Conservantes alimentares baseados em compostos bioativos

Universidade do MinhoEscola de CiênciasDiana Margarida Correia Pereirajulho 2021 Conservantes alimentares baseados em compostos bioativos Diana Margarida Correia Pereira Conservantes alimentares baseados em compostos bioativos UMinho|2021 Universidade do MinhoEscola de CiênciasDiana Margarida Correia Pereirajulho 2021 Conservantes alimentares baseados em compostos bioativosTrabalho efetuado sob a orientação daDra. Maria Sameiro Torres Gonçalvese doDr. David Alexandre Micael PereiraDissertação de Mestrado Mestrado em Bioquímica Aplicada i DIREITOS DE AUTOR E CONDIÇÕES DE UTILIZAÇÃO DO TRABALHO POR TERCEIROS Este é um trabalho académico que pode ser utilizado por terceiros desde que respeitadas as regras e boas práticas internacionalmente aceites, no que concerne aos direitos de autor e direitos conexos. Assim, o presente trabalho pode ser utilizado nos termos previstos na licença abaixo indicada. Caso o utilizador necessite de permissão para poder fazer um uso do trabalho em condições não previstas no licenciamento indicado, deverá contactar o autor, através do RepositóriUM da Universidade do Minho. Licença concedida aos utilizadores deste trabalho Atribuição-NãoComercial-SemDerivações CC BY-NC-ND ii Agradecimentos Desejo exprimir o meu obrigado a todos os que, de alguma forma, permitiram que este barco chegasse a bom porto. Em especial, aos meus orientadores, à Professora Doutora Sameiro Gonçalves, da Universidade do Minho, minha orientadora, o meu obrigado por desde o primeiro momento ter acreditado em mim e nas minhas capacidades. Agradeço todo o carinho e o acompanhamento manifestados durante todo o trabalho, e a preocupação durante todo o percurso. Ao Professor Doutor David Pereira, da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto, meu coorientador, o meu obrigado por me ter deixado fazer parte do seu grupo de trabalho, e desde o primeiro segundo, me ter feito sentir acolhida no mesmo. Agradeço o trato simples, que sempre usou durante as nossas reuniões de trabalho, e ainda, a preocupação e nunca ter permitido o desalento, quando as coisas não correram como esperado. Aos meus amigos e colegas do BioTarget Research Group , agradeço todas as dicas e ajuda prestadas durante todo o trabalho laboratorial. À Cristina e ao Dr. Rui, funcionários do Laboratório de Farmacognosia da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto, o meu maior agradecimento por estarem sempre dispostos a indicar-me onde estaria o material, e, ainda, obrigada pelas palavras amigas. Não poderia deixar de agradecer à Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) pelo financiamento fornecido no âmbito do Projeto PTDC/ASP-AGR/30154/2017, o meu muito obrigada. Um agradecimento especial à minha avó Júlia e ao meu Pai, que sempre estiveram presentes durante toda a caminhada e nunca permitiram que eu desistisse. À minha Mãe, que decerto que teria ficado feliz por este momento. E à minha irmã Rita e à minha afilhada Mafalda, a luz da minha vida, que permitiram que eu nunca baixasse os braços, e por sempre me impulsionarem a dar o meu melhor. À minha família pela compreensão e paciência durante todo este tempo. Por fim, a todos aqueles que contribuíram, direta ou indiretamente, para a realização desta dissertação, o meu sincero agradecimento. iii DECLARAÇÃO DE INTEGRIDADE Declaro ter atuado com integridade na elaboração do presente trabalho académico e confirmo que não recorri à prática de plágio nem a qualquer forma de utilização indevida ou falsificação de informações ou resultados em nenhuma das etapas conducente à sua elaboração. Mais declaro que conheço e que respeitei o Código de Conduta Ética da Universidade do Minho. iv Conservantes alimentares baseados em compostos bioativos Resumo Nos últimos anos, a investigação ao nível dos produtos naturais registou um crescimento exponencial. A indústria alimentar tem acompanhado os avanços registados, com o propósito de utilizar produtos naturais no revestimento dos alimentos, nas embalagens e constituição nutricional, assim como na incorporação direta com funções tecnológicas, como conservantes alimentares. Estes compostos têm vindo a aumentar a vida útil dos produtos alimentícios devido à sua capacidade antimicrobiana e à sua atividade na inibição da tirosinase, sendo já utilizado na cosmética e na odontologia. Um destes compostos é o eugenol, um fenilpropanóide que tem sido muito estudado quanto à capacidade para inibir o crescimento de diversos microrganismos, como bactérias, fungos, patogéneos orais e alimentares, entre outros. Os diversos estudos que têm sido reportados demonstraram que o eugenol, composto bioativo extraído de diversas plantas, como o cravinho– da–índia, tem um importante potencial inibitório no crescimento microbiano e ainda um relevante potencial antioxidante. Atendendo aos aspetos referidos, o eugenol, seus derivados O -alquilados, oxiranos e β-amino álcoois e um análogo, assim como um derivado O -alquilado do carvacrol, anteriormente obtidos por síntese química, foram usados neste trabalho. Os estudos de atividade biológica efetuados com os vinte compostos incluíram a atividade antimicrobiana, contra a Escherichia coli , Pseudomonas aeruginosa , Salmonella typhi , Staphylococcus aureus e Candida albicans . Dezoito dos compostos foram também avaliados relativamente à atividade inibitória da tirosinase, de modo a verificar-se o potencial destes na diminuição do escurecimento enzimático dos alimentos. Os resultados obtidos mostraram que alguns dos compostos estudados são promissores como potenciais conservantes alimentares aumentando a vida útil dos alimentos, devido às suas atividades inibitórias do crescimento microbiano, bem como à capacidade de inibição da atividade da tirosinase. Palavras-Chave: Atividade antimicrobiana; composto bioativo; conservante alimentar; escurecimento enzimático; eugenol; óleos essenciais; tirosinase. v Food preservatives based on bioactive compounds Abstract In last years, research into natural products has grown exponentially. The food industry has followed the advances made, with the purpose of using natural products in food coating, packaging, and nutritional constitution, as well as in the direct incorporation with technological functions, such as food preservatives. These compounds have been increasing the shelf life of food products due to their antimicrobial capacity and their activity in inhibiting tyrosinase. One of these compounds is eugenol, a phenylpropanoid that has been widely studied as to the ability to inhibit the growth of various microorganisms, such as bacteria, fungi, oral and food pathogens, among others. The several studies that have been reported have shown that eugenol, a bioactive compound extracted from several plants, such as clove, has an important inhibitory potential in microbial growth, and a relevant antioxidant potential, being already used in cosmetics and dentistry. In view of the afore mentioned aspects, eugenol, its O -alkylated derivatives, oxiranes and β-amino alcohols and an analogue, as well as an O -alkylated derivative of carvacrol, previously obtained by chemical synthesis, were used in this work. Biological activity studies performed with the twenty compounds included antimicrobial activity against Escherichia coli , Pseudomonas aeruginosa , Salmonella typhi , Staphylococcus aureus and Candida albicans . Eighteen of the compounds were also evaluated for tyrosinase inhibitory activity, to verify their potential in decreasing the enzymatic browning of foods. The results obtained showed that some of the compounds studied are promising as potential food preservatives, increasing the shelf life of foods, due to their microbial growth inhibitory activities, as well as their capacity to inhibit tyrosinase activity. Keywords: Antimicrobial activity; bioactive compound; food preservative; enzymatic browning; eugenol; essential oils; tyrosinase. vi Índice Agradecimentos..................................................................................................................... ii DECLARAÇÃO DE INTEGRIDADE ........................................................................................... iii Resumo ............................................................................................................................... iv Abstract ................................................................................................................................ v Índice ................................................................................................................................... vi Abreviaturas ........................................................................................................................ viii Lista de figuras ..................................................................................................................... xi Lista de tabelas ................................................................................................................... xiii Lista de esquemas .............................................................................................................. xiv Dedicatória .......................................................................................................................... xv Objetivos ............................................................................................................................. xvi Capítulo 1 – Introdução teórica ............................................................................................... 17 1.1 Conservantes alimentares ....................................................................................... 18 1.2 Óleos essenciais e outros compostos bioativos......................................................... 20 1.2.1 Definição de compostos bioativos ........................................................................ 20 1.2.2 Classificação química dos produtos naturais ........................................................ 20 1.2.2.1 Compostos fenólicos ........................................................................................ 20 1.2.2.2 Terpenos ......................................................................................................... 22 1.2.3 Extração de óleos essenciais ................................................................................ 24 1.2.4 Atividade biológica dos componentes dos óleos essenciais ................................... 27 1.2.4.1. Atividade antibacteriana ................................................................................... 29 1.2.4.2. Atividade antifúngica ........................................................................................ 31 1.3. Eugenol ................................................................................................................... 33 1.3.1. Mecanismo de ação do eugenol ........................................................................... 34 xiii Lista de tabelas Tabela 1-Composição química de alguns OEs que exibem propriedades antimicrobianas. Tabela 2-Ocorrência e % de eugenol em diferentes plantas (Marchese et al ., 2017). Tabela 3-Ocorrência e abundância de carvacrol em diferentes plantas (Burt, 2004; De Vincenzi et al ., 2004; Rai et al ., 2017). Tabela 4-Nomenclatura dos compostos testados. Tabela 5-Conclusão da MIC dos compostos testados (µM). xiv Lista de esquemas Esquema 1-Via sintética da melanina, adaptado de (Murray, 2016). Esquema 2-Atividades das PPOs, adaptado de (Dwivedi, 2013). Esquema 3-Diferentes estruturas conformacionais do local ativo da tirosinase, adaptado de (Murray, 2016). Esquema 4-Síntese dos derivados O -alquilados e oxiranos do eugenol 2-12. Esquema 5-Derivados do eugenol 14-17 resultantes do oxirano 7 e diferentes aminas. Esquema 6-Síntese do composto 19. Esquema 7-Reação de O -alquilação do carvacrol. xv Dedicatória À minha mãe ( in memoriam), Inês, que, onde está, deve sentir orgulho ao ver um dos nossos sonhos a ser realizado. À minha avó materna, Júlia, por ser a melhor segunda mãe que eu poderia desejar e a melhor amiga do mundo. Ao meu pai, Agostinho, que apesar das dificuldades e da doença nunca deixou de estar presente em todos os momentos da minha vida. À minha irmã, Rita, por ser a luz da minha vida, somos e seremos sempre o apoio uma da outra. À minha afilhada, Mafalda, por ser a minha princesinha e, apenas, o teu sorriso faz o meu dia. xvi Objetivos Este trabalho consistiu no estudo de atividade biológica do eugenol, seus derivados O - alquilados, oxiranos e β-amino álcoois e um análogo, assim como um derivado O -alquilado do carvacrol, anteriormente obtidos por síntese química. Os objetivos incluíram a avaliação da atividade antimicrobiana dos compostos referidos contra espécies de relevância alimentar e na inibição do escurecimento enzimático de modo a avaliar o potencial dos mesmos como conservantes alimentares, pelas capacidades antimicrobianas e/ou antioxidantes. Especificamente, estudou-se a atividade dos compostos anteriormente mencionados contra microrganismos de diferentes tipos como a Escherichia coli , a Pseudomonas aeruginosa, a Salmonella typhi, o Staphylococcus aureus e a Candida albicans e determinou-se a Concentração Mínima Inibitória (MIC). Foi igualmente estudado o efeito dos compostos na inibição da atividade da tirosinase e consequentemente na inibição do escurecimento enzimático. 17 Capítulo 1 – Introdução teórica 18 1.1 Conservantes alimentares Desde o início da Humanidade que produtos naturais são usados como conservantes dos alimentos, devido aos seus benefícios. Ao longo dos anos, alguns estudos experimentais, com vista à avaliação das potencialidades de algumas plantas, conduziram à descoberta de novos compostos com propriedades físico-químicas específicas e benéficas para a sua utilização na medicina, na indústria farmacêutica e em outras áreas que advêm destas (Lubbe & Verpoorte, 2011). Fatores bióticos, tais como os microrganismos, e abióticos, tais como a oxidação de alimentos, têm sido um grave problema para a indústria alimentar, quer a nível económico, quer ético e quer legal, pois estes alteram a vida útil dos alimentos (Kourkoutas & Proestos, 2020). Para resolver este problema são adicionados aos alimentos diferentes aditivos, substâncias que aumentam a durabilidade dos produtos, e ainda podem modificar as suas propriedades, como a aparência, o sabor e a estrutura (Silva & Lidon, 2016). Estes compostos aumentam a vida útil dos alimentos através da supressão da atividade dos microrganismos patogénicos (Kourkoutas & Proestos, 2020), pois têm a capacidade de atuar contra bactérias, fungos, patogéneos alimentares e orais, e biofilmes microbianos (Marchese et al ., 2017), não alterando os benefícios alimentares para os consumidores, nem provocando alterações químicas e biológicas nos alimentos. Estas substâncias podem ser naturais ou sintéticas, sem valor nutricional, sendo adicionadas em pequenas quantidades aos alimentos durante o seu processamento industrial e o seu embalamento (Silva & Lidon, 2016). Têm sido realizados alguns estudos, de modo a investigar o uso de compostos naturais, tais como os óleos essenciais (OEs), para o revestimento de alimentos. Os óleos essenciais (OEs) são líquidos lipofílicos de natureza aromática obtidos a partir de material vegetal, que pode ser flores, sementes, folhas, galhos e cascos das árvores, ervas, madeira, frutas e raízes. Podem ser obtidos de diversas formas, desde expressão, fermentação, enfloramento, ou hidrodestilação, mas o método mais comumente usado é a destilação por arrastamento de vapor, usado na produção comercial de OEs (Nehme et al ., 2021). Atualmente, os OEs são usados em diversos campos, tais como o farmacêutico e o cosmético, devido às suas atividades biológicas, tais como a antibacteriana, antifúngica e antioxidante. 19 Futuramente, o intuito é o uso de OEs na indústria alimentar. Para tal, vários estudos têm vindo a ser realizados sobre o revestimento de frutos. Um dos estudos realizados foi com o revestimento da maçã, sendo usado um único composto ou a combinação de vários, nomeadamente o eugenol e o citral. Neste estudo, ficou comprovado que o uso destes revestimentos comestíveis limitou a colonização de diferentes patogéneos, contribuindo para um consumo seguro destes frutos que foram ligeiramente processados (Vieira et al ., 2019). 20 1.2 Óleos essenciais e outros compostos bioativos 1.2.1 Definição de compostos bioativos Todos os seres vivos necessitam de sintetizar compostos químicos para a sua sobrevivência e para o seu crescimento. Os compostos bioativos das plantas são metabolitos produzidos pelas células, podendo dividir-se em dois grupos, os metabolitos primários e os metabolitos secundários. Os primários estão interligados com o crescimento e desenvolvimento, enquanto os secundários estão relacionados com a capacidade de sobrevivência da planta em relação ao ambiente que a rodeia. Os metabolitos primários advêm do metabolismo geral comum a todos os seres vivos, animais e vegetais, tendo como objetivo a síntese de compostos essenciais para a sua sobrevivência. Nas plantas, este metabolismo está associado a diversos processos, como o Ciclo de Krebs, para a formação de ácidos carboxílicos, e ainda originam a formação de açúcares, aminoácidos, ácidos gordos, hidratos de carbono, ácidos nucleicos e proteínas, estando todos estes envolvidos nos processos vitais da planta (D. F. L. dos S. Almeida, 2017; Schaaf et al ., 1995). Os metabolitos secundários são originados através de vias biossintéticas dedicadas e permitem que a planta responda a diferentes fatores ambientais, físicos ou biológicos, permitindo por vezes a comunicação com diferentes organismos (Castro et al ., 2005). Estas moléculas podem desempenhar funções na reprodução e no crescimento, fundamentalmente na polinização, e, ainda, atuam como mecanismos de defesa contra radiação ultravioleta, agentes patogénicos, parasitas e predadores, contribuindo também para a cor e o sabor das plantas. 1.2.2 Classificação química dos produtos naturais Os produtos naturais podem ser classificados em diferentes famílias de acordo com a sua estrutura química e origem biossintética. Entre estes grupos encontram-se, por exemplo, os (poli)fenóis, terpenos, alcaloides, entre outros. 1.2.2.1 Compostos fenólicos Os compostos fenólicos são caraterizados pela presença de um anel aromático que contém, no mínimo, um grupo hidroxilo (fenol) na sua estrutura, podendo ser livre ou, em alguns casos, de natureza heterosídica. 21 A grande diversidade estrutural dos compostos fenólicos permite dividi-los em duas grandes classes, devido à sua origem biossintética, os derivados do ácido chiquímico e os derivados da via acetato (Bruneton et al., 2001). Dentro dos compostos fenólicos podem considerar-se diversas subclasses, incluindo os ácidos fenólicos, cumarinas, lenhanas, flavonóides, antocianinas, taninos, entre outras. Exemplos destes podem ser encontrados na Figura 1. Figura 1-Exemplos de compostos fenólicos: ácido sináptico I (ácido fenilpropanóico), esculetina II (cumarina), magnoliol III (neolenhana), pinosilvina IV (estilbeno), mangiferina V (xantona), quercetina VI (flavonol), fisciona VII (antraquinona), xantoxilina VIII (benzofenona) e tetrahidrocanabinol (THC) IX (canabinóide). Os ácidos fenólicos incluem as moléculas que apresentam uma função carboxílica e um hidroxilo fenólico, enquanto os fenóis simples não apresentam a função carboxílica. As cumarinas são 2 H -1-benzopiran-2-onas, podendo considerar-se como lactonas dos ácidos 2hidroxiZ -cinâmicos. As cumarinas encontram-se substituídas no carbono C7 por um hidroxilo. Este grupo hidroxilo pode sofrer metilação ou estar envolvido numa ligação heterosídica. As lenhanas resultam de compostos cujo esqueleto resulta do estabelecimento de uma união entre os carbonos β das cadeias laterais das unidades derivados do 1-fenilpropano. Todos os flavonóides possuem uma origem biossintética comum, e por este motivo podem ser consideradas diversas subclasses, como flavonas, flavonóis, flavanonas, di-hidroflavonóis, flavan-3-óis, chalconas, auronas e antocianinas (Bruneton et al., 2001; Cuyckens & Claeys, 2004). 22 Os flavonóides são ubíquos nas plantas vasculares e são responsáveis pelas colorações do espetro amarelo-laranja das flores, dos frutos e por vezes das folhas. As antocianinas, também flavonoides, estão associadas aos pigmentos azuis, roxos, rosa, malva, púrpura ou violeta. Na sua estrutura encontra-se, normalmente, um grupo OH em C3, e frequentemente, penta- (3,5,7, 3’, 4’) ou hexa-(3,5,7, 3’, 4’, 5’) substituídos por hidroxilos ou metoxilos. Em plantas superiores distinguem-se, geralmente, dois grupos diferentes de taninos, tanto pela sua estrutura como pela sua origem biossintética, os taninos hidrolisáveis e os taninos condensados. Os taninos hidrolisáveis são oligo ou poliésteres de um açúcar e de um número variável de moléculas de ácido fenólico. Os taninos condensados são constituídos por unidades de flavan-3-óis ligadas entre si por ligações carbono-carbono, geralmente 4 →8 ou 4 →6. As quinonas são compostos oxigenados que correspondem à oxidação de derivados aromáticos e caraterizam-se por um agrupamento de 1,4-dicetociclo-hexan-2,5-diénico, para -quinonas, e ocasionalmente, por um agrupamento de 1,2-dicetociclo-hexan-3,5-diénico, ortoquinonas. 1.2.2.2 Terpenos As plantas produzem várias moléculas de natureza volátil necessárias para a sua sobrevivência, pois atraem polinizadores para que ocorra a reprodução, atuando na defesa contra diferentes fatores bióticos e abióticos, transportando informação para as plantas vizinhas, bem como para a própria planta (Dudareva et al., 2006). Quimicamente, estes compostos voláteis incluem alguns terpenos, bem como alcanos, alcenos, álcoois, ésteres, aldeídos e cetonas de baixa massa molecular (Maffei, 2010). Os terpenos podem ser divididos em diferentes classes, tais como monoterpenos, sesquiterpenos, diterpenos, triterpenos ou tetraterpenos, considerando o número de átomos de carbono que os constituem (10, 15, 20, 30, 40, respetivamente). São sintetizados pela via mevalonato, no citoplasma, e pela via 1-desoxixilulose-5-fosfato (DXP), nos plastídeos, como os cloroplastos, descritos no esquema da Figura 2 (Felipe & Bicas, 2017; Kitaoka et al ., 2015; Sharmeen et al ., 2021). 29 1.2.4.1. Atividade antibacteriana A atividade antibacteriana de diferentes compostos tem sido muito estudada, devido à emergência da resistência a antibióticos e à multirresistência de algumas estirpes de bactérias. As bactérias Gram-negativas têm uma camada fina de peptidoglicano e uma membrana lipídica externa, enquanto as bactérias Gram-positivas têm uma camada espessa de peptidoglicano e nenhuma membrana lipídica externa, o que lhes confere uma maior resistência aos antimicrobianos (Figura 6). A atividade antibacteriana do eugenol é devida à presença de grupos hidroxilo livres na sua estrutura, pois estes promovem a disrupção da membrana citoplasmática e consequentemente aumentam a permeabilidade não específica, devido à ligação do grupo OH às proteínas presentes, prevenindo a ação de enzimas (Devi et al ., 2010; Marchese et al ., 2017; Nazzaro et al ., 2013). A performance de um determinado composto relativa à atividade antibacteriana está relacionada com a sua Concentração Mínima Inibitória (MIC) que se define como a mais baixa concentração do composto necessária para limitar o crescimento de um inóculo (C. Carson e Riley, 1995). A Concentração Mínima Bactericida (MBC) é também útil na observação da capacidade antibacteriana de um composto bioativo, dado que se trata da concentração a que um dado composto provoca pelo menos 99,9 % de morte do inóculo (C. F. Carson et al. , 1995). A Zona Inibitória de Crescimento (IZ) é medida pelo diâmetro do halo de inibição do crescimento. A Concentração Mínima Letal (MLC) é a concentração mínima de um determinado composto capaz de matar um microrganismo. Para obter estas concentrações diferentes podem ser usados testes como a difusão em disco, para o screening da atividade bacteriana, e o método de diluição em agar, para a determinação da força das propriedades antibacterianas (Burt, 2004). A B Figura 6-Estrutura das bactérias: Gram-negativa (A) e Gram-positiva (B). 30 Mecanismo de ação antibacteriano Os OEs podem ter diferentes grupos funcionais na sua estrutura, conforme a classe de compostos a que pertençam. A atividade antibacteriana não é caraterizada por nenhum grupo funcional específico, no entanto, as bactérias têm determinados alvos moleculares, que podem ser modulados por moléculas bioativas que têm em conta a especificidade do local de ligação. Na Figura 7, está representada a estrutura de alguns mecanismos celulares de uma célula bacteriana, os quais consistem especialmente na degradação da parede celular, em danos na membrana citoplasmática, em danos nas proteínas membranares, na perda de constituintes citoplasmáticos, como metabolitos e iões, na coagulação do citoplasma e no esgotamento da força motriz de protões (Burt, 2004). A degradação da parede celular está associada à capacidade de pequenos solutos hidrofílicos serem capazes de passar a membrana externa, através de proteínas especializadas, fornecendo canais transmembranares hidrofílicos, sendo que a membrana externa serve como barreira de penetração para macromoléculas e compostos hidrofóbicos. Em geral, destruir ou danificar a membrana externa é um requisito para qualquer soluto exercer atividade bactericida, principalmente nas bactérias Gram-negativas (Faleiro M.L., 2011; Helander et al ., 1998). Os OEs quando estão presentes no meio intracelular de uma bactéria provocam a acidificação dentro da célula, que promove o bloqueio da produção de energia celular (ATP-Adenosina Trifosfato), devido à perda de iões, ao colapso das bombas de protões e à redução do potencial de membrana (Saad et al ., 2013; Turgis et al ., 2009). A membrana bacteriana tem um papel importante na regulação da pressão osmótica celular, na entrada e saída de biomoléculas. Os compostos bioativos ao promoverem alterações na membrana Figura 7-Estrutura de mecanismos celulares de uma célula bacteriana, adaptado de (Burt, 2004). 31 plasmática levam a uma disrupção da pressão osmótica, levando a uma perda de constituintes intracelulares, e eventualmente, à destruição da células (Yang et al ., 2021). Diferentes moléculas, dependendo da sua hidrofobia, permeiam mais facilmente ou menos a membrana, sendo que a porção interna hidrofóbica desta favorece o fluxo dos componentes que atravessam a membrana, e da composição da membrana, portanto, uma mudança de perfil hidrofóbico/hidrofílico pode levar a uma perda de componentes celulares, devida à rotura da membrana celular. A coagulação do citoplasma está associada proteínas e membranas desnaturadas, dependente da hidrofobicidade dos solutos que atravessam a membrana celular e da composição da membrana bacteriana (Gustafson et al ., 1998; Lambert et al ., 2001; Sikkema et al ., 1995; Turgis et al ., 2009). 1.2.4.2. Atividade antifúngica Os fungos estão cada vez mais associados a doenças infeciosas, devido aos fatores de virulência, que lhes permitem causar variados tipos de infeções, podendo levar à morte. Exemplos de doenças fúngicas são as candidíases, micoses, aspergiloses, de entre muitas outras. As candidíases são uma doença fúngica causada por uma levedura do género Candida , sendo a mais comum a espécie Candida albicans . Esta levedura vive normalmente na pele e dentro do nosso corpo, fazendo parte da nossa flora comensal, causando infeções no organismo pela entrada na corrente sanguínea e, consequentemente, nos órgãos internos. As micoses podem ser de diferentes tipos blastomicoses, coccidioidomicoses e mucormicoses, causadas por diferentes tipos de fungos como Blastomyces , Coccidioides e por um grupo de bolores conhecidos como mucormicetes, respetivamente. As aspergiloses são doenças causadas por um fungo, Aspergillus , um bolor comum. Estas doenças são mais comuns em pessoas com o sistema imunitário mais debilitado, pois todos os dias muitas pessoas respiram Aspergillus , que se encontra no ar, e não ficam doentes. Os problemas causados por este fungo estão associados a reações alérgicas, infeções pulmonares e em outros órgãos (Fungal Diseases Homepage | CDC., 2020). 32 Mecanismo de ação antifúngico Os antifúngicos utilizados normalmente são os polienos, como a anfotericina B, os azóis, como fluconazole, itraconazole, entre outros, e as equinocandinas. Estes compostos atuam principalmente na parede celular, inibindo as sínteses de β–glucanos e de quitina; na membrana celular inibindo a síntese de ergosterol; e, ainda, podem atuar na inibição de síntese de outros alvos como ácidos nucleicos, proteínas e microtúbulos. A Figura 8 exemplifica a arquitetura membranar de um fungo (Chopra, 2010). Figura 8-Composição celular de um fungo, adaptado de (Chopra, 2010). 33 1.3. Eugenol O eugenol, designação convencional para 4-alil-2-metoxifenol (Figura 9) é um fenilpropanóide presente em diversos elementos da flora mundial, tais como o cravinho-da-índia, exemplificado na Figura 9, e também, manjericão, canela, noz-moscada, alfavaca-cravo, entre muitos outros (Mishra et al ., 2013), sendo os seus epítetos científicos mostrados na Tabela 2, juntamente com a percentagem de eugenol presente em cada uma destas plantas. Além destas fontes, existem outras, que também contêm eugenol na sua constituição, mas em quantidades mais reduzidas, como é o caso da Myristica fragrans, Melissa officinalis, Illicium anisatum (Jaganathan & Supriyanto, 2012), entre outras. O eugenol tem como fórmula química C10H12O2, com uma massa molar de 164,2 g mol-1, é parcialmente solúvel em água e altamente solúvel em solventes orgânicos. De incolor a amarelo pálido, quanto à cor, é absorvido através do intestino delgado e excretado na urina, ou através de CO2 expirado (Khalil et al ., 2017). Tabela 2-Ocorrência e % de eugenol em diferentes plantas (Marchese et al ., 2017). Planta Abundância em eugenol (%) Nome científico Nome comum Partes específicas Sysgium aromaticum Eugenia aromaticum Eugenia cariophylata Cravinho-da-índia Flores e rebentos 75 – 85 Ocimum basilicum Ocimum gratissimum Manjericão Óleo essencial 70 – 80 Cinnamomum zeylanicum Canela Casca 70 – 95 Figura 9-Estrutura química do eugenol e sua fonte, o cravinho-da-índia. 34 Devido à sua ação farmacológica, poderá vir a ser usado, após testes in vivo , no tratamento de diversas doenças, tais como acne, asma, artrite reumatóide, cicatrizes, verrugas e alergias. Por enquanto, a sua utilização no mercado é apenas restrita à cosmética e medicina dentária, devido às suas propriedades antioxidantes e antissépticas. O eugenol poderá também vir a ser usado no tratamento de doenças infeciosas e como conservante alimentar, devido às suas propriedades antimicrobianas (Marchese et al ., 2017). 1.3.1. Mecanismo de ação do eugenol Diversas investigações descritas, na bibliografia, demonstram o potencial do eugenol, devido às propriedades antimicrobiana, antioxidante, anti-inflamatória, anticancerígena, neuroprotetora e antisstressante, potencial antidiabético e perspetivas hipocolesterolémicas. Atividade antibacteriana Os compostos fenólicos, como o eugenol, estão diretamente relacionados com diversos mecanismos celulares, descritos na Figura 7, que englobam distúrbios na membrana citoplasmática, disrupção da força motriz de protões, fluxo de eletrões, transporte ativo, coagulação de componentes celulares e perda de lípidos nas paredes celulares, tanto nas bactérias Gram-negativas como nas Grampositivas (Burt, 2004; A. L. De Almeida et al ., 2019). No caso da disrupção da membrana citoplasmática, uma vez que leva a um aumento da permeabilidade da membrana, afetando o transporte de iões e ATP, a libertação de iões e a extensiva perda de componentes celulares, pode resultar na morte da célula (Marchese et al ., 2017). Vários autores sugerem que a atividade antibacteriana do eugenol é devida à presença de um grupo OH fenólico livre, que se irá ligar a proteínas impedindo a ação de enzimas (Burt, 2004; Marchese et al ., 2017). Um estudo realizado por Qian, com células CRKP-12 tratadas com eugenol, demonstra hiperpolarização da membrana celular, pois revela que este composto perturba a estrutura da membrana celular e aumenta a sua permeabilidade, provocando, ainda, um intumescimento destas células, levando ao colapso da superfície e a detritos celulares anormais, pois a forma bacilar e a superfície lise das células estudadas é desintegrada pela ação do eugenol. A perturbação na permeabilidade da membrana 35 é devida à despolarização da mesma, ao aumento de H+ intracelular e à perda de ATP, resultando na formação de poros não seletivos, que promovem a perda de iões essenciais e de outras biomoléculas (Bot & Prodan, 2009; Qian et al ., 2020). Estudos focados em microrganismos responsáveis por doenças infeciosas em humanos, tais como Streptococcus pneumoniae , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli , Staphylococcus aureus , Pseudomonas aeruginosa , Candida glabrata , Aspergillus niger , entre outros, demonstraram através dos valores de IZ, bem como MIC e MBC, o potencial inibitório de crescimento destes organismos, sendo, portanto, possível o seu uso para o controlo de doenças infeciosas (Marchese et al ., 2017). A nível de patogéneos de origem alimentar, como E. coli , Listeria monocytogenes e Salmonella spp. , o eugenol demonstrou inibição do crescimento destes patogéneos, diminuindo a proeminência de doenças alimentares, como listerioses, colites hemorrágicas e salmoneloses, e ainda o potencial para atuar como conservantes alimentares, de modo a aumentar a vida útil de produtos alimentícios (Mith et al ., 2014). Um patogéneo alimentar causador de gastroenterite - Vibrio parahaemolyticus , resistente a antibióticos, devido ao consumo de frutos do mar mal cozinhados, serviu como alvo no estudo da atividade do eugenol. Ficou demonstrada uma atividade efetiva contra o crescimento bacteriano deste microrganismo, apresentando atividade na prevenção de biofilmes, importante para a manutenção da segurança alimentar destes alimentos (Ashrafudoulla et al ., 2020). Um biofilme é definido como uma comunidade de células anexadas a uma superfície inseridas numa matriz exopolimérica, que são dificilmente erradicadas representando um foco de infeção. A inibição da formação de biofilmes, comprovada por diferentes estudos, deve-se à deterioração violenta das células presentes nos biofilmes, causando uma significante dispersão celular dentro da matriz do biofilme (De Paula et al ., 2014). Alguns estudos realizados em biofilmes de CRKP-12, Klebsiella pneumoniae resistente a carbapenemos, demonstram um forte efeito do eugenol na inibição destes biofilmes. Resultados referentes a qRT-PCR mostram que os mRNA dos genes relativos a estes biofilmes encontram-se diminuídos na presença do eugenol. Portanto, a inibição de biofilmes causada pelo eugenol, pode atribuirse a um mecanismo de desregulação génica (Qian et al ., 2020). Outro estudo realizado por Triana e colegas, usando derivados do eugenol, como o isoeugenol e o acetato de eugenol, comprovam que a atividade antibacteriana destes compostos se deve à sua estrutura do fenilpropanóide, conferindo-lhe caráter lipofílico, podendo assim danificar a célula bacteriana 36 ao penetrar na membrana lipídica e, assim, danificar a permeabilidade da membrana. O isoeugenol apresenta elevado efeito antibacteriano, devido à ligação dupla próxima ao anel aromático presente na sua estrutura, atuando como detergente, tanto nas membranas internas como externas, pois ambas têm alvos onde o eugenol pode promover um ataque nucleofílico. No entanto, o acetato do eugenol não apresenta atividade antibacteriana, pois o grupo hidroxilo presente no eugenol encontra-se substituído por um grupo acilo, podendo, assim, afirmar-se que a atividade antimicrobiana do eugenol e derivados se deve ao grupo hidroxilo livre (Triana et al ., 2019). Há estudos da ação do eugenol contra isolados de Staphylococcus aureus , alguns resistentes à vancomicina, que mostraram que o eugenol é capaz de desencadear citotoxicidade na célula, devido à produção intracelular de radicais livres de oxigénio (ROS), que induz a inibição do crescimento celular, disrupção da membrana celular e danos no DNA resultando na decomposição celular e morte (Das et al ., 2016). Atividade antifúngica Um estudo de Olea e outros afirma que a atividade antifúngica do eugenol está atribuída à disrupção da estrutura da sua membrana, através da acumulação deste composto na bicamada fosfolipídica, devido ao seu caráter lipofílico. Esta interação altera a fluidez e a permeabilidade das membranas fúngicas, afetando as funções das enzimas ou proteínas importantes ligadas à membrana. A ligação dupla da cadeia lateral do eugenol e o seu sistema aromático promovem a inibição do crescimento fúngico (Olea et al ., 2019). Estes investigadores também estudaram modificações na estrutura do eugenol, através da adição de grupos contendo nitrogénio no anel aromático e modificações na estrutura inicial do composto. A adição do grupo com nitrogénio no anel aromático promove a retirada de eletrões e, diretamente, reage com as ligações duplas substituídas com outros grupos de retirada de eletrões, que promove a produção de ROS pelos compostos aromáticos, num processo mediado por enzimas, levando a uma disrupção química da paliçada da membrana. Os arranjos espaciais dos grupos estruturais presentes no eugenol promovem o aumento do ataque nucleofílico das ligações duplas nos grupos nitro eletrofílicos afetando a permeabilidade da membrana e o transporte de eletrões. A presença de outros grupos no anel aromático afeta a reatividade dos compostos, que é comprovada pela substituição do grupo hidroxilo livre por um grupo acetilo, diminuindo fortemente a atividade destes compostos, pois esta atividade é devida 37 a elevada atração eletrónica do grupo hidroxilo, que aumenta as reações com as ligações duplas do anel aromático (Olea et al ., 2019). Marchese estudou o mecanismo de ação do eugenol em diversas vertentes, a nível fúngico, o caráter lipofílico do eugenol promove a entrada deste nas cadeias de ácidos gordos, e, assim, na bicamada fosfolipídica da membrana fúngica. Este mecanismo promove perturbações na permeabilidade e na fluidez, conduzindo a uma interferência na patogenicidade fúngica, pois compromete a adesão destas células fúngicas a células hospedeiro, e, ainda, o seu dimorfismo, importante fator de virulência dos fungos, conduz a uma redução da habilidade dos fungos colonizarem e infetarem os tecidos hospedeiros (Marchese et al ., 2017). Outros estudos mostram que o transporte de iões é afetado pelo eugenol nas leveduras, pois inibe a atividade H+ - ATPase e a extrusão de H+ estimulada pela glicose (Ahmad et al ., 2010), e mostraram, ainda, que o tratamento com eugenol e metil-eugenol em Candida albicans induz um stress oxidativo, caraterizado pelo aumento do superóxido dismutase e, consequentemente, uma elevada produção de ROS, os quais causam peroxidação lipídica das membranas citoplasmáticas e morte celular (Khan et al ., 2011). O eugenol tem a aptidão de afetar a hidrofobicidade da superfície celular e a capacidade de adesão de células planctónicas, como, por exemplo, em estirpes de Candida , como a Candida tropicallis e Candida dubliniensis. Esta atividade é devida à ligação dupla localizada nas posições α e β da cadeia lateral e ainda ao grupo metilo localizado na posição γ (De Paula et al ., 2014; Qian et al ., 2020). Estudos referentes à inibição de biofilmes provocados pela Candida dubliniensis e pela Candida tropicallis retratam que o eugenol apresenta atividade inibitória e reduz atividade metabólica dos biofilmes. O mecanismo pelo qual o eugenol induz a morte destes biofilmes consiste no facto de este provocar mudanças profundas na morfologia das células e, ainda, provocar perda de constituintes citoplasmáticos, indicando que existe ações no envelope celular. Atividade anticancerígena O cancro está documentado como a segunda maior causa de mortalidade mundial, associado a diferentes fatores como o tabaco, ambiente, fatores genéticos, entre outros, consistindo, essencialmente, na proliferação anormal de células tumorais. 38 O eugenol apresenta-se como um agente inibidor de metástases associadas ao stress oxidativo, e os seus derivados como o isoeugenol, di-hidroisoeugenol e diisoeugenol revelam-se também agentes anticancerígenos do cancro da mama, através das suas moléculas citotóxicas que interagem com a membrana celular (Khalil et al ., 2017). Jaganathan no seu estudo, afirma que a produção de ROS pelo eugenol, está envolvida na indução da apoptose, levando a uma redução do potencial da membrana mitocondrial e na indução da fragmentação do DNA, confirmada pelo padrão de DNA ladder , através da ativação da caspase-3 e pelo produto de clivagem de PARP (Polimerase de poli (ADP-ribose)), e, ainda, pela libertação do citocromo c da mitocôndria para o citosol, tendo um papel importante na via mitocondrial, através da modulação das proteínas da família Bcl2, angiogénese e invasão nas células em estudo (Jaganathan , Saravana Kumar; Supriyanto, 2012). Jaganathan, no seu estudo, afirma que, no caso de um melanoma, o dihidroisoeugenol apresenta uma percentagem de inibição de crescimento de 40 a 60 %, e o o,o ’-dimetildihidro-eugenol apresenta 70 a 80 %, a uma concentração de 10 µM. O eugenol para diferentes tipos de cancro, como melanoma, osteossarcomas, leucemias, cancro gástrico, tumores na pele e cancro na próstata, apresenta diminuição do crescimento das células tumorais. Particularmente, no caso de uma leucemia, o eugenol apresenta um IC50 de 23,7 µM em linhas celulares HL-60, aumentando a produção de ROS e a depleção de glutationa (GSH), o metileugenol, para a mesma linha celular, apresenta um IC50 de 76,5 µM (Yoo et al ., 2005). Atividade anti-inflamatória A inflamação consiste numa resposta natural do corpo, que acontece quando o organismo se encontra debilitado, seja por uma infeção por agentes infeciosos como bactérias, vírus ou parasitas, ou por intoxicação por veneno, seja por uma lesão por calor, radiação ou trauma. Devido a estas situações, o organismo dá início à resposta inflamatória, tendo por objetivo eliminar as lesões, removendo as células mortas e tecidos danificados, iniciando assim a sua reparação. O tratamento de uma inflamação é realizado através de anti-inflamatórios não esteróides e anti-inflamatórios esteróides, sendo que estes provocam alguns efeitos secundários indesejados ao organismo, como por exemplo cansaço, má digestão, e ainda podem provocar mudanças no peso. 45 elevada atividade antioxidante do carvacrol, quer in vivo , quer in vitro (Guimarães et al ., 2010). A reação do carvacrol com o radical livre é facilitada pelo seu caráter de ácido fraco, pois cede átomos de H aos eletrões desemparelhados, produzindo outro radical estabilizado pela dispersão eletrónica, gerando uma estrutura de ressonância para a molécula (Alagawany, 2015). Atividade analgésica As propriedades analgésicas do carvacrol mediadas pela inibição de mediadores periféricos, bem como mecanismos inibitórios centrais, podem estar relacionados à sua forte atividade antioxidante; foram demonstrados em vários outros modelos de algesia in vivo , onde o pré-tratamento de ratos-domésticos com o carvacrol foi eficaz no alívio da dor contra contorções e alongamentos induzidos pelo ácido acético, e ainda nas fases neurogénicas e inflamatórias da dor induzida pela formalina. Carvacrol diminui a peroxidação dos lipossomas fosfolipídicos na presença de ferro III e ascorbato, pelo facto ser um bom sequestrador de radicais peroxilo, gerados pela radiólise de pulso, que inibe a oxidação de lipoproteínas de baixa densidade (LDL), de maneira dependente da concentração num sistema in vitro usando células endoteliais da aorta humana para mediar a oxidação das LDL (Suntres et al ., 2015). Atividade anticancerígena e antiplaquetária Há estudos que demonstram o efeito do carvacrol como anticancerígeno e antiplaquetário in vivo e in vitro durante carcinoma de células hepáticas, tumores pulmonares e carcinogénese quimicamente induzida. A suplementação com carvacrol também aponta para a indução da fragmentação de DNA genómico e da expressão genética de enzimas como caspase 3, 6 ou 9. Ainda, induz a regulação de genes da apoptose no cancro da mama humano na linha celular MCF-7 (Alagawany, 2015). Os efeitos anti proliferativos em linhas de cancro da mama humano metastático e em linhas de cancro de pulmão humano são demonstrados pela indução da apoptose pelo carvacrol associado a mudanças, como diminuições do potencial da membrana, libertação do citocromo C pela mitocôndria, ativação da caspase e ainda clivagem de PARP (polimerase poli (ADP-ribose)) e irregularidades no formato (Suntres et al ., 2015). 46 Atividade anti-inflamatória O carvacrol mostra atividade anti-inflamatória devida à supressão da expressão da cicloxigenase 2 (COX-2), enzima que limita a relação na biossíntese de prostaglandinas, desempenhando um papel fundamental na inflamação, dor e homeostase circulatória, inibindo a ativação dos recetores ativados pelo proliferador de peroxissoma (PPAR) α e γ, a inibição da produção e as ações do óxido nítrico (Suntres et al ., 2015). 47 1.5. Polifenóis oxidases As polifenóis oxidases (PPOs) estão largamente distribuídas na flora mundial, nos micróbios e em tecidos animais, e representam uma grande família de enzimas que contêm cobre (Cu), com dois locais de ligação para substratos fenólicos (Dwivedi, 2013). As PPOs podem ser encontradas em diversos seres vivos como nos animais, como é o caso do camarão, da lagosta, dos caranguejos e ainda, nos humanos e nos ratos. É também encontrada em diversos fungos como Pycnoporous spp., Aspergillus niger, Pycnoporous saguineus e Aspergillus spp. Nas bactérias, podem ser vistas no caso de Bacillus spp., Thermus spp., Streptomycetes spp. e Thermoactinomyces spp. Nas plantas, as PPOs são encontradas nas maçãs, nas bananas, nos pêssegos, no tubérculo da batata, nas sementes das favas e ainda em Helianthus tubrosus, Pyrus communis e Crocus salivs (Dwivedi, 2013). O papel fisiológico destas enzimas inclui a formação de pigmentos, a remoção do oxigénio molecular presente nos cloroplastos, a participação no sistema de defesa nas plantas, e ainda, no enraizamento induzido por feridas e na sua cicatrização (Dwivedi, 2013). Estão ainda presentes em reações de escurecimento oxidativo de alimentos causando deterioração da qualidade dos alimentos, através da alteração das propriedades nutricionais e organoléticas (Dwivedi, 2013), sendo que estas reações diminuem a aceitação dos alimentos por parte do consumidor, e ainda a sua validade e valor. Diferentes tipos de PPOs podem ser consideradas de acordo com a sua habilidade de oxidar diferentes tipos de compostos fenólicos. Um tipo de PPOs é a tirosinase, que pode ser encontrada em animais, como os humanos, sendo importante para o cabelo, para a pele e para a pigmentação dos olhos, devido à sua influência na via biossintética da melanina, presente no Esquema 1. Um segundo tipo é conhecido como polifenolase ou catecolase, e são encontradas em plantas como as maçãs, pêssegos, no tabaco e em folhas de chá, e, ainda, nos cogumelos, e são caraterizadas por catalisar dois tipos de reações, uma que envolve a hidroxilação do monofenol, que dá origem a um difenol, e outra que envolve a remoção de hidrogénio do difenol que será doado à quinona (Dwivedi, 2013). 48 A PPO realiza a o-hidroxilação de monofenóis, caraterizada pela atividade da monofenolase e a oxidação de difenóis em o-quinonas, é caraterizada pela atividade da difenolase, sendo o oxigénio o oxidante primário, representado no Esquema 2. A atividade da monofenolase é também conhecida como hidroxilase ou cresolase e é sempre acoplada à atividade da difenolase, também conhecida como catecolase ou oxidase. Esta última não é sempre precedida da monofenolase (Dwivedi, 2013). Neste trabalho o foco foi a tirosinase, mais propriamente na inibição da atividade da difenolase, de modo a avaliar a capacidade de diferentes compostos para a atuação como potenciais novos Esquema 1-Via sintética da melanina, adaptado de (Murray, 2016). Esquema 2-Atividades das PPOs, adaptado de (Dwivedi, 2013). 49 inibidores, naturais ou de origem natural, para serem integrados na matriz dos alimentos, permitindo diminuir o escurecimento oxidativo provocado pela tirosinase. 1.5.1. Tirosinase A tirosinase, monofenol monooxigenase (E.C. 1.14.18.1), é uma proteína heterotetramerica binuclear tipo II, que contém átomos de cobre no seu local de ligação, como demonstrado na Figura 13 (Murray, 2016). O par de iões de cobre no local ativo da enzima promove a interação com ambos os oxigénios moleculares e com a estrutura fenólica, Figura 14 (Seo et al ., 2003). A tirosinase apresenta quatro estruturas conformacionais dependendo do estado de oxidação dos iões de Cu, denominadas por Emet, Edeoxy, Eoxy e Edeact (Murray, 2016), demonstradas no Esquema 3. A formação Emet , relembrando a via de síntese da melanina, representada no Esquema 1, catalisa a oxidação da L-DOPA a dopaquinona (Murray, 2016). Figura 13-Estrutura da tirosinase obtida através da PDB. Figura 14-Ligação dos átomos de cobre aos resíduos de histidina. 50 1.5.1.1. Escurecimento enzimático O escurecimento enzimático resulta da ação de um grupo de enzimas, nomeadamente a tirosinase, tendo lugar quando, na presença de oxigénio, a tirosinase e seus substratos fenólicos são misturados, após escovagem, descamação e operações de britagem, que levam à rutura da estrutura celular (Loizzo et al ., 2012). Este acontecimento representa um dos maiores problemas da indústria alimentar, pois o escurecimento dos alimentos leva à diminuição da sua vida útil, à não aceitação do produto por parte do consumidor, levando à diminuição do seu valor no mercado (Dwivedi, 2013). A tirosinase contém uma elevada afinidade para os isómeros L dos substratos, como é o exemplo da L-DOPA, também conhecida como levodopa, com nome IUPAC, ácido (S)-2-amino-3-(3,4-diidróxifenil) propanóico, representada na Figura 15 (Loizzo et al ., 2012). Esquema 3-Diferentes estruturas conformacionais do local ativo da tirosinase, adaptado de (Murray, 2016). Figura 15-Estrutura química da L-DOPA. 51 Durante o processo de escurecimento, a o-quinona pode ser convertida em pigmentos de melanina escuros, através de uma série de reações enzimáticas e não enzimáticas. As o-quinonas são poderosos eletrófilos, podendo nucleofilicamente ser atacadas por uma molécula de água, outros polifenóis, aminoácidos, péptidos e proteínas, levando a uma adição de Michael. Uma adição de Michael consiste na adição nucleofílica de um carboanião ou outro nucleófilo a um composto carbonilo alfa, que se encontra beta instaurado, representado no esquema da Figura 16. As extremidades R e R’ são dadores de Michael e estão presentes no nucleófilo e funcionam como grupos retiradores de eletrões, fazendo com que o H acídico forme um carboanião em resultado da reação com a base. O substituinte no alceno ativado é também chamado de aceitador de Michael (Mather et al ., 2006). 1.5.1.1.1. Inibidores da atividade da tirosinase Para combater o escurecimento enzimático, a indústria alimentar tem utilizado diferentes técnicas convencionais, como o uso da autoclave e métodos de branqueamento, mas estas técnicas causam perdas de valor nutricional dos alimentos. Outra abordagem testada foi o uso da energia de microondas, mas devido ao gradiente de temperatura gerado, causa danos aos alimentos, mais propriamente ao cogumelo, elemento testado no estudo de Devece (Devece et al ., 1999). Usualmente para combater a degradação de alimentos, a indústria alimentar adiciona à matriz alimentar, aditivos, que consistem em substâncias que têm como propósito manter ou modificar o sabor dos alimentos, melhorar a sua aparência, através da inibição do escurecimento enzimático, e ainda, prolongar o seu tempo de conservação. Muitas categorias de aditivos alimentares podem ser consideradas como acidulantes, regulares de acidez, antioxidantes, agentes espessantes, corantes e conservantes, emulsificantes, de entre muitos outros (Silva & Lidon, 2016). Figura 16-Adição de Michael. 52 Contudo, estes aditivos diminuem o valor nutricional dos alimentos, e portanto, há uma busca constante por inibidores da atividade da tirosinase de origem natural, pois estes são livres de quaisquer efeitos colaterais prejudiciais para o consumidor (Seo et al ., 2003). Vários estudos demonstram que extratos metanólicos de plantas, como os obtidos das flores Magnolia denudata e a M. denudata var purpurascens apresentam atividade inibitória da tirosinase, representando valores IC50 de 3,34 e 10,55 mg/mL (Loizzo et al ., 2012). Exemplos destes efeitos são os demonstrados no estudo de Seo em que a partir de plantas superiores diversos inibidores podem ser considerados, como os polifenóis, aldeídos e outros derivados (Seo et al ., 2003). Os flavonoides inibem a ação da tirosinase devido à sua capacidade de quelatar o cobre presente no sítio ativo da tirosinase, mas esta situação apenas é aplicável quando o grupo 3-hidroxilo está livre. Outros compostos, como por exemplo a luteolina 4’- O -glucósido e a luteolina 7O -glucósido mesmo sem apresentarem o grupo 3-OH, apresentam atividade inibitória da ação da tirosinase (Seo et al ., 2003). Compostos como os aldeídos e outros derivados, por exemplo, o trans -cinamaldeído e o cuminaldeído, o grupo aldeído reage com os grupos nucleofílicos biológicos, como o sulfidril, amino e grupos hidroxilo, promovendo a formação de uma base de Schiff com o grupo amina primário da enzima tirosinase (Kubo & Kinst-Hori, 1998). 53 Capítulo 2 – Materiais e Métodos 54 2.1. Reagentes O dimetilsulfóxido (DMSO) foi obtido da empresa Enzymatic e a gentamicina foi adquirida da Sigma, dissolvida em água para obter as concentrações pretendidas ao estudo. O meio de cultura utilizado foi o Muller-Huiton tendo sido adquirido da empresa Sigma. Para o estudo da inibição da tirosinase foram adquiridos os reagentes necessários a partir da empresa Sigma. A enzima polifenol oxidase foi obtida a partir de cogumelos Agaricus bisporus ., o substrato utilizado foi a L-DOPA, e o inibidor de referência foi o ácido kójico. 2.2. Determinação da atividade antimicrobiana 2.2.1. Preparação dos microrganismos Os microrganismos, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 e a Salmonella typhi ATCC 3076, bactérias Gram-negativas, Staphylococcus aureus ATCC 25623, bactéria Gram-positiva e um fungo diplóide Candida albicans ATCC 18804, foram colocados em crescimento na estufa a 37ºC, durante 5 dias, em placas de petri. De modo a obter uma suspensão bacteriana, inoculou-se cada um dos microrganismos em meio de cultura Muller-Huiton. Para cada ensaio mediu-se a absorbância das suspensões a 600 nm, para obter um CFU/mL entre 1x10 -7 a 1x10 -5. 2.2.2. Preparação dos compostos 2.2.2.1. Obtenção dos compostos O grupo de investigação da Universidade do Minho sintetizou diferentes compostos derivados de eugenol 1 (compostos 2-17), designadamente dez O -alquilados, cinco dos quais contêm o anel de oxirano (compostos 8-12), para além do oxirano diretamente obtido do eugenol (composto 7); e cinco amino álcoois (13-17). Foi sintetizado o análogo 19 a partir da 6-hidroxi-2-fenilcromen-4-ona. O derivado O -alquilado do carvacrol 20 foi também obtido. As estruturas de todos os compostos referidos são apresentadas na Tabela 4 (Fernandes et al ., 2020; Natal et al ., n.d.; Pinto et al ., n.d.) e foram utilizados nos testes de atividade biológica efetuados ao longo deste trabalho. 61 Capítulo 3 – Discussão de resultados 62 3.1. Compostos estudados nos ensaios biológicos Os compostos testados ao longo deste trabalho são apresentados nos Esquemas 4-7. No Esquema 4 surge o eugenol 1, os derivados O -alquilados 2, 3, 4, 5 e 6 e os oxiranos 8, 9, 10, 11 e 12 correspondentes, assim como o oxirano do eugenol 7. Esquema 4-Síntese dos derivados O -alquilados e oxiranos do eugenol 2-12. No Esquema 5 surgem os derivados do eugenol 1 resultantes da reação de abertura do anel de oxirano com aminas alifáticas (13 e 14) e aromáticas sem ou com substituintes no anel aromático (15, 16 e 17). 63 Esquema 5-Derivados do eugenol 14-17 resultantes do oxirano 7 e diferentes aminas. No Esquema 6 surge a síntese do composto 19 por reação do composto 18 com 1-bromo-3cloropropano em meio básico. Esquema 6-Síntese do composto 19. No Esquema 7 surge o composto 20 resultante da O -alquilação do carvacrol, 5-isopropil-2metilfenol. Esquema 7-Reação de O -alquilação do carvacrol. 64 3.2. Atividade antimicrobiana Como demonstrado na Tabela 5, é aparente a existência de uma relação estrutura-atividade no que diz respeito à atividade antimicrobiana dos compostos testados. Os compostos que apresentam atividade antimicrobiana são o eugenol 1 e os seus derivados O - alquilados e oxiranos, como os compostos 2 e 12, bem como o oxirano 7 e os seus derivados com diferentes aminas, os compostos 13, 14, 15 e 16. Particularmente, o composto 1 apresenta atividade contra a E. coli , S. aureus e C. albicans a uma concentração de 100 µM, e para a P. aeruginosa e S. typhi apresenta atividade a uma concentração de 800 µM. A uma concentração de 200 µM, o composto 7, apresenta atividade contra C. albicans , o 15 contra E. coli e C. albicans . O crescimento da Escherichia coli também é inibido a uma concentração de 200 µM pelos compostos 13, 14 e 16. Os compostos 2 e 12 também apresentam atividade contra S. aureus e C. albicans a uma concentração de 800 µM. Do ponto de vista da relação estrutura-atividade, o composto 1 apresenta atividade antimicrobiana, sendo que esta poderá dever-se ao grupo OH fenólico presente na sua estrutura, como descrito anteriormente. Esta situação também é visível nos compostos 7, 13, 14 e 16, que têm também na sua estrutura um grupo OH fenólico. Esta atividade devida ao OH fenólico poderá resultar da ligação dos compostos em questão a proteínas impedindo a ação de enzimas (Marchese et al., 2017). Como se verifica pela análise dos esquemas, existem outros compostos estudados com caraterísticas estruturais análogas, mas nos quais o grupo OH fenólico está alquilado, e que não apresentam atividade antimicrobiana, o que poderá estar relacionado com a ausência do grupo OH fenólico livre, como é o caso dos compostos de 8, 9, 10, 11. Os compostos 13, 14 e 16 apresentam na sua estrutura um grupo com nitrogénio. A presença deste grupo pode promover a retirada de eletrões e, diretamente, a reação com ligações duplas substituídas com outros grupos de retirada de eletrões, promovendo a produção de ROS pelos compostos aromáticos levando a uma disrupção da membrana (Olea et al., 2019). A atividade do composto 16 poderá estar relacionada não apenas com o OH fenólico, mas também pela presença de um grupo fenilo substituído, bem como de um grupo com nitrogénio. 65 O composto 2, apresenta um caráter de fenilpropanóide, que lhe confere um caráter lipofílico, podendo, assim, danificar a célula bacteriana ao penetrar a membrana lipídica (Triana et al ., 2019), provavelmente a razão pela qual este composto apresenta atividade antimicrobiana relevante. O composto 12, torna-se a exceção a estas perceções, pois não apresenta um grupo OH fenólico, nem caraterísticas de fenilpropanóide, no entanto, apresenta uma atividade antimicrobiana relevante para S. aureus e C. albicans , podendo dever-se à presença de um maior número de carbonos envolvidos na sua cadeia alifática com propriedade éster. O composto 18 é um reagente comercial e o 19 é o composto que advém da reação do 18 com 1-bromo-3-cloropropano. Estes compostos não apresentam atividade antimicrobiana, podendo isto dever-se à ausência de caraterísticas de fenilpropanóide, apesar de na sua estrutura estar presente um grupo OH fenólico livre. Além disso, a presença de um halogénio terminal, o cloro, no composto 19 pode estar envolvido na inatividade antibacteriana deste composto. O composto 20 é sintetizado através da reação do carvacrol com o 3-bromopropan-1-ol. O carvacrol apresenta atividade antibacteriana devido à presença de um grupo OH fenólico na sua estrutura e de um sistema deslocalizado de eletrões, que promove uma diminuição da variação de pH, resultando na ausência de uma força motriz de protões e, consequentemente, na interrupção da síntese de ATP. A diminuição de ATP leva a um comprometimento de alguns processos essenciais na célula, podendo finalmente levar à morte celular (Ultee et al ., 2002). Neste caso, o composto 20 não apresenta um grupo OH fenólico o que poderá ser a razão pela qual este composto não apresenta atividade antimicrobiana. Em geral, a relação estrutura-atividade, isto é, a presença de um grupo OH fenólico e caraterísticas de fenilpropanóide, está relacionada com a atividade antimicrobiana, mas como descrito anteriormente existem algumas exceções a esta relação, podendo dever-se a diferentes caraterísticas estruturais dos compostos em questão. Portanto, não se pode afirmar com certeza que a atividade antimicrobiana dos compostos estudados se deve à presença de um grupo OH fenólico ou a caraterísticas de fenilpropanóide. 66 Tabela 5-Conclusão da MIC dos compostos testados (µM). Compostos Microrganismos Gram negativa Gram positiva Fungo Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Salmonella typhi Staphylococcus aureus Candida albicans 1 100 800 800 100 100 2 >800 >800 >800 800 800 3 >800 >800 >800 >800 >800 4 >800 >800 >800 >800 >800 5 >800 >800 >800 >800 >800 6 >800 >800 >800 >800 >800 7 >800 >800 >800 >800 200 8 >800 >800 >800 >800 >800 9 >800 >800 >800 >800 >800 10 >800 >800 >800 >800 >800 11 >800 >800 >800 >800 >800 12 >800 >800 >800 800 800 13 200 >800 >800 >800 >800 14 200 >800 >800 >800 800 15 200 >800 >800 >800 200 16 200 >800 >800 >800 >800 17 >800 >800 >800 >800 >800 18 >800 >800 >800 >800 >800 19 >800 >800 >800 >800 >800 20 >800 >800 >800 >800 >800 67 3.3. Atividade inibitória da tirosinase De entre os compostos apresentados na Tabela 5, 18 compostos foram testados de modo a se perceber quais podiam ter atividade inibitória da ação da tirosinase. Um composto pode ser considerado um inibidor da atividade da tirosinase dependendo de diferentes tipos de mecanismos, como por exemplo, através da ação como agentes redutores que causam redução química da dopaquinona a dopa, que evita a formação de dopacroma e melanina; através de eliminadores de o -dopaquinona; por inativadores de enzimas não específicos que desnaturam a enzima; inativadores específicos que podem ser catalisados pela tirosinase, e consequentemente, formam uma ligação covalente com a enzima, inativando-a irreversivelmente durante a reação catalítica; e ainda, inibidores específicos da tirosinase que se ligam reversivelmente e reduzem a sua capacidade catalítica. De todos estes mecanismos os mais usuais são os inibidores específicos que podem reversível ou irreversivelmente ligar-se à tirosinase e reduzem a sua capacidade catalítica (Chang, 2009), sendo considerados “verdadeiros inibidores”. O ácido kójico, representado na Figura 17, é um dos inibidores da tirosinase mais estudados, usado como agente de clareamento a pele e como aditivo alimentar para prevenir o escurecimento enzimático (Chen et al ., 1991). Figura 17-Estrutura química do ácido kójico. O ácido kójico tem a habilidade de quelatar o cobre no local ativo da tirosinase, e é reportado como um inibidor de ligação lenta da atividade da difenolase da tirosinase (Cabanes et al ., 1994), atividade esta estudada neste trabalho. Neste trabalho foi estudado a ação de diversos compostos, eugenol e os seus derivados, bem como um derivado do carvacrol, na inibição da atividade da difenolase da tirosinase. Para tal foi utilizado como controlo positivo o ácido kójico, sendo este um inibidor de referência da atividade da tirosinase. A concentração à qual o ácido kójico inibe a atividade da tirosinase é 280 µM, o que é concordante com o IC50 encontrado na bibliografia (Cui et al ., 2018; Saghaie et al ., 2013). Os resultados referentes a esta atividade dos compostos testados estão presentes na Figura 18. 68 Controlo 1 2 3 4 5 6 7 9 10 11 12 13 15 16 17 18 19 20 Ácido kójico 0 50 100 Atividade da tirosinase Amostra % Atividade da tirosinase ** ** ** *** *** *** *** *** ** Pela análise dos resultados podemos constatar que os compostos com atividade mais significativa na diminuição da atividade da tirosinase são os compostos 4, 16 e 17, pois são aqueles em que a % de atividade da tirosinase está semelhante à do ácido kójico, o inibidor de referência. O composto 4 é ativo na inibição da atividade da tirosinase, sendo que esta atividade pode deverse à presença de um grupo OH na sua estrutura de fenilpropanóide, promovendo um ataque nucleofílico ao cobre presente no local ativo da tirosinase, e diretamente envolvido na transferência de protões durante a catálise, impedindo assim a sua atividade (Loizzo et al., 2012; Seo et al., 2003). Em comparação com os outros compostos testados, podemos dizer que a presença de um OH terminal na estrutura de fenilpropanóide é a razão pela qual o composto 4 ser o único dos derivados O - alquilados e oxiranos do eugenol a ter atividade contra a ação da tirosinase. Os compostos 16 e 17 têm na sua estrutura vários grupos OH, o que segundo um estudo com o 2-hidroxitirosol (2-HT), estrutura representada na Figura 19, o que se apresenta estruturalmente relacionado com o substrato usado neste estudo, a L-DOPA, o que é plausível que o 2-HT funcione competitivamente com o substrato, o que poderá levar à inatividade da tirosinase (Uchida et al ., 2014), e consequentemente, à não produção de melanina, estando esta diretamente interligada com o escurecimento enzimático. Figura 18Atividade da tirosinase referente aos compostos testados. Legenda: **- p <0.01; ***- p <0.001. 69 Figura 19-Estrutura química do 2-HT . Além disso, estes compostos são os únicos dos derivados resultantes do oxirano 7 e diferentes aminas, com atividade o que além da presença de mais de um grupo OH na estrutura, poderá dever-se a um grupo fenilo substituído. Em relação ao composto obtido da O -alquilação do carvacrol, o composto 20, e os compostos 18, reagente comercial, e o 19, composto este obtido a partir do reagente comercial, não apresentam inibição da atividade da tirosinase, devido à presença de apenas um grupo OH na sua estrutura, bem como à não substituição do grupo fenilo. 70 Capítulo 4 – Conclusão e perspetivas futuras 77 activities of seed oils from torreya grandis Fort. ex Lindl. BioMed Research International , 2018 . https://doi.org/10.1155/2018/5314320 Cuyckens, F., & Claeys, M. (2004). Mass spectrometry in the structural analysis of flavonoids. Journal of Mass Spectrometry , 39 (1), 1–15. https://doi.org/10.1002/jms.585 Daferera, D. J., Ziogas, B. N., & Polissiou, M. G. (2000). GC-MS Analysis of Essential Oils from Some Greek Aromatic Plants and Their Fungitoxicity on Penicillium digitatum. Journal of Agricultural and Food Chemistry , 48 (6), 2576–2581. https://doi.org/10.1021/jf990835x Das, B., Mandal, D., Dash, S. 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