Caracterización química y bioactividad de compuestos producidos por levaduras y derivados de la vid.

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA DEPARTAMENTO DE NUTRICIÓN Y BROMATOLOGÍA, TOXICOLOGÍA Y MEDICINA LEGAL CARACTERIZACIÓN QUÍMICA Y BIOACTIVIDAD DE COMPUESTOS PRODUCIDOS POR LEVADURAS Y DERIVADOS DE LA VID Memoria presentada por el licenciado EDWIN FERNÁNDEZ CRUZ para optar el Título de Doctor por la Universidad de Sevilla con la mención de “Doctor Internacional” Sevilla, Septiembre 2018 2 A mis Padres A Félix 3 “El mayor error que una persona puede cometer es tener miedo de cometer un error” Elbert Hubbard “The greatest mistake you can make in life is to be continually fearing you will make one” Elbert Hubbard 4 Agradecimientos Edwin Fernández Cruz agradece al Ministerio de Educación, Cultura y Deporte del Gobierno de España por la concesión del Contrato Predoctoral para la Formación de Profesorado Universitario (FPU) y por la ayuda de movilidad internacional para la realización de estancias breves con el objeto de obtener la Mención Internacional del Título de Doctor. Esta Tesis Doctoral ha sido realizada gracias a la financiación de los siguientes proyectos de investigación:  Caracterización Química y Bioactividad de Compuestos Derivados de Aminoácidos Aromáticos Relacionados con el Metabolismo de Levaduras (AGL2013-47300-C3-2-R) otorgado por el Ministerio de Economía y Competitividad (Investigadoras Principales: Dra. Mª Carmen García Parrilla y Dra. Ana Mª Troncoso González).  Análisis Metabolómico y Evaluación de la Bioactividad de Compuestos Producidos por Levaduras Presentes en Alimentos (AGL2016-77505-C3-2-R) otorgado por el Ministerio de Economía y Competitividad (Investigadoras Principales: Dra. Mª Carmen García Parrilla y Dra. Ana Mª Troncoso González).  Investigación e Innovación Tecnológica en Vitivinicultura (PP.AVA.AVA201601.03) otorgado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) al Instituto de Investigación y Formación Agraria y Pesquera (IFAPA, Consejería de Agricultura, Pesca y Desarrollo Rural, Junta de Andalucía) (Investigador principal: Dr. José Manuel Moreno Rojas). El doctorando también agradece al Departamento de Biotecnología de los Alimentos del Instituto de Agroquímica y Tecnología de los Alimentos (IATA) de Paterma (Valencia) y al Departamento de Química de la Universidad de Aveiro (Portugal) por la acogida recibida durante las estancias predoctorales realizadas durante la tesis. Asimismo, esta Tesis ha podido llevarse a cabo gracias a las instalaciones del Centro Andaluz de Biología del Desarrollo (CABD), de los Servicios Generales de la Universidad de Sevilla (CITIUS) y del Área de Tecnología, Postcosecha e Industria Agroalimentaria del Centro Rancho de la Merced (IFAPA). 5 Agradecimientos personales No es sencillo sentarme y escribir esto sin sentir miles de pellizcos en el corazón. Desde el 3 de octubre de 2013, cuando puse mi primer pie en el laboratorio de Nutrición y Bromatología, jamás me imaginé todo el recorrido que me esperaba. En primer lugar, quiero agradecer de corazón la acogida que me dieron mis 3 directoras de tesis, Marícarmen García Parrilla, Ana Troncoso y Ana Belén Cerezo. Ellas saben bien lo descarriado que puedo ser, y aun con todo, han estado siempre que las he necesitado. La gran dosis de paciencia y dedicación con la que me han obsequiado, su tiempo y sus consejos son algo que me ha hecho crecer como persona y como científico. Sin su profesionalidad y su calidad humana, esta tesis no habría sido lo mismo. Maricarmen, tú has sido mi faro en este proyecto. Me has sabido dirigir excepcionalmente, mostrándome tanto tu profesionalidad como tu cercanía. No puedo expresarte mi agradecimiento con palabras, porque se queda corto. Has sido casi una madre para mí en el laboratorio. Ana, tengo que agradecerte todos los consejos que me has dado. Tú has sido quien me ha enseñado a sacar lo mejor de mí mismo, a luchar en este mundo científico tan complicado y a no dejarme avasallar ante las adversidades. Solo espero algún día poder ser un gran científico y una gran persona como eres tú. Y Ana Belén, ¿qué puedo decir de ti? Que has sido mi salvavidas en esta tesis. Solo puedo sentir orgullo al tenerte como mi directora, por todas las horas que me has dedicado, por todo el tiempo en el que, pudiendo estar con tu hija, has estado conmigo, enseñándome y animándome. Tu tiempo, tu profesionalidad y tu paciencia no están pagadas con nada. Solo espero que un día mires atrás y te sientas orgullosa de tu primer doctorando dirigido. Doy las gracias a todos mis compañeros de batalla en el laboratorio. A José Luis, por ser el primero que me recibió. Gracias por tu paciencia en las primeras semanas, por enseñarme y por brindarme tu confianza. ¡Se te echa de menos por aquí! A María Antonia por ser mi compañera para todo. Por esas charlas en la cafetería, por esos días en la UPO, por esas luchas en el masas… Por estar ahí siempre. A Ruth, por reencontrarme con ella años después de habernos conocido y por convertirse en una amiga, por apoyarme sacarme a flote cuando he estado a punto de tirar la toalla. A Marta, por ser ella misma, por transmitirme esa luz tan brillante que tiene por dentro y por sonreírme a todas horas, haciendo que inevitablemente yo sonría. Sé que contigo me llevo una amiga de verdad. A Rocio y Pilar, del vinegar team, por sus risas, su buen humor y su compañía en esas tardes eternas con el ordenador. No sabéis cómo vuestros ánimos me ayudaron a salir hacia delante. A Lourdes y Raquel por esos buenos 6 ratos en el laboratorio y por estar siempre dispuestas a ayudarme. A Matias y Reme por darme una sonrisa cuando más la he necesitado. A Mábel y Cristina, por compartir breves pero buenos momentos mientras buscaban su camino tras defender sus tesis. A Fátima y Marco, por interesarse en nuestro grupo de investigación y compartir su experiencia con nosotros. A Fernando e Inma por ser unos trabajadores ejemplares, por tener ilusión por la ciencia y por engrandecer esta pequeña familia que formamos todos. A la Dra. Ana María Cameán por haber sido una Directora de Departamento excelente, y habernos defendido a capa y espada. A las demás investigadoras del grupo de Toxicología, Silvia, Anabel, Ángeles, Maria Llanas, Isa y Maria Puerto y al señor Dani. ¡Qué sería yo sin tu saludo! Al resto del equipo, María de Gracia, Conchi, Reme y Leti por el apoyo que he recibido de ellas. Debo guardar un hueco especial para Pili y Sara, que son las niñas de mi corazón. A pesar de que hayáis seguido vuestro propio camino, seguís estando ahí. Sois únicas, no cambiéis por nada ni por nadie. Al Dr. Paco Heredia por darme los buenos días religiosamente todos los días al llegar al laboratorio. A los compañeros del grupo de color, José Miguel, María Jesús, Ana, Belén, Carla, Julio, Paco, Berta, Paula y Fran, por su compañía y amabilidad. A Félix, nuestro héroe (porque no tiene otra palabra) por estar siempre dispuesto a salvarnos de la malvada burocracia y por compartir su experiencia y profesionalidad. A María Luisa y Miguel Ángel por echarme una mano cuando la he necesitado. A la Dra. Emma Cantos Villar y el Dr. Tristán Richard por su asesoramiento y su buen hacer. Sin ellos, habría estado perdido en el mundo del vino y de la vid. A Belén y a Raúl por su buena acogida siempre que hemos visitado el centro IFAPA de Jerez. A Eva Valero Blanco, por ser mi profesora años atrás y una gran colaboradora durante mi doctorado. Gracias por compartir tu experiencia conmigo. Al Dr. José Manuel Guillamón por permitirme quedarme durante tres meses en su laboratorio, aprendiendo nuevas técnicas. Siempre ha tenido buenas palabras conmigo y me ha animado cuando las cosas han sido difíciles. También agradecer a su equipo, a Fany, Sara, Roberto y Ricardo por la agradable acogida que me dieron allí. Al Dr. Albert Màs, por su profesionalidad y por darme siempre una sonrisa en las reuniones de proyecto. Solo puedo sentir admiración ante el gran conocimiento que me ha demostrado poseer, del mismo tamaño que su buen corazón. A las demás personas de su grupo las Dras. Maria Jesús Torija y Gemma Beltrán y a sus chicas de laboratorio, Jennifer, Beatriz, Maria Ángeles y Maria José. Gracias por enseñarnos Tarragona cuando hemos tenido reuniones de proyecto. ¡Y por no decaer ante la melatonina! 7 A la Dra. Silvia M. Rocha por su dedicación y orientación durante mi estancia de 3 meses en Portugal. A su grupo de trabajo, Ángelo, Cátia, Roi, Jéssica, Celia, Paulo, Carla, Carina y Sonia por enseñarme la grandeza lusa y la maravilla de sus gentes. A Marcia, Mariana, Anita, Paty, Fernanda y Natalia por mostrarme la multiculturalidad portuguesa mientras viví allí. Sin vosotras, no sé qué habría sido de mi en Aveiro. Muito obrigado! Al Dr. Modesto Carballo, la Dra. Laura Navarro y la Dra. Rocío Valderrama, por ayudarme a comprender las técnicas de biología molecular y de espectrometría de masas. Su asesoramiento ha salvado mis experimentos del desastre más de una vez. Al Dr. Juan Bautista y la Dra. Josefa Álvarez, por ser unos orientadores justos, cercanos y con un gran sentido de la moralidad. Ha sido un absoluto placer hacer un doctorado con coordinadores como vosotros. A mis amigos Rebeca, Rocío, Alberto, Fran, Bea, Josema, Isa y CP por su paciencia y por sus ánimos. Por saber mantener la amistad incluso con el poco tiempo disponible que tenía para ellos. Esta tesis es tan vuestra como mía. A mi grupo de tecnólogas, Esther, Rosa, Ángela, Bea y Aurora por aguantar mi doctorado como si fuese suyo, por animarme a desconectar y por hacerme comprender que la distancia no es un impedimento para mantener una buena amistad. A Mery, Jose, Pilar, Jesús, Copete y Sara por haberme comprendido con mi profesión y haberme hecho desconectar en los ratitos que estábamos juntos. A Juanma por haber sido mi apoyo durante los primeros años de doctorado. No podías faltar aquí. A mis tios, Pepi y Javier, por estar preocupados de que el doctorado no pudiera conmigo. A mis adorados primos, Pili y Javi, por todos los momentos juntos y las palabras de aliento. A Antonio, por recordarme siempre que todo sacrificio tiene su recompensa. A mi abuela, por pensar que aun soy un alumno y no he terminado la carrera. A mi abuelo, que en paz descanse, por irse pensando que era médico por usar una bata blanca. A Félix, por demostrarme que las casualidades pueden ser tan hermosas como inesperadas. Por convertir tu sonrisa en mi mayor debilidad. Por reconstruir los cimientos de un corazón roto con tus abrazos. Por hacer que tu voz sea uno de mis sonidos favoritos en el mundo. Por darme todo el amor y el cariño que se puede recibir de otra persona. Por quererme a pesar de la distancia y mis defectos que a veces te exasperan. Por ser mi luz. Por existir. Me has dado esperanza, me has dado una razón más para sonreír todos los días al levantarme y me has dado fuerzas para luchar por lo que merece la pena. No sé cómo agradecerte lo que has hecho por mí, pero si me dejas, pienso demostrártelo cada día que pase. Te quiero. 8 Y, sobre todo, esta tesis se la dedico a mi madre y mi padre. Ellos son los guerreros incansables que me han permitido llegar hasta donde estoy ahora. No puedo tener mejores padres que vosotros, que habéis estado al pie del cañón soportando mi frustración, ayudándome a levantarme una y otra vez, y haciendo que el doctorado y lo que conlleva escribir una tesis sea mucho más llevadero. Solo espero que ambos estéis orgullosos de mí, porque antes que doctorando soy vuestro hijo, y para mí, es el mayor privilegio que puedo tener en esta vida. Gracias por quererme, gracias por vuestros besos, vuestros abrazos y por estar ahí siempre. Gracias de corazón. Os quiero. Esto es para vosotros. 9 ÍNDICE Resumen .......................................................................................................... Pág.13 Summary .......................................................................................................... Pág.16 Abreviaturas ..................................................................................................... Pág.19 Índice de Figuras .............................................................................................. Pág.23 Índice de Tablas ............................................................................................... Pág.24 INTRODUCCIÓN .............................................................................................. Pág.25 BLOQUE I: COMPUESTOS INDÓLICOS 1. Triptófano ..................................................................................................... Pág.25 1.1. Metabolismo del triptófano ......................................................................... Pág. 27 1.2. Fermentación alcohólica ............................................................................ Pág. 27 1.3. Melatonina ................................................................................................. Pág. 29 1.4. Metabolismo de la melatonina .................................................................... Pág.30 1.5. Presencia de melatonina en alimentos ....................................................... Pág.32 1.6. Otros derivados del triptófano en vino ........................................................ Pág.33 1.7. Técnicas de análisis ................................................................................... Pág.34 1.7.1. Técnicas inmunológicas ................................................................. Pág.34 1.7.2. Técnicas cromatográficas .............................................................. Pág.35 BLOQUE II: ESTILBENOS 2.. Estilbenos .................................................................................................... Pág.37 2.1. Compuestos derivados ..................................................................... Pág.39 3.. Angiogenesis ............................................................................................... Pág.39 BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................. Pág.40 JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS .................................................. Pág.54 16 SUMMARY In recent years, melatonin has been identified in different foods, mainly from plant origin such us fruits (grapes, strawberries) and vegetables (tomatoes and peppers). However, the identification of melatonin in fermented foods as beer and wine has attracted an increasing interest in research. Literature data indicate that the presence of this molecule in fermented food is due to the yeast metabolism, especially from Saccharomyces cerevisiae, during fermentative process. Melatonin is a well-known neurohormone synthesized by the pineal gland of mammals. Its main function is related with circadian rhythms depending of light/darkness conditions. Besides, it has reported additional bioactive properties such as antioxidant, being an effective oxygen scavenger. On the other hand, it has also been described in plants and microorganism, although its role in both organism in not well elucidated. Melatonin is formed from the amino acid tryptophan that belongs to the aromatic amino acids groups. Mammal’s metabolism of tryptophan encompasses different secondary metabolites such as 5-hydroxytryptophan, serotonin and N-acetylserotonin. In plants, tryptamine can be included on the melatonin pathway instead of 5-hydroxytryptophan. However, the metabolic pathway that produce melatonin in microorganisms is not completely defined. Nevertheless, amino acid catabolism by yeast known as the Ehrlich pathway mainly produces indole acetic acid and tryptophol. Analytical techniques to quantify melatonin in biological fluids and foodstuff is quite diverse, covering from radioimmunoassay, being ELISA the most representative, to high resolution liquid chromatographic techniques coupled to a high resolution mass spectrometer. The main challenge of these techniques is to improve the detection and quantification limits of these compounds. ELISA technique is well performed when biological fluids are analysed. Nevertheless, its application to foodstuffs has been less repeatable, maybe due to the presence of interference in the food matrix that can react with the ELISA antibodies. For this reason, High Resolution Liquid Chromatography has proved to be the best technique for the melatonin and derived tryptophan compounds analysis. At first, chromatographic methods with a fluorescence detector were used to determine melatonin in food. However, the low concentrations of melatonin presented in foods, and the limits of detection and quantitation of this detector make it ineffective to describe the presence of melatonin unequivocally. Nowadays, liquid chromatography coupled to mass spectrometers results the best option to study melatonin. However, most of the 17 reported methods only analysed melatonin. Thus, they cannot bring to light to a fully view of the likely formation pathways in fermented foods. Therefore, one of the aims of the present doctoral thesis is to develop a chromatographic method couple to mass spectrometry that simultaneously identify different tryptophan derived compounds related with melatonin formation pathway. Additionally, the study of the compounds stability in different storage conditions was also included. Furthermore, fermentation experiments were performed in synthetic and natural must in order to find yeast with the best ability to synthesize indolic compounds derived from tryptophan. Eventually, commercial beers were analysed to dilucidate whether in other matrixes apart from wine indolic compounds are also produced. Moreover, the bioactivity of stilbenoids compounds derived from the amino acid phenylalanine and present in grapevine stalks of Vitis vinífera, was also study. These experiments have the aim of evaluate the potential ability of these compounds to inhibit angiogenesis. This physiological process is involved in the development of cancer and cardiovascular diseases in adult population. Both diseases are consider the world’s leading cause of death, according to the last data reported by the World Health Organisation. Since vascular endothelial growth factor (VEGF) is the main proangiogenic factor, its inhibition is a plausible molecular mechanism that shows a direct cause-effect for decreasing cardiovascular and cancer risk. One of the most remarkable proofs of VEGF role in angiogenesis is that some cancer treatments are based in an anti- VEGF drugs such as Avastin®, which is the most currently used. However, their lengthy treatment causes serious side effects, increasing the risk of hypertension. Certain polyphenols that are present in foods such as epillogatechin gallate and quercetin, among others, have proved a potential anti-VEGF activity, allowing the activation at the same time of the endothelial nitric oxide synthase, responsible of vasodilation. Thus, anti-VEGF potential of twelve stilbenes was evaluated in human umbilical vein endothelial cells. In addition, the possible effect on the signalling intracellular downstream, particularly on phospholipase γ1 (PLC γ1, main responsible of cell proliferation), protein kinase B and eNOS was also studied. Most remarkable results lead from the development and validation of an analytical method that identified simultaneously nine compounds derived from the amino acid tryptophan for the first time by UHPLC/HRMS technique in fermented synthetic must. The present method has been useful to evaluate the possible matrix effect of fermented samples, resulting beer as the matrix that caused less decrease of indolic compound 18 composition and establishing a storage temperature of 4ºC as the best alternative of conservation. On the other hand, melatonin and related compounds derived from tryptophan metabolism such as serotonin, indole acetic acid, tryptophol and ethyl ester of tryptophan was confirm during the alcoholic fermentation of synthetic must, being the S.cerevisiae Aroma White the most melatonin producer. Additionally, it was proved the reproducibility of results in natural must of different grape varieties (Corredera, Chardonnay, Moscatel, Palomino Fino, Sauvignon Blanc, Tempranillo, Vijiriega), where Aroma White proved again to be the highest melatonin producer. Moreover, for the first time N-acetylserotonin was quantified during the alcoholic fermentation of Tempranillo must. The analysis of indolic compounds in beers pinpoints the identification of 5-hydroxytryptophan, N- acetylserotonin and indole acetic acid in beers as a novelty. Regarding stilbenes bioactivity, astringin, piceatannol, pallidol, ε- and ω-viniferina inhibited VEGF activity (IC50 = 2.9-39.4 µM). In addition, both ε- and ω-viniferin were also able to inhibited PLCγ1, while activated eNOS, likely avoiding the side effects of hypertension, currently related with the anti-VEGF drugs treatment. With no doubt, present results are remarkable to improve wine-making process by enhancing the presence of stilbenes from grapevine and the indolic compounds derived from the amino acid tryptophan by yeast metabolism in wines during the alcoholic fermentation, giving an added value to the final product and trying to emulate this practices to the production of other fermented beverages such as beer. 19 ABREVIATURAS µg Microgramos µL Microlitros µM Micromolar 3-IAA Ácido 3-indolacético 3-IAD Acetaldehido-3-indol 3-IPA Ácido 3-indolpirúvico 5HT Serotonina 5-HTRP 5-hidroxitriptófano AC Acetato de celulosa ADY Levaduras activas deshidratadas AGC Control automático de ganancia Akt Proteína quinasa B ANOVA Análisis de la varianza AOAC Asociación de Químicos Analíticos Oficiales AW Cepa de S. cerevisiae Aroma White BCA Ácido bicinconínico BSA Albumina de suero bovino CABD Centro Andaluz de Biología del Desarrollo CT-QA23 Fermentación control con levadura QA23 CT-RF Fermentación control con levadura Red Fruit DMSO Dimetil sulfóxido DTT Ditiotreitol (agente reductor de muestras) ECV Enfermedades cardiovasculares EFSA Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria EGCG Epigalocatequin galato EGM-2 Medio de crecimiento para células endoteliales 2 ELISA Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas eNOS Óxido nítrico sintasa endotelial ESI Ionización por electrospray FA Fermentación alcohólica FPU Formación de Profesorado Universitario 20 FULL MS2 Espectro de masas con los principales fragmentos FWHM Anchura a media altura HEPES Ácido N-(2-hidroxietil) piperazina-N’-(2-etanosulfónico) HESI Ionización por electrospray calentada HPLC Cromatografía líquida de alta eficacia HRMS Espectrometría de masas de alta resolución HSD Tukey’s Honest Significant Difference HUVEC Células endoteliales humanas de cordón umbilical IATA Instituto de Agroquímica y Tecnología Alimentaria IC50 Mitad de la concentración inhibitoria máxima IFAPA Instituto de investigación y Formación Agraria y Pesquera IT Tiempo de inyección L Litro LC-DAD Cromatografía líquida acoplada a un detector de diodos LC-MS Cromatografía líquida acoplada a un espectrómetro de masas LDA Análisis discriminante lineal LDS Dodecilsulfato de litio (tampón de muestra) LOD Límite de detección LOQ Límite de cuantificación L-TRP EE Etil ester de L-triptófano L-TRP L-triptófano M. pulcherrima Metschnikowia pulcherrima m/z Relación ente masa y carga MEL Melatonina MeOH Metanol mg Miligramo Mha Millones de hectáreas MLT Melatonina mM Milimolar MS Espectrometría de masas MS-MS Espectrometría de masas en tándem n.d/nd No detectable 21 n.q/nq No cuantificable NA-5HT N-acetilserotonina NACSERO N-acetilserotonina NCE Energía de colisión normalizada ng Nanogramo NL Linea de ruido nm Nanómetro NO Óxido nítrico NY Nylon OIV Organización internacional del vino pAkt Proteína quinasa B fosforilada PCA Análisis de componentes principales peNOS Óxido nítrico sintasa endotelial fosforilada PLCγ1 Fosfolipasa C gamma 1 pPLCγ1 Fosfolipasa C gamma 1 fosforilada ppm Partes por millón PTFE Politetrafluoroetileno QTRAP Trampa iónica de triple cuadrupolo R2 Coeficiente de determinación RF Cepa de S. cerevisiae Red Fruit RIPA Buffer de radioinmunoprecipitación RHA Rapontina, Raponticina RP Poder de resolución rpm Revoluciones por minuto RSD Desviación estándar relativa RT Tiempo de retención S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae SERO Serotonina SI-QA23 Fermentación secuencial de QA23 y T. delbrueckii SI-RF Fermentación secuencial de Red Fruit y T. delbrueckii S-lens RF Radio frecuencia de la lente S SM Mosto sintético 22 SO2 Anhídrido sulfuroso/Dióxido de azufre SP Fermentación espontánea SPE Extracción en fase sólida T. delbrueckii Torulaspora delbrueckii Tª Temperatura TBST Buffer Tris-salino con Tween® 20 TOL Triptofol TRY Triptamina TRYPT Triptamina UHPLC Cromatografía líquida de ultra-alta eficacia UV/Vis Luz ultravioleta/Luz visible VEGF Factor de crecimiento vascular endotelial VEGFR-2 Receptor 2 de VEGF YNB Base nitrogenada para levaduras YPD Extracto de levadura con peptona y dextrosa 23 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Estructura química del aminoácido L-triptófano ............................ Pág.25 Figura 2. Estructuras químicas del ácido 3-indolacético y triptofol ................ Pág.28 Figura 3. Estructura química de la melatonina .............................................. Pág.29 Figura 4. Metabolismo de la melatonina en mamíferos, plantas), levaduras y una ruta alternativa común a todos. ........................................... Pág.31 Figura 5. Estructura química del resveratrol .................................................. Pág.37 Figura 6. Metabolismo de formación del resveratrol a través de la fenilalanina ................................................................................................... Pág.38 Figura 7. Procedimiento de preparación del mosto SM300 ........................... Pág.73 Figura 8. Proceso de obtención del mosto de uva para las fermentaciones del vino blanco y el rosado ................................................. Pág.75 Figura 9. Esquema con los diferentes protocolos de inoculación en el mosto de la variedad Tempranillo ................................................................. Pág.76 Figura 10. Muestreo realizado en las diferentes matrices alimentarias utilizadas en los capítulos 1-5 ....................................................................... Pág.78 Figura 11. Esquema de la extracción intracelular por el método del etanol en caliente .......................................................................................... Pág.80 Figura 12. Procedimiento llevado a cabo sobre células HUVEC en presencia de estilbenos y VEGF ........................................................................................ Pág.81 24 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Fuentes alimentarias de triptófano .................................................. Pág.26 Tabla 2. Patrones utilizados para el análisis de compuestos indólicos .......... Pág.59 Tabla 3. Composición del mosto sintético (MS300), soluciones de aminoácidos, vitaminas y factores anaerobios .............................................. Pág.60 Tabla 4. Reactivos empleados para los experimentos de biología Molecular ...................................................................................................... Pág.63 Tabla 5. Cepas de levaduras comerciales utilizadas para el desarrollo de las fermentaciones ................................................................................... Pág.64 Tabla 6. Cepas de levaduras comerciales utilizadas para el desarrollo de las fermentaciones ................................................................................... Pág.71 25 INTRODUCCIÓN BLOQUE I: COMPUESTOS INDÓLICOS 1. Triptófano El triptófano, junto con la tirosina y la fenilalanina, conforman el grupo de los aminoácidos aromáticos (AAA), los cuales presentan anillos aromáticos en su estructura química (Figura 1). Mientras que la fenilalanina y la tirosina se componen de anillos fenólicos, el triptófano posee un anillo indólico formado por un benceno (C6) y un anillo pirrólico (C5). Además, debido a esta estructura química, el triptófano es el aminoácido que presenta el mayor número de carbonos de todos los utilizados para la síntesis proteica, además de tener un fuerte carácter hidrofóbico (Palego et al. 2016). Figura 1. Estructura química del aminoácido L-triptófano Hopkins & Cole describieron el triptófano por primera vez en 1901 (Hopkins and Cole 1901). Mientras que otros aminoácidos fueron aislados a través de una sencilla digestión ácida de proteínas, el triptófano precisó de un proceso más agresivo, con un aumento de la temperatura y el uso de tripsina, de donde cogió su nombre. Pocos años más tarde, en 1908, Ellinger y Flamand describieron la estructura por primera vez (Richard et al. 2009). El triptófano forma parte de los 9 aminoácidos esenciales para la nutrición humana, ya que se necesita de una fuente exógena para incorporarlo al organismo. Según un informe de la Organización Mundial de la Salud (OMS) sobre requerimientos de proteínas y aminoácidos en la nutrición humana, se estableció una cantidad diaria recomendada (CDR) de 250-425 mg/día, siendo la ingesta recomendada entre 3,6-6 mg/kg de peso al día de triptófano (WHO/FAO/UNU Expert Consultation 2007). Las principales fuentes de triptófano en la dieta proceden de alimentos de origen animal como la carne, pescado, marisco, huevo, leche y derivados lácteos, aunque también se encuentra en alimentos vegetales como frutos secos (anacardos, almendras, nueces), guisantes, patatas, cacao o uvas (Gutiérrez-Gamboa et al. 2018; Palego et al. 2016; 32 concluyeron poco después que, aunque la melatonina se había detectado en diferentes organismos invertebrados (insectos, plantas, bacterias, levaduras) no estaba claro qué función poseía en sus respectivos metabolismos pero quizás no estuviese relacionada con los ritmos circadianos vistos en mamíferos (Hardeland & Poeggeler, 2003). Posteriormente, se estudió un posible efecto como antioxidante frente al estrés hipertónico en levaduras, pero los resultados mostraron que la melatonina no causaba ningún efecto positivo en el crecimiento de las mismas (Koziol et al. 2005). En 2008, Park et al. estudiaron la conversión de 5-hidroxitriptófano en serotonina, y comprobaron que las levaduras del género S. cerevisiae poseían una actividad descarboxilasa limitada en cuanto a la velocidad de reacción (Park et al. 2008). Aunque parece ser que, a priori, el metabolismo de melatonina por parte de las levaduras es igual al de mamíferos, estudios más recientes discuten que posiblemente, la síntesis de melatonina no utilice en su ruta la conversión de serotonina en N-acetilserotonina, sino que el 5-hidroxitriptófano se metaboliza en 5-metoxitriptamina para dar lugar a la melatonina, extendiendo esta hipótesis no solo al metabolismo de las levaduras sino al metabolismo general de esta neurohormona (Tan et al., 2016). En la actualidad, los genes y enzimas involucrados en la síntesis de melatonina en levaduras no están completamente descritos. 1.5. Presencia de melatonina en alimentos La melatonina se ha detectado y cuantificado en diversos alimentos, principalmente de origen vegetal. Uno de los primeros estudios se realizó en diversas frutas (taro, piña, fresa, manzana, tomate), verduras (espinacas, zanahoria, pepino, repollo, espárragos, cebolla) y cereales (arroz, cebada, maíz, avena), destacando el contenido de avena (1796,1 pg/g) y de maíz dulce (1366,1 pg/g) (Hattori et al. 1995). Posteriormente, otro estudio en las semillas de plantas comestibles destacó el contenido de melatonina en mostazas blancas y negras entre 129 y 189 ng/g de peso seco (Manchester et al. 2000) y un año más tarde, 2-16 pg/g en tomates (Van Tassel et al. 2001). Chen et al. realizaron un amplio estudio sobre melatonina en hierbas medicinales chinas, describiendo concentraciones entre 12 y 3771 ng/g (G. Chen et al. 2003). En 2006 se detectó por primera vez melatonina en ocho variedades de uva, destacando Nebbiolo 0,965 ng/g) y Croatina (0,870 ng/g) (Iriti, Rossoni, and Faoro 2006) y al año siguiente se describía por primera vez en diferentes aceites de oliva, entre 50 pg/mLde un aceite refinado de girasol y 119 pg/mLde un aceite con denominación de origen de Baena (de la Puerta et al. 2007). 33 Un año después, en 2008, se detectó melatonina por primera vez en vinos, a niveles entre 0,5 ng/mL en vinos de la variedad Sangiovese y 0,4 ng/mL en la variedad Trebbiano (Mercolini et al. 2008), siendo la primera vez que se cuantificaba en alimentos fermentados. Posteriormente, también se detectó melatonina en cervezas comerciales, en valores comprendidos entre 51.8 y 169.7 pg/mL (Maldonado, Moreno, and Calvo 2009a). Dado que la melatonina presente en estos alimentos no se presentaba de una manera inicial, se comenzó a pensar que las levaduras tenían un papel fundamental en la síntesis de este compuesto en alimentos fermentados. Poco tiempo después, en 2011 se confirmó por primera vez que las levaduras eran capaces de sintetizar melatonina durante la fermentación alcohólica de mostos de uva (Rodriguez-Naranjo, Gil-Izquierdo, Troncoso, Cantos-Villar, et al. 2011), determinando más tarde que en condiciones de fermentación controladas, la levadura requería la presencia de triptófano en el medio para sintetizar melatonina, pero la mayor presencia de este compuesto no implicaba una mayor producción de la misma (Rodríguez-Naranjo et al. 2012). A partir de entonces, se ha descrito la síntesis de melatonina en numerosas matrices alimentarias fermentadas por levaduras como el vino de granada (Mena et al. 2012), la cerveza artesanal (Garcia- Moreno, Calvo, and Maldonado 2013), el zumo de naranja (Fernández-Pachón et al. 2014) o el pan (Yılmaz, Kocadağlı, and Gökmen 2014). No obstante, al observar las concentraciones de melatonina en las diferentes matrices, se puede comprobar que la mayor parte de las fuentes alimentarias de melatonina proceden de alimentos vegetales como frutas, verduras y cereales. Sin embargo, resulta remarcable el aporte de fuentes de melatonina derivadas del metabolismo de la S.cerevisiae en alimentos fermentados, aunque en todas ellas el aporte de este compuesto activo sea en pequeñas cantidades. 1.6. Otros derivados del triptófano en vino Además de la melatonina, se han descrito en vinos otros compuestos pertenecientes a su ruta como la serotonina (Manfroi et al. 2009; Wang et al. 2014), aunque no suele ser habitual su cuantificación en vinos, dado las bajas concentraciones en las que se encuentra(ng/mL). Este intermediario desarrolla funciones vitales en el organismo, al ser una de las principales moléculas que influyen en el estado de ánimo. Además, ha mostrado tener propiedades neuroprotectoras frente a la formación de fibras de βamiloide relacionadas con las enfermedades de Parkinson y Alzheimer (Hornedo-Ortega et al. 2018). Por otro lado, el triptofol, alcohol superior derivado del triptófano por la ruta de Ehrlich, suele ser un metabolito habitual en el vino (Bordiga et al. 2016; Gil and Gómez-Cordovés 34 1986; Monagas, Bartolomé, and Gómez-Cordovés 2005). Su función parece estar relacionada como molécula quorum sensing durante la fermentación, es decir, compuestos que son expulsados en el medio y dan información a la población de levaduras para adaptar su metabolismo a las condiciones imperantes (Avbelj, Zupan, and Raspor 2016; Dickinson 2008; Dufour and Rao 2011). El ácido 3-indolacético también se ha descrito en las fermentaciones llevadas a cabo por levaduras en vino (Maslov et al. 2011; Mihaljević Žulj et al. 2015), donde puede cuantificarse como compuesto libre o conjugado con otras moléculas (K. Hoenicke et al. 2001; Simat et al. 2004). El ácido 3-indolacético se considera un off-flavour durante la fermentación alcohólica (Katrin Hoenicke et al. 2002). En plantas si está reconocido su efecto en la elongación celular, crecimiento apical de las raíces o el tropismo (Westfall, Muehler, and Jez 2013). En líneas celulares de vena endotelial de cordón umbilical (HUVEC), ha mostrado bioactividad frente a la migración de líneas celulares en procesos relacionados con la angiogénesis (Cerezo et al. 2017). En menor medida, la triptamina ha sido descrita durante la fermentación alcohólica en vinos (Beneduce et al. 2010; Rodriguez-Naranjo et al. 2013) y se suele aislar también en quesos fermentados (Chang, Ayres, and Sandine 1985; Mayer and Fiechter 2018) aunque no es una de las principales aminas biógenas derivadas del metabolismo de microorganismos. Es más, según las indicaciones de la EFSA sobre los límites máximos permitidos de aminas biógenas en alimentos, la triptamina no se contempla como de especial interés(EFSA Panel on Biological Hazards 2011). 1.7. Técnicas de análisis La cuantificación de estos metabolitos en matrices alimentarias constituye un reto dentro del campo analítico debido a varios factores. En primer lugar, porque las concentraciones que se encuentran de melatonina y derivados en diversos alimentos es muy baja, del orden de trazas (ng/mL). En segundo lugar, el carácter anfipático de la melatonina hace difícil hallar un método de extracción fiable. Y en tercer lugar, debido a su gran capacidad como antioxidante, la melatonina reacciona rápidamente con otros constituyentes en las muestras por lo que hay que hacer un pretratamiento cuidadoso de la muestra (García-Parrilla, Cantos, and Troncoso 2009). 1.7.1. Técnicas inmunológicas Estas técnicas fueron las primeras con las que se comenzó a describir la melatonina en diversas muestras alimentarias. Entre estas técnicas destacan el radioinmunonsayo 35 (RIA) y ELISA, diseñadas en un principio para el análisis de melatonina en fluidos biológicos. En 1984 se desarrolló un método de RIA para analizar melatonina en plasma de rata, suero humano y orina (Vakkuri, Leppäluoto, and Vuolteenaho 1984) y en 1987 para estudiar los cambios en la concentración de melatonina en plasma y saliva humana (McIntyre et al. 1987). Sin embargo, su análisis en alimentos se utilizó una de las primeras veces en 1995, al cuantificar melatonina en plantas comestibles usando el radioinmunoensayo (Hattori et al. 1995). Iriti et al, utilizó la técnica de ELISA para cuantificar melatonina en vinos, al igual que De la Puerta et al. para la identificación de este compuesto en aceites (Iriti, Rossoni, and Faoro 2006; de la Puerta et al. 2007). Más tarde, la determinación realizada de melatonina en cervezas se realizó usando un kit comercial disponible de ELISA (Maldonado, Moreno, and Calvo 2009b). En 2011, Rodríguez-Naranjo et al. probó que al usar el mismo kit en muestras de vino, el porcentaje de falsos positivos podía alcanzar hasta un 25%, descartando este método para el análisis en este tipo de matrices alimentarias, posiblemente provocados por interferentes que reaccionaban con los anticuerpos de la melatonina.(Rodriguez-Naranjo, Gil-Izquierdo, Troncoso, Cantos, et al. 2011). Aunque los métodos inmunológicos ofrezcan unos límites que suelen situarse en el orden de pg/mL, nos encontramos ante una serie de desventajas al aplicarlos a matrices alimentarias. En primer lugar, los kits comerciales de ELISA para el análisis de la melatonina suelen alcanzar un precio elevado en el mercado, teniendo únicamente reactivo para procesar solo 96 muestras como máximo. En segundo lugar, al ser un análisis sumamente específico, solamente se puede realizar la determinación de un único compuesto, provocando la ausencia de información en cuanto a visión global de rutas metabólicas. Por último, la presencia de interferentes puede provocar una malinterpretación de los datos obtenidos, cuantificando otros compuestos que puedan reaccionar con el anticuerpo como si fueran melatonina. Por estos motivos, y a pesar de todos estos antecedentes, las técnicas cromatográficas fueron abriéndose paso en los análisis de compuestos indólicos, venciendo las dificultades que el ELISA no era capaz de solventar. 1.7.2. Técnicas cromatográficas En los años 90, las técnicas cromatográficas empezaron a utilizarse con mayor frecuencia para la detección y cuantificación de la melatonina. Aunque Hattori et al. determinaron melatonina en plantas comestibles con radioimunoensayo, incorporaron 36 un análisis con cromatógrafo de líquidos y detector de fluorescencia para verificar los resultados (Hattori et al. 1995). Además, por aquel entonces se comprobó que moléculas como la serotonina y la triptamina se consideraban interferentes en los análisis de melatonina por HPLC. Vitale et al. desarrollaron un método altamente sensible en fase normal con un detector de fluorescencia, permitiendo diferenciar con mayor exactitud estos compuestos de la melatonina (LOD = 3 pg/mL), ofreciendo mejores resultados que los detectores electroquímicos o la cromatografía en fase reversa. (Vitale et al. 1996). No obstante, en 1999 se utilizó la cromatografía líquida en fase reversa con detectores electroquímicos para determinar melatonina y otros compuestos indólicos relacionados derivados de la melatonina (Sprenger et al. 1999). Por aquel entonces, también se desarrolló un método más sensible con un HPLC de fase reversa y detector de fluorescencia pero añadiendo un paso de derivatización que parecía mejorar la sensibilidad (Iinuma et al. 1999). Sin embargo, los detectores electroquímicos coplados a un HPLC siguieron usándose en diferentes experimentos, como los realizadosen células de médula ósea o semillas de plantas comestibles, aunque obviando cualquier proceso de derivatización (Conti et al. 2000; Manchester et al. 2000). Poco después, Cheng et al. analizó el contenido en hierbas tradicionales chinas usando un HPLC con fluorescencia acoplado a un espectrómetro de masas (G. Chen et al. 2003), siendo una de las primeras veces que se implementa esta técnica y obteniendo un LOD de 50 pg/mL. En 2006, Cao et al. realizaron mejoras en cuanto a la determinación de compuestos indólicos, al desarrollar un método que analizaba melatonina, serotonina y ácido 3-indolacético en extractos de plantas usando también un espectrómetro de masas en tándem (Cao et al. 2006). Los límites de detección que alcanzaron fueron de 5, 100 y 50 pg/mL para la melatonina, serotonina y ácido 3- indolacético respectivamente. La determinación de melatonina en uvas por primera vez se realizó a través de un proceso de HPLC con fluorescencia, pero curiosamente, se utilizó el ELISA para verificar que no coeluían compuestos durante el análisis cromatográfico (Iriti, Rossoni, and Faoro 2006). Para cuantificar melatonina en vinos se usó el mismo método cromatográfico (HPLC-F), pero en esta ocasión, no se recurrió a la técnica ELISA como complemento analítico (Mercolini et al. 2008). Prácticamente a partir del año 2010, la mayor parte de métodos para la determinación de la melatonina y otros compuestos indólicos se realizó con espectrómetros de masas. Rodriguez-Naranjo et al. cuantificó melatonina en vinos usando un Qtrap (Rodriguez-Naranjo, Gil-Izquierdo, Troncoso, Cantos, et al. 2011) con 37 un LOD de 51,72 ng/mL. Además, estas técnicas permitieron cuantificar melatonina en diversos alimentos, con un LOD entre 9,6 y 52,9 ng/mL (Kocadağlı, Yılmaz, and Gökmen 2014). A día de hoy, las técnicas cromatográficas de UPLC acopladas a espectrómetros de alta resolución han probado ser la mejor alternativa para el estudio de la melatonina y otros compuestos indólicos derivados (Zieliński, Szawara-Nowak, and Wiczkowski 2016), ya que la sensibilidad alcanzada por estos equipos permite una cuantificación más fiable. que con otras técnicas. BLOQUE II: Estilbenos 2. Estilbenos Los estilbenos son un grupo de compuestos polifenólicos no flavonoides que se encuentran en diferentes familias de plantas, entre las que destaca la Vitaceae, siendo la Vitis vinífera uno de los géneros más representativos (Rivière, Pawlus, and Mérillon 2012). La uva y los derivados de la misma, como el vino, son las principales fuentes de estilbenos para nuestra dieta (Raúl F. Guerrero et al. 2009). Figura 5. Estructura química del resveratrol. La estructura química de los estilbenos se compone de un esqueleto carbonado formado por dos anillos aromáticos unidos entre sí por un puente etileno (1,2-difeniletileno) (Adrian et al. 2000). Las diferentes combinaciones de esta estructura dan lugar a los diferentes compuestos pertenecientes a los estilbenos. Las estructuras mas simples (monómeros) son aquellos compuestos con la estructura más sencilla, basada en un esqueleto C6-C2-C6 al que están unidos diferentes radicales, que pueden ser de distinta naturaleza (azúcares, grupos metilos, grupos metoxi, etc.). La posición en la que estos sustituyentes se encuentren en el plano dará lugar a diferentes configuraciones espaciales que serán características de cada molécula. El monómero de estilbenos más conocido es el resveratrol, cuya molécula presenta tres grupos hidroxilos, dos en uno 38 de los anillos aromáticos y otro en el restante (Figure 5). El resveratrol se encuentra principalmente en la piel y en los raspones de la uva. Su metabolismo en plantas parte de la biosíntesis del amino ácido fenilalanina a través de la ruta del ácido siquímico. A partir de ese punto, el resveratrol sigue la ruta metabólica descrita en la Figura 6. La fenilalanina se transforma en ácido cinámico por acción de la fenilalanina amonio liasa. Posteriormente, la cinamato-4-hidroxilasa transforma el ácido cinámico en ácido pcumárico, que por acción de la estilbeno sintetasa medida por la presencia de al menos 3 moléculas de malonilCoA da lugar al trans-resveratrol . Figura 6. Metabolismo de formación del resveratrol a través de la fenilalanina (Chon et al., 2009) 39 2.1. Compuestos derivados Además del resveratrol hay otros compuestos monoméricos que han cobrado importancia en los últimos años debido a su potencial como compuestos bioactivos como el piceatanol (Piotrowska, Kucinska, and Murias 2012), el piceido (Raúl F. Guerrero et al. 2009), el pterostilbeno (McCormack and McFadden 2013) o la rapontina (Tao et al. 2017), entre otros (Akinwumi, Bordun, and Anderson 2018). Al mismo tiempo, el resveratrol puede formar oligómeros con la unión de una o más moléculas de este compuesto, dando lugar a la formación de dímeros y tetrámeros (Liu et al. 2013; Mattivi et al. 2011). Sin embargo, a diferencia del resveratrol o del piceido, no todos los compuestos derivados tienen una fuente alimentaria mayoritaria. Se han descrito algunos tetrámeros en vinos, como el hopeafenol y el isohopeafenol, (Decendit 2017; Guebailia et al. 2006), dímeros con las ɛ-viniferina (Vitrac et al. 2002) o el palidol (Flamini et al. 2013), aunque los más estudiados dado su potencial como compuestos bioactivos son el piceatanol y el pterostilbeno. No obstante, su presencia en alimentos no es tan estudiada, ya que sueln concentrarse en los raspones y en otras partes de la vid (Raúl F. Guerrero et al., 2016). Actualmente, se trabaja en el aprovechamiento de estos desechos para extraer compuestos bioactivos derivados del resveratrol (Biais et al. 2017; Rayne, Karacabey, and Mazza 2008; Sáez et al. 2018). Entre los usos potenciales de estos extractos, destacan la sustitución del anhídrido sulfuroso en el vino, dado las reacciones adversas que puede desencadenar en personas sensibles (Raúl F. Guerrero and Cantos-Villar 2015), presentando vinos con características organolépticas similares (Raposo et al. 2016, 2018). 3. Angiogenesis La angiogénesis es un proceso fisiológico basado en la creación de nuevos capilares sanguíneos a través de otros preexistentes (Carmeliet and Jain 2000). Dicho proceso es vital durante la embriogénesis, las etapas de crecimiento y en la regeneración celular. Sin embargo, en adultos también se encuentra relacionado con procesos cancerosos y las enfermedades cardiovasculares derivadas por la formación de la placa de ateroma. también se encuentra activo en procesos tumorales y en el desarrollo de la placa de ateroma (Camaré et al. 2017). Para que las células puedan proliferar, es necesario sintetizar unos factores de crecimiento, entre los cuales destaca el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) (Shibuya 2011). Dicho factor posee diferentes receptores de membrana, siendo el más activo el receptor 2 de VEGF (VEGFR-2) (Cébe-Suarez, Zehnder-Fjällman, and Ballmer-Hofer 2006). 40 En la actualidad, hay tratamientos contra el cáncer cuya diana es la inhibición de este proceso fisiológico (Glade-Bender, Kandel, and Yamashiro 2003; Ranieri et al. 2014). Para ello, inhiben la unión entre el VEGF y el VEGFR-2, evitando el desarrollo de una cascada de señalización intracelular mediada por diferentes proteínas. Entre ellas, destacan la fosfolipasa gamma 1 (PLCγ1), responsable de la proliferación celular (Shibuya 2011) que a su vez, también promueve la activación de la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) mediada por la protein quinasa B (Akt) (Kolluru, Siamwala, and Chatterjee 2010). Sin embargo, la inhibición de esta cascada de señalización se traduce en una disminución de óxido nítrico, el cual es un potente vasodilatador. Los efectos adversos del tratamiento con fármacos anti-angiogénicos provoca a largo plazo hipertensión en los pacientes (Escalante and Zalpour 2011; Zhu et al. 2007). Por tanto, la búsqueda de compuestos capaces de inhibir el VEGF pero a su vez, mantener la producción de óxido nítrico cobra importancia a la hora de buscar tratamiento potenciales como futura alternativa. 41 BIBLIOGRAFÍA Acuña-Castroviejo, D. et al. 2014. “Extrapineal Melatonin: Sources, Regulation, and Potential Functions.” Cellular and Molecular Life Sciences 71(16): 2997–3025. http://link.springer.com/10.1007/s00018-014-1579-2. Adrian, M. et al. 2000. “Stilbene Content of Mature Vitis Vinifera Berries in Response to UV-C Elicitation.” Journal of Agricultural and Food Chemistry 48(12): 6103–5. Akinwumi, Bolanle C., Kimberly Ann M. Bordun, and Hope D. Anderson. 2018. “Biological Activities of Stilbenoids.” International Journal of Molecular Sciences 19(3): 1–25. de Almeida, Eduardo Alves et al. 2011. “Measurement of Melatonin in Body Fluids: Standards, Protocols and Procedures.” Child’s Nervous System 27(6): 879–91. http://link.springer.com/10.1007/s00381-010-1278-8. 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La presencia de microorganismos permite obtener un producto con valor añadido ya que mejora la conservación, el valor nutricional, la funcionalidad y las características organolépticas, entre otros aspectos; lo cual tiene un impacto económico positivo en su comercialización (Hutkins 2006). Las levaduras del género Saccharomyces, son una de las principales encargadas de llevar a cabo el proceso de fermentación que da lugar a la obtención de productos como el pan, el vino o la cerveza. Durante este proceso, las levaduras precisan diversas fuentes de carbono, de nitrógeno asimilable (YAN) y de ausencia de oxígeno para su correcto desarrollo. De ellas, el nitrógeno es el factor más limitante para su crecimiento y actividad durante la fermentación alcohólica (Henschke & Jiranek 1993, Tesnière et al. 2015). Las principales fuentes de YAN son el amonio y los aminoácidos. El amonio es la preferida por las levaduras, debido a que es altamente asimilable. Entre los aminoácidos, la glutamina y la asparragina son los únicos que se consideran como preferidos para su metabolismo (Beltran et al. 2004). Sin embargo, los aminoácidos aromáticos (triptófano, fenilalanina y tirosina), si bien no son sus fuentes prioritarias de nitrógeno, cobran especial relevancia por los metabolitos que forman, ya que poseen propiedades bioactivas (antioxidantes, neuroprotectores, antiangiogénicos) e incluso algunos se han descrito como reguladores del crecimiento, afectando a la morfología de las levaduras (Dickinson 2008). El metabolismo del triptófano conlleva la formación de otros compuestos como la melatonina, la serotonina o el ácido 3-indolacético durante la fermentación alcohólica (Maslov et al. 2011, Rodriguez-Naranjo, Gil-Izquierdo, Troncoso, Cantos-Villar, et al. 2011, Mercolini et al. 2012). Dichos compuestos han demostrado tener propiedades bioactivas como antioxidantes, neuroprotectores y antiangiogénicos (Mas et al. 2014, Hornedo-Ortega et al. 2016, Cerezo et al. 2017). El triptofol, un alcohol superior derivado del metabolismo del triptófano, se ha demostrado que actúa como quorum sensing para las levaduras (Hazelwood et al. 2008, Avbelj et al. 2016). Sin embargo, todavía se desconocen tanto las vías de síntesis por parte de las levaduras como la función que estos compuestos ejercen durante la fermentación alcohólica. Además, las concentraciones de algunos metabolitos como la melatonina han sido descritas en alimentos fermentados a niveles de traza (ng/mL) (Rodriguez-Naranjo, Gil- 55 Izquierdo, Troncoso, Cantos, et al. 2011, Kennaway 2017). Este hecho hace necesario la búsqueda de técnicas analíticas con la suficiente sensibilidad para poder cuantificar estos metabolitos en diferentes matrices. Al mismo tiempo, se requieren técnicas que permitan la detección simultánea de los distintos metabolitos intermediarios en la formación de compuestos bioactivos. Por ello, la cromatografía líquida de ultra-alta eficacia acoplada a un espectrómetro de masas de alta resolución (UHPLC/HRMS) es una técnica que cumple con estos requisitos. Para verificar la eficacia de la técnica, es preciso que los métodos utilizados se encuentren debidamente validados (Kruve et al. 2015). Por tanto, la hipótesis de partida de la presente Tesis Doctoral supone que, disponer de métodos analíticos validados y sensibles que determinen simultáneamente diferentes metabolitos puede permitir mejorar el conocimiento de la síntesis de los compuestos derivados del triptófano durante la fermentación alcohólica, que ayude a establecer las condiciones para la formación de estos compuestos en productos fermentados. La Tesis Doctoral tiene como objetivo principal la identificación y cuantificación de metabolitos derivados del aminoácido aromático triptófano en alimentos fermentados por la levadura Saccharomyces cerevisiae así como el estudio de la bioactividad de otros compuestos derivados de otro aminoácido aromático, la fenilalanina, en el metabolismo de la vid que da lugar a la formación de estilbenos. Para la consecución de este objetivo, se definieron diferentes objetivos específicos a los que se llegaron después del planteamiento de una serie de cuestiones: 1. ¿Es posible cuantificar los compuestos derivados del metabolismo del triptófano simultáneamente y con suficiente sensibilidad? En la bibliografía, existen diversos métodos para medir derivados del triptófano por separado, pero no hay ninguno que lleve a cabo un análisis simultáneo de diversos metabolitos. El primer objetivo requiere el desarrollo de un método analítico validado (Capítulo 1), que debe enfrentarse a los siguientes retos:  Identificación simultánea de compuestos derivados del triptófano, principalmente los descritos en la ruta de síntesis de melatonina en plantas y mamíferos, que permita dilucidad si la levadura presenta dichos metabolitos en su ruta de síntesis (triptófano, 5-hidroxitriptófano, serotonina, N-acetilserotonina y melatonina). Asimismo, se contemplan otros compuestos de interés como el triptofol, el ácido 3-indolacético, la triptamina o el etil ester de triptófano. 56  Validación del método analítico para poder cuantificar cantidades traza (ng/mL) de los compuestos minoritarios en muestras fermentadas por levaduras. 2. ¿Se ve afectada la estabilidad de los compuestos bioactivos derivados del triptófano por efecto de la matriz, temperatura y concentración? La melatonina es una molécula muy inestable ante agentes externos como la luz y el oxígeno, debido a sus características antioxidantes (Friciu et al. 2016, Reiter et al. 2016). Además, otros compuestos derivados como el ácido 3-indolacético también presentan fotosensibilidad. Sin embargo, la composición de la matriz en la que se encuentran estos compuestos bioactivos puede afectar a su estabilidad a lo largo del periodo de almacenamiento de las muestras. Esta cuestión está recogida en el Capítulo 2 de la tesis y para llevarla a cabo se tuvieron en cuenta los siguientes objetivos:  Evaluar el efecto de diferentes matrices (vino, cerveza, mosto sintético fermentado y extracto intracelular de levaduras Saccharomyces) en la estabilidad de los compuestos bioactivos derivados del triptófano.  Determinar el impacto de distintas condiciones de temperatura (4ºC, -20ºC y - 80ºC) y concentración (2, 200 ng/mL) a lo largo del periodo de almacenamiento (30 días) en los compuestos bioactivos mediante un método validado de UHPLC/HRMS. 3. ¿Cómo evolucionan los derivados del triptófano durante la fermentación alcohólica? ¿Presentan las cepas de los géneros Saccharomyces y no- Saccharomyces alguna diferencia en cuanto a su síntesis? Previamente, se ha descrito que las levaduras de tipo Saccharomyces (QA23) sintetizan melatonina en condiciones de fermentación alcohólica. Sin embargo, no se ha estudiado la evolución de múltiples metabolitos derivados del triptófano en condiciones de fermentación con diferentes cepas comerciales (Capítulo 3). Por tanto, para la consecución de este objetivo fue necesario:  Llevar a cabo fermentaciones alcohólicas con diferentes cepas de levaduras comerciales no estudiadas en este aspecto, de tipo Saccharomyces (Aroma White, Red Fruit, QA23, ES488, ICV GRE, UVAFERM BC) y no-Saccharomyces (Torulaspora delbrueckii, Metschnikowia pulcherrima), incluyendo la QA23 como control y utilizando mosto sintético estandarizado, con el objetivo de minimizar interferentes en la matriz.  Analizar las muestras con el método analítico previamente validado para dilucidar qué cepas son las mayores productoras de compuestos bioactivos. 57 4. ¿Cómo evolucionan los compuestos derivados del triptófano al utilizar matrices más complejas? El siguiente objetivo se centra en aquellas cepas de levaduras que producen mayores cantidades de compuestos derivados del triptófano con propiedades bioactivas halladas en el Capítulo 3. Se pretende evaluar la síntesis de estos compuestos durante la fermentación alcohólica en un medio más complejo (Capítulo 4). Para ello, fue necesario:  Utilizar diferentes mostos naturales procedentes de variedades de uva blanca (Corredera, Chardonnay, Moscatel, Palomino Fino, Sauvignon Blanc, Vijiriega) y tinta (Tempranillo).  El análisis de muestras tomadas durante la fermentación alcohólica para dilucidar la evolución de los compuestos derivados del triptófano en las diferentes cepas, con un método de UHPLC/HRMS previamente validado. 5. ¿Aparecen los compuestos bioactivos derivados del triptófano en otras bebidas fermentadas por las levaduras del género Saccharomyces? Las levaduras del género Saccharomyces son capaces de fermentar otros sustratos como los cereales (trigo, cebada) para la obtención de bebidas alcohólicas de baja graduación como la cerveza. Hasta ahora, solo se han realizado análisis de melatonina en cervezas, a través de técnicas ELISA (Maldonado et al. 2009, Garcia-Moreno et al. 2013). Sin embargo, es necesario realizar estudios más completos sobre la presencia de otros compuestos derivados del triptófano con técnicas más sensibles. Este objetivo se abarca en el Capítulo 5 de la presente tesis, con los siguientes objetivos específicos:  Optimización del tratamiento de muestra utilizado en anteriores análisis para permitir una mejor resolución de compuestos bioactivos en muestras de cerveza.  Identificación y cuantificación de compuestos derivados del triptófano en extractos de cervezas comerciales para dilucidar aquellas marcas con mayor presencia de compuestos bioactivos en su composición. 6. Otros compuestos derivados del aminoácido aromático fenilalanina, ¿presentan actividad antiangiogénica? Los estilbenos son compuestos que proceden del aminoácido fenilalanina, siendo el resveratrol el más estudiado. Su bioactividad ha sido extensamente descrita en la 64 piperazina-N’-(2-etanosulfónico) (HEPES) fue proporcionado por Sigma-Aldrich (Barcelona, España). 1.6. Estilbenos Se utilizaron 12 estilbenos derivados del resveratrol. Entre ellos, el picetanol y el pterostilbeno fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (Barcelona, España). Debido a la falta de patrones comerciales, los restantes estilbenos (ampelopsina A, astringina, ɛ- y ω-viniferina,, hopeaphenol, isohopeaphenol, pallidol, rhapontin, r- y r-2-viniferina) fueron aislados de diferentes partes del pino (Picea abies) y de un extracto de vid (Vitis vinífera) suministrado por Actichem S.A. (Montauban, Francia) en el Institut des Sciences de la Vigne et du Vin de Burdeos, utilizando métodos previamente descritos (Biais et al., 2017; Gabaston et al., 2017). 1.7. Reactivos de biología molecular Los reactivos utilizados (función, proveedor y referencia) para el caso de los experimentos de biología molecular se encuentran enumerados en la Tabla 5. Tabla 5. Reactivos empleados para los experimentos de biología molecular. Compuesto Función Proveedor Referencia Tris-HCl Buffer NAPI Applichem A3452 TritonTM X-100 Buffer NAPI Sigma-Aldrich T8787 Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) Buffer NAPI Sigma Aldrich E6758 Bifosfato de sodio Buffer NAPI AppliChem A3902 Fosfato de sodio Buffer NAPI AppliChem A3905 Inhibidores de proteasas Buffer RIPA Roche 05892970001 Benzonasa nuclease Buffer RIPA Novagen 70664 Inhibidores de fosfatasas Buffer RIPA Roche 4906837001 Solución de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 10% Buffer RIPA Applichem A0676 Desoxicolato de sodio (DOC) Buffer RIPA Sigma-Aldrich D6750 Azul tripán (0.4%) Colorante Invitrogen T10282 65 Suero bovino fetal (FBS) Conservación de células Biowest S1810500 2-propanol Conservación de células AppliChem A3465 Suplemento para medio de crecimiento (EGM-2) Crecimiento de células Lonza H3CC-3162 Solución neutralizadora de tripsina (NTS) Desarrollo de pases celulares Lonza CC5002 Tripsina/EDTA Desarrollo de pases celulares Lonza CC5012 Dimetil sulfóxido Disolución de patrones Conservación de células Applichem A3672 Kit de Sandwich ELISA PathScan® Phospho- VEGFR-2 (Tyr1175) (Cell Signalling) ELISA Cell Signalling 7335C Ácido bicinconínico Recuento de proteínas Sigma-Aldrich B9643 Sodio ortovanadato Recuento de proteínas Sigma-Aldrich S6508 Solución de cobre (II) Recuento de proteínas Sigma-Aldrich C2284 Albúmina de suero bovino Recuento de proteínas Sigma-Aldrich A2153 Trizma®-base TBST Sigma-Aldrich T6066 Tween ® 20 TBST Sigma-Aldrich P9416 Medio basal endotelial (EBM-2) Tramiento con VEGF Lonza H3CC-3156 Buffer fosfato salino de Dulbecco (PBS) con cloruro de calcio y cloruro de magnesio (10x) Tratamiento con VEGF Sigma-Aldrich D1283408 VEGF recombinante humano (165) Tratamiento con VEGF R&D systems 293-VE-010 66 Gentamicina Tratamiento con VEGF Lonza H3CC-4083 Metanol (grado HPLC) Western-blot Merck I525-0940 Anticuerpo PLCγ1 (D9H10, XPxp® Rabbit mAb) Western-blot Cell signalling 5690S Anticuerpo fosforilado de PLCγ1 (Tyr783) Western-blot Cell signalling 2821S Buffer de transferencia (20x) Western-blot NuPAGE NP0006-1 Buffer de electrophoresis Western-blot NuPAGE NP0001 Agente reductor para muestras (ditiotreitol) (10x) Western-blot NuPAGE NP0009 Marcador de proteinas para electroforesis Western-blot NuPAGE LC5602 Sustrato para quimioluminiscencia (Signal West Pico PLUS) Western-blot Pierce 34580 Buffer de separación (stripping buffer) Western-blot Pierce 21059 Anticuerpo fosforilado de eNOS (Ser1177) (C9C3, Rabbit mAb). Western-blot Cell signalling 9570S Anticuerpo fosforilado de Akt (Ser473) (D9E, XP® Rabbit mAb) Western-blot Cell-signalling 4060S Anticuerpo secundario (Rabbit IgG, HRP-Linked) Western-blot Cell signalling 7074S Anticuerpo Akt Western-blot Cell Signalling 9272S Anticuerpo eNOS Western-blot Cell Signalling 9572S Solución de Ponceau S Western-blot Sigma-Aldrich P3504 Antioxidante Western-blot NuPAGE NP0005 Buffer de muestra (dodecilsulfato de litio) (4x) Western-blot NuPAGE NP0007 67 1.8. Líneas celulares Los experimentos realizados para comprobar la posible actividad antiangiogénica de compuestos estilbenoides se hizo sobre la línea de células endoteliales de venas del cordón umbilical humano (HUVEC) suministradas por Lonza (Slough, Reino Unido). 1.9. Instrumentación  Agitador magnético con calefacción, placa de aluminio (VWR, Radnor, Pensilvania, EE.UU).  Agitador orbital MaxQ 4000 (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemania).  Agitador vórtex VV3 (VWR, Radnor, Pensilvania, EE.UU).  Autoclave modelo AES 75L (Raypa, Barcelona, España).  Balanza analítica AB204-S (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, EE.UU).  Baño de ultrasonidos J.P. Selecta UB-1538 (Abrera, Barcelona, España)  Baño termostatizado BAE-2 (Raypa, Barcelona, España).  Bomba de vacío MZ2CNT (Vacuubrand, Wetheim, Alemania).  Cabina de seguridad biológica modelo Advantage (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemania).  Cabina de seguridad biológica modelo BIO II A Mini (Telstar).  Centrífuga Allegra X-22R (Beckman Coulter, Pasadena, California, EE.UU).  Centrífuga diferencial con rotor para tubos falcon de 15 ml modelo 3D-30 (Sigma-Aldrich, Barcelona, España).  Centrífuga Heraeus Megafuge 16R (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemania).  Concentrador de muestras a vacío Hypervac-lite (Gyozen, Corea).  Contador automático de células Countess®C10227 (Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU).  Equipo de Agua Milli-Q modelo Nanopure Diamond (Barnstead, Alemania).  Equipo de espectrometría de alta resolución (HRMS) consistente en un híbrido de cuadrupolo/Orbitrap ® Qexactive (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany) con fuentes de ionización ESI, APCI y nanoESI 68 coplado a un cromatógrafo líquido de ultra-alta eficacia (UHPLC) (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany).  Equipo de quimioluminiscencia Amershan Imager 600 (GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA, USA).  Incubador de CO2 modelo NU-4750E AutoFlowTM (Nuaire, Plymouth, UK).  Incubadora de CO2 para levaduras (INCO, Barcelona, España).  Lector de placas multimodal para medidas de fluorescencia, luminiscencia y absorbancia modelo Synergy HT (BioTek ®, Izasa Scientific, Barcelona, España).  Medidor pH Basic 20 (Crison, L’Hospitalet de Llobregat, Barcelona, España).  Micropipeta de 10, 100 y 1000 µL Eppendorf Research plus (Hamburgo, Alemania).  Micropipeta multicanal de 200 µL Eppendorf Research plus (Hamburgo, Alemania).  Pipeta automatic FastPette™ V2 (Labnet International, Edison, NJ, EE.UU).  Sistema de extracción en fase sólida al vacío (Supelco-Visiprep, Sigma- Aldrich, Barcelona, Spain). 1.10. Material fungible  Agujas (0,8x120 mm) Sterican ® (Braun, Mensulgen, Alemania)  Cámara contadora de células CountessTM (Invitrogen, Oregón, EE.UU)  Cámara de Neubauer improved (Marienfeld, Alemania).  Cartuchos desechables de SPE “PhreeTM phospholipid removal” de 1 mL (Phenomenex ® Torrance, California, EE.UU).  Cartuchos desechables de SPE Mega BE-C18, 1 gm, 6 mL (VARIAN, Agilent Technologies, Santa Clara, California, EE.UU).  Columnas de UHPLC SB-C18 (2,1x5 mm, 1,8 µM) (Agilent, Technologies, Santa Clara, California, EE.UU).  Eppendorff ámbar de poliprolileno de 1,5 mL (Brand, Wertjeim, Alemania)  Film de sellado de poliéster para ELISA (146x79 mm) (VWR, Radnor, Pensilvania, EE.UU). 69  Filtros de jeringa de 13 mm (0.2 µM) de membrana de nylon (Whatman, Buckinghamshire, UK).  Filtros de jeringa de 13 mm (0.45 µM) con membrana de politetrafluoroetileno de (VWR, Radnor, Pensilvania, EE.UU).  Filtros estériles de jeringa de 25 mm (0.2 µM) de membrana de acetato de celulosa (VWR, Radnor, Pensilvania, EE.UU).  Filtros para botellas de 0.2 µM de NalgeneTM (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemania)  Geles de poliacrilamida (4-12% Bis-Tris), 1 mm, 12 pocillos (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemania)  Jeringas estériles sin aguja (1mL) Terumo ® (Leuven, Bélgica)  Jeringas estériles sin aguja (5, 10, 20 mL) BD DiscarditTM II (Huesca, España).  Matraces aforados de 2 mL (Hirschmann, Eberstadt, Alemania)  Matraces Erlenmeyer de 1 L (VWR, Radnor, Pensilvania, EE.UU).  Membranas de nitrocelulosa de 0.2 µM, 7x8.4 cm (BioRad, Hercules, California, EE.UU).  Microinsertos para viales de HPLC de 0,1 mL con muelle (VWR, Radnor, Pensilvania, EE.UU).  Microinsertos para viales de HPLC de 0.2 mL (VWR, Radnor, Pensilvania, EE.UU).  Pipetas de vidrio (Labbox Labware, S.L, Vilassar de Dalt, Barcelona, España)  Pipetas estériles serológicas de 5, 10 y 25 mL (ALP, Chorges, Francia)  Placas de 75 cm2 para cultivo celular, en forma de U (Corning, Nueva York, EE.UU).  Placas de 96 pocillos transparentes (VWR, Radnor, Pensilvania, EE.UU).  Placas estériles de cultivo celular de 6 pocillos Falcon ® (Corning, Nueva York, EE.UU)  Precolumnas para columna de UHPLC ZORBAX SB-C18 (2.1x5 mm, 1,8 µM) (Agilent, Technologies, Santa Clara, California, EE.UU).  Puntas desechables para micropipetas de 10, 100 y 1000 µL (VWR, Radnor, Pensilvania, EE.UU). 70  Rascadores estériles para cultivos celulares Falcon ® (Corning, Nueva York, EE.UU)  Tapones de cauco natural perforados de 40 mm (diámetro superior) x 0,41 mm (diámetro inferior) x 40 mm (altura) (Saint-Gobain, Francia)  Tubos de 30 mL estériles Sterilin San Martino - Trecate (NO) Italy  Tubos de centrífuga estériles de 15 mL de polipropileno Falcon ® (Corning, Nueva York, EE.UU)  Viales ámbar de HPLC de 1,5 mL (32x11.6 mm) con tapones de PTFE con septum rojo de 1 mm (VWR, Radnor, Pensilvania, EE.UU). 1.11. Software informático  StatSoft, Inc. (2004). Statistica Software (Sistema software de análisis de datos), version 7.  Thermo Fisher Scientific (2016) TraceFinder™ Software (Sistema de interpretacion de análisis por HRMS), version 3.1.  Systat Software Inc. (2011) Sigmaplot Software (Sistema de representación gráfica), versión 12.  Thermo Fisher Scientific (2013) ChromeleonTM Software (Sistema para programación de equipos de UHPLC) versión 7.1.  Thermo Fisher Scientific (2013) XcaliburTM Software (Sistema de interpretación de resultados tras análisis pro HRMS), version 3.0.63.  CambridgeSoft Limited (2011) ChemDraw Software (Sistema de representación de estructuras químicas), versión 12.  GraphPad Software, Inc. (2012) Grahpad Software (Sistema de estadística y representación de datos), versión 6.  Microsoft Corporation (2013-2016) Paquete Office Excel® (Sistema de representación y organización de datos), versión 2013-2016.  National Institute of Health (2016) ImageJ Software (Sistema de interpretación de bandas obtenidas por Western-Blot), versión 1.51. 1.12. Levaduras vínicas comerciales Se seleccionaron un total de seis levaduras del género Saccharomyces cerevisiae, entre las cuales destacan dos cepas de la variante S.cerevisiae bayanus (Tabla 6). Además, se incluyeron dos levaduras comerciales de 71 géneros no-Saccharomyces, Metschnikowia pulcherrima y Torulaspora delbrueckii. Todas las cepas fueron adquiridas liofilizadas. Tabla 6. Cepas de levaduras comerciales utilizadas para el desarrollo de las fermentaciones 2. MÉTODOS 2.1. Método de cromatografía líquida de ultra alta eficacia acoplado a espectrometría de masas (UHPLC/HRMS) para la determinación simultanea de compuestos indólicos: Validación (Capítulo 1) Se utilizó un equipo de cromatografía líquida de ultra alta eficacia acoplada a un espectrómetro de masas de alta resolución (UHPLC/HRMS) consistente en un híbrido de cuadrupolo/Orbitrap ® Qexactive. El módulo de UHPLC DionexTM 3000 constó de una bomba (HPG-3400RS), un cargador automático de muestras (WPS-3000RS) y un compartimento para la columna cromatográfica (TCC- 3000RS). Se utilizó una column ZORBAX RRHD SB-C18 (2,1 × 100 mm, 1.8-μm tamaño de partícula) con una precolumna compatible con las mismas características que se mantuvo a 40º C durante el análisis. El equipo constó de dos fases móviles, agua milliQ (A) y metanol (B), ambas con una concentración de 0.1% de ácido fórmico. Se programó un gradiente de elución durante 15 minutos con las siguientes características: Género Cepa Proveedor Metschnikowia pulcherrima Flavia® MP346 Lallemand Saccharomyces cerevisiae Aroma White Enartis Saccharomyces cerevisiae ES488 Enartis Saccharomyces cerevisiae Lalvin ICV GRE Lallemand Saccharomyces cerevisiae Red Fruit Enartis Saccharomyces cerevisiae var. bayanus Lalvin QA23 Lallemand Saccharomyces cerevisiae var. bayanus Uvaferm BC Lallemand Torulaspora delbrueckii BiodivaTM TD291 Lallemand 72  0-2 minutos: 95% A, 5% B  2-13 minutos: 0% A, 95% B  13.1-15 minutos: 95% A, 5% B. El flujo seleccionado fue de 0.5 mL/min mientras que se fijó un volumen de inyección de 5 μL. El compartimento de muestras se mantuvo a 4ºC durante todo el análisis. El equipo se calibró semanalmente siguiendo las indicaciones del fabricante. Con respecto a la espectrometría de masas, se utilizó una fuente de ionización en electrospray con temperatura (HESI) en modo positivo. Las características del método desarrollado se enumeran a continuación:  Temperatura del horno: 440ºC  Temperatura del capilar: 270ºC  Voltaje en spray: 3.5 Kv  Flujo de gas de envoltura (sheath gas): 53 unid. arbitrarias  Flujo de gas auxiliar (auxiliary gas): 14 unid. arbitrarias  Flujo de gas de barrido: 3 unid. Arbitrarias  Energía de colisión normalizada (NCE): 20  Poder de resolución: 35000 de anchura a media altura (FWHM).  Margen de ventana: 1.0 m/z.  Nivel de la radiofrecuencia de la lente (S-lens RF): 50%  Tiempo máximo de inyección: 100 ms  Control automático de ganancia (AGC) en modo dirigido: 1x106 iones Se eligió un método dirigido de fragmentación de masas (target MS2) a través de las masas exactas de los diferentes compuestos indólicos. Los patrones de los nueve derivados del L-triptófano se infusionaron en el equipo utilizando una solución con una mezcla de todos los patrones (ver Tabla 2) a concentraciones entre 3 y 55 ng/mL. Tras ver los fragmentos mayoritarios y el tiempo de retención de cada compuesto, se decidió acotar los minutos del tiempo análisis de la siguiente forma:  Serotonina/5-hidroxitriptófano: Minuto 0,5-2  L-triptófano/Triptamina: Minuto 3,6-4,6  N-acetilserotonina: Minuto 5-5,7 73  Melatonina/Etil ester de triptófano: 6,1-7,6  Triptofol/Ácido 3-indolacético: 6,6-7,6 La validación del método se llevó a cabo siguiendo los parámetros establecidos por la Asociación Oficial de Químicos Analíticos (AOAC). Se calcularon los parámetros de linealidad, repetividad, reproducibilidad y límites de detección y cuantificación. 2.2. Preparación del mosto sintético: Capítulo 1, 2 y 3 Figura 7. Procedimiento de preparación del mosto SM300 En primer lugar, se prepararon las soluciones de aminoácidos, vitaminas, oligoelementos y factores anaerobios. Los aminoácidos se disolvieron en una solución al 2% de bicarbonato de sodio, mientras que las soluciones de vitaminas y oligoelementos se prepararon en agua milliQ. Los factores anaerobios se disolvieron en una solución de etanol: Tween80 al 50% (v/v). Las soluciones de vitaminas, aminoácidos y oligoelementos se esterilizaron por filtración (0.2 µM) y se tomaron las respectivas alicuotas. Posteriormente se añadieron al mosto 13,09 mL/L de la solución de aminoácidos, 10 mL/L de vitaminas y 1 mL/L de Agitación (Tª ambiente) Elementos principales Vitaminas Oligoelementos Aminoácidos Agitación (Tª ambiente) Ajuste pH (3,3) Agua milliQ Esterilización por filtrado (0,2 µm) Almacenamiento (4ºC) 80 con los metabolitos intracelulares se almacena a -80ºC hasta el momento de su análisis. Figura 11. Esquema de la extracción intracelular por el método del etanol en caliente de González et al. 1997 para las muestras intracelulares utilizadas en el capítulo 2 2.5.2.1. Extracción en fase sólida para muestras intracelulares Ya que las levaduras se someten a tratamientos agresivos para poder romper su pared celular, esta matriz suele presentar una alta concentración de fosfolípidos. Para evitar estas interferencias en el posterior análisis, las muestras deben tratarse con unos cartuchos de extracción en fase sólida para la eliminación de fosfolípidos (Phree, Phenomenex®). El adsorbente de estos cartuchos provoca la adhesión de fosfolípidos, previa precipitación de los mismos en la muestra. El procedimiento consiste en añadir a los cartuchos una solución de metanol y ácido fórmico (1%) y una pequeña cantidad de muestra (100 µL) respetando una proporción entre ambas soluciones de 1:4. Posteriormente, la mezcla se hace pasar por el cartucho con la ayuda de una bomba de vacío, estando en contacto con el material adsorbente al menos durante 5 minutos, para obtener el extracto 81 final. Los extractos resuspendidos se analizaron a través del equipo de UHPLC/HRMS con el método previamente validado. 2.6. Ensayos para la determinación de la actividad anti-angiogénica de los estilbenos (Capítulo 6) 2.6.1. Cultivo de células Las células fueron utilizadas entre el pase 4 y 5. Se sembraron en placas de 6 pocillos estériles en un medio de crecimiento específico para HUVEC (Endothelial Growth Medium-2, EGM-2) suministrado por Lonza (Slough, UK) hasta la total confluencia de las mismas (5-6 días). Los cultivos se mantuvieron en incubadores a 37ºC a una atmósfera de un 5% de CO2. 2.6.2. Tratamiento celular Las placas con las células confluentes se sometieron a un tratamiento donde se utilizó un medio basal (Endothelial Basal Medium, EBM) adquirido por Lonza (Slough, UK) al que sólo se añadió antibiótico (15 mg de gentamicina + 7.5 µg de anfotericina B) para evitar la contaminación por microorganismos. El procedimiento se describe brevemente en la Figura 12. Figura 12. Procedimiento llevado a cabo sobre células HUVEC en presencia de estilbenos y VEGF VEGF Estilbeno Células confluentes C+C- Compuesto + +- - - + Incubación 5’ Incubación VEGFR-2: 5’ PLCγ1: 10’ Akt, eNOS: 60’ Lavado Centrifugación Recolección proteínas Recuento proteínas (BCA) ELISA (pVEGFR-2) IC50 Western-blot Relación proteína fosforilada/total 13000 rpm, 10’ 37º C 37º C 82 En primer lugar, se realiza un mix de VEGF (25 ng/mL) + estilbenos (0.5-50 µM) que se incuba durante 5 minutos. Posteriormente, las células se incuban con este mix a un tiempo variable, según la proteína a evaluar. En el caso de la evaluación de la inhibición del pVEGFR-2, se incuban 5 minutos, para PLCγ1 10 minutos y para Akt y eNOS 60 minutos (Moyle et al., 2015). Tras la incubación, las células se lavan con un Buffer fosfato salino (PBS) y se lisan usando un buffer para radioinmunoprecipitación (RIPA) en cuya composición se encuentra un digestor de ADN (benzonasa nucleasa) y protectores de la proteína fosforilada (inhibidores de fosfatas y proteasas). Las proteínas son recolectadas tras utilizar raspadores desechables en cada pocillo y se centrifugan a 13000 rpm durante 10 minutos. Las muestras (el sobrenadante) se congelan a -80ºC. 2.6.3. Recuento de proteínas Para el recuento de proteínas totales se utiliza el método espectrofotométrico del ácido bicinconínico (BCA). Este método utiliza la capacidad de algunos aminoácidos (cisteína, cistina, tirosina, triptófano) para convertir el ion de Cu+2 a Cu+1 en un medio salino a 37ºC. Posteriormente, ese ion de Cu+1 reacciona con el BCA dando lugar a un cromóforo, el cual se puede medir su absorbancia a 550 nm. La señal de las proteínas en las muestras se compara con una recta de calibrado realizada con albúmina de suero bovino (BSA). La determinación de las proteínas totales nos permite incluir en los ensayos de ELISA y Western blot la misma cantidad de proteínas de las distintas muestras de tal manera que se puedan comparar los resultados entre ellas. 2.6.4. Determinación del potencial anti-VEGF de los estilbenos por el método ELISA: Estimación del IC50 Se utilizó un kit de ELISA específico que mide la fosforilación del VEGFR-2 en el residuo de Tirosina 1175 (Cell Signalling Technology, Danvers, MA, USA). El ensayo utiliza las muestras de proteínas a una concentración por pocillo normalizada, de manera que los resultados sean comparables entre sí. Las proteínas se incuban durante 1h a 37ºC con el anticuerpo específico para el 83 residuo de tirosina y posteriormente, se añade el anticuerpo secundario y se vuelve a incubar a (37ºC, 30 minutos). Transcurrido el tiempo, se agrega un sustrato a temperatura ambiente que aporta color al unirse con el anticuerpo secundario. Pasados 30 minutos, se añade una solución que interrumpe esta reacción, y se mide la absorbancia en un lector de placas a 450 y 550 nm. Los datos de absorbancia nos permiten realizar los cálculos de IC50 para cada estilbeno, utilizando el software GraphPad Prism. 2.6.5. Análisis de PLCγ1, Akt e eNOS por el ensayo de western-blot El lisado de proteínas (la misma cantidad de proteínas para cada muestra) se mezcla con un tampón (dodecilsulfato de litio, LDS) y un agente reductor especial para la electroforesis (ditiotreitol, DTT). Tras mezclarlo, las proteínas se desnaturalizan en un termobloque (70ºC, 10 minutos) antes de colocarlas en un gel de poliacrilamida (4-12%) para la separación de las mismas (200 V, 45 minutos). Posteriormente, las proteínas se traspasan a una membrana de nitrocelulosa, la cual es tratada durante 1 h con una solución de albúmina de suero bovino (BSA) en TBST (5%). A continuación, se añaden los anticuerpos de las proteínas fosforiladas y se incuban a 4ºC al menos durante 12 h. Después, se incuba 1 h con el anticuerpo secundario y se mide la intensidad de las bandas por quimioluminiscencia con el kit de sustrato para quimioluminiscencia Signal West Pico PLUS (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany). Tras esta media, las membranas vuelven a tratarse para separar los anticuerpos fosforilados y realizar el tratamiento de nuevo con BSA para inbucar las membranas con los anticuerpos totales. 84 BIBLIOGRAFÍA Biais, B., Krisa, S., Cluzet, S., Da Costa, G., Waffo-Teguo, P., Mérillon, J. M., & Richard, T. (2017). Antioxidant and Cytoprotective Activities of Grapevine Stilbenes. 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Stilbenes from common spruce (Picea abies) bark as natural antifungal agent against downy mildew (Plasmopara viticola). Industrial Crops and Products, 103(January), 267–273. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2017.04.009 Gonzalez, B., François, J., & Renaud, M. (1997). A rapid and reliable method for metabolite extraction in yeast using boiling buffered ethanol. Yeast, 13(14), 1347–1356. https://doi.org/10.1002/(SICI)1097- 0061(199711)13:14<1347::AID-YEA176>3.0.CO;2-O Moyle, C. W. A., Cerezo, A. B., Winterbone, M. S., Hollands, W. J., Alexeev, Y., Needs, P. W., & Kroon, P. A. (2015). Potent inhibition of VEGFR-2 activation by tight binding of green tea epigallocatechin gallate and apple procyanidins to VEGF: Relevance to angiogenesis. Molecular Nutrition and Food Research, 59(3), 401–412. https://doi.org/10.1002/mnfr.201400478 Riou, C., Nicaud, J. M., Barre, P., & Gaillardin, C. (1997). Stationary-phase gene expression in Saccharomyces cerevisiae during wine fermentation. Yeast, 13(10), 903–915. https://doi.org/10.1002/(SICI)1097- 0061(199708)13:10<903::AID-YEA145>3.0.CO;2-1 85 RESULTADOS 86 CAPÍTULO 1 / CHAPTER 1 Fernández-Cruz, E; Álvarez-Fernández, M. Antonia., Valero, E., Troncoso, A.M., García-Parrilla, M.C. VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO PARA DETERMINAR MELATONINA Y OTROS COMPUESTOS DERIVADOS DEL METABOLISMO DEL L-TRIPTÓFANO POR UHPLC/HRMS VALIDATION OF AN ANALYTICAL METHOD TO DETERMINE MELATONIN AND COMPOUNDS RELATED TO L- TRYPTOPHAN METABOLISM USING UHPLC/HRMS Food Anylitical Methods 2016, 9 (12), 3327-3336 87 Validation of an analytical method to determine melatonin and 1 compounds related to L-Tryptophan metabolism using 2 UHPLC/HRMS 3 4 Fernández-Cruz, E.ª; Álvarez-Fernández, M. Antonia.ª, Valero, E.b, Troncoso, A.M.a, 5 García-Parrilla, M.C.a* 6 7 aDepartment of Food Science and Nutrition, Faculty of Pharmacy, University of Seville, 8 C/ Profesor García González 2, 41012, Sevilla, Spain. 9 bDepartment of Food Science and Nutrition, Faculty of Experimental Science, 10 University Pablo de Olavide, Carretera de Utrera Km. 1, 41013, Sevilla, Spain. 11 Corresponding author. Tel.: +34 95 4556759. 12 E-mail address: [email protected] (MC. García-Parrilla). 13 14 15 16 17 18 19 20 21 88 Abstract 22 Melatonin is a bioactive compound that is present in wines because of the metabolism of 23 L-Tryptophan by yeasts. Even though the complete pathway of synthesis is not well 24 elucidated, certain related indolic compounds might be involved in it. Consequently, their 25 determination is a matter of interest. On one hand, their formation during fermentation 26 might be related to a specific role for yeast’s metabolism, not known so far. On the other 27 hand, the synthesis by yeasts of bioactive compounds with putative health benefits for 28 consumers, such as melatonin or serotonin, is a relevant matter. 29 This paper aims to develop and validate an analytical method by Ultra High Performance 30 Liquid Chromatography coupled to High Resolution Mass Spectrometry 31 (UHPLC/HRMS) to monitor both melatonin and related indolic compounds, in order to 32 decrease their detection limits and make it possible to assess their occurrence in culture 33 medium and fermented products. In addition, the other objective is to evaluate the 34 production of these compounds by a commercial Saccharomyces cerevisiae used to make 35 white wines. 36 Diminishing the limit of detection below 0.5 ng mL-1 for all compounds under study is an 37 achievement of this work. Furthermore, the strain under study (AROMA WHITE) has 38 been found to synthetize melatonin and related compounds as serotonin. Additionally, the 39 evolution of these compounds over time may contribute to understanding the role they 40 play in yeast metabolism. 41 Keywords: indolic compounds, wine, yeast, Saccharomyces, synthetic must, exact mass. 42 43 44 89 Introduction 45 Melatonin (MEL) has previously been evidenced in wines (Mercolini et al. 2008, 2012, 46 Stege et al. 2010, Rodriguez-Naranjo, Gil-Izquierdo, Troncoso, Cantos, et al. 2011, 47 Vitalini et al. 2013, Vigentini et al. 2015). Despite it having been detected in wine after 48 fermentation, revealing the role of Saccharomyces cerevisiae, little is known beyond this; 49 specifically, its formation by yeasts under fermentation conditions needs to be unravelled. 50 Nevertheless, L-tryptophan (L-TRP) has been pinpointed as its precursor (Sprenger et al. 51 1999, Murch et al. 2000). Additionally, serotonin (SERO), which happens to be an 52 intermediary in the MEL pathway in plants (Iriti 2009, Feng et al. 2014), has been 53 reported in wines (Manfroi et al. 2009, Wang et al. 2014). On the other hand, literature 54 on the chemical composition of wines describes that some of these indolic compounds, 55 such as Tryptophol (TOL) and 3-indolylacetic acid (3-IAA), are present in wines (Mattivi 56 et al. 1999, Maslov et al. 2011, Favre et al. 2014) being the latest an off-flavour. 57 Other analytical techniques to determine L-TRP and derivative compounds in wines have 58 been previously used (García-Parrilla et al. 2009). It is worth mentioning the ELISA 59 assay, since it was used to identify MEL in serum (Welp et al. 2010). However, ELISA 60 results were reported to be inaccurate for wine analysis due to matrix effects (Rodriguez- 61 Naranjo, Gil-Izquierdo, Troncoso, Cantos, et al. 2011). Indeed, the presence of a 62 substance with a similar structure in wines could cause interference. 63 Originally, HPLC coupled with fluorescence detectors was used (Mattivi et al. 1999, 64 Mercolini et al. 2008), but this technique is not suitable for unequivocal identification and 65 therefore mass spectrometry techniques were preferred (Kocadağlı et al. 2014). At 66 present, hybrid quadrupole-orbitrap offers a more accurate analysis of compounds based 67 on the use of exact mass. Therefore, the optimization of an analytical method based on 68 96 Statistical analysis 211 Differences between the indolic compounds during fermentation by S.cerevisiae 212 AROMA WHITE were determined with one-way ANOVA analysis by the Statistica 213 Software (StaSoft Inc 2005). The significance level was set at p < 0.05. 214 215 Results and discussion 216 UHPLC/HRMS method optimization 217 An analytical method by UHPLC/HRMS was optimized to determine L-TRP and 218 derivative compounds. Figure 2 shows the chromatographic peaks obtained for each 219 compound. A run time of less than 8 minutes was achieved. Good resolution was observed 220 in the analysis due to the sensitivity of the Qexactive. The order of elution was as follows: 221 SERO and 5-HTRP appeared first, with a retention time (RT) of less than 2 minutes; 222 subsequently, L-TRP and TRYPT eluted after 4 minutes. Even though there was a 223 significant time space between the first two analytes and the following ones, the most 224 suitable peak resolution was achieved this way. NACSERO had an RT of 5.24 minutes, 225 whereas L-TRP EE was eluted at 6.63 minutes. The rest of the compounds (TOL, 3-IAA, 226 MEL) were obtained at an RT of between 7.09 and 7.14 minutes. Exact mass allowed each 227 peak to be identified, even though the RT differs within just a few seconds. Table 1 228 displays the RT, accurate mass of main fragment [M+H]+, relative intensities found, 229 chemical formula and calculated error (ppm) for the compounds included in this study. 230 Error was below 3 ppm in all cases. SERO, TRYPT, 3-IAA acid and TOL had only one 231 main fragment. SERO fragmentation m/z 160.07544 was the result of the loss of an amine 232 group. This fact was common to most of the compounds, since its bond with the indolic 233 ring was quite weak, as in the case of TRYPT (m/z 144.08038). TOL presented 234 97 dehydroxylation of the hydroxyl group (m/z 144.08053). 3-IAA obtained its main 235 fragment m/z 130.06501 after the loss of the carboxyl group in the lateral chain. These 236 functional groups were putatively the weakest, so they were easily breakable during the 237 analysis. The 5-HTRP showed a main fragment m/z 204.06520 that was also due to a 238 deamination. However, it also presented another fragment (m/z 162.05480), whose 239 formation is not yet clear, but which was useful to identify the compound. NACSERO 240 had the same identification fragment as SERO (m/z 160.07542). MEL and L-TRP EE 241 shared a molecular formula and exact mass. Iriti et al. (Gardana et al. 2014) has previously 242 described the pattern of fragmentation of each compound. Even though they had similar 243 fragmentations determined with a QTRAP (m/z 233  m/z 174 and m/z 233  m/z 216), 244 their different RT and fragment intensities allowed them to be identified without any 245 misinterpretation of the data obtained. 246 247 Method validation 248 Table 2 shows the validation parameters of the analytical method, including linearity, 249 LOD, LOQ, within-lab reproducibility and repeatability for the 9 compounds analysed. 250 Linearity values were calculated through the correlation coefficient (R2) of the curves 251 obtained for each compound within the expected range of concentrations. All the values 252 had an R2 between 0.998-1.000, showing quite good linearity. The repeatability values 253 obtained for all compounds were below 2% with the exception of SERO which highest 254 value was near 21 % but within the AOAC recommendations. On the other hand, 255 reproducibility reached values between 4 and 26 %. The AOAC recommends a 256 reproducibility of 45-32 % for the low limit (5 ng mL-1) and 32-16 % for the other 257 concentrations analysed, so reproducibility was adequate. 258 98 Regarding LOD values, we could achieve to decrease MEL LOD to 0.0047 ng ml-1. As 259 far as MEL is concerned, other authors have reported LOD values for MEL determined 260 by HPLC-MS/MS on different matrixes. Kocadağlı et al. analysed MEL in red wine and 261 obtained a LOD of 0.034 ng mL-1 with a triple quadrupole (Kocadağlı et al. 2014). On 262 the other hand, a LOD of 30.16 ng mL-1 was reported in a study of MEL during all the 263 steps of the winemaking (Gomez et al. 2012). Rodriguez-Naranjo et al obtained a LOD 264 of and 0.13 ng mL-1 by using a ion-trap in the study of MEL in wine (Rodriguez-Naranjo, 265 Gil-Izquierdo, Troncoso, Cantos, et al. 2011). Even though these values are quite low, 266 they are higher than the one achieved in this work. Thus, working with a hybrid 267 quadrupole-orbitrap mass spectrometer demonstrated a better election when it is 268 necessary to low the LOD values in order to improve the analysis. 269 270 Analysis of indolic compounds during fermentation in SM 271 In order to test the suitability of the method to monitor the evolution of L-TRP derivatives 272 during fermentation, an experiment with S.cerevisiae var. AROMA WHITE was 273 performed. Figure 3 shows the evolution of cell density during alcoholic fermentation. 274 Cell population underwent a significant growth rate reaching the maximum at day 2. 275 Then, it decreased quickly at day 3 and it was remained constant until the end of alcoholic 276 fermentation (day 7) in a SM. The indolic compounds under study were monitored over 277 this period. The results are shown in Table 3. It is important to note that all of the 278 compounds were determined at least once during the fermentation experiment, except for 279 NACSERO. The concentration of L-TRP, which is the precursor of the pathway, 280 decreased during fermentation, as expected. Yeasts need this amino acid to synthesize the 281 rest of the compounds. Gil-Agustí et al. (Gil-Agustí et al. 2007) analysed L-TRP content 282 99 in wines and found low concentrations (0.20-1.98 ng mL-1). In contrast, levels in must of 283 around 7000 ng mL-1 have been reported. Although its levels in the same wine after 284 alcoholic and malolactic fermentation were lower (3,660 ng mL-1 and 3.11x106 ng mL-1, 285 respectively) (Wang et al. 2014) those values are higher than the ones obtained in this 286 experiment. On the other hand, the presence of 5-HTRP also decreased. To the best of 287 our knowledge, this is the first time it has been determined in SM fermented with 288 S.cerevisiae. At the beginning of fermentation, the highest concentrations were 289 quantified; these subsequently decreased during the process (19 to 3 ng mL-1). Solutions 290 of amino acids, trace elements, vitamins and anaerobic factors added to the SM were 291 analysed and results showed that the initial amount of 5-HTRP that was observed in the 292 SM was originally present in the solution of amino acids added before the fermentation 293 process. Although yeasts did not synthetized this compound, they used it as a minority 294 nitrogen source. 295 SERO increased during fermentation from less than 1 ng mL-1 to more than 4.5 ng mL-1. 296 Nevertheless, concentrations 1,000 times higher have been assessed in wines (nearly 3000 297 ng mL-1) following malolactic fermentation (Wang et al. 2014). The maximum 298 concentration of MEL was achieved at day 2, coinciding with Rodríguez-Naranjo et al. 299 and Iriti et al. (Rodriguez-Naranjo, Gil-Izquierdo, Troncoso, Cantos, et al. 2011, 300 Vigentini et al. 2015). It seems to be directly related with the cell growth at day 2, when 301 it also reached the maximum value. Then, MEL content also decreased until it completely 302 disappear at day 5. Other authors also detected MEL from day 2 but its concentration 303 remained constant during time (Gomez et al. 2012). TRYPT was also synthetized during 304 fermentation, but at lower levels (0.7 - 1.60 ng mL-1) than have been reported before (Gil- 305 Agustí et al. 2007, Rodriguez-Naranjo et al. 2013). Even though yeasts played an 306 100 important role in its formation, the reached concentrations did not show this metabolite 307 was a main one of the L-TRP metabolism. 308 Furthermore, the concentration of 3-IAA increased sharply in day 1 up to 84 ng mL-1 and 309 then decreased, especially between day 1 and day 3 to 3 ng mL-1. Maslov et al. found 310 higher concentrations in final wines (25-30 ng mL-1) (Maslov et al. 2011). This metabolite 311 appeared in the solution of amino acids, so it was observed at day 0. The significant 312 increase at day 1 brings to light that yeasts synthetized it during fermentation process. 313 Sitbon et al. and Hoenicke et al. highlighted that 3-IAA can be conjugated with other 314 compounds in order to protect the molecule from oxidation, showing a decrease at the 315 following days (Sitbon et al. 1993, Hoenicke et al. 2001). This hypothesis is supported 316 by our data. 317 On the other hand, TOL concentration was the highest of the analytes since it is a main 318 metabolite of the L-TRP metabolism in yeasts (Mas et al. 2014). On day 1, the 319 concentration obtained was 14,000 ng mL-1 and on day 3, it increased up to 19,000 ng 320 mL-1. Nevertheless, its levels had decreased to 16,500 ng mL-1 by day 7. Favre et al. found 321 low quantities in Tannat wines (640-1,450 ng mL-1), but the wine-making procedure 322 influenced this data (Favre et al. 2014). 323 In relation to L-TRP EE, a continuous increase was noticed during fermentation: from 324 2.20 ng mL-1 on day 2, to 17.48 ng mL-1 on day 7. Iriti et al. also reported concentrations 325 of this compound in the laboratory medium (Vigentini et al. 2015), but they found a 326 tendency to decrease over time, which could be attributed either to the different strain 327 used or medium composition. Unlike the SM used in this work, their medium 328 compositionconsisted on buffered liquid mineral medium, containing glucose and yeast 329 nitrogen base (YNB) with 2 different concentrations of L-TRP (20 and 100 mg L-1). 330 101 Yeasts use L-TRP and transform it into metabolites by different pathways. In this study, 331 the synthesis of MEL via 5-HTRP was studied. The obtained data supports that 5-HTRP 332 is used during the first steps of the fermentation but is not synthetized by yeasts. Then, 5- 333 HTRP decreases afterwards, while the other intermediates start to increase. Despite 334 SERO being the precursor of MEL, it keeps increasing while MEL appears in a very tiny 335 quantity and finally disappears. On the other hand, there are alternative pathways that 336 were used by yeasts and were evidenced in the analysis. The formation of TOL and 3- 337 IAA as main metabolites were the preferred pathways during fermentation process, 338 according to other authors (Kradolfer et al. 1982, Mas et al. 2014). While TOL is clearly 339 a waste product, which accumulates in the medium, 3-IAA have a maximum production 340 peak and then starts to disappear until the end of fermentation. The formation of TRYPT 341 occurred, but were not preferential by yeasts. Other pathways such as the kynurenic acid 342 were not included on this study, even though other authors have evidenced it in the 343 metabolism of S. uvarum (Mariko Shin, Tetsuro Shinguu, Keiji Sano 1991). 344 345 Conclusions 346 A validated method for the identification of derivative compounds of the L-TRP. 347 metabolism was developed successfully and LOD and LOQ were lowered with the use of 348 a hybrid quadrupole-orbitrap. It is clear that determined compounds (5-HTRP, SERO, 349 MEL, 3-IAA, TRYPT, TOL, L-TRP EE) are involved in Saccharomyces metabolism and 350 this is a point of departure for further studies, which are required to understand their role. 351 In addition, 5-HTRP was identified in must for the first time. Nevertheless, there is still a 352 need to study yeast metabolism of L-TRP derivatives in greater depth. 353 354 102 Acknowledgements 355 The authors would like to acknowledge the financial support of the Spanish Ministry of 356 Education, Culture and Sport (FPU13/04820). The authors would also like to thank Rocio 357 Valderrama for her technical support at HRMS central service. 358 359 Compliance with Ethical Standards 360 Funding: This work was funded by the Spanish Ministry of Economy and 361 Competitiveness (AGL2013-47300-C3-2-R). 362 Conflict of interest: Edwin Fernández-Cruz, M.Antonia Álvarez-Fernández, Eva Valero, 363 A.M. Troncoso and M.C. García-Parrilla declare that they have no conflict of interest. 364 This study does not contain any studies with human or animal subjects. 365 Ethical approval: This article does not contain any studies with human participants 366 performed by any of the authors. 367 Informed consent: Not applicable. 368 369 103 References 370 AOAC (2012) Appendix F: Guidelines for Standard Method Performance Requirements. 371 Favre G, Peña-Neira Á, Baldi C, et al (2014) Low molecular-weight phenols in Tannat 372 wines made by alternative winemaking procedures. Food Chem 158:504–512. doi: 373 10.1016/j.foodchem.2014.02.173 374 Feng X, Wang M, Zhao Y, et al (2014) Melatonin from different fruit sources, functional 375 roles, and analytical methods. Trends Food Sci Technol 37:21–31. doi: 376 10.1016/j.tifs.2014.02.001 377 Garcia-Parrilla MC, Cantos E, Troncoso AM (2009) Analysis of melatonin in foods. 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Validation parameters of analytical method: linearity (R2), range of calibration, LOD, LOQ (ng mL-1), within-lab reproducibility and repeatability in three levels each (5, 25 and 50 ng mL-1) represented by RSD (%). 113 1 Table 3 Evolution of indolic compounds related to L-TRP during fermentation in SM (day 1–7) Compound Day 0 Day 1 Day 2 Day 3 Day 4 Day 5 Day 6 Day 7 SERO nq 0.67 ± 0.31cdefgh 2.41 ± 0.46befgh 2.50 ± 0.64bgh 3.35 ± 0.17bcgh 3.44 ± 0.23bcgh 4.61 ± 0.55bcdef 4.70 ± 0.63bcdef 5-HTRP 23.28 ± 0.02bcdefgh 18.51 ± 0.19acdefgh 10.90 ± 0.03abdefgh 8.70 ± 0.18abcefgh 5.96 ± 0.06abcdfgh 4.93 ± 0.03abcdegh 4.04 ± 0.11abcdefh 3.12 ± 0.03abcdefg L-TRP 27914.49 ± 58.03bcdefgh 5346.33 ± 68.51acdefgh 836.20 ± 33.24abdefgh 26.81 ± 1.10abcgh 26.60 ± 0.43abcfgh 25.40 ± 0.45abcegh 34.83 ± 1.02abcdefh 46.50 ± 0.61abcdefg TRYPT 2.45 ± 0.02bcdegh 0.79 ± 0.28agh 0.88 ± 0.12adegh 1.25 ± 0.11ac 1.35 ± 0.26ac 1.47 ± 0.55 1.68 ± 0.28abc 1.53 ± 0.27abc NACSERO nq nd nd nd nd nd nd nd Main values and standard deviation are represented (ng mL−1 ) ªSignificant differences with day 0 b Significant differences with day 1 c Significant differences with day 2 d Significant differences with day 3 e Significant differences with day 4 f Significant differences with day 5 g Significant differences with day 6 h Significant differences with day 7 L-TRP EE 0.94 ± 0.01 cdefgh nq 2.20 ± 0.01 adefgh 3.43 ± 0.10 acefgh 5.40 ± 0.06acdfgh 10.02 ± 0.05acdegh 12.30 ± 0.08 acdefh 17.48 ± 0.13 acdefg TOL 174.97 ± 0.74 bcdefgh 14157.97 ± 222.12 acdefgh 16245.06 ± 288.86 abdefgh 19206.29 ± 473.57abch 19277.6 ± 40.95 abcfgh 18603.58 ± 58.36abce 18231.62 ± 383.12abce 18255.62 ± 220.04abcde 3-IAA 0.75 ± 0.04bcdefg 83.81 ± 1.86 acdefg 12.58 ± 0.40 abdefg 3.63 ± 0.18 abcefg 1.66 ± 0.01 abcdg 1.66 ± 0.05 abcdg 0.88 ± 0.03 abcdef nq MEL nq 0.06 ± 0.01ce 0.14 ± 0.00 bdef 0.07 ± 0.01ce 0.04 ± 0.01 bcdf 0.06 ± 0.00ce nq nq Table 3. Evolution of indolic compounds related to L-TRP during fermentation in SM (day 1-7). Main values and standard deviation are represented (ng mL-1). 114 CAPÍTULO 2 / CHAPTER 2 Fernández-Cruz, E., Carrasco-Galán, F., Cerezo-López, A.B., Troncoso, A. M., García-Parrilla, M.C. EFECTO MATRIZ Y SU INFLUENCIA EN LA ESTABILIDAD DE MELATONINA Y COMPUESTOS DERIVADOS DEL TRIPTÓFANO EN DIFERENTES CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO MATRIX EFFECT ON THE STABILITY OF MELATONIN AND OTHER TRYPTOPHAN DERIVED COMPOUNDS AT DIFFERENT STORAGE CONDITIONS FIRST DRAFT 115 Matrix effect on the stability of melatonin and other tryptophan derived 1 compounds at different storage conditions 2 Fernández-Cruz, E., Carrasco-Galán, F., Cerezo-López, A.B., Troncoso, A. M., García- 3 Parrilla, M.C*. 4 Departamento de Nutrición y Bromatología, Toxicología y Medicina Legal. Facultad de 5 Farmacia. Universidad de Sevilla. C/ Profesor García González 2, 41012, Sevilla, Spain 6 *Corresponding author: 7 E-mail address: [email protected]s (M.C. García-Parrilla) 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 116 Abstract 26 Melatonin is a bioactive compound that is synthesised by yeast during alcoholic 27 fermentation, using the amino acid tryptophan as a precursor. Its occurrence has been 28 described in fermented products such as wine, beer, synthetic medium and so others at 29 trace levels. Due to the low concentrations found in these fermented products, melatonin 30 and other derived compounds of the amino acid L-tryptophan are suitable to be affected 31 by the composition of different matrices. In the present work, effects of temperature (4º, 32 -20º, -80ºC) and concentration (low and high) were analised in four matrixes (white wine, 33 pilsner beer, fermented synthetic must, intracellular Sacharomyces cerevisiae extract) 34 during storage. Results show that beer is the matrix with less changes during storage in 35 low and high presence of indolic compounds, being 4ºC for 1 week the best condition to 36 maintain them unalterable. 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 117 Introduction 50 Melatonin (MLT) is a neurohormone that is synthesised from the amino acid tryptophan 51 (L-TRP) in mammals, plants and microorganisms (Murch et al., 2000; Slominski et al., 52 2002; Sprenger et al., 1999). In mammals, the metabolic pathway encompasses different 53 intermediates such as 5-hydroxytryptophan (5-HTRP), serotonin (5-HT) and N- 54 acetylserotonin (NA5-HT) in mammals (Slominski et al., 2002). Plants can also follow 55 this pathway, but they use tryptamine (TRY) instead of 5-HTRP to form serotonin (5- 56 HT). Microorganism such as yeast have proved to synthesized MLT in presence of L- 57 TRP (Rodríguez-Naranjo et al., 2012; Sprenger et al., 1999), although the conversion of 58 5-HTRP to 5HT is quite rate-limiting in S. cerevisiae. However, MLT has been reported 59 in fermented products by the presence of this yeast such as wine (Rodriguez-Naranjo et 60 al., 2011), beer (Garcia-Moreno et al., 2013), orange juice (Fernández-Pachón et al., 61 2014) and bread (Yılmaz et al., 2014). 62 Melatonin concentration in fermented beverages is usually at trace levels (ng/mL). Wine 63 is the alcoholic beverage where MLT has been quantified the most (Meng et al., 2017) 64 However, its amount depends on the analytical technique. In Sangiovese and Trebbiano 65 wines, between 0.4-0.5 ng/mL of MLT were reported using a HPLC-F. Even lower 66 concentrations (0.16-0.32 ng/mL) were found in Cabernet Sauvignon, Malbec and 67 Chardonnay wines using a capillary electrochromatography (Stege et al., 2010). 68 However, higher levels) were found in Merlot and Groppello (4-8 ng/mL wines using a 69 triple quadrupole mass spectrometer (Vitalini et al., 2011). Rodriguez et al. analysed MLT 70 with an ion trap mass spectrometer in different wines and found lower concentrations 71 (5.1-129.5 ng/mL). Melatonin content in beer has been scarcely reported in literature. 72 Concentrations between 51.8 y 169.7 pg/mL were found in commercial beers. However, 73 ELISA assay was performed instead of chromatographic techniques (Maldonado et al., 74 118 2009). Other compounds of the MEL pathway such serotonin have been described in 75 beers (Kirschbaum et al., 1999). However, other L-TRP derived compounds from the 76 catabolic Ehrlich pathway by yeast (Hazelwood et al., 2008) have been described in beers 77 such as tryptophol (Bartolomé et al., 2000), which is also present in wines (Favre et al., 78 2014; Gil and Gómez-Cordovés, 1986), and 3-indolacetic acid (3-IAA) (Maslov et al., 79 2011). 80 These compounds are formed during the alcoholic fermentation by yeast (Rodríguez- 81 Naranjo et al., 2012). It has been reported the synthesis of MLT in pomegranate wines 82 (Mena et al., 2012), orange juice (Fernández-Pachón et al., 2014) and synthetic must 83 (Fernández-Cruz et al., 2017). However, fermented must is an intermediate product and 84 changes should be consider to take place. 85 Due to the complexity of food matrices and the low amounts of MEL and L-TRP-derived 86 compounds reported on literature is surprising to find no works studying the matrix effect 87 on stability of these compounds during storage conditions. The aim of this work is to 88 study different conditions of temperature and indolic compound concentration during 89 storage time in order to gain more knowledge about how the occurrence of these 90 compounds is suitable to be affected. 91 Material and methods 92 Reageants 93 Standards of 5-HTRP, SERO, NACSERO, MEL, TRYPT, 3-IAA, TOL and L-TRP EE 94 and 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) were supplied by 95 Sigma Aldrick (St. Louis, MO, USA). L-tryptophan standard was purchased from 96 Panreac (Darmstadt, Germany). Methanol LC/MS grade was supplied from Merck 97 119 (Darmstadt, Germany) and formic acid (99%) LC/MS grade was provided from Prolabo® 98 (Obregon, Mexico). 99 Commercial beverages 100 Both pilsner beer and white wine bottle were purchased in a local market at glass-bottle 101 format. Pilsner beer has an alcoholic content of 4.6º while white wine had 12.5º. 102 Synthetic must and fermentations 103 Synthetic medium (SM) was based on previous works (Fernández-Cruz et al., 2016). 104 Basically, SM presents 200 g/Lof sugars (fructose and glucose 1:1) and nitrogen sources 105 provided by ammonium and amino acids, allowing a yeast assimilable nitrogen (YAN) 106 of 300 mg/L. Synthetic must was prepared under sterile conditions and was fermented 107 with a Saccharomyces cerevisiae strain (Aroma White). The inoculum was prepared to 108 have an initial population of 106 cell/mL. Fermentation was carried out for 15 days in 1 109 L flasks with 750 mL of SM at 28ºC and 150 rpm. Flasks were daily weighed to ensure 110 the correct development of fermentations that were performed by triplicate. 111 Sampling 112 After 15 days of fermentations, cells were counted with a Neubauer chamber in order to 113 take SM aliquots containing 109 cell/mL. Then, samples were centrifuged and the 114 supernatant was collected in dark-flasks. On the other hand, cell pellet was washed twice 115 with milliQ water to remove the extracellular metabolites. Intracelullar compounds were 116 extracted following the method of González et al. (Gonzalez et al., 1997). Briefly, a 117 solution of ethanol (75%) with HEPES (50 µM) was heat until boiling and added to the 118 pellet. Then, samples were placed in a heated bath (80ºC) for 3 minutes and then, were 119 place on ice. Subsequently, they were dried with a vacuum concentrator 120 (HyperVACLITE, Gyrozen, Seoul, Korea) and the pellet was suspended in milliQ water. 121 120 Samples were centrifuge (5000 g, 10 minutes, 4ºC) and the supernatant was collected in 122 a dark-glass vial. 123 Aliquot preparation 124 Three clusters of the four matrices were prepared as follows: solutions with no standard 125 addition; solutions enriched with 2 ng/mL of each indolic compound; solution with 200 126 ng/mL of indolic compound. The three clusters were repeated twice more in order to 127 storage the same samples at 4º, -20ºC and -80ºC. Samples were initially treated and 128 subsequently at 7 and 15 days. 129 Solid phase extraction 130 Commercial beverages and synthetic must were loaded in a solid phase extraction (SPE) 131 cartridge (VALIAN, Agilent) following the method described for Fernandez-Cruz et al. 132 (Fernández-Cruz et al., 2017). Extracts were dried in a vaccum concentrator 133 (HyperVACLITE, Gyrozen, Seoul, Korea) and suspended in methanol:milliQ water 134 solution (1:1) with formic acid (0.1%) previously to the UHPLC/HRMS analysis. 135 UHPLC/HRMS 136 An UHPLC Dionex Ultimate 3000 system (ThermoScientific, San Jose, USA), coupled 137 to a Thermo Scientific Q-ExactiveTM hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer 138 (Bremen, Germany), was used. The system was controlled with Chromeleon Express 139 software. UHPLC conditions were set according to a previously validated method 140 (Fernández-Cruz et al., 2016). The programs used for the subsequent data analysis 141 comprised Xcalibur Software (version 3.0.63), to confirm compound identification, and 142 TraceFinderTM Software (version 3.1), in order to quantify the different analytes. 143 144 121 RESULTS & DISCUSSION 145 Eight compounds of the L-TRP metabolism and L-TRP itself were storage for 15 days at 146 different conditions of temperature (4ºC, -20ºC and .80ºC). Results are shown in Figures 147 1-7. As can be seen, most of the compounds of MEL pathway were not identified in 148 solution with no standard added, although they were quantifies in the solutions enriched 149 with 2 and 200 ng/mL. 150 Beer is the matrix where tryptophan (Figure 1) is more stable at the different temperatures, 151 with no significant changes until day 15. Initial L-TRP values of beer were the highest of 152 the analysed matrices (750 ng/mL) since the rest only reached a level of 50 ng/mL. Other 153 authors reported similar values for final fermented synthetic must (Fernández-Cruz et al., 154 2017). At day 15 L-TRP started to decrease in the four matrices, although the more 155 enriched was able to maintain the original concentration. 156 5-hydroxytryptophan (Figure 2)was also analysed. Is was only quantified in the 200 157 ng/mL cluster. It was increased in beer and intracellular content, being more unstable in 158 synthetic must and wine. These compound was previously described during alcoholic 159 fermentation and it disappeared at the end of fermentative process (Fernández-Cruz et al., 160 2016). 161 Serotonin (Figure 3) increased its concentration during the storage time from day 0 to day 162 15. N-acetilserotonin have the same trend, but it was significantly from day 7 to day 15 163 in beer and synthetic must. 164 Melatonin (Figure 4) showed different trend depending on the matrix. At first, it was not 165 quantified neither no-enriched nor 2 ng/mL solution. The 200 ng/mL cluster shows that 166 beer maintained MEL content unalterable. However, while fermented synthetic must and 167 intracellular media increased their MEL content, in wine melatonin disappear at the 15. 168 128 252 0.00 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 600.00 700.00 Raw Raw Raw 2 ng/mL2 ng/mL2 ng/mL 200 ng/mL 200 ng/mL 200 ng/mL 4 -20 -80 4 -20 -80 4 -20 -80 SERO beer Initial Day 7 Day15 0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 250.00 Raw Raw Raw 2 ng/mL 2 ng/mL 2 ng/mL 200 ng/mL 200 ng/mL 200 ng/mL 4 -20 -80 4 -20 -80 4 -20 -80 SERO wine Initial Day 7 Day15 0 10 20 30 40 50 Raw Raw Raw 2 ng/mL 2 ng/mL 2 ng/mL 200 ng/mL 200 ng/mL 200 ng/mL 4 -20 -80 4 -20 -80 4 -20 -80 SERO fermented synthetic must Initial Day 7 Day15 0 200 400 600 800 Raw Raw Raw 2 ng/mL 2 ng/mL 2 ng/mL 200 ng/mL 200 ng/mL 200 ng/mL 4 -20 -80 4 -20 -80 4 -20 -80 SERO intracellular Initial Day 7 Day15 A B C D Figure 3. Serotonin content in beer (A), wine (B), synthetic fermented must (C) and intracellular extract (D) during storage conditions of 4ºC, -20ºC, -80ºC 129 Figure 4. N-acetylserotonin content in beer (A), wine (B), synthetic fermented must (C) and intracellular extract (D) during storage conditions of 4ºC, -20ºC, -80ºC 130 253 Figure 5. Melatonin content in beer (A), wine (B), synthetic fermented must (C) and intracellular extract (D) during storage conditions of 4ºC, -20ºC, -80ºC 131 Figure 6. 3-Indoleacetic acid content in beer (A), wine (B), synthetic fermented must (C) and intracellular extract (D) during storage conditions of 4ºC, -20ºC, -80ºC 132 0.00 200.00 400.00 600.00 800.00 1000.00 1200.00 1400.00 Raw Raw Raw 2 ng/mL2 ng/mL2 ng/mL 200 ng/mL 200 ng/mL 200 ng/mL 4 -20 -80 4 -20 -80 4 -20 -80 TOL beer Initial Day 7 Day15 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 Raw Raw Raw 2 ng/mL2 ng/mL2 ng/mL 200 ng/mL 200 ng/mL 200 ng/mL 4 -20 -80 4 -20 -80 4 -20 -80 TOL intracellular Initial Day 7 Day15 0 10000 20000 30000 40000 50000 Raw Raw Raw 2 ng/mL2 ng/mL2 ng/mL 200 ng/mL 200 ng/mL 200 ng/mL 4 -20 -80 4 -20 -80 4 -20 -80 TOL fermented synthetic must Initial Day 7 Day15 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00 140.00 Raw Raw Raw 2 ng/mL 2 ng/mL 2 ng/mL 200 ng/mL 200 ng/mL 200 ng/mL 4 -20 -80 4 -20 -80 4 -20 -80 TOL wine Initial Day 7 Day15 A B C D Figure 7. 3-Indoleacetic acid content in beer (A), wine (B), synthetic fermented must (C) and intracellular extract (D) during storage conditions of 4ºC, -20ºC, -80ºC 133 CAPÍTULO 3/ CHAPTER 3 Fernández-Cruz, E., Álvarez Fernández, M. A., Valero, E., Troncoso, A. M., García- Parrilla, M.C. MELATONINA Y COMPUESTOS DERIVADOS DEL METABOLISMO DEL TRIPTÓFANO PRODUCIDOS DURANTE LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA POR DIFERENTES LEVADURAS VÍNICAS MELATONIN AND DERIVED L-TRYPTOPHAN METABOLITES PRODUCED DURING ALCOHOLIC FERMENTATION BY DIFFERENT WINE YEAST STRAINS Food Chemistry (2017), 217, 431-437 134 Melatonin and derived L-tryptophan metabolites produced during 254 alcoholic fermentation by different wine yeast strains 255 256 Fernández-Cruz, E;a; Álvarez-Fernández, M.A;a Valero, E.;b Troncoso, A.M.;a García- 257 Parrilla, M.C.a* 258 aDepartment of Food Science and Nutrition, Faculty of Pharmacy, University of Seville, 259 C/ Profesor García González 2, 41012, Sevilla, Spain. 260 bDepartment of Food Science and Nutrition, Faculty of Experimental Science, 261 University Pablo de Olavide, Carretera de Utrera Km. 1, 41013, Sevilla, Spain. 262 *Corresponding author. Tel.: +34 95 4556759. 263 *Email address: mcpa[email protected] (M.C. García-Parrilla). 264 265 ABSTRACT 266 Melatonin is a neurohormone involved in the regulation of circadian rhythms in humans. 267 Evidence has recently been found of its occurrence in wines and its role in the 268 winemaking process. The yeast Saccharomyces cerevisiae is consequently thought to be 269 important in Melatonin synthesis, but limited data and reference texts are available on 270 this synthetic pathway. 271 This paper aims to elucidate whether the synthetic pathway of Melatonin in 272 Saccharomyces and non-Saccharomyces strains involves these intermediates. To this end, 273 seven commercial strains comprising Saccharomyces cerevisiae (Red Fruit, ES488, 274 Lalvin QA23, Uvaferm BC, and Lalvin ICV GRE) and non-Saccharomyces (Torulaspora 275 135 delbrueckii and Metschnikowia pulcherrima) were monitored, under controlled 276 fermentation conditions, in synthetic must, for seven days. Samples were analysed using 277 a UHPLC—HRMS system (Qexactive). 278 Five out of the seven strains formed melatonin during the fermentation process: three 279 S.cerevisiae strains and the two non-Saccharomyces. Additionally, other compounds 280 derived from L-tryptophan occurred during fermentation. 281 Keywords: Saccharomyces cerevisiae, synthetic must, bioactive, indolic compounds, 282 HRMS 283 Chemical compounds studied in this article: 284 L-tryptophan (PubChem CID: 6305); 5-hydroxy-L-tryptophan (PubChem CID: 439280); 285 5-hydroxytryptamine (PubChem CID: 5202); N-Acetyl-5-hydroxytryptamine (PubChem 286 CID: 903); Melatonin (PubChem CID: 896); Indole-3-acetic acid (PubChem CID: 802); 287 Tryptamine (PubChem CID: 1150); Tryptophol (PubChem CID: 10685); L-Tryptophan 288 ethyl ester hydrochloride (PubChem CID: 134519). 289 290 291 292 293 294 295 296 136 1. INTRODUCTION 297 Melatonin (MEL) is a bioactive compound with antioxidant properties, in addition to its 298 well-known effect of regulating circadian rhythms (Reiter, 1993; Bonnefont-Rousselot 299 and Collin, 2010). Its occurrence has been evidenced in alcoholic beverages such as beer 300 and wine (Maldonado, Moreno and Calvo, 2009; M. Isabel Rodriguez-Naranjo, Gil- 301 Izquierdo, Troncoso, Cantos, and Garcia-Parrilla, 2011a). Neither of these groups of 302 authors were able to determine it in grapes (pulp, seed or skins). However, the latter group 303 monitored the whole winemaking process, and highlighted that MEL is formed during 304 the fermentation stage (M. Isabel Rodriguez-Naranjo, Gil-Izquierdo, Troncoso, Cantos- 305 Villar, and Garcia-Parrilla, 2011b). This fact pinpoints the role of yeasts, in particular 306 Saccharomyces cerevisiae, in the occurrence of MEL in wine. 307 The MEL synthesis pathway in vertebrates is shown in Figure 1; it includes the following 308 compounds: L-tryptophan (L-TRP), 5-hydroxytryptophan (5-HTRP), Serotonin (SERO), 309 N-acetylserotonin (NACSERO) and MEL (Iriti, 2009; Feng, Wang, Zhao, Han, and Dai, 310 2014). Moreover, other compounds with an indolic ring are present in wine, including 3- 311 indolylacetic acid (3-IAA) (Maslov et al. 2011), Tryptamine (TRYPT) (Gil-Agustí, 312 Carda-Broch, Monferrer-Pons, and Esteve-Romero, 2007), Tryptophol (TOL) (Favre et 313 al. 2014) and L-Tryptophan ethyl ester (L-TRP EE) (Vigentini et al. 2015), among others. 314 As far as our knowledge is concerned, their formation and significance are not well 315 understood. 316 The study of L-TRP metabolism during the fermentation process is of interest because it 317 is the precursor of the bioactive compounds that can be synthesised from it, such as MEL 318 and SERO. Additionally, other compounds with an indolic structure can have an impact 319 on sensorial properties, as is the case with 3-IAA. Consequently, the significance of the 320 137 MEL molecule for yeast needs to be explored, and this paper aims to contribute to 321 unravelling its role. 322 It is well known that S.cerevisiae uses NH4 as its preferred nitrogen source. However, in 323 conditions where this compound is restricted, it can use other sources, such as amino 324 acids. When this occurs, yeasts follow the Ehrlich pathway. In the specific case of the 325 amino acid L-TRP, the main metabolites of this pathway are TOL, as the most synthesised 326 higher alcohol, and 3-IAA as the most present higher acid (Mas et al. 2014). 327 In this context, it would be interesting to broaden knowledge about how the different 328 strains use L-TRP, and specifically: the day of fermentation when it is used, the molecules 329 with an indolic structure that are formed during fermentation, and if the strains under 330 study synthesise these compounds in similar concentrations. Concerning S.cerevisiae 331 strains, it is known that they consume L-TRP in the early stages of alcoholic fermentation 332 (Bisson, 1991), as well as other amino acids present at low concentrations. 333 Nowadays, non-Saccharomyces yeasts are being investigated in depth (Comitini et al., 334 2011; Gonzalez, Quirós, and Morales, 2013; Suárez-Lepe and Morata, 2012). One of the 335 main reasons for this interest is that these strains can be used to produce wines with lower 336 alcohol content, frequently through sequential inoculation of Saccharomyces strains 337 (Contreras et al., 2014; Quirós, Rojas, Gonzalez, and Morales, 2014). In addition, they 338 can be used to improve wine quality in terms of producing flavour compounds, stabilizing 339 wine colour, and promoting enzymatic activity, to decrease protein and polysaccharide 340 levels in the end product, among other uses (Jolly, Varela, and Pretorius, 2014; Suárez- 341 Lepe and Morata, 2012). However, their ability to form the bioactive MEL has not been 342 explored so far, which is why we have included them in our study. 343 144 following 2 days, L-TRP was not consumed and MEL was not detected. However, at day 490 7, MEL was observed. Figure 4 shows sugar concentration in the SM during the 491 fermentation process. As can be observed, S. cerevisiae strains had consumed the entire 492 sugar content by day 3. Red Fruit, ES488 and QA23 strains showed a similar pattern. 493 However, ES488 and QA23 had not synthesised MEL by day 3. There are no prior MEL 494 studies involving Red Fruit and ES488 strains, making this a new contribution of this 495 paper. 496 As far as the Uvaferm BC and ICV GRE strains are concerned, neither of them 497 synthesised any MEL at all. In a previous study, a related S. cerevisiae wine strain, Aroma 498 White, was found to form MEL from day 1 to day 5, but at a low concentration 499 (Fernández-Cruz et al. 2016), with a maximum level of 0.14 ng mL-1 at day 2. Unlike 500 these strains, T. delbrueckii and M. pulcherrima did not form MEL until day 4, which 501 coincided with low levels of L-TRP in the medium. Once again, MEL was observed at 502 day 7. This formation is located at the midpoint of the stationary phase, so these strains 503 took longer to synthesise MEL than the Saccharomyces strains. At the same time, non- 504 Saccharomyces strains did not reach a sugar level below 2 g L-1 at the end of alcoholic 505 fermentation (Figure 4). This occurrence is an original contribution because, so far, there 506 have been no studies that address the metabolism of MEL in non-Saccharomyces yeasts. 507 3-IAA and TOL are the most abundant indolic compounds analysed during alcoholic 508 fermentation. Both of them are products derived from L-TRP, via the Ehrlich pathway. 509 While 3-IAA is the higher acid derivative of L-TRP, TOL is the higher alcohol (Mas et 510 al. 2014). The strains included in this study reached the maximum concentration of 3- 511 IAA at day 1 (Figure 2E); this is linked to the decrease of L-TRP in the medium. Each 512 yeast consumed this compound differently. The lowest values were obtained from QA23 513 and M. pulcherrima strains (56 and 103 ng mL-1, respectively). Red Fruit, Uvaferm BC 514 145 and ICV GRE strains formed 3-IAA in a concentration range of 200–300 ng mL-1. On the 515 other hand, ES488 and T. delbrueckii were the most productive yeasts, with values above 516 400 ng mL-1. Its decrease during fermentation may be caused by conjugation of 3-IAA 517 with other structures (Hoenicke, Simat, Steinhart, Köhler, and Schwab, 2001; Sitbon et 518 al., 1993) and the failure of yeasts to use L-TRP in the end stages of fermentation. 519 Regarding TOL, its concentration increased sharply at day 2, in the case of 520 Saccharomyces strains, and at day 3, in the case of non-Saccharomyces (Figure 2G). In 521 every case, once it reached its maximum, it remained almost unaltered in the medium. 522 This might suggest that yeasts did not need TOL for their metabolism at all. It seems to 523 be an end product of L-TRP yeast metabolism. 524 TRYPT (Figure 2F) is a biogenic amine (BA), which is considered an undesirable 525 compound due to its potential health concerns. The European Food Safety Authority 526 (EFSA) scientific opinion about biogenic amines and their risks showed that TRYPT was 527 present in alcoholic beverages, mostly in beer (EFSA Panel on Biological Hazards 2011). 528 However, TRYPT is not a main BA typically present in wine, and current European Law 529 does not regulate its safety levels. 530 Finally, L-TRP EE is a newly identified compound, recently described in wines, involved 531 in S. cerevisiae metabolism during alcoholic fermentation (Vigentini et al. 2015). It is 532 closely related to MEL, since their exact mass is identical. The results show that all strains 533 were able to synthesise this compound (Figure 2H). Nevertheless, each strain reached 534 different levels of production. Saccharomyces strains Red Fruit and ES488 had an 535 ascending formation of L-TRP EE from day 3 to day 5, with a sharp drop at day 6. 536 Surprisingly, at day 7, the concentration increased again. The other Saccharomyces strain 537 (ICV GRE) had irregular concentration values, with high values at day 4, 6 and 7 (5.87, 538 8.23 and 5.62 ng mL-1, respectively). Saccharomyces cerevisiae var. bayanus Uvaferm 539 146 BC and QA23 did not share a similar pattern of synthesis. While the Uvaferm BC strain 540 hardly formed L-TRP EE, the QA23 one reached two peaks, at day 2 (5.93 ng mL-1) and 541 day 7 (7.03 ng mL-1). 542 On the other hand, non-Saccharomyces strains synthesised this compound throughout the 543 fermentation process. T. delbrueckii produced the highest concentration, at day 2 (8.41 544 ng mL-1), and although this strain also experienced a sharp drop at day 3, its concentration 545 from day 5 was fairly constant. The values of M. pulcherrima strain L-TRP EE oscillated 546 during the alcoholic fermentation, with maximum values at day 1 (6.07 ng mL-1) and day 547 3 (6.67 ng mL-1). Therefore, the non-Saccharomyces strains synthesised L-TRP EE more 548 quickly than the others. 549 550 4. CONCLUSION 551 The compounds studied in relation to L-TRP metabolism developed by yeasts show 552 significant differences between Saccharomyces and non-Saccharomyces wine strains. 553 Under alcoholic fermentation conditions, all the strains were capable of synthesising 554 different indolic compounds from L-TRP. 5-HTRP can be used by yeasts to form 555 intermediates of MEL metabolism. Even though SERO and NACSERO are precursors of 556 MEL, they were barely quantified during alcoholic fermentation. 3-IAA and TOL were 557 the most synthesised compounds. All the strains synthesised TRYPT, but at safe levels. 558 L-TRP EE was also formed by all the strains. It is clear that all these analytes are involved 559 in Saccharomyces metabolism, and this is a point of departure for further studies, which 560 are required to fully understand their roles. 561 562 563 147 ACKNOWLEDGEMENTS 564 This study was funded by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness 565 (AGL2013-47300-C3-2-R). The authors gratefully acknowledge the financial support of 566 the Spanish Ministry of Education, Culture and Sport (FPU13/04820). The authors would 567 also like to thank Rocio Valderrama, at HRMS central service (CITIUS), for her technical 568 support. 569 570 Compliance with Ethical Standards 571 Funding: This work was funded by the Spanish Ministry of Economy and 572 Competitiveness (AGL2013-47300-C3-2-R). 573 Conflicts of interest: Edwin Fernández-Cruz, M.Antonia Álvarez-Fernández, Eva 574 Valero, A.M. Troncoso and M.C. García-Parrilla declare that they have no conflicts of 575 interest. This study does not contain any studies involving human or animal subjects. 576 Ethical approval: This article does not contain any studies performed by any of the 577 authors with human participants. 578 Informed consent: Not applicable. 579 580 581 582 583 584 585 586 148 REFERENCES 587 Bell, S. J., and Henschke, P. A. (2005). Implications of nitrogen nutrition for grapes, 588 fermentation and wine. Australian Journal of Grape and Wine Research, 11(3), 242– 589 295. http://doi.org/10.1111/j.1755-0238.2005.tb00028.x 590 Bonnefont-Rousselot, D., and Collin, F. (2010). Melatonin: Action as antioxidant and 591 potential applications in human disease and aging. Toxicology, 278(1), 55–67. 592 http://doi.org/10.1016/j.tox.2010.04.008 593 College, M. (2012). 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Inhibition of 12 different stilbenes on VEGF phosphorylation induced via VEGFR-2 Compound Size Total OH (Position) Others (Position) IC50 (µM) E-Astringin Monomer 7 Glucoside (3) 2.90 (2.655- 3.169) Pallidol Dimer 6 --- 4.42 (3.839- 5.089) E-ω-viniferin Dimer 5 --- 6.102 (5.039- 7.389) R2-viniferin (Vitisin A) Tetramer 10 --- 8.672 (8.117- 9.265) E-ɛ-viniferin Dimer 5 --- 18.84 (17.400- 20.390) E-Piceatannol Monomer 4 (3,5,3’,4’) --- 39.70 (37.610- 41.890) Inhibition (%) Pterostilbene Monomer 1 (4’) OCH3 (3, 5) 40.7 (50 µM) R-viniferin (Vitisin B) Tetramer 9 --- 23.4 (1 µM) Isohopeaphenol Tetramer 10 --- 16.2 (1 µM) Rhapontin Monomer 6 (5, 5’) OCH3 (4’), Glucoside (3) Ineffective (50 µM) (+)-Ampelopsin A Dimer 6 --- Ineffective (50 µM) Hopeaphenol Tetramer 10 --- Ineffective (1 µM) 257 Resveratrol Piceatannol Pterostilbene Piceid Astringin Rhapontin Ampelopsin A ɛ-viniferin ω-viniferin Pallidol Hopeaphenol Isohopeaphenol R-viniferin R2-viniferin Figure 1. Stilbenes tested on the inhibition of VEGFR-2 phosphorylation in HUVEC. 258 Figure 2. Pallidol caused no inhibition on PLCγ1 phosphorylation (A). Astringin, ω-viniferin (C) and εviniferin (E) showed a significant inhibition of PLCγ1 phosphorylation (86, 68 and 55% respectively). Basal medium containing VEGF (25 ng/mL) was pre-incubated with astringin, ω-viniferin, pallidol (10 µM), ε-viniferin and piceatannol (50 µM) separately. HUVECs were subsequently incubated for 10 minutes with the pre-incubated solution. Cell were lysed and proteins were separated on an SDS-PAGE gel and probed with the corresponding PLCγ1 antibodies. Generated bands (B, D, F) and ratios for pPLCγ1/PLCγ1 (A, C, E) are displayed, *p < 0.05, **p < 0.01, *** p<0.001, ****p<0.0001 versus VEGF positive control. Western blot analysis was performed by triplicate (n=3). 259 Figure 3. Both ω-viniferin (A) and ε-viniferin (C) did not inhibited, and even enhanced the phosphorylation of Akt. Astringin (A), piceatanol (C) and pallidol (E) caused inhibition of Akt. HUVEC were treated incubated 60 minutes in basal medium containing preincubated VEGF (25 ng/mL) with astringin, pallidol, ω-viniferin (10 µM), ε-viniferin and piceatannol (50 µM) separately. Then, HUVEC were lysed and proteins were separated on and SDS-PAGE gel to be treated with specific Akt antibodies. Western blot bands (B, D, F) and ratios for pAkt/Akt are presented, *p < 0.05, **p < 0.01, *** p<0.001, ****p<0.0001 versus negative control. Analysis was performed by triplicate (n=3). 260 Figure 4. ε-viniferin (A) significantly enhances the phosphorylation of eNOS, while ω-viniferin (B) slightly allows the activation of eNOS. Piceatannol (A), astringin (B) and pallidol (C) inhibited eNOS phosphorylation. VEGF (25 ng/mL) was incubated in basal medium with astringin, pallidol, ω-viniferin (10 µM), ε-viniferin and piceatannol (50 µM) separately. HUVEC were treated 60 min with the mix VEGF/stilbene and the subsequent lysed proteins were separated on an gel (SDS-PAGE) and treated with eNOS antibodies. Ratios for peNOS/eNOS are displayed, *p < 0.05, **p < 0.01, *** p<0.001 versus VEGF positive control. Western blot analysis was performed by triplicate (n=3). 261 DISCUSIÓN GENERAL La presente Tesis doctoral se ha centrado fundamentalmente en la identificación y cuantificación de metabolitos derivados del metabolismo del aminoácido L-triptófano durante la fermentación alcohólica (mosto sintético y mosto de uva) y en bebidas comerciales (cerveza). Además, se ha llevado a cabo la determinación de la bioactividad, concretamente en la inhibición frente a la angiogénesis de los estilbenos, que son compuestos derivados del aminoácido aromático fenilalanina y que se producen en el metabolismo de la vid Esta Tesis doctoral se plantea como el estudio del metabolismo del aminoácido triptófano por parte de las levaduras vínicas con la consiguiente producción de compuestos bioactivos de interés en bebidas fermentadas. Respecto al metabolismo de las levaduras, ya se había descrito la formación de ácido 3 indolacético y del triptofol como metabolitos del triptófano por la ruta de Ehrlich en la fermentación alcohólica (Gil & Gómez-Cordovés, 1986; Hoenicke, Simat, Steinhart, Köhler, & Schwab, 2001). Sin embargo, la presencia de melatonina en vinos se ha puesto en evidencia recientemente (Mercolini et al., 2008), así como su síntesis por parte de las levaduras durante la fermentación alcohólica (Rodriguez-Naranjo, Gil-Izquierdo, Troncoso, Cantos-Villar, & García-Parrilla, 2011). Esta molécula, de gran interés como compuesto bioactivo, desempeña en mamíferos funciones relacionadas con el ciclo del sueño/vigilia en el ritmo circadiano (Reiter, 1993). El análisis de la melatonina en matrices alimentarias resulta complejo, debido a sus características anfipáticas, su bajo contenido en alimentos a niveles traza (ng/mL) y su rápida reacción con las especies reactivas de oxígeno por su carácter antioxidante (Mercolini, Mandrioli, & Raggi, 2012; Rodriguez-Naranjo, Gil-Izquierdo, Troncoso, Cantos, & García-Parrilla, 2011; Tan, Zanghi, Manchester, & Reiter, 2014). Por ello, la melatonina precisa de técnicas lo suficientemente sensibles y fiables para su determinación. Lás técnicas de radioinmunoensayo (ELISA) para cuantificar melatonina han sido ampliamente utilizadas en matrices alimentarias (de la Puerta et al., 2007; Garcia- Moreno, Calvo, & Maldonado, 2013b; Iriti, Rossoni, & Faoro, 2006), pero el porcentaje de falsos positivos por interferentes que reaccionen con los anticuerpo del ELISA hace que sean poco fiables (Rodriguez-Naranjo, Gil-Izquierdo, Troncoso, Cantos, et al., 262 2011). Por otro lado, las técnicas cromatográficas acopladas a espectrómetros de masas se presentan como la opción más adecuada para el estudio de la melatonina, ya que se han descrito en la bibliografía límites de detección de 0,034 ng/mL, 0,13 ng/mL y 30,16 ng/mL usando un triple cuadrupolo (Gomez, Raba, Cerutti, & Silva, 2012; Kocadaǧli, Yilmaz, & Gökmen, 2014; Rodriguez-Naranjo, Gil-Izquierdo, Troncoso, Cantos, et al., 2011). Hasta ahora, la mayor parte de los métodos cromatográficos publicados contemplaban el análisis de la melatonina de manera aislada (García-Parrilla, Cantos, & Troncoso, 2009; Gomez, Hernández, Martinez, Silva, & Cerutti, 2013; Russel J Reiter, Tan, Manchester, & Qi, 2001). Sin embargo, este abordaje analítico no permite abarcar el estudio de las posibles vías por las cuales las levaduras sintetizan este compuesto bioactivo. Nuestra hipótesis de partida indicaba que, para obtener información sobre la síntesis de melatonina, es necesario una metodología que nos permita una visión global sobre el metabolismo. En esta tesis, se desarrolló una metodología capaz de abarcar el estudio de metabolitos relacionados con la melatonina (Capitulo 1), identificando nueve compuestos del metabolismo del triptófano (5-hidroxitriptófano, serotonina, N-acetilserotonina, melatonina, triptamina, triptofol, ácido 3-indolacético, etil ester de triptófano) de manera simultánea por primera vez en un tiempo de análisis corto (15 minutos), con unos límites de detección comprendidos entre 1,3 y 6,7 pg/mL. Estos valores representan un hito analítico, ya que los métodos cromatográficos que comprenden un número elevado de compuestos suelen disminuir la sensibilidad. La validación del método se realizó en un equipo de cromatografía líquida de ultra-alta eficacia acoplada a un espectrómetro de masas de alta resolución (Qexactive). Los valores de linealidad (R2) fueron de 0.998-1 y los de repetitividad y reproducibilidad inferiores al 2% para todos los compuestos, salvo la serotonina (21%), todos ellos dentro de los valores establecidos por la AOAC. Además, con el método validado se identificó y cuantificó un compuesto con la misma masa molecular que la melatonina, el etil ester de triptófano. El espectro de masas de este compuesto, fue descrito detalladamente por Gardana et al. (Gardana, Iriti, Stuknytė, De Noni, & Simonetti, 2014). Su m/z (233) coincide con el de la melatonina. Sin embargo, con el método validado se comprobó que la intensidad de uno de los fragmentos de la melatonina (m/z 216) era mucho más intensa en el etil ester de triptófano, siendo este su ion confirmatorio en su análisis. Debido a este hecho, es posible que la detección de 263 isómeros de melatonina en otros equipos menos sensibles al Qexactive y reportados previamente en la bibliografía, diera lugar a errores de interpretación. En el método validado también es un hito el poder diferenciar inequívocamente ambas moléculas en una misma muestra, ya que ambas aparecen durante la fermentación alcohólica (Vigentini et al., 2015). Tras validar un método capaz de detectar hasta niveles trazas (ng/mL) diferentes compuestos derivados del triptófano, se realizó un estudio para comprobar la influencia del posible efecto matriz en la cuantificación de estos compuestos durante diferentes periodos de almacenamiento (Capítulo 2). Además, el tratamiento de la muestra también es importante para evitar pérdidas de metabolitos antes de realizar el análisis definitivo. Se conoce que el triptófano, aunque es estable, puede disminuir su concentración en una solución con otros aminoácidos (Friedman & Cuq, 1988). Por otro lado, la melatonina reacciona rápidamente con los radicales de oxígeno por lo que suele ser una molécula muy reactiva Reiter et al., 2001), y el ácido 3-indolacético se analiza en condiciones de oscuridad para que no se vea afectado por la luz.. Los resultados mostraron que los compuestos son más estables en la cerveza que en cualquiera de las otras matrices (vino, mosto sintético fermentado y extracto intracelular). Este hecho está causado posiblemente porque la cerveza presentó una concentración inicial de compuestos mayor que en las otras matrices. Al mismo tiempo, la temperatura de 4ºC parece ser la más indicada para mantener estos compuestos sin cambios significativos durante 1 semana de almacenamiento. Posteriormente, todos los derivados del triptófano sufren cambios que son significativos tras 15 días de almacenamiento, en todas las temperaturas analizadas. Por tanto, se establecería un tiempo de almacenamiento óptimo de 7 días para que los compuestos indólicos con propiedades bioactivas, como el ácido 3-indolacético o la melatonina, se mantuviesen inalterables en el medio. Una vez validado el método para diferentes matrices, cabe preguntarse: ¿Cuál es el impacto de las levaduras en el metabolismo del triptófano? En primer lugar, se midió la concentración de estos metabolitos en un medio simple (mosto sintético) para evitar posibles interferencias de la matriz (Capítulo 3). Se inocularon cinco cepas de levadura S.cerevisiae y dos cepas no-Saccharomyces (T.delbrueckii y M.pulcherrima). El análisis a través del método validado permitió identificar por primera vez 5-hidroxitriptófano durante la fermentación alcohólica en todas las cepas de levaduras. La disminución de 264 este compuesto durante el proceso fermentativo muestra que las levaduras lo consumen, probablemente para formar los derivados de la ruta de la melatonina, como la serotonina. De todas las cepas utilizadas, solamente la Aroma White produjo serotonina durante la fermentación alcohólica, ya que su concentración aumentó a medida que avanzaba la fermentación alcohólica (de 0,67 a 4,60 ng/mL). Este compuesto sí había sido descrito previamente en vinos, a concentraciones superiores en torno a 3 mg/L (Shi et al., 2017). Asimismo la presencia de serotonina es mayor tras el desarrollo de la fermentación maloláctica (Wang, Ye, Zhu, Wu, & Duan, 2014). Aunque la melatonina pudo ser cuantificada para la mayor parte de cepas, la Red Fruit fue la mayor productora. Además, la cuantificación de melatonina en cepas no- Saccharomyces como T.delbrueckii y M. pulcherrima, resultó de sumo interés pues aún no se había descrito. Tras su análisis, se pudo establecer que la síntesis de melatonina tiene lugar al final de la fase exponencial. Las cepas no-Saccharomyces sintetizan melatonina más tarde debido a la menor velocidad de crecimiento durante la fermentación(Gobert et al., 2017). Al mismo tiempo, se observó que la melatonina no tenía un patrón de síntesis determinado, sino que aparecía y desaparecía del medio a medida que avanzaba la fermentación. Por otro lado, el triptofol y el ácido 3-indolacético, como se esperaba, se pudieron cuantificar en todas las muestras. Mientras que el triptofol se acumuló en el medio, el ácido 3-indolacético disminuyó su concentración después de una notable producción al principio de la fermentación en todas las cepas de levadura. Mientras que el triptofol sí tiene una función descrita como molécula quorum sensing (Chen & Fink, 2006), se desconoce si el ácido 3-indolacético tiene una función en las levaduras, aunque el descenso de su concentración puede estar también provocado por su unión a otras moléculas (Hoenicke et al., 2001). Tras comprobar el metabolismo del triptófano por parte de las levaduras en un medio sintético, cabía enfrentarse al siguiente reto. ¿Es reproducible en medios complejos? Para dar respuesta a esta pregunta, se seleccionaron aquellas cepas con mejores resultados en la producción de compuestos indólicos bioactivos como melatonina y ácido3-indolacético(S. cerevisiae Aroma White, Red Fruit y T.delbrueckii) así como una cepa testigo (QA23) cuya síntesis de melatonina se ha descrito previamente (Rodríguez- Naranjo, Torija, Mas, Cantos-Villar, & García-Parrilla, 2012). Además, se realizaron fermentaciones de mostos de uva procedente de diferentes variedades (Corredera, 265 Chardonnay, Moscatel, Palomino Fino, Sauvignon Blanc, Vijiriega y Tempranillo) (Capítulo 4). Ante todo, se descubrió que el patrón de síntesis de la mayoría de compuestos observado en el mosto sintético se mantenía en los mostos de uva: consumo de triptófano e hidroxitriptófano al principio de la fermentación; acumulación de triptofol en el medio; producción de ácido 3-indolacético con su posterior descenso. Sin embargo, la aparición y desaparición de la melatonina a lo largo de la fermentación es un patrón que no pudo ser reproducido en todas las fermentaciones. La combinación de la cepa Aroma White y el mosto de uva de la variedad Corredera fue la que produjo mayor cantidad de melatonina. Por otro lado, este experimento permitió por primera vez la cuantificación de N- acetilserotonina en mostos de uva de la variedad Tempranillo, siendo un hito del presente trabajo. Aunque su síntesis fue irregular, permitió verificar que la ruta de la melatonina en levaduras se realiza a través de este intermediario. Pero, ¿por qué estas diferencias entre el mosto sintético y el mosto de uva? Además de la complejidad que este último presenta, las fermentaciones no se realizaron a la misma temperatura. Mientras que la levadura se desarrolla de manera óptima a 28ºC, las fermentaciones en bodegas oscilan entre los 16 y 18ºC. Por tanto, aunque se ha comprobado que la temperatura y el medio no afectan a gran parte de los compuestos, parece ser que en lo concerniente a la ruta de la melatonina pueden verse afectadas por estas diferencias. El ácido 3-indolacético y el triptofol se sintetizaron en las primeras etapas de la fermentación alcohólica, pero a diferencia del mosto sintético, no alcanzaron concentraciones tan elevadas. Este hecho puede estar relacionado con la menor concentración de triptófano en el mosto de uva (70-80000 ng/mL en variedades blancas), el cual depende de diversos factores como el clima, el suelo o la fertilización (Bouzas-Cid, Falqué, Orriols, & Mirás-Avalos, 2018; Linsenmeier, Löhnertz, & Schubert, 2004; Ruiz-Rodríguez et al., 2017). No obstante, cabe destacar que en dos variedades de uva blanca (Corredera y Palomino Fino) el contenido de ácido 3-indolacético alcanzado en los primeros días de la fermentación alcohólica se mantuvo constante, a diferencia de la disminución significativa observada en otras variedades. Por tanto, no solo la concentración de triptófano afecta a la síntesis de compuestos derivados, sino que la complejidad del medio, en este caso mosto de uva debe, afecta a la síntesis del ácido 3-indolacético.