Productos naturales de Schizochytrium aggregatum, Paecilomyces variotii y Penicillium roqueforti, hongos de interés acuícola

a OAO DE LAS PAUMS DE GRAN CANAR IA Se rvicio de In ves ti ga ción y T ercer Ci clo TíTULO TESIS DOCTORAL: LECTURA DE TESIS DOCTORAL (ACTILLA) PRODUCTOS NATURALES DE SCHIZOCHYTRIUM AGGREGATUM, PAECILOMYCES VARIOTlI y PENICILLlUM ROQUEFORTI, HONGOS DE INTERÉS ACUiCOLA. AUTOR: ROBERTO MIOSO DE PARTAMENTO/INSTITUTO: B IO LOGíA La tesis doctoral ha sido defendida ante el tri b unal compuesto por los siguientes doctores , en apl i cación de l Real Decreto 1393/2007, 29 de octubre, y el ｡ｾ＠ 9 del Reglamen to para la elaboración. tribunal, defensa y evaluación de tes is doctorales de esta Uni v ersidad ( BOU L PGC , de 5 de noviembre de 2008 ). PRESIDENTE: Dr. O./OOa. JAIME BERMEJO BARRERA SECRETARIO: D r. O./OOa. ELSA MARíA RODRíGUEZ PEREZ VOCAL: D r. O./ OOa . CARM EN MARIA HERNÁNOEZ CRUZ VOCA L: Dr. O./ OOa. M AR TIN BE SSONART GONZÁLEZ VOCAL: Or. O./ OOa. MARíA SALHI ROM ER O y se le ha otorgado la ca l ificación de SoBeesA [}' e ti /tEcctt l ｉｴｾ＠ En Las P almas de Gran Canar ia, a 17 de septiembre de 2 010 El P res idente JAIME BERMEJO ARRERA El Vocal El Vocal ()? ｾ＠ ｍａｒ￭ａｓａｌ ｈ ｾｩ［ｯ＠ EI V CARMEN MARIA HERNÁNO EZ CRUZ MARTIN BESSONA T GONZÁLEZ ELSA MARíA RODRíGUEZ PEREZ PARA EULA INTERESADO/A. Deberá personarse en la Subdirección de Tercer Ciclo y Postgrado para tramitar la solicitud del título de doctor ¡Ji UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA Departamento: BIOLOGIA Programa de doctorado: ACUICULTURA Titulo de la Tesis: Productos Naturales de Schizochytrium aggregatum , Paecilomyces vario tU y Penicillium roqueforti , hongos de interés acuicola . Tesis doctoral pre se ntada por D. Roberto Mioso Dirigida por el Dr. D. Francisco Javier Toledo Marante El Director El Doctorando Las Palmas de Gran Canaria, 18 de mayo de 2010 iv D. FRANCISCO JAVIER TOLEDO MARANTE, CATEDRÁTICO DE ESCUELAS UNIVERSITARIAS POR EL ÁREA DE CONOCIMIENTO DE QUíMICA ORGÁNICA DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA HACE CONSTAR: Que la presente memoria titulada Productos Naturales de Schízochytríum aggregatum, Paecílomyces varíotií y Penícíllíum roquefortí, hongos de interés acuícola, que presenta el doctorando Don Roberto Mioso para oplar al grado de Doctor en Ciencias del Mar por la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, ha sido realizada en el laboratorio de "Química Orgánica 11" del grupo de I+D+i de "Tecnología Química y Desarrollo Sostenible" adscrito al Departamento de Química bajo mi dirección, autorizando con esta fecha su presentación y defensa. y para que conste a los efectos oportunos firmo el presente en Las Palmas de Gran Canaria a 11 de mayo de 2010. v Agradecimientos Quiero aprovechar estas líneas para expresar mi agradecimiento a aquellas personas e instituciones que de uno u otro modo me han apoyado en la realización de este trabajo. Quisiera expresar mis más sinceras gratitudes al Prof. Dr. Francisco Javier Toledo Marante por dirigir este trabajo. Yo me considero muy afortunado por ser uno de sus alumnos. Especialmente, quiero agradecer al Dr. D. Jaime Bermejo Barrera, investigador científico del Instituto de Productos Naturales y Agrobiología del CSIC (IPBA, Tenerife) por su asesoramiento espectroscópico durante la realización de la presente Tesis. Al Dr. D. Juan Emilio González González y al Dr. D. Juan José Santana Rodríguez, miembros del grupo CAFMA de la ULPGC, por su colaboración en los análisis de GC-MS. A los profesores y personal integrante de los departamentos de Química y Biología de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria y del Instituto de Productos Naturales y Agrobiología del CSIC (IPNA, Tenerife) por su colaboración desinteresada. A la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria y al Instituto de Productos Naturales y Agrobiología del CSIC (IPNA, Tenerife), por ofrecerme los medios técnicos y materiales necesarios. A la Comunidad Económica Europea (FEDER), al gobierno de España (CICYT); Ministerio de Ciencia y Tecnología, al gobierno autónomo de Canarias (DGUI); Consejería Educación, Cultura y Deportes (ACIISI); por la financiación de los sucesivos proyectos que han hecho posible esta Tesis. A la agencia CAPES, gobierno del Brasil, por concederme una beca sin la cual no hubiera sido posible este trabajo. Y a la Unión Europea por concederme una beca “Marie Curie” que me permitió realizar mi estancia en Aberdeen, UK. Al Dr. Marcel Jaspars, profesor e investigador científico del Departamento de Química de la Universidad de Aberdeen, UK, así como al Dr. Richard Herbert, profesor emérito de la Universidad de Leeds, UK, por enseñarme elucidación estructural y a trabajar con el aparato de resonancia magnética nuclear. Finalmente, a mi familia, por su paciencia y apoyo. Roberto Mioso vi A A I Ir rm ma a, , P Pa ao ol la a y y A Am ma ay ya a vii Resumen El estudio químico de un organismo, y la elucidación de las estructuras moleculares de sus componentes, puede dar lugar a descubrimientos que aconsejen una posterior producción industrial del mismo. Con este propósito, se seleccionaron tres microorganismos para ser investigadas químicamente, siendo estos: un hongo zoospórico, Schizochytrium aggregatum, y dos hifomicetos, Paecilomyces variotii y Penicillium roqueforti; estos últimos fueron aislados del medio marino del litoral canario. La exploración química de Schizochytrium aggregatum condujo a la identificación de 38 tipos de componentes volátiles, pertenecientes a los grupos de los n-alcanos, 1-alquenos, 1-alcanoles, 2-alquil-1-alcanoles, ácidos grasos libres saturados e insaturados, ésteres metílicos y etílicos de ácidos grasos saturados e insaturados, triglicéridos saturados, diglicéridos, monoglicéridos insaturados, ceras, esteroles, triterpenos, catabolitos lipídicos, monoy sesquiterpenos de cadena cíclica y lineal, entre otros. En Paecilomyces variotii fueron identificados 46 grupos estructurales entre sus componentes volátiles que, mayoritariamente, son componentes lipídicos usuales implicados en la ruta de los ácidos grasos, fragmentos del catabolismo de los mismos, terpenoides y un metabolito de la ruta del ácido shikímico. Se aislaron e identificaron espectroscópicamente dos componentes no volátiles, a saber, oleína y peróxido de ergosterol. La mayor parte de estos componentes se describen aquí por primera vez para esta especie. La nueva cepa de Penicillium roqueforti, una vez cultivada y procesada, no ha suministrado ni un solo componente químico, ni volátil ni no volátil, que esté implicado en la ruta biogenética de la PR-toxina. Tampoco se ha encontrado indicio alguno de que produzca la micotoxina botriodiplodina. Se trata, pues, de una cepa marina que no produce toxinas. En su caldo de cultivo se identificaron 26 componentes volátiles pertenecientes a los grupos de los n-alcanos, 1-alcanoles, 2-alquil-1-alcanoles, ácidos grasos libres saturados e insaturados, amidas de ácidos grasos, ésteres metílicos de ácidos grasos poliinsaturados, monoglicéridos, ceras, alcoholes grasos libres, monoterpenos de cadena lineal, dipéptidos cíclicos y ftalatos de dialquilo. En el micelio se identificaron 64 componentes volátiles pertenecientes a los grupos de los n-alcanos, 1-alquenos, 1-alcanoles, 2-alquil-1-alcanoles, ácidos grasos libres saturados e insaturados, amidas de ácidos grasos, ésteres metílicos y etílicos de ácidos grasos saturados e insaturados, triglicéridos insaturados, diglicéridos, monoglicéridos saturados e insaturados, ceras, éteres grasos, catabolitos lipídicos, mono-, sesquiy diterpenos de cadena lineal, hidrocarburos aromáticos de la ruta del ácido shikímico y otros. También en el micelio se identificaron cinco componentes no volátiles, que se describen aquí por primera vez para la especie P. roqueforti, a saber: peróxido de ergosterol, (9,11)-dehidroperóxido del ergosterol, phidroxi-benzaldehido, el D-(-)-manitol y la novedosa 2-deoxi-2-fosfamino--D-glucopyranosa. Como consecuencia de estos resultados, se propone un modelo que ilustra el modo en que la glucosamina se incorpora a la ruta biogenética de la quitina. Estos resultados han demostrado que los tres hongos estudiados no son, en nuestras condiciones de cultivo, productores de micotoxinas; al contrario, producen importantes componentes nutricionales, lo cual supone que se pueden utilizar directamente para la nutrición animal en acuicultura. Por otra parte, también se pueden usar para producir industrialmente productos de alto valor añadido como oleína, peróxido de ergosterol, (9,11)-dehidroperóxido del ergosterol, p-hidroxi-benzaldehido, D- (-)-manitol y 2-deoxi-2-fosfamino--D-glucopyranosa. Esta última es nueva en la bibliografía. viii Índice Pág. 0-1. 0-2. 0-2.1. 0-2.2. 0-3. 0-3.1. 0-3.2. 0-4. 0.5. I-1. I-2. I-3. I-3.1. I-3.2. I-3.2.1. I-3.2.2. I-3.2.3. I-4. I-5. I-5.1. I-5.2. I-5.3. I-5.3.1. I-6. Agradecimientos……………………...……………………………………... Resumen…………...…………………………….…………………………... Lista de Figuras…..........……………………………………………………. Lista de Tablas………………………………………………………………. Lista de Anexos……………………………………………………………… Lista de Abreviaturas...................................................................................... CAPITULO 0 Introducción…………….…...…….……………....................…..................... Revisión bibliografica: história y aplicaciones de los productos naturales en acuicultura.........................................……………………………….....……... Definición de Productos Naturales.................................................................... Acuicultura y productos de alto valor añadido.................................................. Perspectivas actuales de los productos naturales marinos en acuicultura….… Perspectivas generales………………………………………………..….....… Perspectivas de los PNMs de orígen fúngico………………………….…..…. El método aplicado en esta tesis………………………………..…...….....….. Referencias bibliográficas................................................................................. CAPITULO I Schizochytrium aggregatum Antecedentes…………………………........................…………………..…… Objetivos……………………………………………………………………… Resultados y discusión…………………..………………………..………….. Obtención de biomasa, extracción y fraccionamiento………………………... Estudio químico de la biomasa fúngica………………………………………. Componentes volátiles en la biomasa fúngica………………………………... Presencia de ésteres metílicos de ácidos grasos ramificados en la biomasa fúngica………………………………………………………………………... Presencia de ftalatos de dialquilo en la biomasa fúngica…………………….. Conclusiones………………………………….……………………………..... Experimental………………………………………………………………….. General……………………………………………………………………….. Obtención de la cepa…………………………………………………………. Análisis químico de la biomasa fúngica……………………………………… Obtención del extracto y fraccionamiento por polaridad…………………….. Referencias bibliográficas……………………………………………………. v vii x xiii xiv xvi 1 3 3 4 10 10 16 20 23 36 39 39 39 41 41 50 50 51 52 52 53 53 53 58 ix II-1. II-2. II-3. II-3.1. II-3.2. II-3.2.1. II-3.2.1.1. II-3.2.1.2. II-3.2.2. II-4. II-5. II-5.1. II-5.2. II-5.3. II-5.4. II-6. III-1. III-2. III-3. III-3.1. III-3.2. III-3.2.1. III-3.2.2. III-3.2.3. III-3.2.4. III-3.2.5. III-3.3. III-3.3.1. III-3.3.1.1. III-3.3.1.2. III-3.3.2. III-4. III-5. III-5.1. III-5.2. III-5.3. III-5.3.1. III-5.3.2. III-6. CAPITULO II Paecilomyces variotii Antecedentes……………………………………...……..……………………. Objetivos……………………………………………………………………… Resultados y discución…………………………...…………………………... Obtención de biomasa, extracción y fraccionamiento………………………... Estúdio químico del micelio………………………………………………….. Componentes volátiles en el micelio…………………………………………. Presencia de ésteres metílicos de ácidos grasos ramificados en la biomasa fúngica………………………………………………………………………... Presencia de ftalatos de dialquilo en la biomasa fúngica…………………….. Componentes no volátiles identificados en el micelio de P. variotii………… Conclusiones………………………………………………………………….. Experimental………………………………………………………………….. General……………………………………………………………………….. Aislamiento e identificación de la cepa………………………………………. Cultivo masivo del hongo…………………………………………………….. Estudio químico del micelio………………………………………………….. Referencias bibliográficas……………………………………………………. CAPITULO III Penicillium roqueforti Antecedentes……………………………………...……..……………………. Objetivos……………………………………………………………………… Resultados y discución…………………………...…………………………... Obtención de biomasa, extracción y fraccionamiento………………………... Estudio químico del caldo de cultivo…………..…………………………….. Componentes volátiles en el caldo de cultivo..………………………………. Componentes no volátiles en el caldo de cultivo..…………………...………. Ausencia de toxinas en el caldo de cultivo…………………………………… Presencia de dipéptidos en el caldo de cultivo…...…………………………... Presencia de hidrocarburos y ácidos grasos libres en el caldo de cultivo...….. Estudio químico del micelio………………………………………………….. Componentes volátiles en el micelio……………………………….………… Presencia de ésteres metílicos de ácidos grasos ramificados en el micelio…... Presencia de ftalatos de dialquilo en el micelio………………………………. Componentes no volátiles identificados y cuantificados en el micelio………. Conclusiones………………………………………………………………….. Experimental………………………………………………………………….. General……………………………………………………………………….. Aislamiento e identificación de la cepa………………………………………. Cultivo masivo del hongo…………………………………………………….. Análisis químico del caldo de cultivo………………………………………... Estudio del micelio………………………………………………………..….. Referencias bibliográficas................................................................................. Anexos……………………………………………………………….……….. 65 70 70 70 72 72 81 81 82 87 88 88 89 90 90 98 103 115 116 116 118 118 118 125 125 126 126 127 130 131 132 149 151 151 154 154 155 158 169 182 xvi Abreviaturas AA °C 13C 13C-RMN CCF CDCl3 CH2Cl2 cm COSY d dd ddd DEPT_135 DHA D2O DOCD3 EEAGs EI EFA EM EMAGs EPA EtOAc EtOH eV FAB GnRH GC GC-MS g x l-1 h 1H 1H-RMN Hz HMBC HMQC HPLC HUFAs IR J k Ácido araquidónico Grados Celsius Carbono – isótopo de masa 13 Espectro de resonancia magnética nuclear de Carbono 13 Cromatografía en capa fina Cloroformo deuterado Diclorometano ó cloruro de metileno Centímetro Espectro de correlación de protones (COrrelation SpectroscopY) Doblete, multiplicidad en RMN Doble doblete Triple doblete Espectro para discriminación de tipos de carbonos, con excitación de 135º (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer) Ácido docosahexaenóico Agua deuterada Metanol deuterado Esters etílicos de ácidos grasos Modo de ionización electrónica en el detector de espectrometría de masas (Electrón Ionization) Ácidos grasos esenciales Espectrometría de masas Esters metílicos de ácidos grasos Ácido eicosapentaenoico Acetato de etilo Etanol Electronvoltios Ionización por bombardeo con átomos rápidos en EM (Fast Atom Bombardment) Hormona liberadora de gonadotrofina Cromatografia de Gases (Gas Chromatography) Cromatografía de gases con detector de espectrometría de masas Gramo por litro Hora Protón Espectro de resonancia magnética nuclear de protón Hercios Experimento que permite determinar relaciones entre protones y carbonos separados por 2 o 3 enlaces (Heteronuclear Multiple Bond Coherence) Experimento bidimensional determinar correlaciones C/ H a un enlace (Heteronuclear Multiple Quantum Coherente) Cromatografía líquida de alta eficacia (High Performance Liquid Chromatography) Ácidos grasos poliinsaturados (Hight Unsaturated Fatty acids) Espectroscopía de Infrarrojo Constante de acoplamiento en RMN kilo xvii Abreviaturas kcuenta kDa kg/ ha LD50 m MeOH min. mg. ml m/ z MHz nm NOESY PNMs p.f. ppm Tr RMN SiO2 t TCA TOCSY Rf s µm UV (w/ w) Å  []D Kilocuenta Kilodaltons Kilogramos por hectárea Dosis letal para el 50 % de organismos ensayados Multiplete, multiplicidad en RMN Metanol Minuto Miligramo Mililitro Cociente masa/carga Megahercios Nanómetro, unidad de longitud de onda Experimento 2D para determinar el Efecto Nuclear Overhauser (Nuclear Overhauser Enhancement SpectroscopY) Productos Naturales Marinos Punto de fusión Partes por millón Tiempo de retención, parámetro de la cromatografía de gases Resonancia magnética nuclear Sílice (dióxido de silicio) Triplete, multiplicidad en RMN Ciclo del ácido tricarboxílico Experimento bidimensional para determinar todas las correlaciones H/H de un sistema de espin -hasta 4, 5 enlaces- (TOtal Correlation SpectroscopY) Factor de retención, parámetro de la cromatografía en capa fina Singlete Micrometro (10-6 metro) Espectroscopía ultravioleta Peso/peso Ångström Desplazamiento químico en RMN (ppm) Rotación óptica específica C CA AP PI IT TU UL LO O 0 0 C Ca ap pí ít tu ul lo o 0 0 1 0-1. Introducción La acuicultura depende del uso de productos químicos para su desarrollo, en una proporción creciente a medida que se intensifica la naturaleza del sistema de cultivo empleado. Los productos químicos son responsables de una mejora en la productividad en los criaderos pues proporcionan una mayor supervivencia larvaria y una mejor eficiencia alimentaria, reducen el estrés en el transporte de animales, controlan a los agentes patógenos, combaten los epífitos y organismos adheridos responsables de la disminución del rendimiento de las conducciones de agua, al incrementar la relación carga/ peso de estructuras y materiales (Subasinghe y col., 2000). Sin embargo, gran parte de estos procedimientos operativos utilizan productos químicos sintéticos, los cuales acaban impactando de forma negativa en el medio ambiente y salud animal/ humana por su ecotoxicidad (Tabla 0-1) (Alderman y Michel, 1992). Como es evidente, cualquier investigación dirigida hacia la obtención de productos menos agresivos es de interés general, tanto desde un punto de vista industrial como académico. Contaminante Fuente/ uso Impacto Antibióticos Criaderos, tanques de cultivo Acumulación en sedimentos y organismos, disminución diversidad genética de la microflora béntica. Pesticidas Jaulas, lechos algales Muerte de invertebrados. Desinfectantes Criaderos, tanques de cultivo Hipoxia, mortalidad. Antiincrustantes Jaulas Muerte de invertebrados. Hormonas Criaderos Desconocido. Tabla 0-1. Clasificación de los compuestos químicos usados en acuicultura que pueden llegar a ser contaminantes, sus fuentes, usos e impacto (CBD, 1992, 2004). En el contexto de un modelo de acuicultura racional y sostenible, los productos naturales empiezan a adquirir importancia, una vez que pueden ofrecer un amplio repertorio de componentes con diferentes aplicaciones. Se han aportado evidencias de que estos compuestos han jugado un papel nada despreciable dentro de la acuicultura contemporánea, y que representan un menor riesgo, cuando se les compara con los mencionados productos sintéticos. En este sentido, el 31 de diciembre de 2003, la Agencia de Protección Medioambiental de Estados Unidos C Ca ap pí ít tu ul lo o 0 0 2 (EPA) prohibió la utilización de todos los conservantes de la madera conteniendo arsenato de cobre cromatado, resaltando la importancia de encontrar “alternativas naturales”. Hoy se sabe que las esponjas del orden Verongida no son incrustadas por macroorganismos por poseer mecanismos químicos de defensa; la más notable característica de estas esponjas es que biosintetizan alcaloides, derivados de la dibromotirosina, que son antimicrobianos, citotóxicos y antiincrustantes (Venkateswarlu y col., 1998; Ferriol y col, 2008). Por otra parte, los antecedentes relacionados con la acuicultura informan del uso de los productos naturales como desinfectantes, herbicidas, pesticidas, parasiticidas y antibióticos (Weston, 2000), así como suplementos alimenticios, en forma de vitaminas, ácidos grasos, carotenoides, inmunoestimuladores, hormonas y atrayentes (Boonyaratpalin, 2000). Es evidente el interés fito y zootécnico que todo esto representa. El estudio químico de un organismo, y la elucidación de las estructuras moleculares de sus componentes, puede dar lugar a una serie de aplicaciones que van desde la utilización del propio organismo estudiado como materia prima bruta, sin ningún tipo de tratamiento, hasta la producción masiva de éste para la posterior aplicación de procedimientos extractivos, en orden a la producción industrial, en “biofábricas”, de productos de alto valor añadido aplicables a sectores como el farmacéutico, cosmético, nutracéutico, agrario y, por supuesto, acuícola. En esta tesis, con el propósito de descubrir organismos y productos naturales potencialmente aplicables a una acuicultura de carácter sostenible, se han planteado los siguientes objetivos: 1) Efectuar una revisión de los antecedentes bibliográficos de la química de los productos naturales en relación con la acuicultura. 2) Estudiar los metabolitos producidos por el hongo zoospórico Schizochytrium aggregatum suministrado por “Aquafauna Bio-Marine”. 3) Estudiar los metabolitos producidos por el hongo filamentoso Paecilomyces variotii, aislado del medio marino canario. 4) Estudiar los metabolitos producidos por el hongo filamentoso Penicillium roqueforti, aislado del medio marino canario. C Ca ap pí ít tu ul lo o 0 0 3 La preferencia de estos organismos como objeto de estudio, un microhongo zoospórico y dos hongos filamentosos, responde a unos motivos concretos. En primer lugar, hay antecedentes de aplicación de los hongos zoospóricos con fines nutricionales en acuicultura (Lewis y col., 1999; Nichols y col., 1999). En segundo lugar, como parte de la línea de investigación en “Química Orgánica y Materiales Bioactivos” que ha sido desarrollada desde hace dos décadas por el grupo de investigación de “Tecnología Química y Desarrollo Sostenible” de la ULPGC, es deseable abrir una nueva frontera, dirigida a la obtención de productos naturales de microhongos aislados en los ecosistemas marinos del litoral canario, con especial énfasis en los de tipo filamentoso, por su potencial aplicabilidad en acuicultura. 0-2. Revisión bibliográfica: historia y aplicaciones de los productos naturales en acuicultura 0-2.1. Definición de Productos Naturales La biosfera, con su inmensa diversidad, representa una fuente de productos naturales con aplicaciones nutricionales, farmacológicas y cosméticas (Hay y Fenical, 1996; Nichols y col., 1999). El hombre, conocedor de esta biodiversidad desde tiempos remotos, ha usado estos recursos en forma de organismos o sus extractos para alimentarse, curarse e incluso matarse (Herbert, 1989). Un ejemplo lo encontramos en el uso de microalgas en la nutrición, fechado hace 2000 años, cuando la cianobacteria Nostoc flagelliforme fue utilizada como alimento en China (Gao, 1998). Otro ejemplo, ahora de los tiempos modernos, lo constituye el uso del nutracéutico glucosamina, que se obtiene a partir de la quitina del exoesqueleto de los crustáceos marinos (Barrow y Shahidi, 2007). Convencionalmente, los componentes orgánicos producidos por los organismos son considerados como productos naturales. Algunos autores consideran como “natural” sólo aquellas sustancias que, procediendo directamente de una fuente renovable, no se deriven de otra por modificación química (CBD, 1992). C Ca ap pí ít tu ul lo o 0 0 4 En términos fisiológicos, todo ser vivo posee un metabolismo primario, el cual es responsable de la generación de energía metabólica y la elaboración de estructuras moleculares (Pietra, 1990). Tales estructuras están constituidas por unidades oligoméricas, como los aminoácidos, azúcares, ácidos grasos y nucleótidos que se combinan para producir los polímeros necesarios para la vida, como las proteínas, carbohidratos y lípidos complejos (Harborne, 1988; Mann y col., 1994). Los metabolitos secundarios, sin embargo, son generados a través de rutas biogenéticas específicas. Estas rutas son importantes, pero no críticas, para la vida del organismo, a saber: ruta de los terpenoides, ruta de los policétidos, ruta del nitrógeno (alcaloides, polipéptidos), ruta del ácido shikímico (shikimatos) y ruta de los ácidos grasos (Stone y Willians, 1992). En este contexto, y desde la óptica de la química, la definición de productos naturales marinos (PNMs) alude a los compuestos orgánicos producidos por microorganismos, algas, esponjas, cnidarios, plantas marinas, moluscos y peces en el medio marino (McClintock y Baker, 2001). Buscando evitar dificultades semánticas, se ha optado en esta tesis por una definición más amplia de lo que se entiende por productos naturales. Se han considerado como tales, aquellos componentes orgánicos producidos por un organismo en su totalidad; por lo tanto, abarca tanto a los metabolitos primarios como a los derivados del metabolismo secundario, por ejemplo polisacáridos y terpenoides respectivamente. 0-2.2. Acuicultura y productos de alto valor añadido Históricamente, las actividades relacionadas con la práctica de la acuicultura se remontan a más de 3.000 años (Guo, 2000). Durante la edad media, ya se habían establecido en Europa algunas de estas prácticas de cultivo. No obstante, la acuicultura como actividad zootécnica solamente ha comenzado a perfilarse a partir del último siglo, con la introducción de técnicas depuradas de manejo, lo que permitió la intensificación de los sistemas de cultivo. C Ca ap pí ít tu ul lo o 0 0 5 Técnicamente, esta actividad se desarrolla a través de prácticas operacionales que comprenden la preparación de estanques y estructuras de cultivo, el manejo del suelo, del agua y de la productividad acuática, el transporte de organismos vivos, control de la reproducción, promoción del crecimiento y nutrición, gestión de enfermedades, procesamiento y mejora del producto final (Bernabé, 1991; 1996). El propósito fundamental de la acuicultura es, por lógica, la producción de materia viva a partir del elemento acuático. En este sentido, esta actividad consiste en la manipulación de los medios naturales o artificiales que puedan llevar a la producción de especies útiles al hombre. Entre sus principales vertientes destacan la piscicultura, la carcinocultura, la malacocultura y la talasiocultura (Pillay, 1997). Sin embargo, últimamente se ha introducido el término “Acuicultura de Organismos no Alimentarios” para describir una próspera actividad que acaba de aparecer (Liebezeit, 2005). Consiste en la producción de los productores de los “Productos de Alto Valor Añadido”. Así, invertebrados y peces marinos son ya fuentes de metabolitos de interés comercial. Es presumible que esta actividad crecerá en importancia a medida que el conocimiento de los productos naturales y la ecología química se desarrollen (Inglis, 2000; Galm y Shen, 2007). Entre los productores de estos componentes destacan las esponjas y sus organismos asociados, briozoos y moluscos, los cuales han recibido especial atención por parte de la investigación y desarrollo (Haefner, 2003). En este campo, la ULPGC, es pionera, pues está desarrollando en este momento un proyecto empresarial orientado a la producción de citotóxicos por maricultura de la esponja Verongia aerophoba, la cual se está cultivando en el archipiélago balear (Ferriol y col., 2008). Por otro lado, la reproducción de los peces es regulada en el cerebro por medio de la hormona liberadora de gonadotrofina (GnRH), que se produce específicamente en el hipotálamo (Harvey y Hoar, 1980). Este decapéptido estimula la producción de gonadotrofinas por parte de la hipófisis, y es uno de los primeros productos naturales de alto valor añadido aplicados en acuicultura para inducir la reproducción. En este sentido, los extractos pituitarios provenientes de la carpa (Cyprinus carpio) y del salmón (Salmo salar) se han utilizado con éxito (Sundararaj, C Ca ap pí ít tu ul lo o 0 0 6 1981). Tal procedimiento, conocido como hipofisación, ha devenido en una práctica corriente en la piscicultura moderna. En la actualidad, maduración final, ovulación y espermiación se provocan en las especies de mayor interés acuícola, sobretodo en peces de agua dulce (Tabla 0-2). Fuente biológica del extracto Especie inducida Referencia Rana Clarias gariepinus (Adebayo y Fatoyinbo, 2008) Gallina Tinca tinca (cyprinideo) (Amaral, 1995) Esox lucius (lucio) (Billard y Marcel, 1980) Clarias batrachus (Sahoo y col, 2008) Colossoma mitrei (Godinho y Godinho, 1986) Cyprinus carpio (Madu y col., 1990) H. molitrix (Brzuska, 1999; Singh, 1989) Silurus glanis (Kouril y Hamackova, 1982) Ictalurus punctatus (Bidwell y col., 1985) Aristichthys nobilis (Ufodike y Amadi, 1991) Carpa común, Cyprinus carpio Dicentrarchus labrax (Arcarese y Ravagnan, 1972) Carpa india, Labeo rohita Labeo rohita (Khan y col., 1992) Clarias gariepinus Ctenopharyngodon idella (Schoonbee y Prinsloo, 1986) Clarias lazera Clarias lazera (Hogendoorn y Vismans, 1980) Clarias macrocephalus Clarias macrocephalus (Mollah y Tan, 1983) Salmón del Pacífico Chanos chanos (Vanstone y col., 1977) Salmón C. auratus (carpa dorada) (Suzuki y col., 1988) Trucha arco-iris O. mykiss (trucha arco-iris) (Jalabert, 1978) Pez gato marino H. molitrix (Varghese y Rao, 1976) Mugil cephalus Mugil cephalus (Brasola y col., 1979) Tabla 0-2. Extractos pituitarios usualmente utilizados como inductores hormonales en la reproducción de peces de cultivo. Algunos fisiólogos de la reproducción han mostrado interés por los metabolitos secundarios de una planta india conocida como cóleo (Coleus forskohlii). Su utilidad reside en la actividad de su componente principal, el diterpeno forskolina (1) (Bhat y col., 1983). Según Chaube y Haider (1997), este compuesto actúa estimulando la acción gonadotrópica, desencadenando la esteroidogénesis folicular y maduración ovocitaria final en peces. En concreto, se ha observado que la forskolina estimula la maduración ovocitaria en el pez medaka, Oryzias latipes (Iwamatsu y col., 1987); además, presenta un efecto aditivo sobre la disolución de la vesícula germinal en la perca, Anabas testudineus (Bhattacharyya y col., 2000); y estimula la C Ca ap pí ít tu ul lo o 0 0 7 producción de 17β-estradiol, hormona responsable de la síntesis de vitelogenina en el hígado de la trucha arco-iris, Oncorhynchus mykiss (Yeo, 1998). O HOH O O O OH OH 1 Figura 0-1. Forskolina. La hormona de la muda de los crustáceos marinos, al igual que la de los insectos, está constituida por mezclas de ecdisteroides como crustecdisona (3) (Horn y col., 1968), 2deoxicrustecdisona (4) (Galbraith y col., 1968) y la inokosterona (6) (Faux y col., 1969). Esta familia de moléculas ha sido aislada del reino vegetal; así por ejemplo, la ponasterona A (5), se aisló de las hojas de Podocarpus nakaii (Nakanishi y col., 1966), crustecdisona (3) de Podocarpus elata (Galbraith y Horn, 1969) y, finalmente, 2-deoxicrustecdisona (4), y ecdisona (2) del helecho, Blechnum minus (Chong y col., 1970). Esto significa que se pueden utilizar determinadas fracciones de extractos vegetales, ricas en estos fitoecdisteroides, para modular la metamorfosis, crecimiento y reproducción de crustáceos como el cangrejo azul, Callinectes sapidus (Chan, 1995) o la langosta americana, Homarus americanus (Cheng y Chang, 1991). C Ca ap pí ít tu ul lo o 0 0 14 derivado de los ácidos grasos que fabrica la gorgonia Plexaura hormomalla (Braekman y Daloze, 1983). Las prostaglandinas son moléculas presentes al nivel traza en todos los tejidos animales, donde desempeñan un importante papel en la regulación de numerosos procesos bioquímicos, aunque en P. hormomalla se acumula la (15R)-PGA2 al nivel del 1,5% (w/ w). A pesar de que estas sustancias suelen ser estimuladoras de la actividad de la musculatura lisa, hipotensoras y tranquilizantes, la (15R)-PGA2 resultó inactiva. Sin embargo, por síntesis se transformó en su epímero (15S)-PGA2 que sí resultó activa. O CO2H HO H H H 17 15 1 Figura 0-13. Prostaglandina (15R)-PGA2. Los diterpenos 11,12-dihidroflexibilido (18) y sinulariolido (19) son compuestos producidos por el coral espagueti (Sinularia flexibilis); el primero resultó un fagorrepelente del pez mosquito (Gambusia affinis) y el segundo resultó con actividad algicida (Aceret y col., 2001; McClintock y Baker, 2001). Me OH Me OO Me O 11 12 18 19 Me Me O OH O O Figura 0-14. Fagorrepelentes/ algicidas del coral espagueti. C Ca ap pí ít tu ul lo o 0 0 15 La fanerógama marina Thalassia testudinum fabrica la fitoalexina (fungicida) luteolin-7O--D-glucopiranosil-2-sulfato (20) (Jensen y col., 1998); el molusco Tambja abdere produce la tambjamina A (21), un fagorrepelente y, al mismo tiempo, feromona de alarma (McClintock y Baker, 2001); finalmente, la prostaglandina F-1,15-lactonizada (22) es una hormona que influye en la reproducción y desarrollo de los estados juveniles del opistobranquio Tethys fimbria (Di Marzo y col., 1991; 1992). O OOH O OH OH O HOCH2 HOHO OSO320 7 2" Figura 0-15. Fungicida de Thalassia testudinum. NN H CHNH2 21 Figura 0-16. Fagorrepelente de Tambja abdere. HO AcO O O H H E Z 1 15 22 Figura 0-17. Hormona de Tethys fimbria. C Ca ap pí ít tu ul lo o 0 0 16 0-3.2. Perspectivas de los PNMs de origen fúngico Aunque los hongos y sus metabolitos sean habitualmente conocidos por su toxicidad e influencia negativa en la salud humana, animal y vegetal (Bricknell y Dalmo, 2005), los últimos avances en la investigación de los PNMs han demostrado que estos organismos constituyen, además, una prometedora fuente de sustancias bioactivas con interesantes aplicaciones (Rasmussen y Morrissey, 2007). Sus características heterotróficas y frecuentemente saprofíticas les confieren gran capacidad para producir y degradar compuestos químicos (Verbist y col., 2000). Sus enzimas han sido incluso propuestos como alternativa a los agentes anti-incrustantes tradicionales (Kristensen y col., 2008). El micelio del hongo filamentoso marino Phoma herbarum produce un polisacárido, de tamaño molecular 2,4 × 103 kDa, que es responsable del incremento de la actividad fagocitaria en ratones, presentando además actividad inmunomoduladora (Yang y col., 2005). Los β-glucanos son conocidos polisacáridos, siendo las estructuras activas las del β-1,3 y β-1,6 glucano, las cuales son biosintetizadas principalmente por hongos y levaduras (Abad y Bermejo, 2001; Spiridon y Popa, 2008). La immunoestimulación, por suministro con la dieta de estos β-glucanos, ha resultado eficaz frente a Aeromonas salmonicida, bacteria responsable de algunas enfermedades que sufren los cultivos de la trucha arco-iris (Oncorhychus mykiss) y el salmón atlántico, Salmo salar (Jeney y Anderson, 1993; Guttvik y col, 2002). También ha sido eficaz ante otras enfermedades infecciosas que golpean la carcinocultura (Fisher y col., 1978; Shimonoseki y Toshiaki, 1997). Por otro lado, suplementos alimenticios fabricados con el micelio del hongo Paecilomyces japonica han producido un incremento de la eficiencia alimentaria, mejor crecimiento y también mejor respuesta fagocitaria en juveniles de pez hirame, Paralichthys olivaceus (Lee y col., 2002). Los dinoflagelados producen un impacto comercial negativo en los cultivos de moluscos ya que fabrican toxinas que, a través de éstos, transmiten hasta los consumidores finales (García Camacho y col., 2007). Por la misma razón, también las cianobacterias son responsables del C Ca ap pí ít tu ul lo o 0 0 17 desagradable sabor y olor que suele adquirir la carne del pez gato Ictalurus punctatus, una de las principales especies dulceacuícolas cultivadas en Norte America (Martin y col., 1988; Smith y col., 2008). La inhibición de estos microorganismos en los cultivos es, pues, un objetivo prioritario en acuicultura, habiéndose usado para ello múltiples algicidas comerciales (Schrader, 2005). En un intento de encontrar PNMs que cumplan con la misma función, se han descubierto las clonostachisinas A y B, que fueron aisladas a partir del hongo marino Clonostachys rogersoniana. Se trata de dos nonapéptidos cíclicos (C54H89N9O10 y C53H87N9O10) que presentan un efecto inhibitorio selectivo frente al dinoflagelado Prorocentrum micans (Adachi y col., 2005). Por otra parte, Redhead y Wright (1978) descubrieron dos cepas fúngicas, Acremonium sp. y Emericellopsis sp., que inhibieron el crecimento de cianofíceas, siendo el agente responsable de esta actividad algicida el antibiótico cefalosporina C (23), biosintetizado por ambos hongos. CO2H O O NH O H O H3N CO223 Figura 0-18. Cefalosporina C, de Acremonium sp. y Emericellopsis sp. Del ascomiceto Chromocleista sp. se han aislado las dicetopiperazinas (Park y col., 2006). Se trata de polipéptidos cíclicos que se han mostrado activos frente a la vibriosis, una de las enfermedades que más pérdidas económicas causan en maricultura (Bordas y col., 1998). Esta enfermedad está causada por varias especies bacterianas pertenecientes al género Vibrio, siendo la especie Vibrio anguillarum la principal responsable del fenómeno en peces, crustáceos y moluscos (Fdhila y col., 2003). Otra dicetopiperazina, la mactanamida (24), ha sido aislada del hongo marino Aspergillus sp., y se ha manifestado con actividad fungistática (Lorenz y col., 2008). C Ca ap pí ít tu ul lo o 0 0 18 O NH Me NH Me O NH N O O O Me OH 24 Figura 0-19. Mactanamida, de Aspergillus sp. Kobayashi y col. (1993), estudiando el hongo imperfecto Trichoderma harzianum, un simbionte asociado a la esponja marina Micale cecilia, han aislado un nuevo policétido, la trichoharzina (25) con propiedades bactericidas. Me H Me Me HO O H Me O OH Me CO2H O H 25 Figura 0-20. Trichoharzina, de Trichoderma harzianum. Paralelamente, del fondo marino se ha aislado un nuevo Streptomiceto que produce otro policétido denominado SBR-22, el cual presentó actividad frente a la bacteria Staphylococcus aureus que, resistente a la methicillina (Sujatha y col., 2005), es responsable de la enfermedad que afecta a los ojos de la carpa plateada (Hypophthalmichthys molitrix) cuando se la cultiva en regiones tropicales (Shah y Tyagi, 1986). C Ca ap pí ít tu ul lo o 0 0 19 Los Thraustochytridos pertenecen a un grupo de microorganismos zoospóricos marinos que pueden ser descritos funcionalmente como hongos (Barr, 1992). Estos organismos producen moléculas de alto valor biológico, tales como los ácidos grasos poliinsaturados  3, utilizados tanto en alimentación funcional humana como en acuicultura (Fan y Chen, 2006). También biosintetizan el thraustochitrosido C (26), el cual ha sido obtenido de una cepa de Thraustochytrium globosum (Jenkins y col., 1999). Esta inusual substancia fúngica abre novedosas perspectivas en acuicultura, ya que la inclusión de este tipo de glicoesfingolípidos naturales en las dietas, es presumible que mejorará el crecimiento, tanto en larvas como en juveniles. Además, podría incrementar las tasas de supervivencia, disminuir la incidencia de malformaciones larvales y aumentar la resistencia al estrés (Tocher y col., 2008). O O OH HO HO HO OH HN O 26 Figura 0-21. Thraustochitrosido C, de Thraustochytrium globosum. El escualeno (27) es un triterpeno que se encuentra en el hígado de peces elasmobranquios, siendo éste su principal fuente (Xu y col., 2004). Este componente es un efectivo antioxidante natural, útil en nutracéutica (Yue y Jiang, 2009). En la actualidad, están siendo objeto de estudio una variedad de cepas de hongos Thraustochitridos y Labirintulomicetos, las cuales están siendo propuestas como potenciales substitutas de la fuente tradicional de escualeno (Jiang y col., 2004; Li y col., 2009). En este sentido, Chang y col. (2008) lograron aislar una nueva cepa de la levadura Pseudozyma sp., que fabrica al escualeno. La elevada tasa de producción de este metabolito hace que este organismo marino sea un firme candidato para la producción industrial de “escualeno microbiológico”. Por otro lado, se ha observado que la aplicación de la vacuna 763 con pequeñas dosis de escualeno es un remedio eficaz en la C Ca ap pí ít tu ul lo o 0 0 20 prevención de la enfermedad causada por Flavobacterium psychrophilum en los cultivos de ayu Plecoglossus altivelis, uno de los mas importantes peces de agua dulce en Japón (Rahman y col., 2000). 27 Figura 0-22. Escualeno, de Pseudozyma sp. Todos estos casos indican que el estudio de los PNMs, en especial los de origen fúngico, es un campo prometedor en acuicultura ya que se trata de organismos que suministran nuevas drogas relacionadas con la estimulación del sistema inmunológico de las especies en cultivo o con la gestión de sus enfermedades (Bachère, 2003). 0-4. El método aplicado en esta tesis El aislamiento e identificación de productos naturales requiere el uso de técnicas físicoquímicas de fraccionamiento y purificación. La exploración de estos productos es posible una vez se obtiene material biológico suficiente, bien sea a partir de organismos recogidos directamente de la naturaleza, bien cultivados a través de bioprocesos (fermentación, fotobiorreacción o maricultura). La biomasa obtenida puede ser conservada mediante congelación, liofilización o fijada químicamente en el seno de un disolvente. En el laboratorio de Química Orgánica II, del grupo de “Tecnología Química y Desarrollo Sostenible” de la ULPGC, el material biológico obtenido es habitualmente conservado congelado. Alternativamente, puede ser dejado en maceración en acetona o metanol varios días. Las técnicas preliminares de separación empleadas en el laboratorio son aquellas realizadas a través de cromatografía de adsorción, por medio de columnas gravitatorias y a media presión, así como a través de métodos de partición líquido-líquido. Esta última técnica puede C Ca ap pí ít tu ul lo o 0 0 21 aplicarse simplemente con la ayuda de un embudo de decantación, pudiendo realizarse de acuerdo con una variante del método establecido por Kupchan y col. (1973), el cual nos suministra fracciones de polaridad diferente. A lo largo del proceso de separación de los componentes se podrá optar por una cromatografía de exclusión del tipo SEPHADEX, que permite separar familias de componentes con tamaño molecular similar. A continuación se podrán aplicar otras técnicas de separación; tal es el caso de la cromatografía de adsorción en columnas tipo flash o HPLC/ TLC preparativas. Finalmente, para la obtención de cristales puros se recurre a la cristalización del componente aislado (Leonard y col., 1998). La elucidación estructural por métodos espectroscópicos requiere de sustancias perfectamente puras. Si hay éxito en la obtención de cristales, aún se podrá realizar un estudio de difracción de rayos X. En el caso contrario, si el componente purificado presenta una estructura no cristalina, entonces se recomienda la obtención de espectros de resonancia magnética nuclear de 1H y 13C, así como los espectros de masas. Con los espectros en mano, y una vez estudiados, el investigador propone la estructura del componente. Este proceso requiere de una revisión meticulosa de las estructuras ya descritas en la literatura. Debido a la inmensa cantidad de productos conocidos, es muy conveniente recurrir a una base de datos potente. En la actualidad se encuentran al alcance de la comunidad científica, vía on line, numerosas bases de datos que tratan sobre el tema. Desde la más tradicional Chemical Abstracts Registry, ahora integrada en Scifinder, a otras más específicas como la MarinLit® editada por la Universidad de Canterbury (Nueva Zelanda), la cual abarca toda la literatura publicada sobre productos naturales marinos. Hay que citar también la Antibase (Chemical Concepts), que trata exclusivamente sobre productos naturales aislados a partir de microorganismos y hongos superiores. Una vez comprobados los antecedentes bibliográficos, y conjeturizado que el componente aislado es novedoso, la elucidación estructural ha de realizarse de una forma más refinada. Para C Ca ap pí ít tu ul lo o 0 0 22 tal fin, se necesita de un segundo espectro de masas de alta resolución para que se pueda determinar la fórmula molecular con exactitud, tanto de la molécula como de sus fragmentos. Con esta información en mano se puede deducir la estructura bidimensional del nuevo componente aislado (Colegate y Molyneus, 1993). La obtención de la estructura tridimensional de las moléculas requiere de técnicas de resonancia magnética nuclear de alta resolución. Tales espectros aportan datos indirectos de acoplamiento entre núcleos cercanos en el espacio así como su dependencia angular a través de las constantes de acoplamiento JHH. Complejos experimentos de resonancia bidimensional denominados COSY, HMBC, NOESY y TOCSY nos aportan el resto de la información (Crews y col., 1998). Además de las técnicas anteriormente reseñadas, los métodos analíticos proporcionan herramientas relevantes en el análisis cualitativo y cuantitativo de las sustancias, permitiendo establecer su identidad así como la cantidad precisa de cada uno de los componentes presentes en una determinada mezcla (Valcárcel y Gómez, 1988). Entre las técnicas instrumentales destacan la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y la cromatografía de gases (GC). Tales herramientas, una vez conectadas a modernos detectores de espectrometría de masas, resuelven una infinidad de problemas analíticos (HPLC-MS; GC-MS). La realización de este trabajo fue posible gracias al esfuerzo cooperativo entre los diversos laboratorios de investigación integrados en este proyecto. En este sentido, el laboratorio de Química Orgánica II, del grupo “Tecnología Química y Desarrollo Sostenible” de la ULPGC mantiene una colaboración permanente con el Instituto de Productos Naturales y Agrobiología (IPNA) del CSIC, Tenerife, y el grupo CAFMA de la ULPGC. Se realizaron, además, colaboraciones puntuales con el Laboratorio de Productos Naturales Marinos del Departamento de Química de la Universidad de Aberdeen y el Laboratorio de Química Bioorgánica de la Facultad de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Leeds, Reino Unido. C Ca ap pí ít tu ul lo o 0 0 23 0-5. Referencias Bibliográficas Abad, M.J. and Bermejo, P. 2001 Bioactive natural products from marine sources. Studies Nat. Prod. Chem., v. 25, n. 6, pp. 683-755. Aceret, T.L., Sammarco, P.W., Coll, J.C. and Uchio, Y. 2001 Discrimination between several diterpenoid compounds in feeding by Gambusia affinis. Comp. Biochem. Physiol., v. 128, n. 1, pp. 55-63. Adachi, K., Kanoh, K., Wisespongp, P., Nishijima, M. and Shizuri, Y. 2005 Clonostachysins A and B, new anti-dinoflagellate cyclic peptides from a marine-derived fungus. J. Antibiot., v. 58, pp. 145–150. Adebayo, O.T. and Fatoyinbo, O.A. 2008 Effect of storage period on the efficacy of african bull frog pituitary extract for induced spawning of Clarias gariepinus. Int. J. Zool. Res., v. 4, n. 1, pp. 77-80. Alderman, D.J. and Michel, C. 1992 Chemotherapy in aquaculture today. In: Chemotherapy in aquaculture: from theory to reality. Office Intern. des Epizooties (Ed.), Paris, pp. 3-24. Amaral, H.Jr., 1995 Utilization of hen Gallus domesticus pituitary gland extract to induce spawning in the tench Tinca tinca. Development of a pituitary gland bank for the small rural producer. In: Proceedings of the 6TH Rio Grande meeting of aquaculture experts and 3TH South Brazil meeting on aquaculture, Zimmermann, S. (ed.), pp. 154-161. Amey, M.J. 1981 The application of liquid Derris (5 % rotenone) to a spring-fed upland pond to eradicate perch (Perca fluviatilis L.). Fish. Manag., v. 12, n. 3, pp. 111-112. Arcarese, G. and Ravagnan, G. 1972 First positive results in the artificial propagation of sea bass (Dicentrarchus labrax) on a large scale. Riv. Ital. Piscic. Ittiopatol., v. 7, n. 2, pp. 27-33. Bachère, E. 2003 Anti-infectious immune effectors in marine invertebrates: potential tools for disease control in larviculture. Aquaculture, v. 227, n. 1-4, pp. 427-438. Barr, D.J.S. 1992 Evolution and kingdoms of organisms from the perspective of a mycologist. Mycologia, v. 84, n. 1, pp. 1–11. C Ca ap pí ít tu ul lo o 0 0 30 Kobayashi, M., Uehara, H., Matsunami, K., Auki, S. and Kitagawa, I. 1993 Trichoharzin, a new polyketide produced by the imperfect fungus Trichoderma harzianum separated from the marine sponge Micale cecilia. Tetrahedron Lett., v. 34, pp. 7925-7928. Kouril, J. and Hamackova, J. 1982 Artificial spawning, egg incubation and forced fry rearing of the sheat-fish Silurus glanis L. Prace VURH Vodnany, v. 2, pp. 119-126. Kristensen, J.B., Meyer, R.L., Laursen, B.S., Shipovskov, S., Besenbacher, F. and Poulsen, C.H. 2008 Antifouling enzymes and the biochemistry of marine settlement. Biotech. Adv., v. 26, n. 5, pp. 471-481. Kupchan, S.M, Briton, R.W., Ziegler, M.F. and Siegel, C.W. 1973 Bruceatin, a new potent antileukemic simaroubolide from B. antidysenterica. J. Org. Chem., v. 38, pp. 178-179. Lee, C.H., Paek, N.S., Kim, D.S. and Kim, K.H. 2002 Effects of a Paecilomyces japonicasupplemented diet on the chemiluminescent response of phagocytes and growth in juvenile olive flounder (Paralichthys olivaceus). Aquaculture, v. 208, n. 1-2, pp. 51-57. Lee, K.G. and Shibamoto, T. 2001 Antioxidant property of aroma extract isolated from clove buds Syzygium aromaticum (L.). Food Chem., v. 74, n. 4, pp. 443-448. Leonard, J., Lygo, B. and Procter, G. 1998 Advanced practical organic chemistry, 2th ed., Stanley Thornes (ed.), Cheltenham, 298 p. Lewis, T.E., Nichols, P.D. and McMeekin, T.A. 1999 The biotechnological potential of thraustochytrids. Mar. Biotechnol., v. 1, n. 6, pp. 580–587. Li, Q., Chen, G.Q., Fan, K.W., Lu, F.P., Aki, T. and Jiang, Y. 2009 Screening and characterization of Squalene-producing from Hong Kong mangroves. Agric. Food Chem., v. 57, n. 10, pp. 4267–4272. Liebezeit, G. 2005 Aquaculture of "non-food organisms" for natural substance production. Adv. Biochem. Eng. Biotech., v. 97, pp. 1-28. Lorenz, P., Jensen, P.R. and Fenical, W. 2008 Mactanamide, a new fungistatic Diketopiperazine produced by a marine Aspergillus sp. Nat. Prod. Lett., v. 12, pp. 55-60. C Ca ap pí ít tu ul lo o 0 0 31 Madu, C.T., Ita, E.O., Amaatimin, C.Y., Nwaiku, R.C. and Igwe, P.N. 1990 Induced breeding of the common carp Cyprinus carpio. Annu. Rep. Natl. Inst. Freshwat. Fish. Res. (Nigeria), v. 1988-1989, pp. 53-60. McClintock, J.B. and Baker, B.J. 2001 Marine chemical ecology. CRC Press (Ed.), Boca Raton, 624 p. Mann, J., Banthorpe, D.V., Davidson, R.S., Harborne, J.B. and Hobbs, J.B. 1994 Natural Products: Their chemistry and biological significance. Wesley, A. (ed.), Logman, Harlow, 464 p. Martin, J.F., Bennett, L.W. and Graham, W.H. 1988 Off-flavor in channel catfish (Ictalurus punctatus) due to 2-methylisoborneol and its dehydration products. Water Sci. Technol., v. 20, pp. 99–105. Mollah, M.F.A. and Tan, E.S.P. 1983 HCG-induced spawning of the catfish, Clarias macrocephalus (Gunther). Aquaculture. v. 35, n. 3, pp. 239-247. Nakagawa, H., Kasahara, S. and Sugiyama, T. 1987 Effect of Ulva meal supplementation on lipid metabolism of black sea bream, A. schlegeli (Bleeker). Aquaculture, v. 62, p. 109-121. Nakanishi, K., Koreeda, M., Sasak, S., Chang, M.L. and Hsu, H.Y. 1966 Insect hormones. The structure of Ponasterone A, insect-moulting hormona from the leaves of Podocarpus nakaii Hay. Chem. Comm., pp. 915-917. Nichols, D., Bowman, J., Sanderson, K., Nichols, C.M., Lewis, T., McMeekin, T. and Nichols, P.D. 1999 Developments with Antarctic microorganisms: culture collections, bioactivity screening, taxonomy, PUFA production and cold-adapted enzymes. Curr. Opin. Biotech., v. 10, p. 240-246. Park, Y.C., Gunasekera, S.P., Lopez, J.V., McCarthy, P.J. and Wright, A.E. 2006 Metabolites from the marine-derived fungus Chromocleista sp. isolated from a deep-water sediment sample collected in the Gulf of Mexico. J. Nat. Prod., v. 69, n. 4, pp. 580-584. C Ca ap pí ít tu ul lo o 0 0 32 Pietra, F. 1990 A secret world: natural products of marine life. 1th ed., Birkhäuser Verlag (Ed.), Basel, 279 p. Pillay, T.V.R. 1997. Acuicultura: Principios y prácticas. 1ª ed., Limusa (Ed.), Balderas, 699 p. Pires, R. 1978 Plantas ictiotóxicas: aspecto da Botânica sistemática. In: Anais do 5º Simpósio de plantas medicinais do Brasil. Campinas. Sao Paulo: SBPC, pp. 37-41. Rahman, M.H., Ototake, M., Iida, Y., Yokomizo, Y. and Nakanishi, T. 2000 Efficacy of oiladjuvanted vaccine for coldwater disease in ayu, Plecoglossus altivelis. Fish Pathol., v. 35, n. 4, pp. 199-203. Rasmussen, R.S. and Morrissey, M.T. 2007 Marine biotechnology for production of food ingredients. Adv. Food Nutr. Res., v. 52, pp. 237-292. Redhead, K. and Wright, S.J. 1978 Isolation and properties of fungi that lyse blue-green algae. Appl. Environ. Microbiol., v. 35, n. 5, pp. 962-969. Sahoo, S.K., Giri, S.S. and Chandra, S. 2008 Effects of latency periods and injection doses with carp pituitary extract on spawning performance and egg quality of asian catfish, Clarias batrachus (Linn.). J. Appl. Aquacult., v. 20, n. 4, pp. 295-303. Schoonbee, H.J. and Prinsloo, J.F. 1986 Use of pituitary glands of the sharptooth catfish Clarias gariepinus in the induced spawning of the european common carp Cyprinus carpio and the chinese grass carp Ctenopharyngodon idella. Water S.A., v. 12, n. 4, pp. 235-237. Selvin, J., Huxley, A.J. and Lipton, A.P. 2004 Immunomodulatory potential of marine secondary metabolites against bacterial diseases of shrimp. Aquaculture, v. 230, n. 1-4, pp. 241-248. Selvin, J. and Lipton, A.P. 2004 Dendrilla nigra, a marine sponge, as potential source of antibacterial substances for managing shrimp diseases. Aquaculture, v. 236, n. 1-4, pp. 277283. Schrader, K.K. 2005 Evaluation of several commercial algicides for control of odor-producing cyanobacteria. J. Aquat. Plant Managen., v. 43, pp. 100-102. C Ca ap pí ít tu ul lo o 0 0 33 Shah, K.L. and Tyagi, B.C. 1986 An eye disease in silver carp Hypophthalmichthys molitrix held in tropical ponds, associated with the bacterium Staphylococcus aureus. Aquaculture, v. 55, n. 1, pp. 1-4. Shimonoseki, J.P. and Toshiaki, I. 1997 Preventive agent against infectious disease of crustacea. US Patent nº 5641761. Singh, W. 1989 Fecundity of silver carp Hypophthalmichthys molitrix (Val.). Indian J. Anim. Sci., v. 59, n. 3, pp. 392-394. Smith, J.L., Boyer, G.L. and Zimba, P.V. 2008 A review of cyanobacterial odorous and bioactive metabolites: impacts and management alternatives in aquaculture. Aquaculture, v. 280, n. 1-4, pp. 5-20. Spiridon, J. and Popa, V.I. 2008 Hemicelluloses: major sources, properties and applications. In: Monomers, polymers and composites from renewable resources. Belgacem, M.N. and Gandini, A. (eds.), pp. 289-304. Stone, M.J and Williams, D.H. 1992 On the evolution of functional secondary metabolites (natural products). Mol. Microbiol., v. 6, n. 1, pp. 29-34. Subasinghe, R.P., Barg, U. and Tacon, A. 2000 Chemicals in asian aquaculture: need, usage, issues and challenges. In: Use of chemicals in aquaculture in Asia. Proceedings of the meeting on the use of chemicals in aquaculture in Asia. Arthur, J.R., Lavilla-Pitogo, C.R. and Subasinghe, R.P. (eds.), Tigbauan, Iloilo, Philippines: Southeast Asian Fisheries Development Centre, Aquac. Dep., pp. 1-5. Sujatha, P., Bapi Raju, K.V.V.S.N. and Ramana, T. 2005 Studies on a new marine streptomycete BT-408 producing polyketide antibiotic SBR-22 effective against methicillin resistant Staphylococcus aureus. Microb. Res., v. 160, n. 2, pp. 119-126. Sundararaj, B.I. 1981 Reproductive physiology of teleost fishes. A review of present knowledge and needs for future research. FAO, Rome (Italy). 88 p. Project: FAO-FIOADCP/REP/81/16. Aquaculture Development and Coordination Programme. C Ca ap pí ít tu ul lo o 0 0 34 Suzuki, Y., Kobayashi, M., Nakamura, O., Aida, K. and Hanyu, I. 1988 Induced ovulation of the goldfish by oral administration of salmon pituitary extract. Aquaculture, v. 74, n. 3-4, pp. 379-384. Taylor, P.W. and Roberts, S.D. 1999 Clove oil: an alternative anaesthetic for aquaculture. N. Am. J. Aquacult., v. 61, n. 2, pp. 150-155. Tocher, D.R., Bendiksen, E.Å., Campbell, P.J. and Bell, J. G. 2008 The role of phospholipids in nutrition and metabolism of teleost fish. Aquaculture, v. 280, n. 1-4, pp. 21-34. Ufodike, E.B.C. and Amadi, A.O. 1991 Comparative assessment of the effects of homoplastic and heteroplastic hypophysation on ovogenesis, fecundity and fertility of the mirror carp. J. Aquat. Sci., v. 6, pp. 35-38. Unson, M.D., Holland, N.D. and Faulkner, D.J. 1994 A brominated secondary metabolite synthesized by the cyanobacterial symbiont of a marine sponge and accumulation of the crystalline metabolite in the sponge tissue. Marine biology, v. 119, n. 1, pp. 1-11. Valcárcel, C.M. y Gómez, H.A. 1988 Técnicas analíticas de separación. Reverté (Ed.), Barcelona. 778 p. Vanstone, W.E., Tiro, L.B., Villaluz, A.C., Singh, D.C.R., Kumagni, S., Dulduco, P.J., Barnes, M.M.L. and Duenas, C.E. 1977 Breeding and larval rearing of the milkfish Chanos chanos (Pisces: Chanidae). SEAFDEC Tech. Rep., n. 3, pp. 1-17. Varghese, T.J. and Rao, G.P.S. 1976 On the use of marine catfish pituitary glands for induced spawning of silver carp and catla. Curr. Sci., v. 45, n. 8, pp. 302. Venkateswarlu, Y., Rama Rao, M. and Venkatesham, U. 1998 A new dibromotyrosine-derived metabolito from the sponge P. purpurea. J. Nat. Prod., v. 61, n. 11, pp. 1388-1389. Verbist, J.F., Sallenave, C. and Pouchus, Y.F. 2000 Marine fungal substances. Stud. Nat. Prod. Chem., v. 24, n. 5, pp. 979-1092. C Ca ap pí ít tu ul lo o 0 0 35 Watanabe, K., Miyakado, M., Ohno, N., Okada, A., Yanagi, K. and Moriguchi, K. 1989 A polyhalogenated insecticidal monoterpene from the red alga Plocamium telfairiae. Phytochemistry, v. 28, n. 1, pp. 77-78. Watanabe, K., Umeda, K., Kurita, Y., Takayama, C. and Miyakado, M. 1990 Two insecticidal monoterpenes, telfairine and aplysiaterpenoid A, from the red alga Plocamium telfairiae: structure elucidation, biological activity, and molecular topographical consideration by a semiempirical molecular orbital study. Pest. Biochem. Physiol., v. 37, n. 3, pp. 275-286. Weston, D.P. 2000 Ecological effects of the use of Chemicals in aquaculture. In: Use of chemicals in aquaculture in Asia. Proceedings of the meeting on the use of chemicals in aquaculture in Asia. Arthur, J.R., Lavilla-Pitogo, C.R. and Subasinghe, R.P. (eds.), Tigbauan, Iloilo, Philippines: Southeast Asian Fish. Development Centre, pp. 23-30. Xu, R., Fazio, G. and Matsuda, S.P.T. 2004 On the origins of triterpenoid skeletal diversity. Phytochemistry, v. 65, n. 3, pp. 261-291. Yang, X.B., Gao, X.D., Xu, F.H., Song, Y.C. and Tan, R.X. 2005 Purification, characterization and enzymatic degradation of YCP, a polysaccharide from marine filamentous fungus Phoma herbarum YS4108. Biochimie, v. 87, n. 8, pp. 747-754. Yeo, I.K. 1998 Stimulatory effects of cyclic AMP on vitellogenin induction by estradiol 17-β in the primary culture of hepatocytes in the rainbow trout Oncorhynchus mykiss. J. Fish. Sci. Tech., v. 1, n. 2, pp. 153-158. Yue, C.J. and Jiang, Y. 2009 Impact of methyl jasmonate on squalene biosynthesis in microalga Schizochytrium mangrovei. Process Biochem., v. 44, n. 8, pp. 923-927. C CA AP PI IT TU UL LO O I I C Ca ap pí ít tu ul lo o I I 36 - CAPITULO I - Composición lipídica del hongo Schizochytrium aggregatum por cromatografía de gases – espectrometría de masas (GC-MS). I-1. Antecedentes El hongo heterotrófico Schizochytrium aggregatum es un organismo zoospórico perteneciente al Phylum Labyrinthulomycota, un conocido grupo de protistas abundantes en el medio estuarino y marino (Porter y Kirk, 1986; Porter, 1990). Recientemente se ha dado una particular atención a este grupo de protistas, desde que se ha demostrado que son una fuente muy productiva de importantes metabolitos primarios de interés industrial (Yongmanitchai y Ward, 1989). Estos organismos son capaces de biosintetizar ácidos grasos poliinsaturados, conocidos como HUFAs, a partir de fuentes no lipídicas convencionales (Barclay y col., 1994; Yokochi y col., 1998; Bowles y col., 1999). Su relevancia se ha incrementado por la demanda creciente de estos productos naturales de origen marino (Pomponi, 1999), potencialmente capaces de generar aplicaciones comerciales en nutraceútica, farmacéutica y acuicultura (Lewis y col., 1999; Nichols y col., 1999; Lewis y col., 2000). Los ensayos clínicos revelan la importancia de su valor terapéutico-nutricional, sobre todo en la prevención y tratamiento de enfermedades como la arterioesclerosis, trombosis, artritis y diversos tipos de cáncer (Simopoulos, 1991; Conner, 1997; Horrocks y Yeo, 1999; Tapiero y col., 2002). Los HUFAs son generalmente clasificados en dos grupos principales: los de la serie omega-3 (w3 o n-3) y los de la serie omega-6 (w6 o n-6). Dentro de los HUFAs w3 se encuentran los de cadena muy larga como el ácido docosahexaenoico [DHA, 22:6 (n-3)] y el ácido eicosapentaenoico [EPA, 20:5 (n-3)], los cuales desempeñan un importante papel estructural en los organismos vivos, ya que son constituyentes de las membranas celulares (Sargent y col., 1995). Dentro de los w6 HUFAs, el ácido araquidónico [AA, 20:4 (n-6)] es de particular interés, ya que es el precursor de muchos eicosanoides: prostaglandinas y leucotrienos (Vas Dias, 1995). C Ca ap pí ít tu ul lo o I I 37 Para los organismos marinos, tanto el EPA como el DHA son considerados ácidos grasos esenciales (EFAs), sobre todo durante las fases iniciales de los desarrollos larvarios (Watanabe y Kiron, 1994; Izquierdo, 1996). Se ha observado que la carencia nutricional de estos ácidos afecta directamente a la viabilidad larvaria, actuando negativamente sobre su crecimiento, metamorfosis y supervivencia (Rainuzzo y col., 1992; Sargent y col., 1999). Tradicionalmente, las fuentes más económicas y de gran disponibilidad de HUFAs han sido los aceites de pescado de origen marino, ya que los peces suelen acumular estos ácidos grasos eficientemente y en cantidades considerables bajo la forma esterificada (Ackman, 1982; Van der Wielen y Cabatingan, 1999). Sin embargo, dada la gran diversidad de ácidos grasos presentes en la composición de estos ésteres, y para mejorar los perfiles de HUFAs, el aceite crudo pasa por un proceso de refinamiento que incrementa los contenidos de EPA y DHA (Stout y col., 1990). No obstante, tales productos suelen retener un color y olor desagradable, limitando su uso como aditivo alimenticio humano y en fines farmacéuticos (Zaldívar, 1992; Kiffe y col., 1995). Además, la baja relación DHA/ EPA proporcionada por estas fuentes lipídicas ha demostrado ser nutricionalmente insuficiente como enriquecedor de organismos marinos, ya que éstos tienen preferencia por altos contenidos de DHA (Sargent y col., 1995). Aunque por síntesis química se pueden producir ácidos grasos (Rosu y col., 1998; Robles Medina y col., 1999), la extracción a partir de fuentes naturales parece ser lo más económico hasta el presente (Nilsson, 1996). En este sentido, la producción y extracción de HUFAs a partir de organismos autotróficos, como las microalgas, podría suponer la vía alternativa capaz de suplir el mercado (Balaban y col., 1996; Cohen, 1996). Sin embargo, los elevados costes de producción (Benemann, 1992; Coutteau y Sorgeloos, 1992) y los constantes riesgos de contaminación, suponen incertidumbre permanente en los sistemas de cultivo (Molina Grima y col., 1994). Con ello, la producción de estos micrófitos se ha restringido a unas pocas especies muy resistentes capaces de producir determinados metabolitos para fines específicos. No obstante, la producción de estos bioproductos por fermentación exhibe una perspectiva prometedora ya que permite la obtención de buenos C Ca ap pí ít tu ul lo o I I 38 perfiles de HUFAs a bajo coste (Swaaf y col., 1999; Fan y col., 2001). Así, los Labyrinthulomycotas podrían suponer respuestas a corto plazo de carácter renovable, frente a las tradicionales fuentes extractivas de origen marino (Bajpai y col., 1991; Bowles y col., 1999). En este momento, Schizochytrium aggregatum es la base de algunos productos destinados a la acuicultura. Utilizándose como enriquecedor de rotíferos (Brachionus sp.) y de Artemia (Artemia sp.) transfiriendo a las larvas de peces marinos perfiles de HUFAs compatibles con sus requerimientos nutricionales (Barclay y Zeller, 1996; Luizi y col., 1999; Harel y col., 2002). Además, también se presenta como sustituto parcial o total de las tradicionales microalgas utilizadas en larvicultura de moluscos (Boeing, 1997; Langdon y Önal, 1999) y crustáceos (Figueiredo y Narciso, 2006). Aparte de la importancia reseñada con estos HUFAs, S. aggregatum puede ser igualmente productor de interesantes metabolitos secundarios. De tal forma que, aunque sus perfiles de ácidos grasos estén descritos (Barclay y Zeller, 1996; Ashford y col., 2000), los antecedentes bibliográficos indican la presencia de glicolípidos, fosfolípidos, esfingolípidos y esteroles (colesterol, brasicasterol y estigmasterol) (Kendrick y Ratledge, 1992). Así pues, se ha seleccionado este interesante organismo para realizar un barrido de su fracción lipídica, buscando confirmar las sustancias anteriormente descritas en la literatura y aislar nuevas estructuras que proporcionen algún tipo de aprovechamiento industrial, o incluso demostrar algún tipo de bioactividad interesante. C Ca ap pí ít tu ul lo o I I 45 O O 57 21 O OO 14 17 22 O OO 16 17 23 O O19 57 24 HO 25 26 HO HO 27 Figura I-4. Componentes lipídicos volátiles identificados en Schizochytrium aggregatum. C Ca ap pí ít tu ul lo o I I 46 O H 10 28 Figura I-5. Fragmento lipídico volátil identificado en Schizochytrium aggregatum. OO OH HO HO OO OH 29 30 31 32 33 Figura I-6. Terpenoides volátiles identificados en Schizochytrium aggregatum. C Ca ap pí ít tu ul lo o I I 47 _ CO2 CO2 34 35 CO2 CO2 CO2 CO2 36 CO2 CO2 37 SO2NH 38 Figura I-7. Otros componentes volátiles identificados en Schizochytrium aggregatum. Obsérvese cómo las series homólogas de los componentes volátiles identificados se comportan de forma lineal en los gráficos que resultan de representar el tamaño de la cadena hidrocarbonada (Nº de C) frente al logaritmo del tiempo de retención (log Tr) (Figuras I-8 a I-13). n-Alcanos de Schizochytrium aggregatum 0 10 20 1,0819 1,0929 1,123 1,1502 1,172 Log tr Nº de C Figura I-8. Comportamiento en CG de los n-alcanos de Schizochytrium aggregatum (1; n= 10-12) y patrones comerciales (1; n= 9, y 13). C Ca ap pí ít tu ul lo o I I 48 1-Alquenos de Schizochytrium aggregatum 10 15 20 1,1218 1,1732 1,2145 Log tr Nº de C Figura I-9. Comportamiento en CG de los 1-alquenos de Schizochytrium aggregatum (6; n= 12-13, y 15) y el patrón comercial 1-octadeceno (6; n= 15). EMAGs iso -metil-ramificados de Schizochytrium aggregatum 1,14 1,16 1,18 1,2 1,22 1,24 1,26 0 5 10 15 20 Nº de C Log Tr Figura I-10. Comportamiento en CG de los ácidos grasos saturados de cadena isometil-ramificada identificados en Schizochytrium aggregatum (14; n= 8, y 12). FAs saturados lineales 13 13,5 14 14,5 15 15,5 16 16,5 1,1721 1,2016 1,2136 Log Tr Nº de C Figura I-11. Comportamiento en CG de los ácidos grasos saturados de cadena lineal identificados en Schizochytrium aggregatum (4; n= 12, y 14). C Ca ap pí ít tu ul lo o I I 49 EMAGs saturados de cadena lineal 0 5 10 15 20 25 1,133 1,159 1,18 1,202 1,222 1,236 1,253 1,268 1,302 1,326 Log Tr Nº de C Figura I-12. Comportamiento en CG de los ésteres metílicos de los ácidos grasos saturados de cadena lineal encontrados en Schizochytrium aggregatum (5; n= 10-18) y patrones comerciales (5; n= 9, y 18). EEAGs saturados de cadena lineal 0 5 10 15 20 1,173 1,194 1,216 1,233 1,248 1,278 Log Tr Nº de C Figura I-13. Comportamiento en CG de los ésteres etílicos de los ácidos grasos saturados de cadena lineal encontrados en Schizochytrium aggregatum (7; n= 10-14, y 16). C Ca ap pí ít tu ul lo o I I 50 I-3.2.2. Presencia de ésteres metílicos de ácidos grasos ramificados en la biomasa fúngica Los ácidos grasos metilramificados (14) están ampliamente distribuidos en la naturaleza (Duncan y col., 1974; Perry y col., 1979; Seyama y col., 1983; Thiel y col., 1999; Carballeira y col., 2001; Nechev y col., 2002). Ahora se sabe que se forman por incorporación selectiva del metilmalonil-CoA por el enzima “ácido-graso-sintetasa” (Seyama y col., 1981) y que este paso biogenético es característico de bacterias que producen relativamente altas concentraciones de estos ácidos grasos isoy anteiso-metilramificados, los cuales son, por tanto, aceptados como marcadores moleculares de la materia orgánica de origen bacteriano (Leo y Parker, 1966; Cooper y Blumer, 1968, Cranwell, 1973; 1974; Grimalt y Albaigés, 1990; Kaneda, 1991; Carballeira y col., 2001). Es por ello que la identificación en S. aggregatum de los ésteres metílicos de los ácidos que como el 14-metilpentadecanoico (14, n= 12) y 10-metilundecanoico (14, n= 8), dos derivados de ácidos grasos iso-metilramificados, es un indicio de la presencia de bacterias del genero Mycobacterium asociadas a este hongo (Lambert y col., 1986; Chou y col., 1996, Carballeira y col., 2001; Nechev y col., 2002). Aparte de su identificación por la huella dactilar en GC-MS, las iso-metilsustituciones propuestas en 14 se confirmaron por los fragmentos relativamente intensos que se observan en GC-MS para M+-43 junto a la disminución de las intensidades de los fragmentos M+-29 (Anderson, 1978). I-3.2.3. Presencia de ftalatos de dialquilo en la biomasa fúngica El ftalato de bis-(2-etilhexilo) se ha propuesto anteriormente como un auténtico metabolito en el hongo Penicillium olsonii (Amade y col., 1994). Sin embargo, esta sustancia, conocida tanto por las siglas internacionales DEHP {di(2-ethylhexyl)phthalate} como DOP (dioctylphthalate), se usa ampliamente como plasticida del PMMA {poly(methyl methacrylate)} y el PVC {poly(vinyl chloride)}. Esta sustancia emigra de los materiales plásticos y se introduce en los fluidos biológicos donde se bioacumula con el paso del tiempo, fenómeno que ha provocado incluso problemas de salud en seres humanos que han estado C Ca ap pí ít tu ul lo o I I 51 expuestos a diversos materiales plásticos (Freemantle, 2004). Es por ello que la identificación de las sustancias 36-37 en la biomasa fúngica de S. aggregatum plantea dudas sobre su origen debido a que el hongo vino empaquetado, precisamente, en recipientes de plástico. I-4. Conclusiones 1. Se identificaron en el micelio 38 tipos de componentes volátiles pertenecientes a los grupos de los n-alcanos (1), 1-alquenos (6), 1-alcanoles (2), 2-alquil-1-alcanoles (3), ácidos grasos libres - saturados (4) e insaturados (8, 9) -, ésteres metílicos y etílicos de ácidos grasos - saturados (5, 7) e insaturados (10, 11, 12) -, triglicéridos saturados (15, 16, 17), diglicéridos (18, 19), monoglicéridos insaturados (20), ceras - ésteres de ácidos y alcoholes grasos (21, 22, 23 y 24) -, esteroles (25, 26), triterpenos (27), catabolitos lipídicos (28), mono-, y sesquiterpenos de cadena cíclica y lineal (2933), ftalatos de dialquilo (36, 37) y otros (13, 34, 35, 38). 2. En este estudio no se ha encontrado indicio alguno de que la cepa estudiada de S. aggregatum produzca micotoxinas. Paralelamente, aporta importantes nutrientes y, por tanto, es potencialmente aplicable al campo de la alimentación funcional - animal o humana -. 3. Teniendo en cuenta el rendimiento en lípidos (9,47 %) de la extracción de la biomasa fúngica de S. aggregatum, se supone que este organismo puede ser usado para la producción de biodiesel. C Ca ap pí ít tu ul lo o I I 52 I-5. Experimental I-5.1. General La cromatografía en columna en fase normal se realizó sobre gel de sílice de la casa Scharlau de 0,060,20 mm (cabezas cromatográficas) y 0,040,06 mm (adsorbentes en fase húmeda), tanto a media presión (sistema para cromatografía Büchi) como a baja presión (motores de Fluid Metering Inc. acoplados en serie a columnas de la marca Ace Glass Inc.). La cromatografía en columna en fase reversa se realizó mediante columnas LiChroprep RP-18 (4063 m) integradas en circuitos para cromatografía a baja presión, basados en motores de Fluid Metering Inc. La filtración a través de gel (cromatografía de exclusión por tamaño molecular) se realizó por gravedad a través de Sephadex LH-20 lipofílico, eluyendo con CH2Cl2: MeOH (1: 1). La cromatografía en capa fina en fase normal se realizó sobre capas de 0,25 mm de espesor de la marca Tracer Analítica con mezclas de hexano, benceno, acetato de etilo, cloroformo y metanol en las proporciones que se especifican en cada caso. La cromatografía en capa fina en fase reversa se realizó sobre capas RP-18F254s de 0,25 mm de espesor de la marca Merck con mezclas de acetonitrilo: metanol: agua (80: 18: 2). En todos los casos, el revelado de las mismas se realizó por pulverización con oleum (ácido sulfúrico al 4 %, ácido acético al 80 % y agua al 16 %) y calentándolas a 120 ºC durante 20 min. La cromatografía HPLC semipreparativa se realizó bajo las siguientes condiciones: columna Waters ODS (4,6 x 250 mm, con partículas de 10 μm y tamaño de poro de 100 Å) para las separaciones en fase reversa, y una Alltech Econosphere de SiO2 (4,6 x 250 mm, con partículas de 10 μm y tamaño de poro de 100 Å) para las separaciones en fase normal. Ambas, en un aparato HPLC semipreparativo compuesto por una bomba isocrática Spectraphysics P100 y un detector UV Hewlett Packard 1050 de longitud de onda variable. En todos los casos se trabajó a temperatura ambiente (26 ºC). La cromatografía HPLC analítica se realizó en un aparato Shimadzu, modelo LC-9A, con un detector UV de la misma marca a 254 nm y un detector de índice de refracción asociado en serie. Las condiciones usadas fueron, bien una columna en fase normal con mezclas de n-hexano y EtOAc como eluyente a un flujo de 1,0 ml/ min., bien una columna Shodex OH Pak SB 806 HQ con agua con un 0,05 % de azida sódica como eluyente, también a un flujo de 1,0 ml/ min. Los datos espectroscópicos de RMN fueron proporcionados por aparatos de resonancia magnética nuclear, del tipo Bruker AC a 250 MHz, otro de tipo Bruker AMX a 300 MHz y mediante una unidad Varian Inova de 400 MHz. Se utilizó tetrametilsilano como referencia interna en los espectros de protón y cloroformo deuterado ( 77,0) o metanol deuterado ( 49,0) de la casa Aldrich para calibrar los espectros de carbono 13. La cromatografía analítica en fase gaseosa (GC-MS) se realizó en un aparato Saturn de Varian en las siguientes condiciones: columna CP-Sil 8 Low bleed, temperatura del inyector de 270 ºC durante 10 min.; condiciones de split inicial on, 0,01 min. off y 5 min. on; horno programado a 50 ºC durante 5 min., calentado a 15 ºC/ min. hasta 250 ºC y mantenido a esta temperatura durante 10 min. (tiempo total de análisis de 28,33 min. para cada muestra); flujo de 1 ml/ min.; detector de masas en modo EI (rango de m/ z de 20 a 400). Tiempos de retención de referencia se obtuvieron con patrones de alcanos (Dr. Ehrenstorfer GmbH Alkanes-Mix 10), ésteres metílicos de ácidos grasos (SupelcoTM 37 Component FAME Mix), 1-alquenos (Fluka Chemika) y 1-alcanoles (Fluka Chemika). El resto se asignaron por semejanza de la huella MS observada con las registradas en diferentes bases de datos contenidas en el instrumento. C Ca ap pí ít tu ul lo o I I 53 I-5.2. Obtención de la cepa La cepa se adquirió de Aquafauna Bio-Marine, Hawthorne, California, USA. El hongo Schizochytrium aggregatum (American Type Culture Collection 20888) fue producido por la empresa citada en fermentadores según los procedimientos descritos por Barclay (1994) y Barclay y col. (1994) y concentrado por centrifugación, secado por aspersión y empaquetado al vacío (Barclay y Zeller, 1996). I-5.3. Análisis químico de la biomasa fúngica I-5.3.1. Obtención del extracto y fraccionamiento por polaridad Una muestra de 110 g de Schizochytrium aggregatum se extrajo por maceración (diclorometano, x3, 24 h c/ u, y metanol, x3, 24 h c/ u). Los extractos se filtraron con papel Watman nº 1 y evaporaron en rotavapor. Los extractos se reunieron y desecaron a alto vacío para almacenarlos bajo nitrógeno con el nombre de “extracto bruto”, el cual, fue sometido posteriormente a partición por polaridades según el esquema de la Figura I-1. El espectro de 1H-RMN delató siete protones de ácidos carboxílicos a δ 12,511,2; aromáticos a δ 8,57,0; olefínicos a δ 5,95,0; geminales a heteroátomos a δ 4,33,5 y alifáticos a δ 3,00,6. A dicho extracto bruto se le añadieron 200 ml de agua y 200 ml de cloruro de metileno; las fases se separaron en embudo de decantación y la acuosa se reextrajo con cloruro de metileno (x2, 200 ml c/ u). Las capas orgánicas se reunieron y el disolvente se evaporó para dar 9,64 g de la fracción “liposoluble-0 (Sa-L-0)”. La fase acuosa se extrajo con sec-butanol (x3, 200 ml c/ u) para dar 0,29 g de la fracción “hidrosoluble-1 (Sa-H-1)”. A la fracción “liposoluble-0 (Sa-L-0)” se le añadieron 20 ml de agua, 180 ml de metanol y 200 ml de n-hexano; las fases se decantaron y la acuosa-metanólica se reextrajo con n-hexano hasta la decoloración de éste. Las fases n-hexánicas se reunieron y el disolvente se eliminó, resultando 8,64 g de un semisólido amarillo que denominamos fracción “liposoluble-1 (Sa-L-1)”. A la fase acuosa-metanólica resultante se le añadieron 160 ml de agua, resultando una fase H2O: MeOH (1: 1) que se extrajo con CH2Cl2 (x3, 200 ml c/ u). Las fases orgánicas reunidas se evaporaron para dar 0,75 g de la denominada fracción “liposoluble-2 (Sa-L-2)”. A la fase acuosametanólica resultante se le añadió más metanol y evaporó hasta sequedad, lo que rindió 0,215 g de la fracción “liposoluble-3 (Sa-L-3)”. Estudio de la fracción “Extracto bruto” Por GC-MS resultaron identificadas las siguientes sustancias volátiles: Éster 3-(octadeciloxi) propílico del ácido esteárico (23; Tr= 13,631) Éster metílico del ácido dodecanoico (5; n= 10; Tr= 14,343) Ácido tetradecanoico (4; n= 12; Tr= 14,746) 1-Hexadeceno (6; n= 13; Tr= 14,851) Éster etílico del ácido dodecanoico (7; n= 10; Tr= 14,885) Éster metílico del ácido tridecanoico (5; n= 11; Tr= 15,128) Éster dibutilico del ácido hexanodioico (34; Tr= 15,597) Éster bis(2-metilpropílico) del ácido hexanodioico (35; Tr= 15,601) Éster etílico del ácido tridecanoico (7; n= 11; Tr= 15,632) Tetradecanoato de metilo (5; n= 12; Tr= 15,885) C Ca ap pí ít tu ul lo o I I 54 Ácido hexadecanoico (4; n= 14; Tr= 16,227) Ácido 7-tetradecenoico (8; n= 5, m= 5; Tr= 16,331) Éster etílico del ácido tetradecanoico (7; n= 12; Tr= 16,354) Éster metílico del ácido pentadecanoico (5; n= 13; Tr= 16,593) N-Butil-bencenosulfonamida (38; Tr= 16,655) Éster bis(2-metilpropílico) del ácido 1,2-bencenodicarboxílico (37; Tr= 16,968) Éster etílico del ácido pentadecanoico (7; n= 13; Tr= 17,045) Éster metílico del ácido (Z)-9-hexadecenoico (10; n= 5, m= 7; Tr= 17,140) Éster metílico del ácido hexadecanoico (5; n= 14; Tr= 17,259) Éster metílico del ácido 14-metil-pentadecanoico (14; n= 12; Tr= 17,267) 9-Hexadecenoato de etilo (11; n= 5, m= 7; Tr= 17,570) Éster etílico del ácido hexadecanoico (7; n= 14; Tr= 17,683) Éster metílico del ácido heptadecanoico (5; n= 15; Tr= 17,904) Éster metílico del ácido 3-octil-oxiranooctanoico (13; n= 7, m= 7; Tr= 18,286) Éster 2-hidroxi-1-(hidroximetíl) etílico del ácido (Z)-9-octadecenoico (20; Tr= 18,413) Éster metílico del ácido 9-octadecenoico (10; n= 7, m= 7; Tr= 18,416) Éster metílico del ácido octadecanoico (5; n= 16; Tr= 18,533) Éster eicosílico del ácido (Z)-9-hexadecenoico (24; Tr= 18,764) Éster etílico del ácido octadecanoico (7; n= 16; Tr= 18,954) Éster metílico del ácido 3-pentil-oxiranoundecanoico (13; n= 4, m= 10; Tr= 19,732) Éster metílico del ácido nonadecanoico (5; n= 18; Tr= 20,024) Estudio de la fracción “liposoluble-0 (Sa-L-0)” Por GC-MS resultaron identificadas las siguientes sustancias volátiles: Tridecano (1; n= 10; Tr= 12,384) 10-Undecenal (28; Tr= 13,125) Éster metílico del ácido dodecanoico (5; n= 10; Tr= 14,422) Ácido tetradecanoico (4; n= 12; Tr= 14,862) Éster 2-(octadeciloxi) etílico del ácido hexadecanoico (22; Tr= 15,016) Tetradecanoato de metilo (5; n= 12; Tr= 15,957) Ácido hexadecanoico (4; n= 14; Tr= 16,354) N-Butil bencensulfonamida (38; Tr= 16,786) Éster metílico del ácido (Z)-9-hexadecenoico (10; n= 5, m= 7; Tr= 17,230) Éster metílico del ácido hexadecanoico (5; n= 14; Tr= 17,344) Éster 1-(hidroximetil)-1,2-etanodiilico del ácido hexadecanoico (19; Tr= 17,714) Éster metílico del ácido (Z)-11-octadecenoico (10; n= 5, m= 9; Tr= 18,514) Colesterol (25; Tr= 18,870) 3,7,11-Trimetil-1-dodecanol (33; Tr=19,038) Estudio de la fracción “liposoluble-1 (Sa-L-1)” Por CCF analítica se identificaron seis sustancias. En el espectro de 1H-RMN de esta mezcla se detectaron protones olefínicos (δ 5,15,3), geminales a heteroátomos ( 4,04,2) y los propios de cadenas hidrocarbonadas alifáticas (δ 2,90,7). En el espectro de 13C-RMN se observaron seis carbonos carbonílicos (δ 178187), 16 carbonos olefínicos (δ 130,939 y 128,859), 4 carbonos geminales a heteroátomos (δ 77,54365,914) y 34 señales de cadenas alifáticas (δ 37,46914,132). C Ca ap pí ít tu ul lo o I I 61 Kaneda, T. 1991 Isoand anteiso-fatty acids in bacteria: biosynthesis, function and taxonomic significance. Microbiol. Reviews, v. 55, n. 2, pp. 288-302. Kendrick, A. and Ratledge, C. 1992 Lipids of selected molds grown for production of n-3 and n-6 polyunsaturated fatty acids. Lipids, v. 27, n. 1, pp. 15-20. Kiffe, M., Nokihara K. and Matsunaga, T. 1995 Purification of docosahexaenoic acid (DHA) produced by marine microalgae Isochrysis galbana. J. Marine Biotechnol., v. 2, n. 3, pp. 139-142. Kupchan, S.M, Briton, R.W., Ziegler, M.F. and Siegel, C.W. 1973 Bruceatin, a new potent antileukemic simaroubolide from B. antidysenterica. J. Org. Chem., v. 38, pp. 178-179. Lambert, M.A., Moss, C.W., Silcox, V.A. and Good, R.C. 1986 Analysis of mycolic acid cleavage products and cellular fatty acids of Mycobacterium species by capillary gas chromatography. J. Clin. Microbiol., v. 23, n. 4, pp. 731-736. Langdon, C. and Önal, E. 1999 Replacement of living microalgae with spray-dried diets for the marine mussel Mytilus galloprovincialis. Aquaculture, v. 180, n. 3-4, pp. 283-294. Leo, R.G., Parker, P.L. 1966 Branched chain fatty acids in sediments. Science, v. 152, n. 3722, pp. 649-650. Lewis, T.E., Nichols, P.D. and McMeekin, T.A. 1999 The biotechnological potential of thraustochytrids. Mar. Biotechnol., v. 1, n. 6, pp. 580–587. Lewis, T.E., Nichols, P.D. and McMeekin, T.A. 2000 Evaluation of extraction methods for recovery of fatty acids from lipid-producing microheterotrophos. J. Microb. Methods, v. 43, n. 2, pp. 107-116. Luizi, F.S., Gara, B., Shields, R.J. and Bromage, N.R. 1999 Further description of the development of the digestive organs in Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus) larvae, with notes on differential absorption of copepod and Artemia prey. Aquaculture, v. 176, n. 1-2, pp. 101-116. C Ca ap pí ít tu ul lo o I I 62 Molina Grima, E., Sánchez Pérez, F., García Camacho, F., Acién Fernández, F.G., López Alonso, D. and Segura del Castillo, C.I, 1994 Preservation of the marine microalgae, Isochrysis galbana: influence on the fatty acid profile. Aquaculture, v. 123, n. 3-4, pp. 377-385. Nechev, J., Christie, W.W., Robaina, R., de Diego, F.M., Ivanova, A., Popov, S. and Stefanov, K. 2002 Chemical composition of the sponge Chondrosia reniformis from the Canary Islands. Hydrobiologia, v. 489, n. 1-3, pp. 91-98. Nichols, D., Bowman, J., Sanderson, K., Nichols, C.M., Lewis, T., McMeekin, T. and Nichols, P.D. 1999 Developments with Antarctic microorganisms: culture collections, bioactivity screening, taxonomy, PUFA production and cold-adapted enzymes. Curr. Opin. Biotech., v. 10, n. 3, pp. 240-246. Nilsson, W.B. 1996 Supercritical fluid extraction and fractionation of fish oils. In: Supercritical fluid technology in oil and lipid chemistry. King, J.W. and List, G.R. (eds.), Am. Oil Chem. Soc., Champain, Illinois, pp. 180-212. Perry, G.J., Volkman, J.K. and Johns, R.B. 1979 Fatty acids of bacterial origin in contemporary marine sediments. Geoquim. Cosmoch. Acta, v. 43, n. 11, pp. 1715-1725. Pomponi, S.A. 1999 The bioprocess-technological potential of the sea. J. Biotech., v. 70, n. 1-3, pp. 5-13. Porter, D. 1990 Phylum Labyrinthulomycota. In: Handbook of protoctista. Margulis, L., Corliss, J.O., Melkonian, M. and Chapman, D.J. (eds.), Jones and Bartlett Publishers, Boston, pp. 388-398. Porter, D. and Kirk Jr., P.W. 1986 Marine Fungi: Taxonomic and ecological considerations. II. Lower fungi. In: Frontiers in applied microbiology. Mukerji, K.G., Singh, V.P. and Garg, K.L. (eds.), Print House, Lucknow, pp. 235-246. C Ca ap pí ít tu ul lo o I I 63 Rainuzzo, J.R., Reitan K.I. and Jorgensen, L. 1992 Comparative study on fatty acid and lipid composition of four marine fish larvae. Comp. Biochem. Physiol.: B, v. 103, pp. 21-26. Robles Medina, R., Esteban Cerdán, L., Giménez Giménez, Camacho Páez, B., Ináñez González, M.J. and Molina Grima, E. 1999 Lipase-catalyzed esterification os glycerol and polyunsaturated fatty acids from fish and microalgae oils. J. Biotech., v. 70, n. 1-3, pp. 379-391. Rosu, R., Iwasaki, Y., Shimidzu, N., Doisaki, N. and Yamane, T. 1998 Enzymatic synthesis of glycerids from DHA-enriched PUFA ethyl ester by glycerolysis under vacuum. J. Mol. Catalysis: B, v. 4, n. 4, pp. 191-198. Sargent, J.R., Bell, J.G., Bell, M.V., Henderson, R.J. and Tocher, D.R. 1995 Dietary origins and funtions of long-chain (n-3) polyunsaturated fatty acids in marine fish. Mar. Biotechnol., v. 3, pp. 26-28. Sargent, J.R., McEvoy, L., Estevez, A., Bell, G., Bell, M., Henderson, J. and Tocher, D. 1999 Lipid nutrition of marine fish during early development: current status and future directions. Aquaculture, v. 179, n. 1-4, pp. 217-229. Seyama, Y., Ohashi, K., Imamura, T., Kasama, T. and Otsuka, H. 1983 Branched chain fatty acids in phospholipids of Guinea pig harderian gland. J. Biochem., v. 94, pp. 1231-1239. Seyama, Y., Otsuka, H., Kawaguchi, A. and Yamakawa, T. 1981 Fatty acid synthetase from the harderian gland of Guinea pig: Biosynthesis of methyl-branched fatty acids. J. Biochem., v. 90, n. 3, pp. 789-797. Simopoulos, A.P. 1991 Omega-3 fatty acids in health and disease and in growth and development. Am. J. Clin. Nutr., v. 54, n. 3, pp. 438-463. Stout, V.F., Nilsson, W.B. and Krzynowenk, H. 1990 Fractionation of fish oils and their fatty acids. In: Fish oils and Nutrition. Stansby, M.E. (ed.), Seattle, 1908 p. C Ca ap pí ít tu ul lo o I I 64 Swaaf, M.E., Rijk, T.C., Eggink, G. and Sijtsma, L. 1999 Optimisation of docosahexaenoic acid production in battch cultivations by Crypthecodinium cohnii. J. Biotech., v. 70, n. 13, pp. 185-192. Tapiero, H., Nguyen Ba, G. Couvreur, K.D. and Tew, K.D. 2002 Polyunsaturated fatty acids (PUFA) and eicosanoids in human health and pathologies. Biomed. Pharmacother., v. 56, n. 5, pp. 215-222. Van der Wielen, L.A.M. and Cabatingan, L.K. 1999 Fishing products from the sea-racional downstream processing of marine bioproducts. J. Biotech., Nutrit. Mark., v. 70, n. 1, pp. 363-371. Thiel, V., Jenisch, A., Wörheide, G., Löwenberg, A., Reitner, J. and Michaelis, W. 1999 Mid-chain branched alkanoic acids from “living fossil” demosponges: a link to ancient sedimentary lipids? Org. Geochem., v. 30, n. 1, pp. 1-14. Vas Dias, F.W. 1995 Eicosanoids - A brief overview. In: Fish oil: technology, nutrition and marketing. Hamilton, R.J. and Rice, R.D. (eds.), Barnes, P.J. and Associed, Bridgwater, 138 p. Watanabe, T. and Kiron, V. 1994 Prospects in larval fish dietetics. Aquaculture, v. 124, n. 14, pp. 223-251. Yokochi, T., Honda, D., Higashihara, T. and Nakahara, T. 1998 Optimization of docosahexaenoic acid production by Schizochytrium limacinum SR21. Appl. Microbiol. Biotech. v. 49, n. 1, pp. 72-76. Yongmanitchai, W.Y and Ward, O.P. 1989 Omega-3 fatty acids: alternative sources of production. Proc. Biochem., v. 24, n. 4, pp. 117-125. Zaldivar, J.L. 1992 Positivas proyecciones para los aceites de pescado. Chile Pesq., v. 70, pp. 35-38. C CA AP PI IT TU UL LO O I II I C Ca ap pí ít tu ul lo o I II I 65 - CAPITULO II - Composición lipídica del hongo Paecilomyces variotii aislado del medio marino. II-1. Antecedentes El hongo filamentoso Paecilomyces variotii es conocido en biotecnología por sus múltiples aplicaciones. La novedad en este caso es que se aisló a partir de una muestra de agua colectada en la playa de La Laja, Gran Canaria, por lo que se ha estimado que procedía su reestudio. El primer paso consistió en una revisión bibliográfica, de la que resultaron los siguientes datos. Aldridge y col. (1980) describieron el aislamiento de un anhídrido (1) a partir de P. variotii. O HO2C O O 1 Figura II-1. Anhídrido (1), de P. variotii. Waehner y col. (1983) aportaron un procedimiento para obtener proteína unicelular a partir de P. variotii. Udall y col. (1984) fabricaron alimentos de origen microbiano con P. variotii, y estudiaron las concentraciones adecuadas para el consumo humano. En relación con esto, Bajpai y Bajpai (1987) usaron P. variotii TCRDC-M5 para producir proteína unicelular con un rendimiento de 25 g de peso seco de biomasa por litro en un fermentador de laboratorio. También Silva y col. (1995) abordaron la obtención de proteína a partir de P. variotii, y, finalmente, C Ca ap pí ít tu ul lo o I II I 66 Varsami y col. (1999) enriquecieron tallos de desecho de soja con la proteína fúngica de P. variotii. Haneishi y col. (1988) aislaron cornexistina (2), originalmente antlercidina, de P. variotii SANK 21086. Tras purificarlo por cromatografía de exclusión molecular (Sephadex LH-20) y cristalización en diclorometano, se obtuvo con un rendimiento de 397 g/ l. Su actividad herbicida fue demostrada tanto por aplicación foliar como en suelo. Nakajima y col. (1991) aislaron un metabolito que también identificaron como Cornexistina (2) a partir del filtrado del cultivo de P. variotii SANK 21086. Estructuralmente se agrupó en los “nonadridos” después de un estudio espectroscópico y cristalográfico - difracción de rayos X -. Desde el punto de vista de su actividad biológica, de nuevo, presentó acción herbicida frente a plantas anuales y perennes, tanto monocomo dicotiledoneas, lo que supuso potencial protección para los cultivos de maíz. Amagasa y col. (1994) cuantificaron la actividad al descubrir que el metabolito Cornexistina (2) presentaba acción herbicida sobre diversos semilleros a la concentración de 0,5 kg/ ha respetando la planta del maíz (Zea mays L.); no deja de ser interesante el que dicho efecto resulte inhibido por los intermedios del ciclo TCA. Takahashi y col. (1994) aportaron nuevos datos sobre Cornexistina (2) confirmando su fórmula molecular, C16H20O6, y el mencionado esqueleto de “nonadrido” (2). Además, descubrieron que también presenta actividad frente a hongos y bacterias gram positivas y negativas, con LD50 de 100 mg/ kg. Finalmente, Fields y col. (1995) aislaron hidroxicornexistina (3) por fermentación de P.variotii, y Takeshiba y col. (1990) prepararon diversos derivados de cornexistina (4, R1, R2= -CO2H, CONH2; R1, R2= C(:X)YC(:Z), X,Y,Z= O, NH; R3, R6= OH, SH, NH2, X; R4, R5= H,OH; o R4, R5= O, NH; A= enlace simple, O; los grupos SH, -NH2, -CO2H, -CONH2, NH pueden estar protegidos o en forma de sus sales) y los ensayaron como inhibidores de la germinación, herbicidas y/ o reguladores del crecimiento de las plantas (hormonas vegetales). C Ca ap pí ít tu ul lo o I II I 67 OH OH O CH2R O O O Me Me R2 R1 Me A R5 R4 R6 R3 2, R = H 3, R = OH 4 Figura II-2. Cornexistina (2), Hidroxicornexistina (3) y derivados (4). Ayer y col. (1991) aislaron P. variotii Bainier a partir de larvas del escarabajo del pino, lo cultivaron en medio líquido y extrajeron dos metabolitos nuevos con el esqueleto de 1H-nafto [2,3-c] piran-1-ona. Sus estructuras moleculares, semiviriditoxina (5) y ácido semiviriditóxico (6) fueron elucidadas por métodos químicos y espectroscópicos. O OOHOH OMe H RO2C 5, R = Me 6, R = H Figura II-3. Semiviriditoxina (5) y ácido semiviriditóxico (6). Horn y col. (1992) identificaron las Sphingofunginas E y F (7, 8) en el caldo de cultivo de P. variotii. Al igual que la Sphingofungina B, inhibieron serinapalmitoiltransferasa a concentración nanomolar. Además, Sphingofungina E resultó con actividad fungicida frente a varios hongos implicados en diversas dolencias humanas. C Ca ap pí ít tu ul lo o I II I 68 CO2H O OH OH OH NH2 R 7, R = OH 8, R = H Figura II-4. Sphingofunginas E (7) y F (8). Horn y col. (1993) identificaron dos ácidos eicosenoicos con actividad fungicida en el caldo de cultivo de P. variotii. Leal (1994), estudió la estructura de los polisacáridos hidrosolubles de P. variotii por GC, GC-MS y RMN. Domenech y col. (1994) ampliaron el estudio de los polisacáridos de las paredes celulares de P. variotii a cuatro variedades del mismo hongo. Dechkan-Khodzhaeva y col. (1997) estudiaron los fosfolípidos y ácidos grasos de ambas formas, micelial y levadura, del hongo P. variotii con el resultado de la identificación de un nuevo ácido graso, el neo-iso-pentadecanoico. Terekhova y col. (1997) aislaron del caldo de cultivo de P. variotii el antibiótico de biogénesis mixta ascofuranona (9), el cual había sido aislado previamente de Ascochyta visiae Libert. Finalmente, Babitskaya y Shcherba (2002) aportaron luz sobre la naturaleza de los pigmentos de melanina de P. variotii. C Ca ap pí ít tu ul lo o I II I 69 Me OH Cl HO OHC O O H H 9 Figura II-5. Ascofuranona (9). En cuanto a las aplicaciones biotecnológicas, Behera y col. (2000) encontraron que P. variotii es un hongo útil en la biotransformación del latex de Calotropis procera al enriquecerlo en heptano, por lo que se considera el proceso como una fuente renovable de petróleo y compuestos químicos. Por otra parte, Deodhar y col. (2002) han aplicado el hongo P. variotii en la biorreducción de terpenoides cíclicos y aldehídos aromáticos; Vanhulle y col. (2003) lo han aplicado para el tratamiento y detoxificación de líquidos de desecho - aguas residuales y fluidos agrícolas -; Sachan y col. (2006) lo aplicaron en la biotransformación del ácido p-coumarico; Mukherjee y col. (2006) en la transformación del ácido sinaptico (10) en ácido siringico (11), feromona del coleóptero Stenus comma; Ghosh y col. (2006) lo utilizaron en la transformación del ácido ferúlico en ácido vanillico; Saad y Hamdy (2004) lo utilizaron para producir el enzima Quitinasa; y, finalmente, Battestin y Macedo (2007) lo utilizaron para producir el enzima Tannasa. En cuanto a aplicaciones agrícolas, Wagid y col. (2001) han aplicado el hongo en el control de la enfermedad que otro hongo, Fusarium sp. produce en el cultivo del tomate. El mecanismo de acción es, obviamente, la antibiosis. C Ca ap pí ít tu ul lo o I II I 76 O O 7 9 7 n=0,4 O O H O HO 7 9 5 O O 9 14 O O 30 31 32 33 n 912 Figura II-10. Componentes lípídicos identificados en Paecilomyces variotii. C Ca ap pí ít tu ul lo o I II I 77 O H O OCH3 91 O 34 35 Figura II-11. Fragmentos lipídicos - catabolitos - identificados en Paecilomyces variotii. O H 2 62610 36 37 Figura II-12. Terpenoides identificados en Paecilomyces variotii. O O 38 Figura II-13. Componente de la ruta del ácido shikímico identificado en Paecilomyces variotii. C Ca ap pí ít tu ul lo o I II I 78 CO2 CO2 O O O O CO2 CO2 CO2 CO2 39 40 41 42 S O O NH 43 44 OH 45 46 OH Figura II-14. Otros componentes identificados en el extracto del micelio de Paecilomyces variotii. C Ca ap pí ít tu ul lo o I II I 79 O OO O H H 4 7 47 Figura II-15. Componentes lípídicos identificados en Paecilomyces variotii. Obsérvese cómo las series homólogas de los componentes volátiles identificados se comportan de forma lineal en los gráficos que resultan de representar el tamaño de la cadena hidrocarbonada (Nº de C) frente al logaritmo del tiempo de retención en GC (log Tr) (Figuras II16 a II-20). n-Alcanos 0 10 20 1,0819 1,0893 1,1226 1,1547 1,172 1,1943 Log tr Nº de C Figura II-16. n-Alcanos identificados en Paecilomyces variotii y patrones. 1-Alquenos 0 10 20 1,095 1,145 1,173 1,214 Log tr Figura II-17. 1-Alquenos identificados en Paecilomyces variotii y patrones. C Ca ap pí ít tu ul lo o I II I 80 1-Alcanoles 0 10 20 30 1,2011 1,2132 1,2137 1,3519 Log tr Nº de C Figura II-18. 1-Alcanoles identificados en Paecilomyces variotii y patrones. FAs saturados lineales 0 5 10 15 20 25 1,09 1,17 1,2 1,21 1,23 1,25 1,25 1,28 Log Tr Nº de C Figura II-19. Ácidos grasos saturados de cadena lineal identificados en Paecilomyces variotii y patrones. FAMES saturados de cadena lineal 0 5 10 15 20 25 1,201 1,222 1,238 1,255 1,269 1,305 1,326 Log Tr Nº de C Figura II-20. Ésteres metílicos de ácidos grasos saturados de cadena lineal identificados en Paecilomyces variotii y patrones. C Ca ap pí ít tu ul lo o I II I 81 II-3.2.1.1. Presencia de ésteres metílicos de ácidos grasos ramificados en el micelio Los ácidos grasos metilramificados están ampliamente distribuidos en la naturaleza (Duncan y col., 1974; Perry y col., 1979; Seyama y col., 1983; Thiel y col., 1999; Carballeira y col., 2001; Nechev y col., 2002). Ahora se sabe que se forman por incorporación selectiva del metilmalonil-CoA por el enzima “ácido-graso-sintetasa” y que este paso biogenético es característico de bacterias que producen relativamente altas concentraciones de estos ácidos grasos iso-metilramificados, los cuales son, por tanto, aceptados como marcadores moleculares de la materia orgánica de origen bacteriano (Leo y Parker, 1966; Cooper y Blumer, 1968, Cranwell, 1973, 1974; Grimalt y Albaigés, 1990, Kaneda, 1991; Carballeira y col., 2001). Es por ello que la identificación en P. variotii del éster metílico del ácido 14-metilpentadecanoico 25 - derivado de un ácido graso iso-metilramificado -, es un indicio de la presencia de bacterias del genero Mycobacterium asociadas a este hongo (Lambert y col., 1986; Chou y col., 1996, Carballeira y col., 2001; Nechev y col., 2002). Aparte de su identificación por la huella dactilar en GC-MS, la iso-metilsustitución propuesta en 25 se confirmó por el fragmento relativamente intenso que se observa en GC-MS para M+-43 (m/ z 227) junto a la disminución de la intensidad del fragmento M+-29 (m/ z 241) (Andersson, 1978). II-3.2.1.2. Presencia de ftalatos de dialquilo en el micelio El ftalato de bis-(2-etilhexilo) se ha propuesto anteriormente como un auténtico metabolito en el hongo Penicillium olsonii (Amade y col., 1994). Sin embargo, esta sustancia, conocida tanto por las siglas internacionales DEHP {di(2-ethylhexyl)phthalate} como DOP (dioctylphthalate), se usa ampliamente como plasticida del PMMA {poly(methyl methacrylate)} y el PVC {poly(vinyl chloride)}. Esta sustancia emigra de los materiales plásticos y se introduce en los fluidos biológicos donde se bioacumula con el paso del tiempo, fenómeno que ha provocado incluso problemas de salud en seres humanos que han estado expuestos a materiales plásticos (Freemantle, 2004). Es por ello que la identificación de las sustancias 41 y 42, en el micelio de P. C Ca ap pí ít tu ul lo o I II I 82 variotii plantea dudas sobre su origen debido a que el cultivo masivo se realizó, precisamente, en recipientes de plástico (veáse parte experimental). Así, pués, se supone que estas sustancias son artefactos o productos de transformación de los mismos. II-3.2.2. Componentes no volátiles identificados en el micelio de P. variotii El material “no volátil” obtenido a partir del micelio fue fraccionado y analizado por espectroscopía (fundamentalmente RMN en una y dos dimensiones, IR y EM). Entre estos componentes lipídicos no volátiles se pudieron purificar y caracterizar sólo las sustancias mayoritarias: trioleína (26), peróxido del ergosterol (48) y D-(+)-glucosa. La trioleína (26) se aisló pura a partir de una de las fracciones menos polares del extracto del micelio como un aceite amarillento. En su espectro de IR se observan bandas a 3029, 3007, 1653 (CH=CH), a 1739 (C=O) y a 1233 (C-O) características de ésteres insaturados. En su espectro de 1H-RMN se observan seis protones olefínicos a  5,315,25; cinco protones geminales a oxígeno a  5,22 (1H; dt; J= 5,2 Hz; J= 6,4 Hz);  4,26 (2H; dd; J= 5,2 Hz; J= 13,1 Hz) y  4,11 (2H; dd; J= 6,4 Hz; J= 13,1 Hz); seis hidrógenos en alfa a carbonilo a  2,27; doce hidrógenos alílicos a  2,01; seis hidrógenos en beta a carbonilo a  1,61; sesenta hidrógenos de cadenas hidrocarbonadas lineales a  1,27 y nueve hidrógenos de los metilos terminales a  0,90. En su espectro de 13C-RMN se observan tres señales correspondientes a carbonilos de ésteres a  173,30; 173,20 y 172,80; carbonos que conforman dobles enlaces a  130,20; 130,00; 129,90; 129,70 y 129,60; carbonos enlazados a oxígeno a  68,90 y 62,10 -x2y señales típicas de metilenos y metilos a  34,2– 14,0 características de cadenas hidrocarbonadas lineales. En el espectro 1H-1H-COSY se observa correlación entre el dt a  5,22 y los dos dd a δ 4,26 y 4,11 correspondientes a los protones geminales a oxígeno de la unidad de glicerol. También entre los protones olefínicos a δ 5,27 y los metilenos alílicos a  2,01. C Ca ap pí ít tu ul lo o I II I 83 En el espectro HSQC se observa correlación entre el dt a  5,22 correspondiente al metino geminal a oxígeno de la unidad de glicerol y el carbono enlazado a dicho oxígeno a  68,90. También entre los dos dd a δ 4,26 y 4,11 correspondientes a los protones metilénicos geminales a oxígeno de la misma unidad de glicerol y los carbonos enlazados a dichos oxígenos, que aparecen ambos a δ 62,10. También entre un triplete a δ 2,27 correspondiente a los protones en  a carbonilo y los carbonos en  a carbonilo a δ 34,15. También entre un multiplete a δ 2,01 correspondiente a los protones alílicos y los carbonos en  a doble enlace a δ 27,20. En el espectro HMBC se observa correlación entre los protones en  a carbonilo a  2,27 y los carbonos de metilenos saturados a δ 25,60 y 29,60. También se observa correlación entre el dt a  5,22 correspondiente al metino geminal a oxígeno de la unidad de glicerol y los carbonos metilénicos de dicha unidad de glicerol a  62,10 por un lado y uno de los carbonilos de los ésteres a  172,80. También entre los dos dd a δ 4,26 y 4,11 correspondientes a los protones metilénicos geminales a oxígeno de la unidad de glicerol y los tres carbonos - metinico y metilénicos - enlazados a oxígeno en dicha unidad a δ 68,90 y 62,10 respectivamente, así como con los carbonos carbonílicos a 173,30 y 173,20 (correlaciones a dos y tres enlaces de la unidad de glicerol). También entre los protones alílicos a  2,01 y los carbonos olefínicos a δ 130,20; 130,00; 129,90; 129,70; 129,60. También entre los dos dd a δ 4,26 y 4,11 correspondientes a los protones geminales a oxígeno y los tres carbonos carbonílicos de los ésteres a  173,30; 173,20 y 172,80. Otra sustancia que se pudo aislar y caracterizar espectroscópicamente es el 5,8- epidioxiergosta-6,22-dien-3-ol (48), a la que se denomina usualmente como peróxido del ergosterol. El producto, que cristaliza a partir de metanol, posee un punto de fusión de 178180 ºC. Su espectro de masas (con NaCl) muestra un pico correspondiente al ión molecular más H+ a m/ z 429,1 (C28H45O3); en este espectro se observan, además, iones a m/ z 451,1 (M+Na)+ y 879,4 (2M+Na)+, ello en consistencia con la fórmula molecular C28H44O3. C Ca ap pí ít tu ul lo o I II I 84 En el espectro IR aparece una señal estrecha a 3618 cm-1 y otra ancha en el intervalo 36003200 cm-1 correspondientes ambas a un grupo hidroxilo (libre y asociado respectivamente) y una banda a 973 cm-1 característica de un doble enlace trans en C-22 de un ergoesteroide (González y col., 1983). El espectro de 1H-RMN muestra dos doble dobletes centrados en  5,12 y 5,08 característicos del mencionado doble enlace en posición 22 sobre la cadena lateral del ergosterol. La constante de acoplamiento de 15,2 Hz entre los protones olefínicos en C-22 y C-23 confirma que la estereoquímica de este doble enlace es en efecto, trans. También se observa un sistema AB achacable a un doble enlace cis centrado en  6,33 (A 6,46 y B 6,20 con JAB= 8,6 Hz). El alto desplazamiento de estos protones es característico de un puente endoperóxido entre los carbonos 5 y 8 de los ergoesteroides. Dicho puente de oxígeno se confirma en el espectro de 13C-RMN (Tabla II-2) con las señales a  82,170 y 79,453 que se ha asignado a los carbonos 5 y 8 respectivamente. Obsérvese que el resto de las señales desplazadas en los espectros de protón y de carbono (Tabla II-2), junto con las constantes de acoplamiento, son consistentes con la estereofórmula 48 (Figura II-21). Por otra parte, en el espectro DEPT_135 se desplazan señales positivas para 6 CH3, 7 CH y 4 =CH, así como negativas para 7 CH2. En el espectro 1H-1H-COSY se observa correlación entre sí para los protones olefínicos que conforman el sistema AB a δ 6,46 y 6,20, así como entre los protones olefínicos en C-22 y C23 y los metinos alílicos sobre C-20 ( 2,00) y C-24 ( 1,82). En el espectro HSQC se observa correlación entre los dos protones olefínicos centrados en δ 6,46 y 6,20 y los dos carbonos olefínicos directamente enlazados a ellos que desplazan señales en  130,784 y 135,442 respectivamente. Esto es, el H sobre C-7 y el propio C-7 por un lado y el H sobre C-6 con el propio C-6 por otro. Ello confirma que el doble enlace cis se encuentra, en efecto, entre los carbonos 6 y 7. También se observa correlación entre los dos protones olefínicos centrados en δ 5,12 y 5,08 y los dos carbonos olefínicos directamente enlazados a ellos que C Ca ap pí ít tu ul lo o I II I 85 desplazan señales en  132,337 y 135,240, o sea, el H sobre C-23 y el propio C-23 por un lado y el H sobre C-22 y el propio C-22 por otro. En el espectro HMBC se observa correlación entre los dos protones olefínicos del sistema AB en C-7 (δ 6,46) y C-6 ( 6,20) y los dos carbonos puente del endoperóxido (C-8 a  79,453 y C-5 a  82,170). Ello confirma la presencia del puente epidioxi característico de endoperóxidos esteroidales. También entre los dos protones olefínicos en C-22 ( 5,08) y C-23 ( 5,12) y los carbonos vecinales C-20 ( 39,767) y C-24 ( 42,794) respectivamente. HO OO 1 3 5 8 9 11 22 48 Figura II-21. 5, 8-Epidioxiergosta-6,22-dien-3-ol (Peróxido del ergosterol) En la fracción más polar de P. variotii se encontró además un compuesto polihidroxílico cuyo espectro de 1H-RMN sugiere una estructura de monosacárido { 5,10 (1H, m, protón anomérico);  3,903,20 (6H, m, CH+CH2 geminales a oxígeno);  2,16 (0,25 H, s, OH)}. Mediante un análisis de esta fracción por HPLC con una columna Shodex OH Pak SB806 HQ se dedujo que está constituida fundamentalmente por D-(+)-glucosa, la cual había sido introducida como constituyente del caldo de cultivo KMV modificado (Tabla II-3). C Ca ap pí ít tu ul lo o I II I 92 El resto del material Pv-L-0 se repartió en tres subfracciones, a saber: Pv-L-1, Pv-L-2 y Pv-L-3. Para ello, a la fracción Pv-L-0, concentrada en rotavapor, se le añadieron 20 ml de agua y 180 ml de metanol. Esta mezcla se extrajo con hexano hasta que éste se obtuvo incoloro. Los extractos hexánicos reunidos se evaporaron para dar 1,298 g de un sólido marrón que se denominó Pv-L-1. A la fase acuosa-metanólica resultante de la separación anterior se le añadieron 160 ml de agua para obtener una fase con el 50 % de agua y 50 % de metanol que se reextrajo con diclorometano (x3, 200 ml). Las fases orgánicas reunidas se evaporaron, lo que rindió 0,331 g de un aceite marrón que denominamos fracción Pv-L-2. A la disolución acuosa-metanólica resultante se le añadió más metanol y evaporó en rotavapor para dar un aceite (0,023 g) que se denominó fracción Pv-L-3. Estudio de la fracción liposoluble -1 (Pv-L-1) Supuso 1298 mg de un sólido marrón que, por filtración a través de Sephadex (LH-20, lipofílico, MeOH: CH2Cl2, 1: 1) y CCF (en fase reversa, MeOH: H2O, 98: 2) dió dos subfracciones: Pv-L-1-a (457 mg) y Pv-L-1-b (316 mg). Estudio de la fracción Pv-L-1-a Por CCF en fase normal (SiO2, hexano: AcOEt 8: 2) se observan dos sustancias mayoritarias (Rf= 0,5 y 0,8). Espectro de 1H RMN: protones olefínicos,  5,205,10, geminales a heteroátomos, dos dd a  4,404,00 característicos de triglicéridos y metilenos/ metilos de cadenas hidrocarbonadas. Por análisis GC-MS se identificaron/ cuantificaron las siguientes sustancias volátiles: Ácido tridecanoico (16; n= 11; Tr= 12,230) 1-Tridecanol (14; n= 11; Tr= 14,877) 1,2,3-Propanotriil éster del ácido docosanoico (27; Tr= 17,114) 1-Eicosanol (14; n= 18; Tr= 16,358) Éster etílico del ácido (Z,Z)-9,12-octadecadienoico(linoleico) (24; Tr= 18,375) Se abordó su purificación por cromatografía en columna y CCF preparativa en fase normal (SiO2) siguiéndose la separación por CCF analítica en fase normal (SiO2, hexano: AcOEt, 85: 15) lo que rindió una sustancia, homogénea por CCF, que denominamos Pv-L-1-a-1 (Rf= 0,69). Estudio de la fracción Pv-L-1-a-1 Por espectroscopía se identificó como trioleina (26). Así, su espectro de IR muestra bandas de absorción a 3029, 3007 y 1653 (dobles enlaces), 1739 y 1233 (ésteres). Su espectro de 1H-RMN delató protones olefinicos (δ 5,315,25, 6H, m), protones geminales a heteroátomos a  5,22 (1H; dt; J= 5,2 Hz; J= 6,4 Hz);  4,26 (2H; dd; J= 5,2 Hz; J= 13,1 Hz) y  4,11 (2H; dd; J= 6,4 Hz; J= 13,1 Hz), hidrógenos en  a carbonilo (δ 2,27; t, 6H), hidrógenos alílicos (δ 2,01; m; 12H), hidrógenos en  a carbonilo (δ 1,61; m; 6H), metilenos de cadenas hidrocarbonadas lineales (δ 1,27; 60H) y metilos terminales de dichas cadenas hidrocarbonadas (δ 0,9; 9H) . En su espectro de 13C-RMN se observaron tres carbonos carbonílicos (δ 173,30; 173,20; 172,80), seis carbonos olefínicos (δ 130,20; 130,00; 129,90; 129,70; 129,60; 128,00), tres carbonos geminales a oxígeno (δ 68,90; 62,10 -x2-) y carbonos saturados típicos de cadenas hidrocarbonadas lineales (δ 50,80; 34,20; 34,10; 31,90; 31,50; 29,60 (varios); 27,20; 27,10; 25,60; 24,90; 24,80; 22,70; 22,60; 14,10; 14,00). C Ca ap pí ít tu ul lo o I II I 93 En el espectro 1H-1H-COSY se observa correlación, entre sí, del dt a  5,22 y los dos dd a δ 4,26 y 4,11 correspondientes a los protones geminales a oxígeno de la unidad de glicerol. También entre los protones olefínicos y metilenos alílicos a δ 5,27 y 2,01 respectivamente. En el espectro HSQC se observa correlación entre el dt a  5,22 correspondiente al metino geminal a oxígeno de la unidad de glicerol y el carbono enlazado a dicho oxígeno a δ 68,9. También entre los dos dd a δ 4,26 y 4,11 correspondientes a los protones metilénicos geminales a oxígeno de la misma unidad de glicerol y los carbonos enlazados a dichos oxígenos, que aparecen ambos a δ 62,10. También entre un triplete a δ 2,27 correspondiente a los protones en  a carbonilo y los propios carbonos en  a carbonilo a δ 34,15. También entre un multiplete a δ 2,01 correspondiente a los protones alílicos y los carbonos en  a doble enlace a δ 27,20. En el espectro HMBC se observa correlación entre los protones en  a carbonilo a  2,27 y los carbonos de metilenos saturados a δ 25,60 y 29,60. También se observa correlación entre el dt a  5,22 correspondiente al metino geminal a oxígeno de la unidad de glicerol y los carbonos metilénicos de dicha unidad de glicerol a  62,10 por un lado y uno de los carbonilos de los ésteres a  172,80 (conectividades a dos y tres enlaces). También entre los dos dd a δ 4,26 y 4,11 correspondientes a los protones metilénicos geminales a oxígeno de la unidad de glicerol y los tres carbonos - metínico y metilénicos - enlazados a oxígeno a δ 68,80 y 62,10 respectivamente, así como con los carbonos carbonílicos a  173,30 y 173,20 (correlaciones a dos y tres enlaces de la unidad de glicerol). También entre los protones alílicos a  2,01 y los carbonos olefínicos a δ 130,20; 130,00; 129,90; 129,70; 129,60; 128,00. También entre los dos dd a δ 4,26 y 4,11 correspondientes a los protones geminales a oxígeno y los carbonos carbonílicos de los tres ésteres a δ 173,30; 173,20; 172,80. Estudio de la fracción Pv-L-1-b Por CCF (SiO2, hexano: AcOEt, 8: 2) se observan dos sustancias mayoritarias (Rf= 0,22 y 0,36) impurificadas por otras cinco minoritarias (espectro de 1H-RMN: protones olefínicos,  6,605,00 con sistema AB típico del peróxido del ergosterol, geminales a heteroátomos,  4,103,30 y metilenos/ metilos de cadenas hidrocarbonadas,  2,900,60), lo que indica presencia de componentes lipídicos con abundancia de los insaturados. Se sometieron a separación por cromatografía en columna - fase normal, hexano: AcOEt - seguida de HPLC semipreparativa, lo que dio las siguientes sustancias homogeneas por CCF analítica (SiO2, hexano: AcOEt, 85: 15): Pv-L-1-b-1 (Rf= 0,62), Pv-L-1-b-2 (Rf= 0,59), Pv-L-1-b-3 (Rf= 0,32). Estudio de la fracción Pv-L-1-b-1 Su espectro de 1H-RMN delató protones olefinicos (δ 5,505,20), protones geminales a heteroátomos (δ 4,254,00) y cadenas hidrocarbonadas (δ 3,000,80). En su espectro de 13CRMN se observaron carbonos carbonílicos (δ 180,314), carbonos olefínicos (δ 130,225128,082), carbonos geminales a heteroátomos (δ 77,54376,534) y carbonos saturados típicos de cadenas hidrocarbonadas (δ 34,11514,132). Esto parece indicar la presencia abundante de ácidos grasos libres, con abundancia de los insaturados (la curva integral de los protones olefínicos es intensa). En consistencia con lo anterior, por GC-MS se identificaron las siguientes sustancias: Ácido hexadecanoico (16; n= 14; Tr= 16,225) Ácido heptadecanoico (16; n= 15; Tr= 16,912) 1-(Hidroximetil)-1,2-etanodiil éster del ácido hexadecanoico (28; Tr= 17,595) Éster metílico del ácido 14-metil-pentadecanoico (25; Tr= 17,261) Ácido (Z)-9-octadecenoico (oleico) (19; n= 5, m= 7; Tr= 18,730) Ácido (Z)-13-docosenoico (erúcico) (19; n= 7, m= 11; Tr= 19,760) C Ca ap pí ít tu ul lo o I II I 94 Estudio de la fracción Pv-L-1-b-2 Su espectro de 1H-RMN delató protones olefinicos (δ 6,705,10), protones geminales a heteroátomos (δ 4,804,00) y cadenas hidrocarbonadas (δ 3,000,80). En su espectro de 13CRMN se observaron carbonos carbonílicos (δ 180,00), carbonos olefínicos (δ 130,00120,00), carbonos geminales a heteroátomos (δ 77,0060,00) y carbonos saturados típicos de cadenas hidrocarbonadas (δ 34,0014,00). Esto parece indicar la presencia abundante de ácidos grasos libres, con abundancia de los insaturados (la curva integral de los protones olefínicos es intensa). En consistencia con esto, por GC-MS se identificaron las siguientes sustancias: Éster metílico del ácido 9-oxo-nonanoico (34; Tr= 13,676) 2-Hidroxi-1,3-propanodiil éster del ácido hexadecanoico (29; Tr= 12,192) Ácido 9-hexadecenoico (21; Tr= 14,759) Éster metílico del ácido 14-metil-pentadecanoico (25; Tr= 17,261) Éster metílico del ácido 11-hexadecenoico (20; n= 3, m= 9; Tr= 17,144) Éster metílico del ácido (E)-9-octadecenoico (23; Tr= 18,388) Ácido octadecanoico (16; n= 16; Tr= 17,583) (Z,Z)-9-Octadecenil éster del ácido 9-hexadecenoico (30; Tr= 18,516) Estudio de la fracción Pv-L-1-b-3 Se trata de un sólido blanco (150 mg). Una muestra se sometió a análisis GC-MS sin que se identificase ningún componente volátil - o no se volatilizaron a la temperatura del inyector usada o se salieron del tiempo de análisis prefijado en el método -. El producto se cristalizó a partir de metanol, p.f.= 178180 ºC y se sometió a un estudio espectroscópico detallado. En su espectro IR aparecen señales a 3618 (OH libre), 36003200 (OH asociado) y 973 (22-trans). Su espectro de 1H-RMN delató protones olefínicos pertenecientes a un doble enlace cis a δ 6,46 (1H, d, J= 8,6 Hz, C7-H) y δ 6,20 (1H, d, J= 8,6 Hz, C6-H) (sistema AB característico) y protones olefínicos pertenecientes a un doble enlace trans a δ 5,12 (1H, dd, J= 7,5; 15,2; C23-H); δ 5,08 (1H, dd, J= 8,0; 15,2; C22-H), protones geminales a heteroátomos (δ 3,94; 1H, m), protón hidroxílico (δ 3,45; 1H, s), metinos y metilenos típicos de esqueletos esteroidales (δ 2,101,15; 20H, m) y metilos - angulares y secundarios - típicos de esqueletos esteroidales (δ 1,000,77; 18H), concretamente aparecen en el espectro a δ 0,954 (3H, d, J= 6,4 Hz); 0,863 (3H, d, J= 6,8 Hz); 0,839 (3H, s); 0,788 (3H, d, J= 6,4 Hz); 0,772 (3H, d, J= 6,8 HZ); 0,771 (3H, s) (Tabla II-2). En su espectro de 13C-RMN se observaron cuatro carbonos olefínicos (δ 135,442; 135,240; 132,337; 130,784), tres carbonos geminales a heteroátomos (δ 82,170; 79,453; 66,504) y carbonos saturados típicos de cadenas hidrocarbonadas esteroidales (metinos a δ 56,209; 51,707; 51,101) (metilenos y metilos a δ 44,580; 42,794; 39,767; 39,363; 36,972; 34,705; 33,075; 30,140; 29,721; 28,665; 23,417; 20,902; 20,653; 19,970; 19,660; 18,185; 17,579; 12,890). En su espectro DEPT_135 se observan 11 señales positivas correspondientes a metinos (CH), 7 señales negativas correspondientes a metilenos (CH2) y otras 6 positivas correspondientes a metilos (CH3), lo cual es característico de un esqueleto esteroidal. En su espectro 1H-1H-COSY se observa correlación entre sí en los protones olefínicos del sistema AB anteriormente mencionado (δ 6,46 y 6,20), así como los centrados en δ 5,12 y 5,08 y los metinos en los carbonos 24 y 20 (δ 1,82 y 2,00 respectivamente). En su espectro HSQC se observa correlación entre los protones olefínicos del sistema AB (δ 6,46 y 6,20) y sus carbonos olefínicos respectivos (δ 130,784 y 135,442), lo que delata un doble enlace entre los carbonos 6 y 7. También se observa correlación de los protones olefínicos en C22 (δ 5,08) y C-23 (δ 5,12) y los carbonos en 22 y 23 (δ 135,24 y 132,337 respectivamente). En su espectro HMBC se observa correlación entre los protones olefínicos del sistema AB (δ 6,46 y 6,20) y los carbonos geminales a oxígeno (δ 82,170 y 79,453) por un lado y los carbonos C Ca ap pí ít tu ul lo o I II I 95 olefínicos a  130,784 y 135,442 por otro (conectividades a través de tres y dos enlaces respectivamente). Ello delata un puente epidioxi, característico de endoperóxidos esteroidales. También se observa correlación de los protones olefínicos en C-22 (δ 5,08) y C-23 (δ 5,12) y los carbonos vecinales C-20 ( 39,767) y C-24 ( 42,794) respectivamente. En su espectro de masas (con NaCl) se aprecian los siguientes iones: 429,1 (M+H)+; 451,1 (M+Na)+; 879,4 (2M+Na)+; lo que nos da una fórmula molecular de C28H44O3. Todos estos datos indican que esta fracción está constituida por el 5,8-epidioxiergosta6,22-dien-3-ol (peróxido del ergosterol) (48), sustancia anteriormente descrita en otra especie fúngica (Gonzalez y col., 1983). Estudio de la fracción liposoluble -2 (Pv-L-2) Supuso 331 mg de un aceite amarillo cuyo espectro de 1H-RMN delató protones olefínicos (δ 5,305,00), protones geminales a heteroátomos (δ 4,203,40) y cadenas hidrocarbonadas (δ 2,900,80); el de 13C-RMN delató carbonos carbonílicos a δ 174,00; carbonos olefinicos (δ 130,00128,00); y cadenas hidrocarbonadas (δ 72,0014,00); lo que informa a favor de una posible presencia de componentes lipídicos. Por filtración a través de Sephadex (LH-20 lipofílico, MeOH: CH2Cl2, 1: 1) y CCF (fase reversa, MeOH: H2O, 98: 2) suministró dos subfracciones: PvL-2-a (120 mg) y Pv-L-2-b (165 mg). Estudio de la fracción Pv-L-2-a Por HPLC analítica se trata, al menos, de ocho sustancias - cuatro mayoritarias -. Su espectro de 1H-RMN desplaza protones olefínicos a  6,605,00; con sistema AB característico del peróxido del ergosterol (48) centrado en  6,46 y 6,20; geminales a heteroátomos a  4,303,50 y metilenos/ metilos de cadenas hidrocarbonadas saturadas. Ello anuncia presencia de posibles componentes lipídicos. Por GC-MS sólo se identificaron las siguientes sustancias: Pentadecano (12; n= 12; Tr= 14,375) 1-Hexadecanol (14; n= 14; Tr= 16,332) 2,4-Bis(1,1-dimetiletil)-fenol (45; Tr= 14,413) Se abordó su purificación por HPLC semipreparativa (fase normal, hexano: AcOEt, 50: 50), lo que rindió la siguiente sustancia, homogénea por CCF analítica (SiO2, hexano: AcOEt, 85: 15): Pv-L-2-a-1 (Rf= 0,67). Estudio de Pv-L-2-a-1 Su espectro de 1H-RMN mostró un sistema AB a δ 6,46 y 6,20 que delata, de nuevo, al peróxido del ergosterol (48), protones olefinicos (δ 5,605,00), protones geminales a heteroátomos (δ 4,153,25) y cadenas hidrocarbonadas (δ 2,500,60) superpuestos a metilos angulares esteroidales. Esto parece indicar la presencia abundante de peróxido del ergosterol y otros componentes lipídicos. Por GC-MS se identificaron las siguientes sustancias: Pentadecano (12; n= 12; Tr= 14,092) 2,4-Bis(1,1-dimetiletil)-fenol (45; Tr= 14,380) 1-Hexadecanol (14; n= 14; Tr= 16,332) Di-isobutil éster del ácido hexanodioico (39; Tr= 15,607) C Ca ap pí ít tu ul lo o I II I 96 Estudio de la fracción Pv-L-2-b Por HPLC analítica se muestra como una mezcla compleja. Se abordó su purificación por HPLC semipreparativa (fase normal, hexano: AcOEt, 50: 50) sin éxito. Por análisis GC-MS se identificaron las siguientes sustancias: 2-Butil-1-octanol (15; n= 3, m= 3; Tr= 12,538) 2-Undecanona (35; Tr= 12,369) 2-Metil-1-hexadecanol (15; n= 11, m= 0; Tr= 14,013) Hidroxitolueno butilado (46; Tr= 14,335) 1-Tridecanol (14; n= 11; Tr= 14,258) 2-Hexil-1-octanol (15; n= 3, m= 5; Tr= 14,386) Estudio de la fracción liposoluble-3 (Pv-L-3) Supuso 23 mg de un aceite amarillo cuyos datos de 1H-RMN indican que se trata de una mezcla de sustancias. Ésta presenta protones olefinicos (δ 5,405,00), geminales a heteroátomos (δ 4,103,00) y cadenas hidrocarbonadas (δ 3,000,80). Esto parece indicar a su vez la presencia abundante de ésteres de ácidos grasos insaturados. Por escasez de material se sometió directamente a un estudio de GC-MS de sus componentes volátiles resultando identificadas las siguientes sustancias: 2-Butil-1-octanol (15; n= 3, m= 3; Tr= 12,524) 1-Metilnonil-benceno (44; Tr= 15,051) Benzoato de bencilo (38; Tr= 16,541) Éster metílico del ácido (Z)-9-hexadecenoico (20; n= 5, m= 7; Tr= 17,604) N-butil-bencensulfonamida (43; Tr= 16,699) Maleato de diisooctilo (40; Tr= 18,702) Éster etílico del ácido hexadecanoico (18; Tr= 17,719) Ácido (Z)-13-docosenoico (erúcico) (19; n= 7, m= 11; Tr= 19,824) 2-Hidroxi-1-(hidroximetil) etil éster del ácido (Z,Z)-9,12-octadecadienoico (linoleico) (33; Tr= 18,817). Estudio de la fracción hidrosoluble bruta (Pv-H-0) Se obtuvo por extracción con 2-butanol de la fase acuosa seguido de evaporación del disolvente en rotavapor (806 mg). Sus espectros de resonancia delatan componentes lipídicos: Espectro de 1H-RMN: muestra protones olefínicos a  5,20; geminales a heteroátomos a  4,503,00; y metilenos/ metilos de cadenas hidrocarbonadas a  2,500,80. Espectro de 13C-RMN: presenta carbonos carbonílicos a  175,00; olefínicos a  132,00118,00; geminales a heteroátomos a  70,0064,00 y metilenos/ metilos de cadenas hidrocarbonadas a  70,0064,00. Por filtración a través de Sephadex (LH-20 lipofílico, MeOH: CH2Cl2, 1: 1) se obtuvieron tres subfracciones que se diferenciaron por su comportamiento en CCF: Pv-H-1-a (311 mg), PvH-1-b (132 mg) y Pv-H-1-c (238 mg) Cada una de estas fracciones se sometieron a purificación por HPLC semipreparativa (fase reversa, MeOH: H2O, 98: 2 hasta 90: 10), recomprobándose la purificación por CCF en fase reversa, MeOH: H2O, 98: 2. Se obtuvieron así las siguientes subfracciones: C Ca ap pí ít tu ul lo o I II I 97 Estudio de la fracción Pv-H-1-a-1 Su espectro de 1H-RMN delata protones olefínicos a  5,004,80; geminales a heteroátomos a  4,003,50; y metilenos/ metilos de cadenas hidrocarbonadas a  2,200,80 lo que informa sobre presencia de componentes lipídicos. Se sometió directamente a un estudio de GC-MS de sus componentes volátiles, resultando identificados: Tetradecano (12; n= 11; Tr= 13,262) 2-Metil-1-hexadecanol (15; n= 11; Tr= 14,000) Hidroxitolueno butilado (46; Tr= 14,323) Ftalato de dietilo (41; Tr= 15,069) Ftalato de diisobutilo (39; Tr= 17,008) 9-Octadecenamida (22; Tr= 18,375) Maleato de diisooctilo (40; Tr= 18,707) Estudio de la fracción Pv-H-1-b-1 Su espectro de 1H-RMN delata protones olefínicos a  5,40; geminales a heteroátomos a  4,603,00; y metilenos/ metilos de cadenas hidrocarbonadas a  2,500,80 lo que informa sobre presencia de componentes lipídicos. Se sometió directamente a un estudio de GC-MS de sus componentes volátiles, resultando identificados: Ácido tetradecanoico (16; n= 12; Tr= 14,775) 1-Hexadecanol (14; n= 14; Tr= 16,353) Ácido (Z)-13-docosenoico (erúcico) (19; n= 7, m= 11; Tr= 19,816) Estudio de la fracción Pv-H-1-c-1 Su espectro de 1H-RMN muestra sólo protones geminales a heteroátomos,  5,10 (1H, m, protón anomérico) y  3,903,60 (4H, m, CH geminales a oxígeno),  3,403,20 (2H, CH2 geminal a oxígeno) y protones hidroxílicos a  2,16 (0,25 H, s, OH), lo que delata una estructura de monosacárido. Su espectro de 13C-RMN presenta un carbono anomérico a  93,976; cuatro carbonos metínicos geminales a heteroátomos a  74,879; 73,880; 72,973 y 71,885; y un carbono metilénico geminal a heteroátomos a  62,770 en consistencia con la mencionada estructura de monosacárido. Mediante un análisis de esta fracción por HPLC con una columna Shodex OH Pak SB806 HQ termostatada a 30 ºC (agua con un 0,05 % de NaN3 como eluyente a un flujo de 1,0 ml/ min. y un detector de índice de refracción), después de filtrarla a través de un cartucho SepPak C18 de Waters se dedujo, por comparación con una muestra auténtica, que está constituida por D-(+)-glucosa (Tr= 11,474  0,007). C Ca ap pí ít tu ul lo o I II I 98 II-6. Referencias Bibliográficas Aldridge, D.C., Carman, R.M. and Moore, R.B. 1980 A new tricarboxylic acid anhydride from Paecilomyces variotii. J. Chem. Soc., Perkin Transactions 1, v. 10, pp. 2134-2135. Amade, P., Mallea, M. and Bouaiacha, N. 1994 Isolation, structural identification and biological activity of two metabolites produced by Penicillium olsonii Bainier and Sartory. J. Antibiot., v. 47, n. 2, pp. 201-207. Amagasa, T., Paul, R., Heitholt, J.J. and Duke, S.O. 1994 Physiological effects of cornexistin on Lemna pausicostata. Pest. Biochem. Physiol., v. 49, n. 1, pp. 37-52. Andersson, B.A. 1978 Mass spectrometry of fatty acid pyrrolidines. Prog. Chem. Fats other Lipids, v. 16, pp. 279-308. Ayer, W.A., Craw, P.A. and Nozawa, K. 1991 Two 1H-naphtho [2,3-c] pyran-1-one metabolites from the fungus Paecilomyces variotii. Can. J. Chem., v. 69, n. 2, pp. 189-191. Babitskaya, V.G. and Shcherba, V.V. 2002 The nature of melanin pigments of several microand macromycetes. Appl. Biochem. Microb., v. 38, n. 3, pp. 247-251. Bajpai, P. and Bajpai, P.K. 1987 Single-cell protein production from rayon pulp mill waste by Paecilomyces variotii. J. Ferm. Tech., v. 65, n. 3, pp. 349-351. Battestin, V. and Macedo, G.A. 2007 Tannase production by Paecilomyces variotii. Biores. Tech., v. 98, n. 9, pp. 1832-1837. Behera, B.K., Arora, M. and Sharma, D.K. 2000 Studies on biotransformation of Calotropis procera latex - a renewable source of petroleum, value-added chemicals and products. Energy Sources, v. 22, n. 9, pp. 781-807. Carballeira, N.M., Miranda, C., Lozano, C.M., Nechev, J.T., Ivanova, A., Ilieva, M., Tzvetkova, I. and Stefanov, K. 2001 Characterization of novel methyl-branched chain fatty acids from a halophilic Bacillus species. J. Nat. Prod., v. 64, n. 2, pp. 256-259. C Ca ap pí ít tu ul lo o I II I 99 Chou, S., Chedore, P., Haddad, A., Paul, N.R. and Kasatiye, S. 1996 Direct identification of Mycobacterium species in Bactec 7H12B medium by gas-liquid chromatography. J. Clin. Microbiol., v. 34, n. 5, pp. 1317-1320. Cooper, W.J. and Blumer, M. 1968 Linear, iso and ante-iso fatty acids in recent sediments of the North Atlantic. Deep-Sea Res., v. 15, n. 5, pp. 535-540. Cranwell, P.A. 1973 Branched-chain and cyclopropanoid acids in a recent sediment. Chem. Geol., v. 11, n. 4, pp. 307-313. Cranwell, P.A. 1974 Monocarboxylic acids in lake sediments: indicators, derived from terrestrial and aquatic biota, of palaeoenvironmental trophic levels. Chem. Geol., v. 14, n. 1-2, pp. 1-14. Dechkan-Khodzhaeva, N.A., Ivanov, V.I., Nurtaev, K.S., Gazikhodzhaeva, M.A., Sinyashin, N.I. and Mirtalipov, D.T. 1997 Phospholipid and fatty acid compositions of two forms of the fungus Paecilomyces variotii Bainier var Zaaminella (Dechkan, 1974). Doklady Akad. Nauk Resp. Uzbek., v. 12, pp. 40-43. Deodhar, M.A., Pipalia, N.H. and Karmankar, S.M. 2002 Biotransformation of terpenoids: reductive ability of Paecilomyces variotii. J. Med. Arom. Plant Sci., v. 24, n. 1, pp. 1-5. Domenech, J., Prieto, A., Bernabe, M. and Leal, J.A. 1994 Los polisacáridos de las paredes celulares de cuatro variedades de Paecilomyces variotii fueron caracterizados. Curr. Microb., v. 28, n. 3, pp. 169-173. Duncan, W.R.H., Lough, A.K., Garton, G.A. and Brooks, P. 1974 Characterization of branched chain fatty acids from subcutaneous triacylglycerols of barley-fed lambs. Lipids, v. 9, n. 9, pp. 669-673. Fields, S.C., Gerwick, B.C. and Mireles-Lo, L. 1995 Hydroxycornexistin herbicide. U.S. Patent nº US 5424278, 7 p. Freemantle, M. 2004 Designer liquids in polymer systems. Sci. & Tech., v. 82, n. 18, pp. 26-29. Ghosh, S., Sachan, A. and Mitra, A. 2006 Formation of vanillic acid from ferulic acid by Paecilomyces variotii MTCC 6581. Curr. Sci., v. 90, n. 6, pp. 825-829. C Ca ap pí ít tu ul lo o I II I 100 González, A.G., Barrera, J.B. and Marante, F.J.T. 1983 The steroids and fatty acids of the basidiomycete Scleroderma polyrhizum. Phytochem., v. 22, n. 4, pp. 1049-1050. Grimalt, J.O. and Albaigés, J. 1990 Characterization of the depositional environment of the Ebro Delta (Western Mediterranean) by the study of sedimentary lipid markers. Mar. Geol., v. 95, n. 3-4, pp. 207-224. Haneishi, T., Nakajima, M., Koi, K., Furuya, K., Iwado, S. and Sato, S. 1988 Manufacture of cornexistin herbicide with Paecilomyces. Eur. Patent, nº EP 290193, 18 p. Horn, W.S., Kurtz, M.B., Liesch, J.M., Smith, J.L., Martin, I. and Vicente, F. 1993 Antibiotic eicosenoic acids and their manufacture with Paecilomyces variotii. U.S. Patent, nº US 5233062, 6 p. Horn, W.S., Smith, J.L., Bills, G.F., Raghoobar, S.L., Helms, G.L., Kurtz, M.B., Marrinan, J.A., Frommer, B.R., Thornton, R.A. and Mandala, S.M. 1992 Sphingofungins E & F: novel serine palmitoil transferase inhibitors from P. variotii. J. Antib., v. 45, n. 10, pp. 1692-1696. Kaneda, T. 1991 Isoand ante-iso fatty acids in bacteria: biosynthesis, function and taxonomic significance. Microb. Rev., v. 55, n. 2, pp. 288-302. Kupchan, S.M, Briton, R.W., Ziegler, M.F. and Siegel, C.W. 1973 Bruceatin, a new potent antileukemic simaroubolide from B. antidysenterica. J. Org. Chem., v. 38, pp. 178-179. Lambert, M.A., Moss, C.W., Silcox, V.A. and Good, R.C. 1986 Analysis of mycolic acid cleavage products and cellular fatty acids of Mycobacterium species by capillary gas chromatography. J. Clin. Microbiol., v. 23, n. 4, pp. 731-736. Leal, J.A. 1994 Water-soluble polysaccharides of fungal cell walls. In: Microorganisms in Ruminant Nutrition. Prins, R.A. and Stewart, C.S. (eds.), University Press, Nottingham, pp. 153-165. Leo, R.G. and Parker, P.L. 1966 Branched chain fatty acids in sediments. Science, v. 152, n. 3722, pp. 649-650. C Ca ap pí ít tu ul lo o I II I 101 Mukherjee, G., Sachan, A., Ghosh, S. and Mitra, A. 2006 Conversion of sinapic acis to syringic acid by filamentous fungus P. variotii. J. Gen. Appl. Microbiol., v. 52, n. 2, pp. 131-135. Nakajima, M., Itoi, K., Takamatsu, Y., Sato, S., Furukawa, Y., Furuya, K. Honma, T., Kadotani, J., Kozasa, M. and Haneishi, T. 1991 Cornexistin: a new fungal metabolite with herbicidal activity. J. Antib., v. 44, n. 10, pp. 1065-1072. Nechev, J., Christie, W.W., Robaina, R., de Diego, F.M., Ivanova, A., Popov, S. and Stefanov, K. 2002 Chemical composition of the sponge Chondrosia reniformis from the Canary Islands. Hydrobiologia, v. 489, n. 1-3, pp. 91-98. Perry, G.J., Volkman, J.K., Johns, R.B. 1979 Fatty acids of bacterial origin in contemporary marine sediments. Geoch. Cosmoch. Acta, v. 43, n. 11, pp. 1715-1725. Saad, R. and Hamdy, H.S. 2004 Purification and some properties of extracellular chitinase produced by Paecilomyces variotii. Egipt. J. Biotech., v. 16, pp. 150-161. Sachan, A., Ghosh, S. and Mitra, A. 2006 Biotransformation of p-coumaric acid by Paecilomyces variotii. Lett. Appl. Microb., v. 42, n. 1, pp. 35-41. Seyama, Y., Oaci, K., Imamura, T., Kasama, T. and Otsuka, H. 1983 Branched chain fatty acids in phospholipids of Guinea pig harderian gland. J. Biochem., v. 94, n. 3, pp. 1231-1239. Silva, J.B.A.E., Maciel de Mancilha, I., Teixeira, M.A. and Vanetti, M.C.D. 1995 Utilization of the hydrolyzate of eucalyptus hemicellulose for production of microbial protein. Arq. Biol. Tecnol., v. 38, n. 1, pp. 147-156. Takahashi, S., Nakajima, M., Kinoshita, T., Haruyama, H., Sugai, S., Homma, T., Sato, S. and Haneishi, T. 1994 Hydantocidin and cornexistin: new herbicidal antibiotics. Nat. Eng. Pest Manag. Agents, v. 551, pp. 74-84. Takeshiba, H., Hizuba, J., Sano, H., Ozasa, M. and Nakajima, M. 1990 Preparation of cornexistin derivatives as herbicides, plant growth regulators, and germination inhibitors. Jpn. Kokai Tokkyo Koho, Japan Patent, nº JP 02209844, 47 p. C Ca ap pí ít tu ul lo o I II II I 107 AcO O O OH O 9a 9b OO OH O AcO 10 AcO O O OH O Figura III-5. Eremofortinas C (9a/ 9b) y D (10) Moreau y col. (1980b) vincularon a las Eremofortinas A, B y C con la aparición de PR toxina en las cepas tóxicas, proponiendo al sesquiterpeno Eremofortina C como su precursor biosintético directo. Finalmente se completaron, desde un punto de vista estereoquímico, las estructuras de las Eremofortinas A, B, C, D y E por correlación con la configuración absoluta de PR toxina elucidándose además la estructura de la Eremofortina E o PR-amida (11) por difracción de rayos X (Moreau y col., 1980a). Algo más tarde se volvería a implicar a estos metabolitos en la ruta biosintética/ degradativa de PR toxina (Wei y col., 1989). C Ca ap pí ít tu ul lo o I II II I 108 11, R=NH2 12, R=OH OO O AcO O R O O AcO N OH 13 Figura III-6. Eremofortina E - PR amida - (11), PR ácido (12) y PR imina (13) A continuación se revisó la química y actividad biológica de estos sesquiterpenos eremofilánicos (Moreau, 1981) y se describieron los factores que, relacionados con las condiciones de cultivo, afectan a la producción de PR toxina (Scott, 1984; Chang y col., 1991), así como la degradación que sufre la toxina en el propio productor - P. roqueforti -, descubriéndose los metabolitos que se liberan y acumulan en el medio como consecuencia de la misma, a saber, Eremofortina E (PR amida, 11); PR ácido (12); y PR imina (13) (Chang y col., 1993; 1996). Entre los avances en la descripción del metabolismo secundario de P. roqueforti hay que resaltar también la descripción de la configuración absoluta de la Isofumigaclavina A (1) (Arnoux y col., 1978), la elucidación estructural de las Marcfortinas A (14); B (15); y C (16) (Polonsky y col., 1980; Prangé y col., 1981) y la descripción de la estructura cristalina del enzima Aristolocheno-sintetasa (Caruthers y col., 2000). Esta última supone el primer enzima terpenoideciclasa de origen fúngico y, su estructura, muestra los centros activos que, presumiblemente, participan en la ciclación del pirofosfato de farnesilo (25) que conduce al Aristolocheno (17) que C Ca ap pí ít tu ul lo o I II II I 109 14, R=Me 15, R=H 16 N N N O R H O O Me Me Me Me O N N N O H O O Me Me Me Me H Figura III-7. Marcfortinas A (14), B (15) y C (16) es, a su vez, el precursor biogenético de todos los sesquiterpenos que, relacionados estructuralmente con PR toxina, han sido descritos anteriormente. Obsérvese que todos ellos poseen el esqueleto del eremofilano (18). 17 18 1 2 345 67 8 9 10 11 12 1314 15 Figura III-8. (+)-Aristolocheno (17) y esqueleto carbonado del eremofilano (18) Por otra parte, Olivigni y Bullerman (1978) detectaron el ácido penicílico (19) y patulina (20) en una cepa atípica de P. roqueforti. Lafont y Debeaupuis (1980) describieron el ácido micofenólico (21) y Brueckner y Reinecke (1988) identificaron por GC-MS el ácido aminoisobutírico. C Ca ap pí ít tu ul lo o I II II I 110 O O OH MeO 19 O O O OH H 20 O O Me OH MeO HO2C 21 Figura III-9. Ácido penicílico (19), patulina (20) y ácido micofenólico (21) Chalier y Crouzet (1992) señalaron a las -lactonas como las responsables del aroma del queso azul, describiendo al 4-dodecanolido (-C12, 22), al (Z)-6-dodecen-4-olido {(6Z)--C12:1, 23} y al minoritario 4-hexanolido (-C6), así como la estereoquímica en el carbono 4 {R para 22 y S para 23}, que P. roqueforti elabora a partir de los ácidos oleico y linoleico respectivamente. OO 22 23 OO RS Figura III-10. 4-Dodecanolido (22) y (Z)-6-Dodecen-4-olido (23) C Ca ap pí ít tu ul lo o I II II I 111 Finalmente, Moreau y col. (1982) aislaron a partir de una cepa de P. roqueforti no productora de PR-toxina otra micotoxina previamente descrita en Botryodiplodia theobromae, la Botriodiplodina (24). Los autores elucidan su configuración absoluta por difracción de rayos X e informan de su actividad mutagénica. O HO CH3 CH3 O 24 Figura III-11. Botriodiplodina Tradicionalmente, la taxonomía del grupo P. roqueforti se basó en criterios morfológicos, su capacidad de difusión sobre medios de cultivo estandarizados y el análisis de sus perfiles bioquímicos, conociéndose la variedad P. roqueforti var. roqueforti, usada en la fabricación del queso, y P. roqueforti var. carneum que es la productora de patulina (20) (Pitt, 1979; Frisvad, 1981; Engel y Teuber 1983; Blomquist y col.,1992; Lomascolo y col., 1994). Sin embargo, las modernas herramientas de genética molecular, combinadas con perfiles bioquímicos, pusieron de manifiesto la necesidad de reclasificar el grupo P. roqueforti, dividiéndolo en tres especies que fueron nombradas como: P. roqueforti, P. carneum y P. paneum (Boysen y col., 1996; Boysen y col., 2000). El uso de técnicas de microextracción en fase sólida, seguido del análisis por cromatografía capilar con detector de masas (GC-MS) ha permitido la detección de los sesquiterpenos volátiles intermediarios de las diferentes rutas metabólicas que intervienen en P. roqueforti (Demyttenaere y col., 2002; Jelen, 2002) consolidándose la idea de que, como se indicó anteriormente, el enzima aristolocheno-sintetasa (AS) es el responsable, en P. roqueforti, de ciclar C Ca ap pí ít tu ul lo o I II II I 112 el pirofosfato de farnesilo (25) hasta aristolocheno (17), el cual, a su vez, se considera el precursor biogenético de PR toxina (Figura III-13). Es por ello que tanto Demyttenaere y col. (2002) como Jelen (2002) y Calvert y col. (2002) lo propusieron, junto a germacreno A (26), valenceno (27), - elemeno (28), -gurjuneno (29), -chamigreno (30), -panasinseno (31), -patchouleno (32), - selineno (33), diepi--cedreno (34), -himachaleno (35) y -bisaboleno (36) como el perfil de componentes volátiles que permite diferenciar quimiotaxonómicamente las cepas productoras de la PR toxina de aquellas que no la pueden biosintetizar. Los autores subrayaron que estos marcadores químicos, detectables por GC-MS, estuvieron ausentes tanto en las cepas de Penicillium roqueforti no tóxicas como en las otras cepas de Penicillium sp. que fueron analizadas. La identificación de los metabolitos secundarios puede asistir, pues, la labor de diferenciación taxonómica, si bién, dado que las rutas biogénicas son dependientes de las condiciones de cultivo se debe de tomar los resultados con la debida cautela (Scott y col., 1977; Shimp y Kinsella, 1977b; Maheva y col., 1984; Hassanien y col., 1986; Gock y col., 2003). Es por ello que Jelen (2002) estudió la influencia de las condiciones de cultivo (temperatura y contenido en agua del caldo) y concluyó que, si bien éstos influyen en la cantidad de sesquiterpenos producidos - análisis cuantitativo -, no lo hacen en su perfil - análisis cualitativo -, el cual resultó único y característico de las cepas tóxicas. C Ca ap pí ít tu ul lo o I II II I 113 H PPPO H H H H 25 26 27 17 - PPPO- - H+ + H+ Transposiciones - H+ - H+ PR toxina 6 Figura III-12. Biogénesis de los sesquiterpenos volátiles implicados en la ruta de la PR toxina (6) en las cepas tóxicas de P. roqueforti. C Ca ap pí ít tu ul lo o I II II I 114 28 29 H H 30 H 33 3231 34 H H H 35 36 Figura III-13. Trazadores volátiles típicos de las cepas tóxicas de P. roqueforti. La razón de esta especificidad ha sido justificada mediante estudios estructurales del enzima aristolocheno-sintetasa AS (Caruthers y col., 2000; Calvert y col., 2002; Deligeorgopoulou y Allemann, 2003), evidenciándose que el pirofosfato de farnesilo se acomoda al centro activo de AS adoptando la conformación cuasi-cíclica necesaria (25) que hace posible el ataque nucleofílico de C1 por el doble enlace en C10 produciendo, estereoespecíficamente, el (S)- germacreno A (26), intermedio éste implicado en la ruta de la PR toxina (Figura III-13), mientras que la mutación del AS en un solo punto - residuo 92 - lo convierte en un enzima que desvía la ruta biogenética hacia la producción de terpenoides de cadena lineal, como el (E)--farneseno (38) y (E,E)--farneseno (39) al permitir un acomodo en el centro activo del pirofosfato de farnesilo con su conformación cuasi-lineal (37). C Ca ap pí ít tu ul lo o I II II I 115 38 39 37 OPPP + - HOPPP Figura III-14. Biogénesis de algunos trazadores volátiles encontrados en las cepas no tóxicas de Penicillium roqueforti. III-2. Objetivos de este trabajo En este trabajo, y como consecuencia de haber aislado del medio marino una cepa de P. roqueforti, clasificada por CABI Bioscience (Identification Services, Surrey, UK) se han planteado los siguientes objetivos: III-2.1. Producir a escala de laboratorio dicho hongo mediante su cultivo en agua de mar. III-2.2. Realizar un estudio de los productos naturales que dicha cepa es capaz de biosintetizar en las mencionadas condiciones, realizando un minucioso barrido de sus fracciones liposolubles e hidrosolubles, tanto en lo que se refiere a sus componentes volátiles como a los que no lo son; todo ello en orden a encontrar componentes quimiotaxonómicos que permitan correlacionarla con alguna de las cepas descritas previamente en la bibliografía, esclareciendo si se trata de una cepa productora de micotoxinas o no. Ambos objetivos, que son la base de una futura aplicabilidad biotecnológica del organismo aislado orientada hacia la alimentación animal (acuicultura) y humana (industria láctica) se apoyaban en los antecedentes anteriormente comentados. C Ca ap pí ít tu ul lo o I II II I 116 III-3. Resultados y Discusión III-3.1. Obtención de biomasa, extracción y fraccionamiento En lo que se refiere a la producción de la biomasa de P. roqueforti, comentar que la cepa fue aislada a partir de agua marina procedente del litoral Canario. Las colonias en desarrollo fueron traspasadas a placas de Petri conteniendo el medio sólido KMV modificado, en el que se pudieron purificar. La producción de la biomasa fúngica se consiguió, en el caldo KMV modificado, en un sistema estático de cultivo, a escala de laboratorio. El caldo fue recogido y sometido a extracción líquido-líquido según la Figura III-15. Paralelamente, la biomasa miceliar sobrenadante se recolectó, extrajo y fraccionó según la Figura III-16. Extraído con 2,5 l de CH2Cl2 (x3). Pr-L-0 (0,175 g) Caldo filtrado (12 l) Extracto orgánico evaporado en rotavapor/ 20 ml H2O + 180 ml MeOH; extraído con hexano hasta la decoloración de éste. Pr-L-1 (0,106 g) Fase acuosa ajustada hasta 50% (+ 160 ml): 50% MeOH; extraído con CH2Cl2 (x3). Pr-L-2 (0,052 g) Pr-L-3 (0,017 g) Fase CH2Cl2 Figura III-15. Esquema de partición aplicado al caldo de Penicillium roqueforti. C Ca ap pí ít tu ul lo o I II II I 123 O H O OCH3 91 O H O OCH2CH3 1 13 1 O OCH3 10 71 72 73 Figura III-20. Fragmentos lipídicos volátiles identificados en Penicillium roqueforti. O H 2 6 O O OH 3 7 11 14 10 6 O 74 75 76 77 Figura III-21. Terpenoides volátiles identificados en Penicillium roqueforti. C Ca ap pí ít tu ul lo o I II II I 124 OH OH O 1 2 4 7 78 79 Figura III-22. Componentes volátiles, de la ruta del ácido shikímico, identificados en Penicillium roqueforti. N NH O O Pro Leu 80 Figura III-23. Componentes volátiles, de la ruta de los aminoácidos, identificados en Penicillium roqueforti. C Ca ap pí ít tu ul lo o I II II I 125 CO2 CO2CO2 CO2H CO2 CO2 n n n=1,3,5,7,8 CO2 CO2 CO2 CO2 2 2 2 n n n=1,3 81 82 83 84 85 Figura III-24. Otros componentes volátiles identificados en Penicillium roqueforti. III-3.2.3. Ausencia de toxinas en el caldo de cultivo Los intentos de encontrar metabolitos implicados en la ruta biogenética de PR-toxina en el caldo de cultivo usado resultaron, pues, infructuosos al no detectarse ninguno de los trazadores químicos volátiles propuestos por Demyttenaere y col. (2002), Jelen (2002) y Calvert y col. (2002) (compuestos 17 y 26-36) a pesar de que dichos componentes se encuentran en las bases de datos Nist y Wiley del equipo GC-MS utilizado. En consistencia con esta observación, tampoco se ha encontrado ni un solo componente químico no volátil que se pueda vincular biogenéticamente con la PR-toxina (compuestos 6 y/ o 7-13). III-3.2.4. Presencia de dipéptidos cíclicos en el caldo de cultivo Sin embargo, hay que resaltar aquí la identificación de ciclo-ProLeu {3isobutilhexahidropirrolo[1,2-a]pirazin-1,4-diona} (80). Esta sustancia, que se había aislado previamente tanto a partir de peptona (Kosuge y Kamiya, 1960) como de diversos caldos de C Ca ap pí ít tu ul lo o I II II I 126 cultivo fúngico (Stopsack y col., 1991), pertenece estructuralmente a una familia - dipéptidos cíclicos - que presentan un amplio espectro de actividad biológica. Así, la misma ciclo-ProLeu (80) se ha propuesto como aditivo alimentario de sabor amargo con actividad fungicida (Stopsack y col., 1991), la ciclo-ProTyr y la ciclo-ProPhe, inicialmente descritas como fitotoxinas del hongo Alternaria alternata (Stierle y col., 1988), han sido comercializadas como plaguicidas biorracionales por su elevada estabilidad y baja toxicidad hacia los mamíferos - el herbicida Scythe - (Bobylev y col., 1999), y otras han sido patentadas por su actividad antiinflamatoria y antialérgica (Orihashi y col., 2000). Obsérvese que las mismas roquefortinas C (4) y D (5), discutidas anteriormente, son dipéptidos ciclo-TryHis ligeramente transformados. III-3.2.5. Presencia de hidrocarburos y ácidos grasos libres en el caldo de cultivo Algunos organismos marinos usan hidrocarburos sencillos o ácidos grasos, que son prácticamente insolubles en el agua de mar, como señales químicas (Yasumoto y col., 2000). En unos casos actúan como feromonas sexuales (Maier y Müller, 1986) y, en otros, como factores alelopáticos (Kakisawa y col., 1988). No es de extrañar, pues, la identificación en el caldo de cultivo de n-alcanos (40, n= 12, 14, 17-20, 23-24) y ácidos grasos libres (44, n= 11; 50). III-3.3. Estudio químico del micelio Después de extraer el caldo de cultivo y fraccionarlo según la Figura III-16 se rastreó minuciosamente todas las fracciones, tanto por GC-MS para sus componentes volátiles como por refraccionamiento (CCF, cromatografía en columna, cromatografía de exclusión por tamaño molecular) y estudio espectroscópico (RMN) identificándose y cuantificándose las siguientes sustancias: C Ca ap pí ít tu ul lo o I II II I 127 III-3.3.1. Componentes volátiles en el micelio Se identificaron y cuantificaron por GC-MS, lo que rindió los datos de la Tabla III-2. Si se reunen dichas sustancias por criterios estructurales (Figuras III-17 hasta III-24) se puede deducir que se han identificado y cuantificado n-alcanos (40), 1-alquenos (41), 1-alcanoles (42), 2-alquil1-alcanoles (43), ácidos grasos libres - saturados (44, 48) e insaturados (46) -, amidas de ácidos grasos (51), ésteres metílicos y etílicos de ácidos grasos - saturados (45, 49, 56, 57) e insaturados (47, 52-55) -, triglicéridos insaturados (58), diglicéridos (59), monoglicéridos - saturados (61) e insaturados (60, 62, 63) -, ceras - ésteres de ácidos y alcoholes grasos (64, 65 y 70) -, éteres grasos (68), catabolitos lipídicos (71-73), mono-, sesquiy diterpenos de cadena lineal (75-77), hidrocarburos aromáticos de la ruta del ácido shikímico (78, 79) y ftalatos de dialquilo (83-85). MICELIO Tr (min.) mg ppm (mg x kg-1) 12,075 Dodecano (40; n= 9) 0,0003 0,0036 12,166 ± 0,012 Éster metílico del ácido (2-pentadecil-1,3-dioxolan-4-il) hexadecanoico (61) 3,27 36,37 12,437 1-Dodecanol (42; n= 10) 0,0002 0,0022 12,524 ± 0,007 2-Butil-1-octanol (43; n= 3, m= 3) 0,39 4,34 13,235 Tetradecano (40; n= 11) 0,0058 0,065 13,252 2-Hexil-1-octanol (43; n= 3, m= 5) 0,055 0,61 13,427 (Z,Z)-1,1´-[1,2-etanodiil bis(oxi)]bis9-octadeceno (68) 0,0005 0,0052 13,454 4-Hidroxi-benzaldehido (78) 0,10 1,11 13,684 ± 0,004 Éster metílico del ácido 9-oxo-nonanoico (71) 3,57 39,71 13,830 Éster metílico del ácido 10-undecenoic o (72) 0,23 2,56 13,972 1-Pentadeceno (41; n= 12) 0,098 1,09 14,005 Isovalerato de geranilo (75) 10,28 114,35 14,471 3,7,11-trimetil-1-dodecanol (76) 0,34 3,78 14,751 Éster 1-(hidroximetíl)-1,2-etanodiilico del ácido hexadecanoico (59) 0,050 0,56 14,771 ± 0,005 Ácido tetradecanoico (44; n= 12) 0,0013 0,0145 14,843 ± 0,002 1-Hexadeceno (41; n= 13) 0,96 10,68 14,857 ± 0,010 1-Tridecanol (42; n= 11) 0,29 3,23 15,063 ± 0,001 Ftalato de dietilo (83; n= 1) 0,24 2,67 15,548 ± 0,006 Benzofenona (79) 1,56 17,35 15,602 Éster dibutílico del ácido hexanodioico (81) 0,039 0,43 15,642 ± 0,000 Heptadecano (40; n= 14) 0,024 0,27 15,655 ± 0,015 2-Hexil-1-decanol (43; n= 5, m= 5) 0,37 4,12 15,890 ± 0,008 Éster metílico del ácido tetradecanoic (45; n= 12) 0,164 1,82 15,906 Ácido pentadecanoico (44; n= 13) 0,22 2,45 16,220 Ácido cis-3-octil-oxiranooctanoico (48) 0,045 0,50 16,338 ± 0,010 1-Hexadecanol (42; n= 14) 0,32 3,56 16,348 ± 0,022 1-Eicosanol (42; n= 18) 1,80 20,02 C Ca ap pí ít tu ul lo o I II II I 128 MICELIO Tr (min.) mg ppm (mg x kg-1) 16,418 Octadecano (40; n= 15) 0,20 2,22 16,501 Éster (Z)-eicosílico del ácido 9-hexadecenoico (65; n= 5) 0,14 1,56 16,509 Éster metílico del ácido 2-octilciclopropanododecanoico (49) 0,63 7,01 16,538 Ácido 9-hexadecenoico (46; n= 5, m= 7) 1,01 11,23 16,604 ± 0,020 Éster metílico del ácido pentadecanoico (45; n= 13) 2,89 32,15 16,711 6,10,14-trimetil2-pentadecanona (77) 1,43 15,91 17,008 ± 0,001 Ftalato de bis(2-metilpropilo) (84; n= 1) 1,18 13,13 17,160 ± 0,015 Éster metílico del ácido (Z)-9-Hexadecenoico (47; n= 5, m= 7) 34,40 382,66 17,273 ± 0,006 Éster metílico del ácido 14-metil-pentadecanoico (56) 15,00 166,85 17,289 ± 0,019 Éster metílico del ácido hexadecanoico (45; n= 14) 169,38 1884,09 17,653 ± 0,009 Ftalato de dibutilo (83; n= 3) 20,15 224,14 17,928 ± 0,020 Éster metílico del ácido heptadecanoico (45; n= 15) 0,87 9,68 18,352 Éster etílico del ácido 13-formiltridecanoico (73) 0,099 1,10 18,360 ± 0,008 9-Octadecenamida (51) 0,86 9,57 18,385 ± 0,004 Éster metílico del ácido 11-octadecenoico (47; n= 5, m= 9) 26,18 291,21 18,389 Trioleina (58) 0,26 2,89 18,394 ± 0,009 Éster metílico del ácido 8,11-octadecadienoico (52; n= 5, m= 6) 9,06 100,78 18,550 ± 0,028 Éster metílico del ácido octadecanoico (45; n= 16) 5,46 60,73 18,558 Éster metílico del ácido 16-metil-heptadecanoico (57) 1,04 11,57 18,811 Éster 2-hidroxi-1-(hidroximetil)-etílico del ácido (Z,Z)-9,12-octadecadienoico (62) 0,064 0,71 18,962 Ácido eicosanoico (44; n= 18) 2,78 30,92 19,048 ± 0,058 Éster 2-(octadeciloxi) etílico del ácido hexadecanoico (70) 0,12 1,33 19,542 Éster metílico del ácido 7,10,13-eicosatrienoico (54) 12,60 140,16 19,748 ± 0,005 Tricosano (40; n= 20) 0,53 5,90 19,793 ± 0,024 Éster (Z,Z)-9-octadecenílico del ácido 9-Hexadecenoico (64; n= 5) 1,00 11,12 19,796 Éster (Z)-9-octadecenílico del ácido (Z)-9-octadecenoico (64; n= 7) 0,0040 0,0445 19,814 ± 0,004 Ácido (Z)-13-docosenoico (erúcico) (46; n= 7, m= 11) 0,93 10,34 19,8175 ± 0,001 Éster eicosílico del ácido (Z)-9-octadecenoico (oleico) (65; n= 7) 5,84 64,96 20,205 Éster metílico del ácido 6,9,12,15-docosatetraenoico (55) 7,73 85,98 20,413 Ftalato de bis(4-metilpentilo) (84; n= 3) 0,14 1,56 20,724 Éster metílico del ácido cis-(2-fenil-1,3-dioxolan-4-il)-9-octadecenoico (60) 0,38 4,23 21,454 Éster etílico del ácido (Z,Z)-9,12-octadecadienoico (linoleico) (53) 6,18 68,74 21,820 Pentacosano (40; n= 22) 2,86 31,81 22,143 Éster 2,3-dihidroxipropílico del ácido (Z,Z)-9,12-octadecadienoico (63) 4,40 48,94 22,244 Éster metílico del ácido docosanoico (45; n= 20) 0,46 5,12 22,486 1-Docosanol (42; n= 20) 2,28 25,36 22,648 ± 0,003 Ftalato de bis(2-etilhexilo) (85) 0,99 11,01 22,746 ± 0,013 Ftalato de dihexilo (83; n= 5) 0,86 9,57 25,823 Éster metílico del ácido tetracosanoico (45; n= 22) 1,14 12,68 26,389 ± 0,0226 Ftalato de dioctilo (83; n= 7) 3,34 37,15 Volátiles 369,29 4107,74 No volátiles 14434,71 160564,12 Totales 14804,00 164671,86 Tabla III-2. Componentes volátiles identificados y cuantificados en el micelio de Penicillium roqueforti. C Ca ap pí ít tu ul lo o I II II I 129 Obsérvese cómo las series homólogas de los componentes volátiles identificados se comportan de forma lineal en los gráficos que resultan de representar el tamaño de la cadena hidrocarbonada (Nº de C) frente al logaritmo del tiempo de retención (log Tr) (Figuras III-25 a III-29). n-Alcanos de Penicillium roqueforti 0 20 40 1,082 1,089 1,122 1,146 1,172 1,194 1,215 1,23 1,24 1,263 1,278 1,296 1,312 1,339 1,366 1,399 Log tr Nº de C Figura III-25. Comportamiento en CG de los n-alcanos de Penicillium roqueforti (40; n= 9, 11-12, 14-15, 17-20, 22-24) y patrones comerciales (40; n= 10, 13, 16 y 21). 1-Alquenos de Penicillium roqueforti 12 14 16 18 20 1,1453 1,1715 1,2137 Log tr Nº de C Figura III-26. Comportamiento en CG de los 1-alquenos de Penicillium roqueforti (41; n= 12-13) y el patrón comercial 1-octadeceno (41; n= 15). 1-Alcanoles de Penicillium roqueforti 0 10 20 30 1,0947 1,1719 1,2132 1,2135 1,3519 Log tr Nº de C Figura III-27. Comportamiento en CG de los 1-alcanoles de Penicillium roqueforti (42; n= 10-11, 14, 18 y 20). La posición cromatográfica del 1-eicosanol (42; n= 18) se comprobó por inyección de una muestra comercial del mismo. C Ca ap pí ít tu ul lo o I II II I 130 AGs saturados lineales 0 5 10 15 20 25 1,169 1,202 1,241 1,278 Log Tr Nº de C Figura III-28. Comportamiento en CG de los ácidos grasos saturados de cadena lineal identificados en Penicillium roqueforti (44; n= 12-13 y 18) y el ácido esteárico comercial (44; n= 16). EMAGs saturados de cadena lineal 0 10 20 30 1,1024 1,1587 1,2009 1,2362 1,2683 1,3263 1,3472 1,412 Log Tr Nº de C Figura III-29. Comportamiento en CG de los ésteres metílicos de los ácidos grasos saturados de cadena lineal encontrados en Penicillium roqueforti (45; n= 12-16, 20 y 22) y varios patrones comerciales (45; n= 8-11, 17-18). III-3.3.1.1. Presencia de ésteres metílicos de ácidos grasos ramificados en el micelio Los ácidos grasos metilramificados están ampliamente distribuidos en la naturaleza (Duncan y col., 1974; Perry y col., 1979; Seyama y col., 1983; Thiel y col., 1999; Carballeira y col., 2001; Nechev y col., 2002). Ahora se sabe que se forman por incorporación selectiva del metilmalonil-CoA por el enzima “ácido-graso-sintetasa” (Seyama y col., 1983) y que este paso biogenético es característico de bacterias que producen relativamente altas concentraciones de estos ácidos grasos isoy anteiso-metilramificados, los cuales son, por tanto, aceptados como marcadores moleculares de la materia orgánica de origen bacteriano (Leo y Parker, 1966; Cooper C Ca ap pí ít tu ul lo o I II II I 131 y Blumer, 1968, Cranwell, 1973; 1974; Grimalt y Albaigés, 1990; Kaneda, 1991; Carballeira y col., 2001). Es por ello que la identificación en P. roqueforti de los ésteres metílicos de los ácidos 14-metilpentadecanoico (56) y 16-metilheptadecanoico (57) - dos derivados de ácidos grasos isometilramificados -, es un indicio de la presencia de bacterias del genero Mycobacterium asociadas a este hongo (Lambert y col., 1986; Chou y col., 1996, Carballeira y col., 2001; Nechev y col., 2002). Aparte de su identificación por la huella dactilar en GC-MS, las isometilsustituciones propuestas en 56 y 57 se confirmaron por los fragmentos relativamente intensos que se observan en GC-MS para M+-43 (m/ z 227 y 255 respectivamente) junto a la disminución de las intensidades de los fragmentos M+-29 (m/ z 241 y 269 respectivamente) (Anderson, 1978). III-3.3.1.2. Presencia de ftalatos de dialquilo en el micelio El ftalato de bis-(2-etilhexilo) (85) se ha propuesto anteriormente como un auténtico metabolito en el hongo Penicillium olsonii (Amade y col., 1994). Sin embargo, esta sustancia, conocida tanto por las siglas internacionales DEHP {di(2-ethylhexyl)phthalate} como DOP (dioctylphthalate) se usa ampliamente como plasticida del PMMA {poly(methyl methacrylate)} y el PVC {poly(vinyl chloride)}. Esta sustancia emigra de los materiales plásticos y se introduce en los fluidos biológicos donde se bioacumula con el paso del tiempo, fenómeno que ha provocado incluso problemas de salud en seres humanos que han estado expuestos a diversos materiales plásticos (Freemantle, 2004). Es por ello que la identificación de las sustancias 83-85, tanto en el caldo de cultivo como en el micelio de P. roqueforti plantea dudas sobre su origen debido a que el cultivo masivo se realizó, precisamente, en recipientes de plástico (ver parte experimental). C Ca ap pí ít tu ul lo o I II II I 132 III-3.3.2. Componentes no volátiles identificados y cuantificados en el micelio de P. roqueforti El material “no volátil” obtenido a partir del micelio fue fraccionado y analizado por espectroscopía (fundamentalmente RMN) lo que ha llevado a deducir que está constituida sólo por alcanos de alto peso molecular (40; 1,29 %), ceras con estructura molecular del tipo 64-67 (0,37 %), ceras esteroidales insaturadas (1,11 %), ceras de otros tipos (2,73 %), ftalatos de alquilo de alto peso molecular (3,15 %), triglicéridos insaturados (trioleína 58 y otros; 2,56 %), peróxido del ergosterol (86; 12,63 %), 9(11)-dehidroperóxido del ergosterol (87; 2,15 %), 4hidroxibenzaldehído (78; 0,92 %), fosfoy glicolípidos no identificados (0,31 %) y compuestos polihidroxílicos - manitol 89 y la hexosa 92 - (72,78 %). Obsérvese que algunos de estos compuestos fueron descritos en el apartado anterior por haber sido detectados también como componentes volátiles. Entre estos componentes lipídicos no volátiles se pudieron purificar y caracterizar sólo las sustancias mayoritarias, a saber: trioleína (58), peróxido del ergosterol (86) y 9(11)- dehidroperóxido del ergosterol (87). Entre los componentes aromáticos monocíclicos de la ruta del ácido shikímico se pudo purificar y caracterizar el 4-hidroxibenzaldehído (78). Entre los componentes del metabolismo primario se identificaron el manitol (89) y una hexosa (92). La trioleína (58) se aisló pura a partir de la fracción menos polar del extracto del micelio como un aceite amarillento. En su espectro de IR se observan bandas a 3029,48; 3006,99 y 1653,08 (CH=CH); a 1738,68 (C=O) y a 1232,81 (C-O) y en su espectro de masas (Figura III-30) se observan fragmentaciones típicas de un trioleato de alquilo. A An ne ex xo os s 234 Anexo 53 • e e Espectro de t-NMR del Manitol (89) Current Dat, ｐＬｾ＠ ... tcrs NIJIE IIIn,lol ,- ｾ＠ f2 -"'0<1151110" Plra_tlrs ｾＢ＠ 20010810 ". 13 <11 ｛ｾｔ｟＠ ＢＬＬｾｃｬ＠ ..... 5 _ DIII' 13 ｾＭ '!lI>92 " 1638_ SQ..VE Nl ｾ＠ ｾ＠ ＬｾＬ＠ " • -19:!lCl no H' f1D1'("S I 113153 N, .. • 1<'60310 se, ｾ＠ "'" ｾ＠ 2!i 000 .... c ｾ＠ 31 U uSU " '"' .. ｾＬ＠ '" ., 00000000 IOC ｾ＠ •• 1"16 ." 100 00 uSU ｾ＠ '''' ." O OlOOOOO I.C ｾ＠ 31 09 " 12 00 uoec oo, " 0760200 wt. ＭＬｾ＠ 'X " - ProtesSLng Olr ... ,.r. " ｾＬｾ＠ • " ＧＶＷｾＲＳ＠ MH, - '" '" • " 3 QO Hl ｾ＠ • " ,.. 10 _ 0101 alr'"etlrs ex <OOOc. ftP 20. 060 PIIII ft 15m !jI H. ｦｾ＠ ＭＰＷｾｾＮ＠ f2 -55 22 NI CI!'OICM la 23958 PPIO/CI "lO! 772 7'5ti65 H"," CC,.t::\) A An ne ex xo os s 235 Anexo 54 ! Espectro de IH_NMR de Trioleína (58) , , , , ' , , I , , , , , 1 I , , , • , , , , j , i ¡ , i , i , , i i i i i , F i i i I i , i i , i i i , i i i , • , • , , , I ' , , , , I I , , i ' , i i , , i , , i ' , i , , , , i , i i i , '" • 7 6 5 , 3 , o A An ne ex xo os s 236 Anexo 55 ｾ･Ｚ＠ ent: + ｾｮ＠ P cq: AutoSpec EI+ Magnet BpM:55 Text, J .B0,rtnfif BpI:233499 TIC:4739166 Flags:ACC (¡n(J/eúYlóZ ) EI+ ( 70eV ) Espectro de masas (MS) de Trioleína (58) 2 +. a: Temp. fuente: 230C 1; xlO. ｏｏ ＭＭＭ ｾ ｟ ＮＲＮＳｅＵ＠ .2E5 .lE5 .DE5 .9E5 .BE5 .6E5 .5E5 . 4E5 . 3E5 .2E5 1.lE5 9.3E4 B.2E4 7 . 0E4 5.8E4 4.7E4 . 5E4 .3E4 .2E4 miz A An ne ex xo os s 237 Anexo 56 Espectro TOCSY de Trioleína (58) - , • • , • , 1 i 1 ,11 , ｾ＠ 3 J ｾ＠ ......:o: , , , , , , ＬＬ ｾ＠ • • • O • • • • "\ 0fl1 11 11 , , , , , , -• • • ｾ＠ ; I Ir I . _,,,, , ］ｾ＠ ; 1:· , , , , ¡ " . ＧｩｬＢＡｾｉＮＧ＠ r ｾＮ｟＠ i - I I , , • • •• , • ｾ＠ Ｎｧｾ ｾ ｉｾＱ＠ Ｘ｡ｾｾｪｾｾｾＡＡｾｾｉｾ＠ • a , , , , 1, • • • • • A An ne ex xo os s 238 Anexo 57 • " " Espectro de IH_NMR de Trioleína (58) ',T"T'"""T""T"T"TT"Tr,.,--r--y--,,-., , ¡-,-,;--t , , , , , " "" ｾｔ ｾＧ ｾＧｃ Ｇ ｾＢ Ｇ ｾＧｾＧ ｾ ｾＢＧ ｾ Ｇ ｾＧｾＧ＠ ＢＢｾＧｬ ｬ ｲＭＧ＠ ＮＬ Ｂｾ Ｌ ｾ ＬｾＬ＠ ＮＬＢｾＬｾＧ ｣ ＬｾＬ＠ ＢＢ ｾＧ ｾ Ｇ ｃ ＧｾＢＧｬｬｾＧ ｃＧｾ Ｂ Ｂ Ｇ ｾＧ ｾ ＧｾＬ＠ ＮＢＧｾＬｾＧ｣ＬｾＢＧｾＬｾＬ ｾ ＬｾＬ＠ TI' PII " B 6 4 2 ｾｴＮ＠ PeroootterS Pr. " L-j-I - ] f2 - ltQ!J",llon Plrueters O&te _ 20040!!06 ". "00 INSlfU1 Ｕｾ･｣ｴ＠ ..... ｾ＠ .. DJ.1IJ ... - ＬＬｾ＠ " ＢＧｾ＠ SCLVENT ,,"" "' " ｾ＠ , Ｌｾ＠ &250 000 HI nCIREs o 095361 HI '" 5 2429<'99 Sec ｾ＠ " ｾ＠ 90 !lOO u.", ｾ＠ !!I2!iusec " '" .. ｾＬ＠ · '" .. 0000000Q uc " 1 ¡>() une ... '" ＱＳＡｾＳＴ＠ 1+11 ""-,"" '" ,, -Procns,ng plrueters " ｾＬｾ＠ • ｾＮ＠ 1<'99993 MHZ ｾ＠ " Ｌｾ＠ • " . ｾ＠ "' '" • " '00 le NI'IA plo\ PlrlHler . " 20 00 c. '" 10 15. po_ li 3047 51 Hl Ｌｾ＠ -o 120 pp. " -JIi 01 It.! -• SIlII o""/c • ＢＧｾ＠ '" 18011 tIl/c. A An ne ex xo os s 239 Anexo 58 A An ne ex xo os s 240 Anexo 59 • e e ,,, ｐ･ｮｬ｣ｬｊｊＱｕｾ＠ rOQuefcrt¡ PrI-L-I-a-3 ｾｧｧｾｾｦｦｩｾｾｾｾｾｧｾﾡ･ｾ［＠ ﾡｧｾ［Ｚ｜［ＺＺＺＢＬｧＺｧＺｧＺｧＺｧＺｧＺｩ｜Ｌｩ｜ＬｾｒｬＢＢ＠ ｜｜ｾｾｾ＠ Espectro de It_NMR de Trioleína (58) , 200 , ,5<) , 100 I 1I 51 0 , O ..... -LI-. 3 , F2 - .lC"",,,llo" Plr ... lers OlIO ＲＰＰｾＰＸＰＶ＠ ". I1 22 ﾡｾｔ｟＠ SDen ..... , _ I).¡I¡ 13 ｾｾ＠ ＧＹＰｾＲ＠ " ,,- Stl.I'ENI "W ｾ＠ ｾＢ＠ ｾ＠ • Ｌｾ＠ 192JO 710 H. FlIR:S 1 1731S) ti. .. o ｾＲｴｩｏＩＮｪｏ＠ Ste ｾ＠ ＱＶＳ･ｾ＠ ｾ＠ 26 000 u.te • 37 ｉｾ＠ uste " 3000 K ｾＬ＠ ". .. 00000000 ,te "."... •• !Ulfi ", 11)(1.00 uste " ＬＬｾ＠ .. , • OlOOOOO ,te ｾ＠ ＬＬｾ＠ " 1200 usu ... 15 ｾ ＷＱｩＰＲＰＰ＠ MHI ＮｵＬｾ＠ ,x ,,- Pr.CUllng ｣ＮｲＬＢｉＮｉＧｾｓ＠ " ｾＬｾ＠ • 75 ｾＶＷＱＵｾｏ＠ ｾＬ＠ ｾ Ｎ＠ " ［ｾ＠ • " ) 00 H' ｾ＠ • ｾ＠ '00 lO _ 0101 p..-ntter. ｃｾ＠ 20 00 e. F1P 236 9.0 pe. n 17B1l 1 31 H. F2I' -11 861 "1>" F2 Ｍ ｜ＳＮｾ＠ ｾＶ＠ HI PI'MCM 12 ,.105 op,",e. HlO! 961 5383S II1/C. A An ne ex xo os s 241 Anexo 60 I 200 Espectro DEPT -135 del 4-Hidroxibenzaldebído (78) D .,.- "'" -y' .... po <./J ,J <!' .,. -< ｾ＠ -< :T ｾ＠ < r \ Ct>"c,n\ 00 .. Par_ter, NI.ME ,-{)j-II.'" ,- ｾ＠ - F2 AcQulSIlIO'I PM"Murs Oot. 20000608 h. , .. 59 ﾡｾＱ｟＠ sp ••• - ｾ＠ _ (k,.l 13 ｾＭ 0flIt!35 '" ｾｾ＠ SClI'E"l ACUle ｾ＠ ｾ＠ ｾ＠ • ｾ＠ 18516 516 ｾＬ＠ FlIRS o 211<'510 ｾＮ＠ • , Ｗｾ＼ｏ＠ 'oc ｾ＠ ＬＮｾ＠ ｾ＠ 21 000 "S" • 18 ｾＷ＠ use< " ｾ＠ .. " 1< GO un. "' 1100_< ｾＢ＠ 1450000000 ., Ｌｾ＠ 01 .. OOOOOOOO su " Ｌｾ＠ "., lOO 1312005 ...... . ｾ＠ '" "' a OO14'Sl so< " 22 o "soc " 2' o " .. e "" O 0000000 soc 2 ｾ＠ .. ." 75 11S26Sl OH. ｾＬｾ＠ 'X ｾ＠ • • ltlI6 "" 88.00 "se' Fl -.... 0< ... ,"'1 O"-_'.ro S! J:l76e 75 4617190 .... , '" " ｾＢＧ＠ " '" 10 _ 0101 o ...... ＬｾＮ＠ ｃ ｾ＠ 20 00 C. FIP .. '50000 .... F! 162., ｾ＠ ", F2I' -5 OCIO """ F2 -317).0", -o< 11 00000 oo./u A An ne ex xo os s 242 Anexo 61 • e e r oo- • • , ", Espectro de "t-NMR del 4-Hidroxibenzaldehído (78) ｾｔ＠ "" 11 0. .. P.c ... ,.r . 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