Propuesta de nuevas cepas probióticas para su uso en acuicultura

Dª MARÍA SORAYA DÉNIZ SUÁREZ, SECRETARIA DEL INSTITUTO UNIVERSITARIO DE SANIDAD ANIMAL Y SEGURIDAD ALIMENTARIA DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA. CERTIFICA Que el consejo de Doctores del Departamento en su sesión de fecha de junio de 2012 tomó el acuerdo de dar el consentimiento para su tramitación, a la tesis doctoral titulada: “PROPUESTA DE NUEVAS CEPAS PROBIÓTICAS PARA USO EN ACUICULTURA”, presentada por la doctoranda Dña. Lita Sorroza Ochoa, dirigida por el Catedrático D. Fernando Real Valcárcel y por el Doctor D. Daniel Padilla Castillo. Y para que así conste, y a efectos de lo previsto en el Art° 73.2 del reglamento de Estudios de Doctorado de esta Universidad, firmo la presente en Las Palmas de Gran Canaria, a 20 de mayo de dos mil doce. Anexo II UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA Instituto Universitario de Sanidad Animal y Seguridad Alimentaria PROGRAMA DE DOCTORADO EN SANIDAD ANIMAL Y SEGURIDAD ALIMENTARIA Título de la Tesis “PROPUESTA DE NUEVAS CEPAS PROBIÓTICAS PARA USO EN ACUICULTURA” Tesis Doctoral presentada por Dña. Lita Sorroza Ochoa Dirigida por el Catedrático D. Fernando Real Valcárcel y el Dr. D. Daniel Padilla Castillo El Director Fernando Real Valcárcel El Director Daniel Padilla Castillo La Doctoranda Lita Sorroza Ochoa Arucas, a 28 de mayo de 2012 D. FERNANDO REAL VALCÁRCEL, CATEDRÁTICO DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA EN EL DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA ANIMAL, PRODUCCIÓN ANIMAL, BROMATOLOGÍA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS DE LA FACULTAD DE VETERINARIA. INFORMA: Que la presente tesis doctoral titulada “PROPUESTA DE NUEVAS CEPAS PROBIÓTICAS PARA USO EN ACUICULTURA” realizada por Dña. Lita Sorroza Ochoa, Licenciada en Ciencias del Mar, para optar al grado de Doctora por la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, ha sido realizada bajo mi dirección y considerando que reúne las condiciones y calidad científica para optar al grado de Doctora, autorizo su presentación para que pueda ser juzgada por el tribunal correspondiente. Y para que así conste, firmo la presente en Arucas, a 28 de mayo de 2012. Fdo. Fernando Real Valcárcel D. DANIEL PADILLA CASTILLO, PROFESOR ASOCIADO DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA EN EL DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA ANIMAL, PRODUCCIÓN ANIMAL, BROMATOLOGÍA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS DE LA FACULTAD DE VETERINARIA. INFORMA: Que la presente tesis doctoral titulada “PROPUESTA DE NUEVAS CEPAS PROBIÓTICAS PARA USO EN ACUICULTURA” realizada por Dña. Lita Sorroza Ochoa, Licenciada en Ciencias del Mar, para optar al grado de Doctora por la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, ha sido realizada bajo mi dirección y considerando que reúne las condiciones y calidad científica para optar al grado de Doctora, autorizo su presentación para que pueda ser juzgada por el tribunal correspondiente. Y para que así conste, firmo la presente en Arucas, a 28 de mayo de 2012. Fdo. Daniel Padilla Castillo A mi madre y hermanos, Penélope, Elmer y Segundo por todo el amor brindado en el transcurso de mi vida ÍNDICE ÍNDICE DE TABLAS I ÍNDICE DE FIGURAS IV ABREVIATURAS EMPLEADAS VI I.-INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS 1 II.-REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 4 II.1.- Importancia de la Acuicultura 4 II.1.1.- La acuicultura en el mundo 4 II.1.2.- La acuicultura en la Unión Europea 6 II.1.3.- La acuicultura en España 7 II.1.4.- La acuicultura en las Islas Canarias 8 II.2.- Las enfermedades en piscicultura marina 9 II.2.1.- Enfermedades parasitarias 9 II.2.1.1.-Cryptocaryon irritans 10 II.2.1.2.-Amyloodinium ocellatum 10 II.2.1.3.-Furnestinia echeneis y Sparycotyle chrysophrii 10 II.2.1.4.-Enteromyxum leei 11 II.2.2.- Enfermedades víricas 11 II.2.2.1.-Encefalopatía y retinopatía viral 11 II.2.2.2.-Linfocistis 11 II.2.3.- Enfermedades bacterianas 12 II.2.3.1.-Pasteurelosis 12 II.2.3.2.-Vibriosis 13 II.2.3.3.-Flexibacteriosis 13 II.2.3.4.-Estreptococosis 14 II.3.- Vibriosis en Acuicultura 14 II.3.1.-Etiología 14 II.3.2.-Epidemiología y Patogenia 16 II.3.3.- Clínica y Lesiones 17 II.3.4.- Diagnóstico 18 II.3.5.-Métodos de prevención 18 II.3.6.- Tratamiento 19 II.4.- Antibióticos en Acuicultura 19 II.5.- Vacunas en Acuicultura 21 II.6.- Inmunoestimulantes en Acuicultura 23 II.7.- Probióticos en Acuicultura 25 II.7.1.- Bacterias ácido lácticas 27 II.7.2.- Funciones de la microbiota natural en los organismos vivos 28 II.7.3.- Criterios de selección de una cepa probiótica 29 II.7.4.- Mecanismos de acción de los probióticos 30 II.7.4.1.- Producción de compuestos inhibidores 30 II.7.4.2.- Competición por energía disponible o por compuestos químicos 33 II.7.4.3.- Competición por lugares de fijación 34 II.7.4.4.- Aumento de la respuesta inmune 35 II.7.4.5.- Mejora de la calidad del agua 37 II.7.4.6.- Contribución enzimática para la digestión 37 II.7.4.7.- Fuente de macro-micro nutrientes 38 II.7.5.- Los probióticos como preventivo de enfermedades en acuicultura 39 III.-MATERIAL Y MÉTODOS 48 III.1.- Aislamiento de cepas probióticas 48 III.2.- Selección de cepas probióticas 49 III.2.1.-Mecanismos de acción in vitro 49 III.2.1.1.- Inhibición del crecimiento de patógenos de interés en piscicultura 49 III.2.1.2.- Producción de sustancias antibacterianas 50 III.2.1.2.1.- Determinación de ácidos orgánicos 52 III.2.1.3.- Competición por nutrientes 53 III.2.1.4.- Resistencia a gradientes de pH y bilis 54 III.2.1.5.- Hidrofobicidad celular 55 III.2.1.6.- Adhesión de las bacterias al mucus intestinal 55 III.2.1.7.- Ensayo de exclusión competitiva 59 III.2.1.8.- Crecimiento de las cepas en el mucus intestinal 59 III.2.2.- Identificación de las cepas probióticas 60 III.2.3.- Otras características de las cepas probióticas seleccionadas 61 III.2.4.- Ensayo in vivo 64 III.2.4.1.- Determinación de la inocuidad de las cepas 64 III.2.4.2.- Incorporación del probiótico en la dieta experimental 65 III.2.4.3.- Colonización 66 III.2.4.4.- Efecto protector frente a una infección experimental con Vibrio anguillarum 66 III.3.- Análisis estadístico 69 IV.-RESULTADOS 70 IV.1.- Cepas probióticas obtenidas 70 IV.2.- Resultados de las pruebas in vitro de las cepas probióticas preseleccionadas 70 IV.2.1.- Producción de efecto inhibitorio del crecimiento frente a patógenos 70 IV.2.2.- Identificación de las cepas probióticas preseleccionadas 73 IV.2.3.- Producción de sustancias antibacterianas 77 IV.2.3.1.- Determinación de compuestos orgánicos en los sobrenadantes bacterianos utilizados 78 IV.2.4.- Competición por nutrientes 79 IV.2.5.- Resistencia a la bilis 80 IV.2.6.- Resistencia a gradientes de pH 82 IV.2.7.- Hidrofobicidad de la superficie celular 83 IV.2.8.- Adhesión al mucus intestinal 83 IV.2.9.- Exclusión competitiva 87 IV.2.10.- Crecimiento en mucus intestinal 89 IV.3.-Otras características de las cepas probióticas preseleccionadas 90 IV.3.1.- Patrón de sensibilidad antibiótica 91 IV.3.2.- Perfil de ácidos grasos 92 IV.4.- Ensayos in vivo 94 IV.4.1.- Inocuidad de las cepas probióticas preseleccionadas 94 IV.4.2.- Efecto protector del probiótico frente a una infección con Vibrio anguillarum 95 V.-DISCUSIÓN 99 V.1.- Nuevas cepas probióticas para la piscicultura marina 100 ÍNDICE FIGURAS Figura 1.- Inhibición del crecimiento de las cepas D3S1, L1 y L21 frente al patógeno Vibrio anguillarum 975-1 71 Figura 2.- Inhibición del crecimiento de las cepas D1, L1 y L21 frente al patógeno Photobacterium damselae subsp. piscicida 94/99 72 Figura 3.- Inhibición del crecimiento de las cepas D3S1, D1, L1 y L21 frente al patógeno Yersinia ruckeri 955 72 Figura 4.- Crecimiento y tinción de las 4 cepas preseleccionadas como probióticos, tras 24 horas de incubación 74 Figura 5.- Amplificación del ADN de las 4 cepas seleccionadas con los cebadores universales, antes de realizar la secuenciación 76 Figura 6.- Producción de sustancias antibacterianas en el pocillo sin neutralizar de la cepa L1 y L21 frente a Vibrio anguillarum, por el método de difusión en pocillo 77 Figura 7.- Producción de sideróforos en las 4 cepas preseleccionadas como cepas probióticas y de varias cepas de V. anguillarum utilizadas como control positivo 79 Figura 8.- Valores medios de supervivencia de las 4 cepas de probióticos en la bilis de las diferentes especies de peces estudiadas 81 Figura 9.- Viabilidad de las cuatro cepas probióticas estudiadas en una suspensión a pH entre 3 y 7 83 Figura 10.- Representación del porcentaje de adhesión a distintos sustratos de las 4 cepas probióticas estudiadas, mediante el método de radioactividad 85 Figura 11.- Representación del porcentaje de adhesión a distintos sustratos de las 4 cepas probióticas estudiadas, mediante el método de fluorescencia 86 Figura 12.- Dispersión de los porcentajes de adhesión de las 4 cepas probióticas estudiadas, mediante los métodos de radioactividad y de fluorescencia 87 Figura 13.- Porcentaje de exclusión de Vibrio anguillarum 975-1 por la acción de las diferentes cepas probióticas estudiadas, mediante radioactividad y fluorescencia 88 Figura 14.- Porcentaje de exclusión de P. damselae subsp. piscicida 94/99 por la acción de las diferentes cepas probióticas estudiadas, mediante radioactividad y fluorescencia 89 IV Figura 15.- Cortes histológicos de diferentes órganos de peces inoculados con las cepas probióticas estudiadas (muestras correspondientes al lote inoculado con E. gallinarum L1) 94 Figura 16.- Opacidad corneal y hemorragia en lubinas infectadas con la cepa V. anguillarum 975-1 96 Figura 17.- Úlceras en la piel de lubinas infectadas con la cepa V.anguillarum 975-1 96 Figura 18.- Signos de septicemia hemorrágica en lubinas infectadas con la cepa V. anguillarum 975-1 96 Figura 19.- Identificación de V. anguillarum mediante el perfil Api 20 E (BioMérieux) (código de lectura 324752756) 97 Figura 20.- Confirmación de V. anguillarum 975-1 mediante PCR a partir de muestras de órganos internos de los peces infectados 97 Figura 21.- Porcentaje de supervivencia de lubinas previamente alimentadas con los probióticos Vagococcus fluvialis L21 y Enterococcus gallinarum L1, frente a la infección por Vibrio anguillarum 975-1 98 Figura 22.- Características que deben ser investigadas de un probiótico, según la forma de administración del mismo en los peces 121 V ABREVIATURAS AM Agar Marino AS Agar sangre ASB Albumina Sérica bovina APROMAR Asociación Empresarial de Productos de Cultivos Marinos de España ADN Ácido desoxirribonucleico BAL Bacteria ácido láctica BHIA Agar Infusión Cerebro Corazón BHIB Caldo Infusión Cerebro Corazón BHT Butil hidroxitolueno CAS Agar sulfato azul cromo Ci mmol/ml Milimoles de Curio por ml C:M Cloroformo Metanol Col Colaboradores DO Densidad óptica DBA Dolichos Biflorus Aglutinina DPM Degradaciones por minuto FAO Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura g Fuerza de la gravedad HPLC Cromatografía líquida de alto rendimiento HDTMA Hexadeciltrimetilamonio Kpb Kilopares de bases NCBI Centro Nacional de Información Biotecnológica mg miligramos MGC Mucus Gástrico de Cerdo mRNA Ácido ribonucleico mensajero MRS Agar Man Rogosa y Sharpe VI Nm Nanómetros LMR Límite Máximo de Residuos LPS Lipopolisacáridos OIE Organización Internacional de Epizootias OMS Organización Mundial de la Salud pb Pares de bases PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa PBS Tampón fosfato salino rpm Revoluciones por minuto rRNA Ácido ribonucleico ribosomal SDS Dodecilsulfato sódico TCBS Agar Tiosulfato Citrato sales Biliares Sacarosa TAE Tris base ácido etilendiaminotetraacético TE Tris clorhídrico etilendiaminotetraacético TSA Agar Tripticasa-Soja TSB Caldo Tripticasa-Soja UV Ultra violeta ufc/ml Unidades formadoras de colonia por mililitro v/v Volumen por volumen VII I-INTRODUCCIÓN CONCLUSIONES 122 VI.- CONCLUSIONES PRIMERA.- Se propone por primera vez para su uso como probiótico en piscicultura marina a Vagococcus fluvialis, cepa L21, por sus excelentes resultados, tanto in vitro como in vivo. SEGUNDA.- Se propone por primera vez para su uso como probiótico en piscicultura marina a Enterococcus gallinarum, cepa L1, por su comportamiento adecuado, tanto in vitro como in vivo. TERCERA.- Vagococcus fluvialis L21 y Enterococcus gallinarum L1 son cepas probióticas que pueden utilizarse con efectividad para el control de la infección por Vibrio anguillarum en marinocultura. CUARTA.- Consideramos imprescindible integrar junto a las determinaciones clásicas in vitro, pruebas in vivo de una cepa probiótica antes de recomendar como definitivo su uso para una determinada especie. QUINTA.- Las técnicas para caracterizar y sugerir un nuevo probiótico en una especie tienen que depender de la forma de uso del producto final, cepa viva o sustancia antibacteriana extraídas, en su caso. SEXTA.- La determinación de la adherencia o la exclusión competitiva de una cepa al mucus intestinal ofrece resultados más precisos mediante el método por radioactividad que por el método de fluorescencia. VII-RESUMEN RESUMEN 123 VII.- RESUMEN La aplicación de métodos preventivos en la acuicultura, en los últimos años, mediante antibióticos, inmunoestimulantes o vacunas, no ha resuelto el problema de las enfermedades infectocontagiosas de manera definitiva. De aquí que se haga necesario explorar otros métodos de control de las enfermedades, que sean sostenibles desde el punto de vista del cuidado del medio ambiente, e íntegros con la salud general de los peces, como sucede con el uso de probióticos. En el presente trabajo nos hemos planteado como finalidad la descripción y evaluación de nuevas cepas probióticas, obtenidas a partir de especies de peces marinos de interés actual para la acuicultura, y que comparten, de hecho, un hábitat común cuando se cultivan en zonas suratlánticas o mediterráneas, como la dorada (Sparus aurata), lubina (Dicentrarchus labrax), corvina (Argyrosomus regius) y lenguado (Solea solea). Hemos identificado y evaluado completamente la actividad probiótica de 4 cepas de las 523 cepas aisladas originalmente. Para su evaluación hemos utilizado pruebas in vitro: producción de efecto inhibitorio del crecimiento frente a patógenos, producción de sustancias antibacterianas, competición por nutrientes, resistencia a la bilis, resistencia al pH, hidrofobicidad de la superficie celular, exclusión competitiva y crecimiento en el mucus intestinal de los peces. También hemos realizado una evaluación con pruebas in vivo. Concretamente se ha comprobado la inocuidad en la lubina de las cepas probióticas preseleccionadas, y se ha medido el efecto protector de las cepas frente una infección con Vibrio anguillarum. En algunos casos, se ha realizado la evaluación de una misma prueba mediante métodos alternativos. Hemos encontrado muy buenos resultados como probiótico para la cepa Vagococcus fluvialis L21, y un comportamiento adecuado para la cepa Enterococcus gallinarum L1, tanto in vitro como in vivo. Ambas han protegido con efectividad a la lubina frente a una infección experimental con Vibrio anguillarum, presentando un porcentaje relativo de supervivencia del 42,3 y 20%, respectivamente, respecto al grupo control. Es la primera vez que se propone el uso de V. fluvialis como probiótico para la acuicultura marina. Sugerimos que, en función de la forma de administración de una cepa probiótica, la evaluación de su actividad debe hacerse utilizando una batería de pruebas diferentes. VIII-SUMMARY SUMMARY 124 VIII.- SUMMARY In the last years, use of antibiotics, immunostimulants or vaccines as preventive methods in aquaculture has not solved the incidence of infectocontagious diseases, finally. To this effect, other methods for controlling the diseases must be explored, more careful with marine environment, but also integral with fish health, that it occurs with probiotics. We have tried to describe and evaluate new probiotic strains, as the main objective of the present work, which have been obtained from marine fish species with importance for aquaculture, and which, in fact, are sharing similar mediterranean or sur-atlantic places by culturing, such as gilthead seabream (Sparus aurata), sea bass (Dicentrarchus labrax), meagre (Argyrosomus regius) and sole (Solea solea). Four from 523 originally isolated strains have been identified and whole evaluated. Evaluation was made by in vitro tests: growth inhibition of pathogens by co-culture, production of antibacterial substances, competition by nutrients, fish bile and pH resistance, adhesion and competitive exclusion and growth in intestinal mucus of fish. We have also included in this evaluation some in vivo tests. Particularly, a harmless test and the level of protection against a fish challenge with Vibrio anguillarum were carried out in health European sea bass with pre-selected probiotic strains. In some cases, the evaluation of tests has also been carried out by other alternative methods. Vagococcus fluvialis L21 and Enterococcus gallinarum L1 have showed very good properties as probiotic strains for marine culture, as much in vitro as in vivo tests. Both bacterial strains have produced a very good protection of sea bass against experimental challenge with V. anguillarum, showing a relative percent survival 42.3 and 20%, respectively, respect control group. This is the first time proposing the probiotic effect of V. fluvialis for marine fish aquaculture. We also suggest that evaluation of probiotic activity must be done by a different way, assembling different tests, according to the method of administration of a probiotic strain in the experimental diet. BIBLIOGRAFÍA 128 Avendaño, R., Riquelme, C. 1999. Establishment of mixed probiotics and microalgae as food for bivalve larvae. Aquaculture Research 30, 893-900. Axelsson, L., 2004. Lactic acid bacteria: classification and physiology. En: Salminen S, von Wright A, Ouwehand A (eds). Lactic Acid Bacteria. CRC, Inc. New York, USA. 603. Baffone, W., Pianetti, A., Bruscolini, F., Barbieri, E., Citterio, B. 2000. Occurrence and expression of virulence-related properties of Vibrio species isolated from widely consumed seafood products. International Journal Food Microbiology 54, 9–18. Bagni, M., Archetti, L., Amadori, M. and Marino, G., 2000. Effect of long-term oral administration of an immunostimulant diet on innate immunity in sea bass (Dicentrarchus labrax). Journal of Veterinary Medicine Series B-Infectious Diseases and Veterinary Public Health 47, 745-751. Bagni, M., Romano, N., Finoia, M., Abelli, L., Scapigliati, G., Tiscar, P., Sarti, M., Marino, G. 2005. Shortand long-term effects of a dietary yeast beta-glucan (Macrogard) and alginic acid (Ergosan) preparation on immune response in sea bass (Dicentrarchus labrax). Fish Shellfish Immunology 18, 311-325. Balcázar JL, Vendrell D, de Blas I, Ruiz-Zarzuela I, Múzquiz JL. 2009. Effect of Lactococcus lactis CLFP 100 and Leuconostoc mesenteroides CLFP 196 on Aeromonas salmonicida Infection in brown trout (Salmo trutta). Journal Molecular Microbiology Biotechnology 17(3), 153-157. Balcázar JL., de Blas I., Ruiz-Zarzuela I., Cunningham D., Vendrell D., Muzquiz J.L. 2006. The rol of probiotics in aquaculture. Veterinary Microbiology 114, 173-186. Balcázar JL., Vendrell D., De Blas I., Ruiz-Zarzuela I., Gironés O., Múzquiz JL. 2007. In vitro adhesión and production of antagonistc compounds by lactic acid bacteria fish pathogens. Veterinary Microbiology 122, 373-380. BIBLIOGRAFÍA 129 Bandyopadhyay, P., Das Mohapatra, P. 2009. Effect of a probiotic bacterium Bacillus circulans PB7 in the formulated diets: on growth, nutritional quality and immunity of Catla catla. Fish Physiology Biochemistry 35, 467-478 Barbosa, J., Gibbs, P., Teixeira, P. 2010. Virulence factors among isolated from tradictional fermented meat products produced in the North of Portugal. Food Control 21, 651-656. Bauer, A., Kirby W., Sherris, J., Turck, M. 1966. Antibiotic susceptibility testing by standardized single disk method. American Journal Clinical Pathology 45, 493-496. Bezkorovainy, A. 2001. Probiotics: determinants of survival and growth in the gut. American Journal of Clinical Nutrition 73(2), 399-405. Bjorn, B., Hormbaek, T., Jacobsen, T., Barkholt, V., Granly, A. 2003. Leuconostoc carnosusm 4010 has the potential for use as a protective culture for vacuum-packet meats, culture, isolation, bacteriocin, identification, and meat application experiments. International Journal Food Microbiology 83(2), 171-184. Bogut, I., Milakovic, Z., Bukvic, Z., Brkic, S., Zimmer, R. 1998. Influence of probiotic (Streptococcus faecium M74) on growth and content of intestinal microflora in carp (Cyprinus carpio). Journal Animal Science 43, 231-235. Bruno, M., Montville, T. 1993. Common mechanistic action of bacteriocins from lactic acid bacteria. Applied Environment Microbiology 59, 3003–3010. Brunt, J., Austin, B. 2005. Use of a probiotic to control lactococcosis and streptococcosis in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Journal of Fish Diseases 28, 693–701. Brunt, J., Newaj-Fyzul, A., Austin, B. 2007. The development of probiotics for the control of multiple bacterial diseases of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum). Journal Fish Diseases 30 (10), 573-579. BIBLIOGRAFÍA 130 Buller, N. 2004. Biochemical Identification Tables. En: Bacteria from fish and other aquatic animals: a practical identification manual. CABI Publishing, CAB International. Wallingford, Oxfordshire OX10 8DE. Reino Unido. Burrells, C., William, P., Forno, P. 2001. Dietary nucleotides: a novel supplement in fish feeds 1. Effects on resistance to diseases in salmonids. Aquaculture 199, 159-169. Cabello, F. 2004. Antibióticos y acuicultura en Chile: Consecuencias para la salud humana y animal. Revista Médica Chilena 132,1001-1006. Cahill, M. 1990. Bacterial flora of fish. A review. Microbial Ecology 19, 21-41. Campos, CA., Rodríguez, O., Calo-Mata, P., Prado, M., Barros Velázquez, J. 2006. Preliminary characterization of bacteriocins from Lactococcus lactis, Enterococcus faecium and Enterococcus mundtii strains isolated from turbot (Psetta maxima). Food Research International 39, 356-364. Cano, M., Alonso, C., Garcia-Rosado, E., Rodríguez, S., Castro, D. Borrego, J. 2006. Lymphocystis disease virus detection in asymptomatic cultured gilt-head seabream (Sparus aurata, L.) using an immunoblot assay. Veterinary Microbiology 113,137141. Capkin, E., Altinok, I. 2008. Effects of dietary probiotic supplementations on prevention/treatment of yersiniosis. Journal Applied Microbiology 106(4), 11471153. Carnevali, O., deVivo, L., Sulpizio, R., Gioacchini, G., Olivotto, I., Silvi, S., Cresci, A. 2006. Growth improvement by probiotic in European sea bass juveniles (Dicentrarchus labrax, L.) with particular attention to IGF-1, myostatin and cortisol gene expression. Aquaculture 258(1-4), 430-438. BIBLIOGRAFÍA 131 Carnevali, O., Zamponi, M., Sulpizio, R., Rollo, A., Nardi, M., Orpianesi, C., Silvi, S., Caggiano, M., Polzonetti, A., Cresci, A. 2004. Administration of probiotic strain to improve sea bream wellness during development. International Aquaculture 12, 377– 386. Castex, M., Chim, L., Pham, D., Lemaire, P., Wabete, N., Nicolas, JL., Schmidely, P., Mariojouls, C. 2008. Probiotic P. acidilactici application in shrimp Litopenaeus stylirostris culture subject to vibriosis in New Caledonia. Aquaculture 275, 182–193. Castex, M., Lemairea, P., Wabetea, N., Chima, L. 2010. Effect of probiotic Pediococcus acidilactici on antioxidant defences and oxidative stress of Litopenaeus stylirostris under Vibrio nigripulchritudo challenge. Fish & Shellfish Immunology 28(4), 622631. Chabrillón, M., Rico, R.M., Arijo, S., Diaz-Rosales, P., Balebona, M.C., Moriñigo, M.A. 2006. Interferance of Listonella anguillarium with potentiel probiotic microogranisms isolated from farmed gilthead sea bream (Sparus aurata L.). Aquaculture Research 37, 78-86. Chabrillón, M., Rico, R.M., Arijo, S., Diaz-Rosales, P., Balebonz M.C., Morinigo, M.A. 2005. Interactions of microorganisms isolated from gilthead sea bream, Sparus aurata L., on Vibrio harveyi, a pathogen of farmed Senegalese sole, Solea senegalensis (Kaup). Journal of Fish Diseases 28, 531-537. Chang, C., Liu, W., 2002. An evaluation of two probiotics bacterial starians, Enterococcus faecium SF68 and Bacillus toyoi, for reducing edwardsiellosis in cultured European eel (Anguilla anguilla L). Journal of Fish Diseases 25, 311-315. Chen, C., Chen, S. 2001. Water quality management with Bacillus spp. in the highdensity culture of red-parrot fish Cichlasomia citrinellum 9 C synspilum. Nature Ambient Journal Aquaculture 63, 66–73. BIBLIOGRAFÍA 132 Chikindas, M., García-Garcera, M., Driesessen, A., Ledeboer, A., Nissen-Mejer, V., Abee, T., Konings, W. Venema, G. 1993. Pediocin PA-1, a Bacteriocin from Pediococcus acidilactici PAC1.0 Forms Hydrophilic Pores in the Cytoplasmic Membrane of Target Cells. Applied Environment Microbiology 59, 3577-3584. Chistiakov, D., Kabanov, F., Troepolskaya, D., Tischenko, M. 2010. A variant of the interleukin-1b gene in European sea bass, Dicentrarchus labrax L., is associated with increased resistance against Vibrio anguillarum. Journal Fish Diseases 33, 759-767. Christie, W. 1982. Lipid analysis. Oxford: Pergamon Press. Canada Ltd., Toronto Chythanya, R., Karunasagar, I., Karunasagar, I. 2002. Inhibition of shrimp pathogenic vibrios by a marine Pseudomonas I-2 strain. Aquaculture 208, 1-10. Cintas, L., Casaus, P., Hernández, P. 2000. Bacterias lácticas de origen alimentario: consideraciones taxonómicas y filogenéticas. Alimentaria 1, 61-70. Collado, M., Grzeskowiak, Ł., Salminen, S. 2007. Probiotic strains and their combination inhibit in vitro adhesion of pathogens to pig intestinal mucosa. Current Microbiology 55, 260–265. Collins, M., Farrow, J., Phillips, B., Ferusu, S., Jones, D. 1987. Classification of Lactobacillus divergens, Lactobacillus piscicola, and Some Catalase-Negative, Asporogenous, Rod-Shaped Bacteria from Poultry in a New Genus, Carnobacterium. International Journal Systematic and Evolutionary Microbiology 37 (4), 310-316. Colorni, A. 1987. Biology of Cryptocaryon irritans and Strategies for its Control. Aquaculture 67, 236-237. Crosa, J.H. 1980. A plasmid associated with virulence in the marine fish pathogen Vibrio anguillarum specifies an iron-sequestering system. Nature 284, 566-568. BIBLIOGRAFÍA 133 Cuesta, A., Esteban, M., Meseguer, J. 2002. Natural cytotoxic activity in seabream (Sparus aurata, L.) and its modulation by vitamin C. Fish & Shellfish Immunology 13, 97109. Dahiya, R., Speck, M. 1968. Hidrogen peroxide formation by lactobacilli and its effect on Sthaphylococcus aureus. Journal Dairy Science 51, 1568-1572. Daniels, C., Merrifield, D., Boothroyd, D., Davies, S., Factor, J., y Arnold, K., 2010. Effect of dietary Bacillus spp. and mannan oligosaccharides (MOS) on European lobster (Homarus gammarus L.) larvae growth performance, gut morphology and gut microbiota. Aquaculture 304 (1-4) 49-57. Desriac, F., Defer, D., Bourgougnon, N., Brillet, B., Le Chevalier, P., Fleury, Y. 2010. Bacteriocin as weapons in the marine animal-associated bacteria warfare: Inventory and potential applications as an aquaculture probiotic. Marine Drugs 8(4), 11531177. Díaz-Rosales, P., Salinas, I., Rodríguez, A. 2006. Gilthead seabream (Sparus aurata, L.) innate immune response alter dietary administration of heat-inactivated potential probiotics. Fish & Shellfish Immunology 20, 482-492. Dimitroglou, A., Merrifield, D., Carnevali, O., Picchietti, S., Avella, M., Daniels, C., Guroy, D., Davies, S. 2011. Microbial manipulations to improve fish health and production: A Mediterranean perspective. Fish & Shellfish Inmunology 30, 1-16. Doeschate, K. Coyne, V. 2008. Improved growth rate in farmed Haliotis midae through probiotic treatment. Aquaculture 284 (1-4) 174-179. Doménech, A., Fernández-Garayzábal, J., Pascual, C., García, J., Cutuli, M., Moreno, M., Collins, M., Domínguez, L. 1996. Streptococcosis in cultured turbot, Scophthalmus maximus (L.), associated with Streptococcus parauberis. Journal of Fish Diseases 19, 33-38. BIBLIOGRAFÍA 134 Donlan, R. 2002. Biofilm: Microbial life on surfaces. Emerging Infectectoius Diseases 8 (9), 881-890. Dopazo, C., Lemos, M., Lodeiros, C., Bolinches, J., Barja, J., Toranzo, A. 1988. Inhibitory acitivy of antibiotic-producing marine bacteria against fish pathogens. Journal of Applied Bacteriology 65, 97–101. Douillet, P. 2000a. Bacterial additives that consistently enhance rotifer growth under synxenic culture conditions 1. Evaluation of commercial products and pure isolates. Aquaculture 182, 249-260. Douillet, P. 2000b. Bacterial additives that consistently enhance rotifer growth under synxenic culture conditions 2. Use of single and multiple bacterial probiotics. Aquaculture 182, 241-248. Douillet, P., Langdon, C. 1993. Effects of marine bacteria on the culture of axenic oyster Crassostrea gigas (Thunberg) larvae. The Biological Bulletin 184, 36–51. Douillet, P., Langdon, C. 1994. Use of a probiotic for the culture of larvae of the Pacific oyster (Crassostrea gigas, Thunberg). Aquaculture 119, 25–40. Duff, D. 1942. The oral immunization of trout against Bacterium salmonicida. Journal Immunology 44, 87-94. Duwat, P., Cesselin, B., Sourice, S., Gruss, A. 2000. Lactococcus lactis, a bacterial model for stress response and survival. International Journal of Food Microbiology 55, 8386. Eiras, J. 1994. Elementos de ictiopatología. Fundação Eng. António de Almeida. Porto, 339. ElAamri, F., Padilla, D., Acosta, F., Caballero., M., Roo, J., Bravo, J., Vivas, J., Real, F. 2010. First report of Streptococcus iniae in red porgy (Pagrus pagrus, L). Journal of Fish Diseases 33, 901-906. BIBLIOGRAFÍA 135 Esteban, M.A., Cuesta, A., Ortuno, J., Meseguer J. 2001. Immunomodulatory effects of dietary intake of chitin on gilthead seabream (Sparus aurata L.) innate immune system. Fish & Shellfish Immunology 11, 303–315. Esteve-Gassent, M. D., Barrera, R., Amaro, C. 2004. Efficacy of oral re-immunisation after immersion vaccination against Vibrio vulnificus in farmed European eels. Aquaculture 231 (1-4), 9-22. FAO. 2002.- El estado mundial de la pesca y la acuicultura. FAO. 2008. La acuicultura: única forma de hacer frente al futuro déficit de pescado. Reunión de la FAO para la contribución de la acuicultura al desarrollo sostenible. Roma 2008. http://www.fao.org/newsroom/es/news/2008/1000701/index. Ferguson, RM., Merrifield, DL., Harper, GM., Rawling, MD., Mustafa, S., Picchietti, S., Balcázar, JL., Davies, SJ. 2010. The effect of Pediococcus acidilactici on the gut microbiota and immune status of on-growing red tilapia (Oreochromis niloticus). Journal Applied Microbiology 109(3), 851-862. Fgaier, H., y Eberl, H. 2011 Antagonistic control of microbial pathogens under iron limitations by siderophore producing bacteria in a chemist at setup. Journal of Theoretical Biology 273, 103–114. Finn, J. 1970. The protective mechanisms in diseases of fish. Veterinary Bulletin, Weybridge 40, 873-886. Fjellheim, A., Klinkenberg, G., Skjermo, J., Aasen, I., Vadstein, O. 2010. Selection of candidate probionts by two different screening strategies from Atlantic cod (Gadus morhua L.) larvae. Veterinary Microbiology 144 (1-2), 153-159. Fletcher, T.C. 1981. Non-antibody molecules and the defence mechanisms of fish. En: Pickering, A.D. (Ed.). Stress and Fish, Acad Press. 171-183. BIBLIOGRAFÍA 136 Folch, J., Lees, M. Sloane-Stanley, G.H. 1957. A simple method for theisolation and purification of total lipids from animal tissues. Journal Biological Chemestry 193, 265-275. Fredrickson, A. Stephanopolous, G. 1981. Microbial competition. Science 213, 972-979. Fukami, K., Nishijima, T., Hata, Y. 1992. Availability of deep seawater and effects of bacteria isolated from deep seawater on the mass culture of food microalga Chaetoceros ceratosporum. Nippon Suisan Gakkaishi 58 (5), 931–936. Fuller, R. 1989. Probiotics in man and animals. Journal Applied Bacteriology 66, 365-378. Galindo-Villegas, J., Masumoto, T., Hosokawa, H. 2002. Inmunostimulants and diseases resistance in Japanese flounder Paralichthys olivaceus. S-26. En: Proceedings of the 5th Korea-Japan Biannual Joint Meeting. Kunsan National University, Kunsa, Korea. García De la Banda I, Lobo C., León-Rubio, J., Tapia-Paniagua S., Balebona, M, Moriñigo M, Moreno-Ventas X., Lucas L., Linares F., Arce F, Arijo S. 2010. Influence of two closely related probiotics on juvenile Senegalese sole (Solea senegalensis, Kaup 1858) performance and protection against Photobacterium damselae subsp. piscicida. Aquaculture 306, 281-288. García de la Banda, I., Chereguini, O., Rasines, I. 1992. Influencia de la adición de bacteria lácticas en el cultivo larvario del rodaballo (Scophthalmus maximus L.). Boletín del Instituto Español Oceanográfico 8, 247–254. García, T., Otto, K., Kjelleberg, S., Nelson, D.R. 1997. Growth of Vibrio anguillarum in salmon intestinal mucus. Applied and Environmental Microbiology 63 (3), 1034– 1039. Gatesoupe, F. 1991. The effect of three strains of lactic bacteria on the production rate of rotifers, Brachionus plicatilis, and their dietary value for larval turbot, Scophthalmus maximus. Aquaculture 96, 335–342. BIBLIOGRAFÍA 137 Gatesoupe, F. 1994. Lactic acid bacteria increases the resistance of turbot larvae, Scophtalmus maximus, against pathogenic vibrio. Aquatic of Living Resource 8, 277282. Gatesoupe, F. 2002. Probiotic and formaldehyde treatments of Artemia nauplii as food for larval pollack, Pollachius pollachius. Aquaculture 212, 347–360. Gatesoupe, F. 2008. Updating the importance of lactic acid bacteria in fish farming: natural occurrence and probiotic treatments. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology 14 (1-3), 107-114. Gatesoupe, F., Lambert, C., Nicolas, J. 1999. Pathogenicity of Vibrio splendidus strains associated with turbot larvae, Scophthalmus maximus. Journal of Applied Microbiology 87 (5), 757-763. Gatesoupe, F., Zambonino-Infante, J., Cahu, C., Quazuguel, P. 1997. Early weaning of seabass larvae, Dicentrarchus labrax: the effect on microbiota, with particular attention to iron supply and exoenzymes. Aquaculture 158, 117–127. Gibson, L., Woodworth, J., George, A. 1998. Probiotic activity of Aeromonas media on the Pacific oyster, Crassostrea gigas, when challenged with Vibrio tubiashii. Aquaculture 169, 111–120. Gildberg, A., Johansen, A., Bøgwald, J. 1995. Growth and survival of Atlantic salmon (Salmo salar) fry given diets supplemented with fish protein hydrolysate and lactic acid bacteria during a challenge trial with Aeromonas salmonicida. Aquaculture 138, 23–34. Gildberg, A., Mikkelsen, H. 1998. Effects of supplementing the feed to Atlantic cod (Gadus morhua) fry with lactic acid bacteria and immuno-stimulating peptides during a challenge trial with Vibrio anguillarum. Aquaculture 167, 103–113. BIBLIOGRAFÍA 144 Kontchou, Y., Blondeau, R. 1990. Isolation and characterization of hydrogen peroxide producing Aerococcus sp. from soil samples. FEMS Microbiology Letter 68, 323327. Korun, J., Timur, G. 2008. Marine vibrios associated with diseased sea bass (Dicentrarchus labrax) in Turkey. Journal of Fisheries Sciences 2 (1), 66-76. Kumari, J., Sahoo, P.K. 2006. Dietary immunostimulants influence specific immune response and resistance of healthy and immunocompromised Asian catfish Clarias batrachus to Aeromonas hydrophila infection. Diseases of Aquatic Organism 70, 6370. Lara-Flores, M., Olvera-Novoa, M.A.,Guzmán-Méndez, B.E., López-Madrid, W. 2003. Use of the bacteria Streptococcus faecium and Lactobacillus acidophilus, and the yeast Saccharomyces cerevisiae as growth promoters in Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Aquaculture 216, 193-201. Lategan, M., Gibson, L. 2003. Antagonistic activity of Aeromonas mediastrain A199 against Saprolegnia sp., an opportunistic pathogen of the eel, Anguilla australis Richardson. Journal of Fish Diseases 26, 147-153. Lategan, M., Torpy, F., Gibson, L. 2004. Biocontrol of saprolegniosis in silver perch Bidyanus bidyanus (Mitchell) by Aeromonas media strain A199. Aquaculture 235, 77-88. Lauzon, H., Gudmundsdottir, S., Steinarsson, A., Oddgeirsson, M., Martinsdottir, E., Gudmundsdottir, B. 2010. Impact of probiotic intervention on microbial load and performance of Atlantic cod (Gadus morhua L.) juveniles. Aquaculture 310, 139144. Lawson, P., Falsen, E., Cotta, M., Terence, R. 2007. Vagococcus elongates sp. isolated from a swine-maure storage pit. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 57, 751-754. BIBLIOGRAFÍA 145 Lee, D., Ramos A, Macomber L, Shapleigh J. 2002. Taxis response of various denitrifying bacteria to nitrate and nitrite. Applied of Environmental Microbiology 68, 21402147. Leong, J. C., Fryer, J. 1993. Viral vaccines for aquaculture. Annual Review of Fish Diseases, 225-240. Leung, K. 1987. The rol of the proteases of Aeromonas hydrophila in infections of rainbow trout. Ph.D. Thesis Faculty of Graduate Studies. University of Guelph. Guelph. Ontario. Canada. Lewis, W., Morris, D. 1986. Toxicity of nitrite to fish: a review.Transactions of American Fish Society 155, 183-195. Leyton, Y., Riquelme, C. 2008. Vibrios en los sistemas marinos costeros. Revista biología marina y oceanografía 43 (3), 441-456. Li, J., Tan, B., Mai, K., 2009. Dietary probiotic Bacillus OJ and isomalto oligosaccharides influence the intestine microbial populations, immune responses and resistance to white spot syndrome virus in shrimp (Litopenaeus vannamei). Aquaculture 291 (12), 35-40. Li, J., Tan, B., Mai, K., Ai, Q., Zhang, W., Xu, W., Liufu, Z., Ma, H. 2006. Comparative study between probiotic bacterium Arthrobacter XE-7 and chloramphenicol on protection of Penaeus chinensis post-larvae from pathogenic vibrios. Aquaculture 253, 140-147. Limsuwan, T., Lovell, R. 1981. Intestinal synthesis and absorption of vitamin B12 in channel catfish. Journal Nutrition 111, 2125-2132. Liu, K., Chiu, Ch., Shiu, Y., Cheng, W. Liu, Ch. 2010. Effects of the probiotic, Bacillus subtilis E20, on the survival, development, stress tolerance, and immune status of white shrimp, Litopenaeus vannamei larvae Fish & Shellfish Immunology 28 (5-6), 837-844. BIBLIOGRAFÍA 146 Macey, B., Coyne, V. 2005. Improved growth rate and disease resistance infarmed Haliotis midae through probiotic treatment. Aquaculture 245, 249-261. Magariños, B., Couso, N., Noya, M., Merino, P., Toranzo, A.E., Lamas, J. 2001. Effect of temperature on the development of pasteurellosis in carrier gilthead seabream (Sparus aurata). Aquaculture 195, 17-21. Makras, L., De Vuyst, L. 2006. The in vitro inhibition of Gram-negative pathogenic bacteria by bifidobacteria is caused by the production of organic acids. International Dairy Journal 16, 1049-1057. Makridis, P., Martins, S., Vercauteren, T., Van Driessche, K., Decamp, O., Dinis, M. 2005. Evaluation of candidate probiotic strains for gilthead sea bream larvae (Sparus aurata) using an in vivo approach. Letters in Applied Microbiology 40, 274-277. Manning, T., Gibson, G. 2004. Prebiotics. Best Practice in Research Clinical Gastroenterology 18, 287-298. Mao, Jianqiang, Zhou, Guoqin, Chen, Bing, Du, Xuan, 2006. The effects of compound microorganisms on improving water quality. Journal of Aquaculture 27, 25-27. Martín, V., Vela, A., Gilbert, M., Cebolla, J., Goyache, J. Domínguez, L., FernándezGarayzábal, J.F. 2007. Characterization of Aerococcus viridans isolates from swine clinical specimens. Journal of Clinical Microbiology 3053-3057. Merrifield, D., Harper, G., Mustafa, S., Carnevali, O., Picchietti, S., Davies, SJ. 2011. Effect of dietary alginic acid on juvenile tilapia (Oreochromis niloticus) intestinal microbial balance, intestinal histology and growth performance. Cell Tissue Research 344 (1), 135-146. Meunpol, O., Lopinyosiri, K., Menasveta, P. 2003. The effects of ozone and probiotics on the survival of black tiger shrimp (Penaeus monodon). Aquaculture 220, 437-448. Michael, S. 2002. Fighting Marine Parasites. Aquarium Fish Magazine, October, 25-26. BIBLIOGRAFÍA 147 Minshew, B., Jorgensen, J., Counts, W., Falkon. S. 1978. Association of hemolysin production hemagglutination of human erythrocytes and virulence for chicken embryos of extraintestinal Escherichia coli isolates. Infection and Immunity 20, 5054. Mombelli, B., Gismondo, M.R. 2000. The use of probiotics in medicinal practice. International Journal of Antimicrobial Agents 16, 531-536. Montero, D., Fernandez-Vaquero, A., Tort, L., Caballero, M.J., Izquierdo, M. 2005. Efecto de los inmunoestimulantes en la resistencia a estrés en dorada (Sparus aurata) y lubina (Dicentrarchus labrax). Comunicación oral. X Congreso Nacional de Acuicultura. Gandía, España. Montville, T.J., Chen,Y. 1998. Mechanistic action of pediocin and nisin: recent progress and unresolved questions. Applied of Microbiology Biotechnology 50, 511-519. Moriarty, D.J.W. 1998. Control of luminous Vibrio species in penaeid aquaculture ponds. Aquaculture 164, 351–358. Motta, S. A., Brandelli, A. 2008. Evaluation of environmental conditions for production of bacteriocin-like substance by Bacillus sp. Strain P34. World Journal Microbiology Biotechnology 24, 641-646. Naik, A., Murthy, S., Ramesha, T. 1999. Effect of graded levels of G-probiotic on growth, survival and feed conversion of tilapia, Oreochromis mossambicus. Fish Technology 36, 63-66. Naiud, A., Bidlack, W., Clemens, R., 1999. Probiotic spectra of lactic acid bacteria (LAB). Critical Reviews in Food science and Nutrition 38, 130-136. Nakai, T., Park, S. 2002. Bacteriophage therapy of infectious diseases in aquaculture. Research Microbiology 153, 13-18. BIBLIOGRAFÍA 148 Nakai, T., Sugimoto, R., Park, K., Matsuoka, S., Mori, K., Nishioka, T., Maruyama, K. 1999. Protective effects of bacteriophage on experimental Lactococcus garvieae infection in yellotail. Diseases in Aquatic Organism 37, 33-41. Namba, A., Mano, N., Hirose, H. 2007. Phylogenetic abalysis of intestinal bacteria and their adhesive capability in relation to the intestinal mucus of carp. Journal in Applied Microbiology 102, 1307-1317. Naviner, M., Berge, P., Durand, P., Le Bris H. 1999. Antibacterial activity of themarine diatom, Skeletonema costatum, against aquaculture pathogens. Aquaculture 174, 1524. Nayak, S.K. 2010. Probiotic and immunity: A fish perspective. Fish & Shellfish Immunology 29, 2-14. Nikolopoulou, D., Moutou, E., Fountoulaki, B., Venou, B., Adamidou, S., Alexis, M. 2011. Patterns of gastric evacuation, digesta characteristics and pH changes along the gastrointestinal tract of gilthead sea bream (Sparus aurata L.) and European sea bass (Dicentrarchus labrax L.). Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology 162, (3) 157-288. Nikoskelainen, S., Ouwehand, A., Bylund, G., Salminen, S., Lilius, E. 2003. Immune enhancement in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) by potential probiotic bacteria (Lactobacillus rhamnosus). Fish & Shellfish Immunology 15, 443-452. Nikoskelainen, S., Ouwehand, A., Salminen, S., Bylund, G. 2001a. Protection of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) from furunculosis by Lactobacillus rhamnosus. Aquaculture 198, 229-236. Nikoskelainen, S., Salminen, S., Bylund, G., Ouwehand, A. 2001b. Characterization of the properties of human and dairy derived probiotics for the prevention of infectious diseases in fish. Applied and Environmental Microbiology 67 (6), 2430-2435. BIBLIOGRAFÍA 149 Noga, E., Smolowitz, R., Khoo, L.H. 2000. Pathology of shell disease in the blue crab, Callinectes sapidus Rathburn (Decapoda: Portunidae). Journal of Fish Diseases 23, 389-399. Nogami, K. Maeda, M. 1992. Bacteria as biocontrol agents for rearing larvae of the crab Portunus trituberculatus. Canadian Journal of Fisheries. Aquaculture Society 49, 2373-2376. Nogami, K., Hamasaki, K., Maeda, M., Hirayama, K. 1997. Biocontrol method in aquaculture for rearing the swimming crab larvae Portunus trituberculatus. Hydrobiologia 358, 291-295. Norqvist, A., Bergman, A., Skogman, G., Wolf-Watz, H. 1994. A field trial with the live attenuated fish vaccine strain Vibrio anguillarum VAN 1000. Bulletin of the European Association of Fish Pathologists 14, 156-158. Norqvist, A., Hagstrtlm, A., Wolf-Watz, H. 1989. Protection of rainbow trout against vibriosis and furunculosis by the use of attenuated strains of Vibrio anguillarum. Applied Environmental Microbiology 55, 1400-1405. Norqvist, A., Wolf-Watz, H. 1993. Characterization of a novelchromosomal virulence locus involved in expression of a major surface flagellar sheath antigen of the fish pathogen Vibrio anguillarum. Infection lmmunology 61, 2434-2444. Nya, E., Austin, B. 2011. Development of immunity in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) to Aeromonas hydrophila after the dietary application of garlic. Fish & Shellfish Immunology 30 (3), 845-850. Ocaña, V., Bru, E., De Rui Holgado, A., Nader-Macias M. 1999. Surface characteristics of lactobacilli isolated from human vagina. Journal of Genetic Applied Microbiology 45, 203-12. BIBLIOGRAFÍA 150 Olsson, J., Joborn, A., Westerdahl, A., Blomberg, L., Kjelleberg, S., Conway, P. 1992. Is turbot, Scophthalmus maximus (L.), intestine a portal of entry for the fish pathogen Vibrio anguillarum. Journal of Fish Diseases 19, 225-34. Olsson, J., Jöborn, A., Westerdahl, A., Blomberg, L., Kjelleberg, S., Conway, P. 1998. Survival, persistence, and proliferation of Vibrio anguillarum in juvenile turbot, Scophthalmus maximus, intestine and faeces. Journal of Fish Diseases 21, 1-10. Orozco-Medina, C., Maeda-Martínez, M., López-Cortés, A. 2002. Effect of aerobic Grampositive heterotrophic bacteria associated with Artemia Franciscana cysts on the survival and development of its larvae. Aquaculture 213, 15-29. Ortuño, J., Cuesta, A., Angeles Esteban, M. Meseguer, J. 2001. Effect of oral administration of high vitamin C and E dosages on the gilthead seabream (Sparus aurata L.) innate immune system. Veterinary Immunology and Immunopathology 79, 167-180. Ortuño, J., Esteban, M., Meseguer, J. 2003. The effect of dietary intake of vitamins C and E on the stress response of gilthead seabream (Sparus aurata L.). Fish & Shellfish Immunology 14, 145-156. O'Toole, R., Milton, D., Hörstedt, P., y Wolf-Watz, H. 1997. RpoN of the fish pathogen Vibrio (Listonella) anguillarum is essential for flagellum production and virulence by the water-borne but not intraperitoneal route of inoculation. Microbiology 143, 3849-3859. O'Toole, R., Von Hofsten, J., Rosqvist, R., Olsson, P, Wolf-Watz, H. 2004. Visualisation of zebrafish infection by GFP-labelled Vibrio anguillarum. Microbiol Pathology 37 (1), 41-46. Ouwehand, A., Salminen, S. 2003. In vitro adhesion assays for probiotics and their in vivo relevance. Microbial Ecology of Health Diseases 15, 175-178. BIBLIOGRAFÍA 151 Pacini F. 1854. Osservazioni microscopiche e deduzione patologiche sul colera asiatico. Gazette Medicale de Italiana Toscano Firenze 6, 405-412. Palermo, F., Mosconi, G., Avella, M., Carnevali, O., Verdenelli, M., Cecchini, C., Polzonetti-Magni, A. 2011. Modulation of cortisol levels, endocannabinoid receptor 1A, proopiomelanocortin and thyroid hormone receptor alpha mRNA expressions by probiotics during sole (Solea solea) larval development. General and Comparative Endocrinology 171(3), 293-300. Pan, X., Wu, T., Zhang, L., Song, Z., Tang, H., Zhao, Z. 2008. In vitro evaluation on adherence and microbial properties of a candidate probiotic Clostridium butyricum CB2 for farmed fish. Applied Microbiology 105, 16231629. Panigrahi, A., Kiron, V., Kobayashi, T., Puangkaew, J., Satoh, S., Sugita, H. 2004. Immune response in the rainbow trout Oncorhynchus mykiss inducedby a potential probiotic bacteria Lactobacillus rhamnosus JCM 1136. Veterinary Immunology and Immunopathology 102, 379-388. Panigrahi, A., Kiron, V., Puangkaew, J., Kobayashi, T., Satoh, S., Sugita, H. 2005. The viability of probiotic bacteria as a factor influencing the immuneresponse in rainbow trout Oncorhynchus mykiss. Aquaculture 243,241-254. Parker, B. 1974. Probiotic, the other half of the Antibiotic Story. Animal Nutrition and Health 29, 4-8. Pavanelli, G., Eiras, J., Takemoto, R. 1998. Doenças de peixes:profilaxia,diagnóstico e tratamento. Editora da Universida de Estadual de Maringá. Maringá, Paraná, Brasil. 264. Pazos, F. Santos, Y., Núñez, S., Toranzo, A. 1993. Increasing occurrence of Flexibacter maritimus in the marine aquaculture of Spain. FHS/AFS News Letters 21, 1-2. BIBLIOGRAFÍA 152 Pedersen K., Grisez L., Van Houdt R., Tiainen T., Ollevier F. Larsen J. 1999. Extended serotyping scheme for Vibrio anguillarum with the definition and characterization of seven provisional O-serogroups. Current Microbiology 38, 183-189. Pedersen, A., Dalsgaard, A. 2003. Species composition and microbial resistance genes of Enterococcus spp., isolated from integrated and traditional fish farms in Thailand. Environmental Microbiology 5 (5), 395-402. Pellitero, P.A. 1988. Enfermedades producidas por parásitos en peces. En: Patologia en acuicultura. Espinosa de los Monteros, J. y Labarta (Editores), Plan de Formación de Técnicos Superiores en Acuicultura, CAICYT. Ediciones Mundi-Press Libros. Madrid. 215-326. Penagos, G., Borato, P., Iregui, C. 2009. Sistema inmune y vacunación de peces. Acta Biológica de Colombia 14 (1), 3-24. Pérez, T., Balcázar, J.L., Peix, A., Valverde, A., Velázquez, E., de Blas, I., Ruiz-Zarzuela, I. 2010. Lactococcus lactis subsp. tructae subsp. nov. Isolated from the intestinal mucus of brown trout (Salmo trutta) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology 61(8), 1894-1898. Pérez, T., Balcázar, JL., Merrifield, D., Carnevali, O., Gioacchini, G., De Blas, I., RuizZarzuela, I. 2011. Expression of immune-related genes in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) induced by probiotic bacteria during Lactococcus garvieae infection. Fish & Shellfish Immunology 31, 2, 196-201. Phianphak, W., Rengpipat, S., Piyatiratitivorakul, S., Menasveta, P. 1999. Probiotic use of Lactobacillus spp. for black tiger shrimp, Penaeus monodon. Journal Science Research 24, 10-15. Pirarat, N., Kobayashi, T., Katagiri, T., Maita, M., Endo, M. 2006. Protective effects and mechanisms of a probiotic bacterium Lactobacillus rhamnosus against experimental Edwardsiella tarda infection in tilapia (Oreochromis niloticus). Veterinary Immunology and Immunopathology 113(1-3), 339-347. BIBLIOGRAFÍA 153 Pirofski, L.A. Casadevall, A. 1998. Use of licensed vaccines for active immunization of the immunocompromised host. Clinical Microbiology Reviews 11, 1-26. Planas, M., Pérez-Lorenzo, M., Hjelm, M., Gram, L., Øivind, I., Pintado, J. 2006. Probiotic effect in vivo of Roseobacter strain 27-4 against Vibrio (Listonella anguillarum) infections in turbot (Scophthalmus maximus L.) larvae. Aquaculture 255(1-4), 323-333. Planas, M., Vázquez, J., Marqués, J., Pérez-Lomba, R., González, M., Murado, M. 2004. Enhancement of rotifer (Branchionus plicatilis) growth by using terrestrial lactic acid bacteria. Aquaculture 240, 313-329. Poston, H. 1964. Effect of dietary vitamin K and sufaguanidine on blood coagulation time, microhematocrit and growth of immature brook trout. Progressive Fish Culturist 26, 59-64. Price, R., Lee, J. 1970. Inhibition of Pseudomonas species by hydrogen peroxide producing lactobacilli. Journal Milk Food Technology 33, 13-18. Pulsford, AL., Crampe, M., Langston, A., Glynn, PJ. 1995. Modulatory effects of disease, stress, copper, TBT and vitamin E on the immune system of flatfish. Fish & Shellfish Immunology 5, 631-643. Queiroz, F., Boyd, C. 1998. Effects of a bacterial inoculums in channel catfish ponds. Journal World Aquaculture Society 29, 67-73. Raa, J. 1996. The use of immunostimulatory substances in fish and shellfish farming. Review Fish Science 4, 229-288. Raida, M., Larsen, J., Nielsen, M., Buchmann, K. 2003. Enhanced resistance of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum), against Yersinia ruckeri challenge following oral administration of Bacillus subtilis and B. licheniformis (BioPlus2B). Journal of Fish Diseases 26, 495-498. BIBLIOGRAFÍA 160 Staykov, Y., Spring, P., Denev, S., Sweetman, J. 2007. Effect of mannan oligosaccharide on the growth performance and immune status of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquaculture International 15, 153-161. Strout, R., Sawyer, E., Countermash B. 1978. Pathogenic vibriosis in confinementreared and feral fishes of the Maine-New Hampshire coas. Journal Fish Research. Board of Canada 35, 403-488. Sugita, H., Chihiro, M., Yoshiaki, D. 1990. The vitamin B12-producing ability of intestinal bacteria isolated from tilapia and channel catfish. Nippon Suisan Gakk 56, 701-710. Sugita, H., Hirose, Y., Matsuo, N., Deguchi., Y. 1998. Production of the antibacterial substance by Bacillus sp. strain NM 12, an intestinal bacterium of Japanese coastal fish. Aquaculture 165 (3-4), 269-280. Sugita, H., Matsou, N., Shibuya, K., Deguchi, Y. 1991. The vitamin B12 producing ability of the intestinal microflora os freshwater fish. Aquaculture 92, 267-276. Sullivan, D. 2001. Screening of intestinal microflora for effective probiotic bacteria. Journal of Agriculture Food Chemistry 49, 1751-1760. Suminto-Hirayama, K. 1996. Effects of bacterial coexistence on the growth of a marine diatom Chaetoceros gracilis. Fisheries Science 62 (1), 40-43. Suminto-Hirayama, K. 1997. Application of a growth-promoting bacteria for stable mass culture of three marine microalgae. Hydrobiologia 358, 223-230. Sun, Y., Yang, H., Ru-Long, Ma., Wen-Yan, Lin. 2010. Probiotic applications of two dominant gut Bacillus strains with antagonistic activity improved the growth performance and immune responses of grouper Epinephelus coioides. Fish & Shellfish Immunology 29, 803-809. BIBLIOGRAFÍA 161 Suzer, C., Deniz Çoban, D., Kamaci, H., Saka, S., Firat, K. Otgucuoğlu, O., Küçüksari, H. 2008. Lactobacillus spp. bacteria as probiotics in gilthead sea bream (Sparus aurata, L.) larvae: Effects on growth performance and digestive enzyme activities. Aquaculture 280 (1-4) 140-145. Tapia-Paniagua, S., Chabrillón, M., Díaz-Rosales, P., De la Banda, I., Lobo C, Balebona, MC., Moriñigo, MA. 2010. Intestinal microbiota diversity of the flat fish Solea senegalensis (Kaup, 1858) following probiotic administration. Microbiology Ecology 60 (2), 310-319. Ten Brink, B., Minekus, M., Bol, J., Huis-Veld., J. 1987. Production of antibacterial compounds by Lactobacilli. FEMS Microbiololy Review 46-64. Thompson, F., Iida, T., Swings, J. 2004. Biodiversity of Vibrio. Microbiology and Molecular Biology Reviews 68, 403-431. Toledo-Arana, A., Valle, J., Solano, C., Arrizubieta, M.J., Cucarella, C., Lamata, M., Amorena, B., Leiva, J., Penades, J.R. Lasa, I. 2001. The enterococcal surface protein, Esp, is involved in Enterococcus faecalis biofilm formation. Applied Environment Microbiology 67, 4538-4545. Tolmasky, M., Actis L., Toranzo, A., Barja, J., Crosa HJ. 1985. Plasmids medianting iron uptake in Vibrio anguillarum strains isolated from turbot in Spain. Journal General Microbiology 131, 1989-1997. Toranzo, A. Barja, J., 1990. A review of the taxonomy and seroepizootiology of vibrio anguillarum, with special reference to aquaculture in the northwest of Spain. Diseases of Aquatic Organisms 9, 73-82. Toranzo, A., Barja, J. 1993. Virulence factors of bacteria pathogenic for coldwater fish. Annual Review of Fish Diseases 3, 5-36. Toranzo, A., Magarinos, B., Romalde, J. 2005. A Review of the main bacterial fish diseases in mariculture system. Aquaculture 246, 37-61. BIBLIOGRAFÍA 162 Torrecillas, S., Makol, A., Caballero, M. J., Montero, D., Robaina, L., Real, F., Sweetman, J., Tort, L., Izquierdo, M.S. 2007. Immune stimulation and improved infection resistance in European sea bass (Dicentrarchus labrax) fed mannan oligosaccharides. Fish & Shellfish Immunology 23, 969-981. Torrent, A., Déniz, S., Ruiz, A., Calabuig, P., Sicilia, J., Orós J. 2002. Esophageal Diverticulum Associated with Aerococcus viridians Infection in a Loggerhead Sea Turtle (Caretta caretta). Journal of Wildlife Diseases 38(1), 221-223. Torres, V. 1999. Flora Intestinal, Probióticos y Salud. Ed. Gráfica Nueva. México. Tovar, D., Mazurais, D., Gatesoupe, J., Quazuguel, P., Cahu, C., Zambonino-Infante, J. 2010. Dietary probiotic live yeast modulates antioxidant enzyme activities and gene expression of sea bass (Dicentrarchus labrax) larvae. Aquaculture 300 (1-4), 142147. Tovar, D., Zambonino, J., Cahu, C., Gatesoupe, F.J., Vazquez-Juárez, J. Lesel, R. 2002. Effect of live yeast incorporation in compound diet on digestive enzyme activity in sea bass (Dicentrarchus labrax) larvae. Aquaculture 204(1-2), 113-123. Tovar, D., Zambonino-Infante, J.L., Cahu, C., Gatesoupe, F.J., Vazquez-Juarez, R. 2004. Influence of dietary live yeast on European sea bass (Dicentrarchus labrax) larval development. Aquaculture 234, 415-427. Tseng, D., Ho, P., Huang, S., Cheng, Sh., Shiu, Y., Chiu, Ch., Liu, Ch. 2009. Enhancement of immunity and disease resistance in the white shrimp, Litopenaeus vannamei, by the probiotic, Bacillus subtilis E20. Fish & Shellfish Immunology 26, 339-344. Underdown, B. 1986. Inmunoglobulin A. Annual Review Inmunology 4, 389-417. Vadillo-Rodríguez, V., Busscher, H., van der Mei, H., de Vries, J., Norde, W. 2005. Role of lactobacillus cell surface hydrophobicity as probed by AFM in adhesion to surfaces at low and high ionic strength. Colloids and Surfaces B. Biointerfaces 41 (1), 33-41. BIBLIOGRAFÍA 163 Vallejo, M., Marguet, E., Etchechoury, V. 2008. Características de α−acetolactato sintetasa y producción de diacetilo por Enterococcus faecium ETw7 y Enterococcus faecalis ETw23. Revista Perú de Biología. 15(1), 97-100. Van der Marel, M., Schroers, V., Neuhaus, H., Steinhagen, D. 2008. Chemotaxis towards, adhesion to, and growth in carp gut mucus of two Aeromonas hydrophila strains with different pathogenicity for common carp, Cyprinus carpio L. Journal of Fish Diseases 31(5), 321-30. Varela, L., Ruiz-Jarabo, I., Vargas-Chacoff, L., Arijo, S., León-Rubio, M., García-Millán, I., Martín del Río, M., Moriñigo, M., Mancera, J. 2010. Dietary administration of probiotic Pdp11 promotes growth and improves stress tolerance to high stocking density in gilthead seabream Sparus auratus. Aquaculture 309, 265-271. Vaseeharan, B., Lin, J., Ramasamy, P. 2004. Effect of probiotics, antibiotic sensitivity, pathogenicity, and plasmid profiles of Listonella anguillarum like bacteria isolated from Penaeus monodon culture systems. Aquaculture 241, 77-91. Vázquez, J., Docosal, S., Mirón, J., González, M., Murado, A. 2005b. Proteases production by two vibrio species on residual marine media. Journal Industrial of Microbiology Biotechnology 33, 661-668. Vázquez, J., González, M., Murado, M. 2005a. Effect of lactic acid bacteria cultures on pathogens microbiota from fish. Aquaculture 245, 149-161. Vázquez-Juárez, R., Andlid, T., Gustafsson, L. 1994. Cell surface hidrofobicity and its relation to adhesion of yeasts isolated from fish gut. Colloids and Surfaces B. Biointerfaces 2(1-3), 199-208. Vendrell, D., Balcázar, J., Calvo, A., de Blas I., Ruiz-Zarzuela, I., Gironés, O., Múzquiz, J. 2009. Quantitative analysis of bacterial adhesion to fish tissue. Colloids Surf B Biointerfaces 71 (2), 331-333. BIBLIOGRAFÍA 164 Vendrell, D., Balcázar, J., de Blas I., Ruiz–Zarzuela, I., Gironés O., Múzquiz J. 2007. Protection of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) from lactococcosis by probiotic bacteria. Compared Immunology Microbiology Infect Diseases 31(4), 337-345. Venkat, H.K., Sahu, N.P., Jain, K. 2004. Effect of feeding Lactobacillus based probiotics on the gut microflora, growth and survival of postlarvae of Macrobranchium rosenbergii (de Man). Aquaculture Research 35, 501-507. Verschuere, L., Heang, H., Criel, G., Sorgeloos, P., Verstraete, W. 2000b. Selected bacterial strains protect Artemia spp. from the pathogenic effects of Vibrio proteolyticus CW8T2. Applied and Environmental Microbiology 66 (3), 1139-1146. Verschuere, L., Rombaut, G., Huys, G., Dhont, J., Sorgeloos, P., Verstraete, W. 1999. Microbial control of the culture of Artemia juveniles through preemptive colonization by selected bacterial strains. Applied and Environmental Microbiology 65, 2527-2533. Verschuere, L., Rombaut, G., Sorgeloos, P., Verstraete, W. 2000a. Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture. Microbiology and Molecular Biology Review 64, 655-671. Villamil, L., Figueras, A., Planas, M., Novoa, B. 2003. Control of Vibrio alginolyticus in Artemia culture by treatment with bacterial probiotics. Aquaculture 219, 43-56. Vincent, S., Minkler, P., Bincziewski, B., Etter, L., Shlaes, D. 1992. Vancomycin resitance in Enterococcus gallinarum. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1392-1399. Vine, N., Leukes, D., Kaiser, H. 2006. Probiotics in marine larviculture. FEMS Microbiology Review 30 (3), 404-427. Vine, N., Leukes, W., Kaiser, H., Daya, S., Baxter, J., Hecht, T. 2004. Competition for attachment of aquaculture candidate probiotic and pathogenic bacteria on fish intestinal mucus. Journal of Fish Diseases 27, 319-326. BIBLIOGRAFÍA 165 Wang, S., Lauritz, J., Jass, J., Milton, D. 2003. Role for the major outer membrane protein from Vibrio anguillarum in bile resistance and biofilm formation. Microbiology 149, 1061-71. Wang, W., Chi, Z., Chi, Z., Li, J., Wang, X. 2009. Siderophore production by the marinederived Aureobasidium pullulans and its antimicrobial activity. Bioresource Technology 100, 2639-2641. Wang, X., Wang, Q., Xiao, J., Liu, Q., Wu, H., Zhang, Y. 2010. Hemolysin EthA in Edwardsiella tarda is essential for fish invasion in vivo and in vitro and regulated by two-component system EsrAEsrB and nucleoid protein HhaEt. Fish & Shellfish Immunology 29, 1082-1091. Wang, Y., Han, J. 2007. The role of probiotic cell wall hydrophobicity in bioremediation of aquaculture. Aquaculture 269, 349-354. Wang, Y., Li, J., Lin, J. 2008b. Probiotic in aquaculture: Challenges and outlook. Aquaculture 281, 1-4. Wang, Y., Tian, Z., Yao Z., Wei-fen, L. 2008a. Effect of probiotics, Enterococcus faecium, on tilapia (Oreochromis niloticus) growth performance and immune response. Aquaculture 3-4, 203-200. Wang, Zhiguo, Han, Xuemei, 2004. How to adjust water quality by using microorganism. Ningxia Journal Agriculture Forestry Science Technology 6, 60. Ward, J., Lum, M., Hall, D. 1986. Invasive Haemophylus influenza type b disease in Alaska: Background epidemiology for a vaccine efficacy trial. Journal of Infection Disease 153, 17-26. Wen, Z., Burne, R. 2002. Funtional genomics approach to identifying genes requerided for biofilm development by Streptococcus mutans. Applied and Environmental Microbiology 68, 1196-1203. BIBLIOGRAFÍA 166 Westerdahl, A., Olsson, J., Kjelleberg, S., Cownway, P. 1991. Isolation and characterization of turbot (Scophthalmus maximus) associated bacteria with inhibitory effects against Vibrio anguillarum. Applied and Environmental Microbiology 57, 2223-2228. Whittington, R., Lim, Ch., Klesius, H. 2005. Effect of dietary β-glucan levels on the growth response and efficacy of Streptococcus iniae vaccine in Nile tilapia, Oreochromis niloticus. Aquaculture, 248 (1-4), 217-225. www.fao.org/docrep/005/y7300s/y7300s06a.htm Yano, T., Mangindaan, P., Matsuyama, H. 1989. Enhancement of the resistance of carp Cyprinus carpio to experimental Edwardsiella tarda infection, by some β-1,3glucans. Nippon Suisan Gakkaishi 55, 1815-1819. Yeh, Sh., Chang, Ch., Chi-Yao Chang, Chi., Chun-Hung Liu, Ch., Cheng, W. 2008. Dietary sodium alginate administration affects fingerling growth and resistance to Streptococcus sp. and iridovirus, and juvenile non-specific immune responses of the orange-spotted grouper, Epinephelus coioides. Fish & Shellfish Immunology 25, (12), 19-27. Zhang, Q., Hongming, M., Mai, K., Zhang, W., Liufu Z., Xu, W. 2010. Interaction of dietary Bacillus subtilis and fructo-oligo saccharide on the growth performance, nonspecific immunity of sea cucumber, Apostichopus japonicas. Aquaculture 29 (2), 204-211. Zhou, X., Tian, Z., Wang, Y., Li, W. 2009. Effect of probiotic on larvae shrimp (Penaeus vannamei) based on water quality, survival rate and digestive enzyme activities. Aquaculture 287 (3-4), 349-353. Zhou, X., Tian, Z., Wang, Y., Li, W. 2010. Effect of treatment with probiotics as water additives on tilapia (Oreochromis niloticus) growth performance and immune response. Fish Physiology Biochemistry 36 (3), 501-509. BIBLIOGRAFÍA 167 Zlotkin, A., Chilmonczyk, SD., Eyngor, M., Hurvitz, A., Ghittino, C., Eldar, A. 1998. Trojan horse effect: fagocytemediated Streptococcus iniae infection of fish. Infection and Immunity 71, 2318-2325. X-ANEXOS ANEXOS 173 ANEXO II Otros medios y soluciones Medio CAS para la detección de sideróforos Agua destilada 750 ml NaOH 6 g PIPES 30,24 g MM9 x 10 100 ml Autoclavar y dejar enfriar hasta 50ºC para posteriormente añadir: Ácidos casaminos 30ml Glucosa al 20% 10ml 1M MgCl2 1ml 100 mM CaCl2 1ml CAS-HDTMA 100ml Ajustar pH final a 6,8 ± 0,2 a 25ºC Tampón Fosfato Salino (PBS) Composición por litro Dihidrogenofosfato potásico (KH2PO4; 1,4 mM) 0,24 g Cloruro potásico (KCl; 2,7 mM) 0,20 g Fosfato disódico (Na2HPO4; 0,01M) 1,44 g Cloruro sódico (NaCl; 0,137 M) 8 g Preparación: Mezclar todos los ingredientes en 1 litro agua destilada, agitar hasta que todos los ingredientes estén disueltos. Esterilizar a 121ºC durante 30 minutos. Composición del medio MM9 x 10 KH2PO4 3 g NH4Cl 5 g Agua destilada 1 litro ANEXOS 174 ANEXO II Otros medios y soluciones Soluciones para la determinación del mucus fijado Solución Buffer 0,01 mol/l PBS, pH 7,2 Solución tapizado NaHCO3 8,4 g NaCO3 10,6 g Agua destilada 500ml (pH 9,6) Solución de lavado Solución buffer adicionado con Tween 20 al 0,1% Solución sustrato Agua destilada 12 ml Dako-OPD 4 tabletas Agua oxigenada 30 % 5 µl Solución Stop 0,5 mol/ml H2SO4 al 95 % Solución conjugada PBS 12 ml EstreptavidinaHRP 6 µl (Dilución 1:2000) Solución bloqueadora 100 ml de agua destilada adicionado con 1g de Albúmina Sérica Bovina (ASB) Controles 0,002 mg BSA / ml en PBS como control negativo 0,002 mg mucus de estómago de porcino (sigma) /ml PBS como control positivo Lectina DBA Marcada con biotina 1:1000 en solución PBS ANEXOS 175 ANEXO II Otros medios y soluciones TAE 50X Composición por litro: Tris base 242 g Ácido acético glacial 57,1 ml Na2EDTA 100 ml Ajustar pH final a 8 ± 0,2 a 25ºC Nota: Se mezclan todos los ingredientes hasta que estén todos disueltos, se ajusta el pH y a partir de este concentrado preparamos la solución 1X, necesaria para la electroforesis. TE 1X Composición por litro: 10 ml de Tris-HCl (pH 8) 1M 2 ml EDTA (pH 8) 0,5 M 988 ml de agua destilada Dodecilsulfato sódico (SDS) 1% Composición por litro 10 g dodecilsulfato sódico en 1000 ml de agua destilada. ANEXOS 176 ANEXO III Casas comerciales empleadas BioMar BioMar Iberia, S.A., Dueñas, España. BioMérieux Biomerieux España S.A., Manuel Tovar Nº 45, Madrid. Invitrogen Invitrogen, S.A. Parque Mas Blau, Prat Llobregat, Barcelona España. Oxoid Oxoid Limited, Wade Road Basingstoke Hampshire RG24 8PW, UK. Promega Promega Biotech Iberica S.L., Alcobendas - Madrid, España. Pronadisa Laboratorios Conda, Torrejón de Ardóz, Madrid, España. Sigma Sigma-Aldrich Química, S.A. Cojóbar, Burgos, España. II-REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA XI-PUBLICACIONES DE LA TESIS EN REVISTAS JCR XiIAGRADECIMIENTOS AGRADECIMIENTOS 182 Esta es otra parte muy importante en este documento, hay muchas personas a las que quiero hacer público mi agradecimiento, y espero no olvidarme de ninguna de ellas, así que empezamos: Por supuesto al Dr. D. Fernando Real, Catedrático de Universidad y coordinador del Grupo de Investigación en Enfermedades Infecciosas e Ictiopatología del Instituto Universitario de Sanidad Animal y Seguridad Alimentaria de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, por su apoyo incondicional, por haber creído en mis posibilidades y por haberme proporcionado la oportunidad de formar parte de su grupo de investigación, y que a pesar de todos los inconvenientes que se presentaron a lo largo de este camino, supo estar ahí para hacer posible este sueño. De todo corazón le estaré eternamente agradecida. Gracias a mi otro Director, el Dr. D. Daniel Padilla por su confianza y dedicación. Asimismo quiero agradecer a todas mis compañeras de laboratorio Jimena, Judith, Fátima, Valentina y por supuesto a mi entrañable Lore, que ha sido mi gran apoyo, tanto en los buenos como en los malos momentos, y no cabe duda que los extrañaré a todos. También quiero extender mi agradecimiento a otros profesores que han participado en mi formación como el Dr. D. Félix Acosta, la Dra. Dña. Begoña Acosta, Dra. Dña. Ana Sofía Ramírez, Dra. Dña. María José Caballero, Dr. Gallardo, Dr. Santana del Pino, a mi querida Carmen Quintana, a Mercedes, Silvia, Tatiana, Orestes, a la gente del ICCM, a mi psicólogo favorito Nicolás, en fin a todos los amigos y conocidos, que directa o indirectamente han estado ahí apoyándome, y dándome ánimos en esta dura carrera. Al Dr. Miguel Aller de la Universidad de León y al Dr. Salvador Arijo de la Universidad de Málaga, gracias por haber compartido sus experiencias en este trabajo. Y por supuesto quiero dedicar este trabajo a mis grandes amores, Carmen, Penélope, Segundo y Elmer a quien le debo mi primer ordenador. Sin éste hubiese sido más difícil seguir estudiando. Y no puedo olvidarme de mi familia en Canarias, Cecilia, Carlos y de los pequeños Israel y José Carlos que durante todo este tiempo han estado ahí apoyándome en momentos difíciles, gracias familia los quiero mucho. AGRADECIMIENTOS 183 Y, finalmente, agradecerle a mi comadre y amiga Cecilia que junto a su esposo e hijos me hicieron sentir durante todo este tiempo como en casa. A pesar de la distancia, siempre los voy a llevar en mis recuerdos. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 4 II.- REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA II.1.- IMPORTANCIA DE LA ACUICULTURA II.1.1.- La acuicultura en el mundo El rápido crecimiento de la acuicultura en estas últimas cuatro décadas ha provocado que más de la mitad del pescado que se consume hoy en día proceda de esta industria. Dicha actividad, además de contribuir en la alimentación, también ha ayudado al desarrollo económico global. Según datos de la Organización de Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO, 2008), la acuicultura mundial produjo 73 millones de toneladas, frente a las aproximadamente 65 millones de toneladas procedentes de la pesca extractiva. En realidad, el volumen total de la pesca extractiva ascendió a 88,9 millones de toneladas, pero de ellas, casi 24 millones de toneladas se dedican a otros usos, principalmente piensos para ganadería terrestre, peces y crustáceos. La producción global de la acuicultura ha crecido de manera importante, pasando de 0,6 millones de toneladas en 1950 a 73 millones de toneladas en 2009. Hasta 2007 se mantenía esta tendencia al alza, marcada en el último cuarto del siglo XX. Pero sin embargo, en estos últimos años es perceptible una ligera desaceleración en el ritmo de crecimiento de la acuicultura a nivel mundial, así como también un marcado estancamiento de esta actividad en la Unión Europea. La acuicultura es una actividad que abarca muy variadas prácticas y una amplia gama de especies, sistemas y técnicas de producción. Puede definirse como el cultivo de organismos acuáticos con técnicas encaminadas a hacer más eficiente su producción y así contribuir con los esfuerzos para combatir el hambre y la malnutrición en los países en vías de desarrollo (APROMAR, 2011). A nivel mundial, los países asiáticos son los mayores productores acuícolas, entre los cuales, China lidera la actividad pesquera a nivel mundial, así como también en productos procedentes de la acuicultura (Tabla I). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 5 Tabla I.- Principales países productores de productos acuícolas, por toneladas anuales y tasa de variación interanual (APROMAR, 2011) PAÍS TONELADAS % CRECIMIENTO ANUAL República Popular de China 45.279.173 6,12 Indonesia 4.712.847 22,26 India 3.791.922 9,00 Vietnam 2.589.800 3,70 Filipinas 2.477.392 2,89 Tailandia 1.396.020 1,60 República de Corea 1.331.719 -4,52 Japón 1.243.336 4,68 Bangladesh 1.064.285 5,84 Noruega 961.840 10,45 Total de los principales países productores 64.848.334 6,76 Total resto de países 8.196.271 7,74 Total mundial 73.044.605 6,87 España (Ranking 19º país) 266.479 6,99 En volumen de producción, el alga laminaria japonica o wakame (Undaria pinnatifida), es la principal especie producida en el mundo con 4,9 millones de toneladas en 2009. La segunda especie es la carpa herbívora (Ctenopharyngodon idella) con 4,1 millones de toneladas, pero en relación con el valor de la producción, el langostino blanco (Litopenaeus vannamei) es la principal especie con 7.374 millones de euros, seguido por el salmón del Atlántico (Salmo salar) con un valor de 5.140 millones de euros (Tabla II). El éxito de la acuicultura moderna se basa en el control sobre la reproducción de las especies, en el mejor conocimiento de su biología, en el control de las enfermedades, en las innovaciones tecnológicas y en el desarrollo de alimentos específicos. La acuicultura, a pesar de ser una actividad que se realiza prácticamente en todo el mundo, solo produce avances sustanciales en los países que apuestan verdaderamente por ella. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 6 Tabla II.- Principales especies producidas en acuicultura en 2008 (APROMAR, 2011) ESPECIE NOMBRE CIENTÍFICO VALOR* % CRECIMIENTO ANUAL Langostino blanco Litopenaeus vannamei 7.374 1,6 Salmón del Atlántico Salmo salar 5.140 -8,8 Carpa herbívora Ctenopharyngodon idella 4.233 10,3 Carpa plateada Hypophthalmichthys molitrix 4.177 9,4 Carpa común Cyprinus carpio 3.349 11,4 Cangrejo de canal chino Eriocheir sinensis 3.198 10,4 Langostino tigre Penaeus monodon 2.918 9,0 Tilapia del Nilo Oreochromis niloticus 3.027 16,4 Carpa catla Gibelion catla 2.916 -1,7 Trucha arcoíris Oncorhynchus mykiss 2.721 25,4 Total de las 10 especies principales 39.055 6,0 Total resto de especies 49.064 4,7 Total acuicultura mundial 88.119 5,3 Dorada (Sparus aurata) (Ranking 38º especie) Lubina (Dicentrarchus labrax) (Ranking 39º especie) Rodaballo (Scophthalmus maximus) (Ranking 47º especie) 582 539 425 5,1 -13,6 6,8 * Valor Comercial en millones de euros II.1.2.- La acuicultura en la Unión Europea La producción de pescado mediante procedimientos modernos ha sido desde sus inicios en Europa un ejemplo satisfactorio de esta nueva actividad económica. En 2009 la Unión Europea llegó a producir 1.276.170 toneladas de productos de la acuicultura, representando el 19,6% del volumen de la producción acuática total (acuicultura y pesca extractiva), lo que supone una ligero aumento en lo que respecta al año anterior que fue del 19,2%. Entre los principales productos producidos en la Unión Europea se encuentran pescados de alto valor comercial y los moluscos, con unos volúmenes de producción del 49,4 % para peces y del 50,6 % para moluscos, mientras que económicamente representa el 69,6% y 30,4%, respectivamente. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 7 La producción total de productos acuáticos (acuicultura y pesca) en la Unión Europea alcanzó un máximo de 10,6 millones de toneladas en 1988. Desde entonces no ha cesado de decrecer a un ritmo anual del -2,2%. En 2009 esa cifra global se situó en 6,5 millones de toneladas. La producción de la acuicultura, aunque ligeramente creciente, ha sido insuficiente para compensar la caída de la pesca extractiva. En 2009 en la Unión Europea se produjeron 629.401 toneladas de pescado procedentes de la acuicultura, representado un 0,9 % más que en el año 2008. La principal especie cultivada en la Unión Europea es la trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss), de la que en 2009 se produjeron 195.544 toneladas, lo que representa un 32,1% del total de la producción europea de la acuicultura. La segunda especie es el salmón del Atlántico (Salmo salar) con 146.424 toneladas (23,3% del total). La tercera especie es la dorada (Sparus aurata) con 96.419 toneladas (15,3%). El Reino Unido es el Estado Miembro de la Unión Europea con una mayor producción de pescado de acuicultura en 2009, tanto en toneladas (147.035 toneladas, es decir, el 23,4%) como en valor (474 millones de euros, el 19,8%). Grecia es el segundo productor con 99.581 toneladas (15,8%) y 431 millones de euros (18,0%), mientras que España es el tercer país productor, con 64.200 toneladas (10,2%) y 286 millones de euros (15,5%). A pesar de todas estas cifras, puede concluirse que la piscicultura en la Unión Europea lleva estancada desde el año 2000 y no está desarrollando su potencial creador de riqueza y de empleo, todo ello a pesar de contar con condiciones físicas y ambientales adecuadas, tecnología puntera y empresas dispuestas a invertir. Por otra parte, este sector ha demostrado disponer de los conocimientos y medios para ser una actividad sostenible desde el punto de vista medioambiental, a la vez de ofrecer productos sanos, seguros y de calidad (APROMAR, 2011). II.1.3.- La acuicultura en España En España la mayor producción acuícola corresponde a moluscos, especialmente mejillones (Mytilus mytilus) con un 74% de la producción total, seguida por la producción de peces marinos que supone un 16% y un 10% para peces de acuicultura continental. Pero en 2010, la producción de peces marinos de cultivo tuvo una reducción del 9,4% respecto del año anterior, produciendo solo 43.888 toneladas anuales. Esta caída de las producciones ha ocurrido en todas las especies relevantes (dorada (Sparus aurata), lubina REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 8 (Dicentrarchus labrax) y rodaballo (Scophthalmus maximus)) y supone la primera reducción en los últimos 25 años de esta actividad. Es necesario recordar que en los primeros años de la presente década se habían registrado crecimientos medios del 20%, pero en los actuales momentos estos porcentajes han ido decreciendo, siendo necesario mantener un mínimo entre el 15 y 20% anual, para poder ser competitivos a nivel global. Actualmente, la Comunidad Autónoma de Valencia es la mayor productora de dorada (Sparus aurata) con el 37% de la producción total de esta especie a nivel nacional. En otras Comunidades Autónomas destaca Canarias con la lubina (Dicentrarchus labrax) ocupando el 30% de la producción total, Galicia en la que la producción de rodaballo (Scophthalmus maximus) alcanza el 97% y de lenguado el 83% de la producción total en España, y Murcia donde la corvina (Argyrosomus regius) representa el 56%. II.1.4.- La acuicultura en las Islas Canarias La Acuicultura en el Archipiélago Canario comienza a desarrollarse en la década de los 80 en Gran Canaria y Tenerife. La temperatura de las aguas que bañan el archipiélago, así como la calidad de la misma, constituyen el principal atractivo para las empresas que deciden instalar su actividad acuícola en las islas. Las especies más importantes cultivadas en Canarias son la dorada (Sparus aurata) y lubina (Dicentrarchus labrax) aunque también hay que tener en cuenta el cultivo de otras especies como el lenguado común (Solea solea), la corvina (Argyrosomus regius) o el bocinegro (Pagrus pagrus). Las Islas Canarias son la primera Comunidad Autónoma productora de lubina (Dicentrarchus labrax), con el 30% del total nacional. El resto de la producción de lubina (Dicentrarchus labrax) se distribuye entre Andalucía (29%), Murcia (19%), Valencia (19%) y Cataluña (2%). Asimismo, Canarias es la tercera Comunidad Autónoma productora de dorada (Sparus aurata) con un 15% de la producción total, y segundo en lenguado con el 15% (APROMAR, 2011). Según los datos proporcionados por la Viceconsejería de Pesca del Gobierno de Canarias, en Canarias se cultivaron unas 6.810 toneladas de dorada (Sparus aurata) y lubina (Dicentrarchus labrax) en 2010, lo que representa un ligero descenso respecto al año 2009. El sector acuícola canario, pese a que también sufre las consecuencias de la crisis, es optimista y considera que tiene futuro, por ello se sigue trabajando para conseguir REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 9 abrir nuevos mercados que den salida a dicha producción. Además, en los próximos años se prevé que el desarrollo de esta actividad sea exponencial, una vez aprobado el Plan Regional de Ordenación de la Acuicultura en Canarias, pero para que esto suceda, se deben mejorar algunos aspectos, como la no dependencia de la importación de alevines desde la península, ya que al día de hoy canarias no cuenta con instalaciones que se dediquen a la reproducción de peces para la venta (APROMAR, 2011). II.2.- LAS ENFERMEDADES EN PISCICULTURA MARINA En los últimos años, el aumento global de la producción de las especies acuáticas cultivadas se ha asociado con un aumento en el número y propagación de enfermedades infecciosas y parasitarias. Dichas enfermedades se presentan en los colectivos de peces, moluscos y crustáceos y pueden ser causadas por virus, bacterias, hongos y parásitos (Sindermann, 1990) y se pueden presentar en diferentes ambientes, como el marino, salobre o dulceacuícola. Pero para que se manifieste la enfermedad debe haber una interacción entre el patógeno, el hospedador y el medio ambiente (Toranzo y col., 2005), por lo que la aparición de las enfermedades infecciosas se encuentra normalmente asociada al deterioro de la calidad del medio acuático, a situaciones de estrés o factores nutricionales. En términos de producción, las enfermedades infecciosas son la causa mayoritaria de las pérdidas económicas en granjas acuícolas debido a la alta mortalidad de los animales, los costes de los tratamientos y el descenso de la producción. II.2.1.- Enfermedades parasitarias Los peces marinos pueden ser parasitados por diferentes especies, desde ectoparásitos de piel y branquias, hasta endoparásitos que parasitan órganos internos. Su presencia en peces cultivados depende en gran parte de las condiciones de cultivo, del origen de los peces y del ciclo de vida de los parásitos (Pellitero y col., 1988). La gravedad de las lesiones provocadas por los parásitos depende de diversos factores relacionados con el género del agente causal, su localización y el modo particular de actuación sobre el hospedador (Pavanelli y col., 1998). En España, entre las enfermedades parasitarias más importantes en piscicultura marina podemos encontrar las causadas por: REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 16 II.3.2.- Epidemiología y Patogenia El término vibriosis define una infección sistémica primaria, causada por varias especies de vibrios patógenos, donde Vibrio anguillarum, es el principal agente causante de epizootias. Este patógeno es importante en acuicultura por causar enormes pérdidas económicas a este sector, afectando especialmente a peces de ambientes marinos y salobres (Salmónidos y Perciformes), aunque también lo podemos encontrar en una gran variedad de moluscos y crustáceos (Korun y Timur, 2008). Presenta una amplia distribución geográfica, causando septicemia hemorrágica típica en más de 50 especies de peces, tanto de aguas cálidas como frías, donde podemos encontrar algunas especies como la anguila europea (Anguilla anguilla), anguila japonesa (Anguilla japonica), ayu (Plecoglossus altivelis), lubina (Dicentrarchus labrax), dorada (Sparus aurata), bacalao (Gadus morhua), fletán (Hippoglossus hippoglossus), salmón plateado (Oncorhynchus spp.), salmón del Atlántico (Salmo salar), trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss), rodaballo (Scophthalmus maximus), sargo (Acanthopagrus cuvieri), perca gigante (Lateolabrax japonicus) y medregal (Seriola quinqueradiata) (Anderson y Conroy, 1970; Strout y col., 1978; Tolmasky y col., 1985; Actis y col., 1999; Austin y Austin, 1999; Toranzo y col., 2005; Planas y col., 2006), pero los brotes generalmente se presentan entre primavera y otoño cuando existen cambios bruscos en la temperatura del agua. Como hemos visto, esta enfermedad es un proceso que está relacionado con la calidad y temperatura del agua, pero también se puede presentar como consecuencia de la contaminación producida por las heces de animales portadores (Sinderman, 1990). De forma natural, las diferentes especies del Género Vibrio que habitan en ambientes marinos y salobres son parte del tracto gastrointestinal de los organismos y se encuentran en dos formas, planctónicas en la columna de agua, y bentónica desarrollando biopelículas en el sedimento. Los vibrios juegan un papel importante en el ecosistema marino biodegradando la materia orgánica, pero también pueden actuar como patógenos de organismos acuáticos de importancia comercial (Leyton y Riquelme, 2008). Si bien para V. anguillarum se han descrito 23 serotipos (serotipo O1 al O23), según la nomenclatura europea (Pedersen y col., 1999), solo los serotipos O1 y O2, y en menor grado, el serotipo O3, son los responsables de la mayor parte de los brotes ocurridos REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 17 en la industria acuícola, mientras que los aislados pertenecientes a los restantes serotipos son considerados ambientales y no patogénicos (Toranzo y Barja, 1990). La vía de entrada no está bien definida aunque se sabe que las mucosas juegan un papel muy importante en este proceso (O’Toole y col., 2004). La habilidad de la bacteria para causar daño depende de muchos parámetros que permiten establecer al patógeno dentro del hospedador (Horne y Baxendale, 1983). Diferentes factores de virulencia están implicados en la patogenia de V. anguillarum, como son los sistemas de captación del hierro por la presencia de plásmidos (Crosa, 1980), presencia de más de un flagelo (Norqvist y Wolf-Watz, 1993), adhesinas y factores de adherencia (García y col., 1997; Rodkhum y col., 2006), lipopolisacáridos (O´Toole y col., 1997) o productos extracelulares que incluyen enzimas extracelulares (gelatinasa, elastasa, lecitinasa, lipasa), las citolisinas, citotoxinas, hemolisinas, enzimas proteolíticas y toxinas termoestables (Vázquez y col., 2005b). El factor de virulencia más estudiado es el sistema de captación de hierro codificado por el plásmido pJM1 de 65 Kpb. Los componentes de este sistema son un sideróforo llamado anguibactina y una compleja membrana receptora. Estos dos componentes son promovidos cuando la bacteria crece bajo condiciones limitantes de hierro. En la actualidad, gracias al estudio del genoma se han podido determinar varios genes relacionados con la virulencia de este patógeno (Rodkhund y col., 2005). II.3.3.- Clínica y Lesiones La vibriosis engloba un conjunto de síntomas característicos. Generalmente los peces presentan externamente las típicas lesiones de una septicemia hemorrágica, que se extiende en la piel principalmente alrededor de la cabeza, vientre y ano, así como en la base de las aletas. Asociado a este cuadro de septicemia hemorrágica, también es común observar exoftalmia bilateral y distensión abdominal. Con frecuencia los peces infectados presentan anorexia y anemia. Las branquias son pálidas con un exceso de secreciones mucosas pero, por lo general, no presentan necrosis. A nivel interno se puede observar un aumento del tamaño del bazo, petequias en hígado, y el intestino lleno de líquido transparente, acentuándose estos síntomas en intestino posterior y recto debido al gradiente de pH existente que limita el crecimiento de V. anguillarum en medio ácido (Noga y col., 2000). La vejiga natatoria se encuentra distendida en los peces moribundos lo que hace que estos animales naden muy cerca de la superficie. En casos agudos, el curso de la infección REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 18 es rápido, y la mayoría de los peces infectados mueren sin presentar síntomas clínicos (Actis y col., 1999). En cuanto a los alevines, éstos no presentan la típica forma hemorrágica aguda, y simplemente se observa degeneración del tejido cartilaginoso de los labios con un leve enrojecimiento de la piel alrededor de la mandíbula inferior y del opérculo. Asimismo, se ven a los alevines nadando lentamente muy cerca de la superficie, pero en algunas ocasiones pueden presentar una necrosis profunda en la cola y aleta caudal (Hjeltnes y Roberts, 1993). II.3.4.- Diagnóstico El diagnóstico se realiza con la observación de los signos clínicos, y su confirmación se realiza mediante el aislamiento e identificación del patógeno V. anguillarum, aunque también existen en el mercado kits rápidos de identificación. El cultivo se realiza a partir de órganos internos en diferentes medios de cultivo como el Agar sangre, TSA o el medio TCBS, para posteriormente identificar el patógeno por pruebas bioquímicas convencionales, sistema API (BioMérieux), pruebas inmunológicas como ELISA o serológicas para la confirmación del serotipo, así como también mediante métodos moleculares (PCR) (González y col., 2003). II.3.5.- Métodos de prevención La prevención frente a esta enfermedad se realiza mediante la vacunación y unas buenas normas de manejo que eviten el estrés, unidas a unas buenas medidas higiénicas. Para ello es necesario disminuir al máximo la contaminación orgánica, controlar los factores ambientales como oxigeno y temperatura, y evitar la manipulación excesiva de los peces (Sommerset y col., 2005). Existen en el mercado vacunas comerciales monovalentes y polivalentes contra la vibriosis. Este tipo de vacunas tradicionales denominadas bacterinas, consisten en utilizar la misma cepa bacteriana inactivada mediante tratamientos físicos, químicos, biológicos o una combinación de varios de estos métodos. También se han propuesto vacunas en las que se incluyen componentes de su propia membrana celular. En general, las vacunas dan una mejor protección del pez cuando son administradas por vía intraperitoneal, pero el método REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 19 mayoritariamente utilizado es mediante baño. Por otra parte, además de vacunas inactivadas, también se han utilizado vacunas hechas con la bacteria viva, pero modificada genéticamente (Ward y col., 1986; Norqvist y col., 1989). En especies marinas como la lubina (Dicentrarchus labrax), dorada (Sparus aurata) y rodaballo (Scophthalmus maximus), para controlar la vibriosis se vacuna por baño con una mezcla de bacterinas (serotipos O1 y O2) con peces de un tamaño entre 1 y 2 gramos, siendo necesario repetir la vacunación en espacios cortos de tiempo (3 veces en un mes) para obtener una mejor inmunización (Esteve-Gassent y col., 2004; Toranzo y col., 2005). II.3.6.- Tratamiento El tratamiento frente a la vibriosis se realiza mediante el uso de antibióticos de amplio espectro como la oxitetraciclina, nitrofurantoina, trimetoprim, florfenicol y ácido oxolínico (Aoki y col., 1984; Seljestokken y col., 2006). Estos medicamentos normalmente son administrados como aditivo en el alimento, pero los peces enfermos al presentar anorexia, no ingieren el pienso medicado adecuadamente, por lo que se dificulta su tratamiento por vía oral. No obstante, el uso excesivo de antibióticos y otros agentes quimioterapéuticos ha derivado en la aparición de cepas bacterianas resistentes, por lo que hoy en día alguno de estos han perdido su efectividad frente al control de la vibriosis (Jun y Woo, 2003; Li y col., 2006; Leyton y Riquelme, 2008). Por esta razón, es aconsejable el uso de inmunoestimulantes o de otras bacterias que inhiban el crecimiento de este patógeno, como el empleo de probióticos (Agius y col., 1983; Westerdahl y col., 1991; Sharifuzzaman y Austin, 2009; Chistiakov y col., 2010). II.4.- ANTIBIÓTICOS EN ACUICULTURA La práctica de la acuicultura, particularmente la forma intensiva, requiere a menudo el uso de agentes terapéuticos como métodos curativos y/o profilácticos. Estos agentes terapéuticos incluyen a los antibacterianos, antiparasitarios, antifúngicos, hormonas, etc. El número de sustancias químicas usadas en acuicultura es amplia, ya que son muchas las razones por las que pueden ser usadas, al requerirse en actividades básicas que van desde el mantenimiento de las instalaciones acuícolas y la desinfección de agua, hasta la obtención de color o la determinación del sexo en los peces (Alderman, 1998). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 20 Los antibióticos no se han utilizado siempre de forma responsable en la acuicultura, lo que ha llevado al desarrollo de bacterias resistentes (Kesarcodi-Watson y col., 2008), además de ocasionar posibles riesgos para la salud pública. Los riesgos medio-ambientales originados por su uso continuado están relacionados con su presencia en el medio acuático. Se tiene constancia de que la vida media de algunos antibióticos como la oxitetraciclina en sedimentos puede variar de 9 a 14 días, dependiendo de las corrientes de agua y de factores ambientales, provocando la destrucción de determinadas comunidades microbianas, y por ello el deterioro del medio ambiente. El reconocimiento de los riesgos asociados al uso de antibióticos ha llevado a muchos países de todo el mundo a modificar la legislación vigente sobre el empleo de antibióticos en general. Por tal razón, la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO), la Organización Mundial de la Salud (OMS), la Oficina Internacional de Epizootias (OIE) junto a varios gobiernos nacionales han planteado la limitación del uso de antibióticos en todos los sectores de la producción, y con especial énfasis en la acuicultura (Avella y col., 2010). Dentro del sector acuícola, se han establecido los límites máximos de residuos (LMR) de aquellas sustancias que supongan daños conocidos, y en algunos casos su total prohibición. Estados Unidos, Canadá y la Unión Europea han aprobado un limitado grupo de antibióticos para su uso en acuicultura debido a que en la industria del salmón, carpa y langostinos se llegaron a utilizar enormes cantidades de estas sustancias provocando la aparición de bacterias resistentes a los mismos (FAO, 2002). Existen varias estrategias para enfrentar el problema de los antibióticos en acuicultura. La primera consiste en limitar su uso en las empresas acuícolas o en su defecto establecer o aplicar obligatoriamente los límites máximos de residuos establecido en el Codex Alimentarius (Tabla IV). Una segunda opción consiste en evitar que los animales enfermen utilizando vacunas específicas e inmunoestimulantes, o bien a través del uso de microorganismos que actúen como probióticos. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 21 Tabla IV.- Límites máximos de residuos (LMR) de antibióticos y quimioterapéuticos para la acuicultura en la Unión Europea (FAO, 2002) PRODUCTO LMR (µg/Kg) ESPECIE REGLAMENTO DEL CONSEJO Sulfonamidas 100 Productoras de alimento 508/1999/CE Trimetoprim 50 Peces 508/1999/CE Amoxicilina 50 Productoras de alimento 508/1999/CE Ampicilina 50 Productoras de alimento 508/1999/CE Benzilpenicilina 50 Productoras de alimento 508/1999/CE Cloxacilina 300 Productoras de alimento 508/1999/CE Dicloxacilina 300 Productoras de alimento 508/1999/CE Oxacilina 300 Productoras de alimento 508/1999/CE Penetamato 50 Productoras de alimento 508/1999/CE Sarafloxacina 30 Salmónidos 508/1999/CE Clortetraciclina 100 Productoras de alimento 508/1999/CE Oxitetraciclina 100 Productoras de alimento 508/1999/CE Tetraciclina 100 Productoras de alimento 508/1999/CE Flumequine 600 Salmónidos 2728/1999/CE Ácido oxolínico 300 Peces 807/2001/CE Florfenicol 1000 Peces 1322/2001/CE II.5.- VACUNAS EN ACUICULTURA La vacunación es una herramienta tradicionalmente utilizada en acuicultura como método preventivo para el control de enfermedades infecciosas. El primer ensayo en peces fue descrito por Duff en 1942, quien vacunó oralmente truchas contra la forunculosis con una cepa de Aeromonas salmonicida inactivada con cloroformo. Estos peces fueron posteriormente enfrentados al patógeno y se obtuvo un buen nivel de protección, comparado con las mortalidades de los peces no protegidos por la vacuna. Sin embargo, numerosos ensayos posteriores no pudieron reproducir el éxito original de este primer estudio. La primera vacuna comercial se registró en Estados Unidos y fue contra la enfermedad de la boca roja en 1976. Simultáneamente, algunos investigadores de la Universidad Estatal de Oregón desarrollaron vacunas efectivas contra la vibriosis, dando REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 22 origen al nacimiento de la producción industrial de vacunas en acuicultura (Sommerset y col., 2005). Hoy en día, laboratorios como Hypra, Europharma y Schering-Plough tienen en el mercado vacunas comerciales como Icthiovac-TM, Icthiovac-VR, Icthiovac-PD, Alpha Marine, Aquavac, Garvetil, Furovac y Vibrogen 2, que actúan frente a la mayoría de las enfermedades infecciosas que afectan a la acuicultura como la vibriosis, forunculosis, pasteurelosis, enfermedad entérica de la boca roja, flavobacteriosis, septicemia entérica causada por Edwarsiella, lactococosis, estreptococosis y piscirikettsiosis, entre otras (Sommerset y col., 2005). Los principales métodos de vacunación en los peces utilizan la inmersión en la solución vacunal, la inyección intraperitoneal, inyección intramuscular (para vacunas ADN), administración oral, infiltración anal y el método de spray (Penagos y col., 2009). Los tipos de vacunas existentes, basadas en su contenido son:  Vacunas muertas o inactivadas.- También conocidas como bacterinas, son producidas a partir de un cultivo inactivado de la bacteria causante de la enfermedad. El tratamiento suele ser con formaldehido, fenol, cloroformo, etanol, etc o bien por calentamiento, congelación sonicación o luz UV.  Vacunas subcelulares.- Este tipo de vacunas están compuestas por toxinas inactivadas producidas por el patógeno, como pueden ser los productos extracelulares, fimbrias, material capsular aislados del propio microorganismo o purificados en laboratorio (Rappuoli y Del Giudice, 1999), inactivados, en su caso.  Vacunas vivas.- Por los estudios realizados, este tipo de vacuna presenta grandes ventajas ya que simula las condiciones reales de la enfermedad. En acuicultura este tipo de vacunas ha tenido especial interés en enfermedades víricas, donde los cultivos vivos utilizados son cepas avirulentas naturales, mutantes producidos espontáneamente o cepas derivadas empíricamente de mutagénesis química o pases in vitro (Norqvist y col., 1994).  Vacunas recombinantes.- También llamadas vacunas ADN, en ellas se clona el o los antígenos del patógeno capaz de despertar una respuesta inmune en el pez tras su administración. Recientemente, este tipo de vacunas ha demostrado resultados prometedores en diferentes ensayos experimentales contra enfermedades víricas, ya que induce potentes respuestas inmunitarias (Rocha y col., 2002). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 23 II.6.- INMUNOESTIMULANTES EN ACUICULTURA Los inmunoestimulantes son sustancias biológicas o productos químicos sintéticos que actúan sobre el sistema inmune, potenciando la función de los fagocitos y otros componentes del sistema inmune aumentando su actividad bactericida (Sakai, 1999). En la práctica todos los inmunoestimulantes son suplementos dietéticos y su uso está bastante extendido ya que permite a los animales poseer mayor resistencia frente a infecciones virales, bacterianas, hongos y parásitos, pero algunas de estas sustancias utilizadas no siempre son adecuadas en la acuicultura (Robertsen y col., 1990). A pesar de ello, su uso es bastante habitual en el sector acuícola, con el objetivo de incrementar la supervivencia ante cualquier situación estresante, como puede ser transporte, cambios de temperatura, manipulación periódica, o problemas patológicos. Los inmunoestimulantes que están actualmente disponibles en el mercado se han utilizado en diversas especies de peces, tanto marinos como de agua dulce así como también en crustáceos. Estas sustancias son derivados de extractos celulares de microorganismos como de la levadura (Saccharomyces cerevisiae), levaduras modificadas, o hidrolizadas con altos contenidos en oligosacáridos y nucleótidos (Kogan y Kocher, 2007). El inmunoestimulador más conocido y estudiado en peces es el 1,3-β glucano ya que mejora la respuesta inmune no-especifica, estimulando la actividad de la lisozima, del complemento, la acción fagocítica de los macrófagos, y la resistencia contra las infecciones bacterianas y virales, siendo utilizado para prevenir y reducir la mortalidad de los animales (Kumari y Shaoo, 2006; Sealey y col., 2008). El método más eficaz de administración de estas sustancias en los peces es por inyección, pero el más utilizado es la vía oral ya que minimiza la manipulación y puede ser usado en todos los tamaños de peces (Sakai, 1999), aunque la respuesta en los animales dependerá del tipo de producto utilizado, de la dosis suministrada, del régimen y vía de administración, o de la asociación con otros inmunoestimulantes (Bagni y col., 2005; Ai y col., 2007). En otras investigaciones se ha visto que la administración en la dieta de quitina, lactoferrina, 1-3β glucano, levamisol y vitamina C aumentan la resistencia a enfermedades REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 24 bacterianas en especies de peces de agua dulce y marina producidas por Aeromonas sp., Vibrio sp., Edwarsiella, Yersinia ruckeri, Streptococcus sp. (Anderson y Jeney, 1992; Jeney, 1997; Sakai, 1999; Sahoo y Mukherjee, 2002) y parasitarias, producidas por el protozoo Itchthyophthrius multifiliis (Kumari y Shaoo, 2006). Asimismo, en lubina (Dicentrarchus labrax) se ha encontrado un aumento en la actividad fagocítica con dietas suplementadas con una mezcla de levamisol y β-glucanos. Igualmente, la actividad del complemento y de la lisozima mejora en lubinas (Dicentrarchus labrax) alimentadas con dietas suplementadas con β-glucanos a partir de levaduras, vitamina C y vitamina E (Bagni y col., 2005). Dentro de los inmunoestimulantes se encuentran los llamados prebióticos. Estas sustancias se definen por regla general como ingredientes dietéticos formados por hidratos de carbono no digeribles. Asimismo, son alimentos que estimulan el crecimiento y la actividad de bacterias beneficiosas al organismo. Su principal función reside en el cambio potencial de la comunidad bacteriana intestinal a una dominada por bacterias beneficiosas, lo que favorece la inhibición de la colonización de organismos patógenos (Manning y Gibson, 2004). El uso de prebióticos en acuicultura es muy reciente si lo comparamos con estudios realizados en otras especies terrestres. Entre los prebióticos evaluados en peces tenemos la inulina, fructo oligosacáridos (FOS), fructo oligosacáridos de cadena corta, manano oligosacáridos (MOS), galacto oligosacáridos (GOS), xylooligosacáridos (XOS), arabinoxylo oligosacáridos (AXOS), isomalto oligosacáridos (IMO) y Grobioitc–A. Así, tenemos que los MOS son utilizados porque actúan como inhibidores de la unión de patógenos a las células epiteliales del intestino (Montero y col., 2005). Igualmente, en lubinas (Dicentrarchus labrax) se puede ver cómo la alimentación con MOS mejora la supervivencia de los peces frente a una infección con V. alginolyticus (Torrecilla y col., 2007). En la siguiente tabla detallamos algunos de los inmunoestimulantes estudiados en los últimos años en peces. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 25 Tabla V.- Inmunoestimulantes estudiados en peces II.7.- PROBIÓTICOS EN ACUICULTURA El uso de probióticos no es algo novedoso ya que su utilización se realiza desde la antigüedad, primero en humanos, animales terrestres, y recientemente, en acuicultura. El estudio de bacterias beneficiosas en humanos es muy amplio, y hace más de un siglo, Elie Metchnikoff en 1907, postuló que las bacterias ácido lácticas (BAL) ofrecían beneficios a la salud y llevaban a la longevidad. Sugirió así que la autointoxicación intestinal y el envejecimiento resultante podría suprimirse modificando la microbiota intestinal utilizando microbios útiles para sustituir a los microbios proteolíticos como Clostridium, desarrollando así una dieta con leche fermentada por la bacteria a la que denominó bacilo búlgaro (Underdown, 1986). INMUNOESTIMULANTE ESPECIE REFERENCIA Ajo Oncorhynchus mykiss Nya y Austin, 2011 Glucanos, vitamina E y vitamina C Thunnus maccoyii Kirchhoff y col., 2011 Ergosan Oreochromis niloticus Merrifield y col., 2011 Alginato de sodio Epinephelus coioides Yeh y col., 2008 MOS Oncorhynchus mykiss Staykov y col.,2007 Lactoferrina, Glucanos y Lectina Catla catla Kamilya y col., 2006 Lactoferrina, Levamisol y Glucanos Ictalurus punctatus Kumari y Sahoo, 2006 Quitina, chitosan y levamisol Cyprinus carpio Gopalakannan y Arul, 2006 Macrogard, Ergosan y Glucanos Dicentrarchus labrax Bagni y col., 2000 y 2005 β-Glucanos Oreochromis niloticus Whittington y col. (2005) Glucanos + Manosa Paralichthys olivaceus Honda, 2004 Astaxantina, vitamina E, vitamina C y arginina Paralichthys olivaceus Galindo-Villegas y col., 2002 Vitamina E Sparus aurata Cuesta y col., 2002 Levadura, α-tocoferol y vitamina C Sparus aurata Ortuño y col., 2001 y 2003 Nucleótidos y β-glucano Salmonidae Burrells y col., 2001 Quitina Sparus aurata Esteban y col., 2001 Lactoferrina Cyprinus carpio Kakuta, 1998 Vitamina C Seriola quinqueradiata Sakakura y col., 1998 Vitamina E Scophthalmus maximus Pulsford y col., 1995 Vitamina C Cyprinus carpio Yano y col., 1989 Vitamina C Salmo salar Hardie y col., 1991 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 32  Clase IV.- Bacteriocinas complejas, constituidas por una parte proteica y una o más fracciones lipídicas o glucídicas, llamadas también glicoproteínas. En esta clase se incluye la Lactocina S o Mesenterocina.  Clase V.- Bacteriocinas de estructura celular no modificada postraducción. A esta clase pertenecen la Enterocina AS-48 y la Gasericina A. Por lo general, en la naturaleza existe una enorme diversidad de bacteriocinas, y han sido encontradas en casi todas las especies bacterianas. Actúan destruyendo la integridad de la membrana citoplasmática a través de la formación de poros, lo que provoca la salida de pequeños compuestos, o alterando la fuerza motriz de protones necesaria para la producción de energía y síntesis de proteínas o ácidos nucléicos (Chikindas y col., 1993; Montville y Chen, 1998). Existen multitud de estudios acerca de la actividad inhibitoria producida por bacterias ácido lácticas mediante la producción de bacteriocinas (Klenhamer, 1993). Géneros como Streptococcus, Leuconostoc y Lactococcus lactis producen generalmente la bacteriociana Nisina. Otros géneros como Enterococcus producen Enterocina (A, B, I, L, o P), Carnobacterium sp. produce Divercina y Piscicocina, Pediococcus sp. la Pediocina y la bacteriocina ALP 57. Asimismo, Lactobacillus sp. puede producir Sakacina, Curvacina, o Plantaricina. Todos estos géneros bacterianos han sido ampliamente utilizados a nivel experimental como probióticos en animales acuáticos por inhibir el crecimiento de otros microorganismos competidores (Campos y col., 2006; Motta y Brandelli, 2008; Desriac y col., 2010). b) Peróxido de hidrógeno En la naturaleza, la mayor parte de las bacterias catalasa negativas, producen peróxido de hidrógeno (H2O2) en presencia de oxígeno libre, pero las más estudiadas pertenecen al grupo de bacterias ácido lácticas, las cuales utilizan el oxígeno para formar peróxido mediante la flavoproteína oxidasa o peroxidasas, que es liberada al medio, siendo altamente tóxico para otras bacterias que comparten el mismo hábitat, y a su vez, eliminadas del tracto digestivo (Bruno y Montville, 1993; Bjorn y col., 2003). Asimismo, el peróxido de hidrógeno puede inhibir o destruir bacterias por medio de la inactivación de enzimas. El efecto bactericida del H2O2 se atribuye a su potente poder oxidante en la célula bacteriana y a la destrucción de estructuras moleculares básicas de las proteínas (Dahiya y Speck, 1968; Price y Lee, 1970; Kontchou y Blondeau, 1990; Hyuk y col., 2008). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 33 c) Alteración del pH por la producción de compuestos orgánicos de cadena corta La mayoría de los microorganismos presentan gran versatilidad metabólica, pudiendo presentar requerimientos oxidativos o fermentativos para su crecimiento, y dependiendo de su metabolismo pueden producir o no metabolitos secundarios. Algunas levaduras (Saccharomyces cerevisiae y Debaryomyces hansenii) y bacterias, en su mayoría ácido lácticas, son evaluadas como probióticos en acuicultura por ser consideradas inocuas y por su gran capacidad fermentativa, produciendo cantidades significativas de ácidos orgánicos de cadena corta (ácido acético, ácido fórmico, ácido láctico y etanol) a partir de carbohidratos simples, lo cual produce un aumento en la acidez intestinal que limita el crecimiento de bacterias patógenas (Ten Brink y col., 1987; Mombelli y Gismondo, 2000; Klewicki y Klewicka, 2004; Balcázar y col., 2007). Estos ácidos causan cambios del pH intracelular que son altamente tóxicos para los microorganismos porque atraviesan la membrana bacteriana en forma no ionizada y se acumulan en forma ionizada en el interior de la célula (Aguirre, 1993). Y así, por ejemplo, algunos estudios in vitro han demostrado que el ácido acético y el ácido láctico son los responsables de la disminución del crecimiento de Carnobacterium piscícola, Vibrio alginolyticus, Vibrio pelagius y Vibrio splendidus (Vázquez y col., 2005a). Por otra parte varias especies del Género Bifidobacterium, utilizadas como probióticos en humanos, han sido evaluadas in vitro por producir un fuerte efecto inhibitorio frente a Salmonella enterica y Escherichia coli. En ese estudio se ha comprobado que la actividad inhibitoria es debida a la producción de ácidos orgánicos de cadena corta, en particular ácido láctico y acético (Makras y Vuyst., 2006). d) Diacetilo Algunos géneros bacterianos como Enterococcus pueden producir diacetilo a partir del citrato siguiendo la vía del piruvato, que es el metabolito intermediario. Este compuesto, que es producido en la fermentación no ácida, presenta un potente efecto inhibitorio frente a microorganismos Gram positivos y Gram negativos, siendo muy utilizado en la industria alimenticia (Vallejo y col., 2008). II.7.4.2.- Competición por energía disponible o por compuestos químicos La energía disponible y los compuestos químicos son factores que determinan la coexistencia y dominancia de las distintas poblaciones microbianas en un mismo REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 34 ecosistema (Fredrickson y Stephanopoulos, 1981). En un ecosistema abierto como el de los peces, entre los microorganismos existe competencia por los nutrientes que hay en el medio y por la energía que pudiera obtenerse de estos. El compuesto químico más importante para la mayoría de los microorganismos es el hierro, y su captación es a través de sideróforos, por lo que privándoles de este elemento se podría inhibir el crecimiento de microorganismos indeseables cuya virulencia dependa de la disponibilidad de hierro para su crecimiento (Sullivan, 2001). El carbono es otro elemento que necesitan los microorganismos para su metabolismo. En la microbiota intestinal de los peces predominan organismos heterotróficos que compiten por sustratos orgánicos como el carbono, pero se necesita un mayor conocimiento de los factores que rigen la microbiota para su manipulación (Verschuere y col., 2000b). Un ejemplo de este mecanismo es el efecto inhibitorio que ejerce Pseudomonas fluorescens en co-cultivo frente a Aeromonas salmonicida y V. anguillarum (Smith y Davey, 1993; Gram y col., 1999). Bacterias inocuas que compitan por nutrientes esenciales podrían ser utilizadas como probióticos para competir con patógenos que necesiten de estos compuestos para su crecimiento (Gatesoupe y col., 1997; Sullivan, 2001). Pero el uso de estas bacterias debe ser analizado con precaución, ya que pueden causar efectos adversos como la inducción de la expresión de sideróforos en el patógeno, favoreciendo así el desarrollo de este último en el hospedador (Gram y col., 2001). II.7.4.3.- Competición por lugares de fijación En humanos, un mecanismo para prevenir la colonización intestinal de bacterias patógenas es la competición por lugares de fijación. Y parece ser que este mecanismo es similar en peces (Salminen y col., 1996; Gill, 2003). Así, el establecimiento de la microbiota es un componente clave para promover la salud de los animales por mecanismos competitivos (Tapia-Paniagua y col., 2010). La mucosa intestinal en los peces representa uno de los principales lugares en los que las bacterias presentes en el medio ambiente interactúan con la microbiota intestinal, y así, los tejidos linfoides asociados al intestino desarrollan mecanismos para diferenciar entre los microorganismos patógenos y comensales (Pérez y col., 2010). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 35 La habilidad para la adhesión y posterior colonización de bacterias beneficiosas al mucus intestinal forma la primera barrera de defensa contra la proliferación de bacterias patógenas invasoras. Este fenómeno se conoce como exclusión competitiva, y si esto no se lleva a cabo, las bacterias beneficiosas se consideran como microorganismos en tránsito y se eliminan junto con las heces sin haber ejercido su función probiótica de manera adecuada. Debido a esto, este mecanismo se considera como un pre-requisito para seleccionar una cepa como probiótica (Olsson y col., 1998; Jӧborn y col., 1997; Gatesoupe y col., 1999; Nikoskelainen y col., 2001b). Este mecanismo de adhesión y posterior exclusión de patógenos puede estar basado en factores físico-químico como la hidrofobicidad, o factores específicos donde intervienen las adhesinas que se unen a células receptoras presentes en el epitelio intestinal, y que están presentes en la superficie de las cepas probióticas (Salminen y col., 1996). En los peces la capacidad de adhesión in vitro de bacterias con capacidad probiótica y la capacidad de excluir patógenos han sido evaluadas por varios autores en diferentes cepas probióticas (Nikoskelainen y col., 2001b; Namba y col., 2007; Van de Marel y col., 2008; Balcázar y col., 2009; Vendrell y col., 2009). II.7.4.4.- Aumento de la respuesta inmune Los inmunoestimulantes utilizados son compuestos químicos o microorganismos ya sean viables o no, que actúan aumentando el sistema defensivo del hospedador, provocando que los animales estén más preparados y resistan mejor a infecciones causadas por virus, bacterias, hongos y parásitos (Raa y col., 1996). El sistema inmune de los peces presenta dos tipos de respuesta, la innata y la adquirida. La respuesta inmune innata o sistema de defensa no específico está formado por una serie factores humorales solubles (mucus, proteínas, etc), células citotóxicas inespecíficas y células fagocíticas, y constituyen la primera barrera defensiva de los peces frente a los patógenos. La segunda línea de defensa de los peces es la inmunidad adquirida o respuesta inmune específica, pudiendo ser una respuesta celular y/o humoral, basada en una serie de cambios adaptativos que tiene lugar dentro de las poblaciones linfoides (linfocitos T y B). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 36 Muchos de los inmunoestimulantes usados en acuicultura como probióticos son bacterias vivas o inactivadas, esporas, y componentes de la pared celular de bacterias y levaduras (Irianto y Austin, 2002). Estas sustancias tienen un efecto positivo en las funciones que regulan el sistema inmune del hospedador, debido a que las alteraciones de estas funciones por un desequilibrio en la microbiota pueden contribuir al desarrollo de enfermedades (Pérez y col., 2010). Recientemente, el uso de animales gnotobióticos (libres de patógenos) ha demostrado que las bacterias tienen un impacto profundo sobre la anatomía, fisiología, y desarrollo inmunológico del hospedador (Rawls y col., 2004). Existen diversos trabajos que demuestran que el sistema inmune de peces y crustáceos puede ser estimulado por bacterias probióticas (Sakai, 1999; Nayak, 2010). A continuación, señalamos algunos ejemplos: - En cultivo de dorada (Sparus aurata), estudios in vitro demuestran que la utilización en la dieta de una mezcla de vibrios (Pdp11 y 51M6), algunos miembros del Género Bacillus y una cepa de Shewanella spp. inactivados por calor, tiene un efecto inmunoestimulador modulando el sistema inmune innato en los peces (DíazRosales y col., 2006; Salinas y col., 2006). - En trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss), la utilización de varias cepas probióticas como Lactobacillus rhamnosus, Lactococcus lactis subsp. lactis, Leuconostoc mesenteroides y Lactobacillus sakei administrada en la dieta durante 2 semanas, activó el sistema inmune y protegió a los peces frente a enfermedades bacterianas como la lactococosis y la forunculosis, mostrando porcentajes de supervivencia entre 97-100% (Irianto y Austin, 2002; Nikoskelainen y col., 2003; Balcázar y col., 2007; Brunt y col., 2007; Vendrell y col., 2007). - En larvas de lubinas (Dicentrarchus labrax), dorada (Sparus aurata) y mero (Epinephelus coioides), alimentadas con cepas probióticas (Bacillus sp.) se ha podido observar una estimulación temprana de su sistema inmune, cambios fisiológicos, y la modificación de su microbiota intestinal (Abelli y col., 2009; Sun y col., 2010). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 37 - En lenguado japonés (Paralichthys olivaceus) se ha estudiado el efecto protector de la administración de dos productos comerciales (Lactobacil® y Sporolac®), demostrando que la utilización de éstos en la dieta, aumentan parámetros inmunes como la actividad fagocítica, producción de peroxidasa y además protege un 65-70% a los peces frente a la enfermedad linfoquística, comparado con el grupo no tratado que alcanzaron una mortalidad del 80% (Harikrishnan y col., 2010). - En camarón blanco (Litopenaeus vannamei) se ha evaluado una cepa de Bacillus sp., administrada en la dieta durante 28 días, frente a una infección con el virus de la mancha blanca, demostrando un aumento de la respuesta inmune de estos crustáceos y una mayor resistencia a la enfermedad (Li y col., 2009; Zhou y col., 2009). II.7.4.5.- Mejora de la calidad del agua Muchos estudios señalan que mejorar la calidad de agua en los sistemas de cultivo mediante la adición de cepas probióticas es un factor importante para mantener el bienestar del hospedador. Varios miembros de los Géneros Bacillus y Phenibacillus son utilizados como bacterias “biorremediadoras”, convirtiendo la materia orgánica en CO2 (Antony y Philip, 2006). Asimismo, existen muchos estudios donde se utilizan géneros como Nitrobacter, Enterobacter, Pseudomonas, Cellulomonas y Rhodopseudomonas en cultivo de peces y crustáceos, proporcionando un impacto favorable sobre el medio (Verschuere y col., 2000b; Zhou y col., 2010). Muchas de estas bacterias nitrificantes, son utilizadas para controlar los niveles de amoniaco y nitritos en tanques o acuarios, debido a que estos compuestos son un problema de enorme trascendencia para diferentes cultivos (Lewis y Morris, 1986; Chen y Chen, 2001; Lee y col., 2002; Wang y col., 2004; Wang y Han, 2007). II.7.4.6.- Contribución enzimática para la digestión Varios estudios han descrito el efecto nutricional de algas, cepas probióticas y levaduras sobre el sistema digestivo de peces y crustáceos, mejorando su crecimiento, supervivencia y asimilación de nutrientes (Askarian y col., 2011). Estudios in vitro han evaluado que bacterias aisladas del propio sistema digestivo de los peces aumentan la REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 38 actividad enzimática de su hospedador, produciendo un efecto positivo sobre la digestión de proteínas, almidón y lípidos (Gatesoupe y col., 1997). Otros ensayos realizados con larvas de lubina (Dicentrarchus labrax) alimentados con levadura viva (Debaryomyces hansenii) mostraron un incremento en la actividad enzimática y concentración de tripsina y lipasas mediante el mRNA, sugiriendo la maduración temprana del sistema digestivo de las larvas (Tovar y col., 2004). Por otra parte, también se ha descrito una alta tasa de crecimiento en lenguado senegalés (Solea senegalensis) tras la administración en la dieta de las cepas probióticas Pdp11 y Pdp13 liofilizadas (Sáenz de Rodrigánez y col., 2009). Asimismo, recientes avances sobre nutrición acuícola nos revelan que el uso de cepas de Leuconostoc sp. suplementados en la dieta durante 50 días, aumentan la actividad enzimática del intestino, además de ayudar al crecimiento y supervivencia en esturión (Acipenser persicus) en su fase larvaria (Askarian y col., 2011). II.7.4.7.- Fuente de macro-micro nutrientes Otro mecanismo de acción de las cepas probióticas puede ser el aporte de nutrientes. Estas bacterias pueden producir varias vitaminas como metabolitos secundarios, y entre ellas, la vitamina B12 es la más analizada. Esta vitamina ha sido aislada de microorganismos presentes en el intestino de una gran variedad de peces, como la carpa (Cyprinus carpio), tilapia (Oreochromis niloticus), trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) (Sugita y col., 1990) y bagre de río (Ictalurus punctatus) (Limsuwan y Lovell, 1981), sugiriendo que si estas bacterias que producen vitaminas están en los peces, no necesitarían su administración en la dieta (Sugita y col., 1991). La vitamina C es importante para la formación de los cartílagos y tejido fibroso en los peces, pero debe ser adicionada en la dieta ya que no hay datos que demuestren la producción de esta vitamina por parte de microorganismos intestinales, al contrario de lo que ocurre con la vitamina K que puede ser proporcionada por la propia microbiota intestinal, como se ha demostrado en truchas de rio (Salvelinus fontinalis), contribuyendo así estas bacterias en la dieta de estos peces (Poston, 1964). Sabemos que los carotenoides actúan como antioxidantes en los tejidos de los peces compactando los lípidos dañados por radicales libres. La selección de cepas que produzcan REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 39 diversos pigmentos (amarillo o naranja brillante) sobre medios de cultivo, puede ser un primer paso para la utilización de estas bacterias como potenciales probióticos, partiendo de la base de que estos microorganismos sean inocuos, y que tengan la habilidad de producir estos metabolitos beneficiosos (Holmstrom y col., 2002). Además, se sabe que ciertos lípidos producidos por microorganismos probióticos han contribuido significativamente a la dieta de la trucha alpina (Salvelinus alpinus), rodaballo (Scophthalmus maximus) y tilapia (Oreochromis niloticus) alterando físicamente la morfología de su sistema digestivo (Vine y col., 2006). II.7.5.- Los probióticos como preventivo de enfermedades en Acuicultura La manipulación microbiana es una herramienta viable para reducir o eliminar la incidencia de enfermedades y su utilización está ampliamente demostrada, constituyendo así, una buena alternativa de la sustitución de agentes quimioterapéuticos para el control de las mismas. En la actualidad se ha incrementado la búsqueda de microorganismos con capacidad probiótica con el fin de mejorar el rendimiento en los sistemas de producción, bajo el término de cultivos respetuosos con el medio ambiente (Gatesoupe y col., 1999). Las investigaciones sobre probióticos en acuicultura son muy recientes, ya que no llega a cuatro décadas el momento en el que se iniciaron los primeros estudios. Desde entonces, los probióticos comúnmente usados en acuicultura, incluyen un amplio rango de géneros bacterianos como Lactobacillus, Lactococcus, Carnobacterium, Pediococcus, Enterococcus, Streptococcus, Vibrio, Bacillus, Pseudomonas, Aeromonas, Alteromonas, Roseobacter y Zooshikella, aunque levaduras, bacteriófagos y algas unicelulares también han sido utilizadas con mucho éxito en cultivos de peces, moluscos y crustáceos (Irianto y Austin, 2002; Ringo y col., 2010). Algunas algas unicelulares como Thalassboacter utilis y Skeletonema costatum forman parte del fitoplancton comúnmente utilizado en larvicultura de moluscos y crustáceos. Estas algas producen sustancias tóxicas que inhiben el crecimiento de Vibrio anguillarum (Nogami y Maeda, 1992; Naviner y col., 1999). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 40 Los bacteriófagos son las comunidades más abundantes de la biósfera y se ha estimado que existen 1010 fagos por cada litro de agua de mar, lo que representa un excelente mecanismo de control de las bacterias marinas, equilibrando las poblaciones microbianas en el medio (Ronda y col., 2003). Recientemente, investigadores japoneses han puesto a punto métodos que permiten evaluar la capacidad de los fagos como agentes terapéuticos en acuicultura. Se han hecho ensayos con riñones de peces infectados, donde se ha podido observar la muerte de bacterias en su hábitat natural en presencia de fagos, lo que supondría una mayor supervivencia de los peces infectados por bacterias patógenas (Nakai y Park, 2002). Hasta el momento, la mayoría de los trabajos con fagos se han centrado en el tratamiento de infecciones bacterianas causadas por Lactococcus garvieae y han sido evaluadas en especies como el ayu (Plecoglossus altivelis) o medregal (Seriola quinqueradiata). Actualmente hay identificados 14 fagos diferentes de L. garvieae pero los más utilizados son PLgY y PLgW (Nakai y col., 1999). Hoy en día, las cepas seleccionadas como probióticos son administradas en dietas artificiales, en alimento vivo (artemia y rotíferos) o en agua de cultivo, habiendo sido probados en diferentes colectivos de animales acuáticos como peces, moluscos, crustáceos, equinodermos y mamíferos marinos, con diferentes tamaños y pesos. Asimismo, los probióticos han sido utilizados en acuariofilia, como es el caso de Lactobacillus rhamnosus en larvas de pez payaso (Amphiprion ocellaris) donde el uso de esta bacteria se analiza mediante técnicas moleculares, y se puede observar aceleración en la metamorfosis de los peces, aumento de peso y mejor crecimiento, además de un mejor desarrollo esquelético de la cabeza, junto con una marcada disminución al estrés (Avella y col., 2010). Se han evaluado varias cepas probióticas respecto al nivel de protección de los peces frente a enfermedades bacterianas. Así tenemos que la cepa Pseudomonas fluorescens AH2 protege a la trucha arcoíris frente a una infección con V. anguillarum, mostrando una reducción relativa de la mortalidad del 43% si comparamos los animales tratados (27% mortalidad) con el grupo control (47% mortalidad). En la misma especie, Aeromonas sobria y Bacillus sp. fueron utilizados para el control de la lactococosis, estreptococosis, vibriosis, forunculosis y la enfermedad de la boca roja, produciendo una reducción en la mortalidad desde valores del 75-100% hasta el 0-16% (Gram y col., 1999; REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 41 Brunt y Austin 2005; Brunt y col., 2007; Abbass y col., 2010). Zooshikella sp. ha sido evaluada para el control de estreptococosis en lenguado japonés (Paralichthys olivaceus), mostrando mortalidades del 40% para los peces infectados con Streptococcus y que fueron previamente alimentados con esta cepa, comparados con el grupo control, que no recibió el probiótico donde la mortalidad fue del 85% (Kim y col., 2010). Bacillus circulans PB7 fue probada en carpa catla (Catla catla) frente a una exposición por baño con Aeromonas hydrophila con porcentajes de supervivencia del 96,66%, comparados con el 6,66 % del grupo control (Bandyopadhyay y Mohapatra, 2009). En tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus) se evaluó la mezcla de 2 cepas probióticas, Lactobacillus acidophilus y Bacillus subtilis, mostrando los peces una supervivencia del 36,84% frente a una infección con Aeromonas hydrophila y un 32,88% frente a Streptococcus iniae, comparado con el 100% de mortalidad en el grupo infectado que no recibieron tratamiento probiótico previo (Aly y col., 2008). En juveniles de lenguado senegalés (Solea senegalensis) alimentados con dos cepas del Género Shewanella, se pudo observar entre un 27,5% y un 32,5% de supervivencia, frente a una infección experimental con Photobacterium damselae subsp. piscicida, comparado frente al grupo control que mostró entre un 65-75% de mortalidad (García de la Banda y col., 2010). Frente a la vibriosis, causada por V. anguillarum, se ha evaluado la cepa bacteriana Kocuria SM1. Una dosis de 108 unidades formadoras de colonia (ufc) por gramo de alimento, protege entre un 15% y un 20% frente a la enfermedad en trucha arcoíris, comparada con el 74-80% de mortalidad que se manifestó en el grupo control que no recibió previamente el tratamiento probiótico (Sharifuzzaman y Austin, 2009 y 2010). Hoy en día, existen en el mercado varios productos probióticos, pero solo el Bactocell® (Pediococcus acidilactici) está aprobado por la Unión Europea para ser utilizado en la acuicultura de salmónidos y crustáceos. Como hemos mencionado anteriormente, un amplio grupo de bacterias, tanto Gram positivas como Gram negativas, junto a otros microorganismos, han sido evaluados como probiótico, pero todos los beneficios esperados de estas cepas probióticas difieren mucho entre las especies susceptible a su uso (peces o crustáceos de agua dulce, salobre o marina), el estado del cultivo (larva, juvenil, reproductores) y el sistema de cultivo (flujo continuo o recirculación, tanques, estanques o jaulas). Por otra parte, la forma de aplicación y la