respectiva base (G). Para poder introducir a la guanina en nuestro orden de afinidad sería necesario repetir el estudio en un sistema donde la guanina sea lo suficientemente soluble, como mezclas alcohol/agua, considerando que algunos alcoholes producen cambios insignificantes en la banda SPR (véase sección 3.5). Respecto al número de moléculas de nucleobases por NP que participan en la interacción, se calculó el factor de recubrimiento (fr) a partir de la siguiente ecuación: 4.2 donde Sm es la superficie que ocupa una molécula de monómero y SNP la superficie de una NP. La superficie que ocupan la adenina y la timina en el plano en el que se disponen los anillos 113 aromáticos es de 1.42 nm2, mientras que la de la citosina es de 1.27 nm2.42 Para una AuNP con un diámetro de 14.8 nm su superfice es 688 nm2, obteniéndose un factor de 3.9 para la adenina, de 63.4 para la timina y de 1.9 para la citosina. Que el factor sea superior a 1 (cuando por definición fr ≤ 1) signfica que la interacción de la base no se produce de forma paralela o bien que se forman varias capas en el proceso de asociación. Estudios de la interacción de las bases del ADN en superficie plana de oro han mostrado que todas las bases, excepto la adenina, se orientan paralelas a la superficie;48 e incluso a un alto factor de recubrimiento (como es nuestro caso) las interacciones de apilamiento π pueden llegar a darse, lo que generaría la aparición de multicapas de bases.143 4.3.5.3. Estudio de la interacción adenina/AuNPs y timina/AuNPs por espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear La propuesta de la forma de interaccionar las bases con las nanopartículas siempre han sido en base a los resultados obtenidos por la espectroscopía Raman potenciada de superficie (ERPS).69,70 Sin embargo la espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) es una herramienta de gran aplicación para el estudio de interacciones ligando-receptor.153 Con el fin de comprobar los modos de interacción de las bases estudiadas así como una posible vía alternativa de obtener las constantes de unión, se estudiaron por RMN las interacciones de la adenina y de la timina con las AuNPs. Dentro de la espectroscopía RMN, una de las herramientas más habituales para el estudio de sistemas ligando-receptor es la espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear de Transferencia de Saturación (en inglés, STD-NMR). Esta técnica de RMN es una de las más potentes cuando la cinética de interacción es rápida.154,155 Sin embargo, más popular es una de sus variantes dada su mayor sensibilidad respecto a los espectros STD: WaterLOGSY (Water- Ligand Observed via Gradient SpectroscopY).156 Para una explicación más extensa de estas técnicas, véase el Capítulo 2. La Figura 4.28A muestra un espectro 1H-RMN en el que se ha suprimido la señal de agua por excitation sculpting water suppression y en el que se identificaron tres picos pertenecientes a los átomos de hidrógeno de la adenina. La magnetización del agua (Figura 4.28B) provoca la inversión del pico procedente de los protones del grupo amino debido a que estos protones son intercambiables con el agua. Por su parte, en el espectro WaterLOGSY de las AuNPS sólo se observó la señal procedente de los citratos (Figura 4.29). Capítulo 4: Interacción de monómeros del ADN con nanopartículas de oro 114 Figura 4. 69. A) Espectro 1H-RMN de la adenina en agua. La señal del agua fue suprimida por excitation sculpting water suppression. B) Espectro de WaterLOGSY para la adenina en ausencia de AuNPS. En ambos espectros la concentración de adenina fue 10-3 M. Figura 4.70. Espectro de WaterLOGSY de nanopartículas de oro a la máxima concentración permitida por la experiencia. [AuNPs] = 2.7 x10-9 M, [citrato] = 10-3 M. 1 1 2 3 2 3 A) B) 115 Desafortunadamente, cuando se compararon los espectros 1H-RMN y de WaterLOGSY de una muestra que contenía tanto AuNPs como adenina (Figura 4.30A), sólo se observó la inversión de la señal asociada al grupo amino. La desaparición de las señales de citrato es debida a la baja concentración del mismo. Para comprobar que esta inversión no fue debida a la interacción con la AuNP, se repitió el espectro a 60 ºC (333 K), temperatura en la que el proceso de intercambio es tan rápido que la señal debería ser indetectable. La Figura 4.30B muestra dicho espectro, en el que el pico del grupo amino no se detecta, confirmando que la inversión se debe a un intercambio de protones con el agua. No fue posible estudiar las interacciones de la adenina con AuNPs por RMN de pulsos debido a que los tiempos de asociación de la base con la superficie del oro no son adecuados para poder seguir la interacción con esta técnica. Figura 4.71. A) Comparativa del espectro de 1H-RMN de la adenina con AuNPs (espectro rojo) con el espectro de WaterLOGSY de la adenina con AuNPS (espectro azul). B) Espectro de WaterLOGSY para el sistema adenina/AuNPs a 333 K. La señal con un desplazamiento químico de 0.25 es debida al referente TMSP. [Adenina] = 10-3 M; [AuNPs] = 9.1 x10-10 M; [citrato] = 3.5 x10-4 M. A) B) Capítulo 4: Interacción de monómeros del ADN con nanopartículas de oro 116 Dado el alto valor energético que presenta la interacción de la adenina con las nanopartículas de oro, se estudió por RMN la interacción de la timina, ya que es la base que presenta la constante de asociación más baja. La Figura 4.31A muestra el espectro 1H-RMN de la timina, en el que se ha suprimido la señal de agua. Todos los protones de la molécula generaron un pico en el espectro, siendo las señales de las amidas muy débiles (señales 3 y 4 en la figura). Al igual que en el caso de la adenina, el WaterLOGSY (Figura 4.31B) produjo la inversión de los protones intercambiables con el agua (los amidos). Cuando se comparan los espectros en presencia de AuNPs (Figura 4.32) se produce de nuevo la inversión de los protones intercambiables, lo que significa que es inviable estudiar las interacciones entre bases y AuNPs por RMN. Figura 4.72. A) Espectro de 1H-RMN de timina en agua. La señal del agua fue suprimida por excitation sculpting water suppression. B) Espectro de WaterLOGSY para la timina en ausencia de AuNPS. [Timina] = 10-3 M. 1 2 3 1 2 4 3 4 B) A) 117 Figura 4.73. Comparativa del espectro de 1H-RMN de la timina con AuNPs (espectro rojo) con el espectro de WaterLOGSY de la timina con AuNPS (espectro azul). La señal con un desplazamiento químico próximo a 0 es debida al referente TMSP. [Timina] = 10-3 M; [AuNPs] = 9.1 x10-10 M; [citrato] = 3.5 x10-4 M. Por último, se trató de estudiar el desplazamiento de citrato cuando la adenina se adsorbe a la superficie de la NP. Para ello se comparó el espectro de resonancia magnética nuclear de las AuNPs solas con otro con un exceso de adenina (3 x10-3 M) con el fin de visualizar el máximo aumento de la señal de RMN que se produciría al liberar citrato. Para que los espectros pudieran ser comparativos de forma cuantitativa, se añadió un referente que no interacciona con las NPs: el ácido 3-(trimetilsilil)propanoico-D4 (TMSP). La Figura 4.33A muestra el espectro de las AuNPs solas, obteniéndose la señal de citrato y del TMSP (cuya integral se ajustó a 1). Al espectro que se obtuvo en presencia de adenina (Figura 4.33B) se le ajustó también la integral de la señal del TMSP a 1. Cuando se superpusieron estos espectros (Figura 4.33C) no se detectó ningún cambio, por lo que no se pudo realizar ninguna titulación por RMN. Capítulo 4: Interacción de monómeros del ADN con nanopartículas de oro 118 Figura 4.74. A) Espectro de 1H-RMN de las moléculas de citrato en una solución coloidal. B) Espectro 1H-RMN de las moléculas de citrato en una solución coloidal a una concentración de adenina de 3 x10-3 M. C) Comparativa de los espectros de 1H-RMN de las moléculas de citrato en ausencia de base (espectro rojo) con el espectro de 1H-RMN de las moléculas de citrato en exceso de adenina (espectro azul). La señal del agua fue suprimida por excitation sculpting water suppression. En todos estos espectros [citrato] = 4.8 x10-4 M. A) B) C) 119 4.4. Efecto de la complejidad estructural del monómero en la interacción Para estudiar cómo afecta a la interacción la complejidad estructural del monómero, se compararon los resultados de la adenina (subsección 4.31), de la adenosina y de la adenosina monofosfato (véase sus estructuras en el Esquema 4.3). Esquema 4.5. Secuencia de la complejidad estructural de la unidad monomérica del ADN adenina. 4.4.1. Adenosina En la Figura 4.34A se muestra la evolución de la banda SPR de AuNPs de 14.8 nm a diferentes concentraciones de adenosina, donde estos desplazamientos en la banda SPR también pudieron seguirse por los cambios colorimétricos de las muestras (Figura 4.34B). A diferencias de las bases, en este caso no se llegó a definir completamente la banda asociada a las nanopartículas agregadas, hecho perceptible en las muestras que no adquirieron el color azul, formándose un hombro cuyo centro se estableció a una longitud de onda de 590 nm. Capítulo 4: Interacción de monómeros del ADN con nanopartículas de oro 120 Longitud de onda / nm 400 500 600 700 800 Absorbancia 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 Figura 4.75. A) Titulación espectroscópica de AuNPs con adenosina. Los espectros fueron tomados 1 hora después de añadir el nucleótido y corresponden a un intervalo [adenosina] = 6.0 x10-5 a 3.2 x10-3 M. B) Fotografías de las muestras 1 hora después de mezclar la adenosina con las AuNPs. Cada casilla tiene una concentración diferente de adenosina: 1) 0 M; 2) 6.0 x10-5 M; 3) 1.0x 10-4 M; 4) 1.2 x10-4 M; 5) 3.0 x10-4 M; 6) 5.0 x10-4 M; 7) 7.0 x10-4 M; 8) 9.0 x10-4 M; 9) 1.0 x10-3 M; 10) 1.6 x10-3 M; 11) 2.4 x10-3 M; 12) 3.2 x10-3 M. Aparentemente el grado de agregación (A590/A520) respecto a la concentración de nucleósido no muestra una tendencia sigmodial (Figura 4.35), aunque esto es debido a la gran extensión del intervalo de agregación (abarcando tres órdenes de magnitud, 10-5 -10-3 M) que hace que la zona donde se concentran los primeros puntos no se pueda apreciar bien en la Figura 4.35. A diferencia de la adenina, no se produjo reversión alguna de la agregación, manteniéndose fija la posición de la banda a altas concentraciones de adenosina (> 10-3 M). [adenosina] / M 0.0000 0.0005 0.0010 0.0015 0.0020 0.0025 0.0030 0.0035 A590/A520 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 Figura 4.76. Evolución del grado de agregación (A590/A520) de AuNPs con la concentración de adenosina. La concentración de AuNPs fue fijada a 3.0 x10-10 M. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A) B) 121 La Figura 4.36 muestra el ajuste obtenido de los valores de A590/A520 según la concentración de adenosina siguiendo la ecuación de Benesi-Hidelbrand (ecuación 4.1) en el intervalo 8.0 x10-5 a 8.0 x10-4 M. La constante obtenida presentó un valor de Kf = 4900 ± 170 dm3mol-1; ΔG0 = -21.0 ± 0.1 kJ mol-1. [adenosina]-1 /M-1 02000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 [AuNPs]*(A520)*(A590)-1/M 3.0e-10 4.0e-10 5.0e-10 6.0e-10 7.0e-10 8.0e-10 9.0e-10 1.0e-9 1.1e-9 Figura 4.77. Ajuste por la ecuación de Benesi-Hildebrand para la relación de absorbancia A590/A520 en el intervalo [adenosina] = 8.0 x10-5 M a 8.0 x10-4 M. Al igual que en las bases, también se determinó la constante de formación a través de los parámetros colorimétricos de la teoría CIELab y por las áreas de las bandas de las nanopartículas agregadas obtenidas por deconvolución. La Figura 4.31 muestra la variación de los parámetros a* y b* respecto a la concentración de adenosina, oscilando L entre 90 y 92. En todo el rango de trabajo la componente a* se mantiene positiva (color rojo) siendo su valor superior a b* hasta 10-3 M, punto en el que los parámetros colorimétricos se asemejan en sus valores absolutos. Por otra parte el parámetro b* se mantiene amarillo hasta 2 x10-4 M, a partir del cual toma valores negativos confiriendo a las muestras tonalidades moradas. Para la componente asociada al color rojo (a*) se obtuvo una Kf = 4100 ± 390 dm3mol-1, lo que equivale a ΔG0= -20.6 ± 0.2 kJmol-1; con el parámetro b* se calculó una constante con un valor de 5900 ± 1500 dm3mol-1, es decir, ΔG0= -21.5 ± 0.6 kJmol-1 (Figura 4.38). El valor obtenido por absorbancia resulta ser un punto intermedio entre los calculados por los parámetros a* y b*. Capítulo 4: Interacción de monómeros del ADN con nanopartículas de oro 128 de los aniones citrato no puede ser la misma que la del monómero (sin carga neta) en su acercamiento a una superficie cargada negativamente. Por esto, estas dos constantes aparentes son diferentes: Kap ≠ (Kap)s. Esquema 4.7. Relación entre la constante aparente y las constantes de las diferentes etapas del proceso de agregación inducida por NaCl. 4.5. Influencia del pH en la interacción de la adenina con las nanopartículas de oro Para justificar el orden de afinidad de los nucleósidos, Letsinger y Mirkin se basaron en la disponibilidad del par de electrones de los nitrógenos y oxígenos que interaccionan.60 Por lo tanto el número de formas canónicas (es decir, la deslocalización de estos electrones) y la accesibilidad de estos átomos a la superficie de la nanopartícula son los factores que definen el grado de afinidad de la base con la AuNP. Esto implica que el pH del medio sea un factor determinante, ya que el grado de protonación o desprotonación de los nitrógenos está vinculado a los electrones que interaccionan con la superficie del oro, así como a la carga neta de la molécula. No obstante no se conocen estudios a este respecto. El trabajo desarrollado en las secciones anteriores corresponde a un pH próximo a 6.0, en el que las moléculas de adenina son neutras. Para estudiar la influencia del pH en la interación adenina/AuNPs, se repitió el procedimiento antes realizado a pH ácido y básico. Hay que tener presente que el pH no pudo ser excesivamente ácido, ya que esto provocaría la inmediata agregación de las NPs (los pKas del citrato son 3.13, 4.76 y 6.40).158 Por su parte, la adenina presenta un pKa1 = 4.1 y pKa2 = 9.8.159 La Figura 4.42 muestra los espectros de absorción de AuNPs a distintas concentraciones de adenina y diferentes condiciones de pH, mientras que la Figura 4.43 muestra los colores de dichas muestras. Como se puede observar, a medio básico (pH = 10) no se produjo la agregación. A un pH próximo al neutro, se apreció agregación a partir de una concentración de adenina 10-6 M, manteniéndose la posición de la banda y siendo invariable el color de la muestra a concentraciones mayores (λmax ≈ 670 nm, color azul). En medio ácido (pH = 4), la 129 agregación tuvo lugar a concentraciones más bajas que en las otras condiciones, pero la posición de la banda SPR aparece a una longitud de onda menor que a pH = 6 (λmax ≈ 630 nm, color morado). Longitud de onda / nm 400 500 600 700 800 Absorbancia 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 Longitud de onda / nm 400 500 600 700 800 Absorbancia 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 Longitud de onda / nm 400 500 600 700 800 Absorbancia 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 Longitud de onda / nm 400 500 600 700 800 Absorbancia 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 Figura 4.83. Espectros de absorción de AuNPs con diferentes condiciones de pH (la línea negra corresponde a un pH = 4.0; la línea roja a un pH = 6.2 y la línea azul a un pH = 10.0) y concentraciones de adenina: a) 10-8 M; b) 10-7 M; c) 10-6 M; d) 10-5 M. [AuNPs] = 3.0 x 10-10 M. En medio ácido, dado el valor del primer pKa de la adenina, una proporción de ésta se encuentra en estado catiónico. Por otro lado, atendiendo a los pKa del citrato, dos de sus tres cargas negativas estarán neutralizadas, lo cual explica la agregación a bajas cantidades de ligando. Así las nanopartículas se pueden aproximar más fácilmente ya que las repulsiones que las estabilizan son menores, siendo además la aproximación de la adenina a la superficie de la nanopartícula más favorecida por las atracciones electrostáticas. Por otra parte, que no se alcance una agregación tan elevada como la conseguida a pH = 6 puede deberse a que conforme A) C) B) D) Capítulo 4: Interacción de monómeros del ADN con nanopartículas de oro 130 los cationes se van adsorbiendo a la superficie de la nanopartícula se va produciendo una disminución de la carga neta negativa, hasta alcanzarse una inversión de la carga total, por lo que los agregados de nanopartículas se encontrarían protegidos por cargas positivas. De esta forma el aglomerado de nanopartículas no puede aumentar más cuando ha tenido lugar la inversión de carga superficial. En el caso de pH = 10, parte de adenina se encuentra desprotonada (estado aniónico) ya que el segundo pKa es próximo a 10; la repulsión entre las AuNPs y el anión de adenina impide la interacción entre ellos. A través de los cambios de la banda SPR conforme la concentración de adenina aumenta a pH = 4, es posible obtener la evolución del proceso de agregación (véase Figura 4.44). Resulta sorprendente ver cómo se obtiene una agregación mayor que la mostrada en las Figuras 4.42 y 4.43 gracias a un riguroso análisis de la concentración de adenina. La comparación de estos resultados muestra que la reversión de carga se produce en el intervalo 10-7 a 10-6 M, confirmando la hipótesis planteada en el párrafo anterior. [Adenina] / M 10-5 10-6 10-7 10-8 pH = 10 pH = 6 pH = 4 Figura 4.84. Color de muestras de AuNPs en función de la concentración de adenina y pH del medio. 131 Longitud de onda / nm 400 500 600 700 800 Absorbancia 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 Figura 4.85. A) Titulación espectroscópica de AuNPs con adenina a pH=4. El espectro fue tomado una hora después de añadir la adenina. El intervalo de concentraciones de la base fue de 5x10-8 a 2x10-7 M. B) Fotografía de las muestras una hora después de añadir la adenina a las AuNPs a pH = 4. Cada casilla tiene una concentración diferente de adenosina: 1) 0 M; 2) 5.0 x10-8 M; 3) 6.0 x10-8 M; 4) 7.0 x10-8 M; 5) 8.0 x10-8 M; 6) 9.0 x10-8 M; 7) 1.0 x10-7 M; 8) 1.2 x10-7; 9) 1.4 x10-7; 10) 1.6 x10-6 M; 11) 1.8 x10-7; 12) 2.0 x10-7. El ajuste del grado de agregación (A653/A520) a la ecuación de Benesi-Hildebrand (Figura 4.45) proporcionó una constante (aparente) de formación de (6.3 ± 0.8) x106 dm3mol-1, y un valor de ΔG0 para el proceso de agregación de - (38.8 ± 0.3) kJ·mol-1. La Tabla 4.11 muestra una comparativa de los resultados obtenidos a las distintas condiciones de pH estudiadas para la adenina. Al comparar los resultados queda patente que la presencia de cargas positivas en el ligando favorece la interacción con las nanopartículas aniónicas, siendo la constante del proceso tres veces mayor. Estos resultados vuelven a confirmar que considerar la longitud de onda como criterio para establecer la afinidad de los ligandos no es un procedimiento correcto. En base a la Figura 4.42 se podría llegar a concluir que la interacción con adenina a pH = 6 es más favorable que a pH = 4. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A) B) 11 12 653 nm Capítulo 4: Interacción de monómeros del ADN con nanopartículas de oro 132 [adenina]-1 / M-1 8.0e+6 9.0e+6 1.0e+7 1.1e+7 1.2e+7 1.3e+7 [AuNPs]*(A520)*(A635)-1 / M 2e-10 3e-10 4e-10 5e-10 6e-10 7e-10 8e-10 9e-10 Figura 4.86. Ajuste por la ecuación de Benesi-Hildebrand para la relación de absorbancia A635/A520 en el intervalo [adenina] = 8.0 x10-8 M a 1.2 x10-7 M a un pH = 4. Tabla 4.18. Parámetros obtenidos por titulación espectroscópica de AuNPs (14.8 nm) con adenina a diferentes pH. pH = 4.0 pH = 6.2 pH = 10* (λmax)ag / nm 635 671 0 Kap / dm3mol-1 6.3 x106 2.0 x106 0 (ΔG0)ap / kJmol-1 -38.8 -35.9 0 * No se apreció agregación alguna 133 5.1. Motivación, antecedentes y objetivos Los trabajos de Huixiang Li y Lewis J. Rothberg en la detección de ADN de cadena simple77,78 supusieron un impulso en el uso de AuNPs sin modificar como biosensores, eludiendo la necesidad de funcionalizar al coloide con moléculas selectivas al analito a detectar. El pilar del método desarrollado por H. Li y L. J. Rothberg se basa en la diferencia de propiedades de los oligonucleótidos según sean de cadena simple o doble. El ADN de cadena simple es mucho más flexible que el de doble cadena, debido a la estructura de doble hélice y a los apilamientos π entre bases, de manera que el oligonucleótido puede exponer las bases a la superficie de la nanopartícula produciéndose la adsorción de la hebra en la superficie. Este complejo presenta una densidad de carga negativa mayor que la nanopartícula de por sí,77–79 por lo que la cantidad de sal inerte para provocar la agregación de éste será mayor que la necesaria para alcanzar la aglomeración de simples nanopartículas. En el caso del ADN de doble cadena, la estructura es rígida y no hay posibilidad de que se produzcan interacciones base-oro, por lo que las dobles hebras de ADN se mantienen distanciadas por las repulsiones electrostáticas. Que en el caso del ADN de cadena simple se forme un complejo AuNPs-ADN mientras en el de doble cadena no se produzca la formación de éste hace que la adición de sal provoque la agregación de las AuNPs en el sistema del ADN de doble cadena mientras que en el de simple cadena el color rojo característico de las AuNPs dispersas permanece (véase Esquema 5.1). La sensibilidad del método es inmejorable, hasta el punto de poderse determinar la disparidad de una unidad monomérica en oligonucleótidos complementarios de 24 pares de bases. No obstante dicho procedimiento presenta un hándicap: no es aplicable a moléculas largas de ADN. Como se ha descrito en el Capítulo 1, la longitud del ADN afecta a sus propiedades; así un oligonucleótido de doble cadena con una longitud inferior a los 50 nm se puede considerar como una vara rígida. Por el contrario, a longitudes superiores y en unas condiciones en las que no se favorezca la compactación el ADN se encuentra en una extensión aleatoria. Sin embargo, no se desarrolla justificación alguna de la inviabilidad del método con moléculas largas de ADN, las cuales se acercan más a la realidad que a oligonucleótidos con decenas de pares de bases en 5. Interacción de ADN de cadena larga con nanopartículas de oro Capítulo 5: Interacción de ADN de cadena larga con nanopartículas de oro 134 sistemas biológicos. Por este motivo, resulta interesante conocer la posible interacción entre AuNPs aniónicas y ADN de doble cadena larga. Esquema 5.8. Representación esquemática del método colorimétrico desarrollado por H. Li y L. J. Rothberg para la diferenciación de oligonucleótidos de cadena simple y doble. Los círculos representan nanopartículas de oro. Reimpreso con permiso de H. Li and L. Rothberg, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2004, 101, 14036–14039.77 Copyright 2004 National Academy of Sciences. Por otra parte ha habido un especial interés en la compactación del ADN por “entornos saturados” (crowded environment) dentro de la célula, donde la estructura y estabilidad del biopolímero se ve afectada a causa de la presencia de múltiples moléculas como proteínas, ácidos nucleicos o lípidos, entre otras.160 En este aspecto, el uso de nanopartículas cargadas negativamente suponen un excelente modelo para simular estos entornos dentro de la célula, gracias a la viabilidad para modificar su carga y tamaño.161 Sin embargo estos trabajos se han desarrollado con nanopartículas de sílice,162,163 las cuales presentan interesantes propiedades ópticas pero muy diferentes a las nanopartículas de metales nobles164 además de no presentar afinidad alguna para interaccionar específicamente con el ADN.161 Dada la mayor flexibilidad del ADN de cadena larga así como la afinidad de las nucleobases para interaccionar con el oro coloidal, profundizar en posibles interacciones entre ADN largo y AuNPs resulta clave para el desarrollo de sistemas de detección de ADN con tamaños similares a los presentes En sistemas biológicos. Considerando todo lo expuesto, el objetivo del presente capítulo es el establecimiento de las bases de un sistema colorimétrico de detección de ADN de cadena larga con AuNPs, así 135 como el estudio de las interacciones entre ambos. Además, se analiza la posibilidad de generar complejos ADN-AuNPs sin necesidad de modificar la superficie del oro coloidal. 5.2. Materiales y métodos 5.2.1. Materiales El cacodilato de sodio trihidratado [(CH3)2AsO2Na·3H2O] y el polietilenglicol (PEG, con un peso molecular promedio de 600 g·mol-1) fueron adquiridos de la casa comercial Sigma- Aldrich, mientras que el cloruro sódico (NaCl) fue de Merck. El ADN procedente de bacteriófagos T4 GT7 [ADN-T4, 166000 pares de bases (bps) con una longitud de contorno de 57 µm] fue adquirido de Nippon Gene Co., LTP. Los tintes fluorescentes YOYO-1 y Gelgreen fueron obtenidos de Molecular Probes Inc. y de Biotium respectivamente; el antioxidante 2- mercaptoetanol (2-ME) de Wako Pure Chemical Industries. Todos los reactivos se utilizaron sin ninguna purificación previa. Las nanopartículas de 14.8 ± 1.8 nm fueron sintetizadas y caracterizadas como se describió en el Capítulo 3. El ADN de doble cadena de calf thymus (ADN-CT: 8-15 kbps) se adquirió de Sigma- Aldrich y se utilizó sin purificación alguna; la proporción en absorbancia de la disolución stock de ADN a 260 nm y 280 nm estuvo entre 1.8 y 1.9 (A260/A280 = 1.87), lo que confirma la pureza del reactivo dada la ausencia de proteínas.45 La concentración de la disolución stock de polinucleótido se determinó por espectroscopía de absorción a partir de la absortividad molar ( = 6600 dm3mol-1cm-1 a 258 nm, expresada la concentración de ADN en grupos fosfatos).165 Las muestras y las disoluciones de ADN se prepararon en un tampón de cacodilato ([cacodilato] = 10-3 M; [NaCl] = 0.01 M), cuidadosamente ajustado a pH=7 con ayuda de HCl y NaOH. Las disoluciones se prepararon en agua desionizada, siendo su conductividad menor a 10-6 S·m-1. 5.2.2. Preparación del ADN de cadena simple La disolución madre de ADN de cadena simple fue preparada por desnaturalización térmica: una solución stock de ADN de doble cadena se mantuvo en un baño a 85ºC durante 25 minutos e inmediatamente se introdujo en un baño de hielo para provocar un enfriamiento rápido que evite la recombinación.166 Las disoluciones fueron preparadas en las mismas condiciones que las de ADN de doble cadena (cacodilato 10-3 M y NaCl 0.01 M). La presencia Capítulo 5: Interacción de ADN de cadena larga con nanopartículas de oro 136 mayoritaria de ADN de cadena simple se confirmó por espectroscopía de absorción UV-visible y por espectroscopía de Dicroísmo Circular (CD). 5.2.3. Fragmentación del ADN por sonicación El ADN se preparó en una disolución de tampón cacodilato esterilizada (pH = 7.0) con una concentración final de 330 µg/ml. El ADN fue fragmentado por sonicación usando un sonicador Fisher Scientific FB120 equipado con una sonda de titanio de 2 mm de diámetro y 80 mm de largo. La potencia se estableció en el máximo del dispositivo (100 W); la amplitud de sonicación fue del 50% (0.5 s de pulso y 0.5 s de pausa) con el fin de evitar un calentamiento excesivo del ADN. La disolución se mantuvo en un baño de agua/hielo durante la sonicación. Las muestras se tomaron a diferentes tiempos de sonicación, desde los 10 segundos hasta los 10 minutos, y fueron analizadas en un gel de agarosa del 0.8 % (p/v). La agarosa fue disuelta en un microondas en un tampón TAE (Tris acetato 4x10-2 M y AEDT 10-3 M, con un pH = 8.3) y se añadió el tinte de ácidos nucleicos Red Safe para visualizar el ADN por fluorescencia UV. La electroforesis se realizó acorde al protocolo establecido por Sambrook y Russel.45 El ADN se visualizó por fluorescencia UV usando un sistema de escaneo Ultima 16si (Hoefer INC., EE.UU.). El referente usado para la estimación de tamaño fue 1 Kb Plus DNA Ladder (Thermo Fisher) el cual permite determinar tamaños comprendidos desde 12 kbps hasta 100 bps. Todo el material utilizado fue esterilizado con un autoclave. 5.2.4. Espectros de absorción en el UV-vis 5.2.4.1. Espectros de absorción para el estudio de la agregación inducida por sal en presencia de ADN Los espectros de cada muestra fueron registrados cada cinco minutos después de la adición de NaCl. A los 30 minutos los espectros eran prácticamente invariables, tomándose este tiempo como límite máximo de la medida. Las experiencias se realizaron con AuNPs de 14.8 nm, a concentración fija [AuNPs] = 3.3 x10-10 M, a diferentes cantidades de ADN y a una concentración fija de sal, [NaCl] = 0.075 M. Los volúmenes de la alícuotas fueron: 200 µl de la solución coloidal sintetizada, 1600 µl de ADN con concentración variable y 200 µl de NaCl (0.65 M). Finalmente, se reservaron las muestras en un termobloque (298 K) hasta la toma del espectro. 137 En el caso de las AuNPs de 27 nm el procedimiento fue análogo al descrito, de manera que la concentración final fue [AuNPs] = 4.7 x10-10 M; para el oro coloidal de 4.5 nm de tamaño se adicionó una alícuota de 230 µl, 1570 µl de ADN (de concentración variable) y 200 µl de NaCl (2.4 M), siendo la concentración final [AuNPs] = 1.0 x10-8 M. Dado que las muestras de ADN y NaCl fueron preparadas en el tampón cacodilato-NaCl, se consideraron los cationes sodios provenientes de dicho tampón; los cantidad de contraiones de ADN se considero despreciable dada las bajas concentraciones de trabajo. Las disoluciones de NaCl se prepararon en el tampón cacodilato-NaCl para evitar una mayor dilución, ya que las AuNPs se sintetizan dispersas en agua. 5.2.4.2. Medidas de cinética La reacción fue monitorizada siguiendo los cambios de intensidad de absorbancia a 520 nm y 668 nm para el proceso de agregación inducido por NaCl ([Na+] = 0.075 M) a diferentes concentraciones de ADN-CT o PEG 600. La temperatura se mantuvo a 25 ºC. 5.2.4.3. Medidas de absorbancia a diferentes temperaturas: estudios de melting de ADN Los valores de absorbancia se obtuvieron en un espectrofotómetro Hitachi U-2900, con una cubeta de cuarzo de 1 cm de paso de luz y conectada a un sistema de circulación termostatizado. Se tomó el valor de absorbancia a 258 nm, posición del máximo de absorción del ADN. Una primera experiencia con una disolución de ADN (5 x10-5 M) se realizó como control; después se estudiaron una muestra con AuNPs de 14.8 nm (3.3 x10-10 M) y otra con nanopartículas de 4.5 nm (1x10-8 M) en ausencia de sal. La temperatura de partida fue 25 ºC, alcanzándose como máxima cerca de los 90 ºC; el incremento fue de 5 ºC hasta alcanzarse los 60 ºC, punto en el que la toma de datos fue cada 2 ºC. Alcanzada la temperatura objetivo, se esperó 10 minutos para la medición de la absorbancia. 5.2.5. Espectros de Resonancia Magnética Nuclear de protones Los espectros de cada muestra fueron registrados en un espectrómetro de RMN Ultra- Compact 800 MHz Bruker Avance III. La temperatura de medición fue 278 K. La concentración de ADN fue de 2.7x10-3 M. La muestra se preparó colocando 540 µl de una disolución stock de ADN (preparada en las mismas condiciones de cacodilato y NaCl) en un eppendorf para Capítulo 5: Interacción de ADN de cadena larga con nanopartículas de oro 144 Longitud de onda / nm 400 500 600 700 800 Asorbancia 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 [ADN] = 1·10-7 M [ADN] = 1·10-6 M [ADN] = 1·10-5 M [ADN] = 5·10-5 M [ADN] = 1·10-4 M [ADN] = 5·10-4 M [ADN] = 1·10-3 M Figura 5.89. A) Espectros de absorción de AuNPs (3.3 x10-10 M) en presencia de diferentes concentraciones de ADN de doble cadena (método A). [Na+] = 0.075 M. Los espectros fueron obtenidos 30 minutos después de la adición de sal a la mezcla AuNPs-ADN. B) Fotografía de las diferentes muestras obtenidas por el método A. Todas las casillas excepto la número 9 (que corresponde a la referencia) tienen [Na+] = 0.075 M y diferentes concentraciones de ADN: 1) 0 M; 2) 10-7 M; 3) 10-6 M; 4) 10-5 M; 5) 5 x10-5 M; 6) 10-4 M; 7) 5 x10-4 M; 8) 10-3 M; 9) 0 M ([Na+] = 0 M). Las fotografías fueron tomadas 30 minutos después de la adición de NaCl a la disolución AuNPs-ADN. [ADN] / M 1e-8 1e-7 1e-6 1e-5 1e-4 1e-3 1e-2 A668/A520 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Figura 5.90. Evolución del grado de agregación (A668/A520) frente a la concentración de ADN. [AuNPs] = 3.3 x10-10 y [Na+] = 0.075 M. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 A) B) 145 Tiempo / min 010 20 30 40 50 60 70 A668/A520 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 [ADN] = 0 M [ADN] = 10-6 M [ADN] = 10-5 M [ADN] = 10-4 M Figura 5.91. Evolución del grado de agregación (A668/A520) con el tiempo, donde A668 representa la absorción a 668 nm y A520 a 520 nm. [AuNPs] = 3.3 x10-10 M; [Na+] = 0.075 M. En el caso del método B los resultados son totalmente diferentes a los descritos. No se produce protección alguna, indistintamente de la concentración de ADN que haya en el medio: todas las muestras mostraron el característico color azul violáceo de las nanopartículas agregadas (véase la Figura 5.6); el ADN no fue capaz de desagregar a las AuNPs. El método A prevalece por tanto para una detección colorimétrica del ADN, mostrando que el orden de adición es un parámetro fundamental. Longitud de onda / nm 400 500 600 700 800 Absorbancia 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10 0.11 0.12 [DNA] = 0M [DNA] = 10-7 M [DNA] = 10-6 M [DNA] = 10-5 M [DNA] = 10-4 M [DNA] = 10-3 M Figura 5.92. A) Espectros de absorción de AuNPs (3.3 x10-10 M) en presencia de diferentes concentraciones de ADN de doble cadena (método B). [Na+] = 0.075 M. Los espectros fueron obtenidos 30 minutos después de la adición de ADN a la mezcla AuNPs-NaCl. B) Fotografía de las diferentes muestras obtenidas por el método B. Todas las casillas tienen [Na+] = 0.075 M y diferentes concentraciones de ADN: 1) 0 M; 2) 10-7 M; 3) 10-6 M; 4) 10-5 M; 5) 10-4 M; 6) 10-3 M; 9) 0 M ([NaCl] = 0 M). Las fotografías fueron tomadas 30 minutos después de la adición de ADN a la disolución AuNPs-NaCl. 1 2 3 4 5 6 A) B) Capítulo 5: Interacción de ADN de cadena larga con nanopartículas de oro 146 5.3.2. Comparativa del método entre ADN de cadena doble y simple En el caso de los oligonucleótidos es posible la distinción entre ADN de doble cadena y simple cadena: sus diferencias en cuanto a rigidez y capacidad de interacción permite esta distinción estructural. Sin embargo, cuando el ADN es muy largo (como es nuestro caso) diferentes autores señalan que el método de detección colorimétrica no es viable.77 Por ello el siguiente punto fue estudiar las diferencias que se producen al aplicar el procedimiento desarrollado para el caso de ADN de cadena simple (a través del método A). El ADN de cadena simple se preparó por desnaturalización térmica de ADN de doble cadena (véase la subsección 5.2.2). Comparando los espectros de absorción del ADN de cadena simple y de cadena doble se puede confirmar la formación del primero, ya que el ADN de cadena simple tiene una absortividad mayor que el de doble cadena (Figura 5.7). Una disolución de ADN de doble cadena con una concentración de 50µg·ml-1 tiene una absorbancia de 1, mientras que una disolución de ADN de cadena simple muestra una absorbancia de 1 con una concentración de 40 µg·ml-1.45 Así, la proporción de absorbancia Asimple/Adoble a la longitud de onda del máximo es 1.25. El valor obtenido de nuestros espectros de absorción fue de 1.26, lo que confirma la presencia de ADN de cadena simple. Por otro lado, los espectros de CD también confirmaron la presencia de ADN de cadena simple. M. Rosa y colaboradores observan cambios en el espectro de dicroísmo circular cuando desnaturalizaron el ADN: la intensidad de la banda negativa, relacionada con la helicidad del ADN, disminuye mientras la banda positiva, relacionada con las interacciones de apilamiento π, crece, y el punto de cruce se desplaza 3 nm más.166 La Figura 5.8 muestra la comparativa de los espectros de CD para nuestro ADN de cadena simple preparado a partir de ADN de doble hebra. Longitud de onda / nm 200 220 240 260 280 300 Absorbancia 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 doble cadena cadena simple Figura 5.93. Espectro de absorción UV de ADN de doble cadena (línea roja) y de ADN de cadena simple (línea azul) ambos a la misma concentración. El ADN de cadena simple proviene de la desnaturalización térmica del ADN de cadena doble del que se obtuvo el espectro. Asimple Adoble = 1.26 0.421 0.533 147 Longitud de onda / nm 220 240 260 280 300 320 mgrados) -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 doble cadena cadena simple Figura 5.94. Espectros de dicroísmo circular de ADN de doble cadena (línea roja) y de ADN de cadena simple (línea azul), ambos a la misma concentración. El ADN de cadena simple proviene de desnaturalización térmica del ADN de cadena doble del que se obtuvo el espectro. Siguiendo el método A se determina un comportamiento análogo al ADN de doble cadena. En la Figura 5.9 se puede observar cómo los espectros de absorción son semejantes así como la tendencia en el cambio de color de las distintas disoluciones. El ADN de cadena simple también puede prevenir la agregación de las AuNPs: el ADN de cadena larga, a diferencia de los oligonucleótidos, protege de la agregación independientemente de su estructura secundaria. 263 nm 261 nm Capítulo 5: Interacción de ADN de cadena larga con nanopartículas de oro 148 Longitud de onda / nm 400 500 600 700 800 Absorbancia 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 doble cadena cadena simple Longitud de onda / nm 400 500 600 700 800 Absorbancia 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 doble cadena cadena simple Longitud de onda / nm 400 500 600 700 800 Absorbancia 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 doble cadena cadena simple Longitud de onda / nm 400 500 600 700 800 Absorbancia 0.060 0.065 0.070 0.075 0.080 doble cadena cadena simple Figura 5.95. A-D) Comparativa de los espectros de absorción obtenidos por el método A para ADN de doble cadena (línea roja) y ADN de cadena simple (línea azul). [ADN] =: A) 10-4 M; B) 10-5 M; C) 10-6 M; D) 10-7 M. Todos los espectros se obtuvieron 30 minutos después de añadir el NaCl. E) Fotografías de las diferentes muestras obtenidas por el método A para ADN de cadena doble (fila superior) y para ADN de cadena simple (fila inferior). Cada casilla tiene una concentración diferente de ADN: 1) 10-4 M; 2) 10-5 M; 3) 10-6 M; 4) 10-7 M. En todos los casos, [AuNPs] = 3.3 x10-10 M y [Na+] = 0.075 M. 5.3.3. Influencia de la longitud de la cadena del ADN Un tercer aspecto a considerar en la presente Tesis Doctoral es el tamaño de la hebra de ADN: los estudios bibliográficos hasta la fecha se realizaron con oligonucleótidos con menos de 25 unidades monoméricas,77,78,169 mientras que en el presente estudio se utiliza un ADN que tiene entre 8000 y 15000 bps. Dado que la diferencia de tamaño es muy grande, nos propusimos comprobar si la protección observada se mantiene a un tamaño menor pero siempre por encima A) B) 1 2 3 4 E) C) D) 149 de los 1000 bps. Para ello se fragmentó el ADN por sonicación.45 Una misma disolución de ADN se sonicó a distintos tiempos, tomándose una alícuota en estos instantes previamente fijados para, posteriormente, estimar el tamaño promedio de la biomolécula. La muestra se colocó en un baño de hielo para evitar la posible desnaturalización que provocaría el sobrecalentamiento del sistema. Los tamaños obtenidos por un test de agarosa se muestran en la Figura 5.10, donde se puede comprobar que a los 10 minutos el ADN sonicado tenía un tamaño comprendido entre 1000 y 5000 pares de bases y cuya máxima intensidad se centra en 1650 bp, valor que se tomará como referente. La imagen también muestra una distribución de tamaño del ADN, patente en las bandas anchas que se forman en lugar de líneas que se podrían esperar de biomoléculas con un tamaño definido (véase por ejemplo la Figura 5.10A). Figura 5.96. A) Bandas que genera el marcador 1 Kb Plus DNA Ladder (0.7 µg/línea en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio). B) Fotografía del test de agarosa (0.8 %, con Red Safe como tinte) para las 10 alícuotas tomadas de la sonicación. Cada línea corresponde a un tiempo concreto de sonicación: 0) 0 s (control); 1) 10 s; 2) 20 s; 3) 30 s; 4) 40 s; 5) 50 s; 6) 60 s; 7) 120 s; 8) 180 s; 9) 240 s; 10) 600 s. Cuando se aplicó el método A con el ADN sonicado durante 10 minutos (es decir, con un tamaño medio cercano a los 1650 pares de bases) se observó de nuevo el efecto protector, pero con la salvedad de que la prevención de la agregación inducida por sal se produjo incluso a concentraciones más bajas de ADN (Figura 5.11). Si se compara con la Figura 5.3, se puede A) B) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Capítulo 5: Interacción de ADN de cadena larga con nanopartículas de oro 150 apreciar como la protección es análoga con una diferencia de concentraciones de dos órdenes de magnitud. Longitud de onda / nm 400 500 600 700 800 Absorbancia 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 [ADN] = 10-9 M [ADN] = 10-8 M [ADN] = 10-7 M [ADN] = 10-6 M [ADN] = 10-5 M [ADN] = 10-4 M [ADN] = 10-3 M Figura 5.97. A) Espectros de absorción de AuNPs (3.3 x10-10 M) en presencia de diferentes concentraciones de ADN con un tamaño medio estimado de 1650 pares de bases, siendo [Na+] = 0.075 M (método A). Los espectros fueron obtenidos 30 minutos después de la adición de sal a la mezcla AuNPs-ADN. B) Fotografía de las diferentes muestras obtenidas por el método A con ADN de aproximadamente 1650 bps). Todas las casillas excepto la número 9 (que corresponde al control) tienen [Na+] = 0.075 M y diferentes concentraciones de ADN: 1) 0 M; 2) 10-9 M; 3) 10-8 M; 4) 10-7 M; 5) 10-6 M; 6) 10-5 M; 7) 10-4 M; 8) 10-3 M; 9) 0 M ([Na+] = 0 M). Las fotografías fueron tomadas 30 minutos después de la adición de NaCl a la disolución AuNPs-ADN. Aparentemente parece que esta diferencia de tamaño repercute en los resultados del estudio, sin embargo es necesario tener en cuenta otro factor que se ha modificado: el disolvente. En el estudio desarrollado en la subsección 5.3.1 el ADN y las diferentes muestras se prepararon en agua sin esterilizar, mientras que en este punto todas las disoluciones (incluida la madre del ADN) se prepararon con una disolución tampón que se esterilizó en el autoclave. Con el fin de discernir la verdadera causa de una mejora del efecto protector, se repitió el método A con ADN sin sonicar pero preparado en disolución esterilizada; la tendencia obtenida resultó ser análoga (datos no mostrados). Estilizar tanto el material como las disoluciones amortiguadoras produce una mejora de los resultados dándose protección a concentraciones de ADN inferiores a 10-6 M. La razón de esterilizar en el estudio de la influencia del tamaño del biopolímero en el proceso de protección radica en el hecho de eliminar enzimas, restos de proteínas y nucleasas para las que, el ADN más debilitado al estar sonicado y fragmentado, es más sensible. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 A) B) 151 5.4. Influencia del tamaño de las nanopartículas en la detección de ADN de cadena larga Estudios previos con oligonucleótidos han detemrinado que la curvatura de la NP tiene un efecto considerable en la interacción,84 hasta el punto de provocar la separación de las hebras.49 Además el uso comparativo de AuNPs de diferentes tamaños también implica variar el efecto de saturación o acumulación (crowding effect) y de exclusión de volumen, los cuales repercuten en la estructura y estabilidad del ADN.160,161 5.4.1. Criterio para establecer la concentración de AuNPs en las muestras Trabajar con AuNPs de diferentes tamaños implica un gran problema: ¿cuál es la concentración adecuada para comparar los resultados? Debido a la dependencia de las propiedades ópticas con el tamaño del clúster, así como las cantidades necesarias para su síntesis, es inviable el uso de la misma concentración (expresada en mol de NP por litro) de AuNPs para un estudio comparativo. Actualmente no parece haber criterio alguno establecido, aunque algunos ciertos recomiendan tomar como patrón la “área de superficie específica por volumen” (Volume-Specific Surface Area, VSSA); sobre todo desde que la Comisión Europea propuso la VSSA en 2011 como criterio para definir los nanomateriales.170 Dicho parámetro requiere obtener el tamaño y la forma de las nanopartículas171 y el considerar todos los factores que repercuten en él puede conducir a complejas ecuaciones.172,173 Considerando que el sistema es monodisperso y que todas las nanopartículas tienen un diámetro “d”, la VSSA (en m2/cm3) se puede expresar como:173,174 5.2 donde S es la superficie de la nanopartícula (expresada en m2) y V el volumen de la misma (pero expresado en cm3). Los valores que se obtienen para cada sistema coloidal sintetizado se muestran en la Tabla 5.1. De la superficie específica de las muestras de AuNPs de 14.8 nm se calcularon las concentraciones necesarias de los otros sistemas coloidales para igualar dicho valor. Aunque la concentración estimada es viable para las nanopartículas de mayor tamaño, no ocurre lo mismo con las más pequeñas ya que al ser necesaria una dilución tan grande del coloide, tomando tan solo 62 µl y diluyendo a 2000 µl, no es posible detectar su color a simple vista. Capítulo 5: Interacción de ADN de cadena larga con nanopartículas de oro 152 Tabla 5.19. Valores obtenidos de VSSA para las distintas síntesis de AuNPs y concentraciones de éstas (para obtener la misma superficie específica), obtenidas de la adición del volumen de la alícuota (Val) siendo el volumen final de la muestra 2000 µl. Diámetro /nm VSSA / m2cm-3 Val / µl [AuNPs] / M 4.5 1333 62 2.8 x10-9 14.8 404.7 200 3.3 x10-10 27 222.3 364 8.6 x10-11 Ante este problema se optó como criterio emplear la misma concentración de oro en la muestra ([Au]), lo cual proporciona concentraciones adecuadas para la detección colorimétrica a simple vista y por espectroscopía de absorción. 5.4.2. Detección colorimétrica de ADN con AuNPs de 27 nm Debido a que la concentración oro es la misma tanto para la síntesis de NPs de 14.8 nm como para la de 27 nm, se trabajó con un alícuota del mismo volumen que en el estudio con AuNPs de 14.8 nm; la concentración final de AuNPs de 27 nm fue 4.7 x10-11 M. Antes de proceder con el método A empleando nanopartículas de mayor tamaño, se comprobó que el ADN no produce efecto alguno en la banda SPR. La Figura 5.12 muestra que la banda de absorción de las AuNPs permanece inalterada en el intervalo de trabajo, al igual que con las AuNPs de 14.8 nm. Longitud de onda / nm 400 500 600 700 800 Absorbancia 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 Minuto 0 Minuto 5 Minuto 15 Minuto 30 Minuto 60 Figura 5.98. Evolución con el tiempo de la banda SPR de AuNPS de 27 nm (4.7 x10-11 M) en presencia de ADN de doble cadena (10-4 M). Las concentraciones de cacodilato y de Na+ fueron 9x10-4 M y 9x10-3 M respectivamente. 153 Cuando se adicionó sal a mezclas de AuNPs-ADN con diferentes concentraciones del biopolímero se observó un descenso en la agregación conforme aumentaba la concentración de este último. La Figura 5.13 muestra como la agregación es imperceptible a partir de la concentración de ADN de 10-5 M, manteniéndose rojo el color de las disoluciones desde este punto. En la subsección 5.4.4 se compararán los resultados obtenidos para cada tamaño de coloide. Longitud de onda / nm 400 500 600 700 800 Absorbancia 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 [ADN] = 1·10-7 M [ADN] = 1·10-6 M [ADN] = 1·10-5 M [ADN] = 5·10-5 M [ADN] = 1·10-4 M [ADN] = 5·10-4 M [ADN] = 1·10-3 M Figura 5.99. A) Espectros de absorción de AuNPs de 27 nm (4.7 x10-11 M) en presencia de diferentes concentraciones de ADN de doble cadena a [Na+] = 0.075 M (método A). Los espectros fueron obtenidos 30 minutos después de la adición de sal a la mezcla AuNPs-ADN. B) Fotografía de las diferentes muestras obtenidas por el método A para AuNPs de 27 nm. Todas las casillas excepto la número 9 (que corresponde a la referencia) tienen [Na+] = 0.075 M y diferentes concentraciones de ADN: 1) 0 M; 2) 10-7 M; 3) 10-6 M; 4) 10-5 M; 5) 5 x10-5 M; 6) 10-4 M; 7) 5 x10-4 M; 8) 10-3 M; 9) 0 M ([Na+] = 0 M). Las fotografías fueron tomadas 30 minutos después de la adición de NaCl a la disolución AuNPs-ADN. 5.4.3. Detección colorimétrica de ADN con AuNPs de 4.5 nm En el caso de las AuNPs de menor tamaño fue necesario hacer una corrección en el volumen de la alícuota a tomar de la disolución coloidal madre; se tomaron 230 µl en lugar de los 200 µl que se tomaban con las otras síntesis de AuNPs, siendo la concentración final 1.0 x10-8 M. Al igual que en el caso anterior, se comprobó la influencia del ADN en la banda de absorción de las AuNPs. Como se puede observar en la Figura 5.14, no se produce variación alguna de la banda SPR en el intervalo de tiempo de trabajo. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 A) B)