Efectos de la granada (Punica granatum L.) en las enfermedades inflamatorias autoinmunes

TRABAJO FIN DE GRADO Hewlett-Packard MAPI Ee Facultad de Farmacia Mª Carmen Martínez Carmona EFECTOS DE LA GRANADA (PUNICA GRANATUM L.) EN LAS ENFERMEDADES INFLAMATORIAS AUTOINMUNES o Facultad de Farmacia o Trabajo Fin de Grado o Grado en Farmacia o Efectos de la granada (Punica granatum L.) en las enfermedades inflamatorias autoinmunes o Realizado por: Mª Carmen Martínez Carmona o Tutorizado por: Dra. Marina Sánchez Hidalgo Dra. Mª Ángeles Rosillo Ramírez o Facultad de Farmacia, Departamento de Farmacología o Revisión bibliográfica o Fecha: 18/06/2018 RESUMEN Las enfermedades inflamatorias autoinmunes son cada vez más comunes en nuestra sociedad, afectando a un elevado número de personas y empeorando su calidad de vida. La ausencia de tratamientos que conduzcan a la cura de estas enfermedades, así como la agresividad de los tratamientos actuales que permiten controlar los síntomas, ha aumentado el interés por la búsqueda en la naturaleza de nuevos productos eficaces en su tratamiento, como es el caso de la granada (Punica granatum). En los últimos años se han llevado a cabo un elevado número de estudios que ponen de manifiesto el potencial terapéutico de la granada y/o sus compuestos bioactivos en la inflamación y sistema inmune. Es por ello, que el objetivo de este trabajo es recopilar las investigaciones científicas más notables del papel que desempeñan Punica granatum y sus compuestos en las enfermedades inflamatorias autoinmunes más prevalentes, así como profundizar en los mecanismos moleculares y su posible potencial terapéutico. Tanto la granada como sus compuestos bioactivos han demostrado poseer un potencial terapéutico en los estudios preclínicos de enfermedad inflamatoria intestinal, artritis reumatoide y esclerosis múltiple disminuyendo los niveles de múltiples parámetros inflamatorios, con la consiguiente atenuación de la inflamación, característica común en todas estas patologías. Entre los compuestos bioactivos de la granada, cabe destacar la acción del ácido elágico, el ácido púnico, las urolitinas y las punicalaginas, polifenoles con una alta capacidad antioxidante y antiinflamatoria. Por otro lado, los ensayos clínicos disponibles son muy limitados, sobretodo en la esclerosis múltiple (EM), pero resultan prometedores. La puesta en marcha de ensayos clínicos adicionales que refuerzan el potencial terapéutico de Punica granatum y/o sus compuestos bioactivos descrito en los estudios preclínicos resultan claves para la incorporación de éstos hoy día a la terapia convencional y/o prevención de la la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), artritis reumatoide (AR) y EM. Palabras clave: ácido elágico, autoinmune, enfermedades inflamatorias, granada, inflamación, Punica granatum. ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 1 1.1 PUNICA GRANATUM ...................................................................................................... 1 1.1.1. Características botánicas ........................................................................................ 1 1.1.2. Origen geográfico y producción ............................................................................... 1 1.1.3. Composición química de la granada ........................................................................ 1 1.1.4. Propiedades farmacológicas ................................................................................... 4 1.2 ENFERMEDADES INFLAMATORIAS AUTOINMUNES ......................................................... 5 2. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS ............................................................................................ 6 3. METODOLOGÍA ................................................................................................................ 7 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................................... 8 4.1. ARTRITIS REUMATOIDE ............................................................................................. 8 4.1.1 Estudios preclínicos .............................................................................................. 9 4.1.2. Ensayos clínicos ................................................................................................ 14 4.2 ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL ............................................................... 15 4.2.1 Estudios preclínicos ............................................................................................ 16 4.2.2 Ensayos clínicos ................................................................................................. 25 4.3. ESCLEROSIS MÚLTIPLE. ............................................................................................ 26 4.3.1. Estudios preclínicos ........................................................................................... 27 5. CONCLUSIONES .............................................................................................................. 29 6. BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................................................... 34 1 1. INTRODUCCIÓN 1.1. PUNICA GRANATUM La granada (Punica granatum L.) es una fruta cuya importancia es conocida desde la antigüedad, no sólo por su valor alimenticio sino por sus propiedades beneficiosas para la salud. Si bien, en los últimos años, se ha visto un aumento en el estudio de esta fruta, lo que ha llevado al conocimiento de muchas propiedades y a su utilización para el tratamiento y prevención de múltiples de enfermedades (Yaniv et al., 2014). 1.1.1. Características botánicas El granado, de la familia Punicaceae, es un arbusto caducifolio de 2-5 metros (m) de altura, ramas espinosas y corteza de color marrón claro, con hojas opuestas, oblongas-lanceoladas, enteras y brillantes, que miden 5 a 8 centímetros (cm) de longitud (del Villar y Melo, 2010). El fruto, la granada, es una baya, que tiene unos 12 cm de diámetro y forma hexagonal, piel rojiza y gruesa y alrededor de 600 semillas, cada una de ellas rodeada por una pulpa cargada de agua astringente, que es lo que conocemos como arilo y que varía de color de blanco a rojo oscuro o morado (Reza et al., 2012). 1.1.2. Origen geográfico y producción El origen geográfico del granado es Oriente Próximo (Yaniv et al., 2014). Se caracteriza por su capacidad de adaptación al terreno, pudiendo crecer en zonas áridas y semiáridas (Calín et al., 2015), por lo que su cultivo está ampliamente distribuido por todo el mundo. 1.1.3. Composición química de la granada Recientes ensayos preclínicos han puesto de manifiesto las extraordinarias actividades antioxidantes, anticancerosas y antiinflamatorias de este alimento funcional gracias a sus constituyentes bioactivos fundamentalmente: antocianinas (delfinidina, cianidina y pelargonidina); taninos no hidrolizables como las punicalaginas, ácido elágico y ácido gálico y otros taninos hidrolizables en adición a compuestos flavónicos (quercetina, kanferol, luteonina y miricetina), ácidos grasos 2 poliinsaturados (ácido púnico) sus derivados y metabolitos entre otros. Esta combinación de compuestos confiere a la granada unas propiedades antioxidantes muy superiores a la de otros antioxidantes (incluido el vino tinto y el té verde) que implican un potencial papel beneficioso en la prevención de patologías relacionadas con el estrés oxidativo, inmunomodulación, inflamación y cáncer (Jurenka, 2008). En cuanto a la composición química de la granada: La corteza representa el 60% de la fruta, y es rica en diversos compuestos como los que a continuación se detallan: o fenoles o flavonoides (incluyendo punicalaginas) o proantocianidinas o polisacáridos complejos o minerales: calcio, nitrógeno, potasio, magnesio, fósforo y sodio. A pesar del elevado número de compuestos que presenta la corteza, la mayoría de las propiedades biológicas asociadas a esta parte de la fruta se deben a la presencia de flavonoides y taninos. Se trata de la parte de la fruta con mayor actividad antioxidante, debido a su alto contenido en polifenoles. Los elagitaninos presentes en la corteza incluyen a la punicalgina y la punicalina, conteniendo ambos ácido gálico, que es la unidad básica para la formación de varios taninos. Ambos pueden ser hidrolizados a ácido elágico, un fenol natural con una alta actividad antioxidante. A su vez, la punicalgina está presente en las semillas, corteza y zumo de la granada, y es un compuesto exclusivo de la granada (Viladomu et al., 2013; Danesi et al; 2017). El zumo de la granada es una fuente de: o polifenoles o taninos o antocianidinas, incluyendo a las vitaminas C y E y coenzima Q10 Sus principales compuestos antioxidantes son las antocianidinas y los derivados del ácido elágico, que son los principales constituyentes del zumo y que le aportan a la fruta su color característico. Además, estas antocianidinas se han asociado a la 3 prevención de enfermedades cardiovasculares, obesidad y diabetes. El zumo de la granada es la principal fuente de ingestión de esta fruta, y sus niveles de antioxidantes son mucho más elevados que los presentes en otros zumos naturales (Viladomiu et al., 2013; Danesi et al., 2017). Las semillas de la granada, aunque sólo representan un 3% del peso de la fruta, contienen muchos otros compuestos distintos a los polifenoles que pueden contribuir a los beneficios para la salud que aporta la granada. Las semillas son una gran fuente de lípidos, presentando unos niveles altos de ácido linoleico y linolénico, así como ácido oleico, púnico y palmítico. (Viladomiu et al., 2013). En la tabla 1 se resume la composición química de la granada. Tabla 1. Composición química de Punica granatum (Tomado y adaptado de Viladomiu et al., 2013) Familia Compuesto Parte de la granada Antocianidinas Cianidina-3,5- diglucósido Delfinidina-3-glucósido Cianidina-3-glucósido Pelargonidina-3- glucósdio Corteza, semillas y zumo Corteza, semillas y zumo Corteza, semillas y zumo Corteza, semillas y zumo Taninos Punicalina Punicalgina Ácido elágico glucósido Ácido elágico Corteza, semillas y zumo Corteza, semillas y zumo Semillas y zumo Semillas y zumo Fenoles Ácido gálico Ácido cafeico Catequina Zumo Corteza y zumo Zumo Antioxidantes Ácido ascórbico Vitamina E Zumo Zumo Ácidos orgánicos Ácido cítrico Zumo 4 Ácido málico Ácido tartárico Ácido isocítrico Zumo Zumo Zumo Azúcares Glucosa Fructosa Sacarosa Sorbitol Corteza, semillas y zumo Corteza, semillas y zumo Corteza, semillas y zumo Corteza, semillas y zumo 1.1.4. Propiedades farmacológicas Son muchos los beneficios terapéuticos de la granada, que se atribuyen a distintos mecanismos, de los que destacamos los siguientes: - Acción antiinflamatoria. Esta acción es especialmente interesante en la zona intestinal, debida principalmente a los elagitaninos y antocianidinas (Colombo et al., 2013) - Acción preventiva de enfermedad cardiovascular, obesidad y diabetes, asociada a las antocianidinas (Viladomiu et al., 2013) - Acción anticarcinogénica (Yaniv et al., 2014). La granada tiene acción sobre distintos tipos de cáncer, actuando, por ejemplo, a los siguientes niveles: o Inhibiendo la metástasis del cáncer de ovario gracias a la acción del ácido elágico y la luteolina (Liu et al., 2017) o Inhibiendo la metástasis del cáncer de próstata gracias a un zumo específico de granada (Wang et al., 2012) o Acción antiangiogénica y antiproliferativa del zumo de granada sobre el mieloma múltiple (Tibullo et al., 2016) - Acción antioxidante (Viladomiu et al., 2013) -Acción antimicrobiana (Yaniv et al., 2014) y antivírica, con acción de la punicalagina coadministrada con iones de Zinc sobre el virus del Herpes Simple (Houston et al., 2017) 5 - Acción preventiva del extracto sobre la pérdida de densidad ósea (osteoporosis) (Spilmont et al., 2015) - Capacidad retentiva con el consumo del zumo de granada en pacientes de edad media y ancianos con problemas de memoria (Bookheimer et al., 2013). Además, hay estudios en ratones sobre la acción de los polifenoles de la granada en la enfermedad de Alzheimer (Rojanathammanee et al., 2013). 1.2. ENFERMEDADES INFLAMATORIAS AUTOINMUNES Las enfermedades inflamatorias autoinmunes se caracterizan por una inflamación patológica que a menudo deriva de la activación anormal de las células inmunes innatas por estímulos endógenos o exógenos (Park et al., 2012). Estas patologías afectan aproximadamente al 5-8% de la población causando morbilidad, mortalidad y pérdidas económicas significativas (Bayry and Radstake, 2013). Las enfermedades inflamatorias autoinmunes más comunes son: lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, psoriasis, esclerosis múltiple y enfermedad inflamatoria intestinal (Toussirot et al., 2018). Pese a los múltiples avances realizados en los últimos años, la etiología de estas enfermedades sigue siendo desconocida. En el origen de estas enfermedades participan múltiples factores que confluyen entre sí para dar origen a cada una de las patologías autoinmunes conocidas. Entre estos elementos se incluyen la pérdida de los mecanismos de tolerancia, factores de susceptibilidad genética (polimorfismos HLA, genes no HLA y mecanismos epigenéticos), factores ambientales (agentes vivos de enfermedad, agentes inorgánicos, hormonas y otros) y factores inmunológicos (linfocitos reguladores, citoquinas y moléculas coestimulatorias, entre otros) (Pollard et al., 2005). El tratamiento se centra en el control rápido de la inflamación y la prevención del daño tisular, con el objetivo de la remisión a largo plazo de la enfermedad, mejorando así la calidad de vida y previniendo el daño. Los principales fármacos empleados para paliar los síntomas de estas patologías son los glucocorticoides, así como la terapia biológica (Pereira et al., 2015). Aunque estos tratamientos han 12 significativa de los niveles de la citocina proinflamatoria IL-6 en el tejido articular (Shukla et al., 2008). Figura 1. Incidencia de la artritis en el grupo control y los dos grupos tratados con diferentes dosis del extracto de granada (Tomada de Shukla et al., 2008). Los macrófagos están presentes en las articulaciones de los pacientes con AR y juegan un papel fundamental en la patogénesis de dicha enfermedad (Szekanecz y Koch, 2007). Estas células activadas producen TNF-α, óxido nítrico (NO) y otros mediadores inflamatorios que exacerban la enfermedad (Figura 2). En este sentido, Shukla y colaboradores, demostraron que POMx era capaz de inhibir la activación producida por lipopolisacárido (LPS) de las vías de señalización: factor nuclear kappa B (NF-κB) y las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK), así como, inhibir la activación de ciertos factores de transcripción y la producción de NO en macrófagos murinos (Shukla et al., 2008). De este modo, estos autores afirman que la inhibición de la activación de los macrófagos por POMx podría contribuir a los efectos antiartríticos de este extracto, demostrados en el modelo de CIA. Figura 2. POMx inhibe la producción de NO inducida por LPS en macrófagos de ratón (Tomada de Shukla et al., 2008). 13 De forma similar, un reciente estudio de 2018 ha demostrado que la fracción butanólica de un extracto de la corteza de Punica granatum L. administrado a las dosis de 50 y 75 mg/Kg fue capaz de reducir los signos y síntomas de la enfermedad, disminuyendo la inflamación articular en un modelo de AR experimental inducido por adyuvante completo de Freund en ratas (Gautam et al., 2018. Igualmente, ha sido puesto de manifiesto el efecto del ácido elágico en la prevención y/o tratamiento de la AR experimental inducida por adyuvante en ratones por Allam y colaboradores en 2016. Para ello, trataron a los animales con ácido elágico adminsitrado por vía intraperitoneal a la dosis de 700 mg/Kg, una semana antes de la inducción de la enfermedad y lo continuaron durante tres semanas después. El tratamiento con el ácido elágico inhibió la hinchazón edematosa de la pata y atenuó la patología asociada a la AR experimental. Esto estuvo acompañado por una disminución significativa de los niveles séricos de las citocinas pro-inflamartorias: TNF-α, IL-1β e IL-17, sin embargo produjo un aumento en los niveles séricos de las citocinas anti-inflamatorias: IL-10 e interferón gamma (IFN-γ) (Allam et al., 2016). La IL-17 es una citocina que desempeña un papel crucial en el desarrollo de la AR mediante la activación de respuestas inmunes celulares y humorales específicas de autoantígenos (Lubberts et al., 2004). Se ha demostrado que la IL-17 impulsa la diferenciación, maduración, activación y liberación de citoquinas de los neutrófilos; activa a los monocitos y fibroblastos sinoviales, facilitando la liberación de quimiocinas, prostaglandinas y favorece la síntesis de MMP, implicadas en la destrucción del cartílago (Weaver et al., 2007). Por tanto, su inhibición resulta de gran interés para inhibir la inflamación y el daño articular (Allam et al., 2016). En el estudio llevado a cabo por Lubberts et al., profundizaron en el efecto del ácido elágico sobre la inhibición de la producción de IL-17. Jean-Gilles y colaboradores, estudiaron el efecto anti-inflamatorio de la punicalagina sobre un modelo de AR inducida por adyuvante en ratones. Estos autores, probaron dos dosis de punicalagina 10 y 50 mg/Kg administrada por vía intraperitoneal. Descubrieron, que la dosis de 10 mg/kg, no producía una mejora en los signos y síntomas clínicos de la enfermedad, por el contrario, la dosis de 50 mg/Kg redujo de forma significativa el edema de las patas de los animales, sin embargo, se 14 encontraron con que la dosis más alta, provocaba la muerte de 1 de cada 3 animales, con lo que concluyeron que tendrían que repetir el ensayo, con dosis mayores que 10 mg/Kg, pero menores a 50 mg/Kg (Jean-Gilles et al., 2013). 4.1.2. Ensayos clínicos A día de hoy, existen 2 ensayos clínicos realizados con extracto de granada. En 2011 se realizó un estudio piloto, cuyo objetivo era determinar los posibles efectos beneficiosos de un extracto de granada sobre los parámetros clínicos en la AR activa, basados en el estado oxidativo del suero (Balbir-Gurman et al., 2011). Este estudio se llevó a cabo en 8 pacientes (mujeres post-menopáusicas) que consumieron 10 mL de extracto de granada al día, durante 12 semanas. 6 pacientes completaron el estudio. El consumo del extracto de granada redujo el índice de actividad de la enfermedad (DAS28) en un 17%. Esta reducción del DAS28 se podría atribuir a una marcada disminución en el número de articulaciones sensibles y el ratio de sedimentación de eritrocitos, sin embargo la escala analógica visual del conjunto de los pacientes o el número de articulaciones inflamadas, no se vieron afectados. La mejora de los parámetros clínicos de la AR después del tratamiento con el extracto de granada, estuvo acompañado de una mejora en los índices de estrés oxidativo sérico, medido como niveles de peroxidación lipídica, concentración sérica de grupos sulfidrilos y la actividad de la paraoxonasa asociada a lipoproteínas de alta densidad 1 arilesterasa. Una limitación de este estudio fue el bajo número de pacientes (Balbir-Gurman et al., 2011). Por otro lado, en 2017 se llevó a cabo otro un ensayo clínico doble ciego ramdomizado, donde el grupo de pacientes con AR fueron asignados a dos grupos de forma aleatoria. Los pacientes recibieron dos cápsulas con 250 mg extracto de granada o celulosa como placebo, diariamente, durante 8 semanas. Tras el tratamiento, demostraron que el suplemento con extracto de granada era capaz de reducir la actividad de la enfermedad, incluyendo el número de ariculaciones sensibles e inflamadas, la intensidad del dolor y el ratio de sedimentación de eritrocitos. Además, la puntuación en el cuestionario de la evolución de la salud, la 15 rigidez matutina y los niveles de peróxido de glutatión fueron mejores en el grupo que recibió el tartamiento en comparación con el grupo placebo. Sin embargo, no se encontraron cambios en los niveles séricos de MMP-3, proteína C reactiva y malondialdeido (Ghavipou et al., 2017). 4.2 ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL Bajo la denominación común EII se incluyen a las enfermedades inflamatorias del intestino, grueso principalmente, de etiología desconocida y de evolución crónica, caracterizada por períodos de remisiones y de exacerbaciones. Se distinguen fundamentalmente dos tipos de afectación inflamatoria: la Colitis Ulcerosa (CU) y la Enfermedad de Crohn (EC), que comparten aspectos epidemiológicos y presentan síntomas clínicos, signos radiológicos y hallazgos anatomopatológicos comunes. Sin embargo ambas enfermedades se diferencian principalmente en su localización, forma de afectar el espesor de la pared intestinal, y en las diferentes complicaciones locales y respuestas a la cirugía. Las manifestaciones extraintestinales que pueden presentar estas patologías con frecuencia siguen un curso recidivante (Szigethy et al., 2010). En España, la tasa de incidencia de la EII ha aumentado en los últimos años (López- Serrano et al., 2009). Si bien, las causas fisiopatológicas de la EII permanecen sin conocerse y, en consecuencia, seguimos sin disponer de un tratamiento curativo, los últimos años han aportado importantes avances en el conocimiento de sus mecanismos patogénicos. En este sentido, se considera que estas enfermedades son la consecuencia de una compleja interacción entre factores genéticos, medioambientales, microbiológicos e inmunes. Las estrategias más importantes del tratamiento farmacológico de la EII son la antiinflamatoria y la inmunomoduladora. El mayor conocimiento de los mecanismos patogénicos de la EII ha permitido el desarrollo de fármacos de diseño eficaces, que son fruto de la industria biotecnológica, fármacos biológicos (Rawla et al; 2018). Estudios epidemiologicos y experimentales han mostrado que existe una estrecha relacion entre los habitos alimentarios y el riesgo a padecer ciertas enfermedades. En general, se acepta que el consumo de alimentos derivados de productos vegetales como el vino, frutas, hortalizas, frutos secos, cereales, legumbres, 16 especias, etc (abundantes en la dieta mediterranea) se asocia con efectos beneficiosos sobre la salud, particularmente sobre enfermedades como la EII (Espín et al., 2007). De este modo, alimentos ricos en compuestos fenólicos, como la granada, parecen ser beneficiosos para el tratamiento de la EII, ya que poseen propiedades antiinflamatorias e inmunomoduladoras. Estos compuestos fenólicos suelen tener una eficiencia de absorción baja, por lo que éstos o sus metabolitos llegan al intestino en concentraciones altas, resultando de gran interés para el tratamiento de estas enfermedades. La granada es rica en elagitaninos, que son los precursores del ácido elágico. Así, los elagitaninos se hidrolizan a lo largo del tracto digestivo y liberan el ácido elágico. Tanto los elagitaninos como el ácido elágico son a su vez metabolizados a urolitinas, que son derivados de las dibenzopiranonas, gracias a la acción de una serie de bacterias. Las principales urolitinas que se producen son la Uro-A y la Uro-B, a las que se han asociado potentes propiedades anti-inflamatorias (Espín et al., 2007). Hasta la fecha existen estudios preclínicos y clínicos que ponen de manifiesto el poder beneficioso que ejerce la granada o sus compuestos aislados en el tratamiento de la EII. 4.2.1 Estudios preclínicos 4.2.1.1. In vitro En un estudio llevado a cabo por Giménez Bastida y colaboradores (Giménez- Bastida et al., 2012), pusieron de manifiesto el efecto anti-inflamatorio del ácido elágico y las urolitinas Uro-A y Uro-B en un cultivo celular de fibroblastos humanos de colon (CCD18-Co) estimulados con IL-1β o TNF-α; este efecto antiinflamatorio se vio acompañado de una inhibición de la migración de los fibroblastos y una disminución en la adhesión de monocitos a los fibroblastos. Los fibroblastos colónicos fueron estimulados con IL-1β, dando lugar a un aumento marcado en la producción de PGE2. Por el contrario, el tratamiento de dichas células con la mezcla de metabolitos (Uro-A, Uro-B y ácido elágico, 40, 5 y 1 μM, respectivamente), consiguió disminuir significativamente los valores de PGE2. Por otro lado, el tratamiento con Uro-A o Uro- B, también consiguió disminuir los niveles del ecosanoide. Sorprendentemente, tras 17 tratar las céluas con ácido elágico no se observó ningún cambio significativo sobre los niveles de PGE2 (Figura 3). Figura 3. Efecto de Uro-A, Uro-B y ácido elágico sobre los niveles de PGE2 (Tomada de Giménez-Bastida, 2012) Además, estos autores demostraron la capacidad de las urolitinas y del ácido elágico para inhibir la migración celular de los fibroblastos inducida por IL-1β o TNF-α (Figura 4). El inhibidor del activador del plasminógeno-1 (PAI-1) es una molécula que se asocia a reacciones inflamatorias de la mucosa del intestino y juega un papel regulador en la migración de fibroblastos (Giménez-Bastida et al., 2009). En concordancia con esto, demostraron que la migración de los fibroblastos inducida por IL-1β y TNF-α, estuvo acompañada por un aumento de los niveles de PAI-1, sin embargo el tratamiento con la mezcla de los metabolitos o la Uro-A, redujo de forma significativa los niveles de esta molécula. Finalmente, expusieron que el ácido elágico, Uro-A y la mezcla de metabolitos, inhibía la adhesión de macrófagos THP-1 con fibroblastos de colon (Figura 5); esto estuvo acompañado por una disminución de los niveles de las quimiocinas o moléculas de adhesión: IL-8, CCL2, ICAM-1 y VCAM. 18 Figura 4. Efecto en la migración de los fibroblastos de colon tras una inducción de la migración de éstos, en un caso con IL-1beta y en otro con TNF-alfa (Tomada de Giménez-Bastida, 2012). Figura 5. Efecto de las urolitinas y/o el ácido elágico sobre la adhesión de monocitos a fibroblastos de colon previamente estimulados con IL-1beta o TNF-alfa (Tomada de Giménez-Bastida, 2012). Hollebeeck y colaboradores (Hollebeeck et al., 2012), pusieron de manifiesto el potencian antiinflamatorio de un extracto de la cáscara de la granada así como de la punicalagina aislada en un modelo in vitro de epitelio intestinal humano, usando la línea celular Caco-2 en cámaras bilaterales. Los tratamientos con el extracto de cascara de granada (0.1 mg/mL (conteniendo 8µM de punicalagina) o punicalagina (50µM), se realizó por el lado apical de la cámara, representando la luz intestinal. El estímulo, una mezcla de citocinas pro-inflamatorias (IL-1β, TNF-α e INF-γ) fue añadido por el lado basolateral de la cámara, sim embargo la adicción de LPS se realizó por el lado apical. 19 Tras el tratamiento con el extracto de granada o la punicalagina, sobre las células inflamadas, encontraron una disminución en la transcripción de los genes que codifican IL-6 y MCP-1, mientras que la transcripción de IL-8 no se vio afectada. Ambos tratamientos también disminuyeron de forma dosis-dependiente los niveles de las citocinas IL-6, IL-8 y MCP-1, pero sólo en el compartimento apical. 4.2.1.2. In vivo De igual manera, se disponen de estudios in vivo (Tabla 4) que ponen de manifiesto las propiedades anti-inflamatorias de los elagitaninos y las urolitinas de la granada en modelos de EII. Los estudios preclínicos en modelos animales de inflamación intestinal han generado hallazgos novedosos en varias áreas de investigación (Bamias, 2017). Larrosa y colaboradores demostraron in vivo los efectos anti-inflamatorios del extracto de granada (250 mg/kg/día) y de su metabolito Uro-A (15 mg/kg/día) en ratas. Los resultados de este estudio demostraron que tanto el extracto como la Uro-A conseguían inhibir la producción de NO y disminuir los niveles de PGE2, al igual que los estudios in vitro anteriormente tratados en el presente trabajo. Además, este estudio fue el primero que demostró que un tratamiento previo a la inducción de la colitis con el extracto y la Uro-A era capaz de modular la microbiota, aumentando los niveles de lactobacilos y bifidobacterias (Larrosa et al., 2010). Tabla 4. Propiedades anti-inflamatorias de los elagitaninos y las urolitinas de la granada, demostradas por estudios in vivo Compuesto/Alimento Modelo animal Efecto Ácido elágico Ratas albinas Wistar con cáncer de colon Disminución de: • iNOS • COX-2 • IL-6 • TNF-α Uro-A y Uro-B Ratas Sprague-Dawley sanas Aumento de: • CYP1A1 en mucosa colónica Extracto de granada y Colitis inducida con DSS en Disminución de: 20 Uro-A ratas Fisher F344 • COX-2 • PGE2 • iNOS Uro-A Ratas con edemas producidos por carragenanos Disminución del: • volumen de los edemas El estudio llevado a cabo por Ogawa y colaboradores, demostró el efecto protector del ácido elágico en un modelo de colitis experimental inducida con dextrano sulfato de sodio (DSS) en ratas. Asimismo, estos autores consiguieron una optimización de esta actividad antiinflamatoria mediante la administración de ácido elágico formulado en microesferas (10 mg/kg de ácido elágico) al día. Estas microesferas tenían la capacidad de disolverse cerca de la válvula ileo-cecal y así distribuirse al íleon terminal y al colon selectivamente. Esta acción antiinflamatoria selectiva local del ácido elágico permitió reducir los daños provocados por el DSS de forma dosis-dependiente, disminuyendo la actividad MPO así como la peroxidación lipídica en la mucosa colónica (Ogawa et al., 2002). De forma similar, en los estudios llevados a cabo por Kim y colaboradores, el tratamiento con una bebida de granada (que contenía ácido elágico y elagitaninos) en aquellas ratas colíticas sometidas a DSS, demostró ejercer un marcado efecto antiinflamatorio al reducir significativamente los niveles de las citocinas pro-inflamatorias TNF-α e IL-1β que se vio acompañado de la reducción de la expresión de las enzimas COX-2 e iNOS (Kim et al., 2017). Del mismo modo, Singh y colaboradores demostraron la capacidad del extracto de granada y su fracción rica en ácido elágico (100 y 200 mg/kg) para reducir la colitis inducida con DSS, la cual fue comparable al tratamiento con sulfasalazina (100 mg/kg) y cromoglicato sódico (40 mg/kg) reduciendo significativamente los niveles de histamina, MPO y estrés oxidativo, con su consiguiente efecto anti-inflamatorio (Singh et al., 2009). En esta misma línea, Rosillo y colaboradores, evaluaron inicialmente el efecto protector del ácido elágico (10-20 mg/kg/día) en un modelo murino de EC aguda inducida por ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS) (Rosillo et al., 2011). Además, estos autores describieron posteriormente la atenuación que producía el tratamiento 21 dietético del extracto de granada solo (250 mg/kg/día) o enriquecido en ácido elágico (10 mg/kg/día) empleando el mismo modelo de inflamación colónica descrito con anterioridad (Rosillo et al., 2012). El estudio macroscópico de las muestras colónicas reveló un aumento de la relación peso del colon/longitud del colon en los animales con lesiones en el mismo, de tal forma que este incremento se relacionó directamente con la inflamación, mientras que en los grupos tratados con ácido elágico se observó una disminución de dicha relación, poniendo de manifiesto su acción protectora. Además, el tratamiento con ácido elágico redujo considerablemente el daño tisular en el colon por medio de la observación de las heridas producidas tras la instilación de TNBS (Figura 6) (Rosillo et al., 2011). Figura 6. Efectos de la administración de ácido elágico en la ulceración del colon de ratas (Tomada de Rosillo et al., 2011). Este mismo efecto beneficioso tras la administración oral de ácido elágico se observó en aquellos animales que habían recibido una dieta enriquecida en dicho polifenol y/o extracto de granada. Este estudio permitió valorar la capacidad del tratamiento con extracto de granada y enriquecido en ácido elágico, de disminuir el daño colónico en comparación con la administración exclusiva de ácido elágico (Figura 7). Como podemos observar en la Figura 7, el tratamiento dietético con extracto de granada y ácido elágico, redujo la severidad y extensión del daño colónico inducido mediante TNBS en ratas (Rosillo et al., 2012). 28 Más concretamente, se observó que la nanoemulsión, incluso a una menor dosis que PSO, consiguió reducir la peroxidación lipídica de manera más efectiva que el tratamiento dietético con el aceite natural. Estos resultados indican que la oxidación lipídica inicial no destaca en la activación inicial de células inmunitarias, pero que puede tener un papel fundamental en la posterior desmielinización. Las lipoproteínas oxidadas son neurotóxicas y proinflamatorias, por lo que los productos derivados de la peroxidación lipídica podrían tener un papel fundamental en la desmielinización y el daño axonal. Por tanto, y debido a la falta de toxicidad de esta nanoemulsión, sería una buena opción de tratamiento al comienzo de las enfermedades desmielinizantes, como es el caso de la EM. Cuando la enfermedad esté más avanzada, sería más conveniente la combinación de esta nanoemulsión con tratamientos avanzados para esta enfermedad, como por ejemplo el natalizumab. En esta línea, recientes estudios se han centrado en el estudio de la actividad neuroprotectora de diversos compuestos bioactivos de Punica granatum, como el ácido elágico, sobre la pérdida de esfingolípidos asociados a la mielina que tiene lugar tras la inducción de una EAE experimental (Busto et al., 2018). En este estudio, se comprobó que los síntomas asociados a la EAE aparecían 8 días tras la inducción de la enfermedad experimental, alcanzando un pico en 3 días, coincidiendo con la reducción de la proteína básica de mielina (MBP) (fase aguda de la enfermedad). Además de la MBP, los esfingolípidos son los otros principales componentes de la mielina, y también se observó una reducción del nivel de éstos en la fase aguda de la enfermedad, tanto en corte cerebral como en la médula espinal. Por el contrario, en aquellas ratas recibieron ácido elágico (10mg/kg/día) incorporado en el agua de bebida durante dos días antes de la inducción de la EAE experimental se retrasó el comienzo de la enfermedad y los síntomas se redujeron, comprobando que los niveles de MBP y esfingolípidos no experimentaron la reducción observada en el grupo de animales sometidos a EAE que no habían recibido tratamiento con ácido elágico, de forma que el grupo tratado no experimentó una la pérdida de peso o la inflitración de células inflamatorias T-CD3+ que se observó en el grupo no tratado. Asimismo, el tratamiento con ácido elágico ejerció un efecto neuroprotector tras la administración de cuprizona al 0.2% administrada durante cuatro semanas en la 29 comida para inducir la depleción de oligodendrocitos en ratones (Sanadgol et al., 2017). El análisis de la glicoproteína de mielina oligodendrocítica (MOG), reveló una disminución de dichos valores en aquellas ratas en las que se indujo las desmielinización. Por el contrario, en los grupos de ratas tratadas con ácido elágico (40 u 80 mg/kg/día) hubo una gran diferencia de respuesta en función de la dosis empleada. Concretamente, la dosis de 80/mg/kg/día promovió un incremento de MOG acompañado de una disminución de la apoptosis. La IL-17 es una citocina esencial para el desarrollo de la desmielinización de manera que una disminución de sus niveles resulta esencial para evitar el proceso, mientras que la sobreexpresión de IL-11 ha demostrado limitar la desmielinización por disminución de la microgliosis y de la muerte de ologondendrocitos al poseer efectos reparadores espontáneos. En base a los estudios publicados, altas dosis ensayadas de ácido elágico han demostrado ejercer un efecto antiinflamatorio y profiláctico de la desmielinización, al reducir significativamente la expresión de IL-17 e incrementar los niveles de IL-11, limitando con ello la pérdida de oligodendrocitos y evitando asi la correspondiente desmielinización. En cuanto a los estudios de apoptosis celular, los oligodendrocitos maduros procedentes de aquellos animales tratados con cuprizona durante 4 semanas provocaron la sobreexpresión de la caspasa-3, mientras que en los procedentes de animales que recibieron tratamiento con ácido elágico a alta dosis, los niveles de esta caspasa se vieron notablemente reducidos, demostrando el efecto protector de este polifenol. 5. CONCLUSIONES A raíz de los datos obtenidos en la presente revisión, podemos concluir: 1. Existe un elevado número de estudios preclínicos que demuestran los efectos beneficiosos de Punica granatum y/o sus componentes bioactivos en el tratamiento y/o prevención de las enfermedades inflamatorias autoinmunes más prevalentes. La mayoría de los datos disponibles proceden de modelos animales experimentales y se centran particularmente en los modelos de EII y AR, seguido de la EM experimental. 30 2. La mayoría de las propiedades beneficiosas de Punica granatum en la EII, AR y EM son atribuidas a su alto contenido en polifenoles, destacando fundamentalmente el papel del ácido elágico, el cual reduce la producción de mediadores proinflamatorios, tales como, TNF-α, IL-1β e IL-17, entre otros, a través del bloqueo de las vías de señalización protagonizadas por el NF-KB y las MAPK. No obstante, cabe mencionar también el efecto beneficioso de las punicalaginas, las urolitinas y del ácido púnico, ácido graso poliinsaturado, clave en la EM experimental. 3. Los ensayos clínicos disponibles son muy limitados, sobretodo en la EM, pero resultan prometedores y refuerzan el potencial terapéutico de Punica granatum y/o sus compuestos bioactivos descrito en los estudios preclínicos. 4. Resulta esencial la puesta en marcha de ensayos preclínicos y clínicos adicionales que permitiesen confirmar el efecto beneficioso de Punica granatum y/o sus compuestos bioactivos y la incorporación de éstos hoy día a la terapia convencional y/o prevención de la EII, AR y EM. (Anexo I). Resumen de los ensayos llevados a cabo con Punica granatum o alguno de sus componentes en la artritis, EII y la esclerosis múltiple. Patología Parte de la granada o componente Dosis Tipo de sistema Mecanismo de acción ARTRITIS In vivo Extracto 13.6 ó 34 mg/kg Ratones DBA/1Lac Disminución de la expresión de: • IL-1β • • IL-6 • TNF-α Ácido elágico 58,33 mg/kg (3dosis/semana) Roedores MF1 Disminución de: • TNF-α • IL-1β 31 • IL-17 • PG • MMP Inhibición de: • NF-kB Extracto 50 y 75 mg/kg ratas Disminución de: • IL-1β • TNF-α Punicalagina 50 mg/kg Roedores Disminución de: • edema • IL-1 • Liberación de proteoglicanos ARTRITIS in vitro Punicalagina Colágeno II Inhibición de: • degradación colágeno • MMP-13 • IL-1β • MMP-12 yMMP- 9 Delfinidina 10-100 μM Células MH7A Inhibición de: • HAT • NF-kB • COX-2, MAPKK-4 y PI-3 Zumo (delfinidina) 10 y 13 μM Células MH7A Disminución de la expresión de: • IL-1 e IL-6 • COX-2 y NF-kB 32 Artritis ensayos clínicos Extracto fluido 100 mL Personas Disminución de: • DAS28 • estrés oxidativo • peroxidación lipídica Extracto 250 mg Personas Disminución de: • actividad de la enfermedad • dolor • inflamación articular EII in vitro EII in vivo Urolitinas Ay B Uro-A: 40 μM Uro-B: 5 μM Ácido elágico: 1 μM Línea celular humana CCD18- Co Disminución de la expresión de: • PGE2 • IL-8 Disminución de: • migración celular • Adhesión de monocitos Extracto 50 μM punicalagina Células intestino humano Inhibición: • TNF-α • IL-1β Ácido elágico 10-20 mg/kg Ratas Wistar Disminución de la expresón de: • COX-2 • NOS Disminución de la activación de: • p38 • JNK • MAPKs • NF-kB 33 AE microesferas 10 mg/kg/día Ratones Disminución actividad MPO Extracto granada Uro-A 250 mg/kg/día 15 mg/kg/día Ratas Disminución: • NO • PGE2 AE Fracción rica en AE 100 mg/kg/día 200 mg/kg/día Ratones Disminución de: • Histamina • MPO • EStrés oxidativo AE EG AE + EG 10 mg/kg 250 mg/kg 500 mg/kg 10 mg/kg + 250 mg/kg Ratas Wistar Disminución de la expresión de: • COX-2 • NOS Disminución de: • MAPKs Prevención de la traslocación de: • NF-kB Ensayos clínicos AR Zumo 125 mL Personas Por confirmar Extracto acuoso 6g piel/día Personas Disminución de: • medicación antidiarreica • sangrado rectal Mejoría: • bienestar general • incontinencia fecal Aceite de la semilla (ácido púnico) 100-300 microlitros Ratones C57BL/6 Disminución de los niveles de: • MDA • lipoproteínas oxidadas • daño axonal 34 Esclerosis múltiple In vivo Ácido elágico 10 mg/kg/día Ratas Disminución en la reducción de los niveles de MBP Aumento del nivel de esfingolípidos Ácido elágico 80 mg/kg/día Ratones Disminución de expresión: • IL-17 Aumento de expresión: • IL-11 • Caspasa-3 6. BIBLIOGRAFÍA - Akhtar N, Khan NM, Ashruf O, Haqqi TM. Inhibition of cartilage degradation and suppression of PGE2 and MMPs expression by Pomegranate Fruit Extract in a model of Post-Traumatic Osteoarthritis. Nutrition. 2017; 33: 1-13. - Allam G, Mahdi EA, Alzahrani AM, Abuelsaad AS. Ellagic acid alleviates adjuvant induced arthritis by modulation of pro- and anti-inflammatory cytokines. Cent Eur J Immunol. 2016; 41(4): 339-349. - Balbir-Gurman A, Fuhrman B, Braun-Moscovici Y, Markovits D, Aviram M. Consumption of pomegranate decreases serum oxidative stress and reduces disease activity in patients with active rheumatoid arthritis: a pilot study. Eur J Nutr. 2017; 71: 92-96. - Bamias G, Arseneau KO, Cominelli F. Mouse models of inflammatory bowel disease for investigating mucosal immunity in the intestine. Curr Opin Gastroenterol. 2017; 33(6): 411-416. 35 - Bayry J, Radstake TR. Immune-mediated inflammatory diseases: progress in molecular pathogenesis and therapeutic strategies. 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