Utilización de la resonancia magnética nuclear en el diseño de fármacos: "SAR by NMR"

Utilización de la Resonancia Magnética Nuclear en el Diseño de Fármacos: "SAR by NMR" FACULTAD DE FARMACIA DEPARTAMENTO QUÍMICA ORGÁNICA Y FARMACÉUTICA Trabajo Fin de Grado Curso 2015-16 Francisco Javier Guerrero García Tutor: José Luis Espartero Sánchez Sevilla, Septiembre 2016 i i Resumen del trabajo La espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear, RMN es una herramienta muy valiosa en el diseño de fármacos, ya que es un método a partir del cual se puede obtener muy diversa información, como conocer la información estructural de una molécula, distinguir entre dos conformaciones de un mismo compuesto o detectar interacciones entre distintas moléculas como es el caso de las interacciones fármacoreceptor. Toda esta información se obtiene gracias al estudio de las señales de los diferentes núcleos que se observan en el espectro de la molécula estudiada y las perturbaciones que se producen por la presencia de otras entidades. Por medio del desplazamiento químico y de otros parámetros, podemos conocer mejor a la molécula estudiada y obtener mayor información, con el objetivo de desarrollar nuevos ligandos para una diana farmacológica concreta. Conocer la interacción entre ligando y proteína diana es clave en el diseño de fármacos. Aquí es donde juega un papel crucial la RMN, ya que permite correlacionar los cambios que se producen en una molécula diana cuando un ligando se une a ella, con los cambios en los desplazamientos químicos que se observan al comparar los espectros antes y después de la unión. La interacción que se produce se puede estudiar centrándose en el ligando o en la diana, y aunque existen diversas técnicas dentro de cada tipo, son más numerosas las que estudian el ligando. En cambio, las técnicas que estudian la diana son más específicas y tienen mayor rendimiento. Uno de estos últimos métodos, que se centran en la proteína diana, es el que permite conocer las Relaciones Estructura-Actividad por medio de la RMN, conocido como SAR by RMN, que se basa en identificar cabezas de serie que interaccionen con el sitio activo de la diana y optimizarlos hasta conseguir un ligando de gran afinidad por la diana. Palabras Clave: Diseño de fármacos; espectroscopia RMN; SAR (Structure-activity relationships); Diana; Cribado. ii Índice 1. Introducción ....................................................................................................... 1 2. Objetivos ............................................................................................................ 3 3. Metodología ....................................................................................................... 4 4. Resultados .......................................................................................................... 5 4.1. Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) ................................... 5 4.1.1. Utilidades ........................................................................................................ 7 4.1.2. Ventajas .......................................................................................................... 7 4.1.3. Inconvenientes ............................................................................................... 8 4.1.4. Utilización de la RMN en metabolómica ........................................................ 8 4.2. Diseño de Fármacos ............................................................................................... 9 4.3. Utilización de la RMN en el Diseño de Fármacos ................................................ 14 4.3.1. Importancia del mapeo de desplazamiento químico en el diseño de fármacos ....................................................................................................... 18 4.3.2. La RMN en metabolómica para el diseño de fármacos ............................... 24 4.4. Método SAR by NMR ........................................................................................... 24 4.4.1. Ventajas del método SAR by NMR ............................................................... 30 4.4.2. Ejemplos de aplicación del método SAR by NMR ........................................ 30 5. Conclusión ........................................................................................................ 33 6. Bibliografía ....................................................................................................... 34 1 1. Introducción La Química Farmacéutica tiene como uno de sus temas fundamentales de estudio el diseño y desarrollo de fármacos. El diseño de nuevos fármacos es necesario para obtener tratamientos terapéuticos más eficaces frente a enfermedades que, o bien no tienen aún un tratamiento efectivo o, si lo tienen, éste presenta algunos efectos secundarios. Por ello, se hace necesario tener una variedad de métodos que permitan identificar, aislar y caracterizar un cabeza de serie con determinada actividad farmacológica. Tras una serie de optimizaciones y de modificaciones con el fin de mejorar la potencia, selectividad y propiedades farmacocinéticas y de disminuir la toxicidad, se consigue desarrollar un candidato a fármaco, que se someterá posteriormente a una serie de ensayos clínicos hasta que pueda ser comercializado. Por todo ello, las etapas iniciales de identificación de la diana concreta sobre la que se va a actuar y el conocer qué ligando se pretende obtener, son muy importantes en el proceso y deben realizarse de una manera racional, por el hecho de que una buena elección inicial permite tener un mayor porcentaje de éxito en el desarrollo de un nuevo fármaco, además de un menor gasto de tiempo y dinero. Por este motivo, se han ido desarrollando distintos métodos que se basan en conocer la información que rodea al fármaco y/o al receptor, actualmente hay diversas técnicas que permiten obtener información estructural detallada de una molécula en poco tiempo (Galbis, 2000). La Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) es una de estas técnicas, siendo de las más efectivas y con mayor reproducibilidad, todo ello con un coste adecuado (aunque este puede aumentar si se requieren mejores condiciones para conseguir el objetivo). Por medio de la RMN se puede obtener información de gran relevancia acerca de la diana sobre la que se quiere actuar. Además, se puede utilizar en casi todas las etapas del proceso del diseño del fármaco, por lo que es una de las herramientas de mayor utilidad actual en el campo de la Química Farmacéutica. Una de sus funciones importantes es que tiene la capacidad de detectar cuándo un 2 ligando interacciona con una diana, así como conocer por dónde y qué grupos funcionales actúan en esa interacción. Otro de los métodos de gran un importancia y con un gran desarrollo durante los últimos años, son aquellos métodos basados en las relaciones estructura-actividad (SAR), que permiten desarrollar sustancias con actividad farmacológica a partir de cabezas de serie conocidos que se van modificando y optimizando, con el fin de obtener un fármaco de calidad. Gracias a estos métodos, se ahorra mucho tiempo en el proceso debido a que se reduce la cantidad de fármacos a evaluar que interaccionen con la diana, ya que los derivados de estos cabezas de serie pueden obtenerse más adelante del proceso por medio de la optimización de los cabezas de serie que hayan tenido interacción. A continuación destacaremos los aspectos más importantes del uso de la RMN en el diseño de fármacos, dando un enfoque actual del tema, centrándonos en el método conocido como SAR by RMN como técnica más concreta y eficaz para ello. 3 2. Objetivos El objetivo principal al abordar el presente trabajo ha sido llevar a cabo una revisión bibliográfica de artículos y libros con el fin de tener una visión actual sobre el estudio de las relaciones estructura-actividad de ligandos potencialmente activos frente a una diana farmacológica, en el diseño de fármacos, mediante la utilización de la espectroscopía de RMN como herramienta esencial. Para ello, en primer lugar se abordan brevemente los conceptos básicos de la RMN para pasar a continuación a recordar las etapas generales y las características a tener en cuenta en el diseño de fármacos. Con todo ello, se pasa posteriormente a relacionar ambos conceptos y a interpretar la función de la RMN en el diseño de fármacos. Para finalizar, se describe el método SAR by RMN, y se evalúa su función y capacidad para generar nuevos fármacos. 4 3. Metodología Se ha utilizado una estrategia de búsqueda bibliográfica en bases de datos, concretamente de PUBMED y SCIFINDER, de artículos originales y revisiones que hacían referencia a una serie de palabras clave. Estas palabras clave fueron: drug design (diseño de fármacos), SAR (relaciones estructura-actividad), NMR (resonancia magnética nuclear) y drug discovery (descubrimiento de fármacos). La búsqueda se realizó tanto combinando estas palabras como por separado de las mismas. Se seleccionaron más de una veintena de artículos, que contenían la información que se quería obtener. Además, a través del catálogo FAMA de la Universidad de Sevilla, se encontraron una serie de libros relacionados con el diseño de fármacos mediante la utilización de la RMN. Se seleccionaron aquellos que tratan de los métodos de diseño de fármacos basados en la relación estructura-actividad de la diana. 5 4. Resultados 4.1. Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) La espectroscopía de RMN es una técnica en la que se imbrican diversas ciencias, entre ellas las Matemáticas, la Química, la Física, la Biología, la Informática y la Medicina. El fenómeno de la RMN se basa en el hecho de que los núcleos de ciertos átomos pueden orientar su espín nuclear al aplicársele un campo magnético. Estas diferentes orientaciones tendrían diferentes energías asociadas y se podrían producir transiciones entre ellas al recibir pulsos de radiación. Estos cambios se recogen y se representan en un diagrama que relaciona la intensidad de la señal frente a la frecuencia a la que se registra. La frecuencia de resonancia de los núcleos depende de la especie química estudiada, del tipo de núcleo, de la intensidad del campo magnético aplicado y del ambiente químico que rodea a los núcleos estudiados. Este último factor puede inducir pequeñas modificaciones en la frecuencia de las señales, efecto que se conoce como desplazamiento químico (Pellecchia y cols., 2002). Desde principios de los años 1920 se intentaba detectar el momento angular de espín asociado a los núcleos atómicos. Pero no fue hasta finales de 1945 cuando se detectó la primera señal de RMN, por E. Purcell y colaboradores en la Universidad de Harvard. En diciembre de ese mismo año y de forma independiente, F. Bloch y su equipo también consiguieron detectar señales de RMN de protón en la Universidad de Stanford. Ambos utilizaron equipos experimentales diferentes y por este descubrimiento recibieron el Nobel en 1952 de forma conjunta. Poco tiempo después, con el fin de mejorar la sensibilidad del método, se descubrió el fenómeno del desplazamiento químico antes mencionado, lo que hizo que la técnica perdiera interés para los físicos, pero que atrajo inmediatamente el de los químicos. Más tarde fue descubierto el acoplamiento escalar espín-espín entre núcleos cercanos, que provoca un desdoblamiento de las señales, y gracias al cual se puede obtener más información sobre el entorno del núcleo estudiado. 12 Las interacciones ligando-proteína son determinantes en la actividad de un fármaco. El diseño de pequeños ligandos que causen un efecto deseado en la proteína diana es el enfoque más importante del descubrimiento y desarrollo de fármacos (Dean y cols., 1995). Uno de los parámetros a tener en cuenta en el diseño es la druggability de la diana (Owens, 2007), que es la capacidad de que una diana sea modulada por un ligando líder, ya que es crucial para determinar si un proyecto de descubrimiento de nuevos fármacos progresa desde el hit hasta el cabeza de serie. Sólo el 10% del genoma humano se considera como posible diana, y solo la mitad de éstas son relevantes para la enfermedad, por lo que es importante ser capaces de predecir hasta qué punto un posible objetivo puede ser considerado como diana en las etapas iniciales del proceso. Además se requieren unas propiedades fisicoquímicas y unas características ADME (Absorción, Distribución, Metabolismo y Excreción) adecuadas para que el fármaco pueda ser desarrollado (Pellecchia y cols., 2008). Se buscan dianas con alta druggability, con un sitio de unión definido, un tamaño de hueco adecuado para un ligando pequeño y con cierta hidrofobicidad y flexibilidad. El sitio de unión puede y suele ser modificado tras la formación del complejo ligandodiana. El diseño de moléculas cabezas de serie se realiza en la actualidad mayoritariamente por cribado de amplias quimiotecas de compuestos (HTS), como ya se ha comentado anteriormente. Este cribado está dirigido a seleccionar una serie de características comunes para que unan a un sitio activo de la diana determinada. Estas características pueden ser: pureza, reactividad, propiedades toxicológicas, peso molecular, solubilidad en agua o su facilidad para ser elaboradas. Por lo tanto, según estas características, se elige una u otra quimioteca para ser analizada y de esta manera se consigue reducir el número de compuestos a analizar. Además se eliminan aquellas moléculas que se sabe desde antes de comenzar que no van a tener éxito. Otra forma es utilizar quimiotecas de compuestos similares a fármacos conocidos para una diana concreta. En definitiva, lo que se quiere encontrar son ligandos pequeños, hits, con baja afinidad por macromoléculas. El peso molecular de estas dianas debe ser menor a 350KDa. Los hits también deben tener una solubilidad razonable, ya que a partir de ellos, se quieren obtener cabezas de serie de alta afinidad y fáciles de 13 elaborar. Posteriormente, serán optimizados hasta conseguir un fármaco concreto de alta afinidad (Stockman y Dalvit, 2002). Actualmente, este proceso ofrece un rendimiento pobre, ya que tiene una serie de problemas: No se identifican dianas fiables con druggability para fármacos de uso humano, o simplemente porque no se pueden unir moléculas pequeñas a las dianas. Se consiguen réplicas de fármacos. Por ello hay que tener en cuenta las patentes y consultar base de datos para evitarlo. Trabajar con hits y cabezas de serie novedosos seria otra solución. Los hits identificados no suelen ser de calidad, por lo que los cabezas de serie posteriormente obtenidos carecen de propiedades fisicoquímicas adecuadas. Por ejemplo, un cabeza de serie grande y lipófilo tiene baja biodisponibilidad oral, por mucha potencia que tenga como ligando para una diana concreta. Para solucionar este último inconveniente, actualmente, las industrias utilizan como base cabezas de serie de bajo PM, ya que así hay mayores posibilidades de obtener un fármaco tras la optimización. Esta se realiza con una monitorización de alto rendimiento del ADME. Se suelen buscar cabezas de serie que cumplan la Regla del 5 de Lipinski (Lipinski y cols., 1997), con el fin de obtener un líder con alta potencia, específico, con buena solubilidad en agua, con estructura sencilla y que no tenga grupos reactivos (Peláez, 2011). Aplicar esta regla, permite la filtración de las bases de datos y reducir el número de hits que realmente tienen utilidad, ya que en principio, el número de fármacos potenciales que se tendrían que escanear es enorme (Hajduk, 2006). La identificación de la estructura del cabeza de serie se puede hacer por diferentes métodos: 14 Identificación a partir de fármacos existentes, ya sea que tengan efecto para la misma enfermedad que la estudiada o que se utilicen para otras enfermedades con el fin de conseguir el mismo objetivo. Identificación tras analizar el complejo diana-ligando. Una vez que se analiza el complejo, la estructura del ligando se puede alterar o mantener, con el fin de obtener la mejor estructura para la estabilidad del complejo. Identificación por medio de síntesis combinatoria. Diseño virtual por ordenador. A partir de las estructuras conocidas de ligandos que están almacenadas en base de datos, se hacen modelados moleculares y se predice una estructura que pueda tener alta afinidad. Permiten realizar cribados y ensayos sin utilizar muestras reales. Ayudan a entender el mecanismo de acción de fármacos y mejoran su efecto terapéutico. Ya se han diseñado varios fármacos frente al SIDA con éxito. Obtenerlos por azar. Un ejemplo es que gracias al descubrimiento fortuito de la acción transportadora de la biotina, se han desarrollado fármacos a partir del ácido fólico, que es un ligando óptimo y selectivo frente a algunos tipos de cáncer y enfermedades inflamatorias (Low y cols., 2008). Identificación por RMN. A partir del análisis de los espectros obtenidos se pueden optimizar los cabezas de serie como veremos a continuación. 4.3. Utilización de la RMN en el Diseño de Fármacos La RMN es una herramienta poderosa ya que permite identificar a cabezas de serie con bajo peso molecular y baja afinidad, pero que tienen un alto potencial para convertirse en ligandos de alta afinidad tras la optimización. Utiliza una “sinergia” entre química combinatoria, química medicinal, cribado de alto rendimiento (HTS), diseño de fármacos basado en la estructura, y genómica (Stockman y Dalvit, 2002). Durante las tres últimas décadas, después del establecimiento firme de la espectroscopia de RMN de alta resolución en líquidos como la herramienta esencial para caracterizar la constitución molecular y la conformación de moléculas orgánicas 15 pequeñas, las contribuciones de la RMN al diseño y desarrollo de fármacos se han ampliado para abarcar otros aspectos importantes. Estos incluyen la caracterización de la estructura y la dinámica de proteínas solubles de tamaño medio y de ácidos nucleicos, y de sus complejos con moléculas pequeñas, así como la identificación y caracterización de la unión reversible de ligandos pequeños de afinidad débil a las macromoléculas. En este sentido, la RMN se ha convertido en una herramienta fundamental en el descubrimiento de nuevos fármacos, ya que se utiliza en casi todas las etapas del mismo y permite la comprensión completa de las propiedades de las moléculas y de su comportamiento (Everett, 2015). El proceso de diseño de un fármaco suele durar varios años. Comienza con la identificación del gen que expresa la proteína diana. La estructura 3D de esta diana se determina por medio de RMN (RMN macromolecular). A partir de aquí, se realizan escaneos por RMN de pequeñas moléculas, hits, y se diseñan compuestos que interaccionen con la diana estudiada. Más tarde se sintetizan cabezas de serie a partir de los hits y se cuantifica la relación unión/actividad in vitro. Si los resultados son favorables, se continúa con los ensayos in vivo y se puede observar su comportamiento gracias a la RMN in vivo. Este es un proceso cíclico (Figura 3), que se repite hasta encontrar compuestos lo suficientemente potentes para interaccionar a baja concentración con la diana estudiada. Una vez que obtenemos un candidato concreto a fármaco, se pasa a los ensayos preclínicos en animales, y finalmente, a los ensayos clínicos en diferentes grupos de personas. Estos 2 últimos pasos transcurren durante bastantes años y son los definitivos, ya que muchos de los posibles fármacos que se seleccionan son desechados en estas etapas y no llegan a comercializarse (Larson, 2012). Figura 3 Esquema del proceso de desarrollo de fármacos usando RMN (Upmanyu y cols., 2007) 16 Las ventajas que ofrece la aplicación de la espectroscopía RMN al diseño de fármacos son numerosas (Pellecchia y cols., 2008): Permite identificar dianas sin necesidad de conocer su función, Permite obtener una información rápida sobre el sitio de unión, la distancia entre proteína-ligando y el modo de unión, Es un método muy robusto, fiable y reproducible, que se puede utilizar a lo largo de todo el proceso de diseño de fármacos, al tener diversas aplicaciones, Permite seleccionar moléculas con alta potencia, que tengan situaciones óptimas de unión, es decir, situaciones que contribuyan a una alta entalpía de unión. Por ello, fármacos que tengan alta libertad conformacional o que prefieran adoptar conformaciones distintas a la conformación de unión, no son buenas moléculas, ya que tienen baja entalpía de unión. Otras técnicas no obtienen moléculas de alta potencia con la fiabilidad que las consigue la RMN. Los métodos actuales de RMN capaces de identificar y caracterizar la unión de moléculas pequeñas a una macromolécula se encuadran en dos categorías principales, dependiendo de las señales observadas: 1. Experimentos que detectan las señales del ligando y 2. Experimentos que detectan las señales del receptor. Los métodos basados en la detección de las señales del ligando hacen uso frecuentemente de la espectroscopia RMN de 1H y 13C, aunque los espectros de 19F y 31P también se están utilizando en la industria farmacéutica. Por el contrario, generalmente los métodos basados en la detección de las señales del receptor suelen requerir la producción de proteína marcada isotópicamente y la adquisición de espectros 2D de correlación heteronuclear para monitorear los cambios de los desplazamientos químicos del receptor tras la unión del ligando. Estos últimos métodos están limitados a dianas con pesos moleculares menores de unos 30-40 KDa (a menos que se utilice la perdeuteración), aunque son más robustos que los primeros ya que permiten identificar los ligandos reales, incluso los que se unen de manera 17 irreversible, y permiten revelar información estructural crucial sobre el lugar de unión del receptor (Campos-Oliva, 2011). Algunas de estas aproximaciones son más adecuadas para los métodos de screening y/o la validación de hits a partir de HTS (Tabla 1), mientras que otros son usados para guiar la optimización de hits en compuestos cabeza de serie más potentes y selectivos (Tabla 2) (Pellecchia y cols, 2008). Tabla 1 Métodos de RMN para el screening de compuestos y/o validación de hits* Aproximación Señal observada Uso Descripción Mapeo del desplazamiento químico Receptor Screening primario Validación de hit Lugar de unión Identifica compuestos que se unen a la diana y modifican sus δ STD Ligando Screening primario Validación de hit Identifica compuestos que se unen débilmente WaterLOGSY Ligando Screening primario Identifica compuestos que se unen usando NOEs mediados por el agua SLAPSTIC Ligando Screening primario Detección de fragmentos que se unen. Muy sensible TINS Ligando Screening primario Validación de hit Identifica compuestos que se unen frente a dianas inmovilizadas Relajación T1 y T2 Ligando Screening primario Validación de hit Permite la estimación de la afinidad NOE de transferencia Ligando Validación de hit Conformación ligandos flexibles Permite determinar la conformación bioactiva del ligando Medidas de Difusión Ligando Screening primario Validación de hit Mide la diferencia en velocidades de difusión para ligandos en el estado unido frente al libre * NOE: nuclear Overhauser effect; SLAPSTIC: spin labels attached to protein side chains as a tool to identify interacting compounds; STD: saturation transfer difference; TINS: target immobilized NMR screening; T1 y T2: tiempos de relajación longitudinal y transversal, respectivamente; waterLOGSY: water-ligand observed via gradient spectroscopy. 18 Tabla 2 Métodos de RMN para la optimización de hit a cabeza de serie* Aproximación Señal observada Uso Descripción SAR by NMR Ligando Receptor Información estructural FBDD Screening Optimización del ligando Diseño de ligandos bidentados SAR by ILOEs Ligando-ligando FBDD Screening Optimización del ligando Detección sensible de fragmentos y compuestos que interaccionan débilmente Pharmacophore by ILOEs Ligando-ligando FBDD Screening Optimización del ligando Detecta interacciones ligandoligando mediadas por proteína. Búsqueda basada en el farmacóforo INPHARMA Ligando-ligando Caracterización de compuestos Detecta interacciones ligandoligando mediadas por proteína (competición por el mismo lugar de unión) * FBDD: fragment based drug design; ILOE:interligand nuclear Overhauser effect; INPHARMA: interligand NOEs para mapeo del farmacóforo; SAR: structure-activity relationship. Entre los primeros métodos, quizás el más robusto e interesante sea el mapeo del desplazamiento químico de las señales de la diana, mientras que entre los segundos, es el denominado SAR by NMR el que se considera más potente como herramienta en el diseño de fármacos basado en fragmentos, el cual se tratará más adelante. Se presenta a continuación un breve resumen del primero de los métodos mencionados. 4.3.1. Importancia del mapeo de desplazamiento químico en el diseño de fármacos El experimento de RMN más comúnmente utilizado en este método es la heterocorrelación bidimensional protón/nitrógeno-15, denominado 1H-15N 2D HSQC (Heteronuclear Single Quantum Correlation), de proteínas marcadas con 15N. Dado que este experimento observa las señales NH de los grupos amida, químicamente únicos en el contexto de la estructura terciaria de la proteína, permite el seguimiento de las interacciones en una manera específica del residuo que se modifica (Dias y Ciulli, 2014). La interacción entre un determinado ligando y una posible proteína diana se puede poner de manifiesto gracias a la correlación de los cambios que se producen en 19 el desplazamiento químico de algunas señales NH de la diana, que se pueden observar en los espectros 1H-15N 2D HSQC cuando el ligando se une al sitio activo de la diana, comparándose con el espectro que origina esa diana sin la adición del ligando. Por lo tanto, un mapeo de los desplazamientos químicos permite identificar de forma inequívoca la localización de los sitios de unión de un ligando a una proteína diana. Este mapeo puede ser convencional, cuando se compara el espectro de la proteína con el del complejo proteína-ligando, o mapeo diferencial, comparando 2 espectros con una misma proteína unida en cada espectro a 2 ligandos distintos y detectando las diferencias que existen en los desplazamientos químicos de ambos. Para considerar una perturbación o cambio en el desplazamiento químico como significativa, la diferencia entre el pico en ausencia de ligando y el pico con el ligando unido, debe ser mayor que 0,1 ppm (Ecuación 1) (Stockman y Dalvit, 2002). Un inconveniente del método es que se requiere una alta concentración de proteína purificada para realizar este proceso (Larson, 2012). No obstante, se puede determinar la fuerza de la interacción ligando-proteína gracias a Keq (constante de equilibrio del complejo formado) o KD (constante de disociación) (Zou y Sadler, 2015). ∆𝜹=√[(𝜹( 𝑯 𝟏,𝒑𝒑𝒎)𝒍𝒊𝒃𝒓𝒆−𝜹( 𝑯 𝟏,𝒑𝒑𝒎)𝒖𝒏𝒊𝒅𝒐)𝟐+𝟎,𝟎𝟒×(𝜹( 𝑵 𝟏𝟓 ,𝒑𝒑𝒎)𝒍𝒊𝒃𝒓𝒆−𝜹( 𝑵 𝟏𝟓 ,𝒑𝒑𝒎)𝒖𝒏𝒊𝒅𝒐)𝟐] Ecuación 1 Cálculo de la diferencia en el desplazamiento químico entre la señal producida en ausencia de ligando y la de en presencia del ligando. Si ∆δ > 0,1 ppm, se considera cambio significativo (Stockman y Dalvit, 2002). La KD de un complejo ligado-proteína es la correlación de concentración de fracción de ligando que se une formando complejo frente a la concentración total de ligando presente. Es la constante de disociación del complejo, que indica el grado de afinidad del ligando por la proteína. Según el valor de KD, la unión puede ser: KD < 1µM => Unión fuerte, KD ≈ 1µM => Unión moderada, KD > 10µM => Unión débil, KD > 1M => No formación de complejo, no se observan efectos en RMN. 20 Para ligandos de unión fuerte es despreciable la concentración de proteína y ligando libre, por lo que se puede asumir que por completo están en estado de unión, por lo que el complejo se comporta como una molécula estable simple. Esto conlleva a que en el espectro no se aprecien señales de especies libres o de intercambios. Para aquellos en los que la unión es moderada, coexisten especies libres de proteínas y ligandos y de ambas formando complejo. Dependiendo de la estabilidad del complejo, el intercambio podrá afectar al espectro o no. Si la KD= 1mM, el 50% estarán en estado libre y el otro formando complejo, por lo que en esta situación es difícil analizar el espectro y es por ello por lo que se suele dirigir hacia la formación de complejo añadiendo exceso de ligando. Las señales de exceso pueden ser eliminadas del espectro, pero la solubilidad debe ser alta. Con esto se consiguen interacciones moderadamente fuertes que llevan a un equilibrio entre los estados libres y unidos de los compuestos, lo que permite obtener información estructural. Para uniones débiles, no es posible forzar este estado, ya que sólo existe una pequeña cantidad en estado complejado, por lo que es imposible determinar la estructura tridimensional del complejo. En cambio, la RMN permite obtener cambios conformacionales que se producen tras la formación del complejo y las regiones que están implicadas en la unión. Hay que tener en cuenta que la unión de otra molécula a una región cercana al sitio activo estudiado, puede perturbar los espines de los núcleos que se encuentren en el sitio de unión, sin necesidad de que la estructura cambie. En el caso de que así fuera y se produzca la reordenación, no se podría localizar el sitio de unión por medio de la RMN, aunque son pocos los casos en los que esto ocurre (Holzgrabe y cols., 1999). Según como se observe el cambio experimental en el desplazamiento químico, se puede cuantificar la afinidad de unión según la intensidad de las proteínas libres o unidas. Se diferencia entre: Intercambio lento: los ligandos tienen alta afinidad de unión, KD < 1 µM. Las señales de los ligandos aumentan de forma gradual a medida que se forma el complejo. Esto significa, que a medida que va desapareciendo del estado libre, aumenta de forma concomitante la forma unida, y por tanto, su 21 intensidad. Esto ocurre cuando la diferencia en valor absoluto de los cambios del desplazamiento químico entre las formas libres y unidas es mucho mayor que la constante de intercambio (kexc): |δlibre − δunido|>> kexc (Figura 4, abajo, residuos 230 y 250). Intercambio rápido: los ligandos tienen baja afinidad de unión, kD > 10 µM. Los cambios en el desplazamiento químico se producen de forma no lineal con la cantidad de proteína libre respecto a la que se encuentra en la forma de complejo. Se puede observar cuando la diferencia en el valor absoluto de los desplazamientos químicos en estado libre y en forma unida, es menor que kexc: |δlibre − δunido| < kexc (Figura 4, arriba, residuos 203 y 214). Intercambio intermedio: |δlibre − δunido|≈ kexc. (Figura 4, abajo, residuo 158). Figura 4 Desplazamientos de las señales amida de una proteína tras la unión de un ligando. Los dos paneles muestran regiones representativas con la superposición de trece espectros 1H-15N 2D-HSQC de PCNA, una proteína humana trimérica de 98 KDa, perdeuterada y marcada con 15N, registrados con cantidades crecientes de un ligando. Las flechas indican el movimiento durante la titración de cinco residuos amidas seleccionadas: Arriba, los residuos 203 y 214 sufren intercambio rápido. Abajo, los residuos 230 y 250 sufren intercambio lento, mientras que el residuo 158 presenta intercambio intermedio (Campos-Olivas, 2011) 28 Se pueden hacer simulaciones sencillas, que permiten un modelado estructural del conector más fácil, utilizando paquetes de software, como por ejemplo, LUDI, ALLEGROW o QXP. Cambios y estructuras comunes que se suelen utilizar en la formación de los conectores son los siguientes: a. Inclusión de átomos de O/S para mejorar la flexibilidad, b. Evitar conectores alifáticos, ya que disminuyen la diversidad conformacional, c. Para conectores de 3 átomos, el hidroxietil (CCO), es el que ofrece mayor rango de diversidad conformacional. En cambio, de los utilizados, el propil (CCC) es el que menos ofrece, d. Para conectores de 4 átomos, metiletiltioéter (CCSC) es el que ofrece mayor rango de diversidad conformacional, seguido de hidroxipropil (CCCO). La acilsulfonamida (ASULF) y el butil (CCCC) son los que menos ofrecen, e. Los dobles enlaces ayudan a tener una mayor variedad al tener menor impedimento estérico, aunque por otro lado pierde rotación por el enlace. Una vez que se produce la conexión con éxito, se refina y rigidiza según la información estructural del ligando. El objetivo de la conexión de los fragmentos es aprovechar la gran afinidad que pueden llegar a tener los compuestos bidentados y se consigue aumentando las interacciones entre proteína-ligando, es decir, aumentando su entalpía, y evitando la pérdida de entropía en posibles traslaciones y rotaciones que puedan ocurrir tras la unión. 29 Figura 5. SAR by NMR a-c) Se aprecian los pasos para obtener un ligando a partir de este método. d-f) Ejemplo de fármaco diseñado a partir de este método, un inhibidor de la estromelisina (Pellecchia y cols., 2002) 30 4.4.1. Ventajas del método SAR by NMR Aunque tiene un coste mayor que otros métodos de cribado, este método ofrece muchas ventajas (Huth y cols., 2005; Holzgrabe y cols., 1999): Tiene un alto rendimiento. Esto se debe a la alta sensibilidad al utilizarse el espectro bidimensional 1H/15N HSQC y la fácil evaluación de compuestos, ya que se pueden llegar a analizar unos 1.000 compuestos al día, Los cambios apreciados son la evidencia más determinante de que se produce una unión bien definida y específica, Tiene alta sensibilidad para ligandos de baja afinidad, Permite la cuantificación fácil de KD, Es una técnica inmune a falsos positivos que pueden producirse por uniones no específicas, Si aparecen artefactos, pueden ser detectados fácilmente, Un cambio en el desplazamiento químico producido por la unión de un ligando permite detectar que hay unión, identificar el sitio de unión y orientar al ligando en la diana. Es decir, que ofrece mucha información y que esta puede ser utilizada como huella digital, Aumenta el espacio químico exponencialmente al tamaño de la quimioteca, por lo que se pueden escanear una mayor diversidad de compuestos en menos tiempo, La edición espectral es capaz de eliminar señales del ligando. Por ello, se pueden realizar experimentos a altas concentraciones de un ligando, como por ejemplo, al detectar el segundo cabeza de serie en presencia de cantidad saturada de ligando de primer sitio, Para mejorar su rendimiento se pueden utilizar criosondas o etiquetado 13C de metilos de aminoácidos, por lo que, actualmente, es de aplicación rutinaria sobre dianas con un peso molecular mayor incluso de 40 KDa. 4.4.2. Ejemplos de aplicación del método SAR by NMR Uno de los primeros fármacos sintetizados por este método fue un inhibidor del receptor FK506, que es el encargado de la activación de las células T. Una de las 31 utilidades de FKBP, que fue como se llamó a este inmunosupresor, es la de suprimir las reacciones típicas que se dan como rechazo tras un trasplante. Como ligando de primer sitio de unión se identificó un derivado del ácido pipecolínico, con una KD=2 µM. En condiciones saturadas de éste, se obtuvo que un derivado de la benzamilida, con KD=0,8 µM, se unía a un sitio de unión próximo al del primer ligando. Se hizo un muestreo de ligandos similares a este último obtenido, que tuviera mayor afinidad por FK506. Se eligió un compuesto con KD=100 µM como segundo ligando. Para desarrollar el conector entre ambos, se encontraron cinco con buena afinidad por el receptor. Finalmente se eligió uno de ellos y se generó el compuesto FKBP de alta afinidad con KD= 19 mM (Shuker y cols., 1996). Otro ejemplo de fármaco obtenido por SAR by NMR es un inhibidor de la estromelisina, una metaloproteasa que se asocia con inflamación en sujetos asintomáticos con factores de riesgo cardiovascular. Este fármaco actúa como inhibidor de artritis y de metástasis de tumores. En este caso, el ligando de primer sitio se escoge de antemano al ser una autoproteasa. Es ácido acetohidroxámico, con KD= 15 mM, ya que muchos inhibidores de las metaloproteasas contienen restos de este ácido. En condiciones de saturación de este ligando, se busca por RMN un segundo ligando. Es una búsqueda focalizada en compuestos hidrofóbicos, ya que se uniría a subsitios de este mismo tipo. Se eligen análogos de bifenilos, que presentan buena afinidad. Tras optimización de éste, se determina un conector de 2 C de longitud. Y con ello se obtiene el ligando bidentado definitivo, con KD=20 mM. Figura 6 Ligandos obtenidos (1 y 2) por SAR by NMR y su posterior conexión (3), de un inhibidor de la enzima estromelisina (Stockman y Dalvit, 2002). 32 También se pueden identificar fármacos que interactúen con receptores acoplados a proteína G, como el GPR40. Este es un receptor de ácidos grasos de las células β-pancreáticas, que se encarga de aumentar la secreción de insulina cuando es activado. En caso de que no se secrete bien la insulina, siempre y cuando no sea por la afectación de las células β, se pueden sintetizar fármacos que actúan activando este receptor, a partir de ligandos que interactúen con esta diana (Bartoschek y cols., 2010). Para finalizar, indicar que, dado que el proceso global de poner en el mercado un nuevo fármaco es cuestión de bastantes años como ya se comentó, todavía se tardará algún tiempo en ver los resultados netos de la aplicación de esta nueva aproximación al diseño de fármacos, pero se espera que en el futuro inmediato, más candidatos derivados de esta estrategia FBDD estarán comercialmente disponibles para beneficio de los pacientes (Ma y cols., 2016). 33 5. Conclusión Debido a los grandes avances que se han realizado a lo largo de las últimas décadas, el proceso de descubrimiento y diseño de nuevos fármacos a partir de espectroscopía RMN ha vuelto a aumentar las probabilidades de encontrar y comercializar nuevos medicamentos. Aun así, el método no obtiene actualmente la misma gran cantidad de compuestos que cuando se desarrolló. En un principio, se observaron proteínas conocidas estructural o funcionalmente. Gracias a ello, se analizaron muchos ligandos y se asociaron a señales RMN, creando así bases de datos. El enfoque actual de esta práctica es el de obtener información de dianas consideradas sin druggability, sobre todo a través de los genes que las codifican, con el fin de sintetizar fármacos que interaccionen con ellas. También se utiliza para obtener nuevos fármacos que tengan mayor potencia sobre enfermedades graves, como puede ser el cáncer o el VIH. El SAR by RMN, es el método más selectivo y con mayor rendimiento y sensibilidad de todos los que utilizan espectroscopía RMN. Por ello es el método más utilizado, de los que incluyen RMN, en la industria para el diseño de nuevos fármacos. El cribado de ligandos de baja afinidad para después optimizarlos y la formación de ligandos bidentados, de forma que se obtienen ligandos de alta afinidad y potencia por la diana, respaldan a este método. Uno de los enfoques futuros de este método es la determinación de fármacos a partir de información genética de la proteína a la cual se unirá. Otro sería su papel en la metabolómica, desarrollando compuestos relacionados con metabolitos, ya sean para reducir el efecto de estos en caso de que sean perjudiciales para el organismo, o para sintetizar análogos a ellos cuando estos metabolitos provocan un efecto beneficioso en el organismo. Por último, el desarrollo de nuevos espectros que analizan núcleos metálicos e inorgánicos, permite desarrollar más y mejores fármacos que contienen este tipo de núcleos, como el Pt en fármacos utilizados frente al cáncer. 34 6. Bibliografía Bartoschek, S., Klabunde, T., Defossa, E., Dietrich, V., Stengelin, S., Griesinger, C., et al. Drug design for G-protein-coupled receptors by a ligand-based NMR method. Angew Chem. Int. Ed. 2010; 49(8):1426–9. Campos-Olivas, R. NMR screening and hit validation in fragment based drug discovery. Curr. Top. Med. 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