Reconocimiento molecular entre GAGs y proteínas extracelulares. Estudios estructurales mediante RMN y dinámica molecular.

RECONOCIMIENTO MOLECULAR ENTRE GAGs Y PROTEÍNAS EXTRACELULARES. ESTUDIOS ESTRUCTURALES MEDIANTE RMN Y DINÁMICA MOLECULAR. María José García Jiménez ABREVIATURAS CS Condroitrin Sulfate Sulfato de condroitrina DS Dermatan Sulfate Sulfato de dermatano HS Heparan Sulfate Sulfato de heparano Hp Heparin Heparina KS Keratan Sulfate Sulfato de queratano HA Hialuronic Acid Ácido hialurónico DCs Dendritic Cells Células dendríticas GAGs Glicosaminoglycans Glicosaminoglicanos SPR Surface Plasmon Resonance Resonancia de plasmón superficial ITC Isothermal Titration Calorimetry Calorimetría de titulación isoterma FP Fluorescence Polarization Polarización de fluorescencia IC50 half maximal Inhibitory Concentration Mitad de la concentración inhibitoria máxima RMN Resonancia Magnética Nuclear STD Saturation Transfer Difference Diferencia de saturación transferida WaterLOGSY Water-Ligand Observed via Gradient SpectroscopY Espectroscopía de gradiente observando agua-ligando. Glide Grid-based Ligand Docking with Energetic Docking del ligando basado en un grid energético S3-HMBC Spin-State-Selective Heteronuclear Multiple Bond Correlation Estado de espín selectivo en correlación de enlace múltiple heteronuclear. MDK Midkine Midkina PTN Pleiotrophin Pleiotrofina FGF-1 Fibroblast Growth Factor Factor de crecimiento para fibroblastos XP Docking Extra Precision Docking precisión extra SP Docking Simple Precision Docking con precisión simple Capítulo 1. Introducción. 1.1 BIOMOLÉCULAS: CARBOHIDRATOS. ........................................................... 5 1.2 GLICOSAMINOGLICANOS. .............................................................................. 7 1.2.1 Biosíntesis de GAGs. ..................................................................................... 7 1.2.2 Tipos de glicosaminoglicanos. .................................................................... 10 1.2.2.1 Heparán sulfato y Heparina. .................................................................... 10 1.2.2.2 Sulfato de condroitrina y Dermatán sulfato. ............................................ 11 1.2.2.3 Sulfato de Queratano. .............................................................................. 12 1.2.2.4 Ácido Hialurónico. .................................................................................. 12 1.2.3 Funciones de los GAGs. .............................................................................. 13 1.2.3.1 Heparán Sulfato y Heparina. ................................................................... 14 2.3.2.1 Condroitín Sulfato y Dermatán Sulfato. .................................................. 15 1.2.4 Estructura química de los GAGs. ................................................................ 17 1.3 LECTINAS TIPO C Y FACTORES DE CRECIMIENTO. ............................... 20 1.3.1. Lectinas tipo C: Languerina. ................................................................... 20 1.3.2. Factores de crecimiento: FGF1................................................................ 25 1.3.3. Factores de crecimiento: Midkina y Pleiotrofina. ................................... 29 Capítulo 2. Metodología. 2.1 INTRODUCCIÓN. .............................................................................................. 36 2.2 MÉTODOS DE RMN PARA EL ESTUDIO DEL LIGANDO LIBRE Y DEL COMPLEJO. ................................................................................................................... 36 2.2.1 Obtención de las estucturas tridimensionales del ligando libre de forma experimental. ............................................................................................................... 37 2.2.1.1 Experimentos 1H monodimensionales o S3-HMBC. ............................... 37 2.2.1.2 Experimentos NOESY. ............................................................................ 38 2.2.2 Experimentos para la obtención de las estructuras tridimensionales del ligando asociado de forma experimental. .................................................................... 41 2.2.2.1 Efecto Overhauser Nuclear (tr-NOESY). ................................................ 42 2.2.2.2 Diferencia de saturación transferida (STD).. ........................................... 43 2.2.2.3 T1 selectivo (relajación longitudinal)., ..................................................... 46 2.3 MÉTODOS TEÓRICOS UTILIZADOS PARA EL ESTUDIO DE LA ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DEL LIGANDO LIBRE Y DE LA INTERACCIÓN PROTEÍNA-LIGANDO. ..................................................................... 47 2.3.1 Cálculos computacionales (dinámica molecular) para el estudio teórico de la geometría tridimensional del ligando. ..................................................................... 47 2.3.2.1 Simulaciones de dinámica molecular con restricciones promediadas en el tiempo…………… .................................................................................................. 50 2.3.2 Cálculos teóricos para el estudio teórico de la geometría tridimensional del complejo.. .................................................................................................................... 51 2.3.2.1 Docking. .................................................................................................. 51 2.3.2.2 CORCEMA-ST. ...................................................................................... 55 Capítulo 3. Interacción GAGs derivados de Heparina con FGF-1 y Languerina. 3.1 ANTECEDENTES Y OBJETIVOS. ................................................................... 61 3.2 ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN DEL FGF-1 CON TRISACÁRIDOS DERIVADOS DE HEPARINA. ..................................................................................... 67 3.2.1 Experimentos NOESY transferido. ............................................................. 68 3.2.2 Experimentos de STD., ................................................................................ 70 3.2.3 Experimentos T1 selectivo. ......................................................................... 75 3.2.4 Docking Molecular. ..................................................................................... 77 3.2.5 CORCEMA-ST. .......................................................................................... 83 3.3 ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN ENTRE LA LANGUERINA Y UN HEXASACÁRIDO (HEXA 4S) DERIVADO DE HEPARINA. ................................... 86 3.3.1 Estudio tridimensional del hexasacárido libre. ............................................ 86 3.3.2 Estudio estructural del hexasacárido asociado a Languerina....................... 90 3.4 CONCLUSIONES. .............................................................................................. 94 3.5 PARTE EXPERIMENTAL ................................................................................. 96 Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear. .................................................... 96 Docking ....................................................................................................................... 99 CORCEMA-ST ........................................................................................................... 99 Capítulo 4. Interacción de Midkina con GAGs. 4.1 ANTECEDENTES Y OBJETIVOS. ................................................................. 102 4.2 ESTUDIO DE LOS TETRASACÁRIDOS LIBRES Y COMPLEJADOS. ..... 108 4.2.1 Determinación estructural de los ligandos en su forma libre mediante RMN y dinámica molecular. ............................................................................................... 109 4.2.1.1 Tetrasacáridos dibencilados con tres secuencias diferentes (compuestos 2, 5 y 8) y un tetrasacárido desprotegido con secuencia CS (compuesto 7). ............. 109 4.2.1.2 Tetrasacáridos persustituidos con secuencia alternada. Agregación (compuestos 6 y 9)................................................................................................. 135 4.2.2 Estudio del complejo Midkina-tetrasacárido mediante RMN y docking. . 143 4.2.2.1 Estudio de la interacción entre la Midkina y tetrasacáridos no protegidos (tetrasacáridos 1, 7 y 10). ...................................................................................... 144 Estudio de la interacción entre la Midkina y tetrasacáridos dibencilados 4.2.2.2 (2, 5 y 8). …………………………………………………………………………156 2.3.2.3 Estudio de la interacción entre la Midkina y los tetrasacáridos perprotegidos. ........................................................................................................ 166 4.2.3 Estudio de la interacción de todos los tetrasacáridos mediante experimentos de Polarización de Fluorescencia. ............................................................................. 168 4.3 ESTUDIO DE LOS DISACÁRIDOS EN SU FORMA LIBRE Y COMPLEJADA. ............................................................................................................ 169 4.3.1 Estudio estructural de miméticos de CS en su forma libre mediante técnicas de RMN y dinámica molecular. ................................................................................. 170 4.3.1.1 Disacárido 11. ............................................................................................ 171 4.3.1.2 Disacárido 12. ........................................................................................ 175 4.3.1.3 Disacárido 13. ........................................................................................ 180 4.3.1.4 Disacárido 14. ........................................................................................ 185 4.3.1.5 Disacárido 15 ......................................................................................... 187 4.3.1.6 Pentasacárido 16. ................................................................................... 191 4.3.2 Estudio de los complejos formados por los disacáridos y la midkina mediante RMN y docking. ........................................................................................ 194 4.3.2.1 Complejo formado con el tetrasacárido 11. ........................................... 195 4.3.2.2 Complejo formado por el disacárido 12. ............................................... 198 4.3.2.3 Complejo formado con el disacárido 13. ............................................... 202 4.3.2.4 Complejo formado por el disacárido 15. ............................................... 206 4.3.3 Datos de inhibición obtenidos por polarización de fluorescencia. ............ 210 4.4 CONCLUSIONES. ............................................................................................ 210 4.5 PARTE EXPERIMENTAL. .............................................................................. 213 4.5.1 Estudio de los tetrasacáridos libres mediante RMN. ................................. 213 4.5.2 Estudio de los tetrasacáridos complejados mediante RMN. ...................... 215 4.5.3 Estudio de los disacáridos libres mediante RMN. ..................................... 216 4.5.4 Estudio de los disacáridos complejados mediante RMN. .......................... 216 4.5.5 Estudio de todos los complejos (disacáridos y tetrasacáridos) mediante docking… .................................................................................................................. 217 4.5.3.1 Preparación de estructuras. .................................................................... 217 4.5.3.2 Generación del Grid. ............................................................................. 217 4.5.3.3 Docking flexible. ................................................................................... 218 4.5.6 Estudio de todos los compuestos (disacáridos y tetrasacáridos) mediante dinámica molecular. .................................................................................................. 218 Capítulo 5. Interacción de GAGs con Pleiotrofina. 5.1 INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS. ................................................................. 221 5.2 DISCUSIÓN Y RESULTADOS. ...................................................................... 224 5.2.1 INTERACCIÓN DE LOS TETRASACÁRIDOS NO PROTEGIDOS CON LA PLEIOTROFINA (3, 7 Y 10). ............................................................................. 224 5.2.2 INTERACCIÓN DE LA PLEIOTROFINA CON TETRASACÁRIDOS DIBENCILADOS (2, 5 Y 8). .................................................................................... 234 5.3 DATOS DE INHIBICIÓN OBTENIDOS MEDIANTE POLARIZACIÓN DE FLUORESCENCIA. ..................................................................................................... 244 5.4 CONCLUSIONES. ............................................................................................ 245 5.5 PARTE EXPERIMENTAL. .............................................................................. 246 Capítulo 6. Conclusiones. 6.1 INTERACCIÓN DE GAGs DERIVADOS DE HEPARINA CON FGF-1 Y LANGUERINA. ............................................................................................................ 249 6.2 INTERACCIÓN DE GAGs (TETRASACÁRIDOS Y DISACÁRIDOS) CON MIDKINA. .................................................................................................................... 250 6.3 PLEIOTROFINA .............................................................................................. 252 Anexo………………………………………………………………………………… 259 CAPÍTULO 1 Introducción Capítulo 1 5 1.1 BIOMOLÉCULAS: CARBOHIDRATOS. Además de la evidente y bien conocida función como fuente de energía de los carbohidratos (glucosa y almidón / glucógeno) estas biomoléculas también juegan un papel importante como constituyentes estructurales en diferentes organismos en distintos reinos (quitina o celulosa). Sin embargo, un nuevo campo está surgiendo con ímpetu y está relacionado con el papel que juegan los carbohidratos dentro de la glicobiología donde intervienen en numerosos procesos tanto fisiológicos como patológicos. Como procesos fisiológicos se puede mencionar el desarrollo, crecimiento, diferenciación, reconocimiento y embriogénesis celular y como procesos patológicos los procesos infecciosos, de inflamación y tumorales. Estos procesos pueden provocar modificaciones postraduccionales de las proteínas regulando así su actividad biológica. 1 La glicobiología comprende el estudio de la estructura molecular y función biológica de los carbohidratos libres o presentes en glicoproteínas, glicolípidos y proteoglicanos, así como de las proteínas que interactúan específicamente con estos 2 y su implicación causal en el desarrollo de patologías, diagnosis y terapia.1 En las células de los mamíferos se pueden encontrar diferentes tipos de monosacáridos tales como la Glucosa (Glc), la Galactosa (Gal), la N-acetil galactosamina (GalNAc), la N-acetil glucosamina (GlcNAc), la Xilosa (Xyl), el Ácido Glucurónico (GlcA), la Mannosa (Man), la Fucosa (Fuc) y el Ácido Siálico o el Ácido N-acetilneuraminico (NeuAc). 3 Estos monosacáridos se pueden unir formando disacáridos y moléculas más complejas como oligosacáridos y polisacáridos. Debido a la gran cantidad de grupos hidroxilos que presentan pueden formar tanto estructuras lineales como ramificadas. Además, estas moléculas pueden sufrir modificaciones posteriores como sulfataciones, fosforilaciones, acetilaciones aumentando así su diversidad estructural y, con frecuencia, se pueden encuentran en combinación con otras biomoléculas. En la naturaleza hay diferentes tipos de biomoléculas tales como los ácidos nucleicos (ADN y ARN), las proteínas, los lípidos y los glúcidos siendo este último grupo el tipo más abundante. El conjunto de todos los carbohidratos tanto libres como formando 1 A. Varki, Glycobiology 2017, 27, 3. 2 Y. C. Lee, R. T. Lee, Accounts of Chemical Research 1995, 28, 321. 3 A. A. Weiss, S. S. Iyer, Microbe 2007, 2, 489. Introducción 12 la heparina ya que un hexasacárido de sulfato de dermatano puede enlazar con el cofactor II de la heparina inhibiendo la actividad de la trombina. 1.2.2.3 Sulfato de Queratano. Este disacárido está formado por una β-D galactosa y la β-D glucosamina N-acetilada que se unen mediante enlaces β 1,3 y β 1,4 (figura 1.2.2.4).8 El grado de sulfatación y la longitud en este GAG puede variar pero las dos acciones se producen en el mismo grado. Como ya se ha mencionado la zona común con la que empieza la biosíntesis es diferente, lo que provoca que haya tres tipos de sulfato de queratano con localizaciones en el organismo diferentes. El Tipo I que se encuentra en la córnea, el tipo II que se encuentra en el cartílago y, por último, el tipo III que se encuentra en el cerebro.8,9 Figura 1.2.2.4 Secuencia disacarídica básica del sulfato de queratano (KS). 1.2.2.4 Ácido Hialurónico. Esta secuencia está formada por el ácido β-D glucurónico y una β-D glucosamina N- acetilada unidos por enlaces β-1,4 y β-1 (figura 1.2.2.5). Otra diferencia de este disacárido con los demás, es que no presenta grupos sulfato. Es ampliamente distribuido por los tejidos neuronales, epiteliales y conectivos e interviene en la proliferación, en la migración celular y en la progresión de algunos tumores. Figura 1.2.2.5 Secuencia disacarídica básica del ácido hialurónico. Y= H o SO3- Capítulo 1 13 1.2.3 Funciones de los GAGs. Los GAGs son biomoléculas que llevan a cabo numerosos procesos biológicos (fisiológicos y patológicos) además de funciones estructurales y moduladoras. Una clasificación que se puede hacer de las funciones biológicas de los glicosaminoglicanos es según la forma en que reconocen a diferentes proteínas. Así la figura 1.2.3.1 muestra dos formas de reconocimiento. Por un lado, se puede producir un reconocimiento intrínseco por el cual reconocen proteínas procedentes del mismo organismo y por otro lado, un reconocimiento extrínseco reconociendo proteínas procedentes de un organismo diferente. Para que se produzca este reconocimiento se necesita una proteína que reconozca a glicosaminoglicanos (GBP). Figura 1.2.3.1 Reconocimiento intrínseco (izquierda) y reconocimiento extrínseco (derecha) desde la célula central. Fuente: Ajito Varki y Pascal Garneo 2007.5 Según su función estructural se puede enumerar varios procesos biológicos en los que intervienen los GAGs:1,8,9, 11 , 12 , 13  Intervienen en la elasticidad, resiliencia y compresibilidad de los tejidos.  Contribuyen a la solubilidad de las proteínas glicosiladas del plasma sanguíneo. 11 K. Sugahara, H. Kitagawa, Currante Opinion in Structural Biology 2000, 10, 518. 12 T. Mikami, H. Kitagawa, Glycoconjugate Journal 2017, 34, 725. 13 Y. Mechref, D. Muddiman, Analytical and Bioanalytical Chemistry 2017, 409, 355. Introducción 14  Contribuyen al plegamiento de los polipéptidos que se encuentran en el lumen del Retículo Endoplásmico y protegen a las proteínas de la ruptura de los enlaces glicosídicos.  Inhiben las interacciones célula-célula o célula-matriz gracias a su carga negativa.  Actúan como fuente de energía debido al almacenamiento de glucosa en células animales y en plantas. Debido a la gran cantidad de funciones que los GAGs pueden realizar en el organismo, estos polisacáridos son muy útiles como aplicación médica por su efecto anticoagulante, anti-inflamatorio, como agentes antitumorales entre otros.6 En los siguientes apartados se va a enumerar algunas de las interacciones de los GAGs (que se han estudiado en esta tesis doctoral) con diversas proteínas y las funciones biológicas en las que intervienen estas biomoléculas debido a las interacciones. 1.2.3.1 Heparán Sulfato y Heparina. HSPGs interaccionan con diferentes proteínas en la membrana extracelular realizando así diversas funciones.10, 14 , 15 Estas proteínas pueden ser factores de crecimiento, citoquinas, quimioquinas, enzimas, inhibidores enzimáticos y proteínas de la matriz extracelular. A continuación se describen algunas de las funciones del HS:  Estos GAGs pueden actuar como correceptores uniéndose a receptores tipo FGF o VEFG ayudando a la formación del complejo proteína-ligando o modificando la estructura de ambos o sólo de uno de ellos para que se puede formar el complejo provocando el inicio del proceso de señalización de los FGs. Los glicosaminoglicanos de heparan sulfato secretados también provocan una respuesta de señalización en células cercanas.  Otra función en la que participan estos proteoglicanos es la de intervenir en el enlace de los factores de crecimiento a la membrana extracelular provocando así la regulación de la migración celular por parte de la matriz extracelular. 14 S. Sarrazin, W.C. Lamanna, J.D. ESko, Cold Spring Harbor Perspectives in Biology 2011, 3, 1. 15 R. Raman, V. Sasisekharan, R. Sasisekharan, Chemistry and Biology, 2005, 12, 267. Capítulo 1 15  Los morfógenos también son moléculas de señalización expresados en un tejido. Estos forman unos gradientes morfogénicos que son esenciales para llevar a cabo la diferenciación celular. Para la estabilización de esto gradientes y evitar su difusión se requieren glicosaminoglicanos tales como el HS. Dado que muchos ligandos proteicos, como factores de crecimiento, morfógenos y citoquinas, están implicados en la progresión del tumor, es cada vez más evidente que los proteoglicanos de la superficie celular afectan el comportamiento de las células tumorales. 16  También actúan como receptores de adhesión uniéndose a proteínas de la matriz o de la superficie celular tales como fibronectinas, lamininas, vitronectinas, trombospondina y algunos colágenos fibrilares. Además de intervenir en la adhesión celular también facilitan el proceso de adhesión célula-célula.  HS puede regular la regeneración, mantenimiento y reparación de los tejidos de un tipo determinado de células debido a su unión a factores de crecimiento llevando éstas a cabo su función de mantenimiento y regulación.  Otra función de la heparina muy conocida es su función anticoagulante debido a su intervención en la unión entre la trombina y la antitrombina III acelerando así el proceso de inhibición de la trombina evitando problemas de la coagulación sanguínea.  Los patógenos como las bacterias, virus y parásitos utilizan los receptores de glicosaminoglicanos de la superficie celular para infectar a la célula. 2.3.2.1 Condroitín Sulfato y Dermatán Sulfato. Este tipo de glicosaminoglicano se localiza en la matriz extracelular del sistema nervioso central en vertebrados, 17 bien en la superficie o asociado a la membrana plasmática. Además, se puede encontrar en el cartílago de los mamíferos llevando a 16 J. R. Couchman, H. Multhaupt, R. D. Sanderson, F1000 Faculty Reviews 2016, 5, 1541. 17 L. Djerbal, H. Lortat-Jacob, JCF. Kwok, Glycoconjugate Journal 2017, 34, 363. Introducción 16 cabo funciones estructurales. Como los demás glicosaminoglicanos, éste también interacciona con diferentes proteínas llevando a cabo numerosos procesos fisiológicos y patológicos. 18 , 19 , 20 , 21 Algunas de las funciones que podemos mencionar son:  El CS puede participar en el proceso de osteoartritis. 22  Otra función más estudiada del CS es su interacción y cooperación con proteínas y receptores de señalización extracelular modulando el crecimiento axonal. Más específicamente, el CS puede interaccionar con factores neurotróficos, factores de crecimiento de fibrobrastos, midkina y pleiotrofina llevando a cabo procesos relacionados con las células neuronales (diferenciación, adhesión, migración, crecimiento, etc.). Todas las variantes del CS según el patrón de sulfatación muestran interacción con factores de crecimiento y factores neurotróficos. Además el híbrido CS/DS también puede interaccionar con factores de crecimiento igual que lo hace la Hp o CS. Debido a la gran demanda de GAGs para fines terapéuticos es necesaria la síntesis química de estos productos con nuevas estrategias y grupos protectores para obtener GAGs con un alto grado de estereoselectividad y quimioselectividad necesarios para la interacción proteína-ligando. 23 Además, el patrón de sulfatación de dichos productos regula una gran variedad de interacciones proteína-ligando y la caracterización a nivel molecular de estas interacciones son de gran importancia para el conocimiento de actividades biológicas llevadas a cabo por GAGs. 18 J. Sugahara, T. Mikami, T. Uyama, S. Mizuguchi, K. Nomura, H. Kitagawa, Current Opinion in Structural Biology 2003, 13, 612. 19 C. D. Nandini, K. Sugahara, Advances in Pharmacology 2006, 53, 253. 20 R. M. Lauder, Complementary Therapies in Medicine 2009, 17, 56. 21 J. M. Trowbridge, R. L. Gallo, Glycobiology 2002, 12, 117R. 22 Y. Henrotin, M. Marty, A. Mobasheri, Maturitas 2014, 78, 184. 23 M. Mende, C. Bednarek, M. Wawryszyn, P. Sauter, M. B. Biskup, U. Schepers, S. Bräse, Chemical Reviews 2016, 116, 8193. Capítulo 1 17 1.2.4 Estructura química de los GAGs. La estructura de un disacárido, oligosacárido o polisacárido es determinada por la secuencia monosacarísidica, por la disposición de los enlaces glicosidicos y la estereoquímica de las uniones glicosídicas (α o β) y por el grado y tipo de sustitución de los grupos hidroxilos. Como ya se ha mencionado, las hexosas son anillos de hexapiranosas que pueden mostrar diferentes conformaciones incluso sufrir un equilibrio conformacional como ocurre para el IdoA por diferentes efectos. 24 , 25 , 26 En 1975, Cremer and Pople pusieron de manifiesto una definición para describir los parámetros que proporcionan las conformaciones canónicas para un monosacárido. 27 Estos parámetros representan un conjunto esférico tal que un punto P viene definido por Q, θ y υ siendo Q el radio de la esfera, θ es el ángulo polar que indica si la conformación está en el norte, en el sur o en el ecuador de la esfera y υ es el ángulo azimutal el cual indica donde nos encontramos dentro del ecuador de la esfera (figura 1.2.4.1). En el norte y sur de la esfera nos encontramos las conformaciones de silla perfectamente definidas (4C1 y 1C4), en el ecuador nos encontramos las conformaciones de Bote (B) o bote torcido (S) y entre el ecuador y los polos nos encontramos las conformaciones de media silla (H) o de medio bote (E). 28 La figura 1.2.4.1 b representa el diagrama de pseudorrotación en el que se puede observar las diferentes conformaciones. 24 B. M. Satelle, S. U. Hansen, J. Gardiner, A. Almond, Journal of the American Chemical Society 2010, 132, 13132. 25 T. R. Rudd, M. A. Skidmore, M. Guerrini, M. Hricovini, A. K. Powell, G. Siligardi y E. A. Yates, Current Opinion in Structural Biology 2010, 20, 567. 26 M. Hricovini, The Journal of Phisical Chemistry 2011, 115, 1503. 27 D. Cremer, J. A. Pople, Journal of the American Chemical Society 1975, 97, 1354. 28 G. A. Jeffrey, J. H. Yates, Carbohydrate Research 1979, 74, 319. Introducción 18 Figura 1.2.4.1 a) Sistema de coordenadas esféricas b) diagrama pseudorrotacional para anillos de piranosas. Un efecto importante que hay que mencionar en este apartado es el efecto anomérico del anillo de hexapiranosa. Este efecto provoca que la conformación del carbono anomérico pueda ser α o β dependiendo si los anillos de hexapiranosa tienen el oxígeno interglicosídico en su forma axial o ecuatorial. Para los anillos con conformación 4C1 predomina su forma axial debido al efecto endo-anomérico que estabiliza esa conformación. Cuando el oxígeno interglicosídico (Og) se encuentra en disposición axial, se produce una hiperconjugación entre los electrones no enlazantes del oxígeno endocíclico (O5) y el orbital p antienlazante del enlace C1-O1 aumentando la estabilidad del anillo con respecto a la forma β. 29 Otro efecto que influye en la conformación del ángulo diedro phi es el efecto exo-anomérico que es provocado por la orientación que adopta el carbono Cx (carbono del anillo anterior al enlace glicosídico). Así el enlace O5- C1-Og-Cx puede presentar dos conformaciones diferentes para el enlace siendo -60 o 60. Por el efecto de hiperconjugación entre el orbital antienlazante del enlace O5-C1 con los pares de electrones del Og predomina la conformación -60 para la mayoría de los ciclos de hexopiranosas. 29 V. S. R. Rao, P. K. Qasba, P. V. Balaji, R. Chandrasekaram, Conformation of carbohidrates 1988. Capítulo 1 19 Figura 1.2.4.2 Representación del efecto endo y exo de un anillo de hexopiranosa en su conformación 4C1. Los glicosaminoglicanos tienen una gran flexibilidad conformacional debido a las uniones glicosídicas y a la rotación del grupo hidroxilo en posición C6 del anillo de hexoxamina. Estas uniones están definidas por tres ángulos de torsión tales como υ, ψ y ω.29 En la figura 1.2.4.3 se puede observar los diferentes enlaces en un disacárido de CS. Se puede definir Φ como el ángulo formado entre H1-C1-Og-Cx (Cx es el Carbono del anillo anterior que participa en el enlace glicosídico), Ψ es el ángulo formado entre C1- Og-Cx-Hx (Hx es el hidrógeno unido a Cx) y ω es el ángulo definido entre C4-C5-C6-O6 que nos da información de la rotación del grupo hidroxilo unido al C5 del anillo. Así, podemos tener tres diferentes rotámeros (gauche-gauche, gauche-trans y trans-gauche). Figura 1.2.4.3 Representación de los diferentes ángulos diedros que definen la conformación de los glicosaminoglicanos en un enlace 1,3. Todas estas características estructurales de los glicosaminogliganos se pueden determinar mediante la aplicación de la espectroscpía de 1H-RMN midiendo las constantes de acoplamiento 3JHH y comparándolas con las típicas de cada conformación y las distancias experimentales calculadas a partir de las interacciones dipolo-dipolo (NOEs) que nos dan información adicional de la conformación de cada anillo y de las φψ ω Introducción 20 orientaciones de los ángulos diedros glicosidicos. Esta metodología es aplicada para GAGs libres independientemente de su origen y complejidad y al estudio de su asociación con otras especies como proteínas. 30 1.3 LECTINAS TIPO C Y FACTORES DE CRECIMIENTO. Como ya se ha mencionado los GAGs se asocian a numerosas proteínas en la matriz extracelular modificando o interviniendo en sus funciones. Estas uniones se producen por interacciones no covalentes entre la proteína y el ligando tales como interacciones electrostáticas debido a los aminoácidos cargados positivamente de las proteínas. También se pueden producir interacciones hidrófóbicas con los residuos aromáticos de las proteínas, puentes de hidrógeno o interacciones de Van der Waals. Esta tesis está centrada en el estudio de la asociación de GAGs con proteínas diferentes, bien factores de crecimiento o lectinas tipo-C: Languerina, FGF-1, Midkina y Pleiotrofina, por lo que se va a explicar brevemente la estructura y función de cada una de ellas. 1.3.1. Lectinas tipo C: Languerina. Las lectinas son proteínas de unión a carbohidratos q intervienen en procesos de reconocimiento de GAGs con alta especificidad, a nivel celular y molecular a través de un Dominio de Reconocimiento de Carbohidratos (DRC). Las lectinas tipo C son proteínas que necesitan Ca2+ para ejercer su función y complejar selectivamente oligosacáridos. Suelen estar asociadas al sistema inmune, pivotando el primer proceso de reconocimiento celular sobre estas. Entre las lectinas de tipo C más conocidas se encuentran las expresadas por las células dendríticas (DCs, del inglés dendritic cell) denominadas DC-SIGN. Estas células forman parte esencial del sistema inmunitario encontrándose en la piel y en la mucosa en mamíferos. Las DCs expresan diferentes proteínas transmembranales (tipos I y II) en la matriz extracelular (figura 1.3.1.1). La diferencia entre ambos tipos radica en la cantidad de dominios de reconocimiento de carbohidratos que presentan. 31 30 J. F. G. Vliegenthart, Perspectives in Science 2017 11, 3. Capítulo 1 21 Figura 1.3.1.1 Representación de las diferentes Lectinas tipo C en la superficie celular de la célula dendrítica. Fuente: Carl G. Figdor et al. 2002.31 Centrándonos en la Languerina, es una lectina tipo C expresada por un subconjunto de las células dendríticas, las células de Langerhans (LCs, del inglés Langerhans cell) 32 que se encuentran principalmente en la epidermis de la piel. Para llevar a cabo este reconocimiento la Languerina presenta un dominio de reconocimiento de carbohidratos (CRD). Esta proteína presenta varios dominios cuya ordenación se puede ver en la figura 1.3.1.2. Los tres dominios son: un dominio intracelular (citoplasmático) formado por 43 aminoácidos acabando con un N-terminal, un dominio transmembranal formado por 20 aminoácidos y un dominio extracelular más lago (ECD) acabado con un C- terminal. El dominio citoplasmático está formado por un motivo de señalización rico en prolina, el cual funciona como un sitio de unión para proteínas de transducción de señales. El domino extracelular está subdividido en un domino de reconocimiento de carbohidratos y un cuello muy largo, una secuencia peptídica en forma de hélice alfa. El CRD presenta una secuencia de Glutamato/Prolina/Asparagina formando un patrón EPN, el cual es característico de lectinas con especifidad en manosa. Este dominio CRD es capaz de reconocer carbohidratos interviniendo en procesos biológicos como adhesión célula-célula y célula-matriz. Por último, la Languerina presenta un dominio particular localizado entre el CRD y el dominio de transmembrana, una secuencia de 31 C. G. Figdor, Y. van Kooyk, G. J. Adema, Nature Reviews Immunology 2002, 2, 77. 32 M. Merad, F. Ginhoux, M. Collin, Nature Reviews Immunology 2008, 8, 935. Introducción 28 Figura 1.3.2.2 A, B y C muestra el proceso de formación del complejo terciario asimétrico y E, F, G muestra el proceso de formación del complejo terciario simétrico. Fuente: Vitor H. Pomin 2016.47 Un aspecto muy importante que cabe mencionar es la especificad del GAG de unión para la formación del complejo terciario. Parece que el HS y la Hp son los GAGs responsables de enlazar y regular la actividad de los diferentes FGFs. 52 Ente ambos, la Hp presenta más cargas negativas por lo que se usa para el estudio del complejo terciario de los FGFs. De esta manera, se producen interacciones de tipo electrostático entre estas cargas negativas y positivas de la proteína estabilizando el complejo terciario. Además, el complejo terciario también está estabilizado por interacciones hidrofóbicas y electrostáticas entre el FGF y los dominos D2 y D3 de sus receptores.48,49 Para que se produzca la interacción de GAGs con los FGFs y además que debido a esta interacción los FGFs presenten actividad biológica se debe de tener en cuenta las características conformacionales del enlace. Por ejemplo, la estructura mínima del GAGs en cuestión, necesaria para el enlace, la flexibilidad conformacional que pueden sufrir los anillos de IdoA presentes en los GAGs (HS y Hp) y el patrón de sulfatación de estas biomoléculas, son aspectos muy importantes en la formación del complejo terciario. Estos aspectos pero con más detalle serán comentados en el capítulo referido a la interacción del FGF-1 con trisacáridos derivados de Hp (capítulo 3). 52 M. Mohammadi, S. K. Olsen, R. Goetz, Currente Opinion in Structural Biology 2005, 15, 506. Capítulo 1 29 1.3.3. Factores de crecimiento: Midkina y Pleiotrofina. Midkina es un factor de crecimiento con gran cantidad de aminoácidos básicos y cisteína. Esta proteína se une a GAG y está presente en todos los vertebrados donde se expresa a mitad de la gestación. Su expresión, salvo excepciones, está relacionado con procesos patológicos, cáncer, inflamación, la presión sanguínea, el desarrollo y la protección de tejidos. 53 , 54 , 55 Los inhibidores de la Midkina 56 también son importantes en la esclerosis múltiple y en enfermedades como el Alzheimer (figura 1.3.3.1). Además, la Midkina puede presentar diferentes funciones dependiendo de la célula objetivo. Figura 1.3.3.1 Representación de diferentes funciones biológicas en las que interviene la Midkina. Fuente: Kenji Kadomatsu et al. 2013.53 Algunos de los receptores de la midkina pueden ser PTP, un proteoglicano, LRP una lipoproteína y ALK una quinasa linfoma anaplastia (esquema de la unión a diferentes receptores)53. La figura 1.3.1.2 representa la unión de esta proteína con alguno de sus receptores. 53 K. Kadomatsu, S. Kishida, S. Tsubota, J.Biochem 2013, 153, 511. 54 T. Muramatsu, Current Pharmaceutical Design 2011, 17, 410. 55 K. Kadomatsu, T. Muramatsu, Cancer Letters 2004, 204, 127. 56 T. Matsui, K. Ichihara-Tanaka, C. Lan, H. Muramatsu, T. Kondou, C. Hirose, S. Sakuma, T. Muramtsu, International Archives of Medicine 2010, 3. Introducción 30 Esta proteína está formada por dos cadenas y una zona muy conservada en la estructura “la zona hinge”. Ver figura 1.3.10 A. Una cadena está formada por un dominio C con una cola C terminal y la otra cadena está formada por un domino N y una cola N- terminal. Estas dos cadenas están unidas por una zona hinge. La estructura secundaria de las dos cadenas son láminas B antiparalelas con tres puentes disulfuros en el domino N y dos puentes en el domino C. Además, el domino C contiene un círculo “loop” flexible. En el dominio C la midkina presenta dos zonas de reconocimiento de carbohidratos. Una zona, cluster-1, formada por residuos de lisina (K79 y K87) y por una arginina (R81). El cluster-2 se encuentra en el loop flexible formado por la lisina (K86 y K87) y por una arginina (R89). 57 El dominio N terminal es requerido para la dimerización de la Midkina junto con la transglutaminasa y la heparina. Estudios posteriores llevados a cabo con un pentasacárido de heparina (fondaparium) y la Mdkb presente en el pez zebra, han sugerido dos zonas más en la estructura de la proteína, capaces de unirse a carbohidratos. Estas dos zonas (cluster-3 y cluster-4) se encuentran en el domino N- terminal de la proteína (ver estructura 1.3.11 B y C). Así mediante técnicas de resonancia han concluido la necesidad de las 4 zonas (2 de cada dominio) y la zona hinge para la unión del pentasacárido de heparina. 58 57 W. Iwasaki, K. Nagata, H. Hatanaka, T. Inui, T. Kimura, T. Muramatsu, K. Yoshida, M. Tasumi, F. Inagaki, The EMBO Journal 1997, 16, 6936. 58 J. Lim, S. Yao, M. Graf, C. Winkler, D. Yang, Biochemical Society 2013, 451, 407. Capítulo 1 31 Figura 1.3.3.2 Representación de la estructura de la Midkina. En A) podemos observar la estructura secundaria de la midkina y la zona hinge. En B y C se representa la estructura secundaria con una superficie electrostática para poder observar los 4 clúster formados de aminoácidos positivos (azul). Fuente:Jackwee Lim et al. 2013.58 A pesar de haberse resuelto la estructura de la Midkina completa mediante RMN y parcial por difracción de rayos X, la naturaleza precisa del complejo de membrana a través del cual activa su función permanece por descubrir. En general, estos procesos implican la oligomerización extracelular del receptor al formar el complejo con factores de crecimiento y el GAG. Dicha oligomerización produce una señal intracelular frecuentemente por fosforización que es la responsable de la actividad. GAGs tipo heparina interacciona con la Midkina debido a su estructura tridimensional y la disposición de los grupos cargados negativamente.57 Otro tipo de GAG que también interacciona con la Midkina es el CS tipo E. 59 En el capítulo 4 se describe un estudio llevado a cabo en esta tesis doctoral. Este estudio trata sobre las interacciones de GAGs con la Midkina debido a la gran importancia que este tema presenta. Así que se comentará los en contexto los antecedentes previos a este tipo de interacciones y se pondrá de manifiesto los requisitos estructurales para la interacción con HS O CS-GAG. La Midkina puede unirse a sus diferentes receptores, como ya se ha mencionado, formando un complejo proteína-receptor. Por ejemplo, un receptor es PTP que es un proteoglicano encontrado en la superficie celular. Este presenta tres zonas diferenciables en su estructura: un dominio extracelular formado por cadenas de CS, una zona de transmembrana y un dominio citoplasmático. Mediante este dominio extracelular se puede producir la interacción entre la Midkina y el PTP provocando la activación de la Midkina. Esta estimulación provoca la fosforilación de las tirosinas que se encuentran en la zona citoplasmática del receptor provocando el inicio del sistema de señalización transfiriendo la señal a dos quinasas tipo MAP y PI3. La unión a los receptores provoca diferentes funciones.53, 60 (figura 1.3.3.3). 59 P. Zou, K. Zou, H. Muramatsu, K. Ichihara-Tanaka, O. Habuchi, S. Ohtake, S. Ilematsu, S. Sakuma, T. Muramatsu, Glycobiology 2003, 13, 35. 60 T. Muramatsu, Journal of Biochemistry 2002, 132, 359. Introducción 32 Figura 1.3.3.3 Proceso llevado a cabo por la Midkina cuando es activada por sus receptores. Fuente: Kenji Kadomatsu et al. 2013.53 Bastante parecida a la estructura de la Midkina es la Pleiotrofina (PTN). Esta proteína también es un factor de crecimiento neuronal el cual presenta una similitud con la proteína de un 45% y un plegamiento similar. Esta proteína es una potente citoquina mitogénica la cual presenta diversas funciones en la superficie celular. Por ejemplo, las células cancerígenas presentan una alta expresión de esta proteína cuyos niveles dependen de la metástasis del tumor. 61 , 62 , 63 , 64 , 65 , 66 , 67 , 68 , 69 Por el contrario, una alta 61 M. Hatziapostolou, J. Delbe, P. Katsoris, C. Polytarchou, J. Courty, E. Papadimitriou, Prostate 2005, 65, 151. 62 R. Jager, K. Noll, K. Havemann, K. H. Pfluger, C. Knabbe, H. Rauvala, G. Zugmaier, International Journal of Cancer 1997, 73, 537. 63 R. Mentlein, J. Held-Feindt, Journal of Neurochemistry 2002, 83, 747. 64 F. Vacherot, D. Caruelle, D. Chopin, S. Gil-Diez, D. Barritault, J. P. Caruelle, J. Courty, Prostate 1999, 38, 126. 65 A. Wellstein, W. J. Fang, A. Khatri, Y. Lu, S. S. Swain, R. B. Dickson, J. Sasse, A. T. Riegel, M. E. Lippman, Journal of Biological Chemistry 1992, 267, 2582. 66 L. Zhang, T. Mabuchi, E. Satoh, S. Maeda, H. Nukui, H. Naganuma, Neurologia Medico Chirurgica (Tokyo) 2004, 44, 637. 67 N. Zhang, R. Zhong, Z. Y. Wang, T. F. Deuel, Journal of Biological Chemistry 1997, 272, 16733. 68 D. Weber, H. J. Klomp, F. Czubayko, A. Wellstein, H. Juhl, Cancer Research 2000, 60, 5284. 69 Y. Kong, P. S. Bai, K. J. Nan, H. Sun, N. Z. Chen, X. G. Qi, International Journal of Colorectal Disease 2012, 27, 287. Capítulo 1 33 expresión de estas proteínas en otro tipo de células ayuda al mantenimiento de células, reparación de tejidos y protección de células neuronales durante su adición. 70 , 71 , 72 , 73 , 74 , 75 , 76 Además, esta proteína participa en el desarrollo del sistema nervioso central y en la reparación y regeneración de tejidos. 77 , 78 , 79 La estructura de la Pleiotrofina no se encuentra tan definida como la estructura de la Midkina (figura 1.3.3.4). La distribución de aminoácidos básicos en el NTD de la Pleiotrofina es diferente a la Midkina. La Pleiotrofina presenta un clúster de aminoácidos básicos en el extremo NTD similar a la Midkina del pez “zebra” pero con un aminoácido adicional, R39. 80 , 81 70 E. Gramage, G. Herradon, Y. B. Martin, M. Vicente-Rodriguez, L. Rojo, H. Gnekow, A. Barbero, C. Perez-Garcia, Toxicology 2013, 306, 2147. 71 G. Herradon, C. Perez-Garcia, British Journal of Pharmacology 2014, 171, 837. 72 M. Vicente-Rodriguez, E. Gramage, G. Herradon, C. Perez-Garcia, Toxicology 2013, 314, 166. 73 E. Gramage, G. Herradon, Current Pharmaceutical Design 2011, 17, 449. 74 G. Herradon, L. Ezquerra, Current Medicinal Chemistry 2009, 16, 3322. 75 D. M. Marchionini, E. Lehrmann, Y. Chu, B. He, C. E. Sortwell, K. G. Becker, W. J. Freed, J. H. Kordower, Brain Research 2007, 1147, 77. 76 I. R. Taravini, M. Chertoff, E. G. Cafferata, J. Courty, M. G. Murer, F. J. Pitossi, O. S. Gershanik, Molecular Neurodegeneration 2011, 6, 40. 77 H. J. Yeh, Y. Y. He, J. Xu, C. Y. Hsu, T. F. Deuel, Journal of Neuroscience 1998, 18, 3699. 78 Y. S. Li, P.G. Milner, A.K. Chauhan, M.A. Watson, R.M. Hoffman, C.M. Kodner, J. Milbrandt, T.F. Deuel, Science 1990, 250, 1690. 79 H. A. Himburg, J. R. Harris, T. Ito, P. Daher, J. L. Russell, M. Quarmyne, P. L. Doan, K. Helms, M. Nakamura, E. Fixsen, G. Herradon, T. Reya, N. J. Chao, S. Harroch, J. P. Chute, Cell Reports 2012, 2, 964. 80 W. Iwasaki, K. Nagata, H. Hatanaka, T. Inui, T. Kimura, T. Muramatsu, K. Yoshida, M. Tasumi, F. Inagaki, The EMBO Journal 1997, 16, 6936. 81 E. Ryan, D. Shen, X. Wang, The FEBS Journal 2016, 283, 1488. Introducción 34 Figura 1.3.3.4 Estructura de la Pleiotrofina, extremo N y C reductor de los dos dominios. Fuente: Fuente: Eathen Ryan et al. 2016. Fuente: Eathen Ryan, 2016. 35 CAPÍTULO 2 Metodología Capítulo 2 36 2.1 INTRODUCCIÓN. Los procesos fisiológicos llevados a cabo en las células se basan en el reconocimiento molecular proteína-ligando. Para conocer las bases estructurales de dicho reconocimiento molecular es de gran importancia determinar las interacciones proteínaligando establecidas por las fuerzas intermoleculares entre ambas especies. 1 , 2 , 3 El estudio de los complejos proteína-ligando se ha abordado con una amplia selección de técnicas biofísicas tales como SPR (del inglés, Surface Plasmón Resonance) que permite obtener parámetros cinéticos de interacción, ITC (del inglés, Isothermal Titration Calorimetry) que mide propiedades termodinámicas del enlace y FP (del inglés, Fluorescence Polarization) que proporciona el porcentaje de inhibición (IC50) indicando la efectividad de una sustancia para inhibir una función biológica. Además, se utilizan técnicas computacionales como las dinámicas moleculares y docking de las que se puede obtener la estructura tridimensional de los ligandos libres y de los complejos, respectivamente. Finalmente, se ha de mencionar las técnicas de RMN 4 , 5 (Resonancia Magnética Nuclear), y de difracción de rayos X que proporcionan la estructura atómica del complejo. 6 En este capítulo se va a describir la metodología aplicada durante el desarrollo de esta tesis doctoral para el estudio de la interacción proteína-ligando empleando técnicas de Resonancia Magnética Nuclear y métodos teóricos. 2.2 MÉTODOS DE RMN PARA EL ESTUDIO DEL LIGANDO LIBRE Y DEL COMPLEJO. Dependiendo de las características espectroscópicas de cada biomolécula los procedimientos para la determinación de sus estructuras tridimensionales son diferentes. Para el caso de los carbohidratos el más empleado es la combinación de datos 1 N. Sharon, Journal of Biological Chemistry 2007, 282, 2753. 2 W. I. Weis, K. Drickamer, Annual Review of Biochemistry 1996, 65, 441. 3 R. U. Lemieux, Accounts of Chemical Research 1996, 29, 373. 4 B. Meyer, T. Peters, Adgewnadte Chemie 2003, 42, 864. 5 L. Fielding, Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 2007, 51, 219. 6 S. Pérez, K. Mazeau, C. Hervé du Penhoat, Plant Physiology and Biochemistry 2000, 38, 37. Metodología 37 experimentales y cálculos de dinámica molecular en disolvente explícito. Como alternativa se puede emplear dinámica molecular con restricciones experimentales promediadas en el tiempo. En general a lo largo de esta tesis se ha empleado como primera opción los cálculos sin resticciones seguidos de la comparación con los datos experimentales de RMN, constantes de acoplamiento y distancias interprotónicas derivadas de medidas de NOE. Sólo en los casos en los que hubo discrepancias se realizaron cálculos restringidos empleando distancias experimentales. 2.2.1 Obtención de las estructuras tridimensionales del ligando libre de forma experimental. 2.2.1.1 Experimentos 1H monodimensionales o S3-HMBC. Para carbohidratos el análisis de las constantes de acoplamiento a tres enlaces proporciona una información de alta calidad y precisión sobre las geometrías torsionales y como consecuencia de la conformación de los anillos de piranosa. Las constantes de acoplamiento se pueden calcular teóricamente empleando varias ecuaciones; desde la ecuación de Karplus, hasta otras más sofisticadas y precisas como la de Altona que considera la electronegatividad de los sustituyentes. En la presente memoria se han empleado ecuaciones de Altona parametrizadas para cada enlace, en general usando el promedio a lo largo de la dinámica molecular calculado para cada estructura. Las medidas de estas constantes se han realizado habitualmente a partir de la separación de las señales en un 1H monodimensional normal o selectivo o mediante un S3-HMBC. 7 Este último experimento está basando en un experimento HMBC en el que se relacionan dos espines 1H y 13C mediante un acoplamiento a largo alcance heteronuclear directo y otro espín 1H (pasivo) es atraído al espín 13C siendo sometido a una selección S3 mediante el acoplamiento heteronuclear a un enlace. Así el espectro de 1H activo es dividido en dos espectros. 7 L. Kjaerulff, A. J. Benie, C. Hoeck, C. H. Gotfredsen, O. W. Sorensen, Journal of Magnetic Resonance 2016, 263, 101. Capítulo 2 44 Figura 2.2.2.2 Representación del proceso del experimento STD durante el cual se irradia el receptor. Debido a que esta técnica se suele usar para equilibrios donde las constantes de disociación pueden variar de 10 nM a 10 mM se debe de tener muy en cuenta las condiciones experimentales para la realización de estos experimentos. Así para equilibrios con baja afinidad puede ocurrir que obviamente no se forma complejo y para equilibrios con bastante afinidad puede ocurrir que el ligando no se disocie. Al igual que para el NOE es muy importante la cinética del equilibrio. Durante un intercambio rápido el ligando se disociará del complejo portando la información deseada que pasará al seno de la disolución. Y si el ligando está en exceso saturará el sitio de reconocimiento de la proteína aumentando la proporción de ligando saturado en el seno de la disolución durante el tiempo de saturación antes de que pierda la información de ligando enlazado por su relajación longitudinal y trasversal (s-1). Si el intercambio es lento, el ligando no se separará del complejo y relajará en el sitio de reconocimiento antes de disociarse o incluso no se disociará por lo que la magnetización en el seno de la disolución es nula. Además de la cinética y de la afinidad de la interacción proteína-ligando también es bastante influyente el exceso de ligando empleado y el tiempo de saturación. De forma general se define que el ligando debe de presentarse en una proporción de 50 a veces 1000 veces mayor que la proteína. Cuanto mayor sea el tiempo de saturación y el cantidad de ligando enlazado mayor será los valores de STD. Después de todo esto se puede “asegurar” que no se deben comparar valores de STD para diferentes equilibrios y especies ya que hay una gran cantidad de condiciones para la obtención de estos valores. Este experimento se lleva a cabo a dos frecuencias diferentes. Por un lado, se irradia a una frecuencia de 7 ppm (aromáticos) o a 0-1 ppm (grupos alifáticos) saturando ciertos protones de la proteína. El espectro obtenido es on-resonance y se puede medir un valor de intensidad de Isat. Por otro lado, se irradia a una frecuencia que se encuentre lejos de los valores de la proteína y del ligando obteniendo un espectro de referencia denominado off-resonance. De este espectro se obtiene un valor de intensidad de I0. De Metodología 45 la diferencia de ambos espectros (Isat-I0) se obtiene el espectro STD (de diferencia) el cual proporciona información acerca de la parte del ligando que se encuentra más próximo a la proteína y, por supuesto, de la interacción proteína-ligando. Así podemos obtener un valor de saturación STD para cada uno de los protones que intervengan en el enlace (figura 2.2.2.3). Figura 2.2.2.3 Espectro de referencia, de saturación (a la izquierda) y de diferencia (STD) a la derecha. La aplicación de este experimento es para conocer el mapa del epítopo y la orientación del ligando al interaccionar con la proteína. Para ello, se calcula el valor de STD0 a partir de los valores de STD medidos en el espectro. Se construye una gráfica la cual representa la curva de crecimiento de los valores de STD medidos a diferentes tiempos de saturación para cada protón (figura 2.2.2.4). De esta gráfica se obtiene el valor de STD0 (valor de la pendiente inicial de crecimiento) mediante un ajuste matemático a una ecuación mono-exponencial. 21 21 M. Mayer, T. L. James, Journal of the American Chemistry Society 2004, 126, 4453. Capítulo 2 46 Figura 2.2.2.4 Curvas de crecimiento obtenidas para la interacción de 2G12 (un anticuerpo del VIH) con un tetramanósido mimético de high-mannose. Fuente: Enríquez-Navas et al. 2011. 22 2.2.2.3 T1 selectivo (relajación longitudinal).5, 23 En un sistema de dos espines nucleares la relajación puede ocurrir mediante dos mecanismos: T1 (longitudinal) y T2 (trasversal). 24 Además, la relajación T1 puede ser selectiva o no, aunque se conoce que el índice de relajación longitudinal selectiva (1/T1(sel) de los ligandos es un indicador de interacción más sensible que el índice no selectivo. 25 Debido a la gran diversidad de la espectroscopía de resonancia se conocen varios métodos para medir la constante de acoplamiento para un sistema proteína-ligando dado 26 . Uno de esos métodos puede ser el T1 selectivo aplicado en uno de los sistemas estudiados en esta tesis (interacción del FGF-1 con trisacáridos de heparina) se ha utilizado este método para la determinación de la constante de disociación. Los tiempos de relajación fueron medidos por una secuencia de pulsos con inversión recovery (un pulso de 180º con forma y un pulso de 90º duro). En un sistema de interacción proteína-ligando donde el ligando se encuentra en exceso sobre el receptor el valor de la relajación del ligando viene descrita por la ecuación 2. 1/T1obs =1/T1free + fbound (T1bound + σbound) Ecuación 7 Donde fbound es la fracción del ligando enlazado ([PL]/[P]) y σbound es el tiempo de vida del estado enlazado. La relación entre la concentración de ligando total y T1 es representada en la ecuación 8. Así, se puede obtener valores de constante de disociación para un sistema en equilibrio. 22 P. M. Enríquez-Navas, M. Marradi, D. Padro, J. Angulo, S. Penadés, Chemistry- A European Journal 2011, 17, 1547. 23 Y. Fraenkel, G. Navon, A. Aronheim, J.M. Gershoni, Biochemistry, 1990, 29, 2617. 24 M. C. Fernandez-Alonso, M. A. Berbis, A. Canales, A. Ardá, F. J. Cañada, J. Jiménez-Barbero, New Applications of High-Resolution NMR in Drug Discovery and Development 2013, 1, 7. 25 G. Valensin, T. Kushnir, G. Navon, Journal of Magnetic Resonance 2004, 46, 23. 26 L. Fielding, Current Topics in Medicinal Chemistry 2003, 3, 39. Metodología 47 [P0]*T1obs = ([L0] + KD) (T1enlazado + σenlazado) Ecuación 8 Varios ejemplos utilizando este tipo de experimentos son representados en la bibliografía. Debido a que se produce una interacción dipolo-dipolo la cual provoca una relajación T, esta magnitud se puede expresar en términos de σij y ρij, relajación cruzada y autorelajación respectivamente21 que dependen a su vez del tiempo de correlación. Un experimento complementario al STD es el WaterLOGSY ya que aunque proporciona información sobre el modo de unión del complejo también ofrece información adicional sobre la capa de hidratación de la interfase proteína-ligando. 27 Así, la magnetización es transferida desde el agua del seno de la disolución presente en la interfaz ligandoproteína, la cual trasfiere magnetización a los protones del ligando a través de dos procesos. 28 , 29 , 30 2.3 MÉTODOS TEÓRICOS UTILIZADOS PARA EL ESTUDIO DE LA ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DEL LIGANDO LIBRE Y DE LA INTERACCIÓN PROTEÍNA-LIGANDO. 2.3.1 Cálculos computacionales (dinámica molecular) para el estudio teórico de la geometría tridimensional del ligando. Una de las propuestas en este grupo de investigación hace un tiempo fue la aplicación de dinámicas moleculares con disolvente explícito para ligandos derivados de Heparina (trisacáridos) obteniendo estructuras en movimiento de los compuestos y sus propiedades en disolución asemejando el sistema a la forma de estudio experimental. 27 L. Geist, M. Mayer, X. L. Cockcroft, B. Wolkerstorfer, D. Kessler, H. Engelhardt, D. B. McConnell, R. Konrat, Journal of Medicinal Chemistry 2017, DOI 10.1021/ACS.JMEDCHEM.7B00845 28 C. Dalvit, G. Fogliatto, A. Stewart, M. Veronesi, B. Stockman, Journal of Biomolecular NMR 2001, 21, 349. 29 C. A. Lepre, J. M. Moore, J. W. Peng, Chemical Reviews 2004, 104, 3641. 30 J. W. Peng, J. Moore, N. Abdul-Mana, Progress in Nuclear Magnetic Spectroscopy 2004, 44, 225. Capítulo 2 48 Durante el desarrollo de esta tesis doctoral hubo la necesidad de aplicar el sistema utilizado en el grupo a ligandos nuevos derivados de CS e híbridos DS/CS con grupos aromáticos como sustituyente. El problema encontrado fue la poca bibliografía existente para este tema lo que provocó proponer un protocolo para la realización de estas simulaciones. Este protocolo está dividido en la preparación de los archivos de los residuos nuevos necesarios para la realización de la simulación y la propia simulación en sí. 1. Preparación de los residuos por separado partiendo de una estructura con formato pdb. Para ello se utilizó Glycam-06 ya que es bien conocido el uso de este campo de fuerza a la modelización de carbohidratos, glicoproteínas y glicolípicos incluso para complejos proteína ligando 31 , 32 describiendo las propiedades fisicoquímicas de los glicanos y glicoconjugados siendo totalmente compatible con el campo de fuerza AMBER. Además se ha usado como parámetros PARM 94 33 ya que es el usado por AMBER para el empleo de las componentes van der Waals en la modelización de carbohidratos. Para la obtención de las cargas de cada uno de los residuos se usó el método RESP y el módulo de antechamber y parmchk el cual nos permite la obtención de las propiedades de los residuos. Y por último se usó el módulo de tleap de AMBER 34 para la creación de los archivos que contienen las coordenadas y propiedades de nuestro sistema. En el cual se hace mención a la solvatación del sistema y a la inclusión del disolvente explícito como moléculas de agua TIP3P. 2. Una simulación de dinámica molecular consiste en la aplicación de leyes de movimiento a los átomos que forman parte de las moléculas como un conjunto de configuraciones moleculares. Para eso se calcula las coordenadas de desplazamiento (trayectoria) de un sistema molecular a una temperatura dada encontrando 31 K. N. Kirschner, A. B. Yongye, S. M. Tschampel, J. Gonzalez-Outeirino, C. R. Daniels, B.L. Foley, R. J. Woods, Journal of Computational Chemistry 2008, 29, 622. 32 M. B. Tessier, M. L. Demarco, A. B. Yongye, R. J. Woods, Molecular Simulation 2008, 34, 349. 33 W. D. Cornell, P. Cieplak, C. I. Bayly, I. R. Gould, K. M. Merz, D. M. Ferguson, D. C. Spellmeyer, T. Fox, J. W. Caldwell, P. A. Kollman, Journal of the American Chemical Society 1995, 117, 5179. 34 T. A. D. D. A Case, T. E. Cheatham, III, C. L. Simmerling, J. Wang, R. E. Duke, R., R. C. W. Luo, W. Zhang, X. Wu, S. R. Brozell, H. G. T. Steinbrecher, Q. Cai, X. Ye, J. Wang, M. J. Hesieh, G. Cui, D. R. Roe, D. H., M. G. S. Mathews, C. Sagui, V. Babin, T. Luchko, S. Gusarov, A. Kovalenko, P. A. Kollman, University of California, San Francisco 2010. Metodología 49 velocidades y posiciones de un conjunto de partículas como una función del tiempo llevado a cabo por ecuación de movimiento en tiempo de Newton’s. Estas simulaciones son llevadas a cabo mediante un conjunto microcanónico (NVE) o canónico (NVT) determinando las propiedades termodinámicas. El procedimiento descrito en la figura 2.3.1.1 representa todos los pasos seguidos en equilibrar el sistema antes de la producción de la dinámica y la obtención de la trayectoria. Para la simulación de la dinámica se utilizan varios algoritmos y las propiedades observadas físicamente son computadas a un tiempo promedio en conjunto de microestados individuales. Por eso las dinámicas deben de ser suficientemente largas como para que los movimientos importantes sean bien mostrados estocásticamente. Sin embargo, se debe de tener en cuenta la longitud de dichas dinámicas ya que se puede producir desviaciones del campo de fuerza. 35 Otra limitación de las dinámicas es que las moléculas de estudio se sometan a eventos dinámicos lo que provoque un aumento en la escala de tiempo de la simulación. Este puede ser solventado mediante el aumento de la temperatura para alcanzar la conformación más estable energéticamente lo que puede provocar conformaciones no reales. 35 K. N. Kirschner, R. J. Woods, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 2001, 98, 10541. Capítulo 2 50 Figura 2.3.1.1 Protocolo de seguimiento para la obtención de las trayectorias de las Dinámicas Moleculares. 2.3.2.1 Simulaciones de dinámica molecular con restricciones promediadas en el tiempo. Estas simulaciones fueron desarrolladas para generar estructuras consistentes con los datos experimentales obtenidos de RMN. Para ello se lleva a cabo la simulación con restricciones promediadas en el tiempo. Estas restricciones suelen ser distancias experimentales procedentes de los NOEs interprotónicos. Para conducir las estructuras hacia valores experimentales se debe de incluir un término de energía artificial Epenalti basada en una incorporación de una función penalti que se suma a la energía del sistema Esistema para obtener la energía total del sistema Etotal. La función penalti es una función artificial que presenta tres regiones diferentes. Para definir esta función se necesita un margen del 10% del valor de la distancia experimental determinando los valores de r1, r2, r3 y r4 pasando desde una Epenalti de 0 a una función parabólica y a una linear. Equilibrio Producción de la dinámica Trayectoria de la DM para el análisis Minimización del disolvente Minimización de todo el sistema Calentamiento 1- disolvente 2- sistema Todo el sistema Metodología 51 Las estructuras generadas con esta metodología pueden mostrar las características procedente de un sistema en equilibrio conformacional 36 , 37 , 38 como el equilibrio del IdoA ampliamente estudiado. 39 La distancia R en este tipo de simulaciones es una distancia promedio dependiente del tiempo. 2.3.2 Cálculos teóricos para el estudio teórico de la geometría tridimensional del complejo. Al igual que existen gran cantidad de experimentos de RMN que se pueden llevar a cabo para el estudio de las interacciones proteína-ligando también se desarrollaron métodos computacionales para el mismo estudio. Durante la realización de esta tesis doctoral sólo se han utilizado dos métodos teóricos para el estudio de los complejos, docking y CORCEMA-ST, cuyos fundamentos serán mostrados a continuación. 2.3.2.1 Docking. El docking es un procedimiento computacional que predice la orientación y conformación de uno o más ligandos enlazados a una proteína. Hay diversos programas utilizados para la realización de un docking 40 , 41 que aunque trabajan de forma ligeramente diferente todos presentan características comunes como la búsqueda de localizaciones en la superficie de la proteína que permiten las interacciones favorables con el ligando, la búsqueda conformacional del ligando y el cómputo de la energía de interacción entre la proteína y el ligando (resultado de la afinidad de enlace o la función “scoring”). Uno de los programas utilizados para la realización de un docking es glide (del inglés, grid-based ligand docking with energetic) que usa una serie de filtros jerárquicos que evalúa la interacción del ligando en el sitio activo del receptor. 36 R. K. a. E. R. P. Z. W. F. van Gunsteren, “Procedings NATO/CECAM workshop on nucleica cid conformation and dynamics” W. K. Olson ed 1984, 79-92. 37 D. A. Cumming, J. P. Carver, Biochemistry 1987, 26, 6664. 38 P. M. S. Hendrickx, F. Corzana, S. Depraetere, D. A. Tourwé, K. Augustyns, J. C. Martins, Journal of Computational Chemistry 2010, 31, 561. 39 Z. Zhang, S. A. McCallum, J. Xie, L. Nieto, F. Corzana, J. Jiménez-Barbero, M. Chen, J. Liu, R. J. Linhardt, Journal of the American Society 2008, 130, 12998. 40 Autodock The Scripps Research. 41 Glide manual. Capítulo 2 52 La búsqueda de la localización y orientación se lleva a cabo mediante un procedimiento (figura 2.3.2.1) por Glide. El procedimiento consiste en diferentes etapas: 1. Búsqueda del “Site point” en un espacio de 2 Å cubriendo la región del sitio activo. Para ello se mide la distancia desde el “site point” a la superficie del receptor y desde del centro del ligando hasta la superficie del ligando (átomo en el extremo) las cuales son comparadas y si son presentan una coincidencia suficientemente buena se coloca el dentro del ligando en el “site point”. 2. En la segunda etapa se analiza el ligando en diferentes subetapas. 2a. Test del diámetro del ligando analizando la ubicación de los diferentes átomos. Se produce una selección de las posibles orientaciones del diámetro pero si se producen demasiados impedimentos estéricos con el receptor, la orientación se omite. 2b. Se considera la rotación alrededor del diámetro del ligando puntuando las interacciones entre los átomos capaces de formar puentes de hidrógenos o interacciones de los metales con el receptor. Si este resultado es aceptable se puntúan todas las interacciones ligando y receptor. 2c. Se lleva a cabo una pequeña puntuación de la molécula dependiendo de la posición relativa de los átomos al receptor. Para ello se utiliza un algoritmo de la función de puntuación empírica ChemScore de Schorodinger que reconoce las interacciones hidrofóbicas, los enlaces de hidrógeno y las interacciones con los metales penalizando los impedimentos estéricos. 2d. Por último se lleva a cabo un refinamiento de las estructuras obtenidas por el cual se permite la rotación del ligando en un radio de 1 A en todas las direcciones cartesianas y se vuelve a puntuar las estructuras mejor puntuadas de la etapa anterior. Al siguiente filtro sólo pasan aproximadamente unas 400 estructuras. 3. Minimización de energía. Se comienza por unos filtros (grid) de van der Waals y electrostáticos suaves que van aumentando su potencia. Así se reduce los grandes términos de energía y los gradientes producidos por contactos interatómicos próximos permitiendo un movimiento más libre. Se optimizan los ángulos de torsión en un docking flexible y por último se usa Monte Carlo para explorar la torsión mínima para un número pequeño de estructuras de menor energía. Metodología 53 4. En la última etapa las estructuras cuya energía han sido minimizada se calcula una puntuación mediante una función scoring, GlideScore, basada en ChemScore. A partir de GlideScore se calcula el término Docking Score en el que se tiene en cuenta la penalización del estado Epik y las deformaciones (si se usasen). Por último, la selección de la mejor estructura obtenida se lleva a cabo mediante Emodel que combina la afinidad del enlace predicha por GlideScore, la energía de tensión interna y la energía Coulomb-vdW. Figura 2.3.2.1 Esquema jerárquico usado por Glide para llevar a cabo el docking. Antes de comenzar cualquier cálculo de docking se debe de generar un grid. Este grid generado representa la forma y las propiedades del receptor, por lo que Glide permite definir la estructura del receptor mediante un grid de 30 Å máximo (figura 2.3.2. 2). Además, el ligando (su centro) también es definido en la generación del grid. Así, se construye un grid más pequeño para el punto medio del diámetro del ligando. Las dimensiones de este grid varían en un rango de 6 a a14 Å permitiendo la búsqueda de un modo de enlace asimétrico o inusual en el sitio activo. CAPÍTULO 3 Interacción GAGs derivados de Heparina con FGF-1 y Languerina. Capítulo 3 61 3.1 ANTECEDENTES Y OBJETIVOS. En el primer capítulo se explicó brevemente la estructura del FGF-1 y la formación e importancia biológica del complejo terciario formado por FGF:FGFr:Hp. Como antecedentes en este capítulo se va a poner de manifiesto los estudios más relevantes realizados con el FGF-1. Se va a mostrar tanto su interacción con diferentes GAGs derivados de HS/Hp como datos de su actividad biológica. La primera parte de este capítulo nos ayudará a comprender con más detalle la estructura básica de GAGs que es reconocida por este factor de crecimiento y la activación de la actividad mitogénica del FGF-1 por GAGs. Hoy en día se conoce claramente el sitio de reconocimiento del FGF-1 por GAGs como HS y/o Hp. 1 , 2 Este factor de crecimiento en su superficie presenta dos zonas de reconocimiento de GAGs, principal y secundaria (figura 3.1.1). Las dos zonas presentan una superficie electrostática positiva capaz de acomodar las cargas negativas de los grupos sulfato que se encuentran como sustituyentes en la Hp. Estas dos zonas se diferencian en la capacidad para acomodar más o menos cargas negativas procedentes del Hp-GAG. Así, la zona principal presenta la longitud necesaria para acomodar las cargas negativas de tres grupos sulfato mientras que la zona secundaria puede acodar sólo dos. Esta diferencia provoca que los GAGs se orienten en una u otra zona o incluso en las dos en función de su tamaño y su patrón de sustitución. Se conoce que el amplio rango de estas interacciones tan específicas depende de la secuencia, la distribución de carga y la flexibilidad conformacional del anillo de Idurónico que presenta la Hp. 3 , 4 , 5 , 6 Además, se ha demostrado la importancia del patrón de sulfatación de la Hp en el reconocimiento proteína-ligando. 1 A. D. Digabriel, I. Lax, D. I. Chen, C. M. Svahn, M. Jaye, J. Schelessinger, W. A. Hendrickson, Nature 1998, 393, 812. 2 A. Canales, R. Lozano, B. López-Méndez, J. Angulo, R. Ojeda, P. M. Nieto, M. Martín-Lomas, G. Giménez-Gallego, J. Jiménez-Barbero, FEBS Journal 2006, 273, 4716. 3 J. Turnbull, A. Powell, S. Guimond, TRENDS in Cell, Biology 2001, 11, 75. 4 B. Casu, M. Petitou, M. Provasoli, P. Sinay, TIBS 1988, 13, 221. 5 N. Jastrebova, M. Vanwildemeersch, U. Lindhal, D. Spillmann, Journal of Biological Chemistry 2010, 285, 26842. 6 S. E. Guimond, J. E. Turnbull, Current Biology 1999, 9, 1343. Interacción de GAGs con FGF-1 y Langerina 62 Figura 3.1.1 Estructura del FGF-1 (2ERM) representada con la superficie de potencial electrostático. El HS-GAGs es un polisacárido lineal que contiene unidades D-GlcN y D-GlcA o L- IdoA. De la biosíntesis de este GAGs resulta residuos sulfatados y no sulfatados distribuidos en diferentes zonas de la cadena. La figura 3.1.2 muestra la estructura de Hp natural, la cual presenta una estructura tridimensional helicoidal. De esta forma, en la estructura de la Hp se puede observar gran cantidad de grupos sulfato orientados hacia ambas caras de su eje longitudinal. Este patrón de sulfatación es muy importante para la dimerización del FGF-1 (complejo 2:2:2) ya que la Hp actúa como nexo de unión entre dos cadenas de FGF-1 y los FGFR. Figura 3.1.2 Estructura de la Hp (1HPN). Representación de los anillos de IdoA en su conformación 1C4. Un tema muy estudiado por diferentes investigadores durante muchos años ha sido la longitud mínima necesaria de GAGs que interaccionan con el FGF-1 provocando su respuesta biológica. Este tema ha sido muy controvertido debido al patrón de sulfatación tan diferente que pueden presentar los GAGs tipo Hp y HS. Parece que la longitud mínima de la Hp para enlazar con FGF-1 es la estructura formada por cuatro monosacáridos que contiene un trisacárido totalmente sulfatado en el extremo reductor imprescindible para interaccionar con el FGF-1. Esta secuencia trisacarídica está Zona prinpipal (puede acomodar más cargas negativas) Zona secundaria (puede acomodar menos cargas negativas) Capítulo 3 63 formada GlnN6SO3-IdoA2SO3-GlcN6SO3 (GIG). Los tres grupos sulfato presentes en dicha secuencia son imprescindibles para interaccionar con el FGF-1. 7 En nuestro grupo de investigación se ha llevado a cabo diferentes estudios para determinar la interacción y actividad mitogénica del FGF-1 con GAGs tipo Hp. Para ello se utilizaron hexasacáridos y octasacáridos sintéticos de heparina con diferente patrón de sulfatación. 8 Todos los GAGs utilizados presentaban el trisacárido básico (GIG) capaz de interaccionar con el FGF-1. Este estudio puso de manifiesto la importancia de la distribución potencial electrostática a lo largo de la cadena carbonatada de los oligosacáridos. Para analizar el modo de unión de oligosacáridos de Heparina y FGF-1, se realizó un estudio mediante Espectroscopía de Resonancia de Plasmón Superficial. Para ello se usaron cinco hexasacáridos 9 , 10 , 11 con diferente patrón de sulfatación. Mediante los experimentos de SPR y los resultados de la actividad mitogénica obtenida en años anteriores,8 se llegó a la conclusión que el patrón de sulfatación era el origen de las diferencias entre la interacción y la actividad biológica. 12 Para aceptar esta conclusión se tuvo que asumir el papel de las interacciones electrostáticas entre los GAGs y el FGF-1 y considerar que no hay grandes diferencias estructurales entre los hexasacáridos derivados de heparina estudiados. 13 Además se mostró que el ensamblaje del complejo terciario (FGF-1:FGFR:Hp) es esencial para la actividad biológica (Schle y Pelegrini 2010). Sin embargo, la dimerización del FGF-1 no es imprescindible para la actividad biológica pero sí influye en la afinidad de FGF-1 con GAGs. 7 M. Guerrini, T. Agulles, A. Bisio, M. Hricovini, L. Lay, A. Naggi, L. Poletti, L. Sturiale, G. Torri, B. Casu, Biochemical and Biophysical Research Communicationes 2002, 292, 222. 8 J. Angulo, R. Ojeda, J. L. de Paz, R. Lucas, P. M. Nieto, R. M. Lozano, M. Redondo- Horcajo, G. Giménez-Gallego, M. Martín-Lomas, ChemBioChem 2004, 5, 55. 9 J. L. De Paz, J. Angulo, J. M. Lassaletta, P. M. Nieto, M. Redondo-Horcajo, R. M. Lozano, G. Giménez-Gallego, M. Martín-Lomas, ChemBioChem 2001, 2, 673. 10 R. Ojeda, J. Angulo, P. M. Nieto, M. Martín-Lomas, Canadian Journal of Chemistry 2002, 80, 917. 11 R. Lucas, J. Angulo, P. M. Nieto, M. Martín-Lomas, Organic and Biomolecular Chemistry 2003, 1, 2253. 12 J. C. Muñoz-Garcia, M. J. García-Jiménez, P. Carrero, A. Canales, J. Jiménez- Barbero, M. Martín-Lomas, A. Imberty, J. L. de Paz, J. Angulo, H. Lortat-Jacob, P. M. Nieto, Glycobiology 2014, 24, 1004. 13 J. C. Muñoz-García, J. López-Prados, J. Angulo, I. Diaz-Contreras, N. Reichard, J. L. de Paz, M. Martin-Lomas, P. M. Nieto, Chemistry European Journal 2012, 18, 16319. Interacción de GAGs con FGF-1 y Langerina 64 La importancia de la polaridad de la cadena de GAGs en la interacción con el FGF-1 se puso de manifiesto gracias a dos hexasacáridos sintéticos con el mismo patrón de sulfatación pero con la secuencia desplazada (figura 3.1.3). El hexasacárido que presentaba una secuencia igual que la Hp natural (representado en amarillo) provocaba la actividad mitogénica del FGF-1 mientras que con el hexasacárido con la secuencia desplazada (rojo) provocaba que el FGF-1 se mantuviese inactivo. Además, los dos mostraban diferencias en afinidad. Mediante la realización de un docking del FGF-1 con los dos hexasacáridos, se observó que la zona de unión principal del FGF-1 era la idónea para fijar la estructura de una secuencia trisacarídica G-I-G y la zona secundaria aceptaría un disacárido con secuencia G-I. Este fue el modelo propuesto con el hexasacárido con la misma secuencia que la heparina (hexasacárido representado en amarillo). Sin embargo, el otro hexasacárido (representado en rojo) se une a la zona principal de unión la misma secuencia trisacarídica pero la zona secundaria se queda libre. Esto explicaba la diferencia en la actividad mitogénica y en la interacción.12 Figura 3.1.3 Docking realizado con la estructura tridimensional del FGF-1 y dos hexasacáridos de Hp. En amarillo el Hexasacárido con la secuencia natural de Hp, en rojo el hexasacárido con la secuencia desplazada y en verde la estructura de la proteína. En este capítulo se va a estudiar la interacción del FGF-1 con diferentes trisacáridos conteniendo la secuencia GIG (secuencia mínima de interacción). Debido a que estos trisacáridos presentan diferente patrón de sulfatación se va a intentar determinar cómo influye el patrón de sulfatación en dicha interacción. La conformación estructural de dichos trisacáridos fue estudiada por el Dr. Juan Carlos Muñoz mediante espectroscopía de RMN y dinámica molecular. Los trisacáridos de Capítulo 3 65 heparina presentan una estructura helicoidal 14 al igual que oligosacáridos de mayor longitud. 15 El anillo central (IdoA) de estos trisacáridos presenta un equilibrio conformacional entre la conformación de 1C4 y conformaciones ecuatoriales cercanas a la 2S0 como las 2,5B y 5S1. Este equilibrio está influenciado por la temperatura y por la presencia de los grupos sulfato en los residuos de GlcN adyacentes a él. Aunque estos trisacáridos presentan una estructura rígida, el estudio de las uniones glicosídicas mostró un enlace rígido (anti-Ψ) para GlcN-IdoA y un enlace más flexible para IdoA-GlcN que algunos casos, dependiendo del patrón de sulfatación, permitía unas conformaciones anti-Ψ(minoritarias).13 La serie de 8 trisacáridos sintéticos se estudiaron en el grupo de investigación con una proteína de membrana, la Languerina. Como ya se comentó en la introducción (capítulo 1) es una lectina tipo C, la cual interacciona con carbohidratos de forma dependiente de Ca2+. Se comprobó mediante experimentos de RMN de interacción (STD y NOESY transferido) que los trisacáridos interaccionan de forma dependiente de Ca2+ ya que estos trisacáridos presentan dos grupos hidroxilos libres en el extremo no reductor 16 (figura 3.1.4_izquierda). Esta interacción no está influencia por el patrón de sustitución de los trisacáridos. Otros estudios que se llevaron a cabo con la Languerina fueron con GAGs derivados de Hp pero con mayor longitud, un dodecasacárido. Se obtuvo la estructura del complejo en la cual se puede observar la interacción en otro sitio de unión, independiente del ión Ca2+ (figura 3.1.4_derecha). 14 B. Mulloy, M. J. Forster, C. Jones, D. B. Davies, Biochemical Journal 1993, 293, 849. 15 D. Mikhailov, R.J. Linhard, K.H. Mayo, Biochemical Journal 1997, 328, 51. 16 J. C. Muñoz-García, E. Chabrok, R. R. Vivés, A. Thomas, J. L. de Paz, J. Rojo, A. Imberty, F. Fieschi, P. M. Nieto y J. Angulo, Journal of American Chemistry Society 2015, 137, 4100. Interacción de GAGs con FGF-1 y Langerina 66 Figura 3.1.4 Derecha) Estructura obtenida para el trisacárido persulfatado y la Languerina los cuales se unen de forma dependiente de Calcio. Izquierda) Estructura obtenida para el complejo formado por la misma proteína y un dodecasacárido derivado de Heparina el cual se une a la Languerina de forma independiente de Ca2+. Debido a los resultados tan importantes obtenidos mediante los experimentos de STD para los complejos trisacáridos-Languerina, se decidió realizar un estudio de la interacción de dicha proteína con un hexasacárido de heparina, el cual presentaba un grupo sulfato en posición 4 de su extremo no reductor. Este grupo podría bloquear la interacción con la Languerina por el Ca2+ provocando que se produzca dicha interacción en otro sitio de enlace de la proteína. Este sitio de unión podría ser una grieta cargada positivamente debido a los aminoácidos básicos que forman el trímero de Languerina al igual que ocurría con el dodecasacárido de Hp. Por todo lo expuesto anteriormente, en este capítulo se va a estudiar complejos formados por GAGs derivados de Heparina con FGF-1 y Languerina. OBJETIVOS. 1- Estudiar la influencia del patrón de sustitución de los trisacáridos de Hp en su interacción entre el FGF-1 mediante técnicas de RMN como NOESY transferido, STD y T1-selectivo (estas dos últimas no utilizadas hasta ahora para demostrar dicha interacción) y métodos teóricos (docking y CORCEMA-ST). 2- Con la Languerina, se pretendía estudiar el sitio de unión del Hexasacárido (el cual presenta la posición 4 del extremo no reductor bloqueado mediante un grupo sulfato) en Capítulo 3 67 la zona de enlace de la proteína, determinando si esta unión es dependiente o independiente del ión Ca2+. 3.2 ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN DEL FGF-1 CON TRISACÁRIDOS DERIVADOS DE HEPARINA. Para analizar la interacción del FGF-1 con trisacáridos derivados de Hp se sintetizaron ocho trisacáridos con la misma secuencia pero con diferente patrón de sulfatación.13 La figura 3.2.1 muestra los ocho trisacáridos englobados en dos series: la serie 1 contiene los trisacáridos representados a la izquierda de la imagen (del 1 al 4) y la serie 2 engloba a los trisacáridos de la derecha (del 5 al 8). Figura 3.2.1 Representación de todos los trisacáridos. La serie 1 está formada por los trisacáridos 1, 2, 3 y 4. La serie 2 está formada por los trisacáridos 5, 6, 7 y 8. Al anillo de GlcN en el extremo reductor se denomina anillo A, al ácido Idurónico anillo B y a la GlcN del extremo no reductor se denomina anillo C. Interacción de GAGs con FGF-1 y Langerina 68 La diferencia entre ambas series es que la 2 (trisacáridos del 5 al 8) no presenta ningún grupo sulfato en la posición 6 del anillo de GlcN en posición A, si se denomina como A al anillo presente en el extremo reductor. Con estas dos series se puede mostrar la influencia de ese grupo sulfato en la interacción con el FGF-1. Hay dos grupos sulfato que se mantuvieron invariantes en los ocho trisacáridos, los grupos en las posiciones 2 de los anillos B y C, ya que se consideran necesarios para interaccionar con el FGF-2. Dentro de la misma serie las posiciones sulfatadas para los anillos A, B y C van cambiando de tal forma que el trisacárido 1 está totalmente sulfatado mientras que el trisacárido 4 sólo presenta grupos sulfato en una de las dos caras en la estructura tridimensional. Debido a que la estructura tridimensional de los trisacáridos en su forma libre se había determinado de forma muy exacta mediante espectroscopia de RMN (NOESY) y dinámica molecular13 pero con condiciones diferentes a las que se iba a llevar a cabo el estudio de los complejos con el FGF-1 se decidió realizar experimentos a 600 MHz y a 25ºC para conocer con exactitud los desplazamientos químicos. Para ello se llevaron a cabo experimentos de caracterización como 1H-RMN, COSY y HSQC (ver parte experimental) para los 8 trisacáridos. A continuación, se detallan los experimentos llevados a cabo para determinar la interacción proteína-ligando. 3.2.1 Experimentos NOESY transferido. El primer experimento llevado a cabo fue un NOESY transferido para determinar la conformación del ligando complejado con el FGF-1 y comprarla con la del ligando libre. Además, estos experimentos proporcionarían información sobre la interacción ya que al tener un tiempo de correlación diferente el ligando libre del enlazado se podría producir un cambio de signo de los NOEs. Debido a que los trisacáridos 1 y 4 dentro de la misma serie son los que presentan una mayor diferencia en el número de grupos sulfato se decidió hacer experimentos NOESY y NOESY transferido a dichos trisacáridos. Se prepararon 4 muestras diferentes con la misma concentración de ligando 1mM pero dos de ellas contenían FGF-1 (19 µM) y otras dos no. En la figura 3.2.1.1 se puede observar la comparación los espectros obtenidos para el trisacárido 4 en su forma libre (espectro C) y enlazada (espectro A) junto con los mismos experimentos para el trisacárido 1 (espectro B complejado y ligando D ligando libre). En ambos casos, se observa la aparición de picos de cruce aunque pocos intensos cuando los trisacáridos están en su estado enlazado (espectros A y B) obteniendo la Capítulo 3 69 primera muestra de interacción. A 600 MHz cuando el ligando está libre no presenta NOEs debido a que se encuentra en la zona de NOE cero por el tiempo de correlación. Figura 3.2.1.1 Espectros obtenidos de los experimentos NOESY. Espectros A y C (para el trisacárido 4 y los espectros B y D para el trisacárido 1. El tiempo de mezcla para los experimentos llevados a cabo con los ligandos libres fueron 500 ns y para el complejo 300 ns. Ambos realizados en un espectrómetro de 600 MHz y a 25ºC. Después de comprobar que se produce interacción entre ambos trisacáridos y el FGF-1 pero que los picos NOEs son poco intensos para obtener una estructura tridimensional del ligando enlazado se hizo un NOESY transferido a 15ºC. Al bajar la temperatura se aumenta el tiempo de correlación y el equilibrio conformacional se desplaza hacia las especies más estables obteniéndose así una mayor intensidad en los picos NOEs. Así se puede obtener la estructura tridimensional del ligando cuando forma parte del complejo. La conformación del anillo de IdoA es la más importante ya que presenta un equilibrio conformacional entre las estructuras de silla (1C4) y bote torcido (2SO) cuando el ligando está en su forma libre. Los demás anillos muestran una conformación 4C1 muy estable. En la figura 3.2.1.2 se observa el pico NOE H2B/H5B para el IdoA indicando la conformación 2So. Además, siguen apareciendo dos NOEs interglicosídicos para el enlace IdoA-GlcN (H1C/H4B y H1C/H3B). Después de estos experimentos se puede concluir que no varía la estructura tridimensional del ligando libre con la del enlazado al FGF-1. A B D C Interacción de GAGs con FGF-1 y Langerina 76 Figura 3.2.3.1 Representación de la curva de crecimiento del T1 selectivo al aumentar la concentración de ligando. Capítulo 3 77 Todos los datos obtenidos para las constantes de disociación son del orden de bajo µM, lo que nos indica una interacción fuerte. Esto está de acuerdo con los trabajos publicados por Ornitz et al. Si se compara la serie 1 y 2 se observa que las KD obtenidas para ésta última serie son mayores que para la serie 1. Esto indica una interacción mayor para los trisacáridos con grupo sulfato en posición 6 del anillo A, lo que está de acuerdo con los valores de STD0. En el caso de la serie carente del grupo 6-O-sulfato en el anillo A los valores experimentales de afinidad son muy dispersos y no es posible racionalizarlos empleando un único modo de unión común para todos los oligosacáridos. Trisacárido KD (µM) Trisacárido KD (µM) 1 49.2 ± 0.3 5 50.6 ± 0.1 2 26.1 ± 0.7 6 180.9 ±5.5 3 15.4± 0.4 7 46.7 ± 0.9 4 84.7± 0.4 8 132.4± 1.8 Tabla 3.2.3.1 Tabla que representa los valores de KD obtenidos para cada uno de los trisacáridos. 3.2.4 Docking Molecular.23 Para obtener una estructura tridimensional del complejo e intentar complementar los datos experimentales obtenidos por RMN se llevó a cabo un docking molecular de todos los trisacáridos con el FGF-1 (ver parte experimental). Para ello se usó el módulo de Glide implementado en maestro. Debido a que la zona principal del FGF-1 donde interacciona con los GAGs es la que tiene la capacidad para interaccionar con una secuencia trisacarídica G-I-G, el grid de 16 Å utilizado para la realización del docking se centró en esta zona. Primero, se van a analizar los resultados obtenidos para la serie 1. La figura 3.2.4.1 representa las estructuras superpuestas obtenidas del docking para el trisacárido 4. Se puede observar que todas las poses se encuentran en la zona principal de la proteína, como era de esperarse. A la derecha, en la misma figura se observa una estructura encontrada para el complejo. Se han agrupado todas las estructuras encontradas en función de la posición de los grupos sulfatos que interaccionan con la proteína. En este caso, sólo se obtiene una estructura del complejo diferente ya que se ha descartado las estructuras que presentan el grupo carboxilo del anillo de IdoA hacia la proteína debido a que esta interacción no es real según estructuras del complejo obtenidas previamente mediante RMN y rayos X (2ERM y 2AXM). Como se puede observar la estructura para el complejo obtenida presenta los tres grupos sulfato del Interacción de GAGs con FGF-1 y Langerina 78 ligando orientados hacia la proteína con la misma secuencia que se muestra en la estructura de resonancia 2ERM. Figura 3.2.4.1 Figura representativa del docking para el trisacárido 4. En la parte de la izquierda se presenta el FGF-1 con superficie electrostática y la superposición de los trisacárido de menor energía interaccionando en la zona principal de la proteína. A la derecha se representa una de las estructuras del ligando encontradas en el docking. Para el trisacárido 3 que contiene un grupo sulfato más en el anillo A, se obtuvo el mismo resultado (figura 3.2.4.2). Todas las estructuras obtenidas se encuentran en la zona principal de la proteína pero en este caso se muestran varias estructuras diferentes. La estructura a) representada en dicha figura es la superposición de todas las estructuras obtenidas del docking molecular. La b) representa el ligando con la misma secuencia que la estructura complejada 2ERM y la c) y d) son estructuras en las que el enlace interglicosídico entre los anillos B y A rota hacia una disposición anti orientando el grupo sulfamato del anillo A hacia la proteína. Según los estudios realizados de los trisacáridos en su forma libre y complejada mediante RMN estas estructuras no podían ser reales. Zona principal Zona secundaria Capítulo 3 79 Figura 3.2.4.2 Representación de las estructruas obtenidas del docking molecular. a) Representación de las estructuras de más baja energía obtenidas para el docking molecular. b, c y d) tres estructuras diferentes del docking en las cuales se produce un cambio en la orientación de la secuencia o un cambio en los grupos sulfatos que interaccionan para el trisacárido 3. Sin embargo, para los trisacárido 1 y 2 se obtuvieron muchas más combinaciones posibles ya que presentan más grupos sulfato. El grupo sulfato en posición 2 del anillo C es importante para la formación del complejo 2:1, FGF-1:Trisacárido. Los resultados del docking para estos dos trisacáridos (1 y 2) son representados en las figuras 3.2.4.3 y 3.2.4.4 respectivamente. Una estructura del ligando obtenida es como la estructura cristalográfica obtenida en estudios previos con código pdb 2AXM (figura 4.2.4.3 b). La misma estructura aparece en el resultado del docking para el trisacárido 1. Esto pone de manifiesto que es posible pensar que la diferencia en las interacciones entre los trisacáridos 3 y 4 y 1 y 2 se puede deber a modos de unión diferentes y se pone de manifiesto la importancia del sulfato en posición 6 del anillo C. a c d b Interacción de GAGs con FGF-1 y Langerina 80 Figura 3.2.4.3 Representación de las estructruas obtenidas del docking molecular. a) Representación de las estructuras de más baja energía obtenidas para el docking molecular. b, c y d) tres estructuras diferentes del docking en las cuales se produce un cambio en la orientación de la secuencia o un cambio en los grupos sulfatos que interaccionan para el trisacárido 2. d a c b Capítulo 3 81 Figura 3.2.4.4 Representación de las estructruas obtenidas del docking molecular. a) Representación de las estructuras de más baja energía obtenidas para el docking molecular. b, c y d) tres estructuras diferentes del docking en las cuales se produce un cambio en la orientación de la secuencia o un cambio en los grupos sulfatos que interaccionan para el trisacárido 1. Para la serie 2 las estucturas obtenidas son orientadas en diferentes zonas de la proteína por lo que no se representan las estructuras de las poses de menor energía y se representa solamente la superposición de las estructuras en las diferentes zonas del FGF- 1 (figura 3.2.4.5). El complejo a) es la representación del resultado del docking con el trisacárido 5, el b) es el complejo del trisacárido 6, el c) es el complejo para el trisacárido 7 y por último, el c) es el complejo representativo de la interacción del trisacárido 8 con FGF-1. d a c b Interacción de GAGs con FGF-1 y Langerina 82 Figura 3.2.4.5 Representación de las estructuras de los trisacáridos superpuestas sobre el FGF-1. La figura a) corresponde al docking del trisacárido 5, la b) corresponde al complejo con el trisacárido 6, la c) corresponde al trisacárido 7 y, por último, el trisacárido 8 interaccionan con FGF-1 se representa en la figura d). Este docking fue llevado a cabo con un grid con unas dimensiones más grandes que la serie 1 debido a que los 4 trisacáridos sólo presentan 2 sulfatos en una de las caras y era posible su interacción en otros sitios de unión del FGF-1. Por eso, el grid aplicado era con dimensiones iguales a la proteína para que los trisacáridos puedan mostrar total libertad de movimiento y se unan a la zona más adecuada para tal interacción. De esta forma se obtuvieron estructuras lejos del sitio de interacción principal confirmando la importancia del grupo sulfato en posición 6 del anillo A en la interacción con el FGF-1. Así los trisacáridos 7 y 8 presentan interacción en una zona adicional mientras que los trisacáridos 5 y 6 no. La interacción en esta zona puede provocar que los valores de STD0 obtenidos para estos dos trisacáridos no sean muy tan diferentes con los dos trisacáridos semejantes de la serie 1. Sin embargo, para los trisacáridos 5 y 6 sí muestran más influencia en las curvas de crecimiento del STD cuando presentan o no grupos sulfato debido a que no se unen a la zona adicional. Además, el trisacárido 8 no presenta ninguna estructura en la zona principal debido a que sólo tiene dos sulfatos. Los tres trisacáridos restantes de la misma serie sí presentan estructuras en la zona principal y en la secundaria. Estas diferentes zonas de unión puede justificar que los valores de KD medidos experimentalmente para la serie 2 y los valores de STD0 muy poco diferentes d a c b Capítulo 3 83 para los trisacáridos 3 y 4 y 7 y 8. Cuando se aplicó este grid más grande a los trisacáridos de la serie 1, estos se orientaron en las dos zonas de interacción del FGF-1, la principal y la secundaria aunque mayoritariamente en la principal. De los cuatro trisacáridos de la serie 1 ninguno presentó estructuras en la zona adicional indicando que posiblemente ese sitio de unión sea real para los trisacáridos 7 y 8. 3.2.5 CORCEMA-ST.23 Para complementar la parte experimental y teórica, se midieron los valores de STD0 teóricos. Para ello, se utilizó CORCEMA-ST. En la figura 3.2.5.1 se muestra las gráficas de STD0 experimentales (arriba) y teórica (abajo) para el trisacárido 4. Como input se utilizó la estructura obtenida del docking molecular representada en la figura 3.2.5.1. Además, se muestra la estructura utilizada en la figura 3.2.5.2. En naranja se representan los aminoácidos que están más cerca del ligando y la estructura secundaria de la proteína se muestra en azul. Según los resultados las curvas de crecimiento obtenidas tanto experimentales como teóricas son parecidos con un R-NOE de 0.45 indicando que los valores de STD0 teóricos son representativos ya que está por debajo de 0.5 que es el límite aceptado. Esta estructura del complejo obtenida mediante docking molecular representa una estructura semejante a la obtenida para un hexasacárido con código 2ERM indicando que el modo de unión del trisacárido 4 con los tres sulfatos orientados hacia la proteína es la adecuada. 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 012345 Tiempo de saturación (s) HA1 HB1 HC1 STD (%) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0 1 2 3 4 5 STD (%) Tiempo de saturación (s) HA1 HB1 HC1 STD experimental STD teórico R-noe 0.45 Interacción de GAGs con FGF-1 y Langerina 84 Figura 3.2.5.1 Curvas de crecimiento del STD experimental (arriba) y teórico obtenido mediante CORCEMA-ST (debajo). Factor R-NOE 0.45 para el trisacárido 8. Se llevó a cabo CORCEMA-ST para el complejo formado con el trisacárido 3 con todas las estructuras diferentes encontradas como resultado del docking y la única con la que se obtuvo un R-NOE menor de 0.5 fue con la que presentaba los mismos grupos sulfato orientados hacia la proteína que el trisacárido 4 obteniéndose así un R-NOE de 0.32 (figura 3.2.5.2). Por lo que se puede sugerir que según los datos experimentales y teóricos que la estructura del complejo mostrada como a) en la figura 3.2.4.2 es la estructura real del complejo FGF-1-trisacárido 3. En la cual la adición de un grupo sulfato en posición 2 de la GlcN A no es de vital importancia en la interacción del ligando con la proteína, lo que estaría de acuerdo con los valores de STD experimentales en ambos casos. 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 012345 Tiempo de saturación (s) HA1 HB1 HC1 STD (%) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0 1 2 3 4 5 STD (%) Tiempo de saturación (s) HA1 HB1 HC1 STD experimental STD teórico R-noe 0.45 Capítulo 3 85 Figura 3.2.5.2 Curvas de crecimiento del STD experimental (arriba) y de teórico (abajo) obtenido de CORCEMA-ST con un factor R-NOE de 0.32. Figura 3.2.5.3 Representación de las dos estructuras de los complejos con los que se ha realizado CORCEMA-ST para el trisacárido 8 (izquierda) y 7 (derecha). En azul se representa la estructura de la proteína. 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0 1 2 3 4 5 HA1 HB1 HC1 STD (%) Tiempo de saturación (s) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0 1 2 3 4 5 Tiempo de saturación (s) STD (%) HA1 HB1 HC1 R-noe 0.32 STD experimental STD teórico 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0 1 2 3 4 5 HA1 HB1 HC1 STD (%) Tiempo de saturación (s) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0 1 2 3 4 5 Tiempo de saturación (s) STD (%) HA1 HB1 HC1 R-noe 0.32 STD experimental STD teórico Interacción de GAGs con FGF-1 y Langerina 92 Figura 3.3.2.1 Espectros monodimensionales de los experimentos de STD obtenidos a 4 s de saturación para una muestra que contiene Ca2+ (espectro superior) y sin Ca2+ y, por tanto, con EDTA (espectro inferior). El rojo es el espectro de referencia (1H-RMN) y el negro de diferencia (1H-STD). La temperatura de medida fue 298K para el Hexasacárido 4S. Se midieron los valores de STD0 relativos para los protones anoméricos ya que son los que más aislados se encuentran en el espectro y se pudieron medir con más facilidad. Estos valores han sido obtenidos para la muestra que contenía Ca2+ hasta 5.0 s de saturación (tabla 3.3.2.1). Estos valores varían entre un rango de 46 a 100% sin mostrar ninguna tendencia a lo largo del hexasacárido. Esto claramente indica la orientación del hexasacárido en la grieta formada por el trímero de la Languerina. Tabla 3.3.2.1 Valores de STD0 relativo medidos para cada uno de los protones anoméricos presentes en el Hexasacárido 4S a 298K. Se quiso obtener una estructura del complejo formado por ambas especies por lo que se realizó un docking flexible y simple (SP) para el complejo. El resultado obtenido (figura 3.3.2.2 A) es muy similar el presentado en años anteriores (2012) por E. Chabrol (figura 3.3.2.2 B) mostrando que el ligando se une a la Languerina de forma independiente al Ca2+ interaccionando mediante fuerzas electrostáticas con los grupos cargados positivamente de la superficie de la proteína. Esta idea es totalmente contraria a los resultados obtenidos anteriormente para los trisacáridos derivados de Hp y la misma proteína los cuáles se coordinaban por el ión Ca2+ y se estabilizaba mediante interacciones electrostáticas con residuos vecinos de Lisina (figura 3.3.5 c). STD0 relativo (%) STD0 relativo (%) H1A 49 H1D 46 H1B 97 H1E 60 H1C 79 H1F 100 Capítulo 3 93 Figura 3.3.2.2 Representación de los diferentes complejos formados por la Languerina y GAGs derivados de Hp. a) Muestra la estructura del complejo Languerina:Hexasacárido obtenida mediante docking. b) Muestra la misma proteína con un dodecasacárido publicada por E. Chabrol (2012). c) Representación del complejo formado por un trisacárido de Hp y la Languerina estudiado por J. C. Muñoz. La última parte de este estudio fue la obtención de valores de STD0 relativos y teóricos para el complejo obtenidos a partir de CORCEMA-ST. Los tiempos de saturación teóricos fueron de 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0 y 5.0 s. Los valores de STD0 relativos teóricos son bastantes similares a los obtenidos de forma experimental obtenidos mediante RMN (tabla 3.3.2.2). STD0 relativo (%) STD0 relativo (%) H1A 43 H1D 40 H1B 99 H1E 55 H1C 79 H1F 100 A B C Interacción de GAGs con FGF-1 y Langerina 94 Tabla 3.3.2.2 Valores teóricos del STD0 para cada protón anomérico del Hexasacárido medidos a partir de CORCEMA-ST a diferentes tiempos de saturación. Además, las curvas de crecimiento del STD tanto experimental como teórico para cada uno de los anillos representan una gran similitud (figura 3.3.2.3) indicando que la estructura del complejo propuesta anteriormente y obtenida por docking puede ser bastante real. Se calculó también el factor R-NOE que indica la compatibilidad entre varios valores. Este es de 0.1 lo que indica una fiabilidad alta para ambos datos, experimentales y teóricos. Figura 3.3.2.3 Curvas de crecimiento experimentales y teóricas del STD obtenidas para los protones anoméricos del Hexasacárido 4S mediante RMN y CORCEMA-ST. 3.4 CONCLUSIONES. 1. Los experimentos NOESY transferido a 15ºC llevados a cabo para los trisacáridos 1 y 4 con el FGF-1 muestran que no se produce ningún cambio en la estructura de los trisacáridos al formar parte del complejo proteína-ligando. Esta estructura es similar a la estructura helicoidal de la heparina natural mostrando una conformación lineal. 2. Los estudios de STD llevados a cabo con todos los trisacáridos muestran que se produce interacción entre el FGF-1 y todos los trisacáridos de Hp. A partir de las curvas de crecimiento del STD medido para los protones anoméricos de los trisacáridos, se ha obtenido valores de STD0 muy pequeños, menos del 1%. Este porcentaje tan bajo puede deberse a la distancia tan larga que existe entre las cadenas laterales cargadas 0 1 2 3 4 5 8 STD (%) 6 7 01 2 3 465 Tiempo de saturación (s) Líneas discontinuas –> Valores experimentales. Líneas continuas –> Valores teóricos. Capítulo 3 95 positivamente del FGF-1 y los grupos sulfato negativos de los carbohidratos lo que provoca que los hidrógenos de los carbohidratos reciban poca saturación desde la proteína. Esto se pone de manifiesto en las estructuras de docking obtenidas para los complejos formados por los trisacárido 3 y 4. Además, estos valores tan pequeños indican una gran diferencia de afinidad con respecto a otros GAGs más largos estudiados con el FGF-1 indicando la importancia de la longitud del GAGs en la afinidad y en la selectividad necesaria para la regulación biológica del FGF-1. A pesar de eso, los valores de STD obtenidos para los trisacáridos del 1 al 4 muestran una interacción compatible con la zona principal del FGF-1 con tres grupos sulfatos orientados a la superficie de la proteína. Esto sólo se ha podido comprobar para los trisacáridos 3 y 4 mediante las estructuras de docking y los valores teóricos de STD de todos los trisacáridos de la serie 1. Los trisacáridos 1 y 2 al presentar un grupo sulfato más en el anillo de GlcN del extremo aparecen más estructuras del ligando cuando forma parte del complejo. Una de las estructuras encontradas es la obtenida mediante datos cristalográficos (2AXM) en la cual ese grupo sulfato es importante para la formación del dímero FGF-1:trisacárido. Esto podría estar de acuerdo con que las curvas de STD0 son mayores para los trisacáridos 1 y 2 que para los 3 y 4 indicando la importancia de ese grupo sulfato. Los trisacáridos de la serie 2 no presentan ningún grupo sulfato en posición 2 del anillo de GlcN_A. Este grupo es muy importante para la interacción tal y como se muestra en las constantes de disociación y en los valores de STD experimentales excepto para el trisacárido 7 y 8. Como reflejan las curvas de crecimiento de STD, las del trisacárido 7 son muy parecidas a su equivalente de la serie 1, el trisacárido 3 y para el 8 son incluso mayores que para su equivalente, el 4, aunque las constantes de disociación para ellos sean mayores que para los trisacáridos 3 y 4. Esto puede estar de acuerdo con los resultados de docking con un grid grande ya que se observa que los dos trisacáridos (7 y 8) se unen a una zona adicional de la proteína además de a la zona secundaria y primaria. Lo cual justifica que los valores de STD0 no sean menores ya que se unen en otra zona en la que le puede llegar más saturación desde la proteína y que los valores de constante de disociación sean mayores ya que se unen en otra zona que no está tan cargada positivamente con la zona principal lo que provoca una menor interacción. Debido a las diferentes zonas encontradas y estructuras no se ha podido obtener valores de STD0 teóricos aceptables para determinar la formación del complejo. 3. En el caso de la interacción entre el Hexasacárido y Languerina se ha comprobado su existencia y demostrado que esta se produce por la grieta que se forma en las Interacción de GAGs con FGF-1 y Langerina 96 intersecciones de los dominios que forman el cuello de las tres regiones extracelulares. La estructura propuesta en esta interfase se ha demostrado por simulación de los resultados de STD basados en la geometría del complejo. 3.5 PARTE EXPERIMENTAL Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear. Los experimentos de RMN para el estudio de los trisacáridos se realizaron en un BRUKER 600 MHz AVANCE III HD con un imán ASCEND III equipado con una criosonda QCI S3 H/F-C/N-D 05-Z. Para el estudio del Hexasacárido se utilizó el espectrómetro de 700 MHz, Bruker AVANCE III, situado en el servicio técnico del CITIUS (Sevilla). Los trisacáridos y el hexasacárido de Hp fueron sintetizados previamente en el grupo. El FGF-1 humano comercial se compró a Peprotech el cual consistía en 141 residuos expresado en E. coli con una masa molecular de 16.5 KDa. La Languerina fue proporcionada por el laboratorio de Franck Fieschi. La determinación de la estructura tridimensional de los trisacáridos fue realizada por Juan Carlos Muñoz en su tesis doctoral. Para el traslado de la asignación previa a la actual ya que se han cambiado las condiciones, se han realizado experimentos selectivos sobre los anoméricos, HSQC y COSY-dqf a 298 K. Los experimentos realizados para la determinación estructural del Hexasacárido 4S fueron un 2D-TOCSY y un 2D-NOESY. Tras una optimización de las condiciones después de varios experimentos negativos, se logró encontrar condiciones adecuadas. Las muestras para llevar a cabo los experimentos de STD 17 , 18 y NOESY 19 transferido fueron preparadas en 250 µL con una concentración de buffer fosfato de 5mM a pH 6.0 y 100 mM de NaCl en 99.39% de D2O. La relación final proteína-ligando usada fue de 1:84, con una concentración de FGF-1 19uM y de ligando 1.6mM. 17 M. Mayer, B. Meyer, Angewandte Chemie International Edition 1999, 38, 1784. 18 J. Angulo, P.M. Nieto, European Biophysics Journal 2011, 40, 1357. 19 F. Ni, Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 1994, 26, 517. Capítulo 3 97 En las tablas siguientes se resumen las pruebas realizadas para optimizar la relación proteína ligando la concentración del tampón fosfato. Las concentraciones para las diferentes muestras preparadas para el trisacárido 4 fueron: PRUEBAS PROTEÍNA (µM) LIGANDO RELACIÓN BUFFER FOSFATO (mM) NaCl (mM) 1 19 100 µM 1:5 10 150 2 19 200 µM 1:10 10 150 3 19 200 µM 1:10 10 100 4 19 617 µM 1:33 10 100 5 19 1.6 mM 1:84 5 100 Las concentraciones en las muestras preparadas para el trisacárido 1 fueron: PRUEBAS PROTEÍNA (µM) LIGANDO RELACIÓN BUFFER FOSFATO (mM) NaCl (mM) 1 19 100 µM 1:5 5 100 2 19 200 µM 1:10 5 100 3 19 500 µM 1:26 5 100 4 19 1.6 mM 1:84 5 100 Los experimentos de STD son esencialmente los descritos por Meyer con las mejoras recogidas en la bibliografía: previa purga antes de iniciar el experimento se irradia selectivamente durante el tiempo de relajación con un tren de pulsos gausianos de 49 ms y un ancho de banda de 80 Hz aproximadamente correspondiente a una atenuación de 60 dB separados por un intervalo de 1 ms; posteriormente se introdujo un filtro spin-lock para disminución de las señales residuales de la proteína y finalmente se suprimió el agua residual con excitation sculpting. La frecuencia de irradiación utilizada para obtener el espectro on-resonance fue de 7 ppm (irradiando la zona aromática de la proteína) y off-resonance de 40 ppm. Los tiempos de saturación para la obtención de las curvas de STD fueron de 0.5, 1, 2, 3 y 4 s variando el tiempo de relajación inversamente al tiempo de relajación de cada experimento con un mínimo de 0.1s. Así se mantiene constante el tiempo total del experimento. Para estos experimentos se hicieron con 2048 escanes de 2 fides de 16384 puntos de adquisición y un tiempo total para cada tiempo de saturación de 5h. Interacción de GAGs con FGF-1 y Langerina 98 A partir de los datos de STD (%) variando el tiempo de saturación se obtiene la curva de crecimiento del STD. De tal curva se obtiene los valores de STD0 obtenidos de los valores de las pendientes iniciales ajustando la curva a una ecuación monoexponencial de crecimiento asintótico: STD0(tsat) = STDmax · (1-exp(ksat·tsat)) Ecuación 1 STDmax es el máximo asintótico de la curva y ksat es una constante que depende de las propiedades de relajación de cada protón. Por último, tsat es el tiempo de saturación. Los experimentos del T1 selectivo mediante RMN 20 , 21 se llevaron a cabo con una concentración de proteína de 19 µM y las concentraciones de ligando fueron variando (80, 160, 320, 480 y 640 µM) obteniendo así una relación proteína-ligando de 1:4, 1:8, 1:16, 1:24 y 1:32 respectivamente. La concentración de los trisacáridos en su forma libre fue de 500 µM. Los tiempos de relajación, T1, se midieron empleando la técnica de inversión recovery (incluyendo un pulso de 180º selectivo, Gaussiano, y un pulso de 90º duro). Para cada una de las relaciones se hicieron 10 experimentos variando el tiempo de relajación: 1, 50, 100, 200, 400, 800, 1, 2, 5, 8 y 10 s. Para obtener el T1 selectivo se usó el módulo de Dynamic Center de TopSpin. De aquí se obtuvieron los T1 selectivos (s-1). Para calcular los valores de KD se utiliza la siguiente ecuación: [P0]*T1obs = ([L0] + KD) (T1enlazado + σenlazado) Ecuación 2 Se representa [P0]*T1obs vs [L0]. De ahí se obtiene una pendiente que es (T1enl + σenl) y de la ordenada en el origen se obtiene la KD. 20 L. Fielding, Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 2007, 51, 219. 21 Y. Fraenkel, G. Navon, A. Aronheim, J.M. Gershoni, Biochemistry 1990, 29, 2617. Capítulo 3 99 Docking Para llevar a cabo el docking se usó el módulo de Glide implementado en Schrödinger. 22 Además, se utilizó la estructura de la proteína con código 2ERM obtenida por RMN. A partir del hexasacárido presente en esta estructura se obtuvieron los diferentes trisacáridos y estas estructuras se superpusieron sobre el hexasacárido de partida. Antes de llevar a cabo el docking se realizó una búsqueda conformacional de todos los ligando manteniendo la conformación de los anillos. Después se construyó un grid centrado en la parte principal de la proteína FGF-1 de 16 Å y se llevó a cabo el docking con las estructuras obtenidas de la búsqueda conformacional. CORCEMA-ST Por último, después de la obtención de diferentes estructuras del docking se hizo una simulación teórica del STD mediante cálculos de la matriz de relajación completa según se implementada en el programa CORCEMA-ST codificado en MATLAB. 23 , 24 Se usaron las mismas coordenadas para la proteína y para el complejo que las obtenidas del pdb. Las condiciones usadas para CORCEMA-ST fueron las mismas que las usadas para la obtención de los STD experimentales. Así, la concentración de los trisacáridos fue de 1.5 mM, el tiempo de correlación de la proteína fue de 22 ns y del ligando de 0.4 ns. Se utilizó una distancia umbral de corte de 8 Å alrededor del ligando, de forma que sólo aquellos residuos con una distancia por debajo de esta, fueron incorporados en los cálculos. La selección de los protones de la proteína instantáneamente saturados fue realizada por el programa basándose en una tabla de los desplazamientos químicos predichos para el FGF-1 realizada por el programa SHIFTX. 25 Se asumió una cinética de asociación controlada por una constante de equilibrio de 500000 M-1 asignando un valor de 0.85 para el parámetro de S2 de los metilos de la proteína. El tiempo de correlación 22 Schrodinger Release 2015-4: Maestro 10.4, Schrodinger, LLC: New York, NY, USA, 2015. 23 Y. Yuan, D.W. Bleile, X. Wen, D.A.R. Sanders, K. Itoh, H.W. Liu, B.M. Pinto, Journal American Chemistry Sociaty 2008, 130, 3157. 24 N. Rama Krishna, V. Jayalakshmi, Progress Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, 2006, 49, 1. 25 S. Neal, A.M. Nip, H. Zhang, D.S. Wishart, Journal Biomolecular NMR, 2003, 26, 215. Interacción de GAGs con FGF-1 y Langerina 100 del ligando libre usado fue de 0.9 ns. Para simular la relajación no-específica por el oxígeno paramagnético presente en la disolución, utilizamos unos valores de pérdidas de 0.1 a 0.3 s-1 para todos los protones en estado libre y enlazado. 101 CAPÍTULO 4 Interacción de Midkina con GAGs Capítulo 4 108 OBJETIVOS 1. Determinar la estructura tridimensional mediante espectroscopía de RMN y dinámica molecular del tetrasacárido 7 en su forma libre; 2, 5, 8 dibencilados; y 6 y 9 persustituidos. 2. Comprobar la influencia en el comportamiento conformacional de la secuencia, el patrón de sulfatación y el aumento de la sustitución por grupos protectores hidrofóbicos en los tetrasacáridos. 3. Estudiar las bases moleculares que rigen la interacción tetrasacáridos desprotegidos-Midkina mediante de NOESY transferido, STD y docking. Para ello se estudiaron los complejos formados por los tetrasacáridos desprotegidos 1 y 7 (CS tipo E) y el tetrasacárido 10 (CS tipo T). Con este estudio se pretende encontrar diferencias en el modo de unión según la secuencia y el grado de sulfatación ya que sólo con el estudio realizado anteriormente de los complejos formados con los tetrasacáridos 3 y 4 no era suficiente. 4. Determinar el modo de unión de los productos dibencilados (compuestos 2, 5 y 8) y persustituidos (6 y 9) con la Midkina intentando encontrar diferencias en la estructura del complejo o en las fuerzas que rigen la interacción por la presencia de grupos protectores hidrofóbicos y su afinidad. 5. Conocer la estructura tridimensional de los disacáridos miméticos con diferente secuencia (11, 12, 13, 14 y 15) junto con el pentasacárido 16 de igual secuencia que el disacárido 15. 6. Estudiar el complejo formado por los disacáridos y la Midkina de igual forma que con los tetrasacáridos. Determinar la interacción producida cuando se produce la pérdida de grupos sulfato y la influencia de la secuencia con los mismos grupos protectores (compuestos 13 y 15). Valorar el papel der los ácidos urónicos en la interacción y comprobar la influencia de las cargas en la interacción (serie 11-14) y el aumento de la longitud de la cadena. 4.2 ESTUDIO DE LOS TETRASACÁRIDOS LIBRES Y COMPLEJADOS. Este apartado está dividido en tres partes. La primera consiste en el estudio de los tetrasacáridos dibencilados (2, 5 y 8), el desprotegido (7) y los persustituidos (6 y 9) en su forma libre mediante técnicas de espectroscopía de RMN y dinámica molecular. La segunda refleja el estudio de los complejos formados por los tetrasacáridos dibencilados (2, 5 y 8) y desprotegidos (1, 7 y 10) con la Midkina mediante técnicas de Interacción de Midkina con GAGs 109 espectroscopía de RMN y docking. Y la última parte son datos de inhibición de los complejos medidos por Polarización de Fluorescencia. 4.2.1 Determinación estructural de los ligandos en su forma libre mediante RMN y dinámica molecular. 4.2.1.1 Tetrasacáridos dibencilados con tres secuencias diferentes (compuestos 2, 5 y 8) y un tetrasacárido desprotegido con secuencia CS (compuesto 7). Para el estudio de estos compuestos mediante RMN se prepararon muestras de todos ellos, con una concentración de 1 mM en 250 µL de buffer 1x PBS (concentración del buffer) en D2O. Para todos los compuestos se llevaron a cabo experimentos de asignación de RMN tales como 1H-RMN, COSY, TOCSY, HSQC y NOESY a 700 MHz y a 600 MHz a 298K de forma general. Cuando fue conveniente se usaron experimentos sensibles a la fase, de sensibilidad incrementada, eco-antieco y con filtro de cero cuanto. Tales experimentos fueron acompañados de experimentos monodimensionales selectivos de los protones anoméricos a 600 MHz debido a su mejor rendimiento y sensibilidad. Tanto los espectros como las tablas con los desplazamientos químicos de cada uno de los tetrasacáridos se pueden encontrar en el material suplementario.  Tetrasacárido 2. El tetrasacárido 2 presenta una secuencia híbrida CS/DS formada por IdoA-GalNAc- GlcA-GalNAc combinando en la misma molécula residuos de GlcA e IdoA recientemente propuestos como potenciales ligandos activos (figura 4.2.1.1) O OH O2C OH OBn O O3SO O OSO3 NHAc O O3SO OOMP OSO3 NHAc OO BnO -O2C OH Capítulo 4 110 Figura 4.2.1.1 Estructura del tetrasacárido 2 que presenta una secuencia híbrida DS/CS con dos grupos bencilos en los anillos de IdoA y GlcA. El anillo de IdoA en GAGs presenta un característico equilibrio conformacional que es dependiente de su propia sulfatación, la sustitución de los anillos adyacentes y de su posición dentro de la cadena (terminal o interno). Para los residuos internos de Heparina regular se encuentra un equilibrio de conformaciones mayoritarias 1C4 y 2SO. Dicho equilibrio se detecta por la presencia de un NOE exclusivo de la conformación 2SO y se analiza evaluando las constantes de acoplamiento intraanulares que aparecen como promedio de las correspondientes conformaciones participantes.9 Para poder valorar si se produce un equilibrio conformacional para este anillo en una secuencia DS se realizaron experimentos NOESY para el tetrasacárido 2 a 700 MHz a diferentes temperaturas (figura 4.2.1.2). A baja temperatura se puede apreciar un pico NOE H2D/H5D indicativo de la presencia de la conformación 2SO mientras que alta temperatura este se solapa con la señal del agua. Las conformaciones para los anillos A y B son 4C1 como era de esperar ya que se observan los picos NOEs característicos de esta conformación (H3/H1 y H5/H1) para ambos anillos. Figura 4.2.1.2 Espectros NOESY a 700 MHz. A la izquierda alta temperatura (281K) y el de la derecha alta temperatura del tetrasacárido 2. Representación sólo de la parte anomérica para ambas temperaturas. Las constantes de acoplamiento medidas son consistentes con una conformación 4C1 para los anillos A, B y C y 2SO mayoritaria para el IdoA (tabla 4.2.1.1). Estas fueron medidas mediante un experimento S3-HMBC a 310K. Pareja de hidrógenos 3JHH experimental Pareja de hidrógenos 3JHH experimental H1A/H2A 8.5 H2C/H3C 7.8 H3A/H4A 3.5* H3C/H4C 2.2 H2B/H3B 8.3* H4C/H5C 1.2 Interacción de Midkina con GAGs 111 Tabla 4.2.1.1 Valores de 3JHH medidos para el tetrasacárido 2 a 298K a partir del experimento S3-HMBC. Las distancias experimentales también pueden predecir un posible equilibrio si lo hubiese para el IdoA (tabla 4.2.1.2). Para ello se llevaron a cabo experimentos NOESY a diferentes tiempos de mezcla y temperaturas obteniendo la curva del crecimiento del NOE para los hidrógenos interanulares. En este caso, se observa una distancia H2D/H5D corta indicando una conformación mayoritariamente 2SO. Las distancias para los anillos A y B se han calculado a partir de la curva de crecimiento del NOE a 281K y las distancias para el anillo D se han medido con un NOESY a 298K. Además, a ninguna de las temperaturas hemos podido obtener la señal para el H1C aislada para poder medir las distancias aunque sí se han podido determinar los NOEs. Tabla 4.2.1.2 Distancias experimentales obtenidas a partir del experimento (NOESY) para el tetrasacárido 2. Medidas a baja temperatura para los anillos A y B y a temperatura ambiente para el anillo D. Para obtener una estructura del ligando libre que complementase la estructura obtenida de forma experimental se llevó a cabo una simulación de dinámica molecular de 500 ns para este tetrasacárido. Así, el análisis de las trayectorias obtenidas mediante las dinámicas moleculares ayudaría a elucidar el supuesto equilibrio conformacional del anillo de IdoA. En la figura 4.2.1.3 se muestran la coordenada de plegamiento θ para cada anillo del tetrasacárido 2. Como se puede observar los dos anillos de GalNAc no H3B/H4B 8.7 H1D/H2D 5.6 H4B/H5B 10.4 H2D/H3D 9.9 H3D/H4D 6.0 Pareja de átomos Distancia experimental H2A/H1A 3.06 H3A/H1A 2.48 H5A/H1A 2.27 H3B/H1B 2.58 H5B/H1B 2.37 H3A/H1B 2.56 H2D/H5D 2.83 H4D/H5D 2.40 Capítulo 4 112 varía la confomación siendo esta 4C1 ya que θ presenta valores entre 0-30ºC tal y como se esperaba según el comportamiento general de los anillos de galactosamina. Sin embargo, los anillos de ácido urónico sí cambian de conformación a lo largo de la simulación. Sorprendentemente, el anillo de GlcA aunque se mantiene estable más de un 70% de la simulación presenta un equilibrio conformacional (4C1, 1C4 y 2SO) a partir de la 4/5 parte de la trayectoria (figura 4.2.1.3). El anillo de IdoA presenta el equilibrio esperado entre las conformaciones 1C4 y 2SO cuando se realiza una dinámica molecular sin restricciones, sin embargo, el porcentaje de 2SO encontrado es muy bajo todo lo contrario a lo observado de forma experimental. Si se compara el comportamiento obtenido mediante las coordenadas de plegamiento del IdoA de este tetrasacáridos con los otros dos de la misma serie se puede afirmar que las coordenadas de plegamiento para el IdoA varían en función de la adición de grupos sulfato y protectores. Ya que el IdoA en el tetrasacárido 1 (no protegido) mostraba un equilibrio conformacional 4C1, 1C4 y 2SO, el del tetrasacárido 3 (persulfatado) una estabilidad conformacional 1C4 y el del tetrasacárido 2 un equilibrio conformacional 1C4 y 2SO. Figura 4.2.1.3 Representación de la coordenada de plegamiento θ, la cual indica la conformación para cada uno de los cuatro anillos del tetrasacárido 2 obtenidas de una DM libre a 500 ns. θ 0 20 40 60 80 100 120 140 180 160 Tiempo (ps) 0 100000 200000 300000 400000 500000 GluA_B θ 0 20 40 60 80 100 120 140 180 160 Tiempo (ps) 0 100000 200000 300000 400000 500000 GalNAc_A IdoA_D θ 0 20 40 60 80 100 120 140 180 160 Tiempo (ps) 0 100000 200000 300000 400000 500000 θ 0 20 40 60 80 100 120 140 180 160 Tiempo (ps) 0 100000 200000 300000 400000 500000 GalNAc_C Interacción de Midkina con GAGs 113 Debido a que las conformaciones de los anillos de GlcA e IdoA obtenidas de las simulaciones moleculares no coinciden durante toda la simulación con los NOEs experimentales se llevó a cabo una dinámica molecular con restricciones promedias en el tiempo de 8 ns para obtener estructuras teóricas compatibles con las experimentales. Para ello se utilizaron distancias experimentales basadas en NOE como H1-H5 de 2.37 Å para el GlcA y H2-H5 de 2.83 Å para el anillo IdoA. En este caso, la figura 4.2.1.4 muestra que para el anillo B la conformación se mantiene en θ 0-30º indicando una única conformación 4C1 durante toda la trayectoria. Para el IdoA se mantiene el mismo equilibrio encontrado en la simulación libre pero con un porcentaje para la conformación de 2SO bastante mayor, un 65% (θ = 90). Si se observa el gráfico D de la misma figura se representa la coordenada ϕ para el anillo D indicando una conformación mayoritaria de 2SO, pero también se observan las conformaciones 3S1 y 1S5 durante muy poco tiempo. Por lo tanto, para un anillo de IdoA con una distancia H2/H5 de 2.83 Å existe un equilibrio conformacional entre 1C4 y 2SO mayoritariamente. Se lanzó otra DM con las mismas restricciones pero con la conformación del anillo de IdoA en 2SO para determinar si partiendo de esa estructura la conformación se mantenía constante. El porcentaje de 2SO e 1C4 era prácticamente el mismo lo que prueba la consistencia de los datos. Tiempo (s) GalNAc_A 01000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 0 30 60 90 120 150 180 θ 01000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 0 30 60 90 120 150 180 01000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 0 30 60 90 120 150 180 θ Tiempo (s) GalNAc_C 01000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 0 30 60 90 120 150 180 θ Tiempo (s) IdoA_D GalNAc_A θ Tiempo (ps) θ Glc_B GalNAc_C Tiempo (ps) θ Tiempo (ps) IdoA_D θ Tiempo (ps) IdoA-D Capítulo 4 114 Figura 4.2.1.4 Coordenadas θ para los anillos que forman el tetrasacárido 2 (A, B, C y D) y coordenada ϕ para el anillo IdoA el cual presenta un equilibrio conformacional (nótese que la coordenada ϕ no está definida para valores de θ 0 o 180º A continuación se van a exponer los resultados cuantitativos obtenidos de la dinámica molecular comparándolos con los experimentales obtenidos mediante RMN. Las distancias entre los hidrógenos de los anillos y la de los enlaces glicosídicos junto con las constantes de acoplamiento son propiedades de los GAGs necesarias para determinar el equilibrio del IdoA, las conformaciones de los demás anillos y la flexibilidad conformacional del tetrasacárido 2 Se ha llevado a cabo un promedio de las 3JHH obtenidas durante toda la trayectoria de las dinámicas moleculares con y sin restricciones (tabla 4.2.1.3). Dichos valores muestran una conformación 4C1 para los anillos A, B y C al igual que las constantes de acoplamiento experimentales. Sin embargo, el anillo IdoA exhibe valores de 3JHH diferentes tanto experimentales como teóricos. Claramente, las constantes obtenidas en la dinámica sin restricciones son pequeñas indicando una conformación 1C4, tal y como mostraba la coordenada de plegamiento, sin embargo, las 3JHH analizadas de la dinámica con restricciones muestran el equilibrio conformacional característico de este anillo. En ninguno de los dos casos, estas constantes reflejan los datos experimentales ya que estos muestran una conformación 2SO mayoritaria para el IdoA. φ Tiempo (s) IdoA_D 3JHH experimental 3JHH dinámica libre 3JHH dinámica restricciones H1A/H2A 8.5 8.2 8.2 H2A/H3A 10.4 10.4 H3A/H4A 3.5* 2.6 2.8 H4A/H5A 0.96 0.9 H1B/H2B 6.5 7.5 H2B/H3B 8.3* 9.3 8.9 H3B/H4B 8.7 7.9 8.6 Tiempo (ps) Interacción de Midkina con GAGs 115 Tabla 4.2.1.3 Constantes de acoplamiento experimentales (S3-HMBC) y teóricas (DM con y sin restricciones) para el tetrasacárido 2 medidas a 298K. Los resultados de distancias tanto experimentales como teóricas del tetrasacárido 2 se muestran en la tabla 4.2.1.4. En este caso para los anillos A y B se muestra una conformación 4C1. Para el anillo D la distancia entre los hidrógenos H2/H5 medida en la dinámica libre es muy grande indicando una conformación 4C1, en la dinámica con restricciones es más corta indicando un equilibrio entre las dos especies 1C4 y 2SO, sin embargo, la distancia experimental para la misma pareja de átomos es bastante más corta indicando una conformación 2SO de forma mayoritaria. Tabla 4.2.1.4 Distancias experimentales (NOESY) y teóricas (DM con y sin restricciones) para el tetrasacárido 2. Medidas a baja temperatura para los anillos A y B y a temperatura ambiente para el anillo D. Otro aspecto importante a tener en cuenta es la flexibilidad conformacional de los enlaces glicosídicos del tetrasacárido 2. Para estudiar la flexibilidad de forma teórica se presentan en la figura 4.2.1.5 las trayectorias (Φ, Ψ) de los ángulos glicosídicos. Todos los ángulos muestran una conformación syn-Ψ para dicho enlace a pesar de que el H4B/H5B 10.4 8.7 9.9 H1C/H2C 8.2 8.3 H2C/H3C 7.8 10.5 10.5 H3C/H4C 2.2 2.6 2.9 H4C/H5C 1.2 0.9 1.3 H1D/H2D 5.6 1.8 3.8 H2D/H3D 9.9 1.3 5.9 H3D/H4D 6.0 2.8 4.2 Pareja de átomos Distancia experimental Distancia dinámica libre Distancia dinámica restricciones H2A/H1A 3.06 3.04 3.05 H3A/H1A 2.48 2.68 2.72 H5A/H1A 2.27 2.59 2.57 H3B/H1B 2.58 3.01 2.72 H5B/H1B 2.37 2.61 2.51 H3A/H1B 2.56 2.57 2.78 H2D/H5D 2.83 4.02 3.25 H4D/H5D 2.40 4.26 2.37 Capítulo 4 116 Φ enlace intermedio es el menos flexible siendo los otros dos enlaces formados por GlcA/IdoA-GalNAc menos rígidos en Ψ y Φ respectivamente. Figura 4.2.1.5 Trayectorias (Φ, Ψ) de los enlaces glicosídicos del tetrasacárido 2. Después de obtener las características estructurales de este tetrasacáridos dibencilado se debe de analizar la influencia de los bencilos en esta estructura comparándola con la del tetrasacárido sin proteger comentada en los antecedentes. Se van a comparar las distancias experimentales (tabla 4.2.1.5) para los tetrasacáridos 1 y 2. La conformación para los anillos de GalNAc y GlcA es 4C1 en los dos tetrasacáridos tal y como muestran las distancias experimentales. Sin embargo, aunque las distancias obtenidas para los Ψ Φ Ψ Φ Ψ GalNAc-GlcA GlcA-GalNAc GalNAc-IdoA Interacción de Midkina con GAGs 117 anillos de IdoA en ambos tetrasacáridos sean parecidas indicando la misma conformación con los demás datos experimentales analizados se ha concluido que dicho anillo para el tetrasacárido 2 muestra una conformación más fija en 2SO que el del tetrasacárido 1. Tabla 4.2.1.5 Tabla comparativa de las distancias experimentales medidas para el tetrasacárido 2 (protegido) y 1 (sin proteger).  Tetrasacárido 5. Se van a exponer los resultados obtenidos del análisis llevado a cabo para la determinación estructural de forma experimental y teórica del tetrasacárido 5 y se determinará las diferencias estructurales con su equivalente sin bencilar el tetrasacárido 4 previamente estudiado en el grupo. La estructura del tetrasacárido 5 como ya se ha mencionado, es una secuencia de CS normal con patrón de sulfatación tipo E y con dos bencilos en las posiciones 3 de los anillos de GlcA (figura 4.2.1.6). Figura 4.2.1.6 Estructura del tetrasacárido 5 que presenta una secuencia CS tipo E con dos grupos bencilos en los anillos de GlcA. O OO OSO3 O3SO NHAc O -O2C BnO OH OMP O HO O OSO3 O3SO NHAc O -O2C BnO OH Tetrasacárido 1 Tetrasacárido 2 H2A/H1A 3.06 3.06 H3A/H1A 2.51 2.48 H5A/H1A 2.48 2.27 H3B/H1B 2.59 2.58 H5B/H1B 2.34 2.37 H3A/H1B 2.44 2.56 H2D/H5D 2.74 2.83 H4D/H5D 2.83 2.40 H3C/H1D 2.22 Capítulo 4 124 las distancias experimentales son un poco largas incluso más largas que las distancias teóricas indicando que hay cierta tensión en la estructura. Figura 4.2.1.11 Trayectorias (Φ, Ψ) para cada una de las uniones glicosídicas del tetrasacárido 5. Se van a comparar los datos experimentales obtenidos para el tetrasacárido 5 con su equivalente sin proteger, el tetrasacárido 4. Las distancias interglicosídias experimentales para el tetrasacárido 4 son más cortas que para el 5 lo que puede indicar que hay una posible influencia en las uniones interglicosídicas de la tensión generada por la introducción de sustituyentes, aunque no cambien su geometría. No se observa de forma experimental ningún NOE interglicosídico que indique cualquier otra geometría. Ver tabla 4.2.1.6 para las distancias comparativas de ambos tetrasacáridos. Tetrasacárido 4 Tetrasacárido 5 Ψ Φ GlcA-GalNAc Ψ Φ GalNAc-GlcA GlcA-GalNAc Ψ Φ Interacción de Midkina con GAGs 125 Tabla 4.2.1.10 Tabla representativa de las distancias experimentales del tetrasacárido 5 (protegido) y 4 (sin proteger) medidas a 298K. Se han podido medir más constantes de acoplamiento del tetrasacárido 5 que del 4 pero para el anillo C se observan en los dos casos constantes de acoplamiento típico de la conformación 4C1 (tabla 4.2.1.7). Tetrasacárido 4 Tetrasacárido 5 H1A/H2A 8.0 6.7 H2A/H3A 9.0 H3A/H4A 8.4 H4A/H5A 9.4 H1B/H2B 7.6 8.3 H2B/H3B 10.4 H3B/H4B 2.7 H4B/H5B 2.7 H1C/H2C 7.8 7.7 H2C/H3C 8.7 8.5 H3C/H4C 9.0 8.8 H4C/H5C 9.7 9.9 H1D/H2D 7.7 8.4 H2D/H3D 10.8 H3D/H4D 2.7 3.1 H4D/H5D 3.3 H3A/H1A 2.78 2.60 H5A/H1A 2.17 2.78 H3B/H1B 2.38 2.60 H5B/H1B 2.37 2.60 H4A/H1B 2.10 2.95 H3C/H1C 2.50 2.60 H5C/H1C 2.14 3.04 H3B/H1C 2.28 2.75 H3D/H1D 2.56 2.60 H5D/H1D 2.49 2.87 H4C/H1D 2.27 2.70 Capítulo 4 126 Tabla 4.2.1.11 Tabla representativa de las constantes de acoplamiento experimentales del tetrasacárido 5 (bencilado) y 4 (no protegido).  Tetrasacáridos 7 y 8. En este último apartado se discutirán los resultados obtenidos para el tetrasacárido 7 (sin proteger) y el 8 (dibencilado), los dos con la misma secuencia (GlcA – GalN – GlcA- GalN) siendo complementaria a 4 y 5. Se determinó la estructura tridimensional de ambos empleando la estrategia anteriormente descrita. Para ello se llevaron a cabo los mismos experimentos de asignación de ambos tetrasacáridos (ver anexo). También se construyó las curvas de crecimiento del NOE a partir de estas se determinó las distancias experimentales y, por último, se realizó el análisis de las torsiones interanulares mediante las constantes de acoplamiento. La estructura del tetrasacárido 7 se representa en la figura 4.2.1.12 la cual es una secuencia de CS alternada comenzando por el anillo de GalNAc en el extremo reductor. Figura 4.2.1.12 Tetrasacárido 7 de secuencia CS tipo E. Incluye un grupo sulfato en posición 4 del extremo no reductor. La estructura del tetrasacárido 8 se muestra en la figura 4.2.1.13, presenta la misma secuencia que el tetrasacárido 7 pero con dos grupos bencilos en los anillos de GlcA. Figura 4.2.1.13 Estructura del tetrasacárido 8 que presenta una secuencia CS tipo E alternada más un grupo sulfato en posición 4 del anillo GlcA del extremo no reductor y dos grupos bencilos en los anillos de GlcA. O BnO2C O BnO OBz OMP OO OSO3 O3SO NHAc O BnO2C O3SO BnO OBz OO OSO3 O3SO NHAc O -O2C O BnO OH OMP OO OSO3 O3SO NHAc O -O2C O3SO BnO OH OO OSO3 O3SO NHAc O -O2C OHO OH OMP OO OSO3 O3SO NHAc O -O2C O3SO HO OH OO OSO3 O3SO NHAc O BnO2C O BnO OBz OMP OO OSO3 O3SO NHAc O BnO2C O3SO BnO OBz OO OSO3 O3SO NHAc O -O2C O BnO OH OMP OO OSO3 O3SO NHAc O -O2C O3SO BnO OH OO OSO3 O3SO NHAc O Interacción de Midkina con GAGs 127 En la figura 4.2.1.14 se muestran los dos espectros obtenidos para el tetrasacárido 8 a la izquierda y el 7 a la derecha. En ambos espectros se observan los NOEs experimentales indicativos de la conformación 4C1 para todos los anillos independientemente de la presencia de los grupos bencilos al igual que ocurría con los otros dos grupos de tetrsacáridos. Al igual que para 5 se observan NOEs interglicosídicos compatibles con una conformación extendida. Figura 4.2.1.14 Espectros NOESY obtenidos para el tetasacáridos 8 (izquierda) y 7 (derecha) a 600 ms y 298K. Se midieron las constantes de acoplamiento para ambos tetrasacáridos. En la tabla 4.2.1.12 se exponen las constantes de acoplamiento experimentales para el tetrasacárido 7. Todas ellas indican la misma conformación 4C1 para todos los anillos tal y como era de esperar al no presentar sustituyentes aromáticos. Tabla 4.2.1.12 Constantes de acoplamiento experimentales medidas a 298K para el tetrasacárido 7. Pareja de átomos 3JHH experimental Pareja de átomos 3JHH experimental H1A/H2A 8.6 H1C/H2C 8.5 H2A/H3A 9.7 H2C/H3C 10.9 H3A/H4A 3.1 H3C/H4C 2.1 H4A/H5A H4C/H5C H1B/H2B 8.0 H1D/H2D 8.0 H2B/H3B 9.0 H2D/H3D 9.7 H3B/H4B 9.0 H3D/H4D 9.7 H4B/H5B 9.9 H4D/H5D 10.3 Capítulo 4 128 Las constantes de acoplamiento para el tetrasacárido 8 son representadas en la tabla 4.2.1.13. En este caso, al igual que para el tetrasacárido 7 son indicativas de una conformación 4C1 para los cuatro anillos que forman el oligosacárido. Por lo tanto, no hay ninguna evidencia experimental, a falta de los valores de distancias, que asegure un cambio en la estructura a causa de la bencilación en los anillos de GlcA. Tabla 4.2.1.13 Valores medidos de forma experimental a 298K de las constantes de acoplamiento para el tetrasacárido 8. Se midieron las distancias interprotónicas experimentales para ambos tetrasacáridos 7 y 8 las cuales son representadas en la tabla 4.2.1.14 y 4.2.1.15 respectivamente. En ambas se observan distancias pequeñas para todas las parejas de hidrógenos confirmando la misma conformación determinada mediante los NOEs, 3JHH y distancias para todos los anillos de los tetrasacáridos. Tabla 4.2.1.14 Distancias experimentales medidas a 298K para el tetrasacárido 7. Pareja de átomos 3JHH experimental Pareja de átomos 3JHH experimental H1A/H2A 8.6 H1C/H2C 8.8 H2A/H3A 10.8 H2C/H3C 10.9 H3A/H4A 3.1 H3C/H4C 2.8 H4A/H5A H4C/H5C H1B/H2B 7.4 H1D/H2D 7.8 H2B/H3B 9.2 H2D/H3D 9.2 H3B/H4B 9.2 H3D/H4D 9.2 H4B/H5B 9.6 H4D/H5D 9.6 Pareja de átomos Distancia experimental Pareja de átomos Distancia experimental H3A/H1A 2.60 H3C/H1C 2.60 H5A/H1A 2.69 H5C/H1C 2.70 H3B/H1B 2.60 H4B/H1C 2.91 H5B/H1B 2.90 H3D/H1D 2.60 H3A/H1B 2.70 H5D/H1D 2.91 H3C/H1D 2.69 Pareja de átomos Distancia experimental Pareja de átomos Distancia experimental H3A/H1A 2.60 H5C/H1C 2.60 Interacción de Midkina con GAGs 129 Tabla 4.2.1.15 Distancias experimentales medidas a 298K para el tetrasacárido 8. Se procedió a simular el comportamiento conformacional mediante dinámica molecular sin restricciones durante 500 ns. En la figura 4.2.1.15 se recogen las coordenadas de plegamiento θ para los 4 anillos del tetrasacárido 7 de la dinámica libre. En este se observa una única conformación para los 4 anillos, 4C1 la cual no cambia a lo largo de toda la simulación ya que al no presentar grupos bencilos la simulación sin restricciones es compatible con la estructura experimental. Figura 4.2.1.15 Representación de la coordenada θ para cada uno de los 4 anillos que forman el tetrasacárido 7 obtenidos de la dinámica molecular libre. La figura 4.2.1.16 representa las coordenadas θ para los cuatro anillos del compuesto 8 y la coordenada ϕ para los dos anillos de GlcA. Como se observa, los anillos de GalNAc se mantienen en 4C1 mientras tanto, los anillos de GlcA muestran un equilibrio entre las conformaciones 4C1, 1C4, un bote 3,OB y dos botes torcidos OS2 y 3S1. Estas tres últimas conformaciones se producen cuando θ es 90º y, obviamente, junto con la conformación 1C4 son imposibles de que se produzcan de forma experimental ya que los NOEs indican una conformación mayoritaria 4C1. Este es un error de parametrización del campo de fuerzas que se manifiesta al incluir residuos voluminosos en, al menos los anillos de ácido glucurónico. H5A/H1A 2.54 H4B/H1C 2.79 H3B/H1B 2.60 H3D/H1D 2.60 H5B/H1B 2.73 H5D/H1D 2.94 H3A/H1B 2.43 H3C/H1D 2.71 Capítulo 4 130 Figura 4.2.1.16 Representación de la coordenada θ (izquierda) para los 4 anillos del tetrasacárido 8. A la derecha, representación de la coordenada ϕ para los dos anillos de GlcA. Debido a estas discrepancias se llevó a cabo una dinámica molecular con restricciones promediadas en el tiempo. Las distancias de referencia utilizadas fueron H1/H3 de 2.60 Å para los anillos de GlcA y al ponerle restricciones, la conformación se mantienen en 4C1 para los dos anillos GlcA. Figura 4.2.1.17 Coordenada θ para el tetrasacárido 8 obtenido mediante DM con restricciones. La tabla 4.2.1.16 muestra las constantes de acoplamiento H-H obtenidas al analizar las dinámicas moleculares con y sin restricciones para el tetrasacárido 7. Las constantes obtenidas para las dos dinámicas son muy similares debido a que no se produce ningún cambio de conformación en ninguna de las dos simulaciones. Además, estos valores están totalmente de acuerdo con los experimentales. 3JHH experimental 3JHH dinámica libre 3JHH dinámica restricciones Interacción de Midkina con GAGs 131 Tabla 4.2.1.16 Constantes de acoplamiento experimentales y teóricas (medidas de la DM con y sin restricciones) para el tetrasacárido 7 a 298K y a 600 MHz. Para el tetrasacárido 8 también se midieron las constantes de acoplamiento teóricas para las dos simulaciones. En este caso, las constantes de acoplamiento medidas para los GlcA son diferentes en los dos casos y, como es de esperar, las obtenidas de la dinámica con restricciones en la cual las conformaciones se mantienen constantes son las que corroboran los datos experimentales (tabla 4.2.1.17). H1A/H2A 8.6 8.2 8.1 H2A/H3A 9.7 10.5 10.4 H3A/H4A 3.1 2.5 2.5 H4A/H5A 1.0 1.0 H1B/H2B 8.0 7.3 7.4 H2B/H3B 9.0 8.5 8.6 H3B/H4B 9.0 8.6 8.7 H4B/H5B 9.9 9.9 10.0 H1C/H2C 8.5 8.2 8.2 H2C/H3C 10.9 10.5 10.5 H3C/H4C 2.1 2.5 2.4 H4C/H5C 1.07 1.0 H1D/H2D 8.0 7.3 7.4 H2D/H3D 9.7 8.4 8.5 H3D/H4D 9.7 8.5 8.5 H4D/H5D 10.3 9.9 9.9 3JHH experimental 3JHH dinámica libre 3JHH dinámica restricciones H1A/H2A 8.6 8.2 8.2 H2A/H3A 10.8 10.4 10.5 H3A/H4A 3.1 2.6 2.6 H4A/H5A 1.0 1.0 H1B/H2B 7.4 4.6 8.3 H2B/H3B 9.2 5.6 10.0 H3B/H4B 9.2 5.8 9.1 H4B/H5B 9.6 6.0 9.9 H1C/H2C 8.8 8.2 8.3 Capítulo 4 132 Tabla 4.2.1.17 Constantes de acoplamiento experimentales y teóricas (medidas de la DM con y sin restricciones) para el tetrasacárido 8 a 298K y a 600 MHz. Para un análisis más detallado se analizaron distancias obtenidas de forma teórica para el tetrasacárido 7 (tabla 4.2.1.18). Todas las distancias son compatibles con una conformación 4C1 para todos los anillos. En cuanto a la geometría global del tetrasacárido, las distancias están de acuerdo con una conformación extendida. La estructura determinada tanto de forma experimental como teórica para el tetrasacárido 7 es similar a la del tetrasacárido 4. Tabla 4.2.1.18 Distancias experimentales y teóricas del tetrasacárido 7 medidas a 298K y a 600 MHz. H2C/H3C 10.9 10.3 10.4 H3C/H4C 2.8 2.9 3.1 H4C/H5C 1.1 1.1 H1D/H2D 7.8 3.8 7.4 H2D/H3D 9.2 3.8 8.3 H3D/H4D 9.2 4.2 8.4 H4D/H5D 9.6 4.0 9.9 Distancia experimental Distancia dinámica libre Distancia dinámica restricciones H3A/H1A 2.60 2.66 2.67 H5A/H1A 2.69 2.63 2.65 H3B/H1B 2.60 2.79 2.75 H5B/H1B 2.90 2.55 2.53 H3A/H1B 2.70 2.51 2.42 H3C/H1C 2.60 2.63 2.64 H5C/H1C 2.70 2.63 2.63 H4B/H1C 2.91 2.35 2.34 H3D/H1D 2.60 2.79 2.76 H5D/H1D 2.91 2.54 2.53 H3C/H1D 2.69 2.48 2.51 Interacción de Midkina con GAGs 133 Las distancias interprotónicas experimentales la conformación para el tetrasacárido 8 también coinciden con una conformación canónica 4C1 para las GlcNAc y para los GlcA hay un poco de desviación para el anillo D. Sin embargo la distancia H1/H5 del anillo B es algo más corta indicando que el anillo intermedio se fija más y que el anillo del extremo no reductor se desvía de su conformación aunque no cambia pero ocurre en los dos tetrasacáridos independientemente de los grupos bencilo. Tabla 4.2.1.19 Distancias experimentales y teóricas del tetrasacárido 8 medidas a 298K y a 600 MHz Los ángulos de enlace glicosídicos mostrados en la figura 4.2.1.18 para el tetrasacárido 8 reflejan que las uniones GlcA-GlcNAc de los extremos presentan un espacio conformacional más extenso que el mostrado por la unión central al igual que ocurre para el tetrasacárido 7 el cual no muestra grupos bencilos (figura 4.2.1.19). Aunque los muestren algo de flexibilidad la conformación syn-Ψ no cambia. Distancia experimental Distancia dinámica libre Distancia dinámica restricciones H3A/H1A 2.60 2.67 2.65 H5A/H1A 2.54 2.60 2.54 H3B/H1B 2.60 2.39 2.73 H5B/H1B 2.73 3.06 2.50 H3A/H1B 2.43 2.47 2.36 H3C/H1C 2.67 2.63 H5C/H1C 2.60 2.55 2.51 H4B/H1C 2.79 2.86 3.63 H3D/H1D 2.60 3.76 2.77 H5D/H1D 2.94 3.31 2.50 H3C/H1D 2.71 2.55 2.47 GalNAc-GlcA GalNAc-GlcA Capítulo 4 140 señales muy pequeñas indicando que algún tipo de degradación está ocurriendo en la muestra. A los 20 días se realizó el mismo experimento y con la misma muestra obteniendo el espectro superior donde las dos señales pequeñas aumentan. Esto sugiere que la muestra se degrada con el paso del tiempo. Figura 4.2.1.26 Espectros 1F-RMN obtenidos a 0 días, 1 día y 20 días de la preparación de la muestra. Para obtener datos cuantitativos de la estructura tridimensional del tetrasacárido 9 se midieron las constantes de acoplamiento (tabla 4.2.1.20) y tal y como se observa las constantes medidas fueron muy escasas. Tabla 4.2.1.20 Constantes de acoplamiento experimentales y teóricas (medidas de la DM con y sin restricciones) para el tetrasacárido 8 a 298K y a 600 MHz. Pareja de átomos 3JHH experimental Pareja de átomos 3JHH experimental H1A/H2A H1C/H2C 8.2 H2A/H3A H2C/H3C H3A/H4A H3C/H4C H4A/H5A H4C/H5C H1B/H2B 8.1 H1D/H2D 8.2 H2B/H3B 8.1 H2D/H3D 8.2 H3B/H4B 8.3 H3D/H4D H4B/H5B 8.3 H4D/H5D 9.8 Interacción de Midkina con GAGs 141 Para el tetrasacárido 6 el procedimiento utilizado para la disolución de la muestra fue el mismo. Como era de esperarse, se formaba un agregado que persistía incluso al disolver la muestra e impedía la realización del análisis cuantitativo de dicho tetrasacárido pudiendo medir muy pocas constantes de acoplamiento. Para el tetrasacárido 9 se llevaron a cabo tres dinámicas moleculares sin restricciones de 50 ns cada una haciendo un total de 150 ns. Las dinámicas fueron lanzadas consecutivamente de tal forma que las coordenadas obtenidas de una dinámica era el input de coordenadas para la siguiente dinámica. Se decidió hacer así ya que cuando se lanzaba una dinámica de 500 ns como las demás, al presentar tantos grupos protectores aromáticos, el coste computacional aumentaba al doble. Las representaciones de las coordenadas de plegamiento theta para las tres dinámicas (cada línea de un color) y para los cuatro anillos se representan en la figura 4.2.1.25. La línea roja representa las coordenadas de los primeros 50 ns de la dinámica, la verde representa los segundos 50 ns y la azul representa los últimos 50 ns. Se puede observar que para los tres anillos A, B y C las coordenadas son de una conformación 4C1, sin embargo para el anillo D representado en última posición en la figura 4.2.1.25 se observa que hay un cambio en las conformaciones ya que theta varía desde 0 a 180º pasándose y manteniéndose en 90º. Obviamente, es previsible esperar un equilibrio conformacional según la dinámica libre a que el GlcA se encuentra en un extremo y presenta tres grupos hidrofóbicos en las posiciones 2, 3 y 5. Como mínimo existen tres conformaciones 4C1, 1C4 y la que predomina cuando theta está en el ecuador. Para saber dicha conformaciones hay que fijarse en la coordenada phi representada en la figura xxx. (Hacerla pero no me gusta ya que ocupa mucho y se no ve bien los símbolos. Coger frames alternados.). GlcNAc_C θ(°) -30 030 60 90 120 150 180 210 10000 8000 6000 4000 2000 0 12000 14000 16000 18000 20000 10000 8000 6000 4000 2000 0 12000 16000 18000 10000 θ(°) -30 030 60 90 120 150 180 210 GlcNAc_A Frecuencia relativa de θ Capítulo 4 142 Figura 4.2.1.27 Representación de las coordenadas de Cremer-Pople (theta) para los 4 anillos del tetrasacárido 9 de las tres dinámicas de 50 ns realizadas. Del tetrasacárido 9 no se pudieron medir distancias experimentales entre los hidrógenos debido al solapamiento. Se intentaron medir las 3JHH con un resultado algo mejor pero obviamente para los anillos de GlcA no coincidían con las dinámicas libres lanzadas por lo que se llevó a cabo una dinámica molecular con restricciones promediadas en el tiempo. Para ello se usó como restricciones las distancias H1-H5 y H3-H5 para el anillo D que era es que presentaba un equilibrio conformacional. Estas distancias obviamente fueron distancias medidas teóricamente 2.6 Å para las dos. Se puede observar que para los anillos de GalNAc no hay muchas 3JHH medidas pero sí hay algunas más para los anillos GlcA. Para el anillo B, tanto las constantes experimentales como teóricas (con y sin restricciones) son constantes grandes indicativas de una conformación 4C1. Sin embargo para el anillo D las constantes obtenidas de la dinámica con restricciones sí coinciden con las experimentales indicando que la conformación teórica y experimentales es 4C1 mientras que los valores no coinciden con los acoplamientos teóricos de la dinámica libre. GlcA_D Frecuencia relativa de θ θ(°) 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 -30 030 60 90 120 150 180 210 θ(°) -30 030 60 90 120 150 180 210 Frecuencia relativa de θ 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 16000 18000 0 GlcA_B 3JHH experimental 3JHH dinámica libre 3JHH dinámica restricciones H1A/H2A 8.2 8.2 H2A/H3A 10.3 10.3 H3A/H4A 3.0 3.0 H4A/H5A 1.0 1.0 H1B/H2B 8.1 7.8 7.8 H2B/H3B 8.1 8.8 8.9 H3B/H4B 8.3 8.5 8.9 Interacción de Midkina con GAGs 143 Tabla 4.2.1.21 Constantes de acoplamiento H-H experimentales para el tetrasacárido 9 medidas a 298K. 4.2.2 Estudio del complejo Midkina-tetrasacárido mediante RMN y docking. Esta parte del capítulo está enfocada en el estudio de los complejos formados entre la Midkina y los diferentes tetrasacáridos cuyos resultados obtenidos acerca de la estructura tridimensional se han expuesto anteriormente. Además, se han incorporado a este estudio los complejos formados con la misma proteína pero con tetrasacáridos cuya estructura tridimensional libre fue estudiada anteriormente en el grupo10. La primera parte de esta sección está enfocada en el estudio de los complejos formados por la Midkina y los tetrasacáridos no protegidos (tetrasacárido 1, 7 y 10). Además de la estructura del complejo se determinará la influencia del grado de sulfatación en la interacción proteína-ligando ya que los resultados obtenidos para el tetrasacárido 1 podrá ser comparados con el tetrasacárido 3 ya estudiado en el grupo y los resultados de los tetrasacáridos 7 y 10 también podrán ser comparados entre ellos ya que presentan la misma secuencia pero difieren en el grado de sulfatación. La segunda parte está basada en el estudio de los complejos proteína-ligando formados por la Midkina y los tetrasacáridos dibencilados (tetrasacáridos 2, 5 y 8). Después de conocer las posibles estructuras del complejo y las bases moleculares de la interacción de la Midkina con los tetrasacáridos dibencilados se estudiará cómo afectará la presencia de dos grupos hidrofóbicos en dicha interacción. Por último, se estudiarán los complejos formados por la Midkina y el tetrasacárido persustituido (compuesto 9) y se determinará la influencia de los grupos hidrofóbicos en la interacción proteína-ligando. H4B/H5B 8.3 10.0 10.1 H1C/H2C 8.2 8.3 8.3 H2C/H3C 10.5 10.4 H3C/H4C 3.0 3.4 H4C/H5C 1.3 1.5 H1D/H2D 8.2 3.2 7.5 H2D/H3D 8.2 4.2 9.0 H3D/H4D 4.6 8.7 H4D/H5D 9.8 3.7 9.9 Capítulo 4 144 El estudio de todos los complejos se llevó a cabo mediante técnicas de RMN como 1H- STD y NOESY transferido a 298K y 600 MHz y técnicas teóricas como docking. Las condiciones de las diferentes muestras fueron 1 mM de tetrasacárido y 20 µM de proteína en 250 µL de buffer 1 x PBS. Si se necesitase un cambio en las condiciones de los experimentos o de la muestra se especificará en el apartado correspondiente. 4.2.2.1 Estudio de la interacción entre la Midkina y tetrasacáridos no protegidos (tetrasacáridos 1, 7 y 10).  Tetrasacárido 1. En primer lugar, se mostrarán los resultados obtenidos para el complejo formado por el tetrasacárido 1 y la Midkina. Para ello, se llevaron a cabo experimentos de NOESY transferido y STD a 298K. Con ambos experimentos además de conocer si se produce interacción entre la proteína y el ligando también proporcionan información acerca de la estructura del tetrasacárido en su forma enlazada y del porcentaje de saturación que le llega al ligando desde la proteína indicando el modo de unión de ambos compuestos (para más detalle ver metodología). El espectro NOESY obtenido a un tiempo de mezcla de 200 ms con 8 escanes de 512 fides y 4096 puntos cada fid se representa en la figura 4.2.2.1. En ella, se muestran los picos NOEs del ligando enlazado que están rotulados. Se observan los mismos picos NOEs que los obtenidos cuando el ligando se encuentra en su forma libre indicando que la estructura no varía a causa de la interacción con el receptor. Sin embargo, las velocidades de crecimiento de los picos son ahora mayores y compatibles con un complejo de mayor tamaño. Esta estructura sigue siendo lineal y con conformación 4C1 para los anillos de GlcA y GalNAc y 2SO para el IdoA. Además, se realizaron los mismos experimentos a diferentes tiempos de mezcla pudiendo medir las distancias experimentales representadas en la tabla 4.2.2.1. Los tiempos de mezcla fueron: 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 y 1s. Todas ellas reflejan la misma conformación del ligando libre. Interacción de Midkina con GAGs 145 Figura 4.2.2.1 Espectro NOESY transferido a 200 ms y 298K. Muestra la conformación del ligando enlazado del tetrasacárido 1. Tabla 4.2.2.1 Distancias experimentales del tetrasacárido 1 enlazado, obtenidas a partir de la curva de crecimiento del NOE a 298K por el método de las velocidades iniciales. En la figura 4.2.2.2 se muestra el espectro 1H-STD (negro) y el 1H-RMN (rojo) para el tetrasacárido que se está estudiando. Tal y como se esperaba se produce interacción entre la proteína y el ligando. Además, en el espectro 1H-STD se observa que a todos los protones en mayor o menor medida le llega saturación de la proteína indicando un modo de interacción lineal entre la proteína y el ligando. Es decir, no hay segmentos, ni caras, ni residuos con una interacción preferente con la Midkina. El modo de unión sería similar al descrito por RMN y observado para los tetrasacáridos 3 y 4. En este caso, el tetrasacárido se situan entre los dos dominios que contiene la Midkina, que se Pareja de átomos Distancias experimentales Distancias experimentales H3A/H1A 2.6 Å H3C/H1C 2.6 Å H5A/H1A 2.2 Å H5C/H1C 2.6 Å H3B/H1B 2.6 Å H4B/H1C 2.3 Å H5B/H1B 2.5 Å H3D/H1D 2.4 Å H3A/H1B 2.9 Å H2D/H5D 2.7 Å H4D/H5D 2.4 Å H2D/H1D 2.5 Å H3C/H1D 2.2 Å Capítulo 4 146 encontraría en una conformación plegada, y la región hinge con los que también establece contacto, pero sin una orientación definida. Figura 4.2.2.2 Espectro 1H-RMN (rojo) y espectro STD (negro) a un tiempo de saturación de 4 s. Para realizar un análisis más cuantitativo se han medido los valores de STD0 tanto absolutos y como relativos para los protones que no están solapados (tabla 4.2.2.2). Se puede observar que el 100% de saturación con un valor de STD0 absoluto de 4,3% le corresponde a uno de los protones del anillo D, llegándole más saturación que al anillo aromático presente en el tetrasacárido 1 (prácticamente la mitad). Este hecho pone de manifiesto la menor influencia en el enlace del grupo OMP con respecto a los demás hidrógenos. Además, los valores de STD0 absolutos varían de un 2-4.3% por lo que el rango de saturación es pequeño no pudiéndose obtener más conclusiones. Nombre STD0 rel./abs. Nombre STD0 rel./abs. H1A 93.6/4.0 H2C 62.2/2.7 H3A 49.1/2.1 H3C 94.5/4.1 H1B 60.9/2.6 H5C 48.7/2.1 H2B 60.4/2.6 H2D 47.1/2.0 H3B 60.3/2.6 H3D 38.0/1.6 H4B 58.6/2.5 H4D 100/4.3 H5B 37.6/1.6 H5D 62.8/2.7 Ac 81.5/3.5 CH3-OMP 55.3/2.4 Ph-OMP 48.6/2.1 Interacción de Midkina con GAGs 147 Tabla 4.2.2.2 Valores de STD0 absolutos y relativos obtenidos para el tetrasacárido 1 de 0.5 a 4 s de tiempo de saturación a 298K. Para determinar la orientación que toma el ligando al interaccionar con la proteína se determinó el mapa del epítopo (figura 4.2.2.3). Este refleja la ausencia de una zona privilegiada con una mayor interacción que el resto, que se distinguiera por STD más altos o, por el contrario, zonas que tuviesen menos responsabilidad en la interacción. Por lo tanto, se puede deducir una interacción similar a la descrita consistente con un modo de unión lineal del ligando en el centro activo de la Midkina en una conformación plegada. Figura 4.2.2.3 Representación del mapa de epítopo para el tetrasacárido 1 obtenido de los valores de STD0 medidos a 298K. Si se comparan los resultados obtenidos del análisis de RMN para los tetrasacáridos 1 y 3 (de la misma secuencia pero con diferencia en el patrón de sulfatación) se puede indicar que ambos se comportan de forma similar cuando se unen a la proteína ya que los valores de STD ligeramente superiores mostrados para el tetrasacárido 1 no son indicativos de una mayor interacción. Por lo tanto, para esta pareja de tetrasacáridos no se puede diferenciar un modo de unión diferente debido al aumento de grupos sulfato, sin embargo, los valores de IC50 si muestran una gran diferencia para ambos tetrasacáridos indicando mayor interacción para el tetrasacárido 3 con mayor grupos sulfato, como era de esperarse. Para obtener una estructura teórica del complejo y complementar los resultados experimentales se realizó un docking para el tetrasacárido 1 mediante el módulo de Glide. Para ello se utilizó el modelo 3 de la estructura de la MDK. El Grid empleado para la realización del docking fue de 30 Å desde el centro de la proteína ocupando toda la superficie del sitio activo de ella. Las demás condiciones de este estudio se pueden O OH O2C OH OH O O3SO O OSO 3 NHAc O O3SO OO OSO3 NHAc OO HO -O2C OH CH3 HHH H H H H H H H H HH H H H H H H H 100-70% 70-40% 40-0% Capítulo 4 148 ver en la parte experimental. El docking SP es un docking simple que se basa en las interacciones electrostáticas para la determinación de la estructura del complejo. En la figura 4.2.2.4 se observa que con un grid grande el ligando se queda entre los dos dominios de la proteína. Se muestran las 11 estructuras de menor energía obtenidas para el complejo y claramente se puede observar diferentes modos de unión pero todos pueden confirmar los datos experimentales obtenidos mediante STD. Figura 4.2.2.4 Estructuras superpuestas para el tetrasacárido 1 obtenidas del docking molecular.  Tetrasacárido 7. El mismo estudio sobre el complejo formado con el tetrasacárido 1 se realizó con el tetrasacárido 7, el cual presenta una secuencia de CS-E y un sulfato más en el extremo no reductor. Se llevaron a cabo experimentos de NOESY transferido para determinar la estructura del ligando en su forma enlazada a diferentes tiempos de mezcla (s) y experimentos STD para determinar el modo de unión entre ambas especies. Además del docking que permite obtener la estructura del complejo de forma teórica. En la figura 4.2.2.5 se muestra el espectro NOESY obtenido a 200 ms y 298K. Los NOEs significativos para la determinación de la estructura se denotan en el espectro bidimensional. Dichos NOEs son indicativos de una estructura lineal cuyas conformaciones para los cuatro anillos es de 4C1 no encontrándose diferencias en los NOEs que reflejen una estructura del ligando enlazado diferente a la del libre. Interacción de Midkina con GAGs 149 Figura 4.2.2.5 Espectro tr-NOESY a 200 ms a 298K. Muestra la conformación del ligando enlazado del tetrasacárido 7. Además de los espectros, en la tabla 4.2.2.3 se recogen las distancias experimentales obtenidas a partir de la curva de crecimiento del NOE para el ligando cuando forma parte del complejo. Respecto a la disposición de los enlaces glicosídicos las distancias deducidas mediante NOE para el enlace entre el anillo C y D es más larga de lo esperado ya que es mayor que cuando el ligando se encuentra en su forma libre. Además, la distancia H1D/H5D muestra una longitud ligeramente mayor que el resto, lo que podría indicar una cierta distorsión o mayor flexibilidad en esta región. Tabla 4.2.2.3 Distancias experimentales del ligando enlazado (tetrasacárido 7). El espectro de STD y 1H-RMN se representan en la figura 4.2.2.6 en el cual se observa que se produce interacción entre el tetrasacárido 7 y la Midkina. Además, se observa un gran solapamiento entre señales no estando las señales del ligando bien definidas Pareja de átomos Distancia experimental Pareja de átomos Distancia experimental H3A/H1A 2.6 Å H3C/H1C 2.6 Å H5A/H1A 2.8 Å H5C/H1C 2.7 Å H3B/H1B 2.6 Å H4B/H1C 2.8 Å H5B/H1B 2.9 Å H3D/H1D 2.6 Å H3A/H1B 2.8 Å H5D/H1D 3.2 Å H3C/H1D 3.0 Å 252 complementar los valores experimentales y obtener una estructura teórica. Los resultados de la DM libres reproducen mejor los datos experimentales cuando los disacáridos presentan un anillo con grupos sulfato y el otro anillo sin ninguno independientemente de la secuencia. Este efecto se puede explicar debido a una inestabilidad de las cargas. Aunque reproduce la conformación mayoritaria de los anillos no reproduce la linealidad estructural con un único mínimo energético en la trayectoria (Φ/Ψ). 3. Después de los valores de STD0 obtenidos para cada disacárido no se observan diferencias en el modo de unión de los disacáridos con la Midkina ya que se orientan entre ambos dominios de la Midkina. Sí es evidente que al presentar una secuencia diferente a los tetrasacáridos y una longitud más pequeña la interacción es más pequeña que para los tetrasacáridos persustituidos pero más alta que los desprotegidos. 4. La realización del docking molecular llevado a cabo con las mismas condiciones de grid y de docking que los tetrasacáridos confirma las diferentes estructuras obtenidas las cuáles no indican un único modo de unión con la Midkina. 6.3 PLEIOTROFINA 1. Al igual que la Midkina, la Pleiotrofina interacciona con alta afinidad con los tetrasacáridos derivados de CS. Esto se aprecia en los valores de afinidad medidos por polarización de fluorescencia y en los espectros de RMN obtenidos que indican que la interacción es tan fuerte que se observan señales muy anchas y agrupadas con una relación señal-ruido muy pequeña debido al poco ligando en forma libre que se encuentra en disolución. 2. Las afinidades que presentan los complejos son bastantes diferentes tal y como se aprecia en los valores de IC50. En general, para una misma serie aumentan al aumentar la sustitución de grupos aromáticos. 3. No se ha podido determinar la orientación del ligando en el sitio activo de la proteína, aunque se ha podido determinar que los ligandos reciben magnetización en los STD a lo largo de toda su cadena y por todas direcciones. Lo que estaría de acuerdo con un modo de asociación análogo al descrito para los mismos carbohidratos y la Midkina siendo consistentes con una situación central del oligosacárido que es rodeado por la PTN interaccionando con los dominios por direcciones opuestas. 253 4. La estructura tridimensional de todos los ligandos cuando forman parte de los complejos es lineal es igual a la del ligando en su forma libre, no se altera ni la conformación a nivel de los anillos ni a nivel global por variación en los enlaces glicosídicos. 254 ANEXO 255 Espectro monodimensional obtenido a 298K para el trisacárido 1. Espectro bidimensional HSQC obtenido para el trisacárido 1. 256 Espectro monodimensional obtenido a 298K para el trisacárido 2. Espectro bidimensional HSQC obtenido para el trisacárido 2. 257 Espectro monodimensional obtenido a 298K para el trisacárido 3. Espectro bidimensional HSQC obtenido para el trisacárido 3. 258 Espectro monodimensional obtenido a 298K para el trisacárido 4. Espectro bidimensional HSQC obtenido para el trisacárido 4. 259 Espectro monodimensional obtenido a 298K para el trisacárido 5. Espectro bidimensional HSQC obtenido para el trisacárido 5. 260 Espectro monodimensional obtenido a 298K para el trisacárido 6. Espectro bidimensional HSQC obtenido para el trisacárido 6. 261 Espectro monodimensional obtenido a 298K para el trisacárido 7. Espectro bidimensional HSQC obtenido para el trisacárido 7. 268 Espectro bidimensional HSQC para el tetrasacárido 2 a 298K y 600 MHz. Espectro bidimensional NOESY para el tetrasacárido 2 a 298K, 600 MHz y 500 ms. 269 Curvas de crecimiento del NOE para los 4 anillos del tetrasacárido 2 a 298K y 600 MHz para el anillo D y a 281K y 600 MHz para los anillos A y B. Las líneas representan un ajuste lineal de los valores experimentales (símbolos). 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 NOE Tiempo de mezcla (s) H3A/H1A H3A/H1A H5B/H1B H5B/H1B H3A/H1B H3A/H1B H3B/H1B H3B/H1B H5A/H1A H5A/H1A 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 NOE Tiempo de mezcla (s) H2D/H5D H2D/H5D H4D/H5D H4D/H5D Anillos A y B (tetrasacárido 2) Anillos C y D (tetrasacárido 2) 270 Espectro monodimensional para el tetrasacárido 5 a 298K y 700 MHz. Espectro bidimensional HSQC para el tetrasacárido 5 a 298K y 700 MHz. 271 Espectro bidimensional TOCSY para el tetrasacárido 5 a 298K y 700 MHz. Espectro bidimensional NOESY para el tetrasacárido 5 a 298K, 700 MHz y 500 ms. 272 Curvas de crecimiento del NOE para los 4 anillos del tetrasacárido 5 a 298K y 600 MHz. Las líneas representan un ajuste lineal de los valores experimentales (símbolos). 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 NOE Tiempo de mezcla (s) H3A/H1A H5A/H1A H3B/H1B y H5B/H1B H4A/H1B 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 NOE Tiempo de mezcla (s) H4C/H1D H3D/H1D H5D/H1D H5C/H1C H3B/H1C H3C/H1C Anillos A y B (tetrasacárido 5) Anillos C y D (tetrasacárido 5) 273 Espectro monodimensional para el tetrasacárido 7 a 298K y 600 MHz. Espectro bidimensional HSQC para el tetrasacárido 7 a 298K y 700 MHz. 274 Espectro bidimensional TOCSY para el tetrasacárido 7 a 298K y 600 MHz. Espectro bidimensional NOESY para el tetrasacárido 7 a 298K, 600 MHz y 500 ms. Anillos A y B (tetrasacárido 7) 275 Curvas de crecimiento del NOE para los 4 anillos del tetrasacárido 7 a 298K y 600 MHz. Las líneas representan un ajuste lineal de los valores experimentales (símbolos). 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 NOE Tiempo de mezcla (s) H3A/H1A H5A/H1A H3B/H1B H3A/H1B H5B/H1B 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 NOE Tiempo de mezcla (s) H3C/H1D H3D/H1D H5D/H1D H5C/H1C H4B/H1C H3C/H1C Anillos C y D (tetrasacárido 7) 276 Espectro monodimensional para el tetrasacárido 8 a 298K y 600 MHz. Espectro bidimensional HSQC para el tetrasacárido 8 a 298K y 600 MHz. 277 Espectro bidimensional TOCSY para el tetrasacárido 8 a 298K y 600 MHz. Espectro bidimensional NOESY para el tetrasacárido 8 a 298K, 600 MHz y 500 ms. 284 Curvas de crecimiento del NOE transferido para los 4 anillos del tetrasacárido 2 a 298K y 600 MHz. Las líneas representan un ajuste lineal de los valores experimentales (símbolos). 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 NOE Tiempo de mezcla (s) H3A/H1A H5A/H1A H3B/H1B H5B/H1B H3A/H1B 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 NOE Tiempo de mezcla (s) H3A/H1A H5A/H1A H3B/H1B H5B/H1B H3A/H1B 285 Representación de los valores de STD experimentales (símbolos) y un ajuste mediante la ecuación de Box Lucas (líneas) para el tetrasacárido 2. 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 0 1 2 3 4 5 STD (%) Tiempo de saturación (s) H1A H1A H2A H2A H3A H3A Ac Ac CH3 (OMP) CH3 (OMP) Ph (OMP) Ph (OMP) H1B H1B H2B H2B H4B H4B Bn1 Bn1 Bn2 Bn2 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 0 1 2 3 4 5 STD (%) Tiempo de saturación (s) H5C H5C H2C H2C H3C H3C H3D H3D H4D H4D H5D H5D Anillos A y B (tetrasacárido 5) 286 Curvas de crecimiento del NOE transferido para los 4 anillos del tetrasacárido 5 a 298K y 600 MHz. Las líneas representan un ajuste lineal de los valores experimentales (símbolos). 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0 100.0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 NOE transferido Tiempo de mezcla (s) H3A/H1A H5A/H1A H3B/H1B y H5B/H1B H4A/H1B 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0 100.0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 NOE transferido Tiempo de mezcla (s) H4C/H1D H3D/H1D H5D/H1D H5D/H1D H3B/H1C H3C/H1C Anillos C y D (tetrasacárido 5) Anillos A y B (tetrasacárido 5) 287 Representación de los valores de STD experimentales (símbolos) y un ajuste mediante la ecuación de Box Lucas (líneas) para el tetrasacárido 5. 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 0 1 2 3 4 5 6 STD (%) Tiempo de saturación (s) H1A y CH2 (BN) H1A y CH2 (BN) H2A y H3A H2A y H3A H5A H5A Ac Ac BN BN CH3 (OMP) CH3 (OMP) Ph (OMP) Ph (OMP) H1B H1B 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 0123456 STD (%) Tiempo de saturación (s) H1D H1D H2C H2C H5C H5C H3C H3C H4D H4D H1C H1C Anillos C y D (tetrasacárido 5) 288 Curvas de crecimiento del NOE transferido para los 4 anillos del tetrasacárido 8 a 298K y 600 MHz. Las líneas representan un ajuste lineal de los valores experimentales (símbolos). 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 NOE Tiempo de mezcla (s) H3A/H1A H5B/H1B H3A/H1B H3B/H1B H5A/H1A 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 NOE Tiempo de mezcla (s) H3C/H1D H3D/H1D H5D/H1D H5C/H1C H4B/H1C Anillos C y D (tetrasacárido 8) Anillos A y B (tetrasacárido 8) Anillos C y D (tetrasacárido 8) 289 Representación de los valores de STD experimentales (símbolos) y un ajuste mediante la ecuación de Box Lucas (líneas) para el tetrasacárido 8. 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 0 1 2 3 4 5 STD (%) Tiempo de saturación (s) H1A H1A H2A H2A BN1 BN1 Ac Ac CH3 (OMP) CH3 (OMP) Ph (OMP) Ph (OMP) H1B H1B BN2 BN2 H4B H4B H5B H5B H3B H3B H3A H3A 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 0 1 2 3 4 5 STD (%) Tiempo de saturación (s) H2C H2C H3C H3C H1D H1D H4D H4D Anillos C y D (tetrasacárido 8) 290 Espectro monodimensional para el disacárido 11 a 290K y 600 MHz. Espectro bidimensional HSQC para el disacárido 11 a 290K y 600 MHz. 291 Espectro bidimensional TOCSY para el disacárido 11 a 290K y 600 MHz. Espectro bidimensional NOESY para el disacárido 11 a 290K y 600 MHz. 292 Curvas de crecimiento del NOE para los 2 anillos del disacárido 11 a 290K y 600 MHz. Las líneas representan un ajuste lineal de los valores experimentales (símbolos). Espectro monodimensional para el disacárido 12 a 298K y 600 MHz. 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 NOE Tiempo de mezcla (s) H3A/H1A H5B/H1B H5A/H3A H4B/H2B H3B/H2B 293 Espectro bidimensional HSQC para el disacárido 12 a 298K y 600 MHz. Espectro bidimensional TOCSY para el disacárido 12 a 298K y 600 MHz. 300 Curvas de crecimiento del NOE para los 4 anillos que se han podido medir para el pentasacárido 16 a 298K y 600 MHz. Las líneas representan un ajuste lineal de los valores experimentales (símbolos). 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 NOE Tiempo de mezcla (s) H3A/H1A y H5A/H1A H5B/H1B H3A/H1B H3B/H1B H2A/H1A H2B/H1B 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 NOE Tiempo de mezcla (s) H3A/H1A y H5A/H1A H5B/H1B H3A/H1B H3B/H1B H2A/H1A H2B/H1B 301 Representación de los valores de STD experimentales (símbolos) y un ajuste mediante la ecuación de Box Lucas (líneas) para el complejo formado con el disacárido 11. Representación de los valores de STD experimentales (símbolos) y un ajuste mediante la ecuación de Box Lucas (líneas) para el complejo formado con el disacárido 12. 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0 0 1 2 3 4 5 STD (%) Tiempo de saturación (s) H1A H1A H3A H3A H4A H4A Bn Bn CH3 (OMP) CH3 (OMP) Ph (OMP) Ph (OMP) Bz Bz H5B H5B H3B H3B H6A H6A H6B H6B 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 0 1 2 3 4 5 STD (%) Tiempo de saturación (s) H1A H1A H3A H3A H4A H4A Bn Bn CH3 (OMP) CH3 (OMP) Ph (OMP) Ph (OMP) Bz Bz H1B H1B H2B H2B H6A H6A H6B H6B H2A H2A H5A, H5B Y H3B H5A, H5B y H3B 302 Representación de los valores de STD experimentales (símbolos) y un ajuste mediante la ecuación de Box Lucas (líneas) para el complejo formado con el disacárido 13. Representación de los valores de STD experimentales (símbolos) y un ajuste mediante la ecuación de Box Lucas (líneas) para el complejo formado con el disacárido 15. 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 0 1 2 3 4 5 STD (%) Tiempo de saturación (s) H1A H1A H3A H3A H4A H4A Bn Bn CH3 (OMP) CH3 (OMP) Ph (OMP) Ph (OMP) Bz Bz H1B H1B H2B H2B H6A H6A H2A H2A H5A H5A H3B H3B H5B H5B 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 0 1 2 3 4 5 STD (%) Tiempo de saturación (s) H1A H1A H4A H4A Bn Bn CH3 (OMP) CH3 (OMP) Ph (OMP) Ph (OMP) Bz Bz H2B H2B H4B H4B 303 Representación de los valores de STD experimentales (símbolos) y un ajuste mediante la ecuación de Box Lucas (líneas) para el complejo formado por el tetrasacárido 3 con la Pleiotrofina. 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 0 1 2 3 4 5 STD (%) Tiempo de saturación (s) H1A H1A H4A H4A CH3 (OMP) CH3 (OMP) Ph (OMP) Ph (OMP) H3B H3B H4B H4B H5B H5B 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 0 1 2 3 4 5 STD (%) Tiempo de saturación (s) H1C H1C H2D H2D H3D H3D H4D H4D H5D H5D H1D H1D 304 Representación de los valores de STD experimentales (símbolos) y un ajuste mediante la ecuación de Box Lucas (líneas) para el complejo formado por el tetrasacárido 7 con la Pleiotrofina. 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 0 1 2 3 4 5 STD (%) Tiempo de saturación (s) H1A H1A H3A H3A H5A H5A CH3 (OMP) CH3 (OMP) Ph (OMP) Ph (OMP) H3B H3B H1B H1B H5B H5B 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 0 1 2 3 4 5 STD (%) Tiempo de saturación (s) H1A H1A H3A H3A H5A H5A CH3 (OMP) CH3 (OMP) Ph (OMP) Ph (OMP) H3B H3B H1B H1B H5B H5B 305 Representación de los valores de STD experimentales (símbolos) y un ajuste mediante la ecuación de Box Lucas (líneas) para el complejo formado por el tetrasacárido 10 con la Pleiotrofina. 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 0 1 2 3 4 STD (%) Tiempo de saturación (s) H1A H1A H2A H2A H5A H5A H3A H3A H4A H4A CH3 (OMP) CH3 (OMP) Ph (OMP) Ph (OMP) H2B H2B H3B H3B H4B H4B H5B H5B 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 0 1 2 3 4 STD (%) Tiempo de saturación (s) H4C H4C H2C H2C H3C H3C H5C H5C H2D H2D H3D H3D H4D H4D H5D H5D 306 Representación de los valores de STD experimentales (símbolos) y un ajuste mediante la ecuación de Box Lucas (líneas) para el complejo formado por el tetrasacárido 2 con la Pleiotrofina. 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 0 1 2 3 4 5 STD (%) Tiempo de saturación (s) H5A H5A H2A H2A H3A H3A BN1 BN1 CH3 (OMP) CH3 (OMP) Ph (OMP) Ph (OMP) H1B H1B BN2 BN2 H2B H2B H5B H5B H3B H3B 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 012345 STD (%) Tiempo de saturación (s) H3C H3C H3D H3D H4D H4D 307 Representación de los valores de STD experimentales (símbolos) y un ajuste mediante la ecuación de Box Lucas (líneas) para el complejo formado por el tetrasacárido 5 con la Pleiotrofina. 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 0 1 2 3 4 5 STD (%) Tiempo de saturación (s) H2A y H3A H2A y H3A Bn1 Bn1 Ph (OMP) Ph (OMP) Bn2 Bn2 H2B H2B H4B H4B 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 0 1 2 3 4 5 STD (%) Tiempo de saturación (s) H1C H1C H3D H3D H5D H5D 308 Representación de los valores de STD experimentales (símbolos) y un ajuste mediante la ecuación de Box Lucas (líneas) para el complejo formado por el tetrasacárido 8 con la Pleiotrofina. 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 0 1 2 3 4 5 STD (%) Tiempo de saturación (s) H1A H1A H2A H2A H3A H3A Bn Bn Ph (OMP) Ph (OMP) CH3 (OMP) CH3 (OMP) H2B H2B H4B H4B H1B H1B H5B H5B 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 0 1 2 3 4 5 STD (%) Tiempo de saturación (s) H1C H1C H3C H3C H5C H5C H1D H1D H2D H2D H3D H3D H5D H5D H4D H4D