Disminución de las células mieloides supresoras en placentas de diabetes gestacional. Papel de leptina

1 UNIVERSIDAD DE SEVILLA DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA MÉDICA BIOLOGÍA MOLECULAR E INMUNOLOGÍA TESIS DOCTORAL DISMINUCIÓN DE LAS CÉLULAS MIELOIDES SUPRESORAS EN PLACENTAS DE DIABETES GESTACIONAL. PAPEL DE LEPTINA MALIKA TAMI Director: D. VÍCTOR SANCHEZ MARGALET Programa de Doctorado: Biología Molecular, Biomedicina e Investigación Clínica SEVILLA, 2024 2 3 DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA CLÍNICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR E INMUNOLOGÌA UNIVERSIDAD DE SEVILLA DISMINUCIÓN DE LAS CÉLULAS MIELOIDES SUPRESORAS EN PLACENTAS DE DIABETES GESTACIONAL. PAPEL DE LEPTINA Trabajo realizado para optar al grado de doctora por MALIKA TAMI VoBo por el director de Tesis La doctorando Fdo.: VÍCTOR SÁNCHEZ-MARGALET Fdo: MALIKA TAMI SANCHEZ MARGALET VICTOR MANUEL - Firmado digitalmente por SANCHEZ MARGALET VICTOR MANUEL - Fecha: 2025.02.10 12:03:06 +01'00' 4 5 6 AGRADECIMIENTOS Este periodo fue un reto de superación. A pesar de todos los inconvenientes, siento que ha merecido la pena, por las personas maravillosas que han hecho que el trabajo de cuatro años valga la pena. En primer lugar, agradezco a mi director de tesis, Víctor Sánchez, la oportunidad que me ha dado de poder desarrollar este proyecto. Como le agradezco a Dr. Antonio Pérez su aportación a este trabajo. También agradezco a Dr. Luis De La Cruz Merino su confianza y su amabilidad. Al Departamento de Citología, quiero agradecerles, a cada uno, su disposición a ayudarme siempre, especialmente Dra. Carmen, Dr. Manuel De Miguel y mi compañero Marcos. Del servicio de enfermería del departamento de Bioquímica del HUVM, agradezco la colaboración de cada profesional, el apoyo y la amabilidad con la que me han tratado siempre. A las pacientes y todas las personas que han participado en este trabajo. Del Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular e Inmunología, a los que habéis estado y a los que aun seguís, en especial a Rodri, Cris, M. Carmen Naranjo y Juan Antonio Flores. Del Hospital Virgen Macarena, agradezco la colaboración de las técnicos del laboratorio de citometría de flujo. Gracias por vuestra comprensión y amabilidad. Dejo sin nombrar a muchas personas importantes, mis agradecimientos van dirigidos a cada uno de vosotros también. A mis padres, gracias... Han sido mi refugio durante estos años. Cada vez que he estado desbordada, sin esperarlo, se ha organizado el destino para llevarme a parar a su lado. Ustedes me han enseñado ver el lado positivo a la vida, y no perder la fe en que mi esfuerzo nunca será en vano. Gracias a ustedes he logrado todo lo que me he propuesto. Por último, te agradezco infinitamente Dra. M. Victoria Vázquez, tu colaboración, tu apoyo y cariño. Esta tesis va dedicada a ti, querida Viti. 7 8 CONTENIDO APREVIACIONES I. INTRODUCCIÓN 19 CAPITULO 1: DIABETES MELLITUS 19 1.1 DEFINICIÓN 19 1.2 DIAGNÓSTICO 20 1.3 TIPOS DE DIABETES MELLITUS 21 1.3.1 Diabetes tipo 1: 21 1.3.2 Diabetes tipo 2: 21 1.3.3 La diabetes mellitus gestacional (DMG) 22 1.4 DIFERENCIAS ENTRE DM1 Y DM2 22 1.5 DIABETES MELLITUS GESTACIONAL 23 1.5.1 Definición 23 1.5.2 Diagnóstico 24 1.5.3 Limitaciones en el diagnóstico de DMG 26 1.5.4 Cambios fisiológicos del embarazo asociados a la secreción de insulina 26 1.5.5 Tratamiento de la diabetes gestacional 28 CAPITULO 2: ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LA PLACENTA 30 2.1 ASPECTOS CONCEPTUALES 30 2.2 FORMACIÓN DEL TROFOBLASTO E IMPLANTACIÓN 31 2.3 IMPLANTACIÓN 32 2.2.1 Aposición 33 2.2.2 Adhesión 33 2.2.3 Invasión 33 2.4 DECIDUALIZACIÓN DEL ENDOMETRIO MATERNO 35 2.5 LAS VELLOSIDADES CORIÓNICAS COMO PRINCIPAL ESTRUCTURA ANATÓMICA - FUNCIONAL DE LA PLACENTA 37 2.6 BARRERA PLACENTARIA 38 2.7 REMODELACIÓN DEL SISTEMA INMUNE MATERNO 40 2.8 FACTORES DE COMPATIBILIDAD MATERNO-FETAL 42 2.9 INFLAMACIÓN Y EMBARAZO 43 2.10 PLACENTA Y PATOLOGÍAS DEL EMBARAZO 44 2.11 EFECTO DE LA DMG EN PLACENTA 45 CAPITULO 3: LEPTINA 49 3.1 DEFINICIÓN DE LEPTINA 49 3.2 ESTRUCTURA DE LA LEPTINA 50 9 3.3 SÍNTESIS DE LA LEPTINA 51 3.4 SÍNTESIS DE LA LEPTINA EN EL EMBARAZO 52 3.5 LEPTINA PLACENTARIA 53 3.6 RECEPTOR DE LA LEPTINA 54 3.6.1 Isoformas del receptor de la leptina 54 3.6.2 Isoformas y expresión del receptor de la leptina Ob-R 55 3.7 PRINCIPALES VÍAS DE SEÑALIZACIÓN ACTIVADAS POR LEPTINA 57 3.7.1 Vía de señalización JAK/STAT (Janus Kinase / Signal Transducer an Activator of Transcription) 58 3.7.2 Vía MAPK (Proteínas quinasas activadas por mitógenos). 60 3.7.3 Vía de señalización de PI3K (Phospo-Inositide 3-Kinase) 63 3.8 LEPTINA Y SISTEMA INMUNE 66 3.9 LEPTINA Y SISTEMA INMUNE MATERNO 69 3.10 LEPTINA Y PATOLOGÍAS DEL EMBARAZO 70 3.10.1 DESÓRDENES DEL CRECIMIENTO PLACENTARIO. 70 3.10.2 PREECLAMSIA 71 3.10.3 DIABETES MELLITUS GESTACIONAL 73 3.11 ESTRATEGIAS TERAPEUTICAS DE LEPTINA 74 CAPÍTULO 4: INMUNOLOGÍA 76 4.1 TIPOS DE RESPUESTA INMUNITARIA 76 4.2 LINFOCITOS T REGULADORES COMO SUBPOBLACIÓN TH 77 4.3 CÉLULAS SUPRESORAS DE ORÍGEN MIELOIDE 82 4.3.1 TIPOS DE CÉLULAS SUPRESORAS DE ORÍGEN MIELOIDE 83 4.3.2 PAPEL DE MDSC EN DIFERENTES PATOLOGÍAS 85 4.3.3 PAPEL DE MDSC EN EL EMBARAZO 87 CAPITULO 5: GALECTINAS 88 5.1 DEFINICIÓN 88 5.2 CARACTERISTICAS GENERALES 89 5.3 GALECTINAS Y RESPUESTA INMUNITARIA 90 5.4 LA FUNCIÓN DE LAS GALECTINAS EN LA BIOLOGÍA DE LAS CÉLULA T REGULADORAS 91 5.5 LA FUNCIÓN DE LAS GALECTINAS EN LA BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS B 92 5.6 LA FUNCIÓN DE LAS GALECTINAS EN LA BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS MDSCs 92 5.7 PAPEL DE LAS GALECTINAS EN EL EMBARAZO 93 5.8 GALECTINA-8 95 II. HIPÓTESIS97 III. OBJETIVOS 97 IV. MATERIALES Y METODOLOGÍA 98 TIPO DE ESTUDIO 98 16 La DM constituye un costoso problema sanitario debido a su creciente prevalencia y a la elevada morbilidad y mortalidad que presenta, así como a sus implicaciones clínicas relevantes, tanto pronosticas y terapéuticas, como relacionadas con la calidad de vida de los enfermos y sus familiares (Arslania, 2005; Pasquel et al., 2021). A pesar de más de 100 años de investigación sobre la diabetes, actualmente, no existe cura, la medicina personalizada parece ser una vía prometedora. 1.2 DIAGNÓSTICO El diagnóstico de la diabetes no suele ser evidente en las fases iniciales de la enfermedad, debido a que no tiene sintomatología objetiva y se requiere la valoración de varios factores antes de adscribir la diabetes a un subtipo concreto. De hecho, la mayoría de los diagnósticos son de pacientes con diabetes prolongada en el tiempo y cetosis. Los diagnosticados de fases tempranas suelen ser de forma casual. No existe una prueba diagnóstica única para cada tipo de diabetes, el diagnóstico clínico de la DM se basa en la agrupación de indicios. La forma habitual de diagnosticar la DM es la siguiente: ▪Mediante el índice de glucemia, y en caso de que el paciente no presente síntomas o una descompensación metabólica aguda, se repite la misma prueba, en días diferentes, manteniendo los criterios para evitar errores de medición. ▪Cuando se cumplen 2 criterios diagnósticos diferentes (pj. Glucemia en ayuno≥ 126mg/dl y HbA1c (glucosa en plasma venoso) > 6,5%), se confirma el diagnóstico sin repetir la prueba. ▪Si además de un índice de glucemia elevado, el paciente tiene cetosis, se inicia el tratamiento de forma urgente, y se repite la prueba el día siguiente para confirmar que se trata de una hiperglucemia (Porter y Barret, 2004). ▪Las formas monogénicas de la diabetes pueden detectarse mediante el estudio genético o mediante el diagnóstico molecular. 17 Actualmente, los criterios diagnósticos de la diabetes mellitus se basan en la agrupación de cuatro indicios: ▪ HbA1c ≥ 6,5% determinada por un método estandarizado frente al ensayo del estudio DCCT. ▪ Glucemia en ayunas ≥126mg/dl al menos 8h desde la última ingesta calórica. ▪ Glucemia a las 2h durante una SOG≥200mg/dl, utilizando el equivalente a 1,75g/kg (hasta un máximo de 75g) de glucosa anhidra disuelta en agua. ▪ Glucemia ≥200mg/dl en cualquier momento del día. En pacientes con síntomas clásicos de hiperglucemia o complicación aguda hiperglucémica. Cabe señalar que existe una población de riesgo que se encuentra en las fases iniciales de la diabetes que recibe la denominación genérica de «prediabéticos». Estos casos se caracterizan por: (índice de glucemia a las 2h = 140-199mg/dl) y (la glucemia basal=100-125mg/dl) y (HbA1c<6,5%). 1.3 TIPOS DE DIABETES MELLITUS El diagnóstico etiológico de la DM señala cuatro tipos de diabetes (ADA, 2023; Clements et al., 2018): 1.3.1 Diabetes tipo 1: Causada por la destrucción autoinmune de las células β pancreáticas. Generalmente, conduce a una deficiencia absoluta de insulina. 1.3.2 Diabetes tipo 2: Debido a una pérdida progresiva no autoinmune de la secreción de insulina por las células β. Generalmente es en un contexto de resistencia a la insulina y síndrome metabólico. 18 Otros tipos específicos de diabetes mellitus: construido por ocho subgrupos asociados a otras causas, incluyen: a) defectos genéticos en la función de las células beta (como la diabetes neonatal), b) defectos genéticos y la acción de la insulina, c) enfermedades del páncreas exocrino (como la fibrosis quística y la pancreatitis), d) endocrinopatías, infecciones, e) formas no frecuentes de diabetes mediada por inmunidad, f) otros síndromes genéticos asociados a diabetes y g) la diabetes inducidas por tratamientos químicos (como los glucocorticoides). 1.3.3 La diabetes mellitus gestacional (DMG) Es una alteración de la tolerancia a la glucosa que comienza, o es reconocida por primera vez, en el embarazo. Se clasifica en dos subgrupos según la presencia o no de hipertensión. La diabetes mellitus gestacional (DMG) es una de las complicaciones más comunes del embarazo. Esta entidad suele aparecer alrededor de la semana 24 de la gestación, sobre todo, en mujeres con determinados factores de riesgo. El incremento de la resistencia a la insulina que se manifiesta en estas pacientes causa un ambiente metabólico intrauterino adverso (Silverman, 1998) marcado por interacciones complejas entre las hormonas y los factores reguladores producidos por la placenta. Estos podrían afectar a su desarrollo y su función contribuyendo a las complicaciones de la DMG (Gauster et al., 2012; Pérez-Pérez et al., 2018). 1.4 DIFERENCIAS ENTRE DM1 Y DM2 La DM1 es una enfermedad de origen autoinmunitario, causada por una destrucción autoinmune selectiva de las células β-pancreáticas (Atkinson y Eisenbarth, 2001). La manifestación clínica de la DM1 se produce tras la destrucción de hasta el 19 90% de la masa celular β (Gepts, 1965). La DM1 aparece en los primeros años de vida, y se puede detectar en su primera fase (prediabetes) por la presencia en suero de anticuerpos anti células β pancreaticas, y la infiltración linfocitaria de T autorreactivas en los islotes pancreáticos (Couper y Donaghue, 2009). Por lo generalmente, la DM1 se caracteriza por una produce disminuida o nula de insulina. En cambio, la DM 2, la más común, se distingue porque el cuerpo no produce o no usa la insulina de manera correcta (Atkinson y Eisenbarth, 2001). Clínicamente, la diferencia entre la DM1 y la DM2 reside en la cantidad de insulina segregada, de modo que en DM1, la cantidad de insulina es insuficiente para inhibir la síntesis de ácidos grasos a partir de la lipólisis y la sobreproducción de cuerpos cetónicos. La DM2 sobreviene cuando las células β pancreáticas no pueden producir la dosis extra de insulina para contrarrestar los efectos de la resistencia. En definitiva, la descompensación metabólica asociada a la DM1 se debe al déficit en la producción de insulina; pero en la DM2, no son evidentes. En los últimos años, se han probado diferentes terapias de base inmunológica en modelos animales, entre ellas terapias contra la diabetes, especialmente DM1 con el objetivo de detener el ataque de las células inmunes a las células β pancreáticas productoras de insulina o restablecer la tolerancia a insulina. Desafortunadamente, todas las estrategias inmunomoduladoras no solo han obtenido resultados negativos en humanos, sino también, efectos segundarios adversos en la mayoría de los casos tratados. 1.5 DIABETES MELLITUS GESTACIONAL 1.5.1 Definición La diabetes mellitus gestacional (DMG) es una alteración de la tolerancia a la glucosa que comienza, o es reconocida por primera vez, en el embarazo (Salzberg et al., 2016). El primer caso de DMG fue diagnosticado en el año 1824, y fue caracterizado por sensación de sed y poliuria en la madre y macrosomía fetal. Entonces, el índice de 20 mortalidad materna por DMG era el 30% de los casos, y la mortalidad neonatal era superior al 90% (García-García, 2017). Actualmente, tras cien años del descubrimiento de la insulina, la prevalencia de DMG ha disminuido notablemente, sin embargo, debido a la falta de un consenso mundial que concrete los niveles umbral de hiperglucemia que infieren un diagnóstico de DMG, la prevalencia de esta patología depende del método de cribaje y diagnóstico utilizados. Según los resultados del estudio realizado por HAPO (Hyperglycemia and Adverse Pregnancy Outcome), que incluyó 25.505 mujeres embarazadas de 15 centros hospitalarios, en nueve países, la prevalencia de DMG era 17,8 % para la primera década del siglo XXI (Metzger, Lowe y Dyer, 2008). Los datos porcentuales más recientes que se han informado por la federación Internacional de Diabetes (FID) utilizando los criterios de la IADPSG, corresponden al año 2017, la DMG afecta al 14% de recién nacidos a nivel mundial, dependiendo de las variaciones geográficas y étnicas, siendo los países árabes, sur y sudeste de Asia y América Latina las poblaciones de mayor riesgo. En España, la prevalencia de la diabetes durante el embarazo es 8,7%, de los cuales 87,5% corresponde a DMG (SAS, 2013). El 1-3% de mujeres en edad fértil padecen de diabetes y 5-10% de las embarazadas desarrollan DMG. En menores de 25 años, la incidencia es de 0,4-0,5% y aumenta a edades mayores hasta 4,3-5,5% (García-García, 2017). La DMG es una enfermedad sistémica, crónico degenerativa, de severidad variable, cuyo impacto va en consonancia con la prevalencia de la población a la DM2 y la obesidad (Buchanan et al., 2012). Las complicaciones de la DMG afectan tanto a la madre como al feto e incluyen complicaciones durante el embarazo que aumentan la morbi-mortalidad materno-perinatal, tanto en la madre, tales como la preeclamsia, el aborto, el desarrollar trastornos hipertensivos (Barquiel, 2012), y aumenta la tasa de parto por cesárea (Metsger et al., 2007); como en su descendiente, por ejemplo, la macrosomía fetal, la dificultad respiratoria y la muerte prematura del recién nacido (Barnes-Powell, 2007; Mitanchez et al., 2015). Además, la Sociedad Española de Ginecología y Obesidad (SEGO) refiere dos tipos de complicaciones que pueden afectar al feto según el momento del embarazo en el que se manifiesta la DMG: la embriopatía diabética (malformaciones congénitas y aborto) en la primera mitad del embarazo, y 21 fetopatía diabética (alteraciones metabólicas, malformaciones congénitas) en la segunda mitad del embarazo. La DMG en la mayoría de los casos desaparece tras el parto, permaneciendo siempre un riesgo de padecer DM2 tanto para la madre como para su descendiente, especialmente en mujeres con DMG asociada a obesidad (Plagemann, 2011). 1.5.2 Diagnóstico Como cualquier prueba de diagnóstico, la prueba de detección de la glucosa no aporta un diagnóstico exacto, sino que más bien está diseñada para identificar a tantos casos sean posible. La forma rutinaria de detección de la DMG es mediante una prueba de detección de la glucosa (GCT, por sus siglas en inglés) entre la semana 24 y 28 del embarazo mediante. Según los criterios de la OMS y los resultados del estudio Hiperglucemia y Resultados Adversos del Embarazo (HAPO), la gestante padece de DMG si en la prueba de tolerancia a la glucosa oral (OGTT) (120 min, 75 g de glucosa) el nivel de glucosa plasmática es superior a: 92 mg/dl en ayunas, 180 mg/dl tras 1h, 153 mg/dl pasadas de 2 horas de la ingesta de glucosa. Un único valor elevado confirma la diabetes. Si la prueba se realiza antes de las 20 semanas de gestación, los criterios varían: glucemia plasmática en ayunas >126 mg/dl, nivel de glucosa >200 mg/dl o HbA1c >6,5%. Se recomienda el cribado de DM2 no diagnosticada en la primera visita prenatal en la población de riesgo, mujeres con antecedentes de DMG o prediabetes, malformaciones, muerte fetal, abortos sucesivos o peso al nacer >4500 g en embarazos anteriores, obesidad, trastornos metabólicos, edad >35 años, enfermedad vascular, síntomas clínicos de diabetes y grupos étnicos con mayor riesgo de DMG/DM2 (países árabes, sur y sudeste de Asia y América Latina) (Kautzky-Willer et al., 2019). Un estudio reciente de Thamotharan y compañeros revela un método de análisis rápido que puede ayudar a diagnosticar la DMG en las primeras etapas del embarazo. Este estudio, además de ser una prueba de que la DMG inicia su desarrollo mucho antes de ser diagnosticada, ofrece la posibilidad de diagnóstico más rápido que pueda permitir 22 actuar antes de que se desarrollen condiciones adversas para la madre y el feto (Thamotharan et al., 2022). El método consiste en aislar las vesículas extracelulares (VE) secretadas por la placenta a la sangre (las VE son sacos unidos a la membrana que contienen micro-ARN) y comparar los micro-ARN de las VE de mujeres sanas no embarazadas, con embarazadas sanas y con diabéticas gestacional, observando que los micro-ARN de las VE de las mujeres que posteriormente desarrollan diabetes gestacional son diferentes a los de otras mujeres embarazadas y a los de las mujeres no embarazadas. Este hallazgo podría dar lugar al desarrollo de tratamientos para una de las complicaciones más severas del embarazo. 1.5.3 Limitaciones en el diagnóstico de DMG Partiendo de la evidencia de que incluso una hiperglucemia leve es un factor de riesgo para la morbi-mortalidad materno-fetal, en sentido restringido, la hiperglucemia gestacional es posible que no altere la organogénesis del feto, ya que suele aparecer alrededor de la semana 24 del embarazo, por lo cual, la macrosomía fetal se debe a la diabetes pre-gestacional de tipo 1 o 2 no identificadas hasta etapas tardías del embarazo cuando la organogénesis del feto ya ha sido dañada (García, 2008). Además, la DMG está asociada con alteraciones de las vellosidades placentarias (Taricco et al., 2009; Schafer et al., 1998) que completan su desarrollo durante la segunda mitad de la gestación, por lo tanto, estas vellosidades pueden adaptarse al ambiente glucémico asociado a DMG, lo que sugiere un inicio más temprano de la DMG. El mayor inconveniente en este contexto es no poder diferenciar entre la DMG de aparición temprana y la DM manifiesta no diagnosticada, solo a través de sus trastornos fisiopatológicos, de modo que la DMG está asociada a trastornos tempranos, y la diabetes no diagnosticada está asociada a complicaciones a largo plazo que afecta la 23 morfología de la placenta y principalmente a su función (Gauster et al., 2012). Estudios recientes demuestran que entre todos los embarazos de DMG, solo el 30%-40% de las mujeres manifestaron trastornos diagnosticados antes de la semana 20 de gestación (Bartha et al., 2000; Meyer, Carbone y Gauthier, 1996). Por otra parte, debido al aumento de la prevalencia de la obesidad materna, no es difícil predecir un aumento en la incidencia de DMG. 1.5.4 Cambios fisiológicos del embarazo asociados a la secreción de insulina El fin de la gestación es proporcionar al feto en proceso de formación y crecimiento, las condiciones idóneas y sustento para desarrollarse hasta llegar al estado en el que esté preparado para sobrevivir fuera del útero. Las condiciones en cuestión implican cambios fisiológicos y metabólicos en la madre. Estos cambios promueven la acumulación de tejido adiposo seguido de un patrón de secreción de insulina y la sensibilidad a la acción de la misma, de modo que se produce en la madre resistencia progresiva al efecto de la hormona, por lo que se define el embarazo como un estado diabetogénico. Se ha sugerido que la placenta interviene en este proceso, sin embargo, los mecanismos celulares exactos para esta compleja transición siguen desconocidos (Handwerger y Freemark, 2000). Según el patrón de secreción de insulina, se pueden distinguir dos fases importantes en el embarazo: - Primera fase Incluye los dos primeros trimestres de la gestación. Se caracteriza por un aumento de la sensibilidad materna a la insulina que causa un aumento fisiológico de la ingesta alimentaria dirigida a ser almacenada en forma de grasa (Di Cianni et al., 2003). 24 -Segunda fase Corresponde al tercer trimestre de la gestación. Se caracteriza por la evolución rápida del feto que requiere un flujo de glucosa continuo, dirigido hacia él, y provoca un descenso en los niveles de glucosa en la sangre de la madre. Un estudio comparativo del transporte de glucosa mediado por insulina en los tejidos periféricos de gestantes con DMG con mujeres obesas no embarazadas revela una reducción del 40% en los niveles de glucosa en sangre de embarazadas sanas y una disminución del 65% en gestantes con DMG (Barbour, 2007). Esta hipoglucemia materna leve estimula la lipólisis del tejido graso materno almacenado durante la primera fase de la gestación como fuente de energía (Phelps et al., 1981). Generalmente, la sensibilidad materna a la insulina, alterada por el embarazo, recupera sus niveles normales pregestacionales días después del parto (Ryan et al., 1985). Sin embargo, las interacciones complejas entre las hormonas y los factores reguladores producidos por la placenta, como la leptina, estrógenos, progesterona, cortisol, lactógeno placentario y hormonas del crecimiento placentario, podrían afectar al desarrollo y función de la misma, a través de mecanismos endocrinos, paracrinos y autocrinos (Gauster et al., 2012; Pérez-Pérez et al., 2018) y aumentar paulatinamente la resistencia a la insulina, hasta producirse un estado fisiológico de resistencia a la misma, que puede alcanzar los niveles que se observan en pacientes con diabetes tipo 2 (Catalano et al., 1991). Estas alteraciones en el desarrollo y funciones de la placenta, agravadas por factores como el sobre peso, la obesidad, la edad fértil más avanzada, los antecedentes de DMG, los antecedentes familiares de DM2 y el origen étnico (Mitanchez et al., 2015; McIntyre et al., 2019), acentúan la resistencia a la insulina, provocando la DMG (Jansson et al., 2006). Se ha demostrado que los niveles séricos tanto de leptina como de insulina aumentan durante los embarazos DMG, y que la insulina promueve la expresión de leptina en las células trofoblásticas placentarias (Pérez-Pérez et al., 2013), lo que sugiere que la insulina contribuye al crecimiento de la placenta en DMG, promoviendo la sobreexpresión de la leptina en las células trofoblásticas placentarias (Pérez-Pérez et al., 2013). Asociado así, la sobrexpresión de leptina placentaria con el aumento del peso placentario en DMG y la macrosomía fetal. En general, la placenta de mujeres diabéticas mal controladas tiene 25 pesos significativamente más altos y proporciones de peso feto-placentario significativamente más bajas en comparación con controles sanos (Radaelli et al., 2003; Taricco et al., 2009; Cetin et al., 2005).  1.5.5 Tratamiento de la diabetes gestacional Desafortunadamente, existen muchas controversias en cuanto a las medidas terapéuticas obstétricas en este tipo de embarazo de alto riesgo, especialmente en el uso de agentes orales durante el embarazo por su impacto sobre la salud del feto. El tratamiento de la DMG consiste básicamente en dieta y actividad física a niveles de intensidad moderada, si no está contraindicada. Si no se logra normalizar los niveles de glucosa mediante dieta y ejercicio físico en el rango terapéutico (en ayunas <95 mg/dl y 1h posprandial <140 mg/dl) se debe iniciar una terapia con insulina como primera opción. Además, para prevenir la morbi-mortalidad materna y fetal/neonata, y restringir el crecimiento intrauterino, es de transcendental importancia un seguimiento clínico y un asesoramiento personalizado a las gestantes para asegurar el control glucémico durante todo el periodo del embarazo (Sayakhot, Carolan-Olah y Steele, 2016). Asimismo, aumentar la atención estructurada previa a la concepción para este grupo de mujeres, y adaptar las nuevas tecnologías de control glucémico a las circunstancias del embarazo (Schaefer-Graf et al., 2018) especialmente en mujeres obesas, ya que, debido al aumento de la prevalencia de la obesidad materna, no es difícil predecir un aumento en la incidencia de DMG. CAPITULO 2: ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LA PLACENTA 2.1 ASPECTOS CONCEPTUALES La placenta humana es un órgano que desarrollan las mujeres durante la gestación, que se adhiere al útero y a través de esta se establecen los intercambios entre la madre y el embrión, haciendo de ella un órgano relevante para el embarazo. 32 macrófagos y la potencialización de la fagocitosis. Las células NK se dividen en dos subpoblaciones: CD56dim y CD56 brignt, la primera está presente en sangre periférica y es citotóxica, la segunda está presente en cantidades mínimas, y se estimulan por las citosinas deciduales: IL-12, IL-15 y IL-18, y producen IFN γ- en respuesta a este estimulo (Lanier, 2005; Gerosa et al., 2005; Hart et al., 2005; Parham, 2005). Durante el ciclo menstrual, el recuento de NK aumenta gradualmente hasta alcanzar un máximo en la fase lútea tardía llegando a formar el 70% de los leucocitos deciduales totales, luego disminuye gradualmente después de la semana 20 de gestación (Lindaman, Dowden y Zavazava et al., 2006; Iglesias et al., 2002; Gutiérrez, Donato y Mindlin, 2006). Se ha demostrado que las células NK están implicadas en la diferenciación y renovación del endometrio, y juegan un papel vital en el éxito de la implantación embrionaria mediante la regulación de la invasión del trofoblasto, la angiogénesis y la tolerancia inmunológica al embrión (Ziegler et al., 2018). Es importante señalar que la implantación del embrión en el endometrio es un aloinjerto (tolerado) que expresa proteínas sintetizadas a partir de los genes paternos, y por lo tanto extraños para el SI materno y precisan de un mecanismo inmune compatibilizador a nivel del útero para no producir rechazo; agregando a ello que el las células de citotrofoblasto extravelloso no expresan las moléculas HLA II clásicas (moléculas inmunogénicas en transplantes), ni HLA I clásicas; pero sí expresa moléculas HLA I no clásicas, como HLA-C, HLA-E y HLA-G (el más expresado) que se caracterizan por presentar un polimorfismo limitado que previene la citotoxidad inducida por las células NK y por lo tanto, permite la tolerancia inmune al feto (Lindaman, Dowden y Zavazava, 2006; Iglesias et al., 2002; Gutiérrez, Donato et Mindlin, 2006; Burton y Watson, 1997). 33 2.5 LAS VELLOSIDADES CORIÓNICAS COMO PRINCIPAL ESTRUCTURA ANATÓMICA - FUNCIONAL DE LA PLACENTA El desarrollo embrionario durante la tercera semana también comprende la continuación del desarrollo del trofoblasto, el principal componente celular de la placenta. Las células del trofoblasto se diferencian en múltiples linajes celulares dependiendo de diferentes factores autocrinos y paracrinos (Hussain et al., 2022; Sieg et al., 2022). Tras la implantación del embrión, el trofoblasto invasor produce los troncos vellocitarios en la aproximidad de la capa coriónica, los mismos aumentan de grosor transformándose en vellocidades primarias; se forman en los días 12-13 posfecundación y constan de a) citotrofoblasto (CT), la capa interna formada por células mononucleares y, b) el sincitiotrofoblasto (ST), la capa externa formada por células multinucleares (Burton y Watson, 1997; Demir et al., 1997; Mayhew y Burton, 1997). Posteriormente, las células del misodermo extraembrionario migran hacía el núcleo de la vellocidad primaria originando una vellocidad secundaria. Este proceso avanza durante la tercera semana, y al final de esta, es cuando las células mesodérmicas de las vellocidades secundarias comienzan a diferenciarse en células sanguíneas y pequeños vasos sanguíneos que acabarán formando lo que llamamos sistema capilar velloso. A estas alturas, la vellocidad recibe el nombre de terciaria o placentaria definitiva (Demir et al., 1997; Mayhew y Burton). Los capilares de esta entran en contacto con los capilares que se estarán desarrollando al mismo tiempo en el misodermo de la placa coriónica y el películo de fijación. A su vez, estos vasos entran en contacto con los del sistema circulatorio interembrionario (Coyne y Lazear, 2016). Por lo que, cuando el corazón empieza a latir durante la cuarta semana de desarrollo, el sistema velloso está listo para suministrar al embrión los nutrientes y el oxígeno que necesita. Siguiendo con el desarrollo, el citotrofoblasto es altamente proliferativos y tienen la capacidad de migrar, a través del sincitiotrofoblasto que recubre la vellocidad hasta alcanzar el endometrio materno, entra en contacto con los tallos vellosos y forman la cubierta citotrofoblática externa la cual, de forma paulatina, va rodeando a todo el trofoblasto y termina uniendo firmamente la placa curionica al tejido endometrial. Hacía los días 19-20, mientras la vellocidad coriónica se ha agrandado, el embrión queda anclado en su cubierta 34 trofoblastica por el estrecho pilículo de fijación que más adelante se convertirá en el cordón umbilical que conectará la placenta con el embrión (Apaza Valencia, 2014; León-Juárez et al., 2017). Figura 5. Esquemas de las primeras fases de la Segmentación en los embriones humanos. Microfotografía electrónica de barrido de un folículo maduro en el ovario de rata. Los dibujos de los estadios de 58 y de 107 células representan secciones del embrión (Carlson, B. M. (2014). Embriología Humana y Biología del Desarrollo) 2.6 BARRERA PLACENTARIA La clasificación histológica de la placenta se rige por el número de barreras que separan la sangre fetal y materna y distingue dos típos principales: a) placenta hemocorial que se caracteriza por poseer una sola capa de células en la interfase, y el trofoblasto fetal penetra en el endometrio hasta entrar en contactar con la sangre materna (Sadler, 2007), b) placenta epiteliocorial que contiene seis capas de células que separan el trofoblasto fetal del útero materno, en la cual el epitelio coriónico fetal contacta con el epitelio uterino permaneciendo este intacto (De Mestre et al., 2010). 35 Figura 4. Diferencia entre el tipo de placenta epitelocorial (izquierda) y hematocorial (derecha). En la placenta epiteliocorial se observa que el corion está en contacto con el epitelio uterino, en cambio en la hematocorial el corión atraviesa el epitelio y entra en contacto con la sangre materna (Adaptado de Ivascu & de Simón, 2012). En los humanos, la barrera placentaria está formada por la membrana basal que se encuentra en la cara fetal y el sincitiotrofoblasto de las vellocidades coriales comprendido en la cara materna, y se encuentra rodeada de sangre materna del espacio intervelloso, de manera que la única barrera entre el capilar fetal y el espacio intervelloso es el trofoblasto, es decir que el trofoblasto está en contacto directo con la sangre materna; es por ello que se considera la placenta humana del tipo hemocorial. Esta característica es determinante en la función inmunológica de la placenta, de tal forma que mientras la epiteliocorial forma una barrera ante el acceso del sistema inmunitario materno, la hemocorial tiene menor función como tal (Demir et al., 1997; Cross et al., 2006; Mayhew y Burton, 1997). Por otra parte, la barrera placentaria es la unidad histofuncional que permite el intercambio de gases y nutrientes entre la madre y el feto, de modo que la transferencia de sustancias se produce a través del sincitiotrofoblasto, citotrofoblasto, las vellocidades de la membrana basal, lecho capilar del feto y el endotelio (benirschke, 2004), sin mezclarse la sangre del feto con la sangre materna, mediante diferentes mecanismos (Hernández, 2003, Demir et al., 1997; Cross et al., 2006; Jones, 1991): 36 ● Difusión simple: está basada en el transporte pasivo a favor del gradiente de moléculas con peso molecular inferior a 600 Da. Ej. la transferencia de oxígeno. ● Difusión facilitada: se produce a través de canales formados por proteínas de membrana específicas que permiten el paso de moléculas cargadas. Por este mecanismo, se tranfiere la glucosa al feto y los lactatos del feto a la madre. ● Transporte activo: este tipo de transferencia requiere un gasto de energía, en el cual se produce el transporte en contra de un gradiente de concentración; es un evento sodio dependiente. Por el cual se transfieren los aminoácidos. ● Pinocitosis: es un tipo de endocitosis en la cual proteínas de superficie capturan determinadas sustancias. El hecho de que el sincitiotrofoblasto esté en contacto directo con la sangre materna sugiere su papel importante como barrera inmunológica protectora al feto. Además, la transferencia de nutrientes y de oxígeno se produce a través de la barrera placentaria. Esta transferencia está regulada por diferentes factores bioquímicos, fisiológicos y anatómicos como la concentración de las sustancias a cada lado de la barrera, la presión arterial de la madre, la diferencia de presión hidrostática a cada lado de la barrera, el flujo sanguíneo placentario, la presión osmótica y el ejercicio (Hernández, 2003; Cunningham et al., 2006). 2.7 REMODELACIÓN DEL SISTEMA INMUNE MATERNO Cada ser humano se caracteriza por marcadores propios específicos que son reconocibles por el propio sistema inmunitario que, en una respuesta inmunitaria normal, reconoce antígenos extraños y se moviliza para rechazar y destruir todo aquello que no esté codificado en nuestros genes, como las proteínas de virus, bacterias y parásitos, e incluso las proteínas humanas que son de otro individuo. Sin embargo, 37 cuando el SI no funciona adecuadamente (inmunodeficiencia), puede confundir lo propio con lo extraño y genera una respuesta inmunitaria contra lo propio, como puede generar una respuesta inmunitaria excesiva contra antígenos extraños que termina dañando los tejidos propios (trastornos autoinmunitarios). La inmunología de la reproducción tiene sus bases en la inmunología del trasplante y describe el feto como un aloinjerto que teóricamente debería ser rechazado por el SI materno. Sin embargo, el embarazo es un fenómeno fisiológico particular, en el que el feto semialogénico coexiste con la madre sin producirse rechazo, existiendo potencialmente un riesgo desde la concepción hasta el parto de ser un objetivo del sistema inmune materno. Durante más de medio siglo, se intentó explicar la paradoja inmunológica del no rechazo del feto por diferentes teorías (Billingham y Medawar, 1953). Una de las primeras teorías formuladas para explicar el milagro de la reproducción postula que el SI materno se suprime durante la gestación. Sin embargo, se demostró que el SI materno se mantiene activo durante el embarazo y rechaza todo tipo de agresiones externas (Gérard Chaouat, 2016; Li, Xu y Jin, 2021). A partir de ahí, se planteó que la placenta forma una barrera inmunológica entre la madre y el feto capaz de inhibir la expresión de las moléculas de reconocimiento, como sucede en algunos tumores. Sin embargo, esta teoría también ha sido desestimada en humanos tras demostrarse que la placenta humana no es una barrera física que previene el intercambio celular materno-fetal, pues se han detectado células y desechos celulares de origen fetal en la sangre materna (Saito et al., 2007) y también células maternas en la sangre de su descendiente (Adams et al., 2007). Actualmente, las investigaciones dirigidas a esclarecer el dilema de la tolerancia fetal coinciden en que la unidad feto-placentaria, a pesar de expresar antígenos de rechazo e interactúar completamente con las células inmunes del huésped inmunocompetente, no provoca una respuesta de rechazo debido a que las células trofoblásticas placentarias y las células inmunitarias en conjunto forman un sistema inmunológico protector del feto. Esta tolerancia inmune está instruida por factores placentarios inmunosupresores e inmunomoduladores y por la regulación de la respuesta inmune materna ante los antígenos de histocompatibilidad fetal (Moffett y Loke, 2006). Así, numerosos mecanismos celulares y moleculares actúan 38 conjuntamente para reforzar la inmunosupresión en la interfase trofoblasto-endometrio. Estos mecanismos deben ser locales y no comprometer los sistemas de defensa de la madre (Garcés y Gutiérrez, 2009). 2.8 FACTORES DE COMPATIBILIDAD MATERNO-FETAL Hacia el final del primer trimestre, los citotrofoblastos se extienden hacia las arterias espirales y entran en el espacio decidual como trofoblastos extravellosos. Estos, al invadir la decidua y evadir la vigilancia inmunitaria materna, no expresan las moléculas HLA II clásicas ni las HLA I clásicas; pero sí expresan moléculas HLA I no clásicas tolerogénicas como HLA-C, HLA-E y, especialmente, HLA-G que son reconocidas por las células NK a través de sus receptores KIR y previenen la citotoxidad inducida por las NK. El gen HLA-G es el que más se expresa en la interfase materno-fetal y, a diferencia de las moléculas HLA-I clásicas, tiene un polimorfismo limitado que permite la tolerancia del aloinjerto fetal (Lindaman, Dowden y Zavazava, 2006; Iglesias et al., 2002; Gutiérrez, Donato y Mindlin, 2006). Se ha demostrado que las moléculas HLA-G con propiedades inmunosupresoras (Eira, et al., 2017) a) inhiben la actividad citotóxica y proliferativa de las células NK y LT, e inducen su apoptosis (Gonen-Gross et al., 2010); b) favorecen la producción de citoquinas Th2 por los linfocitos T (Blanco et al., 2008); c) activan las células presentadoras de antígenos (CPA) tolerogénicas (Hunt et al., 2005; Hunt et al., 2006; Rizzo et al., 2007; Hunt y Langat, 2009) y, d) activa los mecanismos inmunosupresores de las células Treguladoras (Treg) que se encargan de modular la respuesta inmune materna contra el feto, de manera que no perciba al embrión como un cuerpo extraño (Hunt et al., 2006; Rizzo et al., 2007; Hunt y Langat, 2009). Otro factor de compatibilidad materno fetal descubierto recientemente son las moléculas inmunosupresoras como el ligando 1 de muerte programada (PD-L1), pues se ha demostrado que las células placentarias producen exosomas que contienen moléculas inmunosupresoras como PD-L1 (Abumaree et al., 2017) con propiedades 39 inmunosupresoras, similares a las células cancerosas (Whiteside, 2018). En este mismo contexto, se ha demostrado que la placenta sobreexpresa la proteína STING que participa en la activación de IFN-γ en respuesta al ADN extraño y propio (Ishikawa et al., 2008). Además, la placenta desempeña un papel fundamental en la inflamación a través de la acción de citoquinas proinflamatorias tipo Th1 como IL-2, TNF- ! e IFN-γ consideradas vitales para un embarazo exitoso (Faggioni et al., 2001; Fantuzzi et al., 2000). A este respecto, se ha demostrado que la leptina es un factor trófico autocrino en las células trofoblásticas, cuya expresión está aumentada en DMG y juega un papel importante como adipocina proinflamatoria (Hotamisligil et al., 1993). Por lo tanto, en el embarazo se establece un sistema de “camuflaje” de los antígenos extraños que permite el bloqueo de la acción de los anticuerpos antiHLA (Raghupathy, 2001). 2.9 INFLAMACIÓN Y EMBARAZO Tras la implantación, el blastocito invade poco a poco el endometrio, ocasionado daño celular y tisular en el útero, reemplazando las capas del tejido materno que va atravesando por células trofoblasticas con la intervención de células reparadoras en un ambiente inflamatorio fumentado por las células NK, macrófagos, linfocitos T y células dendríticas (Hernández, 2003; Cunningham, 2006; Page, 1993). Esta respuesta inflamatoria se caracteriza por un perfil de citosinas proinflamatorias tipo Th1 con niveles altos de interleuquina 8 (IL-8), RANTES (regulated on activated normal T- cells where it is expressed and secreted) y factor granulocito estimulante de colonias (G- CSF). Este proceso transicional provoca alteraciones en el estado general de la gestante que se traducen en los síntomas típicos de las primeras semanas del embarazo como náuseas y vómitos que desaparecen en el segundo trimestre debido a que la respuesta inmune disminuye y el perfil de citoquinas se invierte hacia estado inmunológico Th2 caracterizando una fase antiinflamatoria. Al final del tercer trimestre, a medida que se va acercando el nacimiento del bebé, se vuelve reaparecer el ambiente proinflamatorio Th1, que provoca la contracción uterina, el trabajo de parto y la expulsión de la placenta (Chaouat y Diallo, 1997; Mor, 2007; Abrahams et al., 2005; Wegman y Guilbert, 1992). 40 2.10 PLACENTA Y PATOLOGÍAS DEL EMBARAZO La placenta es un órgano estructuralmente complejo que intermedia y controla el intercambio madre-feto durante la gestación, lo cual la expone a condiciones intrauterinas adversas que pueden afectar negativamente la anatomía y fisiología de este órgano (Abramovwicz y Sheiner, 2007; Espinal Jara, 2020). De allí, ha surgido la necesidad de la investigación científica para el estudio morfológico en placentas procedentes de embarazos patológicos. Curiosamente, las investigaciones apuntan a la existencia de una relación estrecha entre la morfología de este órgano, su función y las patologías del embarazo (Abramovwicz y Sheiner, 2007; Gude et al., 2004), siendo las fallas estructurales y/o funcionales en la membrana fetal (placenta, amnios y cordón) factores contribuyentes a las complicaciones en la salud de la madre como DMG y preeclamsia; y en la salud del feto como retraso en el crecimiento intrauterino (RCIU), desnutrición e macrosomia (Abramowicz y Sheiner, 2007; Jansson et al., 2006; Diaz Rojas, 2011; Gude, Robert y Kalionis, 2004). Aguirre Chacón en su análisis de la morfoestereología de la placenta, relaciona las lesiones y el bajo peso de la placenta con la restricción del transporte intrauterino de nutrientes a través de la membrana placentaria. En su estudio, refiere además que el peso de la placenta es indicador para el percentil del recién nacido, es decir, a mayor peso de la placenta mayor peso del recién nacido (Aguirre Chacón, 2017). Ortega Hernandez (2018) relaciona las lesiones observadas en las placentas de embarazadas hipertensas (calcificaciones e infarto placentario) con la suspensión de la transferencia de sustancias a través de la membrana placentaria, y con el bajo peso de la placenta (Gutierrez-Nuñez et al., 2021). Se ha asociado la DMG mal controlada con un aumento del peso placentario, y unas proporciones de peso feto-placentario significativamente más bajas (Radaelli et al., 2003; Taricco et al., 2009; Cetin et al., 2005), sin observarse diferencias anatómicas significativas entre la placenta y el cordón procedentes de gestantes con DMG en comparación con controles sanos (Pathak et al., 2010). Diferentes estudios histológicos revelan lesiones vasculares en placentas patológicas como la corangiosis y necrosis 41 fibrinoide (Taricco et al., 2009; Madazli et al., 2008), edemas, inmadurez y ramificaciones a nivel de las vellosidades coriónicas (Taricco et al., 2009; Schafer-Graf et al., 1998), así como depósitos de fibrina en el sincitiotrofoblasto y una marcada hiperplasia del citotrofoblasto (Al-okail y Al-Attas, 1994). 2.11 EFECTO DE LA DMG EN PLACENTA La placenta cumple una función de transporte de nutrientes entre la madre y el feto, lo que la expone a las alteraciones metabólicas maternas y/o fetales que influyen negativamente en su desarrollo y en la salud del feto. Estas alteraciones consisten principalmente en cambios a nivel microanatómico y/o molecular y estrés oxidativo, y afectan al transporte de oxígeno y nutrientes, causando un ambiente proinflamatorio (Lappas, Mitton y Permezel, 2010; Taricco et al., 2009) y alteraciones en el transporte de aminoácidos y lípidos (Colomiere al., 2009; Gauster et al., 2012), sin afectar el flujo transplacentario de glucosa, ya que este parece estar limitado y no depende de la disponibilidad del transportador de glucosa (al-okail y Al-Attas, 1994; Osmond et al., 2000). ● Efecto del estrés oxidativo asociado a DMG en la placenta. Las alteraciones metabólicas maternas y/o fetales asociadas con la DMG producen estrés oxidativo a nivel de la placenta. Para contrarrestar los efectos negativos del estrés oxidativo, se induce una regulación positiva de enzimas antioxidantes, como la glutatión reductasa y la catalasa, las cuales están significativamente elevadas en las placentas con DMG en comparación con placentas controles sanas (Lappas, Mitton y Permezel, 2010). Sin embargo, una exposición prolongada al estrés oxidativo puede causar inflamación a nivel del tejido placentario (Taricco et al., 2009). 48 La leptina se secreta al plasma donde circula libre o ligada a macroproteínas séricas que regulan su biodisponibilidad y su acción (Ahima y Flier, 2000; Frühbeck, 2006), hasta llegar a los tejidos diana donde se une a su receptor. Estas dos formas de leptina, libre y ligada, se mantienen en un equilibrio dinámico (Frühbeck, 2006). El aumento de la expresión del gen ob con la ingesta alimentaria se debe a la secreción de insulina (MacDougald et al., 1995), ya que se ha descrito que la insulina estimula de forma directa la expresión de leptina y de su ARNm, tanto en roedores como en humanos (MacDougald et al., 1995; Cammisotto et al., 2002), in vivo e in vitro. 3.4 SÍNTESIS DE LA LEPTINA EN EL EMBARAZO Durante la gestación, se produce una adaptación del metabolismo materno a las exigencias metabólicas del feto en proceso de crecimiento. Estos cambios generan una ganancia de peso y cambios en la sensibilidad a la insulina en la gestante con la finalidad de mantener niveles de glucosa adecuados para el desarrollo correcto del feto. El tejido adiposo cumple una función endocrina importante gracias a la síntesis de adipocitoquinas, incluida la leptina. Estas adipocinas desempeñan un papel fundamental en la regulación de la homeostasis energética y el sistema reproductivo (Sartori et al., 2016); de hecho, se ha propuesto un vínculo entre las adipocinas y el éxito del embarazo, aunque los datos no son muy concluyentes (Lekva et al., 2017; Bao et al., 2015; Howell et al., 2017) excepto en caso de la leptina. La leptina es la principal citoquina producida por la placenta, y tiene una gran importancia en la gestación. Se ha demostrado que esta hormona influye en varias funciones relacionadas con la reproducción, incluido el desarrollo y la implantación del embrión (Acconcia y Kumar, 2006), la modulación de la angiogénesis durante el embarazo (Harris et al., 2000; Henson y Castracane, 2001) y la invasión de las células 49 trofoblásticas a la pared uterina (Catellucci et al., 2000; Henson et al., 2005). Otros efectos de la leptina incluyen la estimulación de la mielopoyesis, eritropoyesis y linfopoyesis (Gainford et al., 1996), la inducción de la secreción de gonadotropina coriónica humana (Islami et al., 2003; Henson y Castracane, 2005) y de la inhibición de la secreción de progesterona por las células citotrofoblásticas (Cameo et al., 2003). Además de la modulación del crecimiento placentario (Schubring et al., 1997; Ong et al., 1999; Ashworth et al., 2000). En este mismo contexto, se ha demostrado que la leptina puede interaccionar con el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) y el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF-2) en cultivo celular de citotrofoblásto (Islami et al., 2003; Henson et al., 2005) y la inducción de neovascularización en córneas de ratas sanas, pero no en córneas de ratas obesas resistentes a la leptina (Islami et al., 2003). 3.5 LEPTINA PLACENTARIA La leptina experimenta una serie de cambios durante el proceso de gestación: a) en el inicio del embarazo manifiesta un aumento fisiológico que precede al aumento de la adiposidad (Fogteloo et al., 2001) y, b) a partir del segundo trimestre se registra un aumento tanto de ARN mensajero (ARNm) de leptina como de su receptor en la placenta (Henson et al., 1998), de 150%-200% (Masuzaki et al., 1997; Butte et al., 1997). Sin embargo, c) tras el parto los niveles de leptina en el recién nacido sufren una caída inmediata (Sagawa et al., 2002); por otra parte, d) en casos de pérdida del embarazo, los niveles de leptina materna experimentan un descenso importante durante el primer trimestre de gestación (Henson y Castracane, 2005). Por todo ello, es evidente pensar que durante el embarazo la leptina procede principalmente de la placenta (Senaris et al., 1997), y no del tejido adiposo, sugeriendo que la hiperleptimenia materna es producida por la leptina placentaria. 50 La leptina presente en la circulación fetal y el cordón representa un porcentaje pequeño de la leptina total sintetizada por la placenta (Senaris et al., 1997). Sin embargo, en comparación con otras proteínas importantes como el lactógeno, es relativamente alta (Wyrwoll et al., 2005), y juega un papel importante en la regulación del crecimiento y desarrollo fetal (Holloway et al., 2002; Linnemann et al., 2001; Maffeis et al., 1999). Se ha demostrado que la leptina placentaria aumenta el transporte de aminoácidos y de óxido nítrico (Jansson et al., 2003) y disminuye los niveles de triglicéridos y colesterol en placenta (White et al., 2006). Los niveles de leptina durante la gestación se correlacionan directamente con el peso del neonato, la altura y perímetro del craneo del feto durante su evolución en el útero (Schübring et al., 1997; Ong et al., 1999; Sooranna et al., 2001; Hauguel-de Mouzon et al., 2005). Asimismo, en los recién nacidos con perímetro de cráneo pequeño debido a la deficiencia de leptina, se ha demostrado que la administración exógena puede corregir los daños (Henson et al., 2005). Los niveles de leptina en los recién nacidos varían según el sexo y se mantienen más altos en el sexo femenino que en el masculino durante toda la vida (Ertl et al., 1999). Se han detectado las isoformas del receptor de leptina en el intestino delgado de recién nacidos (Sobhani et al., 2000), sugiriendo que esta hormona juega un papel importante en la regulación del metabolismo del neonato (Malik et al., 2001). 3.6 RECEPTOR DE LA LEPTINA 3.6.1 Isoformas del receptor de la leptina En el año 1995 se localizó el gen Ob denominado gen de la obesidad, en el cromosoma 6 de ratón o en el cromosoma 7 en humanos. En el mismo año, fue aislado el receptor de leptina (Ob-R) o (LEPR), desde el plexo coroideo de ratones obesos db/db (Lee et al., 1998; Tartaglia, 1997). De modo que la eliminación genética del 51 recepctor (Ob-Rb) era responsable del fenotipo obeso del ratón db/db. El receptor de leptina está codificado por el gen (db) situado en el cromozoma 4 en ratones o el cromozoma 1 en humanos (Lee et al., 1996; Winiky et al.,1996). Los sitios anatómicos que expresan el receptor de leptina comprenden el tejido adiposo, hipotálamo, corazón, células β pancreáticas y todas las células del SII y SIA (Fantuzzi y Faggioni, 2000; Sánchez-Margalet et al., 2003), por lo que se considera que la leptina es el nexo entre la sistema inmunitario y metabólico. Esta destrubición universal del receptor de leptina le atribuye a la hormona su naturaleza pleiotrópica. La leptina y su receptor comparten características estructurales y funcionales con las citocinas helicoidales de cadena larga, incluyendo a IL-3, IL-6, IL-11 e IL-12, LIF (LeukaemiaIinhibitor y Factor), CNTF (Ciliar y Neurotrophic Factor), CT-1 (Cardiotrophin-1) y OSM (Oncostatin-M) (Matarese, 2000; Zhang et al., 1997). El receptor Ob-R está localizado en la superficie celular en forma de un dímero (Nakashima et al., 1997), y es responsable de transducir las señales en la célula y activar diferentes vías de señalización como (JAK-STAT), (PI3K) y (MAPK). Estas vías de señalización son las propias de un receptor de citocinas tipo I (Zabeau et al., 2003). La región extracelular del receptor Ob-R se caracteriza por dos regiones similares (CRH) separados por una región (Ig-like) intermedia; CRH1 (dominio CRH membrana distal) y CRH2 (dominio CRH membrana proximal). La función de CRH1 se desconoce, y CRH2 es el responsable de la interacción de la leptina (Zabeau et al., 2004; Iserentant et al., 2005). CRH2 está unido a dos dominios FNIII que junto a la región Ig son los responsables de la activación del receptor. 3.6.2 Isoformas y expresión del receptor de la leptina Ob-R Para ejercer su efecto, tanto a nivel central como a nivel periférico, la leptina debe interaccionar con sus receptores transmembrana (Ob-R). Existen al menos seis isoformas del receptor de leptina (Ob-Ra, Ob-Rb, Ob-Rc, Ob-Rd, Ob-Re, Ob-Rf) que 52 resultan del procesamiento alternativo del mismo ARNm y/o del procesamiento proteolítico de productos proteicos subsecuentes (Lee et al., 1996). Todas ellas comparten idénticos domiños extracelulares, excepto la isoforma Ob-Re, que se presenta unida a la leptina en sangre (Leptin Binding Protein) como forma soluble del receptor (Lee et al., 1996). Las isoformas de Ob-R se clasifican en tres tipos: corta, larga y secretada. ● Las isoformas cortas y largas de Ob-R son similares a pesar de presentar diferencias estructurales y funcionales (Belouzard et al., 2004). Se expresan en todas las líneas celulares hematopoyéticas (Gainsford et al., 1996), en las células humanas citotrofoblásticas (Bodner et al., 1999), en la membrana basal y en las microvellosidades de la placenta humana (Ebenbichler et al., 2002). En esta última, la isoforma larga tiene poca actividad, siendo la isoforma corta la encargada de transmitir la señal biológica a través de la cascada de señalización MAPK (Bifulco et al., 2003; Cauzac et al., 2003). ● Las isoformas cortas (Ob-Ra, OB-Rc, Ob-Rd y Ob-Rf) se caracterizan por una pequeña cola citoplasmática de 30-40 aminoácidos. Se expresan en el cerebro y otros órganos. Se han detectado altos niveles de expresión de las isoformas Ob- Ra y Ob-Rc en el plexo coroideo y microvasos cerebrales, sugiriendo su papel en el transporte de leptina a través de la barrera hematoencefálica. ● La isoforma larga (Ob-Rb) es la única que posee una cola citoplasmática de 300 aminoácidos con motivos importantes para la interacción de algunas proteínas y para la activación de las vías de señalización (Fruhbeck, 2006). Se ha demostrado que la forma Ob-Rb, responsable del fenotipo obeso db/db del ratón, se expresa fundamentalmente en el hipotálamo (Zabeau et al., 2003), células trofoblásticas de la placenta (apartir de los días 19-21 de embarazo), células de la zona laberíntica placentaria (Kawai et al., 1999), sistema inmune (Sánchez- 53 Margalet et al., 2003), células sanguíneas (Tsiotra et al., 2000), cérvix uterino y fetos humanos de 2 y 3 meses de gestación (Abir et al., 2005). ● La forma soluble del receptor sirve como vehículo para el transporte de la leptina a los tejidos fetales (Schulz S et al., 2000). Figura 5. Representación esquemática de la estructura general de las diferentes isoformas de los receptores de leptina (ObR). En la parte inferior se muestra el número de residuos de aminoácidos para cada receptor (Adaptado de Vergara Reyes, 2018). 54 3.7 PRINCIPALES VÍAS DE SEÑALIZACIÓN ACTIVADAS POR LEPTINA La determinación de los efectos de la leptina requiere, además del análisis de la estructura de su receptor y los mecanismos bioquímicos y moleculares implicados en dicha unión, el estudio detenido de las diferentes vías de señalización activadas al efecto. Generalmente, tras unirse la leptina al receptor Ob-Rb, se activan diferentes vías de señalización, de las cuales consideramos tres vías metabólicas de manera principal: la JAK/STAT, la vía de transducciones de señales a través de las Janus-cinasas- transductores de la señal y activadores de la transcripción (Janus Kinase / Signal Transducer an Activator of Transcription) responsable de la transducción de la transcripción; la vía MAPK (proteínas quinasas activadas por mitógenos/ Mitogen- Activated Protein Kinase) asociada a la expresión de genes implicados en la transcripción, señalización y fisiología celular; y finalmente, la vía PI3K (fosfatidilinositol-3-quinasa/phosphatidylinositol 3-kinase) interviene en el control de la supervivencia y multiplicación celular (Russo et al., 2004). 3.7.1 Vía de señalización JAK/STAT (Janus Kinase / Signal Transducer and Activator of Transcription) Esta vía fue descubierta gracias a la similitud de la estructura y el receptor de la leptina con la estructura y receptor de la familia de citocinas tipo I. Para la activación de la vía JAK sólo son necesarios el motivo citoplasmático Box1 y los aminoácidos más próximos. Todas las isoformas de Ob-R contienen el motivo Box1 necesario para la unión de JAK y activación de MAPK (Cameo et al., 2003), excepto la isoforma largar Ob-Rb que presenta a demás el motivo Box2 y otros dominios que le confiere la capacidad de señalizar vía STAT y la especificidad hacia las distintas JAK (Myers, 2004). Es por ello que la leptina modula la señalización a través de STAT3 55 exclusivamente por la isoforma larga del receptor que contiene el módulo Y1138 al que se une STAT3. En una célula sana, la vía JAK/STAT está compuesta por tres elementos esenciales: un receptor situado en la membrana celular, Tirosín-quinasas (JAK) y siete factores de transcripción STAT. Existen varios tipos de receptores y cada uno reconoce un ligando específico (citocinas, hormonas, otros). El receptor de leptina está unido a dos tirosín-quinasas JAK, una por cada lado, y tiene residuos de citocina en sus extremos, los cuales tienen la posibilidad de ser fosforilados. La vía JAK/STAT inicia cuando el receptor reconoce a un ligando, y se dimeriza activando la quinasa JAK que utiliza ATP para autofosforilarse. La interacción del receptor Ob-Rb con quinasas citoplasmáticas, especialmente con Janus Kinase 2 (JAK2), se debe a que este carece de dominio tirosina quinasa (Münzberg et al., 2005). El receptor Ob-Rb también carece de actividad enzimática intrínseca, por lo que la señalización a partir de él ocurre cuando se une a la leptina por interacción no covalente con JAK2 (Tartaglia, 1997; Couturier y Jockers, 2003), por lo que se autofosforila JAK2 en numerosos residuos tirosina. STAT se encuentra en forma desactivada en el citoplasma, y cuando se fosforilan los risiduos de tirosina en el receptor (Tyr985 y Tyr1138) proporcionan un sitio de unión para las proteínas (SH2) (Tartaglia, 1997; Banks et al., 2000). Tanto las proteínas STAT como las tirosinafosfatasa (SHP-2) poseen los dominios SH2, por lo que las proteínas STAT (STAT3, STAT5 y STAT6) pueden unirse al dominio intracelular fosforilado del receptor. La unión de STAT3 a la tirosina Y1138 de Ob-Rb produce su activación y su disociación del receptor. Cuando se fosforila STAT, gastando otra molécula de ATP, se separa del receptor para formar dímeros activos, los cuales pueden efectuar su actividad de reguladores de transcripción, ingresan al núcleo donde se encuentra el ADN, y se unen a una región promotora de los genes diana para permitir la transcripción de genes específicos imprescindibles para la regulación del peso corporal por la leptina. Se ha 56 demostrado que la eliminación del residuo Y1138 de Ob-Rb en ratones Knockout les provoca obesidad severa (Tartaglia, 1997; Gualillo et al., 2002). STAT3 cumple diferentes funciones asociadas a la regulación del ciclo celular, crecimiento y transformación (Banks et al., 2000). La proteína SHP-2 regula negativamente la fosforilación en tirosina y la activación de STAT3 (Frühbeck, 2006). Los efectos antiapoptóticos de la leptina ocurren por las vías JAK/STAT, MAPK y PI3K a través de una regulación negativa de la caspasa-10 y de TRAIL (ligand inductor de apoptosis relacionado con TNF) (Russo et al., 2004). Figura 6. Mecanismos de activación de las vías de JAK/STAT a través del receptor de leptina. La unión de leptina a su receptor provoca su dimerización e induce la autofosforilación intracelular de Jak2 en sus propios residuos tirosina. Los residuos tirosina fosforilados son los sitios de unión de las proteínas de señalización, y que contienen dominios (SH2). La Tyr 1138 se recluta STAT3 fosforilado, que se activa y dimeriza, luego se transloca al núcleo para inducir la expresión genética. (Adaptado de Pérez Pérez, 2007). 57 3.7.2 Vía MAPK (Proteínas quinasas activadas por mitógenos). La vía MAPK es una de las vías más estudiadas debido a su capacidad de estimular la proliferación celular. Esta vía está asociada con amplio espectro de enfermedades inflamatorias como la diabetes, artritis reumatoide, asma y aterosclerosis, además de enfermedades degenerativas como la distrofia muscular, Parkinson, Alzheimer y esclerosis lateral amiotrófica (ELA) (Kin y Choi, 2015; Moens, Kostenko y Sveinbjornsson, 2013; Geisler, Shi, Gerrard, 2013). Es obvio asociar la vía MAPK con el cáncer, debido a su implicación en el control de la diferenciación y proliferación celular, viéndose afectaciones diversas principalmente a lo largo de la vía MAPK/ERK (Fang y Richardson, 2005). De hecho, con el estudio de esta enfermedad se ha descubierto mucha de la información que se conoce sobre esta vía. Se conocen tres clases de proteínas quinasa activadas por mitógenos: a) JNKSAPK (Quinasa NH2 terminal c-Jun / Proteína quinasa activada por estrés) que está implicada en la respuesta celular al estrés; b) ERK (Quinasas reguladas extracelularmente/Extracellular Regulated Kinases) implicada en el control de la diferenciación y proliferación celular y; c) p38-MAPK que interviene en la respuesta celular al estrés. Generalmente, los receptores Ob-R que no poseen el residuo Tyr985 presentan una capacidad reducida de inducir esta vía. Tanto la isoforma corta como la isoforma larga del receptor pueden activar la vía MAPK, aunque en menor medida por la primera (Banks et al., 2000). Para obtener la máxima activación de esta vía, la porción intracelular de la isoforma del receptor Ob-Rb debe estar intacta, a pesar de que la parte más distal no interviene en la activación de esta vía (Bjorbaek et al., 2001). La leptina puede inducir la activación de ERK (Extracellular Regulated Kinases) a través de dos vías diferentes (Hegyia et al., 2004): 64 Figura 9. Efecto de la leptina en las células del sistema inmune innato y adaptativo. Efectos de la leptina sobre las respuestas inmunes innatas y adaptativas. La leptina afecta tanto a la inmunidad innata como a la adaptativa. En la inmunidad innata, la leptina modula la actividad y función de los mastocitos mejorando la capacidad migratoria y su tasa de supervivencia. La leptina también modula la actividad y función de los neutrófilos aumentando la quimiotaxis y la secreción de radicales de oxígeno (como el peróxido de hidrógeno, H2O2 y el superóxido, O2) a través de mecanismos directos e indirectos. La acción de la leptina parece estar mediada por el factor de necrosis tumoral (TNF) secretado por monocitos/macrófagos. La leptina aumenta la fagocitosis por monocitos/macrófagos y mejora la secreción de mediadores proinflamatorios. En las células asesinas naturales (NK), la leptina aumenta la capacidad citotóxica y la secreción de perforina e interleucina-2 (IL-2). La leptina también puede modular la capacidad migratoria de los eosinófilos humanos, así como su supervivencia y capacidad migratoria. La leptina estimula la liberación de citocinas inflamatorias (incluidas IL-1b, IL-6, IL-8) y quimiocinas (proteína quimiotáctica de monocitos-1). Finalmente, la leptina induce cambios funcionales y morfológicos en las CD humanas, otorgándoles licencia para el cebado Th1 y promoviendo la supervivencia de las CD. Además, la leptina también aumenta la capacidad migratoria de las DC humanas inmaduras y la capacidad de presentación de antígenos. En la inmunidad adaptativa, la leptina afecta la generación, maduración y supervivencia de las células T al reducir su tasa de apoptosis. En las células T de memoria, la leptina promueve el cambio hacia las respuestas inmunes de las células T auxiliares 1 (Th1) al aumentar la secreción de interferón-ɣ (IFN-ɣ) y facilita las respuestas Th17. Por el contrario, la leptina puede actuar como una señal negativa para la expansión de las células T reguladoras humanas (Treg). Luego, este proceso se sostiene mediante un bucle autocrino de secreción de leptina por parte de las células Th1. Finalmente, la leptina activa las células B para que secreten citocinas (TNF-a, IL-6, IL-10 y TNF-a), así como la producción de IgG2a y respuestas de hipersensibilidad de tipo retardado. (Adaptado de Pérez-Pérez et al., 2017). 65 3.9 LEPTINA Y SISTEMA INMUNE MATERNO La inmunomodulación del sistema inmune materno es importante para prevenir la acción de los linfocitos T y las células NK presentes en la sangre materna y la decidua (Hutter y Hammer, 1998). Las citoquinas inflamatorias, como la interleucina-1 β (IL-1β), la interleucina-6 (IL-6), el factor de necrosis tumoral α (TNFα), las prostaglandinas y la leptina, desempeñan un papel importante en la promoción del proceso inflamatorio intrauterino requerido para que el tejido placentario sea inerte al SI materno hasta el momento del parto (Lappas, Rice y phospholipase, 2004; Rice, 2001; Lappas, 2005). Se ha demostrado que interleucinas como IL-1β, IL-6 y el IL-1α y IFN- ϒ regulan la expresión de leptina (Henson y Castracane, 2006; Fontana, 2010) a la par que la leptina estimula en las células del trofoblasto la secreción de IL-6 y TNFα (Cameo, Bischof y Cebral, 2010; Soh, Mitchell y Keelman, 2000; Barrientos et al., 2015). Otro efecto importante de la leptina en placenta es la generación de la inmunusupresión mediante la expresión del antígeno leucocitario humano G (HLA-G) que promueve la apoptosis de los linfocitos T CD8+ activados, inhibe las células NK y la generación de células presentadoras de antígenos. La leptina placentaria modula negativamente las citoquinas proinflamatorias en la interfase placenta materna como TNF-α e IL-1 para evitar el rechazo del trofoblasto invasivo (Ashworth et al., 2000); la estimulación de la mielopoyesis, eritropoyesis y linfopoyesis (Gainford et al., 1996) y, además, se ha observado que la leptina induce la secreción de gonadotropina coriónica humana (Islami et al., 2003; Henson y Castracane, 2005). Estos datos indican que la leptina es una citocina placentaria con función proinflamatoria que confiere a las células del trofoblasto un fenotipo tolerogénico para prevenir el rechazo (Barrientos et al., 2015). Además, se han asociado los desajustes en los niveles de leptina con la patogénesis del embarazo como la diabetes mellitus gestacional (DMG), el síndrome de ovario poliquístico (SOP), la restricción del crecimiento intrauterino (RCIU) y la preeclamsia (Pérez-Pérez et al., 2016). 66 Figura 10. Esquema que ilustra el papel de la lptina en el desarrollo y función de la placenta. (A) La leptina, secretada por el sincitiotrofoblasto, es una hormona fundamental para el establecimiento y mantenimiento del embarazo, que ejerce efectos autocrinos y paracrinos que regulan la decidualización estimulando la expresión y secreción de metaloproteinasas (MMP), promoviendo la proliferación, la migración y disminuyendo los efectos apoptóticos. La leptina parece intervenir en la angiogénesis y la inmunotolerancia al regular la inmunomodulación, probablemente interactuando con diversos tipos de células uterinas, incluidos el citotrofoblasto, las células asesinas naturales uterinas (uNK) y los macrófagos. En particular, se cree que la interacción del antígeno leucocitario humano (HLA) paterno expresado en citotrofoblastos con los receptores similares a inmunoglobulinas (KIR) de las células asesinas maternas desempeña un papel fundamental en la placentación y el éxito reproductivo. (B) Los citotrofoblastos proliferativos migran hacia las arterias espirales y contribuyen a la remodelación iniciada por las células uNK dentro de la decidua y la parte superior del miometrio, lo que conduce al ensanchamiento de la luz arterial, lo que disminuye la resistencia contra el flujo sanguíneo que irriga al feto. Las fallas en este proceso se asocian con complicaciones del embarazo como abortos o preeclamsia probablemente debido al daño de las vellosidades placentarias provocado por el estrés oxidativo. (adaptado de Pérez-Pérez et al., 2017). 67 3.10 LEPTINA Y PATOLOGÍAS DEL EMBARAZO 3.10.1 DESÓRDENES DEL CRECIMIENTO PLACENTARIO. Durante el primer trimestre del embarazo, las células trofoblásticas de la placenta humana, que son células primarias diferenciadas, inician su crecimiento de una forma invasiva análoga al crecimiento de las células cancerosas, con la importante diferencia de que las primeras tienen un límite en espacio y tiempo. Sin embargo, existen múltiples casos de desregulación de los procesos de proliferación, diferenciación, apoptosis e invasión de las células trofoblásticas (Li et al., 2004) causados por la proliferación descontrolada del trofoblasto (Bischop et al., 2005) como la Enfermedad Trofoblástica Gestacional (ETG). Esta, comprende un conjunto de patologías como la mola completa, la mola parcial o incompleta, la mola invasiva y el coriocarcinoma. La mola hidatidiforme y el coriocarcinoma son tumores trofoblásticos que afectan las células trofoblásticas (no el estroma), quienes sintetizan leptina (Li et al., 2004). La mola hidatiforme es un tumor trofoblástico benigno caracterizado por inflamación severa de las vellosidades coriónicas causada por la retención de líquido. Sin embargo, cerca del 50% de los casos de mola hidatidiforme evolucionan a coriocarcinoma. La expresión de leptina y de su receptor aumentan en las gestantes afectadas de ETG (Sagawa et al., 1997) alcanzando los valores normales diagnosticados en las gestantes diabéticas o obesas, y disminuyen progresivamente con el tratamiento (Reitman et al., 2001), lo que sugiere el papel fisiopatológico de la leptina en los tumores ETG (Li et al., 2004). Actualmente, se desconoce la base molecular del origen de la ETG y de su progresión a la malignidad. A nivel clínico, la leptina podría servir como marcador para el diagnóstico y pronóstico de estos tumores (Sagawa et al., 1997; Masuzaki et al., 1997). 68 3.10.2 PREECLAMSIA La preeclamsia se define como hipertensión que acompaña el inicio del embarazo; sin embargo, no se diagnostica hasta después de la vigésima semana en el 10% de los embarazos a nivel mundial, según la OMS. Esta entidad afecta de forma difusa las células endoteliales de las arterias espirales del útero, produciéndose una inadecuada invasión del citotrofoblasto en estas arterias que puede alterar el desarrollo y función de la placenta. La preeclamsia es una importante causa de morbimortalidad materno perinatal. Sus complicaciones afectan tanto a la madre como al feto. En la madre, la preeclamsia puede elevar las cifras tensionales de la gestante a 140/90 mmHg (Walter, 2000), causar hipertensión acompañada de complicaciones cardiovasculares tras el parto y aumentar el riesgo de presentar en el futuro diabetes mellitus. En el feto, la preeclamsia puede causar restricción del crecimiento, nacimiento prematuro, bajo peso al nacer y el riesgo de muerte infantil (Gagnon, 2003), además de otras alteraciones sistémicas (Redman et al., 2005). La preeclamsia es una patología multifactorial de causas desconocidas. Se han postulado varios factores asociados al desarrollo de esta patología: factores inmunes, genéticos y factores placentarios (Laivuori, 2007). Además de la obesidad, la edad, la presencia de antecedentes familiares de la misma y la preeclamsia en el primer embarazo (Luo y Ma, 2013). La determinación del nivel de leptina en el plasma de la gestante puede ser un buen marcador predictivo de la gravedad de la enfermedad que puede ofrecer información sobre la disfunción y crecimiento de la placenta (Baksu et al., 2005), debido a que la preeclamsia se caracteriza por alta expresión de leptina en suero materno (Bouloumie et al., 1998), en la placenta (Lu et al., 2006) y en el líquido amniótico (Chan et al., 2006), por lo que se correlacionan sus niveles con la gravedad 69 de la enfermedad y las restricciones en el crecimiento fetal (Sagawa et al., 2002). La expresión de leptina aumenta también en plasma y en el cordón umbilical del recién nacido (Odegard et al., 2002). Cabe señalar que, en los casos de retraso de crecimiento intrauterino sin preeclamsia, los niveles de la leptina se mantienen en los valores normales de gestación sana (Laivuori et al., 2006), lo que sugiere que la leptina en este caso no es un factor determinante en la patogénesis de la enfermedad. El único tratamiento disponible para la preeclamsia es mediante los antihipertensivos que ayudan a estabilizar la situación de la madre y evitar el desarrollo de complicaciones. Sin embargo, si persiste el riesgo se procede definitivamente a interrumpir el embarazo. 3.10.3 DIABETES MELLITUS GESTACIONAL Según estudios realizados, las placentas de gestantes con DMG expresan más leptina que las placentas de DM1 (Radaelli et al., 2003). Además, estos niveles experimentan mayores aumentos con los tratamientos con insulina (Lepercq et al., 1998), lo que sugiere que la insulina estimula la síntesis de leptina en placenta (Sagawa et al., 2002) al mismo tiempo que la leptina inhibe la síntesis de insulina (Ceddia et al., 2002). Se ha demostrado además que la leptina está implicada en la síntesis de poteínas placentarias (Mundo et al., 1999). Por todo lo anterior, podemos concluir que la leptina de origen placentario está asociada con la macrosomia fetal y el aumento del peso placetario en DMG. Por otra parte, se ha demostrado que los niveles de leptina en sangre del cordón son más elevados en casos de diabetes mellitus pre-gestacional y gestacional que en controles sanos (Lea et al., 2000) y se correlacionan tanto con el crecimiento del feto (Persson et al., 1999) y los niveles glucémicos (Henson y Castracane, 2006). Por otra parte, el aumento de la síntesis de leptina está acompañado de una alta producción de 70 las citoquinas (IL-6, IL-1, TNF-α) (Radaelli et al., 2003). Todos estos datos sugieren que el aumento en los niveles de leptina en DMG es una respuesta protectora que se opone a los efectos de un desequilibrio de citoquinas proinflamatorias característico de muchas patologías del embarazo (Mundo et al., 1999). Existe, pues, una relación entre los niveles de leptina en suero materno, los niveles de insulina y la tasa de insulina/glucemia en bebés de madres diagnosticadas de DMG, de manera que el exceso de glucemia materna influye en la síntesis de leptina fetal debido a que los niveles altos de leptina en gestantes diagnosticadas de DMG provocan alteraciones metabólicas, elevan los niveles de leptina placentaria y dañan los mecanismos de las células trofoblásticas relacionados con las funciones metabólicas e inmunológicas del feto. Estas alteraciones tienen graves consecuencias en el feto como el aumento de la probabilidad de que este nazca con mayor masa grasa, que desarrolle DM2 y que padezca enfermedades inmunes en el futuro (Cetin et al., 2005). 3.11 ESTRATEGIAS TERAPÉUTICAS DE LEPTINA Debido a la gran cantidad de funciones asociadas a la leptina, tanto a nivel metabólico y endocrino, como en el sistema inmunológico, hace relevante la posibilidad de emplear esta molécula pleotrópica con fines terapéuticos. Sin embargo, se ha asociado el aumento de los niveles de leptina en suero con ciertas enfermedades crónico-degenerativas asociadas con la obesidad y la resistencia a la insulina (Fantuxxi, 2005; Jiménez y Chávez, 2003). Esto se debe a que la leptina, al favorecer las rutas proinflamatorias asociadas a la polarización hacia una respuesta Th1, favorece la infiltración inflamatoria temprana de las células pancreáticas, acelerando la aparición de DM1 en una proporción hasta 10 veces mayor en ratones hembra que en machos (Matarese et al., 2002). 71 Como estrategia farmacológica para inhibir los efectos adversos de la leptina en el sistema inmunológico, se ha considerado la elaboración de antagonistas que interfieren en dichos efectos sin causar aumento de peso (Perera y Chin, 2008). También existe la opción acertada en el proceso de estudio de los receptores solubles que se unen a la leptina para impedir su unión a los receptores de membrana, bloqueando así la respuesta biológica. Otra estrategia es el uso de variantes mutantes de citocinas con actividad antagónica y gran afinidad de unión al receptor de leptina, pero sin posibilidad de activarlo. Sin embargo, estas variantes pueden ser eliminadas vía hepática (Vadacca et al., 2011). Asimismo, se ha estudiado la posibilidad de diseñar anticuerpos de gran afinidad y especificidad, sin embargo, se desconocen sus efectos a largo plazo, como podrían activar una respuesta inmune y ser neutralizados después de repetidas dosis (Perera y Chin, 2008; Peelman et al., 2008). 72 CAPÍTULO 4: INMUNOLOGÍA 4.1 TIPOS DE RESPUESTA INMUNITARIA Una respuesta inmune eficiente requiere un control estricto del inicio, desarrollo y final de la actividad inmunológica, ajustado a la necesidad defensiva. De no darse estas circunstancias, el sistema inmune atacaría y destruiría a los tejidos propios poniendo en peligro la vida del individuo. La regulación inmunológica es el conjunto de medidas fundamentales para establecer la homeostasis del sistema inmune, manteniendo la tolerancia hacia el antígeno propio. Se puede clasificar el sistema inmune, desde el punto de vista funcional, en Sistema Inmune Innato (SII) y Aquerido (o específico) (SIA). Se trata de una clasificación didáctica, ya que ambos sistemas funcionan de forma integrada de manera que el sistema inmune innato, como primera línea de defensa, activa el sistema inmune adquirido en respuesta a las infecciones, y el sistema inmune adquirido depende de los mecanismos efectores del sistema inmune innato para actuar contra los microorganismos. La inmunidad efectora se compone de inmunidad innata y adaptativa: ● La inmunidad innata o inespecífica se activa a las pocas horas o días de la infección, impidiendo el ingreso del antígeno en el organismo. Los elementos característicos de la respuesta innata son la piel, las mucosas, las sustancias antimicrobianas, el complemento, los fagocítos, las células asesinas naturales (NK) y eosinófilos, entre otros (Murphy y Weaver, 2016). ● La inmunidad adaptativa o adquirida es una respuesta específica del antígeno que se activa unos días después de la infección como una segunda línea de defensa del organismo (Murphy y Weaver, 2016). Existen dos tipos de respuesta adaptativa: a) humoral: está mediada por los linfocitos B (producen anticuerpos) y; b) celular: implica una mayor fagocitosis y células 73 citotóxicas específicas del antígeno. Está fomentada por los linfocitos T (LT) y linfocitos B (LB). Todas las células hematopoyéticas (eritrocitos, leucocitos y plaquetas) surgen de la misma célula madre hematopoyética (HSC, del inglés hematopoietic stem cell), y bajo la acción de diferentes citoquinas, se forman dos grupos celulares. Cada grupo se caracteriza por un precursor: 1. Un pregenitor mieloide, del que derivan los eritrocitos, basófilos, células dendríticas, mastocitos, monocitos (y macrófagos), neutrófilos, plaquetas y eosinófilos. 2. Un progenitor linfoide, del que deriva los linfocitos B y T, y las células NK. Cada precursor se diferencia en un tipo celular concreto a través de un proceso determinado: eritropoyesis (eritrocitos), granulopoyesis (granulocitos), monopoyesis (monocitos), linfopoyesis (linfocitos) y trombopoyesis (plaquetas). El control hematopoyético del SI ocurre mediante la secresión de diferentes citosinas a través de las células Th. 4.2 LINFOCITOS T REGULADORES COMO SUBPOBLACIÓN TH Los linfocitos T o células T (LT) son células fundamentales del SI que juegan un papel central como mediadores de la respuesta inmune. Los LT se subdividen en dos típos: colaboradores y reguladores; los colaboradores se encargan de coordinar la respuesta inicial frente al patógeno y los linfocitos T reguladores (Treg) se encargan de proteger la integridad del organismo y parar la respuesta inmune cuando se haya sanado la infección, para evitar el desarrollo de enfermedades autoinmunitarias (lupus, diabetes 80 El papel que han demostrado tener las MDSCs durante estos últimos años en la inmunomodulación de un amplio abanico de enfermedades ha supuesto que este subconjunto celular sea la entidad biológica más discutida en la inmunología. Sin embargo, los datos disponibles sobre el papel de las células MDSCs en el sistema inmune de humanos son escasos e inconcluyentes dado que a) el uso de diferentes marcadores para analizar las subpoblaciones de MDSCs en diversos entornos clínicos, b) las diferentes vías de señalización inmunosupresoras asociadas a las células MDSCs, c) los distintos mecanismo de supresión de MDSCs que varían según las condiciones patológicas, d) la dificultad de replicar in vivo los resultados obtenidos in vitro sobre los mecanismos inmunosupresores de las células MDSCs y e) los diferentes factores emergentes implicados en el reclutamiento y proliferación de las subpoblaciones de MDSCs, como el pH del estroma y nutrientes como la glucosa o los lípidos (Ma y Xia, 2018; Padoan, Plebani y Basso, 2019). 4.3.1 TIPOS DE CÉLULAS SUPRESORAS DE ORÍGEN MIELOIDE Las células mieloides supresoras MDSCs constituyen un grupo heterogéneo de estirpe mieloide (M-MDSC, G-MDSC, E-MDSC y F-MDSC); sin embargo, debido a la ambigüedad en torno a sus funciones, se emplea el término MDSCs para referirse a la población en general. Fenotípicamente, se han identificado en humanos dos subpoblaciones importantes de MDSC según los marcadores que se expresan en la superficie celular (Bronte et al., 2016; Cassetta et al., 2019; Rodríguez et al., 2009): a) M-MDSC: De estirpe monocítica y fenotipo característico (CD11b+HLA-DR−/lowCD15−CD14+), sus homólogos de ratón se definen por (CD11b+Ly6C+Ly6G). Representan aproximadamente el 81 20% de las MDSC totales, y comprenden macrófagos y células dendríticas. b) G-MSC (o PMN-MDSC) de estirpe granulocítica (CD11b+HLADR−/lowCD15+CD14− o CD11b+CD14−CD66b+) en humanos y (CD11b+Ly6C+Ly6G+) en ratones. G-MDSC Suponen el 80% de MDSC. Algunos autores definen las G-MSC como PMN-MDSC para diferenciarlas de los neutrófilos inactivados y resaltar sus características fenotípicas polimorfonucleares (baja granulosidad, baja expresión de CD16, altos niveles de arginasa-1, peroxinitrito, CD11b y CD66b) (Rodríguez et al., 2009). Los marcadores empleados para identificar las dos subpoblaciones se expresan en subconjuntos de monocitos y neutrófilos maduros, así como en linajes precursores hematopoyéticos (Cassetta et al., 2019), lo que requiere, en ocasiones, del uso de marcadores adicionales como LOX-1 y S100A9 para más precisión en la identificación de M-MDSC y G-MDSC (Condamine et al., 2016; Zhao et al., 2012; Roussel et al., 2017; Wistuba-Hamprecht et al., 2017). Además de M-MDSC y G-MDSC, existen otros subconjuntos de MDSC como las MDSC fibrocíticas (F- MDSC) que fueron diferenciadas a partir de precursores de células sanguíneas en el cordón umbilical; y la subpoblación (E-MDSC), fenotípicamente similar a los eosinófilos, que ha sido identificada recientemente. La subpoblación F-MDSC comparte el fenotipo: CD33, CD11b, CD14 o CD15 con las MDSC y se diferencian en que no expresa NOS2 ni L-13. Las F-MDSC comparten con los fibrocitos el fenotipo CD163, fibronectina, TLR4 y IL‐1β y se diferencian en que expresan niveles bajos o nulos de otros marcadores como α‐SMA, CCR7 (Zoso et al., 2014). 82 4.3.2 PAPEL DE MDSC EN DIFERENTES PATOLOGÍAS Es evidente hoy en día que la inmunomodulación en el curso clínico de muchas enfermedades autoinmunes está sujeta al reclutamiento de poblaciones celulares inmunosupresoras como MDSCs y Tregs (Padoan, Plebani y Basso, 2019), siendo los niveles altos de MDSCs biomarcadores predictivos de un peor pronostico clínico en las enfermedades autoinmunes, mientras que están bajos en el estado estacionario de individuos sanos (Schrijver, Théroude y Roger, 2019). En enfermedades autoinmunes como el cáncer y la sepsis, las MDSCs parecen tener un papel dual en el SI en la mayoría de los estudios clínicos realizados (Budhwar et al., 2018), siendo beneficiosas en las primeras etapas de la enfermedad controlando la inflamación, mientras han demostrado ser perjudiciales en estados más avanzados por su efecto inmunosupresor. En estos casos, los niveles altos de MDSCs son biomarcadores predictivos de un peor pronostico clínico (Schrijver, Théroude y Roger, 2019). 83 Figura 13: Mecanismos de inmunosupresión de las MDSC (adaptado de Millrud, Bergenfelz y Leandersson, 2017). En transplante de órganos, el efecto inmunosupresor provocado por la acumulación de las células MDSCs es considerado positivo en cuanto a la prevención de la inmunogenecidad y la protección del transplante, sin embargo, esta interracción entre la inmunosenescencia y la inmunosupresión aún necesita ser estudiada, ya que resulta difícil determinar hasta qué punto los efectos generales son perjudiciales o no según sea el caso (Ochando et al., 2019; Salminen, Kaarniranta y Kauppinen, 2019). La inflamación es la condición unificadora que impulsa la acumulación de MDSCs, por lo que no es inesperado que las MDSCs se acumulen en individuos con obesidad (Clements et al., 2018). 84 En los últimos años, las investigaciones han ampliado la importancia de las MDSCs en el sistema inmune, revelando un nuevo papel inmunosupresor de las MDSCs asociado al inmunometabolismo. A diferencia de las MDSCs inducidas por el cáncer o sepsis, que son puramente perjudiciales para el huésped, las MDSCs inducidas por la obesidad no lo son en todos sus efectos. Clements y sus compañeros (Clements et al., 2018) sugieren que las MDSCs inducidas por la obesidad son parcialmente beneficiosas para el huésped, debido a que protegen contra algunas de las disfunciones metabólicas asociadas con la obesidad al mismo tiempo que favorecen el crecimiento tumoral mediante la inhibición de las células T CD8+; alegando además que la leptina es un regulador clave que vincula la inflamación crónica asociada a la obesidad y/o la diabetes, la inmunosupresión y la progresión tumoral. 4.3.3 PAPEL DE MDSC EN EL EMBARAZO La hiperglucemia asociada a la diabetes es un factor de riesgo para la prevalencia de muchas enfermedades, especialmente las autoinmunes (Mitanchez et al., 2015). La inflamación crónica de bajo grado y la elevación del nivel de glucosa en sangre, así como el ambiente proinflamatorio que produce un elevado perfil de citoquinas inflamatorias, son factores claves en el incremento de la tasa de proliferación de subpoblaciones inmunosupresoras como las células MDSCs. Estudios recientes han demostrado que las MDSCs son beneficiosas en el embarazo, ya que facilitan la implantación y protegen al embrión alogénico del rechazo (Ostrand-Rosenberg et al., 2017). Sin embargo, los estudios de MDSCs en la DMG se encuentran en una etapa temprana y en la actualidad se desconoce cómo esta población puede comportarse en DMG. 85 CAPITULO 5: GALECTINAS 5.1 DEFINICIÓN Todas las células del organismo tienen en el compartimiento intracelular y en la matriz extracelular estructuras sacarídicas llamadas glicanos, ligadas a proteínas formando glico-proteínas. Los glico-conjugados contienen información vital codificada en los glicanos. Debido a que la biosíntesis de los glicanos no requiere molde, existe una gran diversidad de estructuras sacarídicas unidas mediante la acción concertada de glicosiltransferasas y glicosidasas (Cerliani et al., 2016). Las proteínas encargadas de descifrar la información biológica codificada en los glicanos son las lectinas, gracias a su alto grado de estereometría que le permite interaccionar con los glucoconjugados formando enlaces reversibles adaptables a las diversas estructuras sacarídicas. Por lo tanto, la respuesta celular depende de la naturaleza de estas lectinas y de los glicanos con los cuales interactúan (Kooyk y Rabinovich, 2008; Dam y Brewer, 2010). Se han caracterizado tres familias importantes de lectinas: Receptores de lectinas de tipo C (C-type lectin receptors, CLRs); Lectinas de unión a ácido siálico (siglecs); y galectinas (Gals) (Johnson et al., 2013; Rabinovich y Toscano, 2009). Los CLRs y las siglecs son, generalmente, proteínas presentes en la superficie de células del sistema inmune, mientras que las galectinas son lectinas solubles, caracterizadas por su capacidad de reconocer residuos β-galactósidos presentes en los glicoconjugados expresados en una gran variedad de tipos celulares (Rabinovich y Croci, 2012; Rabinovich y Toscano, 2009). Las galectinas carecen de péptidos señal y se secretan al medio extracelular a través de vías no clásicas, en un proceso que implica que las galectinas se acumulen en el lado citoplasmático de la membrana plasmática y se liberen en vesículas y exosomas, o se transloquen directamente a través de la membrana plasmática (Nickel, 2003). Se cree que esta secreción no clásica previene la unión de galectinas a oligosacáridos en las glicoproteínas recién sintetizadas dentro de la célula (Barondes et al., 1994). 86 Actualmente, se conocen 16 miembros de la familia de galectinas (Gal), divididos en tres subfamilias diferentes según su estructura terciaria (Hirabayashi et al., 2002; Patnaik et al, 2006; Stowell et al., 2008; Ideo et al., 2011): a) las galectinas “prototipo” (gal-1, -2, -5, -7, -10, -11, -13, -14, -15 y 16) contienen una única DRC que puede dimerizar; b) las galectinas de tipo de repetición en “tándem” (gal- 4, -6, -8, -9 y - 12) poseen dos dominios de reconocimiento de carbohidratos (CRD) homólogos en tándem conectados por una sola cadena polipeptídica de aproximadamente 70 aminoácidos; y c) gal-3, la única galectina de tipo “quimérico”, contiene un CRD conectado a una región N-terminal no lectina, que es responsable de la oligomerización (Rabinovich y Toscano, 2009; Rabinovich y Liu, 2008; Cummings y Liu, 2009). Se han detectado galectinas en mamíferos, insectos, hongos y plantas (Rabinovich y Liu, 2008; Vasta, 2012). Gracias a su distribución en una variedad de células y tejido del organismo, sus potenciales aplicaciones y los avances logrados en este campo son hoy una diana terapéutica importante para el desarrollo de fármacos. 5.2 CARACTERISTICAS GENERALES Las galectinas son pequeñas proteínas solubles con un peso molecular que oscila entre 14 y 35 kDa (Barondes et al., 1994; Rabinovich, Kooyk y Cobb, 2012; Cummings et al., 2022) que tienen una alta capacidad de unión al β-galactósido. Estas lectinas poseen una función intracelular (núcleo y citoplasma) incluida la modulación de la supervivencia celular, la inmunidad intracelular y la autofagia (Liu, Patterson and Wang, 2002; Thurston et al., 2012; Johannes et al., 2015). Pero también pueden ser secretadas a través de una vía no convencial, aún desconocida, como proteínas extracelulares (Mehul y Hughes, 1997) que ejercen funciones críticas fuera de las células, interactuando con los glicosidos localizados en la superficie celular y en la matriz extracelular (Rabinovich y Croci, 2012) con una afinidad en el rango submicromolar (Cummings y Esko, 2009). 87 El estado de oligomerización de las diferentes galectinas (formas monoméricas versus diméricas u oligoméricas), los patrones de distribución (localización nuclear, citoplasmática o extracelular) y la remodelación activa de N- glicanos y O-glicanos en las células diana determinan colectivamente la avidez de las interacciones de unión galectina-glucano (Hirabayashi et al., 2002; Rabinovich y Toscano, 2009). Como consecuencia, las galectinas pueden desempeñar diversas funciones redundantes o complementarias (Rabinovich y Croci, 2012). Además, las glicoproteínas predominantes que interactúan con las galectinas incluyen integrinas en la superficie celular, laminina y fibronectina en la MEC, cruciales en los procesos de adhesión y migración celular (Rabinovich y Croci, 2012; Le Mercier et al., 2010). Todas las galectinas se expresan en humanos excepto la galectina-5 y la galectina-6 que se encuentran exclusivamente en roedores; galectina-11 y galectina-15 se distribuyen específicamente en cabras y ovejas rumiantes (Cooper, 2002). Las galectinas humanas exhiben una distribución no uniforme en el organismo, de modo que las galectinas 1, -2, -4, -7, -8 y -9 se expresan ampliamente en el cerebro (Saal et al., 2005); la galectina-12 en el tejido adiposo (Yang, Havel y Liu, 2012); mientras que la galectina-2 y la galectina-4 predominan en el tracto gastrointestinal (Thomsen, Hansen y Danielsen, 2009; Huflejt y Leffler, 2004). 5.3 GALECTINAS Y RESPUESTA INMUNITARIA Las galectinas han surgido como importantes moduladores de la señalización célula a célula. Actúan de manera similar a las citosinas; pueden estimular la adhesión y la apoptosis celular, regular la respuesta inmune innata y adaptativa (Rabinovich et al., 2007; Hernandez y Baum, 2002), de ahí su función en la modulación de una variedad de procesos celulares relevantes para la biología del cáncer (Kaltner y Gabius, 2012; Nabi, Shankar y Dennis, 2015; Rabinovich y Croci, 2012), de manera que la angiogénesis, el escape inmune del tumor y la metástasis pueden comprometer la función de las 88 galectinas (Rabinovich y Croci, 2012; Elola et al., 2014). Por ello, cada vez son más los estudios sobre la función de las galectinas en la respuesta inmunitaria, concretamente, en la función de las células T efectoras (Cooper et al., 2010; Cedeno-Laurent y Dimitroff, 2012; Mendez-Huergo, 2014; Cerliani et al., 2011) como la apoptosis de los timocitos y linfocitos T activos (Perillo et al., 1995; Rabinovich, 1998; Rabinovich et al., 2000) y la regulación de las células reguladoras (linfoides y mieloides) como MDSC, Tregs, Bregs, macrófagos M2 y células dentríticas tolerogénicas (Rabinovich y Toscano, 2009; Kooyk y Rabinovich, 2008; Rabinovich y Liu, 2008; Cummings y Liu, 2009). Además, se ha demostrado que según el tipo de galectina y el contexto celular, estas proteínas pueden influir en la magnitud y la resolución de los procesos inflamatorios adoptando funciones pro- o antiinflamatorias, dirigiendo la polarización de monocitos/macrófagos según la expresión de citoquinas proinflamatorias versus antiinflamatorias (Rabinovich et al., 2004); Por ejemplo, se ha demostrado en diversos modelos experimentales de enfermedades autoinmunes e inflamación crónica, como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y la diabetes experimental, que la administración in vivo de galectina-1 recombinante cambia el pronóstico de la enfermedad promoviendo un perfil de citoquinas antiinflamatorio (Toscano et al., 2007; Pérez et al., 2015; Baum et al., 2003), sin embargo, el silenciamiento del gen galectina- 1 o el bloqueo de la misma mediante anticuerpos promueve el rechazo tumoral en diferentes tipos de cáncer (Martínez-Bosch, et al., 2014; Baker et al., 2014; Rutkowski et al., 2015). Otro ejemplo son los estudios sobre la conversión de las galectinas en autoantígenos que han demostrado que contribuye a la patogenia de las enfermedades autoinmunes y a la oncogénesis (Rabinovich et al., 2004; Liu y Rabinovich, 2005). 89 5.4 LA FUNCIÓN DE LAS GALECTINAS EN LA BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS T REGULADORAS Las células reguladoras son factor clave en el equilibrio entre la activación inmune y la limitación de la respuesta autoinmune. Esta función reguladora está mediada por citocinas (Stowell et al., 2008) y la inhibición de las células T (Cooper et al., 2010). En este mismo contexto, se ha demostrado que la biología de las células Tregs (diferenciación, expansión, estabilidad y actividad inmunosupresora) y sus mediadores están regulados por galectinas como la galectina-1 (Chaudhry y Rudensky, 2013; Baatar et al., 2009), la galectina-3 (Ocklenburg et al., 2006), la galectina-9 (Kared et al., 2013) y la galectina-10 (Kubach et al., 2007), que parecen estar reguladas positivamente en Tregs y pueden influir en su función inmunosupresora (Garín et al., 2006; Baatar et al., 2009; Wang et al., 2009). Otro estudio sobre los efectos de la galectina-8 en SI en modelos de ratón demostró que esta galectina parece inducir las células Tregs e inhibir los linfocitos T citotóxicos y la IL-10 (Sampson et al., 2015). 5.5 LA FUNCIÓN DE LAS GALECTINAS EN LA BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS B Las galectinas también tienen diferentes funciones reguladoras durante la vida de las células B, en relación a su maduración, diferenciación, señalización, tolerancia y supervivencia. Por ejemplo, la galectina-1 está regulada positivamente en las células B de memoria IgM+ y parece atenuar la señalización de las células B maduras (Tabrizi et al., 2009) y la galectina-8 puede aumentar la diferenciación y la supervivencia de las células plasmáticas (Tsai et al., 2008; Anginot et al., 2013). Las otras galectinas han demostrado tener un papel opuesto en la biología de las células plasmáticas; así, la galectina-9 promueve la apoptosis de las células plasmáticas (Moritoki et al., 2013) y galectina-3 intracelular favorece el fenotipo de células B de memoria (Acosta- Rodríguez et al., 2004). 96 IV. MATERIALES Y METODOLOGÍA Tipo de estudio Este trabajo esta desarrollado en el marco del proyecto “Papel de la leptina en el transporte placentario y su implicación en la diabetes gestacional” que ha sido llevado a cabo por el servicio de bioquímica del Hospital Universitario Virgen Macarena en colaboración con el departamento de bioquímica médica e inmunología de la facultad de medicina, entre el mes de enero 2019 y febrero 2024. Se trata de un estudio prospectivo diseñado como una aportación al proyecto en cuestión, con la intención de ampliar los resultados obtenidos en estudios paralelos, en este caso, analizando el efecto de la leptina sobre las células supresoras derivadas de mieloides y los linfocitos T reguladores en placentas de gestantes diagnosticadas de DMG. Para valorarlo, hemos monitorizado el efecto de leptina sobre MDSCs y Treg en DMG mediante citometría de flujo, RT-qPCR y Western blot, como hemos contrastado los posibles efectos de esta proteína mediante el bloqueo de las vías de señalización, además del posible papel de galectina-8 en este proceso. Se han llevado a cabo estudios in vitro de cultivos primarios obtenidas de muestras de sangre periférica de controles sanos. En paralelo, hemos monitorizado las mismas poblaciones celulares presentes en los trofoblastos de placentas control y placentas procedentes de gestantes con DMG. Todas las placentas analizadas son obtenidas de partos por cesaria. Los datos obtenidos de la monitorización por citometría de flujo de las poblaciones MDSCs y Tregs se intentarán relacionar con los factores asociados con la DMG analizando el efecto de leptina y la expresión de galctina-8 en las células DMSCs, y la demostración de su actividad en MDSCs en DMG aportará a un nuevo dato sobre las MDSCs en DMG. 97 Diseño del estudio Se realizó un estudio de cohortes en el que se clasificaron dos grupos: un grupo control considerado como sano y otro grupo formado por mujeres embarazadas diagnosticadas con DMG, con el objetivo de estudiar el perfil de células inmunosupresoras en el grupo considerado como enfermo. Población de estudio Para la realización de este estudio, se analizaron, por un lado, 30 placentas de embarazos a término y 20 placentas de mujeres con diabetes gestacional. Todas de parto no gemelar y cesárea programada. Por otro lado, se analizaron muestras de sangre periférica de 80 controles sanas no embarazadas, 25 embarazadas sanas, 23 embarazadas diagnosticadas de diabetes gestacional y 4 embarazadas después del parto. Debido a la escacés de las muestras de sangre periférica obtenida, se decidió considerar solo los resultados obtenidos del análisis de la sangre periférica de los controles sanos no embarazadas. La extracción de sangre coincidió con la evaluación clínica para poder disponer de los datos clínicos. Aprovechando la extracción de sangre para la prueba de la lactosa, se obtuvieron de cada control 1 tubo de EDTA-K3 con la muestra de sangre periférica aproximadamente 10ml de sangre. Las muestras se trasladaron en frio al laboratorio de bioquímica médica e inmunología de la facultad de medicina para ser procesadas. a) Criterios de inclusión en el estudio ● Tener más de 18 años. ● Todas las pacientes debían leer y firmar el consentimiento manteniendo en todo momento la confidencialidad y el anonimato. 98 b) Criterio de exclusión en el estudio. Se excluyen las pacientes diagnosticadas de alguna enfermedad autoinmune. c) Cohorte sana. La población sana esta formada, por un lado, por un grupo de 30 gestantes sanas que no padecían ninguna enfermedad oncológica conocida y, por otro lado, de un grupo de 20 profesionales sanitarios del Hospital Universitario Virgen Macarena y 10 donantes de sangre periférica. Todos cumplían con las características demográficas y epidemiológicas demandadas según la muestra de pacientes analizada, como sexo y rango de edad. MATERIALES CULTIVO CELULAR: Cultivo primario Nuestro material de trabajo principal es el cultivo primario de trofoblasto y la sangre periférica. El tejido placentario es bastante complicado en su manejo. Tanto la fase de aislamiento de células trofoblásticas como el cultivo en placas. Además, su cultivo requiere un extremo cuidado para evitar su contaminación. Los distintos tipos de células sanguíneas que circulan (glóbulos rojos, glóbulos blancos, plaquetas, etc.) carecen de adheridas a la superficie del frasco de cultivo. Las muestras de sangre periférica provienen de la unidad de enfermería del HUVM. A partir de los viales se obtuvo el cultivo para la realización del trabajo. Al tratarse de un cultivo primario, es necesario el mantenimiento de estas células en las condiciones óptimas para 99 la consecución de la fase experimental. La sangre humana está compuesta de dos partes iguales: plasma y células. Las células sanguíneas incluyen: leucocitos (glóbulos blancos), eritrocitos (glóbulos rojos) y trombocitos (plaquetas). Los leucocitos incluyen linfocitos (linfocitos B y linfocitos T) y monocitos que, junto con otras células, forman la base del sistema inmunitario innato y se denominan: células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Habitualmente, las PBMCs se pueden separar de otros componentes de la sangre por medio de un gradiente de densidad utilizando Ficoll-Paque. Gracias a su viabilidad sencilla y robusta, la centrifugación de gradiente de densidad se usa en gran cantidad de aplicaciones de investigación. Los eritrocitos, los granulocitos y las células muertas pasarán por la capa de Ficoll por tener densidad más elevada que los linfocitos y los monocitos que se acumularán en la barrera gradiente de plasma. Obteniendo poblaciones celulares muy viables e intactas a nivel funcional. En nuestro caso, los leucocitos totales se obtuvieron mediante sedimentación con dextrano (10%) (Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation Supplementum. 1968;97:77–89). Los leucocitos aislados se cultivaron en placas de 6 pocillos durante 24 h a 37º y atmósfera de 5% de CO2, utilizando RPMI-1640 con 10% de FBS (suero bovino fetal). Las muestras se incubaron en ausencia o presencia de leptina (concentración de 10 y 100nM) y las células se analizaron mediante marcaje y citometría de flujo como se describe en los apartados seguientes. No se observó una diferencia significativa entre la incidencia de la contaminación en los cultivos celulares ya que el cultivo celular obtenido utilizando Dextrano era más propenso, aunque en menor medida, a la contaminación. Además, se puede obtener un número mayor de células que permite realizar ensayos funcionales y de reducir el costo económico y el tiempo de la aplicación. 100 MEDIOS DE CULTIVO 1. Medio de cultivo completo Tras varios ensayos, las condiciones óptimas para llevar a cabo los experimentos son: DMEM F-12 basal (500ml) suplementado con: Suero fetal bovino inactivado mediante calor 10% y L-penicilina 100 μU/ml / Estreptomicina 100 μg/ml / L-Glutamina 100 μg/ml. ANTICUERPOS. 2. Los anticuerpos utilizados en los diferentes experimentos son: Anticuerpo primario: Anti-Galectina-8: (Santa Cruz Biotechnology, CA): (Calbiochem). Anticuerpos policlonales de conejo dirigidos contra las formas de Gal-8 y la forma fosforilada de Gal-8, de 45 KDa. Concentración stock 200 μg/ml. a) Western Blot: Anticuerpos secundarios: Están marcados con peroxidasa de rábano. Se utilizan para poder detectar los anticuerpos primarios con el sistema quimioluminiscente de detección. Ambos de Promega Madison WI USA 6082744330 300 μl, Conjugate 1 mg/ml. ● Anti-rabbit IgG HRP: W401B 18428902 ● Anti-mouse IgG HRP: W402B 18434102 b) Inmunohistoquímica: Anticuerpo segundario: kit de detección Vectastain® ABC-HRP (Véctor lab): PK-7800 anti-mouse & Streptavidina-peroxidasa. 101 c) Citometría de flujo: Las muestras de sangre periférica fueron analizadas por citometria de flujo: se le realizó un hemograma y un marcaje celular con anticuerpos monoclonales. Se empleó el citómetro de fujo BD FACSCantoTM II CBD Biosciences, San José, USA) y los resultados fueron analizados con el sofware BD FACSDivaTM CBD Biosciences). 1. Estudio de células supresoras de origen mieloide M-MDSC y G-MDSC. Los anticuerpos monoclonales empleados para el marcaje de MDSCs son: PerCP-CyTM5.5 Mouse Anti-Human CD 45 (Ref:564105; BD PharmingenTM). FITC Mouse Anti-Human CD 14 (Ref: 555397; BD PharmingenTM). APC Mouse Anti-Human CD 15 (Ref: 551376; BD PharmingenTM). PE Mouse Anti-Human CD 33 (Ref: 555450; BD PharmingenTM). PE-CyTM7 Mouse Anti-Human HLA-DR (Ref: 560651; BD PharmingenTM). APC-CyTM7 Rat Anti-CD11b (Ref: 557657; BD PharmingenTM). Los anticuerpos se obtuvieron de Becton Dickinson Immunocytometry Systems (BDIS, San Jose, CA, EE. UU.) La selección de las diferentes subpoblaciones de células supresoras mieloides se obtuvo mediante el gateo secuencial. Para la subpoblación monocítca M-MDSC: CD45+CD33+CD11b+HLA-DR- CD14+CD15- y para la subpoblación granulocítca G-MDSC: CD45+CD33+CD11b+HLA-DR-CD14-CD15+. 102 Figura 15. Caracterización de las células MDSCs, M-MDSC y G-MDSC. Laboratorio de Bioquímica Clínica HUVM. En el gráfico de la izquierda de la figura 15, se representa FSC CForward Scater o dispersión frontal) vs SSC CSide Scater o dispersiin lateral). FSC expresa el tamaño de las células y SSC la complejidad o granulosidad. En este gráfico se seleccionan los granulocitos y los monocitos, y queda una pequeña población (color negro) de linfocitos. En el segundo gráfico, se representa SSC vs CD45, la región es positva para CD45+ (a la derecha del eje: CD45). En el tercer gráfico se representa CD33 vs CD11b de las células CD45+ (las MDSCs son CD33+ y CD11b+) y obtenemos las células CD33+CD11b+CD45+. En el cuarto gráfico representamos HLA-DR vs CD33 del anterior gateo, y se selecciona la población CD33+HLADR-. De este modo caracterizamos la subpoblación CD45+CD33+CD11b+HLA-DR-. En el último gráfico se representa CD14 vs CD15, obteniéndose: las dos poblaciones: M-MDSC (CD45+CD33+CD11b+HLA-DR-CD14+CD15-) y G-MDSC (CD45+CD33+CD11b+HLA-DR-CD14-CD15+). 103 Para calcular el valor absoluto de M-MDSC, se multiplica “eventos de interés/eventos totales” por el valor absoluto de leucocitos. 2. Estudio de linfocitos T reguladores. Para el marcaje de los linfocitos T reguladores se utlizaron el anticuerpo monoclonal Human Regulatory T Cell Cocktail CRef: 560249; BD PharmingenTM). Contene FITC Ant-Human CD4; PE- CyTM7 ant-Human CD25 y Alexa Fluorr 647 ant-Human CD127. Este cocktail no integra el factor de transcripciin FOXP3, considerado como el principal regulador del desarrollo y de la función de esta población celular (Treg). ● Para el procesamiento de las muestras de cultivo primario por citometría de flujo también se emplearon los siguientes reactivos: ● Sheath Fluid (Ref: 342003; BD FACSTM). ● Lysing Solution 10X Concentrate (Ref: 349202; BD FACSTM). Figura 16. Caracterización de linfocitos Treguladores. Laboratorio de Bioquímica Clínica H.U.Virgen Macarena. 104 En la figura 16, se repreenta la caracterización de los linfocitos Tregs, en el primer gráfico se representa FSC vs SSC obteniendo tres poblaciones diferentes, en la parte inferior izquierda observamos células pequeñas de poca granulosidad, son linfocitos (color azul), los Treg aparecen en esta región, en la región inferior abajo derecha, estas células son de mayor tamaño y poca granulosidad, son monocitos (color verde) y la nube de la región superior de SSC, que tiene mayor granulosidad, son los granulocitos (color negro). En el segundo gráfico, se representa SSC vs CD4 y se selecciona la población Treg en la parte inferior derecha (color azul). El último gráfico representa CD127 vs CD25, la región azul corresponde a la subpoblación CD25+ y CD127-, los linfocitos Treg. Para calcular el recuento absoluto de Treg multplicamos el número de eventos de interés/eventos totales” por el recuento absoluto leucocitos que obtenemos del hemograma. DISOLUCIONES TAMPÓN. ● Tampón PBS Se utiliza en el lavado de células y de las muestras de tejido placentario. Fosfato dibásico de sodio 8.1 mM, pH 7.5/ Fosfato monobásico de potasio 1.5 mM /Cloruro sódico 137 mM / Cloruro potásico 2.7 Mm 105 ● Tampón para la eletroforesis en gel de poliacrilamida “running buffer” Se prepara una disolución stock 10 veces más concentrada de la que tomamos la cantidad de 50 ml en el momento de su uso para preparar 500 ml que se necesitan para realizar la electroforesis. El pH se ajusta a 8.3 Tris Base 14.5 g / Glicina 72 g / SDS 5 g / Agua c.s.p. 500 ml. Se utilizaron geles de poliacrilamida preparados en 8-16% ● Tampón para la transferencia de las proteínas del gel de poliacrilamida. Se prepara una disolución stock 25 veces más concentrada de la que se toman 10 ml para diluir hasta 250 ml que se utilizan. Lllevar a pH = 8.3 Tris Base 18.150 g / Glicina 90 g / Agua destilada c.s.p. 500 ml ● Tampón TBS-T Este tampón es isotónico y posee características similares a las del PBS. El detergente Tween-20 presente en el mismo facilita su función de lavado, mejorando la unión específica de los anticuerpos frente a la unión inespecífica en los experimentos de inmunodetección. 50 ml NaCl 3M / 20 ml Tris HCl 1 M / 5 ml Tris Base1M / 500 μl Tween-20 0.05 % v/v / Agua destilada c.s.p. 1000 ml. Ajustar a pH=7.5 112 3. Tras este tiempo de incubación, se trabaja a 4 ºC. Se lavan las células con PBS frío, se recoge en un eppendorf y se le añade 400l de tampón de lisis frío y con. Posteriormente ese lisado se deja un mínimo de 30 minutos a 4ºC en rotación constante para que se produzca la solubilización de las proteínas. 4. Las muestras se centrifugan a 4 ºC durante 20 minutos a 13000 r.p.m. 5. El sobrenadante se traspasa a otro eppendorf. Retiramos una pequeña alícuota de 20 μl que emplearemos para la normalización de la concentración de proteínas. 6. La concentración de proteínas se determina por un kit de reactivos “Micro BCA Protein Assay Reagent Kit” (Pierce, Rockford, IL). Es un kit altamente sensible para la determinación colorimétrica cuantitativa del contenido proteico total en soluciones acuosas diluidas. Se utiliza el ácido bicinconínico (BCA) como reactivo de detección para el Cu+, formado cuando el Cu+2 se reduce por la proteína en un ambiente alcalino. El producto morado se forma por quelación de dos moléculas de BCA con una de Cu+. Este complejo soluble en agua tiene una absorbancia a 562 nm que es lineal con el aumento de la concentración de la proteína. La estructura macromolecular de la proteína junto con la presencia de cuatro aminoácidos (Cys, cistina, Tyr y Trp) en las proteínas son los responsables de la formación del color con el BCA tras la reacción. Se prepara una curva standard siendo el blanco el buffer de lisis (diluyente). Se sigue el protocolo que marca la casa comercial. 7. Tras la normalización de la cantidad de proteína se separa un volumen pequeño del lisado de células, alrededor de 100 µl, a otro tubo de eppendorf al que se le añade unos 30 µl de tampón-SDS de desnaturalización 5X con DTT 100 mM, o tampón de carga de electroforesis. 8. El lisado se desnaturaliza en el termobloque a 95 ºC durante 5’. Se deja enfriar, para su posterior análisis en electroforesis de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) 9. El contenido del gel se transfiere a una membrana de nitrocelulosa, mediante un sistema semi-seco a 30-35 V. 113 10. Para bloquear la unión inespecífica de los anticuerpos, la membrana se incuba a temperatura ambiente (25ºC) y durante 30 minutos con leche descremada en polvo al 5% en TBS-T, con agitación suave (velocidad lenta). Transcurridos los 30 minutos, la membrana se lava con TBS-T cuatro veces, retirando el TBS-T después de cada uno de los lavados. Los lavados de la membrana se realizan con agitación también y a mayor velocidad. En este momento se puede detener el proceso dejando la membrana en estas condiciones a 4ºC, en leche o ya en TBS-T, hasta el día siguiente. 11. La membrana se incuba con el anticuerpo primario correspondiente durante toda la noche (a diluciones generalmente 1:1000) en TBS-T en agitación a velocidad lenta. Se lava cuatro veces durante 5 minutos con TBS-T. 12. Se incuba la membrana con el anticuerpo secundario anti-IgG unido a peroxidasa de rábano a una dilución 1:10000. Se lava 4 veces con TBS-T. 13. Por último, se revela la membrana. La peroxidasa de rábano se visualiza revelando la membrana mediante un sistema de quimioluminiscencia altamente sensible, empleando los kits “Super SignalR West Femto Máximum Sensitivity Substrate”. 2. Análisis por RT-qPCR Extracción de RNA con TRIsure: 1. Recoger la muestra y lavar con cuidado con 1,5 ml de PBS frío en un eppendorf. Colocar en hielo durante el proceso. 2. Añadir 1 ml de TRIsure (a 4ºC). 3. Guardar los viales a -80ºC O/N (o más tiempo). 4. Descongelar los viales en hielo, romper el tejido, centrifugar a 12000g y recoger el sobrenadante y preparar la centrífuga a 4ºC. 5. Incubar 5 minutos a temperatura ambiente (RT). 114 6. Añadir 200 ul de cloroformo por cada ml de TRIsure empleado en la extracción. 7. Cerrar los tubos y agitar en las manos vigorosamente durante 15 segundos. 8. Incubar las muestras durante 3 minutos a RT. 9. Centrifugar las muestras a 12000 g durante 15 minutos (ó a 2600 g durante 30 minutos) a 4ºC. 10. Transferir la fase acuosa a un nuevo eppendorf con cuidado de no tocar la interfase (unos 490-500 ul aproximadamente). 11. Añadir 1 volumen de isopropanol (500 ul cuando hemos utilizado 1 ml de TRIsure) e incubar las muestras 10 minutos a RT. 12. Centrifugar a 12000 g durante 10 minutos (ó a 2600 g durante 30 minutos) a 4ºC. Tener en cuenta la posición del tubo para ver el pellet. 13. Descartar el sobrenadante y lavar con 1 ml de etanol 75% (para 1 ml de TRIsure empleado). Mezclar bien en vórtex o con el dedo y centrifugar a 7500 g durante 5 minutos a 4ºC. 14. Retirar el sobrenadante y dejar secar el pellet. Resuspender pipeteando el RNA en agua DEPC (unos 20-50 ul en función de la cantidad de células del pocillo). 15. Cuantificar el RNA en el NanoDrop, utilizando como blanco la alícuota del agua DEPC usada para resuspender las muestras. 16. Si están muy concentradas, hacer una dilución para dejarlas aproximadamente a 500 ng/ul para la retrotranscripción. Retrotranscripción (Kit PrimeScript RT Reagent Kit, TAKARA): Descongelar los reactivos en hielo. Preparar una MasterMix de estos reactivos en función del número de muestras que vayamos a utilizar. Para cada reacción hay que añadir 5 ul de la MasterMix, que contiene: Reactivo 1 (5X PrimeScript Buffer) 2 ul Reactivo 2 (PrimeScript RT Enzyme Mix) 0,5 ul Reactivo 3 (Oligo dT Primer) 0,5 ul Reactivo 4 (Random 6 mers) 2 ul 115 En un volumen de reacción total de 10 ul se pueden retrotranscribir hasta 500 ng de RNA total. Por ello, preparamos las muestras con 500 ng de RNA y completamos hasta 5 ul con RNase Free dH2O (Reactivo 5). Le añadimos los 5 ul de la Master Mix y colocamos las muestras en el termociclador. q-PCR (Kit TB Green Premix Ex Taq, Tli RNase H Plus, TAKARA): Descongelar en hielo los reactivos del kit y los primers específicos (10 uM, dilución 1:10 del stock). Preparar una MasterMix de estos reactivos para cada pareja de primers en función del número de muestras que vayamos a utilizar (tener en cuenta los triplicados y los blancos, con agua en lugar de muestra). Para cada reacción hay que añadir 14 ul de la MasterMix, que contiene: - TB Green Premix Ex Taq 8 ul - PCR Forward Primer (10 uM) 0,5 ul - PCR Reverse Primer (10 uM) 0,5 ul - ROX Reference Dye 0,32 ul - DEPC water 4,68 ul Diseñar la placa de 96-wells y añadir 14 ul de MasterMix (específico para cada gen estudiado) y 1 ul de cDNA. Colocar la placa en el termociclador, diseñar el experimento y comenzar el protocolo. o Galectina-8 sense GTT GTC CTT AAA CAA CCT ACA G o Galectina-8 antisense TAA CGA CGA CAG TTC GTC CAG o Ciclofilina B sense 5´-CTT CCC CGA GAA ATT CA-3´ o Ciclofilina B antisense 5´-TCT TGG TGC TCT CCA CCT TC-3´ 116 3. Citometría de flujo Preparación de la muestra para ser analizada por citometría de flujo: Placentas: Por cada determinación, se recogieron las placentas de embarazos a término con parto no gemelar y las placentas de mujeres con diabetes gestacional. Tras obtener muestras de trofoblasto se cortaron con tijeras en pequeños trozos y se filtraron con gasa doble: Las células fueron incubadas con anticuerpos frente a diferentes marcadores celulares marcados con fluoróforos para análisis por citometría de flujo de las MDSCs (CD45+, CD33+, CD11b+, HLA.DR-, CD14+ y CD15+), tanto monocíticas (M-MDSC) CD14+ como granulocíticas (G-MDSC) CD15+. El total de leucocitos se definió por el número de CD45+. El análisis de la significancia de las diferencias se llevó a cabo por una prueba de ANOVA seguido de Bonferroni. Por otra parte, se ha procesado y analizado cuatro tubos EDTA-K3 de sangre periférica por cada determinación.  Procesamiento del trofoblasto. Las placentas pertenecían a donantes sanas o con DMG dadas a luz por cesárea en el Hospital Universitario Virgen Macarena. La edad de la madre en el momento del parto (23,0 años+ 9) y el peso del recién nacido (3040g+70), el peso medio de la placenta (400g+90). La edad gestacional (39,5 semanas+0,7). Después de la cesárea, las placentas se transportaron de inmediato en hielo y suero fisiológico al laboratorio donde se lavaron varias veces con PBS1x para eliminar el exceso de sangre. Se tomaron muestras del tejido libre de infarto visible, hematoma o calcificación de al menos siete cotiledones a una distancia intermedia entre las placas coriónicas y basal. Estas partes centrales de los cotiledones se lavaron varias veces con PBS1x para eliminar la sangre antes de tratarlas para obtener cultivo primario. 117 Para la segregación celular de trofoblastos de placenta humana, partiendo del tratamiento mecánico mediante tijeras quirúrgicas, se trituraron los trofoblastos luego se filtraron los restos de tejido con gazas estériles y se centrifugó el sobrenadante a 1200 rpm durante 5 min. Se desechó el sobrenadante y se analizó el pellet mediante citometría de flujo siguiendo el protocolo habitual. Otro método eficaz para la segregación celular del trofoblasto es el método enzimático mediante la combinación de dos soluciones de colagenasa tipo I (1mg/ml) y colagenasa IV (10mg/ul) a (1:1). 1- Se pesa la colagenasa en PBS colagenasa tipo I (1mg/ml) y colagenasa IV (10mg/ul) a (1:1), y se filtra (No se requiere esterilidad) 2- Se incuban los trofoblastos desmenuzados en la solución de colagenasa en baño a 37º C con agitación durante 30-45min 3- Se neutraliza la colagenasa con (PBD+FBS 5%) a (1:2). 4- Filtrar con gasas y lavar las gasas con PBS. 5- Centrifugar a 350g durante 10´ Se obtuvieron una serie de suspensiones celulares, aunque durante el proceso experimental se presentaron inconvenientes, se logró implementar un protocolo combinado colagenasa tipo I y IV, a partir del cual se pudo obtener el mayor número de células vivas posibles. Sin embargo, se optó por el método mecánico debido a su eficacia y para reducir gastos. 118 Sangre periférica: Preparación del cultivo primario a partir de sangre periférica. La obtención del cultivo primario se inicia por extracción de sangre por parte del personal de enfermería del HUVM. Se transporta la muestra, unos 10-40ml, en frio hasta el laboratorio para su procesado inmediato que se lleva a cabo en el departamento de bioquímica molecular e inmunología de la facultad de medicina donde, manipulando siempre las muestras en campanas de flujo laminar, se procedía las células totales de la sangre, sometiéndola a una digestión de 60min con Dextrano 10% (675ul /10ml de sangre). (Accelerar la disolución del polisacárido en una estufa a 60ºC y filtrar en esterilidad. Llevar a temperatura ambiente). Posteriormente recogíamos el sobrenadante que centrifugamos a 1000 rpm a 4° C durante 15 minutos. Un requisito esencial es realizar el procedimiento con un mínimo de vibración para evitar que las fases se mezclen evitando agitar el contenido de los tubos y desactivado el freno de la centrífuga. Se retira el sobrenadante de y era lavado dos veces con 5ml de PBS 1x y centrifugado a 400rpm. El cultivo primario se realizó en 4300ul de medio RPMI 1640 con suero bovino fetal al 10 %, penicilina/estreptomicina al 1 %. Se añade 1ml cultivo/pocillo en placas de 24 pocillos (n = 4 pocillos por muestra) y se conserva el resto de cultivo para realizar las medidas basales de MDSCs y Tregs (50ul/tubo). El tiempo "cero" fue el momento de la siembra. Todos los pocillos se dejaron durante 24 horas a 37º y atmósfera de 5% de CO2, utilizando RPMI-1640 con 10% de FBS (suero bovino fetal) antes de tomar una alicuota (50ulx2) de cada pocillo para monitorizar las dos poblaciones celulares por citometría de flujo. Durante los días siguientes. En el microscopio de contraste de fases se vigilaba diariamente el cultivo de las células, Se procedía a "levantar" las células de la superficie del pocillo de la placa de cultivo resuspendiendo bien antes de tomar una alicuota de 50ul que pasamos por el citómetro de flujo. La población MDSC se puede caracterizar por citometría de fujo como CD45+CD3-CD19-CD20-CD56-CD16- HLADR-CD33+CD11b+ y los marcadores del linaje monocítico y granulocítico CD14+ y CD15+ respectvamente (Bronte V. et all.,2015; Gabrilovich, 2017). 119 Prueba de viabilidad y determinación de rendimiento. 1. Analizar las células usando un contador celular automático. 2. Determinar la viabilidad y el rendimiento. Procedimiento: Se realizaron cinco análisis por ensayo mediante citometría de flujo para cada muestra de cultivo primario de sangre periférica (basal y 24h tras la inducción), y uno para cada placenta. El protocolo aplicado en el procesado de las muestras fue el protocolo rutinario empleado en el Laboratorio de Citometría de Flujo del Servicio de Bioquímica Clínica del Hospital Universitario Virgen Macarena. 1. Marcar los tubos de ensayo necesarios según el número de análisis pertinente 2. Por cada análisis, pipetear 50 μL de muestra en el tubo de ensayo correspondiente. 3. Añadir 5 μL de mezcla de anticuerpos monoclonales correspondiente al análisis de MDSCs y 3,5ul de mezcla de anticuerpos monoclonales correspondiente al análisis de Treg. 4. Agitar en vortex luego incubar 15 minutos en oscuridad. 5. Añadir en cada tubo de ensayo 1 mL de BD FACSTM Lysing Solution 10X Concentrate para lisar los eritrocitos. 6. Agitar en vortex luego incubar 3 minutos en oscuridad. 7. Adquirir 100.000 eventos en el citómetrodeflujo en caso de cultivo primario de sangre periférica y 106 eventos en casos de cultivo primario de placenta. 120 4. Inmunohistoquímica en muestras de trofoblasto incluidas en parafina Se tomo una muestra representativa de trofoblasto y se sumergió varias veces en tampón fosfato salino (PBS) para retirar restos de sangre antes de su inmersión y fijación en formaldehido al 4% para su posterior inclusión en parafina. Se realizaron cortes de 4 µm representativos de cada muestra. a) Para el estudio histopatológico de las secciones obtenidas, se tiñeron con hematoxilina & Eosina. Procedimiento: - Hematoxilina: colorante que tiñe componentes ácidos en tonos azul y púrpura (núcleos). - Eosina: colorante ácido que tiñe de rosa las estructuras básicas (citoplasma). ▪ Se incubación las muestras a 60ºC durante 1.5h. ▪ Se realizaron dos lavados de Xilol durante 10 minutos ▪ Se rehidrataron las muestras en alcoholes de concentraciones descendentes (100% x2, 100%, 90%, 70%) durante 30´, seguidos de lavados en agua corriente. ▪ Se sumergieron las muestras en hematoxilina de Harris durante 2 min. Posteriormente se lavaron con agua. ▪ Se diferenciaron las muestras con alcohol-ácido durante 15 segundos: 2 gotas de HCl 0.1% (10 µl HCl 37% en 50ml H2Od) en 200 ml EtOH 70% de ▪ Se lavaron las muestras con agua corriente y carbonato de litio para virar de color. 121 ▪ Se lavaron las muestras con agua corriente y se sumergieron en eosina durante 2 minutos antes de lavar y ▪ Finalmente, se volvieron a deshidratar con alcoholes en concentraciones ascendentes (90% x2, 100% x2) seguidos de dos baños en Xileno de 30 segundos. b) Tinciones inmunohistoquímicas Se realizaron las tinciones sobre las secciones de bloques de tejido de áreas representativas delimitadas en parafina. Se realizaron los cortes en un microtomo de rotación Shandon AS325 (Anglia Scientific Inst LTD. Cambridge. UK) y un portaobjetos Gap microscope slides (DakoCytomation. Dinamarca). Procedimiento: A) DESPARAFINACIÓN E HIDRATACIÓN DE LAS MUESTRAS. El desparafinado se realiza por calentamiento en estufa a 37ºC y se completa colocando el portaobjetos con los cortes de parafina en una cuna de cristal y sumergirlos en una cubeta con xilol durante 10´-15´. Se repite este paso en otra cubeta con Xilol. La rehidratación se realiza sumergiendo los cortes, sucesivamente, en una batería de cubetas con alcoholes de concentraciones decrecientes (100%, 90%, 80, 70%). En cada cubeta debe estar 5´o 25 inmersiones continuas. Una vez concluido la inmersión sumergir en agua destilada 5´. B) RECUPEARACIÓN DEL ANTÍGENO. Se realiza un pretratamiento en tampón EDTA-pH 9.0, durante 20 min a 96°C, con un equipo PTLink (Dako Glostrup). 128 Parece que la leptina 10nM ejerce un efecto apoptótico sobre la población MDSCs. No obstante, parece que la subpoblación G-MDSC reacciona de forma más discreta a la leptina y muestra un comportamiento diferente al observado en las M-MDSC (por lo que esta subpoblación G-MDSC fue analizada por separado en los experimentos de control de inhibición farmacológica posteriores). Se observó que a medida que aumenta la concentración de leptina, disminuye el número de células MDSCs y Tregs. El efecto máximo se observó para una concentración de leptina de 10nM, que produce un descenso mayor en el número de células observado en las condiciones control. 3. LA ESXPRESIÓN DE GALECTINA-8 ES SIGNIFICAMENTE SUPERIOR EN PLACENTA EN DIABETES GESTACIONA Para ampliar el conocimiento del efecto de la leptina sobre las células MDSCs, comparamos la expresión de galectina-8 (una galectina proinflamatoria expresada en MDSCs) en placentas sanas y en placentas patológicas (diabetes gestacional) mediante RT-PCR, obteniendo los resultados siguientes: 129 Figura 3. La placenta diabética expresa niveles superiores de galectina-8 que la placenta sana. La placenta diabética expresa niveles significativamente superiores de galectina- 8 que la placenta sana. TINCIÓN H-E E INMUNOHISTOQUÍMICA Para corroborar los resultados de RT-qPCR, analizamos la expresión de galectina-8 en tejido trofoblástico placentario mediante la técnica de inmunohistoquímica. a. Tinción Hematoxilina-Eosina Con el objetivo de identificar diferentes tipos celulares y tejidos placentarios y obtener información sobre las características, la forma y la estructura celular y de tejido en placentas sanas y patológicas, se realizaron tinciones con Hematoxilina y Eosina. 130 Figura 4. Tinción Himatoxilina-Eosina de trofoblastos de placenta control y patológica (DG). A partir de la tinción Himatoxilina-Eosina, se observa que la placenta diabética muestra arterias fetales dilatadas y mayor densidad de fibrinas. b. Inmunohistoquímica Determinamos la expresión de galectina-8 en placenta normales y en placentas de gestantes diagnosticadas con diabetes gestacional. 131 Figura 5. Expresión de galctina-8 en placenta sana y en diabetes gestacional. CN: Control negativo (A y E), PN: Placenta sana (B, C y D) y PD: Placenta en diabetes gestacional (F, G y H). Según el análisis histoinmunoquímico, la placenta sana expresa niveles considerables de galectina-8, sin embargo, en diabetes gestacional, se observa que la placenta sobre expresa esta proteína en niveles superiores especialmente en sincitiotrofoblasto. Concluimos pues, que la expresión de galectina-8 depende del tipo celular, y es variable dentro del mismo tipo celular, lo que apunta a un tipo de regulación fina dependiendo del contexto extracelular. 132 4. LA LEPTINA A BAJA DOSIS ESTIMULA LA ESXPRESIÓN DE GALECTINA-8 EN EL TROFOBLÁSTICO PLACENTARIO. Con el fin de estudiar el efecto directo de la leptina sobre la expresión de galectina-8 en placenta, se desarrollaron experimentos de dosis-respuesta sobre el tejido trofoblástico en medio de cultivo al 10% de suero y se estimuló con distintas concentraciones de leptina (0-10 nM) humana y se analizaron tras 24h, por una parte, se estudió la expresión de galectina-8 mediante Western-blot y RT-PCR en placentas sanas, y mediante RT-PCR en placenta en diabetes gestacional. Posteriormente se compararon los resultados obtenidos observando un aumento significativo de la expresión de galectina-8 en las placentas patológicas. Figura 6. Expresión de galectina-8 en placenta control. La leptina estimula la expresión de galectina-8 en trofoblasto de placenta sana * diferencias estadisticamente significativas con respecto a los niveles basales (p≤0,05). Se observa un aumento de la expresión de galectina-8 según la concentración de leptina empleada en el estímulo del trofoblasto, alcanzando su máximo en la concentración 10nM con respecto a los valores basales. 133 Figura 7. Expresión de galectina-8 en placenta en diabetes gestacional. (*) diferencias estadisticamente significativas con respecto a los niveles basales (p≤0,05). Se observa un aumento de la expresión de galectina-8 dependiendo de la concentración de leptina estimulante (Figura 2). En este caso, una concentración mínima de la proteína (0,1nM) consiguió un efecto máximo en la expresión de galesctina-8 con diferencias estadisticamente significativas con respecto a los valores basales, y un efecto reverso a partir de concentraciones superiores a esta (1nM y 10nM). Observamos en placentas sanas que la dosis 10nM de leptina estimula la máxima respuesta, aunque la dosis 0,1nM de leptina fue suficiente para observar activación significativa a nivel nuclear. Debido a que la placenta diabética sobreexpresa la leptina, la máxima respuesta al estímulo con esta proteína se consigue con dosis mínimas de la misma (0,1nM) y se observa el efecto contrario (respuesta disminuida) también con dosis mucho inferiores (1nM) a las requeridas en el caso de placenta sana (> 10nM). Concluimos que la leptina a baja dosis estimula la síntesis de galectina-8 y a dosis altas la inhibe. 134 5. VÍAS DE ACCIÓN DE LEPTINA EN DMSCs. INHIBICIÓN FARMACOLÓGICA MEDIANTE WORTAMANINA Y PD. Habíamos demostrado que la leptina promueve la muerte de las células MDSCs. Con la finalidad de apoyar y evaluar la credibilidad de los resultados de los experimentos previos, diseñamos experimentos de inhibición farmacológica para identificar la vía de señalización por la que la leptina actúa sobre MDSCs. Se utilizaron dos inhibidores farmacológicos: un inhibidor de la vía MAPK a nivel de MEK, PD980059, y un inhibidor de la vía PI3K quinasa, Wortmanina en cultivo primario de sangre periférica en 10% de suero. Las células se cultivaron en ausencia o presencia de leptina (10nM) con los inhibidores farmacológicos durante 24 horas a 37 ºC y 5% de CO2. Como control negativo se empleó el cultivo de estas en presencia de suero (SFB 10%). Los inhibidores farmacológicos se añadieron a los pocillos correspondientes 30 minutos antes de añadirles la dosis de leptina. De nuevo, mediante citometría de flujo, medimos los eventos. Como habíamos comprobado anteriormente, la leptina (10 nM) promueve la muerte de las células MDSCs. Estos niveles descienden aún más con el inhibidor de la vía MAPK: PD98059. Sin embargo, el efecto de la leptina en la incorporación de PD98059 fue casi nulo, lo que significa que la leptina no está actuando tras la incorporación de este inhibidor. Por tanto, la leptina estaría actuando por la vía MAPK. De nuevo, la exclusión de la subpoblación granulocítica G-MDSCs de los datos influyo de forma significativa en los resultados. 135 Figura 8. La leptina no actúa sobre las células MDSCs en presencia del inhibidor de la vía MAPK (PD98059). Las células MDSCs obtenidas de sangre periférica de controles sano se incubaron en 10% de suero con el inhibidor farmacológico y leptina 10 nM a 37 ºC durante 24 horas. El inhibidor farmacológico PD98059 (100 µM) fue añadido 30 minutos antes de la adición de la dosis de leptina. Como control, se emplearon células incubadas a 37ºC en presencia de suero (SFB 10%). Mediante la citometría de flujo medimos el recuento celular en cada caso. Analizando los resultados, parece no afectarse la proliferación de las células MDSCs, en presencia del inhibidor Wortmanina. Por lo tanto, la vía PI3K podría no estar implicada en este proceso ya que la leptina no actúa por la vía PI3K. 136 Figura 9. Aumento del porcentaje de apoptosis celular de MDSCs en cultivo en presencia del inhibidor Wortmanina. Las células MDSCs obtenidas de sangre periférica de controles sanos se incubaron en medio al 10% de suero a 37 ºC durante 24 horas en cuatro condiciones diferentes: a) condición control, b) 10 nM leptina, c) wortmanina y d) leptina a 10 nM junto con el inhibidor farmacológico. El inhibidor farmacológico wortmanina (50 µM) se añadio 30 minutos antes de la adición de la dosis de leptina. Como control, se emplearon células incubadas a 37ºC en presencia de suero (SFB 10%). Mediante la citometría de flujo medimos el recuento celular en cada caso. Como puede observarse en la fig.10, el bloqueo de la vía PI3K por Wortmanina no impidió el efecto apoptótico de la leptina, mientras que el bloqueo de la vía MAPK por PD98059 sí blogueó dicho efecto (fig. 9). Por tanto, el efecto apoptótico de la leptina en las células MDSCs, en medio con 10% de suero, se realiza por medio de la activación de la vía MAPK. Sin embargo, la vía PI3K no parece necesaria para mediar el efecto trófico de la leptina en las células MDSCs. 137 VI. DISCUSIÓN La diabetes gestacional se asocia con un ambiente inflamatorio en la placenta que puede participar en la fisiopatología de la enfermedad, incluido el sobrecrecimiento placentario, lo que facilita la macrosomía fetal. Las células MDSCs son células del sistema inmunológico innato que inhiben a las células T, y que se acumulan en placenta y están aumentadas en la sangre del cordón. Al igual que ocurre con otras poblaciones de células como macrófagos, células dendríticas y células T reguladoras, los mecanismos de supresión de las MDSCs varían según las condiciones patológicas, lo que sugiere que las MDSCs utilizan diferentes mecanismos según estas condiciones. En cualquier caso, las MDSCs participarían en el estado inmunosupresor de la placenta que contribuye a evitar el rechazo del feto por la madre. Los datos bibliográficos sugieren que las alteraciones en los niveles adecuados de distintas proteínas involucradas en diversos procesos celulares placentarios pueden contribuir potencialmente al desarrollo de las patologías del embarazo como la DMG, siendo la leptina y la galectina-8 posibles factores que contribuyan al desarrollo o al mantenimiento de las alteraciones en este sistema evadiendo la respuesta inmune. Por lo tanto, la posible diferencia en la expresión del gen de galectina-8 en el trofoblasto placentario sano en comparación con el mismo tejido patológico, serviría para aclarar si el reclutamiento de las subpoblaciones reguladoras como MDSCs y Tregs tienen efectos importantes en la progresión del embarazo y la modulación del SI materno, especialmente, en DG, o si simplemente es la consecuencia de una pérdida generalizada de la regulación en los niveles normales proteicos en el trofoblasto asociados a la DMG. Con el objetivo de comprender mejor el tipo de ambiente inmunológico que la DMG produce en la placenta, planteamos comparar el reclutamiento de las células MDSCs en placentas sanas y placentas de mujeres diagnosticadas de DMG. Partiendo del hecho de que la DMG está asociada a un ambiente inflamatorio que podría traducirse en una disminución de los efectos de inmunosupresión de las MDSCs, se esperaba que el ambiente placentario inflamatorio y los niveles altos de leptina en la 144 Baker, G. J., Chockley, P., Yadav, V. N., Doherty, R., Ritt, M., Sivaramakrishnan, S., Castro, M. G., & Lowenstein, P. R. (2014). Natural killer cells eradicate galectin-1– deficient glioma in the absence of adaptive immunity. Cancer Research, 74(18), 5079– 5090. Baksu, A., Ozkan, A., Goker, N., Baksu, B., & Uluocak, A. (2005). Serum leptin levels in preeclamptic pregnant women: relationship to thyroid-stimulating hormone, body mass index, and proteinuria. American Journal of Perinatology, 161–164. Ball, J., Archer, S., & Ward, S. (2014). PI3K inhibitors as potential therapeutics for autoimmune disease. Drug Discovery Today, 19(8), 1195–1199. Banks, A. S., Davis, S. M., Bates, S. H., & Myers, M. G. (2000). 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