Uso de L-Carnitina para proteger a los peces de la intoxicación por cilindrospermopsina

ES 2 460 391 B2 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 21 Número de publicación: 2 460 391 Número de solicitud: 201201151 51 Int. CI.: A61K 31/205 (2006.01) A23K 1/18 (2006.01) A23K 1/16 (2006.01) (2006.01) A61P 39/00 12 PATENTE DE INVENCIÓN CON EXAMEN PREVIO B2 54 Título: Uso de L-Carnitina para proteger a los peces de la intoxicación por cilindrospermopsina 73 Titular/es: UNIVERSIDAD DE SEVILLA (50.0%) OTRI-Pabellón de Brasil, Paseo de las Delicias s/n 41013 Sevilla (Sevilla) ES y UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA (50.0%) 72 Inventor/es: CAMEAN FERNÁNDEZ, Ana María; VÁZQUEZ CUETO, Carmen María; GUZMÁN GUILLÉN, Remedios; PRIETO ORTEGA, Ana Isabel; MORENO NAVARRO, Isabel; JOS GALLEGO, Ángeles Mencia; PICHARDO SÁNCHEZ, Silvia; PUERTO RODRÍGUEZ, María; GUTIÉRREZ PRAENA, Daniel; MOYANO SALVAGO, M. Rosario y BLANCO RODRÍGUEZ, Alfonso 74 Agente/Representante: GONZÁLEZ CARVAJAL, Ramón 22 Fecha de presentación: 08.11.2012 43 Fecha de publicación de la solicitud: 13.05.2014 Fecha de la concesión: 29.09.2014 45 Fecha de publicación de la concesión: 06.10.2014 57 Resumen: La presente invención se refiere al uso de una composición que comprende L-Camitina (LC) para el tratamiento, prevención y/o recuperación de efectos tóxicos en peces expuestos a Cilindrospermopsina (CYN). También se refiere al uso de la citada composición en la recuperación de las alteraciones histopatológicas producidas en los tejidos de la lista que comprende hígado, riñón, corazón, branquias y/o tracto gastrointestinal. Además, dicha composición se utiliza para la fabricación de un alimento funcional, un complemento vitamínico, o un complemento nutricional. Se puede realizar consulta prevista por el art. 40.2.8 LP. Aviso: Uso de L-Carnitina para proteger a los peces de la intoxicación por Cilindrospermopsina La presente invención se refiere al uso de una composición que comprende L- 5 Carnitina (LC) para el tratamiento, prevención y/o recuperación de efectos tóxicos en peces expuestos a Cilindrospermopsina (CYN). También se refiere al uso de la citada composición en la recuperación de las alteraciones histopatológicas producidas en los tejidos de la lista que comprende hígado, riñón, corazón, branquias y/o tracto gastrointestinal. Además, dicha composición 10 se utiliza para la fabricación de un alimento funcional, un complemento vitamínico, o un complemento nutricional. ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR 15 La L-carnitina (L-3-hidroxi-4-N,N,N-trimetilaminobutirato) (LC) es un derivado aminoacídico sintetizado a partir de los aminoácidos esenciales lisina y metionina con la ayuda de la vitamina C y otros compuestos secundarios producidos por el cuerpo (Harpaz S, Aquaculture 249: 3-21, 2005) que está presente en la mayoría de las especies animales y en muchos 20 25 microorganismos y plantas. La LC se encuentra ampliamente distribuido por todo el organismo, aunque se presenta en mayores cantidades en el corazón yen el músculo esquelético (Rebouche C. J. FASEB J. 6: 3379-3386,1992). La función principal de este derivado aminoacídico consiste en actuar como cofactor en el transporte de ácidos grasos al interior de la mitocondria, donde se produce la ~-oxidación de los mismos, para la obtención de energía metabólica (Bremer J. Physiol. Rev. 63: 1420-1480, 1983), desempeñando un papel crucial en el metabolismo de los ácidos grasos. 30 El 75% de la cantidad de LC requerida por el organismo proviene de la dieta. 35 El resto se sintetiza endógenamente en el hígado y en menor cantidad en el riñón y cerebro, a partir de los aminoácidos lisina y metionina, como indicamos con anterioridad (Tanphaichitr V. y Broquist H. P. J. Biol. Chem. 248: 2176-2181,1973). ES 2 460 391 A1  2 ES 2 460 391 B2 DESCRIPCIÓN Aunque no se conocen con exactitud los mecanismos de acción de la LC, su uso beneficioso en algunas patologías cardiovasculares (Ferrari R et al., Ann. N.Y. Acad. Sci 033: 79-91, 2004; Kendler 8.S. J. Cardiovasc. Nurs. 21: 9-16, 2006) se cree debido a sus propiedades antioxidantes y 5 antiinflamatorias (Savica V. et al., Semin. Nephrol. 24: 464-468, 2004; Laviano A. et al., Curro Opino Clin. Nutr. Metab. Care 9: 442-448, 2006). 10 Son múltiples los usos descritos para el uso de la LC sola o en combinación con otras sustancias. Así, distintos trabajos y patentes de investigación la describen para el tratamiento de astenias y anorexias (FR 4465), en combinación con citrato de lisina tribásico y de vitamina C; como complemento nutricional en sujetos convalecientes, personas de edad, deportistas, mujeres embarazadas o cualquier persona asténica que presente perturbaciones funcionales musculares (ES 2 043 062); 15 alteraciones cardiacas asociada a la hipertensión arterial (P200901543); trastornos cerebrales centrales y periféricos, cardiacos, vasculopáticos, y trastornos del aprendizaje o relacionados con la edad, en combinación con el coenzima Q10 (ES 2 269355 T3); prevención de disfunciones hepáticas y biliares frente a lesiones inducidas por agentes hepatotóxicos exógenos y 20 25 endógenos por su intenso efecto antioxidante y su eficaz mejora de la circulación periférica y función cardiaca, en combinación con un extracto de Silybum marianum (ES 2 225 576 T3); prevención de la fibrosis renal (P201100709) Y tratamiento de todas las formas de nefropatías mediante una composición de L-acetil carnitina y L-propionil carnitina (ES 2 254 206 T3); prevención ó tratamiento de alteraciones de órganos que realizan función metabólica intensa (hígado, riñón, sistema cardiovascular y cerebro) como hepatosis, nefropatías y lesiones cardiovasculares o cerebrales provocadas por sustancias tóxicas, en combinación con glutation (ES 2 232 443 T3); la efectividad terapéutica de acetil L-carnitina en neuropatías 30 periféricas (ES 2 039 262), Y en el tratamiento de pacientes aquejados de metabolismo cerebral deficiente tal y como se produce en la demencia senil y pre-senil y enfermedad de Alzheimer (4.346.107), promoción de la regeneración del tejido nervioso, inhibición de la degeneración neuronal y trastornos cerebrales producidos por el envejecimiento y el uso de fármacos 35 neurotóxicos, para mejorar el proceso de aprendizaje y memoria y para el tratamiento del coma y shock (ES 2 078 019 T3; ES 2 043 608; ES 2 207 ES 2 460 391 A1  3 ES 2 460 391 B2 287 T3); trastornos del aprendizaje en niños que sufren de déficit de atenciónlhiperactividad (ADHD), en combinación con la sal interna de acetil- L-carnitina y una huperzina (ES 2 237 591 T3). Además, por su mecanismo de acción, es útil para trastornos del metabolismo de los lípidos y formas 5 alérgicas y para la activación de las defensas inmunes, en combinación con polisacáridos (ES 2 222 388 T3); propionil L-carnitina es útil para la prevención y/o tratamiento de trastornos debidos a un metabolismo lipídico anormal, tales como la hipercolesterolemia, aterosclerosis, hiperlipidemias y obesidad, en combinación con quitosana (ES 2 197 890 T3). Ha demostrado 10 15 20 25 utilidad frente a la citotoxicidad inducida por agentes inmunosupresores, en combinación con glicina (ES 2 269 356 T3); enfermedades oculares como el glaucoma (ES 2 040 106); isovaleril L-carnitina ha probado ser útil para la prevención y curación de osteoporosis (ES 2 247 005 T3); enfermedades de la piel como ictiosis, psoriasis y dermatosis inducidas por una queratinización defectuosa como caspa, acné e hiperkeratosis palmar y plantar, en combinación con ácido glicólico (ES 2 088 655 T3); infecciones micóticas producidas por Gryptococcus neoformans, Gandida albicans y Aspergillus sp. (ES 2 101 998 T3) Y son útiles para el tratamiento de infecciones intestinales, gastritis tipo B y úlceras duodenales humanas producidas por Gampylobacter sp. y Helicobacter sp. en combinación con alcoholes alifáticos de cadena larga (ES 2 093 395 T3). Concretamente en peces, la LC y derivados se ha empleado con diferentes propósitos: promotor del crecimiento, prestando protección frente a concentraciones tóxicas de amoniaco y xenobióticos, aliviar el estrés inducido por temperaturas extremas,aumentando la reproducción etc., que han sido revisados en la literatura científica (Harpaz S, Aquaculture 249: 3- 21, 2005), con resultados a veces contradictorios. Se ha demostrado que L- carnitina, como aditivo alimentario, mejora el crecimiento (Becker et al., Aquaculture 174:313-332, 1999; Yang et al., Aquaculture 342:48-55, 2012), 30 la función reproductora (CH 19950003453 19951207), el desarrolllo y la supervivencia de peces y almejas (JP19800024343 19800227) y la resistencia al estrés generado por frío en cíclidos (Harpaz et al., J. Therm. Biol. 24:57-62, 1999; CH19980000400 19980219). Además se ha demostrado que ejerce efecto protector frente a la penetración de 35 xenobióticos aniónicos en guppies (Schreiber et al., Comp. Biochem. Physiol. 117C:99-102, 1997). No existiendo, hasta el momento, nada ES 2 460 391 A1  4 ES 2 460 391 B2 5 10 15 20 25 publicado de LC con respecto a Cilindrospermopsina (CYN) objeto de esta invención y por tanto, siendo novedoso aportar el uso de la LC con respecto al tratamiento, prevención y/o recuperación de efectos inducidos por CYN en peces. Por otro lado, la CYN es una toxina producida por cianobacterias tóxicas presentes en aguas superficiales, pertenecientes al menos a seis géneros, siendo las especies identificadas en los momentos actuales Cylindrospermopsis raciborskii, Anabaena bergii, Aphanizomenon ovalisporun, Aphanizomenon flos-aquae, Umezakia natans, y Raphidiopsis curvata, entre otras. CYN se aisló por primer vez de un cultivo de Cylindrospermopsis raciborskii, obtenido de los reservorios de agua de bebida que surtían a la población de Palm Island, Queensland, Australia (Ohtani I et al., J. Am. Chem. Soco 144:7941-7942, 1992), Se ha comprobado su acumulación en peces y crustáceos, afectando a la calidad y seguridad de este tipo de alimentos y suponiendo un riesgo potencial para el consumidor. En comparación con los mamíferos, los estudios sobre efectos tóxicos de CYN en peces son muy escasos, destacando que puede afectar no sólo al hígado sino también al riñón, corazón, branquias, y tracto gastrointestinal. Las cianobacterias constituyen parte de la dieta de diversos ciprinídos y cíclidos, como es el caso, por ejemplo, de las Tilapias (Orechromis, sp.). La Tilapia (Oreochromis sp.) es uno de los pescados que más rápidamente se ha introducido en acuicultura, por la facilidad que presenta su manejo, gran capacidad de adaptación a condiciones adversas y fácil reproducción; sus distintas variedades son filtradoras y consumidoras de cianobacterias y en Europa se está despertando un gran interés por su cultivo. Como mecanismo de acción tóxica más aceptado, la CYN está considerada 30 un citotoxina general que bloquea la síntesis de proteínas en células eucariotas de mamíferos y plantas (Terao K. et al" Toxicon 32:833-843, 1994; Runnegar M.T. et al. Biochem. Pharmacol. 49:219-225, 1995) y disminuye los contenidos de Glutation (GSH). La disminución de GSH no parece conllevar a un incremento del estrés oxidativo en la célula, 35 sugiriéndose que no es un mecanismo primario de la toxicidad de CYN. Sin embargo, recientemente, se ha comprobado la participación directa del ES 2 460 391 A1  5 ES 2 460 391 B2 estr.és oxidativo en la patogénesis de CYN en peces (Gutierrez-Praena D. et al., Aquat. Tox. 105:100-106,2011; Puerto M. et al., Ecotoxicology 20: 479- 490, 2011), detectándose un aumento en la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), lipoperoxidación (LPO), oxidación de proteínas 5 y de ADN así como cambios en la actividad de diversas enzimas antioxidantes en peces. Los escasos estudios toxicológicos realizados hasta la actualidad han conducido al establecimiento de una Ingesta Diaria Tolerable (IDT) provisional de 0,03 ¡.Jg/Kg/día de CYN, y la propuesta de un valor guía provisional de 1 ¡.Jg/L de CYN en aguas de bebida. 10 15 20 25 Actualmente no existe un tratamiento antidótico específico en casos de intoxicación por CYN y sus epímeros procedentes de cianobacterias. Hasta la fecha, tan sólo el uso de la N-acetilcisteína ha demostrado actividad protectora en peces frente a la intoxicación por CYN (Gutierrez-Praena D. et al., Aquat. Toxicol. 31: 1-8,2012; P201101162, Cameán FernándezA. etal., 2011). Teniendo en cuenta la ubicuidad de esta toxina, se hace necesario recuperar peces que presenten alteraciones histopatológicas con diferentes niveles de afección, que pueden impedir el ciclo de vida normal de las especies afectadas. EXPLICACiÓN DE LA INVENCiÓN La presente invención se refiere al uso de una composición que comprende LC para el tratamiento, prevención y/o recuperación de efectos tóxicos en peces expuestos a CYN. En tilapias (Oreochromis sp.) expuestas a dosis únicas y repetidas de CYN se inducen estrés oxidativo y alteraciones patológicas. En concreto, se ha comprobado aumento de los niveles de peroxidación lipídica (LPO) y de 30 oxidación de ADN, disminución de los niveles de GSH, en diferentes órganos (hígado, riñón) de peces expuestos a 400 ¡.Jg CYN/kg pez de forma aguda por vía oral. Así mismo, CYN induce múltiples alteraciones histopatológicas en órganos diversos: hígado, riñón, tracto gastrointestinal, corazón y branquias. 35 ES 2 460 391 A1  6 ES 2 460 391 B2 5 10 15 La LC administrada en esta invención se muestra efectiva manteniendo el estado de salud del pez, previniendo daños causados por la toxina y/o mejorando los efectos tóxicos inducidos por CYN en diversos órganos de tilapias intoxicadas. Además, el uso de LC como aditivo alimentario no sólo mejora los niveles de GSH en hígado y riñón, sino que por su propia actividad antioxidante es capaz de disminuir la lipoperoxidación (LPO) (hígado, riñón), la oxidación de ADN (hígado, riñón) inducida por CYN, y prevenir y recuperar las lesiones histopatológicas inducidas en múltiples órganos como hígado, riñón, corazón, tracto gastrointestinal y branquias. En este sentido, un primer aspecto de la presente invención se refiere al uso de una composición que comprende LC para la elaboración de un medicamento útil en el tratamiento, prevención y/o recuperación de efectos tóxicos en peces expuestos a CYN. La composición de la presente invención comprende, al menos, LC. El medicamento está compuesto, al menos, por la composición anterior. La LC, sus 20 sales, derivados farmacéuticamente aceptables o sus profármacos, se formulan en una composición farmacéutica apropiada, en la cantidad terapéuticamente efectiva, junto con uno o más vehículos, adyuvantes o excipientes farmacéuticamente aceptables. El medicamento se emplea para el tratamiento de los efectos tóxicos en peces expuestos a CYN. 25 Por un "derivado farmacéuticamente aceptable" se entiende cualquier sal, farmacéuticamente aceptable o cualquier otro compuesto que después de su administración, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) LC. 30 Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en la elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye sólidos o líquidos, disolventes, tensioactivos, etc. 35 El término "tratamiento" tal como se entiende en la presente invención supone combatir los efectos tóxicos para estabilizar el estado de toxicidad de los ES 2 460 391 A1  7 ES 2 460 391 B2 individuos. El medicamento se emplea también para la prevención de los efectos tóxicos ocasionados a los peces expuestos a CYN. El término "prevención" tal como se entiende en la presente invención consiste en evitar la aparición de efectos tóxicos en peces expuestos a CYN. En este caso, previamente a la 5 intoxicación por CYN, los peces están protegidos por un aumento de las defensas antioxidantes producido por la acción de la LC. El medicamento también se emplea para la recuperación de los efectos tóxicos ocasionados en peces expuestos a CYN. 10 15 20 25 El término "efectos tóxicos" tal como se entiende en la presente invención hace referencia a la consecuencia derivada de la exposición del pez a la CYN, es decir, la aparición de diversos efectos adversos, como por ejemplo, un daño celular que ocasiona un daño en los tejidos biológicos, lo que a su vez puede provocar un cambio en las funciones fisiológicas y en el metabolismo celular. La CYN es una toxina de naturaleza alcaloide, en cuya estructura interviene un grupo tricíclico guanidinio unido a hidroximetiluracilo. Es producida por al menos seis géneros de cianobacterias, que se encuentran ampliamente distribuida en aguas tropicales y subtropicales. Pueden existir dos posibles epímeros de forma natural, cilindrospermopsina (CYN) y 7 -epicilindrospermopsina, ambos tóxicos; la completa pérdida del grupo uracilo elimina la toxicidad de CYN. En reservas naturales de agua se ha descrito otra variante, la 7 -desoxicilindrospermopsina, cuya toxicidad apenas está establecida, siendo menos tóxica en ratón que CYN. Un segundo aspecto de la presente invención es el uso de una composición que comprende L-Carnitina para la elaboración de un medicamento útil en la recuperación de efectos tóxicos en peces expuestos a CYN. El término "recuperación" hace referencia a la desaparición de los efectos tóxicos causados por la intoxicación con CYN. Esta recuperación supone la reversión total de los 30 daños causados en los tejidos del pez, recuperando de esta forma las funciones normales de los órganos afectados. En una realización preferida de la presente invención, los efectos tóxicos son alteraciones histopatológicas. El término "alteraciones histopatológicas" tal como 35 se entiende en la presente invención son daños producidos en los tejidos biológicos del pez. Estos daños son detectados por medio del análisis a nivel ES 2 460 391 A1  8 ES 2 460 391 B2 microscópico de las estructuras patológicas de las diferentes muestras obtenidas, sin excluir otras técnicas de detección. Una realización aún más preferida de la invención, es el uso donde las 5 alteraciones histopatológicas son producidas en al menos uno de los tejidos de la lista que comprende hígado, riñón, corazón, branquias o tracto gastrointestinal. Tal como se ha mencionado anteriormente, la CYN puede acumularse en el tejido hepático y también puede llegar a otros órganos utilizando la sangre como medio de dispersión, de esta forma, la toxina puede 10 causar efectos tóxicos y/o alteraciones histopatológicas en los citados órganos. La recuperación de los tejidos afectados por las alteraciones histopatológicas es un aspecto destacable de la presente invención ya que puede suponer la curación de los peces cultivados, peces seleccionados por diversas características para la cría, peces de especies en peligro de extinción o 15 cualquier otro tipo de pez que presente alteraciones histopatológicas en un 20 25 grado reversible. En otra realización más preferida de la presente invención, la LC se administra en una cantidad diaria de entre 400 y 880 mg por Kg de peso del pez. Esta administración se lleva a cabo durante al menos veintiún días. Preferiblemente la cantidad diaria incorporada a los peces es a partir de 400 mg por Kg de peso. Esta composición, se puede administrar de distintas formas, entre ellas, pero sin limitarse, intraperitonealmente, oralmente, bucalmente, intramuscularmente o de forma subcutánea. Más preferiblemente se administra de forma oral o intraperitoneal. En otra realización más preferida la composición se presenta en una forma adaptada a la administración oral o intraperitoneal. 30 Preferiblemente los peces intoxicados están expuestos a más de 400 IJg CYN/ kg de pez por vía oral en exposición única (intoxicación aguda). Otra realización preferida de la presente invención, comprende el uso de la composlclon anteriormente descrita que además incluye excipientes 35 farmacológicamente aceptables. ES 2 460 391 A1  9 ES 2 460 391 B2 sustancias de degradación de la peroxidación de los Iípidos que reaccionan con el ácido tiobarbitúrico; la oxidación de ADN mediante la determinación de los sitios apurínicosl apirimidínicos por cada 100.000 pares de bases y se determinó además el cociente glutatión reducido/glutatión oxidado 5 (GSH/GSSG) en hígado y riñón. Los estudios histológicos por microscopia óptica y electrónica en los distintos órganos se llevaron a cabo según Atencio et al. (Toxicol. Pathol. 36:449-458, 2008), incluyendo en el caso de las branquias microscopia óptica y electrónica de barrido (SEM). 10 15 20 25 30 Para los estudios de significación estadística entre grupos, se empleó el análisis de la varianza (ANOVA) y posteriormente el ensayo de Tukey, con una significación estadística p<0,05. Los resultados más significativos fueron los siguientes: 1) En la FIG. 1 se observa como la toxina CYN (procedente de células liofilizadas de un cultivo de Aphanizomenon ovalisporum o de estándar puro) incrementa la lipoperoxidación (LPO) en hígado (2,1 veces y 1,7 respectivamente), yen riñón (1,4 veces y 1,5 respectivamente) frente al control, y los efectos protectores de LC se demuestran con las dos dosis ensayadas. 2) En la FIG. 2 se observa como CYN procedente de células liofilizadas de un cultivo de Aphanizomenon ovalisporum aumenta la oxidación de ADN en hígado y riñon (1,3 veces y 1,4 respectivamente) en relación al control, y los efectos protectores de LC se demuestran con las dos dosis ensayadas. 3) La FIG. 3 muestra la disminución de los cocientes GSH/GSSG en hígado y riñón de los peces intoxicados con CYN, y la aplicación de ambas dosis de LC mejoró este parámetro. EJEMPLO 2. LC mejoró las alteraciones histopatológicas inducidas por CYN en hígado. El estudio histopatológico del hígado de los peces pertenecientes a los lotes tratados con CYN puso en evidencia un proceso degenerativo que consistió en una desorganización del parénquima hepático con presencia de glucógeno en el citoplasma del hepatocito y ciertas gotas de grasa (FIG. 4 G, H, 1, J), frente a 35 una ausencia de lesiones del grupo control (FIG. 4 A, B) caracterizada por ES 2 460 391 A1  16 ES 2 460 391 B2 cordones hepáticos normales, con hepatocitos con una morfología poliédrica normal. En los dos lotes de peces tratados exclusivamente con LC se observó que, con 5 ambas dosis (400 y 880 mg LC/Kg pez/día) no existían lesiones hepáticas y presentan una morfología aparentemente normal (FIG. 4 C, D, E, F). En los lotes de peces a los que junto a la toxina CYN se les administró 400 mg LC/kg pez/día presentan un parénquima con una morfología aparentemente normal con ausencia de grasa y glucógeno granular en el caso de la CYN procedente 10 de liofilizado (FIG. 4 K, L) Y un cierto contenido de glucógeno pero sin llegar a ser un proceso patológico en el caso de CYN pura (FIG. 4 M, N). El estudio de los peces del lote a los que junto con CYN (procedente de liofilizado o pura) se les administró una dosis de 880 mg LC/Kg pez/día mostró 15 un parénquima hepático aparentemente normal con recuperación total de las lesiones provocadas por la toxina, tanto al microscopio óptico, como al electrónico (FIG. 4 Ñ, 0, P, Q). A, B: Hígado de los peces control. A. Cordones hepáticos normales, 20 hepatocito con una morfología aparentemente normal. B. Detalle de hepatocito aparentemente normal, con organoides citoplasmáticos, retículos y mitocondrias. 25 C, D: Tilapias tratadas con LC (400 IJg/kg pez/día). C. Parénquima con una morfología aparentemente normal, con los hepatocitos dispuestos en cordones y zona pancreática aparentemente normal. D. Detalle de hepatocito aparentemente normal con organoides citoplasmáticos y ausencia de grasa y glucógeno granular. E, F: Tilapias tratadas con LC (880 mg LC/Kg pez/día). E. Parénquima con una morfología aparentemente normal, con los hepatocitos dispuestos en 30 cordones y zona pancreática aparentemente normal. F. Detalle de hepatocito aparentemente normal con organoides cito plasmáticos y ausencia de grasa y glucógeno granular. G, H: Hígado de tilapias expuestas a CYN procedente de liofilizado (400 IJg CYN/Kg pez). G. Parénquima hepático desorganizado, hepatocitos con 35 presencia de glucógeno (círculos). H. El hepatocito presenta gran contenido de glucógeno en el citoplasma (círculo) y gotas lipídicas (flecha). ES 2 460 391 A1  17 ES 2 460 391 B2 1, J: Hígado de peces expuestos a CYN pura (400 I-Ig LC/Kg pez). l. Parénquima hepático desorganizado, hepatocitos con presencia glucógeno (circulo) y de vesículas de grasa (flecha). J. El hepatocito presenta con un citoplasma con escasos organoides y el resto del citoplasma repleto de 5 grasa (circulo) y cierta presencia de glucógeno granular (flecha). 10 15 K, L: Hígado de tilapias expuestas a CYN procedente de liofilizado y tratadas con LC (400 mg LC/Kg pez/día). K. Parénquima con una morfología aparentemente normal, con los hepatocitos dispuestos en cordones aparentemente normales. L. Detalle de hepatocito aparentemente normal con organoides citoplasmáticos y ausencia de grasa y glucógeno granular. M, N: Hígado de peces expuestos a CYN pura y tratadas con LC (400 mg LC/Kg pez/día). M. Cordones hepáticos normales, con cierta morfología poliédrica con núcleo central y citoplasma claro con escaso contenido en glucógeno (círculo). N. Detalle de hepatocito con cierto contenido en glucógeno (círculo). Ñ, O: Hígado de tilapias expuestas a CYN procedente de liofilizado y tratadas con LC (880 mg LC/Kg pez/día). Ñ. Parénquima hepático aparentemente normal. O. Detalle de hepatocito aparentemente normal. P, Q: Hígado de peces expuestos a CYN pura y tratadas con LC (880 mg 20 LC/Kg pez/día). P. Cordones hepáticos normales, pero con cierta morfología poliédrica con núcleo central y citoplasma sin contenido de glucógeno. Q. Detalle de hepatocito aparentemente normal. 25 EJEMPLO 3. LC mejoró las alteraciones histopatológicas inducidas por CYN en riñón. Morfológicamente los riñones de los peces de los lotes tratados con CYN (procedente de liofilizado o pura) mostraron una glomerulopatía, observándose 30 al microscopio óptico una atrofia glomerular y dilatación de la capsula de Bowman y al microscopio electrónico se observa esta glomerulopatía con tumefacción e incluso pérdida de las microvellosidades de los túbulos contorneados proximales (FIG. 5 G, H, 1, J). Los riñones de los peces del lote control presentaron una estructura aparentemente normal (FIG. 5 A, B). 35 ES 2 460 391 A1  18 ES 2 460 391 B2 El estudio de los peces de los lotes tratados solamente con las dosis de LC (400 y 880 mg LC/Kg pez/día) no mostró ninguna lesión renal (FIG. 5 C, D, E, F). En los peces a los que se les administró CYN (procedente de liofilizado o pura) junto con 400 ó 880 mg LC/Kg pez/día se observó estructuralmente y 5 ultraestructuralmente una morfología del parénquima renal totalmente normal (FIG. 5 K, L, M, N, Ñ, O, P, Q). 10 15 20 25 A, B: Riñón de los peces control. C, D: Tilapias tratadas con LC (400 IJg/kg pez/día). C. Glomérulos y túbulos aparentemente normales. D. Glomérulo con podocito aparentemente normal. E, F: Tilapias tratadas con LC (880 mg LC/Kg pez/día). E. Glomérulos y túbulos aparentemente normales. F. Túbulo contorneado proximal aparentemente normal. G, H: Riñón de tilapias expuestas a CYN procedente de liofilizado (400 IJg CYN/Kg pez). G. Glomerulopatía y atrofia glomerular (circulo), tubulonefrosis y dilatación de la capsula de Bowman (flecha) y ligera tubulonefrosis (estrella). H. Microvellosidades de los túbulos contorneados proximales tumefactos y pérdidas de estas (circulo). 1, J: Riñón de peces expuestos a CYN pura (400 IJg LC/Kg pez). l. Glomerulopatía (circulo), atrofia glomerular (estrella), ditalación de la capsula de Bowman y tubulonefrosis (flecha). J. Tubulonefrosis de túbulos contorneados proximal con células engrosadas e hialinizadas (flechas). K, L: Riñón de tilapias expuestas a CYN procedente de liofilizado y tratadas con LC (400 mg LC/Kg pez/día). K. Glomérulos y túbulos aparentemente normales. L. Membrana basal aparentemente normal. M, N: Riñón de peces expuestos a CYN pura y tratadas con LC (400 mg LC/Kg pez/día). M. Glomérulos y túbulos aparentemente normales. N. Túbulo contorneado próximal aparentemente normal, con abundantes microvellosidades. 30 Ñ, O: Riñón de tilapias expuestas a CYN procedente de liofilizado y tratadas con LC (880 mg LC/Kg pez/día). Ñ. Glomérulos y túbulos aparentemente normales. O. Túbulo contorneado próximas aparentemente normal. P, Q: Riñón de peces expuestos a CYN pura y tratadas con LC (880 mg LC/Kg pez/día). P. Glomérulos y túbulos aparentemente normales. Q. Detalle 35 de túbulo contorneado distal aparentemente normal y con abundantes mitocondrias. ES 2 460 391 A1  19 ES 2 460 391 B2 5 10 15 20 EJEMPLO 4. LC mejoró las alteraciones histopatológicas inducidas por CYN en corazón. El estudio histopatológico realizado sobre peces tratados con CYN (procedente de liofilizado o pura) mostraron al microscopio óptico procesos de miofibrolisis, con pérdida de miofibrillas, presencia de edemas y hemorragias (FIG 6. G,I). Al microscopio electrónico se observa una pérdida de las miofibrillas (FIG. 6 H, J). El corazón de los peces del lote control presentó una estructura aparentemente normal (FIG. 6 A, B). Los peces tratados solo con LC (400 y 880 mg LC/Kg pez/día) presentan una morfología de las fibras cardiacas similares a las del grupo control (FIG. 6 C, D, E, F)., No se observaron lesiones en los tratados con ambas dosis de LC (400 ó 880 mg LC/Kg pez/día) y expuestos a CYN (FIG. 6 K, L, M, N, Ñ, O, P, Q). A, B: Corazón de los peces control. C, D: Tilapias tratadas con LC (400 IJg/kg pez/día). C. Fibras musculares aparentemente normales. D. Detalle de miofibrillas aparentemente normales, con bandas perfectamente dispuestas y normales. E, F: Tilapias tratadas con LC (880 mg LC/Kg pez/día). E. Fibras musculares aparentemente normales. F. Detalle de miofibrillas con material contráctil 25 intacto, con bandas perfectamente dispuestas y normales G, H: Corazón de tilapias expuestas a CYN procedente de liofilizado (400 IJg CYN/Kg pez). G. Miofibrolisis, pérdida de miofibrillas (flecha), ciertos edemas (estrella) y hemorragias (círculo). H. Pérdida y desintegración de las miofibrillas (circulo) 30 1, J: Corazón de peces expuestos a CYN pura (400 IJg LC/Kg pez). l. Miofibrolisis con pérdida de miofibrillas (círculos), abundantes edemas (estrella) y ciertas hemorragias (flecha). J. Pérdida y desintegración de las miofibrillas (circulo). K, L: Corazón de tilapias expuestas a CYN procedente de liofilizado y 35 tratadas con LC (400 mg LC/Kg pez/día). K Fibras musculares ES 2 460 391 A1  20 ES 2 460 391 B2 aparentemente normales pero ciertas hemorragias (círculo). L. Detalle de miofibrillas normales sin pérdida de material contráctil. M, N: Corazón de peces expuestos a CYN pura y tratadas con LC (400 mg LC/Kg pez/día). M. Fibras musculares aparentemente normales. N. Detalle 5 de miofibrillas normales sin pérdida de material contráctil. Ñ, O: Corazón de tilapias expuestas a CYN procedente de liofilizado y tratadas con LC (880 mg LC/Kg pez/día). Ñ Fibras musculares aparentemente normales. O. Detalle de miofibrillas aparentemente normales. P, Q: Corazón de peces expuestos a CYN pura y tratadas con LC (880 mg 10 LC/Kg pez/día). P. Fibras musculares aparentemente normales. Q. Detalle de miofibrillas aparentemente normales. EJEMPLO 5. LC mejoró las alteraciones histopatológicas inducidas por 15 CYN en intestino. A nivel de intestino en los peces tratados con CYN (procedente de liofilizado o pura) se observaron procesos de enteritis con necrosis de enterocitos al microscopio óptico y pérdida manifiesta de microvellosidades al microscopio 20 electrónico (FIG. 7 G, H, 1, J),en comparación con el grupo control (FIG. 7 A, B). Tras la administración de las dos dosis de LC (400 y 880 mg LC/Kg pez/día) solo se observó una actividad manifiesta de las células caliciformes, sin interés patológico (FIG. 7 C, D, E, F), al igual que en los grupos de peces a los que se les administró LC junto con CYN (FIG. 7 K, L, M, N, Ñ, 0, P, Q), mostrando así 25 ambas dosis de LC un efecto protector frente a la toxina. A, B: Intestino de los peces control. A. Vellosidades aparentemente normales con enterocitos aparentemente normales. B. Enterocitos con abundantes microvellosidades aparentemente normales (círculo). 30 C, D: Tilapias tratadas con LC (400 ~g/kg pez/día). C. Vellosidades aparentemente normales con enterocitos aparentemente normales y abundantes células caliciformes (flecha). D. Enterocitos con abundantes células caliciformes aparentemente normales (flechas). E, F: Tilapias tratadas con LC (880 mg LC/Kg pez/día). E. Vellosidades 35 aparentemente normales con enterocitos aparentemente normales y ES 2 460 391 A1  21 ES 2 460 391 B2 abundantes células caliciformes (flecha). F. Enterocitos con abundantes microvellosidades (circulo). G, H: Intestino de tilapias expuestas a CYN procedente de liofilizado (400 I-.Ig CYN/Kg pez). G. Detalle de vellosidades intestinales con enterocitos 5 necrosados (circulo) H. Detalle de enterocito con pérdida parcial de las microvellosidades (circulo). 10 15 1, J: Intestino de peces expuestos a CYN pura (400 I-.Ig LC/Kg pez). l. Detalle de vellosidades intestinales con enterocitos necrosados (circulo) J. Detalle de enterocito con pérdida parcial de las microvellosidades (circulo). K, L: Intestino de tilapias expuestas a CYN procedente de liofilizado y tratadas con LC (400 mg LC/Kg pez/día). K. Vellosidades aparentemente normales con enterocitos aparentemente normales y abundantes células caliciformes (flecha). L. Enterocitos aparentemente normales con abundantes microvellosidades (circulo). M, N: Intestino de peces expuestos a CYN pura y tratadas con LC (400 mg LC/Kg pez/día). M. Vellosidades aparentemente normales con enterocitos aparentemente normales y abundantes células caliciformes (flecha). N. Enterocitos con abundantes microvellosidades (circulo). Ñ, O: Intestino de tilapias expuestas a CYN procedente de liofilizado y 20 tratadas con LC (880 mg LC/Kg pez/día). Ñ. Vellosidades aparentemente normales con enterocitos aparentemente normales y abundantes células caliciformes (flecha). O. Enterocitos aparentemente normales con abundantes microvellosidades (circulo). P, Q: Intestino de peces expuestas a CYN pura y tratadas con LC (880 mg 25 LC/Kg pez/día). P. Vellosidades aparentemente normales con enterocitos aparentemente normales y abundantes células caliciformes (flecha). Q. Enterocitos con abundantes microvellosidades (circulo). 30 EJEMPLO 6. LC mejoró las alteraciones histopatológicas inducidas por CYN en branquias. Al microscopio óptico las branquias de los peces tratados con CYN pura presentaron, a nivel de las laminillas" procesos de hiperemia y hemorragia (FIG. 35 8 1, J), siendo estas lesiones más manifiestas en los peces tratados con CYN procedente de liofilizado (FIG. 8 G, H). Al microscopio electrónico de barrido ES 2 460 391 A1  22 ES 2 460 391 B2 pueden observarse infiltrados inflamatorios, erosión y tumefacción de la superficie lamelar (FIG. 8 G, H, 1, J). Estas lesiones no fueron observadas en el lote control (FIG. 8 A, B), ni en los 5 peces tratados con LC (400 ó 880 mg LC/Kg pez/día) (FIG. 8 C, D, E, F), ni en los grupos de a los que se les administró LC junto con CYN (FIG. 8 K, L, M, N, Ñ, O, P, Q), que presentaron una morfología aparentemente normal. Se muestra así el efecto protector de ambas dosis de LC frente a CYN. 10 15 20 A, B: Branquias de los peces control. C,D: Tilapias tratadas con LC (400 ~g/kg pez/día). Estructura aparentemente normal. E,F: Tilapias tratadas con LC (880 mg LC/Kg pez/día). Estructura aparentemente normal. G, H: Branquias de tilapias expuestas a CYN procedente de liofilizado (400 ~g CYN/Kg pez). G. Detalle de filamento branquial con presencia procesos de hiperemia (flecha) y hemorragias en laminillas secundarias (circulo). H. Arco branquial con superficie erosionada y tumefacta (círculo). 1, J: Branquias de peces expuestos a CYN pura (400 ~g LC/Kg pez). l. Detalle de filamento branquial con hiperemia en laminillas secundarias (flecha) y hemorragias (círculo). J. Arco branquial con pérdida de continuidad, erosionado e infiltrado celular (circulo). K, L: Branquias de tilapias expuestas a CYN procedente de liofilizado y tratadas con LC (400 mg LC/Kg pez/día). K. Filamento branquial 25 aparentemente normal. L. Arco branquial aparentemente normal. M, N: Branquias de peces expuestos a CYN pura y tratadas con LC (400 mg LC/Kg pez/día). M. Filamento branquial aparentemente normal. N. Arco branquial aparentemente normal. Ñ, O: Branquias de tilapias expuestas a CYN procedente de liofilizado y 30 tratadas con LC (880 mg LC/Kg pez/día). Ñ. Filamento branquial aparentemente normal. O. Arco branquial aparentemente normal. 35 P, Q: Branquias de peces expuestos a CYN pura y tratadas con LC (880 mg LC/Kg pez/día). P. Filamento branquial aparentemente normal. Q. Arco branquial aparentemente normal. ES 2 460 391 A1  23 ES 2 460 391 B2 1. Uso de una composicion que comprende L-Carnitina para la elaboracion de un medicament° Otil en el tratanniento y/o prevencion de efectos toxicos en 5 peces expuestos a cilindrospermopsina. 10 2. Uso de una composicion que comprende L-Carnitina, segun reivindicacion 1, para la elaboracion de un medicamento Otil en la recuperacion de efectos toxicos en peces expuestos a cilindrospernmpsina. 3. Uso segOn cualquiera de las reivindicaciones 1 6 2, donde los efectos toxicos son alteraciones histopatolOgicas. 4. Uso segun la reivindicaciOn 3, donde las alteraciones histopatolOgicas son 15 producidas en al menos uno de los tejidos de la lista que comprende higado, corazon, branquias o tract° gastrointestinal. 20 5. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la L-Carnitina se administra en una cantidad diaria de entre 400 y 880 mg LC/Kg pez/dia. 6. Uso segUn la reivindicaciOn 5, donde la composiciOn se presenta en una forma adaptada a la administracion oral o intraperitoneal. 7. Uso segOn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la composicion 25 incluye excipientes farmacolOgicamente aceptables. 8. Uso segim cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la composicion comprende ademas otra sustancia activa. 30 9. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la fabricacion de un alimento funcional. 10. Uso segOn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para la fabricaciOn de un complemento vitaminico. 35 1. Uso de una composición que comprende L-Carnitina para la elaboración de un medicamento útil en el tratamiento ylo prevención de efectos tóxicos en 5 peces expuestos a cilindrospermopsina. 10 2. Uso de una composición que comprende L-Carnitina, según reivindicación 1, para la elaboración de un medicamento útil en la recuperación de efectos tóxicos en peces expuestos a cilindrospermopsina. 3. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde los efectos tóxicos son alteraciones histopatológicas. 4. Uso según la reivindicación 3, donde las alteraciones histopatológicas son 15 producidas en al menos uno de los tejidos de la lista que comprende hígado, riñón, corazón, branquias o tracto gastrointestinal. 20 5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la L-Carnitina se administra en una cantidad diaria de entre 400 y 880 mg LC/Kg pez/día. 6. Uso según la reivindicación 5, donde la composición se presenta en una forma adaptada a la administración oral o intraperitoneal. 7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la composición 25 incluye excipientes farmacológicamente aceptables. 8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la composición comprende además otra sustancia activa. 30 9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la fabricación de un 35 alimento funcional. 10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para la fabricación de un complemento vitamínico. ES 2 460 391 A1  24 ES 2 460 391 B2 REIVINDICACIONES  ES 2 460 391 B2 25  ES 2 460 391 B2 32  ES 2 460 391 B2 33  ES 2 460 391 B2 34  ES 2 460 391 B2 35  ES 2 460 391 B2 36  ES 2 460 391 B2 37 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 21 N.º solicitud: 201201151 22 Fecha de presentación de la solicitud: 08.11.2012 32 Fecha de prioridad: INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA 51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional DOCUMENTOS RELEVANTES Categoría 56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas A A A A A GUTIÉRREZ-PRAENA DANIEL et al. Protective role of dietary N-acetylcysteine on the oxidative stress induced by cylindrospermopsin in tilapia (Oreochromis niloticus). Environmental toxicology and chemistry, 2012. Vol. 31 (7). ISSN 1552-8618 (Electronic) Doi: doi:10.1002/etc.1838 pubmed:22511408, páginas 1548-1555. SCHREIBER S. et al. Dietary L-Carnitine Protects the Gills and Skin of Guppies (Poecilia reticulata) Against Anionic Xenobiotics. COMPARATIVE BIOCHEMISTRY AND PHYSIOLOGY. PART C: COMPARATIVE PHARMACOLOGY TOXICOLOGY, 19970501 ELSEVIER SCIENCE, OXFORD, GB, 1997. Vol. 117 (1) ISSN 0742-8413 Doi: doi:10.1016/S0742-8413(96)00230-7, páginas: 99-102. WO 9105554 A1 (UNIV GEORGIA RES FOUND et al.) 02.05.1991, todo el documento. US 2001043983 A1 (HAMILTON NATHAN D.) 22.11.2001, párrafos 10,16,22,24. HARPAZ S. et al. L-Carnitine and its attributed functions in fish culture and nutrition-a review. Aquaculture, 2005, Vol. 249 (1-4) ISSN 0044-8486, páginas: 3-21. 1-13 1-13 1-13 1-13 1-13 Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud El presente informe ha sido realizado  para todas las reivindicaciones  para las reivindicaciones nº: Fecha de realización del informe 17.02.2014 Examinador A. I. Polo Díez Página 1/4 INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA Nº de solicitud: 201201151 CLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUD A61K31/205 (2006.01) A23K1/18 (2006.01) A23K1/16 (2006.01) A61P39/00 (2006.01) Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) A61K, A23K, A61P Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, BDTXTE, MEDLINE, BIOSIS, FSTA, HCAPLUS Informe del Estado de la Técnica Página 2/4 OPINIÓN ESCRITA Nº de solicitud: 201201151 Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 17.02.2014 Declaración Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986) Reivindicaciones 1-13 SI Reivindicaciones NO Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986) Reivindicaciones 1-13 SI Reivindicaciones NO Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986). Base de la Opinión.- La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica. Informe del Estado de la Técnica Página 3/4 OPINIÓN ESCRITA Nº de solicitud: 201201151 1. Documentos considerados.- A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión. Documento Número Publicación o Identificación Fecha Publicación D01 GUTIÉRREZ-PRAENA DANIEL et al. 2012 D02 SCHREIBER S et al. 1997 D03 WO 9105554 A1 02.05.1991 D04 US 2001043983 A1 22.11.2001 D05 HARPAZ et al. 2005 2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración La invención se refiere, según la primera y segunda reivindicación, al uso de composiciones que comprenden L- carnitina para la elaboración de medicamentos útiles para el tratamiento y/o prevención y/o recuperación de los efectos tóxicos en peces expuestos a cilindrospermopsina (CYN) Las reivindicaciones dependientes 3 a 13 aportan detalles sobre el uso de las reivindicaciones 1 y 2. El documento D1 propone la utilización de la N-acetilcisteína (NAC) en la dieta para proteger a la tilapia de los efectos tóxicos que produce la exposición a las cilindroespermopsinas. La NAC es un precursor del glutatión, además de estimular las enzimas implicadas en el ciclo del GSH (Glutation-reductasa, gamma-glu tamilcisteina sintetasa, glutatión-S-transferasa). Por todo ello, su ingestión contrarresta la inhibición de la síntesis de Glutation y el estrés oxidativo que produce la intoxicación con CYN. El documento D2 demuestra el efecto protector de la L-carnitina frente a xenobióticos aniónico en peces de la especie Poecilia reticulata. Las membranas y capas epiteliales de las branquias y la piel de los peces a los que se les había administrado L-carnitina estaban protegidas frente a la entrada de xenobióticos aniónicos pero no de xenobióticos catiónicos (figura 1) El documento D3 describe los efectos de alimentar un tipo de peces con un suplemento de carnitina. La L-carnitina, molécula implicada en la producción de energía metabólica, demostró ser útil para aumentar el crecimiento y para conferir resistencia frente a la toxicidad del amonio (ejemplo 3; reivindicación 9) El documento D4 utiliza la L- carnitina junto con ácido lipóico como suplemento para animales de edad avanzada (entre los que se citan los peces) con objeto de aumentar su metabolismo mitocondrial (párrafo 16) El documento D5 es una revisión sobre la función de la L-carnitina en peces. Novedad y actividad inventiva (art. 6.2 y 8.2 de la L.P.) Ninguno de los documentos citados en el estado de la técnica divulga ni sugiere el uso del L-carnitina para tratar o prevenir los efectos tóxicos en los peces expuestos a la toxina cilindrospermopsina. El único compuesto que ha sido utilizado con éxito para tratar o prevenir los efectos tóxicos de la CYN en peces ha sido la NAC (documento D1), compuesto que no tiene similitud estructural con la L-carnitina, ni está involucrado en los mismos mecanismos fisiológicos. Por otro lado, aunque la L-carnitina ha sido utilizado como suplemento alimenticio de los peces con muchas finalidades (ver documentos D2-D5): aumento de crecimiento, protección de ciertos xenobióticos, etc., no se deduce de manera evidente de estos documentos que la L-carnitina vaya a proteger a los peces de todo tipo de tóxicos y, en particular, de la intoxicación con CYN. Por lo tanto, se considera que las reivindicaciones 1 a 13 tienen características que no se encuentran ni resultan evidentes del estado de la técnica, y por tanto cumplen el requisito de novedad y de actividad inventiva. Informe del Estado de la Técnica Página 4/4