Valoración del efecto protector del ozono sobre el rechazo crónico en el trasplante pulmonar experimental

UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA Facultad de Veterinaria Programa de Doctorado: Clínica Veterinaria e Investigación Terapéutica Título de la Tesis: “VALORACIÓN DEL EFECTO PROTECTOR DEL OZONO SOBRE EL RECHAZO CRÓNICO EN EL TRASPLANTE PULMONAR EXPERIMENTAL” Tesis Doctoral presentada por Da. Keila Eliam Zerecero Ramírez Y Dirigida por el Dr. D. Norberto Santana Rodríguez, y codirigida por el Dr. D. Bernardino Clavo Varas, el Dr. D. Pedro Llontop Santisteban, el Dr. D. José Manuel García Castellano y el tutor del programa de doctorado el Dr. D. José Alberto Montoya Alonso. El Director, Codirectores, El Tutor, La Doctoranda, Las Palmas de Gran Canaria a 9 de julio de 2013. TITULO DE LA TESIS “VALORACION DEL EFECTO PROTECTOR DEL OZONO, SOBRE EL RECHAZO CRÓNICO EN EL TRASPLANTE PULMONAR EXPERIMENTAL” Tesis Doctoral presentada por: DÑA. KEILA ELIAM ZERECERO RAMÍREZ Dirigida por los Doctores: DR. NORBERTO SANTANA RODRÍGUEZ DR. BERNARDINO CLAVO VARAS DR. PEDRO LLONTOP SANTISTEBAN DR. JOSÉ MANUEL GARCÍA CASTELLANO Tutor del Programa de Doctorado: DR. JOSÉ ALBERTO MONTOYA ALONSO El Director, El Director, El Director, El Director, El Tutor, La Doctoranda Las Palmas de Gran Canaria a 9 de julio del 2013. Barranco de la Ballena, Sn 35010 – Las Palmas de Gran Canaria Telf.: 928 45 00 00 NORBERTO SANTANA RODRIGUEZ, DOCTOR EN MEDICINA, MEDICO ESPECIALISTA EN CIRUGÍA TORÁCICA Y RESPONSABLE DE CIRUGÍA EXPERIMENTAL DE LA UNIDAD DE INVESTIGACIÓN DEL HOSPITAL UNIVERSITARIO DR.NEGRÍN DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA CERTIFICA: Que el trabajo de investigación titulado “Valoración del efecto protector del ozono sobre el rechazo crónico en el trasplante pulmonar experimental” ha sido realizado por Dña. Keila Eliam Zerecero Ramírez, en la unidad de Investigación del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín, bajo mi dirección y asesoramiento, una vez revisada la presente memoria la encuentro apta para su defensa como Tesis Doctoral, para optar al grado de doctor. Y para que así conste y surta los efectos oportunos extiendo el presente certificado, en Las Palmas de Gran Canaria a 1 de julio del dos mil trece. NORBERTO SANTANA RODRIGUEZ Barranco de la Ballena, Sn 35010 – Las Palmas de Gran Canaria Telf.: 928 45 00 00 BERNARDINO CLAVO VARAS, DOCTOR EN MEDICINA, MEDICO ESPECIALISTA EN ONCOLOGIA RADIOTERAPICA E INVESTIGADOR DE LA UNIDAD DEL DOLOR CRÓNICO Y DE LA UNIDAD DE INVESTIGACIÓN DEL HOSPITAL UNIVERSITARIO DR.NEGRÍN DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA CERTIFICA: Que el trabajo de investigación titulado “Valoración del efecto protector del ozono sobre el rechazo crónico en el trasplante pulmonar experimental” ha sido realizado por Dña. Keila Eliam Zerecero Ramírez, en la unidad de Investigación del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín, bajo mi dirección y asesoramiento, una vez revisada la presente memoria la encuentro apta para su defensa como Tesis Doctoral, para optar al grado de doctor. Y para que así conste y surta los efectos oportunos extiendo el presente certificado, en Las Palmas de Gran Canaria a 28 de junio del dos mil trece. BERNARDINO CLAVO VARAS Barranco de la Ballena, Sn 35010 – Las Palmas de Gran Canaria Telf.: 928 45 00 00 PEDRO LLONTOP SANTISTEBAN, DOCTOR EN VETERINARIA E INVESTIGADOR DE LA UNIDAD DE INVESTIGACIÓN DEL HOSPITAL UNIVERSITARIO DE GRAN CANARIA DR. NEGRIN CERTIFICA: Que el trabajo de investigación titulado “Valoración del efecto protector del ozono sobre el rechazo crónico en el trasplante pulmonar experimental” ha sido realizado por Dña. Keila Eliam Zerecero Ramírez, en la unidad de Investigación del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín, bajo mi dirección y asesoramiento, una vez revisada la presente memoria la encuentro apta para su defensa como Tesis Doctoral, para optar al grado de doctor. Y para que así conste y surta los efectos oportunos extiendo el presente certificado, en Las Palmas de Gran Canaria a 28 de junio del dos mil trece. PEDRO LLONTOP SANTISTEBAN Barranco de la Ballena, Sn 35010 – Las Palmas de Gran Canaria Telf.: 928 45 00 00 JOSE MANUEL GARCIA CASTELLANO, DOCTOR EN MEDICINA Y CIRUGÍA E INVESTIGADOR CIENTÍFICO DE LA UNIDAD DE INVESTIGACIÓN DEL COMPLEJO HOSPITALARIO UNIVERSITARIO INSULAR-MATERNO INFANTIL DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA. CERTIFICA: Que el trabajo de investigación titulado “Valoración del efecto protector del ozono sobre el rechazo crónico en el trasplante pulmonar experimental” ha sido realizado por Dña. Keila Eliam Zerecero Ramírez, en la unidad de Investigación del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín, bajo mi dirección y asesoramiento, una vez revisada la presente memoria la encuentro apta para su defensa como Tesis Doctoral, para optar al grado de doctor. Y para que así conste y surta los efectos oportunos extiendo el presente certificado, en Las Palmas de Gran Canaria a 29 de junio del dos mil trece. JOSE MANUEL GARCIA CASTELLANO JOSÉ ALBERTO MONTOYA ALONSO, CATEDRÁTICO DE MEDICINA Y CIRUGÍA ANIMAL DEL DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA ANIMAL, PRODUCCIÓN ANIMAL, BROMATOLOGIA Y TECNOLOGIA DE LOS ALIMENTOS DE LA FACULTAD DE VETERINARIA DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA Y DIRECTOR DEL PROGRAMA DE DOCTORADO “CLINICA VETERINARIA E INVESTIGACION TERAPEUTICA” CERTIFICA: Que Dña. Keila Eliam Zerecero Ramírez, Licenciada en Veterinaria por la Universidad Nacional Autónoma de México, ha sido realizado bajo mi tutoría el presente trabajo de tesis doctoral titulado “Valoracion del efecto protector del ozono sobre el rechazo crónico en el trasplante pulmonar experimental”. Y para que así conste y surta los efectos oportunos extiendo el presente certificado, en Arucas (Las Palmas de Gran Canaria) a 9 de julio del dos mil trece. J. ALBERTO MONTOYA ALONSO FINANCIACIÓN Tesis Doctoral Keila Eliam ZereceroRamirez Financiación El proyecto de investigación que ha permitido la realización de esta tesis doctoral ha sido financiado por: Entidad financiadora: Beca FIS del Instituto de Salud Carlos III Proyecto de investigación: PI 10/01485 Título: “Valoración del efecto protector del ozono en el rechazo crónico del TP experimental”. Investigador principal: Dr. Norberto Santana Rodríguez Investigadores colaboradores: Dr. Pedro Llontop Santisteban y Dr. Bernardino Clavo Varas Periodo: 2010-2013. Cuantía económica: 35.000 Euros INDICES Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Indice general INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………….. 1 ………………………………………………………………………. 1. Trasplante pulmonar 1 1.1. Definición y conceptos………………………………………………………………...... 1 1.2. Consideraciones generales………………………………………………………………. 1 1.3. Reseña histórica del TP………………………………………………………………..... 2 1.4. Situación del TP experimental………………………………………………………… 4 1.5. Tipos de TP…………………………………………………………………………........ 4 1.6. Indicaciones para el TP…………………………………………………………………. 5 1.6.1. Enfermedad pulmonar intersticial difusa (EPID)…………………………………....... 5 1.6.2. Fibrosis quística (FQ) y otras bronquietásias…………………………………………. 6 1.6.3. Enfermedades pulmonares obstructivas………………………………………………. 7 1.6.4. Enfermedades vasculares pulmonares………………………………………………… 8 1.6.5. Indicaciones para realizar un TP pediátrico………………………………………....... 9 1.7. Contraindicaciones para realizar el TP………………………………………………...... 10 1.7.1. Contraindicaciones absolutas…………………………………………………………. 10 1.7.1. Contraindicaciones relativas…………………………………………………………... 11 1.8. Selección del receptor…………………………………………………………………… 11 1.8.1. Exámenes y pruebas de laboratorio que se deben realizar al paciente potencial receptor de un TP……………………………………………………………...………. 12 1.8.2. Evaluación de la comorbilidad del receptor………………………………………....... 12 1.9. Selección del donante…………………………………………………………………… 13 1.9.1. Donantes en muerte cerebral………………………………………………………….. 13 1.9.2. Donantes en asistolia………………………………………………………………...... 16 1.9.3. Donantes vivos……………………………………………………………………....... 17 1.9.4. Mantenimiento y cuidados del donante……………………………………………...... 18 1.10. Compatibilidad donante-receptor……………………………………………………… 18 1.11. Resultados del TP……………………………………………………………………… 19 1.11.1. Supervivencia……………………………………………………………………....... 19 1.11.2. Calidad de vida………………………………………………………………………. 20 1.12. Complicaciones en el TP………………………………………………………………. 20 1.12.1. Complicaciones precoces………………………………………………………….... 21 1.12.1.1. Atribuibles al acto quirúrgico……………………………………………………… 21 1.12.1.2. Pulmonares………………………………………………………………………… 23 1.12.1.3. Infecciosas…………………………………………………………………………. 25 1.12.1.4. Generales………………………………………………………………………....... 28 1.12.2. Complicaciones tardías………………………………………………………………. 29 1.12.2.1 Procesos linfoproliferativos o neoplasias………………………………………....... 29 1.12.2.2. Rechazo crónico (RC) y bronquitis obliterante (BO)……………………………… 29 1.12.2.3. Toxicidad farmacológica………………………………………………………...... 31 …………………………………………………………………...... 2. La terapia con Ozono 32 2.1. Descubrimiento del ozono y su historia en la medicina………………………………… 32 2.2. Propiedades físicas y químicas del ozono………………………………………………. 33 2.3. El ozono ambiental y su toxicidad………………………………………………………. 33 Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Indice general 2.4. Producción de ozono para la práctica médica y su dosificación……………………....... 35 2.4.1. La concentración de ozono……………………………………………………………. 36 2.5. Mecanismo de acción del ozono……………………………………………………....... 37 2.6. Vías de administración del ozono……………………………………………………….. 42 2.7. Efectos secundarios y contraindicaciones del ozono……………………………………. 47 2.7.1. Efectos adversos de la terapia con ozono…………………………………………...... 47 2.7.2. Contraindicaciones para utilizar la terapia con ozono……………………………....... 49 2.7.3. Recomendaciones para evitar los efectos adversos en la ozonoterapia……………….. 50 JUSTIFICACION…………………………………………………………………………... 52 OBJETIVOS……………………………………………………………………………....... 54 MATERIAL Y METODO 55 …………………………………………………………………………. 1. Sujetos de estudio 55 1.1. Características de alojamiento y manutención…………………………………………... 55 1.2. Normativa para el uso, protección y cuidado del animal de laboratorio………………… 55 2. Instalaciones y equipo…………………………………………………………………… 56 3. Material quirúrgico y fungible…………………………………………………………... 56 4. Medicación anestésica y analgésica……………………………………………………... 57 5. Equipo y reactivos para el análisisy procesamiento de las muestras……………………. 57 6. Diseño del estudio……………………………………………………………………….. 58 7. Técnica quirúrgica………………………………………………………………………. 59 7.1. Inducción de la muerte cerebral y extracción del pulmón donante……………………… 59 7.2. Implante del injerto en el receptor………………………………………………………. 61 8. ……………………………………... Cuidados postquirúrgicos y tratamiento con ozono 63 8.1. El tratamiento con ozono………………………………………………………………... 63 9. Sacrificio del animal trasplantado……………………………………………………….. 63 10. Mediciones………………………………………………………………………………. 64 10.1. Respuesta clínica al trasplante………………………………………………………. 64 10.2. Determinaciones histológicas……………………………………………………….. 64 10.3. Determinaciones genómicas………………………………………………………… 65 10.3.1. Extracción de RNA y síntesis de DNA……………………………………………... 65 Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Indice general 10.3.2. Determinación de la expresión genómica mediante RT-PCR………………………. 66 10.4. Análisis estadístico………………………………………………………………….. 67 RESULTADOS 68 ………………………………………………………….. 1. Evolución clínica postoperatoria 68 ……………………………………………….. 2. Descripción macroscópica de lospulmones 68 …………………………………………………………… 3. Determinaciones histológicas 69 ………………………………………… 4.- Análisis de la expresión genética por RT-PCR 71 DISCUSIÓN………………………………………………………………………………… 75 CONCLUSIONES………………………………………………………………………….. 82 BIBLIOGRAFIA…………………………………………………………………………… 84 Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Indice de tablas Tabla I. Comorbilidad en el receptor de trasplante pulmonar………………… 13 Tabla II. Grados del rechazo agudo……………………………………………… 24 Tabla III. Clasificación clínica de la BO………………………………………… 30 Tabla IV. Toxicidad farmacológica……………………………………………….. 31 Tabla V. Efectos tóxicos del ozono………………………………………………. 34 Tabla VI. Sistema de antioxidantes……………………………………………….. 42 Tabla VII. Vías de administración del ozono………………………………………. 43 Tabla VIII. Condiciones de la RT-PCR…………………………………………….. 66 Tabla IX. Tiempos invertidos en la realización de los TP experimentales………... 68 Tabla X. Hallazgos histológicos con hematoxilina y eosina……………………... 71 Tabla XI. Expresión génica del pulmón sham vs el pulmón trasplantado………… 71 Tabla XII. Expresión génica del pulmón sham vs el pulmón trasplantado y tratado con ozono……………………………………………………………….. 72 Tabla XIII. Expresión génica del pulmón trasplantado vs el pulmón trasplantado y tratado con ozono………………………………………………………. 72 Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Indice de figuras Figura 1. Reacción natural de formación de ozono…………………………………... 33 Figura 2. Localización del ozono ambiental…………………………………………. 34 Figura 3. Corona de descarga………………………………………………………… 35 Figura 4. Diagrama de instalaciones para ozonoterapia……………………………… 36 Figura 5. Formación de peróxido de hidrógeno a partir de la administración de ozono…………………………………………………………………… 38 Figura 6. Inducción del estrés oxidativo transitorio y controlado por los antioxidantes de la sangre………………………………………………… 38 Figura 7. Efectos de los productos del estrés oxidativo inducido por la ozonoterapia………………………………………………………………… 40 Figura 8. Filtro antibacterial del ozonador……………………………………………. 43 Figura 9. Rata Sprague-Dawley……………………………………………………… 55 Figura 10. Quirófano 1 de la Unidad de Investigación del HUGC Dr. Negrín………... 56 Figura 11. Instrumental microquirúrgico………………………………………………. 57 Figura 12. Cuff y pinza yasargil………………………………………………………... 57 Figura 13. Medicación anestésica y analgésica………………………………………... 57 Figura 14. Intubación orotraqueal……………………………………………………… 59 Figura 15. Inducción de muerte cerebral………………………………………………. 59 Figura 16. Esternotomía media y perfusión pulmonar…………………………………. 60 Figura 17. Colocación de cuff‟s………………………………………………………... 61 Figura 18. Hilio pulmonar disecado……………………………………………………. 61 Figura 19. Anastomosis del injerto pulmonar………………………………………….. 62 Figura 20. Ozonosan Alpha plus® Dr.Hänsler Nordring, Germany………………… 63 Figura 21. Administración rectal de ozono…………………………………………….. 63 Figura 22. Toracotomía de un animal trasplantado a los 3 meses……………………... 64 Figura 23. Bloque pulmonar de un individuo del grupo TP…………………………… 69 Figura 24. Bloque pulmonar de un individuo del grupo TP-O3………………………... 69 Figura 25. Pulmón histológicamente sano…………………………………………… 70 Figura 26. Infiltrados linfoplasmocitarios perivasculares e intensa vasculitis…………. 70 Figura 27. Grupo de TP-O3 mostrando rechazo agudo leve…………………………… 70 Figura 28. Sham vs TP…………………………………………………………………. 73 Figura 29. Sham vs TP-O3…………………………………………………………… 73 Figura 30. TP vs TP-O3………………………………………………………………… 74 ABREVIATURAS Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Abreviaturas ADN Acido desoxirribonucleico ADP Adenosindifosfato AHT Autohemoterapia ozonizada AMP Adenosinmonofosfato AP Antero-posterior ARMD Degeneración macular ARN Acido ribonucleico ATP Adenosintrifosfato BAL Antibodies levels bHJH-PAS Basic hélix-loop-helix PAS BO Bronquitis obliterante BTB Biopsia transbronquial °C Grados centígrados C5H4N4O3 Acido úrico C6H8O6 Acido Ascórbico Ca++ Calcio CEC Circulación extracorpórea CFCs Clorofluorocarbonados CH4 Metano Cldn5 Claudin 5 cm centímetros CMV Citomegalovirus CO Monóxido de carbono COX-2 Ciclooxigenasa 2 CV Capacidad vital DBP Solución de dextrano baja en potasio DEZn Dietil-zinc DLCO Capacidad de difusión pulmonar de monóxido de carbono DSIP Delta sleep inducing peptide immunoreactor EC Solución de Eurocollins ECA Enzima convertidora de angiotensina ECMO Circulación extracorpórea con oxigenación de membrana EPAS-1 Endothelial PAS domain protin 1 EPID Enfermedad pulmonar intersticial difusa EPN Edema pulmonar neurogénico EPOC Enfermedad pulmonar obstructiva crónica F2-IsoPs F2-isoprostanos Fas Proteína de superficie ligada al TNF Fe Hierro Fe2+ Ion ferroso Fe3+ Ion ferrico FELASA Federation of European Laboratory Animal Science Association FEV1 Volumen espiratorio forzado en el primer segundo FiO2 Fracción de oxígeno inspirado FMO2 Flavin mono-oxigenasa 2 FN- Factor nuclear kappa-beta Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Abreviaturas FP Fibrosis pulmonar FPI Fallo primario del injerto FQ Fibrosis quística FR Frecuencia respiratoria g Gramos G-6PD Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa g/mol Gramos por mol G-GPD Glucosa 6-fosfato deshidrogenasa GPX Glutatión peroxidasa GPX-3 Glutathione peroxidase 3 GSH Glutatión reducido GSH-Rd Glutatión reductasa GSSG Glutatión oxidado GSH-T Gutation transferasa H+ Hidrógeno HClO Acido hipocloroso HCSC Hospital Clínico San Carlos H2O Agua H2O2 Peróxido de hidrógeno H2SO4 Acido sulfúrico HIV Virus de inmunodeficiencia humana HIF1a Hipoxia inducible factor 1-alpha Hspb27 Heat shock 27 kDa protein 1 HLA Antígenos de histocompatibilidad HTP Hipertensión pulmonar IA Intraarterial IAr Intraarticular ID Intradiscal I/E Relación inspiratoria/espiratoria IF Intraforaminal ILx Intradiscal IM Intramuscular IP Intraperitoneal IPL Intrapleura IV Intravenosa IL-1 Interleukina 1 IL-2 Interleukina-2 IL-8 Interleukina-8 IL-12 Interleukina-1 ISHLT International Society for Heart and Lung Transplantation K+ Potasio KLF2 Krüppel-like factor 2 km/m3 Kilómetros por metro cúbico L/min Litros por minuto LIR Lesion de isquemia-reperfusión LRSG Lung Rejection Study Group Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Abreviaturas LOPs Productos de la oxidación lipídica mcg/kg Microgramos por kilo mcg/L Microgramos por litro mcg/ml Microgramos por mililitro MDA Malonildialdehído MgCl2 Cloruro de magnesio ml Mililitros min/m2 Minutos por metro cuadrado mm Milímetros mmHg Milímetros de mercurio m Micrometros l Microlitros Na+ Sodio NaCl Cloruro de sodio nm Nanometros NO Oxido nítrico ó monóxido de nitrógeno NO2 Dióxido de nitrógeno NYHA New York Heart Association ONT Organización Nacional de Trasplantes O2 Oxígeno O2Anión superóxido O3 Ozono OHRadical hidroxilo O=NOOPeroxinitrito PaO2 Presión alveolar de oxígeno PCO2 Presión parcial de anhídrico carbónico PEEP Presión positiva al final de la espiración PGE1 Prostaglandina E 1 pH Potencial hidrógeno Plvap Plasmalemma vesicle associated protein ppmv Partes por millón volumen PO Oral POAD Enfermedad arterial periférica oclusiva PO2 Presión parcial de oxígeno Prdx-6 Peroxiredoxin 6 PUFAs Acidos grasos poliinsaturados PVC presión venosa central RA Rechazo agudo RC Rechazo crónico RCP Resucitación cardio-pulmonar RHA Rechazo hiperagudo RLO Radicales libres de oxígeno ROS Especies reactivas de oxígeno ROO Radicales peroxil R-OOH Hidroxiperóxidos RTLFs Capacidad amortiguante y antioxidante de los fluidos del tracto respiratorio Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Introducción 5  Bilateral secuencial.- Se implanta primero un pulmón y posteriormente se implanta en contralateral, realizando la anastomosis bronquial, arterial y venosa independientemente en cada pulmón.  Cardiopulmonar.- Se reemplaza en bloque el corazón y ambos pulmones, realizando una anastomosis traqueal y las anastomosis propias del trasplante cardiaco aislado.  Lobar.- Se trasplanta un lóbulo para realizar un trasplante unilateral o dos lóbulos para realizar un TP bilateral(39). 1.6. Indicaciones para realizar el TP. El trasplante pulmonar está indicado como la alternativa terapéutica de enfermedades pulmonares no malignas en fase terminal cuando fracasan otras alternativas de tratamiento y cuando quizás la expectativa de vida a plantear según el criterio médico esté por debajo de los dos años. Se plantea al realizar un TP a éstos pacientes que la expectativa de vida que se les ofrezca esté por encima a la que alcanzaría sin el TP(40). Además de evaluar la situación y la historia clínica completa del paciente, debemos profundizar en aquellos factores de riesgo específicos con el fin de identificar el período (ventana del trasplante) en el cual se debe de plantear esta opción terapéutica, por lo cual englobamos las patologías pulmonares en los siguientes grupos(41-43): 1.6.1. Enfermedad pulmonar intersticial difusa (EPID). Que se compone de un grupo heterogéneo de patologías que evolucionan a fibrosis pulmonar (FP) hasta causar un fallo respiratorio. La más frecuente es la FP idiopática y de etiología desconocida. En este grupo, los pacientes suelen tener una edad promedio entre los 40-70 años y con frecuencia presentan una patología extrapulmonar (alteraciones digestivas, cardíacas, efectos secundarios de la medicación inmunosupresora, corticoides) y pulmonar secundaria (carcinoma broncogénico, TBC pulmonar, zonas de bronquiectasias colonizadas por patógenos). Para evaluar el estado de la gravedad de ésta enfermedad es necesario realizar una prueba de esfuerzo, ya que en ocasiones los resultados de las pruebas respiratorias no evidencian el desarrollo de la misma. En los casos en donde los pacientes ya se encuentran en una fase terminal, continuar con el tratamiento con fármacos esteroides y otros agentes inmnosupresores no han demostrado proporcionar algún tipo de beneficio. Los pacientes con FP idiopática que cumplan los siguientes requisitos deberán ser considerados como posibles candidatos para inclusión en la lista de espera para TP: Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Introducción 6 a) Enfermedad sintomática y progresiva no controlada con esteroides o inmunosupresores (desaturación en reposo y/o con el ejercicio), demostrada con controles cada 3 meses evaluando la respuesta al tratamiento. b) Deterioro de la función pulmonar, incluso en pacientes con escasos síntomas. c) Capacidad vital (CV) entre el 60 y 70% y/o capacidad de difusión pulmonar del monóxido de carbono (DLCO) entre el 50 y 60%. La FP asociada a una enfermedad sistemática como ocurre en la esclerodermia, la artritis reumatoide, la sarcoidosis o postquimioterapia deben considerarse individualmente. En general, se requiere que exista poca actividad sistémica de la enfermedad y que cumplan todos los criterios generales médicos. Además, deben haber fracasado todas las demás opciones terapéuticas. Cumplidos estos requisitos, se aplican los mismos criterios que para la FP idiopática. En los casos de FP es recomendable, siempre que se pueda, un TP bipulmonar frente al unilateral. 1.6.2. Fibrosis quística (FQ) y otras causas de bronquiectasias. En este grupo se encuentra la FQ y otras tipos de bronquiectasias como deficiencias estructurales o funcionales de la motilidad ciliar, el síndrome de Kartagener o inmunodeficiencias. En todas ellas se da la particularidad de que los pacientes presentan colonización por patógenos en ocasiones multiresistentes e incluso panresistentes; suelen hallarse la Pseudomona aeruginosa y con menos frecuencia la Burkholderia cepacia. Sin embargo, la presencia de estos gérmenes no es una contraindicación absoluta para el trasplante, pero si son factor potencial del aumento de la morbilidad y la mortalidad en el periodo postoperatorio inmediato. En estas enfermedades el tipo de trasplante que se recomienda que se debe realizar es el bilateral, para evitar el paso de los gérmenes del pulmón nativo al recién implantado, independientemente de ser remitido a un centro trasplantador con posibilidad de realizar pruebas de sensibilidades antibióticas y valorar distintas combinaciones de antibióticos que sean efectivas “in vivo”(44). Los parámetros para identificar a los pacientes con FQ o bronquiectasias como candidatos a TP en período de ventana, y que suponen una expectativa de supervivencia inferior al 50% a los 2 años, son los siguientes: a) FEV1  30%. b) PCO2  50 mmHg. c) PO2  55 mmHg. Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Introducción 7 Si el paciente presenta además de los criterios clásicos expuestos: a) Deterioro progresivo de la función respiratoria incluso con un deterioro rápido del FEV1 o que se encuentre superior al 30% del previsto que condicione un aumento del número de hospitalizaciones b) Hemoptisis masiva recidivante acompañada de una desnutrición severa a pesar del tratamiento médico correcto Se consideran como signos de alerta y el paciente debe ser remitido lo antes posible a una unidad de TP para un contacto inicial. Las mujeres jóvenes con estos parámetros tienen peor pronóstico, y por tanto deben ser remitidas para valoración con carácter urgente a un centro de referencia de TP. 1.6.3. Enfermedades pulmonares obstructivas. En este grupo englobamos a los pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) no bronquiectásica (en sus variantes bronquitis crónica o enfisema), la deficiencia de alfa-1-antitripsina y a la bronquiolitis obliterante (BO). Se debe considerar al paciente como un potencial candidato a TP si presenta: a) FEV1  25%. b) PCO2  55 mmHg. Generalmente los pacientes que presentan una PCO2 elevada y oxigenoterapia domiciliaria crónica de largo tiempo tienen peor pronóstico, por lo que deben de ser evaluados con carácter de urgente. c) Hipertensión pulmonar con cor pulmonale crónico. Estos parámetros asociados a la edad del paciente, estado nutricional y el grado de hipertensión pulmonar, se identifican como los mejores índices para dar un pronóstico sobre la evolución del procedimiento, pero no son parámetros funcionales que permiten esclarecer el momento para la inclusión del paciente al programa de trasplante, ya que con la oxigenoterapia asociada a la rehabilitación respiratoria el paciente puede prolongar su sobrevivencia(41). Recientemente en un estudio publicado en el New England Journal of Medicine se ha descrito el índice “BODE”, en el que se demostró su capacidad de predecir la mortalidad de los pacientes con EPOC y consiste en un sistema multivariable (B índice de masa corporal, O grado de obstrucción, D grado de disnea, E capacidad de ejercicio), quizás en un futuro próximo ayude a seleccionar mejor los pacientes para trasplante(40,42). Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Introducción 8 1.6.4. Enfermedades vasculares pulmonares. La Hipertensión pulmonar (HTP) se define como la existencia de una presión media de la arteria pulmonar (PAPm) mayor de 25mmHg en reposo. Se mide por cateterismo cardiaco derecho. En función de la presión capilar se diferencian en dos grupos: I. HTP precapilar, cuando la presión enclavada es menor o igual a 15 mmHg. A este grupo pertenece la HTP idiopática, la HTP debida a enfermedades pulmonares, el tromboembolismo crónico, la enfermedad venooclusiva, la hemangiomatosis capilar, los fármacos y las conectivopatías. II. HTP postcapilar, cuando esta presión es superior a 15 mmHg. A este grupo pertenece la HTP causada por una insuficiencia cardíaca izquierda que puede ser de etiología primaria o secundaria a otra enfermedad(45). En todos estos pacientes de forma previa se debe realizar una prueba de vasorreactividad y haber instaurado un tratamiento con vasodilatadores, optimizándolo con el uso de la oxigenoterapia, antagonistas del calcio (Ca++), anticoagulación y prostaciclinas. En algunos casos, se requerirá de tratamiento quirúrgico (septostomía atrial o endarterectomía), dependiendo del proceso primario desencadenante. Pero a pesar de todas estas indicaciones, los pacientes con HTP tienen un pronóstico desfavorable de supervivencia después de realizar el TP. Todos los pacientes deben de ser evaluados en un centro con experiencia en tratamiento vasodilatador antes del trasplante. Los criterios que debe cumplir un paciente con HTP, sin enfermedad cardiaca primaria congénita, para ser considerado en ventana de TP son los siguientes: a) Enfermedad sintomática y progresiva, a pesar del tratamiento óptimo médico y/o quirúrgico que condiciona una disnea grado III-IV en la escala de la New York Heart Association (NYHA). b) Índice cardíaco menor de 21/min/m2, presión en la aurícula derecha superior a 15mmHg y presión media en la arteria pulmonar superior a 55mmHg. En la HTP secundaria al Síndrome de Eisenmenger, el papel de la medicación vasodilatadora en el período pre-trasplante no está bien establecido, considerándose el TP ante todo paciente con síntomas progresivos y disnea grado III-IV de la NYHA, a pesar de tratamiento óptimo. En todos los casos de HTP se realiza un TP bipulmonar o un TCP. Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Introducción 9 1.6.5. Indicaciones para realizar un TP pediátrico. La indicación para la realización de un TP en individuos en edad pediátrica es la manifestación de HTP asociada a enfermedades cardiovasculares o anomalías pulmonares congénitas como enfermedad estructural cardiaca, estenosis de las venas pulmonares, enfermedad parenquimatosa, anomalías congénitas pulmonares y problemas de adaptación pulmonar a la vida extrauterina. Al igual que en los pacientes adultos adultos, se debe optimizar el tratamiento médico, incluyendo los vasodilatadores y el oxígeno (O2), antes de que el niño sea considerado como candidato a TP. Desafortunadamente para estos pacientes no existen indicadores para su pronóstico debido a la diversidad de enfermedades incluidas en este apartado, pero los criterios empíricos para considerar un candidato a TP son: a) Deterioro de la enfermedad a pesar del tratamiento médico y/o quirúrgico correcto. b) Moderado o grave compromiso funcional (NYHA III-IV). c) Fallo ventricular derecho, cianosis importante o bajo gasto cardíaco. En los casos donde la HTP es secundaria una anomalía en el desarrollo o a una enfermedad parenquimatosa pulmonar, se requiere de una valoración individual así como el tomar en cuenta si el paciente presenta hernia diafragmática congénita, deficiencia congénita de surfactante pulmonar proteína B o enfermedad pulmonar enfisematosa quística congénita, ya que no existen criterios específicos que indiquen si son candidatos a un TP. Los niños que padecen de bronquitis obliterante, displasia broncopulmonar o FQ y que presentan disnea progresiva grado III-IV a pesar de tener tratamiento farmacológico, también son candidatos a un TP, sin embargo no se disponen datos sobre factores predictivos de supervivencia, por lo que se aplican los parámetros indicados para los pacientes adultos. En general, el tipo de TP que se les practica es el bipulmonar, a menos que el caso implique deformidad anatómica severa del tórax o cirugía previa que involucren un riesgo quirúrgico importante, se considera realizar TP unipulmonar para minimizar el riesgo de muerte (46). Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Introducción 10 1.7.-Contraindicaciones para realizar el TP. Para realizar un TP existen contraindicaciones absolutas que indican situaciones en las cuales no es justificado el realizar este procedimiento, relacionadas a características generales del receptor como la morbilidad y la edad entre otras y contraindicaciones relativas en las que el trasplante podría llevarse a cabo a pesar de la comorbilidad asociada más la valoración propia del paciente descartando la posibilidad lesionar otros órganos y del criterio del médico tratante: 1.7.1. Contraindicaciones absolutas(32,33,41):  Insuficiencia de otro órgano. Particularmente alteración renal con un aclaramiento de creatinina inferior a 50mg/ml/min, dado el impacto negativo de la medicación inmunosupresora sobre la función renal y enfermedad coronaria intratable o disfunción ventricular izquierda, que debe considerarse apto para un TPC y no un TP bipulmonar.  Enfermedad neoplásica o maligna en los últimos dos años. A excepción de los epiteliomas basocelulares. Para las neoplasias renales, cáncer de mama grado II o superior, el cáncer de colon en grado superior al A de Dukes, y el melanoma grado III o superior el período libre de enfermedad deberá ser superior a 5 años.  Infección crónica extrapulmonar. Hepatitis B antígeno positivo, Hepatitis C con daño hepático demostrado histológicamente, infección por VIH.  Deformidad severa de la caja torácica o de la columna vertebral y cualquier enfermedad musculo-esquelética que afecte al tórax. Como la cifoescoliosis severa. Cualquier enfermedad progresiva neuromuscular es contraindicación absoluta.  Imposibilidad de cumplir con el tratamiento o seguimiento post-operatorio.  Enfermedad psiquiátrica o psicológica intratable que impida la medicación adecuada.  Adicción a sustancias tóxicas activa en los últimos 6 meses. (alcoholismo, farmacodependencia o tabaquismo). Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Introducción 11 1.7.2.-Contraindicaciones relativas(32,33,41): Sin olvidar tener en cuenta la comorbilidad y la edad del paciente, se debe considerar:  Tratamiento con esteroides. Ocasionan problemas en el manejo postoperatorio (necrosis avascular, osteoporosis, diabetes, hipertensión, miopatías), si se han usado durante años. Se considera óptima una dosis inferior a 20mg/día de prednisolona o prednisona.  Estado nutricional. Se debe corregir todo peso corporal que esté por debajo del 70% y/o superior al 130% del ideal, dado que es un importante predictor de la supervivencia.  Problemas médicos que no hayan desembocado en un fallo orgánico para ser considerados contraindicación absoluta pero que sí añaden un riesgo mayor al manejo post-quirúrgico. Diabetes mellitus, hipertensión arterial, úlcera péptica, reflujo gastro-esofágico y/o enfermedades del colágeno.  Osteoporosis sintomática. Realizar siempre una densitometría ósea. Previo al trasplante se debe tratar cualquier problema metabólico óseo, tanto en los pacientes con enfermedad sintomática como asintomática.  Situación clínica inestable. Ventilación invasiva, memebrana de circulación extracorpórea, colonización bacteriana, micótica y/o por micobacterias multiresistentes. 1.8. Selección del receptor. Para la inclusión de un paciente en la lista de espera del programa de trasplante pulmonar, se requiere de una evaluación exhaustiva del mismo, poniendo principal atención en las pruebas del funcionamiento del sistema cardiovascular. Es importante conocer el estado de los órganos principales y del sistema inmunológico, metabólico, de coagulación, etc. así como los sistemas psico-sociales. Con los resultados obtenidos, asociado al criterio de indicaciones y contraindicaciones para la realización del TP se realiza la valoración global para incluir al paciente como un candidato al procedimiento(42). Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Introducción 12 1.8.1. Exámenes y pruebas de laboratorio que se deben realizar al paciente potencial receptor de TP. Los estudios básicos o de rutina deben ser realizados en todos los pacientes en el hospital de origen para obtener la información sobre los factores pronósticos de la enfermedad y de la comorbilidad asociada. En los centros de TP solo se realizarán las pruebas específicas complementarias o las que supongan un alto riesgo para el paciente(47):  Hemograma, coagulación y bioquímica general.  Proteinograma y aclaramiento de creatinina (orina de 24 h).  Grupo sanguíneo. Anticuerpos irregulares y citotóxicos.  Antígenos de histocompatibilidad (HLA) y poblaciones linfocitarias.  Serología completa, parásitos en heces y Mantoux.  Cultivo y antibiograma de esputo, orina y nasofaríngeo.  Radiografías (Rx) AP y lateral de tórax.  Tomografía computadorizada toraco-abdominal de alta resolución.  Pruebas funcionales respiratorias completas.  Gammagrafia de ventilación-perfusión.  Test de esfuerzo estandarizado: 6 min de marcha.  Electro y ecocardiograma.  Ecocardiografía de estrés o coronariografía en pacientes con alto riesgo de enfermedad coronaria y en mayores de 55 años.  Metabolismo óseo. El número de posibles receptores de TP es superior a la oferta de donantes, por lo que se han elaborado una serie de guías internacionales, con el fin de acondicionar los recursos existentes a los candidatos más óptimos(47,48). El tiempo medio de espera en lista para TP a nivel internacional es de 1 a 2 años, Por lo que los posibles candidatos deben cumplir una serie de condiciones generales y específicas de su enfermedad de base, factores de peor pronóstico, que justifiquen un TP antes de 2 años(32). 1.8.2. Evaluación de la comorbilidad del receptor. Como ya hemos mencionado, para tomar una decisión de inclusión del paciente a la lista de espera, ya se debieron haber agotado todos los tratamientos posibles, incluyendo a aquellos pacientes con lesión pulmonar aguda grave, en los que es raro que se considere como opción terapéutica al trasplante. Además de los estudios de gabinete y laboratorio de rutina que se practican al paciente, se debe realizar una evaluación de la comorbilidad y controlarla antes de que los pacientes estén en lista de espera. Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Introducción 13 Existen normativas internacionales con respecto a la edad del paciente que limitan la indicación para un TCP con un límite de 55 años, para el TP unilateral en 65 años y para el TP bilateral en 60 años(49). 1.9. Selección del donante. La escasez de los órganos donados para realizar diversos tipos de trasplantes, es el factor principal que provoca el desbalance entre la oferta y la demanda y que frena el desarrollo de esta alternativa médica. Esta situación se encuentra condicionada a ideas religiosas, culturales y legales que han influido en la actitud de la población para la donación. Por otro lado, la falta del entrenamiento de los médicos para la identificación de un donante potencial y del equipamiento necesario para extracción, preservación y mantenimiento de los órganos en condiciones adecuadas es otro factor importante. Se estima que en el caso de los donantes multiorgánicos, solo el 10-15% tienen pulmones aceptables para TP, debido a la dificultad para prevenir el daño pulmonar asociado a la muerte cerebral o por agresiones al tejido como consecuencia de una intubación endotraqueal o de la ventilación mecánica que además favorece el desarrollo de infecciones. Por otra parte, existen actualmente conflictos de detalles entre la preservación de los pulmones y de otros órganos que ya se encuentran generalizados como es el caso de los riñones(50-52). En España, la Organización Nacional de Trasplantes (ONT) y las Organizaciones Autonómicas de Trasplante centralizan y coordinan todo el proceso de donación y los equipos de trasplante son los encargados de valorar las características de Tabla I: Comorbilidad en el receptor Respiratoria Cardiovascular Efectos secundarios del tratamiento Otros Infecciones Enfermedad Coronaria Corticoides Infecciones no respiratorias Carcinoma broncogénico Fallo ventricular izquierdo Inmunosupresores Alteraciones digestivas en la FQ Cor pulmonale Hipertensión arterial Reflujo gastrointestinal Neumotórax Accidente vascular Úlcera péptica Embolismo pulmonar Enfermedad diverticular Osteoporosis Malnutrición Problemas psicosociales Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Introducción 14 los donantes y decidir su validez en función de los criterios clásicos para considerar un donante como ideal y son(53): 1. Edad < 55 años. 2. Compatibilidad de grupo sanguíneo ABO. 3. Rx normal de tórax. 4. Oximetría arterial > 300mmHg con FiO2 de 1.0 y PEEP de 5cm de H2O durante 5 minutos. 5. Fumador de menos de 20 paquetes por año. 6. No evidencia de sepsis o broncoaspiración. 7. Ausencia de secreciones purulentas en la broncoscopía. 8. Ausencia de gérmenes en el cultivo y en la tinción de gram del esputo. 9. Ausencia de patología pulmonar previa. 10. Sin antecedentes de cirugía cardiopulmonar. 11. Ausencia de traumatismo torácico. Se han adoptado otras medidas con el afán de compensar la escasez de los donantes pulmonares, con posibilidad de obtener los órganos procedentes de donantes a corazón parado, obtención de lóbulos pulmonares de individuos genéticamente emparentados y se está estudiando la posibilidad de xenotrasplantes para su aplicación en el futuro(54-59). Por lo anterior, los pulmones para trasplante pueden obtenerse de varios tipos de donantes: 1. Donante cadáver. Son todos los donantes en los que su fallecimiento se ha diagnosticado y certificado con base en el cese de las funciones encefálicas o cardiorrespiratorias. Se clasifican en:  Donante en muerte cerebral  Donante en asistolia 2. Donante vivo. Se refiere a aquella persona que efectúe una donación en vida de aquellos órganos, o parte de los mismos de los que su función pueda ser compensada por el organismo propio del donante de forma adecuada y segura, por lo que ésta donación es compatible con la vida. 1.9.1. Donantes en muerte cerebral. Se define como muerte cerebral al cese irreversible de la actividad de ambos hemisferios cerebrales y del tronco encefálico. Los sistemas vitales cardiovascular y respiratorio se mantienen, en este caso, por medio de apoyo artificial(63,64). Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Introducción 21 derivadas del órgano trasplantado, también pueden deberse al proceso de adaptación del organismo a su nuevo injerto o son secundarias al tratamiento inmunosupresor. 1.12.1. Complicaciones precoces. Las complicaciones precoces más frecuentes las podemos clasificar de la siguiente manera:  Atribuibles al acto quirúrgico.- Neumotórax y fuga de aire persistente, derrame pleural, hemorragia, dehiscencia o estenosis bronquial, estenosis vasculares, lesiones nerviosas, alteraciones de la herida quirúrgica.  Pulmonares.- Fracaso agudo del injerto, rechazo agudo del injerto, edema de reperfusión.  Infecciosas.- Pleurales, pulmonares y extrapulmonares, otras.  Generales.- Inestabilidad hemodinámica o hipotensión, HTP, arritmias cardiacas, fallo renal agudo, tromboembolismo pulmonar, coagulopatía con diátesis hemorrágica, miopatía, complicaciones abdominales, procesos linfoproliferativos. 1.12.1.1. Atribuibles al acto quirúrgico. Neumotórax y fuga de aire persistente: Las causas de ésta complicación pueden ser pequeñas lesiones durante el despegamiento del bloque pulmonar al momento de la extracción del injerto, bullas subpleurales y dehiscencias a nivel de la sutura bronquial. El tratamiento indicado debe ser inicialmente conservador, manteniendo el sello de agua por un periodo de tiempo más largo. Raras ocasiones se requiere de una corrección quirúrgica(80). Derrame pleural (DP): Se relaciona con una mayor permeabilidad capilar y con déficit del drenaje linfático del injerto. Este exudado seroso generalmente va disminuyendo durante los primeros diez días. El tratamiento consiste en mantener el drenaje pleural hasta obtener < de 80ml de exudado/día. Hemorragia: Si ocurre dentro de las primeras horas post-trasplante y es de magnitud que provoque alteración de la estabilidad hemodinámica o restricción respiratoria, requiere una re-exploración quirúrgica. Esta complicación se asocia al aumento del índice de la morbilidad y mortalidad post-operatora(81,82). Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Introducción 22 Estenosis bronquial: Puede ocurrir en fase temprana o tardía del postoperatorio. Se atribuye a la isquemia de la mucosa por la pérdida de la irrigación de las arterias bronquiales. Esta anormalidad se puede evaluar mediante una fibrobroncoscopía o una tomografía. Su tratamiento consiste en efectuar dilataciones endoscópicas o colocar stents intraluminales(83-85). Estenosis vasculares: Se presentan en aproximadamente el 29% de los pacientes trasplantados y son diagnosticadas por medio de la ecografía transesofágica. El grado de estenosis repercute en la evolución clínica del paciente a corto plazo:  Estenosis venosa. Los signos clínicos son inespecíficos y si la estenosis es completa, el infarto pulmonar se produce en un plazo de 4-6 horas. Radiográficamente se puede observar un infiltrado difuso, que hay que diferenciar con otras patologías como infección, RA o LIR. Como tratamiento se han reportado resultados aceptables con un activador del plasminógeno; sin embargo si se detecta que la obstrucción significativa, es preciso repararla con angioplastia o cirugía, y en ocasiones la única opción terapéutica es la lobectomía o el retrasplante.  Estenosis arterial. Es poco frecuente y la terapéutica de elección es similar a la que se emplea para la estenosis venosa El diagnóstico se realiza por una ecografía transesofágica o angiografía y aunque se puede intentar el tratamiento con dilatación neumática y endo-prótesis, con frecuencia requiere corrección quirúrgica(86,87). Lesiones nerviosas: Los nervios frénicos pueden lesionarse durante las maniobras de despegamiento del pulmón nativo, principalmente en aquellas patologías supurativas crónicas que han formado adherencias pleurales. Esto ocasiona como consecuencia una mala mecánica de ventilación del paciente que dificultará el periodo de retiro del respirador. Otra lesión común es la del nervio recurrente izquierdo a la disección del hilio homolateral, este nervio no tiene repercusión en la función ventilatoria, pero su lesión provoca disfonía por parálisis de la cuerda vocal izquierda(86). Alteraciones de la herida quirúrgica: A pesar de la inmunosupresión a la cual está sometido el paciente, las alteraciones en la herida quirúrgica se observan con poca frecuencia:  Mala fijación del esternón. Produce dolor por secundario a la movilización de la zona de la esternotomía, altera la mecánica ventilatoria y en casos extremos puede llegar a producir una dehiscencia y desplazamiento del mismo. Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Introducción 23  Osteomielitis del esternón. Añade inestabilidad y además de alteraciones de ventilación, existe un alto riesgo de mediastinitis. Por lo anterior, se deben respetar las medidas de asepsia, disminuir en lo posible la devascularización excesiva y asegurar una buena fijación del esternón(86). 1.12.1.2. Pulmonares. Fracaso agudo del injerto: Es el término utilizado para referirse al fallo de la función y deterioro de la función del injerto recién implantado(88,89). Se presenta dentro de las primeras 72 horas de vida y no se conoce su etiología, cursa de forma similar al edema de reperfusión y no tiene buena respuesta al tratamiento. A éste se le atribuye el 30% de la mortalidad postoperatoria temprana(90,91). Rechazo agudo (RA): Es una de las complicaciones más frecuentes en los pacientes trasplantados y se generalmente presenta dentro de los primeros 3 meses, aunque puede desarrollarse en cualquier momento de la vida del receptor. La manifestación clínica es muy inespecífica, ya que podemos tener desde pacientes asintomáticos hasta los que presentan disnea, tos y fiebre y con radiografías de tórax que pueden estar sin alteraciones radiográficas y otras en donde observamos signos de hipoxemia e infiltrados difusos con una espirometría que evidencia la caída de los volúmenes y que mejoran después de semanas de tratamiento(92,93). Se manifiesta por la expresión de una respuesta inflamatoria mediada por células, en donde los linfocitos del receptor reconocen al pulmón implantado como extraño. Se produce entonces una activación de los linfocitos T y éstos liberan citoquinas (especialmente IL-2), responsables de la proliferación de las células mononucleares y de la expresión de los HLA clase II en el endotelio y epitelio bronquial. Los HLA aumentan la superficie antigénica de las células del receptor potencializando así la reacción inmunológica(94). El diagnóstico se realiza a través de una biopsia transbronquial (BTB). En los casos en los que no se pueda realizar un estudio histopatológico debido a la situación de compromiso respiratorio del paciente, se tratan los signos clínicos con dosis altas de prednisona (500mg/Bid/3días) y si no se observa mejoría dentro de las primeras 12 horas, se deben descartar otras causas etiológicas de los signos clínicos(86,92,95). En 1995 el Lung Rejection Study Group (LRSG) estandarizó una nomenclatura para el diagnóstico de RA basándose en el grado de infiltración linfocitaria. Este hallazgo no es patognomónico, por lo que se debe realizar un lavado broncoalveolar (LBA) con cultivo y estudio de la celularidad para descartar otros procesos patológicos como la neumonía por Citomegalovirus, Pneumocystis Carinii, enfermedad Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Introducción 24 linfoproliferativa postrasplante, problemas de preservación, zona de biopsias previas o posible recurrencia de la enfermedad primitiva como la sarcoidosis(92): El tratamiento se instaura a partir del grado A2 y se basa en la administración de fármacos inmunosupresores como los inhibidores de la síntesis de IL-2 (ciclosporina A, Tacrolimus), agentes anti-mitóticos de soporte (azatioprina, micofenolato mofetil) y corticosteroides (iniciando con metilprednisolona y luego prednisona) a dosis altas durante los primeros 3 meses y posteriormente se van disminuyendo hasta alcanzar una dosis de mantenimiento. Se ha reportado que algunos hallazgos histológicos como la presencia de linfocitos B, la presencia de tejido de granulación intraluminal y la expresión en las células mononucleares de los antígenos C494 y C219 asociados a los grados de rechazo A3 y A4 como factores predictores de la resistencia al tratamiento esteroideo. En estos casos se suele aplicar terapia citolítica (anticuerpos monoclonales OKT3, globulina antilinfocítica, globulina antitimocítica, daclizumab, basiliximab). Otros tratamientos poco comunes son la irradicación total linfocitaria y la fotoféresis(92,96). A pesar de todo ello, aunque se resuelva el episodio de RA refractario, la incidencia de RC no se modifica. De hecho, la recurrencia de episodios de RA se ha relacionado directamente con el desarrollo de RC(92). Edema de Reperfusión: También conocido como edema de reimplantación, respuesta de reimplantación o daño de reperfusión. Se le define como la alteración del parénquima pulmonar que consiste en un edema de baja presión por extravasación de líquido al espacio extravascular a consecuencia de la lesión de isquemia-reperfusión (LIR) secundario al trasplante o bien a factores relacionados con la preservación del pulmón. También se cree que está influido por la interrupción del drenaje linfático en el pulmón implantado(88,97,98). También se asocia su incidencia con el aumento del tiempo de isquemia y con la circulación extracorpórea (CEC). Tabla II: Grados de rechazo agudo (LRSG 1995) Grado A0 No rechazo Grado A1 Mínimo Grado A2 Ligero Grado A3 Moderado Grado A4 Severo Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Introducción 25 Cuando un tejido es sometido a un proceso de isquemia (LIR), se generan una serie de eventos que desembocan en la muerte celular; la anoxia provoca una disminución de los niveles de ATP, deteniendo el metabolismo energético, se activa entonces el metabolismo anaerobio para mantener los niveles de ATP, pero la célula sufre una degeneración del intercambio iónico y de membrana y termina en un proceso de apoptosis. Radiográficamente lo observamos como un infiltrado alveolo-intersticial difuso asociado con la manifestación clínica de un deficiente intercambio gaseoso; que puede ser desde una hipoxemia leve hasta un cuadro de distrés respiratorio severo. Afortunadamente su incidencia ha disminuido notablemente con los nuevos líquidos de preservación con características de líquido extracelular, bajos en potasio (perfadex®)(99,100). Las medidas terapéuticas que se deben adoptar, con el fin de prevenir ésta complicación es adoptar un adecuado protocolo de extracción pulmonar reduciendo el tiempo de isquemia, limitando el aporte de líquidos excesivo en el proceso de implante y con una adecuada manipulación del injerto. Si el edema ya está establecido, las medidas deben de ir enfocadas a favorecer el balance hídrico negativo con la administración de diuréticos y catecolaminas, cuidando siempre de la función renal. Con éstas medidas de soporte, el edema suele resolverse en un periodo de 36 a 72 horas (86,88). 1.12.1.3. Infecciosas. Pleurales: Se trata del empiema pleural y presenta una baja incidencia del 3-5%, probablemente asociada con la profilaxis antibiótica la vigilancia radiológica y los cuidados de los drenajes pleurales, con evacuación precoz de las colecciones líquidas. Sin embargo, cuando ésta complicación aparece, se asocia con mortalidad importante (75). Suele producirse en los trasplantes bipulmonares favorecido por la incisión de “clam-shell”, que permite la comunicación entre ambas cavidades pleurales y por la presencia de dehiscencias de la anastomosis bronquial y el mantenimiento prolongado de los tubos de drenaje. Como en cualquier otro empiema, el tratamiento consiste en administrar un adecuado tratamiento de antibióticos y en mantener drenada correctamente a la cavidad pleural(80,86,101). Pulmonares y extrapulmonares: El pulmón; al estar en contacto con el exterior es más susceptible a la agresión de los agentes externos, por lo que las infecciones son dos veces más frecuentes en receptores pulmonares que en receptores de corazón e hígado y se estima que constituyen la principal causa de morbilidad y mortalidad postoperatoria del TP. Esta puede ser adquirida desde el pulmón donante, desde el pulmón nativo contralateral en el caso de los trasplantes unilaterales o desde los senos Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Introducción 26 paranasales y/o las vías aéreas superiores, además de los factores de la exposición exterior y los que favorecen a la infección como la inmunosupresión, la denervación del pulmón trasplantado con depresión del reflejo tusígeno y abolición del reflejo mucociliar, y la interrupción del drenaje linfático(86). Según el germen causal pueden clasificarse en:  Bacterianas. La neumonía bacteriana es la infección más frecuente y aparece hasta en un 66% de los pacientes con TP y generalmente aparece dentro de las primeras dos semanas después de la cirugía. Con tratamiento adecuado de antibióticos durante los primeros 10 días post-trasplante, la cifra de los pacientes afectados puede reducirse hasta en un 10%.(102). Los gérmenes aislados con mayor frecuencia son la Pseudomona aeruginosa, el Staphylococus aureus y el Haemophylus influenzae(103). Otra infección tuberculosa es rara, pero es más común que se presente en la población de TP, por lo que sería necesario realizar en éstos pacientes la quimioprofilaxis adecuada durante 9 a 12 meses con el fármaco adecuado(104). La bronquitis bacteriana representa el 25% de las infecciones en lospacientes trasplantados y es más frecuente en aquellos que padecen de FQ y es favorecida cuando el paciente es portador de una prótesis endobronquial o por un RC, contribuyendo al desarrollo de bronquiectasias en la BO(105). La mediastinitis es una grave complicación, que aparece con mayor frecuencia tras disecciones amplias del mediastino como en los TCP o cuando aparecen dehiscencias de la anastomosis respiratoria. También, aunque en raras ocasiones aparece como a una osteomielitis esternal(86).  Virales. La infección por Citomegalovirus (CMV) es la segunda infección más frecuente en el paciente con TP, generalmente se manifiesta de 1 a 4 meses tras el TP y no todos los pacientes infectados desarrollan la enfermedad(106). Su incidencia y prevalencia está relacionada directamente con el estado serológico del receptor y del donante, y del tratamiento inmunosupresor. La neumonía es la manifestación más común de ésta infección con signos de con fiebre, tos, deterioro respiratorio e infiltrados difusos en la Rx, planteando muchas veces la necesidad de un diagnóstico diferencial con un RA. Sin embargo, también puede manifestarse de forma insidiosa como hepatitis, gastroenteritis, colitis, retinitis, o un cuadro generalizado con importante postración. El diagnóstico puede realizarse por serología, detección de virus en la BTB o en el lavado Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Introducción 27 broncoalveolar, y se ha asociado con una mayor incidencia de RC. El tratamiento con ganciclovir es el más eficaz y puede utilizarse como profiláctico a partir del día 10 postoperatorio(107,108). Otros virus que pueden afectar al paciente con TP son el Herpes; no presenta problemática excesiva debido a la eficacia del tratamiento con Aciclovir, el virus sincitial respiratorio, paramixovirus y el virus de Epstein-Barr. Este último se le ha asociado con procesos linfoproliferativos y relacionados al RC(86,109-112).  Micoticas Este tipo de infecciones pueden ocurrir en el periodo postoperatorio temprano o tardío, las más frecuentes son las producidas por Candida albicans o Aspergillus spp. La candidiasis neumónica es rara, pero si se produce puede ser fatal. Puede provocar mediastinitis, aneurismas micóticos e infección diseminada. El tratamiento es con fluconazol o anfotericina B. La Aspergilosis aparece entre el 20% y 40% de los receptores pulmonares con una presentación clínica de la enfermedad en el 25-60% de los pacientes infectados. La variedad más comúnmente aislada es el Aspergillus fumigatus y se caracteriza por una bronquitis ulcerativa o pseudomembranosa, neumonía y también puede ser diseminada; provocando una estenosis del árbol respiratorio debida al proceso inflamatorio que produce y en su forma ulcerativa propiciar la aparición de una fístula broncoarterial con hemoptisis masiva y un mal pronóstico. El diagnóstico se realiza por fibrobroncoscopía, aislando el hongo de las lesiones ulcerativas y de las aspiraciones y el tratamiento es a base de itraconazol y anfotericina B y como tratamiento profiláctico se puede utilizar el fluconazol y aerosoles de anfotericina B(86).  Otras infecciones. La infección por Pneumocystis carinii supone un grave riesgo para los pacientes inmunodeprimidos. La mortalidad asociada a la neumonía por este germen es considerable y por ello es obligada la profilaxis con cotrimoxazol desde el día 15 posttrasplante y que ha demostrado una alta efectividad(86). Finalmente, hay que tener en cuenta las enfermedades infecciosas según el área geográfica, por ejemplo en España se han reportado casos de Leishmaniasis en pacientes trasplantados(113). Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Introducción 28 1.12.1.4. Generales. Inestabilidad hemodinánica o hipotensión: Es frecuente sobre todo cuando hay sangrados importantes y al utilizar CEC debido a la disminución de las resistencias periféricas. En estos casos la necesidad de mantener balances hídricos negativos para minimizar el edema pulmonar por reperfusión agrava más el problema, por lo que es necesario realizar un balance hídrico estricto asociado a la administración de fármacos inotrópicos y vasoactivos. A los pocos días después de la cirugía los pacientes logran estabilizarse. Se ha relacionado con la liberación por parte de los leucocitos y plaquetas de citoquinas y otros factores humorales(86). Hipertensión pulmonar: Puede ser producida tras la reestructuración de la hemodinámica del circuito pulmonar o por la implantación de pulmones más grandes que aumentan la presión intratorácica causando una alteración del retorno venoso. Se debe monitorear si los pacientes presentan elevaciones de las cifras de la presión arterial pulmonar durante las primeras 48 horas postrasplante, especialmente si presentan edema de reperfusión ya que esta hipertensión puede afectar al mantenimiento hemodinámico general del paciente y, en ocasiones es preciso emplear PGE1 y NO(86). Arritmias cardiacas: Las más frecuentes son las ventriculares como la fibrilación o el flutter auricular. Podrían estar relacionadas a la manipulación quirúrgica y a las suturas de la aurícula izquierda(114,115). Fallo renal agudo: Probablemente a causa de las variaciones del flujo plasmático renal al que es sometido el paciente durante el trasplante, sumado a la sobrecarga y a la toxicidad de los fármacos que estos pacientes requieren. En algunos casos puede ser necesario realizar diálisis transitoria hasta estabilizar al paciente(116). Tromboembolismo pulmonar (TEP): Es una complicación de gravedad extrema, y los pacientes con TP son considerados de alto riesgo para el desarrollo de trombosis venosa profunda. La profilaxis debe ser muy rigurosa a base de anticoagulantes de bajo peso molecular (heparina, henoxaparina) y maniobras físicas como la movilización y compresión elástica de las extremidades inferiores además de la vigilancia de los catéteres hasta el inicio de la deambulación del paciente. Puesto que en el pulmón trasplantado no existe circulación bronquial, se ha estimado un 12% de incidencia de TEP en pacientes con TP y TCP con una mortalidad de hasta el 42%(86). Coagulopatías: Aparecen con mayor frecuencia en aquellos pacientes que han tenido hemorragias importantes y/o sometidos a un mayor tiempo de CEC y que han requerido de politransfusiones debido al exceso del consumo de factores de coagulación. El tratamiento es de sostén, a base de la administración de plasma y de factores de la coagulación(82,117). Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Introducción 29 Miopatía: Aparece al parecer como consecuencia de múltiples mecanismos, sin embargo se le ha relacionado sobre todo con el empleo crónico y/o a altas dosis de corticoides y al uso de los relajantes musculares. No se le considera una complicación seria y suele ser reversible a medio plazo tras reducir la dosis de esteroides. Cuando la miopatía postoperatoria es severa, los pacientes sufren de insuficiencia respiratoria crónica por una disfunción del metabolismo oxidativo del músculo-esquelético que persiste a pesar de la mejora en la oxigenación tras el TP, prolongando la necesidad de una larga ventilación mecánica que demora la recuperación del paciente, favorece las infecciones y ocasiona de forma indirecta una mayor morbilidad y mortalidad(86). Complicaciones abdominales: Entre las comunes tenemos al íleo paralítico prolongado, la isquemia intestinal, la colitis, la perforación de colon y la colelitiasis. Son las responsables de hasta un 22% de las muertes postrasplante y, en el caso de perforación de colon, la mortalidad se incrementa hasta en un 50% a pesar del tratamiento quirúrgico. En pacientes con FQ, la incidencia de estas complicaciones es mayor y el cuadro más común que presentan es la obstrucción intestinal distal. Por ello, aunque no exista ingesta oral, deberá mantenerse un tratamiento a base de administración oral de enzimas pancreáticas a la mitad de la dosis habitual, asociado con agentes mucolíticos como la acetilcisteína(86). 1.12.2. Complicaciones tardías. 1.12.2.1. Procesos linfoproliferativos o neoplásicos. Como ya hemos mencionado, éstos procesos han sido relacionados con el virus de Epstein-Barr, aunque su papel no ésta aún bien definido. Además se ven favorecidos por el tratamiento inmunosupresor. Se puede presentar como una proliferación policlonal de linfocitos lentamente progresiva hasta un proceso proliferativo monoclonal de alta malignidad. Este proceso suele no afectar al SNC y responde a la reducción del tratamiento inmunosupresor o extirpación de la masa en los casos en que el proceso esté localizado También puede utilizarse quimioterapia convencional y aciclovir. En los casos de falta de respuesta, la supervivencia es inferior a 6 meses(86). 1.12.2.2. Rechazo crónico (RC) y Bronquitis obliterante (BO). La BO es un proceso fibroproliferativo que provoca la obliteración de la vía aérea y la fibrosis del injerto, se le considera como la manifestación principal del RC y continúa siendo el talón de Aquiles para los pacientes receptores y los médicos especialistas en el TP, provocando una baja supervivencia a largo plazo en comparación con el trasplante de otros órganos sólidos. Su índice de incidencia dentro de los dos primeros años es alta, pero los pacientes que no la presentan permanecen siempre en Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Introducción 30 riesgo acumulativo del 60-80% entre los 5 y 10 años postrasplante representando así la principal causa de muerte de los pacientes con TP pasado el primer año de la cirugía(96). Es indetectable en la fase-preclínica y no existe tratamiento satisfactorio. En su fase inicial, la enfermedad es de carácter insidioso, con disnea progresiva, tos y muchas veces se asociada con una colonización de la vía aérea por Pseudomona aeruginosa produciendo brotes recurrentes de bronquitis purulentas. Su diagnóstico por medio de histopatología tiene una sensibilidad ≤ al 17% y los hallazgos sugieren que existen dos procesos distintos allegados uno del otro; por una parte existe una inflamación de las estructuras bronquiolares de origen inmune y/o infeccioso que conduce a una respuesta fibroproliferatriva de los bronquiolos y bronquio de la vía aérea de mayor tamaño con progresiva obstrucción y fibrosis del injerto y se le considera activa si se acompaña de infiltración linfocítica peribronquiolar o inactiva si la infiltración es escasa o ausente. Y por otro lado, los episodios previos de RA son el factor de riesgo más importante para el desarrollo de la BO; además de la asociación con la neumonía citomegálica, la bronquitis linfocítica, la isquemia de la vía aérea y el sistela HLA entre el donante y el receptor(92,118). El hallazgo de la bronquitis linfocítica o de inflamación linfocítica no fibrosante, precedida por episodios de RA; debe alertar al clínico hacia un posible cambio de tratamiento inmunosupresor, ya que se le asocia a un incremento del riesgo para desarrollar BO. Dada ésta problemática, se utiliza la caída del FEV1 ≤ al 80% del pico obtenido después del trasplante sin causa no justificada para clasificar a la BO clínicamente: Tabla III: Clasificación clínica de la BO Grado 0 FEV1> 80% del basal Grado 1 FEV1= 66-79% Grado 2 FEV1= 51-65% Grado 3 FEV1<50% Una vez establecido el diagnóstico, la enfermedad puede seguir un curso lento y progresivo o estacionarse, bien de forma espontánea o como respuesta al tratamiento que consiste en aumentar la inmunosupresión, pero no existen evidencias que hayan demostrado alguna eficacia. Se considera que es efectivo si se consigue ralentizar la caída de la función pulmonar o por lo menos estabilizarla, ya que la mejoría es poco probable (92,119). Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Introducción 37 (B) La concentración de ozono expresada como mcg/ml. (C) La presión barométrica (mmHg), si es diferente de la normal. Por razones de seguridad, se aconseja evitar la presión hiperbárica. La dosis total de ozono es equivalente al volumen de gas (ml) multiplicada por la concentración de ozono (mcg/ml) Como un ejemplo; si utilizamos un volumen de 100ml de sangre y el equivalente de gas (1:1); con una concentración de ozono de 40mcg/ml, la dosis total de ozono es: 100x40=4000mcg ó 4.0mg(130). 2.5.-Mecanismo de acción del ozono Cuando se administra ozono a un paciente, se desencadenan diversas reacciones bioquímicas, farmacológicas, inmunológicas y posiblemente psico-neurológicas. Aunque gracias al oxígeno podemos vivir, este gas desencadena un efecto negativo a largo plazo, ya que la respiración celular permite la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS), entre las cuales el radical hidroxilo (OH-), es uno de los compuestos más destructivos de las enzimas y ADN. El ser humano en reposo produce alrededor de 5g de anión superóxido (O2-); el cual es producido en la mitocondria por los complejos I y II y es el precursor de varias moléculas de radicales(131,132). Otras ROS como el peróxido de hidrógeno (H2O2), el ácido hipocloroso (HCIO) y el óxido nítrico (NO) son generados continuamente en pequeñas cantidades por las oxidasas y mieloperoxidasas, y tienen un papel esencial en la defensa contra organismos patógenos. Por otro lado, el envejecimiento, los desórdenes metabólicos (diabetes, aterosclerosis, degeneración celular, etc.) pueden empeorar debido a una producción excesiva de las ROS. Irónicamente, la falta parcial de oxígeno (hipoxia), observable en las enfermedades vasculares isquémicas, representa la causa de muerte por infarto cardiaco o choque. Además la hipoxia aumenta la metástasis neoplásica y conlleva finalmente a la muerte(129). El ozono se disuelve fácilmente en la parte acuosa del plasma, en los fluidos extracelulares, y en la ligera capa de agua que cubre la piel, la mucosa del tracto respiratorio, intestino, vagina, etc., a una temperatura, presión atmosférica y presión relativa normal. Posteriormente, debido a su alta solubilidad, reacciona inmediatamente con las biomoléculas y iones presentes en los fluidos biológicos: antioxidantes, proteínas, carbohidratos y principalmente ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs), presentes también en las membranas celulares y/o lipoproteínas que están protegidas por antioxidantes y albúmina(133,134). Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Introducción 38 La reacción del ozono con estas moléculas implica el desarrollo de varios procesos fundamentales que se desencadenan al mismo tiempo. Algunas de las dosis de ozono se consumen durante la oxidación del ácido ascórbico (C6H8O6), ácido úrico (C5H4N4O3), sulfhidrilo (SH-), grupos GSH (formas reducidas de glutatión), proteínas y glicoproteínas presentes en el agua del plasma. La otra reacción fundamental es la conocida como “peroxidación lipidica”. En el ambiente hidrofílico del plasma, un mol de un ácido graso poliinsaturado (particularmente ácido araquidónico transportado por la albúmina o presente en el plasma, triglicéridos y quilomicrones) y un mol de ozono dan lugar a dos moles de aldehídos y un mol de peróxido de hidrógeno(129,135). Estas reacciones completadas dentro de segundos, consumen el total de la dosis de ozono que genera peróxido de hidrogeno y una gran variedad de aldehídos conocidos como productos de la oxidación lipídica (LOPs). Por lo tanto, debe de quedar claro que algunas de las dosis de ozono son neutralizadas por los antioxidantes presentes en el plasma y solo la reacción con los PUFA‟s es la responsable de los efectos biológicos y terapéuticos, lo que define que una dosis muy baja de ozono es inefectiva. Por otra parte, después de la ozonización de la sangre, la capacidad antioxidante del plasma disminuye en un 30% después de 5 minutos, pero regresa a valores normales durante los siguientes 15 minutos debido a la rápida reducción de los antioxidantes oxidados operados por los eritrocitos(136,137). Esta observación enfatiza que incluso con dosis de ozono tan altas como 80mcg/ml gas por ml de sangre, la capacidad antioxidante del plasma puede ofrecer protección a las células sanguíneas(129). Las ROS incluyen varios radicales como el anión superóxido (O2-), monóxido de nitrógeno (NO), peroxinitrito (O=NOO-), el ya mencionado radical hidroxilo y otros componentes antioxidantes como el peróxido de hidrógeno y ácido hipocloroso (HClO). Todos estos componentes son potencialmente citotóxicos(138-140) pero con una vida media muy corta (normalmente una fracción de segundo) y el plasma y las células tienen antioxidantes capaces Fig.5: Formación de peróxido de hidrógeno a partir de la administración de ozono Fig.15: Inducción del estrés oxidativo transitorio y controlado por los antioxidantes de la sangre OZONO PLASMA ROS LOPS Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Introducción 39 de neutralizarlos si sus concentraciones no rebasan su capacidad antioxidante. Este concepto enfatiza el por qué la dosis de ozono debe ser precisa y bien calibrada contra la capacidad antioxidante y de ese modo la sangre sea capaz de desencadenar reacciones útiles sin provocar cualquier daño(129). Los LOPs generados después de la peroxidación de una gran variedad de PUFA‟s, son heterogéneos y representan los radicales peroxil (ROO), hidróperoxidos (R-OOH) y un complejo aldehídico mixto llamado malonildialdehído (MDA) y alquenos, entre ellos el 4-hidroxi-2,3 transnonenal (4-HNE), que es potencialmente citotóxico. La cantidad de LOPs se puede controlar mediante el uso de concentraciones precisas de ozono, exactamente relacionadas con el volumen sanguíneo y la capacidad antioxidante, para alcanzar una gran cantidad de efectos biológicos no alcanzables con una sola droga(141). Las ROS son producidas durante un corto periodo de tiempo, en el que el ozono está presente y fácilmente producen efectos biológicos en la sangre, mientras que los LOPs, que son simultáneamente producidos, tienen un tiempo de vida más largo y a través del sistema vascular alcanzan prácticamente todos los órganos en donde ellos podrán desencadenar más tarde los efectos(129). Tan pronto como el ozono se disuelve en el agua plasmática y reacciona con los PUFA‟s, las concentraciones de las ROS (principalmente el H2O2) comienzan a incrementar, pero con la misma rapidez, disminuyen porque se asocian rápidamente a las difusas moléculas existentes dentro de los eritrocitos, leucocitos y plaquetas, donde se disparan varias vías bioquímicas. Este aumento de las ROS no representa toxicidad para la célula, porque al mismo tiempo el plasma y el líquido intracelular se someten a una reducción de agua gracias a la presencia de poderosas enzimas antioxidantes tales como la catalasa, glutatión peroxidasa (GSH-Px) y glutatión libre reducido (GSH). Quizás durante unos pocos segundos, el gradiente químico de las ROS, entre el plasma y el líquido intracelular ha sido estimado en un rango de 1 a M equivalente a un 10% de su concentración plasmática, el cual evita cualquier toxicidad(141-144). La presencia transitoria de las ROS en el citoplasma, significa que actúan como mensajeros químicos del ozono y que su nivel es crítico: debe estar por encima de cierto umbral para ser eficaz pero no demasiado alto para ser nocivo. En estudios realizados con sangre humana expuesta a concentraciones de ozono que van de 20 a 80mcg/ml por ml de sangre, el proceso de generación de las ROS, difusión y reducción fue siempre encontrada extremadamente transitoria(136,145-147). Incluso se considera a estas moléculas como un elemento fisiológicamente omnipresente en el cuerpo(148,149). Por otra parte, las ROS son reconocidas como moléculas de señalización intracelular, capaz de activar una tirosin-kinasa, la cual fosforila un factor de transcripción nuclear (NF) que permite la síntesis de numerosas proteínas Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Introducción 40 diferentes(150,151). Básicamente las funciones de las ROS por oxidación de cisteínas, actúan sobre las células mononucleares de la sangre, en plaquetas, en células endoteliales y en eritrocitos(146,147,152-157). Las ROS que entran en los eritrocitos, casi inmediatamente son reducidas a agua e hidroperóxidos a expensas de GSH. La enorme masa de eritrocitos puede limpiar fácilmente las ROS en 10-15 min y reciclar de nuevo antioxidantes oxidados de forma reducida(158,159). Mientras la glutation reductasa (GSH-Rd) utiliza la reducción de nicotinamida adenin dinucleotido fosfatasa (NADPH, esta coenzima sirve como un electrón donante para varias reacciones bioquímicas) para reciclar glutatión oxidado (GSSG) a su nivel original de GSH, el NADP oxidado es reducido después de la activación de la vía de la pentosa fosfato, de los cuales la glucosa-6-fosfatodeshidrogenasa (G-6PD) es la enzima clave. Así la glicólisis es acelerada con un consecuente incremento de niveles de ATP. Por otra parte, la reinfusión de eritrocitos, por un corto periodo, mejora la entrega de oxígeno dentro de los tejidos isquémicos porque de un cambio a la derecha de la curva de disociación de oxígeno-hemoglobina debido a una leve disminución de pH intracelular (efecto de Bohr) y/o un incremento de niveles de 2,3-difosfoglicerato (2,3-DPG)(129). Existe una amplia literatura con respecto a la citotoxicidad de los LOPs(160). Estos compuestos cuando se prueban ya sea en cultivos de tejido, o examinados en el contexto delicado del sistema respiratorio, son tóxicos incluso a una concentración de . Sorprendentemente, las concentraciones submicromolares (0.01-0.m) probados en varios tipos celulares, pueden estimular la proliferación y tener útiles actividades bioquímicas. Estos hallazgos llevan a creer que la toxicidad de los productos lipídicos ozonizados depende de sus concentraciones finales y tejido-localización, de modo que pueden actuar como dañinos o ser útiles señales(161-166). La sangre en comparación con los pulmones, es un “tejido” mucho más resistente al ozono, sin embargo, cuando se reinfunde sangre ozonizada a pacientes con degeneración macular (ARMD), los LOPs desaparecen de la sangre en un tiempo aproximado de 4.2 ± 1.7min. Por otra parte, en muestras de sangre ozonizada cultivada in vitro, los niveles de los LOPs difícilmente Fig.7: Efectos de los productos del estrés oxidativo inducido por la ozonoterapia Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Introducción 41 disminuyen durante las siguientes 2h, observando la toxicidad de los mismos en los cultivos celulares estáticos, lo que ha hecho hincapié en el papel de la degradación enzimática y la captación hepática; haciendo irrelevante la toxicidad de LOPs in vivo para los siguientes procesos(167): 1. Formación de productos de adición de albúmina-4-HNE(165). 2. Dilución de compuestos en la sangre y fluidos corporales. 3. Neutralización de LOPs. 4. Detoxificación de LOPs(168,169). 5. Excreción de LOPs dentro de la orina y bilis(170). 6. Bioactividad sin toxicidad. Para un punto de vista farmacocinético, los vestigios de las cantidades de LOPs pueden reaccionar con todos los órganos, particularmente con la médula ósea y SNC. Los LOPs son extremadamente importantes informadores de células de un mínimo y calculado estrés oxidativo, provocando una respuesta adaptativa. Con respecto a los eritrocitos, los LOPs pueden influir en el linaje eritroblástico que permite la generación de células con características bioquímicas mejoradas. Esos “eritrocitos mejorados”, debido a una inducción de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, un elevado contenido de 2-3-DPG y enzimas antioxidantes, son capaces de distribuir una mayor cantidad de oxígeno dentro de los tejidos isquémicos. La consecuencia de los tratamientos repetidos, obviamente dependiendo del volumen de sangre ozonizada y la concentración de ozono; es que después de unos pocos minutos de iniciado el tratamiento, aprox. 0.8% “eritrocitos mejorados” entraran diariamente en la circulación y gradualmente sustituirán a los viejos eritrocitos generados antes de la terapia. Esto significa que, durante una ozonoterapia prolongada, la población de eritrocitos incluirá no solo células con diferentes edades, sino que además contendrá eritrocitos con diferentes capacidades funcionales y bioquímicas y un aumento marcado en las enzimas antioxidantes. Este proceso de activación celular es muy dinámico y con duración de un tiempo determinado debido a que las células sanguíneas tienen un tiempo de vida definido y una limitada memoria bioquímica; sin embargo, esta ventaja terapéutica debe ser mantenida con menor frecuencia en los tratamientos(129,171). La toxicidad del oxígeno en sangre, fluidos biológicos y órganos internos se evita totalmente al reducir ligeramente la dosis con ozono transitoriamente para activar solamente la multiforme y potente capacidad antioxidante. El sistema antioxidante ha evolucionado durante los últimos dos billones de años como una esencial defensa contra Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Introducción 42 el oxígeno: esto está compuesto por albúmina, vitamina C y E, ácido úrico, bilirrubina, cisteína, ubiquinol, ácido -lipoico y de antioxidantes intracelulares como el GSH, tioredoxin y enzimas (superóxido dismutasa (SOD), GPX, GSH-T, catalasa, etc.) y proteínas como transferrina y ceruloplasmina, capaces de quelar el hierro libre y el cobre que, de otra manera, puede favorecer la formación de radicales hidroxilo. La riqueza y variedad de los antioxidantes extra e intracelulares, son capaces de explicar cómo ligeras cantidades de ozono pueden ser dominadas con el resultado de la estimulación de varios sistemas biológicos sin efectos perjudiciales, desechando la teoría de la toxicidad del tratamiento con ozono(131,172-182). Tabla VI: Sistema de antioxidantes No enzimáticos Enzimáticos Hidrosolubles Liposolubles Prot. Quelantes Ácido úrico Vitamina E Transferrina Super óxidoÁcido ascórbico Vitamina A Ferritina dismutasa Glucosa, cisteína Carotenoides Ceruloplasmina GlutatiónCisteamina, Taurina Coenzima Q Lactoferrina peroxidasa Triptofano Ácido  -lipoico Hemopresina Catalasa Histidina Bilirrubina Albúmina Sistema redoxMetionina Tiorredoxina glutatión GSH Bioflavonoides Equivalentes Prot. plasmáticas Melatonina reductores vía Licopeno NADPH y NADH La interacción entre antioxidantes, enzimas y el sistema metabólico es muy importante como el permitir su rápida generación y el mantenimiento de un estatus normal de antioxidantes. Durante la exposición de sangre a adecuadas concentraciones de ozono, el reservorio antioxidante disminuye menos de 35% en relación a dosis de ozono entre 10-80mcg/ml de gas por ml de sangre. Es importante añadir que este parcial agotamiento es corregido en menos de 20 min gracias al reciclaje de ácido dehidroascorbico, GSSG, radical -tocopheril de los componentes reducidos(129). 2.6.-Vías de administración del ozono El ozono puede administrarse por cualquier vía parenteral o tópica, exceptuando la vía de inhalación; debido a la toxicidad traqueo-bronquio-pulmonar que se produce. La mezcla de gas debe estar compuesta de no menos de 95% de oxígeno y menos de 5% de ozono; tiene una leve presión positiva y puede ser colectada con una Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Introducción 43 jeringa calibrada o por inserción de una conexión de acero inoxidable y un tubo de silicón en la válvula de salida del generador de ozono. Aunque el ozono es un potente desinfectante, se debe utilizar de preferencia un filtro antibacterial, ozonoresistente, hidrofóbico y con una porosidad de 0.2m; para evitar una posible infección o el paso de posibles partículas contaminantes, ya que el oxígeno médico, los anillos y grifos no están estériles(183). Desde 1984 está prohibida la administración directa de ozono vía intravenosa e intraarterial, debido a que se registraron varias muertes por embolismo pulmonar. Ya que, aunque el gas sea administrado muy lentamente; favorece la formación de un tren de burbujas de gas, de las cuales, las que corresponden a ozono de disuelven y reaccionan con la sangre, pero la parte de oxígeno reacciona en el ventrículo derecho y luego se dirige a circulación pulmonar. La solubilidad del oxígeno a 37°C es aproximadamente 0.23ml por 100ml de plasma, por lo tanto; el plasma venoso no puede disolver eficazmente el oxígeno, llevando a la formación de un émbolo de gas. Tabla VII: Vías de administración del ozono Parenteral Tópica o locorregional Intravenosa (IV) Oral* (PO) Intraarterial (IA) Tubal Intramuscular (IM) Auricular Subcutánea (SC) Cutánea Intraperitoneal (IP) Vaginal Intrapleural (IPL) Uretral e intravesical Intraarticular (IAr) Rectal Intradiscal (ID) Intraforaminal (IF) Intralesional (ILx) *realizarse durante 30-60min en apnea. Por otro lado no se ha visto ninguna ventaja de la administración “directa” intravenosa o intraarterial, con respecto a la autohemoterapia y la administración rectal; además tendrían que realizarse repetidas punciones en los vasos sanguíneos provocando contracciones vasculares y molestias en el paciente. Sin embargo, la administración de ozono por la arteria hepática, complementada con otros agentes terapéuticos como alcoholes y componentes citotóxicos para el tratamiento de neoplasias y metástasis hepáticas parece ser relativamente útil. Con base en este hecho, es posible entonces Fig.8: Filtro antibacterial del ozonador Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Introducción 44 postular que la administración lenta de ozono (20-40ml de gas con una concentración de hasta 80mcg/ml) vía intraarteria hepática dispersa el gas dentro de los sinusoides y capilares tumorales, disminuyendo el riesgo de embolismo gaseoso; y provocando el efecto citotóxico directo en las células tumorales sin los efectos secundarios que conllevan los agentes quimioterapéuticos(183). Hace algunos años, algunos curanderos han utilizado la ozonoterapia para el tratamiento de hepatitis viral crónica y vasculopatías administrando peligrosos volúmenes de hasta 300ml de gas a concentraciones de 10-15mcg/ml por vía intramuscular o subcutánea, subdivididos en diferentes regiones del cuerpo, y algunos cosmetólogos han empleado esos mismos volúmenes a concentraciones de 2-4mcg/ml para combatir la lipodistrofia (celulitis), administrándolos en una sola sesión. Esta práctica, aun teniendo el mayor cuidado en la administración de éstos grandes volúmenes, ha provocado la muerte por embolismo en por lo menos dos mujeres jóvenes, quienes se trataron de esta trivial patología en Italia en 1998 y 2002. Esto posiblemente fue provocado cuando el enorme volumen de gas convergió dentro de las partes bajas del cuerpo, después de haberse puesto de pie y caminar inmediatamente después de terminar el tratamiento, a un embolismo pulmonar y/o cerebral particularmente. Este tipo de tragedias puede evitarse administrando un volumen menor de gas, con un gentil masaje posterior al tratamiento y un descanso de por lo menos media hora(183). Los médicos rusos han utilizado la vía intraperitoneal e intrapleural. Ellos emplean primero agua ozonizada para realizar lavados, especialmente para barrer el material purulento y luego insuflando dentro de las cavidades 100-300ml de gas con concentraciones de 5-50mcg/ml de ozono; dependiendo de la gravedad de la infección. El ozono se disuelve rápidamente y, por reacciones con los exudados puede reducir la infección. Además mediante la estimulación de la vasodilatación y de la proliferación celular, se puede llegar a una rápida cicatrización. Este tratamiento no es dañino para el peritoneo y no produce ninguna molestia en el paciente y el riesgo de embolismo es prácticamente nulo. Otras posibilidades interesantes para la aplicación de ozono vía de administración intraperitoneal e intrapleural es(183): a) Pacientes afectados por neoplasias como carcinomas peritoneales o mesoteliomas pleurales, ya que las insuflaciones diarias de gas pueden generar el efecto citotóxico directamente en las células neoplásicas, además de provocar al mismo tiempo la activación de macrófagos y neutrófilos residentes en el área y por vía linfática, la activación de los mensajeros de ozono para la inducción de las citocinas como TNF, IFN, IL2 y prostaciclina, que activan al sistema inmune, para acompletar la destrucción de las células neoplásicas(184,185). Por Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Introducción 45 otro lado, Stadlbauer ha observado que en ratas precondicionadas con ozono intraperitoneal y que fueron sometidas a un injerto cardiaco agudo, ha prolongado la supervivencia del mismo(186). b) Pacientes afectados con hepatitis viral crónica, insuflando el ozono diariamente a través del catéter ya implantado y durante las diálisis peritoneales y complementando el tratamiento con el uso de IFN- y/o autohemoterapia ozonizada e insuflación rectal del gas. La aplicación tópica puede ser realizada mediante gas, aceite y/o agua ozonizada. Afecciones gingivales, en mucosas y tonsilares pueden ser tratadas con catéteres de metal o silicón. Se puede utilizar un volumen de gas de hasta 20ml a una concentración de ozono de hasta 20mcg/ml. Pero el paciente, después de una respiración profunda, debe permanecer en apnea unos 40-60seg y luego expirar profundamente. Las úlceras aftosas en la cavidad oral pueden ser tratadas con mini-inyecciones intralesionales de ozono (a concentraciones de 5-10mcg/ml), seguidas de una aplicación diaria de aceite ozonizado(183). Las infecciones vaginales y rectales crónicas (bacterianas, virales, micóticas y protozoarias), resistentes a los tratamientos convencionales, responden muy bien a la ozonoterapia. Se pueden realizar lavados de la cavidad afectada utilizando agua ozonizada para remover las secreciones purulentas y posteriormente insuflar 50-100 y 300ml de gas en la cavidad vaginal y rectal respectivamente y posteriormente aplicar aceite ozonizado. Se debe tener en cuenta que se debe reducir la dosis del ozono conforme la infección disminuya. También se pueden aplicar supositorios y óvulos vaginales de aceite ozonizado antes de acostarse. Estrategias similares también pueden aplicarse para el tratamiento de infecciones uretrales y vesicales, teniendo en mente siempre disminuir las concentraciones de ozono entre 3 y 10-15mcg/ml, respectivamente(183). Para realizar las aplicaciones cutáneas de ozono se puede considerar a todos los tipos de lesiones e infecciones; (desde úlceras diabéticas, quemaduras, picaduras de insectos, quemaduras por medusas, traumatismos de guerra, accidentes, etc.). Para utilizar el gas, la lesión debe estar cerrada herméticamente con materiales ozonoresistentes, para prevenir la inhalación del ozono y conseguir una favorable vasodilatación de la zona afectada(187). El generador de ozono, debe estar equipado con una bomba de succión. Si no es factible hacer una exposición dinámica de la zona; se puede improvisar una exposición estática con una bolsa de polietileno grande, sellada con tela adhesiva ancha, pero que no esté apretada para no provocar una éstasis venosa. Ambos sistemas se benefician del empleo de agua, ya que se ha hecho mención Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Introducción 46 anteriormente, de que el ozono actúa fuertemente en formas húmedas y debe disolverse en agua. Debe tenerse en cuenta, que debe realizarse dos veces al día y antes de cada tratamiento un lavado de la zona, preferentemente con agua ozonizada y la aplicación de aceite ozonizado después del tratamiento y antes de acostarse. Nadie duda de la potente actividad desinfectante del ozono (probablemente un poco inferior a la del yodo), en lo que respecta a las bacterias gram (+), gram (-), hongos, virus y protozoarios. El barato y simple tratamiento con agua y aceite ozonizados es bien tolerado y es mucho más corto comparado con cualquier tratamiento convencional. La gran ventaja es debida a una serie de factores concomitantes tales como la desinfección, la vasodilatación y la oxigenación con la normalización de la acidosis tisular y la reabsorción del edema(188-190). La teoría de la secuencia de la cicatrización de las heridas, se ha representado esquemáticamente que ocurre en tres etapas sucesivas(191):  Fase I: indica el estado de la inflamación, normalmente tiene una duración de 23 días. La ozonoterapia puede disminuir el riesgo de cronificación en caso de infección secundaria a un traumatismo, diabetes, isquemia local y posiblemente la resistencia a antibióticos.  Fase II: corresponde a la etapa intermedia, con una duración aproximada de dos semanas. La síntesis de matriz extracelular (fibronectina, colágeno III/I, ácido hialurónico y condroitin-sulfato) está acompañada por una activa proliferación de fibroblastos y queratinocitos. El uso de aceite ozonizado, no solo previene infecciones; también estimula la cicatrización de tejido.  Fase III: incluye el final de la regeneración definitiva y la remodelación del tejido cicatrizal; puede llevar un largo tiempo en pacientes diabéticos y de edad avanzada. En algunos casos, la liberación excesiva del factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF1) puede estimular una excesiva fibrogénesis con formación de tejido queloide. El éxito y la rapidez en la regeneración de una úlcera necrótica en pacientes diabéticos, inmunodeprimidos o con arteriopatías; puede lograrse mediante la combinación del tratamiento parenteral con autohemoterapia ozonizada (AHT) con la aplicación apropiada de aceite y agua ozonizados y controlando estrictamente la glucemia, para que exista una sinergia de los componentes del tratamiento. Actualmente en el área de ortopedia, el ozono es utilizado particularmente en el caso de dolor de espalda baja aplicando la mezcla del gas por medio de una inyección en los puntos de activación detectables en los músculos paravertebrales de los pacientes. Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Justificación 52 En la actualidad, el trasplante de órganos y tejidos se ha incorporado como una alternativa más dentro de la terapéutica clínica, revolucionando así el campo de la medicina. El desarrollo de potentes inmunosupresores, antimicrobianos y el refinamiento de las técnicas quirúrgicas, anestésicas y los cuidados postoperatorios ha permitido una mejor selección de los donantes, de los receptores y de un elevado número de investigaciones relacionadas con la preservación de los órganos y las complicaciones del trasplante, lo que ha hecho posible alargar la vida de muchos pacientes en todo el mundo. En el caso particular del TP, se le considera como la opción terapéutica en el caso de patologías pulmonares no malignas en su proceso terminal (ya sea esta una afección de las vías aéreas, parénquima y/o circulación pulmonar), que tiene como finalidad mejorar la calidad y alargar la vida del paciente. Desde la década de los 80 se han realizado más de 21000 TP (uni o bipulmonares), con un incremento progresivo de la supervivencia a corto plazo y una mejoría considerable en la calidad de vida de la mayoría de los pacientes, gracias al desarrollo y refinamiento de una técnica quirúrgica y preservación orgánica, optimización del tratamiento y a las mejorías antes mencionadas, que incluyen también la recuperación e inclusión de pacientes inicialmente desestimados; obteniendo además una disminución en las complicaciones postoperatorias. Sin embargo, la supervivencia a largo plazo ha sufrido un estancamiento; ya que la supervivencia actual global ronda en aproximadamente un 53% a los 5 años debido al RC y no ha variado en los últimos 15 años. Un estudio recientemente realizado por nuestro grupo sobre el RC en el TP experimental con DNA-microarrays, mostró que los procesos de óxido-reducción intracelular y las defensas frente a los mismos están presentes y regulados genéticamente en el RC, deduciendo que si podemos manipular los cambios de la expresión génica a través de la regulación de los factores de transcripción, podemos determinar la respuesta celular frente al daño oxidativo, para desarrollar una nueva alternativa de tratamiento para el control del RC, último responsable del fracaso del órgano y principal causa de fallecimiento a largo plazo de los pacientes sometidos a TP. Los estudios realizados con O3 como tratamiento a dosis y por las vías de administración adecuadas, señalan que provoca una activación y potenciación de los sistemas antioxidantes de la sangre y de las funciones biológicas celulares debido a la inducción de un estrés oxidativo transitorio y controlado, que no produce efectos perjudiciales y que además su administración repetida induce una respuesta de adaptación al estrés oxidativo que es capaz de reequilibrar el sistema redox alterado por los estímulos patógenos. Además es capaz de estimular las células pluripotenciales de la Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Justificación 53 médula ósea mejorando las propiedades de estas y de otras células sanguíneas circulantes, como son la inmunomodulación celular y la oxigenación de los tejidos. El RC continua siendo el talón de Aquiles del TP y la supervivencia a largo plazo sigue siendo baja en comparación a la de otros órganos sólidos, lo que demanda un esfuerzo de la investigación experimental. Valorando la posibilidad de desarrollar una opción terapéutica que ayude a frenar el RC y con el postulado de que el O3 es un fármaco real y que sus “efectos terapéuticos” podrían contribuir a la disminución del daño ocasionado por la LIR inicial y por el factor crónico de isquemia-inflamación que está ligada al RC del TP se ha desarrollado la presente tesis. OBJETIVOS Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Objetivos 54 1. “Valorar si el tratamiento con ozono modifica desde el punto de vista histológico el curso evolutivo del rechazo crónico en el pulmón trasplantado” 2. “Valorar si el tratamiento con ozono disminuye el estrés oxidativo relacionado con el rechazo crónico en el trasplante pulmonar mediante cuantificación con PCR en tiempo real” 3. “Valorar el efecto protector del ozono sobre el pulmón trasplantado” MATERIAL Y METODO Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Material y método 55 1. Sujetos de estudio. Para el desarrollo del modelo animal experimental del trasplante pulmonar, se utilizaron 36 ratas macho cosanguíneas (Rattus norvergicus), de la cepa SpragueDawley (SD), con una edad aproximada de 3-5 meses y un peso vivo que oscilaba entre 300 y 450g(38,231). 1.1. Características del alojamiento y manutención. Dichos ejemplares fueron criados en el bioterio de la Unidad de Investigación del Hospital Universitario Dr. Negrín de Las Palmas de Gran Canaria, obtenidos a partir de una colonia de reproductores (1ª generación) procedente del Centro de Producción Animal de Harlan Interfauna Ibérica SL (Barcelona, España). Los animales fueron destetados a los 21 días de edad, y se mantuvieron en condiciones de estabulación de 4 individuos por jaula (Makrolón III de 20x35x55cm; Allentown Inc., Panlab S.L., Barcelona, España), con un ciclo de luz/obscuridad de 12hrs respectivamente a una intensidad de 270 lux, con una temperatura ambiente de 21±1°C, humedad relativa de 50±5%, con un sistema de ventilación de 15-20 renovaciones/h. Fueron alimentados ad libitum con pellets de una dieta comercial para mantenimiento(232-234) (R.02-E Standard Diet, Prolabor, España); la cual posee una composición de 15% proteína bruta, 4% grasa bruta, 4% celulosa bruta, 5% cenizas brutas, 12mg/kg CuO, 15000 UI/kg vitamina A, 1500 UI/kg vitamina D3 y 80mg/kg vitamina E. El agua también se ofreció ad libitum, siendo purificada por un sistema de ósmosis inversa (Edstrom Industries, Waterford, WI, USA). 1.2. Normativa para el uso, protección y cuidado del animal de laboratorio. Siguiendo las recomendaciones de la Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA), los animales fueron supervisados en todo momento Fig.9: Rata Sprague-Dawley Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Material y método 56 para proporcionar bienestar animal, controlar la conducta y el estrés. Fueron valorados los signos fisiológicos oculares (hematoporfirina, hundimiento del globo ocular), respiratorios (frecuencia respiratoria, estornudos, flujo nasal), signos de actividad anormal (anorexia, somnolencia, automutilación, vocalización) y el aspecto externo (piloerección, lordosis, deshidratación, pérdida de peso). la monitorización microbiológica de rutina no reveló presencia de patógenos durante el periodo del estudio experimental(235,236). Fueron seguidas las normas nacionales e internacionales vigentes sobre el cuidado, uso y protección de los animales de experimentación, bajo las condiciones sanitarias en la categoría de convencional limpio de acuerdo a las recomendaciones y exigencias recogidas en el Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos (National Research Council, 1996), Directiva del Consejo Europeo 86/609 (Directiva-Comisión de las Comunidades Europeas, 1986), Real Decreto Español 1201/2005 (Ministerio de Presidencia 2005) y la Ley 32/2007 (Cortes Generales, 2007). 2. Instalaciones y equipo. El desarrollo del modelo experimental fue realizado en el quirófano 1 y en la sala de pre y postoperatorio y laboratorio de la Unidad de Investigación del Hospital Universitario Dr. Negrín. Se utilizó un ventilador Servo-900C® (Siemens-Elema, Suecia), un microscopio de pie Zeiss, OPMI® 912,5x (West Alemania), una nevera Misa® de 4 ºC, un Congelador Revco® de -70 ºC y un generador médico de ozono (Ozonosan Alpha plus®, Dr. Hänsler Nordring, Germany). 3. Material quirúrgico y fungible. Durante el acto quirúrgico se utilizaron paños quirúrgicos estériles, catéteres de venopunción nº 14 y 16 (Abbocath®, Abbott, Sligo, Irlanda), cuffs (fabricados a partir de catéteres de venopunción cortados en cilindros de 3 mm, con una base de 1,5 mm y una lengüeta de 1,5 mm) (38,231), sistemas de infusión intravenosa (Intrafix primeline®, Braun, España), bisturís nº 22, jeringas de 1 y 2ml, agujas 21 y 25G, tijeras de Metzembaum y Mayo, pinzas de Kocher, mosquitos, pinzas de disección, pinzas de Adson, pinzas de microcirugía (relojero), tijeras de microcirugía Westcott, microclamps Fig.10: Quirófano 1 de la unidad de investigación del HUGC Dr. Negrín Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Material y método 57 vasculares de 3,4mm (Yasargil®, Medicom Alemania), aplicador de microclamps, portaagujas Baumgartner, blefaróstato Murdock, microportaagujas Castroviejo estriado, microportaagujas Barranquer, suturas de Vycril® (Jonhnson and Jonhnson, Madrid, España) y seda negra 3/0 (Silkan®. B. Braun Surgical S.A. España), ligaduras de Prolene® de 6/0 y 7/0 (Ethicon, USA), torundas, hisopos y gasas estériles suero fisiológico, líquido de preservación frío Perfadex®. 4. Medicación anestésica y analgésica. Se utilizó en cada uno de los animales un protocolo de anestesia balanceada fija utilizando como inductor medetomidina (Domtor®, Pfizer, Madrid, España) y atropina® al 1% (Braun, Madrid, España) y como anestésico ketamina (Ketolar 500®, Pfizer, Madrid, España). El efecto de la medetomidina fue revertido con su antagonista, el atipamezol (Antisedan®, Pfizer, Madrid, España), como analgésico postoperatorio se empleó buprenorfina (Buprex®, Schering-Plough, Barcelona, España)(237,239). Finalmente; para facilitar la intubación orotraqueal, fue utilizado un hisopo empapado con lidocaína al 1% (Xilonibsa®, Inibsa, Barcelona, España). 5. Equipo y reactivos para procesamiento y análisis de las muestras Para realizar el estudio histopatológico, las muestras de tejido colectadas fueron preservadas en formol al 10% a temperatura ambiente. La deshidratación se realizó mediante un aclaramiento con alcohol y xilol (Leica, TP-1050, Leica Instruments, Fig.13: Medicación anestésica y analgésica Fig. 12: Cuffs Fig.11:Instrumental microquirúrgico Fig.11:Cuffs y pinza Yasargil Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Material y método 58 Gmbh, Nussloch, Alemania), para después ser incluidas en parafina (Leica, ReichertJung Histoembedder, Leica Instruments, Gmbh, Nussloch, Alemania). Los cortes histológicos se realizaron con un microtomo (Leica, LR-2055 Leica Instruments, Gmbh, Nussloch, Alemania). Se utilizó un calentador de agua P Selecta para montar las muestras a portaobjetos de 76x26 Knittel Glaber y posteriormente teñidas con Hematoxilina y Eosina. Para el proceso de tinción se utilizó hematoxilina, alcohol etílico, potasio alume, agua destilada, óxido mercúrico, ácido acético glacial y eosina soluble en agua. Para purificar el RNA del tejido colectado se utilizó el protocolo de extracción por TRI-reagent (reactivos de Sigma Chemical Co®, St. Louis, MO) y para la síntesis de cDNA se utilizó el kit Script cDNA síntesis (BioRad®, Barcelona, España). Los cebadores fueron fabricados por Thermo Electrón (www.thermo.com). Se utilizó SYBR Green (Foster City, CA) para la realización de los RT-PCR. 6. Diseño del estudio Se diseñó un estudio experimental de TP microquirúrgico con donantes en muerte cerebral, para los cuales se utilizaron 36 ratas macho de la cepa SD y se distribuyeron aleatoriamente en 4 grupos. Ninguno de los animales recibió tratamiento inmunosupresor ni antibiótico postoperatorio, además en este modelo se han incluido algunos aspectos de la técnica quirúrgica que se realiza en pacientes humanos como el control del tiempo de isquemia, perfusión retrógrada en el pulmón del donante y perfusión secuencial controlada del pulmón una vez implantado en el receptor: 1.- Grupo control (n=6). Se les realizó una toracotomía izquierda e inmediatamente se tomaron las muestras de pulmón izquierdo sano. 2.- Grupo sham (n=6). Se les realizó una toracotomía izquierda y se manipuló el pulmón sin lesionarlo y se mantuvo de esa manera durante 50 minutos. A los 3 meses posteriores se tomó una muestra de pulmón izquierdo. 3.- Grupo de TP (n=12; 6 trasplantes: 6 donantes y 6 receptores). Se les realizó un TP unilateral izquierdo con la técnica de cuffs y a los 3 meses se tomaron las muestras de pulmón trasplantado. 4.- Grupo de TP-Ozono (n=12; 6 trasplantes: 6 donantes y 6 receptores). Se les realizó un TP unilateral izquierdo con la técnica de cuffs. Los animales receptores fueron tratados con O3 por vía rectal diariamente 10 días antes de la cirugía y posteriormente a la cirugía, 3 veces por semana durante 3 meses. Finalizado ese tiempo, se tomaron las muestras de pulmón trasplantado. Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Material y método 59 Las muestras obtenidas de cada animal se destinaron al estudio histopatológico y al estudio genómico mediante RT-PCR. 7. Técnica quirúrgica. 7.1. Inducción de la muerte cerebral y extracción del pulmón del donante. El animal donante ha sido sometido a anestesia balanceada general fija, utilizando como inductor el -2 adrenérgico medetomidina a dosis de 0.5mg/kg subcutánea (SC) (Domtor®, Pfizer, Madrid, España), combinado con el fármaco anticolinérgico atropina a dosis de 0.04mg/kg intramuscular (IM) (Atropina®, Braun, España). Después de comprobar el efecto de sedación, se procedió a administrar ketamina a dosis de 75mg/kg intraperitoneal (IP) (Ketolar 500®, Pfizer, Madrid, España) para obtener el efecto anestésico profundo(38,237-239). Una vez anestesiado se rasuró y limpió la parte anterior del tórax y la región craneal y se realizó entubación orotraqueal según la técnica descrita por Weksler y cols(240), utilizando un catéter endovenoso de 14G (Abbocath®, Abott Ireland Ltd., Sligo, Irlanda) y facilitando a la misma con la aplicación de lidocaína 2% (Xylonibsa®, Inibsa, Barcelona, España) en la epiglotis. Durante todo el proceso de extracción se mantuvo al animal ventilado con una presión inspiratoria de 12 cmH2O, con una relación inspiratoria/espiratoria (I/E) de 1:2, una fracción inspirada de oxígeno (FiO2) de 0.2, con un volumen corriente (VC) de 1ml/100g de peso y una presión positiva al final de la espiración (PEEP) de 2cm de H2O y una frecuencia respiratoria (FR) de 60 respiraciones por minuto (rpm)(38). Con la rata en posición decúbito esternal, se realizó con una fresa dental una trepanación de 2mm en la zona anterolateral a la región de la brema por la cual se introdujo un catéter Fogarty de calibre 3F (LeMaitre® vascular, Burlington, MA, USA), posteriormente se llenó lentamente el globo del catéter con 200l de solución salina, con lo que se provocó un aumento gradual de la presión intra-craneana, con el fin de conseguir una hernia cerebral para Fig.14: Intubación Orotraqueal Fig.15: Inducción de Muerte Cerebral Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Material y método 66 10.3.2. Determinación de la expresión genómica mediante qRT-PCR. Se ha determinado la expresión de: Heat shock 27 kDa protein 1 (Hspb27), Peroxiredoxin 6 (Prdx-6), Endothelial PAS domain protein 1 (EPAS-1), Glutathione peroxidase 3 (GPX-3), Selenoprotein P, plasma 1 (Sepp-1), Vascular endotelial growth factor A (Vegf-A), Surfactant, pulmonary-associated protein A1 (Sftp-a1), Surfactant associated protein B (Sftp-b), Plasmalemma vesicle associated protein (Plvap), Krüppel-like factor 2 (KLF2), Claudin 5 (Cldn5), Thrombomodulin (Thbd), Delta sleep inducing peptide, immunoreactor (DSIP), Flavin containing monooxygenase 2 (Fmo2). Se ha utilizado un termociclador de capilares LightCycler 1.5® (Roche, Mannheim, Alemania), con el kit “LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I” (Roche, Cat No 12239264001) y el software de lightcycler 3.5.3 y se han seguido las instrucciones del fabricante. Los cebadores que se han utilizado para cada uno de los genes del estudio han sido diseñados utilizando el software online “Primer3” Tabla VIII: Condiciones de la RT-PCR Gen Numero Descripción Prime Foward Prime Reverse Hspb27 NM_031970.3 Heat shock protein 1 GGCACACTCACGGTGG AGGC GGGAGGGCTGGTGACG GCTA Prdx-6 NM_053576.2 Peroxiredoxin 6 CCAGCCACCACGGGC AGAAA CAGCCCAGTTCCCGCAG AC EPAS-1 NM_023090.1 Endothelial PAS domain protein 1 TGCGCCTGGCCATCAG CTTC CCGTCTTGGGTCACCAC GGC GPX-3 NM_022525.3 Glutathione peroxidase 3 TGGCAAACAGGAGCCA GGCG AGTTCCGCAGTGGGAGG GCA Sepp-1 NM_001083911 .1 Selenoprotein P GCAAGGTCGCTGCAG GAGGG GCAGGGCTTTGGCCTTG GCT Vegf-A NM_031836.2 Vascular endotelial growth factor CCAGGCTGCACCCACG ACAG CGCACACCGCATTAGGG GCA Sftp-a1 NM_017329.1 Pulmonary surfactantassocated protein A 5’CAGAGACGGGAGAG ACGGTGT 5’CAGCTAAGCTGGAAAT CCTGG Sftp-b NM_138842.1 Pulmonary surfactantassociated protein B 5’TGCTTCCAAACCCCA CACCTC 5’AGAGGACATGGTTCTG CTGCA Plvap NM_020086.1 Plasmalemma vesicle associated protein 5’ACTACTCGCTGATGC CGGAGT 5’TGGCGTCGCAGCTCTC CATTT KLF2 NM_001007684 .1 Kruppel like factor 2 (lung) Cldn5 NM_031701.2 Claudin 5 5’TTCTGTTCCACTGCA AGACGGC 5’ATTTCCAACGCTGCAG ACCCC Thbd NM_031771.2 Thrombomodulin GGTGCCTGCACCATCG CAGT GCTGGAGCCAGCACACC CAG DSIP NM_031345.1 Delta sleep induced peptide 5’CCCTGGAGCCACTTC CTTTCA 5’TCGGTGTTCATGATTC GGGTT Fmo2 NM_144737.2 Flavin containing monooxygenase 2 5’AAGCCACCCTTCCGT CGATAC 5’TCTGCCATCATCGTCG TCTCC Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Material y método 67 (http://frodo.wi.mit.edu/) y posteriormente se han optimizado con la temperatura de anillado y la concentración de MgCl2. La especificidad de los cebadores fue comprobada mediante electroforesis en gel de agarosa, observando que se generó una banda del tamaño esperado. El fragmento amplificado se analizó mediante la curva de melting que permite la identificación y diferenciación de las variantes genéticas. Los cebadores específicos que se emplearon y las condiciones de la qRT-PCR han sido recogidos en la tabla XI. Los resultados fueron corregidos mediante el gen cyclophilin-a (peptidylpropyl isomerase A) como housekeeping gene. 10.4. Analisis estadístico. Para el análisis estadístico de los datos se utilizó el programa SPSS for windows, versión 15.0 (2006, SPSS Inc. Illinois USA). El nivel de significación estadística se estableció para una ∞=0.05. Desde el punto de vista descriptivo, las variables cuantitativas se muestran como media aritmética y desviación típica o como mediana con un máximo y mínimo. Las variables cualitativas se trataron analizando la frecuencia absoluta de la aparición de cada una de las categorías así como las frecuencias relativas. Para comparar las diferencias de medias se utilizó la U de Mann Whitney. RESULTADOS Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Resultados 68 1.-Evolución clínica postoperatoria Todos los animales sham y los trasplantados presentaron una buena evolución postoperatoria. No se observaron dehiscencias ni infecciones de las heridas quirúrgicas en ninguno de los animales. En la tabla XII, se expresan los tiempos de: la extracción; (desde el inicio de la cirugía en el donante hasta el momento de la extracción del bloque cardiopulmonar), de banco; (desde la extracción del bloque cardiopulmonar hasta finalizar la colocación de los cuffs), del implante; (desde el inicio de la cirugía en el receptor hasta finalizar el cierre de la toracotomía) y de isquemia del injerto; (desde el momento del clampaje de la aorta torácica durante la extracción hasta el momento de la reperfusión arterial del injerto en el receptor). 2.-Descripción macroscópica de los pulmones En los animales del grupo control tras la realización de la toracotomía observamos ambos pulmones de aspecto normal con una coloración rojiza brillante, de consistencia suave y superficie lisa con una adecuada expansión y vaciamiento de los mismos, sin dificultad aparente al intercambio gaseoso y sin presencia de focos atelectásicos o fibróticos. En los animales del grupo sham, no se observaron diferencias macroscópicas significativas con relación al grupo control en el tejido pulmonar; pero si presentaron una mínima cantidad de adherencias entre el pulmón y la pleura parietal a nivel de la toracotomía realizada en esos animales. Tabla IX: Tiempos invertidos en la realización de los TP experimentales Tiempos Media ± SD en minutos Tiempo de extracción 71,5 ± 19,79 Tiempo de banco 33,13 ±6,51 Tiempo de implante 68,91 ± 6,31 Tiempo de isquemia 237,16 ± 16,50 Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Resultados 69 En el hemitórax izquierdo de todos los individuos pertenecientes al grupo de trasplante pulmonar sin ozono se observó una desaparición importante de la morfología pulmonar con ausencia de la función ventilatoria a pesar de las maniobras de reclutamiento alveolar. En su lugar se observó un muñón de tejido fibrótico que ocupaba la mitad de la capacidad del hemitórax, de color oscuro, apariencia irregular y rígido, que envolvía los cuffs que se utilizaron para realizar las anastomosis del TP. Dicho tejido presentaba múltiples adherencias a la pared costal y el mediastino ipsilateral. Al corte de la pieza se observó la presencia de cavidades quísticas con un contenido mucoso de coloración amarilloverdosa. En el hemitoráx derecho observamos un crecimiento compensatorio del pulmón no trasplantado que alcanzaba la cavidad pleural izquierda conservando un aspecto morfológico normal. En el grupo de animales de trasplante pulmonar que recibieron el preacondicionamiento con ozono, se observó en el hemitorax izquierdo una disminución del tamaño del pulmón trasplantado (aunque de menos cuantía) que presentaba una consistencia suave y lisa, con una ligera coloración hialina y algunas zonas atelectásicas, acompañado de un menor número de adherencias a la pared costal y al mediastino. El tejido pulmonar presentaba función ventilatoria aunque inferior a la del pulmón no trasplantado que se incrementó tras las maniobras de reclutamiento alveolar. En el hemitorax derecho seguimos observando el mismo crecimiento compensatorio del pulmón no trasplantado con una morfología aparentemente normal. 3.-Determinaciones histológicas En el estudio microscópico del grupo control se observó un parénquima pulmonar de aspecto normal en todos los animales (n=6), constituido por tejido conjuntivo fibroso, revestido por células planas con núcleos basófilos que se corresponden con los neumocitos tipo I y otras más aisladas con núcleos grandes y nucléolos que se corresponden con los neumocitos tipo II. Se observaron también Fig.23:Bloque pulmonar de un individuo del grupo trasplante pulmonar Fig.24:Bloque pulmonar de un individuo del grupo trasplante pulmonar+ozono Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Resultados 70 algunos vasos sanguíneos, y en la luz del alveolo (ópticamente vacía) algunos macrófagos. En el estudio microscópico del grupo sham observamos signos de congestión vascular e hiperinsuflación en 5 animales secundario al proceso de extracción y presencia aislada de histiocitos alveolares en 1 animal, con un aspecto histológico normal, similar del pulmón a la del grupo control en todos ellos (n=6). En el grupo de trasplante pulmonar sin ozono observamos una desaparición del parénquima pulmonar con ligera persistencia de los bronquios y bronquiolos dilatados y rodeados de infiltrados linfoplasmocitarios acompañados de una intensa vasculitis, características de un cuadro de RC severo con importante destrucción pulmonar en todos los animales (n=6) En el grupo de animales de trasplante pulmonar que recibieron previamente el acondicionamiento con ozono no se observó la presencia de lesiones en 3 animales. Se observó una leve cantidad de infiltrados mononucleares perivasculares e intersticiales, que corresponden a un rechazo agudo leve en 1 animal y signos de bronconeumonía focal sin otras lesiones en 1 animal. En ninguno de ellos se observaron signos de RC. En 1 animal el pulmón no fue valorable por escases de la muestra. Fig.26:Infiltrados linfoplasmocitarios perivasculares e intensa vasculitis Fig.27 Gpo. de TP-O3 mostrando un rechazo agudo leve Fig.25:Pulmón histológicamente sano Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Resultados 71 En la tabla X se muestran los hallazgos microscópicos descritos. 4.-Análisis de la expresión genética por RT-PCR En las tablas XI, XII y XIII se muestran los resultados de los genes analizados por RT-PCR de los pulmones del grupo sham, grupo trasplante y grupo trasplante que fue tratado con ozono, previa normalización de los datos está en función de la cyclophilina. Los datos de las tablas XI Y XII, están estandarizados según la media del grupo sham por lo que se presentan como cambios relativos en relación al mismo, mientras que en la tabla XIII, los cambios relativos del grupo TP-O3 están estandarizados frente a la media del grupo TP. Tabla XI: expresión génica del pulmón sham vs el pulmón trasplantado Genes Sham TP P Hspb27 1 ± 0,18 2,60 ± 0,27 <0,001 Prdx-6 1 ± 0,19 1,23 ± 0,57 0,8089 EPAS-1 1 ± 0,15 2,79 ± 0,26 <0,001 GPX-3 1 ± 0,22 0,91 ± 0,29 0,2723 Sepp-1 1 ± 0,15 2,08 ± 0,59 0,0042 Vegf-A 1 ± 0,17 1,60 ± 0,70 0,9605 Sftp-a1 1 ± 0,20 1,59 ± 0,41 0,9948 Sftp-b 1 ± 0,16 2,13 ± 0,43 0,001 Plvap 1 ± 0,19 2,19 ± 0,54 0,0024 KLF2 1 ± 0,18 1,60 ± 0,08 0,999 Cldn5 1 ± 0,20 2,57 ± 0,33 <0,0001 Thbd 1 ± 0,15 1,32 ± 0,28 0,9822 DSIP 1 ± 0,15 1,22 ± 0,09 0,992 Fmo-2 1 ± 0,18 1,82 ± 0,59 0,0168 Tabla X: Hallazgos histológicos con hematoxilina-eosina ID Animal Control Sham TP TP-O3 Rata 1 Sin lesiones Congestión, hiperinsuflación RC severo Sin lesiones Rata 2 Sin lesiones Histiocitos alveolares aislados RC severo Sin lesiones Rata 3 Sin lesiones Congestión, hiperinsuflacion RC severo Sin lesiones Rata 4 Sin lesiones Congestión, hiperinsuflacion RC severo RA1 (Rechazo agudo leve) Rata 5 Sin lesiones Congestión, hiperinsuflacion RC severo Bronconeumonía focal Rata 6 Sin lesiones Congestión, hiperinsuflacion RC severo No valorable (Tejido escaso) Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Resultados 72 Tabla XII: expresión génica del pulmón sham vs el pulmón trasplantado y tratado con ozono Genes Sham TP-O3 P* Hspb27 1 ± 0,18 0,76 ± 0,15 0,143 Prdx-6 1 ± 0,19 0,75 ± 0,12 0,071 EPAS-1 1 ± 0,15 0,90 ± 0,21 0,571 GPX-3 1 ± 0,22 0,43 ± 0,14 0,036 Sepp-1 1 ± 0,15 1,83 ± 0,74 0,180 Vegf-A 1 ± 0,17 0,68 ± 0,17 0,036 Sftp-a1 1 ± 0,20 1,08 ± 0,34 0,571 Sftp-b 1 ± 0,16 0,86 ± 0,07 0,025 Plvap 1 ± 0,19 0,80 ± 0,27 0,025 KLF2 1 ± 0,18 0,60 ± 0,18 0,036 Cldn5 1 ± 0,20 0,68 ± 0,29 0,101 Thbd 1 ± 0,15 0,71 ± 0,19 0,036 DSIP 1 ± 0,15 0,87 ± 0,36 0,786 Fmo-2 1 ± 0,18 0,77 ± 0,15 0,143 Tabla XIII: expresión génica del pulmón trasplantado vs el pulmón trasplantado y tratado con ozono Genes TP TP-O3 P** Hspb27 2,60 ± 0,27 0,76 ± 0,15 <0,0001 Prdx-6 1,23 ± 0,57 0,75 ± 0,12 0,0392 EPAS-1 2,79 ± 0,26 0,90 ± 0,21 <0,001 GPX-3 0,91 ± 0,29 0,43 ± 0,14 0,0024 Sepp-1 2,08 ± 0,59 1,83 ± 0,74 0,2612 Vegf-A 1,60 ± 0,70 0,68 ± 0,17 0,0088 Sftp-a1 1,59 ± 0,41 1,08 ± 0,34 0,0191 Sftp-b 2,13 ± 0,43 0,86 ± 0,07 0,0001 Plvap 2,19 ± 0,54 0,80 ± 0,27 0,0002 KLF2 1,60 ± 0,08 0,60 ± 0,18 <0,0001 Cldn5 2,57 ± 0,33 0,68 ± 0,29 <0,0001 Thbd 1,32 ± 0,28 0,71 ± 0,19 0,0015 DSIP 1,22 ± 0,09 0,87 ± 0,36 0,0271 Fmo 1,82 ± 0,59 0,77 ± 0,15 0,0024 Todos los datos de las tablas XI, XII y XIII fueron expresados en función de la media y su desviación típica. El valor de “p” estima las diferencias entre los grupos mediante el test de la U de Mann-Whitney en donde estadísticamente observamos: Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Resultados 73 En la tabla XI existe un aumento significativo de la expresión de los genes Hspb27, EPAS-1, Sepp-1, Sftp-b, Plvap, Cldn5 y Fmo-2. En la tabla XII observamos una menor expresión de los niveles de los genes GPX-3, Vegfa, Sftp-b, Plvap, Klf2 y Thbd. Y finalmente en la tabla XIII hay una disminución estadísticamente significativa en la expresión de todos los genes, excepto en Sepp-1. A continuación se muestra gráficamente la expresión de los genes, indicando cuales presentaron significancia estadística: Fig. 28: Sham vs TP Fig. 29: Sham vs TP-O3 Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Resultados 74 Fig. 30: TP vs TP-O3 Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Discusión 80 En los neumocitos tipo II, se ha detectado la presencia de Sftp-a1. Es un gen que codifica la síntesis de la proteína surfactante A1 (SP-A1) que es responsable de la inducción de citoquinas pro-inflamatorias de la proliferación de las células inmunes, de la quimiotaxis, del control de la fagocitosis de los macrófagos alveolares, del control de la inmunidad contra antígenos y la modulación de las ROS(284). En esta misma familia tenemos al gen Sftp-b, que codifica para la expresión de la proteína surfactante B (SPB) cuya función es contribuir a la función del líquido surfactante(285). El déficit de ambas proteínas se relaciona con la insuficiencia respiratoria, y particularmente la SPA1 se ha asociado con el síndrome de dificultad respiratoria infantil de los bebés prematuros y con la inmadurez estructural de los pulmones(284). Otro dato importante es que a algunas variaciones genéticas de ésta molécula, se les ha relacionado con la fibrosis pulmonar idiopática y con la inflamación de lesiones pulmonares graves, el asma, la fibrosis quística y el envejecimiento(286-288). En nuestro estudio hemos observado que existe un aumento de la expresión de estos dos genes en el RC, quizás como mcanismo compensador debido a las alteraciones inmunológicas e inflamatorias asociadas al TP e incluso para parricipar en el control de infecciones bacterianas, de forma que el O3 dismunye la expresión de las mimsas hasta valores normales probablemnte pq se reuiere menos de su expresión al no haber lesiones de RC en estos animales. La Prdx-6 es una enzima bifuncional miembro de la familia tiol-proteína antioxidante específica, implicada en la regulación redox de la célula, capaz de reducir los ácidos orgánicos de cadena corta, los ácidos grasos, los hidroperóxidos de fosfolípidos y también al H2O2, por lo que su papel también es importante en la protección contra el daño oxidativo(289). En nuestro estudio, la expresión de ésta molecula tiene el mismo comportamiento que la de GPX3. La función de la familia FMO es la de metabolizar una amplia gama de fármacos, xenobióticos y algunos sustratos endógenos(290). En los humanos, aparentemente existen diferencias entre los alelos que codifican para la expresión de las FMO2 asociado con el origen étnico(291). Quizás es posible que esta enzima actúe como detoxificante de los productos tóxicos del estrés oxidativo, ya que hemos visto que su expresión aumenta en el RC y disminuye con el tratamiento de ozono; sin embargo habrá que realizar más estudios sobre su funcionamiento y verificar si existe algún cambio en su comportamiento basado en las diferencias moleculares entre especies y/o razas. En nuestro estudio, también detectamos la actividad de un neuropéptido que no se ha relacionado hasta ahora con el tejido pulmonar, se trata de DSIP. Su función principal es la de regular el sueño; sin embargo también se le atribuye la capacidad de regular algunas funciones endocrinas y se piensa que quizás este regulado por los Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Discusión 81 corticoides(292,293). Un trabajo realizado con mitocondrias de rata in-vitro demostró que este neuropeptido mejora la eficiencia de la fosforilación oxidativa(294). En nuestro estudio, observamos que la expresión de éste neuropeptido disminuye en los animales que recibieron tratamiento, por lo que podemos hipotetizar que su actividad en el RC se encuentre relacionado con la inflamación y que de alguna manera influye en el sistema antioxidante. Finalmente, en nuestro estudio, el tratamiento con O3 ha evitado o al menos retrasado de forma significativa la aparición a los 3 meses de RC en los pulmones trasplantados por su efecto antimicrobiano, antioxidante y probablemente también inmunosupresor, lo que abre una nueva alternativa de tratamiento y/o prevención de los pacientes trasplantados. Dado que es un fármaco que no produce efectos adversos, que es fácil de administrar y económico, desde el punto de vista traslacional supone una opción potencialmente aplicable al ser humano. Los futuros estudios experimentales a largo plazo y los ensayos clínicos que devengan nos ayudaran a confirmar este singular aplicabilidad terapéutica del O3 en el TP. CONCLUSIONES Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Conclusiones 82 Primera: “Los hallazgos macroscópicos mostraron que los pulmones trasplantados habían perdido la morfología pulmonar a los 3 meses convirtiéndose en un pequeño muñón fibrótico sin capacidad funcional. Mientras que los pulmones trasplantados y tratados con O3 se observó que conservaban la estructura pulmonar y ventilatoria normal”. Segunda: “Los hallazgos histológicos del grupo de animales trasplantados mostraron la presencia de un RC severo en todos los animales, mientras que en los pulmones de los animales trasplantados y tratados con O3 no se observó la presencia de signos de RC, de forma en que el tratameinto con O3 protege a los pulmones trasplantados del RC”. Tercera: “Se comprobó por medio de la técnica de PCR-RT la presencia de genes relacionados con el estrés oxidativo en los pulmones de los animales trasplantados, mientras que se observó el efecto antioxidante y detoxificante del O3 en la expresión génica de los pulmones de los animales que fueron tratados con O3”. Cuarta: “Los signos de angiogénesis y el edema que se desencadenan por la hipoxia resultante del TP influyen en la presentación del RC, y fue observado en este estudio que el ozono es capaz de regular e inhibir estos signos mediante el control de los genes Vegf-A, Klf-2, Thbd, Plvap y EPAS1. Quinta: “Los genes Vegf-A y KLF2, tienen influencia sobre la acción de la COX-2, por lo que a pesar que no se ha reportado, el O3 pudiera tener propiedades desinflamatorias, analgésicas y quizás antipiréticas; estos efectos podrían ser entonces tener sinergia con la administración de fármacos inhibidores selectivos de la COX-2”. Sexta: “Se observó por medio de la técnica de PCR-RT que el ozono puede ser capaz de ejercer influencia sobre la homeóstasis celular, ya que regula los genes que son capaces del control del transporte de membrana y la concentración de solutos; mecanismos que mantienen la polaridad celular y de ésta manera inhibir el proceso de apoptosis relacionado al RC”. Tesis Doctoral Keila Eliam Zerecero Ramírez Conclusiones 83 Septima: “En nuestro estudio, el tratamiento con O3 ha evitado o al menos retrasado de forma significativa la aparición a los 3 meses de RC en los pulmones trasplantados por su efecto antimicrobiano, antioxidante y probablemente también inmunosupresor, este último hasta ahora no ha sido evaluado”. Octava: “Desde el punto de vista traslacional; el ozono es un medicamento seguro, económico y de fácil administración y representa una alternativa de tratamiento para pacientes que han sido sometidos o van a ser sometidos a un TP”. 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