Cultivo y valoración de Hydropuntia cornea (Rhodophyta) y Ulva rigida (Chlorophyta) para la producción de biodiesel: dinámica de la disponibilidad de amonio y de las condiciones de irradiación sobre la calidad de la biomasa

CULTIVO Y VALORACIÓN DE HYDROPUNTIA CORNEA (RHODOPHYTA) Y ULVA RIGIDA (CHLOROPHYTA) PARA LA PRODUCCIÓN DE BIODIESEL. DINÁMICA DE LA DISPONIBILIDAD DE AMONIO Y DE LAS CONDICIONES DE IRRADIACIÓN SOBRE LA CALIDAD DE LA BIOMASA. RAYCO GONZÁLEZ GONZÁLEZ TESIS PRESENTADA Y PUBLICAMENTE DEFENDIDA PARA LA OBTENCION DEL TITULO DE MASTER OFICIAL EN CULTIVOS MARINOS Las Palmas de Gran Canaria a 9 de Diciembre de 2010 MASTER OFICIAL EN CULTIVOS MARINOS VI MASTER INTERNACIONAL EN ACUICULTURA Las Palmas de Gran Canaria, España 2008-2010 1 CULTIVO Y VALORACIÓN DE HYDROPUNTIA CORNEA (RHODOPHYTA) Y ULVA RIGIDA (CHLOROPHYTA) PARA LA PRODUCCIÓN DE BIODIESEL. DINÁMICA DE LA DISPONIBILIDAD DE AMONIO Y DE LAS CONDICIONES DE IRRADIACIÓN SOBRE LA CALIDAD DE LA BIOMASA. RAYCO GONZÁLEZ GONZÁLEZ Trabajo realizado en el Centro de Biotecnología Marina de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria (ULPGC); Islas Canarias, España, bajo la dirección del Dr. Juan Luis Gómez Pinchetti. Presentado como requisito parcial para la obtención del Título oficial de Máster Universitario en Cultivos Marinos otorgado por la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria y del Diploma de Master of Science en Acuicultura otorgado por el Centro Internacional de Altos Estudios Agronómicos Mediterráneos (CIHEAM). Director: Juan Luis Gomez Pinchetti Autor: Rayco González González MASTER OFICIAL EN CULTIVOS MARINOS VI MASTER INTERNACIONAL EN ACUICULTURA Organizado conjuntamente por la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria (ULPGC), el Instituto Canario de Ciencias Marinas (Gobierno de Canarias) y el Centro Internacional de Altos Estudios Agronómicos Mediterráneos (CIHEAM), a través del Instituto Agronómico Mediterráneo de Zaragoza (IAMZ) 2 Índice General Índice de figuras 3 Índice de tablas 4 Resumen 5 Abstract 6 Lista de Abreviaturas 7 1 Introducción 8 1.1 Sistemas integrados en Acuicultura (IMTA) 10 1.2 El cultivo intensivo de macroalgas 14 1.3 Valoración y aplicaciones de la biomasa 16 2 Objetivos 18 3 Materiales y Métodos 19 3.1 Especies, sistema y condiciones experimentales de cultivo 19 3.2 Determinación de la producción y la tasa de crecimiento 21 3.3 Biofiltración de amonio 22 3.4 Determinación de pigmentos fotosintéticos 23 3.5 Determinación del rendimiento cuántico óptimo (Fv/Fm) del PSII como indicador de estrés (medidas de fluorescencia de la clorofila) 24 3.6 Procesado de la biomasa 24 3.7 Extracción y valoración de lípidos totales y triglicéridos (TG) 24 3.8 Estudio comparativo con la biomasa del Proyecto Bifaro 26 3.9 Estadistica 26 4 Resultados 27 4.1 Cultivo de Hydropuntia cornea y Ulva rigida 27 4.2 Capacidad de biofiltración de amonio 32 4.3 Dinámica de la concentración de pigmentos fotosintéticos 35 4.4 Rendimiento cuántico óptimo del PSII como indicador de estrés 38 4.5 Valoración del contenido en lípidos y triglicéridos (TG) 40 5 Discusión 47 6 Conclusiones 52 7 Bibliografía 54 Anexo-1 66 3 Índice de figuras. Figura 1 – Procesos asociados al cultivo de peces 9 Figura 2 – Diagrama esquemático del sistema de cultivo 20 Figura 3 – Influencia de la radiación sobre producción de Hidropuntia cornea 33 Figura 4 – Evolución de la concentración de los pigmentos 36 Figura 5 – Aspecto morfológico externo de Hidropuntia cornea 37 Figura 6 – Evolución del Rendimiento Cuántico Optimo del PSII (Fv/Fm) 39 Figura 7 – Evolución de lípidos totales en Hidropuntia cornea 41 Figura 8 – Evolución de lípidos totales en Ulva rigida 42 Figura 9 – Evolución de los triglicéridos en Hidropuntia cornea 44 Figura 10 – Evolución de los triglicéridos en Ulva rigida 45 4 Índice de tablas Tabla 1 – Revisión de sistemas integrados y uso de la biomasa. 12 Tabla 2 – Datos medios de producción de las especies cultivadas 30 Tabla 3 – Datos medios de la tasa de crecimiento de las especies cultivadas 31 Tabla 4 – Valores medios de eficiencia y tasa de eliminación de amonio 34 Tabla 5 – Estimas y valoración de rendimientos en lípidos y triglicéridos 46 5 Resumen Las macroalgas Hydropuntia cornea (Rhodophyta) y Ulva rigida (Chlorophyta) fueron cultivadas en tanques de 90 L de manera intensiva; a escala de planta piloto en un sistema de biofiltración de aguas ricas en nutrientes (N-amonio y P-fosfato) y bajo diferentes condiciones de irradiación: (1) Exterior (outdoor) con radiación natural y, (2) bajo condiciones de invernadero (80% PAR + 10% UVA + 0% UVB), en las instalaciones de cultivo del Centro de Biotecnología Marina (Taliarte, Telde, Gran Canaria). En relación a los nutrientes, la dinámica de circulación establecida consistió en 2 semanas con agua de mar (limitación de nutrientes) y posteriormente 4 semanas bajo flujo continuo con aporte de nutrientes, N-amonio y P-fosfatos. Durante este periodo, se establecieron controles sólo con agua de mar. Bajo la combinación de los efectos de la irradiación y la dinámica de nutrientes, se determinaron los valores de producción y tasa de crecimiento, la capacidad de biofiltración de N-amonio (NUE y NUR) y el rendimiento quántico máximo (Fv/Fm) mediante fluorescencia de la clorofila del PSII, medida in vivo como indicador del estrés, además del contenido en los principales pigmentos fotosintéticos, clorofila y ficobiliproteínas. Con la biomasa obtenida, en los diferentes tratamientos durante el periodo experimental, se analizó el contenido en lípidos totales y triglicéridos (TG), con el objetivo de valorar la calidad de la biomasa como fuente de biodiesel. Una comparativa se realizó con muestras obtenidas en los desarrollos del Proyecto Bifaro, en los que la dinámica de cultivo fue invertida, 4 semanas con aporte de nutrientes y 2 semanas con agua de mar. Los resultados, obtenidos de los diferentes tratamientos, revelan la fuerte interrelación entre los efectos de la irradiación y la dinámica de nutrientes sobre la producción (máximos superiores a 30 g PS m-2 d-1) y calidad de la biomasa recolectada en las unidades de biofiltración (p.e. NUE superiores al 50%). En cuanto a la producción de lípidos y triglicéridos, los cálculos de los rendimientos en las condiciones más favorables alcanzaron valores de 1.7 g lípidos m-2 d-1 (6.4 t lípidos ha-1 año-1) y 0.7 g TG m-2 d-1 (2.4 t TG ha-1 año-1) para Hydropuntia cornea y 1.2 g lípidos m-2 d-1 (4.3 t lípidos ha-1 año-1) y 0.6 g TG m-2 d-1 (2.1 t TG ha-1 año-1), calculados para Ulva rigida. Palabras clave: amonio, biofiltración, cultivo en tanque, estrés, ficobiliproteínas, fluorescencia de la clorofila, Hydropuntia cornea, lípidos, triglicéridos, Ulva rigida 6 Abstract Macroalgae species Hydropuntia cornea (Rhodophyta) and Ulva rigida (Chlorophyta) were intensively grown in 90 L tanks at a pilot scale, in a biofiltration unit supplied with water rich in nutrients and different light conditions: (1) outdoor (natural radiation) and (2) under greenhouse conditions (80% PAR + 10% UVA + 0% UVB), at the culture facilities of the Center of Marine Biotechnology (Taliarte, Telde, Gran Canaria). In relation to nutrients, water flow dynamic was established in 2 first weeks with tanks supplied with seawater (nutrients limited) and the next 4 weeks under a continuous flow of nutrients (N-ammonium and P-phosphate). Controls were tanks supplied only with seawater. Under these combined effects of light quality and nutrients supply dynamic, yield and growth rate, N-ammonium biofiltration capacity (NUE and NUR), maximum quantum yield (Fv/Fm) as stress indicator, and photosynthetic pigments content, chlorophyll and phycobiliproteins, were estimated. In addition, with biomass obtained under the different treatments, total lipids and tryglicerides (TG) were determined in order to evaluate macroalgal biomass as a source of biodiesel. A comparative analysis was carried out with samples obtained from the experimental set of the Project Bifaro, where cultures dynamic was inverted, 4 first weeks under nutrients supply and 2 next weeks only with seawater (nutrients limited). Results obtained with the different treatments showed a strong relationship between light radiation and nutrients dynamic on the yield (maximum values higher than 30 g DW m-2 d-1) and biomass quality harvested from the biofiltration system (i.e. NUE higher than 50%). In relation with total lipids and tryglicerides contents, yields calculated for the most favourable conditions reached values closed to 1.7 g total lipids m-2 d-1 (6.4 t total lipids ha-1 year-1) and 0.7 g TG m-2 d-1 (2.4 t TG ha-1 year-1) for Hydropuntia cornea and 1.2 g total lipids m-2 d-1 (4.3 t total lipids ha-1 year-1) and 0.6 g TG m-2 d-1 (2.1 t TG ha-1 year-1), calculated for Ulva rigida. Key words: ammonium, biofiltration, tank culture, stress, phycobiliproteins, chlorophyll fluorescence, Hydropuntia cornea, lipids, tryglicerides, Ulva rigida Lista de abreviaturas PAR – Photosintetic Active Radiation NUE – Nitrogen uptake efficiency NUR – Nitrogen uptake rate IMTA – Integrated Multi-Trophic Aquaculture Fv/Fm – Índice estimador de la integridad del fotosistema II PSII – Fotosistema II “cpt” – Polietileno de alta densidad 8 1. Introducción En la actualidad, la producción de alimentos de origen acuático asciende a 157⋅106 toneladas por año, aproximadamente un 2% de la producción mundial total de alimento, y supone alrededor del 16% del consumo humano de proteína (Food and Agriculture Organization of the United Nations, 2009; Duarte et al., 2009). En las últimas dos décadas las capturas de la pesca han ido disminuyendo progresivamente y muchos stocks han sido sobreexplotados, de tal forma que la oferta global de pescado per capita se ha visto igualmente disminuida aún cuando, y de acuerdo con datos globales, las capturas se mantienen dos veces por encima de los niveles considerados sostenibles (Duarte et al., 2009). En contraste, la producción de la Acuicultura ha ido creciendo de forma constante a tasas que alcanzan duplicaciones por periodos de 10 años (> 7% por año), en las últimas 5 décadas, generando el 39% de los alimentos de origen acuático (FAO, 2009). De entre estos productos, la producción de organismos marinos (o Maricultura) está dominada, datos en peso, por las algas (46.2%), seguidas por los bivalvos (42.9%), peces diádromos (5.3%), peces marinos (3.7%) y crustáceos (1.8%). En la última década, la producción de crustáceos ha mostrado el mayor crecimiento (23% por año), dos veces más que las peces diádromos (11.5%) y los peces marinos (10.5%), y casi cuatro veces más que los bivalvos (6.2%). De acuerdo con estos datos y la tendencia a que la producción de animales marinos siga aumentando, se estima que en los próximos 20 años ésta sobrepasará las capturas de la pesca, y en los siguientes 30 años excederá la producción de proteína animal terrestre (Duarte et al., 2009). Para mantener el ritmo de crecimiento de esta actividad de forma sostenible, será necesario resolver algunos aspectos que forman un importante “cuello de botella” principalmente relacionado con la disponibilidad, adecuación y coste del alimento (piensos); la introducción de enfermedades; el efecto de los escapes sobre la biodiversidad; la disponibilidad de espacios; y el aumento del impacto medioambiental negativo que genera (Buschmann et al., 2008a; Duarte et al., 2009; Troell et al., 2009; Chávez-Crooker y Obreque-Contreras, 2010). En relación a este último aspecto señalado, la generación y descarga al medio, desde las infraestructuras de producción intensivas y a gran escala, de 15 máximos de producción (g Peso Seco m-2 d-1) y eficiencia del sistema (% conversión de energía luminosa en biomasa). A mayor control de estas variables, mayor posibilidad de incrementar la producción y modificar la calidad de la biomasa obtenida (Friedlander y Levy, 1995). Los beneficios de la incorporación de los sistemas de cultivo de macroalgas, en el desarrollo de los ya comentados sistemas multi-tróficos integrados, no están únicamente relacionados con la posibilidad de disminuir los desechos producidos que puedan causar problemas de eutrofización (y sus aspectos ecológicos relacionados). La posibilidad de cultivar peces con algas y otros organismos marinos disminuiría los costes, permitiendo la producción de dos o más organismos en un solo sistema y así, considerando algunos de los factores descritos anteriormente como el flujo y aporte de nutrientes y CO2, aumentar los rendimientos de la producción (Neori et al., 1991; Buschmann et al., 2001; Demetropoulos y Langdon, 2004a). Para poder interpretar, los resultados obtenidos en los sistemas de cultivo y biofiltración con algas, conceptos como la eficiencia de asimilación de nutrientes y la tasa de asimilación de nutrientes deben ser bien entendidos (Buschmann et al., 2001). La eficiencia de asimilación de un nutriente, p.e. nitrógeno (NUE), se define como la reducción media (%) en la concentración del nutriente, mientras que la tasa de asimilación (NUR) es la cantidad de un nutriente asimilada/eliminada por unidad de tiempo. Ambos conceptos varían dependiendo de las condiciones ambientales que afecten al sistema de cultivo en un periodo determinado, pero también de variables de cultivo como la profundidad del tanque, la densidad de inoculación o la tasa de renovación del medio. Jiménez del Rio et al. (1994) encontraron que la eficiencia de asimilación de nitrógeno disuelto (NUE) en un biofiltro de Ulva estaba inversamente relacionada con la tasa de renovación del medio y directamente relacionada con la densidad de inoculación del alga en los tanques de cultivo. Además, demostraron como la tasa de asimilación de nitrógeno (NUR) estaba directamente relacionada con ambas, el flujo de agua y la densidad del alga. Estos principios son importantes a la hora de establecer los objetivos; si la idea es obtener descargas de aguas limpias, la eficiencia de eliminación es un buen indicador, pero si el objetivo es aumentar la producción de biomasa dando como resultado una menor reducción de los nutrientes, la tasa de asimilación/eliminación es el parámetro a controlar (Buschmann et al., 2001). 16 Todas estas consideraciones y variables que intervienen e influyen directamente sobre el crecimiento de las macroalgas en los sistemas de cultivo intensivos, incluyendo los biofiltros, también pueden alterar las características fisiológicas de la biomasa y causar situaciones de estrés que pueden limitar la producción del sistema (Figueroa et al., 2006). La determinación de la actividad fotosintética es uno de los parámetros controlables y monitorizables más utilizados en el estudio de las situaciones y causas de estrés. Una de las determinaciones de la actividad fotosintética más utilizadas, por ser una técnica no-intrusiva y rápida, es la medida in vivo de la fluorescencia de la clorofila asociada al PSII. Recientemente esta técnica ha sido utilizada y recomendada para la determinación de estrés, la caracterización fisiológica y los procesos de degradación en macroalgas cultivadas en aguas residuales provenientes de tanques de peces (Figueroa et al., 2006; Mata et al., 2006). 1.3 Valoración y aplicaciones de la biomasa En las últimas décadas, la producción mundial de macroalgas ha estado dirigida, en su mayor parte, al consumo humano y la industria de los ficocoloides (agar, carragenatos y alginatos) (Zemke-White y Ohno, 1999). Otras aplicaciones de importancia industrial con relevancia son la obtención de fertilizantes agrícolas, el consumo animal o, más recientemente, los mercados de la cosmética y la talasoterapia (McHugh, 2003). Con un mercado menor, pero potencialmente muy interesante, la obtención de metabolitos con actividad biológica, farmacológica, medicinal o biotecnológica de las algas en general, y de las macroalgas en particular, ha aumentado significativamente (Smit, 2004; Dhargalkar y Pereira, 2005; Cardozo et al., 2007). Entre estas sustancias se encuentran como ejemplos representativos: pigmentos (ficobiliproteínas y carotenoides), polisacáridos sulfatados, compuestos halogenados, sustancias “antifouling”, lectinas, fucoidanos y sustancias con actividad antioxidante. En el escenario actual en el que aumenta el interés por el aprovechamiento de biomasa para la producción alternativa de biocarburantes, las algas se encuentran en el punto de mira por diversos motivos, entre los que se encuentran: la nula competición por terreno para el cultivo de especies terrestres y la capacidad para reducir las emisiones de CO2 a través del proceso fotosintético. La eficiencia 17 fotosintética de los vegetales marinos se encuentra alrededor del 6-8%, valores mayores a los estimados para vegetales terrestres (1.8-2.2%), y teniendo en cuenta su composición bioquímica, la biomasa de microy macroalgas puede ser considerada seriamente para la conversión de energía solar y la producción de biocarburantes (Aresta et al., 2005; Ross et al., 2008; Goh y Lee, 2010), añadiendo así una aplicación potencial con interés añadido a la producción de biomasa de macroalgas en los sistemas integrados. Aunque fisiológicamente el metabolismo del carbono y su relación con la producción de polisacáridos, lípidos y ácidos grasos en macroalgas han sido ampliamente estudiados, no existe demasiada información sobre la producción de biodiesel, al contrario de lo que sucede con las microalgas (Chisti, 2007), probablemente debido a las bajas concentraciones de lípidos, frente a las altas de polisacáridos, encontradas en macroalgas (Rupérez y Saura-Calixto, 2001). El biodiesel es una mezcla de ésteres mono-alquilo de ácidos grasos de cadena larga obtenidos por un proceso de transesterificación a partir de lípidos neutros de almacenamiento (triglicéridos). El porcentaje de triglicéridos en especies de los diferentes géneros cultivables, p.e. Ulva, es predominante en altas condiciones de irradiación y disminuye bajo intensidades más bajas, sugiriendo que los cambios en la composición de lípidos puede ser un mecanismo de adaptación y supervivencia a diferentes condiciones de radiación (Khotimchenko y Yakovleva, 2004). Paralelamente, la composición bioquímica de Ulva rigida, incluyendo la síntesis de triglicéridos y ácidos grasos, se ve afectada de forma directa por la dinámica del aporte de nutrientes, particularmente nitrógeno (Gómez Pinchetti et al., 1998; Gordillo et al., 2001), lo que probablemente afectaría el rendimiento en la producción de biodiesel a partir de este tipo de biomasa. Teniendo en cuenta que en los últimos años, algunos de los proyectos desarrollados en nuestro Centro han estado orientados al efecto que la dinámica del aporte de nutrientes (principalmente N-amonio y P-fosfato y su relación con el metabolismo del carbono) y otros parámetros tienen sobre la biomasa cultivada de forma intensiva y algunos de sus productos, p.e. polisacáridos o aminoácidos tipo micosporina (MAA’s); la valoración de lípidos y sus componentes (p.e. triglicéridos y ácidos grasos) y la posibilidad de su modificación a través de los cambios en las condiciones de cultivo, fueron considerados como un objetivo interesante a la hora de plantear el presente trabajo. 18 2. Objetivos De acuerdo con los antecedentes expuestos, los objetivos planteados en el presente trabajo fueron: 1.- Determinar la producción y el crecimiento de dos especies de macroalgas: Ulva rigida (Chlorophyta) e Hydropuntia cornea (Rhodophyta). 2.- Comparar las diferentes condiciones establecidas sobre la capacidad de biofiltración de N-amonio de las dos especies estudiadas. 3.- Evaluar la capacidad fotosintética (nivel de estrés) utilizando medidas in vivo de fluorescencia de la clorofila. 4.- Valorar y cuantificar el contenido en lípidos totales y triglicéridos para la obtención de biodiesel. 19 3. Material y Métodos 3.1 Especies, sistema y condiciones experimentales de cultivo Las dos especies utilizadas en este estudio fueron Ulva rigida C. Agardh (Ulvaceae; Chlorophyta) e Hydropuntia cornea (J. Agardh) M.J. Wynne (Gracilariaceae; Rhodophyta), anteriormente descrita como Gracilaria cornea. Ulva rigida es un alga verde (Phylum Chlorophyta) perteneciente a la familia Ulvaceae dentro del orden Ulvales con las siguientes características: un talo laminar, con dos capas de células (distromáticos), que esta irregularmente lobulado y presenta en el margen dientes microscópicos. Las células presentan de 2 a 3 (4) pirenoides, además las células básales; justo por encima de la región rizoidal; son rectangulares (2-4 veces mas altas que anchas). Hidropuntia cornea es un alga roja (Phylum Rhodophyta) perteneciente a la familia Gracilariaceae dentro del orden Gracilariales con las siguientes características: talo pseudoparenquimatoso multiaxial cuyo corte transversal es cilíndrico y su ramificación es irregular y/o alterna (nunca es dicótoma). Las células de distribuyen en dos zonas claramente diferenciadas, una interior (médula), con células relativamente más grandes, y una exterior (córtex) donde se observan células más pequeñas y con gran cantidad de cloroplastos. Los cultivos originales han sido mantenidos, creciendo de forma vegetativa, en los sistemas de cultivo intensivo del Centro de Biotecnología Marina (ULPGC) durante los últimos años. El diseño experimental desarrollado (Fig. 2; Anexo 1) incorpora un modelo en el que se determinan los trasvases de nutrientes contenidos en las aguas residuales provenientes de tanques para el cultivo intensivo de dorada (Sparus aurata), principalmente nitrógeno y fósforo disuelto en forma de amonio y fosfato respectivamente y la calidad de los efluentes obtenida después de su paso en flujo continuo a través de los tanques para el cultivo intensivo de macroalgas. El agua de mar se obtiene mediante bombeo directo del mar y se dirige a los tanque de peces previo paso por un sistema de filtros de arena. 20 Figura. 2.- Diagrama esquemático del sistema de cultivo experimental indicando los flujos de agua y nutrientes, utilizado paralelamente dentro y fuera del invernadero. C: tanques control; R: tanques con aporte de nutrientes a partir de la semana 3. Las flechas indican la dirección del flujo de agua. Los efluentes son bombeados desde 2 tanques de 11 m3 con una densidad óptima de peces de 20 Kg m-3 y tasas de renovación de agua entre 6 – 8 vol d-1. Después de su paso por un tanque de decantación para la separación de la materia particulada, el agua es bombeada directamente a los tanques de macroalgas que actúan como biofiltro (Fig. 2). Durante los periodos en los que no hay posibilidad de mantener peces de forma continuada, se establece un “modelo virtual” (de acuerdo a los modelos descritos por: Porter et al., 1987; Losordo y Westers, 1994), en el que a partir de una solución concentrada de cloruro de amonio y fosfato de potasio se realiza un aporte con concentraciones y flujos controlados, para simular la presencia de peces a una densidad de 20 Kg m-3, a partir del tanque de decantación previo al bombeo hacia el biofiltro. Para el presente trabajo, el sistema de biofiltración y cultivo de macroalgas fue organizado con tanques circulares de cultivo, construidos de polietileno de alta densidad (Allibert Manutención, Barcelona), con un volumen de 90 l (0,09 m3) y una superficie aérea de 0,2 m2 (S:V = 2,2 m-1) (Anexo 1). La aireación (bombas ELMO model 2BH 1600, Siemens, Alemania) para la rotación de la biomasa es Tanque de Decantación Tanque de Peces (Virtual) C R R R C M A R Desagüe Bomba Filtro de Arena 21 suministrada a través de un tubo de polietileno lineal situado en el fondo del tanque. El flujo abierto de agua se mantiene a través de un desagüe situado en la parte superior del tanque y cubierto con una malla para evitar el escape de algas. Dos condiciones “outdoor” fueron establecidas para dos juegos de cinco tanques cada uno; (1) bajo radiación natural (100% PAR + UVR) y (2) bajo condiciones de invernadero (80% PAR, 10% UVA, 0% UVB). Los datos de irradiación (W m-2) fueron obtenidos de forma permanente con un radiómetro ELDONET (Real Time Computer, Erlangen, Alemania). Este radiómetro toma lecturas en tres canales (PAR, 400-700 nm; UV-A, 315-400 nm; UV-B, 280-315 nm) a intervalos de 1 seg., y almacena los datos a través del software WinDose 2000, que calcula la dosis diaria acumulada. A partir de estos valores se calcularon las dosis PAR medias semanales (kj m-2 d-1). El periodo de cultivo para cada especie fue establecido en 6 semanas de duración; Hydropuntia cornea durante el periodo comprendido entre el 6 de julio y el 17 de agosto de 2009 y Ulva rigida entre el 17 de agosto y el 28 de septiembre de 2009. Durante las dos primeras semanas, los tanques fueron llenados con agua de mar, sin adición extra de nutrientes, en flujo abierto con una tasa de renovación de 20 vol. d-1 (1,25 l min-1). Las siguientes cuatro semanas se mantuvieron dos tanques en las mismas condiciones (control) y otros tres tanques fueron mantenidos con agua proveniente del tanque de decantación, enriquecida con Namonio y P-fosfato, en las mismas condiciones. La tasa de renovación fue regulada diariamente. Los datos de temperatura del agua fueron medidos con sensores Hobo UTBI-001 (Onset Computer Co., USA) programados a intervalos de 30 min. 3.2 Determinación de la producción y la tasa de crecimiento De forma general, los tanques fueron cosechados semanalmente y la biomasa ajustada a las densidades volumétricas óptimas, determinadas previamente, para los tanques utilizados; 13 g l-1 para Hydropuntia cornea y 10 g l-1 para Ulva rigida. Después de escurrir la biomasa cosechada para la obtención del peso fresco escurrido (PF) la Producción fue calculada de acuerdo a DeBoer y Ryther (1977): 22 P (g PS m-2 d-1) = [(Pt – P0) / t) * (PS/PF)] / A donde: Pt - P0; excedente en gramos de PF, a los t días PS/PF; relación peso seco / peso fresco escurrido A = Area superficial del tanque de cultivo en m2 Las relaciones PS/PF fueron determinadas para cada especie con muestras secadas en la estufa a 90°C hasta obtener el peso constante (0,12 y 0,21 para H. cornea y U. rigida, respectivamente). La tasa de crecimiento neta fue calculada de acuerdo a D’Elia y DeBoer (1978): µ (% d-1) = 100 * Ln (Pt / P0) / t donde: Pt; peso fresco de la biomasa alcanzada en t días P0; peso fresco de la biomasa inicial 3.3 Biofiltración de amonio Semanalmente, el día posterior al cosechado y reajuste de los tanques, se determinaron las tasas de biofiltración de amonio durante el periodo de enriquecimiento con nutrientes. Las muestras recolectadas en las entradas y salidas de los diferentes tanques fueron procesadas inmediatamente siguiendo el método colorimétrico de Parsons et al. (1984). Como controles se utilizaron muestras de agua de mar. Con los resultados obtenidos se calcularon la eficiencia de eliminación de N-amonio (NUE): NUE (%) = Cs/Ce * 100 donde Cs y Ce son las concentraciones de amonio en la salida (desagüe) y en la entrada del tanque; y la tasa de asimilación de N-amonio (NUR): NUR (mmol m-2 h-1) = Q * (Cs - Ce) / A 23 donde: Q = flujo de agua (l h-1), Ce = concentración de N-amonio en la entrada (mmol), Cs = concentración de amonio en la salida (mmol), A = superficie del tanque (m2). 3.4 Determinación de pigmentos fotosintéticos Para la determinación de pigmentos, muestras de 2 g fueron recolectadas de cada tanque de cultivo y congeladas a -20ºC. Para el análisis de pigmentos, muestras de 1 g fueron homogeneizadas. Para la determinación de clorofila a la muestra fue homogeneizada en 4 ml de metanol. Después de centrifugar, la concentración de pigmentos fue cuantificada de acuerdo con la ecuación (Wellburn, 1994): Cl a (µg ml-1) = 16.72 A665.2 – 9.16 A652.4 Para la determinación de ficobiliproteínas (ficoeritrina y ficocianina), 1 g de muestra fue homogeneizado en 4 ml de tampón fosfato (0,1 M; pH 6.0). Después de centrifugar a 9.000 rpm durante 5 min a 15ºC, el extracto obtenido fue cuantificado por espectrofotometría (Shimadzu UV-160) de acuerdo con las ecuaciones de Beer y Eshel (1985): R-FE (mg ml-1) = [(A564 - A592) - (A455 - A592) x 0,20] x 0,12 R-FC (mg ml-1) = [(A618 - A645) - (A592 - A645) x 0,51] x 0,15 Las muestras fueron analizadas por triplicado. Para posteriores comparaciones, los datos obtenidos fueron normalizados a valores de peso seco, mg mg-1 PS o µg mg-1 PS. 24 3.5 Determinación del rendimiento cuántico óptimo (Fv/Fm) del PSII como indicador de estrés (medidas de fluorescencia de la clorofila) Para la determinación del efecto de las diferentes condiciones de cultivo sobre el grado de estrés de la biomasa se utilizó un Plant Efficiency Analizer (PEA, Hansatech, UK) con el que se determinó, in vivo, el rendimiento cuántico óptimo del PSII (Fv/Fm) a través de las medidas de fluorescencia de la clorofila: Fv/Fm = (Fm - F0) / Fm donde F0, es el nivel mínimo de fluorescencia Fm, es el nivel de fluorescencia máximo en un pulso de saturación Fv, es la fluorescencia variable PSII, fotosistema II Para ello las algas fueron adaptadas a la oscuridad durante un tiempo de 15 min. antes de aplicar un pulso de luz de 2.000 µmoles de fotones m-2 s-1 (100% de saturación) durante un intervalo de 5 s. Las medidas fueron tomadas por triplicado, al menos una vez cada semana, durante el periodo experimental. 3.6 Procesado de la biomasa Los excedentes de la producción semanal fueron envasados y congelados a -20 ºC antes de ser secados por liofilización (Freezone 6L, Labconco, USA). Las muestras secas fueron envasadas al vacío y almacenadas en oscuridad hasta el momento de su análisis. 3.7 Extracción y valoración de lípidos totales y triglicéridos (TG) Los lípidos totales de las muestras seleccionadas fueron extraídos por el método de Folch (Folch et al., 1957) y cuantificados gravimétricamente. Con el objetivo de eliminar sales, las muestras fueron tamizadas durante 15 min., 1 g de muestra fue extraído con cloroformo:metanol (2:1) en una proporción de 30 ml g-1 PS. Para evitar la degradación oxidativa durante la extracción, se añadió BHT 31 Tabla 3.- Datos medios (media ± sd; n ≥ 9) de tasa de crecimiento (% d-1) de las especies cultivadas en tanques “cpt” (90 l) bajo las diferentes condiciones ensayadas; Interior: bajo invernadero, Exterior: irradiación natural. R: Rhodophyta, C: Chlorophyta. Tasa de crecimiento (% d-1) Interior Exterior Especie (Division) Periodo experimental Sin N/P (1) Con N/P (2) Sin N/P (1) Con N/P (2) Hydropuntia cornea (R) Jul – Ago 09 3.2 ± 0.8 5.5 ± 1.3 3.0 ± 0.6 6.0 ± 2.1 Ulva rigida (C) Ago – Sep 09 3.4 ± 1.5 1.2 ± 0.6 3.4 ± 0.8 1.9 ± 0.5 (1) Sin aporte de nitrógeno y fósforo (SW) durante un periodo de 2 semanas (2) Con aporte de nitrógeno y fósforo durante las 4 semanas posteriores 32 La influencia de los valores de radiación, tomados como dosis PAR diaria acumulada, sobre la producción de Hydropuntia cornea en las diferentes condiciones ensayadas se muestran en la Figura 3. Los valores de producción media aumentaron con la radiación de forma general, siendo mayores tanto fuera (Fig. 3A) como dentro del invernadero (Fig. 3B), para los tanques correspondientes a los periodos con aporte de nutrientes. En estas condiciones específicas, los valores de producción de los tanques exteriores fueron superiores a los obtenidos en los tanques situados en el interior del invernadero. Las producciones de los tanques control y sin aporte de nutrientes (primeras 2 semanas del periodo experimental) se mantuvieron constantes, en relación al aumento de los valores de radiación, de forma general, mostrando valores inferiores a los obtenidos de los tanques con aporte de nutrientes. Aunque cabría esperar la misma dinámica para los datos de producción de Ulva rigida, los problemas de esporulación durante el periodo experimental en los tanques con aporte de nutrientes, no permitieron obtener datos de producción suficientes para realizar la comparativa. 4.2 Capacidad de biofiltración de amonio Los datos de biofiltración de amonio de Hydropuntia cornea y Ulva rigida durante las 4 últimas semanas de tratamiento con aporte continuo de nutrientes (Namonio y P-fosfatos) se presentan en la tabla 4. El flujo de N-amonio durante el periodo experimental de cultivo de Hydropuntia cornea mostró valores medios de 4.5 ± 0.5 mmoles N-NH4+ h-1. En estas condiciones los valores de eficiencia de eliminación de amonio fueron superiores al 75% en los tanques interiores frente a valores medios del 84% para los tanques en el exterior. Las tasas de eliminación/asimilación por unidad de superficie fue igualmente superior en los tanques exteriores (18.1 ± 5.8 mmoles NNH4+ m-2 h-1) que en los del interior del invernadero (17.6 ± 3.0 mmoles N-NH4+ m-2 h-1) no observándose diferencias significativas. En el caso de Ulva rigida, el flujo de N-amonio durante el periodo experimental mostró valores medios de 2.9 ± 1.0 mmoles N-NH4+ h-1. Bajo estas 33 . Figura 3.- Influencia de la irradiación (dosis PAR acumulada, kj m-2 d-1) sobre la producción de Hydropuntia cornea (g PS m-2 d-1) en las condiciones ensayadas. A: Tanques exteriores; B: Tanques en el interior invernadero (80% PAR). Medias ± sd (n ≥ 3). 0 20 40 60 80 100 11 12 13 14 15 Produccion (g PS m-2 d-1) Dosis irradiacion x 103 (kj m-2 d-1) A 0 20 40 60 80 100 910 11 12 Dosis irradiacion x 103 (kj m-2 d-1) Produccion (g PS m-2 d-1) B 34 Tabla 4.- Valores medios (media ± sd; n ≥ 9) de eficiencia de eliminación NUE (%) y tasa de eliminación de amonio NUR (mmoles m-2 h-1) de las especies cultivadas en tanques “cpt” (90 l) con aporte de N-amonio y P-fosfatos, bajo las diferentes condiciones ensayadas; interior: bajo invernadero, exterior: irradiación natural. R: Rhodophyta; C: Chlorophyta. Biofiltración de amonio NUE (%) NUR (mmoles m-2 h-1) Especie (Division) Periodo experimental Flujo amonio (mmoles h-1) Interior Exterior Interior Exterior Hydropuntia cornea (R) Jul – Ago 09 4.5 ± 0.5 76.1 ± 20.2 83.9 ± 19.1 17.6 ± 3.0 18.1 ± 5.8 Ulva rigida (C) Ago – Sep 09 2.9 ± 1.0 98.3 ± 2.6 98.3 ± 4.5 15.2 ± 6.1 14.7 ± 5.7 35 condiciones los valores de eficiencia de eliminación de amonio fueron superiores al 98% tanto en los tanques interiores como en los exteriores (Tabla 4), alcanzándose en algunas de las muestras valores del 100%. Las tasas de eliminación/ asimilación, por unidad de superficie fueron ligeramente superiores en los tanques interiores (15.2 ± 6.1 mmoles N-NH4+ m-2 h-1) en comparación a los tanques exteriores (14.7 ± 5.7 mmoles N-NH4+ m-2 h-1) no observándose diferencias significativas. Comparativamente los valores de eficiencia de eliminación (NUE) en los tanques de Ulva rigida fueron superiores a los de Hydropuntia cornea a pesar de que los rangos en los valores medios de ésta última fueron amplios (valores mínimos cercanos al 50-60% y máximos del 100%). Los valores medios de las tasas de eliminación (NUR) fueron ligeramente superiores para H. cornea en comparación a los obtenidos con U. rigida a pesar de que no se observaron diferencias significativas. 4.3 Dinámica de la concentración de pigmentos fotosintéticos Los resultados de la dinámica y evolución de los pigmentos fotosintéticos, clorofila a y ficobiliproteínas (R-ficoeritrina y R-ficocianina) de Hydropuntia cornea bajo las condiciones ensayadas se muestran en la figura 4. Los datos de clorofila correspondientes al experimento de Ulva rigida no se muestran por la imposibilidad de realizar un análisis coherente de los datos obtenidos, debido a los problemas de esporulación y pérdida de biomasa en los tanques con aporte de nutrientes. En Hydropuntia cornea la dinámica mostró, en los tanques control durante todo el experimento y en los tanques con tratamiento durante las 2 primeras semanas sin aporte de nutrientes, una disminución continuada en las concentraciones de ambas ficobiliproteínas hasta alcanzar los valores mínimos en la semana 6. Sin embargo, la concentración de clorofila a no mostró variaciones significativas durante todo el periodo experimental (Fig. 4). De forma inversa, se observó un aumento de los valores de las diferentes concentraciones de los tres pigmentos mayoritarios en los tanques con aporte contínuo de nutrientes durante las 4 últimas semanas, alcanzándose los valores máximos entre las semanas 4 y 5. En la semana 6, aunque los valores se mantienen en los niveles máximos, se observa una ligera disminución en los tres pigmentos analizados (Fig. 4). 36 Fig. 4.- Evolución de la concentración (µg g-1 PF) de clorofila a y ficobiliptroteínas (R-ficoeritrina y R-ficocianina) de Hydropuntia cornea bajo las condiciones ensayadas. SW: 2 semanas sin aporte de nitrógeno; +N: 4 semanas con aporte de nutrientes. Barra negra: control interior con agua de mar; barra trama diagonal: tanques tratamiento (+N) interior; barra gris: control exterior con agua de mar; barra blanca: tanques tratamiento (+N) exterior. Datos expresados como media ± sd (n ≥ 3). Los valores medios en la semana 0 fueron: clorofila a = 84.0 ± 16.2 µg g-1 PF; ficoeritrina = 113,4 ± 8,0 µg g-1 PF; ficocianina = 19,0 ± 3,7 µg g-1 PF. Para la transformación de los datos a µg g-1 PS se utiliza una relación PS/PF para H. cornea = 0.12. 0 20 40 60 80 100 123456 Clorofila a (ug g-1 PF) Semana SW +N 0 100 200 300 400 500 600 123456 Ficoeritrina (ug g-1 PF) SW +N Semana 0 20 40 60 80 100 123456 Ficocianina (ug g-1 PF) Semana SW +N 37 El aumento en la concentración de clorofila a de Hydropuntia cornea evolucionó de forma paralela tanto para los tanques situados en el interior del invernadero como los exteriores, alcanzándose valores máximos cercanos a 90 µg g-1 PF (750 µg g-1 PS). La dinámica fue observada igualmente para las ficobiliproteínas. Sin embargo, los valores fueron superiores para los tanques situados en el interior del invernadero en comparación a los tanques situados en el exterior (Fig. 4). La R-ficoeritrina fue el pigmento mayoritario en H. cornea, incluso en comparación a la clorofila a, alcanzando concentraciones máximas superiores a 500 µg g-1 PF (4.2 mg g-1 PS). La R-ficocianina alcanzó valores máximos superiores a 80 µg g-1 PF (667 µg g-1 PS). Las diferencias en la concentración de pigmentos de las algas cultivadas sin aporte de nutrientes con respecto a las cultivadas con aporte contínuo de N y P fueron observadas morfológicamente de forma clara, tal y como se muestra en la figura 5. Figura 5.- Aspecto morfológico externo de Hydropuntia cornea cultivada con aporte de nutrientes (color rojo oscuro) y sin aporte de nutrientes (color pardo-amarillo). 38 4.4 Rendimiento cuántico óptimo del PSII como indicador de estrés La dinámica de los valores correspondientes al rendimiento cuántico óptimo del PSII, como indicador de estrés de la biomasa, medidos in vivo a través de la fluorescencia de la clorofila, se presentan en la figura 6. Los valores de la relación Fv/Fm obtenidos para Ulva rigida en el estado considerado “óptimo” o “sin estrés” fueron superiores a los observados para Hydropuntia cornea (0.8 y 0.6 respectivamente). De forma general, las dos especies mantuvieron su condición fisiológica estable durante las 6 semanas de duración del experimento. Sin embargo, en los tanques control de U. rigida se observó una disminución en los valores de Fv/Fm a partir de la semana 4. A partir de la semana 3, coincidiendo con la inyección de nutrientes en los tanques correspondientes, los valores sufrieron un ligero ascenso indicando el efecto positivo de esta adición sobre la capacidad fotosintética de la biomasa (Fig. 6). Para Hydropuntia cornea la dinámica se mantuvo estable en los tanques situados en el interior del invernadero, bajo las diferentes condiciones establecidas, mostrando valores cercanos al 0.6. Sin embargo, los valores de Fv/Fm obtenidos para los tanques situados en el exterior, con irradiación natural, fueron menores que los observados en los tanques interiores, incluso en el periodo de aporte de nutrientes. Los valores mínimos, por debajo del 0.4, fueron obtenidos para los tanques control, exteriores sin aporte de nutrientes, en la semana 6 (Fig. 6). 39 Figura 6.- Evolución del rendimiento cuántico óptimo del PSII (Fv/Fm) en Hydropuntia cornea y Ulva rigida cultivadas bajo las diferentes condiciones ensayadas. SW: 2 semanas sin aporte de nitrógeno; +N: 4 semanas con aporte de nutrientes. Barra negra: control interior; barra trama diagonal: tanques tratamiento (+N) interior; barra gris: control exterior; barra blanca: tanques tratamiento (+N) exterior. Datos expresados como media ± sd (n ≥ 4). Las medidas en la semana 0 se realizaron con la biomasa del día de inoculación de los tanques (día 0). 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 0 1 2 3 4 5 6 Fv/Fm Semana Ulva rigida SW +N 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 0 1 2 3 4 5 6 Fv/Fm Semana Hydropuntia cornea SW +N 40 4.5 Valoración del contenido en lípidos y triglicéridos (TG) Los resultados de los análisis de lípidos totales extraídos de las muestras de Hydropuntia cornea y Ulva rigida se muestran en las figuras 7 y 8. Las muestras obtenidas, en el trabajo experimental descrito, fueron comparadas y analizadas conjuntamente con las obtenidas en los experimentos del Proyecto Bifaro, en los que muestras de las mismas especies cultivadas en periodos similares, bajo las mismas condiciones de irradiación (interior y exterior), fueron cultivadas con una dinámica inversa de nutrientes, es decir, 4 semanas con aporte de nutrientes y 2 semanas finales sólo con agua de mar. En general, el contenido en lípidos de ambas especies mostró niveles por debajo del 3%, siendo ligeramente superiores en las muestras de Hydropuntia cornea en comparación a los observados en Ulva rigida (Fig. 7 y 8). Para las muestras de Hydropuntia cornea obtenidas en el presente trabajo, el contenido en lípidos totales se mantuvo estable, durante las dos primeras semanas en agua de mar y en las semanas posteriores para los tanques con aporte de nutrientes, sin observarse cambios significativos entre los tanques exteriores en comparación a los situados en el interior del invernadero. Sin embargo, los tanques control con agua de mar mostraron una disminución considerable en la concentración de lípidos totales, tanto dentro como fuera del invernadero, alcanzando concentraciones cercanas al 1% (Fig. 7A). La misma dinámica fue observada para las muestras del Proyecto Bifaro (Fig. 7B), valores menores para los controles, excepto en la semana 6 para el control exterior, y valores máximos y estables para los tanques con aporte de nutrientes durante las 4 primeras semanas y en las 2 semanas posteriores sólo con agua de mar. En el caso de Ulva rigida las diferencias entre los valores del contenido en lípidos totales fueron más acusadas entre las algas cultivadas con aporte de nutrientes en los dos tipos de experimento y las muestras obtenidas de los tanques control o sin aporte de nutrientes (Fig. 8). En estos resultados también se observa la disminución en la concentración de lípidos, en las muestras obtenidas de los tanques con aporte de nutrientes después de 4 semanas; semana 6 para este experimento (Fig. 8A) y semana 4 para las muestras del Proyecto Bifaro (Fig. 8B). 47 5. Discusión Para el correcto desarrollo del IMTA, debemos buscar y/o conocer las especies de macroalgas, locales, que mejor se adapten a las condiciones ambientales de un sistema de biofiltro (Chopin et al., 2001; Copertino et al., 2009). Nuestras algas ya han demostrado, en estudios anteriores (Gómez-Pinchetti et al., 1998; Mata et al., 2010), que son muy adaptables y maleables en diferentes condiciones ambientales; por eso, nuestro estudio esta dirigido a la búsqueda de las variaciones dadas cuando cambiamos los factores ambientales de irradiación y nutrientes en la calidad de la biomasa, haciendo hincapié en la presencia de lípidos (Harwood y Guschina, 2009). Hemos obtenido resultados interesantes (ver tablas 3 y 4) en cuanto a la producción y tasa de crecimiento (SGR). La adición de nutrientes al medio, sobre todo nitrógeno, redunda en el incremento de la biomasa de las especies autótrofas (Buschmann et al., 2008a). Por ello, las producciones y tasas de crecimiento obtenidas durante el cultivo han sido altas; aunque hay una alta desviación estándar presente, que seguramente se deba a la alta variación diaria en la irradiación incidente (Schuenhoff et al. 2006; Shpigel y Neori, 2007; Buschmann et al, 2008b); lo que concuerda con resultados obtenidos por otros autores (Chow et al., 2001; Msuya y Neori, 2002; Bartoli et al., 2005; Hernández et al., 2006; Hirata et al., 2007; Shpigel y Neori, 2007; Wang et al., 2007; Buschman et al., 2008b; Marinho-Soriano et al., 2009; Cruz-Suárez et al., 2010) con especies afines. En otro orden de cosas, la producción de ulva se colapso durante la tercera semana de cultivo, coincidiendo con la luna llena (04/09/09) que indujo la fase reproductiva, lo que coincide con lo reportado por otros autores (Msuya y Neori, 2002; Bartoli et al., 2005; Copertino et al., 2009) que observaron este mismo comportamiento en especies del género. Aún con el contratiempo presentado, los resultados, durante las tres primeras semanas de cultivo, indican una producción estable; entorno a 39.1 ± 18.0 g PS m-2 d-1 (3.4 ± 1.5% d-1) y 38.5 ± 9.7 g PS m-2 d-1 (3.4 ± 0.8% d-1), dentro y fuera respectivamente; que son estimas próximas a las obtenidas por Msuya y Neori, (2002) con 1,2 ± 2,7% d-1, Bartoli et al., (2005) con 3,4% d-1, Wang et al., (2007) con 3,3% d-1 pero alejadas de Pereira et al. (2006) y Copertino et al. (2009), que obtuvieron un 20% d-1 de SGR medio, aunque ellos 48 trabajaron con Phorphyra en cámaras de cultivo. El alga roja (H. cornea) no presentó ningún contratiempo de tipo reproductivo, puesto que es un clon estéril, por lo tanto, la producción fue máxima con 58.4 ± 19.8 g PS m-2 d-1 (6.00 ± 2.1 % d1), durante el periodo con adición de nutrientes, similar a lo reportado por otros autores (Chow et al., 2001.; Msuya y Neori, 2002.; Hernandez et al., 2006; Buschman et al., 2008b; Marinho-Soriano et al., 2009.) que han trabajado en especies cercanas. Al someter a H. cornea y Ulva rigida a un periodo sin nutrientes lo que supone una situación de estrés, y siguiendo las indicaciones de Figueroa et al. (2006) que sugiere este parámetro como fiable y fácil de medir, se recopilaron datos del rendimiento cuántico óptimo del PSII (Fv/Fm) para registrar si hubo variaciones en el estado fisiológico. Los datos recabados (figura 6) indican que el estrés sufrido, por la carencia de nutrientes durante dos semanas, es inapreciable, solo en la semana sexta en los tanques control se observó un empeoramiento mientras que las replicas se mantienen en el óptimo, este hecho coincide con Mata et al. (2006) que observó la incidencia positiva de la densidad en el mantenimiento y recuperación del óptimo tras un episodio de estrés agudo, como puede ser la desecación o cambio brusco de irradiación (Figueroa et al., 2006, Mata et al., 2006, Aguilera et al., 2008). Por el contrario, en U. rigida a partir de la cuarta semana se vio el descenso en la relación Fv/Fm para los controles, mientras que las replicas estuvieron en máximos, lo cual indica su sensibilidad a la falta de nutrientes. En ambos cultivos, Fv/Fm siempre fue ligeramente superior dentro del invernadero en comparación con el exterior; muy posiblemente esto se deba a la diferente radiación incidente, en el exterior incide la radiación UV, fuente de estrés adicional, que es casi totalmente reflejada por la cubierta del invernadero (Aguilera et al., 2008). Como la irradiación es un factor importante en la producción (Braud, 2006; Schuenhoff et al., 2006), y durante nuestro cultivo hubo un rango amplio (de 14469 a 12250 kj m-2 d-1), enfrentamos los datos (figura 3) obteniendo confirmación positiva de la mayor producción conforme aumenta la cantidad de irradiación, además se observa la diferencia, a una irradiación dada, entre la presencia/ausencia de nutrientes (Hernández et al., 2006; Pereira et al., 2006). En cuanto a la biofiltración obtenida durante el experimento (Tabla 5) donde no hubieron diferencias significativas entre los cultivos, ni siquiera entre exterior e 49 interior, es superior o similar a las indicadas por otros autores (Chow et al., 2001; Msuya y Neori, 2002; Schuenhoff et al., 2003; Hernández et al., 2006; Buschman et al., 2008b; Robertson-Andersson et al., 2008; Mao et al., 2009; Marinho-Soriano et al., 2009; Mata et al., 2010b); donde sus resultados de eficiencia de asimilación de nitrógeno (NUE) están comprendidos entre el 20 y el 80%. Como nuestro experimento fue diseñado para obtener la máxima filtración es normal obtener resultados por encima del 50%. Por otro lado, fisiológicamente U. rigida y H. cornea han sido citadas como especies adaptadas a alta irradiación (Schuenhoff et al., 2006; Shpigel y Neori, 2007, Buschman et al., 2008b), lo que implica que los mejores resultados tanto en producción como en biofiltración ocurren en los periodos de verano-otoño. La biofiltración de Ulva no se vio afectada por el hecho de entrar en fase reproductiva (Msuya y Neori, 2002; Bartoli et al., 2005; Copertino et al., 2009), puesto que siguió activa fisiológicamente produciendo esporas, aunque no biomasa. Aunque el NUE es fácilmente comparable no da mucha información, mientras que la tasa de asimilación (NUR) nos permite saber la relevancia y capacidad para suprimir del medio, en este caso, el nitrógeno por unidad temporal y superficial (Jiménez del Río et al., 1994). Los datos muestran una tasa de asimilación (NUR) que llega a duplicar la de otros autores (Chow et al., 2001; Msuya y Neori, 2002; Bartoli et al., 2005; Schuenhoff et al., 2006; Shpigel y Neori, 2007; Buschmann et al., 2008b; Copertino et al. 2009). No obstante, aun no hallando diferencias significativas entre las dos especies, para los dos parámetros, se observó una mayor eficiencia en U. rigida que no se traduce en una mejor tasa de asimilación que es obtenida por H. cornea. Buschman et al. (2008b) afirma que “altas concentraciones de nitrógeno (amonio) incrementan el contenido de los pigmentos fotosintéticos, proteínas solubles y el nitrógeno interno, además de compuestos fotoprotectores o intermediarios de la fotosíntesis”. Esta respuesta fisiológica de las macroalgas es un hecho patente en nuestro estudio, como podemos observar en la figura 4, la cantidad de pigmentos se duplica, como mínimo en una semana, manteniéndose a partir de ahí constante. La Ficoeritrina es el pigmento característico de las Rodófitas (algas rojas) y por eso su cantidad es tan alta en comparación a la clorofila y la ficocianina. La aparente diferencia, en la media entre los tratamientos fuera y dentro de invernadero, se debe a la presencia/ausencia, respectivamente, de la radiación UV que provoca fenómenos de degradación como indican otros 50 autores (Aguilera et al., 2008; Buschmann et al., 2008b). Otros autores (Msuya y Neori, 2002; Neori et al., 2003; Msuya y Neori, 2008) reseñan como parámetros de calidad, el alto contenido en proteínas y bajo en cenizas, puesto que la biomasa va destinada como alimento, como nuestro fin es obtener compuestos destinados a la industria, hemos hecho hincapié en los pigmentos además de los lípidos como parámetros a valorar. El porcentaje de lípidos observados en los diferentes tratamientos no fueron elevados, no superaron en ningún caso el 3% en peso seco, este hecho es comparable a lo descrito por otros autores (Al-Hassan et al., 1991; Gordillo et al., 2001; Rupérez y Saura-Calixto, 2001; Khotimchenko y Yakovleva, 2004; Narayan et al., 2005; Khotimchenko, 2005; Colombo et al., 2006; Khotimchenko, 2006; de Oliveira et al., 2009; Cruz-Suárez et al., 2010; Saito et al., 2010) donde confirman el bajo nivel de lípidos presentes en las macroalgas. Los lípidos totales se incrementan durante las dos semanas que pasan sin nutrientes aunque este incremento sea pequeño, del orden de 1-2 % en peso seco, concuerda con los datos de Gordillo et al. (2001) donde muestra las consecuencias de la carencia de nitrógeno en diferentes concentraciones de carbono (CO2). La diferencia entre los controles y las réplicas era la esperada puesto que la bibliografía (Gordillo et al., 2001; Msuya y Neori, 2002) indica la variación de las proporciones en los componentes (proteínas, cenizas, carbohidratos, lípidos, etc.) cuando se cultivan en aguas con nutrientes. La disminución de los lípidos totales, tras cuatro semanas con nutrientes, se debió posiblemente a un cambio de relación entre los componentes celulares. Dentro de los lípidos neutros de ambas especies, nos interesan los triglicéridos presentes (fig. 9 y 10) cuya dinámica es muy parecida: aumento en su proporción relativa, respecto los lípidos totales, conforme pasan las semanas sin nutrientes y disminución cuando se añaden nutrientes (Yamaberi et al., 1998; Gordillo et al., 2001). Además, este comportamiento coincide con las muestras del proyecto Bifaro aunque las muestras pertenecientes a U. rigida mostraron unas proporciones muy superiores a las obtenidas en este experimento, esta discrepancia podría deberse a la época del año (invierno) de su cultivo, como indican otros autores (Al-Hasan et al., 1991; Khotimchenko y Yakovleva, 2004; Kostetsky et al., 2004; Guschina y Harwood, 2006) los cambios ambientales (irradiación, temperatura, minerales…) provocan una adaptación que repercute en los lípidos, o a la edad de los talos (Khotimchenko, 2006). 51 La comparación con los resultados obtenidos por otros autores (Chisti, 2007; Hu et al., 2008; Mata et al., 2010a) que trabajan con microalgas, aunque es difícil porque trabajan con biorreactores además de con raceways, nos aportan una perspectiva en la viabilidad de la obtención de los lípidos neutros para su uso en la fabricación de biodiesel (Mata et al., 2010a). Aunque el rendimiento por superficie es más bajo en las microalgas, cuya producción es aproximadamente de 127 t PS ha-1 año-1, en raceways (Chisti, 2007), esto se compensa ampliamente por la acumulación de lípidos neutros, hablamos del 20 al 50% en peso seco en determinadas condiciones (Hu et al. 2008), cuya presencia en triglicéridos alcanza hasta el 80% (Chisti, 2007), por lo cual obtendríamos con los mejores resultados una producción de triglicéridos de 50,8 t PS ha-1 año-1. 52 Conclusiones 1.- Las especies de macroalgas Hydropuntia cornea y Ulva rigida mostraron una alta capacidad de crecimiento en el sistema desarrollado y bajo las condiciones ensayadas alcanzando máximos de producción superiores a 30 g PS m-2 d-1, en condiciones de radiación natural y aporte continuado de nutrientes en el caso de H. cornea y sin aporte de nutrientes, tanto en condiciones interiores como exteriores, en el caso de U. rigida. Este último hecho estuvo relacionado con los procesos de esporulación acusados en los tanques con aporte de nutrientes, durante el periodo de luna llena coincidente con el periodo experimental, que produjeron la pérdida parcial de biomasa en los tanques indicados. 2.- Bajo las condiciones de aporte de nutrientes, la capacidad de biofiltración de N-amonio de ambas especies alcanzó valores medios de NUE superiores al 50% llegándose a determinar valores del 100% en algunos de los análisis realizados. Para Hydropuntia cornea se obtuvieron valores medios del 84%, y velocidades de asimilación NUR de 18.1 mmoles N-NH4+ m-2 h-1, en condiciones de radiación natural, mientras que para Ulva rigida los valores medios de NUE alcanzaron el 94%, y una NUR de 15.4 mmoles N-NH4+ m-2 h-1, en condiciones interiores. Estos resultados confirman que, en las condiciones ensayadas, ambas especies soportan tasas de biofiltración interesantes para su utilización eficiente en diferentes tipos de sistemas integrados. 3.- Bajo las condiciones ensayadas, Hydropuntia cornea mostró la respuesta esperada en cuanto a la dinámica de los pigmentos fotosintéticos, acumulando clorofilas y ficobiliproteínas en condiciones de aporte de nutrientes y utilizándolos para mantener su actividad en condiciones de limitación. 53 4.- La capacidad fisiológica, determinada por las medidas in vivo de la fluorescencia de la clorofila, se mantuvo estable durante el periodo experimental disminuyendo en los tanques control, sin aporte de nutrientes y en condiciones de radiación natural, a partir de la semana 4 de cultivo, e indicando que ambas especies mantienen su capacidad fotosintética intacta durante largos periodos de limitación de nutrientes y bajo altos niveles de radiación. 5.- A pesar de mostrar niveles no superiores al 3% en la concentración de lípidos totales, lo que ya ha sido descrito como una generalidad en macroalgas, se observaron pequeñas variaciones tanto en el contenido en lípidos como en el de triglicéridos en algunas de las condiciones ensayadas. El porcentaje de lípidos disminuyó en los tanques control, tanto dentro como fuera del invernadero mientras el contenido en triglicéridos, respecto a los lípidos totales, fue superior en las muestras control, sin aporte de nutrientes, tanto en los tanques exteriores como interiores, independientemente de la dinámica de nutrientes establecida. 6.- Los rendimientos teóricos en la producción de lípidos y triglicéridos del sistema ensayado, considerando esta biomasa como fuente potencial de biodiesel y barajando las condiciones más favorables, fueron superiores para Hydropuntia cornea que alcanzó valores de 6.4 t lípidos ha-1 año-1 y 2.4 t TG ha-1 año-1 frente a los 4.3 t lípidos ha-1 año-1 y 2.1 t TG ha-1 año-1, calculados para Ulva rigida. 54 Bibliografía Al-Hassan, R.H., Hantash, F.M., Radwan S.S., 1991. Enriching marine macroalgae with eicosatetraenoic (arachidonic) and eicosapentaenoic acids by chilling. Appl. Microbiol. Biotechnol. 35: 530-535. 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A: Tanques cpt de 90 l situados en el interior del invernadero; B: Tanques en el exterior; C y D: Detalles de Hydropuntia cornea en los tanques de cultivo. A B C D