Evaluación de la seguridad in vitro e in vivo de compuestos azufrados naturales para su uso potencial en el ámbito agroalimentario

89 Rev. Toxicol (2024) 41: 89 - 95 Evaluación de la seguridad in vitro e in vivo de compuestos azufrados naturales para su uso potencial en el ámbito agroalimentario: revisión bibliográfica Cascajosa-Lira A.1, Prieto A.I.1, Pichardo S.1, Guzmán-Guillén R.1*, Jos A.1, Aguinaga-Casañas M.A.2, Baños A.2, Cameán A.M.1 1Área de Toxicología, Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla, España. 2DMC Research Center SLU, Camino de Jayena s/n, Alhedin, 18620, Granada, España. Resumen: Recientemente, el interés por los compuestos organosulfurados ha aumentado debido a sus numerosas propiedades beneficiosas en el ámbito agroalimentario y de la salud. En este estudio se han evaluado diversas propiedades relacionadas con aspectos de la seguridad de compuestos orgánicos de azufre a través de ensayos in vitro e in vivo. Los resultados señalan que los compuestos derivados spropilglutatión y s-propilcisteína no presentan una actividad citotóxica o genotóxica relevante en estudios realizados en cultivos celulares. Además, el propilpropano tiosulfonato, propilpropano tiosulfinato, spropilglutatión, s-propilcisteína y el sulforafano no exhiben efectos genotóxicos en estudios realizados in vivo. Así mismo, se observó que el propilpropano tiosulfonato, el propilpropano tiosulfinato y el sulforafano muestran un perfil seguro a largo plazo en ensayos subcrónicos realizados en roedores. Estos hallazgos confirman la seguridad de los compuestos organosulfurados evaluados, subrayando la necesidad de realizar estudios toxicológicos completos para comprender plenamente sus efectos en sistemas biológicos y garantizar su uso seguro en aplicaciones agroalimentarias. Palabras clave: Allium; in vitro; in vivo; citotoxicidad; genotoxicidad. Abstract: In vitro and in vivo safety assessment of natural sulfur compounds for their potential use in the agri-food sector: bibliographic review. Recently, interest in organosulfur compounds has increased due to their numerous beneficial properties in the agri-food and health fields. In this study, various safety aspects of organic sulfur compounds have been evaluated through in vitro and in vivo assays. The results indicate that propyl-propane thiosulfonate, propyl-propane thiosulfinate, spropyl glutathione, s-propyl cysteine and sulforaphane do not exhibit genotoxic effects in vivo. In addition, s-propyl glutathione and s-propyl cysteine do not exhibit relevant cytotoxic or genotoxic activity in cell culture studies. Moreover, it was observed that propyl-propane thiosulfonate, propyl-propane thiosulfinate and sulforaphane show a safe long-term profile in subchronic assays in live animals. These findings confirm the safety of the evaluated organosulfur compounds, emphasizing the need for comprehensive toxicological studies to fully understand their effects on biological systems and ensure their safe use in agro-food applications. Keywords: Allium; in vitro; in vivo; cytotoxicity; genotoxicity. Introducción El género Allium incluye entre 600 y 700 especies como el ajo (A. sativum), la cebolla (A. cepa) o el puerro (A. porrum) (Putnik et al., 2019). Desde la antigüedad, las especies de este género han sido cultivadas por los humanos, y estuvieron entre las primeras plantas domésticas documentadas (Nicastro et al., 2015). El principal interés de estas especies reside en sus compuestos organosulfurados (OSCs), como el propilpropano tiosulfonato (PTSO), propilpropano tiosulfinato (PTS), s-propilglutatión (GSSP), s-propilcisteína (CSSP), que son metabolitos secundarios con actividad biológica y un aroma característico. Además, se ha demostrado que el sulforafano (SFN), otro OSC presente en verduras crucíferas pertenecientes al género Brassica, como la coliflor y el brócoli, mejora el estrés oxidativo, la capacidad antioxidante y la neuroinflamación (Baralic et al., 2024). Cuando los tejidos de la planta se dañan, se produce una cascada de reacciones enzimáticas por parte de la aliinasa, degradando los compuestos iniciales y dando lugar a nuevos metabolitos altamente reactivos y biológicamente activos (Ramírez et al., 2017). Los OSCs poseen interesantes propiedades antimicrobianas, antivirales, antiprotozoarias, antioxidantes, antidiabéticas, antiespasmódicas, anticancerígenas, antimutagénicas, antiasmáticas, antiamnésicas, antiinflamatorias, hepatoprotectoras, neuroprotectoras, hipotensoras, hipoglucemiantes, inmunomoduladoras y prebióticas (Ariza et al., 2021; Guillamón et al., 2021; Putnik et al., 2019; Rabelo-Ruiz et al., 2021; Sorlozano-Puerto et al., 2018). Todas estas propiedades le otorgan al género Allium diversos usos en varias áreas del conocimiento, y aunque tradicionalmente este género se ha utilizado con fines medicinales, en los últimos años se ha potenciado su uso en la industria agroalimentaria (Teshika et al., 2019). Así, los extractos de Allium ricos en OSCs pueden usarse potencialmente en los sectores de alimentación humana y piensos para animales como sustitutos de los conservantes sintéticos (Ribeiro-Santos et al., 2017; Sorlozano-Puerto et al., 2018). Sin embargo, su uso en alimentos es limitado debido a sus propiedades organolépticas (Poojary et al., 2017). Varios OSCs, como el PTSO y su principal derivado, el PTS, han demostrado tener potenciales aplicaciones en el almacenamiento de maíz, principalmente debido a su actividad antifúngica y antimicotoxigénica. Podrían usarse en concentraciones del orden de partes por millón para reducir hasta un 90% las concentraciones de micotoxinas producidas por Fusarium (Mylona et al., 2019). Además, debido a sus actividades antioxidantes y antibacterianas, el PTSO y el PTS insertados en una matriz sintética también se han propuesto para su uso en envases activos de alimentos para conservar mejor las ensaladas (Llana-Ruíz-Cabello et al., 2015, 2016). La introducción de estas nuevas aplicaciones podría llevar a un aumento en la exposición de los consumidores, haciendo necesario determinar un rango seguro de concentraciones para su uso en la industria. Aunque se ha revisado exhaustivamente la toxicidad de algunos OSCs, especialmente aquellos que contienen grupos alquilo en su estructura (Llana-Ruiz-Cabello et al., 2013), la seguridad de los OSCs que poseen grupos más complejos como los tiosulfonatos o tiosulfinatos aún no ha sido analizada en profundidad. Por todo ello, el objetivo del presente trabajo es poner de manifiesto los ensayos de evaluación toxicológica de los OSCs de interés agroalimentario: PTSO, PTS, GSSP, CSSP, SFN in vitro e in vivo disponibles en la bibliografía como un primer paso a su posible empleo como aditivo alimentario. Materiales y Métodos Se llevó a cabo una búsqueda en la literatura científica utilizando las plataformas de Science Direct y Pubmed. Las palabras clave empleadas fueron PTSO, PTS, GSSP, CSSP, SFN e in vitro o in vivo. Los criterios de inclusión en este trabajo fueron los siguientes: 1) artículos disponibles en inglés; 2) artículos publicados antes del 1 de Junio de 2024 y después del 1 de enero de 2000; 3) estudios realizados in vitro o in vivo; 4) estudios que realicen investigaciones relevantes sobre la potencial toxicidad de los OSCs (PTSO, PTS, GSSP, CSSP, SFN), como estudios de genotoxicidad, agudos, subcrónicos, etc. Se aplicaron los siguientes criterios de exclusión: 1) revisiones; 2) artículos publicados en idiomas distintos del inglés; 3) actas y disertaciones 4) libros o capítulos de libros; 5) material editorial; 6) estudios no centrados en la toxicidad de OSCs. Después de revisar los resúmenes y confirmar que los estudios eran adecuados y pertinentes para los objetivos establecidos, se eligieron un total de 12 artículos (Figura 1). *e-mail: [email protected] sergas.es 90 Rev. Toxicol (2024) 41: 89 - 95 Evaluación de la seguridad in vitro e in vivo de compuestos azufrados naturales para su uso potencial en el ámbito agroalimentario: revisión bibliográfica Figura 1. Esquema de los diferentes estudios seleccionados para la presente revisión. Resultados y Discusión En el presente trabajo se han abordado ensayos in vitro e in vivo con relación a la citotoxicidad, mutagenicidad, genotoxicidad, estrés oxidativo, morfología celular, biotransformación, estudios agudos y subcrónicos, y estudios sobre la reproducción y el desarrollo. Citotoxicidad Los estudios de citotoxicidad de OSCs se han llevado a cabo para PTSO, PTS, GSSP y CSSP y son principalmente el ensayo de reducción de MTS (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3- carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazolio), el ensayo del contenido total de proteínas (CP) y el ensayo de exclusión del azul tripán (AT). Respecto al PTSO, además de los ensayos anteriores, también se ha llevado a cabo el ensayo de captación de rojo neutro (RN). Los modelos in vitro utilizados son las líneas celulares: HepG2, Caco- 2 y L5178Y tk+/-. Los tiempos de exposición ensayados fueron 24 y 48 horas en todos los ensayos, exceptuando el ensayo de exclusión del azul tripán, cuyos tiempos de exposición fueron 4 y 24 horas. Las concentraciones efectivas medias (CE50) para cada una de las sustancias en las líneas celulares Caco-2 y HepG2 están expresadas en la tabla 1. Para la línea celular L5178Y tk+/- únicamente se ha realizado el ensayo de exclusión del azul tripán, cuyas CE50 obtenidas fueron 20 μM y 40 μM para 4 y 24 horas, respectivamente, en el caso del PTSO (Mellado- García et al., 2015). Para PTS en las mismas condiciones, las CE50 fueron de 25 μM y 17,5 μM a las 4 y 24 horas, respectivamente (Mellado-García et al., 2017). Estos resultados indican que la exposición a PTSO y PTS principalmente tiene un impacto inhibitorio sobre la viabilidad de las células dependiente de la concentración en los ensayos realizados tanto en células Caco-2, HepG2 como L5178Y tk+/-, con distintos grados de sensibilidad (Tabla 1) y duración en la respuesta. Respecto a los derivados GSSP y CSSP, no es posible alcanzar la CE50 incluso a las máximas concentraciones ensayadas (50–450 μM) (Cascajosa-Lira et al., 2023a). Mutagenicidad in vitro Los resultados de los estudios de mutagenicidad se encuentran en la tabla 2. Los OSCs evaluados han sido PTSO, PTS, GSSP y CSSP y los ensayos realizados el test de Ames (para todos ellos) y el ensayo de linfoma de ratón (MLA) en presencia y ausencia de la fracción microsomal S9 (sólo en el caso de PTSO y PTS). El PTSO no mostró un aumento en el número de colonias revertientes Tabla 1. Concentraciones efectivas medias (CE50) de PTSO, PTS, GSSP y CSSP expresadas en μM para las líneas celulares Caco-2 y HepG2, en los ensayos MTS, RN y CP. Sustancia ensayada Línea celular CE50 (μM) MTS RN CP Referencia 24h 48h 24h 48h 24h 48h PTSO Caco-2 374,2 ± 2,3 388,3 ± 1,6 367,9 ± 2,8 366,5 ± 1,9 369,8 ± 3,4 350,9 ± 1,5 Llana-Ruiz-Cabello et al., 2015 HepG2 415,14* 401,6* 400,7 ± 1,4 395,7 ± 2,6 380,8 ± 2,7 368,1 ± 3,1 Llana-Ruiz-Cabello et al., 2015 PTS Caco-2 340,0* 193,0* 280,0* 187,0* - 228,0* Mellado-García et al., 2017 GSSP Caco-2 FR FR - - FR FR Cascajosa-Lira et al., 2023a CSSP Caco-2 FR FR - - FR FR Cascajosa-Lira et al., 2023a FR= Fuera de Rango. Por encima del límite de solubilidad. * Dato de ± SD no aportado por el estudio. Tabla 2. Principales resultados en estudios de mutagenicidad para los compuestos PTSO, PTS, GSSP, CSSP y SFN. Sustancia ensayada Ensayo Referencia Ames MLA -S9 +S9 4h 24h PTSO Resultados negativos para las cepas TA97, TA98, TA100, TA102, TA104 usando concentraciones entre 1-20 mM Resultados negativos para concentraciones entre 2,5-30 μM Resultados positivos para concentraciones entre 2,5- 20 μM Mellado-García et al., 2015 PTS Resultados negativos para TA97, TA98, TA100, TA102 y TA104 usando concentraciones entre 8,75 y 280 µM Aumento del número de colonias para la cepa TA104, pero con IM < 2 a concentraciones entre 8,75 y 280 µM Resultados negativos para concentraciones entre 0,9-15,75 μM Mellado-García et al., 2017 GSSP Resultados negativos a concentraciones entre 5000– 312,5 μg/placa - - - Cascajosa-Lira et al., 2023a CSSP Resultados negativos a concentraciones entre 250– 15,63 μg/placa - - - Cascajosa-Lira et al., 2023a SFN Resultados negativos para las cepas TA97, TA98, TA100 y TA102 usando concentraciones 62-5000 µg de BSE/placa - - Zhou et al., 2015 91 Rev. Toxicol (2024) 41: 89 - 95 Cascajosa-Lira A, Prieto A.I., Pichardo S., Guzmán-Guillén R., Jos A., Aguinaga-Casañas M.A., Baños A., Cameán A.M en el test de Ames con cepas bacterianas, incluso a la concentración más alta probada (20 mM), tanto en presencia como en ausencia de S9, indicando ausencia de genotoxicidad en este ensayo. Además, a pesar de que en el ensayo MLA con células L5178Y tk⁺/⁻ se observaron aumentos en las frecuencias de mutación inducida tras 24 horas de exposición a concentraciones de 2,5 a 20 μM, no se detectaron aumentos significativos tras un tratamiento de 4 horas. Estos resultados indican que la mutagenicidad del PTSO podría estar influenciada por la duración de la exposición y la concentración utilizada (Mellado- García et al., 2015). Los estudios sobre la mutagenicidad del PTS indicaron que, en las cepas bacterianas de Salmonella typhimurium TA97, TA98 y TA100, no hubo un aumento en el número de colonias revertientes a ninguna de las concentraciones de PTS probadas, con o sin el sistema de activación metabólica S9. Tan sólo la cepa TA104 mostró un aumento en las colonias revertientes a las dos concentraciones más bajas en presencia de S9. Por su parte, en la cepa TA102, se observó una disminución en las colonias en ausencia de S9 (8,75-140 µM) y en presencia de S9 (8,75-35 µM), lo que podría indicar una posible interferencia con el crecimiento bacteriano más que una mutagenicidad directa. Además, el índice mutagénico fue inferior a 2 en todas las cepas, indicando que PTS no es mutagénico en estas condiciones. En el MLA con células L5178Y tk+/- tratadas con PTS durante 4 y 24 horas, no se encontraron diferencias significativas en las frecuencias de mutación inducidas. Los controles positivos confirmaron la validez de los ensayos (Mellado-García et al., 2017). Los estudios de mutagenicidad realizados con GSSP y CSSP, utilizando cepas de S. typhimurium (TA1535, TA102, TA100, TA98 y TA97A), no mostraron aumentos significativos en el número de colonias revertientes en ninguna de las cepas a las concentraciones probadas para cada sustancia (GSSP: 5000–312,5 μg/placa y CSSP: 250–15,63 μg/placa). Además, el índice de mutagenicidad (IM) de los compuestos ensayados tuvo valores de 0,7-1,4 para GSSP y 0,6-1,2 para CSSP, manteniéndose siempre por debajo de 2 (Cascajosa-Lira et al., 2023a). También se han llevado a cabo estudios de mutagenicidad y genotoxicidad para evaluar el extracto de brócoli rico en glucorafanina (BSE). En la prueba de Ames, cuatro cepas de S. typhimurium (TA97, TA98, TA100 y TA102) fueron expuestas a concentraciones de hasta 5000 µg de BSE/placa, tanto en presencia como en ausencia del sistema de activación metabólica S9. Los resultados no indicaron actividad mutagénica (Zhou et al., 2015). Genotoxicidad in vitro Los estudios de genotoxicidad llevados a cabo con OSCs (PTSO, PTS, GSSP, CSSP y SFN) son el ensayo de micronúcleos (MN) en la línea celular L5178Y tk⁺/⁻ y el ensayo cometa estándar y modificado con enzimas en la línea celular Caco-2. Los resultados se muestran en la tabla 3. En el ensayo de MN, las concentraciones de PTSO seleccionadas se basaron en la CE50 0-40 μM de la viabilidad celular en el modelo experimental considerado. En ausencia de la mezcla de activación metabólica S9, no se observó un aumento significativo en la frecuencia de células binucleadas con micronúcleos (BNMN) y tampoco hubo variaciones significativas en el índice de división nuclear (NDI). Sin embargo, en presencia de la mezcla S9, se detectó un aumento (p ≤ 0.001) en la frecuencia de BNMN a partir de 15 μM, lo que sugiere que, a partir de determinadas concentraciones, los metabolitos de PTSO pueden inducir la formación de MN (Mellado-García et al., 2015). Sin embargo, en el ensayo cometa, PTSO no indujo roturas de cadenas de ADN en células Caco-2 a ninguna de las concentraciones probadas (0-50 μM) después de 24 ó 48 horas de exposición. Además, la digestión enzimática de los núcleos con endonucleasa III (EndoIII) y formamidopirimidina ADN glicosilasa (FPG) no reveló un aumento en el daño del ADN en células tratadas con PTSO, lo que demuestra que este compuesto no causa daño genotóxico indirecto por oxidación del ADN (Mellado-García et al., 2015). Los estudios sobre la genotoxicidad del PTS indican que este compuesto puede inducir daños genéticos en células L5178Y tk+/-. Se observó un aumento significativo en la frecuencia de BNMN a la concentración más alta probada (17,25 µM) en ausencia del sistema de activación metabólica S9. Además, se registraron incrementos significativos a concentraciones de 20 y 25 µM en presencia de S9. Sin embrago, no se encontraron variaciones significativas en el NDI en comparación con el grupo control en ninguna de las concentraciones probadas, tanto en presencia como en ausencia de S9, lo que sugiere que los efectos observados pueden depender de factores específicos de la concentración y las condiciones del ensayo (Mellado-García et al., 2017). En el ensayo del cometa estándar, PTS no indujo roturas de ADN en células Caco-2 a concentraciones de 70 y 140 mM tras 24 y 48 horas de exposición, indicando ausencia de genotoxicidad a estos niveles. Aunque se observaron aumentos significativos en las roturas de ADN a 280 µM PTSO después de ambos tiempos de exposición en comparación con el grupo control, estos efectos fueron más pronunciados tras 48 horas, con la cantidad de ADN en la cola del cometa aproximadamente el doble que después de 24 horas. Cabe señalar que no se observó un aumento en el daño al ADN tras la digestión enzimática de los núcleos con Endo III o FPG en células expuestas a PTS. Por su parte, los controles positivos en todos los experimentos mostraron aumentos significativos en el porcentaje de ADN en la cola del cometa, confirmando la eficacia del ensayo (Mellado-García et al., 2017). Los estudios de genotoxicidad de GSSP y CSSP indicaron ausencia de Tabla 3. Principales resultados en estudios de genotoxicidad para los compuestos PTSO, PTS, GSSP y CSSP. Sustancia ensayada Ensayo Referencia Micronúcleos Cometa estándar Cometa modificado con enzimas -S9 +S9 PTSO Resultados negativos a concentraciones entre 5-40 μM Resultados positivos a concentraciones de 15 y 20 μM Resultados negativos a concentraciones entre 5-50 μM Resultados negativos a concentraciones entre 5-50 μM Mellado-García et al., 2015 PTS Resultados positivos a la concentración más alta ensayada (17,25 µM) Resultados positivos a concentraciones de 20 y 25 µM Resultados positivos a las 24 y 48h a la concentración de 280 µM Resultados negativos a concentraciones entre 5-50 μM Mellado-García et al., 2017 GSSP Resultados negativos a concentraciones entre 16,25-260 μM - Resultados negativos a concentraciones entre 112,5–450μM Resultados negativos a concentraciones entre 112,5–450 μM Cascajosa-Lira et al., 2023a CSSP Resultados negativos a concentraciones entre 31,25-500 μM - Resultados negativos a concentraciones entre 112,5–450 μM Resultados negativos a concentraciones entre 112,5–450 μM Cascajosa-Lira et al., 2023a 92 Rev. Toxicol (2024) 41: 89 - 95 Evaluación de la seguridad in vitro e in vivo de compuestos azufrados naturales para su uso potencial en el ámbito agroalimentario: revisión bibliográfica cambios significativos en la frecuencia de BNMN y en el NDI en células L5178Y tk+/- tras exposiciones de 4 y 24 horas, comparado con el control negativo. Además, en los ensayos del cometa estándar y modificados con enzimas (Endo III y FPG) en células Caco-2, GSSP y CSSP no produjeron roturas de ADN ni daño oxidativo del ADN a las concentraciones probadas (112,5–450μM) tras 24 ó 48 horas de exposición. Los controles positivos confirmaron la validez de los ensayos. En resumen, GSSP y CSSP no mostraron efectos genotóxicos en las condiciones evaluadas (Cascajosa-Lira et al., 2023a). A pesar de que se han realizado investigaciones sobre sus efectos biológicos y toxicológicos, la genotoxicidad específica del SFN no ha sido objeto de análisis en cultivos celulares. A pesar de que PTSO y PTS mostraron algunos resultados positivos en ensayos in vitro de mutagenicidad y genotoxicidad bajo condiciones específicas de concentración y tiempo de exposición, en presencia de la fracción de activación metabólica S9, los metabolitos resultantes de las reacciones de conjugación en fase II, como la unión con glutatión y cisteína, no exhiben estos efectos. Esto sugiere que los procesos de biotransformación en fase II pueden neutralizar los efectos perjudiciales observados con los compuestos parentales, subrayando la importancia de estas rutas metabólicas en la mitigación del potencial genotóxico de estos compuestos. Estudios de estrés oxidativo in vitro Se han realizado estudios de evaluación de las propiedades del PTSO para proteger y revertir efectos tóxicos, utilizando como agente tóxico el peróxido de hidrógeno (H2O2) (Llana-Ruiz-Cabello et al., 2015). Las concentraciones usadas de PTSO fueron: 65,3; 130,6 y 261,1 µM, y la de H2O2 100 µM. En los ensayos de protección (células tratadas con PTSO y posteriormente expuestas a H2O2), no se registró un efecto significativo en el contenido de Especies Reactivas de Oxígeno (ERO) después de 24 horas. Sin embargo, en células Caco-2 pretratadas con PTSO durante 48 horas antes de la exposición a H2O2, los niveles de ERO se mantuvieron similares al grupo control y menores que los observados tras la exposición a H2O2. De manera similar, no se observaron diferencias significativas en los niveles de glutatión (GSH) entre el grupo pretratado con H2O2 y aquellos expuestos a PTSO durante 24 horas. No obstante, después de 48 horas de exposición a PTSO, los niveles de GSH fueron significativamente más altos que en el grupo de H2O2, siendo similares al grupo control, lo que sugiere un efecto protector del PTSO frente al estrés oxidativo inducido por H2O2. En los ensayos de reversión (células expuestas primero a H2O2 y posteriormente tratadas con PTSO), el PTSO redujo significativamente los niveles de ERO en comparación con el grupo de H2O2 en todas las concentraciones probadas después de ambos tiempos de pretratamiento. Respecto a los niveles de GSH, no se observaron diferencias significativas entre los grupos expuestos a PTSO y el grupo de H2O2 a ninguna de las concentraciones probadas tras ambos tiempos de exposición. Estudios sobre la morfología celular Solo se encuentran disponibles estudios de morfología celular para PTSO en las líneas celulares HepG2 y Caco-2, correspondientes a hepatocarcinoma humano y adenocarcinoma de colon humano respectivamente, y a concentraciones correspondientes a la CE50, CE50/2 e CE50/4 de cada línea celular (Llana-Ruiz-Cabello et al., 2015). Dado que se ha documentado la actividad antitumoral del PTSO en diversas líneas celulares, como MCF-7, T-84 y HT-29, induciendo apoptosis celular a bajas concentraciones (Guillamón et al., 2023), es razonable anticipar cambios morfológicos significativos en líneas celulares neoplásicas tras la exposición a este compuesto. De hecho, la exposición de células Caco-2 a PTSO reveló cambios morfológicos significativos a las diferentes concentraciones y tiempos de exposición. A 92,5 μM de PTSO durante 24 horas, se observaron grandes espacios intercelulares y nucleolos segregados. A las 48 horas con la misma concentración, los resultados fueron similares, pero más intensos, apareciendo autofagosomas. La exposición a 370 μM de PTSO durante 24 horas resultó en una pérdida severa de viabilidad celular, con núcleos dañados y citoplasma necrótico. Las células expuestas a 92,5 μM durante 48 horas presentaron vacuolas autofágicas y mitocondrias con crestas transversales delgadas. A 185 μM durante 24 horas, se observaron núcleos y nucleolos dañados, dilatación en el retículo endoplásmico y mitocondrias alteradas. A 370 μM, el daño fue más pronunciado, con núcleos dañados y órganos necróticos visibles. En células HepG2, expuestas a 100 μM durante 24 y 48 horas, se observaron núcleos eucromáticos grandes y vesículas secretoras sin cambios morfológicos significativos respecto al control negativo. 400 μM, se detuvo el crecimiento celular, observándose características de apoptosis temprana y necrosis. Después de 48 horas a esta concentración, se encontraron restos celulares en el medio de cultivo y células con MN. Sin embargo, aunque no se han analizado los cambios morfológicos en células sanas, se ha reportado que el PTSO no llegó a alcanzar la concentración de CE50 en células MDBK a 100 µg/mL, equivalente a una concentración de 548 µM (Aguinaga et al., 2022), superior a las concentraciones utilizadas en ensayos con líneas celulares tumorales. Por lo tanto, sería relevante realizar estudios adicionales en diversas líneas de células sanas para evaluar exhaustivamente los cambios morfológicos inducidos por el PTSO y confirmar así la seguridad de este compuesto. Estudios de biotransformación en microsomas hepáticos La biotransformación del PTSO fue investigada mediante ensayos in vitro con microsomas de hígado de rata macho y hembra y de hígado humano, y la caracterización de los metabolitos se realizó mediante Cromatografía Líquida de Ultra Alta Resolución acoplada a Espectrometría de Masas (UHPLC-MS/MS). Se diseñó una ruta metabólica que incluía sólo los metabolitos con estructuras químicas bien conocidas. Esta ruta de transformación del PTSO incluye la hidroxilación, reducción y desaturación en la fase I, y la conjugación con glutatión y con cisteína en la fase II. Hasta donde se sabe, esta es la primera aproximación realizada de la ruta metabólica del PTSO (Cascajosa-Lira et al., 2023b). La transformación de PTS en dipropil disulfuro (DPDS) ha sido descrita previamente por Teyssier y Siess (2000), y en un estudio reciente, también se detectó DPDS en muestras de hígado de rata expuestas a PTSO (García-Nicolas et al., 2023). Cabe señalar que el DPDS es un compuesto autorizado tanto en alimentos destinados al consumo humano como en piensos para animales en la Unión Europea y, por lo tanto, no presenta riesgo para la salud humana (European Commission, Regulation (EU) No 872/2012; European Commission, Regulation (EU) 2017/62). Genotoxicidad in vivo Los estudios de genotoxicidad in vivo revisados engloban dos ensayos principales: el ensayo de MN en la médula ósea, y el ensayo cometa estándar y modificado con enzimas en sangre, estómago e hígado. Se han llevado a cabo estudios de genotoxicidad tanto para el PTSO (Mellado-García et al., 2016) como para el PTS (Cascajosa-Lira et al., 2021) y el SFN (Zhou et al., 2015). Sin embargo, no existen estudios in vivo para los conjugados: GSSP y CSSP. El PTSO ha sido evaluado por su potencial genotóxico en estudios recientes utilizando varios ensayos. Por un lado, en el ensayo de genotoxicidad y citotoxicidad en médula ósea, se expresa la proporción de eritrocitos policromáticos (PCE) entre el total de eritrocitos, y el porcentaje de micronúcleos (% MN). Los resultados mostraron que no hubo diferencias significativas en la proporción de PCE/total de eritrocitos entre los grupos experimentales y los controles negativos o positivos. Además, PTSO no indujo un aumento en la frecuencia de MN en eritrocitos inmaduros a ninguna de las dosis probadas (5,5; 17,4 y 55 mg/kg) (Mellado-García et al., 2016). En el mismo estudio, el PTSO no indujo roturas de cadenas de ADN en 93 Rev. Toxicol (2024) 41: 89 - 95 Cascajosa-Lira A, Prieto A.I., Pichardo S., Guzmán-Guillén R., Jos A., Aguinaga-Casañas M.A., Baños A., Cameán A.M la sangre, el estómago y el hígado a ninguna de las dosis ensayadas (5,5; 17,4 y 55 mg/kg) en el ensayo cometa estándar y su versión modificada por enzimas Endo III y FPG (Mellado-García et al., 2016). Estos resultados indican que el PTSO no provoca daño significativo en el ADN ni induce lesiones oxidativas en los tejidos evaluados, lo que sugiere un efecto no genotóxico en las condiciones ensayadas. Por otro lado, el PTS también ha sido evaluado in vivo con los ensayos de MN y cometa estándar y modificado con enzimas, en ratas expuestas a dosis de 5,5, 17,4, y 55 mg/kg PTS (Cascajosa-Lira et al., 2021). En el ensayo de MN, se observaron diferencias significativas en la relación entre eritrocitos policromáticos (PCE) y eritrocitos normocromáticos (NCE). En los animales tratados con la dosis más alta de 55 mg/kg, tanto en machos como en hembras, hubo una disminución en esta relación (p < 0.05). Así mismo, la relación PCE/total de eritrocitos mostró una reducción en machos y hembras a 55 mg/kg (p < 0.05) y sólo en hembras a 17,4 mg/kg (p < 0.05). Sin embargo, el porcentaje de MN en eritrocitos inmaduros no mostró cambios significativos en ninguno de los grupos de ambos sexos. En el ensayo cometa estándar y modificado por enzimas, los resultados mostraron que no hubo roturas significativas de cadenas de ADN en el hígado, estómago y sangre de las ratas tratadas con PTS en ninguna de las dosis ensayadas y en ninguno de los sexos. Del mismo modo, no se encontraron cambios notables en la frecuencia de sitios sensibles a Endo III o FPG en ningún tejido evaluado (Cascajosa-Lira et al., 2021). Estos resultados sugieren que el PTS no provoca daños significativos en el ADN en los sitios sensibles a las enzimas reparadoras de ADN evaluadas, indicando ausencia de genotoxicidad en las condiciones ensayadas. Por otro lado, se ha demostrado que el tratamiento con BSE rico el glucurafanina (precursor del SFN) a dosis de hasta 10 g/kg de peso corporal no altera las proporciones de PCE/RBC significativamente en el ensayo de MN en médula ósea de ratón. Esto indica que el BSE no fue citotóxico para la médula ósea tras la exposición oral. No hubo diferencias estadísticamente significativas en la frecuencia de MN entre todos los grupos de dosis (2,5-5,0-10,0 g/kg) y los grupos de control negativo (p > 0.05). La frecuencia de MN en los grupos de control positivo, tanto machos como hembras, fue significativamente mayor que en el grupo de control negativo (p < 0.05), lo que indica la validez del ensayo (Zhou et al., 2015). Para asegurar la validez de los resultados negativos de genotoxicidad en estudios in vivo, es fundamental demostrar analíticamente la presencia de los compuestos ensayados en el tejido diana. En este sentido, Mellado-García et al. (2016) demostraron la presencia de metabolitos de PTSO en el tejido diana, lo cual valida sus resultados y confirma que el compuesto fue metabolizado y alcanzó los tejidos de interés sin ejercer ningún efecto tóxico. Por otro lado, Cascajosa-Lira et al. (2021) demostraron efectos citotóxicos de PTS en la médula, subrayando que el compuesto llegó correctamente al tejido diana sin producir efectos genotóxicos. En contraste, Zhou et al. (2015) no realizaron estudios analíticos para confirmar la presencia de SFN en los tejidos a pesar de haber obtenido resultados negativos en sus ensayos de genotoxicidad. Esta omisión plantea dudas sobre la interpretación de los resultados, ya que, sin la confirmación analítica, no se puede asegurar que la ausencia de efectos tóxicos se deba realmente a la no toxicidad del compuesto y no a una falta de exposición efectiva de los tejidos al mismo. Toxicidad aguda y subcrónica Se han realizado estudios subcrónicos de 90 días en ratas para evaluar los efectos del PTSO (Cascajosa-Lira et al., 2020) y PTS (Cascajosa- Lira et al., 2022), a dosis de hasta 55 mg/kg, así como un estudio de 30 días con extracto de brócoli rico en glucorafanina (BSE) a una dosis de 3 g/kg (Zhou et al., 2015). El estudio de toxicidad oral aguda del PTSO en ratas determinó que una dosis de 2000 mg/kg fue letal en 24 horas, causando inflamación en intestino e hígado, con necrosis hepática y enteritis severa. A 175 mg/kg también resultó letal, aunque mostrando daños histológicos menos intensos, mientras que la dosis de 55 mg/kg fue tolerada, estableciendo este valor como la dosis máxima tolerada (DMT) (Llana-Ruiz Cabello et al., 2015). El estudio de toxicidad oral subcrónica del PTSO en ratas no reveló muertes no programadas ni signos clínicos relevantes atribuibles al compuesto. No se observaron diferencias significativas en el aumento de peso corporal, consumo de alimentos y agua, así como en la eficiencia del consumo de alimentos entre los grupos control y tratados. Los parámetros hematológicos y bioquímicos no indicaron signos de toxicidad. Tampoco se detectaron patologías visibles durante la necropsia, ni alteraciones en los pesos de los órganos, y los exámenes histopatológicos no mostraron diferencias en comparación con el grupo control. Por todo esto, el PTSO no presentó efectos tóxicos subcrónicos significativos a las dosis evaluadas (Cascajosa-Lira et al., 2020). El estudio de toxicidad aguda del PTS en ratas estableció la DL50 en 550 mg/kg y la DMT en 175 mg/kg, ya que esta última dosis administrada por sonda gástrica no causó muerte ni lesiones clínicas (Cascajosa-Lira et al., 2022). El estudio de toxicidad subcrónica del PTS a 55 mg/kg en ratas no mostró alteraciones en la marcha, postura, movimientos o comportamiento. Los exámenes oftalmológicos tampoco revelaron anormalidades. Del mismo modo, no se observaron diferencias significativas en el peso corporal, ganancia de peso, ingesta de alimentos o eficiencia de conversión de alimentos. En hematología y bioquímica clínica, no hubo cambios relevantes. Las necropsias y el peso de los órganos no mostraron diferencias significativas, y la histopatología no reveló características patológicas en los órganos evaluados, incluidos el sistema gastrointestinal, respiratorio, linfático, urinario, circulatorio, nervioso, musculoesquelético y reproductivo. En resumen, la administración subcrónica de PTS no produjo toxicidad en ratas a las dosis estudiadas (Cascajosa-Lira et al., 2022). En cuanto al SFN, existen pocos estudios sobre su toxicidad aguda y subcrónica. Scola et al. (2017) detectaron una toxicidad severa, manifestada en sedación profunda, ataxia, ptosis y temblores en ratones expuestos a dosis altas de SFN administradas por vía intraperitoneal. En este estudio, una dosis de 300 mg de SFN/kg provocó la muerte de todos los animales en las primeras tres horas. Dosis de 250 mg/kg causaron síntomas similares, con la muerte de siete de doce ratones en cuatro horas. A 200 mg/kg, todos los animales mostraron sedación y ptosis, y seis de doce murieron durante la primera noche. A dosis menores, como 150 mg/kg, la sedación persistió, pero no hubo mortalidad. Además, los autores calcularon la dosis letal media (LD50) en 212,67 mg/kg. Por otro lado, Zhou et al. (2015) estudiaron los efectos de BSE en ratas expuestas oralmente durante 30 días a una dosis de 3 g/kg/día (equivalente a 390 mg/kg/día de glucorafanina, precursor de SFN). No se observó mortalidad ni efectos clínicos adversos relacionados con el tratamiento durante el periodo de estudio. Los animales mantuvieron actividades y crecimiento normales, y los pesos corporales no presentaron diferencias significativas entre los grupos tratados con SFN y los grupos control. Hubo una ligera disminución en el consumo de alimentos en los machos de dosis alta, asociada con un aumento en la eficiencia alimentaria, lo que mantuvo la ganancia de peso corporal similar a la de los grupos de control. Se observaron variaciones menores en los parámetros de hematología y química clínica, pero dentro del rango de control histórico, sin una relación clara de dosis-respuesta. Los parámetros de química clínica mostraron cambios mínimos dentro del rango de control histórico del laboratorio, sin diferencias significativas en los indicadores de toxicidad hepática o renal. Los pesos de los órganos aumentaron en los machos de dosis alta para el bazo y los riñones, mientras que el peso absoluto de los testículos se redujo ligeramente, aunque todos los valores se mantuvieron dentro del rango de control histórico. Las evaluaciones macroscópicas en la necropsia no revelaron anormalidades, y las evaluaciones histológicas de varios 94 Rev. Toxicol (2024) 41: 89 - 95 Evaluación de la seguridad in vitro e in vivo de compuestos azufrados naturales para su uso potencial en el ámbito agroalimentario: revisión bibliográfica tejidos mostraron estructuras normales sin anormalidades atribuibles al tratamiento con SFN. Toxicidad reproductiva sobre dos generaciones El estudio de toxicidad reproductiva y multigeneracional del PTSO en ratones CD1 no mostró cambios clínicos ni mortalidad atribuida a su administración en tres fases (pre-apareamiento, gestación y lactancia) y a tres dosis diferentes (14, 28 y 55 mg/kg/día) (Cascajosa-Lira et al., 2024). Se observaron algunos cambios en el peso corporal y el consumo de alimentos, pero no estaban relacionados con el sexo ni eran dependientes de la dosis. Las dos generaciones parentales (F0, F1) mostraron un rendimiento reproductivo normal, y las crías (F1 y F2) nacieron sin anormalidades. Los niveles séricos de hormonas sexuales (progesterona, testosterona, estradiol, hormona foliculoestimulante y hormona luteinizante) estaban en rangos normales. Aunque se observaron cambios significativos en el análisis de esperma en la generación F0, no se encontraron variaciones en la generación F1 ni alteraciones en la fertilidad. Los pesos absolutos y relativos de los órganos, así como los estudios histopatológicos, no mostraron alteraciones significativas en ninguna de las generaciones. El PTSO no se consideró tóxico para la reproducción ni con afectación sobre el desarrollo en ratones bajo las condiciones ensayadas. Estos resultados se alinean con estudios previos en ratas Sprague-Dawley, estableciendo un nivel sin efecto adverso observado (NOAEL) ≥ 55 mg/kg/día para animales parentales y sus crías. Este tipo de estudios, siguiendo directrices regulatorias, son importantes para la evaluación de riesgos, ya que examinan una amplia gama de parámetros relevantes y sensibles para identificar posibles efectos adversos, asegurando datos completos y fiables. Otros estudios En un estudio sobre los efectos del PTSO en la disrupción endocrina (Cascajosa-Lira et al., 2023c), no se registraron cambios significativos en el peso de los órganos endocrinos de ratones, ni en los ciclos estrales de las hembras. No se observaron alteraciones significativas en los niveles séricos de hormonas sexuales en ratones macho. En hembras, hubo una disminución significativa en la expresión de genes relacionados con la esteroidogénesis y los receptores hormonales a ciertas dosis de PTSO, pero sin mostrar un efecto claro dependiente de la dosis y por lo tanto no atribuible al compuesto. Además, se encontró que el PTSO no interactúa eficazmente con los receptores de estrógenos y andrógenos según los análisis de acoplamiento molecular. Estos resultados indican que, aunque PTSO muestra ciertos efectos en la expresión génica y las hormonas, éstos no tienen relevancia toxicológica. Además, se ha publicado una revisión que incluye varios estudios sobre la efectividad del PTSO y el PTS, entre otros extractos de Allium, administrados a animales de granja con el objetivo de mejorar la microbiota intestinal. Aunque las dosis administradas son más bajas que las evaluadas en los estudios toxicológicos, es importante destacar que ninguno de los animales mostró signos de toxicidad durante todo el periodo del ensayo (Guillamón et al., 2021). Conclusión En conclusión, los estudios presentados en este trabajo proporcionan una evaluación exhaustiva, tanto in vitro como in vivo, de la citotoxicidad, mutagenicidad, genotoxicidad, estrés oxidativo, morfología celular, biotransformación, estudios agudos y subcrónicos y efectos reproductivos y de desarrollo de diversos OSCs. Los hallazgos indican que los derivados GSSP y CSSP no muestran actividad citotóxica ni genotóxica significativa in vitro, y que PTSO, PTS, GSSP, CSSP y SFN no presentan efectos genotóxicos in vivo. PTSO, PTS y SFN muestran un perfil seguro a largo plazo en ensayos subcrónicos in vivo, apoyando su perfil de seguridad para aplicaciones en el sector agroalimentario. Los estudios también subrayan la importancia de las rutas metabólicas de biotransformación, que pueden neutralizar los efectos dañinos de los compuestos parentales. En general, los datos sugieren que la evaluación de estos compuestos debe considerar tanto sus efectos directos como los resultados de su metabolismo, para una comprensión completa de su toxicidad potencial y una correcta valoración de su seguridad para su aplicación en la industria alimentaria. Agradecimientos Agradecimientos: Proyecto P18-TP247 de la Junta de Andalucía. Antonio Cascajosa Lira agradece al Ministerio de Universidades la concesión del contrato FPU (2019/01247). Bibliografía 1. Aguinaga-Casañas, M.A.; Mut-Salud, N.; Falcón-Piñeiro, A.; Alcaraz-Martínez, Á.; Guillamón, E.; Baños, A. In Vitro Antiparasitic Activity of Propyl-Propane-Thiosulfinate (PTS) and Propyl-Propane-Thiosulfonate (PTSO) from Allium cepa against Eimeria acervulina Sporozoites. 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