La regulación del transporte de L-arginina vía HCAT-1 por insulina involucra activación diferencial de los subtipos A y B de receptores de insulina y receptores de adenosina en células endoteliales de vena umbilical humana de diabetes gestacional

PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CHILE Facultad de Ciencias Biológicas Programa de Doctorado en Ciencias Biológicas Mención Ciencias Fisiológicas LA REGULACIÓN DEL TRANSPORTE DE L-ARGININA VÍA HCAT-1 POR INSULINA INVOLUCRA ACTIVACIÓN DIFERENCIAL DE LOS SUBTIPOS A Y B DE RECEPTORES DE INSULINA Y RECEPTORES DE ADENOSINA EN CÉLULAS ENDOTELIALES DE VENA UMBILICAL HUMANA DE DIABETES GESTACIONAL. Tesis entregada a la Pontificia Universidad Católica de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Grado de Doctor en Ciencias Biológicas mención Ciencias Fisiológicas Por ENRIQUE ALBERTO GUZMÁN GUTIÉRREZ Director de Tesis : Luis Sobrevia Co-Director de Tesis : Carmen Vázquez Comisión de Tesis : Juan Carlos Vera Xavier Figueroa Gareth Owen Francisca Bronfman Enero de 2014 i Para mis Padres, por su incondicional apoyo; Alejandra, por su sabiduría, amor y compañía; e Hijo por cambiarme la vida. ii Agradecimientos Quiero agradecer a todos los miembros del Laboratorio de Fisiología Celular y Molecular (CMPL), de manera particular a mi tutor: Profesor Luis Sobrevia, quien con su gran apoyo y constancia me ayudó crecer como investigador, profesional y como persona. Además, a quienes están y estuvieron en el laboratorio, Carlos Puebla, Carlos Salomón, Francisco Westermeier, Tamara Saez, Rocío Salsoso, Andrea Leiva, Fabian Pardo, Romy Orellana, Amparo Pacheco y Ninoska Muñoz; quienes me ayudaron en el día a día de la vida de un estudiante de doctorado. Además, quiero agradecer al Departamento de Fisiología y Zoología de la Universidad de Sevilla, de manera especial, a la Profesora Carmen Vázquez, quien junto a su equipo de trabajo, Alfonso Mate, Sonia Zambrano, Maria Victoria “Mariví” Ruiz, y Antonio Blanca; me ayudaron durante mis estadías en la Universidad de Sevilla y compartí hermosos momentos que no olvidaré. También quiero agradecer a los miembros de la comisión de tesis, Dra. Francisca Bronfman, Dr. Juan Carlos Vera, Dr. Xavier Figueroa, Dr. Gareth Owen, y también al Dr. Juan Carlos Sáez quienes por su disposición y comentarios he podido terminar esta tesis, la cual ha abierto nuevas líneas de investigación. Agradecer a las fuentes de financiamiento: beca de doctorado en Chile, beca de pasantía doctoral en el extranjero y beca de apoyo de tesis doctoral AT-24120944 de CONICYT, y a los proyectos del laboratorio: Anillos ACT-73 CONICYT, y FONDECYT 1110977. Agradezco de manera muy especial a mis padres Raúl y María, quienes me han apoyado desde siempre con su amor y compañía, a mi hermano Raúl Antonio, Elizabeth y Constanza, quienes me acompañaron como familia durante mi estadía en Santiago. Agradezco a mi grandes “Amigos de la vida”, Renato Martinez y Paulina Fernández, quienes siempre me alentaron a seguir y mirar al frente en todos los desafíos. Y finalmente agradecer a mi gran amor Alejandra, quien me ha dado todo, siempre estaré agradecido por estár conmigo en las buenas y en las malas. Además, agradecer a mi pequeño hijo por darme un nuevo aire a mi vida. Los Amo. iii Índice General Índice general iii Índice de figuras vi Índice de tablas x Abreviaturas xi Resumen xii Abstract xiii 1 Introducción 1 1.1 Diabetes gestacional 1 1.1.1 Efecto de la diabetes gestacional sobre la función endotelial 2 1.2 Transporte de L-arginina 3 1.2.1 Transportador de aminoácidos catiónicos tipo 1 (hCAT-1) 4 1.2.2 Regulación del transporte de L-arginina vía hCAT-1 4 1.2.3 Regulación de la expresión de SLC7A1 5 1.2.4 Efecto de la diabetes gestacional sobre el transporte de L-arginina en HUVEC 9 1.3 Receptores de adenosina 10 1.3.1 Rol de los receptores de adenosina en la diabetes gestacional 13 1.4 Insulina 16 1.4.1 Rol de la insulina en diabetes gestacional 17 1.4.2 Regulación del transporte de L-arginina vía hCAT-1 por insulina 19 1.4.3 Receptores de insulina 20 1.4.4 Regulación del efecto de insulina por adenosina 24 1.5 Comentario final 28 2 Hipótesis 30 3 Objetivos 31 3.1 Objetivos generales 31 3.2 Objetivos específicos 31 4 Métodos 32 4.1 Muestras biológicas y cultivo celular 32 4.1.1 Colección de cordones umbilicales 32 4.1.2 Cultivo de células endoteliales de vena umbilical humana 34 4.1.3 Condiciones experimentales 34 4.1.4 Cuantificación de proteínas 35 4.2 Transporte de L-arginina 36 4.3 Expresión de hCAT-1 y receptores de insulina 39 4.3.1 Western blots 39 4.3.2 Extracción de RNA total y transcripción reversa 39 4.3.3 PCR no cuantitativo 40 4.3.4 PCR cuantitativo (real time) 42 4.4 Promotor SLC7A1 y knockdown de receptores de insulina 43 iv 4.4.1 Clonamiento de una región del promotor de SLC7A1 43 4.4.2 Transfección transitoria y medición de la actividad luciferasa 44 4.4.3 Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) 45 4.4.4 Silenciamiento génico de IR-A e IR-B 47 4.4.5 Generación de los plásmidos pShuttle-siIR-A y B 47 4.4.6 Recombinación homóloga en células HEK293 48 4.4.7 Cosecha de adenovirus 49 4.4.8 Transducción adenoviral de HUVEC 50 4.5 Estimación del tamaño muestral 50 4.6 Análisis de datos 51 5 Resultados 52 5.1 Caracteristicas clínicas de las embarazadas y los recién nacidos 52 5.2 Efecto de la diabetes gestacional sobre el transporte de L-arginina 54 5.3 Efecto de insulina sobre el transporte de L-arginina 58 5.4 Efecto de diabetes gestacional e insulina sobre la abundancia de la proteína hCAT-1 en HUVEC 58 5.5 Efecto de diabetes gestacional e insulina sobre los niveles de mRNA para hCAT-1 en HUVEC 62 5.6 Efecto de diabetes gestacional e insulina sobre la actividad transcripcional del promotor de SLC7A1 62 5.7 Efecto de diabetes gestacional sobre la expresión de las isoformas A y B del receptor de insulina en HUVEC 64 5.8 Silenciamiento de IR-A e IR-B en HUVEC 64 5.9 Efecto de insulina sobre la expresión de las isoformas A y B del receptor de insulina en HUVEC 64 5.10 Participación de IR-A e IR-B en la captación de L-arginina en HUVEC 69 5.11 Participación de IR-A e IR-B en el transporte de L-arginina en HUVEC 69 5.12 Participación de IR-A e IR-B en la abundancia de proteína para hCAT-1 en HUVEC 74 5.13 Participación de IR-A e IR-B en los niveles de mRNA para hCAT-1 en HUVEC 74 5.14 Participación de IR-A e IR-B sobre la actividad transcripcional del promotor de SLC7A1 en HUVEC 77 5.15 Efecto de la activación e inhibición de los receptores de adenosina sobre la captación de L-arginina en HUVEC 81 5.16 Efecto de la activación e inhibición de los receptores de adenosina sobre el transporte de L-arginina en HUVEC 84 5.17 Participación de IR-A e IR-B sobre el efecto de la activación e inhibición de los receptores de adenosina sobre la captación de L-arginina en HUVEC 95 5.18 Participación de IR-A e IR-B en el efecto de la activación e inhibición de los receptores de adenosina sobre el transporte de L-arginina en HUVEC normales 104 5.19 Participación de IR-A e IR-B en el efecto de la activación e inhibición de los receptores de adenosina sobre el transporte de L-arginina en HUVEC con diabetes gestacional 126 v 5.20 Efecto de los reeptores de adenosina e insulina sobre la abundancia de proteína para hCAT-1 en HUVEC 148 5.21 Efecto de IR-A e IR-B sobre la activación e inhibición de receptores de adenosina en la abundancia de proteína para hCAT-1 en HUVEC 148 5.22 Efecto de IR-A e IR-B sobre la activación e inhibición de receptores de adenosina en los niveles de mRNA para hCAT-1 en HUVEC 150 5.23 Efecto de IR-A e IR-B sobre la activación e inhibición de receptores de adenosina en la actividad transcripcional del promotor de SLC7A1 en HUVEC 159 5.24 Efecto de diabetes gestacional sobre la unión de Sp1 al promotor de SLC7A1 en HUVEC 164 5.25 Efecto de IR-A e IR-B en la unión de Sp1 al promotor de SLC7A1 en HUVEC 164 6 Discusión 168 6.1 Diabetes gestacional 170 6.2 Efecto de diabetes gestacional sobre el transporte de L-arginina 172 6.3 Efecto de diabetes gestacional sobre la expresión de hCAT-1 173 6.4 Efecto de insulina sobre el transporte del L-arginina en diabetes gestacional 174 6.5 Efecto de insulina en la expresión de hCAT-1 en diabetes gestacional 176 6.6 Participación de las isoformas A y B del receptor de insulina en el transporte de L-arginina 179 6.7 Efecto de los receptores de adenosina sobre el efecto de diabetes gestacional 183 6.8 Efecto de los receptores de adenosina sobre el efecto de insulina en diabetes gestacional 184 6.9 Efecto de los receptres de adenosina y de las isoformas del receptor de insulina en diabetes gestacional 186 7 Conclusiones generales 189 8 Proyecciones 190 9 Referencias 191 vi Índice de Figuras Pág Figura 1 Esquema de la región promotora desde -1606 pb desde el sitio de inicio de la transcripción de SCL7A1 7 Figura 2 Modulación del transporte de L-arginina vía hCAT-1 por insulina y adenosina en HUVEC de embarazos con diabetes gestacional 29 Figura 3 Diabetes gestacional aumenta la captación de L-arginina en HUVEC 55 Figura 4 Diabetes gestacional aumenta el transporte total y saturable de Larginina en HUVEC 56 Figura 5 Insulina revierte el aumento de la captación de L-arginina en HUVEC de diabetes gestacional 59 Figura 6 Insulina revierte el aumento del transporte total y saturable de Larginina en HUVEC de diabetes gestacional 60 Figura 7 Insulina revierte el aumento de la abundancia de proteína y los niveles de mRNA para hCAT-1 en HUVEC de diabetes gestacional 61 Figura 8 Insulina revierte el aumento de la actividad transcripcional del promotor de SLC7A1 en HUVEC de diabetes gestacional 63 Figura 9 Diabetes gestacional se asocia con aumento en los niveles de mRNA para IR-A 65 Figura 10 Silenciamiento de las isoformas A y B del receptor de insulina mediante siRNA en HUVEC 66 Figura 11 Silenciamiento específico de las isoformas A y B del receptor de insulina mediante siRNA en HUVEC. 67 Figura 12 Insulina revierte el aumento de los niveles de mRNA para IR-A en HUVEC de diabetes gestacional 68 Figura 13 Insulina requiere de IR-A para revertir el aumento de la captación de L-arginina en HUVEC de diabetes gestacional 70 Figura 14 Insulina requiere de IR-A para revertir el aumento del transporte de Larginina en HUVEC de diabetes gestacional 71 Figura 15 Insulina requiere de IR-A para revertir el aumento de la abundancia de proteína para hCAT-1 en HUVEC de diabetes gestacional 75 Figura 16 Insulina requiere de IR-A para revertir el aumento de los niveles de mRNA para hCAT-1 en HUVEC de diabetes gestacional 76 Figura 17 Insulina requiere de IR-A para revertir el aumento de la actividad transcripcional del promotor de SLC7A1 78 Figura 18 Insulina requiere de la actividad de receptores de adenosina A2A para aumentar la captación de L-arginina en HUVEC provenientes de embarazos normales. 82 Figura 19 Insulina requiere de la actividad de receptores de adenosina A1 para revertir el aumento de la captación de L-arginina en HUVEC de diabetes gestacional 83 Figura 20 El transporte de L-arginina no se altera por activación de receptores de adenosina en HUVEC provenientes de embarazos normales. 88 Figura 21 Insulina requiere de la actividad de receptores de adenosina A2A para aumentar el transporte saturable de L-arginina en HUVEC normales 89 vii Figura 22 Diabetes gestacional aumenta el transporte de L-arginina de una manera dependiente de receptores de adenosina A2A 90 Figura 23 Insulina revierte el aumento del transporte de L-arginina en HUVEC de diabetes gestacional de una manera dependiente de receptores de adenosina A1 91 Figura 24 Insulina requiere de IR-A e IR-B, pero no de receptores de adenosina A1 para aumentar la captación de L-arginina en HUVEC normales 96 Figura 25 Insulina requiere de IR-A e IR-B, y de receptores de adenosina A2A para aumentar la captación de L-arginina en HUVEC normales 97 Figura 26 Insulina requiere de IR-A e IR-B, pero no de receptores de adenosina A2B para aumentar la captación de L-arginina en HUVEC normales 98 Figura 27 Insulina requiere de IR-A e IR-B, pero no de receptores de adenosina A3 para aumentar la captación de L-arginina en HUVEC normales 99 Figura 28 Insulina requiere de IR-A y de receptores de adenosina A1 para revertir el aumento de la captación de L-arginina en HUVEC de diabetes gestacional 100 Figura 29 Insulina requiere de IR-A y de receptores de adenosina A2A para revertir el aumento de la captación de L-arginina en HUVEC de diabetes gestacional 101 Figura 30 Insulina requiere de IR-A y no de receptores de adenosina A2B para revertir el aumento de la captación de L-arginina en HUVEC de diabetes gestacional 102 Figura 31 Insulina requiere de IR-A y no de receptores de adenosina A3 para revertir el aumento de la captación de L-arginina en HUVEC de diabetes gestacional 103 Figura 32 El transporte de L-arginina no se altera en HUVEC normales knockdown para IR-A en presencia de agonistas y antagonistas de receptores de adenosina 105 Figura 33 Insulina no aumenta el transporte de L-arginina en HUVEC normales knockdown para IR-A en ausencia y presencia de agonistas y antagonistas de receptores de adenosina 107 Figura 34 El transporte de L-arginina no se altera en HUVEC normales knockdown para IR-B en presencia de agonistas y antagonistas de receptores de adenosina. 109 Figura 35 Insulina no aumenta el transporte de L-arginina en HUVEC normales knockdown para IR-B en ausencia y presencia de agonistas y antagonistas de receptores de adenosina 111 Figura 36 HUVEC normales knockdown para IR-A e IR-B en ausencia y presencia de agonistas y antagonistas de receptores de adenosina no cambian el transporte de L-arginina 113 Figura 37 Insulina no aumenta el transporte de L-arginina en HUVEC normales knockdown para IR-A e IR-B en ausencia y presencia de agonistas y antagonistas de receptores de adenosina 115 Figura 38 El aumento del transporte de L-arginina en HUVEC de diabetes gestacional knockdown para IR-A es vía activación de receptores de adenosina A2A 127 viii Figura 39 Insulina recupera el transporte de L-arginina en HUVEC de diabetes gestacional knockdown para IR-A en presencia de un antagonista de receptores de adenosina A2A. 129 Figura 40 El aumento del transporte de L-arginina en HUVEC de diabetes gestacional knockdown es revertido en presencia de un antagonista de receptores de adenosina A2A. 131 Figura 41 Insulina revierte el aumento del transporte de L-arginina en HUVEC de diabetes gestacional knockdown para IR-A de manera dependiente de receptores de adenosina A1 133 Figura 42 El aumento transporte de L-arginina en HUVEC de diabetes gestacional knockdown para IR-A e IR-B solo se bloqueó en presencia de un antagonista de receptores de adenosina A2A. 135 Figura 43 Insulina revierte el aumento del transporte de L-arginina en HUVEC de diabetes gestacional knockdown para IR-A e IR-B de una manera dependiente de receptores de adenosina A1 137 Figura 44 Insulina requiere de la ctividad de receptores de adenosina A1 para revertir el aumento de la abundancia de proteína para hCAT-1 en HUVEC de diabetes gestacional 149 Figura 45 Insulina no aumenta la abundancia de proteína en HUVEC normales knockdown para IR-A y no es modificado por agonistas y antagonistas de receptores de adenosina A1 y A2A 151 Figura 46 Insulina no aumenta la abundancia de proteína en HUVEC normales knockdown para IR-B y no es modificado por agonistas y antagonistas de receptores de adenosina A1 y A2A 152 Figura 47 Insulina revierte el aumento de la abundancia de proteína de hCAT-1 en HUVEC de diabetes gestacional knockdown para IR-B, requiriendo la actividad de receptores de adenosina A1 153 Figura 48 Insulina revierte el aumento de la abundancia de proteína de hCAT-1 en HUVEC de diabetes gestacional knockdown para IR-B 154 Figura 49 Insulina requiere de IR-A e IR-B, y no de receptores de adenosina A1 para aumentar niveles de mRNA para hCAT-1 en HUVEC normales 155 Figura 50 Insulina requiere de IR-A e IR-B, y no de receptores de adenosina A2A para aumentar niveles de mRNA para hCAT-1 en HUVEC normales 156 Figura 51 Insulina requiere de IR-A, y receptores de adenosina A1 para revertir el aumento de los niveles de mRNA para hCAT-1 en HUVEC de diabetes gestacional 157 Figura 52 Insulina requiere de IR-A, y no de receptores de adenosina A2A para revertir el aumento de los niveles de mRNA para hCAT-1 en HUVEC de diabetes gestacional 158 Figura 53 Insulina requiere de IR-A e IR-B, y no de receptores de adenosina A1 para aumentar la actividad transcripcional del promotor de SLC7A1 en HUVEC normales 160 Figura 54 Insulina requiere de IR-A e IR-B, y no de receptores de adenosina A2A para aumentar la actividad transcripcional del promotor de SLC7A1 en HUVEC normales 161 Figura 55 Insulina requiere de IR-A, y de receptores de adenosina A1 para 162 2 1.1.1 Efecto de la diabetes gestacional sobre la función endotelial Diabetes gestacional genera alteraciones estructurales y funcionales, incluyendo la disfunción endotelial de la micro y macrocirculación placentaria (Tchirikov y cols., 2002; Biri y cols., 2006; Sobrevia y cols., 2011; Westermeier y cols., 2011; Salomón y cols., 2012), observándose una regulación alterada del tono vascular en la circulación feto-placentaria (Berholm y cols., 2003; San Martin & Sobrevia, 2006; Casanello y cols., 2007; Sobrevia y cols., 2011), aún sin existir una claridad con respecto a los mecanismos de la disfunción endotelial asociados a este síndrome (Sobrevia y cols., 2011). El segmento distal del cordón umbilical y la placenta son lechos vasculares donde no existe inervación (Marzioni y cols., 2004), por lo tanto, una regulación local del tono vascular resulta de una equilibrada combinación de la síntesis, liberación y bioactividad de vasodilatadores (i.e., óxido nítrico, prostaglandinas, adenosina) y vasoconstrictores (i.e., endotelina 1), derivados del endotelio (Olsson & Pearson, 1990; Becker y cols., 2000). Se ha reportado que en arterias y venas de la placenta humana provenientes de embarazos con diabetes gestacional existe un aumento en la síntesis de óxido nítrico (NO) (Figueroa y cols., 2000). Además, el mismo resultado se obtuvo a partir de cultivos primarios de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) obtenidos desde pacientes diagnosticados con diabetes gestacional (Sobrevia y cols., 1995). Por lo tanto, el aumento de la vasodilatación observada en esta patólogía puede ser consecuencia de un aumento en la síntesis de NO y su biodisponibilidad en la circulación placentaria humana (Sobrevia y cols., 2011). Incluso cuando la disfunción endotelial se asocia a diabetes gestacional, este es referido como una alteración de la síntesis de NO y de la captación del aminoácido catiónico L-arginina (i.e., ruta L-arginina/NO) (Sobrevia y cols., 2011; Guzmán-Gutiérrez y cols., 2013). La mayoría de los estudios no son concluyentes con 3 respecto a los mecanismos detrás de estos efectos de la diabetes gestacional. Sin embargo, es aceptado que es el resultado de la alteración de múltiples mecanismos metabólicos, incluyendo la sensibilidad del endotelio fetal humano a las moléculas vasoactivas como adenosina (Vásquez y cols., 2004; San Martín & Sobrevia, 2006; Salomón y cols., 2012; Guzmán-Gutiérrez y cols., 2012; 2013). 1.2 Transporte de L-arginina El transporte de L-arginina en células humanas comprende a diferentes sistemas de transportadores de aminoácidos entre ellos al sistema y+ (alta afinidad, transporte independiente de Na+) y los transportadores dependientes de Na+ (b0,+, B0,+, e y+L) (San Martín & Sobrevía, 2006; Wu, 2009). La familia y+ está compuesta de 5 miembros de transportadores de aminoácidos catiónicos (CATs: cationic amino acids transporters) CAT1, CAT2A, CAT2B, CAT3 and CAT4 (Closs y cols., 2006; Grillo y cols., 2008), considerados como el principal mecanismo de transporte de L-arginina en diversos tipos celulares (Tong & Barbul, 2004). CAT-1 se expresa, con mayor y menor abundancia, en diversos tipos celulares; exceptuando el caso del hígado, donde no se reporta su expresión (Verrey y cols., 2004). El sistema CAT-1 es considerado el principal transportador de Larginina en la placenta (Grillo y cols., 2008). En HUVEC se ha demostrado que el transporte de L-arginina es mediado por los sistemas hCAT-1 (~80% del transporte de L-arginina total) y hCAT-2B (~20% del transporte de L-arginina total) humanos (Casanello & Sobrevia, 2002; González y cols., 2004, 2011a; Verrey y cols., 2004). En células endoteliales de la microvasculatura de la placenta se han descrito los sistemas y+ e y+L, CAT-1 y 4F2hc, respectivamente (Dye y cols., 2004). Además, se ha descrito que el trasporte de L-arginina en estos tipos celulares 4 es mediado por el sistema B0,+ (Pann y cols., 1995). En otros modelos endoteliales, como por ejemplo el de la vena safena humana (HSVECs: human saphenous vein endothelial cells) se ha descrito la expresión de CAT-2B, el cual puede ser activado por una ruta dependiente de PKC (Visigalli y cols., 2007), y en células endoteliales de la arteria pulmonar humana (hPAEC: human pulmonary artery endothelial cells) se ha descrito la expresión de CAT-1, el cual es el responsable del 70-95% de la captación de L-arginina (Sergey y cols., 2003). 1.2.1 Transportador de aminoácidos catiónicos tipo 1 (hCAT1) hCAT1 pertenece al sistema de transporte y+ el cual se caracteriza por ser independiente de Na+ y de pH (Deves & Boyd, 1998; Closs y cols., 2006). Este transportador presenta valores de Km para L-arginina, L-lisina, y L-ornitina entre 100 y 150 µM, y es fuertemente estimulado por el sustrato en el lado trans de la membrana (Closs y cols., 2006). Además, hCAT-1 puede ser estimulado por hiperpolarización de la membrana (Closs y cols., 2006). El gen que codifica para esta proteína es el SLC7A1 el cual se ubica en el cromosoma 13q12-q14 (Albritton y cols., 1992; Hammermann y cols., 2001) está formado por 13 exones y 11 intrones, de los cuales los exones (-1) y (-2) son notraducibles (Hammermann y cols., 2001; Sobrevia & González 2009), ubicando el inicio de la transcripción (ATG) en el exón +1 (Sobrevia & González 2009, González y cols., 2011a). 1.2.2 Regulación del transporte de L-arginina vía hCAT1 El transporte de L-arginina vía hCAT-1 está sujeto a regulación por diferentes agentes o condiciones (Sobrevia & González, 2009; González y cols., 2011a). 5 En HUVEC se ha determinado que la expresión de hCAT-1 aumenta en presencia de algunas citoquinas, tales como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) (Irie y cols., 1997; Visigalli y cols., 2007) y el factor de crecimiento transformante beta (TGF-β) (Vásquez y cols., 2007), en presencia de radicales libres como el anión superoxido (O2-) (González y cols., 2011b), de la hormona insulina (González y cols., 2011a; GuzmánGutiérrez y cols., 2012), de la activación de receptores de adenosina del tipo A2A (Vásquez y cols., 2004; Guzmán-Gutiérrez y cols., 2012), o altas concentraciones extracelulares de D-glucosa (25 mM) (Vásquez y cols., 2007), siendo los últimos tres componentes asociados a diabetes gestacional (San Martín & Sobrevia, 2006). Cabe destacar, que HUVEC proveniente de embarazos de diabetes gestacional poseen mayor expresión hCAT-1 (Vásquez y cols., 2004; Guzmán-Gutiérrez y cols., 2012). Sin embargo, también se ha mostrado que existe disminución de la expresión de hCAT-1, por ejemplo en hipoxia (Casanello y cols., 2007; 2009; Prieto y cols., 2011), y en presencia del miR-22 (microRNA derivado del hígado) (Jopling y cols., 2006; Bhattacharyya y cols., 2006; Cicera y cols., 2010). 1.2.3 Regulación de la expresión de SLC7A1 La organización génica de los transportadores CAT, está conformada por dos subfamilias conformadas por los transportadores de aminoácidos catiónicos (CAT) y los transportadores de aminoácidos asociados a glicoproteínas (HAT). La familia de transportadores de aminoácidos catiónicos son codificados por los genes SLC7A (1-4) y corresponden a proteínas con 14 dominios transmembrana (Verrey y cols., 2004). Entre los genes que codifican para CAT-1 en rata, ratón y humano existen características comunes: la región promotora carece de caja TATA, poseen múltiples sitios 6 de unión a la proteína específica 1 (Sp1) y tienen una extensa región 3’ no traducible (3’UTR) que podrían cumplir funciones en la regulación de la estabilidad del mRNA o en la traducción (Aulak y cols., 1996; 1999; Fernández y cols., 2003; Hatzoglou y cols., 2004). SCL7A1 posee múltiples sitios de consenso para el factor transcripcional, Sp1 (ver Figura 1), el cual puede ser regulado por insulina o en procesos inflamatorios (Sobrevia & González 2009; González y cols., 2011). En HUVEC sólo se ha descrito que insulina aumenta la actividad transcripcional de SCL7A1 (González y cols., 2011a; GuzmánGutiérrez y cols., 2012), un mecanismo dependiente del factor transcripcional Sp1 (entre - 177 y-105 pb desde el ATG), sin estudios descritos en diabetes gestacional. El factor transcripcional Sp1 pertenece a la súper familia de Sp/Factor tipo Krupel (Sp/KLF), que se divide en las subfamilias Sp, con 8 miembros (Sp1 – Sp8) y la subfamilia KLF, con 15 miembros (Solomon y cols., 2008). Luego, la subfamilia Sp se subdivide en dos grupos nuevamente Sp1-Sp4 (604-785 aminoácidos) y Sp5-Sp8 (394-452 aminoácidos), siendo este último grupo una versión truncada de Sp1 (Solomon y cols., 2008; Wierstra, 2008). La proteína Sp1 posee dos dominios de activación transcripcional, adyacente a estos sitios posee sitios ricos en Serinas y treoninas (S/T) que permiten modular el efecto de Sp1 de manera postraduccional, y en el dominio del extremo COOH terminal posee sitios de interacción con represores o activadores transcripcionales (Solomon y cols., 2008; Wierstra 2008). En los dominios ricos en serinas y treoninas, posee varios sitios de consenso para diferentes quinasas, que incluyen quinasas de calmodulina (CamK), quinasas de caseína (CK), proteína quinasa A (PKA), PKC, y p42/44mapk (Samsons y cols., 2002; Sobrevia & González 2009). Se ha observado que insulina favorece la actividad de Sp1 en hepatoblastoma humano (células HepG2), donde 7 -1606 CTAAGCCATCTGCATGTGTTCATTAAAACTTTTTCTGGGGACTTTTTCTGGCTCATCCCTGTAGTCC -1539 CGATGCTAGGGGAGGTTGAGGCAAAATGATCGCTAGACAGCTGGTATTTGAGGCCAGCCTATGCAACATATCA -1466 AAAACCCGTGTCTATATGTAGAAAAAATATTAACTAGGCGTGATGACACAAGCCTGTAGTTCCATCTGCTTGG -1393 GAGGCTGAGGCAGGAGGATGGCTTGAGCCTGGGAATTTGAAGTTCCAGTGAGCTATGATTGTACCGCTGCATT -1320 CCAGCCTGGGTGACAGAGTGAGACCCCTGTCTCTAAAAAACAAACAAATGACAACAGCAACAACAACAGAACA Sp1 -1247 CTTTTTCTGAAGCTAGCACCATGCAGTTATGTACTTTATAAATTGCTAGTCTAATTCCAAGGGAATAGTTCAG -1174 CAGCTGATATTTGAGAAGGACCTGTAGAAAGGATTCAAAGACCACGGACACCGTCCACTGTTTTTCTGTTTTC -1101 CTATAAGATAGAAGAAGGATGGCATTATTAATTTATGCCCTGTTTACCTATCCCAAGTCCCAGATCACTGGAT -1028 CTTTAAAGATTATGATTCTCGCTTGGCTTTTGGTACAAAAGGAGACAAGGAGGGAGCTTAAAAGGTGAGCACG -955 GTGTGATTCAGGACTGAAGCTTCTGCCACTTCCTGGGGGGTAACTGCAAAAGTGAGCCGTTCTGACTAGCCGT -882 TTGTGCATTTGCCACTGCCAAGGGGGCACAGGTAGATTCAAGCTTTGGGGCTCTTCTGACAACTGGCAAGGAT -809 AAGGTATTAGCAAGGGCAAAGGAATAGTAATAAAATAATCCAATAACAAAGACATGAAGATTTATAATAATTT -736 TTAGGCCGGTGCAGTGTTTCAGGACTGTAATCCTAGGGCGCTTTGGGAGGCCCAGGCGGGAGGATCGCTTGAG -663 GCCAGGATTTCGAGGTTAAGGTGAACTGCGCTCCAGCCTGGGCAATAGAGTAACACCCTGTCTCTAAAATGAA -590 AAGAAAACAGTTTAAACCTTTTAAGTGCATACCAAATCTTTTATTTTGGAGAAGGAAAACTGGTCTCGAGTTC -517 CGTGTGAGCTCCCTGGGGCCCGCCGGGAGGGGGTTGGCACGGCCGGACCTGCAGCACTAGTTCTGGCCAGGGC -444 GCTGTGGGATCTGCAGGGGACCACAGGATGCTGTGGCGCGGTGCGCTCAGATTGGCGGAGAAACGGCCACACG -371 CCTACGGAGCTACTGAGAAGGCGAGCGGAGGCGCAGCCCGCCCGCCCGCCGCGGGAACCCCAGGTTGGGGCGC -298 TGGGCGCGCGAAGACTCAGCCGCCCCGCCCACCAAGGGCGCGTCGGTCCCCGGCCGCAGCCTCTGGGCTGGCA Sp1 (Figura 1 continúa en la página 8) 8 Figura 1. Esquema de la región promotora desde -1606 pb desde el sitio de inicio de la transcripción de SCL7A1. Secuencia de la región de -1606 pb desde el inicio propuesto de la transcripción (*) del promotor de SCL7A1 (para transportador de aminoácidos catiónicos tipo 1, hCAT-1) que ha sido clonado. Además, se incluyen dos exones no traducibles (exones -2 (gris oscuro) y -1 (gris claro)) antes del codón de inicio (ATG). En verde se destacan los sitios de unión del factor de transcripción Sp1. -225 GCCGCCGCCGCGCCGCGCTCCCATTGGTGCCCGGCGGTGACGCGGCCGAGCGGGCCGGGGCTGCCTGGTCCGG Sp1 -152 GGGCGGGCGTGGGGCGCGGGGCGCGGAGCGCGAGGGGCGGGGGCCGGGCGCACTGCTGATGAAACCTGGCGCC Sp1 Sp1 -79 GGAACCCGCCAGCCCTCGGCGCCCATTCAGTCCGCGCAGGCAGGTGTGAGCAGCGGGTCAACTACCTGGCAGG -6 CGCGCACGCGGCCGCGGGCTCCCGCTAACCGCAGCCTCCACTCCTCTCCCCGCGCGCCGCGCCCCCGCCCCGC * Exón -2 +67 CCCGCCCCGCCCGGTCTCGCCGGCCGAGCGTCCGTTGGTCCTTGAGCGCGTCCGACAGTCTGTCTGTTCGCGA Exón -2 +134 TCCTGCCGGAGCCCCGCCGCCGCCGGCTTGGATTCTGAAACCTTCCTTGTATCCCTCCTGAGACATCTTTGCT Exón -1 +208 GCAAGATCGAGGCTGTCCTCTGGTGAGAAGGTGGTGAGGCTTCCCGTCATATTCCAGCTCTGAACAGCAACATG Exón -1 9 aumenta la transcripción de genes como el inhibidor del activador del plasminógeno 1 (PAI-1) (Banfi y cols., 2001), y la lipoproteína Apo A1 (Murao y cols., 1998, Lam y cols., 2003); y en músculo esquelético L6 se ha demostrado que insulina induce la expresión de PKCδ, siendo un mecanismo dependiente de Sp1 (Horovitz -Fried y cols., 2007). 1.2.4 Efecto de la diabetes gestacional sobre el transporte de L-arginina en HUVEC Se ha reportado que los niveles de NO en líquido amniótico (von Mandach y cols., 2003) y la síntesis de NO en venas y arterias placentarias (Figueroa y cols., 2000) están aumentados en diabetes gestacional. Estudios tempranos realizados en cultivos primarios de HUVEC aislados desde embarazos con diabetes gestacional mostraron un aumento en la síntesis de NO y en la actividad del transporte de L-arginina (Sobrevia y cols., 1995, 1997). Estos resultados fueron asociados con un mayor número de copias del mRNA, nivel de proteína total y actividad de la eNOS (Vásquez y cols., 2004; Farías y cols., 2006, 2010; Westermeier y cols., 2011). Además, HUVEC obtenidas desde embarazos de diabetes gestacional muestran un alto número de copias para hCAT1 (Vásquez y cols., 2004). De manera interesante, HUVEC incubadas en presencia de alta D-glucosa muestran mayor síntesis de L-citrulina a partir de L-arginina (indicador de actividad de NOS), y niveles de cGMP intracelular (indicador de bioactividad de NO) (Sobrevia y cols., 1997; González y cols., 2004, 2011a). En este fenómeno se ha propuesto como mecanismos de señalización celular involucrados las rutas de PKC y p42/p44mapk (Montecinos y cols., 2000; Flores y cols., 2003). Así, en diabetes gestacional hay un aumento en los niveles de NO asociado con un aumento del transporte de L-arginina. En HUVEC provenientes de embarazos con diabetes gestacional, insulina reduce el aumento del transporte de L-arginina observado en este tipo celular comparado con 10 HUVEC obtenidos desde embarazos normales (Sobrevia y cols., 1998). Además, se observó que en presencia de insulina se redujo el incremento de la síntesis de NO (expresado como acumulación de cGMP) (Sobrevia y cols., 1998). Otras moléculas vasoactivas, tal como adenosina, pueden aumentar el transporte de L-arginina y la actividad de la eNOS (Vásquez y cols., 2004; San Martín & Sobrevia 2006; Farías y cols., 2006, 2010; Westermeier y cols., 2011; Guzmán-Gutiérrez y cols., 2012). Se ha observado in vitro que los niveles de adenosina en el medio de cultivos de HUVEC provenientes de embarazos con diabetes gestacional (2.5 µM) son mayores que las HUVEC provenientes de embarazos normales (50 nM) (Vásquez y cols., 2004; Westermeier y cols., 2011). Además, en HUVEC de embarazos normales incubadas con nitrobenziltioinosina (NBTI, inhibidor del transporte de nucleósidos) aumenta el transporte de L-arginina, indicando que el aumento de adenosina extracelular y potencialmente la activación de receptores de adenosina están involucrados en el aumento del transporte de L-arginina (San Martín & Sobrevia, 2006; Westermeier y cols., 2009; Sobrevia y cols., 2011). 1.3 Receptores de adenosina Adenosina es un nucleósido purínico implicado en diversas funciones biológicas, tales como biosíntesis de nucleótidos o el metabolismo energético celular (Eltzschig, 2009). Además, es un mediador de la vasodilatación de la circulación coronaria, cerebral y muscular, en varias condiciones incluyendo hipoxia y el ejercicio (Berne y cols., 1983). La adenosina extracelular es una molécula de señalización que puede activar receptores de adenosina. Los receptores de adenosina, pertenecientes a la familia P1 de los receptores purinérgicos, están acoplados a proteína G y se han descrito al menos 4 subtipos: A1, A2A, 11 A2B y A3 (Fredholm y cols., 2001, 2007, 2011; Burnstock y cols., 2006, 2010). La estimulación de los receptores de adenosina genera diferentes efectos biológicos los cuales dependen de su patrón de expresión y disponibilidad en la membrana de un tipo celular o tejido en particular (Liu y cols. 2002; Wyatt y cols. 2002; Feoktistov y cols., 2002). El extremo N-terminal es relativamente corto (7 a 13 residuos), comparado con su C-terminal (32 a 120 residuos) (Burnstock, 2006). Los dominios transmembranas de los receptores de adenosina humanos, poseen entre un 39–61% de identidad en su secuencia, y un 11-18% de identidad con los receptores de la familia P2 (receptores de ATP) (Burnstock, 2006). Cambios en el patrón de expresión de receptores de adenosina durante condiciones fisiopatológicas como la hipoxia, isquemia o en inflamación generan un alteración significativa en su señalización de los receptores de adenosina (Burnstock y cols., 2010, Fredholm y cols., 2011). Los receptores A1, A2A y A3 son activados a concentraciones nanomolares de adenosina, mientras que se necesita concentraciones micromolares para activar los receptores A2B, existiendo diferentes fármacos usados como agonistas y antagonistas para estos receptores (Tabla 1) (Fredholm y cols., 2001; 2011; Schulte & Fredholm, 2003; Eltzschig, 2009; Mundell & Kelly, 2010). Los receptores A1 y A3 son clásicamente denominados como receptores inhibidores acoplados a proteína Gi/Go (preferencialmente Gi para receptor A1); por otro lado, A2A y A2B son conocidos como receptores activadores acoplados a proteína Gs (Klinger y cols., 2002). Los mecanismos de señalización asociados a la activación de los receptores A1 y A3 incluyen inhibición de la adenilil ciclasa, activación de fosfolipasa C (PLC) y activación de la ruta PI3k/Akt, mientras que la activación de receptores A2A y A2B induce activación de la adenilil ciclasa (Eltzschig, 2009; Fredholm y cols., 2011). Todos los receptores de adenosina estimulan MAPK a través de una vía de señalización que difiere del tipo de receptor que ha sido 18 de insulina en este síndrome (Metzger y cols., 2007). Aun cuando el claro rol de insulina en diabetes gestacional es generalmente aceptado, la señalización celular y la respuesta a insulina en el tejido feto-placenta en este síndrome no es un fenómeno bien entendido (Hiden y cols., 2009; Westermeier y cols., 2009; Sobrevia & González, 2009; Sobrevia y cols., 2009; Guzmán-Gutiérrez y cols., 2013). Incluso cuando los receptores de insulina son expresados en la vasculatura placentaria humana (Hiden y cols., 2009; Westermeier y cols., 2011; Salomón y cols., 2012), existe limitada información sobre la acción de este receptor sobre los efectos vasculares de insulina sobre la circulación placentaria en diabetes gestacional (Desoye & Hauguel-de Mouson, 2007; Barret y cols., 2009; Genua y cols., 2009; Sobrevia y cols., 2011). Diabetes gestacional genera alteraciones a nivel del transporte transplacentario desde la madre al feto, un fenómeno que ocurre, entre otros factores, por la pérdida del balance hormonal que es inducido, por ejemplo, por alteraciones en la síntesis y señalización de insulina (Kuzuya & Matsuda, 1997; Metzger & Custan, 1998;; Greene & Solomon, 2005; Biri y cols. 2006; Sobrevia & González, 2009; Barret y cols., 2009). Insulina genera vasodilatación dependiente de NO derivado del endotelio en sujetos normales (Steinberg & Baron, 2002; Sundell & Knuuti, 2003; Barret y cols., 2009; Sonne y cols., 2010; Timmerman y cols., 2010). Además, estudios in vitro muestran que insulina activa la ruta L-arginina/NO en HUVEC (González y cols. 2004, 2011a; Muñoz y cols. 2006) como en otros endotelios (Sundell & Knuuti, 2003; Barret y cols., 2009). Observaciones iniciales sugirieron un efecto vasodilatador diferencial de insulina entre la macro y microvasculatura de la placenta humana desde fetos que fueron adecuados (AGA) o grandes (LGA) para la edad gestacional en diabetes gestacional (Jo y cols., 2009). Este estudio muestra que insulina induce una vasodilatación dependiente del endotelio derivado 19 del NO en arterias y venas umbilicales de embarazos normales o diabetes gestacional, insulina no alteró los vasos coriónicos de embarazos normales, pero generó relajación de los vasos coriónicos de embarazos con diabetes gestacional. Estas observaciones fueron acompañadas con incrementos de insulina plasmática en sangre de cordón umbilical (Westgate y cols., 2006; Lindsay y cols., 2007; Colomiere y cols., 2009). De manera interesante, no es conocido el potencial mecanismo asociado con esta respuesta específica a insulina por la unidad feto-placentaria durante la diabetes gestacional (Youngren y cols., 2007; Barret y cols., 2009; Sobrevia & González, 2009). 1.4.2 Regulación del transporte de L-arginina vía hCAT1 por insulina Se ha observado que en cultivos primarios de HUVEC en condiciones de euglicemia (i.e., conteniendo 5 mM de D-glucosa) y en presencia de concentraciones fisiológicas de insulina (0.1–1 nM) producen un aumento de la velocidad máxima del transporte de L-arginina (Vmax), pero sin cambios significativos de la Km aparente (González y cols., 2004; 2011; Guzmán-Gutiérrez y cols., 2012). Este fenómeno fue observado con una alta capacidad de transporte máximo (i.e., Vmax/Km) (Casanello y cols., 2007; Vásquez y cols., 2004; Escudero y cols., 2008), lo cual indica la participación de transportadores de membrana para aminoácidos catiónicos en este proceso (González y cols., 2004; Sobrevia & González, 2009). La magnitud reportada del efecto estimulatorio del transporte de L-arginina (cercano a 5 veces) fue comparable al efecto de la transestimulación con lisina en la medición de captación de L-arginina (González y cols., 2004). Estos resultados se complementan con el aumento del número de copias de mRNA para hCAT1 (González y cols., 2004; Guzmán-Gutiérrez y cols., 2012) y de la abundancia de proteína (González y cols., 2011A; Guzmán-Gutiérrez y cols., 2012). Estos estudios 20 sugieren que el transporte de L-arginina es estimulado por insulina, por un aumento en la expresión de transportadores de membrana para hCAT1 en HUVEC (Sobrevia & González, 2009). Además, se ha propuesto que el efecto de insulina sobre el transporte de L-arginina es un mecanismo de señalización celular, los cuales incluyen fosfatidilinositol 3 quinasa (PI3K), proteína quinasa C (PKC) y proteínas quinasas activadas por mitógeno p42 y p44 (p42/p44mapk) (González y cols., 2004), aumentando la unión del factor transcripcional Sp1 al promotor de SCL7A1, en la zona de consenso entre -177 a -105 pb desde el ATG (González y cols., 2011). Por otro lado, en HUVEC obtenidas desde embarazos con diabetes gestacional, muestran que en presencia de 5 mM de D-glucosa, insulina (1 nM) disminuye el transporte total de L-arginina, mientras que a 25 mM de Dglucosa, se observa una insensibilidad a insulina (0.1–10 nM) (Sobrevia y cols., 1996; 1998), lo cual abre la opción de estudiar un mecanismo de resistencia a insulina mediado por defectos a nivel del receptor de insulina o su señalización. Recientemente se ha reportado que HUVEC expresan dos subtipos de receptores de insulina, tipo A (IR-A) y B (IR-B) (Westermeier y cols., 2011), con una relación IR-A/IR-B cercano a 2, donde IR-A aumenta 1.6 veces en HUVEC provenientes de embarazos con diabetes gestacional, lo que sugiere la participación de estos subtipos de receptor de insulina durante la patología. 1.4.3 Receptores de insulina Insulina genera sus efectos biológicos por la activación del receptor de insulina en la membrana plasmática de células endoteliales de venas umbilicales humanas (Zheng & Quon, 1996; Nitert y cols., 2005) y de la microvasculatura placentaria (Desoye & Hauguelde Mouzon, 2007; Hiden y cols., 2009), un efecto que es diferencial en estos dos lechos vasculares (Hiden y cols., 2009; Sobrevia & González, 2009; Sobrevia y cols., 2011). El 21 gen que codifica para el receptor de insulina humano está localizado en el brazo corto del cromosoma 19 y consiste de 22 exones, y 21 intrones (Seino y cols., 1989). El receptor de insulina maduro es una glicoproteína compuesta por dos subunidades β (dominio transmembrana) unida por puentes disulfuros. El N-terminal de la subunidad α extracelular (exones 1-2) y el dominio rico en cisteínas (exones 3-5) son responsables por la alta afinidad por insulina en combinación con el dominio C-terminal (residuos de aminoácidos 704-719) (Kristensen y cols., 1998; Thorsoe y cols., 2010). La señalización de insulina involucra la participación de PI3K como proteína regulatoria del metabolismo de Dglucosa en tejidos como el musculo esquelético y los adipocitos promoviendo la translocación de la isoforma 4 del transportador de D-glucosa (GLUT4) a la membrana plasmática y estimulando la producción de NO y la vasodilatación dependiente del endotelio. (Bergandi y cols., 2003). El efecto mitogénico es principalmente mediado por MAPK, el cual regula el crecimiento, la diferenciación, y el control, por ejemplo, de la síntesis de moléculas vasoconstrictoras como endotelina 1 (ET-1) (Kim y cols., 2006; Muniyappa y cols., 2007). Con el clonamiento de las dos isoformas del receptor de insulina, i.e., receptor de insulina A (IR-A) y B (IR-B), se ha propuesto la posibilidad de una respuesta diferencial a insulina por una activación selectiva (o semiselectiva) de estas isoformas (Ullrich y cols., 1985; Ebina y cols., 1985; Frasca y cols., 1999; Sesti y cols., 2001; Belfiore y cols., 2009; Genua y cols., 2009; Sciacca y cols., 2003; 2010; Thorsoe y cols., 2010; Sen y cols., 2010). El cDNA de IR-A (exón 11-) no posee el exón 11, e IR-B (exón 11+) contiene el exón 11 (Genua y cols., 2009; Thorsoe y cols., 2010; Sen y cols., 2010). Ambas isoformas están expresadas en tejidos sensibles a insulina (hígado, músculo y tejido adiposo) (Moller y cols., 1989; Mosthaf y cols., 1990), pero IR-A es predominantemente expresado en el feto 22 y la placenta, donde juega un rol en el desarrollo embrionario (Frasca y cols., 1999). Estas isoformas están también expresadas en tejido adulto, especialmente en el cerebro (Belfiore y cols., 2009). Por otro lado, IR-B está expresado principalmente en tejido adulto diferenciado como el hígado, el cual aumenta los efectos metabólicos de insulina (Sciacca y cols., 2003, 2010; Genua y cols., 2009; Sen y cols., 2010). La desregulación del splicing del receptor de insulina en tejidos claves para insulina puede ocurrir en pacientes con insulinoresistencia, pero este rol en diabetes mellitus no es claro (Belfiore y cols., 2009). Se ha reportado que en HUVEC expresan ambas isoformas del receptor de insulina (Westermeier y cols., 2011), donde al comparar la relación IR-A/IR-B entre células normales y diabetes gestacional se observó que una diferencia de ~1.6 veces, debido a una alta expresión de IR-A en células provenientes de embarazos con diabetes gestacional. Por lo tanto, esto podría ser asociado con una disminución a la respuesta de insulina, como en otras patologías donde predomina la isoforma IR-A, como es la Diabetes Mellitus tipo 2 (Norgren y cols., 1994), y en estados de insulinoresistencia relacionados con aumento de la relación IR-A/IR-B en músculo esquelético de pacientes con distrofia miotónica tipo 1 (Savkur y cols., 2001) y 2 (Savkur y cols., 2001; Phillips y cols., 1998). Insulina, los factores de crecimiento tipo insulina 1 (IGF1) y 2 (IGF2) generan diversos efectos metabólicos y mitogénicos mediante su receptor, con actividad tirosina quinasa presente en la superficie de las células blanco. Estas hormonas poseen una alta homología estructural, ambos receptores pueden actuar como ligandos de estas moléculas. A concentraciones fisiológicas, insulina e IGF1 están unidas solo a los receptores de insulina e IGF, respectivamente. Mientras que, IGF2 se une al receptor de IGF1 (IGFR1) y a IR-A (Frasca y cols., 1999). La afinidad de IGF2 por IR-A es menor que a la de insulina para este receptor (EC50 0.9 versus 2.5 nM, respectivamente), mientras que la unión de 23 IGF1 a IR-A es muy alta (EC50 > 30nM). La afinidad de IGF2 a IGFR1 es comparable con la de IGF1 (EC50 0.6 versus 0.2 nM, respectivamente), donde insulina se une débilmente a este receptor (EC50 > 30nM) (Pandini y cols., 2002). Por lo tanto, es posible que exista una respuesta diferencial a insulina en la vasculatura fetoplacentaria dado por la activación preferencial de uno de los subtipos de receptores de insulina en embarazos con diabetes gestacional. La expresión de las isoformas del receptor de insulina es también diferencial, IR-A se expresa preferencialmente durante la vida prenatal (incluyendo la placenta), e IR-B se expresa preferencialmente en adultos, en tejidos diferenciados (Belfiore y cols., 2009). Un desbalance en la expresión y/o prevalencia de rutas de señalización asociadas con estas isoformas puede generar serias consecuencias afectando el desarrollo normal del feto durante el embarazo (Hiden y cols., 2009; Genua y cols., 2009). Se ha reportado que el estado de insulinoresistencia está asociado con disminución de la relación IR-A/IR-B en adipocitos y músculo esquelético de sujetos con diabetes mellitus tipo 2 (DMT2) (Mosthaf y cols., 1991; Kellerer y cols., 1993; Sesti y cols., 1994), pero una alta relación de IRA/IR-B fue descrito en músculo esquelético de pacientes con distrofia miotónica tipo 1 (Savkur y cols., 2001) y 2 (Phillips y cols., 1998; Savkur y cols., 2001), enfermedades que cursan con insulinoresistencia extrema. Aun cuando los pacientes con DMT2 tengan insulinoresistencia extrema e hiperinsulinemia, se han asociado con incremento en la expresión de la isoforma IR-A (Norgren y cols., 1994), no existe un acuerdo relativo sobre la expresión de isoformas del receptor de insulina con estas enfermedades (Belfiore y cols., 2009). Defectos en la expresión de moléculas de la señalización de insulina han sido propuestas en la placenta humana en embarazos con diabetes gestacional, sugiriendo un potencial estado de insulinoresistencia en la placenta asociado a este síndrome (Colomiere 24 y cols., 2009). Como los niveles de insulina fetal durante la diabetes gestacional están incrementados (Wesgate y cols., 2006; Lindsay y cols., 2007; Colomiere y cols., 2009), lo que es característico en este síndrome, no solo puede llevar a un mecanismo de crecimiento y maduración fetal, sino que también a una respuesta defectuosa dado por la señalización celular inducida por insulina en la unidad feto-placenta. Interesantemente, no se ha logrado demostrar una potencial relación entre disfunción endotelial y un desbalance en la relación IR-A/IR-B en pacientes, asociado a disfunción endotelial. 1.4.4 Regulación del efecto de insulina por adenosina Estudios muestran que la sensibilidad a insulina en ratas suplementadas con adenosina en la dieta está aumentada (Ardiansyah y cols., 2010). Estos datos se complementan con observaciones similares descritas en adipocitos de ratas diabéticas (Joost & Steinfelder, 1982), músculo esquelético de rata no diabética (Vergauwen y cols., 1995), y pacientes con diabetes mellitus tipo 1 que recibieron una infusión de adenosina (Srinivasan y cols., 2005) (Tabla 2). En los estudios disponibles en la literatura, la concentración de adenosina, agonistas, y antagonistas de receptores de adenosina, e insulina utilizada fue superior a 100 nM, lo cual sugiere para los receptores de adenosina, que la activación e inhibición de los receptores de adenosina era completa, y para insulina, la participación tanto de IR-A e IR-B, y de los receptores de IGF en el sistema. Sin embargo, en los trabajos de Webster y colaboradores, Ciaraldi y colaboradores, Sundell y colaboradores, y Srinivasan y colaboradores, la concentración de insulina utilizada, es relativamente selectiva para los receptores de insulina, sugiriendo la posibilidad que la activación de receptores de adenosina, aumentan el efecto de insulina. De la misma manera, los trabajos de Pawelczyk y colaboradores., y Dhalla y colaboradores, muestran Tabla 2. Regulación del efecto de insulina por agonistas/antagonistas de receptores de adenosina. Células o tejidos Condición experimental Efecto de insulina Fenómeno biológico Referencias Tejido adiposo de rata Insulina + adenosina Aumentado Transporte de 2DG Joost & Steinfelder, 1982 Músculo soleo de rata Insulina + PIA Aumentado Contenido de glucógeno Espinal y cols., 1983 Tejido adiposo de rata Insulina + PIA Aumentado Transporte de 2DG Green A. 1987 Músculo soleo de rata Insulina + GR79236 Aumentado Contenido de piruvato Webster y cols., 1996 Adipocitos humanos* Insulina + PIA Aumentado Transporte de 2DG Ciaraldi y cols., 1997 Músculo soleo de rata Insulina + DPCPX Aumentado Transporte de 2DG Han y cols., 1998 Músculo esquelético de rata Insulina + DPCPX Aumentado Transporte de 2DG Derave & Hespel. 1999 Venas coronarias Insulina + adenosina Aumentado Flujo sanguíneo Laine y cols., 2000; 2004 Venas coronarias Insulina + adenosina Aumentado Flujo sanguíneo Sundell y cols., 2002 Venas coronarias† Insulina + adenosina Aumentado Flujo sanguíneo Srinivasan y cols., 2005 Músculo esquelético de rata Insulina + cafeína Disminuido Transporte de 2DG Vergauwen y cols., 1994 Linfocitos T humano Insulina + ZM-241385 Disminuido Proliferación celular Pawelczyk y cols., 2005 Adipocitos de rata Insulina + CVT-3619 Disminuido Secreción ácidos grasos Dhalla y cols., 2008 Músculo esquelético de rata Insulina + cafeína Disminuido Transporte de 2DG Kolnes y cols., 2010 HUVEC Insulina+ZM-241385 Disminuido Transporte de L-arginina Guzmán-Gutiérrez y cols., 2012 Tabla 2 continúa en la página 26 25 26 PIA: N6-(fenilisopropil) adenosina, GR79236: N-[(1S,trans)-2-hidroxiciclopentil] adenosina, DPCPX: 8-ciclopentil-1,3dipropilxantina, ZM-241385: 4-(2-[7-Amino-2-(2-furil)[1,2,4]triazolo[2,3-a][1,3,5]triazin-5-ilamino]etil)fenol, CVT-3619: N6-[2-{6- [((1R,2R)-2-hidroxiciclopentil)-amino]purín-9-yl}(4S,5S,2R,3R)-5-[(2-fluorofeniltio)metil]-oxolano-3,4-diol-adenosina, 2DG: 2deoxi-D-glucosa, * muestras obtenidas de pacientes con síndrome de ovario poliquístico, †muestras de pacientes con diabetes mellitus tipo 1. 26 que la inhibición de receptores de adenosina, bloquean el efecto de insulina, mediado sólo por los subtipos de receptores de insulina. Además, la expresión y activación de receptores de adenosina reduce los niveles plasmáticos de D-glucosa, por medio de un incremento en la liberación y del efecto biológico de insulina en ratas diabéticas (Johansson y cols., 2006; Németh y cols., 2007; Töpfer y cols., 2008). La activación del receptor de adenosina A1 (Vergauwen y cols., 1994) o la disminución de la expresión del receptor de adenosina A2B (Ardiansyah y cols., 2010, Figler y cols., 2011), resultan en un aumento de la sensibilidad a insulina, pero no existe información sobre los mecanismos específicos que expliquen la acción biológica de adenosina (Burnstock y cols., 2006; San Martín & Sobrevia, 2006; Mundell & Kelly, 2010). La activación del receptor de adenosina A2B, pero en menor grado que los receptores de adenosina A1 y A2A, previenen el desarrollo de diabetes en ratón (Németh y Cols., 2007). Pero, en un estudio reciente muestra que la sensibilidad a insulina disminuye en ratones C57BL/6J al activar farmacológicamente el receptor A2B, a excepción del ratón knock-out para este receptor, sugiriendo que el receptor de adenosina A2B participa en el proceso de insulinoresistencia (Figler y cols., 2011). Esto abre la posibilidad de que el aumento y/o la inhibición de la expresión, o de la actividad de los receptores de adenosina puedan asociarse como un mecanismo de protección contra este síndrome. Basado en estos antecedentes existiría una posible comunicación cruzada entre los receptores de adenosina y los receptores de insulina, un fenómeno que podría generar un potencial mecanismo regulatorio de las acciones biológicas de insulina en la vasculatura fetoplacentaria en diabetes gestacional. 27 34 4.1.2 Cultivo de células endoteliales de vena umbilical humana Las células endoteliales fueron obtenidas de vena de cordón umbilical humano (HUVEC) de embarazos normales. Para aislar y cultivar las HUVEC se utilizó el método descrito inicialmente por Jaffe y cols. (1973) adaptado en el laboratorio (González y cols., 2011). Este procedimiento consiste en canular la vena umbilical, repletar el lumen venoso con solución de colagenasa tipo II (Clostridium histolyticum, 0.2 mg/ml) preparado en medio 199 (M199). Las venas umbilicales fueron incubadas por 15 minutos a 37°C. Luego de completado el período de digestión con colagenasa, la suspensión celular fue centrifugada a 1200 rpm por 10 minutos y el pellet resultante fue resuspendido en M199 suplementado con 3.2 mM L-glutamina, 100 U/ml penicilina/streptomicina, 10% de suero bovino fetal y 10% de suero de recién nacido (medio de cultivo primario, PCM). La suspensión celular fue transferida a placas de cultivo celular cuya superficie (60 mm2) fue cubierta con gelatina al 1%. Las células fueon mantenidas en un ambiente humidificado a 37°C con una atmósfera de 5% CO2 equilibrado con aire. El PCM fue reemplazado completamente cada 48 horas hasta lograr 100% de confluencia (i.e., monocapa endotelial). 4.1.3 Condiciones experimentales Una vez que las células en pasaje 1 alcanzaron 100% de confluencia (monocapa) fueron traspasadas a placas de experimentación (pasaje 2). Al alcanzar ~90% de confluencia fueron deprivadas de suero pre-incubándolas por 12 horas en M199. Luego, las células fueron expuestas a insulina (1 nM, 8 horas), NECA (N-etilcarboxamidoadenosina; agonista inespecífico de receptores de adenosina, 1000 nM), CPA (N-ciclopentiladenosina; agonista específico para receptores de adenosina tipo A1, 30 nM), CGS-21680 (3-[4-[2-[[6- 35 amino-9-[(2R,3R,4S,5S)-5-(etilcarbamoil)-3,4-dihidroxi-oxolan-2-il]purin-2-il]amino]etil] fenil]ácido propanoico; agonista específico para receptores de adenosina tipo A2A, 30 nM), 2Cl-IB-MECA (1-[2-Cloro-6-[[(3-iodofenil)metil]amino]-9H-purin-9-il]-1-deoxi-N-metilβ-D-ribofuranuronamido; agonista específico para receptores de adenosina tipo A3, 30 nM), DPCPX (8-Ciclopentil-1,3-dipropilxantina; antagonista selectivo para receptores de adenosina tipo A1, 30 nM), ZM-241385 (4-(2-[7-Amino-2-(2-furil)[1,2,4]triazolo[2,3a][1,3,5]triazin-5-ilamino]etil)fenol; antagonista específico para receptores de adenosina tipo A2A, 10 nM), MRS-1754 ([N-(4-cianofenil)-2-[4-(2,3,6,7-tetrahidro-2,6-dioxo-1,3dipropil-1H-purin-8-il)-fenoxi]acetamida; antagonista selectivo para receptores de adenosina tipo A2B, 30 nM) y/o MRS-1523 (3-propil-6-etil-5-[(etil-tio)carbonil]-2-fenil-4propil-3-piridina carboxilato; antagonista para receptores de adenosina tipo A3, 30 nM). Para evaluar la activación diferencial de IR-A e IR-B, cultivos primarios de HUVEC fueron infectados con un vector adenoviral que contenía siRNA dirigido a cada receptor para generar células knockdown para IR-A o IR-B (ver sección Transducción adenoviral de HUVEC). A las 40 horas post-infección las células serán expuestas a insulina a las diferentes condiciones antes mencionadas. 4.1.4 Cuantificación de proteínas La metodología utilizada fue el método de Bradford (Bradford, 1976) fundamentado en el cambio de coloración del azul brillante de Coomassie ante diferentes concentraciones de proteína. La solución comercial de Bradford (Bio-Rad Protein Assay) será diluida 1/5 (v/v) y sus alícuotas de 100 μl fueron transferidas a placas de 96 pocillos. En función del tipo y estado de confluencia celular, fueron añadidos 5, 10 ó 20 μl de muestra de lisado proteico homogenizados por agitación. Adicionalmente, se preparó una 36 curva estándar con BSA conteniendo 0, 20, 30, 50, 80 y 100 ng/ml. A partir de esta curva estándar los valores fueron interpolados con las absorbancias medidas a 595 nm de longitud de onda para cada muestra en un espectrofotómetro (Multiskan EX, Thermo LabSystems). 4.2 Transporte de L-arginina Monocapas confluentes de células endoteliales en pasaje 2 fueron cultivadas en placas de 96 pocillos siendo usadas para realizar estos experimentos como se ha descrito (González y cols., 2011). El medio de cultivo fue removido y las células serán lavadas (x2) con 200 µl por pocillo de solución Krebs (131 mM NaCl, 5.6 mM KCl, 25 mM NaHCO3, 1 mM NaH2PO4, 5 mM D-glucosa, 20 mM HEPES, 2.5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7.4). Las células fueron expuestas a L-arginina 300 μM para ensayos de captación y de 15 a 1000 µM para ensayos de transporte en mezcla con L-[3H]arginina (3 µCi/ml) por 1 minuto (velocidad inicial) a 37°C en solución Krebs. Los ensayos fueron realizados en presencia de D-[14C]manitol (0.05-0.4 µCi/ml) como marcador extracelular. La captación de L-arginina fue detenida removiendo el medio de captación y lavando (x2) con solución Krebs a 4°C (Sobrevia y cols., 1995). Una vez finalizado los experimentos de transporte, las células fueron digeridas con 1 N de ácido fórmico para realizar la determinación de proteínas. El digerido de células fue traspasado a tubos de plástico y mezclados con líquido de centelleo (2 ml) y etanol (96%, 3 ml). Los parámetros cinéticos del transporte de L-arginina (constante aparente de Michaelis-Menten y velocidad máxima, Km y Vmax, respectivamente) fueron determinados usando concentraciones crecientes de L-arginina no marcada con tritio. Los cálculos para el transporte mediado de L-arginina fueron realizados de acuerdo a la siguiente fórmula: 37 Componente saturable = (captación total) – (componente no saturable) (Ecuación 1) En la cual, la captación total (CT) fue definida por:   max [ ] [] [] V Arg CT m Arg Km Arg      (Ecuación 2) donde [Arg] fue la concentración de L-arginina en el medio y (m•[Arg]) fue el componente no saturable (lineal) del transporte en el rango de concentraciones a usar en este estudio. A partir de la representación gráfica de los datos de transporte total se calculó el valor de la pendiente de la fase lineal correspondiente al componente no saturable de transporte (m). Al restar el componente no saturable del transporte total, se obtuvieron los datos de transporte saturable los cuales fueron representados por la ecuación de MichaelisMenten sin el componente saturable:         max m V Arg VK Arg   (Ecuación 3) donde v corresponde a la velocidad inicial del transporte a diferentes concentraciones de Larginina. El parámetro cinético Vmax será expresado como pmol/µg proteína/minuto y la Km aparente como µM. La capacidad de transporte de L-arginina fue estimada por la razón Vmax/Km (Devés y Boyd, 1998; Mann y cols., 2003). La contribución relativa al transporte saturable de L-arginina de cada condición experimental comparada con la condición control, en células normales y con diabetes 38 gestacional, fue estimada a partir de los valores de Vmax/Km de L-arginina (Escudero y Sobrevia, 2008) mediante la siguiente expresión: /max max CX CX m CX m VK FKV   (Ecuación 4) donde CVmax y CKm fueron los parámetros cinéticos para el transporte de L-arginina en células normales o con diabetes gestacional en ausencia de insulina y/o agonistas/antagonistas de receptores de adenosina, i.e., control (C), XVmax y XKm fueron los parámetros cinéticos para el transporte de L-arginina en presencia de insulina y/o agonistas/antagonistas de receptores de adenosina (X). La contribución relativa de CPA, CGS-21680, NECA, 2Cl-IB-MECA, DPCPX, ZM-241385, MRS1754 y/o MRS1523 al efecto de insulina sobre al transporte saturable de L-arginina, fue estimada mediante: /max max CX Ins X m CX m VK FKV   (Ecuación 5) donde InsVmax e InsKm fueron los parámetros cinéticos para el transporte de L-arginina en presencia de insulina, XVmax y XKm fueron los parámetros cinéticos para el transporte de Larginina en presencia de insulina y NECA, CPA, CGS-21680, 2Cl-IB-MECA, DPCPX, ZM-241385, MRS1754 y/o MRS1523. 39 4.3 Expresión de hCAT-1 y receptores de insulina 4.3.1 Western blots Células confluentes en pasaje 2 cultivadas en M199 sin sueros fueron lavadas (2x) con PBS (200 µl por pocillo, 37°C) y preincubadas en solución Krebs en ausencia o en presencia de insulina y/o NECA, CPA, CGS-21680, 2Cl-IB-MECA, DPCPX, ZM-241385, MRS1754 o MRS1523. La reacción fue detenida lavando las células con PBS frío conteniendo ortovanadato de sodio (200 mM). Las células fueron lisadas en buffer de lisis [63.5 mM Tris/HCl (pH 6.8), 10% glicerol, 2% SDS, 1 mM ortovanadato de sodio, 1 mM 4-(2-aminoetil) benzenosulfonil fluoruro (AEBSF), 50 mg/ml leuptina, 5% 2mercaptoetanol]. Los lisados proteicos (70 µg) fueron separados por electroforesis en gel de poliacrilamida al 8% (SDS-PAGE) y transferidos a membranas de nitrocelulosa. Las proteínas transferidas fueron bloqueadas por 12 horas en albúmina de suero de bovino al 5% en solución salina Tris Tween (TBST) (50 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, 0.02% v/v Tween 20, 4°C, pH 7.4) y probadas con anticuerpo primario anti-hCAT-1 (dilución 1/500), anti-Sp1 (dilución 1/500), y anti-β-actina (dilución 1/5000) (González y cols., 2011, Westermeier y cols., 2011). Las membranas fueron lavadas (x6) en TBST e incubadas por 1 hora en 0.2% TBST/BSA conteniendo anticuerpo anti-IgG de conejo conjugado con HRP (dilución 1/3000 en 0.2% TBST/BSA). Las bandas de proteínas fueron detectadas por quimioluminiscencia aumentada. 4.3.2 Extracción de RNA total y transcripción reversa El RNA total fue aislado utilizando isotiocianato de guanidina/fenol (Chomczynski/Fenol). El RNA fue cuantificado por espectrofotometría (A260 nm) y su integridad fue evaluada por la relación A260/A280 y la visualización en gel de agarosa (2%). 40 Para la reacción de transcripción reversa se utilizarón alícuotas de 1 μg de RNA total, usando oligo(dT)18, partidores aleatorios (random primers) y la enzima MMLV-RT (Molones Murine Leukaemia Virus-Reverse Transcriptase, Promega) (González y cols., 2011; Westermeier y cols., 2011). 4.3.3 PCR no cuantitativo Los cDNA fueron amplificados utilizando los partidores (0.5 µM) descritos en la Tabla 4 en mezcla (20 µl) con dNTPs (0.2 mM de cada uno), Taq DNA polimerasa (2.5 UI/l), MgCl2 (2 mM) y 5 ó 10% del producto de transcripción reversa como templado (volumen final de 20 µl) (González y cols., 2004; 2011). En todos los ensayos se realizó un ciclo de incubación a 95°C por 5-7 minutos, 30-40 ciclos que incluyen un paso de denaturación por 30 segundos a 95°C, alineamiento por 56°C (IR-A e IR-B), 57°C (hCAT1) o 54°C (18S), y una extensión a 72°C por 5-7 minutos. Las reacciones de PCR fueron realizadas en un termociclador modelo I-Cycler de BioRad. Los productos obtenidos luego de la reacción de PCR fueron visualizados mediante electroforesis en geles de agarosa (1-2%) en solución tampón Tris-borato-EDTA, conteniendo 0.5 µg/ml de bromuro de etidio. Los productos de amplificación fueron observados por medio de la exposición del gel a luz UV en un transiluminador y la imagen fue capturada mediante una cámara NIKON (USA). Las imágenes fueron digitalizadas y analizadas mediante el programa Scion Image Beta 4.02 (Scion Corporation, USA). Los resultados fueron expuestos como la razón entre cada una de las muestras y su correspondiente control interno (18S). 41 Tabla 4. Secuencias de oligonucleótidos para PCR no cuantitativo y cuantitativo Partidor Secuencia hCAT-1 sentido 5’-GAGTTAGATCCAGCAGACCA-3’ hCAT-1 antisentido 5’-TGTTCACAATTAGCCCAGAG-3’ 18S sentido 5’-TCAAGAACGAAAGTCGGAGG-3’ 18S antisentido 5’-GGACATCTAAGGGCATCACA-3’ 28S sentido 5’-TTGAAAATCCGGGGGAGAG-3’ 28S antisentido 5’-ACATTGTTCCAACATGCCAG-3’ hCAT-1, Transportador de aminoácidos catiónicos tipo 1; 18S, subunidad ribosomal 18S; 28S, subunidad ribosomal 28S. 42 4.3.4 PCR cuantitativo (real time) Los ensayos de PCR cuantitativo serán realizados por PCR de tiempo real utilizando un sistema termociclador rápido LightCyclerTM (Roche Diagnostics, Lewes, U.K.) (González y cols., 2004; 2011; Westermeier y cols., 2011). La reacción será realizada en un volumen de 10 μl utilizando los partidores (0.5 µM) descritos en la Tabla 4 en mezcla con dNTPs (0.2 mM de cada uno), Taq DNA polimerasa (2.5 UI/l) y solución tampón de reacción entregada en la mezcla QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (QIAGEN, Crawley, U.K.). Todos los ensayos incluirán un paso de denaturación a 95°C por 15 segundos, seguido por 20 segundos de alineamiento a 56°C (IR-A e IR-B), 54°C (hCAT-1), ó 52°C (28S) y una extensión final a 72°C por tiempos variables dependiendo del tamaño del producto (10-30 segundos). La detección del producto fluorescente fue realizada al final de cada ciclo luego de un paso adicional de 3 segundos a 3°C bajo la temperatura de ‘melting’ del producto (Tm). La especificidad de los productos fueron confirmadas por electroforesis en gel de agarosa (1.5 % v/v) y por el análisis de las curvas de melting (González y cols., 2004; 2011; Westermeier y cols., 2011). Para preparar los estándares para el PCR tiempo real, los productos de hCAT-1, IRA, IR-B y 28S fueron separados por electroforesis en geles de agarosa (1.8% v/v) y visualizados por tinción con bromuro de etidio (0.5 µg/ml). Los productos fueron secuenciados utilizando el kit BigDye Terminador v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems) y el secuenciador automático de DNA ABI Prism 3730 (Applied Biosystems/Hitachi). Cada producto fue removido desde el gel, purificado por centrifugación en columnas usando el kit de extracción desde gel Qiaquick (Qiagen, Crawley, U.K.) y cuantificado por densitometría utilizando como referencia el marcador de 43 peso molecular HpaII digerido de pBluescript II 1 (SK+). Los estándares fueron preparados por diluciones seriadas de cada producto de PCR en tRNA para obtener concentraciones desde 101 a 109 copias por cada 2 μl. La expresión génica fue cuantificada usando una muestra de 2 μl de cDNA de HUVEC diluido 10 veces. Todos los ensayos incluyeron blancos de tRNA o de RNA de HUVEC además de las muestras de cDNA de HUVEC y los estándares. 4.4 Promotor SLC7A1 y knockdown de receptores de insulina 4.4.1 Clonamiento de una región del promotor de SLC7A1 El constructo de la región promotora de SLC7A1 se encuentra disponible en el laboratorio (González y cols., 2011). Brevemente, a partir del DNA genómico proveniente de células HUVEC la región promotora (i.e., región río arriba del inicio de la transcripción) de SLC7A1, fue clonado en el vector reportero pGL3 (Promega) dejando acoplado el gen reportero luciferasa a un segmento de DNA correspondiente a un fragmento del promotor del gen de interés para estudiar su actividad transcripcional (González y cols., 2011a). Luego, dos regiones del promotor fueron amplificadas los cuales abarcan +142 pb del exón 1 hasta -650 pb y -1606 pb río arriba del inicio de la transcripción, respectivamente. Posteriormente fueron clonados en el sistema plasmidial pCR®-Blunt II-TOPO®. Cada reacción de ligación fue introducida en bacterias competentes mediante el proceso de transformación. Posteriormente, aquellos clones conteniendo el vector plasmidial fueron seleccionados y purificados. Los fragmentos de DNA del promotor fueron liberados desde el vector de clonamiento utilizando las enzimas de restricción MluI y NcoI. La digestión de los plásmidos entregó los productos esperados de 1748 y 792 pb, además del vector vacío. Este mismo protocolo fue realizado para 50 4.4.8 Transducción adenoviral de HUVEC HUVEC fueron cultivadas hasta alcanzar ~70% de confluencia e infectadas con diluciones seriadas de los constructos adenovirales en medio M199. Para evaluar la eficiencia de la infección, se utilizó la reacción de β-galactosidasa (LacZ), marcador enzimático cuyo gen se encuentra en la secuencia del esqueleto adenoviral. Las células (sembradas en placas de 24 posillos) fueron incubadas (12 horas) en presencia del virus Ad-siIR-A, AdsiIR-B, y Ad-Control (-). La inhibición de la expresión de IR-A e IR-B fue evaluada por PCR y western blots dentro de las 48 horas siguientes a la transducción (Salomón y cols., 2012; Westermeier y cols., 2013). 4.5 Estimación del tamaño muestral Para el cálculo del tamaño muestral se utilizó la fórmula de comparación de las medias (Fernández, 1996) para determinar el número de muestras a ser incluidas por grupo. Se utilizaron los niveles de insulina previamente publicados en muestras de sangre de cordón umbilical de embarazos con diabetes gestacional (Lindsay y cols., 2007). Así: (Ecuación 6) Dónde: n = sujetos de estudio Zα = valor de Z correspondiente al riesgo deseado para test unilateral (1.645) Zβ = valor de Z correspondiente al poder estadístico del 90% (1.2820) S2 = varianza del grupo control (0.0016) d2 = valor mínimo de la diferencia que se desea detectar (0.00238) 2 22 )(2 d SZZ n   51 Así, 22 2 2(1.645 1.2820) 0.0016 0.00238 n  7.74n De esta manera, se debio incluir al menos 8 muestras por grupo de embarazos normales y de diabetes gestacional por análisis para determinar diferencias en relación a los niveles de insulina. 4.6 Análisis de datos La variación estadística de los promedios fue estimada usando la distribución normal y representada por el error estándar (S.E.M.). Al comparar dos valores se establecieron los límites de confianza, comparando los percentiles mediante el uso de la distribución t de Student (dos colas) y el test de Mann-Whitney. La comparación de más de dos grupos experimentales fueron realizados con el análisis de varianza (ANOVA) de dos vías y seguido de comparaciones post hoc con el test de Bonferroni. Los datos fueron analizados usando los programas Enzfitter v2.0 (Elsevier, Biosoft) y graficados mediante el programa Graphpad Prism v5.0d. Debido a que este último programa no permite el ingreso de datos que usen una coma como separador de decimales y con el fin de dar mayor claridad en el texto, los valores numéricos se presentaron con un punto como separador de fracciones decimales. Las diferencias con un valor de P<0.05 fueron consideradas estadísticamente significativas. 52 5. RESULTADOS 5.1 Caracteristicas clinicas de las embarazadas y los recien nacidos En este estudio se utilizó un total de 63 muestras de cordones umbilicales humanos, de los cuales 35 provenian de embarazos normales (Normal) y 28 de embarazos diagnosticados con diabetes gestacional (todas las características clínicas de las embarazadas y de los recién nacidos se resumen en la Tabla 5). Las embarazadas correspondientes al grupo con DG mostraron un mayor nivel de glicemia a las 2 horas de ingesta de 75 gramos de glucosa (test de tolerancia a la glucosa), asi como un nivel elevado de hemoglobina glicosilada. Además, se encontró un aumento en la concentración de insulina en pacientes diagnosticados con diabetes gestacional respecto a pacientes que cursaron su embarazo sin patologías asociadas (Normal). En concordancia con esto, se encontró que las embarazadas con diabetes gestacional presentan un mayor HOMA-IR y función de la c élula β, y menor HOMA-IS con repecto a las embarazadas sin patología. Los recién nacidos provenientes de embarazos con diabetes gestacional mostraron un mayor índice ponderal por un mayor peso al nacer comparados con los recién nacidos provenientes de embarazos normales. Es importante destacar que los niños provenientes de embarazos con diabetes gestacional mostraron mayores niveles de insulina en sangre obtenida desde el cordón umbilical. En relación con esto, los recién nacido mostraron un mayor HOMA-IR y un menor HOMA-IS. No se observó diferencias significativas en los parámetros determinados en ambos grupos de estudio tanto en la madre (edad, estatura, peso, IMC, presión arterial sistólica, glicemia basal) como es el recién nacido (sexo, edad gestacional, estatura y glucosa en vena umbilical). 53 Tabla 5. Características clínicas de las madres y recién nacidos Variables Normal (n=35) DG (n = 28) Variables maternas Edad (años) 28 ± 0.64 (18-38) 31 ± 0.59 (18-38) Estatura (cm) 159 ± 1.5 (147-177) 159 ± 0.9 (147-185) Peso (Kg) 68 ± 2.0 (54-92) 64 ± 1.4 (45-86) IMC (Kg/cm2) 26 ± 0.23 (22-29) 25 ± 0.37 (19-29) Presión sistólica (mmHg) 107 ± 7.0 (103-107) 112 ± 6.0 (105-113) Hemoglobina glicosilada (% del total) 4.0 ± 0.34 (3.2-5.1) 5.7* ± 0.1 (5.3-6.2) Glicemia basal (mg/dl) 82 ± 0.92 (67-95) 83 ± 1.1 (67-114) TTGO (mg/dl) Glicemia basal 88 ± 0.1 (69-97) 95 ± 1.9 (87-112) Glicemia post carga de glucosa (2 horas) 98 ± 1.2 (65-114) 164* ± 2.5 (140-239) Insulina plasmática (µU/ml) 5.2 ± 0.13 (4.9-5.6) 7.8* ± 0.7 (5.9-11.6) HOMA-IR 1.1 ± 0.04 (0.8-1.3) 1.8* ± 0.1 (1.0-3.2) HOMA-IS (%) 88 ± 3.0 (77.1-125.2) 54.6* ± 2.5 (31.2-78.6) Función de la célula β (%) 80 ± 2.8 (73.4-85.3) 91.7* ± 3.1 (70.0-99) Variables del recién nacido Sexo (femenino/masculino) 20/15 13 /15 Edad gestacional (semanas) 38 ± 0.34 (37-40) 38 ± 0.21 (37-40) Peso al nacer (gramos) 3192 ± 44 (2580-3970) 4353* ± 51 (3800-5100) Estatura (cm) 49 ± 3.6 (36-54) 49 ± 4.1 (43-55) Índice ponderal (gramos/cm3) 2.5 ± 0.03 (2.0-3.3) 3.7* ± 0.06 (3.1-5.7) Glucosa en vena umbilical (mmol/L) 3.6 ± 0.4 (2.9-4.3) 4.5 ± 0.6 (4.2-4.9) Insulina en vena umbilical (µU/mL) 6.1 ± 0.7 (5.5-7.9) 11.6* ± 0.6 (8.9-13.1) HOMA-IR 0.98 ± 0.11 (0.7-1.5) 2.32* ± 0.39 (1.6-2.8) HOMA-IS (%) 102 ± 22 (85-110) 43* ± 7.75 (30-60) La glicemia materna fue evaluada en condiciones basales (ayuno de 12 horas) y 2 horas después de una carga oral de 75 gramos de glucosa en embarazadas normales (Normal) o con diagnóstico de diabetes gestacional (DG), como se describe en los métodos. Lo valores son promedio ± SEM (rango), excepto para hemoglobina glicosilada donde corresponden al promedio ± DS (rango). Las pacientes diagnosticadas con DG fueron tratadas con dieta consistente en la administración de 30 a 35 calorías/kilo (peso corporal ideal) con un mínimo de 1800 calorías y entre 180-200 gramos de hidratos de carbono al día. IMC, índice de masa corporal; HOMA-IR, homeostasis model assessment for insulin resistance; HOMA-IS, homeostasis model assessment for insulin sensitivity (ver métodos). *P<0.05 versus embarazos normales. 54 5.2 Efecto de la diabetes gestacional sobre el transporte de L-arginina En HUVEC provenientes de embarazos con diabetes gestacional la captación de Larginina (300 µM) fue mayor comparada con HUVEC normales (Figura 3). Al evaluar el transporte total de L-arginina en todo rango de concentraciones para este aminoácido usado en este estudio fue mayor en HUVEC con diabetes gestacional respecto a HUVEC normales (Figura 4A). El transporte total de L-arginina exhibió un componente lineal con una pendiente (KD) de 20 ± 2 (10-5) y 28 ± 3 (10-5) (pmol/µg proteínas/minuto)/µM) en células normales y con diabetes gestacional, respectivamente. La representación de los datos de transporte es una gráfica de Eadie-Hofstee muestra que los valores se ajustan a una curva de decaimiento exponencial (participación de al menos dos sistemas de transporte) (Figura 4C). El transporte de L-arginina en todo rango de concentraciones para este estudio fue mayor en diabetes gestacional respecto a HUVEC normales ajustado a una curva de Michaelis-Menten sin el componente lineal mostrando una cinética saturable y significativamente mayor en diabetes gestacional con respecto a HUVEC normales (Figura 4B), lo que se reflejó en una disminución de la Vmax sin cambios significativos en el valor de la Km aparente en ambos grupos experimentales (Tabla 6). La representación de los datos de transporte en una gráfica de Eadie-Hofstee muestra que los valores se ajustan a una regresión lineal (participación de un sistema de transporte) (Figura 4D). Al analizar las capacidades de transporte (Vmax/Km) se observó que el transporte en diabetes gestacional fue mayor comparado con células normales. Al estimar la contribución relativa entre ambos grupos se observó que en diabetes gestacional el transporte de L-arginina aumentó en ~3 veces con respecto a HUVEC normales (Tabla 6). 55 0 1 2 3 4 Normal Diabetes gestacional * Captación total de L-arginina (pmol/g proteína/minuto) Figura 3. Diabetes gestacional aumenta la captación de L-arginina en HUVEC. Células provenientes de embarazos normales (Normal) y con diabetes gestacional (Diabetes gestacional) fueron incubadas con 300 µM de L-arginina (3 µCi/mL L- [3H]arginina, 37°C, 1 minuto). La radioactividad asociada a las células fue determinada como se describe en los métodos. Los valores corresponden al promedio ± S.E.M., n=12. *P<0.05 con respecto a Normal. 56 0200 400 600 800 1000 0 2 4 6 8 L-Arginina (M) Captación total de L-arginina (pmol/g proteína/minuto) 0200 400 600 800 1000 0 1 2 3 4 5 L-Arginina (M) Captación total de L-arginina (pmol/g proteína/minuto) 0.00 0.01 0.02 0.03 0 2 4 6 V/[L-Arginina] (pmol/g proteina/minuto/M) V (pmol/g proteina/minuto) 0.00 0.01 0.02 0.03 0 1 2 3 4 5 V/[L-Arginina] (pmol/g proteina/minuto/M) V (pmol/g proteina/minuto) A B C D Figura 4. Diabetes gestacional aumenta el transporte total y saturable de L-arginina en HUVEC. El transporte de L-arginina fue determinado en HUVEC provenientes de embarazos normales (○) o con diabetes gestacional (●). Las células fueron incubadas en presencia de L-arginina (15-1000 µM, 3 µCi/mL L-[3H]arginina, 37°C, 1 minuto) como se describen en los métodos. (A) Los datos del transporte de L-arginina total fueron ajustados a una ecuación de Michaelis-Menten más un componente lineal. (B) Los datos del transporte de L-arginina saturable fueron ajustados a una ecuación de Michaelis-Menten sin componente lineal. (C-D) Transformación de Eadie-Hofstee para los datos en A y B, respectivamente. Los valores corresponden al promedio ± S.E.M., n=12. 57 Tabla 6. Parámetros cinéticos del transporte saturable de L-arginina en HUVEC. Transporte de L-arginina Vmax (pmol/µg proteína/minuto) Km (µM) Vmax/Km (pmol/µg proteína/minuto/(µM)) 1/C/XF KD (10-5 µM-1) Normal Control 1.0 ± 0.1 79 ± 46 0.012 ± 0.003 1.0 ± 0.2 20 ± 2 Insulina 2.3 ± 0.1* 93 ± 22 0.024 ± 0.006* 2.0 ± 0.5* 25 ± 3 Diabetes gestacional Control 4.3 ± 0.3* 120 ± 31 0.035 ± 0.011* 2.9 ± 0.9* 28 ± 3 Insulina 2.2 ± 0.5† 172 ± 40 0.012 ± 0.005† 1.0 ± 0.4† 31 ± 3 Transporte de L-arginina en HUVEC provenientes de embarazos normales (Normal) y con diabetes gestacional (Diabetes gestacional) en ausencia y presencia de insulina. Vmax, velocidad máxima. Km, constante de Michaelis-Menten. Vmax/Km, capacidad máxima de transporte. 1/C/XF, corresponde al efecto relativo para el transporte de L-arginina de las diferentes condiciones con respecto a células HUVEC controles normales sin insulina sobre la capacidad máxima de transporte (Vmax/Km); 1/DG/XF, corresponde al efecto relativo para el transporte de L-arginina de las diferentes condiciones con respecto a células HUVEC controles provenientes de embarazos con diabetes gestacional sin insulina sobre la capacidad máxima de transporte (Vmax/Km). KD, corresponde al transporte de L-arginina lineal no saturable. *P<0.05 con respecto a su control normal sin insulina. †P<0.05 con respecto al control normal con insulina. Valores corresponden a promedio ± S.E.M. (n=5-12). b 57 58 5.3 Efecto de insulina sobre el transporte de L-arginina Insulina aumentó la captación de L-arginina (300 µM) en HUVEC normales, sin embargo, en DG revertió parcialmente el efecto de diabetes gestacional (Figura 5). Estos efectos también fueron observados en todo el rango de concentraciones de L-arginina (Figura 6A). La representación de los datos de transporte en una gráfica de Eadie-Hofstee muestra que los valores se ajustan a una curva de decaimiento exponencial (participación de al menos dos sistemas de transporte) (Figura 6C). Los datos que fueron ajustados a una curva saturable de Michaelis-Menten (Figura 6B), mostrarón que insulina aumenta la Vmax en HUVEC normales, y una disminuye la Vmax en DG sin cambios en la Km aparente para ambos grupos (Tabla 6). La transformación de Eadie-Hofstee mostró que los datos se ajustan a una regresión lineal (Figura 6D). Al analizar las eficiencias relativas se observó que el transporte en HUVEC con DG en presencia de insulina fue recuperado a valores de HUVEC normales, mientras que en células normales, insulina aumentó al doble la eficiencia relativa del transporte de L-arginina (Tabla 6). 5.4 Efecto de diabetes gestacional e insulina sobre la abundancia de la proteína hCAT-1 en HUVEC. Diabetes gestacional (DG) se asoció con un aumento en la abundancia relativa de la proteína hCAT-1 respecto a células provenientes de embarazos normales (Figura 7A). La incubación de DG con insulina causó una disminución de la abundancia de la proteína hCAT-1 alcanzando valores cercanos a los observados en HUVEC normales en ausencia de insulina. Sin embargo, en HUVEC normales expuestas a esta hormona la abundancia de esta proteína aumentó respecto al valor observado en estas células en ausencia de insulina (Figura 7A). 59 0 1 2 3 4 * *† Control Insulina Captación total de L-arginina (pmol/g proteína/minuto) Figura 5. Insulina revierte el aumento de la captación de L-arginina en HUVEC de diabetes gestacional. Células provenientes de embarazos normales (barra blanca) y con diabetes gestacional (barra negra) fueron incubadas con 300 µM de Larginina (3 µCi/mL L-[3H]arginina, 37°C, 1 minuto) en ausencia y presencia de insulina (1 nM, 8 horas). La radioactividad asociada a las células fue determinada como se describe en los métodos. Los valores corresponden al promedio ± S.E.M., n=12. *P<0.05 con respecto a Normal. †P<0.05 con respecto a diabetes gestacional sin insulina. 66 0 1 2 3 4 5Ad-Control Ad-IR-A 010 50 100 200 MOI * *** (mRNA IR-A/rRNA 28S)x104 (número de copias) Figura 10. Silenciamiento de las isoformas A y B del receptor de insulina mediante siRNA en HUVEC. El número de copias del mRNA de las isoformas A (IR-A) y B (IR-B) del receptor de insulina humano fue determinado en células HUVEC normales mediante RT-PCR en tiempo real en ausencia o presencia de adenovirus portadores del siRNA contra IR-A (Ad-IR-A), IR-B (Ad-IR-B), y control (AdControl). Control sin infección se representa en la barra gris. Se utilizaron oligonucleótidos específicos para IR-A, IR-B y 28S, como se describe en los métodos. Los valores corresponden al promedio ± S.E.M, n=6. *P<0.05 con respecto a su correspondiente Ad-Control. 67 0 2 4 6 8 ** †† Ad-IR-A (100 MOI) Ad-IR-B (100 MOI) - -+ -- ++ + (mRNA IR-A/rRNA 28S)x10 4 (número de copias) 0 1 2 3 Ad-IR-A (100 MOI) Ad-IR-B (100 MOI) - -+ -- ++ + *†*† (mRNA IR-B/rRNA 28S)x10 4 (número de copias) A B Figura 11. Silenciamiento específico de las isoformas A y B del receptor de insulina mediante siRNA en HUVEC. El número de copias del mRNA de las isoformas A (IR-A) y B (IR-B) del receptor de insulina humano fueron determinados en células HUVEC normales (barras blancas) y DG (barras negras) mediante RT-PCR en tiempo real en ausencia (-) o presencia (+) de adenovirus portadores del siRNA contra IR-A (Ad-IR-A, 100 MOI), e IR-B (Ad-IR-B, 100 MOI). Se utilizaron oligonucleótidos específicos para IR-A, IR-B y 28S, como se describe en los métodos. Los valores corresponden al promedio ± S.E.M, n=6. En A,*P<0.05 con respecto a las células transfectadas con el Ad-IR-A. †P< 0.05 con respecto a las células transfectadas con Ad-IR-A y al control en ausencia de adenovirus. En B, *P<0.05 con respecto a las células transfectadas con el Ad-IR-B. †P<0.05 con respecto a las células transfectadas con Ad-IR-B. o B A 68 0 2 4 6 8IR-A IR-B IR-A/IR-B * * -- - ++ + Insulina (mRNA IRs/rRNA 28S)x104 (número de copias) Figura 12. Insulina revierte el aumento de los niveles de mRNA para IR-A en HUVEC de diabetes gestacional. El número de copias del mRNA de las isoformas A (IR-A) y B (IR-B) del receptor de insulina humano fue determinado en en células provenientes de embarazos normales (barras blancas) o con diabetes gestacional (barras negras) mediante RT-PCR en tiempo real en ausencia (-) o presencia (+) de insulina (1 nM, 8 horas). En barras grises se muestran las relaciones entre IR-A e IR-B en ausencia y presencia de insulina. Se utilizaron oligonucleótidos específicos para IR-A, IR-B y 28S, como se describe en los métodos. Los valores corresponden al promedio ± S.E.M., n=6. *P<0.05 con respecto a HUVEC en presencia de insulina y HUVEC normales en ausencia y presencia de insulina. 69 5.10 Participación de IR-A e IR-B en la captación de L-arginina en HUVEC. Para evaluar la participación de IR-A e IR-B en la captación de L-arginina en HUVEC normales y HUVEC de diabetes gestacional, ambos tipos celulares fueron transducidos con Ad-IR-A y Ad-IR-B. Como se observó previamente insulina aumentó la captación de L-arginina en HUVEC normales; sin embargo, este efecto fue bloqueado al transducir estas células con Ad-IR-A y/o Ad-IR-B (Figura 13). Mientras que el aumento de la captación de L-arginina en HUVEC con diabetes gestacional que fue bloqueado por insulina fue recuperado sólo en células transducidas con Ad-IR-A (Figura 13). 5.11 Participación de IR-A e IR-B en el transporte de L-arginina en HUVEC. Como se indicó, en células HUVEC normales insulina aumentó la Vmax y la razón Vmax/Km del transporte de L-arginina con respecto a las células en ausencia de esta hormona (ver Figura 6). Sin embargo, en células transducidas con Ad-IR-A y/o Ad-IR-B, el efecto de insulina fue bloqueado en estos parámetros (Figura 14A, Tabla 7). En HUVEC provenientes de embarazos con diabetes gestacional, insulina disminuyó la Vmax y la razón Vmax/Km del transporte de L-arginina con respecto a las células en ausencia de esta hormona (ver Figura 6). Este efecto de insulina fue bloqueado sólo en células transducidas con el Ad-IR-A, sin observarse cambios en células transducidas con Ad-IR-B (Figura 14C). El valor de Km aparente no varió significativamente en ninguna condición experimental en ambos tipos celulares (Tabla 7). 70 0 1 2 3 4 Insulina Ad-Control Ad-IR-A Ad-IR-B - + - - - - + - - - + + + - + - + - + + - - - + + + - - + - - + *† * *†*†*†*† *† Captación de L-arginina (pmol/g prot/min) Figura 13. Insulina requiere de IR-A para revertir el aumento de la captación de Larginina en HUVEC de diabetes gestacional. Células provenientes de embarazos normales (Normal, barras blancas) y con diabetes gestacional (DG, barras negras) fueron incubadas con 300 µM de L-arginina (3 µCi/mL L-[3H]arginina, 37°C, 1 minuto) en ausencia (-) y presencia (+) de insulina (1 nM, 8 horas) y/o adenovirus portadores de siRNA contra IR-A (Ad-IR-A, 100 MOI) o IR-B (Ad-IR-B, 100 MOI). La radioactividad asociada a las células fue determinada como se describe en los métodos. Los valores corresponden al promedio ± S.E.M., n=5. *P<0.05 con respecto a Normal transfectadas con Ad-Control en ausencia de insulina, Ad-IR-A y/o IR-B en ausencia y presencia de insulina. †P<0.05 con respecto a DG transfectadas con Ad-Control y con Ad-IR-B en presencia de insulina. 71 0200 400 600 800 1000 0 1 2 3 4 5 GD Ad-IR-A Ad-IR-B Ad-IR-A+Ad-IR-B Insulina Ad-IR-A+insulina Ad-IR-B+insulina Ad-IR-A+Ad-IR-B+insulina Normal L-Arginina (M) Transporte de L-arginina (pmol/g proteina/min) 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0 1 2 3 4 5 V/[L-arginina] (pmol/g proteina/min/M) V (pmol/g proteina/min) 0200 400 600 800 1000 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Control Ad-IR-A Ad-IR-B Ad-IR-A+Ad-IR-B Insulina Ad-IR-A+insulina Ad-IR-B+insulina Ad-IR-A+Ad-IR-B+insulina L-Arginina (M) Transporte de L-arginina (pmol/g proteina/min) 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 V/[L-arginina] (pmol/g proteina/min/M) V (pmol/g proteina/min) A C B D Figura 14 continúa en la página 72 71 71 72 Figura 14. Insulina requiere de IR-A para revertir el aumento del transporte de L-arginina en HUVEC de diabetes gestacional. El transporte de L-arginina fue determinado en HUVEC provenientes de embarazos normales (A,C) o con diabetes gestacional (B,D). Las células fueron incubadas en presencia de L-arginina (15-1000 µM, 3 µCi/mL L-[3H]arginina, 37°C, 1 minuto) en ausencia y presencia de insulina (1 nM, 8 horas) y/o adenovirus portadores de siRNA contra IR-A (Ad-IR-A, 100 MOI) o IR-B (Ad-IR-B, 100 MOI) como se describen en los métodos. (A) Los datos del transporte de L-arginina saturable fueron ajustados a una ecuación de Michaelis-Menten sin componente lineal en células Normales. (B) Los datos del transporte de L-arginina saturable fueron ajustados a una ecuación de Michaelis-Menten sin componente lineal en células provenientes de embarazos con diabetes gestacional. (C-D) Transformación de Eadie-Hofstee para los datos en A y B, respectivamente. Los valores corresponden al promedio ± S.E.M., n=6-12. 72 73 Tabla 7. Efecto del silenciamiento de las isoformas del receptor de insulina sobre los parametros cinéticos del transporte de L-arginina saturable en HUVEC. Transporte saturable de L-arginina Vmax (pmol/µg proteina/ minuto) Km (µM) Vmax/Km (pmol/µg proteina/minuto/ (µM)) 1/C/XF 1/DG/XF KD (10-5) (pmol/µg proteina/ minuto/ (µM)) Normal Sin insulina Control 1.0 ± 0.1 79 ± 46 0.012 ± 0.001 1.0 ± 0.1 - 20 ± 2 Ad-IR-A 0.9 ± 0.1 81 ±30 0.011 ± 0.001 0.9 ± 0.1 - 24 ± 3 Ad-IR-B 0.9 ± 0.1 78 ± 32 0.012 ± 0.001 1.0 ± 0.1 - 28 ± 3 Ad-IR-A+ Ad-IR-B 1.0 ± 0.1 76 ± 46 0.013 ± 0.001 1.1 ± 0.1 - 29 ± 3 Con insulina Control 2.3 ± 0.1* 93 ± 22 0.024 ± 0.006* 2.0 ± 0.5* - 25 ± 3 Ad-IR-A 0.9 ± 0.1† 90 ± 33 0.010 ± 0.001† 0.8 ± 0.1† - 26 ± 3 Ad-IR-B 0.9 ± 0.1† 78 ± 38 0.011 ± 0.001† 0.9 ± 0.1† - 24 ± 2 Ad-IR-A+ Ad-IR-B 1.1 ± 0.1† 88 ± 46 0.012 ± 0.001† 1.0± 0.1† - 22 ± 2 DG Sin insulina Control 4.3 ± 0.3# 120 ± 27 0.035 ± 0.003# 2.9 ± 0.2# 1.0 ± 0.1 28 ± 3 Ad-IR-A 3.9 ± 0.7# 102 ± 65 0.038 ± 0.003# 3.1 ± 0.3# 1.1 ± 0.1 25 ± 3 Ad-IR-B 4.4 ± 0.3# 127 ± 27 0.034 ± 0.003# 2.8 ± 0.2# 1.0 ± 0.1 30 ± 3 Ad-IR-A+ Ad-IR-B 4.2 ±0.3# 115 ± 27 0.036 ± 0.004# 3.0 ± 0.3# 1.0 ± 0.1 28 ± 3 Con insulina Control 2.2 ± 0.5‡ 172 ± 40 0.012 ± 0.001‡ 1.0 ± 0.1‡ 0.3 ± 0.1‡ 31 ± 3 Ad-IR-A 4.1 ± 0.2# 185 ± 38 0.022 ± 0.001* 1.8 ± 0.2* 0.6 ± 0.1 27 ± 3 Ad-IR-B 2.2 ± 0.2‡ 187 ± 49 0.011 ± 0.001‡ 0.9 ± 0.1‡ 0.3 ± 0.1‡ 33 ± 4 Ad-IR-A+ Ad-IR-B 4.3 ± 0.4# 115 ± 21 0.037 ± 0.003# 3.1 ± 0.3# 1.1 ± 0.1 28 ± 3 Transporte de L-arginina en HUVEC provenientes de embarazos normales (Normal) y con diabetes gestacional (DG) en presencia o ausencia de insulina (1 nM, 8 horas), y/o adenovirus portadores de sirRNA contra IR-A (Ad-IR-A, 100 MOI) o IR-B (Ad-IR-B, 100 MOI) como se describen en los métodos. Vmax, velocidad máxima. Km, constante de Michaelis-Menten. Vmax/Km, capacidad máxima de transporte. 1/C/XF, corresponde al efecto relativo para el transporte de L-arginina de las diferentes condiciones con respecto a células HUVEC controles normales sin insulina sobre la capacidad máxima de transporte (Vmax/Km); 1/DG/XF, corresponde al efecto relativo para el transporte de L-arginina de las diferentes condiciones con respecto a células HUVEC controles provenientes de embarazos con diabetes gestacional sin insulina sobre la capacidad máxima de transporte (Vmax/Km). KD, corresponde al transporte de L-arginina lineal no saturable. *P<0.05 con respecto a su control normal sin insulina. †P<0.05 con respecto al control normal con insulina. #P<0.05 con respecto a su control normal sin y con insulina. ‡P<0.05 con respecto a su control DG sin insulina. Valores corresponden a promedio ± S.E.M. (n=6-12). 74 5.12 Participación de IR-A e IR-B en la abundancia de proteína para hCAT-1 en HUVEC. Como se comentó anteriormente, en HUVEC normales insulina aumentó la abundancia relativa de la proteína hCAT-1 (ver Figura 7A). El efecto de insulina sobre la abundancia de proteína de hCAT-1 fue bloqueado en células knock-down para las isoformas A (IR-A) y/o B (IR-B) del receptor de insulina (Figura 15A). Sin embargo, en HUVEC provenientes de embarazos con diabetes gestacional, el efecto de insulina se asoció con un aumento en la abundancia relativa de la proteína hCAT-1, efecto que fue bloqueado por insulina (ver Figura 7A). El efecto de insulina observado en estas células fue bloqueado sólo en las células knock-down para la isoforma A del receptor de insulina (IR-A) (Figura 15B). 5.13 Participación de IR-A e IR-B en los niveles de mRNA para hCAT-1 en HUVEC. Como se observó previamente, insulina aumentó el número de copias del mRNA para hCAT-1en células normales (ver Figura 7B); sin embargo fue bloqueado al transducir estas células con adenovirus que contenían el siRNA para ambas isoformas (A y B) del receptor de insulina (IR-A e IR-B) (Figura 16A). Por otro lado, en HUVEC provenientes de embarazos con diabetes gestacional, donde estas células se asociaron con un aumento en el número de copias del mRNA, insulina causó una disminución en el mRNA de hCAT-1, alcanzando valores cercanos a los observados en HUVEC normales en ausencia de insulina (ver Figura 7B). De manera interesante, el efecto de insulina solo fue bloqueado en presencia de adenovirus que contenían el siRNA para la isoforma A del receptor de insulina (IR-A). 75 hCAT-1 ß-actina hCAT-1 ß-actina AB Figura 15. Insulina requiere de IR-A para revertir el aumento de la abundancia de proteína para hCAT-1 en HUVEC de diabetes gestacional. La abundancia de proteína para hCAT-1 fue determinada en HUVEC provenientes de embarazos normales (A) y de diabetes gestacional (B) mediante westerrn-blot en ausencia (-) y presencia (+) de insulina (1 nM, 8 horas) y/o adenovirus portadores de siRNA contra IR-A (Ad-IR-A, 100 MOI), o IR-B (Ad-IR-B, 100 MOI). Se utilizarón anticuerpos anti-hCAT-1 (1:250) y anti-β-actina (1:2500), como se describe en los métodos. Los valores corresponden al promedio ± S.E.M., n=6. En A, *P<0.05 con respecto al resto de condiciones. En B, *P<0.05 con respecto a control normal (barra gris), células DG transfectadas con Ad-Control y Ad-IR-B en presencia de insulina. 75 75 82 0 1 2 3 4A1A2A A2B A3 Captación de L-arginina (pmol/g proteina/min) 0 1 2 3 4 CPA DPCPX CGS-21680 ZM-241385 NECA MRS-1754 2Cl-IB-MECA MRS-1523 - - - - - - - - - + - - - - - - + + - - - - - - - - + - - - - - - - - + - - - - - - + + - - - - - - - - + - - - - - - - - + - - - - - - + + - - - - - - - - + - - - - - - - - + - - - - - - + + + - - - - - - - *** * ** * * * ** Captación de L-arginina (pmol/g proteina/min) A B Figura 18. Insulina requiere de la actividad de receptores de adenosina A2A para aumentar la captación de L-arginina en HUVEC provenientes de embarazos normales. Células provenientes de embarazos normales fueron incubadas con 300 µM de L-arginina (3 µCi/mL L-[3H]arginina, 37°C, 1 minuto) en ausencia (A) y presencia (B) de insulina (1 nM, 8 horas), agonistas (CPA, CGS-21680, NECA, 2Cl-IB-MECA) y antagonistas (DPCPX, ZM-241385, MRS1754, MRS1523) de receptores de adenosina A1, A2A, A2B y A3, respectivamente. La radioactividad asociada a las células fue determinada como se describe en los métodos. Los valores corresponden al promedio ± S.E.M., n=6-12. En B, *P<0.05 con respecto a todos los valores observados en A, y a las células incubadas con insulina en presencia de ZM-241385. 83 0 1 2 3 4A1A2A A2B A3 * †† Captación de L-arginina (pmol/g proteina/min) 0 1 2 3 4 CPA DPCPX CGS-21680 ZM-241385 NECA MRS-1754 2Cl-IB-MECA MRS-1523 - - - - - - - - - - - - - - - - - + - - - - - - + + - - - - - - - - + - - - - - - - - + - - - - - - + + - - - - - - - - + - - - - - - - - + - - - - - - + + - - - - - - - - + - - - - - - - - + - - - - - - + + + - - - - - - - * † † † Captación de L-arginina (pmol/g proteina/minuto) A B Figura 19. Insulina requiere de la actividad de receptores de adenosina A1 para revertir el aumento de la captación de L-arginina en HUVEC de diabetes gestacional. Células provenientes de embarazos con diabetes gestacional fueron incubadas con 300 µM de L-arginina (3 µCi/mL L-[3H]arginina, 37°C, 1 minuto) en ausencia (A) y presencia (B) de insulina (1 nM, 8 horas), agonistas (CPA, CGS21680, NECA, 2-Cl-IB-MECA) y antagonistas (DPCPX, ZM-241385, MRS1754, MRS1523) de receptores de adenosina A1, A2A, A2B y A3, respectivamente. En A y B, la barra gris corresponde a las células normales en ausencia de insulina. La radioactividad asociada a las células fue determinada como se describe en los métodos. Los valores corresponden al promedio ± S.E.M., n=6-12. En A, *P<0.05 con respecto al resto de los valores observados en A. †P<0.05 con respecto al resto de los valores, excepto células normales. En B, *P<0.05 con respecto al resto de los valores observados en B. †P<0.05 con respecto al resto de los valores, excepto células normales. 84 5.16 Efecto de la activación e inhibición de los receptores de adenosina sobre el transporte de L-arginina en HUVEC. En HUVEC provenientes de embarazos normales la activación e inhibición por agonistas y antagonistas de receptores adenosina de A1 (CPA, DPCPX), A2A (CGS-21680, ZM241385), A2B (NECA, MRS1754) y A3 (2-Cl-IB-MECA, MRS1523), no mostraron cambios sobre la Vmax, Km y la Vmax/Km del transporte saturable de L-arginina (Figura 20A, Tabla 8). La transformación de Eadie-Hofstee de estos datos mostró que se ajustan a una regresión lineal (Figura 20B). Sin embargo, estas células aumentan la Vmax, y la Vmax/Km en el transporte saturable de L-arginina al ser incubadas con insulina, este efecto fue bloqueado al incubar estas células con un antagonista de receptores de adenosina A2A (ZM-241385) en ausencia y presencia de un agonista de receptores de adenosina A2A (CGS-21680) (Figura 21A, Tabla 8). La transformación de Eadie-Hofstee de estos datos mostró que se ajustan a una regresión lineal (Figura 21B). Por otro lado, células HUVEC provenientes de embarazos con Diabetes gestacional muestran un mayor transporte de L-arginina con respecto a células normales. El efecto de diabetes gestacional sólo fue bloqueada parcialmente al usar ZM-241385 en ausencia y presencia de CGS-21680 (Figura 22A, Tabla 9). La transformación de Eadie-Hofstee de estos datos mostró que se ajustan a una regresión lineal (Figura 22B). Pero si estas células son incubadas en presencia de insulina, la captación de L-arginina vuelve a valores observados en células normales en ausencia de insulina. Este efecto de insulina fue bloqueado al utilizar un antagonista de receptores de adenosina A1 (DPCPX) en ausencia y presencia de un agonista para este receptor (CPA). Además, el efecto de insulina también fue bloqueado por el agonista del receptor de adenosina A2A (CGS-21680), pero revertido en presencia del antagonista de este receptor (ZM-241385) (Figura 23A, Tabla 9). La transformación de Eadie-Hofstee de estos datos mostró que se ajustan a una regresión lineal (Figura 23B). 85 Tabla 8. Parametros cinéticos del transporte saturable de L-arginina por activación de receptores de adenosina en HUVEC provenientes de embarazos normales. Transporte de L-arginina Vmax (pmol/µg proteina/minuto) Km (µM) Vmax/Km (pmol/µg proteina/minuto/(µM)) 1/C/XF 1/Ins/XF Sin insulina Control 1.0 ± 0.1 79 ± 46 0.012 ± 0.008 1.0 ± 0.6 ZM-241385 1.0 ± 0.1 99 ± 33 0.010 ± 0.004 0.8 ± 0.3 DPCPX 1.0 ± 0.1 77 ± 40 0.012 ± 0.004 1.0 ± 0.6 MRS-1754 1.2 ± 0.1 71 ± 16 0.017 ± 0.009 1.4 ± 0.7 MRS-1523 1.1 ± 0.1 67 ± 21 0.016 ± 0.008 1.3 ± 0.6 CGS-21680 1.1 ± 0.2 128 ± 15 0.008 ± 0.002 0.7 ± 0.2 CPA 1.2 ± 0.1 103 ± 21 0.011 ± 0.003 0.9 ± 0.2 NECA 1.5 ± 0.1 79 ± 21 0.018 ± 0.005 1.5 ± 0.4 2Cl-IB-MECA 1.0 ± 0.1 62 ± 23 0.016 ± 0.007 1.3 ± 0.6 ZM-241385 CGS-21680 1.0 ± 0.1 90 ± 33 0.011 ± 0.001 0.9 ± 0.1 DPCPX CPA 1.1 ± 0.1 75 ± 40 0.014 ± 0.001 1.2 ± 0.1 MRS-1754 NECA 1.0 ± 0.1 70 ± 16 0.014 ± 0.001 1.2 ± 0.1 MRS-1523 2Cl-IB-MECA 1.3 ± 0.1 69 ± 21 0.018 ± 0.008 1.5 ± 0.6 La tabla continúa en la próxima página. 85 86 Continuación Vmax (pmol/µg proteina/minuto) Km (µM) Vmax/Km (pmol/µg proteina/minuto/(µM)) 1/C/XF 1/Ins/XF HUVEC normales Con insulina Control 2.3 ± 0.1* 93 ± 22 0.024 ± 0.006* 2.0 ± 0.5* 1.0 ± 0.3 ZM-241385 0.9 ± 0.4 95 ± 59 0.010 ± 0.001 0.8 ± 0.1 0.4 ± 0.1† DPCPX 2.2 ± 0.1* 88 ± 20 0.025 ± 0.008* 2.1 ± 0.6* 1.0 ± 0.3 MRS-1754 2.3 ± 0.2* 110 ± 29 0.021 ± 0.007* 1.8 ± 0.6* 0.9 ± 0.3 MRS-1523 2.2 ± 0.1* 88 ± 18 0.025 ± 0.005* 2.1 ± 0.4* 1.0 ± 0.2 CGS-21680 2.9 ± 0.1* 137 ± 20 0.021 ± 0.003* 1.8 ± 0.2* 0.9 ± 0.1 CPA 2.7 ± 0.1* 104 ± 21 0.025 ± 0.003* 2.1 ± 0.2* 1.0 ± 0.1 NECA 1.7 ± 0.1* 95 ± 21 0.017 ± 0.004* 1.4 ± 0.3 0.7 ± 0.1 2Cl-IB-MECA 2.5 ± 0.1* 84 ± 12 0.029 ± 0.004* 2.4 ± 0.3* 1.2 ± 0.2 ZM-241385 CGS-21680 0.9 ± 0.2 95 ± 59 0.009 ± 0.001 0.8 ±0.1 0.4 ± 0.1† DPCPX CPA 2.2 ± 0.1* 80 ± 20 0.027 ± 0.002* 2.3 ± 0.2* 1.1 ± 0.1 MRS-1754 NECA 2.3 ± 0.2* 113 ± 29 0.020 ± 0.002* 1.7 ± 0.2* 0.8 ± 0.1 MRS-1523 2Cl-IB-MECA 2.3 ± 0.3* 89 ± 18 0.025 ± 0.003* 2.1 ± 0.3* 1.0 ± 0.1 86 87 Transporte de L-arginina en HUVEC provenientes de embarazos normales en presencia o ausencia de insulina (1 nM, 8 horas), agonistas y/o antagonistas de receptores de adenosina como se describen en los métodos. Vmax, velocidad máxima. Km, constante de Michaelis-Menten. Vmax/Km, capacidad máxima de transporte. 1/C/XF, corresponde al efecto relativo para el transporte de L-arginina de las diferentes condiciones con respecto a células HUVEC controles normales sin insulina sobre la capacidad máxima de transporte (Vmax/Km); 1/Ins/XF, corresponde al efecto relativo para el transporte de L-arginina de las diferentes condiciones con respecto a células HUVEC controles provenientes de embarazos normales con insulina sobre la capacidad máxima de transporte (Vmax/Km). ZM-241385, antagonista de receptor de adenosina (RA) tipo A2A; DPCPX, antagonista de RA tipo A1; MRS-1754, antagonista de RA tipo A2B; MRS-1523, antagonista de RA tipo A3; CGS-21680, agonista de RA tipo A2A; CPA, agonista de RA tipo A1; NECA, agonista de RA tipo A2B; 2Cl-IB-MECA, agonista de RA tipo A3. *P<0.05 con respecto HUVEC sin insulina. †P<0.05 con respecto a Control en HUVEC normales con insulina. 87 88 0 200 400 600 800 1000 0.0 0.5 1.0 1.5 L-Arginina (M) Transporte de L-arginina (pmol/g proteina/minuto) 0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010 0.0 0.5 1.0 1.5 Control CPA DPCPX CPA+DPCPX CGS-21680 ZM-241385 CGS21680+ZM-241385 NECA MRS-1754 NECA+MRS-1754 2Cl-IB-MECA MRS-1523 2Cl-IB-MECA+MRS-1523 V/[L-arginina] (pmol/g proteina/minuto/M) V (pmol/g proteina/minuto) A B Figura 20. El transporte de L-arginina no se altera por activación de receptores de adenosina en HUVEC provenientes de embarazos normales. El transporte saturable de L-arginina fue determinado en HUVEC provenientes de embarazos normales. Las células fueron incubadas en presencia de L-arginina (15-1000 µM, 3 µCi/mL L-[3H]arginina, 37°C, 1 minuto) en ausencia y presencia de agonistas (CPA 30 nM, CGS-21680 30 nM, NECA 1µM, 2Cl-IB-MECA 50 nM, 8 horas) y/o antagonistas (DPCPX 30 nM, ZM-241385 10 nM, MRS-1754 30 nM, MRS1523 30 nM) de receptores de adenosina A1 A2A, A2B y A3, respectivamente, como se describen en los métodos. (A) Los datos del transporte de L-arginina saturable fueron ajustados a una ecuación de Michaelis-Menten sin componente lineal. (B) Transformación de Eadie-Hofstee para los datos en A. Los valores corresponden al promedio ± S.E.M., n=6-12. 89 0200 400 600 800 1000 0 1 2 3 L-Arginina (M) Transporte de L-arginina (pmol/g proteina/minuto) 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0 1 2 3 Control Insulin Insulina+CPA Insulina+DPCPX Insulina+CPA+DPCPX Insulina+CGS-21680 Insulina+ZM-241385 Insulina+CGS-21680+ZM-241385 Insulina+NECA Insulina+MRS-1754 Insulina+NECA+MRS-1754 Insulina+2Cl-IB-MECA Insulina+MRS-1523 Insulina+2Cl-IB-MECA+MRS-1523 V/[L-arginina] (pmol/g proteina/minuto/M) V (pmol/g proteina/minuto) A B Figura 21. Insulina requiere de la actividad de receptores de adenosina A2A para aumentar el transporte saturable de L-arginina en HUVEC normales. El transporte saturable de L-arginina fue determinado en HUVEC provenientes de embarazos normales en presencia de insulina (1 nM, 8 horas). Las células fueron incubadas en presencia de L-arginina (15-1000 µM, 3 µCi/mL L-[3H]arginina, 37°C, 1 minuto) en ausencia y presencia de agonistas (CPA 30 nM, CGS-21680 30 nM, NECA 1µM, 2Cl-IB-MECA 50 nM, 8 horas) y/o antagonistas (DPCPX 30 nM, ZM-241385 10 nM, MRS-1754 30 nM, MRS1523 30 nM) de receptores de adenosina A1 A2A, A2B y A3, respectivamente, como se describen en los métodos. (A) Los datos del transporte de L-arginina saturable fueron ajustados a una ecuación de Michaelis-Menten sin componente lineal. (B) Transformación de Eadie-Hofstee para los datos en A. Los valores corresponden al promedio ± S.E.M., n=6-12. 90 0200 400 600 800 1000 0 1 2 3 4 5 L-Arginina (M) Transporte de L-arginina (pmol/g proteina/min) 0.00 0.01 0.02 0.03 0 1 2 3 4 5 CPA DPCPX CPA+DPCPX CGS-21680 ZM-241385 CGS-21680+ZM-241385 NECA MRS-1754 NECA+MRS-1754 2Cl-IB-MECA MRS-1523 2Cl-IB-MECA+MRS-1523 Diabetes gestacional Normal V/[L-arginina] (pmol/g proteina/minuto/M) V (pmol/g proteina/minuto) A B Figura 22. Diabetes gestacional aumenta el transporte de L-arginina de una manera dependiente de receptores de adenosina A2A. El transporte saturable de L-arginina fue determinado en HUVEC provenientes de embarazos con diabetes gestacional. Las células fueron incubadas en presencia de L-arginina (15-1000 µM, 3 µCi/mL L-[3H]arginina, 37°C, 1 minuto) en ausencia y presencia de agonistas (CPA 30 nM, CGS-21680 30 nM, NECA 1µM, 2Cl-IB-MECA 50 nM, 8 horas) y/o antagonistas (DPCPX 30 nM, ZM-241385 10 nM, MRS-1754 30 nM, MRS1523 30 nM) de receptores de adenosina A1 A2A, A2B y A3, respectivamente, como se describen en los métodos. (A) Los datos del transporte de L-arginina saturable fueron ajustados a una ecuación de Michaelis-Menten sin componente lineal. (B) Transformación de Eadie-Hofstee para los datos en A. Los valores corresponden al promedio ± S.E.M., n=6-12. 91 0200 400 600 800 1000 0 1 2 3 4 5 L-Arginina (M) Transporte de L-arginina (pmol/g proteina/minuto) 0.00 0.01 0.02 0.03 0 1 2 3 4 5 Insulina Insulina+CPA Insulina+DPCPX Insulina+CPA+DPCPX Insulina+CGS-21680 Insulina+ZM-241385 Insulina+CGS-21680+ZM-241385 Insulina+NECA Insulina+MRS-1754 Insulina+NECA+MRS-1754 Insulina+2Cl-IB-MECA Insulina+MRS-1523 Insulina+2Cl-IB-MECA+MRS-1523 Diabetes gestacional Control V/[L-arginina] (pmol/g proteina/minuto/M) V (pmol/g proteina/minuto) A B Figura 23. Insulina revierte el aumento del transporte de L-arginina en HUVEC de diabetes gestacional de una manera dependiente de receptores de adenosina A1. El transporte saturable de L-arginina fue determinado en HUVEC provenientes de embarazos con diabetes gestacional en presencia de insulina (1 nM, 8 horas). Las células fueron incubadas en presencia de L-arginina (15-1000 µM, 3 µCi/mL L-[3H]arginina, 37°C, 1 minuto) en ausencia y presencia de agonistas (CPA 30 nM, CGS-21680 30 nM, NECA 1µM, 2Cl-IB-MECA 50 nM, 8 horas) y/o antagonistas (DPCPX 30 nM, ZM-241385 10 nM, MRS-1754 30 nM, MRS1523 30 nM) de receptores de adenosina A1 A2A, A2B y A3, respectivamente, como se describen en los métodos. (A) Los datos del transporte de L-arginina saturable fueron ajustados a una ecuación de Michaelis-Menten sin componente lineal. (B) Transformación de Eadie-Hofstee para los datos en A. Los valores corresponden al promedio ± S.E.M., n=6-12. 98 0.0 0.5 1.0 1.5 Captación de L-arginina (pmol/g proteina/minuto) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Ad-Control Ad-IR-A Ad-IR-B Ad-IR-A+Ad-IR-B **** NECA MRS-1754 - -+ -- ++ + Captación de L-arginina (pmol/g proteina/minuto) A B Figura 26. Insulina requiere de IR-A e IR-B, pero no de receptores de adenosina A2B para aumentar la captación de L-arginina en HUVEC normales. Células provenientes de embarazos normales fueron incubadas con 300 µM de L-arginina (3 µCi/mL L-[3H]arginina, 37°C, 1 minuto) en ausencia (A) y presencia (B) de insulina (1 nM, 8 horas), agonista (NECA, 1 µM, 8 horas), y antagonista (MRS1754, 30 nM, 8 horas) del receptor de adenosina A2B en células knock-down para las isoformas del receptor de insulina A (Ad-IR-A) y B (Ad-IR-B). La radioactividad asociada a las células fue determinada como se describe en los métodos. Los valores corresponden al promedio ± S.E.M., n=6-12. *P<0.05 con respecto a todos los valores observados en A, y a las células incubadas con insulina en presencia de Ad-IR-A y/o Ad-IR-B. A B 99 0.0 0.5 1.0 1.5 Captación de L-arginina (pmol/g proteina/minuto) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Ad-Control Ad-IR-A Ad-IR-B Ad-IR-A+Ad-IR-B * * ** 2Cl-IB-MECA MRS-1523 - -+ -- ++ + Captación de L-arginina (pmol/g proteina/minuto) A B Figura 27. Insulina requiere de IR-A e IR-B, pero no de receptores de adenosina A3 para aumentar la captación de L-arginina en HUVEC normales. Células provenientes de embarazos normales fueron incubadas con 300 µM de L-arginina (3 µCi/mL L-[3H]arginina, 37°C, 1 minuto) en ausencia (A) y presencia (B) de insulina (1 nM, 8 horas), agonista (2-Cl-IB-MECA, 30 nM, 8 horas), y antagonista (MRS-1523, 30 nM, 8 horas) del receptor de adenosina A3 en células knock-down para las isoformas del receptor de insulina A (Ad-IR-A) y B (Ad-IR-B). La radioactividad asociada a las células fue determinada como se describe en los métodos. Los valores corresponden al promedio ± S.E.M., n=6-12. *P<0.05 con respecto a todos los valores observados en A, y a las células incubadas con insulina en presencia de Ad-IR-A y/o Ad-IR-B. A B 100 0 1 2 3 4 *** * Captación de L-arginina (pmol/g proteina/minuto) 0 1 2 3 4 Normal DG-Ad-Control DG-Ad-IR-A DG-Ad-IR-B DG-Ad-IR-A+Ad-IR-B CPA DPCPX - -+ -- ++ + ** * ** *** Captación de L-arginina (pmol/g proteina/minuto) A B Figura 28. Insulina requiere de IR-A y de receptores de adenosina A1 para revertir el aumento de la captación de L-arginina en HUVEC de diabetes gestacional. Células provenientes de embarazos con diabetes gestacional fueron incubadas con 300 µM de L-arginina (3 µCi/mL L-[3H]arginina, 37°C, 1 minuto) en ausencia (A) y presencia (B) de insulina (1 nM, 8 horas), agonista (CPA, 30 nM, 8 horas), y antagonista (DPCPX, 30 nM, 8 horas) del receptor de adenosina A1 en células knock-down para las isoformas del receptor de insulina A (Ad-IR-A) y B (Ad-IRB). La radioactividad asociada a las células fue determinada como se describe en los métodos. Los valores corresponden al promedio ± S.E.M., n=6-12. En A, *P<0.05 con respecto á las células en presencia de Ad-IR-A y/o Ad-IR-B. En B, *P<0.05 con respecto a células con Ad-IR-A, Ad-IR-B en presencia de DPCPX, y Ad-IR-A+Ad-IR-B. A B 101 0 1 2 3 4 ** ****** Captación de L-arginina (pmol/g proteina/minuto) 0 1 2 3 4 Normal DG-Ad-Control DG-Ad-IR-A DG-Ad-IR-B DG-Ad-IR-A+Ad-IR-B * CGS-21680 ZM-241385 - -+ -- ++ + ** *** †† Captación de L-arginina (pmol/g proteina/minuto) A B Figura 29. Insulina requiere de IR-A y de receptores de adenosina A2A para revertir el aumento de la captación de L-arginina en HUVEC de diabetes gestacional. Células provenientes de embarazos con diabetes gestacional fueron incubadas con 300 µM de L-arginina (3 µCi/mL L-[3H]arginina, 37°C, 1 minuto) en ausencia (A) y presencia (B) de insulina (1 nM, 8 horas), agonista (CGS-21680, 30 nM, 8 horas), y antagonista (ZM-241385, 10 nM, 8 horas) del receptor de adenosina A2A en células knock-down para las isoformas del receptor de insulina A (Ad-IR-A) y B (Ad-IR-B). La radioactividad asociada a las células fue determinada como se describe en los métodos. Los valores corresponden al promedio ± S.E.M., n=6-12. En A, *P<0.05 con respecto á las células normales (Normal) y con diabetes gestacional (DG) en presencia de Ad-IR-A y/o Ad-IR-B en presencia de ZM241385. En B, *P<0.05 con respecto a células normales (Normal) y con DG con Ad-IR-A en ausencia y presencia de DPCPX, Ad-IR-B en presencia de ZM241385, y Ad-IR-A+Ad-IR-B en presencia de ZM-241385. †P<0.05 con respecto a Normal en ausencia y presencia de de CGS-21680 en ausencia de ZM-241385. A B 102 0 1 2 3 4 **** Captación de L-arginina (pmol/g proteina/minuto) 0 1 2 3 4 Normal DG-Ad-Control DG-Ad-IR-A DG-Ad-IR-B DG-Ad-IR-A+Ad-IR-B NECA MRS-1754 - -+ -- ++ + ******** Captación de L-arginina (pmol/g proteina/minuto) A B Figura 30. Insulina requiere de IR-A y no de receptores de adenosina A2B para revertir el aumento de la captación de L-arginina en HUVEC de diabetes gestacional. Células provenientes de embarazos con diabetes gestacional fueron incubadas con 300 µM de L-arginina (3 µCi/mL L-[3H]arginina, 37°C, 1 minuto) en ausencia (A) y presencia (B) de insulina (1 nM, 8 horas), agonista (NECA, 1 µM, 8 horas), y antagonista (MRS1754, 30 nM, 8 horas) del receptor de adenosina A2B en células knock-down para las isoformas del receptor de insulina A (Ad-IR-A) y B (Ad-IR-B). La radioactividad asociada a las células fue determinada como se describe en los métodos. Los valores corresponden al promedio ± S.E.M., n=6-12. En A, *P<0.05 con respecto al resto de los valores en presencia de Ad-Control, AdIR-A y Ad-IR-B. En B, *P<0.05 con respecto a células normales (Normal) y con DG con Ad-Control y Ad-IR-B. A B 103 0 1 2 3 4 *** * Captación de L-arginina (pmol/g proteina/minuto) 0 1 2 3 4 Normal DG-Ad-Control DG-Ad-IR-A DG-Ad-IR-B DG-Ad-IR-A+Ad-IR-B 2Cl-IB-MECA MRS-1523 - -+ -- ++ + ***** * ** Captación de L-arginina (pmol/g proteina/minuto) A B Figura 31. Insulina requiere de IR-A y no de receptores de adenosina A3 para revertir el aumento de la captación de L-arginina en HUVEC de diabetes gestacional. Células provenientes de embarazos con diabetes gestacional fueron incubadas con 300 µM de L-arginina (3 µCi/mL L-[3H]arginina, 37°C, 1 minuto) en ausencia (A) y presencia (B) de insulina (1 nM, 8 horas), agonista (2-Cl-IB-MECA, 30 nM, 8 horas), y antagonista (MRS-1523, 30 nM, 8 horas) del receptor de adenosina A3 en células knock-down para las isoformas del receptor de insulina A (Ad-IR-A) y B (Ad-IR-B). La radioactividad asociada a las células fue determinada como se describe en los métodos. Los valores corresponden al promedio ± S.E.M., n=6-12. En A, *P<0.05 con respecto al resto de los valores en presencia de Ad-Control, AdIR-A y Ad-IR-B. En B, *P<0.05 con respecto a células normales (Normal) y con DG con Ad-Control y Ad-IR-B. A B 104 Cuando las HUVEC de diabetes gestacional son incubadas en presencia de insulina, la captación de L-arginina vuelve a valores observados en células normales en ausencia de insulina. Este efecto de insulina fue bloqueado al utilizar un antagonista de receptores de adenosina A1 (DPCPX) y el agonista del receptor de adenosina A2A (CGS-21680) (ver Figura 19B). Este efecto fue bloqueado sólo en las células knock-down para IR-A (Figuras 28B, 29B). El efecto de insulina en células HUVEC provenientes de embarazos con diabetes gestacional no fue modificado por por agonistas y/o antagonistas de receptores A2B y A3 (ver Figura 19B). La captación de L-arginina en estas condiciones no fue modificado en presencia de los siRNA para IR-A e IR-B (Figuras 30B, 31B). 5.18 Participación de IR-A e IR-B en el efecto de la activación e inhibición de los receptores de adenosina sobre el transporte de L-arginina en HUVEC normales. Como ya se ha indicado, en HUVEC provenientes de embarazos normales no cambiaron los parámetros cinéticos (Vmax, Km, Vmax/Km) del transporte saturable de Larginina en presencia de agonistas y/o antagonistas de receptores de adenosina (ver Figura 20A). El transporte de L-arginina saturable no fue modificado en presencia de siRNA para las isoformas A (IR-A) y B (IR-B) del receptor de insulina (Figuras 32A, C, E; 34A, C, D; y 36A, C, D; Tablas 10, 11 y 12). La transformación de Eadie-Hofstee de estos datos mostró que se ajustan a una regresión lineal (Figuras 32B/D/F; 34B/D/F; 36B/D/F). Por otro lado, insulina aumenta la Vmax y la Vmax/Km del transporte saturable de Larginina en células HUVEC normales transfectadas con un siRNA control (Ad-control), sin modificarse por agonistas y antagonistas de receptores de adenosina A1, A2B y A3; sin 105 0200 400 600 800 1000 0.0 0.5 1.0 1.5 L-Arginina (M) 0.000 0.005 0.010 0.015 0.0 0.5 1.0 1.5 Ad-Control ZM-241385+CGS-21680DPCPX+CPA MRS1754+NECA MRS1523+2Cl-IB-MECA V/[L-arginina] (pmol/g proteina/minuto/M) 0.000 0.005 0.010 0.015 0.0 0.5 1.0 1.5 Ad-Control CGS-21680CPA NECA 2Cl-IB-MECA V (pmol/g proteina/minuto) V/[L-arginina] (pmol/g proteina/minuto/M) 0200 400 600 800 1000 0.0 0.5 1.0 1.5 Transporte de L-arginina (pmol/g proteina/minuto) L-Arginina (M) 0.000 0.005 0.010 0.015 0.0 0.5 1.0 1.5 Control ZM-241385DPCPX MRS-1754 MRS-1523 V/[L-arginina] (pmol/g proteina/minuto/M) 0200 400 600 800 1000 0.0 0.5 1.0 1.5 L-Arginina (M) Figura 32 continúa en la siguiente página A C E B D F 105 106 Figura 32. El transporte de L-arginina no se altera en HUVEC normales knockdown para IR-A en presencia de agonistas y antagonistas de receptores de adenosina.. El transporte saturable de L-arginina fue determinado en HUVEC provenientes de embarazos normales. Las células fueron incubadas en presencia de L-arginina (15-1000 µM, 3 µCi/mL L-[3H]arginina, 37°C, 1 minuto) en ausencia y presencia de agonistas (A y B; CPA 30 nM, CGS-21680 30 nM, NECA 1µM, 2Cl-IB-MECA 50 nM, 8 horas), antagonistas ( C y D; DPCPX 30 nM, ZM-241385 10 nM, MRS-1754 30 nM, MRS1523 30 nM) y las combinaciones agonistas+antagonistas (E y F) de receptores de adenosina A1 A2A, A2B y A3, respectivamente, como se describen en los métodos. (A, C, E) Los datos del transporte de L-arginina saturable fueron ajustados a una ecuación de Michaelis-Menten sin componente lineal. (B, D, F) Transformación de Eadie-Hofstee para los datos en A, C y E, respectivamente. Los valores corresponden al promedio ± S.E.M., n=6-12. 106 107 0200 400 600 800 1000 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 L-Arginina (M) 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 insulina ZM-241385+CGS-21680+insulinaDPCPX+CPA+insulina MRS1754+NECA+insulina MRS1523+2Cl-IB-MECA+insulina Ad-Control Ad-Control+insulina V/[L-arginina] (pmol/g proteina/minuto/ M) 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 insulina CGS-21680+insulinaCPA+insulina NECA+insulina 2Cl-IB-MECA+insulina Ad-Control Ad-Control+insulina V/[L-arginina] (pmol/g proteina/minuto/ M) 0200 400 600 800 1000 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 L-Arginina (M) 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 insulina ZM-241385+insulinaDPCPX+insulina MRS-1754+insulina MRS-1523+insulina Ad-Control+insulinaAd-Control V/[L-arginina] (pmol/g proteina/minuto/ M) V (pmol/g proteina/minuto) 0200 400 600 800 1000 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 L-Arginina (M) Transporte de L-arginina (pmol/g proteina/minuto) Figura 33 contínua en la siguiente página A C E B D F 107 114 Figura 36. HUVEC normales knockdown para IR-A e IR-B en ausencia y presencia de agonistas y antagonistas de receptores de adenosina no cambian el transporte de L-arginina. El transporte saturable de L-arginina fue determinado en HUVEC provenientes de embarazos normales. Las células fueron incubadas en presencia de L-arginina (15-1000 µM, 3 µCi/mL L- [3H]arginina, 37°C, 1 minuto) en ausencia y presencia de agonistas (A y B; CPA 30 nM, CGS-21680 30 nM, NECA 1µM, 2Cl-IB-MECA 50 nM, 8 horas), antagonistas (C y D; DPCPX 30 nM, ZM-241385 10 nM, MRS-1754 30 nM, MRS1523 30 nM) y las combinaciones agonistas+antagonistas (E y F) de receptores de adenosina A1 A2A, A2B y A3, respectivamente, como se describen en los métodos. (A,C,E) Los datos del transporte de L-arginina saturable fueron ajustados a una ecuación de Michaelis-Menten sin componente lineal. (B,D,F) Transformación de Eadie-Hofstee para los datos en A, C y E, respectivamente. Los valores corresponden al promedio ± S.E.M., n=6-12. 114 115 0200 400 600 800 1000 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 L-Arginina (M) 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 insulina ZM-241385+CGS-21680+insulina DPCPX+CPA+insulina MRS1754+NECA+insulina MRS1523+2Cl-IB-MECA+insulina Ad-Control Ad-Control+insulina V/[L-arginina] (pmol/g proteina/minuto/ M) 0200 400 600 800 1000 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 L-Arginina (M) Transporte de L-arginina (pmol/g proteina/minuto) 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 insulina ZM-241385+insulinaDPCPX+insulina MRS-1754+insulina MRS-1523+insulina Ad-Control Ad-Control+insulina V/[L-arginina] (pmol/g proteina/min/M) V (pmol/g proteina/minuto) 0200 400 600 800 1000 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 L-Arginina (M) 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 insulina CGS-21680+insulinaCPA+insulina NECA+insulina 2Cl-IB-MECA+insulina Ad-Control Ad-Control+insulina V/[L-arginina] (pmol/g proteina/minuto/ M) Figura 37 continúa en la página 116 A C E B D F 115 116 Figura 37. Insulina no aumenta el transporte de L-arginina en HUVEC normales knockdown para IR-A e IR-B en ausencia y presencia de agonistas y antagonistas de receptores de adenosina. El transporte saturable de L-arginina fue determinado en HUVEC provenientes de embarazos normales knock-down para las isoformas A y B del receptor de insulina (IR-A+IR-B). Las células fueron incubadas en presencia de L-arginina (15-1000 µM, 3 µCi/mL L-[3H]arginina, 37°C, 1 minuto) en ausencia y presencia de agonistas (A y B; CPA 30 nM, CGS-21680 30 nM, NECA 1µM, 2Cl-IB-MECA 50 nM, 8 horas), antagonistas ( C y D; DPCPX 30 nM, ZM-241385 10 nM, MRS-1754 30 nM, MRS1523 30 nM) y las combinaciones agonistas+antagonistas (E y F) de receptores de adenosina A1 A2A, A2B y A3, respectivamente, en presencia de insulina (1 nM, 8 horas) como se describen en los métodos. (A, C, E) Los datos del transporte de L-arginina saturable fueron ajustados a una ecuación de Michaelis-Menten sin componente lineal. (B, D, F) Transformación de Eadie-Hofstee para los datos en A, C y E, respectivamente. Los valores corresponden al promedio ± S.E.M., n=6-12. 116 117 Tabla 10. Parámetros cinéticos del transporte saturable de L-arginina en presencia de agonistas y/antagonistas de receptores de adenosina en HUVEC normales knock-down para IR-A. Transporte de L-arginina Vmax (pmol/µg proteina/minuto) Km (µM) Vmax/Km (pmol/µg proteina/minuto/(µM)) 1/C/XF 1/Ins/XF Sin insulina Normal 1.0 ± 0.1 79 ± 46 0.012 ± 0.001 1.0 ± 0.1 - Control 1.0 ± 0.1 77 ± 44 0.012 ± 0.001 1.0 ± 0.1 - ZM-241385 1.0 ± 0.1 95 ± 33 0.010 ± 0.001 0.8 ± 0.1 - DPCPX 1.0 ± 0.1 79 ± 45 0.012 ± 0.001 1.0 ± 0.1 - MRS-1754 1.2 ± 0.1 78 ± 32 0.015 ± 0.002 1.3 ±0.1 - MRS-1523 1.1 ± 0.1 66 ± 38 0.016 ± 0.003 1.3 ± 0.1 - CGS-21680 1.1 ± 0.2 90 ± 44 0.012 ± 0.001 1.0 ± 0.1 - CPA 1.2 ± 0.1 88 ± 45 0.013 ± 0.001 1.1 ± 0.1 - NECA 1.1 ± 0.1 81 ± 32 0.012 ± 0.001 1.0 ± 0.1 - 2Cl-IB-MECA 1.0 ± 0.1 88 ± 22 0.011 ± 0.001 0.9 ± 0.1 - ZM-241385 CGS-21680 1.0 ± 0.1 90 ± 33 0.011 ± 0.001 0.9 ± 0.1 - DPCPX CPA 1.1 ± 0.1 76 ± 40 0.014 ± 0.002 1.2 ± 0.1 - MRS-1754 NECA 1.0 ± 0.1 85 ± 16 0.011 ± 0.001 0.9 ± 0.1 - MRS-1523 2Cl-IB-MECA 1.1 ± 0.1 72 ± 21 0.015 ± 0.003 1.3 ± 0.1 - La tabla continúa en la próxima página. 117 118 Continuación Vmax (pmol/µg proteina/minuto) Km (µM) Vmax/Km (pmol/µg proteina/minuto/(µM)) 1/C/XF 1/Ins/XF Con insulina Control 1.3 ± 0.1 88 ± 42 0.014 ± 0.002 1.1 ± 0.1 1.0 ±0.1 ZM-241385 0.9 ± 0.1 90 ± 49 0.010 ± 0.001 0.8 ± 0.1 0.7± 0.1 DPCPX 1.2 ± 0.1 80 ± 45 0.015 ± 0.003 1.3 ± 0.1 1.1 ± 0.1 MRS-1754 1.3 ± 0.1 92 ± 46 0.014 ± 0.002 1.2 ± 0.1 1.0 ± 0.1 MRS-1523 1.2 ± 0.1 75 ± 29 0.016 ± 0.003 1.3 ± 0.1 1.1 ± 0.1 CGS-21680 0.9 ± 0.1 99 ± 34 0.009 ± 0.001 1.8 ± 0.2 0.6 ± 0.1 CPA 0.9 ± 0.1 85 ± 52 0.010 ± 0.001 0.8 ± 0.1 0.7 ± 0.1 NECA 0.9 ± 0.1 90 ± 42 0.010 ± 0.001 0.8 ± 0.1 0.7 ± 0.1 2Cl-IB-MECA 0.8 ± 0.1 82 ± 33 0.009 ± 0.001 0.8 ± 0.1 0.6 ± 0.1 ZM-241385 CGS-21680 0.9 ± 0.1 90 ± 59 0.010 ± 0.001 0.8 ± 0.1 0.7 ± 0.1 DPCPX CPA 1.2 ± 0.1 77 ± 45 0.015 ± 0.003 1.3 ± 0.1 1.1 ± 0.1 MRS-1754 NECA 1.3 ± 0.1 99 ± 49 0.013 ± 0.001 1.1± 0.1 0.9 ± 0.1 MRS-1523 2Cl-IB-MECA 1.3 ± 0.1 92 ± 45 0.014 ± 0.003 1.2 ± 0.1 1.0 ± 0.1 118 119 Transporte de L-arginina en HUVEC provenientes de embarazos con diabetes gestacional (DG) en presencia o ausencia de insulina (1 nM, 8 horas), agonistas y/o antagonistas de receptores de adenosina como se describen en los métodos. Vmax, velocidad máxima. Km, constante de Michaelis-Menten. Vmax/Km, capacidad máxima de transporte. 1/C/XF, corresponde al efecto relativo para el transporte de L-arginina de las diferentes condiciones con respecto a células HUVEC controles normales sin insulina sobre la capacidad máxima de transporte (Vmax/Km); 1/Ins/XF, corresponde al efecto relativo para el transporte de Larginina de las diferentes condiciones con respecto a células HUVEC controles en presencia de insulina sobre la capacidad máxima de transporte. ZM-241385, antagonista de receptor de adenosina (RA) tipo A2A; DPCPX, antagonista de RA tipo A1; MRS-1754, antagonista de RA tipo A2B; MRS-1523, antagonista de RA tipo A3; CGS-21680, agonista de RA tipo A2A; CPA, agonista de RA tipo A1; NECA, agonista de RA tipo A2B; 2Cl-IB-MECA, agonista de RA tipo A3. 119 120 Tabla 11. Parámetros cinéticos del transporte saturable de L-arginina en presencia de agonistas y/antagonistas de receptores de adenosina en HUVEC normales knock-down para IR-B. Transporte de L-arginina Vmax (pmol/µg proteina/minuto) Km (µM) Vmax/Km (pmol/µg proteina/minuto/(µM)) 1/C/XF 1/Ins/XF Sin insulina Normal 1.0 ± 0.1 79 ± 46 0.012 ± 0.001 1.0 ± 0.1 - Control 1.0 ± 0.1 89 ± 44 0.011 ± 0.001 1.0 ± 0.1 - ZM-241385 1.0 ± 0.1 103 ± 33 0.009 ± 0.001 0.8 ± 0.1 - DPCPX 1.0 ± 0.1 92 ± 45 0.010 ± 0.001 0.9 ± 0.1 - MRS-1754 1.2 ± 0.1 83 ± 32 0.014 ± 0.002 1.3 ± 0.1 - MRS-1523 1.1 ± 0.1 74 ± 38 0.014 ± 0.002 1.3 ± 0.1 - CGS-21680 1.1 ± 0.2 104 ± 44 0.011 ± 0.001 1.0 ± 0.1 - CPA 1.2 ± 0.1 99 ± 45 0.012 ± 0.001 1.1 ± 0.1 - NECA 1.1 ± 0.1 93 ± 32 0.012 ± 0.001 1.1 ± 0.1 - 2Cl-IB-MECA 1.0 ± 0.1 110 ± 22 0.009 ± 0.001 0.9 ± 0.1 - ZM-241385 CGS-21680 1.0 ± 0.1 107 ± 33 0.009 ± 0.001 0.8 ± 0.1 - DPCPX CPA 1.1 ± 0.1 88 ± 40 0.013 ± 0.002 1.2 ± 0.1 - MRS-1754 NECA 1.0 ± 0.1 94 ± 16 0.011 ± 0.001 1.0 ± 0.1 - MRS-1523 2Cl-IB-MECA 1.1 ± 0.1 88 ± 21 0.013 ± 0.002 1.2 ± 0.1 - La tabla continúa en la próxima página. 120 121 Continuación Vmax (pmol/µg proteina/minuto) Km (µM) Vmax/Km (pmol/µg proteina/minuto/(µM)) 1/C/XF 1/Ins/XF Con insulina Control 1.3 ± 0.1 101 ± 42 0.013 ± 0.002 1.2 ± 0.1 1.0 ± 0.1 ZM-241385 0.9 ± 0.1 110 ± 49 0.008 ± 0.001 0.7 ± 0.1 0.6 ± 0.1 DPCPX 1.2 ± 0.1 99 ± 45 0.012 ± 0.002 1.1 ± 0.1 0.9 ± 0.1 MRS-1754 1.3 ± 0.1 103 ± 46 0.012 ± 0.002 1.1 ± 0.1 0.9 ± 0.1 MRS-1523 1.2 ± 0.1 89 ± 29 0.013 ± 0.002 1.2 ± 0.1 1.2 ± 0.1 CGS-21680 0.9 ± 0.1 130 ± 34 0.007 ± 0.001 0.6 ± 0.1 0.5 ± 0.1 CPA 0.9 ± 0.1 98 ± 52 0.009 ± 0.001 0.8 ± 0.1 0.7 ± 0.1 NECA 0.9 ± 0.1 110 ± 42 0.008 ± 0.001 0.7 ± 0.1 0.6 ± 0.1 2Cl-IB-MECA 0.8 ± 0.1 99 ± 33 0.008 ± 0.001 0.7 ± 0.1 0.6 ± 0.1 ZM-241385 CGS-21680 0.9 ± 0.1 106 ± 59 0.008 ± 0.001 0.7 ± 0.1 0.6 ± 0.1 DPCPX CPA 1.2 ± 0.1 99 ± 45 0.012 ± 0.002 1.1 ± 0.1 0.9 ± 0.1 MRS-1754 NECA 1.3 ± 0.1 110 ± 49 0.012 ± 0.002 1.1 ± 0.1 0.9 ± 0.1 MRS-1523 2Cl-IB-MECA 1.3 ± 0.1 109 ± 45 0.011 ± 0.001 1.0 ± 0.1 1.0 ± 0.1 121 122 Transporte de L-arginina en HUVEC provenientes de embarazos normales knock-down para IR-B en presencia o ausencia de insulina (1 nM, 8 horas), agonistas y/o antagonistas de receptores de adenosina como se describen en los métodos. Vmax, velocidad máxima. Km, constante de Michaelis-Menten. Vmax/Km, capacidad máxima de transporte. 1/C/XF, corresponde al efecto relativo para el transporte de L-arginina de las diferentes condiciones con respecto a células HUVEC controles normales sin insulina sobre la capacidad máxima de transporte (Vmax/Km); 1/Ins/XF, corresponde al efecto relativo para el transporte de Larginina de las diferentes condiciones con respecto a células HUVEC controles en presencia de insulina sobre la capacidad máxima de transporte. ZM-241385, antagonista de receptor de adenosina (RA) tipo A2A; DPCPX, antagonista de RA tipo A1; MRS-1754, antagonista de RA tipo A2B; MRS-1523, antagonista de RA tipo A3; CGS-21680, agonista de RA tipo A2A; CPA, agonista de RA tipo A1; NECA, agonista de RA tipo A2B; 2Cl-IB-MECA, agonista de RA tipo A3. 122 123 Tabla 12. Parámetros cinéticos del transporte saturable de L-arginina en presencia de agonistas y/antagonistas de receptores de adenosina en HUVEC normales knock-down para IR-A e IR-B. Transporte de L-arginina Vmax (pmol/µg proteina/minuto) Km (µM) Vmax/Km (pmol/µg proteina/minuto/(µM)) 1/C/XF 1/Ins/XF Sin insulina Normal 1.0 ± 0.1 79 ± 46 0.012 ± 0.001 1.0 ± 0.1 - Control 1.0 ±0.1 66 ± 44 0.015 ± 0.001 1.0 ± 0.1 - ZM-241385 1.0 ± 0.1 84 ± 33 0.012 ± 0.001 0.8 ± 0.1 - DPCPX 1.0 ± 0.1 65 ± 45 0.015 ± 0.003 1.0 ± 0.1 - MRS-1754 1.2 ± 0.1 69 ± 32 0.017 ± 0.003 1.1 ± 0.1 - MRS-1523 1.1 ± 0.1 67 ± 38 0.016 ± 0.003 1.1 ±0.1 - CGS-21680 1.1 ± 0.1 85 ± 44 0.013 ± 0.001 0.9 ± 0.1 - CPA 1.2 ± 0.1 82 ± 45 0.015 ± 0.003 1.0 ± 0.1 - NECA 1.1 ± 0.1 89 ± 32 0.012 ± 0.001 0.8 ± 0.1 - 2Cl-IB-MECA 1.0 ± 0.1 83 ± 22 0.012 ± 0.001 0.8 ± 0.1 - ZM-241385 CGS-21680 1.0 ± 0.1 92 ± 33 0.011 ± 0.001 0.7 ± 0.1 - DPCPX CPA 1.1 ± 0.1 79 ± 40 0.014 ± 0.003 0.9 ± 0.1 - MRS-1754 NECA 1.0 ± 0.1 83 ± 16 0.012 ± 0.001 0.8 ± 0.1 - MRS-1523 2Cl-IB-MECA 1.1 ± 0.1 78 ± 21 0.014 ± 0.003 0.9 ±0.1 - La tabla continúa en la próxima página. 123 130 Figura 39. Insulina recupera el transporte de L-arginina en HUVEC de diabetes gestacional knockdown para IR-A en presencia de un antagonista de receptores de adenosina A2A.. El transporte saturable de L-arginina fue determinado en HUVEC provenientes de embarazos con diabetes gestacional knock-down para la isoforma A del receptor de insulina (IR-A). Las células fueron incubadas en presencia de L-arginina (15-1000 µM, 3 µCi/mL L-[3H]arginina, 37°C, 1 minuto) en ausencia y presencia de agonistas (A y B; CPA 30 nM, CGS-21680 30 nM, NECA 1µM, 2Cl-IB-MECA 50 nM, 8 horas), antagonistas ( C y D; DPCPX 30 nM, ZM-241385 10 nM, MRS-1754 30 nM, MRS1523 30 nM) y las combinaciones agonistas+antagonistas (E y F) de receptores de adenosina A1 A2A, A2B y A3, respectivamente, en presencia de insulina (1 nM, 8 horas) como se describen en los métodos. (A, C, E) Los datos del transporte de L-arginina saturable fueron ajustados a una ecuación de Michaelis-Menten sin componente lineal. (B, D, F) Transformación de Eadie-Hofstee para los datos en A, C y E, respectivamente. Los valores corresponden al promedio ± S.E.M., n=6-12. 130 131 0200 400 600 800 1000 0 1 2 3 4 5 L-Arginina (M) Transporte de L-arginina (pmol/g proteina/minuto) 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0 1 2 3 4 5 Control CGS-21680CPA NECA 2Cl-IB-MECA Ad-Control Normal Ad-Control DG V (pmol/g proteina/minuto) V/[L-arginina] (pmol/g proteina/minuto/M) 0200 400 600 800 1000 0 1 2 3 4 5 L-Arginina (M) 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0 1 2 3 4 5 Control ZM-241385DPCPX MRS-1754 MRS-1523 Ad-Control Normal Ad-Control DG V/[L-arginina] (pmol/g proteina/minuto/M) 0200 400 600 800 1000 0 1 2 3 4 5 L-Arginina (M) 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0 1 2 3 4 5 Control ZM-241385+CGS-21680DPCPX+CPA MRS1754+NECA MRS1523+2Cl-IB-MECA Ad-Control Normal Ad-Control DG V/[L-arginina] (pmol/g proteina/minuto/M) Figura 40 continúa en la página 132 A C E B D F 131 132 Figura 40. El aumento del transporte de L-arginina en HUVEC de diabetes gestacional knockdown para IR-B es revertido en presencia de un antagonista de receptores de adenosina A2A.. El transporte saturable de L-arginina fue determinado en HUVEC provenientes de embarazos con diabetes gestacional knock-down para la isoforma B del receptor de insulina (IR-B). Las células fueron incubadas en presencia de L-arginina (15-1000 µM, 3 µCi/mL L-[3H]arginina, 37°C, 1 minuto) en ausencia y presencia de agonistas (A y B; CPA 30 nM, CGS-21680 30 nM, NECA 1µM, 2Cl-IB-MECA 50 nM, 8 horas), antagonistas (C y D; DPCPX 30 nM, ZM-241385 10 nM, MRS-1754 30 nM, MRS1523 30 nM) y las combinaciones agonistas+antagonistas (E y F) de receptores de adenosina A1 A2A, A2B y A3, respectivamente, como se describen en los métodos. (A,C,E) Los datos del transporte de L-arginina saturable fueron ajustados a una ecuación de Michaelis-Menten sin componente lineal. (B,D,F) Transformación de Eadie-Hofstee para los datos en A, C y E, respectivamente. Los valores corresponden al promedio ± S.E.M., n=6-12. 132 133 0200 400 600 800 1000 0 1 2 3 4 5 L-Arginina (M) Transporte de L-arginina (pmol/g proteina/minuto) 0.00 0.01 0.02 0.03 0 1 2 3 4 5 insulina CGS-21680+insulinaCPA+insulina NECA+insulina 2Cl-IB-MECA+insulina Ad-Control Normal Ad-Control DG Ad-Control DG+insulina V/[L-arginina] (pmol/g proteina/minuto/ M) V (pmol/g proteina/minuto) 0200 400 600 800 1000 0 1 2 3 4 5 L-Arginina (M) 0.00 0.01 0.02 0.03 0 1 2 3 4 5 insulina ZM-241385+insulinaDPCPX+insulina MRS-1754+insulina MRS-1523+insulina Ad-Control Normal Ad-Control DG Ad-Control DG+insulina V/[L-arginina] (pmol/g proteina/minuto/ M) 0200 400 600 800 1000 0 1 2 3 4 5 L-Arginina (M) 0.00 0.01 0.02 0.03 0 1 2 3 4 5 insulina ZM241385+CGS-21680+insulinaDPCPX+CPA+insulina MRS1754+NECA+insulina MRS-1523+2Cl-IB-MECA+insulina Ad-Control Normal Ad-Control DG Ad-Control DG+insulina V/[L-arginina] (pmol/g proteina/minuto/ M) Figura 41 continúa en la página 134 A C E B D F 133 134 Figura 41. Insulina revierte el aumento del transporte de L-arginina en HUVEC de diabetes gestacional knockdown para IR-A de manera dependiente de receptores de adenosina A1. El transporte saturable de L-arginina fue determinado en HUVEC provenientes de embarazos con diabetes gestacional knock-down para la isoforma B del receptor de insulina (IR-B). Las células fueron incubadas en presencia de L-arginina (15-1000 µM, 3 µCi/mL L-[3H]arginina, 37°C, 1 minuto) en ausencia y presencia de agonistas (A y B; CPA 30 nM, CGS-21680 30 nM, NECA 1µM, 2Cl-IB-MECA 50 nM, 8 horas), antagonistas ( C y D; DPCPX 30 nM, ZM-241385 10 nM, MRS-1754 30 nM, MRS1523 30 nM) y las combinaciones agonistas+antagonistas (E y F) de receptores de adenosina A1 A2A, A2B y A3, respectivamente, en presencia de insulina (1 nM, 8 horas) como se describen en los métodos. (A, C, E) Los datos del transporte de L-arginina saturable fueron ajustados a una ecuación de Michaelis-Menten sin componente lineal. (B, D, F) Transformación de Eadie-Hofstee para los datos en A, C y E, respectivamente. Los valores corresponden al promedio ± S.E.M., n=6-12. 134 135 0200 400 600 800 1000 0 1 2 3 4 5 L-Arginina (M) Transporte de L-arginina (pmol/g proteina/minuto) 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0 1 2 3 4 5 Control CGS-21680CPA NECA 2Cl-IB-MECA Ad-Control Normal Ad-Control DG L-Arginina (M) Transporte de L-arginina (pmol/g proteina/minuto) 0200 400 600 800 1000 0 1 2 3 4 5 L-Arginina (M) 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0 1 2 3 4 5 Control ZM-241385DPCPX MRS-1754 MRS-1523 Ad-Control Normal Ad-Control DG V/[L-arginina] (pmol/g proteina/minuto/M) V (pmol/g proteina/minuto) 0200 400 600 800 1000 0 1 2 3 4 5 L-Arginina (M) 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0 1 2 3 4 5 Control ZM-241385+CGS-21680DPCPX+CPA MRS1754+NECA MRS1523+2Cl-IB-MECA Ad-Control Normal Ad-Control DG V/[L-arginina] (pmol/g proteina/minuto/M) Figura 42 continúa en la página 136 A C E B D F 135 136 Figura 42. El aumento transporte de L-arginina en HUVEC de diabetes gestacional knockdown para IR-A e IR-B solo se bloqueó en presencia de un antagonista de receptores de adenosina A2A. El transporte saturable de L-arginina fue determinado en HUVEC provenientes de embarazos con diabetes gestacional knock-down para las isoformas A y B del receptor de insulina (IR-A+IR-B). Las células fueron incubadas en presencia de L-arginina (15-1000 µM, 3 µCi/mL L-[3H]arginina, 37°C, 1 minuto) en ausencia y presencia de agonistas (A y B; CPA 30 nM, CGS-21680 30 nM, NECA 1µM, 2Cl-IB-MECA 50 nM, 8 horas), antagonistas (C y D; DPCPX 30 nM, ZM-241385 10 nM, MRS-1754 30 nM, MRS1523 30 nM) y las combinaciones agonistas+antagonistas (E y F) de receptores de adenosina A1 A2A, A2B y A3, respectivamente, como se describen en los métodos. (A,C,E) Los datos del transporte de L-arginina saturable fueron ajustados a una ecuación de Michaelis-Menten sin componente lineal. (B,D,F) Transformación de Eadie-Hofstee para los datos en A, C y E, respectivamente. Los valores corresponden al promedio ± S.E.M., n=6-12. 136 137 0200 400 600 800 1000 0 1 2 3 4 5 L-Arginina (M) Transporte de L-arginina (pmol/g proteina/minuto) 0.00 0.01 0.02 0.03 0 1 2 3 4 5 insulina CGS-21680+insulinaCPA+insulina NECA+insulina 2Cl-IB-MECA+insulina Ad-Control Normal Ad-Control DG Ad-Control DG+insulina V/[L-arginina] (pmol/g proteina/minuto/M) V (pmol/g proteina/minuto) 0200 400 600 800 1000 0 1 2 3 4 5 L-Arginina (M) 0.00 0.01 0.02 0.03 0 1 2 3 4 5 insulina ZM-241385+insulinaDPCPX+insulina MRS-1754+insulina MRS-1523+insulina Ad-Control Normal Ad-Control DG Ad-Control DG+insulina V/[L-arginina] (pmol/g proteina/minuto/M) V (pmol/g proteina/minuto) 0200 400 600 800 1000 0 1 2 3 4 5 L-Arginina (M) 0.00 0.01 0.02 0.03 0 1 2 3 4 5 insulina ZM241385+CGS-21680+insulinaDPCPX+CPA+insulina MRS1754+NECA+insulina MRS-1523+2Cl-IB-MECA+insulina Ad-Control DG+insulina Ad-Control Normal Ad-Control DG V/[L-arginina] (pmol/g proteina/minuto/M) Figura 43 continúa en la página 138 A C E B D F 137 138 Figura 43. Insulina revierte el aumento del transporte de L-arginina en HUVEC de diabetes gestacional knockdown para IR-A e IR-B de una manera dependiente de receptores de adenosina A1. El transporte saturable de L-arginina fue determinado en HUVEC provenientes de embarazos con diabetes gestacional knock-down para la isoforma A y B del receptor de insulina (IRA+IR-B). Las células fueron incubadas en presencia de L-arginina (15-1000 µM, 3 µCi/mL L-[3H]arginina, 37°C, 1 minuto) en ausencia y presencia de agonistas (A y B; CPA 30 nM, CGS-21680 30 nM, NECA 1µM, 2Cl-IB-MECA 50 nM, 8 horas), antagonistas ( C y D; DPCPX 30 nM, ZM-241385 10 nM, MRS-1754 30 nM, MRS1523 30 nM) y las combinaciones agonistas+antagonistas (E y F) de receptores de adenosina A1 A2A, A2B y A3, respectivamente, en presencia de insulina (1 nM, 8 horas) como se describen en los métodos. (A, C, E) Los datos del transporte de L-arginina saturable fueron ajustados a una ecuación de Michaelis-Menten sin componente lineal. (B, D, F) Transformación de Eadie-Hofstee para los datos en A, C y E, respectivamente. Los valores corresponden al promedio ± S.E.M., n=6-12. 138 139 Tabla 13. Parámetros cinéticos del transporte saturable de L-arginina en presencia de agonistas y/antagonistas de receptores de adenosina en HUVEC con diabetes gestacional knock-down para IR-A. Transporte de L-arginina Vmax (pmol/µg proteina/minuto) Km (µM) Vmax/Km (pmol/µg proteina/minuto/(µM)) 1/C/XF 1/GD/XF 1/ GD-Ins/XF Sin insulin Normal 1.0 ± 0.1 79 ± 46 0.012 ± 0.001 1.0 ± 0.1 0.3 ± 0.1 - Control 4.2 ± 0.3*† 101 ± 43 0.041 ± 0.004* 3.4 ± 0.3* 1.0 ± 0.1* - ZM-241385 2.0 ± 0.5* 123 ± 61 0.016 ± 0.001*† 1.3 ± 0.1 0.4 ± 0.1 - DPCPX 4.2 ± 0.3*† 132 ± 56 0.031 ± 0.008* 2.5 ± 0.1* 0.8 ± 0.1* - MRS1754 4.1 ± 0.3*† 120 ± 63 0.034 ± 0.003* 2.8 ± 0.3* 0.8 ± 0.1* - MRS1523 4.2 ± 0.3*† 122 ± 52 0.034 ± 0.003* 2.8 ± 0.3* 0.8 ± 0.1* - CGS-21680 4.0 ± 0.3*† 134 ± 66 0.029 ± 0.002* 2.4 ± 0.2* 0.6 ± 0.1* - CPA 4.3 ± 0.3*† 133 ± 53 0.032 ± 0.003* 2.6 ± 0.3* 0.8 ± 0.1* - NECA 4.3 ± 0.3*† 122 ± 55 0.035 ± 0.003* 2.9 ± 0.3* 0.9 ± 0.1* - 2Cl-IB-MECA 4.1 ± 0.3*† 154 ± 44 0.026 ± 0.003* 2.1 ± 0.2* 0.6 ± 0.1* - ZM-241385 CGS-21680 1.8 ± 0.2* 132 ± 55 0.013 ± 0.001 1.1 ± 0.1 0.3 ± 0.1 - DPCPX CPA 4.1 ± 0.3*† 133 ± 64 0.030 ± 0.003* 2.5 ± 0.3* 0.7 ± 0.1* - MRS-1754 NECA 4.3 ± 0.3*† 142 ± 34 0.030 ± 0.003* 2.5 ± 0.3* 0.7 ± 0.1* - MRS-1523 2Cl-IB-MECA 4.0 ± 0.3*† 132 ± 66 0.030 ± 0.003* 2.5 ± 0.3* 0.7 ± 0.1* - La tabla continúa en la próxima página. 139