Deslignificación enzimática de materiales lignocelulósicos de interés industrial

DESLIGNIFICACIÓN ENZIMÁTICA DE MATERIALES LIGNOCELULÓSICOS DE INTERÉS INDUSTRIAL Sevilla, a 25 de Septiembre de 2014 Memoria que presenta Alejandro Rico Campos para optar al título de Doctor en Ciencias Químicas por la Universidad de Sevilla Deslignificación enzimática de materiales lignocelulósicos de interés industrial Visado en Sevilla, a 25 de Septiembre de 2014 DIRECTORES TUTOR Dra. Dña. Ana Gutiérrez Suárez Investigador Científico del CSIC IRNAS-CSIC Prof. D. José C. del Río Andrade Profesor de Investigación del CSIC IRNAS-CSIC Prof. Dña. Mª Elena Fernández Boy Profesor Titular de la Universidad de Sevilla Memoria que presenta D. Alejandro Rico Campos para optar al grado de Doctor en Ciencias Químicas por la Universidad de Sevilla Dr. D. Jorge Rencoret Pazo Investigador del CSIC IRNAS-CSIC D. JOSÉ MANUEL PARDO PRIETO, PROFESOR DE INVESTIGACIÓN DEL CSIC Y DIRECTOR DEL INSTITUTO DE RECURSOS NATURALES Y AGROBIOLOGÍA DE SEVILLA DEL CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS Certifica: Que la presente Memoria de Investigación titulada “Deslignificación enzimática de materiales lignocelulósicos de interés industrial”, presentada por D. Alejandro Rico Campos para optar al grado de Doctor en Ciencias Químicas por la Universidad de Sevilla, ha sido realizada en el Departamento de Biotecnología Vegetal, bajo la dirección de la Dra. Dña. Ana Gutiérrez Suárez, el Prof. D. José Carlos del Río Andrade y el Dr. Jorge Rencoret Pazo, reuniendo todas las condiciones exigidas a los trabajos de Tesis Doctorales. En Sevilla, a 25 de Septiembre de 2014 A mis padres AGRADECIMIENTOS Este trabajo se ha llevado a cabo en el Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla (IRNAS) del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC). Ha sido financiado por los proyectos europeos: “Optimized pre-treatment of fast growing woody and nonwoody Brazilian crops by detailed characterisation of chemical changes produced in the lignin-carbohydrate matrix” (LIGNODECO, KBBE-2009-3-244362), “Novel and more robust fungal peroxidases as industrial biocatalyst” (PEROXICATS, KBBE-2010-4-265397) y “Optimized oxidoreductases for medium and large scale industrial biotransformation” (INDOX, KBBE-2013-7-613549), por el proyecto del Plan Nacional “Desarrollo de pre-tratamientos enzimáticos optimizados para la deconstrucción de materiales lignocelulósicos madereros y no-madereros” (LIGNOCELL, AGL2011-25379), y por el proyecto del CSIC “Cultivos lignocelulósicos de crecimiento rápido: composición química y aprovechamiento industrial” (2010-40E-075). Quiero expresar mi sincero agradecimiento a las personas que tanto directa como indirectamente han hecho posible la realización de esta Tesis: A la Dra. Ana Gutiérrez y al Prof. José Carlos del Río, mis padres científicos y directores de esta Tesis, por todo lo que me han aportado tanto a nivel científico como a nivel personal. A Ana Gutiérrez por su dedicación y profesionalidad en el trabajo, siempre acompañado de una gran amabilidad y simpatía. A José Carlos del Río por ser el responsable de mi andadura en la investigación, por sus conocimientos, enseñanzas y su trato personal. A mi compañero, director de esta Tesis y Dr. Jorge Rencoret y a mi compañero Esteban Babot, mis hermanos mayores en la ciencia. Por todo lo que me han enseñado, por darme respuestas a todas mis preguntas, por siempre estar disponibles cuando lo he necesitado. Porque sin ellos no hubiera sido fácil. Al Prof. Ángel T. Martínez, del Centro de Investigaciones Biológicas (CIBCSIC, Madrid), por su capacidad de gestión y organización, y por aportar numerosos y valiosos conocimientos a los proyectos y artículos en los que he estado implicados. A la Dra. Elena Fernández, tutora de este trabajo, por haber aceptado la tutoría del mismo, así como por su amabilidad y disponibilidad para cualquier consulta. I  RESUMEN La presente Tesis aborda el estudio de tratamientos enzimáticos (basados en la utilización de lacasas en presencia de mediadores redox) encaminados a eliminar/modificar la lignina y/o lípidos presentes en materiales lignocelulósicos de interés industrial, con el fin de conseguir un aprovechamiento más eficaz y racional de dichos materiales, tanto para la producción de celulosa como de biocombustibles de segunda generación (bioetanol). La importancia de los lípidos en la materia prima radica en que son responsables de la formación de los denominados depósitos de pitch durante la fabricación de pasta y papel, reduciendo drásticamente la calidad del producto final y provocando importantes pérdidas económicas. Por otra parte, tanto el contenido como la composición y estructura de la lignina influyen decisivamente en el proceso de deslignificación de la lignocelulosa afectando tanto a los procesos de cocción y blanqueo (en la producción de celulosa) como en la sacarificación enzimática (en la producción de bioetanol). En esta Tesis se han utilizado lacasas de alto potencial redox, de los hongos basidiomicetos Trametes villosa y Pycnoporus cinnabarinus y de bajo potencial redox como la lacasa del hongo ascomiceto Myceliophthora thermophila. Los tratamientos enzimáticos se realizaron en presencia y ausencia de mediadores redox tanto sintéticos, como el 1- hidroxibenzotriazol (HBT), como fenólicos incluyendo siringaldehído (SA) y siringato de metilo (MeS). Los materiales lignocelulósicos utilizados incluyeron pastas kraft de eucalipto para los estudios de deslignificación/blanqueo y eliminación de lípidos responsables del pitch, y madera de eucalipto (Eucalyptus globulus) y hierba elefante (Pennisetum purpureum) para los estudios de deslignificación como pretratamiento previo a la sacarificación enzimática para la obtención de bioetanol. En los tratamientos de pasta kraft de eucalipto con la lacasa de M. thermophila (MtL) en presencia de los mediadores fenólicos SA y MeS, los mejores resultados de deslignificación (25%) y aumento de blancura (8.3 puntos) de dichas pastas se obtuvieron en el tratamiento con MtL y MeS (seguido de extracción alcalina con peróxido). Sin embargo, la mayor eliminación de los compuestos lipofílicos se consiguió en el tratamiento con MtL en presencia de SA como mediador, produciéndose una disminución del 73% de esteroles libres, 91% de glicósidos de esteroles y del 89% de ésteres de esteroles. Estos tratamientos incluyeron la optimización de las dosis enzima-mediador obteniéndose unos resultados muy prometedores con unas dosis tanto de lacasa como de MeS aceptables para su implementación industrial. Estos resultados fueron la base para la realización de un ensayo de este tratamiento II  enzimático a escala piloto que se llevó a cabo en el “Centre Technique du Papier” (Grenoble, Francia). Otros estudios estuvieron encaminados al desarrollo de pretratamientos enzimáticos basados en la utilización del sistema lacasa-mediador para deslignificar materiales lignocelulósicos procedentes de cultivos de crecimiento rápido (eucalipto y hierba elefante) con el objeto de mejorar el rendimiento de la sacarificación enzimática y la producción de bioetanol. Primeramente se realizaron tratamientos de estos materiales con una lacasa de alto potencial redox (de T. villosa) y HBT como mediador, en una secuencia que incluía cuatro tratamientos enzimáticos seguidos cada uno de ellos de una extracción alcalina con peróxido de hidrógeno (8 pasos). Tras la secuencia completa se determinó el contenido en lignina (lignina Klason) y se evaluó el rendimiento de la sacarificación enzimática (con celulasas) y fermentación de las muestras pretratadas. Con estos pretratamientos se consiguió una eliminación de lignina de un 48% en la madera de eucalipto y de un 32% en la hierba elefante, que conllevaron una mejora en el rendimiento de la liberación de glucosa de un 61% y 12% y de producción de etanol de 4 g/L y 2 g/L en la madera de eucalipto y hierba elefante, respectivamente, respecto de las muestras sin pretratamiento enzimático. Además de la variación en el contenido en lignina del material lignocelulósico tras los pretratamientos, se estudió la modificación estructural del polímero de lignina mediante el análisis de las muestras por Resonancia Magnética Nuclear bidimensional (2D- NMR). Estos estudios revelaron una eliminación significativa de las unidades guayacilo (G) y siringilo (S) de la lignina así como de las cadenas laterales (principalmente uniones β-O-4’) y una disminución más moderada del contenido en ácido p-cumárico (presente en la hierba elefante) sin una variación sustancial de las señales de polisacárido. Estos análisis también mostraron una oxidación en el Cα de las unidades S de la lignina que fue más evidente en el caso de la madera de eucalipto. Con el fin de facilitar la viabilidad industrial de este pretratamiento enzimático basado en el sistema lacasa-mediador, posteriormente se estudiaron pretratamientos enzimáticos de madera de eucalipto en condiciones similares a los anteriormente descritos, pero utilizando un sistema lacasa-mediador de más bajo coste, que consistió en la utilización de una lacasa comercial (MtL) y de un mediador fenólico (MeS). Tras el pretratamiento completo (cuatro ciclos) se obtuvo una eliminación del 50% del contenido en lignina de la madera de eucalipto así como un aumento de un 40% en la liberación de glucosa tras sacarificación enzimática, respecto de las muestras sin pretratamiento enzimático. La modificación estructural de la lignina producida por estos pretratamientos se estudió en profundidad mediante 2D-NMR. Estos análisis revelaron una eliminación significativa de las unidades guayacilo III  (G) y siringilo (S) de la lignina con preferencia de las primeras, así como de las cadenas laterales (principalmente uniones β-O-4’ y β-β’). La modificación más relevante observada fue la oxidación en el Cα de las unidades S. En estos pretratamientos se llevó a cabo un estudio detallado por 2D-NMR de la modificación estructural de la lignina tras cada uno de los 8 pasos (incluyendo tratamientos enzimáticos y extracción alcalina) tanto en el material lignocelulósico completo como en las ligninas aisladas enzimáticamente y en los filtrados de los tratamientos, lo que ha aportado información de gran interés sobre el mecanismo de degradación de la lignina por el sistema lacasa-mediador y que será de ayuda para desarrollar pretratamientos enzimáticos viables industrialmente. La presente Tesis incluye los siguientes apartados: I) una introducción general sobre los cultivos lignocelulósicos, su composición, su interés industrial, y los procesos utilizados tanto para la producción de pasta de celulosa como para la producción de biocombustible de segunda generación, así como los principales problemas que plantean algunos de sus constituyentes y algunas soluciones biotecnológicas a estos problemas; II) los objetivos perseguidos en la Tesis; III) una descripción detallada de los materiales estudiados y los métodos analíticos empleados; IV) los resultados generales obtenidos y su discusión; V) las referencias citadas; VI) las publicaciones científicas; y VII) las principales conclusiones.  V  ABSTRACT The present Thesis deals with the development of enzymatic treatments (based on the use of laccases in the presence of redox mediators) aimed at the removal/modification of the lignin and/or lipids present in lignocellulosic materials of industrial interest, in order to achieve a more efficient and rational use of these materials for the production of both, cellulose and second generation biofuels (bioethanol). The importance of lipids in the raw materials is because they are responsible for the formation of the so-called pitch deposits during pulp and paper manufacturing, drastically reducing the quality of the final product and producing important economic losses. Moreover, the content, composition and structure of the lignin have a significant effect on the delignification process of the lignocellulose, affecting both the cooking and bleaching processes (during the production of cellulose) or the enzymatic saccharification (during the production of bioethanol). In this Thesis, high redox potential laccases from the fungal basidiomycetes Trametes villosa and Pycnoporus cinnabarinus as well as a low redox potential laccase from the fungal ascomycete Myceliophthora thermophila have been used. The enzymatic treatments were performed in the presence and absence of redox mediators, including synthetic compounds such as 1-hidroxybenzotriazole (HBT), and natural phenolic compounds such as syringaldehyde (SA) and methyl syringate (MeS). The lignocellulosic materials used included eucalyptus kraft pulps for the studies regarding delignification/bleaching and removal of lipids responsible for pitch, and eucalyptus wood (Eucalyptus globulus) and elephant grass (Pennisetum purpureum) for studies about enzymatic delignification as pretreatment prior enzymatic saccharification for the production of second generation bioethanol. In the enzymatic treatments of eucalyptus kraft pulps with the laccase from M. thermophila (MtL) in the presence of the phenolic mediators SA and MeS, the best results of delignification (25%) and whiteness increase (8.3 points) were obtained with MtL and MeS (followed by alkaline peroxide extraction). However, the highest removal of the lipophilic compounds were obtained using MtL in the presence of SA as mediator, resulting in a decrease of 73% of free sterols, 91% of sterol glycosides and 89% of sterol esters. These treatments included the optimization of VI  enzyme-mediator doses, obtaining very promising results with doses of MtL and MeS low enough for further industrial implementation. These results were the basis for additional scale-up of the enzymatic treatment at pilot scale, that was carried out at the “Centre Technique du Papier” (Grenoble, France). Other studies were aimed at the development of enzymatic pretreatments based on the use of the laccase-mediator system for the delignification of lignocellulosic materials from fast growing crops (eucalyptus and elephant grass) in order to improve the yields of the enzymatic saccharification and the production of bioethanol. The pretreatments of these materials were initially performed with a high redox potential laccase (from T. villosa) and HBT as mediator in a multistage sequence consisting of successive enzymatic and alkaline peroxide stages. After completing the sequence, the lignin content (Klason lignin) was determined and the yields of the enzymatic saccharification (using cellulases) and fermentation of the pretreated samples were evaluated. These pretreatments removed up to 48% of the lignin in eucalyptus and up to 32% of the lignin in elephant grass, leading to an improvement in the glucose yield of 61% and 12%, and ethanol yield of 4 g/L and 2 g/L in eucalyptus wood and elephant grass, respectively, with respect to the control samples without pretreatment. Besides the variation in the lignin content of the lignocellulosic material after the pretreatments, the structural modification of the lignin polymer was studied by two-dimensional nuclear magnetic resonance (2D-NMR). These studies revealed a significant removal of guaiacyl (G) and syringyl (S) lignin units and aliphatic side chains (mainly β-O-4′ linkages) and a more moderate decline of the p-coumaric acid content (present in elephant grass) without a substantial change in the polysaccharide signals. The analyses also indicated a Cα oxidation of the S-lignin units that was more evident in the case of eucalyptus wood. In order to facilitate the potential industrial feasibility of the enzymatic pretreatments based on the laccase-mediator system, the enzymatic pretreatment of eucalyptus wood was studied under similar conditions as described above but using a low cost laccase-mediator system, constituted by a commercial laccase (MtL) and a natural phenolic mediator (MeS). This pretreatment (four cycles) resulted in a 50% lignin removal in the eucalyptus wood and a 40% increase in glucose yields after the enzymatic saccharification. The structural changes occurring in the lignin during these pretreatments were studied in depth by 2D-NMR. VII  The analyses revealed a significant removal of guaiacyl (G) and syringyl (S) lignin units, with a preferential removal of the former, as well as of the side chains (mainly β-O-4′ and β-β′ linkages). The most significant modification observed was the oxidation of S-lignin units at Cα. Furthermore, a detailed 2D-NMR study of the structural modifications of the lignin was carried out after each of the 8 steps (including the enzymatic treatments and the alkaline extraction) in both, the whole cell walls and in isolated lignins, as well as in the filtrates, that has provided information of great interest about the mechanism of lignin degradation by the laccase-mediator system that will help to develop industrially feasible enzymatic pretreatments. The present Thesis includes the following sections: I) a general introduction about lignocellulosic materials, their composition, their industrial interests, the processes used for the production of cellulose pulp and second generation biofuel, as well as the main problems originated by their constituents and some biotechnological solutions to address them; II) the objectives pursued in the Thesis; III) a detailed description of the selected materials and the analytical methods used; IV) the overall results obtained and their discussion; V) the cited references; VI) the scientific publications; and VII) the main conclusions.   I. Introducción  3  I.1. BIOMASA LIGNOCELULÓSICA La biomasa lignocelulósica representa la mayor fuente de energía y material renovable de la Tierra, y tiene por tanto un gran potencial como materia prima para la producción de celulosa, bioenergía y otros productos de interés industrial. La principal fuente de biomasa lignocelulósica la constituyen los cultivos forestales y agrícolas, aunque los residuos generados a partir de estos cultivos también presentan interés como materia prima. I.1.1. Cultivos lignocelulósicos Los cultivos forestales (Figura 1) incluyen especies de coníferas y frondosas. Ambas especies se utilizan a escala mundial para la obtención de pasta de papel. En términos económicos generales, las coníferas son más valiosas que las frondosas, ya que sus troncos son más largos y rectos, su madera es uniforme, ligera y blanda, presentan fibras largas (entre 3 y 5 mm) que ofrecen una alta resistencia mecánica, y son más adecuadas para la mayoría de las calidades papeleras (García Hortal 2007). Las principales coníferas utilizadas para la fabricación de pasta de papel son la Picea y el pino. La madera de frondosas, por otro lado, es una madera más dura, de fibras cortas (entre 0.75 y 2 mm) que dan lugar a pastas menos uniformes. El papel fabricado con maderas de frondosas es más débil que los fabricados con maderas de coníferas pero su superficie es más lisa, y por lo tanto, es mejor para papel de escritura. Otra de las ventajas es que el crecimiento de las especies de frondosas utilizadas para la fabricación de pasta de papel es más rápido que el de las coníferas, dando lugar a mayor cantidad de fibra en menos tiempo. Así, los cultivos madereros de crecimiento rápido son atractivos para la industria papelera como también lo son para la obtención de bioetanol. Las principales especies de frondosas utilizadas en el sector papelero y potencialmente interesantes para la producción de bioetanol son el eucalipto, el chopo y el abedul. Los cultivos agrícolas (Figura 1) constituyen una excelente materia prima alternativa a los cultivos forestales para la obtención de celulosa, principalmente por su gran abundancia y su coste relativamente bajo, especialmente en países con baja disponibilidad de madera. Presentan ciclos de crecimiento más cortos, alcanzando la madurez más rápidamente que las especies madereras. El principal inconveniente de este tipo de materias primas es que la mayoría sólo están disponibles en ciertas épocas del año. Ejemplos de cultivos no madereros son: hierba elefante, bambú, cáñamo, lino, kenaf, yute, etc. Por otro lado, los residuos generados de los cultivos agrícolas, como el rastrojo de maíz, la paja de trigo, de arroz y de otros cereales, I. Introducción  10  - Compuestos intermediarios de la ruta biosintética de la lignina, tales como aldehídos cinamílicos (D) (Kim et al. 2003), ácido ferúlico (E) (Leplé et al. 2007), alcohol cafeílico (F) (Chen et al. 2012) y alcohol 5-hidroxiconiferílico (G) (Chen et al. 2013). - Compuestos no relacionados con la ruta biosintética de la lignina. Compuestos que pertenecen a otra ruta biosintética, similares a los monolignoles, y que se encuentran en el lugar de lignificación, y terminan incorporándose a la lignina, como ocurre con la tricina (H) en la paja de trigo (del Río et al. 2012). Figura 7. Estructuras de precursores de la lignina: (A) acetato, (B) p-cumarato, (C) benzoato, (D) aldehído correspondiente a los alcoholes p-hidroxicinamílicos, (E) ácido ferúlico, (F) alcohol cafeílico, (G) alcohol 5-hidroxiconiferílico y (H) tricina. AB DEF G H C I. Introducción  11  La formación del polímero de lignina (lignificación) comienza con la deshidrogenación enzimática de los monolignoles para formar radicales libres de tipo fenoxilo, estabilizados por resonancia (Figura 8). La deshidrogenación enzimática consiste en una reacción de transferencia de un electrón catalizada por peroxidasas en presencia de peróxido de hidrógeno o por lacasas en presencia de oxígeno (Freudenberg y Neish 1968; Adler 1977; Baucher et al. 1998; Boerjan et al. 2003; Ralph et al. 2004). Figura 8. Deshidrogenación del alcohol coniferílico y formas resonantes del radical fenoxilo (adaptado de Adler 1977). A continuación, tiene lugar el acoplamiento (Figura 9) de estos monolignoles radicales entre sí y con el polímero creciente de lignina mediante diversos tipos de uniones. Figura 9. Mecanismo de la unión de los monolignoles libres al polímero de lignina (Freudenberg y Neish 1968). Aunque la variedad de uniones entre monolignoles y de monolignoles con el polímero creciente de lignina es amplia (Figura 10), se pueden diferenciar dos tipos de enlaces: de tipo éter y de tipo carbono-carbono. • • • • • Peroxidasa Lacasa -(e -+ H+) H 2 0 • • β 1 5 4 OMe HO O O MeO L I G N I N A L I G N I N A OMe OH HO HO O MeO L I G N I N A I. Introducción  12  Figura 10. Enlaces tipo éter y carbono-carbono presentes en el polímero de lignina: (A) β-O-4′, (B) α-O-4′, (C) 4-O-5′, (D) β-1′, (E) β-5′/α-O-4′ fenilcumarano, (F) 5-5′/α′′-O- 4/β′′-O-4′ dibenzodioxocina, (G) β-β′/α-O-γ′/γ-O-α′ resinol y (H) β-1′/α-O-α′ espirodienona. Entre las uniones de tipo éter se diferencian principalmente dos tipos, la unión alquil-aril éter (la más estable termodinámicamente), siendo la unión más corriente de este tipo el enlace β-O-4′ (A), mientras que el enlace α-O-4′ (B) es menos frecuente. Por otro lado, en menor proporción existe la unión aril-aril éter, como por ejemplo la unión 4-O-5′ (C). Las uniones o enlaces de tipo carbono-carbono son también conocidas como enlaces condensados. Son más difíciles de romper que los enlaces de tipo éter e incluyen las uniones de dos cadenas alifáticas (MeO) (MeO) (OMe) ABC DEF GH 1 4 α β4′ 1′ 4 1 α β 4′ 1′1 45′ 1′ 4 1 α β 1′ 4′ β α 4′ 5′ 1′ 1 4 β′′ α′′ 1′′ 4′′ 4′ 5′ 1′ 5 4 1 1 4 αγ′ γ ββ′ α′ 1′ 4′ 1′ 4′ α′ α β β′ 1 4 I. Introducción  13  (β-β′ resinol) (G), la unión de un carbono de un anillo bencénico con el de una cadena alifática de otra unidad, como los enlaces β-1′ (D) y β-5′ fenilcumarano (E) y las uniones entre carbonos de anillos bencénicos (5- 5′ o bifenilo). Se ha descrito que el enlace 5-5′ no se encuentra tal cual, sino en forma de trímero, ya que incorpora una nueva unidad mediante un enlace β′′-O-4′ y un enlace α′′-O-4, dando lugar a una estructura de tipo dibenzodioxocina (F) (Karhunen et al. 1995). Igualmente, las uniones β-1′ se encuentran preferentemente en forma de espirodienonas (H) (Zhang y Gellerstedt 2001; Zhang et al. 2006). La composición de la lignina depende de su origen botánico: la lignina de coníferas presenta principalmente unidades G, la lignina de frondosas unidades G y S en diversas proporciones y la lignina de plantas herbáceas contiene unidades H, G y S en diversas proporciones. Incluso en un mismo árbol, la composición de la lignina puede variar dependiendo de la edad (Freudenberg y Lehmann 1963; Rencoret et al. 2011), la parte del árbol (Bland 1966), el tipo de células (Fergus y Goring 1970; Hardell et al. 1980a, 1980b) y del lugar de la pared celular o la lámina media donde se sintetice (Fergus y Goring 1970; Fukushima y Terashima 1991; Christiernin et al. 2005). Las unidades G tienen un único grupo metoxilo y la posición C-5 libre y disponible para la formación de enlaces carbono-carbono, por lo que las ligninas con mayor cantidad de unidades G tienen una estructura más condensada y por lo tanto la lignina se degrada con mayor dificultad (del Río et al. 2005) que las ligninas con un mayor contenido en unidades S. Por esta misma razón, debido a no presentar ningún grupo metoxilo y tener la posición C-3 y C-5 libres, las unidades H son las que dan lugar a una lignina con mayor grado de condensación. Curiosamente, en plantas transgénicas con unidades H mayoritariamente, se obtiene mayor liberación de glucosa que en plantas naturales con una cantidad mínima de unidades H con respecto a las unidades S y G (Bonawitz et al. 2014). La estructura del polímero de lignina no se conoce con exactitud, y hasta el momento tan sólo se han descrito modelos estructurales. Los primeros modelos estructurales de lignina de coníferas y frondosas datan de los años setenta (Nimz 1974; Adler 1977) y con el paso del tiempo se han ido mejorando gracias al avance de las técnicas analíticas, especialmente de la 2D-NMR, que ha permitido el descubrimiento de nuevas subestructuras. Los modelos más actuales de la estructura de la lignina de coníferas y frondosas se muestran en laFigura 11, donde se puede observar la presencia de las nuevas unidades descubiertas en los últimos años, tales como dibenzodioxocinas (Karhunen et al. 1995) y espirodienonas (Zhang y Gellerstedt 2001; Zhang et al. 2006). I. Introducción 14 Figura 11. Modelos del polímero de lignina en maderas: (A) conífera (Picea) (Brunow 2001) y (B) frondosa (álamo) (Boerjan et al. 2003). A B I. Introducción  15  La lignina se encuentra unida covalentemente a los carbohidratos, formando los llamados complejos lignina-carbohidrato (LCC) (Watanabe 2003). En general se acepta que existen tres tipos de uniones lignina-carbohidrato, glucósidos de fenilo, ésteres del ácido 4-O- metilglucurónico con el Cγ de la lignina y éteres de bencilo (Fengel y Wegener 1984) (Figura 12). Figura 12. Tipos de uniones lignina-carbohidrato: (A) glucósido de fenilo, (B) éster de ácido 4-O-metilglucurónico con el Cγ de la lignina y (C) éter de bencilo, diferentes unidades de azúcar unidas con el Cα de la lignina (R= C6 en la glucosa, manosa, galactosa o C5 en arabinosa). Adaptado de Balakshin et al. (2011). Compuestos minoritarios Además de los carbohidratos (celulosa y hemicelulosas) y lignina, existen en los materiales lignocelulósicos otros componentes presentes en pequeñas cantidades que pueden tener importancia cuando estos materiales se utilizan como materia prima en la producción de pasta y papel. Algunos de estos compuestos protegen a la madera de los insectos y son responsables de su color, olor y gusto. Se pueden dividir en extraíbles lipofílicos e hidrofílicos y compuestos insolubles. C 1 de carbohidrato Carbohidrato 1 5 6 α β γ 4′ 1′ α β γ 4′ 1′ A B C I. Introducción  16  Los extraíbles lipofílicos se pueden extraer del material lignocelulósico con disolventes apolares. Los extraíbles lipofílicos (Figura 13) incluyen: alcanos (A), alcoholes grasos (B), aldehídos (C), ácidos grasos (D), esteroles (E), ácidos resínicos (F), ceras (ésteres de ácidos grasos con alcoholes de cadena larga (G)) y glicéridos (ésteres de ácidos grasos con glicerol (H)). Los esteroles pueden estar formando glicósidos y acilglicósidos (Gutiérrez y del Río 2001b), siendo el más abundante el sitosterol 3β-D-glucopiranósido (I), y también pueden encontrarse esteroles libres o esterificados con ácidos grasos (ésteres de esteroles (J)). Figura 13. Estructuras de compuestos representativos de las principales familias de extraíbles lipofílicos: (A) n-pentacosano, (B) n-docosanol, (C) n-octacosanol, (D) ácido palmítico, (E) sitosterol, (F) ácido abiético, (G) octacosanil hexadecanoato, (H) trilinoleína, (I) sitosterol 3β-D-glucopiranósido y (J) sitosteril linoleato. G J A B C D EF H I H O I. Introducción  17  Los extraíbles hidrofílicos se pueden aislar del material lignocelulósico mediante extracciones con disolventes polares. Los extraíbles hidrofílicos (Figura 14) incluyen compuestos fenólicos de bajo peso molecular tales como precursores de la lignina (ácidos phidroxicinámicos y aldehídos p-hidroxicinamílicos), ácidos bencenocarboxílicos relacionados (ácido p-hidroxibenzoico, vainíllico y siríngico), aldehídos y cetonas aromáticas (p-hidroxibenzaldehído, vainillina, siringaldehído y propioguayacona), lignanos (dilignoles y compuestos relacionados), taninos hidrolizables (ésteres del ácido gálico y sus dímeros), taninos no hidrolizables (varias unidades de flavonoides condensadas) y flavonoides (estructuras derivadas del anillo de flavona, 2-fenilbenzopirona). Figura 14. Estructuras de compuestos representativos de los compuestos extraíbles polares: (A) ácido siríngico, (B) ácido p-hidroxibenzoico, (C) vainillina, (D) acetosiringona, (E) ácido gálico y (F) 2-fenilbenzopirona. Los compuestos insolubles son sustancias proteicas, pécticas y de naturaleza inorgánica (García Hortal 2007; Hillis 1962; Fengel y Wegener 1984; Rowe 1989; Sjöström 1993) y su contenido varía con el origen botánico, y en general, es más elevado en las plantas herbáceas (Lu y Ralph 2010). FE ADCB I. Introducción  18  I.2. BIORREFINERÍA DE LA LIGNOCELULOSA El término biorrefinería se puede atribuir a la utilización eficiente e íntegra de todos los componentes de la biomasa (residuo cero). Además tiene por objeto aumentar la sostenibilidad tanto a nivel de uso de recursos naturales, a nivel técnico-económico, como a nivel medioambiental. Mediante una serie de procesos químicos, físicos y/o biológicos, la biomasa se transforma para dar lugar a una amplia variedad de productos, como productos energéticos, biopolímeros y productos químicos de base biológica. Estos productos pueden ser utilizados por la propia biorrefinería. La biorrefinería de material lignocelulósico (Figura 15) consiste en la utilización de todos los componentes de la lignocelulosa (celulosa, hemicelulosas y lignina). El alto grado de entrecruzamiento que existe entre los constituyentes lignocelulósicos es una de las principales barreras para el desarrollo de esta biorrefinería, tanto por la resistencia de la matriz lignocelulósica a su degradación (Zhang et al. 2007), como por su insolubilidad en la mayoría de los disolventes (Zakzeski et al. 2010). Actualmente, los principales procesos de biorrefinería de materiales lignocelulósicos son la producción de celulosa y la producción de bioetanol, aunque los residuos de lignina de estos procesos (contenidas en las lejías negras y residuos forestales) también son susceptibles de uso. A continuación se describen más en detalle la obtención de pasta de celulosa para la producción de papel, y la obtención de bioetanol. Figura 15. Esquema de una biorrefinería lignocelulósica. En negro ejemplos de productos obtenidos a partir de la lignina y en rojo ejemplos de productos obtenidos a partir de la celulosa. Biomasa Lignocelulósica Productos energéticos Productos de base biológica Biocombustibles sólidos Biocombustibles líquidos Productos químicos Polímeros y resinas Biomateriales BIORREFINERÍA LIGNOCELULÓSICA -Bioetanol -Vainillina -Guayacoles -Siringoles -Siringaldehído -Combustión de lignina -Polímeros para envases en la industria alimenticia -Polímeros espumosos -Resinas fenol-formaldehído -Papel -Dispersantes -Tableros -Adhesivos I. Introducción  19  I.2.1. Producción de pasta de papel El principal uso no alimenticio de la biomasa vegetal es la producción de pasta de celulosa a partir de la cual es posible obtener una variada gama de productos como papel ondulado para embalaje y envases, papel para escribir e imprimir, cartón para embalaje, papel prensa, etc. La fabricación de la pasta de papel consiste básicamente en la separación de las fibras de celulosa, que se encuentran cementadas por la lignina. Existen muchos procedimientos que se han ido desarrollando y mejorando a lo largo del tiempo, que presentan ventajas e inconvenientes que han de ser evaluados conforme al tipo de producto final que se desea obtener, teniendo en cuenta parámetros tales como resistencia mecánica del papel a la rotura, rasgado, rozamiento, plegado, rugosidad, blancura, deteriorabilidad, además del costo unitario del proceso, impacto medioambiental de la producción o el tipo de materia prima disponible. La obtención de productos celulósicos comprende fundamentalmente el proceso de pasteado y el proceso de blanqueo. Pasteado El proceso de pasteado destruye o debilita los enlaces interfibras en el vegetal para la separación de las fibras de celulosa mediante procesos mecánicos y/o químicos o la combinación de ambos (Tabla 1). Pasteado mecánico El pasteado mecánico separa las fibras por fragmentación mecánica, utilizando molinos y refinadores de discos, lo que supone un considerable gasto energético. Prácticamente todos los constituyentes estructurales originales del vegetal, celulosa y hemicelulosas (deseados, blancos e hidrofílicos) y lignina (indeseable, oscura e hidrofóbica), permanecen en la pasta, por lo que el rendimiento obtenido es próximo al 95% (García Hortal 2007). I. Introducción  26  19). Los pasos para obtener el bioetanol de segunda generación son: pretratamiento, hidrólisis y fermentación. Figura 19. Distintos pasos para la producción de bioetanol a partir de material lignocelulósico: (A) pretratamiento, (B) hidrólisis de la celulosa con celulasas (1) produciendo celobiosa que libera a glucosa por la acción de β-glucosidasas (2), y (C) producción de bioetanol por fermentación de la glucosa. Pretratamientos Cuando se parte de un material lignocelulósico, el pretratamiento es un paso esencial para la obtención de azúcares fermentables en la etapa de hidrólisis. El objetivo del tratamiento previo es separar la lignina de la celulosa y hemicelulosas, para hacer a los carbohidratos más accesibles a las enzimas hidrolíticas. Los requisitos de un pretratamiento idóneo para la obtención de bioetanol fueron recogidos por Carvalheiro et al. (2008) y Yang y Wyman (2008): - Aumentar la porosidad y el área específica de la biomasa para facilitar la accesibilidad de los reactivos o las enzimas que se emplean durante la hidrólisis. - Reducir el pretratamiento mecánico (reducir gastos energéticos). - Generar celulosa activa (reducir la cristalinidad de la celulosa, apta para los posteriores procesos de hidrólisis y fermentación). - Desacoplar las hemicelulosas y maximizar el rendimiento de pentosas en forma no degradada. I. Introducción  27  - Obtener hidrolizados con un bajo nivel de inhibidores, y minimizar las pérdidas de nutrientes necesarios para la fermentación. - Emplear reactores con una alta carga de sólidos por volumen. - Minimizar los vertidos y contaminantes residuales. Entre los distintos pretratamientos existentes, se puede distinguir los pretratamientos físicos, químicos, físico-químicos, así como los pretratamientos biológicos que se describen a continuación. Pretratamientos físicos Los pretratamientos físicos, tales como la trituración mecánica, la pulverización por martilleo y la extrusión, buscan romper la estructura lignocelulósica y reducir el tamaño de partícula y cristalinidad de la celulosa con el fin de aumentar la superficie específica y reducir el grado de polimerización. En general, los pretratamientos físicos son efectivos, pero son largos y/o costosos. La energía necesaria para la reducción del tamaño de las partículas puede alcanzar hasta una tercera parte de la energía total necesaria para la producción de bioetanol (Aden et al. 2002; US Department of Energy 1993). Pretratamientos químicos - Pretratamientos alcalinos Estos pretratamientos aumentan la digestibilidad de la celulosa y son más eficaces que los procesos ácidos o hidrotermales para la solubilización de la lignina (Carvalheiro et al. 2008). El pretratamiento alcalino puede llevarse a cabo a temperatura ambiente y tiempos que van de segundos a días. Causan una menor degradación del azúcar que el pretratamiento ácido y ha demostrado ser más eficaz en residuos agrícolas que en los materiales de madera (Kumar et al. 2009). Sin embargo, la posible pérdida de azúcares fermentables y la producción de compuestos inhibidores debe ser tomada en consideración para optimizar las condiciones de pretratamiento. Hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de calcio e hidróxido de amonio son pretratamientos alcalinos adecuados. La adición de un agente oxidante (oxígeno/H2O2) para el tratamiento previo alcalino (NaOH/Ca(OH)2) puede mejorar el rendimiento al favorecer la eliminación de la lignina (Carvalheiro et al. 2008). - Pretratamientos ácidos El objetivo principal de los pretratamientos ácidos es solubilizar la fracción de hemicelulosa para hacer que la celulosa sea más accesible a las enzimas. Este tipo de tratamientos previos se pueden realizar con ácido concentrado o diluido pero la utilización de ácido concentrado es menos atractivo debido a la formación de compuestos I. Introducción  28  inhibidores y la corrosión de reactores y equipos. Los altos costos de operación y mantenimiento reducen el interés de la aplicación del pretratamiento con ácido concentrado a escala comercial (Wyman 1996). El tratamiento previo con ácido diluido aparece como método más favorable para aplicaciones industriales. Se han obtenido rendimientos altos con ácido sulfúrico, que es el ácido más estudiado. Los ácidos clorhídrico, fosfórico y nítrico también se han probado (Mosier et al. 2005a). Ácidos orgánicos tales como ácido fumárico o maleico están apareciendo como alternativas para mejorar la hidrólisis de la celulosa. - Ozonólisis El ozono es un potente oxidante que muestra una alta eficacia en la deslignificación (Sun y Cheng 2002). Este pretratamiento no conduce a la formación de compuestos inhibidores que puedan afectar a la posterior hidrólisis y fermentación. Un inconveniente importante a considerar es la gran cantidad de ozono necesario, que puede hacer que el proceso sea económicamente inviable (Sun y Cheng 2002). - Organosolv Consiste en la utilización de mezclas de disolventes orgánicos o acuosos, tales como metanol, etanol, acetona, glicol de etileno y alcohol tetrahidrofurfurílico, con el fin de solubilizar la lignina y proporcionar celulosa adecuada para la hidrólisis enzimática (Zhao et al. 2009). La principal ventaja del proceso organosolv es la recuperación de la lignina relativamente pura como un subproducto (Zhao et al. 2009). Los solventes deben ser separados, ya que podrían tener efectos inhibidores en la hidrólisis enzimática y los microorganismos fermentativos (Sun y Cheng 2002). El alto precio de los disolventes es otro factor importante a considerar para aplicaciones industriales. - Líquidos iónicos Los líquidos iónicos son sales con una temperatura de fusión por debajo del punto de ebullición del agua. Típicamente están compuestos de cationes orgánicos y aniones inorgánicos. Los líquidos iónicos son conocidos como disolventes “verdes” dado que no forman gases tóxicos o explosivos. Los hidratos de carbono y la lignina se pueden disolver de forma simultánea en los líquidos iónicos, como resultado, las interacciones no covalentes entre los polímeros de celulosa, hemicelulosas y lignina se interrumpe eficazmente y reduce al mínimo la formación de productos de degradación. Para la aplicación a gran escala de los líquidos iónicos, el desarrollo de métodos de reciclado es un requisito indispensable. Las técnicas deben ser desarrolladas para recuperar hemicelulosas y lignina de las soluciones después de la extracción de la celulosa (Hayes 2009). I. Introducción  29  Pretratamientos físico-químicos - Explosión con vapor Es el pretratamiento físico-químico más ampliamente empleado. La explosión con vapor consiste básicamente en calentar el material lignocelulósico en un reactor con vapor a alta presión (20-50 bares, 210-290ºC) durante unos minutos. Después, la bajada brusca de la presión hace expandir el vapor dentro de la biomasa para facilitar la impregnación de agua en la matriz lignocelulósica. Los factores más importantes que afectan a la explosión con vapor son el tamaño de partícula, temperatura, tiempo de residencia y el efecto combinado de la temperatura y el tiempo. Cabe destacar como características más atractivas el menor impacto ambiental, menor inversión de capital, mayor potencial de eficiencia energética, productos químicos y condiciones del proceso menos peligrosas y la recuperación completa de los carbohidratos (Avellar y Glasser 1998). Aunque la posibilidad de evitar catalizadores ácidos se considera una ventaja, la adición de un catalizador ácido ha sido también descrito como una manera de aumentar la digestibilidad de la celulosa, para mejorar la hidrólisis de la hemicelulosa y, dependiendo de la temperatura, para disminuir la producción de compuestos de degradación (Sun y Cheng 2002). Los principales inconvenientes de la explosión con vapor son la degradación parcial de la hemicelulosa y la generación de algunos compuestos tóxicos que pudieran afectar a las siguientes etapas de hidrólisis y fermentación (Oliva et al. 2003). - Agua líquida caliente Se basa en aplicar presión para mantener el agua en estado líquido a temperaturas elevadas (160-240ºC) y provocar alteraciones en la estructura lignocelulósica. El objetivo principal es solubilizar la hemicelulosa para hacer que la celulosa sea más accesible y para evitar la formación de inhibidores. En general, este pretratamiento es atractivo debido a que no requiere la presencia de catalizador, construcción de reactores de bajo costo a causa del bajo potencial de corrosión y baja concentración de hemicelulosa solubilizada y productos de lignina. Sin embargo, el agua exigida en el proceso y los altos requisitos energéticos hacen que no se desarrolle a escala comercial. - Explosión amoniacal de la fibra (AFEX) En el proceso AFEX se emplea amoníaco a temperaturas entre 60- 100ºC, y alta presión durante un período de tiempo variable. Se libera la presión, lo que resulta en una rápida expansión del amoníaco que causa inflamación y ruptura física de las fibras de la biomasa y descristalización parcial de la celulosa. Recuperar y reciclar el amoníaco es factible a pesar de su alta volatilidad (Teymouri et al. 2005), pero la complejidad asociada y los costes de recuperación del I. Introducción  30  amoníaco pueden ser significativos en relación con el potencial comercial del pretratamiento AFEX (Eggeman y Elander 2005; Mosier et al. 2005b). Una de las principales ventajas es que no hay formación de inhibidores. En condiciones óptimas el proceso AFEX puede conseguir una conversión de más del 90% de celulosa y hemicelulosas en azúcares fermentables. Otro tipo de proceso que utiliza el amoníaco es conocido como percolación reciclada de amoníaco en el que el amoníaco acuoso (5-15% en peso) pasa a través de un reactor relleno con biomasa. Un reto importante para este proceso es disminuir la carga de líquido o la temperatura del proceso para reducir el costo de la energía. - Oxidación húmeda La oxidación húmeda es un pretratamiento oxidativo que emplea oxígeno o aire como catalizador. La oxidación se lleva a cabo durante 10-15 minutos a temperaturas desde 170 hasta 200ºC y a presiones de 10 a 12 bares de O2 (Olsson et al. 2005). En general, se logra una formación de inhibidores baja y una eliminación eficaz de la lignina. - Pretratamiento con microondas Este pretratamiento se lleva a cabo por la inmersión de la biomasa en reactivos químicos diluidos y exponiendo la suspensión a la radiación de microondas por tiempos de residencia que varían de 5 a 20 minutos (Keshwani 2009). - Pretratamiento con ultrasonido El efecto de los ultrasonidos sobre la biomasa lignocelulósica se ha empleado para la extracción de celulosa, hemicelulosas y lignina. Algunos investigadores han demostrado que la sacarificación de la celulosa se ha mejorado de manera eficiente por el pretratamiento ultrasónico (Yachmenev et al. 2009). - Explosión con CO2 Su metodología es igual a la del pretratamiento de explosión con vapor, pero con la adición de dióxido de carbono (CO2). El CO2 formaría ácido carbónico aumentando la velocidad de hidrólisis. En la práctica, este pretratamiento no ha ofrecido mejores rendimientos que otros similares; sin embargo, tiene la ventaja de que no forma compuestos inhibitorios como en el caso de la explosión con vapor (Sun y Cheng 2002). Pretratamientos biológicos Además de los pretratamientos físicos, químicos y físico-químicos, existen pretratamientos biológicos que usan hongos y enzimas. Estos pretratamientos se describen con más detalle en el apartado I.3. I. Introducción  31  Hidrólisis La hidrólisis o sacarificación consiste en la rotura de los carbohidratos, presentes en los materiales lignocelulósicos (celulosa y hemicelulosas), en sus azúcares individuales (glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, etc.). La hidrólisis se puede llevar a cabo química o enzimáticamente. En la hidrólisis ácida, el ácido sulfúrico y el ácido clorhídrico son ácidos potenciales para la hidrólisis de materiales lignocelulósicos (Aguilar et al. 2002). Sin embargo, el uso de estos ácidos concentrados conlleva un determinado nivel de corrosión en los reactores y además son tóxicos, corrosivos y peligrosos (Velmurugan y Muthukumar 2011). Por este motivo, se han desarrollado procesos de hidrólisis enzimática, mediante el uso de celulasas que atacan a las fibras de celulosa de los tejidos vegetales (Bhat 2000). Estas enzimas son producidas por hongos como Trichoderma reesei y Aspergillus niger y/o bacterias, tales como Clostridium cellulovorans (Arai et al. 2006). La mayoría de investigaciones para la producción de celulasas comerciales se han centrado en los hongos ya que la mayoría de las bacterias relevantes son anaerobias con una baja tasa de crecimiento. Debido a las características de la celulosa no es posible obtener glucosa a partir de celulosa por la acción directa de un solo tipo de celulasas (Wyman 1996). Para ello es necesario la acción de diferentes tipos de celulasas (endoglucanasas, exo-glucanasas y β-glucosidasas) que actúan sinérgicamente sobre la celulosa (Wright 1988). La endo-glucanasa y la exo-glucanasa rompen los fragmentos de celulosa por el interior y los extremos, respectivamente, en moléculas de celobiosa que a continuación se dividen por la acción de la β-glucosidasa en glucosas individuales. El pretratamiento de materiales celulósicos y las condiciones en la que se realiza la hidrólisis, como temperatura y pH, se encuentran entre los factores que más influyen en la eficiencia de la hidrólisis enzimática. A menudo en los estudios de laboratorio se utilizan dosis de celulasas de 10 FPU/g y de β-glucosidasa de 500 nkat/g, ya que resulta una hidrólisis eficaz con un alto rendimiento de glucosa en un tiempo (48-72 horas) y coste de enzima razonable. Fermentación La conversión a bioetanol se lleva a cabo por fermentación de los monosacáridos (pentosas y hexosas) liberados por la hidrólisis. La fermentación se produce mediante el uso de microorganismos apropiados. El microorganismo ideal debe tener una amplia aplicación sobre diferentes sustratos, alto rendimiento y productividad de etanol, tolerancia a los inhibidores presentes en los hidrolizados y a altas concentraciones de etanol, y capacidad para fermentar azúcares a altas temperaturas (Hahn-Hägerdal et al. 2007). Los microorganismos más I. Introducción  32  usados para la producción de etanol son la levadura Saccharomyces cerevisiae y la bacteria Zymomona mobilis (Claassen et al. 1999) que ofrecen altos rendimientos de etanol (90-97%) y alta tolerancia al etanol. El proceso de hidrólisis enzimática y la fermentación se puede realizar utilizando diferentes estrategias: hidrólisis y fermentación separada (SHF), hidrólisis y fermentación simultáneas (SSF) y conversión microbiana directa (DMC). En SHF, la hidrólisis y la fermentación se llevan a cabo en recipientes separados bajo sus propias condiciones óptimas, sin embargo, con este proceso está asociado la inhibición de la actividad enzimática por parte del producto final y los problemas de contaminación. Con el fin de eliminar los inconvenientes del proceso de SHF, se ha desarrollado el proceso SSF, que combina la hidrólisis y la fermentación en un mismo recipiente. Los azúcares producidos durante la hidrólisis se fermentan inmediatamente a etanol y por lo tanto, se pueden evitar los problemas asociados con la acumulación de azúcar, la inhibición de la enzima, así como la contaminación (Galbe y Zacchi 2002; Ohgren et al. 2007). Otra ventaja de la SSF sobre SHF es la reducción de costes debido al uso de un solo reactor. El principal inconveniente de SSF son las diferentes temperaturas óptimas de los procesos de hidrólisis y fermentación. La mayoría de las levaduras de fermentación tienen una temperatura óptima alrededor de 30-35°C, mientras que las enzimas que hidrolizan muestran actividades óptimas alrededor de 50°C (Kadar et al. 2004). En DMC no se añade la enzima de manera externa, sino que el proceso de hidrólisis está mediado por las enzimas producidas por los microorganismos (Demirbas 2005). Los azúcares generados son convertidos inmediatamente en etanol. El proceso de conversión microbiana directa tiene la desventaja de un bajo rendimiento en etanol. I.2.3. Problemas que limitan el aprovechamiento industrial de los materiales lignocelulósicos Algunos de los componentes presentes en los materiales lignocelulósicos como la lignina y los lípidos pueden limitar su aprovechamiento industrial. Problemática de la lignina Como se ha mencionado anteriormente, la lignina forma un conglomerado con los carbohidratos formando una barrera que evita el acceso a la celulosa. En la producción de biocombustibles a partir de lignocelulosa, la presencia de lignina supone un problema, ya que obstaculiza el acceso de las enzimas hidrolíticas (celulasas y βglucosidasa) a los carbohidratos. I. Introducción  33  Por otro lado, la lignina es responsable del color oscuro de las pastas químicas de celulosa, un problema que se ha agravado debido a la utilización de reactivos de blanqueo menos agresivos. Problemática de los lípidos En la industria papelera existe otro problema relacionado con los extraíbles lipofílicos presentes en los materiales lignocelulósicos. Estos compuestos forman unos depósitos comúnmente denominados depósitos de pitch, que afectan negativamente al proceso de fabricación de pasta de celulosa dando lugar a importantes pérdidas económicas por depositarse en las máquinas de papel (que obligan a realizar paradas en la producción) y en la misma pasta (que da lugar a pastas contaminadas) (Allen 1980; Hillis y Sumimoto 1989; Back y Allen 2000), reduciendo drásticamente la calidad del producto final (Figura 20). Además, algunos compuestos lipofílicos también tienen un impacto negativo sobre el medio ambiente, considerándose tóxicos cuando se liberan en los vertidos (Ali y Sreekrishnan 2001; Rigol et al. 2004). Estos problemas se han agravado debido a la utilización de reactivos de blanqueo menos agresivos. Cuando anteriormente se utilizaban reactivos clorados, muchos de estos compuestos lipofílicos se degradaban o estaban presentes en concentraciones más bajas. Figura 20. Imagen de resina en un árbol (izquierda) y de un depósito de pitch en una pasta kraft TCF (derecha). I. Introducción  34  I.3. BIOTECNOLOGÍA EN LA BIORREFINERÍA DE LA LIGNOCELULOSA La eliminación de la lignina y los lípidos es una cuestión técnica importante en la producción de celulosa en la industria papelera y la deslignificación un desafío clave para la conversión de material lignocelulósico en combustibles líquidos como el bioetanol de segunda generación. En la actualidad, se elimina la lignina y los lípidos mediante el uso de tratamientos físicos, químicos o físico-químicos caracterizados por su alto consumo energético y su impacto negativo sobre el medio ambiente. A diferencia de ellos, los procesos biotecnológicos, como los tratamientos con hongos y con enzimas, ofrecen la posibilidad de usar tecnologías respetuosas con el medio ambiente y de gran interés desde un punto de vista industrial. Aunque muchas de las aplicaciones enzimáticas están aún en estado de investigación y desarrollo, algunas ya han comenzado a aplicarse en la industria. I.3.1. Biodegradación de lignina y lípidos con hongos Entre los hongos capaces de degradar la lignina están algunos hongos ascomicetos, como Chrysonilia sitophyla (Rodríguez et al. 1997), y deuteromicetos, como Fusarium proliferatum (Regalado et al. 1997). Estos hongos producen un tipo de degradación denominada podredumbre blanda que, generalmente, tiene lugar en angiospermas con un alto porcentaje de humedad y sobre materiales que ya han comenzado a ser degradados por otros microorganismos (Blanchette 1995; Daniel 2003). Sin embargo, los basidiomicetos de podredumbre blanca constituyen el grupo más hábil de microorganismos a la hora de llevar a cabo una eliminación rápida y efectiva de la lignina con una mínima pérdida de celulosa (Kirk y Farrell 1987). El término podredumbre blanca hace referencia al aspecto que presenta la madera tras su colonización: la eliminación de la lignina hace que adquiera una tonalidad más blanquecina y un aspecto fibroso debido a la exposición de la celulosa (Martínez et al. 2011). Estos hongos de podredumbre blanca, durante su crecimiento en la naturaleza utilizan dos sistemas enzimáticos extracelulares para degradar la biomasa lignocelulósica: un sistema hidrolítico (produce hidrolasas) que degradan los polisacáridos, y un sistema ligninolítico oxidativo, que degrada la lignina (Sánchez 2009). En la mayoría de los casos, la eliminación de lignina por hongos de podredumbre blanca es paralela a la degradación de polisacáridos, en el llamado patrón de degradación simultánea (Otjen y Blanchette 1986). Sin embargo, unas pocas especies de hongos de podredumbre blanca son capaces de eliminar la lignina sin causar una pérdida significativa de polisacáridos, en un patrón llamado de degradación selectiva, de mayor interés biotecnológico. Por otro lado, los hongos de podredumbre parda han desarrollado una estrategia de degradación diferente al ser capaces I. Introducción  35  de degradar la mayor parte de la celulosa y hemicelulosas, dejando el polímero de lignina intacto. La madera se enriquece en lignina y presenta un color desde marrón rojizo oscuro a dorado, y de ahí su nombre (Martínez et al. 2011). El pretratamiento con hongos de podredumbre blanca para la eliminación de la lignina durante la producción de pasta de papel supone una alternativa al tratamiento químico del material lignocelulósico, dando lugar a un tipo de pasta de papel denominada como biomecánica (Kirk et al. 1992). Este pretratamiento supone una serie de ventajas energéticas, físicoquímicas y medioambientales en la producción de este tipo de pasta (Akhtar et al. 1998). El tiempo de tratamiento debe de ser suficiente para reducir el contenido en lignina, sin ser excesivo, para evitar la pérdida de celulosa. Con la utilización de hongos ligninolíticos como Ceriporiopsis subvermispora se han conseguido ahorros de hasta un 40% de energía en el refino y una disminución de la toxicidad de los efluentes durante el tratamiento de maderas de coníferas y frondosas (Blanchette et al. 1990; Akhtar et al. 1993). Los hongos del género Pleurotus también se han estudiado para su posible utilización en el pretratamiento de paja de trigo como materia prima alternativa para la fabricación de pasta de papel (Martínez et al. 1994). En estos estudios se comprobó que algunas especies del género Pleurotus eran capaces de degradar la lignina sin alterar significativamente el contenido en polisacáridos de la paja de trigo. Su utilización, especialmente en el caso de P. eryngii, supondría un ahorro en reactivos químicos y energía empleados durante la fabricación de pasta semiquímica a partir de estos residuos (Camarero et al. 1998). Por otro lado, los pretratamientos biológicos para la producción de biocombustibles de segunda generación emplean organismos, principalmente hongos de podredumbre blanca, parda y blanda que degradan la lignina y la hemicelulosa y muy poco la celulosa, más resistente que el resto de componentes (Sánchez 2009), siendo los hongos de podredumbre blanca los microorganismos más eficaces. El uso de Phanerochaete chrysosporium, uno de los hongos de podredumbre blanca mejor estudiados debido a su capacidad para degradar la lignina, tiene el inconveniente que requiere condiciones especiales de crecimiento para degradar la lignina (Kirk y Farrell 1987). Sin embargo, P. eryngii e Irpex lacteus, son hongos de podredumbre blanca capaces de crecer bajo condiciones menos restrictivas y degradar residuos lignocelulósicos de modo que puedan ser convertidos en etanol (Cohen et al. 2002; Salvachúa et al. 2013). También, los problemas de pitch originados durante la producción de pasta de papel, y que han aumentado debido al uso de tecnologías más respetuosas con el medio ambiente y a la recirculación de las aguas de proceso, se han intentado solucionar mediante la utilización de microorganismos (Behrendt y Blanchette 1997; Farrell et al. 1993; Gao et al. 1994; Gutiérrez et al. 1999, 2001a). Entre estos microorganismos se II. Objetivos  45  La presente Tesis aborda el estudio y desarrollo de tratamientos biotecnológicos aplicados a materiales lignocelulósicos, para obtener un mejor aprovechamiento industrial de los mismos utilizando tecnologías menos contaminantes. Se presta un interés especial a la eliminación/modificación de los extraíbles lipofílicos y al polímero de lignina, ya que ambos constituyentes presentan especial relevancia cuando se utiliza el material lignocelulósico para la producción de pasta y papel, y para la fabricación de biocombustibles de segunda generación como el bioetanol. Los objetivos específicos de esta Tesis son los siguientes: - Desarrollar tratamientos enzimáticos basados en el sistema lacasamediador que permitan degradar tanto la lignina residual como los compuestos extraíbles lipofílicos presentes en las pastas de celulosa. - Desarrollar tratamientos enzimáticos basados en el sistema lacasamediador que permitan degradar la lignina presente en los materiales lignocelulósicos procedentes de cultivos de crecimiento rápido, tanto madereros (eucalipto) como no madereros (hierba elefante), y así mejorar el rendimiento de la sacarificación enzimática, con vistas a la producción de bioetanol de segunda generación. - Estudiar las modificaciones estructurales que tienen lugar en el polímero de lignina durante diferentes tratamientos enzimáticos mediante la utilización de la Resonancia Magnética Nuclear bidimensional. III. Materiales y Métodos  49  III.1. MATERIALES III.1.1. Cultivos lignocelulósicos En la presente Tesis se ha utilizado muestras de eucalipto (Eucalyptus globulus) y hierba elefante (Pennisetum purpureum). El eucalipto (Eucalyptus) es un género perteneciente a la familia Myrtaceae, orden Myrtales, clase Magnoliopsida (dicotelidóneas) de la división Magnoliophyta. El eucalipto es un árbol de crecimiento rápido. En general, no necesita un suelo con alta fertilidad pero sí con buen drenaje. La especie Eucalyptus globulus conocido como gomero azul de Tasmania o eucalipto blanco, es originario del sudeste de Australia y Tasmania. Con una altura comprendida generalmente entre 30-55 m y una anchura de hasta 2 m de diámetro, es una de las especies con más interés industrial, porque su madera tiene una densidad alta (550 kg/m3), con bajo contenido en lignina y compuestos extraíbles. La madera de eucalipto (E. globulus) utilizada en esta Tesis fue suministrada por la empresa papelera ENCE (Pontevedra, España). La hierba elefante (P. purpureum) es una planta perteneciente a la familia Poaceae, orden Cyperales, clase Liliopsida (monocotelidóneas) de la división Magnoliophyta. No se debe confundir con la especie Miscanthus giganteus, también llamada a veces hierba elefante. Este cultivo, con origen en África, ha sido introducido en muchas zonas tropicales y subtropicales. La hierba elefante crece rápidamente, su altura puede alcanzar hasta 3 m, y llega a producir hasta 45 toneladas de biomasa por hectárea anualmente (Woodard y Prine 1993). Por este motivo, la hierba elefante representa un recurso lignocelulósico atractivo, tanto para la producción de bioenergía y biomateriales, como para la producción de papel. La hierba elefante (P. purpureum) utilizada en esta Tesis fue suministrada por la Universidad Federal de Viçosa (Brasil). Tanto el eucalipto (E. globulus) como la hierba elefante (P. purpureum) se secaron al aire y se molieron en un molino de cuchillas IKA MF10 pasado por un tamiz de malla Nº 100. Después se pulverizaron finamente en un molino planetario Retsch PM100 (Retsch, Haan, Alemania) a 400 rpm (con 5 min de pausa después de cada 5 min de molienda), utilizando un frasco de ágata de 500 mL y unas bolas de ágata (20 x 20 mm). El tiempo total del molino de bolas para las muestras fue de 5 h. III.1.2. Pastas de celulosa La pasta kraft cruda (no blanqueada) de eucalipto (E. globulus) utilizada en la presente Tesis fue suministrada por ENCE (Pontevedra, España). III. Materiales y Métodos  50  La madera de E. globulus utilizada en la cocción kraft se obtuvo de árboles de la especie de 12 a 14 años procedentes de las plantaciones de ENCE. La cocción kraft de las astillas se realizó en un digestor Lorentzen & Wettre 165ºC (50 min), con una relación licor/madera de 3.5, 25% de sulfidez y un 16% de álcali activo. Las características particulares de la pasta kraft son: número kappa de 15.5 (~ 2,3% de contenido de lignina), blancura % ISO de 38.5% y viscosidad intrínseca de 1187 mL/g. III.1.3. Enzimas Se utilizaron una lacasa comercial del hongo ascomiceto Myceliophthora thermophila y una lacasa del hongo basidiomiceto Trametes villosa, ambas proporcionadas por Novozymes (Bagsvaerd, Dinamarca), y una lacasa obtenida de una cepa hiperproductora del basidiomiceto Pycnoporus cinnabarinus, proporcionada por Beldem (Andenne, Bélgica). Las actividades de cada una de las preparaciones enzimáticas fueron 954U/ml, 204 U/ml y 45 U/ml, respectivamente. Las actividades de las lacasas se valoraron midiendo la oxidación del ácido 2,2-azino-bis (3- etilbenzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS) 5mM tamponado con acetato sódico 0.1 M (pH 5) a 24ºC. La formación del radical catiónico del ABTS se midió a 436 nm (ε436 = 29300 M-1cm-1). Una unidad actividad enzimática se define como la cantidad de enzima que transforma 1 µmol de ABTS por minuto. III.1.4. Mediadores Los compuestos utilizados como mediadores de la lacasa fueron el mediador sintético HBT (1-hidroxibenzotriazol), suministrado por Sigma- Aldrich (Steinheim, Alemania); y los mediadores naturales siringaldehído (4-hidroxi-3,5-dimetoxibenzaldehído), también suministrado por Sigma- Aldrich (Steinheim, Alemania), y siringato de metilo (metil-3,5-dimetoxi-4- hidroxibenzoato), suministrado por Alfa Aesar (Karlsruhe, Alemania). III.2. MÉTODOS ANALÍTICOS III.2.1. Evaluación de las propiedades de las pastas Determinación de la blancura y de la viscosidad intrínseca Las blancura y la viscosidad intrínseca de las pastas se estimaron mediante los métodos estándar ISO (International Organization for Standardization Documentation and Information 2003) 3688:1999 y III. Materiales y Métodos  51  5351/1:1981, respectivamente. Estas medidas fueron realizadas en ENCE (Pontevedra, España). Determinación del índice kappa El procedimiento estándar utilizado en la industria para determinar el grado de deslignificación en una pasta química es la determinación del índice kappa por la norma TAPPI T 236 cm-85 (Tappi 2006) y consiste en el volumen en mL de una disolución de KMnO4 0,1 N consumido por 1 g de pasta. La lignina de la pasta reacciona con el permanganato y la cuantificación del permanganato consumido se determina por titulación con tiosulfato de sodio. Con ayuda de una batidora de mano, se desintegraron los gramos de pasta necesarios para el ensayo (Tabla 2) en 140 mL de agua destilada y se lavó el pie de la batidora con 50 mL de agua. Con agitación constante, se adicionó una mezcla de 25 mL de KMnO4 0,1 N y 25 mL de H2SO4 0,2 N. Al cabo de 5 min se midió la temperatura y después de 10 min se paró la reacción con 5 mL de KI 1,0 N, se colocaron unas gotas de solución indicadora de almidón al 0,2% y se valoró el I2 liberado con una disolución de Na2S2O3 0,2 N. Previamente, se realizó siempre un ensayo en blanco que no contenía pasta. El índice kappa se calculó por la expresión: IK = 1 + 0,013(25 – t) p = IK: índice kappa p: volumen de permanganato de potasio 0,1 N consumido en el ensayo (mL) f: factor de corrección para un consumo de 50% de permanganato de potasio y que depende de p (Tabla 3) w: peso de pasta seca (g) b: volumen consumido de tiosulfato de sodio para determinación del blanco (mL) a: volumen consumido de tiosulfato de sodio para determinación de la muestra (mL) N: normalidad de la disolución de tiosulfato de sodio t: temperatura del medio de reacción (ºC) 0,1 (b – a)N w p x f III. Materiales y Métodos  52  Tabla 2. Peso de pasta ideal (c/ ≈ 7,5% humedad) para la determinación del índice kappa. Adaptado de un documento realizado por Armindo Gaspar de la Universidad de Aveiro. IK peso ideal/g peso seco/g 70,0 0,190 0,176 65,0 0,204 0,189 60,0 0,221 0,205 55,0 0,242 0,224 50,0 0,266 0,246 45,0 0,295 0,273 40,0 0,332 0,308 35,0 0,380 0,351 30,0 0,443 0,410 25,0 0,531 0,492 20,0 0,664 0,615 19,0 0,699 0,647 18,0 0,738 0,683 17,0 0,781 0,724 16,0 0,830 0,769 15,0 0,886 0,820 14,0 0,949 0,879 13,0 1,022 0,946 12,0 1,107 1,025 11,0 1,208 1,118 10,0 1,328 1,230 9,0 1,476 1,367 8,0 1,661 1,538 7,0 1,898 1,757 6,0 2,214 2,050 5,0 2,657 2,460 4,0 3,321 3,705 3,0 4,428 4,100 2,0 6,642 6,150 1,0 13,284 12,300 III. Materiales y Métodos  53  Tabla 3. Factores f de corrección del consumo de permanganato usado en la determinación del índice kappa (Tappi 2006). f+ 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 30 0,958 0,960 0,962 0,964 0,966 0,968 0,970 0,973 0,975 0,997 40 0,979 0,981 0,983 0,985 0,987 0,989 0,991 0,994 0,996 0,998 50 1,000 1,002 1,004 1,006 1,099 1,011 1,013 1,015 1,017 1,019 60 1,002 1,024 1,026 1,028 1,030 1,033 1,035 1,037 1,039 1,042 70 1,004 III.2.2. Aislamiento y análisis de los compuestos lipofílicos El análisis de los compuestos extraíbles lipofílicos de las pastas de celulosa requiere su aislamiento previo. Para ello, se extrajeron con acetona en un extractor de tipo Soxhlet durante 8 h. A continuación se evaporó el disolvente a sequedad en un rotavapor y la cantidad de extracto se determinó por gravimetría. Los extractos lipofílicos obtenidos se redisolvieron en CHCl3 para su posterior análisis por cromatografía de gases (GC) y cromatografía de gases/espectrometría de masas (GC/MS). En el análisis de lípidos mediante GC y GC/MS, las características de las columnas cromatográficas utilizadas fueron las adecuadas para poder separar e identificar compuestos de alto peso molecular como ceras, ésteres de esteroles, triglicéridos, etc. Previamente se habían realizado estudios sobre procedimientos para el análisis de los extractos lipofílicos de maderas por GC y GC/MS (Gutiérrez et al. 1998, 2004) donde se usaron columnas cortas. En estos estudios, las columnas capilares seleccionadas para el análisis de lípidos por GC fueron de longitud corta (de 5 m) ya que proporcionan una conveniente elución y separación de lípidos de alto peso molecular (Wakeham y Frew 1982; Lusby et al. 1984; Evershed et al. 1989; Sitholé et al. 1992; Örså y Holmbom 1994), además de que el análisis se realiza en un corto período de tiempo (20 min). En nuestro caso, los análisis cromatográficos de los extractos se llevaron a cabo en un cromatógrafo de gases Agilent 6890N equipado con un detector de ionización de llama (FID) y una columna capilar DB- 5HT (J&W; 5 m x 0.25 mm ID y 0.1 µm de espesor de película). El programa de calentamiento del horno comenzó a 100°C (1 min), seguido de un incremento de temperatura hasta 350°C (3 min) a 15ºC/min. Las temperaturas del inyector y del detector se mantuvieron a 300°C y 350°C, respectivamente. El gas portador que se utilizó fue Helio y la inyección se realizó en modo splitless. En el caso de los análisis por GC/MS, los cromatogramas obtenidos tienen que ser reproducibles con los obtenidos por GC usando columnas III. Materiales y Métodos  54  capilares de 5 m para identificar los diferentes compuestos. No obstante, en el sistema GC/MS, debido a las condiciones de alto vacío a las que opera, no se pueden usar columnas tan cortas, utilizándose normalmente columnas de 10-15 m. En nuestro caso, el análisis mediante GC/MS se llevó a cabo en un cromatógrafo de gases Varian Star 3800 acoplado a un detector de trampa de iones (ITD, Varian Saturn 4000), usando una columna capilar DB-5HT (J&W; 12 m x 0,25 mm ID, con espesor de película de 0,1 µm). El horno se calentó de 120°C (1 min) a 380°C (5 min) a 10ºC/min. La línea de transferencia se mantuvo a 300ºC. La temperatura del inyector se programó de 120ºC (0,1 min) a 380°C con una rampa de 200ºC/min y manteniéndose hasta el final del análisis. El gas portador utilizado fue Helio. La identidad de cada componente se determinó por comparación de sus espectros de masas con los espectros existentes en las librerías (Wiley y NIST) y con espectros publicados anteriormente, por sus fragmentaciones y, cuando fue posible, por comparación con patrones. III.2.3. Aislamiento enzimático de la lignina Para obtener una mayor comprensión de la modificación de la estructura de la lignina, ésta fue aislada enzimáticamente (CEL) del resto de constituyentes que forman el material lignocelulósico. Para el aislamiento, las muestras secas se extrajeron tres veces con agua y después tres veces con etanol al 80% por sonicación en un baño ultrasónico durante 30 min cada vez. Las preparaciones CEL fueron aisladas por sacarificación de los polisacáridos enzimáticamente como se ha descrito por Chang et al. (1975). Se utilizó Cellulysin® celulasa, una preparación de celulasa cruda de Trichoderma viride que también contiene actividad hemicelulasa. Su actividad era≥10,000 FPU/g de peso seco. El material libre de extractos molido con bolas (200 mg) fue suspendido en 30 mL de acetato de sodio 20 mM (pH 5) en tubos de centrífuga de 50 mL. Se añadió 7,5 mg de Cellulysin, y la reacción fue incubada a 30ºC durante 48 h. Los sólidos se sedimentaros por centrifugación (8000 rpm, 4ºC, 20 min), y se repitió el proceso con tampón y enzima nueva, tres veces. Por último, el residuo (CEL) se lavó con agua destilada, se recuperó por centrifugación y se liofilizó. III.2.4. Determinación de la fracción hidrosoluble El porcentaje de los compuestos hidrosolubles se determinó según la norma Tappi T 207 om-88 (Tappi 2004). Para ello, los cartuchos de los cultivos madereros y no madereros extraídos con acetona, una vez secos, se colocaron en matraces con 100 mL de agua destilada y se tuvieron en un baño a 100ºC durante 3 h, al cabo de las cuales el III. Materiales y Métodos  55  extracto se concentró en rotavapor y se secó a 100ºC para su determinación gravimétrica. III.2.5. Determinación del contenido en cenizas El contenido en cenizas se determinó mediante la norma Tappi 211 om- 85 (Tappi 2004). Para ello se depositaron 200 mg de cada una de las muestras en crisoles de porcelana previamente tarados y se introdujeron en la mufla a 575ºC durante 6 h. Para tararlos se limpiaron con HCl y se introdujeron en la mufla a 575ºC durante 1 h. Después de las 6 h en la mufla, se sacaron los crisoles y se pesaron una vez que alcanzaron la temperatura ambiente. Los contenidos en cenizas se expresaron como porcentajes de la materia prima inicial. III.2.6. Determinación del contenido en carbohidratos Determinación de azúcares neutros mediante hidrólisis enzimática Para la determinación de los azúcares neutros de la hierba elefante y la madera de eucalipto se incubó 30 mg de muestra con 3 mL de tampón citrato de sodio (100 mM, pH 5) y un coctel de enzimas (de Novozymes, Bagsvaerd) con celulasas (Celluclast 1.5L) y β-glucosidasa (Novozym 188) durante 72 h a 45ºC. Para una optimización del método se probaron varias dosis de celulasas (10, 5, 2 y 0.5 FPU/g) y de β-glucosidasa (500, 250, 100 y 25 nkat/g). A continuación, se diluyó la muestra hasta 14,4 mL para tomar 4,8 mL, lo que corresponde aproximadamente a 10 mg del material de partida. Posteriormente, se convierten los monosacáridos en alditoles, para su posterior análisis por GC. Para ello se añaden 200 µL de 2-desoxiglucosa, que actúa como patrón interno. Se pasa 1 mL del hidrolizado con el patrón interno a otro tubo, manteniéndolo en hielo, y se añaden 0,1 mL de NH3 conteniendo 150 mg/mL de NaBH4. Después de incubarse 1 h a 30ºC se añaden 50 µL de ácido acético glaciar en dos veces, para la descomposición del exceso de NaBH4. Por último tiene lugar la acetilación para convertir los monosacáridos en derivados volátiles (acetatos de alditol) para su análisis por GC. A 0,3 mL de la solución se le añaden 0,45 mL de 1-metilimidazol (catalizador) y 3 mL de anhídrido acético y se incubó 30 min a 30ºC. Después de enfriarse en hielo, se añaden 3,75 mL de agua destilada y 2,5 mL de diclorometano, para extraer los acetatos de alditol. Tras agitar se aspira la fase superior acuosa. Este proceso se repite una vez más con 3 mL de agua destilada y 2 mL de diclorometano, y tres veces más con solo 3 mL de agua destilada. Se evapora el diclorometano, se añade acetona y se vuelve a evaporar y se resuspende en cloroformo. La identificación y cuantificación de los diferentes monosacáridos liberados se llevó a cabo por GC. Se utilizó un cromatógrafo de gases Agilent 6890N equipado con IV. Resultados Generales y Discusión  65  En la presente Tesis se ha estudiado la capacidad de un sistema enzimamediador, formado por enzimas de tipo lacasas y mediadores tanto naturales como sintéticos, para la deslignificación y eliminación de lípidos de pastas de celulosa, así como para la deconstrucción enzimática de la pared celular vegetal de materiales lignocelulósicos para mejorar la sacarificación de los carbohidratos (y su posterior fermentación) con vistas a la producción de bioetanol de segunda generación. IV.1. DESLIGNIFICACIÓN Y ELIMINACIÓN ENZIMÁTICA DE LÍPIDOS EN PASTAS DE CELULOSA USANDO EL SISTEMA LACASAMEDIADOR En esta Tesis se ha estudiado la capacidad de la lacasa recombinante de Myceliophthora thermophila (MtL) para deslignificar pastas kraft de eucalipto, y simultáneamente eliminar los componentes lipofílicos de las materias primas causantes de los depósitos de pitch. Con este fin se realizaron tratamientos enzimáticos de pasta kraft de eucalipto con MtL (20 U/g) en presencia de dos mediadores fenólicos naturales (siringaldehído, SA y siringato de metilo, MeS), seguidos de una extracción alcalina con peróxido de hidrógeno. A continuación se evaluaron las propiedades de las pastas tras los tratamientos enzimáticos (antes y después de la extracción alcalina) evidenciándose una mejora de las mismas después de la extracción alcalina. Los mejores resultados se obtuvieron en los tratamientos que incluían MeS como mediador, obteniéndose una deslignificación de hasta el 25% y un aumento de la blancura del 15%. Por otro lado, se consiguió una eliminación simultánea de los compuestos lipofílicos presentes en la pasta de eucalipto (incluyendo esteroles, tanto libres como conjugados en forma de ésteres y de glicósidos), que son los principales responsables de la formación de depósitos de pitch durante la fabricación de pasta de papel a partir de madera de eucalipto (Gutiérrez et al. 2009). La mayor eliminación de los compuestos lipofílicos se alcanzó en el tratamiento con MtL en presencia de SA como mediador, produciéndose una disminución de hasta el 73% de esteroles libres, del 91% de esterol glicósidos y del 89% de ésteres de esteroles. Los resultados obtenidos son muy prometedores con vistas al posterior escalado de este tratamiento ya que se utiliza un sistema lacasa-mediador compuesto por una lacasa comercial (MtL) así como mediadores naturales de bajo coste económico. Con el fin de mejorar los resultados anteriores se estudió el efecto de la adición de un surfactante (Tween 20) en el tratamiento enzimático de las pastas de celulosa. El Tween 20 sólo contiene ácidos grasos saturados, a diferencia del Tween 80, que contiene ácidos grasos IV. Resultados Generales y Discusión  66  insaturados que pueden promover reacciones de peroxidación (Jensen et al. 1996). En estos estudios también se utilizó Tween 80 con fines comparativos ya que la mayoría de los estudios publicados sobre el uso del sistema lacasa-mediador en pastas de papel se han realizado en presencia de Tween 80 (Moldes y Vidal 2008; Fillat y Roncero 2010a; Fillat et al. 2010b). En cuanto las propiedades de las pastas tras la adición de Tween 20 y Tween 80, no se observaron diferencias significativas en la deslignificación entre los tratamientos enzimáticos realizados en ausencia y presencia de Tween. Sólo se observó una mejora en los valores de viscosidad de dichas pastas en los tratamientos con Tween 80 pero fueron acompañados de valores de blancura más bajos. También se evaluó el efecto de la adición de Tween en la eliminación de compuestos lipofílicos en la pasta de eucalipto. En general, la eliminación de sustancias lipofílicas no mejoró con respecto a aquellos tratamientos en los que no hubo adición de Tween. Sólo la eliminación de esteril glicósidos aumentó por la adición de Tween 20 y Tween 80 en los tratamientos con lacasa-MeS (degradación aproximadamente del 50% y 45%, respectivamente). También se realizaron tratamientos enzimáticos con la lacasa (no comercial) del basidiomiceto Pycnoporus cinnabarinus (PcL). Se aplicó a la pasta de eucalipto en presencia de los mediadores SA y MeS. A pesar de que PcL es una lacasa de alto potencial rédox, los resultados de blancura de las pastas tras estos tratamientos fueron similares a los obtenidos con MtL (de bajo potencial redox). Sin embargo, en tratamientos de pasta de eucalipto con PcL en presencia del mediador sintético HBT se obtuvieron mejores resultados de blancura (Camarero et al. 2007). Teniendo en cuenta que los principales obstáculos para la utilización a nivel industrial del sistema lacasa-mediador son los elevados costes de este sistema como consecuencia del uso de altas dosis de enzima y mediador, se evaluaron distintas dosis de enzima y de MeS. Se probaron dosis de MtL entre 1 y 20 U/g de pasta junto con concentraciones de MeS entre 0.6 y 6.7 mM. La Figura 28 muestra los resultados de blancura y deslignificación (como índice kappa) de las pastas (después de la extracción alcalina con peróxido de hidrógeno) obtenidos utilizando las diferentes dosis de lacasa y mediador. Aunque el mejor resultado de blancura y de índice kappa se obtuvo con la mayor dosis de lacasa y mediador, se observaron resultados muy prometedores a las dosis más bajas de enzima y MeS. Posteriormente se realizaron tratamientos de pasta en biorreactores de 200 mL (Labomat, Mathis), en condiciones parecidas a las de aplicación industrial, incluyendo oxígeno presurizado (4 bares) mientras que los anteriores tratamientos se habían llevado a cabo en matraces con burbujeo de oxígeno. En los tratamientos en biorreactor, se consiguió reducir la duración del tratamiento en más de un IV. Resultados Generales y Discusión  67  50% con una deslignificación y una mejora de la blancura similar a las obtenidas en matraz, incluso a la dosis más baja de enzima y mediador. Figura 28. Blancura e índice kappa de la pasta de eucalipto después del tratamiento con diferentes dosis de la lacasa de M. thermophila (desde 1 U/g hasta 20 U/g) y metilsiringato (desde 0.6 mM hasta 6.7 mM) seguido de una extracción alcalina con peróxido de hidrógeno, comparado con un control (sin enzima ni mediador). Cabe mencionar que este tratamiento se realizó a escala piloto en el “Centre Technique du Papier” (Grenoble, Francia), en un estudio en colaboración utilizando la dosis más baja de enzima y mediador. Con esta aplicación se obtuvieron resultados muy positivos, mejorando la calidad de las pastas y modificando todas las propiedades de las mismas positivamente (Burnet et al. 2011). IV.2. PRETRATAMIENTO ENZIMÁTICO DE MADERA DE EUCALIPTO Y HIERBA ELEFANTE CON LA LACASA DE TRAMETES VILLOSA Y EL MEDIADOR HBT En la presente Tesis se estudió por primera vez la capacidad de la lacasa de alto potencial redox de Trametes villosa (TvL) combinada con el mediador sintético HBT como pretratamiento de materiales lignocelulósicos madereros, como el eucalipto (Eucalyptus globulus), y no madereros, como la hierba elefante (Pennisetum purpureum), para eliminar y/o modificar la lignina, con el fin de facilitar la accesibilidad de Control 20 U 6.7 mM 40 50 60 70 6 8 10 12 ISO Brightness (%) Kappa number 10 U 3 mM 10 U 1 mM 5 U 1.7 mM 5 U 0.6 mM 2 U 1 mM 1 U 0.6 mM Laccase (U·g -1 ) and mediator (mM) doses Blancura (% ISO) Índice kappa Dosis de lacasa (U/g) y mediador (mM) IV. Resultados Generales y Discusión  68  las enzimas celulolíticas a los carbohidratos y por tanto mejorar el rendimiento de la sacarificación enzimática con vistas a la producción de bioetanol de segunda generación. Los pretratamientos se realizaron utilizando dosis diferentes de lacasas (10, 25 y 50 U/g) y una concentración fija (2.5%) del mediador HBT en una secuencia de 4 ciclos que incluía cuatro etapas enzimáticas en presencia de oxígeno seguidas (cada una de ellas) de una extracción alcalina con peróxido de hidrógeno. Tras la secuencia completa se determinó el contenido en lignina (como lignina Klason) de las muestras. Los mejores resultados se obtuvieron con las dosis más altas de enzima, consiguiéndose una eliminación de lignina de la madera de eucalipto de hasta un 48% y de un 32% en la hierba elefante. Por otro lado, se estudió la mejora en la sacarificación enzimática (con celulasas) de la madera de eucalipto y la hierba elefante pretratadas con el sistema lacasa-mediador TvL (25 U/g) y HBT. Las dosis de celulasas utilizadas fueron 10 FPU/g y 500 nkat/g de β-glucosidasa. En el caso de la madera de eucalipto la liberación de glucosa tras la hidrólisis enzimática se estabilizó después de 72 h, con un 61% más de rendimiento respecto al control en ese mismo tiempo. Sin embargo, en el caso de la hierba elefante la estabilización en la liberación de glucosa tuvo lugar tras 4 h de tratamiento con celulasas, aumentando el rendimiento en un 51% respecto al control. También se realizaron experimentos de sacarificación y fermentación simultánea con estas materias primas, obteniéndose la máxima cantidad de etanol durante las primeras 17 h, aunque se observó una ligera producción del mismo durante el período restante. Aunque en todos los casos los mayores rendimientos (en valor absoluto) de etanol se obtuvieron con la hierba elefante, el tratamiento enzimático fue más eficaz con la madera de eucalipto con una producción mayor de etanol (4 g/L en 17 h) que en el caso de la hierba elefante (2 g/L en 17 h). Por otro lado, se estudió en detalle la modificación estructural del polímero de lignina de la madera de eucalipto y de la hierba elefante durante los pretratamientos enzimáticos. Para ello, se usó un método desarrollado recientemente en nuestros laboratorios para analizar “in situ” los componentes estructurales de la madera (carbohidratos y lignina) por 2D-NMR (Figura 29) y que consiste en disolver el material vegetal finamente molido en dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-d6) formando un gel directamente en el tubo de NMR (Kim et al. 2008; Rencoret et al. 2009). Las principales subestructuras (enlaces) de lignina identificadas en las muestras de hierba elefante y eucalipto analizadas por HSQC NMR se muestran en la Figura 30. En el caso de la hierba elefante, los análisis de 2D-NMR revelaron un fuerte descenso de los enlaces β-O-4′ de la lignina durante los pretratamientos enzimáticos, e incluso su eliminación casi completa a la IV. Resultados Generales y Discusión 69 dosis más alta de enzima. Del mismo modo, las unidades siringilo (S) de la lignina disminuyeron fuertemente, mientras que aumentaron paralelamente las unidades S oxidadas. Los espectros mostraron una disminución preferente de las unidades guayacilo (G), en comparación con las unidades S, que prácticamente desaparecieron con la dosis más alta de enzima. Sin embargo, las señales de ácido p-cumárico permanecieron en el espectro a la dosis más alta de enzima. Por tanto, la lignina de la hierba elefante, que tiene una relación S/G alrededor de 1.2, se enriqueció en unidades S después del tratamiento enzimático. Este resultado fue inesperado, ya que en estudios anteriores de tratamientos de madera de eucalipto con hongos se había observado una disminución en la relación S/G de la lignina tras dichos tratamientos (del Río et al. 2002). La eliminación preferente de las unidades G observada en los tratamientos de esta tesis puede deberse a razones topológicas que favorezcan el acceso de los mediadores de la lacasa a las unidades G de la lignina, presentes en los vasos de las plantas (Musha y Goring 1975). Figura 29. Espectro HSQC NMR de la hierba elefante disuelta en dimetilsulfóxido deuterado mostrando las señales de lignina S y G, y el ácido p-cumárico en la región aromática, y las principales señales de enlaces (β-O-4′) y carbohidratos en la región alifática (oxigenada). 60 80 100 120 140 34567 δC δH PCA Lignina S Lignina G Carbohidratos Metoxilos Región alifática oxigenada Cadenas laterales de lignina Región aromática IV. Resultados Generales y Discusión  70  Por otro lado, los resultados de 2D-NMR de los pretratamientos enzimáticos de madera de eucalipto mostraron la desaparición de los enlaces β-O-4′ de la lignina, incluso a las dosis más bajas de enzima. Al igual que ocurría en la hierba elefante, las unidades G de lignina se degradaron preferentemente respecto de las unidades S, llegando a desaparecer completamente, incluso a las dosis más bajas de enzima, mientras la mayor parte de las unidades S se oxidaron. Por tanto, la lignina de la madera de eucalipto tratada enzimáticamente está enriquecida principalmente en unidades S oxidadas, al igual que ocurre durante el tratamiento enzimático de la hierba elefante. La mayor reducción del contenido de lignina de eucalipto con respecto a la hierba elefante durante el pretratamiento enzimático puede ser debida a la mayor relación S/G de la lignina de eucalipto (alrededor de 3.3) de acuerdo con estudios previos (Rencoret et al. 2008, 2011). Figura 30. Principales subestructuras (enlaces) de lignina identificadas en las muestras de hierba elefante y eucalipto analizadas por HSQC NMR: (A) subestructuras de lignina β-O-4′ (incluyendo una segunda unidad S o G), (PCA) ácido p-cumárico, (FA) ácido ferúlico, (H) unidades p-hidroxifenilo, (G) unidades guayacilo, (S) unidades siringilo y (S′) unidades S Cα-oxidada (R puede ser: OH = ácido terminal, C = cetona, H = aldehído terminal). IV. Resultados Generales y Discusión  71  IV.3. PRETRATAMIENTO ENZIMÁTICO DE MADERA DE EUCALIPTO CON LA LACASA DE MYCELIOPHTHORA THERMOPHILA Y SIRINGATO DE METILO Los estudios anteriores mostraron el gran potencial del sistema enzimamediador formado por la lacasa de T. villosa y el mediador HBT para la degradación de la lignina en materiales lignocelulósicos madereros y no madereros (Gutiérrez et al. 2012). Sin embargo, el elevado coste del HBT dificulta su aplicación industrial, y por eso en la presente Tesis se ha estudiado el uso de mediadores naturales, como el MeS, que muestra resultados prometedores debido a su precio más moderado y a un potencial rédox adecuado (Kulys et al. 2002). En estos pretratamientos, realizados con madera de eucalipto, se utilizó la lacasa de M. thermophila (MtL) (50 U/g) y MeS (3%) como mediador, y a continuación se realizó una extracción alcalina con peróxido en una secuencia de 4 ciclos. Los pretratamientos enzimáticos incluyeron cuatro etapas enzimáticas en presencia de oxígeno (etapas 1, 3, 5 y 7) seguidas (cada una de ellas) de una extracción alcalina con peróxido (etapas 2, 4, 6 y 8). Después de los 4 ciclos se consiguió una disminución en el contenido de lignina de la madera de eucalipto del 50%. Esta disminución en el contenido de lignina consiguió aumentar el rendimiento en la sacarificación enzimática, con una liberación de glucosa de casi el 40%, con respecto a la muestra de madera de eucalipto inicial (utilizando 2 FPU/g de celulasa y 100 nkat/g de β-glucosidasa). Por otro lado, se estudió en detalle las modificaciones estructurales producidas en la lignina durante las diferentes etapas del tratamiento enzimático mediante 2D-NMR de las muestras en estado de gel (Rencoret et al. 2007, 2009, 2011). Los análisis de 2D-NMR revelaron diferencias importantes en las muestras pretratadas enzimáticamente con respecto al control (Figura 31). Las principales subestructuras (enlaces) de lignina identificadas en la muestra de eucalipto analizadas por HSQC NMR se muestran en la Figura 30. En la etapa 3 (Figura 31D) se observó el mayor aumento de la señal de lignina S oxidada. Curiosamente, esta señal disminuyó en todos los casos con la extracción alcalina (etapas 2, 4, 6, 8; Figuras 31C, 31E, 31G, 31I). Después de dos ciclos de tratamientos lacasa-mediador y extracción alcalina (etapa 5; Figura 31F) se observó la ausencia total de unidades G y de subestructuras de tipo resinol, junto con una alta disminución de enlaces β-O-4′ en la lignina. Por último, tras los 4 ciclos de pretratamiento (Figura 31I) las señales de los enlaces β-O-4′ se redujeron considerablemente con respecto a las señales de carbohidratos y las de unidades S de lignina, destacando la formación de las unidades S oxidadas. IV. Resultados Generales y Discusión  72  Figura 31. Espectro HSQC NMR de eucalipto (muestras tratadas con la lacasa de M. thermophila y MeS) disuelto en dimetilsulfóxido deuterado, con una secuencia enzimática multietapa, incluyendo 4 tratamientos con la lacasa de M. thermophila y MeS, y 4 extracciones alcalinas con peróxido: (A) muestra inicial de eucalipto; (B), (D), (F) y (H) muestras del primero, segundo, tercero y cuarto pretratamiento enzimático con lacasa y mediador (etapas 1, 3, 5 y 7, respectivamente); (C), (E), (G) y (I) muestras de la primera, segunda, tercera y cuarta extracción alcalina con peróxido (etapas 2, 4, 6 y 8, respectivamente). IV. Resultados Generales y Discusión  73  Para obtener un conocimiento más detallado de la modificación de la estructura de la lignina a lo largo de la secuencia del pretratamiento, la lignina de las muestras de eucalipto pretratadas se aislaron enzimáticamente según el método descrito por Chang et al. (1975), y se analizaron mediante 2D-NMR. El efecto más notable del pretratamiento con el sistema lacasa-mediador fue la reducción significativa de las unidades de lignina de tipo G, resultando en un incremento de la relación S/G desde 5.0, en la etapa 2, hasta 13.8, en la etapa 8. Además, se produjo un fuerte aumento en la señal de lignina S oxidada a lo largo del tratamiento. Por otro lado, se observó una disminución significativa de enlaces β-O-4′ y subestructuras resinol, junto con una disminución menos intensa de las señales de fenilcumarano, espirodienonas y grupos terminales de alcohol cinamílico, que era especialmente evidente en la etapa 8. Finalmente, se analizaron mediante 2D-NMR los filtrados obtenidos tras cada paso de la secuencia con el objetivo de identificar los productos de degradación de la lignina en la madera de eucalipto. En las muestras tratadas enzimáticamente de las etapas 2 a 8 se observó un aumento de la relación S/G, y la pérdida de subestructuras fenilcumarano, resinol y espirodienonas. También, en comparación con las muestras control y en las últimas etapas, se observó una disminución de los enlaces β-O-4′, además de un fuerte incremento en las unidades S oxidadas. Estos estudios han demostrado por primera vez el gran potencial del uso de una lacasa comercial (de bajo potencial redox), en combinación con mediadores fenólicos naturales, como pretratamiento para deslignificar la madera y mejorar la sacarificación enzimática con vistas a la producción de bioetanol de segunda generación. V. Referencias  82  Faix, O., Meier, D. and Fortmann, L. (1990). Thermal degradation products of wood. A collection of electron-impact (EI) mass spectra of monomeric lignin derived products. Holz Roh-Werkstoff, 48, 351-354. Farrell, R. L., Blanchette, R. A., Brush, T. S., Hadar, Y., Iverson, S., Krisa, K., Wendler, P. A. and Zimmerman, W. (1993). CartapipTM: a biopulping product for control of pitch and resin acid problems in pulp mills. Journal of Biotechnology, 30, 115-122. 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Enzymes offer an environmentally benign and efficient alternative to chemical reagents in many industrial applications, including pulp and paper manufacture (Kenealy and Jeffries, 2003). Lipases (pitch control) and xylanases (bleaching) were introduced in the mill several years ago (Gutiérrez et al., 2001a; Bajpai et al., 2006), yet lignin-degrading oxidoreductases offer additional benefits compared to xylanases for pulp bleaching because they act directly on lignin (Bajpai et al., 2006). Likewise, oxidoreductases also have a high potential for pitch control because they act over a wide range of lipophilic compounds by a recently described oxidative mechanism (Gutiérrez et al., 2009). Laccases (phenoloxidases, EC 1.10.3.2) are multicopper oxidases that use molecular oxygen as the final electron acceptor and have been object of high interest for the development of environmentallybenign technologies (Mayer and Staples, 2002). The direct action of laccases on lignin is in principle restricted to the phenolic units that only represent a small percentage of the total polymer, a fact that limits its biotechnological application for paper pulp delignification. However, the interest on laccases as industrial biocatalysts steadily increased after discovering the effect on laccase activity of some synthetic compounds, including 2,2’- azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) (Bourbonnais and Paice, 1990) and 1-hydroxybenzotriazole (HBT) (Call, 1994) acting as electron carriers between the enzyme and the final substrate. In this way, the action of laccase is expanded to non-phenolic substrates, which are oxidized by the mediator radical, increasing the potential of the enzyme in degradation of lignin and other aromatic compounds. Since then, a variety of studies have confirmed the potential of the so-called laccase-mediator system for bleaching different pulp types (Bourbonnais and Paice, 1996; Poppius-Levlin et al., 1999; Camarero et al., 2004; Moldes and Vidal, 2008; Fillat and Roncero, 2010). On the other hand, the modification of some lipophilic extractives by laccases has been suggested (Zhang et al., 2005), and recently it was reported the high efficiency of the laccase-mediator system for the removal of lipophilic extractives regardless the pulping process and the raw material used (Gutiérrez et al., 2006a; 2006b; Molina et al., 2008; Valls et al., 2009) and a patent application was filed on this application (Gutiérrez et al., 2006c). However, the cost, safety and environmental profile of some of the synthetic mediators included in most of the above studies make it difficult to implement laccase-mediator systems in pulp bleaching at industrial scale. Recently, several lignin-related natural phenols, which form stable radicals, have been investigated as laccase mediators for pulp bleaching Publicación 1 VI. Publicaciones 101 (Camarero et al., 2007; Fillat et al., 2010b) and removal of lipophilic extractives from pulp (Gutiérrez et al., 2007). The present paper provides the first evidence of the feasibility of using a commercial laccase, and a cheap natural phenol with a suitable redox potential (Kulys et al., 2002) as mediator, for removing lignin and lipids from paper pulp. The enzyme used is the thermostable laccase from the ascomycete Myceliophthora thermophila, which has been cloned, expressed in Aspergillus oryzae, biochemically characterized, improved for different applications, and commercialized (Xu et al., 1996; Berka et al., 1997). The results presented make the laccase-mediator treatment economically feasible from an industrial point of view. 2. Material and methods 2.1. Pulp Eucalyptus globulus unbleached kraft pulp, with a kappa number of 15.5 (~2.3% lignin content), brightness of 38.5% ISO, and intrinsic viscosity of 1187 mL g-1 was obtained from the ENCE mill in Pontevedra (Spain) and used in enzyme treatment and control experiments. 2.2. Fungal laccase and mediators A commercial fungal laccase from the ascomycete M. thermophila, provided by Novozymes (Bagsvaerd, Denmark) was used in this study. Laccase activity was measured as initial velocity during oxidation of 5 mM ABTS from Roche to its cation radical (ε436 29300 M-1 cm-1) in 0.1 M sodium acetate (pH 5) at 24ºC. The laccase activity of the enzyme preparation was 945 U/ml. One activity unit (U) was defined as the amount of enzyme transforming 1 µmol of ABTS per min. A fungal laccase preparation (45 U/ml) obtained from a laccase-hyperproducing strain of the basidiomycete Pycnoporus cinnabarinus that was provided by Beldem (Andenne, Belgium) was also used for comparative studies. Syringaldehyde (4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzaldehyde; Cat.: S760- 2, Lot.: S16872-326) from Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) and methyl syringate (methyl 4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoate; Cat.: A18054/L05417, Lot.: 10110113) from Alfa Aesar (Karlsruhe, Germany) were assayed as mediators. VI. Publicaciones Publicación 1  102 2.3. Laccase-mediator treatments of eucalypt pulp First, pulp treatments with M. thermophila laccase-mediator were carried out in duplicate using 10 g (dry weight) of pulp at 3% consistency (w:w) in 50 mM sodium dihydrogen phosphate buffer (pH 6.5). Laccase loading was 20 U g-1 pulp and concentration of mediators (syringaldehyde and methyl syringate) in the reaction was kept at 6.75 mM. The treatments were carried out in 500 mL flasks with O2 bubbling, placed in a thermostatic shaker at 170 rev min-1 and 50 ºC, for 12 h. Finally, some enzymatic treatments (with MtL) were performed in 200-mL bioreactors (Labomat, Mathis) under conditions more similar to those of industrial application (including 10% pulp consistency and 4 bar oxygen pressure). Pulp treatments were repeated in the presence of Tween 20 (Cat.: TW00200250, Lot.: 10926401) or Tween 80 (Cat.: TW00800250, Lot.: 10628801) from Scharlau (0.05% w:v) and with lower doses of laccase (from 20 U g-1 to 1 U g-1 pulp) and mediator (from 6.75 mM to 0.6 mM). In a subsequent step, pulps at 5% consistency (w:w) were submitted to an alkaline peroxide extraction (Ep) using 3% (w:w) H2O2 and 1.5% (w:w) NaOH, both referred to pulp dry weight, at 90 ºC for 2 h. Controls including laccase without mediator were also performed. Pulp treatments with P. cinnabarinus laccase were performed as described above for M. thermophila ones, but using 50 mM sodium tartrate (pH 4) as a buffer. 2.4. Pulp lipid extraction and chromatographic analysis Treated pulps and controls were air dried and samples were Soxhletextracted with acetone for 8 h (Gutiérrez et al., 2001b). All extracts were evaporated to dryness and redissolved in chloroform for analysis of the lipophilic fraction by gas chromatography (GC) and gas chromatographymass spectrometry (GC-MS). The GC analyses of lipids were performed in an Agilent 6890N Network GC system using a short fused-silica DB-5HT capillary column (5 m x 0.25 mm internal diameter, 0.1 µm film thickness) from J&W Scientific, enabling simultaneous elution of the different lipid classes (Gutiérrez et al., 1998). The temperature program started at 100°C with 1 min hold, then raised to 350°C at 15°C min-1, and held for 3 min. The injector and flame-ionization detector (FID) temperatures were set at 300°C and 350°C, respectively. Helium (5 mL min-1) was used as carrier gas, and the injection was performed in splitless mode. Peaks were quantified by area. The GC-MS analyses were performed with a Varian 3800 chromatograph coupled to an ion-trap detector (Varian 4000) using a Publicación 1 VI. Publicaciones 103 medium-length (12 m) capillary column of the same characteristics described above for GC using FID. The oven was heated from 120°C (1 min) to 380°C at 10°C min-1, and held for 5 min. The transfer line was kept at 300°C, the injector was programmed from 120°C (0.1 min) to 380°C at 200°C min-1 and held until the end of the analysis, and helium was used as carrier gas at a rate of 2 mL min-1. Compounds were identified by mass fragmentography, and by comparing their mass spectra with those of the Wiley and NIST libraries, and standards. 2.5. Py-GC-MS analysis of pulp lignin Pyrolysis of pulps (approximately 1 mg) after Soxhlet extraction with acetone, was performed with a 2020 micro-furnace pyrolyzer (Frontier Laboratories Ltd.) connected to an Agilent 6890 GC-MS system equipped with a DB-5MS (Agilent J&W) fused-silica capillary column (30 m x 0.25 mm i.d., 0.25 μm film thickness) and an Agilent 5973 mass selective detector (EI at 70 eV). The pyrolysis was performed at 500ºC. The oven temperature was programmed from 40ºC (1 min) to 300ºC at 6ºC min-1 (10 min). Helium was the carrier gas (1 mL min-1). The compounds were identified by comparing their mass spectra with those of the Wiley and NIST libraries and reported in the literature (Ralph and Hatfield, 1991). For pulp lignin analyses in terms of its p-hydroxyphenyl:guaiacyl: syringyl (H:G:S) composition, single-ion Py-GC-MS traces were obtained using the molecular ions of the following selected markers (del Río et al., 2001): m/z 108 (4-methylphenol), 122 (4-ethylphenol), 120 (4-vinylphenol) and 134 (4-t-propenylphenol) for H-lignin units; m/z 138 (4-methyl- guaiacol), 152 (4-ethylguaiacol), 150 (4-vinylguaiacol) and 164 (4-t- propenylguaiacol) for G-lignin units; and m/z 168 (4-methylsyringol), 182 (4-ethylsyringol), 180 (4-vinylsyringol), and 194 (4-t-propenylsyringol) for S-lignin units. Phenol, guaiacol and syringol were not selected as lignin markers, to prevent interferences due to eventual formation of syringol from residual amounts of the S-type mediators used. 2.6. Papermaking evaluation of eucalypt pulps Pulp brightness, kappa number (before and after acetone extraction, as described in section 2.4) and intrinsic viscosity were analyzed following ISO 3688:1999, ISO 302:1981 and ISO 5351/1:1981 standard methods, respectively (International Organisation for Standardization Documentation and Information (ISO), 2003). Data from replicates were averaged. In all cases the standard deviations were below 2% of the mean values. VI. Publicaciones Publicación 1  104 3. Results and discussion In this paper, the ability of recombinant M. thermophila laccase (MtL) to delignify eucalypt kraft pulp, and simultaneously remove lipophilic extractives causing pitch deposits, in the presence of two simple S-type phenols of plant origin (syringaldehyde and methyl syringate) was tested. The commercially available MtL retains activity through a wide pH range (from pH 4 to pH 9) and has higher thermostability (being active up to 70ºC) than the different basidiomycete laccases investigated for biotechnological application (Xu et al., 1996). More importantly, MtL can be heterologously expressed in industrial hosts (such as Aspergillus species) with high yields (Berka et al., 1999), compared with the basidiomycete laccases whose heterologous expression results in low yields currently limiting their large-scale commercialization in pulp bleaching. 3.1. Pulp delignification with MtL and S-type mediators Unbleached eucalypt kraft pulp was treated with MtL in the presence and absence of syringaldehyde and methyl syringate, and subsequently extracted with alkaline peroxide. The delignification degree was evaluated before and after an alkaline peroxide extraction, by determining the kappa number (an estimation of lignin content in pulp) and the ISO brightness. Intrinsic viscosity (an estimation of cellulose integrity) was also determined. The results obtained are shown in Table 1, compared with the control pulp. Table 1. Pulp papermaking properties (kappa number, brightness, and viscosity) and lignin S/G molar ratio (from selected Py-GC-MS markers, Fig. 1) of eucalypt pulp treated with M. thermophila laccase (MtL) in the absence and presence of syringaldehyde (SA) or methyl syringate (MS), and control without enzyme, before (initial) and after an alkaline peroxide extraction (Ep). Control MtL MtL-SA MtL-MS Before Ep After Ep Before Ep After Ep Before Ep After Ep Before Ep After Ep Kappa number 13.3 10.7 12.9 9.8 14.5 9.3 12.2 8.0 Brightness (% ISO) 43.5 57.0 41.5 60.1 35.6 61.7 36.5 65.3 Intrinsic viscosity 1230 1030 1240 1020 1220 972 1240 978 S/G ratio 1.45 0.92 1.10 0.61 1.19 0.55 0.73 0.26 The positive effects of the enzymatic treatments on pulp properties, especially on brightness, were only evidenced after the alkaline extraction, revealing the need of an alkaline peroxide stage after the Publicación 1 VI. Publicaciones 105 treatment with laccase and natural mediators. In the absence of this extraction, the pulp brightness decreased with the enzymatic treatment. Likewise, the kappa number only decreased 0.4 and 1.1 points with the MtL alone and in the presence of methyl syringate, respectively, and increased 1.2 points with the MtL-syringaldehyde treatment (due to partial retention of the mediator on the non-extracted pulp). After the peroxide extraction, the properties of the treated pulps improved with respect to the control. The brightness of eucalypt pulp increased up to 3.1, 4.7 and 8.3 points after the treatments with MtL alone, MtL-syringaldehyde, and MtL- methyl syringate, respectively. On the other hand, a decrease in kappa number up to 2.7 points was obtained after the MtL-methyl syringate treatment followed by a decrease of 1.4 points in the MtL- syringaldehyde treatment and by 0.9 points decrease in the treatment with MtL alone. The increased delignification (up to 25%) and brightness (up to 15%) obtained using methyl syringate as mediator are very promising results since they provide the first evidence on pulp properties improvement using a commercial laccase and a cost-effective natural mediator. 3.2. Comparison with other laccases and mediators For comparative purposes, the (non-commercial) laccase from the basidiomycete Pycnoporus cinnabarinus (PcL) was also applied to eucalypt pulp in the presence of syringaldehyde and methyl syringate as mediators (data not shown). In spite of PcL being a high-redox potential laccase, less reactivity was shown towards lignin (compared with MtL) since worse results in terms of brightness increase (only 0.5 points) and kappa decrease (only 0.1 points) were obtained in the treatments with laccase alone. In the PcL treatments carried out in the presence of syringaldehyde and methyl syringate, similar increases in brightness (about 5 points) and decreases in kappa number (about 1 point) were obtained with both mediators. These results are inferior to those described above using the MtL and methyl syringate as mediator. The above improvements of eucalypt pulp brightness are lower than reported using the synthetic mediator HBT in combination with high redox-potential laccases from basidiomycetes (Camarero et al., 2007), although the latter treatment has not been industrially implemented due to the high cost and environmental issues associated to this and other synthetic mediators. However, the low redox-potential laccase from the ascomycete M. thermophila can be heterologously expressed in A. oryzae, in contrast to the high redox-potential basidiomycete laccases. Therefore, MtL has the advantage of being a commercially-available cheap laccase, which will enable the up-scaling of the enzymatic treatment of pulp. Although low redox-potential laccases can not oxidize mediators such as HBT (Ibarra et al., 2006), this is not a problem here since the mediators used (syringaldehyde and methyl syringate) are VI. Publicaciones Publicación 1  106 phenolic mediators of low redox potential. These phenolic mediators can be easily obtained from natural sources (Tuberoso et al., 2009) and are also present in eucalypt pulping liquor (Gutiérrez et al., 2007). In addition, the decrease in pulp viscosity reported here (5%) is lower than that attained using HBT (18%) (Camarero et al., 2007). 3.3. Enzymatic modification of pulp lignin as shown by analytical pyrolysis With the aim of investigating how the enzymatic treatment affected the composition of residual lignin, the lignin in the enzymatically-treated pulps was analyzed by pyrolysis coupled to GC-MS. Py-GC-MS allows for in situ analysis of lignin by chromatographic separation and massspectrometric identification of the compounds released after the pyrolytic breakdown of whole pulp. Unfortunately, the lignin content in chemical pulps is often too low for direct detection of these breakdown products. However, their relative abundances can be analyzed in single-ion chromatographic traces corresponding to selected marker compounds, as described by del Río et al. (2001). Although the Py-GC-MS analyses were performed after pulp extraction with acetone (and kappa numbers only slightly varied before and after the extraction) the presence of residual syringaldehyde and methyl syringate was detected in chromatographic traces corresponding to their molecular ions (m/z 182 and 212, respectively). With the aim of preventing an eventual interference of these compounds, syringol was excluded from the selected markers used to analyze pulp residual lignin, together with phenol and guaiacol (Fig. 1). From the traces obtained (that did not include H-type lignin markers), the relative lignin composition in the enzymatically-treated eucalypt pulps and controls were calculated, and shown in Table 1 as S/G molar ratios (Table 1). A slight decrease in the S/G ratio was already observed after the enzymatic treatment with MtL alone, which was the largest after MtL treatment in the presence of methyl syringate followed by the alkaline peroxide stage, indicating a preferential removal of lignin S-units by this laccase-mediator system. This result is in agreement with a more linear structure of S lignin with a predominance of β-O-4' inter-unit linkages (Ibarra et al., 2007), while G lignin is more condensed (branched) due to additional linkages involving the C5 position at the benzenic ring (which is blocked by a second methoxy group in S units) making it more resistant towards degradation. Publicación 1 VI. Publicaciones 107 Fig. 1. Single-ion chromatographic traces of markers from Py-GC/MS of paper pulp (control, before alkaline peroxide extraction) used to estimate the lignin S/G ratio. G- lignin markers (A) included: 4-Methylguaiacol (m/z 138), 4-ethylguaiacol (m/z 152), 4- vinylguaiacol (m/z 150) and 4-t-propenylguaiacol (m/z 164). S-lignin markers (B) included: 4-Methylsyringol (m/z 168), 4-ethylsyringol (m/z 182), 4-vinylsyringol (m/z 180) and 4-t-propenylsyringol (m/z 194). Same vertical scale was used in A and B chromatographic traces. 4-vinylsyringol 4-ethylsyringol m/z 180 m/z 182 4-methylsyringol m/z 168 B HO H 3 CO H 3 CO HO H 3 CO H 3 CO HO H 3 CO H 3 CO 4-t-propenylsyringol m/z 194 4 6 8 1012141618 Retention time (min) HO H 3 CO H 3 CO 4-methylguaiacol 4-vinylguaiacol 4-ethylguaiacol m/z 138 m/z 150 m/z 152 A HO H 3 CO HO H 3 CO HO H 3 CO ~ 4-t-propenylguaiacol m/z 164 HO H 3 CO 4 6 8 1012141618 Retention time (min) VI. Publicaciones Publicación 1  108 3.4. Pitch removal with MtL and S-type mediators The removal of lipophilic extractives by eucalypt pulp treatments with MtL and syringadehyde and methyl syringate as mediators, was evaluated before and after the alkaline peroxide extraction by GC and GC-MS analyses. The results obtained are shown in Table 2. The main lipophilic compounds present in eucalypt pulp (Fig. 2A) included sterols (predominantly sitosterol) in free (c) and esterified (j) form. Minor amounts of sterol glycosides (g) were also present. The detailed composition of lipophilic extractives from eucalypt pulp has been published elsewhere (Gutiérrez and del Río, 2001; 2001b). These compounds have been shown to be the main responsible for pitch problems during manufacturing of eucalypt pulp (Gutiérrez et al., 2009). Table 2. Removal (percentage of reduction) of the main lipophilic extractives (sterols) from eucalypt pulp after treatment with M. thermophila laccase (MtL) in the absence and presence of syringaldehyde (SA) or methyl syringate (MS) before and after an alkaline peroxide extraction (Ep). MtL MtL-SA MtL-MS Before Ep After Ep Before Ep After Ep Before Ep After Ep Free sterols 25 21 73 69 48 40 Sterol glycosides 0 7 91 86 24 24 Sterol esters 41 41 89 82 92 80 It was observed (Table 2) that the enzymatic treatment (without the subsequent alkaline peroxide extraction) using laccase alone was able to partially remove the free sterols (about 25%) and sterol esters (about 41%). When the laccase treatment was performed in the presence of syringaldehyde, a decrease of free sterols (up to 73%), sterol glycosides (up to 91%) and sterol ester (about 89%) contents, was produced (Fig. 2B). A similar removal of sterol esters (up to 92%) seems to be attained in the laccase treatments using methyl syringate as mediator (Fig. 2C), whereas a lower decrease of free sterols (up to 48%) was observed. A decrease on the sterol glycoside content was not observed with the latter mediator. Similar values of lipophilic extractives removal were obtained in the enzymatic treatments followed by the alkaline peroxide extraction (Table 2). Publicación 1 VI. Publicaciones 109 Fig. 2. GC-MS analysis (total-ion chromatograms) and chemical structures of the main lipophilic compounds identified in eucalypt kraft pulp (without alkaline peroxide extraction) before (A) and after treatment with laccase M. thermophila using syringaldehyde (B) and methyl syringate (C) as mediators. Peak identification: (a) stigmasta-3,5,7-triene; (b) stigmasta-3,5-diene; (c) sitosterol; (d) 7-hydroxysitosterol; (e) sitostanetriol; (f) 7-ketositosterol; (g) sitosteryl 3-D-glucopyranoside; (h) sitosteryl 9-oxononanoate; (i) 7-ketositosteryl 3-D-glucopyranoside; and (j) sitosterol esters. Same vertical scale was used in the three chromatograms. Relative response HO O OH O OH CH 2 OH HO c g O O R j Relative response c g j ab Relative response A C 100% 510152025 Retention time (min) 5 10152025 Retention time (min) 100% 100% 5 10152025 Retention time (min) B c j HO O abd HO OH HO OHOH e f O OO H hi O OH O OH HO CH 2 OH O d VI. Publicaciones Publicación 1  116 Kulys, J., Krikstopaitis, K., Ziemys, A., Schneider, P., 2002. Laccasecatalyzed oxidation of syringates in presence of albumins. J. Mol. Catal. B Enzym. 18, 99-108. Mayer, A.M., Staples, R.C., 2002. Laccase: new functions for an old enzyme. Phytochemistry 60, 551-565. Moldes, D., Vidal, T., 2008. 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Publicaciones  117 PUBLICACIÓN 2: Demonstration of laccase-based removal of lignin from wood and nonwood plant feedstocks. Ana Gutiérrez, Jorge Rencoret, Edith M. Cadena, Alejandro Rico, Dorothee Barth, José C. del Río and Ángel T. Martínez. Bioresource Technology, 119, 114-122 (2012). Publicación 2 VI. Publicaciones  119 Demonstration of laccase-based removal of lignin from wood and non-wood plant feedstocks Ana Gutiérreza, Jorge Rencoretb, Edith M. Cadenaa, Alejandro Ricoa, Dorothee Barthc, José C. del Ríoa, Ángel T. Martínezd a Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla, CSIC, PO Box 1052, E- 41080 Seville, Spain b Department of Biochemistry, Great Lakes Bioenergy Research Center, University of Wisconsin, Madison, Wisconsin 53706, USA c VTT, PO Box 1000, FI-02044 VTT, Finland d Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Ramiro de Maeztu 9, E-28040 Madrid, Spain Abstract The ability of Trametes villosa laccase, in conjuction with 1- hydroxybenzotriazole (HBT) as mediator and alkaline extraction, to remove lignin, was demonstrated during treatment of wood (Eucalyptus globulus) and non-wood (Pennisetum purpureum) feedstocks. At 50 U g-1 laccase and 2.5% HBT concentration, 48% and 32% of the Eucalyptus and Pennisetum lignin were removed, respectively. Two-dimensional nuclear magnetic resonance of the feedstocks, swollen in dimethylsulfoxide-d6 revealed the removal of p-hydroxyphenyl, guaiacyl and syringyl lignin units and aliphatic (mainly β-O-4'-linked) side-chains of lignin, and a moderate removal of p-coumaric acid (present in Pennisetum) without a substantial change in polysaccharide crosssignals. The enzymatic pretreatment (at 25 U g-1) of Eucalyptus and Pennisetum feedstocks increased the glucose (by 61% and 12% in 72h) and ethanol (by 4 and 2 g L-1 in 17 h) yields from both lignocellulosic materials, respectively, as compared to those without enzyme treatment. Keywords: Enzymatic deconstruction, Laccase, Bioethanol, Lignocellulose, 2D-NMR VI. Publicaciones Publicación 2  120 1. Introduction Lignin removal is an important technical issue for paper manufacturing and a key challenge for the conversion of lignocellulosic feedstock into liquid transportation fuels such as ethanol. Biofuel production from lignocellulosic material requires deconstruction of the cell-wall matrix into individual polymers, and hydrolysis of the carbohydrate polymers into monomeric sugars. Biomass recalcitrance towards enzymatic hydrolysis is correlated with the content and composition of lignin (Studer et al., 2011). Physical, chemical and biological pretreatments, or combinations of these processes, are being studied for deconstructing lignocellulosic biomass and removing lignin (Alvira et al., 2010; Yu et al., 2011). Most biological pretreatments for delignifying lignocellulosic materials employ lignin-degrading fungi, mainly belonging to the group of white-rot basidiomycetes (Kumar et al., 2009; Salvachúa et al., 2011) but such pretreatments require long application periods and consume a fraction of the plant polysaccharides. Laccases (phenoloxidases, EC 1.10.3.2) are multicopper oxidases that oxidize substituted phenols using molecular oxygen as the final electron acceptor. The direct action of laccases on lignin is, in principle, restricted to phenolic units that only represent a small percentage of the total polymer, a fact that limits their biotechnological application. However, the discovery that some synthetic compounds can act as electron carriers between the enzyme and the final substrate (Bourbonnais and Paice, 1990), 1-hydroxybenzotriazole (HBT) being among the most efficient ones (Call, 1994) has expanded the utility of laccases. Studies have confirmed the potential of laccase-mediator systems for pulp delignification (Poppius-Levlin et al., 1999; Ibarra et al., 2006; Babot et al., 2011), pitch control (Gutiérrez et al., 2009), organic synthesis (Kunamneni et al., 2008), polymer modification (Prasetyo et al., 2010), applications in the forest industry (Widsten and Kandelbauer, 2008) and bioethanol production from physically/chemically pretreated lignocellulose (Palonen and Viikari, 2004; Moilanen et al., 2011). The present study shows the ability of the high redox-potential laccase from the basidiomycete Trametes villosa (Li et al., 1999) to remove lignin and make cellulose accessible to hydrolysis for conversion to fuels, when applied on the whole lignocellulosic biomass in combination with HBT as a redox mediator. Eucalypt (Eucalyptus globulus) and Elephant grass (Pennisetum purpureum) were selected as representative for rapidly growing, high biomass-producing woody and non-woody plant species, respectively. The modification of lignin in the pretreated lignocellulosic materials was analyzed by two-dimensional nuclear magnetic resonance (2D-NMR) spectroscopy of the whole sample at the gel state (Kim et al., 2008; Rencoret et al., 2009). In addition to lignin removal, the effect of the enzymatic treatments on sugar Publicación 2 VI. Publicaciones  121 and ethanol yield from the two pretreated lignocellulosic materials was also assessed. 2. Material and methods 2.1. Lignocellulosic samples Elephant grass (P. purpureum) from Viçosa Federal University (Brazil) and eucalypt (E. globulus) from ENCE (Pontevedra, Spain), were airdried and ground in an IKA MF10 cutting mill to pass through a 100-mesh screen, and finely ball-milled in a Retsch PM100 ball mill at 400 rev min-1 using an agate jar and balls. 2.2. Fungal laccase and mediators The laccase preparation from the basidiomycete T. villosa was provided by Novozymes (Bagsvaerd, Denmark). Its activity was measured as the oxidation of 5 mM 2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS, from Roche, Mannheim, Germany) to the cation radical (ε436 29300 M-1 cm-1) in 0.1 M sodium acetate buffer (pH 5) at 24ºC (Li et al., 1999). One activity unit (U) was defined as the amount of enzyme transforming 1 µmol of ABTS per min. HBT from Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany) was used as mediator. 2.3. Laccase-mediator treatments The eucalypt and Elephant grass samples were treated with the T. villosa laccase in the presence (and absence) of HBT, as mediator. Laccase doses of 10, 25 and 50 U g-1 were assayed, together with 2.5% HBT (selected after testing several HBT concentrations, from 0.5 to 3%), both with respect to lignocellulosic material dry weight. The HBT concentration was selected after testing several doses (from 0.5 to 3%). The treatments were carried out in 200-mL pressurized bioreactors (Labomat, Mathis) placed in a thermostatic shaker at 170 rev min-1 and 50 ºC, using 2 g (dry weight) samples at 6% consistency (w:w) in 50 mM sodium tartrate buffer (pH 4) under O2 atmosphere (2 bars) for 24 h. After the treatment, the samples were filtered through a Büchner funnel and washed with 1 L of water. In a subsequent step, samples at 6% consistency (w:w) were submitted to a peroxide-reinforced alkaline extraction using 1% (w:w) NaOH and 3% (w:w) H2O2 (also with respect to sample dry weight) at 80 ºC for 90 min, followed by water washing (Babot et al., 2011). Cycles of four successive enzyme-extraction treatments were applied. Treatments VI. Publicaciones Publicación 2  122 with laccase alone (without mediator) and controls without laccase and mediator, were also performed (followed in both cases by the corresponding alkaline extractions). 2.4. Enzymatic hydrolysis The laccase-pretreated samples were hydrolyzed with a cocktail containing commercial enzymes (from Novozymes, Bagsvaerd) with cellulase (Celluclast 1.5 L; 10 FPU g-1) and β-glucosidase (Novozym 188; 500 nkat g-1) activities, at 1% consistency in 3 mL of 100 mM sodium citrate buffer (pH 5) for 72 h at 45 ºC, with magnetic stirring (in triplicate experiments). The amount of total sugars released during the enzymatic hydrolyses was determined by the dinitrosalicylic acid (DNS) method (Miller, 1959). The different monosaccharides present were analyzed in a Waters Alliance 2795 high performance liquid chromatography (HPLC) system with an Aminex HPX-87H column (BioRad) and a Waters 2410 refractive index detector, using 5 mM H2SO4 (0.6 ml min-1) as eluent. To improve the separation of the monosaccharides, a HPLC Fast Acid Analysis column (BioRad) was included before the above column, and a Cation-H Refill cartridge (BioRad) was added as a pre-column to remove impurities. Glucose, xylose and arabinose were used as standards. 2.5. Fermentation Simultaneous saccharification and fermentation was conducted at 10% consistency in a 25-mL volume in Erlenmeyer flasks with airlocks (triplicate experiments). The biomass was pre-hydrolysed for 6 h at 45°C as described in section 2.4, RedStar yeast (from Lesaffre, Marcq-en- Barœul, France) was added with an OD600 of 3.5 (about 1g L-1), and the flasks were incubated at 30°C with 100 rev·min-1 shaking for up to 64 h. The progress of the fermentation was monitored by weighing the flasks regularly, and the ethanol production was calculated from the weight loss. 2.6. Klason lignin content and polysaccharide composition Klason lignin content was estimated according to T222 om-88 (Tappi, 2006). Monosaccharides in the acid hydrolysate were analyzed by high performance anion exchange chomatography using a CarboPac PA-1 column at 30°C in a Dionex DX 500 series chromatograph equipped with pulse amperometric detection (Dionex ED 40), and expressed in mg of anhydrosugars per 100 mg of sample. Publicación 2 VI. Publicaciones  123 2.6.1. 2D-NMR spectroscopy Fifty to sixty milligram of lignocellulose samples were swollen in dimethylsulfoxide-d6 for 2D-NMR at the gel state (Kim et al., 2008; Rencoret et al., 2009). Heteronuclear single quantum correlation (HSQC) 2D-NMR spectra were acquired on a Bruker Biospin (Billerica, MA) AVANCE 500 MHz spectrometer fitted with a cryogenically cooled 5-mm TCI gradient probe with inverse geometry (proton coils closest to the sample). The 13C-1H correlation experiment was an adiabatic HSQC experiment (Bruker standard pulse sequence ‘hsqcetgpsisp.2’; phasesensitive gradient-edited-2D HSQC using adiabatic pulses for inversion and refocusing). Gel HSQC spectra were acquired from 10 to 0 ppm in F2 (1H) with 1000 data points for an acquisition time (AQ) of 100 ms, an interscan delay (D1) of 500 ms, 200 to 0 ppm in F1 (13C) with 400 increments (F1 acquisition time 8 ms) of 40 scans. The 1JCH used was 145 Hz. Processing used typical matched Gaussian apodization in 1H and a squared cosine bell in 13C. Prior to Fourier transformation, the data matrices were zero filled up to 1,024 points in the 13C dimension. The central solvent peak was used as an internal reference (δC/δH 39.5/2.49). The 13C-1H correlation signals of the different lignin units in the aromatic region were used to estimate the lignin composition in terms of phydroxyphenyl (H), guaiacyl (G), syringyl (S) and oxidized syringyl (S') units, and the p-coumaric acid and ferulic acid contents referred to total lignin (H+G+S+S'). 3. Results and discussion 3.1. Elephant grass and eucalypt wood delignification with laccasemediator The lignin contents (as Klason lignin) of Elephant grass and eucalypt samples after the laccase-mediator sequence were determined and compared with their respective controls (Table 1). The lignin content in both lignocellulosic materials decreased considerably, after the enzymatic sequence, concomitantly with increasing laccase doses. For Elephant grass, the decreases were about 11, 22 and 32% of the initial lignin content when using laccase doses of 10, 25 and 50 U/g, respectively (the decreases in lignin content did not stabilize in the course of the enzymatic sequence but progressively increased with respect to the previous step in each of the four laccase-mediator/extraction steps). The reduction in eucalypt wood was more pronounced, attaining 32, 34 and 48% with the above laccase doses. The treatments with laccase alone (without mediator) decreased the lignin content (<5%) in both materials. No significant change in the lignin content, or even a slight increase, have VI. Publicaciones Publicación 2  124 previously been reported after laccase (alone) treatment of steam pretreated giant read (Arundo donax) and spruce (Picea abies), respectively (Moilanen et al., 2011). Likewise, no substantial variation in the lignin content and composition (discussed below) was reported after laccase-mediator treatment of steam-exploded eucalypt samples (Martin- Sampedro et al., 2011), most probably because of the different enzyme preparation (Novozym 51003 from Novozymes, Bagsvaerd, based on Myceliophthora thermophila laccase) (Li et al., 1999) and treatment conditions used. Table 1. Lignin content of Elephant grass and eucalypt samples after four enzymatic treatments, each of them followed by an alkaline peroxide extraction, compared with the original untreated material, a control without enzyme and a treatment with laccase alone. Elephant grass Eucalypt Untreated material 22.1 22.3 Control 21.1 18.0 Laccase (10 U g - 1 ) - HBT 18.8 12.2 Laccase (25 U g - 1 ) - HBT 16.4 11.9 Laccase (50 U g - 1 ) - HBT 14.3 9.4 Laccase (50 U g - 1 ) 20.7 17.5 The sugar contents after acid hydrolysis were, glucose (44%), xylose (19%) and arabinose (1%) for untreated Elephant grass, and glucose (44%), xylose (12%), galactose (1%) and mannose (1%) for eucalypt wood. These values were basically the same after treatments with laccase alone, and after treating Elephant grass with laccase-HBT; however, an increase in the glucose (up to 49%) and xylose (up to 13%) contents was observed after treating the eucalypt wood with laccase (25 U g-1) in the presence of HBT, due to the removal of lignin. 3.2. Enzymatic modification of Elephant grass lignin (as shown by 2D-NMR) Figure 1 shows the complete HSQC NMR spectrum of the whole Elephant grass at the gel state, including the aliphatic oxygenated region, with methoxyl, lignin side-chain and carbohydrate cross-signals, and the aromatic region, with the lignin and p-coumaric acid signals (the traces of ferulic acid are not visible in the whole spectrum). The detailed assignments of the different signals are shown in Fig. 2, which includes the expanded aliphatic oxygenated (top) and aromatic (bottom) regions of the spectra of the control and laccase-mediator treated samples. The P  m d li d c s F d in s a m g la n c li Pu ma dif g dif co sh Fig im n ig as ma gr at ne co g u a ff gn ff or ho g. m th gn s ai ra tt ea on gn b in e ni e rre ow . e he na ig n T as e ar nd ni bli n ere n ere e w 1 th e als gn l T ss er rly di n ic li e e s wn . hy a s nm ig h s y iti s ca ig n c n p n H yls ar i me gn e ( m io su ac gn nt co nt po in H su ro n en nin e ( F ma " on u ci ni l om on n S ul om nt n a Fi a "s ns b ió n ig m E nd T SQ lfo ma th ts s ali g in si s. bs ón n gn mp Ele di Ta QC ox at he s str ip g. nl ile . str n a n po e in ab C xi tic e in ru ph ly e In ru 2 an in os p ng b d c a n uc ha 2 y n n uc 2 nd n s ph g le N e r ali E ctu at 2A c t" t ct d s it ha s e NM - d re ip Ele ur ti A ) co " th tu c sig tio an si 3 MR d 6 g ph ep re c ) or hi ur cin g on nt ig 3 . R 6 s io ha ph es c o s rr in s re n n n t gn R sh on ati ha s i o sh re n s es n na g na s ho n, ic an id x ho es re s a als a gr al pe ow a c nt de xy ow sp eg (A am s an ra ls ec w an (o t g en yg w po lig g A m a nd as s ct win nd ox gr nti ge we o g io A) ic a d ss in tr ng d xy ra fi en ed n gn on ), c s s n u g m yg as e na d d no n in s s p s t m lig m ge ss d a s de oc , n st sig p - sa th m g ma en s . te s ed ce s c ru gn - c a he o n ain na a ed ig d el sig clu uc n co m e of in n at n d gn llu g ud ct e ou mp a w n li te d r na to u n d tu ed um p a w (G ig d e re a o lo na in ur d m le ro wh G gn ) eu eg ls os als ng re o ma es o ho a nin r uc g s x se s g es on ar s, m ole an n re ca io o xy e o C s n ric , ma e nd in eg aly on of yla of C γ id th c e at p d nt gio yp n f an g f γ - d h es ti pl S te on pt o b n g m - H e e a st c a S er n. t of bo e m H γ en e s an tim n u - u s f ot ( el me γ , nt s nd m re t n un S a t th X et , C if p d ma eg b its ni Se m h h X) s h C fie pe at g bio s) t ee mp he l ), sp ho C β ed ec fe te io o ) li e pl e lig p ox β - d ct e ed on m a in F es s gn s e xy H a tra ru d n ma n nk Fig s, sp n sin c yl H β ar a u f o as d ka gs , pe in nc ctr s β a re a li fr o ss p ag s re ec n ce ra a a e a c o of s p - ge . es ct a e a a an s re om t (E - c es 2 sp tr a n nd sh e a m th E co ( 2 pe ru n c u nd d ho l ac he le ou (β a ec um nd cr u d C ow is ci th e ep um β - an ct m d ry n s C α w st d he H ph ma - O nd iv o c ys d sid α - wn te ds e H ha ar O - d ve o ca sta de d - H n ed s S an ric - 4 5 ely f ar a er e H α V in d c in SQ nt c 4') 5 y, c rb all r e - α V I n i co nt Q a ) a fo a co bo in c c . F n o te QC g ac an or an on oh ne s h co P Fi T n en C ra cid nd r nd n hy e so a or Pu ig T nte ns s as d d d d tr y olu ain rre ub g. Ta e si sp ss (P c de F ro yd c u n e bl . 3 ab n iti p s) P ca eta Fi ol dr ce ti s ela lic 3 bl nts ie e s C ar ai g E a el o s at ca , e s es ec sw CA rb ile g. E ate l u on in tio a a e s ctr w A) bo ed 3 Ele es ul n n o ac an 2 in o ra wo ) s oh d 3 e s o β n cio nd 2 . n of a, oll si hy s fo p . os N β - ns o d T f , e g yd sig or ph T se N - O s ( n 1 t T t t a n n dra g r t ha T e M O (A e 2 h h h h ar a at na th an h i MR - 4 A es 25 he he he he re in ls te a he nt he is R 4 A γ , s  5 e e e e e n s e l e t e s R ' , VI. Publicaciones Publicación 2  132 The HSQC spectra of the eucalypt samples treated with laccasemediator showed important differences compared to the control ones (Fig. 5). The signal of side-chains in β-O-4' lignin substructures (Aα) present in the aliphatic oxygenated region of the control spectrum completely disappeared even at the lowest enzyme dose (Figs. 5B). Likewise, the G lignin signals, in the aromatic region of the spectrum, also completely disappeared with the lowest enzyme dose, while the S units were Cα-oxidized (and in a significant extent remained as such) as revealed by the strong increase in the S'2,6 signal, which became the most prominent signal in this region when the enzyme dose was increased (Fig. 5E and F, and Table 3). Therefore, the results obtained for the eucalypt wood confirmed the Cα-oxidation mechanism for lignin removal by laccase-HBT, and revealed that most of the residual lignin in wood treated with the highest laccase dose corresponds to the oxidized S' units. Similarly to the Elephant grass enzymatic treatment, the decrease in G units seemed to occurre to a greater extent than in the S ones. The presence of oxidized lignin units was also observed in eucalypt pulp residual lignin after a laccase-mediator treatment, including both Cα ketones and carboxylic acids (Ibarra et al., 2007). A general picture of the compositional changes revealed by the NMR analyses of the eucalypt samples, enabling comparison of treatments with different laccase doses (in the presence of HBT) and with laccase alone, is shown in Fig. 4B. The general tendency at increasing enzyme doses is a decrease in lignin carbon (in aromatic, side-chain and methoxyl structures), although to a lower extent than in the Elephant grass samples, and a concomitant increase of polysaccharides, including acetylated units. In contrast, the effect of laccase alone was very moderate, being basically reduced to the decrease in lignin G units. P  F a o H U id Pu Fig aro of HB U· de u g. om e BT g en b . m eu T: - 1 nt bli 5 ma uc : A 1 if ic 5. ati ca A e ie ca E ic aly A a en ed ac E c ( yp an nz d, ci x (δ pt nd zy a ió pa δ H t t d ym an ón a - δ tr D me nd n n δ C re D ) e. d T 2 d C , a ) S T 2 e 6 te C Se a d 6. ed Co ee b 3 d on e ble a - 7 w ntr T e lip 7. wi ro Ta 3 ph 6 th ol ab 3 f ha 6 a h w bl fo at an lo wi le or tic nd ow ith e 2 q c d w ho 2 qu o 1 w a ou fo ua ox 0 a ut or an xy 00 nd t e r nti yg 0 - d e s ifi ge 12 h nz ig ic en 25 hi zy gn ca na 5 g ym na ti at p gh m al o te pp h me a n d pm do e; as o m os B ss of (δ ; se B sig ft δ H b es a gn th H - bo s an nm e - δ ott o nd m se δ C to of d me e , om f E en li 2 m T E ) nt, ig 2. m ) T. 1 , F gn 5 re v 10 F nin - 5 eg vil 0 ig n 5. g llo U g. s .5 io os U· 3 str 5 on sa g 3 r u a ns a - 1 fo uc an s o la 1 or ctu nd of ac e r t ur d f t cc en th re 5 th ca nz he es 50 he as zy e s. 0 - 1 e se ym m V 1 H e me ma V I 10 HS in e; ai . 0 SQ n a n P p QC th an l Pu pp C he nd ig ub p C N e d gn bl m N p C nin lic m; M pr C n ca t MR re a s a to R es an str ac op s se nd ru cio p ) sp en d uc o ) pe c F ctu n 1 a ec e ) ur e 3 an ctr o 5 re es 33 nd ra of 50 es s  3 d a f 0 s VI. Publicaciones Publicación 2  134 3.4. Enzymatic hydrolysis and fermentation The Elephant grass and eucalypt samples treated with laccase (25 U g-1), alone and in the presence of HBT, were hydrolyzed using a cellulase and β-glucosidase cocktail, and the main monosaccharides released (glucose, xylose and arabinose) were analyzed by HPLC (total reducing sugars from the DNS assay showed similar tendencies). The effect of hydrolysis time was investigated and 72 h hydrolysis was chosen since monosaccharide release already stabilized after this time period, and reached 64-71% of sample weight for Elephant grass and 35-58% for eucalypt (Fig. 6A, Table 4). In the case of eucalypt wood, the effect of the laccase-HBT treatment increased with cellulase hydrolysis times, the highest increases in glucose and xylose releases were obtained after 72 h. However, for Elephant grass the highest increases in sugar releases by the laccase-mediator treatment were observed after only a 4-h hydrolysis. The ability of laccase-mediator treatment to increase polysaccharide hydrolysis by cellulases had been already reported, but only on pretreated (steam-exploded) wood (Palonen and Viikari, 2004). Interestingly, the treatment with laccase alone (without mediator) also slightly increased the hydrolysis yields for eucalypt and Elephant grass, with respect to that of the controls. This agrees with the findings by Moilanen et al. (2011) who reported a 12% hydrolysis increase (after 48 h) by laccase (alone) treatment of steam-pretreated spruce wood, although, surprisingly, the same enzymatic treatment on giant read decreased the hydrolysis yield. During the subsequent long-term simultaneous saccharification and fermentation (Fig. 6B), the maximal ethanol production rate (0.32-0.76 g L-1 h -1) was achieved during the first 17 h, although further, a slight production was observed during the remaining period (0.02-0.05 g L-1 h-1). The latter is explained by the moderate but significant effect caused by milling. In all cases, the highest total ethanol yields were obtained from Elephant grass compared with eucalypt wood. The laccase-mediator pretreatment significantly increased ethanol production after 17 h of saccharification-fermentation. Interestingly, the enzymatic treatment was considerably more efficient improving ethanol production from eucalypt (over 4 g L-1 in 17 h) than from Elephant grass (~2 g L-1 in 17 h). The presence of the mediator seems necessary to improve ethanol production, since treatment with laccase alone was useless on Elephant grass, and only caused a very moderate increase in ethanol production from eucalypt (0.4 g L-1 in 17 h). Publicación 2 VI. Publicaciones  135 Fig. 6. Effect of enzymatic pretreatment on biomass enzymatic hydrolysis and saccharification: A) Comparison of glucose (black symbols) and xylose (white symbols) release during 0-72 h hydrolysis of Elephant grass (dashed lines) and eucalypt (continuous lines) pretreated with laccase-HBT (circles) and laccase alone (triangles) and controls without enzyme (squares); B) Time-course of ethanol production during simultaneous saccharification and fermentation of milled Elephant grass (dashed lines) and eucalypt (continuous lines) pretreated with laccase-HBT (circles) and laccase alone (triangles), in sequences including four enzymatic treatments and four alkaline peroxide extractions, and controls without enzyme (squares). Mean values from triplicate experiments. See Table 4 for final sugar yields and ethanol production. 0 4 8 12 16 0 1224364860 Time (h) Ethanol / (g/L) 0 1 2 3 4 5 0 122436486072 Time (h) Glucose/Xylose (g/L) A B VI. Publicaciones Publicación 2  136 Table 4. Monosaccharide (glucose and xylose) after 72 h (and 4 h, parenthesis) hydrolysis (% of sample weight), and ethanol release 64 h (and 17 h, parenthesis) after adding the yeast to the cellulase reaction (% of sample weight) from the Elephant grass and eucalypt samples treated with laccase-HBT (25 U g-1) in a sequence including four enzymatic treatments (and four alkaline peroxide extractions) compared with a control without enzyme and a treatment with laccase alone. Means ± S.D (from triplicates). Hydrolysis Fermentation Glucose (%) Xylose (%) Ethanol (%) Elephant grass Control 48.4 ± 1.3 (18.6 ± 1.3) 15.7 ± 0.8 (5.5 ± 0.4) 14.1 ± 0.1 (10.7 ± 0.2) Laccase-HBT 54.4 ± 1.3 (35.3 ± 1.6) 16.3 ± 0.6 (9.2 ± 0.5) 16.2 ± 0.6 (12.9 ± 0.1) Laccase alone 49.4 ± 1.2 (20.8 ± 2.7) 16.1 ± 0.4 (5.9 ± 0.6) 13.6 ± 0.6 (10.7 ± 0.2) Eucalypt Control 29.4 ± 5.1 (14.0 ± 2.6) 6.0 ± 1.0 (2.6 ± 0.4) 6.3 ± 0.4 (5.5 ± 0.2) Laccase-HBT 47.3 ± 1.5 (17.7 ± 1.1) 10.5 ± 0.2 (3.6 ± 0.2) 12.3 ± 0.2 (10.1 ± 0.1) Laccase alone 33.1 ± 1.1 (13.5 ± 1.6) 7.0 ± 0.3 (2.6 ± 0.4) 7.3 ± 0.9 (5.9 ± 0.1) 4. Conclusions Woody and nonwoody plant biomass can be significantly delignified by enzymes (30-50% lignin removal) by applying a sequence consisting of successive laccase-mediator and alkaline extraction stages, directly on the ground lignocellulosic material (i.e. without a partial degradation and subsequent deconstruction). The HSQC NMR spectra of the lignocellulosic samples showed a significant decrease of both aromatic and aliphatic lignin signals after the enzymatic treatments, and provide strong evidence for a Cα-oxidation degradation mechanism, with high presence of oxidized S units in the residual lignin. The improved cellulose hydrolysis, and higher ethanol production in enzyme/mediator-treated feedstock demonstrates the potential of this approach in biofuel production. Acknowledgements This study was funded by the LIGNODECO EU-project on "Optimised pre-treatment of fast growing woody and nonwoody Brazilian crops by detailed characterization of chemical changes produced in the lignincarbohydrate matrix" (KBBE-3-244362) and the ELLE, LIGNOCELL and RAPERO Spanish MICINN (co-financed by FEDER funds) projects (AGL2008-00709, AGL2011-25379 and BIO2008-01533, respectively). J. Ralph (Madison, Wisconsin, USA) is acknowledged for facilities to perform some of the NMR analyses and T. Liitia and T. Tamminen (VTT, Finland) for the contributions in enzymatic hydrolysis and fermentation. Publicación 2 VI. Publicaciones  137 Novozymes (Bagsvaerd, Denmark) is acknowledged for the T. villosa laccase and J.L. Colodette (Viçosa Federal University, Brazil) and J. Romero (ENCE, Spain) are acknowledged for the Elephant grass and eucalypt samples, respectively. J. Rencoret acknowledges the CSIC JAE- Doc contract of the program “Junta para la Ampliación de Estudios” cofinanced by the European Social Fund (ESF). References Alvira, P., Tomas-Pejo, E., Ballesteros, M., Negro, M.J., 2010. Pretreatment technologies for an efficient bioethanol production process based on enzymatic hydrolysis: A review. Bioresource Technology 101, 4851-4861. Babot, E.D., Rico, A., Rencoret, J., Kalum, L., Lund, H., Romero, J., del Río, J.C., Martínez, A.T., Gutiérrez, A., 2011. 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