Ácido Fólico como Antioxidante frente a los efectos del Binge Drinking sobre el corazón

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA Ácido Fólico como Antioxidante frente a los efectos del Binge Drinking sobre el corazón. Óscar Ortiz Rendón TFG. Óscar Ortiz Rendón. UNIVERSIDAD DE SEVILLA Facultad de Farmacia Trabajo Fin de Grado Grado en Farmacia Ácido Fólico como Antioxidante frente a los efectos del Binge Drinking sobre el corazón. Óscar Ortiz Rendón Sevilla a 20 Septiembre 2018 Departamento de Fisiología Dra. Fátima Nogales Bueno Trabajo experimental 2 TFG. Óscar Ortiz Rendón. RESUMEN El alcohol, es uno de los grandes problemas de la sociedad moderna, en especial durante la adolescencia, ya que cada vez la edad con la que se comienza a beber es mas temprana, además de los cambios en los hábitos de consumo, ingiriendo grandes cantidades de alcohol en muy poco tiempo y aumentando la frecuencia a cada fin de semana. A este movimiento social se le denomina “binge drinking” o “botellón” y supone una alerta global, debido a que esta sustancia psicoactiva representa multitud de factores de riesgo para diversas patologías, como, por ejemplo, patología cardiovascular. Este patrón de consumo, que a día de hoy se observa entre los adolescentes en mayor proporción, provoca la aparición de estrés oxidativo (EO), que ocasiona una saturación en los sistemas enzimáticos antioxidantes y aumenta las especies reactivas de oxígeno (EROs) en el organismo provocando daño celular a nivel de los diferentes tejidos y órganos. Así, se ha encontrado que el estrés oxidativo provocado como consecuencia del consumo de alcohol tipo “binge drinking”, afecta directamente a la funcionalidad del corazón ya que aumenta frecuencia cardíaca. Pero además, se ha demostrado, por primera vez en este estudio, que este consumo de alcohol aumenta los niveles de homocisteína en suero y con ello, el riesgo de enfermedad cardiovascular. La suplementación con ácido fólico (vitamina B9) en la dieta de ratas adolescentes sometidas a consumo agudo de alcohol, evita los efectos adversos producidos por las EROs al ser una vitamina antioxidante. Por otra parte, el ácido fólico interviene en el ciclo de la metionina, aumentando los niveles de glutatión reducido, un antioxidante endógeno cofactor de la enzima glutatión peroxidasa, y disminuyendo la homocisteína. Por todo ello, la suplementación con ácido fólico en la dieta podría resultar una terapia eficiente frente al “binge drinking” previniendo modificaciones adversas en el corazón y sistema cardiovascular. PALABRAS CLAVES: Binge drinking, alcohol, ácido fólico, estrés oxidativo, homocisteína, cardiovascular. 3 TFG. Óscar Ortiz Rendón. ÍNDICE 1. Introducción. 6 1.1. Binge Drinking. 6 1.1.1. Generalidades. 6 1.1.2. Metabolismo del alcohol. 7 1.1.3. Balance oxidativo,binge drinking y enfermedad cardiovascular. 9 1.2. Ácido fólico. 12 1.2.1. Generalidades. 12 1.2.2. Ácido fólico y enfermedad cardiovascular. 13 2. Binge drinking y ácido fólico. 14 3. Objetivos. 15 4. Materiales y Métodos. 15 4.1. Animales de experimentación y condiciones. 15 4.1.1. Animales y condiciones de experimentación. 17 4.2. Dieta animales. 17 4.3. Método de alcoholización. 17 4.4. Determinación de parámetros nutricionales. 17 4.4.1. Estudio nutricional y de la ingesta de ácido fólico. 17 4.5. Estudio macroscópico. 18 4.6. Toma y procesamiento de las muestras de ratas. 18 4.6.1. Obtención y tratamiento de las muestras de suero. 18 4.6.2. Obtención y tratamiento de las muestras de corazón. 18 4.7. Actividad antioxidante y oxidación de biomoléculas. 18 4.7.1. Homogenización del tejido. 18 4.7.2. Concentración total de proteínas. 19 4.7.3. Actividad de la glutatión peroxidasa. 21 4.7.4. Actividad de la glutatión reductasa. 21 4.7.5. Actividad de la superóxido dismutasa. 23 4.7.6. Actividad de la catalasa. 24 4.7.7. Peroxidación lipídica. 24 4 TFG. Óscar Ortiz Rendón. 4.8. Determinación de homocisteína en suero. 24 4.9. Determinación de la presión y frecuencia cardíaca. 25 5. Resultados y discusión. 25 5.1. Parámetros nutricionales. 26 5.2. Actividad enzimática antioxidante en corazón y suero. 28 5.3. Oxidación y daño molecular. 30 5.4. Evaluación del daño cardiovascular. 31 6. Conclusiones. 34 7. Bibliografía. 35 5 TFG. Óscar Ortiz Rendón. 1. Introducción y antecedentes. 1.1. Binge drinking. 1.1.1. Generalidades. El alcohol es una droga psicoactiva que en la actualidad está al alcance de todos los públicos, lo que implica un riesgo para la salud, originando problemas de adicción que derivan a su vez en alteraciones metabólicas, funcionales y psicológicas. El grado de afección por esta sustancia depende a su vez de factores tales como el sexo, la edad, el volumen ingerido, los hábitos de consumo, el marco socio-cultural en el que se ubique, la genética, etc. De acuerdo con la OMS (2018), el consumo excesivo de alcohol supone el 5,3% de todas las defunciones a nivel global, unos 3 millones de defunciones cada año, siendo además el factor causal que provoca más de 200 enfermedades y trastornos. En la actualidad, son cada vez más jóvenes los que consumen alcohol en grandes cantidades, lo que implica un gran problema, ya que la adolescencia es un periodo de crecimiento y desarrollo, tanto físico, mental y social, siendo un claro predicto de una posible dependencia de alcohol en la edad adulta (Ministerio de Sanidad, Consumo y Bienestar Social, 2019). En España, la edad a la que se empieza a beber alcohol es a los 13 años. La mayoría de estos jóvenes buscan una integración social por medio de un movimiento que en las últimas décadas resuena con fuerza entre los adolescentes, el “binge drinking” o comúnmente llamado “ el botellón”. “Binge drinking” o “botellón” es como se denomina al movimiento social que consiste en beber alcohol intensivamente en periodos de tiempo cortos y frecuencia de repetición alta. En España, desde un punto de vista preventivo y encuadrado en un contexto de promoción de la salud pública, se ha sugerido la siguiente definición para el binge drinking (BD): consumo de 5 o más vasos de bebidas alcohólicas en un intervalo aproximado de dos horas, en la que se mantiene un determinado nivel de intoxicación (presencia de alcohol en la sangre no inferior a 0,8 g/L) (Ministerio de Sanidad, Consumo y Bienestar Social, 2019). Según las últimas estadísticas del Ministerio de Sanidad, Servicio Sociales e Igualdad registradas por la Delegación de Gobierno para el Plan Nacional sobre Drogas (DGPNSD) de 2018, el alcohol es la sustancia psicoactiva más extendida entre los estudiantes de Enseñanzas Secundaria de 14 a 18 años. El 76,9% ha consumido bebidas alcohólicas en alguna ocasión en su vida, y aproximadamente 2 de cada 3 jóvenes (67%) ha tomado alcohol en los últimos 30 días, observando que el 21,8% de los jóvenes ha experimentado una borrachera en este periodo y el 31,7% ha realizado BD. Con respecto las estadísticas del 2012, en los cuales el porcentaje de jóvenes consumidores de alcohol era de 81,2% en los últimos 12 meses y de un 74% en los últimos 30 días, se observa una tendencia decreciente en el consumo de esta sustancia psicoactiva, aunque en la actualidad la prevalencia sigue muy elevada (76.6% y 67%, respectivamente). 6 TFG. Óscar Ortiz Rendón. 1.1.2. Metabolismo del alcohol. El alcohol ingerido es absorbido en la mucosa gástrica por las células endoteliales y distribuido por el organismo. La mayor parte del alcohol (90%-80%) es metabolizado por la vía oxidativa del etanol y el resto puede ser metabolizado por vías no oxidativas, aunque también es eliminado a través de la orina , sudor o respiración (Carreras y Castellano, 2012). El órgano donde más cantidad de etanol es metabolizado en el hígado, aproximadamente un 90% (Cascales et al., 1997). En el hígado es metabolizado a través de dos enzimas que actúan conjuntamente, realizando dos reacciones consecutivas: primero actúa la Alcohol deshidrogenada (ADH) transformando el etanol en acetaldehído y en segundo lugar actúa la acetaldehído deshidrogenasa (ALDH) dando como producto final un acetato (Hernández y cols., 2014). En los hepatocito coexisten tres sistemas enzimáticos (figura 1) que oxidan el etanol hasta acetaldehído: La vía de la alcohol deshidrogenasa (ADH); el sistema microsomal oxidativo (SMOE) y la vía de la catalasa (Hernández et al., 2014). En condiciones normales, la ADH es la vía de oxidación del alcohol mayoritaria, siendo entre el 80-90% el alcohol que se metaboliza. Se localiza en el citosol de los hepatocitos, secundariamente en estómago, intestino delgado, riñón y cerebro (Carreras y Castellano, 2012). La ADH transfiere un hidrógeno del sustrato al cofactor NAD+, produciendo NADH y acetaldehído. El SMOE, dependiente del citocromo P-450, se encuentra en el retículo endoplasmático del hepatocito e interviene en la oxidación del alcohol cuando la vía de la ADH está saturada. Se ha relacionado que esta vía actúa en mayor grado en personas que tienen un consumo crónico, debido a que el alcohol induce la sobreexpresión génica de una isoenzima de la CYP-450, la CYP-2E1, que es capaz de oxidar usando NADPH y oxígeno molecular, aunque en el consumo agudo también se produce. 7 TFG. Óscar Ortiz Rendón. Figura 1. Imagen representativa de las vías de metabolización del alcohol en hígado, donde la vía principal es la ADH. La sobreestimulación de esta vía provoca un exceso en especies reactivos de oxígeno (EROs): anión superóxido (O2-); peróxido de hidrógeno (H2O2); radical hidroxilo (OH-), responsables del estrés oxidativo (EO) que produce el alcohol. Aproximadamente esta vía tiene un 10% de actividad en la metabolización del alcohol (Carreras y Castellano, 2012). La vía de la catalasa, que se encuentra en los peroxisomas del citosol del hepatocito, oxida el etanol usando H2O2. En base a ello, su actividad se ve reducida a una situación de saturación de las otras vías, donde se genere una concentración de H2O2 mayor, por ello esta vía en condiciones normales no es relevante en el hígado, tan solo participa en un 2% (Hernández et al., 2014). El acetaldehído, producido por estas vías, es metabolizado a acetato y se incorpora al ciclo de Krebs como Acetil-CoA. La responsable de esta reacción es la acetaldehído deshidrogenasa (ALDH), de la que se conocen dos isoenzimas diferenciadas por su localización y su actividad: ALDH-1, se localiza en el citosol y actúa a concentraciones altas de acetato; ALDH-2, se localiza en las mitocondrias y actúa en condiciones normales fisiológicas (Carreras y Castellano, 2012). La ALDH necesita como cofactor NAD+, cuando existe una saturación de las vías oxidativas se producen alteraciones debidas al desbalance de la relación NADH/NAD+, como son : Aumento de la síntesis de lípidos produciendo esteatosis hepáticas, menor actividad del ciclo de Krebs, aumento de ácido láctico, aumento de ácido úrico y desbalance energético. 8 ETANOL ADH (citosol) SMOE (retículo endoplasmático) CAT (peroxisomas) ACETALDEHIDO NADP H2O NADPH O2 2H2O NAD+ NADH H2O2 ALDH Acetato TFG. Óscar Ortiz Rendón. Existe una vía no oxidativa, que tiene poca relevancia y es catalizada por la ácido graso etil ester sintetasa (FAEE). Esta vía da como producto final compuestos altamente tóxicos para diferentes tipos de células y tejidos (Hernández et al., 2014). En corazón se encuentran las tres vías metabólicas oxidativa, al igual que en hígado, aunque presentan distinta distribución en este tejido (figura 2). Los niveles de catalasa y SMOE están aumentados siendo éstas las principales vías de metabolización, a diferencia del hígado donde la vía principal es la ADH. La ADH en corazón desempeña una actividad discreta respecto a las demás vías oxidativas, incluso en concentraciones elevadas de alcohol (Orellana et al., 1998). A elevadas concentraciones de este compuesto, los niveles de catalasa aumentan siendo esta la principal vía de metabolización en el corazón. A ello se suma que incrementa el número de peroxisomas en la célula, lo que implica un aumento en el tamaño del músculo del corazón, relacionado con la cardiomegalia encontrada. Figura 2. Sistemas enzimáticos oxidativos metabolizadores del alcohol en corazón, donde la vía principal, a diferencia de en el hígado, es la CAT. Algunos autores determinan que el metabolismo del alcohol por medio del SMOE es responsable, en parte, de la patogénesis de las cardiopatías alcohólicas, incluyendo disfunción contráctil, generando EO e induciendo la apoptosis celular, posiblemente a través de la activación de las señales proapoptóticas JNK y ASK-1 (Zhang et al., 2013). 1.1.3. Balance oxidativo, binge drinking y enfermedad cardiovascular. El balance oxidativo es un equilibrio entre los procedimientos que generan oxidación y los sistemas antioxidantes endógenos. Cuando este equilibrio se altera a favor de los primeros se produce EO y aparece una mayor producción de especies oxidantes, que no son neutralizados por medio de los sistemas antioxidantes endógenos del organismo, ya que éstos se encuentran disminuidos y no son capaces de tener una actividad efectiva frente a la acumulación de especies oxidantes o bien están inhibidos. Todo ello produce radicales libres que son moléculas inestables (Valko et al., 2004) altamente reactivas con multitud de biomoléculas (proteínas, lípidos, ADN) 9 CAT (+) ADH SMOE TFG. Óscar Ortiz Rendón. A cada grupo se les planteó unas condiciones experimentales individuales: •Grupo C: ratas alimentadas con pienso comercial y agua ad libitum, y tres días a la semana una inyección intraperitoneal de solución salina. •Grupo A: ratas alimentadas con pienso comercial y agua ad libium, y tres días a la semana una inyección intraperitoneal de etanol (3g/kg de peso de rata). •Grupo CF: ratas alimentadas con pienso comercial suplementado con ácido fólico (8ppm) y agua ad libitum, y tres días a la semana una inyección intraperitoneal de solución salina. •Grupo AF: ratas alimentadas con pienso comercial suplementado con ácido fólico (8 ppm) y agua ad libitum, y tres días a la semana una inyección intraperitoneal de etanol (3g/kg de peso de la rata). Los tratamientos se realizaron de acuerdo a los protocolos de manejo, cuidado y sacrificio de los animales aprobados previamente por el Comité de Ética de la Universidad de Sevilla. Los animales permanecieron bajo estas condiciones hasta el momento del sacrificio para la obtención de las muestras. Las ratas permanecieron en ayunas durante 12 horas antes del sacrificio. Figura 6. Esquema del diseño experimental. Grupos de ratas: C=control; A=alcohol; CF=control fólico; AF=grupo alcohol fólico. SSF= solución salina fisiológica. 16 DISEÑO EXPERIMENTAL Día 28 Día 48 C y CF Comida y bebida ad libitum Inyección de SSF CF y AF Comida y bebida ad libitum Suplementación ác. Fólico A y AF Comida y bebida ad libitum Inyección etanol Sacrificio y obtención de muestras Días de inyección intraperitoneal 1ª semana 2ª semana 3ª semana TFG. Óscar Ortiz Rendón. 4.2. Dieta animales. La alimentación dotada a los animales de experimentación fue de pienso comercial básica semisintética (Harlan Laboratorios) que cubría todas las necesidades energéticas y nutricionales. La alimentación de los grupos suplementados (CF y AF) contenía, además, 8 ppm de ácido fólico en la comida. 4.3. Método de alcoholización. Método de alcoholización que se realizó para los grupos alcohol (A y AF) tenía como base el modelo de alcoholización “binge drinking” basado en la administración por vía intraperitoneal, tres días consecutivos por semana, durante tres semanas, etanol (3g/kg de peso) en solución salina al 20%v/v (Callaci et al., 2010). A los animales del grupo control se le administró la misma cantidad de solución salina mediante inyección intraperitoneal durante el mismo periodo de tiempo. 4.4. Determinación de parámetros nutricionales. 4.4.1. Estudio nutricional y de la ingesta de ácido fólico. Durante el periodo experimental de tres semanas se midió diariamente la ingesta líquida y sólida por diferencia de peso. En el caso del agua se midió, con anterioridad, el peso del biberón y se rellenó de agua y cada día se midió la diferencia de peso del contenido en agua con respecto al día anterior. En el caso de la comida se midió la cantidad de pienso que tenía y se comparaba con el día anterior. Se utilizó una balanza analítica (COBOS D-2000-SX, de 0.1g de precisión). La ingesta de ácido fólico (µg/día) se calculó a partir de los datos de la ingesta sólida. Las calorías diarias se calcularon a partir de los datos obtenidos de la ingesta sólida multiplicado por 3.96 Kcal del pienso ingerido. 4.5. Estudio macroscópicos. Para controlar el desarrollo de los animales durante el proceso del tratamiento hasta el día de sacrificio, las ratas se pesaron diariamente utilizando la balanza analítica (COBOS D-2000-SX, de 0.1g de precisión). Al término del periodo de experimentación, los animales antes del sacrificio se pesaron y se anestesiaron con una inyección intraperitoneal, 0.5ml/100 g de peso, de uretano (SIGMA) al 28% p/v. Una vez anestesiadas, se determinó la circunferencia abdominal y torácica (Novelli et al., 2007)y se midió la longitud cráneo-caudal usando un pie de rey métrico de precisión 0.01mm. 17 TFG. Óscar Ortiz Rendón. 4.6. Toma y procesamiento de las muestras de ratas. 4.6.1. Obtención y tratamiento de las muestras de suero. Después de anestesiar a los animales de experimentación y realizar el estudio macroscópico, se extrajo la sangre mediante punción cardíaca a través del tórax, ésta se depositó en un tubo de ensayo y se dejó reposar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Acto seguido se centrifugó a 3000 r.p.m. durante 10 minutos. Con una micropipeta se recogió el suero sobrenadante, se alicuotó en eppendorf y se almacenó en el congelador de -80ºC hasta el momento posterior para la determinación de parámetros. 4.6.2. Obtención y tratamientos del corazón. Luego de la toma de suero y hacer una laparotomía media, se comenzó extrajo el corazón, se sumergió en nitrógeno líquido y se almacenó en el congelador de -80ºC hasta su posterior análisis. 4.7. Actividad antioxidante y oxidación de biomoléculas en corazón. 4.7.1. Homogenización del tejido. Para la determinación de la actividad de las enzimas antioxidantes y la concentración total de proteínas, una parte del corazón congelado se pesó, troceó y suspendió en tampón de sacarosa en una proporción 1:4 p/v (Sacarosa (ROIG FARMA 250 mM); TRIS (SIGMA-ALDRICH) 15mM; DTT (SIGMA) 1mM; EDTA (SIGMA) 1Mm), usando para ello un homogenizador de tejidos con pistillo de teflón Pobel 245432, España). El pH del tampón se ajustó hasta 7 con una solución de HCl (PANREAC). El homogenizado resultante se centrifugó a 3000 r.p.m. a 4ºC durante 20 minutos y se recogió el sobrenadante, alicuotándolo en eppendorf que posteriormente se congelaron a -80ºC hasta el momento del análisis. 4.7.2. Concentración total de proteínas. Se determinaron las proteínas totales en suero y corazón, para poder expresar la actividad de enzimas antioxidantes como actividades específicas (U/mg de proteína). Fundamento: La determinación de proteínas se llevó a cabo según el método descrito por (Lowry et al., 1951). En este método se hacen reaccionar las proteínas con el reactivo Folin-Ciocalteau, lo que origina un complejo coloreado. El color se forma debido a la reacción del Cu2+ con las proteínas en medio alcalino y por la reducción del fosfomolibdato por la tirosina y el triptófano presentes en las proteínas de la muestra. La intensidad del color depende de la calidad de estos aminoácidos aromáticos. 18 TFG. Óscar Ortiz Rendón. Los reactivos que se empleados en el método son: - Reactivo A: Na2CO3 2% p/v en NaOH 0.1M - Reactivo B: CuSO4·5H2O 1% (p/v) - Reactivo C: Tartatro de sodio potasio 2.7p/v - Reactivo D: 1.7ml de reactivo B y 1.7ml de reactivo C en 170 ml de reactivo A - Reactivo E: Reactivo de Folin-Ciocalteau diluido en agua bidestilada en proporción 1:1 v/v - Muestras diluidas con agua bidestilada: *Suero 1/1000 *Homogenizado de tejido de corazón 1/750 Los reactivos D y E deben ser preparados en el mismo momento que se usen. Procedimiento: La técnica consiste en desarrollar una curva patrón a partir de la cual, midiendo sus absorbancias se determina las concentraciones estándares de proteína en el medio, con lo que se puede calcular las concentraciones de proteínas de las muestras por medio de la medición de absorbancia de cada muestra. Para la curva patrón se prepara una solución madre de albúmina bovina de concentración igual a 1 mg/mL, a partir de la cual se preparan cuatro soluciones estándares cuyas concentraciones son: P1: 0.1mg/mL; P2: 0.05mg/mL; P3 0.025mg/mL; P4: 0.0125 mg/mL. Posteriormente se mezclan los tubos de ensayo con 5 mL de reactivo D con 1 mL de muestra diluida (corazón 1/750 mL en agua bidestilada y suero 1/1000 en agua bidestilada), y se deja reposar de 15 a 20 minutos a temperatura ambiente. Transcurrido ese tiempo se adiciona 0.5 ml del reactivo E, se agita y se deja incubar durante unos 30 minutos a temperatura ambiente. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, se empezó a medir las absorbancias de la curva patrón y las muestras, por duplicado a 750 nm en un espectrofotómetro. Cálculo: para conocer la concentración total de proteínas de las muestras se extrapola sus absorbancias a la recta de la curva patrón de concentraciones conocidas. 4.7.3. Actividad de la glutatión peroxidasa. Fundamento: la enzima glutatión peroxidasa (GPx) cataliza la reducción de los peróxidos orgánicos y del peróxido de hidrógeno en una reacción en que interviene la glutatión. La actividad de esta enzima se determinó según el método descrito por (Lawrence y Burk, 1976) ligeramente modificado. En este método, el glutatión oxidado (GSSG) formado por la acción de la enzima GPx se acopla a la reacción que cataliza 19 TFG. Óscar Ortiz Rendón. la glutatión reductasa (GR) midiendo la disminución de absorbancia a 340 nm como consecuencia de la oxidación del NADPH. GPx 2GSH + H2O2 → GSSG + 2H2O GR GSSG + NADPH H+ → 2GSH + NADP+ Los reactivos empleados en este método son: - Tampón fosfatopotásico (TPK)..............................250mM, pH= 7,4 a 4ºC - EDTA (SIGMA) en tampón TPK............................10mM - AZIDA....................................................................10 mM - NADPH en bicarbonato al 0,75%p/v......................2 mM - GR en tampón TPK...............................................10 U - GSH.......................................................................10 mM - H2O2.................................................................…...2,5 mM - Muestras diluidas: Suero 1/200 con agua bidestilada - Tejido homogenizado del corazón 1/40 con agua bidestilada Procedimiento: En una microcubeta de 1,5mL de volumen, se añaden 300 µL de TPK, 100 µL de EDTA, 100 µL de AZIDA, 100 µL de NADPH, 100 µL de GSH, 100 µL de GR y 100 µL de muestra diluida. Se deja incubar durante cinco minutos. La microcubeta del blanco contiene 200 µL de H2O mientras que la microcubeta de la muestra contiene 100 µL de muestra y 100 µL de H2O2 que serán añadidos justo antes de comenzar la medida de absorbancia. A continuación se coloca un blanco y la muestra en el espectrofotómetro. Adicionamos los 100 µL de H2O2 a la vez que le damos a autocero y comenzar la medida. La medida se realiza durante 3 minutos a 340 nm . Se observa como esta absorbancia disminuye con el tiempo. Cálculos: La actividad de la enzima GPx se calcula a través de la fórmula: mU/mg proteína = [ (ΔAbs(min) * Vf * 103) / (ε * d * Vm * C) ] * D mU/mg proteína: nmol de GPx por mg de proteína de la muestra; Vf: Volumen final en mL en la microcubeta; ε : coeficiente de absorción para el NADPH, cuyo valor es 6,22 mM-1cm-1; ΔAbs(min): incremento de absorbancia por minuto, valor absoluto; d: paso de la luz de la cubeta, 1 cm; Vm: Volumen de la muestra en mL en la cubeta; C: concentración de proteínas totales de la muestra en mg proteínas/mL; D: factor de dilución de la muestra. 20 TFG. Óscar Ortiz Rendón. 4.7.4. Actividad de la Glutatión reductasa. Fundamento: Dicha técnica se basa en el método espectrofotométrico descrito por (Worthing y Rosemeyer, 1974) ligeramente modificado, por el cual se mide la disminución de absorbancia a 340nm producida por la oxidación del NADPH. La glutatión reductasa (GR), dependiente de NADPH, cataliza la reducción del glutatión oxidado (GSSG) a glutatión reducido (GSH). Los reactivos empleados en este método son: - Tampón fosfato potásico (TPK) (pH= 7.4 a 4ºC) ........ 0,066 M - Solución de cloruro potásico (ACOFARMA) ............... 2 M - Solución EDTA (en TPK) (SIGMA) .......................…... 10 mM - Solución de NaHCO3 (SIGMA) ...............................…. 0,1% p/v - Solución glutatión oxidado (GSSG) (SIGMA) ............. 10 mM - Solución NADPH (en NaHCO3) (SIGMA) ................… 1 mM Procedimiento: En una microcubeta de 1,5 mL se añaden: 590 µL de tampón TPK, 100 µL de cloruro potásico, 100 µL de EDTA, 100 µL de GSSG, 100 µL de NADPH y se deja incubar durante 2 minutos a temperatura ambiente. La reacción se inició cuando se adicionaron 10 µL del homogenizado sin diluir al comienzo de la medición en el espectrofotómetro. Todas las muestras se midieron frente a un blanco, el cual contenía tampón TPK en vez de muestra, a 340 nm durante 3 minutos. Cálculo: La actividad de la enzima GR se obtiene a través de la siguiente fórmula: mU/mg = [ (ΔAbs(min) · Vf · 103) / (ε · d · Vm · C) ] mU/mg proteína: nmol de GR por mg de proteína de la muestra; Vf: Volumen final en mL en la microcubeta; ε : coeficiente de absorción para el NADPH, cuyo valor es 6,22 mM-1cm-1; ΔAbs(min): incremento de absorbancia por minuto, valor absoluto; d: paso de la luz de la cubeta, 1 cm; Vm: Volumen de la muestra en mL en la cubeta; C: concentración de proteínas totales de la muestra en mg proteínas/mL. 4.7.5. Actividad de la Superóxido Dismutasa. Fundamento: La superóxido dismutasa (SOD) es la enzima que cataliza la formación de peróxido de hidrógeno (H2O2) y oxígeno (O2-) a partil del radical superóxido. SOD 2 O2- + 2 H+ → H2O2 + O2 21 TFG. Óscar Ortiz Rendón. La actividad de la SOD se mide a través del método descrito por (Fridovich, 1985) ligeramente modificado, en el que se utiliza el sistema xantina/xantina oxidasa para generar radicales superóxido (O2-). En este ensayo se usa el citocromo C, que es reducido por el radical superóxido, al mismo tiempo esta reacción es inhibida por la superóxido dismutasa, que compite por los radicales superóxido generados por el sistema xantina/xantina oxidasa. Por ello, el grado de inhibición en la reacción de reducción del citocromo C es un indicador de la actividad de la SOD. SOD Xantina/xantina oxidasa → O2- + H+ → H2O2 + O2 ↓ Citocromo C ↓ Citocromo c reducido Para que la reacción siempre estuviera desplazada hacia la derecha se añadió catalasa, para que esta enzima formara agua al tomar el peróxido de hidrógeno formado por la SOD. Los reactivos empleados en este método son: - Tampón fosfato potásico (TPK) (pH = 7,8 a 4ºC) c/ DTPA..……...0,066 M - Solución xantina (SIGMA)....................................................……..0,5 mM - Solución xantina oxidasa (SIGMA).......................................……..25 U - Solución citocromo c (SIGMA).............................................……...100 µM - Solución de cianuro sódico (NaCN) (PANREAC)................……...0,5 mM - Solución de catalasa (SIGMA).............................................……...10 U Procedimiento: En una microcubeta de 1,5mL se añade 490 µL de TPK, 200 µL de citocromo C, 200 µL de xantina 100 µL de NaCN, 100 µL de catalasa, 10 µL de muestra homogenizada de corazón. Para que la reacción de comienzo se ha de añadir 100 µL de la xantina oxidasa para que se generen las especies de superóxido, por lo que es lo último en añadirse antes de medir a 550 nm en el espectrofotómetro, con lo que se observó un aumento de la absorbancia debido a la reducción del citocromo C. Para medir la reducción del citocromo c en ausencia de SOD, se realizó una medida de referencia, la cual se preparó al igual que lo anteriormente descrito pero sin muestra, lo que produjo la reducción completa del citocromo C debida a los radicales superóxidos producidos por el sistema xantina/xantina oxidasa. Se definió la unidad U de SOD como la cantidad de enzima que produce la inhibición de un 50% de la reducción del citocromo C. Cada muestra problema se midió frente a su blanco, que se preparó de la misma forma pero sin que la reacción llegara a producirse, al no añadir al blanco la xantina oxidasa. 22 TFG. Óscar Ortiz Rendón. Cálculos: Los resultados se expresan en U/mg de proteína y se calcula según las siguientes expresiones: % inhibición = 100 - [(ΔAbsmuestra/minuto/ΔAbsreferencia/min) · 100] U/ mg proteína = % inhibición / (50 · C) ΔAbs: incremento de absorbancia; C: cantidad de proteína presente en la muestra en mg 4.7.6. Actividad de la catalasa. Fundamento: La catalasa (CAT), es una enzima que cataliza la reducción del peróxido de hidrógeno (H2O2) a agua. CAT 2 H2O2 → H2O + O2 Para la determinación de la actividad de la catalasa se llevó a cabo el método descrito por (Beers y Sizer 1952), por el que se midió espectrofotométricamente la disminución de peróxido de hidrógeno (H2O2) en el medio a 240nm. Los reactivos empleados en este método son: - Tampón fosfato potásico (TPK) (pH= 7,4 a 4ºC).......................0,066M - Solución peróxido de oxígeno (H2O2)........................................1/100 v/v - Dilución de muestra homogenizada de corazón en agua bidestilada 1/120 Procedimiento: Se añadieron los siguientes elementos en una cubeta de cuarzo macro, 2 mL de Tampón fosfato potásico y 120 µL de la muestra homogenizada de corazón diluida. Antes de medir en el espectrofotómetro, se añadió 480 µL de peróxido de hidrógeno para que empezara la reacción, midiendo así como va desapareciendo el hidróxido de hidrógeno a 240 nm durante 3 minutos. Cálculos: Para determinar la actividad de la catalasa en la muestra homogenizada de corazón, se calculó usando la siguiente fórmula: mU/ mg proteína total = [ ( ΔAbs(min) · Vf ) / ( ε · d · Vm · C ) ] · D mU/mg proteína: nmol de catalasa por mg de proteína de la muestra; Vf: Volumen final en mL en la microcubeta; ε : coeficiente de absorción para el H2O2, cuyo valor es 0,0394 mM-1·cm-1; ΔAbs(min): incremento de absorbancia por minuto, valor absoluto; d: paso de la luz de la cubeta, 1 cm; Vm: Volumen de la muestra en mL en la cubeta; C: concentración de proteínas totales de la muestra en mg proteínas/mL; D: factor de dilución de la muestra 23 TFG. Óscar Ortiz Rendón. 4.7.7. Peroxidación lipídica. Fundamento: Para la determinación de la peroxidación lipídica se llevó a cabo el método descrito por (Beers y Sizer, 1952), la cual provoca la reacción entre el malondialdehído (MDA) y el ácido tiobarbitúrico (TBA). Como producto final de la degradación de los lípidos se obtiene el MDA, que puede reaccionar con TBA a unas temperaturas altas y pH bajo. Por cada molécula de MDA hay una adición nucleofílica con dos moléculas de TBA, esto genera un pigmento rojo que se puede medir espectrofotométricamente a 535 nm. Los reactivos empleados en este método son: - Solución ácido tricloroacético (TCA)............................20% p/v - Solución ácido tiobarbitúrico (TBA)..............................0,67% p/v Procedimiento: En primer lugar, se toman 150 µL de la muestra homogenizada de corazón y se mezclan en tubo de eppendorf con una cantidad igual de ácido tricloroacético. Se centrifuga durante 10 minutos a 14000 rpm con una temperatura de 4ºC para precipitar las proteínas. Se toma del sobrenadante resultante 150 µL mezclándose, en un nuevo tubo eppendorf, con 150 µL de ácido tiobarbitúrico y se deja incubaren al baño María durante 10 minutos a 100ºC. Una vez terminada la incubación, se trasladaron los tubos eppendorf a un recipiente con hielo para bajar la temperatura de los mismos. Posteriormente se midió en el espectrofotómetro frente a un blanco que se procesó de la misma forma a excepción de que contenía la agua bidestilada en lugar de la muestra. Cálculos: Para la determinación de la concentración de MDA se usó la siguiente fórmula. Abs = ε · C · d Abs: Absorbancia de la muestra; ε: coeficiente de extinción molar para el MDA a 535 nm = 153·10-3 mL·mol-1·cm-1; C: concentración de MDA en la muestra mol/ml; d: paso de la luz de la cubeta, 1cm. 4.8. Determinación de homocisteína en suero. Los niveles de homocisteína se determinaron en suero de ratas mediante un analizador automático discreto multicanal (BAYER RA 1000). 4.9. Determinación de la presión y frecuencia cardíaca. El día anterior al sacrificio se midió la frecuencia cardíaca de las ratas adolescentes sometidas a BD mediante el método indirecto de oclusión de la cola (Gómez-Amores et al., 2007). Las mediciones se realizaron usando un Medidor de presión 645 NIPREM (CIBERTEC, Barcelona,España). Las señales recogidas se 24 TFG. Óscar Ortiz Rendón. trataron con un soporte informático a través de un sistema de adquisición de datos acoplado al medidor de presión. Cada medición en cada animal se realizó 3-4 veces sucesivamente con el fin de calcular la media aritmética, que fue el valor utilizado. 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5.1. Parámetros nutricionales. En la tabla 1, se reflejan los datos obtenidos en los parámetros nutricionales y morfológicos medidos durante el experimento. En ellos se puede observar que no hubo cambios significativos en la ingesta de comida sólida ni en el incremento de peso corporal entre los grupos estudiados tras el consumo de alcohol tipo BD. El modelo de suplementación con ácido fólico elegido fue eficaz, mostrando los grupos suplementados una mayor concentración sérica de esta vitamina respecto a los grupos no suplementados. Grupos de ratas C: n=6 A: n=6 CF: n=6 AF: n=6 Incremento de peso corporal (g/día) 5.38 ± 0.19 5.03 ± 0.27 5.47 ± 0.20 5.07 ± 0.23 Ingesta sólida (g/día/rata) 13.1 ± 0.79 12.0 ± 0.67 13.4 ± 0.73 12.8 ± 0.56 Ingesta de fólico (g/día) 32.4 ± 2.23 30.3 ± 1.97 fff 131.3 ± 0.33 122.7 ± 5,28 Ácido fólico en suero (µg/L) 95,45 ± 2,41 102,7 ± 2,12 109,4 ± 4,35 120,1 ± 4,52 IOS corazón 0.43 ± 0.02 0.45 ± 0.03 0.43 ± 0.04 0.44 ± 0.01 Proteínas totales en corazón (mg/mL) 38,8 ± 3,1 39,7 ± 2,9 36,0 ± 2,67 38,3 ± 3,1 Tabla 1. parámetros nutricionales. Los resultados son expresados como la media ± SEM de 6 animales en cada grupo n= numero de animales ; C: grupo control; A: grupo alcohol; CF: grupo control fólico; AF: grupo alcohol fólico; IOS: índice organosomático. Significación estadística: AF vs A: fffp<0,001. Los datos obtenidos en este caso demuestran que este modelo de consumo de alcohol, en las ratas adolescentes, no afecta la cantidad de alimento ingerido ya que debido a la vía de administración, mediante inyección intraperitoneal, el alcohol no pasa a través del sistema digestivo y por tanto, no altera la mucosa intestinal ni 25 TFG. Óscar Ortiz Rendón. Figura 12. Representación de los niveles plasmáticos de homocisteína. Los resultados son expresados como la media ± SEM de 6 animales en cada grupo. Grupos: C, grupo control; A, grupo alcohol; CF, grupo control fólico; AF, grupo alcohol fólico. Significancia estadística: A vs. C: **p<0.01; A vs AF ffp<0.01. (Piano et al., 2017) detalla los efectos adversos del consumo excesivo de alcohol en el riesgo y el desarrollo de la enfermedad cardiovascular en humanos. Estos autores sugieren que el consumo de alcohol tipo BD se asocia con un mayor riesgo de presión arterial, hipertensión, infarto de miocardio y accidente cerebrovascular en adultos de mediana edad y mayores. Además, ellos concluyen que el consumo excesivo de alcohol también puede tener efectos cardiovasculares adversos en adultos jóvenes (de 18 a 30 años). Los mecanismos por los que se producen estas alteraciones continúan sin esclarecer, aunque la evidencia disponible sugiere que el consumo excesivo de alcohol puede inducir EO y lesiones vasculares además de ser proaterogénico. Sin embargo, hasta la fecha, no existía bibliografía que determine los niveles de homocisteína tras el binge drinking. Como se puede apreciar en la figura 10, los niveles de homocisteína en el grupo AF disminuyen, alcanzándose valores próximos al grupo control. De nuevo, la suplementación con ácido fólico es una terapia efectiva frente al daño cardiovascular. Es bien conocido que el ácido fólico disminuye los niveles de homocisteína a través del ciclo de la metionina. Uno de los mecanismos propuestos es mediante la regeneración de GSH a través de la transufuración de la homocisteína (Davis and Uthus, 2003). Resultados similares se han observado en ratas expuestas al alcohol pero de manera crónica (Barrero et al., 2012). De la misma manera, se ha estudiado la frecuencia cardiaca de las ratas adolescentes sometidas a BD con el fin de determinar si existía daño en el corazón (Figura 13). Se puede observar que la frecuencia cardíaca en el grupo A presenta un aumento muy significativo con respecto al grupo C. Sin embargo, la suplementación con ácido fólico utilizada restaura este parámetro hasta valores controles, por lo que se puede sugerir que la suplementación utilizada contribuye a mejorar la funcionalidad cardíaca afectada tras el BD. 32 TFG. Óscar Ortiz Rendón. Figura 13. Frecuencia cardíaca. Los resultados son expresados como la media ± SEM de 6 animales en cada grupo. Grupos: C, grupo control; A, grupo alcohol; CF, grupo control fólico; AF, grupo alcohol fólico. Significancia estadística: A vs. C: *p<0.05; A vs AF ffp<0.01. Estudios diversos han mostrado que existe una asociación entre el consumo de alcohol y el aumento de la frecuencia cardiaca, incluso tras el BD y que estos bebedores presentan un mayor riesgo cardiovascular (Ryu et al., 2014; Sengul et al., 2011; Rossinen et al., 1999). Se ha demostrado que el alcohol, consumido de forma aguda, provoca debilidad en la contracción del corazón (Danziger et al., 2014; Guarnieri y Lakatta, 1990) y disminuye el volumen sistólico, provocando irregularidades en la frecuencia cardíaca que podría producir arritmias como mecanismo compensatorio. Las aurículas se ven forzadas a bruscos espasmos descoordinados con los ventrículos, lo que se conoce como fibrilación auricular, pudiendo llegar (en casos más graves) a producir una muerte súbita cardíaca. Una de las causas principales pueden ser las alteraciones en la repolarización miocárdica y en la prolongación de la duración del potencial de acción, provocado por disminución de los niveles de potasio que son de gran importancia (Zhang et al., 2017). La suplementación con ácido fólico disminuye la frecuencia cardíaca mejorando el funcionamiento del corazón. Como se ha podido determinar, la suplementación utilizada restablece la actividad de los sistemas enzimáticos antioxidantes alterados frente al EO sufrido por el BD, y disminuye la oxidación lipídica en el corazón, por lo que evita las alteraciones cardíacas producidas por este consumo de alcohol en las ratas adolescentes. Además, disminuye los niveles de homocisteína, mejora la actividad del par enzimático GPx/GR y aumenta los niveles de fólico en suero. Todo ello repercute en una mejor protección frente al EO y por tanto, una menor oxidación de los lípidos y demás biomoléculas, demostrando que la suplementación con ácido fólico es una terapia eficiente frente al daño y la enfermedad cardiovascular. 33 TFG. Óscar Ortiz Rendón. 6. Conclusiones. El consumo de alcohol tipo binge drinking no afecta a la cantidad de alimento ni el ácido fólico ingeridos por las ratas adolescentes así como a sus parámetros morfológicos, ya que debido a la vía de administración, mediante inyección intraperitoneal, el alcohol no pasa a través del sistema digestivo y por tanto, no altera la mucosa intestinal ni produce malnutrición. La suplementación con ácido fólico utilizada incrementó significativamente la ingesta de esta vitamina y aumentó su concentración en el suero de las ratas suplementadas. Los efectos del consumo de alcohol tipo binge drinking destacan por alterar la actividad de las enzimas antioxidantes cardíacas, pero sobre todo por disminuir la actividad de la GPx, ya que probablemente produce una disminución de ácido fólico en el corazón y por consiguiente, de GSH, el principal cofactor de esta enzima. Sin embargo, la suplementación en la dieta con fólico restaura la actividad de esta enzima al aumentar el GSH en corazón. En el suero de las ratas expuestas al binge drinking, la actividad de la enzima GPx disminuye, probablemente debido a un agotamiento del GSH, como sucede en el corazón, a pesar de que la enzima GR presenta una alta actividad para regenerarlo. La suplementación utilizada aumenta la actividad de la enzima GPx tras el binge drinking debido a la elevada concentración de fólico en suero. El consumo de alcohol tipo binge drinking durante la adolescencia produce daño oxidativo a nivel cardiovascular y afecta a la funcionalidad del corazón ya que incrementa los niveles de homocisteína en suero así como la frecuencia cardíaca. La suplementación utilizada restauraba ambos parámetros. La suplementación con esta vitamina es eficaz para mejorar la actividad de la GPx en corazón y suero y hacer frente al desbalance oxidativo producido por el alcohol, mejorando la funcionalidad cardíaca y el daño cardiovascular. 34 TFG. Óscar Ortiz Rendón. 7. Bibliografía. - Abilés JS. Estrés oxidativo y su relación con el aporte de antioxidantes nutricionales en el paciente crítico [en línea]. HeraUgrEs: 2007 [consultado en mayo 2019). Disponible en: http://hera.ugr.es/tesisugr/16710794.pdf - Barrero MJ, Ojeda ML, Díaz-Castro J, Nogales F, Murillo ML, Carreras O. The action of folic acid upon aldosterone clearance: a possible hypotensor in alcoholic rats. 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