Vida intracelular de "Corynebacterium pseudotuberculosis"

TESIS DOCTORAL JUSTO VALDIVIA ZEVALLOS 2015 VIDA INTRACELULAR DE CORYNEBACTERIUM PSEUDOTUBERCULOSIS Justo D. Valdivia Zevallos (Tesis Doctoral 2015) La infección por C. pseudotuberculosis tiene enorme trascendencia en medicina veterinaria. La difusión intraorgánica del agente causal se ve facilitada por la supervivencia en el interior de los macrófagos, actuando como un parásito intracelular facultativo. Pero de esta vida intracelular se desconocen muchos aspectos necesarios para entender la interacción parásito-hospedador. En el presente trabajo hemos pretendido estudiar in vitro la interacción de cepas clínicas y de referencia de C. pseudotuberculosis con células no fagocíticas, analizar de forma comparada la interacción de esta bacteria con fagocitos murinos, ovinos y caprinos y el efecto bactericida del suero de cabra y oveja sobre este patógeno. Todas las cepas utilizadas fueron identificadas mediante métodos bioquímicos convencionales, así como mediante una PCR-multiplex para regiones específicas de los genes 16S rRNA y PLD. Todas las cepas utilizadas en el presente trabajo son nitrato reductasa negativas y, por tanto, se corresponden con C. pseudotuberculosis biovar ovis. La invasión celular de esta bacteria sobre la línea celular no fagocítica FLK-BLV-044, replicándose ligeramente hasta las 24 horas y permaneciendo viable durante al menos 6 días. Los porcentajes de adherencia varían entre el 2 y el 1,5%, aunque no se observen diferencias estadísticamente significativas. La tasa de invasión disminuye de forma estadísticamente significativa por la presencia de azúcares. La bacteria se replica ligeramente hasta las 24 horas postinfección. La tasa de proliferación intracelular se situó alrededor de 1,08. La tasa de fagocitosis de las cepas de C. pseudotuberculosis sobre la línea celular macrofágica J774 se encuentra entre 50,9 y el 66,6%. Los índices de proliferación intracelular quedaron establecidos en 0,26, lo cual indica que la bacteria no se replica activamente en el interior del macrófago, pero sí se produce la persistencia de, al menos, 72 horas postinfección. Ninguna de las cepas utilizadas produjo inhibición de la producción del contenido de peroxidasa. También se observó inhibición de la explosión respiratoria de los fagocitos de oveja. Las cuatro cepas de C. pseudotuberculosis fueron susceptibles al efecto bactericida del suero de cabra mientras que, paralelamente, las mismas cepas analizadas fueron resistentes al efecto bactericida del suero de oveja. Dª MARÍA SORAYA DÉNIZ SUÁREZ, SECRETARIA DEL INSTITUTO UNIVERSITARIO DE SANIDAD ANIMAL Y SEGURIDAD ALIMENTARIA DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA. CERTIFICA Que el consejo de Doctores del Departamento en su sesión de fecha de febrero de 2015 tomó el acuerdo de dar el consentimiento para su tramitación, a la tesis doctoral titulada: “Vida intracelular de Corynebacterium pseudotuberculosis”, presentada por el doctorando D. Justo Darío Valdivia Zevallos, dirigida por el Catedrático D. Fernando Real Valcárcel y por los doctores D. Daniel Padilla Castillo y Dª Begoña Acosta Hernández. Y para que así conste, y a efectos de lo previsto en el Art° 73.2 del reglamento de Estudios de Doctorado de esta Universidad, firmo la presente en Las Palmas de Gran Canaria, a 20 de febrero de dos mil quince. Anexo II UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA Instituto Universitario de Sanidad Animal y Seguridad Alimentaria PROGRAMA DE DOCTORADO EN SANIDAD ANIMAL Y SEGURIDAD ALIMENTARIA Título de la Tesis “Vida intracelular de Corynebacterium pseudotuberculosis” Tesis Doctoral presentada por D. Justo Darío Valdivia Zevallos Dirigida por el Catedrático D. Fernando Real Valcárcel y los Doctores D. Daniel Padilla Castillo y Dª Begoña Acosta Hernández El Director Fernando Real Valcárcel El Director Daniel Padilla Castillo La Directora Begoña Acosta Hernández El Doctorando Justo Darío Valdivia Zevallos Arucas, a 28 de Febrero de 2015 D. FERNANDO REAL VALCÁRCEL, CATEDRÁTICO DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA EN EL DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA ANIMAL, PRODUCCIÓN ANIMAL, BROMATOLOGÍA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS DE LA FACULTAD DE VETERINARIA. INFORMA: Que la presente tesis doctoral titulada “Vida intracelular de Corynebacterium pseudotuberculosis” realizada por D. Justo Darío Valdivia Zevallos, Licenciado en Veterinaria, para optar al grado de Doctor por la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, ha sido realizada bajo mi dirección y considerando que reúne las condiciones y calidad científica para optar al grado de Doctor, autorizo su presentación para que pueda ser juzgada por el tribunal correspondiente. Y para que así conste, firmo la presente en Arucas, a 28 de febrero de 2015. Fdo. Fernando Real Valcárcel ÍNDICE ÍNDICE DE TABLAS I ÍNDICE DE FIGURAS II I.-INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS 1 II.-REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 4 II.1.- La seudotuberculosis por Corynebacterium pseudotuberculosis 4 II.1.1.- Etiopatogenia de la enfermedad 4 II.1.1.1.- Puerta de entrada del patógeno 5 II.1.1.2.- Localización de la infección 7 II.1.1.3.- Factores de virulencia de C. pseudotuberculosis 8 II.1.1.3.1.- Efecto de la exotoxina fosfolipasa D 8 II.1.1.3.2.- Ácidos micólicos 9 II.1.2.- Otros aspectos de la enfermedad 10 II.2.- Aplicaciones actuales del cultivo celular a la investigación biosanitaria 20 II.3.- Procesos de adherencia e invasión celular por las bacterias 23 II.3.1.- Adherencia celular 23 II.3.2.- Invasión celular 25 II.4.- Explosión respiratoria y contenido en peroxidasa 28 III.-MATERIAL Y MÉTODOS 29 III.1.- Cepas de Corynebacterium pseudotuberculosis utilizadas 29 III.1.1.- Aislamiento e identificación de C. pseudotuberculosis 29 III.1.2.- Conservación de las cepas 31 III.1.3.- Perfil de resistencia antibiótica 31 III.2.- Estudio de la de adherencia e invasión celular de Corynebacterium pseudotuberculosis en línea celular no fagocítica 32 III.2.1.- Línea celular 32 III.2.2.- Curva de crecimiento de C. pseudotuberculosis 32 III.2.3.- Determinación de las tasas de adherencia e invasión celular de C. pseudotuberculosis en la línea celular FLK-BLV-044 33 18 III.2.4.- Determinación del tiempo de infección en la invasión de C. pseudotuberculosis en la línea celular FLK-BLV-044 34 III.2.5.- Efecto de la concentración del inóculo en la invasión de C. pseudotuberculosis en la línea celular FLK-BLV-044 34 III.2.6.- Persistencia intracelular de C. pseudotuberculosis y tasa de replicación intracelular (Índice IPRO) en la línea celular FLK-BLV-044 34 III.2.7.- Efecto de la preincubación con antisuero de conejo frente a C. pseudotuberculosis en la línea celular FLK-BLV-044 35 III.2.8.- Determinación del efecto de la incubación celular a 4ºC en la invasión de C. pseudotuberculosis en la línea celular FLK-BLV-044 37 III.2.9.- Determinación del efecto de la presencia de azúcares en la invasión de C. pseudotuberculosis en la línea celular FLK-BLV-044 37 III.2.10.- Estudio de la adherencia e invasión de C. pseudotuberculosis en la línea celular FLK-BLV-044 Mediante inmunofluorescencia 38 III.2.11.- Determinación del mecanismo de invasión bacteriana 39 III.3.- Estudio de la fagocitosis, persistencia y replicación de Corynebacterium pseudotuberculosis en macrófagos 40 III.3.1.- Células fagocíticas utilizadas 40 III.3.2.- Determinación de la tasa de fagocitosis de C. pseudotuberculosis 41 III.3.3.- Determinación del tiempo de fagocitosis en la infección por C. pseudotuberculosis 41 III.3.4.- Determinación de la resistencia a la fagocitosis y replicación intracelular de C. pseudotuberculosis 41 III.3.5.- Estudio de la adherencia e invasión de C. pseudotuberculosis en la línea celular macrofágica de ratón J774 mediante inmunofluorescencia 42 III.4.- Estudio del efecto inmunomodulador de los fagocitos de oveja, cabra y ratón sobre C. pseudotuberculosis 42 III.4.1.- Explosión respiratoria 43 III.4.2.- Contenido en peroxidasa en macrófagos de oveja, cabra y ratón 44 III.5.- Determinación del efecto bactericida del suero 44 IV.-RESULTADOS 46 IV.1.- Caracterización de las cepas de C. pseudotuberculosis utilizadas en este estudio 46 IV.1.1.- Aspectos clínico-patológicos de los animales Muestreados 46 IV.1.2.- Identificación de C. pseudotuberculosis 46 IV.1.3.- Perfil de resistencia antibiótica 49 IV.2.- Adherencia e invasión de C. pseudotuberculosis en células no fagocíticas (línea celular FLK-BLV-044) 51 IV.2.1.- Establecimiento de las condiciones previas: curva de crecimiento y tiempo de infección 51 IV.2.2.- Porcentaje de adherencia e invasión 53 IV.2.3.- Efecto de la concentración del inóculo 55 IV.2.4.- Efecto de la incubación de las células a 4ºC 56 IV.2.5.- Efecto de la preincubación con antisuero de conejo 57 IV.2.6.- Efecto de la presencia de determinados azúcares 58 IV.2.7.- Supervivencia y/o replicación intracelular 59 IV.2.8.- Adherencia e invasión intracelular mediante inmunofluorescencia 61 IV.3.- Interacción de C. pseudotuberculosis con fagocitos de ratón, cabra y oveja 62 IV.3.1.- Estandarización de las condiciones previas: tiempo de infección 62 IV.3.2.- Fagocitosis por la línea celular de ratón J774 63 IV.3.3.- Persistencia y/o replicación intracelular en La línea celular de ratón J774 64 IV.3.4.- Estudio de la fagocitosis por inmunofluorescencia 65 IV.3.5.- Explosión respiratoria y contenido de peroxidasa de leucocitos de ratón, oveja y cabra 66 IV.4.- Efecto bactericida del suero de cabra y oveja sobre C. pseudotuberculosis 69 V.-DISCUSIÓN 72 V.1.- Aspectos clínicos y microbiológicos de las cepas de C. pseudotuberculosis objeto de estudio 72 V.2.- Papel de las células no fagocíticas en la permanencia de C. pseudotuberculosis 76 V.3.- Interacción de C. pseudotuberculosis con células Fagocíticas 82 VI.- CONCLUSIONES 87 VIIBIBLIOGRAFÍA 88 VIII.- RESUMEN 106 IX.- SUMMARY 107 X.- AGRADECIMIENTOS 108 XI.- PUBLICACIONES DE LA TESIS EN REVISTAS INDEXADAS 111 ÍNDICE FIGURAS Figura 1. Resultados obtenidos mediante la PCR-multiplex de los genes 16S rRNA y PLD de las 4 cepas empleadas en nuestro estudio 49 Figura 2. Representación gráfica del crecimiento de Corynebacterium pseudotuberculosis a lo largo del tiempo 51 Figura 3.- Efecto del tiempo de infección en la invasión de Corynebacterium pseudotuberculosis en la línea celular de origen ovino FLK-BLV-044 52 Figura 4. Adherencia de Corynebacterium pseudotuberculosis en la línea celular de origen ovino FLK-BLV-044 53 Figura 5.- Invasión de Corynebacterium pseudotuberculosis en la línea celular de origen ovino FLK-BLV-044 54 Figura 6.- Efecto de la multiplicidad de la infección (MOI) de Corynebacterium pseudotuberculosis en la invasión en la línea celular FLK-BLV-044 55 Figura 7.- Tasas de invasión de Corynebacterium pseudotuberculosis en la línea celular FLK-BLV-044 a 4ºC con una MOI inicial de 100≈1 56 Figura 8.- Efecto de la preincubación con suero anti-Corynebacterium pseudotuberculosis en la invasión de la línea celular FLK-BLV-044, a partir de una MOI de 100≈1 57 Figura 9.- Efecto de la incubación de Corynebacterium pseudotuberculosis con glucosa y manosa al 1% en la invasión de la línea celular FLK-BLV-044, a partir de una MOI de 100≈1 58 Figura 10.- Replicación intracelular de Corynebacterium pseudotuberculosis en la línea celular FLK-BLV-044, a partir de una MOI de 100≈1 60 Figura 11.- Invasión y adherencia de Corynebacterium pseudotuberculosis en la línea celular FLK-BLV-044, a una MOI de 100≈1, mediante inmunofluorescencia 61 Figura 12.- Porcentaje de fagocitosis de Corynebacterium pseudotuberculosis en la línea celular J774 en función del tiempo de infección empleado (MOI 10≈1) 62 Figura 13.- Actividad fagocítica de la línea celular J774 sobre Corynebacterium pseudotuberculosis, tras 120 minutos de incubación a una MOI 10≈1 63 Figura 14.-Persistencia y replicación intracelular de Corynebacterium pseudotuberculosis en la línea celular fagocíticaJ774, que fue inoculada a una MOI 10≈1 65 II Figura 15.- Fagocitosis de Corynebacterium pseudotuberculosis en la línea celular macrofágica J774 a una MOI de 10≈1 mediante inmunofluorescencia 66 Figura 16.- Índice de explosión respiratoria en macrófagos de ratón, oveja y cabra infectados con C. pseudotuberculosis, a una MOI 10≈1 67 Figura 17.- Contenido de peroxidasa en leucocitos de ratón, oveja y cabra infectados con C. pseudotuberculosis 68 Figura 18. Resistencia del efecto bactericida del suero de cabra de las cepas de C. pseudotuberculosis estudiadas, expresada como porcentaje de viabilidad de cada cepa estudiadas, medida tras diferentes tiempos de incubación 70 Figura 19.- Resistencia del efecto bactericida del suero de oveja de las cepas de C. pseudotuberculosis estudiadas, expresada como porcentaje de viabilidad en diferentes tiempos de incubación 71 II I-INTRODUCCIÓN II-REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA III-MATERIAL Y METODO IV-RESULTADOS XI-PUBLICACIONES DE LA TESIS EN REVISTAS INDEXADAS Introducción y objetivos I.-INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS La linfadenitis caseosa, también denominada seudotuberculosis o enfermedad de Preisz-Nocard, es una enfermedad infectocontagiosa muy prevalente en algunos países en donde los pequeños rumiantes constituyen una parte esencial de su ganadería. De ahí que se considere una de las enfermedades más importantes de cabras y ovejas en países como EEUU, Canadá o Australia, habiéndose cuantificado en este último país unas pérdidas asociadas a la producción de lana, de aproximadamente 17 millones de dólares anuales (Paton y cols., 1994). El agente causal de la enfermedad, Corynebacterium pseudotuberculosis, es un microorganismo cosmopolita con una importante significación clínica (Fontaine y Baird, 2008), a pesar de no producir grandes pérdidas directas por mortalidad de animales, pero sí por disminución en la productividad de carne, lana y leche (Paton y cols., 1994; Aleman y Spier, 2001). La enfermedad produce una infección bacteriana supurativa de carácter crónico, que afecta a ganado ovino, caprino, bovino, equino, y otros animales domésticos y silvestres (Aleman y cols., 1996), así como a la especie humana, tras el contacto con animales infectados (Peel y cols., 1997), siendo considerada como una zoonosis menor. La infección se produce a través de alimento e inhalación de polvo contaminado, así como a través de heridas abiertas. Las lesiones más características se traducen en la presentación de abscesos en ganglios linfáticos de diferentes regiones anatómicas. No obstante, la enfermedad puede manifestar diferentes formas clínicas, que frecuentemente se asocian a tres síndromes principales: linfadenitis piógena, respiratorio posterior y caquectizante (León y cols., 2002c). Pero además y, aunque con una baja prevalencia, acontecen una amplia variedad de formas clínicas, algunas de ellas típicas como es el caso de la anemia hemolítica neonatal, y otras más difíciles de asociar con la seudotuberculosis (mortalidad perinatal, mamitis, poliartritis, etc.). 1 Introducción y objetivos Para que aparezca la enfermedad es imprescindible conjugar varios factores, por un lado, el papel que juega la exotoxina que produce el agente causal, que afecta a la permeabilidad vascular, lo que facilitaría la diseminación de la bacteria de los vasos sanguíneos a la vía linfática (Muckle y Gyles, 1983; Yozwiak y Songer, 1993). Pero además, C. pseudotuberculosis presenta una capa ácida micólica cerosa en la superficie de su pared celular que presenta propiedades citotóxicas, desempeñando un papel muy importante en la patogenicidad (Hard, 1972). A ambos factores habría que sumar un hecho trascendente en el curso de la infección: “el agente causal se encuadra en el grupo de patógenos que pueden comportarse como parásitos intracelulares facultativos, capaces de sobrevivir en el interior de los macrófagos de su hospedador”. Pero de esta vida intracelular, se desconocen muchos aspectos que son necesarios analizar en profundidad a la hora de entender mejor la interacción parásitohospedador. Resolver muchas de estas incógnitas permitirá conocer con detalle los mecanismos de agresión y supervivencia de este agente causal de enfermedad y, a la vez, mejorar la eficacia de los métodos de control que se aplican actualmente. Además, de forma espontánea, surge también el planteamiento de si las células no fagocíticas podrían jugar algún papel en el mantenimiento y en la difusión de la infección dentro del hospedador. Por otra parte, los cultivos celulares permiten un control preciso en el laboratorio del medio ambiente intracelular, la caracterización y homogeneidad de la muestra y economizan el uso de reactivos, evitando a la vez el sacrificio de miles de animales de experimentación. De ahí que estos estudios han sido ampliamente utilizados para profundizar en el conocimiento de la patogenia de algunos parásitos intracelulares. Por otro lado, la capacidad de ciertas bacterias de invadir células no fagocíticas es considerada como un importante factor de virulencia de varias bacterias patógenas humanas y animales, como Escherichia coli, Yersinia, Salmonella y Shigella (Galán, 1994; Zierler y Galán, 1995), entre otras. Aprovechando la experiencia previa del grupo de investigación a la hora de analizar la interacción de diferentes patógenos de interés para la sanidad animal como: Hafnia alvei (Padilla y cols., 2008; 2010), Photobacterium damselae subsp. piscicida 2 Introducción y objetivos (Acosta y cols, 2009) o Streptococcus iniae (El Aamri y cols., 2012) con células de distintos orígenes, nos hemos marcado como finalidad de este trabajo “profundizar en el conocimiento de la vida intracelular de Corynebacterium pseudotuberculosis, en células fagocíticas y no fagocíticas”. De esta manera, y con todo lo expuesto anteriormente, los objetivos específicos que nos hemos planteado en el desarrollo del presente trabajo de investigación son los siguientes: Primero.- Obtener cepas clínicas de campo recientes de la infección ovina o caprina por Corynebacterium pseudotuberculosis, a partir de casos de indudable diagnóstico, con el fin de evitar que las cepas hayan tenido un mantenimiento prolongado en el laboratorio. Segundo.- Estudiar la adherencia e invasión de Corynebacterium pseudotuberculosis en células no fagocíticas, ante distintas condiciones de cultivo. Tercero.- Analizar la capacidad de supervivencia y replicación intracelular del patógeno citado en células no fagocíticas. Cuarto.- Estudiar de forma comparada, la posible interacción entre fagocitos murinos, ovinos y caprinos con Corynebacterium pseudotuberculosis, analizando los mecanismos de persistencia y replicación intracelular. Quinto.- Estudiar de forma comparada, la respuesta inmune de base celular, de los leucocitos murinos, ovinos y caprinos frente a la infección por Corynebacterium pseudotuberculosis, mediante las técnicas de explosión respiratoria y contenido de peroxidasa. Sexto.- Estudiar comparativamente el efecto bactericida del suero de cabra y oveja frente a Corynebacterium pseudotuberculosis. 3 Revisión Bibliográfica II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA II.1.- LA SEUDOTUBERCULOSIS POR CORYNEBACTERIUM PSEUDOTUBERCULOSIS. II.1.1. ETIOPATOGENIA DE LA ENFERMEDAD El agente causal de linfadenitis caseosa es Corynebacterium pseudotuberculosis, patógeno bacteriano intracelular facultativo (Funke y cols., 1997; Aleman y Spier 2001). Corynebacterium pseudotuberculosis es una bacteria Gram positiva, de morfología cocobacilar pleomórfica de 1-3 μm de largo por 0,5 -0,6 μm de ancho, inmóvil y que forma colonias blanco-amarillentas cuando son sembradas en el medio agar sangre, donde produce beta hemólisis tras una incubación de 48 a 72 h a 37°C. A su vez, es un organismo no esporulado, anaerobio facultativo (Hommez y cols., 1999). En medios sólidos, las colonias bacterianas son pálidas, secas y de consistencia friable (Quinn y cols., 1994). Tras una incubación de 24 h, las colonias son pequeñas de color blanco amarillentas, aumentando hasta un diámetro de 1-2 milímetros tras 48 h de incubación (Coyle y cols., 1985). El crecimiento de C. pseudotuberculosis se ve favorecido tras la adición de suero o sangre entera a los medios de cultivo. Cuando se cultiva C. pseudotuberculosis en medios de cultivo líquidos o en suspensión acuosa, C. pseudotuberculosis tiende a formar agregados y precipitados (Aleman y Spier, 2001; Baird y Fontaine, 2007). La aplicación de técnicas de análisis de secuencias del gen ribosómico 16S rRNA y estudios de hibridación, han demostrado que dentro del Género Corynebacterium existen tres especies diferentes, C. diphteriae, C. ulcerans y C. pseudotuberculosis. Estas tres especies comparten, entre otras características, la producción de una fosfolipasa D con idénticas características (Lipsky y cols., 1982; Wong y Groman, 1984; Funke y cols., 1997: Leardini y cols., 2002). Estudios filogenéticos indican que el Género Corynebacterium se halla íntimamente relacionado con los Géneros Mycobacterium, Nocardia y Rhodococcus, 4 Revisión Bibliográfica conformando el grupo denominado CNMR (Coyle y Lipsky, 1990; Von Graevenitz y Krech, 1992; Clarridge y Spiegel, 1995; Koneman y cols., 1999). Cepas de distintos orígenes de esta especie presentan variabilidad bioquímica. En base a ello, se han propuesto dos biotipos por su capacidad de producir la enzima nitrato reductasa, denominándose biovariedad equi para los aislamientos que reducen los nitratos y la biovariedad ovis para aquellas cepas que no presentan dicha capacidad (Songer y cols., 1988; Leardini y cols., 2002; Vay y Almuzara, 2002). De forma genérica, las cepas aisladas a partir de pequeños rumiantes y vacunos son nitrato negativo, mientras que las cepas nitrato positivas son las aisladas a partir de équidos y vacunos, no habiéndose registrado la transmisión natural entre las diferentes especies (Aleman y Spier, 2001). II.1.1.1.- Puerta de entrada del patógeno La inducción de la infección experimental por C. pseudotuberculosis se ha llevado a cabo por diferentes rutas en pequeños rumiantes, como son la vía intradérmica, subcutánea, intravenosa, intratraqueal, intravaginal e intralinfatica. Por todas las vías se logró reproducir la enfermedad experimentalmente (Nagy, 1976; Burrell, 1978; Pepin y cols., 1994b; Fontaine y cols., 2006). En infecciones naturales la principal ruta de entrada de la bacteria es a través de piel (Batey, 1986b; Brown y Olander, 1987; Davis, 1990; Collett y cols., 1994). La infección se facilita por pequeñas heridas y abrasiones cutáneas como las causadas en el esquilado (Paton y cols., 1988). El número de bacterias viables en la descarga purulenta de un absceso se han estimado entre 106 y 107 unidades formadoras de colonia por gramo de pus (Brown y Olander, 1987). Por tanto, la ruptura de los abscesos superficiales libera grandes cantidades de bacterias viables a la piel adyacente y al vellón, pudiendo contaminar el entorno adyacente muy fácilmente. Lesiones por heridas en mucosa bucal debido al pastoreo son un importante factor de riesgo (Brown y Olander, 1987; Robles y Olaechea, 2001). Las heridas causadas durante la castración, el corte del rabo de las ovejas y el ombligo en animales neonatos se han sugerido como puerta ocasional de entrada de C. pseudotuberculosis en el animal (Valli y Parry, 1993). 5 Revisión Bibliográfica También se ha descrito la vía respiratoria como puerta de entrada de la infección (Stoops y cols., 1984), a partir de la observación de que algunas ovejas infectadas de forma natural sólo presentaban lesiones pulmonares, y un número pequeño de estas lesiones estaban situadas en el interior de las paredes de las vías respiratorias. Por otra parte, Brown y Olander (1987) describieron la producción de abscesos pulmonares diseminados inyectando por vía intravenosa C. pseudotuberculosis pero otros estudios indican que tales lesiones pulmonares pueden producirse a partir de una infección sistémica iniciada en otra localización. Así, tras la inoculación intravenosa en corderos con C. pseudotuberculosis, la mayoría de las lesiones internas aparecen en los pulmones asociados a ganglios linfáticos torácicos (Brogden y cols., 1984). También se ha observado que en infecciones naturales en ovinos, los patrones de distribución de las lesiones pulmonares son coherentes con la propagación hematógena o linfática, en lugar de la extensión vía aerógena (Nairn y Robertson, 1974), por lo que la vía aerógena es de poca importancia. La aparición de la enfermedad en un rebaño serológicamente negativo se produce tras la introducción de un animal infectado clínica o sub-clínicamente (Ayers, 1977). También se ha descrito la transmisión de la infección a través de los trabajadores agrícolas y sus equipos. En rebaños con una alta prevalencia, los esquiladores y su equipo inevitablemente están expuestos a las descargas purulentas de las lesiones superficiales, por lo que si las medidas posteriores de desinfección son insuficientes, es posible que el equipo de esquila, la ropa y otros equipos de inmovilización, puedan actuar como vectores mecánicos de la infección a otros rebaños. En rebaños de ovejas con linfadenitis caseosa, los animales con lesiones pulmonares representan una importante fuente de infección para otros animales (Pepin y cols., 1994a; Williamson, 2001), ya que se ha observado el aumento en la seroprevalencia de la enfermedad en grupos de ovejas en ausencia de lesiones superficiales (Ellis y cols., 1987; Paton y cols., 1988). Además, C. pseudotuberculosis ha sido aislado a partir de tráquea de ovejas con abscesos pulmonares, confirmando que, efectivamente, se produce la descarga de las lesiones pulmonares hacia las vías respiratorias altas (Stoops y cols, 1984; Pepin y cols., 1994a), pudiéndose crear aerosoles con material infeccioso. En condiciones de estrecho contacto y flujo de aire 6 Revisión Bibliográfica reducido, como en un cobertizo cubierto, el aerosol producido podría ser capaz de infectar a un gran número de animales en un corto período de tiempo (Paton y cols., 1996). II.1.1.2.- Localización de la infección Tras la entrada del patógeno, el organismo se propaga rápidamente al ganglio linfático más cercano donde se desarrollan múltiples piogranulomas microscópicos que aumentan de tamaño y terminan uniéndose formando abscesos de mayor tamaño. Este proceso es seguido a veces por la diseminación de la bacteria por vía sanguínea o el sistema linfático, provocando lesiones similares en otros órganos. La naturaleza de estas lesiones son significativas ya que se cronifican y con frecuencia permanecen en el animal de por vida. Bacterias viables pueden ser recuperadas de abscesos varios años después de la infección inicial. También se ha descrito la reactivación de la enfermedad con el desarrollo de abscesos en nuevas localizaciones tras un período de inactividad aparente del patógeno (Aleman y Spier, 2001; Baird y Fontaine, 2007). Una vez en el interior del ganglio linfático, C. pseudotuberculosis es fagocitado por macrófagos (Aleman y Spier, 2001). Mediante métodos histoquímicos se ha descrito la unión entre fagosomas y lisosomas, pero el patógeno resiste el ataque enzimático permitiendo la permanencia en el interior celular como parásito intracelular facultativo. Una vez desarrollado el absceso, parte de las bacterias de su interior entran a los capilares y forman colonias que ocluyen y trombosan los vasos produciendo isquemia localizada, que junto a las toxinas producidas por C. pseudotuberculosis, destruyen células de la parte sana del absceso, adicionándose una nueva capa a la masa necrótica. Si se produce la salida de bacterias del absceso, se produce la diseminación de C. pseudotuberculosis a través de los vasos linfáticos, penetrando en otros ganglios y eventualmente en vasos sanguíneos, pudiendo llegar a diferentes órganos donde se reproduce la formación de abscesos. A su vez, el tejido conectivo de los abscesos puede romperse liberándose líquido purulento (Bofill y cols., 1998). Entre los mecanismos por los cuales C. pseudotuberculosis se propaga desde el punto de la entrada de la infección, es de crucial importancia la supervivencia y la replicación de C. pseudotuberculosis. Esta habilidad del patógeno de sobrevivir en el 7 Revisión Bibliográfica interior de este nicho intracelular está relacionada con la composición lipídica de su pared celular, principalmente por los ácidos corinomicólicos, existiendo una correlación positiva entre el contenido de estos lípidos y la habilidad de producir lesiones en los ganglios. Los lípidos de la pared celular constituyen un factor piógeno, relacionándose con la infiltración masiva con leucocitos polimorfonucleares que transportan las bacterias a los nódulos linfáticos y con el efecto citotóxico que destruye a los fagocitos (Brown y Olander, 1987; Aleman y Spier, 2001). II.1.1.3.- Factores de virulencia de C. pseudotuberculosis Los principales factores de virulencia de C. pseudotuberculosis están representados por la producción de la exotoxina fosfolipasa D y la presencia de ácidos micólicos. II.1.1.3.1.- Efecto de la exotoxina fosfolipasa D Corynebacterium pseudotuberculosis produce una fosfolipasa D (PLD) que actúa sobre la esfingomielina y la lisofosfatidilcolina. Inoculaciones experimentales realizadas en oveja con un mutante no productor de PLD han demostrado la ausencia de lesiones macroscópicas en los animales inoculados, aun siendo inoculados con una dosis 100 veces mayor que aquellos inoculados con una cepa salvaje que sí desencadenó la formación de los clásicos abscesos pseudotuberculosos (Hodgson y cols., 1992). Por tanto, la producción de PLD parece ser un factor de virulencia esencial en la patogénesis de C. pseudotuberculosis. Su mecanismo de acción podría estar relacionado con el hecho de que la PLD afecta a la permeabilidad vascular, lo que facilitaría la diseminación de la bacteria de los vasos sanguíneos a la vía linfática (Muckle y Gyles, 1983; Yozwiak y cols., 1993). La PLD produce el aumento de la permeabilidad de la membrana endotelial vascular por la hidrólisis de esfingomielina. Este aumento de la permeabilidad provoca la liberación de plasma de los vasos sanguíneos hacia los tejidos y desde allí al sistema linfático (Carne y Onon, 1978). Asimismo, se sabe que la PLD activa la vía complementaria del sistema inmune, agotando el complemento en la zona que rodea las bacterias protegiéndolas de la opsonización (Yozwiak y Songer, 1993). A su vez, inhibe la quimiotaxis de neutrófilos y provoca la degranulación de células fagocíticas ocasionando necrosis y trombosis en vasos linfáticos, favoreciendo la 8 Revisión Bibliográfica supervivencia y multiplicación del microorganismo (Aleman y Spier, 2001) al disminuir la fagocitosis en los pasos iniciales de la infección (Yozwiak y Songer, 1993). Varios géneros bacterianos liberan fosfolipasas, y en la mayoria de los casos, ha demostrado desempeñar un papel importante en la virulencia (Schmiel y Miller, 1999). La PLD fue caracterizada por primera vez por Carne en 1940, quien determinó que era una fosfatidilcolina fosfalido hidrolasa, más conocida como fosfolipasa D, y desde entonces ha sido detectada en todos los aislamiento de C. pseudotuberculosis (Songer y cols., 1988). Esta enzima funciona como una esfingomielinasa específica que cataliza la disociación de la esfingomielina, importante fosfolípido que forma parte constitutiva de la pared celular (Bernheimer y cols., 1980). Se han descrito diversas actividades biológicas para la PLD, incluyendo dermonecrosis (Carne, 1940; Muckle y Gyles, 1986), letalidad, lisis sinérgica de eritrocitos en presencia de un factor extracelular de Rhodococcus equi (Fraser, 1961) e inhibición del síndrome estafilocócico (lisis inducida por lisis de eritrocitos) (Zaki, 1976). II.1.1.3.2. Ácidos micólicos El segundo factor de virulencia más importante para el desarrollo de la enfermedad es la presencia de los ácidos micólicos. Corynebacterium pseudotuberculosis no produce cápsula protectora, pero en su lugar presenta una capa ácida micólica cerosa en la superficie de su pared celular. Este capa micólica presenta una serie de propiedades citotóxicas que desempeñan un papel muy importante en la patogenicidad de este patógeno (Hard, 1972; Muckle y Giles, 1983; Tashjian y Campbel, 1983). La inoculación experimental por vía subcutánea de ácido micólico extraído a partir de C. pseudotuberculosis en ratones, produce inflamación localizada con congestión y un área central de necrosis hemorrágica. Además, el ácido micólico induce cambios degenerativos y muerte de leucocitos (Carne y cols., 1956). Sin embargo, y a diferencia del efecto letal de la inoculación de moléculas similares extraídas de las micobacterias, el efecto citotóxico del ácido micólico de C. pseudotuberculosis se limita al lugar de la inoculación (Hard, 1975). Algunos autores han sugerido que la capa 9 Revisión Bibliográfica microbiológicas básicas en placa y tubo (morfología, movilidad, hemolisis, oxidasa, catalasa), y sistemas miniaturizados de galerías de identificación como API Coryne. Corynebacterium pseudotuberculosis crece bien en agar sangre en 48 horas, observándose el desarrollo de colonias pequeñas, blancas, secas y rodeadas de una ßhemólisis parcial. Con la tinción de Gram, se observan cocobacilos cortos Gram positivos, normalmente agrupados en empalizada. Se han evaluado diferentes sistemas miniaturizados para la identificación de este patógeno, como son los sistemas API Coryne (bioMérieux), API 20 Strep (Morrison y Tillotson, 1988) y Minitek identification system (BBL Microbiology Systems). Estos sistemas incluyen test enzimáticos y de fermentación de azúcares, siendo métodos de identificación rápidos pero que muchas veces requieren pruebas adicionales para confirmar una identificación definitiva (Lipsky y cols., 1982; Coyle y Lipsky, 1990, Funke y cols., 1997; Hommez y cols., 1999; Baird y Fontaine, 2007). El diagnóstico por métodos serológicos se basa fundamentalmente en el uso de la técnica de ELISA desde que Shen y cols. (1982) describieran la primera aplicación de esta técnica para detectar anticuerpos contra un antígeno de la pared celular de C. pseudotuberculosis. A partir de entonces, la técnica ELISA ha demostrado ser una herramienta muy útil en el diagnóstico de la linfadenitis caseosa (Maki y cols., 1985; Sutherland y cols., 1987; Chikamatsu y cols., 1989; Kuria y Holtad, 1989; Laak y Schreuder, 1991; Laak y cols., 1992; Schreuder y cols., 1994), siendo una técnica muy empleada en los programas de erradicación de la enfermedad en zonas endémicas (Songer y cols., 1990; Menzies y cols., 1994; Dercksen y cols., 2000). Otras técnicas serológicas descritas para el diagnóstico de la linfadenitis caseosa incluyen la inmunofluorescencia indirecta (Simón y cols., 1987), microaglutinación, inmunodifusión (Menzies y Muckle, 1989), inhibición de la hemólisis sinérgica (Ruíz y cols., 1995), dot blot, western blotting (Ter Laak y cols., 1992), fijación de complemento (Shigidi, 1978) y la inhibición de hemolisis sinérgica (Real y León, 1990). 16 Revisión Bibliográfica Finalmente, técnicas de biología molecular como la secuenciación del 16S rDNA y la técnica de la PCR han perfeccionado el diagnóstico de la enfermedad, al ser técnicas muy sensibles y específicas, pero más caras que las anteriormente descritas, si bien la diferenciación entre C. pseudotuberculois y C. ulcerans puede ofrecer reacciones cruzadas, al ser dos especies genéticamente muy relacionadas, por lo que hay que recurrir a PCR múltiples en la correcta diferenciación entre estas dos especies del Género Corynebacterium (Çetinkaya y cols., 2002). Pacheco y cols. (2007) desarrollaron una PCR multiplex (mPCR) identificando tres genes diferentes presentes en C. pseudotuberculosis, el gen 16S rDNA, el gen rpoB y el gen pld, que codifica la exotoxina PLD, una esfingomielinasa implicada en la virulencia de C. pseudotuberculosis y C. ulcerans (McNamara y cols., 1995). El diagnóstico diferencial de la linfadenitis caseosa se realiza frente a otras enfermedades que desencadenan abscesos de características similares, entre las que destacan las infecciones causadas por Staphylococcus aureus, Streptococcus sp., Actinomyces sp., Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, así como traumatismos, cuerpos extraños, reacciones de sensibilidad a inyectables y tumores (Burrel, 1980; Aleman y Spier, 2001; León y cols., 2002b). La vacunación en zonas donde la prevalencia es alta se presenta como el mejor método para la prevención, control y erradicación de la enfermedad, siendo el campo más investigado actualmente desde que Cameron (1972) utilizara una suspensión de C. pseudotuberculosis inactivada por formalina para la vacunación de ovejas merino, consiguiendo protección frente a la muerte aguda o subaguda, pero no frente al desarrollo de abscesos. Años más tarde, Nairn y cols. (1977) analizaron el efecto protector del toxoide mediante la exotoxina cruda concentrada y formalinizada en un grupo de 24 ovejas, obteniendo la reducción significativa de la formación de abscesos entre el grupo control y el grupo de ovejas inoculadas con el toxoide, demostrando el importante papel de la exotoxina en el desarrollo de la enfermedad, hecho confirmado unos años después en el estudio de Anderson y Nairn (1984). A partir de estos años, se han realizado multitud de estudios analizando la eficacia de diferentes vacunas, como la asociación de una bacterina inactivada con 17 Revisión Bibliográfica formalina asociada a hidróxido de aluminio como adyuvante (LeaMaster y cols., 1987), células enteras con el adyuvante muramil dipéptido (Brogden y cols., 1990), el bacilo de Calmette y Guerin por su probada actividad frente al Micobacterium bovis (Real y León, 1990), células enteras asociadas a toxoide (Eggleton y cols., 1991a) y toxoide purificado por métodos cromatográficos (Eggleton y cols., 1991 a-b). El inicio de las vacunas con técnicas de biología molecular e ingeniería genética se produce a partir de los trabajos de Hodgson y cols. (1992) con la delección del gen de la fosfolipasa D, disminuyendo así la virulencia de la cepa de C. pseudotuberculosis modificada. Un año después, se describieron sitios específicos del gen que codificaban para la toxina PLD, y que al ser alterados producían la inactivación de la toxina secretada (Tachedjian y cols., 1995). El uso de autovacunas específicas también ha ofrecido buenos resultados en la inmunización de rebaño (León y cols., 2002a). En el año 2003, investigadores peruanos analizaron la eficacia de una vacuna elaborada a partir de precipitado proteico de C. pseudotuberculosis con las exotoxinas en ratones albinos inoculados con C. pseudotuberculosis, observando una disminución de las lesiones producidas, así como la disminución del número y tamaño de los abscesos en el grupo de animales vacunados (Medrano y cols., 2003). Junto a la vacunación, unas buenas medidas de manejo, higiene y desinfección son fundamentales para el control de la enfermedad en el rebaño. La mayoría de los desinfectantes comunes, como lejía, glutaraldehido, formaldehido y yodóforos son muy eficaces en la eliminación del microorganismo, pero la presencia de materia orgánica dificulta su actividad, facilitando su diseminación (Ismail y Hamid, 1972) como ocurre en los exudados purulentos (Nairn y Robertson, 1974). Un correcto manejo del colectivo es fundamental para disminuir la incidencia de presentación de esta enfermedad, destacando el esquileo y baño de animales infectados de forma separada, el control de moscas, mantener unas buenas prácticas de higiene y desinfección durante el esquileo, así como la limpieza y desinfección de instrumentos y ambientes donde se ha producido la ruptura de los abscesos (Paton y cols., 1994; Aleman y Spier, 2001). Además, otros investigadores recomiendan la eliminación de todo animal positivo, presente o no síntomas (Cubero y cols., 2002b). 18 Revisión Bibliográfica La mayoría de los antibióticos de amplio espectro son muy eficaces en el control in vitro del crecimiento y multiplicación de este patógeno (Muckle y Gyles, 1982; Coyle y Lipsky, 1990; Judson y Songer, 1991; Von Graevenitz y Krech, 1992; Aleman y Spier, 2001). Sin embargo, in vivo, el agente causal de la linfadenitis caseosa generalmente es refractario a la terapia antibiótica, debido a su encapsulación en los abscesos (Aleman y Spier, 2001; Williamson, 2001) y a la naturaleza intracelular del microorganismo durante el ciclo de la enfermedad, por lo que el tratamiento quirúrgico de lesiones externas se ha sugerido como una alternativa válida (Davis, 1990; Aleman y Spier, 2001). Si bien es cierto que en estudios recientes usando la combinación de rifampicina (antibiótico con actividad intracelular) y oxitetraciclina se produjo la disminución del tamaño de las lesiones de los nódulos linfáticos externos de ovejas tratadas (Senturk y Temizel, 2006), pero el estudio no reflejo si el colectivo llegó a declararse libre de la enfermedad, por lo que se hacen necesarios nuevos trabajos que confirmen que este tratamiento se convierta en una alternativa viable y efectiva en el control de lindadenitis caseosa (Baird y Fontaine, 2007). En la eliminación quirúrgica del absceso, tras el drenaje se recomienda una limpieza diaria con antisépticos como soluciones yodadas, así como la aplicación de un tratamiento antibiótico parenteral durante 4-6 semanas para evitar la reaparición de las lesiones, aunque está técnica presenta detractores que abogan por la eliminación completa del ganglio afectado (Gezon y cols., 1991; Rizvi y cols., 1997; Alemán y Spier, 2001; Baird y Fontaine, 2007). A día de hoy, la discusión sobre los mejores métodos de control de la linfadenitis caseosa continúa. Muchos abogan por el uso de la vacunación, y la describen como la principal estrategia en el control de la enfermedad en zonas endémicas, pero la inexistencia de políticas de obligatoriedad en la vacunación frente a la linfadenitis caseosa en pequeños rumiantes facilita la diseminación de la infección. Sin embargo, investigaciones recientes indican que las vacunas actualmente en uso no están ofreciendo los resultados esperados para una eficaz prevención de la enfermedad (Fontaine y cols., 2006), por lo que el sector está demandando el desarrollo de nuevas vacunas que proporcionen una protección más completa y clarificar los mecanismos por los que C. pseudotuberculosis persiste en el hospedador (Fontaine y Baird, 2008; Baird y Malone, 2010). 19 Revisión Bibliográfica La infección por C. pseudotuberculosis en el hombre ha sido reconocida como una enfermedad ocupacional en países productores de pequeños rumiantes (Prospert y col., 1991; Bartolomé y cols., 1995; Peel y cols., 1997; Romero y cols., 2004; Liu y cols., 2005; Join-Lambert y cols., 2006), siendo considerado un patógeno oportunista (Coyle y Lipsky, 1990) en personas inmunodeprimidas (Lipsky y cols., 1982; Funke y cols., 1997) con desarrollo de adenopatías en diferentes localizaciones en función de la zona de entrada del patógeno, con presencia de fatiga, mialgias, hepatomegalia, fiebre, falta de apetito, pérdida de peso, dolores musculares y articulares, aunque también se ha descrito un episodio grave de neumonía eosinofílica (Goldberger y cols., 1981). II. 2. APLICACIONES ACTUALES DEL CULTIVO CELULAR A LA INVESTIGACIÓN BIOSANITARIA El cultivo celular engloba un conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de células in vitro, conservando sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas. Las aplicaciones que presenta el cultivo celular abarcan un gran número de disciplinas. El cultivo de tejidos se desarrolló a partir de los últimos años del siglo XIX, cuando Wilhem Roux mantuvo en el año 1885 células de embrión de pollo en solución salina durante unos días. El primer investigador que empleó técnicas in vitro para el estudio de fenómenos in vivo, fue Harrison en cultivos de médula espinal embrionaria de anfibios, pero rápidamente el interés se centró en el cultivo de células de animales homeotermos, especialmente humanas, por su gran interés médico. En la actualidad, los estudios que emplean cultivos celulares abarcan gran número de disciplinas: - Actividad intracelular. Mecanismos implicados en los diferentes procesos intracelulares, como transcripción de DNA, síntesis de proteínas, metabolismo energético, etc. 20 Revisión Bibliográfica - Flujo intracelular. Movimientos intracelulares de sustancias y señales asociadas a los diferentes procesos fisiológicos, como por ejemplo ensamblaje y desensamblaje de los diferentes componentes intracelulares, movimientos del RNA, etc. - Ecología celular. Estudio de las condiciones ambientales responsables del mantenimiento de la funcionalidad celular, de su diferenciación, de las necesidades nutricionales, infecciones, estudio de la transformación celular (inducidas por virus o agentes químicos), cinética de la población celular, etc. - Interacciones celulares. Procesos de inducción embrionaria, cooperación metabólica, inhibición por contacto o por adhesión, interacciones célula-célula. Como ejemplo de áreas de investigación que usan técnicas de cultivo celular podemos citar las siguientes: - Virología: establecimiento de condiciones de cultivo de virus, estudio de la interacción del virus con su huésped, producción de vacunas antivirales, etc. - Bacteriología: Estudios de adherencia e invasión bacteriana. - Investigación del Cáncer. - Inmunología. Gracias especialmente a la introducción de las técnicas de fusión celular en la producción de anticuerpos monoclonales, así como en el análisis de la genética de la célula somática. - Ingeniería de proteínas. Por la producción de proteínas en líneas celulares: interferón, insulina, hormona de crecimiento,... - Estudios de interacción y señalización celular, en la diferenciación y en el desarrollo. Comprende el estudio de los receptores y de las vías de translocación de la señal. 21 Revisión Bibliográfica - Aplicaciones diagnósticas. Por ejemplo, en medicina y farmacología destacan el análisis cromosómico de células crecidas a partir de muestras de amniocentesis, detección de infecciones virales, ensayos de toxicidad,... - Aplicaciones médicas: mantenimiento y producción de tejidos para trasplante. - Aplicaciones industriales y agronómicas: producción por reproducción in vitro de clones de plantas de interés comercial. Los cultivos celulares permiten un control preciso y fino del medio ambiente intracelular, la caracterización y homogeneidad de la muestra, una economía en el uso de reactivos, evitando a su vez el sacrificio de miles de animales de experimentación. El cultivo celular no puede reemplazar siempre al ensayo in vivo pero es una alternativa válida en muchas situaciones. Como desventajas en el uso de los cultivos celulares, destacar la fácil contaminación del cultivo por hongos, bacterias y micoplasmas, su elevado coste, la inestabilidad de muchas líneas celulares continuas, y su extrapolación al modelo in vivo. Las células de mamíferos se cultivan y mantienen como norma general a una temperatura 37ºC con un 5% de CO2, pero estas condiciones de cultivo pueden variar para cada tipo celular, afectándose la expresión de diferentes fenotipos en función de las condiciones de cultivo. En general, al ser un procedimiento donde se tienen controlados todos los pasos, en los últimos años se ha atribuido como método de referencia para dilucidar las distintas etapas que se producen en la colonización y difusión de los tejidos por parte de distintos patógenos. De ahí que estos estudios han sido ampliamente utilizados para profundizar en el conocimiento de la patogenia de algunos parásitos intracelulares, como Escherichia coli, Yersinia spp., Salmonella spp. y Shigella spp. (Galán, 1994; Zierler y Galán, 1995); Yersinia pseudotuberculosis, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium y Shigella flexineri (Cossart y Lecuit, 2000). 22 Revisión Bibliográfica II.3.- PROCESOS DE ADHERENCIA E INVASIÓN CELULAR POR LAS BACTERIAS En el establecimiento de la infección de bacterias patógenas se requiere de la adhesión a células del hospedador, colonización de los tejidos, y en determinados casos, la invasión celular seguida de la multiplicación intracelular, diseminación a otros tejidos o persistencia (Pizarro-Cerdá y Cossart, 2006). II.3.1.- ADHERENCIA CELULAR La interacción entre bacterias y los tejidos del huésped o proteínas solubles es crucial en el desarrollo de la mayoría de las enfermedades infecciosas, tanto para la adhesión primaria y la colonización tejido-especifica como para la invasión del patógeno en los diferentes tejidos de su huésped. La adherencia bacteriana ocurre entre moléculas de superficie del microorganismo que pueden ser fimbriales o afimbriales y receptores del huésped generalmente constituidos por glicolípidos o glicoproteínas. En el inicio de la infección, una vez que la bacteria atraviesa la puerta de entrada del organismo, intentará adherirse a la superficie celular adyacente, siendo este hecho sumamente importante en regiones anatómicas tales como la boca, intestino delgado y el tracto urinario, ya que las mucosas implicadas están afectadas por diversos fluidos que arrastran con facilidad microorganismos no adheridos, así como el peristaltismo, movimiento ciliar o el recambio de células del epitelio y de la capa mucosa (Hultren y cols., 1993; Preissner y Shingh, 2000). Sin embargo, aún en zonas relativamente estancadas, tales como el colon y el tracto vaginal, el movimiento Browniano puede separar de la superficie tisular a las bacterias que no han logrado fijarse con firmeza a las células del hospedador. A este respecto, es oportuno tener en cuenta que la mayoría de los patógenos se pueden unir de manera más o menos estable a los tejidos (Heithoff y cols., 1997; Dalton y March, 1998). Debido a todo esto, las bacterias no adherentes son rápidamente eliminadas por estos mecanismos inespecíficos de defensa del hospedador. La unión a la célula puede conducir a alteraciones estructurales y/o funcionales de las proteínas del huésped y a la activación de mecanismos celulares que incluyen a la invasión del patógeno a células y tejidos, facilitando no solo la entrada de patógenos a 23 Revisión Bibliográfica las células del huésped, sino que así también éstos puedan escapar de la acción de ciertos antibióticos y de la respuesta inmune (Preissner y Shingh, 2000; Tran Van y Sansonetti, 2000). Entre las estrategias usadas por las bacterias patógenas para adherirse a células no fagocíticas destacamos las siguientes: - Adhesinas: Las adhesinas son componentes de la superficie celular o apéndices bacterianos que facilitan la adhesión. En bacterias Gram negativas, la gran mayoría de sus fimbrias funcionan como adhesinas, pero en muchos casos la verdadera adhesina es una proteína de una subunidad menor en la punta de la fimbria. Por el contrario, en bacterias Gram positivas, proteínas de superficie o polisacáridos actúan como adhesinas específicas. Diversas adhesinas microbianas pueden mediar la unión a los tejidos, al inicio de la infección, pudiendo unirse a células no fagocíticas o a la matriz extracelular y muchos microorganismos invasivos entran a la célula del huésped después de unirse a estructuras de superficie. Existen una gran cantidad de adhesinas bacterianas, incluyendo componentes de la matriz extracelular como colágeno, lamininas, elastina, proteoglicanos e hialuranos. - Pili o fimbrias: El mecanismo más conocido de adherencia bacteriana involucra la formación de enlaces mediados por proteínas fibrilares denominadas pili o fimbrias. Un pilus se constituye básicamente por una secuencia ordenada de subunidades proteicas de pilina que forman una estructura cilíndrica. Los pili son largos, flexibles y se extienden hacia el exterior de la superficie bacteriana para interactuar con la célula hospedadora. La punta de los pili media en la adherencia bacteriana uniéndose a ciertas moléculas ubicadas sobre la superficie de las células de los tejidos. Por lo general, estos receptores de las adhesinas fimbriales corresponden a carbohidratos, glicoproteínas o glicolípidos, cuya función primaria consiste en mantener unidas a las células de los tejidos. La unión de los pili a su célula diana es tan específica, que los receptores presentes en los tejidos del hospedador determinan el tipo de bacterias que colonizan la zona implicada. En algunos casos, la unión “específica” entre el carbohidrato superficial de la célula hospedadora y el extremo distal del pilus depende de otras proteínas localizadas precisamente en la punta de la fibrilla. No obstante, numerosas reacciones de adhesión 24 Revisión Bibliográfica se basan en la participación directa de la pilina (Deitsch y cols., 1997; Finlay y Falkow, 1997; Hacker y cols., 1997). - Adhesinas no fimbriales: Algunas bacterias poseen proteínas superficiales cuya estructura y proceso de ensamblaje difieren de los observados en los pili, aunque también funcionan eficazmente como determinantes de adherencia. Dichas sustancias reciben genéricamente el nombre de “adhesinas no fimbriales” y su participación suele ser independiente de la ausencia o presencia de pili. Además, buena parte de ellas reconocen como sus receptores a ciertas proteínas superficiales de tejidos diana en lugar de unirse a carbohidratos (Hacker y cols., 1997; Edwards y Puente, 1998). Dado que prácticamente todos los estudios asociados a los pili se han realizado en bacterias Gram negativas, aún persisten diversas dudas acerca de estas estructuras de adherencia en las bacterias Gram positivas. II.3.2.- INVASIÓN CELULAR De acuerdo con numerosos autores, las dos propiedades que confieren patogenicidad a las bacterias son la toxigenicidad y la invasividad. En cuanto a la toxigenicidad, se define como la capacidad para producir toxinas, mientras que la invasividad se refiere a la facultad para penetrar, establecerse, reproducirse y diseminarse en los tejidos del hospedador (Heithoff y cols., 1997; Quinn y cols., 1997; Smith, 1998). Algunas bacterias han desarrollado mecanismos que les permiten ingresar a las células hospedadoras, incluidos los fagocitos profesionales (neutrófilos y macrófagos). Para lograr lo anterior, se adhieren íntimamente a dichas células y provocan cambios significativos en su citoesqueleto, que derivan en el englobamiento del microorganismo, a través de un proceso similar al de la fagocitosis macrofágica, en el que tiene lugar la polimerización y despolimerización de la actina, para dar lugar a los pseudópodos “fagocitarios”. En este sentido, las proteínas bacterianas que estimulan el fenómeno suelen denominarse “invasinas” o “factores de invasión” (Lee, 1996; Keisari, y cols., 1997; Quinn y cols., 1997; Casadevall, 1998). Esta clase de ingreso o internalización en las células hospedadoras diferentes de los fagocitos profesionales puede o no involucrar la formación de estructuras análogas a 25 Material y Métodos III.2. ESTUDIO DE LA DE ADHERENCIA E INVASIÓN CELULAR DE C. PSEUDOTUBERCULOSIS EN LÍNEA CELULAR NO FAGOCÍTICA Los diferentes ensayos correspondientes a este apartado se realizaron por triplicado en placas de cultivo celular de 24 pocillos (Corning) con la línea celular no fagocítica de origen ovino FLK-BLV-044. Los ensayos descritos a continuación se basan en la metodología descrita por Isberg y Falkow (1985) y Pizarro-Cerdá y cols. (2002). III.2.1. LÍNEA CELULAR Para las experiencias de adherencia e invasión celular usamos la línea celular FLK-BLV-044, que adquirimos en el Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (referencia: ACC 153). Es una línea estable fibroblástica de células embrionarias de riñón ovino. La línea celular se cultivó utilizando el medio DMEM (Sigma) suplementado con un 10% de suero fetal bovino descomplementado, y se cultivó a 37ºC con un 5% de CO2. La línea celular se conservó mediante congelación a -80ºC y en nitrógeno líquido. III.2.2. CURVA DE CRECIMIENTO DE CORYNEBACTERIUM PSEUDOTUBERCULOSIS Para la estandarización de los ensayos de adherencia e invasión celular determinamos previamente la curva de crecimiento de C. pseudotuberculosis para calcular el momento en que la bacteria se encuentra al final de su fase de crecimiento exponencial. Para ello partimos de medio de cultivo BHIB adicionado de 0,1% de Tween 80, donde sembramos C. pseudotuberculosis, realizándose lecturas de la densidad óptica del cultivo por espectrofotometría a 600 nm de longitud de onda y, paralelamente, realizando diluciones seriadas y recuento de UFC/ml de cada uno de esos momentos de lectura. 32 Material y Métodos III.2.3. DETERMINACIÓN DE LAS TASAS DE ADHERENCIA E INVASIÓN CELULAR DE C. PSEUDOTUBERCULOSIS EN LA LÍNEA CELULAR FLKBLV-044 Las cuatro cepas usadas en este estudio descritas en el punto III.1 se cultivaron en medio AS a 37ºC durante 48 horas para obtener cultivos al final de su fase exponencial. Al mismo tiempo se prepararon las células en placas de 24 pocillos a una confluencia del tapiz del 80-90%. Cada pocillo se inoculó con 20 µl (condición estándar) de cada una de las cepas probadas tras las 48 horas de incubación, correspondiéndose con una multiplicidad de infección (MOI) de 100≈1, es decir, 100 bacterias por cada célula. Una vez inoculadas, las placas se centrifugaron a 450 rpm durante 5 minutos para promover la adherencia bacteriana y fueron incubadas a 37ºC. Transcurridas cuatro horas de la infección procedemos al recuento de bacterias totales (adheridas e internas). Para ello, realizamos el lavado de cada pocillo retirando el medio de cultivo celular y adicionando PBS, para volver a retirar el PBS adicionado y volver a sustituirlo con PBS para, posteriormente, lisar las células del tapiz con 100 µl de tritón X-100 al 0,2%. Seguidamente, realizamos recuento en placa mediante diluciones seriadas, obteniendo la suma de bacterias adheridas e internas (bacterias totales) para cada una de las 4 cepas probadas. Para determinar la tasa de invasión, los pocillos inoculados bajo las mismas condiciones mencionadas en la determinación de las bacterias totales, tras 4 horas de incubación se lavan 3 veces con PBS estéril y se añade 500 µl de medio DMEM con gentamicina a una concentración de 200 µg/ml durante 2 horas para eliminar las bacterias adheridas al tapiz celular. Transcurridas estas 2 horas, procedemos a eliminar los restos de antibiótico mediante lavados sucesivos con PBS. Posteriormente, añadimos 100 µl de tritón X-100 al 0,2% para lisar las células del tapiz y para que liberen las bacterias intracelulares que han escapado a la acción bactericida del antibiótico. Posteriormente, realizamos recuento en placa tras diluciones seriadas en PBS, determinando así la tasa de invasión para cada cepa. La tasa de adherencia bacteriana será la diferencia entre el recuento de bacterias totales y las internalizadas en las células. 33 Material y Métodos III.2.4. DETERMINACIÓN DEL TIEMPO DE INFECCIÓN EN LA INVASIÓN DE C. PSEUDOTUBERCULOSIS EN LA LÍNEA CELULAR FLK-BLV-044 El objetivo de esta prueba es determinar el tiempo que necesita C. pseudotuberculosis para penetrar en la línea celular ovina FLK-BLV-044. Para ello, tras realizar la infección de los pocillos a una MOI 100≈1 con las diferentes cepas de C. pseudotuberculosis, mantenemos tiempos de infección de 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 y 240 minutos. Tras estos periodos, procedemos al lavado de cada pocillo con PBS y añadimos 500 μl de medio de cultivo celular DMEM con gentamicina (200 μl/ml) durante dos horas. Transcurrido ese tiempo, lavamos los pocillos tres veces con PBS estéril, lisamos con tritón y sembramos para realizar el recuento de las bacterias internas para cada uno de los diferentes tiempos utilizados, siguiendo la metodología descrita anteriormente. III.2.5. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL INÓCULO EN LA INVASIÓN DE C. PSEUDOTUBERCULOSIS EN LA LÍNEA CELULAR FLKBLV-044 El objetivo de este ensayo es determinar la existencia de receptores celulares implicados en la invasión celular y su posible saturación tras el aumento de la multiplicidad de la infección (MOI), es decir, el número de bacterias por cada célula. Para este ensayo cultivamos nuestras cepas en medio AS a 37°C durante 48 horas para obtener un cultivo en fase exponencial, e infectamos diferentes pocillos con una suspensión de C. pseudotuberculosis en PBS a una MOI de 5≈1, 25≈1, 50≈1, 100≈1 y 150≈1, respectivamente. El resto del ensayo sigue la misma metodología descrita anteriormente en ensayos previos. III.2.6. PERSISTENCIA INTRACELULAR DE C. PSEUDOTUBERCULOSIS Y TASA DE REPLICACIÓN INTRACELULAR (ÍNDICE IPRO) EN LA LÍNEA CELULAR FLK-BLV-044 El objetivo de esta prueba es determinar si una vez producida la invasión, nuestras cepas se mueren en el interior celular, quedan latentes, o son capaces de 34 Material y Métodos multiplicarse/replicarse activamente. Para este ensayo usamos un tapiz celular con una confluencia del 60%-70% debido a que este ensayo se va a prolongar durante varios días. Se infectan placas de 24 pocillos con nuestras cepas a una MOI 100≈1 de la misma forma que como se describió en el punto III.2.3. Transcurridas 4 horas de incubación, procedemos a la eliminación del medio de cultivo en los pocillos y realizamos tres lavados con PBS. Posteriormente añadimos medio de cultivo con gentamicina a una concentración de 200 μl/ml para eliminar bacterias adheridas. Tras una incubación de dos horas con gentamicina, para determinar el punto de inicio, tres pocillos por cada cepa se lavan tres veces con PBS, se añade tritón X-100 al 0,2% y se procede al recuento en placa. Para determinar los siguientes puntos de muestreo, en el resto de pocillos se elimina el medio de cultivo con gentamicina a 200 μl/ml y se sustituye por medio de cultivo con gentamicina a una concentración de 20 μl/ml con el fin de mantener un ambiente extracelular estéril y se realizan recuentos de las bacterias intracelulares a las 24, 48, 72, 96, 120 y 148 horas. La tasa de replicación intracelular (índice IPRO) expresa la relación existente entre el número de bacterias intracelulares viables presentes a las 24 horas con las presentes tras 4 horas postinfección. III.2.7. EFECTO DE LA PREINCUBACIÓN CON ANTISUERO DE CONEJO FRENTE A C. PSEUDOTUBERCULOSIS EN LA LÍNEA CELULAR FLK-BLV044 El objetivo de este ensayo es analizar si un antisuero anti-C. pseudotuberculosis elaborado en conejo bloquea ligandos específicos bacterianos impidiendo su unión a receptores celulares, afectando por tanto a la invasión de C. pseudotuberculosis en la línea celular de origen ovino FLK-BLV-044. La obtención del antisuero policlonal antiC. pseudotuberculosis para la técnica de la inmunofluorescencia se realizó según la metodología descrita por Harlow y Lane (1988) y Acosta y cols. (2002), utilizándose 2 conejos de unos 2 Kg de peso procedentes de una explotación con un alto nivel sanitario. Ambos animales fueron desparasitados y adaptados a nuestro animalario, inspeccionándolos periódicamente durante dos semanas para garantizar su buen estado de salud previo a la inmunización. A cada animal se le administró 2 ml de un inóculo compuesto por 1 ml de una suspensión de la cepa C. pseudotuberculosis IUSA-1 35 Material y Métodos inactivada y 1 ml de Adyuvante de Freund incompleto (Sigma) repartidos en 10 puntos de inoculación por vía subcutánea en la zona lumbar. La suspensión inactivada de C. pseudotuberculosis se realizó con un cultivo en fase exponencial de C. pseudotuberculosis IUSA-1 adicionando un 5‰ de formol e incubando durante 24 horas a 37ºC para inactivar las bacterias. A las 24 horas tomamos una alícuota de 100 µl de la suspensión y la sembramos en una placa de AS a 37ºC, e incubamos durante 48 horas para garantizar la inexistencia de bacterias vivas. Tras cinco semanas desde la primera inoculación, se les aplicó una segunda dosis de recuerdo con un inóculo preparado de forma similar a la primera inoculación, para provocar así una buena hiperinmunización. A los 15 días de esta segunda inoculación se procedió a la sangría completa de los conejos por punción cardíaca (previamente anestesiados mediante la aplicación subcutánea de una solución compuesta por 0,2 ml de acepromacina y 0,4 ml de ketamina). Una vez obtenida la sangre, se conservó refrigerada durante 3 horas, y posteriormente se centrifugó a 3.000 rpm durante 5 minutos para la separación de fases. El suero se conservó a -80ºC para ser usado posteriormente en la determinación del efecto de la preincubación con antisuero de conejo de C. pseudotuberculosis en la línea celular FLK-BLV-044 y en la técnica de la inmunofluorescencia. Una vez obtenido el antisuero, procedemos a la realización de las siguientes suspensiones a una relación 1:1 y su incubación durante 30 minutos para, posteriormente, proceder a su recuento en placa mediante diluciones previas seriadas con PBS. - antisuero completo + cultivo en fase exponencial - antisuero descomplementado + cultivo en fase exponencial - PBS + cultivo en fase exponencial Tras la incubación de las diferentes suspensiones se procedió a la inoculación de cada pocillo en la línea celular, a una MOI 100≈1. Tras 4 horas de infección, lavamos los pocillos, añadimos gentamicina, volvemos a lavar, lisamos con tritón X-100 y procedemos al recuento en placa, determinando las tasas de infección bajo cada una de 36 Material y Métodos estas condiciones para valorar el bloqueo de ligandos específicos que reduzcan la tasa normal de invasión de las cepas analizadas bajo condiciones estándar. III.2.8. DETERMINACIÓN DEL EFECTO DE LA INCUBACIÓN CELULAR A 4ºC EN LA INVASIÓN DE C. PSEUDOTUBERCULOSIS EN LA LÍNEA CELULAR FLK-BLV-044 El objetivo de este ensayo es determinar la intervención del metabolismo celular en el proceso de invasión de C. pseudotuberculosis en la línea celular FLK-BLV-044. Veinte minutos previos a la infección, incubamos una placa de cultivo celular de 24 pocillos a 4ºC con una confluencia al 80-90% con la línea celular señalada. Una vez inoculados los pocillos con las cepas de C. pseudotuberculosis a una MOI 100≈1, incubamos durante 90 minutos a 4ºC y procedemos al recuento de bacterias intracelulares tras la eliminación de las bacterias adheridas con gentamicina. El control de la infección se realiza al mismo tiempo pero incubando a 37ºC. III.2.9. DETERMINACIÓN DEL EFECTO DE LA PRESENCIA DE AZÚCARES EN LA INVASIÓN DE C. PSEUDOTUBERCULOSIS EN LA LÍNEA CELULAR FLK-BLV-044 En las células eucariotas, muchos receptores celulares son azúcares que son reconocidos por ligandos bacterianos por lo que, si previamente bloqueamos estos ligandos adicionando azúcares durante la incubación de los inóculos de C. pseudotuberculosis, se bloqueará la posterior unión con el receptor celular y se evitará en parte la internalización celular de la bacteria. Para ello, preparamos un cultivo de C. pseudotuberculosis en presencia de un 1% de glucosa y un 1% de manosa, así como un inóculo control sin azúcares (lote testigo). Tras 48 horas de incubación con o sin azúcares, procedemos al cálculo de los diferentes inóculos por recuento en placa tras diluciones seriadas. El ensayo prosigue como ensayos previos inoculando las diferentes cepas de C. pseudotuberculosis a una MOI 100≈1 en placas de 24 pocillos con la línea celular FLK-BLV-044, observando tasas de invasión celular bajo las condiciones probadas. 37 Material y Métodos III.2.10. ESTUDIO DE LA ADHERENCIA E INVASIÓN DE C. PSEUDOTUBERCULOSIS EN LA LÍNEA CELULAR FLK-BLV-044 MEDIANTE INMUNOFLUORESCENCIA Para realizar la técnica de la inmunofluorescencia, las células de la línea FLKBLV-044 fueron depositadas en placas de 24 pocillos con una lentilla de vidrio de 12 mm de diámetro en el fondo de cada pocillo. Para producir la infección celular se inocularon los pocillos con una MOI 100≈1 con un tiempo de infección de 4 horas. Transcurridas estas 4 horas de infección, procedemos a la eliminación del medio de cultivo, y realizamos tres lavados con PBS, fijando posteriormente con una solución de paraformaldehído al 4% durante 20 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, las lentillas con las células fijadas fueron extraídas cuidadosamente de los pocillos y depositadas en una cámara húmeda donde se realizó la técnica de la tinción doble por inmunofluorescencia según la metodología descrita por Pizarro-Cerdá y cols. (2002). Los anticuerpos primarios y secundarios se diluyeron a una concentración 1:1000 en una solución de albúmina sérica bovina (Sigma) al 1% en PBS. Las lentillas se lavaron con PBS y se incubaron durante 20 minutos con el anticuerpo primario (anticuerpo policlonal anti-C. pseudotuberculosis obtenido en conejo). Se realizan nuevos lavados con PBS y las lentillas se incuban durante 20 minutos con 200 µl del anticuerpo secundario alexa-594 anti-conejo (fluorocromo con emisión en rojo) (Invitrogen) para marcar las bacterias extracelulares. Posteriormente, las células se permeabilizaron utilizando una solución de tritón X-100 al 0,1% en PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente para permitir la entrada de los anticuerpos primario y secundario al interior celular. Transcurrido este tiempo se procede a su lavado con PBS, y para proceder al marcado de las bacterias totales (extracelulares + internas), las lentillas se vuelven a incubar con el anticuerpo primario siguiendo el proceso descrito anteriormente, para proceder posteriormente a la incubación con 200 µl del anticuerpo secundario alexa-488 anti-conejo (fluorocromo con emisión en verde) (Invitrogen). De este modo, las bacterias extracelulares quedarán marcadas con ambos anticuerpos secundarios (rojo y verde), mientras que las bacterias intracelulares únicamente quedarán marcadas con el alexa 488 con emisión en verde. Después de realizar otros 3 lavados con PBS, se procedió al montaje de las lentillas en portaobjetos con una gota de ProLong Gold con DAPI (Invitrogen), que marca de manera selectiva el material 38 Material y Métodos genético con emisión en azul. Todas las preparaciones se examinaron con microscopio de epifluorescencia Zeiss con cámara digital Zeiss AxioCam HRc, y las imágenes digitales se procesaron con Photoshop CS3 (Adobe). Las imágenes fueron obtenidas en el laboratorio del Servicio de Microbiología del Hospital Marqués de Valdecillas de Santander (Hospital Marqués de Valdecillas, Barrio de las Mazas, Liencres). III.2.11. DETERMINACIÓN DEL MECANISMO DE INVASIÓN BACTERIANA El objetivo de esta experiencia es determinar si la internalización de C. pseudotuberculosis depende de la viabilidad bacteriana tras la inactivación de C. pseudotuberculosis por calor y radiación ultravioleta. Si tras la infección con bacteria no viable no se observaran bacterias internas, la internalización requiere que la bacteria esté viva, o la internalización se realiza por mecanismos bacterianos que se inactivan por calor y/o radiación ultravioleta, por lo que podríamos referirnos a invasión bacteriana. Por el contrario, si observamos bacterias intracelulares tras la inactivación por calor y/o radiación ultravioleta querrá decir que existe fagocitosis por parte de la línea celular empleada. Este ensayo se realiza por la técnica de la tinción doble por inmunofluorescencia, cuyo protocolo se ha descrito anteriormente en el punto III.2.10. La inactivación bacteriana por calor consistió en mantener un cultivo celular de C. pseudotuberculosis a 60ºC durante 90 minutos. La inactivación por radiación ultravioleta consistió en someter a un cultivo celular a radiación ultravioleta durante 150 minutos. En ambos casos se tomaron alícuotas de 100 µl y se sembraron en medio agar sangre para comprobar la completa inactivación bacteriana. Tras la inactivación bacteriana, se procedió a la inoculación de tres pocillos por cepa bajo condiciones estándar previamente descritas para aplicar la técnica de la tinción doble por inmunofluorescencia. 39 Material y Métodos III.3. ESTUDIO DE LA FAGOCITOSIS, PERSISTENCIA Y REPLICACIÓN DE C. PSEUDOTUBERCULOSIS EN MACRÓFAGOS III.3.1. CÉLULAS FAGOCÍTICAS UTILIZADAS Para las diferentes experiencias de fagocitosis, resistencia y replicación intracelular de C. pseudotuberculosis en células fagocíticas especializadas usamos la línea celular macrofágica de ratón J774, cedida por el Dr. Vivas del Servicio de Microbiología del Hospital Marqués de Valdecillas (Santander), así como leucocitos obtenidos a partir de cabra y oveja. Ambos tipos celulares se cultivaron utilizando medio DMEM suplementado con un 10% de suero fetal bovino descomplementado a 37ºC y en una atmósfera acondicionada con un 5% de CO2. Los diferentes experimentos se realizaron por triplicado en placas de cultivo celular de 24 pocillos (Corning). Para la obtención de macrófagos de oveja y cabra se extrajeron 7 ml de sangre de oveja o de cabra por punción venosa de la yugular, mezclándose con 7 ml de medio DMEM a 37 ºC, a los que se había adicionado previamente penicilina (50 UI/ml) y estreptomicina (50 µg/ml) (Barta 1993; Luo y cols., 2006). Para la separación de las células mononucleares se utilizó un gradiente de Ficoll. Para su elaboración, se disolvieron 6,41 g de Ficoll–400 en 100 ml de agua destilada, adicionando diatrizoato sódico con la ayuda de un densímetro para que la densidad final de la mezcla fuera de 1,081 g/ml, y posteriormente se esterilizó en autoclave durante 30 minutos a 121ºC. En dos tubos estériles se dispensaron 4 ml de Ficoll adicionándolos a 6 ml de la mezcla de sangre y DMEM procedente de cada animal. Sin agitar los tubos, se centrifugaron a 600 g durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras la centrifugación se obtuvo una banda blanquecina entre el plasma y el medio de separación que contiene las células mononucleares que se recogieron con la ayuda de pipetas Pasteur estériles, depositándose en tubos estériles a los que se adicionó 5 ml de medio DMEM. Finalmente, mediante una cámara de Neubauer procedemos a determinar el número de células por ml. 40 Material y Métodos III.3.2. DETERMINACIÓN DE LA TASA DE FAGOCITOSIS DE C. PSEUDOTUBERCULOSIS Para determinar la tasa de fagocitosis de C. pseudotuberculosis usamos la línea celular estabilizada J774 de ratón en placas de cultivo celular de 24 pocillos a una confluencia del tapiz del 80-90% (105 células por pocillo). Los pocillos fueron inoculados a una MOI 10≈1 con cada una de las cepas de C. pseudotuberculosis durante 2 horas a 37ºC. Se lavaron todos los pocillos tres veces con PBS estéril para eliminar las bacterias extracelulares residuales que no fueron fagocitadas, y se adicionaron 600 μl de medio DMEM con 200 μg/ml de gentamicina, incubándose durante otras 2 horas a 37ºC, considerándose este momento el tiempo 0. Para detectar la posible presencia de bacterias extracelulares no retiradas del medio, se sembraron 100 μl del sobrenadante en medio agar sangre. Posteriormente se lavaron todos los pocillos tres veces con 700 µl de PBS estéril y se lisaron las macrófagos utilizando tritón al 1% durante 5 minutos para, finalmente, realizar recuento en placa mediante diluciones seriadas en PBS, determinando así el número de bacterias fagocitadas por los macrófagos. III.3.3. DETERMINACIÓN DEL TIEMPO DE FAGOCITOSIS EN LA INFECCIÓN POR C. PSEUDOTUBERCULOSIS El objetivo de esta prueba es conocer el tiempo que necesitan los macrófagos para fagocitar a C. pseudotuberculosis. Para ello incubamos nuestras cepas a 37°C en la línea celular macrofágica de ratón J774 a una MOI 10≈1, y dejamos tiempos de infección de 15, 30, 45, 60, 120 y 240 minutos, procediendo a la realización de la técnica de la tinción doble por inmunofluorescencia y recuento en placa con la misma metodología descrita anteriormente. III.3.4. DETERMINACIÓN DE LA RESISTENCIA A LA FAGOCITOSIS Y REPLICACIÓN INTRACELULAR DE C. PSEUDOTUBERCULOSIS El objetivo de este experimento es determinar si, una vez producida la fagocitosis, C. pseudotuberculosis se muere en el interior del macrófago, queda latente, o es capaz de resistir, multiplicarse/replicarse activamente. Para este ensayo usamos un 41 Resultados obteniéndose un código de lectura final 0111304, que se correspondía con C. pseudotuberculosis con un nivel de fiabilidad del 99,3%. Tabla 3. Caracterización fenotípica de las cepas de C. pseudotuberculosis obtenidas en Gran Canaria, y de la cepa de referencia CECT-808T, mediante el sistema API Coryne (bioMérieux) Cepas de C. pseudotuberculosis CECT-808T IUSA-1 IUSA-2 TARA-1 Prueba Reducción de Nitratos - - - - Pirazinamidasa - - - - Pirrolidonilarilamidasa - - - - Fosfatasa alcalina + - - - β-glucuronidasa - - - - β-galactosidasa - - - - αglucosidasa + + + + N-acetil-β-glucosaminidasa - - - - Hidrólisis de la esculina - - - - Ureasa + + + + Hidrólisis de la gelatina - - - - Fermentación a partir de: Testigo Negativo - - - - Glucosa + + + + Ribosa + + + + Xilosa - - - - Manitol - - - - Maltosa - - + - Lactosa - - - - Sacarosa - - - - Glicógeno - - - - (+) Reacción positiva; (-) Reacción negativa Para corroborar la identificación de las 4 cepas empleadas de nuestro estudio, todas ellas fueron sometidas a análisis por la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediante la realización de una PCR-multiplex para regiones específicas de los genes 16S rRNA y PLD. En la Figura 1 observamos que en las 4 cepas analizadas se producen las amplificaciones esperadas de 816 y 203 pares de bases 47 Resultados (pb), confirmando de manera definitiva que las cepas CECT-808T, IUSA-1, IUSA-2 y TARA-1 se correspondían, sin lugar a dudas, con Corynebacterium pseudotuberculosis. Figura 1. Resultados obtenidos mediante la PCR-multiplex de los genes 16S rRNA y PLD de las 4 cepas empleadas en nuestro estudio MW: marcador de peso molecular de 50 a 2000 pares de bases Pocillo 1: CECT-808T. Pocillo 2: IUSA-1. Pocillo 3: IUSA-2. Pocillo 4: TARA-1. Pocillo 5: control negativo. IV.1.3.- PERFIL DE RESISTENCIA ANTIBIÓTICA En la Tabla 4 observamos los perfiles de resistencia antibiótica de las cepas analizadas. Como se puede apreciar, todas las cepas de C. pseudotuberculosis estudiadas son sensibles a la gentamicina, ampicilina, lincomicina, oleandomicina, amoxicilina y bacitracina. Por el contrario, todas las cepas son resistentes a la novobiocina, fosfomicina, ácido nalidíxico, cefalotina, cloxacilina, nitrofurantoina y estreptomicina. En el caso de la penicilina G y la enrofloxacina, todas las cepas mostraron una sensibilidad intermedia, excepto la cepa TARA-1, que es sensible. A su vez, todas las cepas son resistentes a la kanamicina y cefuroxima, excepto la cepa TARA-1 que muestra sensibilidad intermedia. Finalmente, todas las cepas son sensibles a la eritromicina, salvo la cepa IUSA-1, que presenta un nivel de sensibilidad intermedia. 16S rRNA (816 pb) PLD (203 pb) 48 Resultados Tabla 4. Perfil de resistencia antibiótica de la cepas clínicas de C. pseudotuberculosis aisladas, comparadas con la cepa de referencia CECT-808T Cepas de C. pseudotuberculosis IUSA - 1 IUSA - 2 TARA – 1 CECT-808T Antibióticos Gentamicina (10mg) S S S S Ampicilina (30 mg) S S S S Lincomicina (50 mg) S S S S Oleandomicina (1mg) S S S S Amoxicilina (30 mg) S S S S Bacitracina (10 U) S S S S Eritromicina (15 mg) I S S S Penicilina G (100 U) I I S I Enrofloxacina (15 mg) I I S I Kanamicina (30 mg) R R I R Cefuroxima(30 mg) R R I R Novobiocina (30mg) R R R R Fosfomicina(50 mg) R R R R Ácido nalidíxico (30 mg) R R R R Cefalotina (30 mg) R R R R Cloxacilina (5 mg) R R R R Nitrofurantoina (100 mg) R R R R Estreptomicina (10 mg) R R R R (S) Sensible (I) Sensibilidad Intermedia (R) Resistente 49 Resultados IV.2.- ADHERENCIA E INVASIÓN DE CORYNEBACTERIUM PSEUDOTUBERCULOSIS EN CÉLULAS NO FAGOCÍTICAS (LÍNEA CELULAR FLK-BLV-044) IV.2.1.- ESTABLECIMIENTO DE LAS CONDICIONES PREVIAS: CURVA DE CRECIMIENTO Y TIEMPO DE INFECCIÓN Previamente a la realización de los ensayos de adherencia e invasión de C. pseudotuberculosis en la línea celular no fagocítica de origen ovino FLK-BLV-044, determinamos la curva de crecimiento para C. pseudotuberculosis a fin de obtener un cultivo fresco en fase de crecimiento exponencial para la estandarización de los ensayos. En la Figura 2 observamos que hasta las 12 horas de incubación se mantiene la fase de latencia, pero a partir de ese momento comienza la fase de crecimiento logarítmico con un pico máximo a las 48 horas, momento en el que se inicia la fase estacionaria y, posteriormente, la fase de declive a partir de las 72 horas de iniciado el cultivo. A consecuencia de estos resultados, todos los ensayos de adherencia e invasión celular se realizaron con cultivos frescos con 48 horas de incubación. Figura 2. Representación gráfica del crecimiento de Corynebacterium pseudotuberculosis a lo largo del tiempo 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 O12 18 21 24 27 30 36 42 48 54 70 100 120 140 Absorbancia a 600 nm Tiempo de incubación (horas) Curva de crecimiento de C. pseudotuberculosis Fase de crecimiento Fase estacionaria Fase de latencia Fase de declive 50 Resultados En la Figura 3 y Tabla 5 se representa la tasa de invasión de las diferentes cepas de C. pseudotuberculosis en función del tiempo de incubación. Como observamos, la tasa de invasión aumenta con el incremento de la duración del contacto célula-bacteria en las 4 cepas analizadas, y así, la cepa IUSA-1 presenta la mayor tasa de invasión con un 0,164% a los 240 minutos. Comprobamos que a los 30 minutos de incubación prácticamente no observamos bacterias internalizadas, hecho que ocurre con las 4 cepas en estudio, que presentan una cinética de invasión celular semejante a lo largo del tiempo de infección, no apreciando diferencias estadísticamente significativas entre las cuatro cepas del estudio. Debido a estos resultados, en la estandarización definitiva del tiempo de infección para este ensayo se utilizó un periodo de incubación de 4 horas. Figura 3.- Efecto del tiempo de infección en la invasión de Corynebacterium pseudotuberculosis en la línea celular de origen ovino FLK-BLV-044 Tabla 5. Datos numéricos del efecto del tiempo de infección en la invasión de Corynebacterium pseudotuberculosis en la línea celular de origen ovino FLK-BLV-044 CEPAS Tiempo de infección (minutos) 30´ 60´ 90´ 120´ 150 180´ 210´ 240´ CECT-808T 0,039 0,058 0,072 0,087 0,102 0,115 0,127 0,139 ÍUSA-1 0,038 0,056 0,075 0,093 0,116 0,134 0,152 0,164 IUSA-2 0,038 0,057 0,074 0,095 0,120 0,120 0,126 0,133 TARA-1 0,039 0,056 0,074 0,091 0,124 0,124 0,134 0,143 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 0,18 30' 60' 90' 120' 150' 180' 210' 240' % Invasión Tiempo de infección (minutos) CECT-808T IUSA-1 IUSA-2 TARA-1 51 Resultados IV.2.2.- PORCENTAJE DE ADHERENCIA E INVASIÓN En la Figura 4 y Tabla 6, se representan las tasas de adherencia tras 4 horas de incubación de las cuatro cepas de C. pseudotuberculosis analizadas. Puede apreciarse que todas las cepas mostraron valores similares. En la Figura 4 observamos que los porcentajes de adherencia varían entre el 1,994% de la cepa IUSA-1 y el 1,494% de la cepa TARA-1, mientras que las cepas IUSA-2 y CECT-808T presentan tasas de adherencia intermedias, con valores de 1,602% y 1,701%, respectivamente, aunque a nivel estadístico no se observan diferencias estadísticamente significativas al comparar las tasas de adherencia de las 4 cepas de estudio. Figura 4. Adherencia de Corynebacterium pseudotuberculosis en la línea celular de origen ovino FLKBLV-044 0 0,5 1 1,5 2 2,5 CECT-808 T IUSA-1 IUSA-2 TARA-1 % Adherencia Cepas de C. pseudotuberculosis estudiadas 52 Resultados En la Figura 5 y Tabla 6 observamos las tasas de invasión de C. pseudotuberculosis en la línea celular FLK-BLV-044, tras 4 horas de incubación. La cepa IUSA-1 es la que presenta porcentualmente una mayor tasa de invasión (0,164%), mientras que la cepa IUSA-2 fue la que mostró menor tasa de invasión con el 0,133%. Finalmente, las cepas CECT-808T y TARA-1 presentan tasas de invasión intermedias, con valores de 0,139 y 0,143%, respectivamente, si bien a nivel estadístico, como ocurriera con la adherencia, no se observan diferencias significativas entre los valores encontrados para las 4 cepas estudiadas. Figura 5.- Invasión de Corynebacterium pseudotuberculosis en la línea celularde origen ovino FLK-BLV044 Tabla 6. Datos numéricos de la adherencia e invasión de Corynebacterium pseudotuberculosis en la línea celular de origen ovino FLK-BLV-044 CEPAS Porcentaje de adherencia Porcentaje de invasión CECT-808T 1,701 0,139 IUSA-1 1,994 0,164 IUSA-2 1,602 0,133 TARA-1 1,494 0,143 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 0,18 0,2 CECT -808 T IUSA-1 IUSA-2 TARA-1 Control % Invasión Cepas de C. pseudotuberculosis estudiadas 53 Resultados IV.2.3.- EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL INÓCULO En la Figura 6 y Tabla 7 observamos cómo varía la invasión de C. pseudotuberculosis en función de la variación de la multiplicidad de la infección (MOI), que representa el ratio nº de bacterias por célula. Como se observa, se producen aumentos significativos (p ˂ 0,05) de la tasa de invasión conforme incrementamos el ratio bacteria/célula de 5≈1 hasta 100≈1, no existiendo incremento en la tasa de invasión al incrementarse la MOI de 100≈1 a 150≈1. En la Figura, diferentes letras muestran diferencias estadísticamente significativas entre los valores comparados. Figura 6.- Efecto de la multiplicidad de la infección (MOI) de Corynebacterium pseudotuberculosis en la invasión en la línea celular FLK-BLV-044 Tabla 7. Datos numéricos de la multiplicidad de la infección (MOI) en la línea celular de origen ovino FLK-BLV-044 CEPAS Multiplicidad de infección (MOI) MOI≈5 MOI≈25 MOI≈50 MOI≈100 MOI≈150 CECT-808T 0.090 0,095 0,114 0,139 0,104 IUSA-1 0,090 0,113 0,145 0,164 0,131 IUSA-2 0,087 0,093 0,125 0,133 0,109 TARA-1 0,087 0,095 0,129 0,143 0,105 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 5 25 50 100 150 % Invasión Multiplicidad de la infección (MOI) CECT-808 T IUSA-1 IUSA-2 TARA-1 bcd bab aaa a abab aaa a aa a bc bc bc 54 Resultados IV.2.4.-EFECTO DE LA INCUBACIÓN DE LAS CÉLULAS A 4ºC En la Figura 7 y Tabla 8 observamos el efecto producido en la invasión de C. pseudotuberculosis a una MOI de 100≈1, tras la incubación previa de la línea celular FLK-BLV-044 a 4ºC para determinar la implicación del metabolismo celular en la internalización bacteriana. Como apreciamos en dicha Figura, el hecho de incubar la línea celular a esa temperatura produce una drástica disminución en la tasa de invasión de C. pseudotuberculosis (p ˂ 0,05) con todas las cepas analizadas, presentando todas ellas una tasa de invasión inferior al 0,04%. Figura 7.- Tasas de invasión de Corynebacterium pseudotuberculosis en la línea celular FLK-BLV-044 a 4ºC con una MOI inicial de 100≈1 *diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05) 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 CECT -808 T IUSA-1 IUSA-2 TARA-1 % Invasión CONTROL INCUBACIÓN A 4 ºC * * * * Cepas de C. pseudotuberculosis estudiadas * * * * * 55 Resultados IV.2.5.- EFECTO DE LA PREINCUBACIÓN CON ANTISUERO DE CONEJO En la Figura 8 y Tabla 8 podemos observar el efecto de la preincubación de C. pseudotuberculosis con suero completo (SC) y descomplementado (SD) anti-C. pseudotuberculosis. Como se observa en dicha Figura, las cuatro cepas estudiadas responden con un modelo similar en esta prueba; la incubación, tanto con suero completo como con suero descomplementado de conejo, produce una disminución estadísticamente significativa (p ˂ 0.05) en las tasas de invasión de todas las cepas de C. pseudotuberculosis incluidas en este estudio, en la línea celular FLK-BLV-044, a una MOI de 100≈1, respecto al grupo control, que fue incubado con PBS. Figura 8.- Efecto de la preincubación con suero anti-Corynebacterium pseudotuberculosis en la invasión de la línea celular FLK-BLV-044, a partir de una MOI de 100≈1 PBS: Buffer fosfato salino SD: Suero descomplementado anti-C.pseudotuberculosis SC: Suero completo anti-C.pseudotuberculosis *diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05) 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 0,18 0,2 CECT-808T IUSA-1 IUSA-2 TARA-1 % Invasion Cepas de C. pseudotuberculosis estudiadas PBS SD SC * * * * * * * * 56 Resultados Tabla 11. Datos numéricos expresados en porcentaje de la fagocítica de la línea celular J774 sobre Corynebacterium pseudotuberculosis, tras 120 minutos de incubación a una MOI 10≈1 CEPAS Porcentaje de fagocitosis CECT-808T 57,27 IUSA-1 66,66 IUSA-2 53,50 TARA-1 50,90 IV.3.3.- PERSISTENCIA Y/O REPLICACIÓN INTRACELULAR EN LA LÍNEA CELULAR DE RATÓN J774 En la Figura 14 y Tabla 12 observamos la evolución intracelular de C. pseudotuberculosis en la línea celular fagocítica de ratón J774, que fue inoculada con una MOI 10≈1. Los índices de proliferación intracelular (índice IPRO) de las cuatro cepas utilizadas en este estudio (CECT-808T, IUSA-1, IUSA-2 y TARA-1), que expresan la relación entre el número de bacterias viables a las 24 horas y 2 horas postinoculación, quedaron establecidos en 0,26, indicando la inexistencia de replicación activa de esta bacteria en el interior del macrófago en las condiciones estudiadas, pero sí una persistencia intracelular de C. pseudotuberculosis, al menos hasta las 72 horas postinoculación. No se apreciaron diferencias estadísticamente significativas entre los valores mostrados por las cepas estudiadas. Como observamos en la Figura 16, entre las 2 y 6 horas postinfección, se produce una drástica disminución de C. pseudotuberculosis en el interior de la línea celular J774, existiendo bacterias viables hasta las 72 horas, momento en que dimos por finalizada la experiencia al observar daño celular con destrucción del tapiz. 63 Resultados Figura 14.-Persistencia y replicación intracelular de Corynebacterium pseudotuberculosis en la línea celular fagocítica J774, que fue inoculada a una MOI 10≈1 Tabla 12.- Datos numéricos de la persistencia y replicación intracelular de Corynebacterium pseudotuberculosis en la línea celular fagocítica J774 inoculada a una MOI 10≈1 CEPAS Tiempo de infección (horas) 2 6 24 48 72 CECT-808T 63,76 61,04 13,32 3,34 1,32 IUSA-1 68,34 65,65 18,21 6,76 3,31 IUSA-2 61,43 45,35 9,78 0 0 TARA-1 56,98 50,32 5,33 0 0 IV.3.4.- ESTUDIO DE LA FAGOCITOSIS POR INMUNOFLUORESCENCIA La microscopia de fluorescencia confirmó la localización intracelular de C. pseudotuberculosis. En las imágenes, las bacterias intracelulares se marcaron en verde con el anticuerpo secundario alexa fluor-488, mientras que el ADN quedó marcado en azul por acción del DAPI (Figura 15). Se detectaron bacterias intracelulares hasta pasadas las 48-72 horas con una morfología redondeada y marcadas con DAPI, 0 10 20 30 40 50 60 70 80 2 6 24 48 72 % supervivencia intracelular Tiempo postinfección (horas) CECT-808T IUSA-1 IUSA-2 TARA-1 64 Resultados indicando la integridad de su ADN y su viabilidad en el interior de los macrófagos. En la Figura 15A se observa la superposición de imágenes de fluorescencia y contraste de fase, donde las bacterias intracelulares quedan marcadas en verde y el ADN en azul. La Figura 15B se corresponde con la imagen magnificada con sobreexposición del DAPI para la visualización del ADN celular y bacteriano. La Figura 15C muestra la imagen magnificada de un macrófago con bacterias fagocitadas, mientras que la imagen 15D muestra la imagen magnificada para la visualización de bacterias fagocitadas. Figura 15.- Fagocitosis de Corynebacterium pseudotuberculosis en la línea celular macrofágica J774 a una MOI de 10≈1 mediante inmunofluorescencia IV.3.5.- EXPLOSIÓN RESPIRATORIA Y CONTENIDO DE PEROXIDASA DE LEUCOCITOS DE RATÓN, OVEJA Y CABRA En la Figura 16 y Tabla 13 observamos los resultados del índice de explosión respiratoria, mientras que en la Figura 17 y Tabla 14 se representan los resultados obtenidos del contenido de peroxidasa en macrófagos de ratón (línea celular J774), oveja y cabra, tras la exposición con C. pseudotuberculosis, a una MOI 10≈1. D C B A 65 Resultados Respecto al índice de explosión respiratoria, se encontraron diferencias estadísticamente significativas atendiendo a la especie de procedencia de los macrófagos utilizados. Como se aprecia en la Figura 16 y Tabla 13, se produjo la inhibición de la explosión respiratoria de los fagocitos de oveja (p < 0,05), respecto a los valores encontrados en ratón y cabra, con todas las cepas de C. pseudotuberculosis utilizadas. Sin embargo, como observamos en la Figura 17 y Tabla 14, ninguna de las cepas estudiadas produce la inhibición de la producción del contenido de peroxidasa, y en el análisis estadístico de los datos entre las especies utilizadas, muestra únicamente diferencias estadísticamente significativas con las cepas CECT-808T, IUSA-2 y TARA1 en macrófagos de ratón (p < 0,05). Figura 16.- Índice de explosión respiratoria en macrófagos de ratón, oveja y cabra infectados con C. pseudotuberculosis, a una MOI 10≈1 *diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05) Tabla 13.- Datos numéricos del índice de la explosión respiratoria en leucocitos de ratón, oveja y cabra infectados con C. pseudotuberculosis CEPAS Macrófagos obtenidos de ratón oveja cabra CECT-808T 1,12 0,62 1,073 ÍUSA-1 1,18 0,62 1,103 IUSA-2 0,87 0,51 0,90 TARA-1 0,98 0,54 0,91 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 Ratón Oveja Cabra Indice de estimulación Macrófagos obtenidos de CECT-808T IUSA-1 IUSA-2 TARA-1 * * * * 66 Resultados Figura 17.- Contenido de peroxidasa en leucocitos de ratón, oveja y cabra infectados con C. pseudotuberculosis *diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05) Tabla 14.- Datos numéricos del contenido de peroxidasa en leucocitos de ratón, oveja y cabra infectados con C. pseudotuberculosis expresados como índice de estimulación CEPAS Macrófagos obtenidos de ratón oveja cabra CECT-808T 1,12 1,40 1,63 ÍUSA-1 1,27 1,41 1,47 IUSA-2 1,00 1,37 1,40 TARA-1 1,02 1,31 1,40 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 Ratón Oveja Cabra Índice de peroxidasa Macrófagos obtenidos de CECT-808T IUSA-1 IUSA-2 TARA-1 * * * 67 Resultados IV.4.- EFECTO BACTERICIDA DEL SUERO DE CABRA Y OVEJA SOBRE C. PSEUDOTUBERCULOSIS La resistencia/susceptibilidad de las cepas de C. pseudotuberculosis analizadas en este estudio, frente al efecto bactericida del suero de cabra y oveja se puede observar en las Figuras 18 y 19, respectivamente. Los resultados se expresan como porcentaje de bacterias viables tras la incubación con el suero completo de cabra y oveja (SC), durante 3 horas a 37ºC. Los resultados muestran el valor medio de cada lecturarealizada por triplicado, incluyendo los controles de cada una de las experiencias realizadas tras la incubación con suero descomplementado (SD), por tratamiento térmico para la eliminación del sistema del complemento. Tomando como base para la interpretación de esta prueba, la directriz que señala RL. Davies (1991), que considera a una cepa resistente al efecto bactericida del suero cuando tras 3 horas de incubación presenta un porcentaje de viabilidad superior al 100%, todas las cepas estudiadas mostraron un patrón de respuesta similar cuando fueron incubadas con suero de cabra y, de la misma manera, cuando fueron incubadas con suero de oveja. En la Figura 18 observamos que las cuatro cepas C. pseudotuberculosis estudiadas fueron susceptibles al efecto bactericida del suero de cabra, mientras que, en la Figura 19 podemos observar que esas mismas cepas analizadas fueron resistentes al efecto bactericida del suero de oveja. 68 Resultados Figura 18.- Resistencia del efecto bactericida del suero de cabra de las cepas de C. pseudotuberculosis estudiadas, expresada como porcentaje de viabilidad de cada cepa estudiadas, medida tras diferentes tiempos de incubación 0 20 40 60 80 100 120 0 h 1 h 2 h 3 h % Viabilidad bacteriana Tiempo (horas) SD SC (b) 0 20 40 60 80 100 120 140 0 h 1 h 2 h 3 h % Viabilidad bacteriana Tiempo (horas) SD SC (c) 0 20 40 60 80 100 120 0 h 1 h 2 h 3 h % Viabilidad bacteriana Tiempo (horas) SD SC (d) IUSA-1 IUSA-2 TARA-1 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100 102 0 h 1 h 2 h 3 h % Viabilidad bacteriana Tiempo (horas) SD SC (a)(a) CECT-808T SD: Suero descomplementado anti-C. pseudotuberculosis SC: Suero completo anti-C. pseudotuberculosis 69 Resultados Figura 19.- Resistencia del efecto bactericida del suero de oveja de las cepas de C. pseudotuberculosis estudiadas, expresada como porcentaje de viabilidad en diferentes tiempos de incubación 0 20 40 60 80 100 120 0 h 1 h 2 h 3 h % Viabilidad bacteriana Tiempo (horas) SD SC (a)(a) 90 95 100 105 110 115 120 0 h 1 h 2 h 3 h % Viabilidad bacteriana Tiempo (horas) SD SC (b) 85 90 95 100 105 110 115 0 h 1 h 2 h 3 h % Viabilidad bacteriana Tiempo (horas) SD SC (c) ( 80 85 90 95 100 105 110 0 h 1 h 2 h 3 h % Viabilidad bacteriana Tiempo (horas) SD SC (d) IUSA-1 CECT-808T IUSA-2 TARA-1 SD: Suero descomplementado anti-C. pseudotuberculosis SC: Suero completo anti-C. pseudotuberculosis 70 Discusión V.- DISCUSIÓN V.1.- ASPECTOS CLÍNICOS Y MICROBIOLÓGICOS DE LAS CEPAS DE C. PSEUDOTUBERCULOSIS OBJETO DE ESTUDIO La clínica encontrada en los animales, de los cuales se tomaron las muestras de los abscesos, a partir de los cuales aislamos cada una de las cepas estudiadas IUSA-1, IUSA-2 y TARA-1 (Tabla 2) en este trabajo, ha sido absolutamente convencional y, por tanto, coincidente con las formas clásicas de la enfermedad en los pequeños rumiantes, que se manifiestan con linfadenitis caseosa superficial, afectando a los ganglios linfáticos submandibulares y a la región retromamaria. Esta última localización se ha descrito ocasionalmente en el ganado caprino canario (Real y cols., 1993). Estos aspectos clínicos son coincidentes con los señalados previamente por otros autores (Unanian y cols., 1985; Brown y cols., 1986; Collins y Cummins, 1986). También coincide el curso subagudo a crónico, encontrado en los animales estudiados, respecto a los que señalan referencias previas (León, 1985). Y, aunque el estudio clínicopatológico fue muy reducido en número, no hemos apreciado otros cuadros que también se citan en la bibliografía como bronconeumonías caseosas (Addo y Dennis, 1977), abortos (Benham y cols., 1962), artritis y bursitis (Beer, 1981; Zarzuelo, 1981) epididimitis y endometritis (Mostafa y cols., 1973), ni cuadros septicémicos en animales jóvenes (León, 1985). Coincidiendo con Unanian y cols. (1985), no apreciamos diferencias significativas en el aspecto general relacionado con su peso corporal entre los animales enfermos y los sanos de los colectivos estudiados clínicamente (Tabla 2), aunque dicho valor no fue medido individualmente. Aunque no lo investigamos específicamente, tampoco hemos localizado, ni comprobamos la existencia de alguna evidencia clínica de la afección de ganglios linfáticos viscerales o de órganos internos, como se señalan en algunos casos (Zarzuelo, 1981; Batey, 1986a), por lo que, atendiendo a la clasificación de L. León (1985), de las dos formas posibles de la enfermedad, la que hemos estudiado es la linfadenítica. Pero, si nos centramos en la clasificación realizada por otros autores (Zarzuelo, 1981; Guada, 1986), la forma clínica presente en los animales del estudio fue la nodular, caracterizada 72 Discusión por ganglios linfáticos de consistencia pastosa, pudiendo afectar a cualquier ganglio corporal. Debido a la homogeneidad en la respuesta de nuestras cuatro cepas a los distintos antimicrobianos utilizados en este estudio, y aunque no entraban a formar parte de nuestros objetivos iniciales, hemos considerado interesante incluir estos datos en la discusión, aún conscientes de que corresponden a un número limitado de cepas como para poder considerar dichos resultados concluyentes. Según Judson y Songer (1991) las cepas de C. pseudotuberculosis nitrato reductasas negativas presentan una alta resistencia a la acción de los aminoglucósidos. Asimismo, estos autores refieren una mayor resistencia del biovar ovis frente al biovar equi (nitrato positivo). A este respecto las cuatro cepas que formaron parte de nuestro trabajo (Tabla 3) fueron nitrato reductasa negativas y, por tanto, se corresponden con C. pseudotuberculosis biovar ovis. En nuesto estudio entre los tres aminoglucósidos incluidos (gentamicina, kanamicina y estreptomicina) hemos encontrado una sensibilidad variable a los mismos, habiéndose mostrado todas nuestras cepas sensibles a la gentamicina y resistentes a la estreptomicina. Respecto a la kanamicina todas las cepas (Tabla 4) fueron resistentes excepto TARA-1, que mostró una sensibilidad intermedia. Bryan y cols. (1980) justificaron esta resistencia con la actividad nitrato reductasa, que incapacita el transporte de los aminoglucósidos por la membrana bacteriana. La gentamicina, según nuestros resultados, es activa frente a C. pseudotuberculosis biovar ovis, por lo que consideramos que la explicación dada por Bryan y cols. (1980) no debe ser la única causa de resistencia o sensibilidad a los aminoglucósidos. Romero y cols. (2008) obtuvieron tan solo un 32% de sensibilidad para este antimicrobiano, mientras que Estevao y cols. (2007) describen una alta sensibilidad a la gentamicina y kanamicina. En nuestro estudio, las cuatro cepas resultaron sensibles a la gentamicina, mientras que frente a la kanamicina, solo tres cepas mostraron resistencia antibiótica. Romero y cols. (2008), así como Estevao y cols. (2007) describen baja sensibilidad para otro antimicrobiano del grupo, la neomicina, la cual no hemos utilizado en nuestro estudio. Estos mismos autores señalan a la nitrofurantoina como un antimicrobiano poco efectivo in vitro frente a C. pseudotuberculosis, si bien el 100% de sus cepas mostraron una sensibilidad intermedia, a diferencia de nuestras cepas que mostraron un 100% de resistencia. Por otro lado, se han descrito aislamientos resistentes a los nitrofuranos 73 Discusión bacterianos y la línea celular usada, o la utilización de métodos distintos a la hora de cuantificar las bacterias internalizadas. Elkamel y Thune (2003) y López-Dóriga y cols. (2000), trabajando con Photobacterium damselae subsp. piscicida con la línea celular EPC (línea epitelial de células de carpa), obtuvieron resultados contradictorios en la capacidad de replicación intracelular de este patógeno. En nuestro caso, la variabilidad que han podido inducir estos factores es muy reducida al haber realizado los experimentos por triplicado y someter a todas las cepas de estudio a los mismos métodos de evaluación en paralelo. Por otro lado, y con respecto a estudios similares realizados con C. pseudotuberculosis, no existe hasta la fecha referencia alguna que nos permita comparar los resultados obtenidos, por lo que sólo podemos concluir que la adherencia y la invasión intracelular dependen directamente de los factores señalados anteriormente. Una vez hemos comprobado que diferentes cepas de C. pseudotuberculosis son capaces de penetrar en células no fagocíticas de origen ovino, y de multiplicarse y permanecer en el interior celular a través de estos resultados, estamos convencidos de que un mejor conocimiento de las interacciones de C. pseudotuberculosis en células no fagocíticas y, por tanto, de las interacciones bacteria-célula, puede ayudar al desarrollo de nuevas herramientas para combatir esta enfermedad, y también aumentará nuestra evidencia documental sobre el sistema inmune de las especies ovina y caprina. En resumen, nuestros datos indican que C. pseudotuberculosis es capaz de invadir células no fagocíticas de origen ovino y que, una vez en su interior, es capaz de replicarse, permaneciendo viable durante más de 120 horas. Estos hallazgos in vitro son de sumo interés, ya que plantean la posibilidad de que este patógeno pueda difundirse in vivo a través de este tipo de células, facilitando la difusión del microorganismo, permitiéndole a la vez, cierto grado de protección frente a los mecanismos defensivos del hospedador infectado, otorgándole un nicho adecuado para su multiplicación y permanencia, permitiendo también el establecimiento del estado de portador en el curso de la infección. En el organismo vivo, la diseminación de C. pseudotuberculosis tiene lugar de manera casi inmediata a la infección primaria (León y cols., 2002b). En nuestro modelo 80 Discusión experimental in vitro no podemos, ni hemos pretendido, valorar la participación de algunos factores de difusión que contribuyen de forma activa para la difusión local del microorganismo en la patogenia de la enfermedad. De esta manera, la exotoxina facilita el transporte y la difusión del microorganismo por vía linfática hasta el estrato linfático inmediato (nódulo linfático regional), y su efecto se concreta en un incremento de la permeabilidad vascular (Brown y cols., 1986; Carne y Onon, 1978), actuando directamente sobre las células endoteliales en el entorno del punto de infección y, posteriormente, en otros territorios orgánicos. Pero a la exotoxina también se le reconoce una acción fosfolipídica (por una fosfolipasa D) que ocasiona reacciones de contracción celular y, como consecuencia, aumento de la permeabilidad capilar (Carne y Onon, 1978). En definitiva, el efecto permeabilizante sobre las membranas celulares del organismo vivo, se traduce en facilitar la afluencia de granulocitos y macrófagos al punto de infección y, posteriormente, su incorporación a la corriente linfática y hemática (León y cols., 2002b). Y, desde la puerta de entrada, las corinebacterias se difunden por vía linfática, normalmente transportadas por los macrófagos, pero también libres, hasta los nódulos linfáticos regionales, e incluso hasta órganos internos, donde continúan su multiplicación bacteriana, a la par que producen las lesiones características (Hard, 1972; Blood y cols., 1979). Todas estas serían las principales limitaciones que no pueden ser comparables con los métodos desarrollados en nuestro estudio in vitro. Pero, en cualquier caso, la supervivencia de la bacteria en células no fagocíticas resulta esencial a la hora de facilitar la difusión del microorganismo en el hospedador vivo. Una vez establecida la base de que C. psedotuberculosis es un patógeno intracelular facultativo, capaz de residir en el interior de células no fagocíticas, quedan abiertas nuevas incógnitas como líneas futuras de investigación en este campo específico. Completar en profundidad el estudio del tráfico intracelular de C. pseudotuberculosis en células no fagocíticas de los pequeños rumiantes puede permitirnos conocer las bases celulares y moleculares de dichos procesos, hoy en día totalmente desconocidos. Y, estudiar las estrategias de invasión y tráfico intracelular de C. pseudotuberculosis en células no fagocíticas, no solo puede ayudar al desarrollo de nuevas dianas terapéuticas y vacunas, sino también, a identificar aspectos desconocidos de las vías de señalización relacionadas con la respuesta inmune de base celular, frente a las infecciones por C. pseudotuberculosis y otros patógenos intracelulares de las especies animales y humana. 81 Discusión La interacción con células no fagocíticas animales, puede conferir a C. pseudotuberculosis cierto grado de protección frente a las defensas de las cabras y ovejas, o proporcionarle un nicho adecuado en el establecimiento del estado de portador. Además, la infección por este patógeno de células no pertenecientes al sistema inmune, podría afectar al curso de la infección en los tejidos, ya que actualmente se sabe que las infecciones bacterianas activan defensas celulares directa o indirectamente, a través de la inducción de mediadores proinflamatorios y citoquinas. V.3.- INTERACCIONES DE C. PSEUDOTUBERCULOSIS CON CELULAS FAGOCITICAS La segunda parte de nuestro estudio la hemos desarrollado con la línea celular de ratón J744, de naturaleza macrofágica. Los macrófagos son células efectoras, destruyen una gran variedad de patógenos bacterianos que son fagocitados y expuestos a un medio ambiente perjudicial. No todos los microorganismos que entran en un fagocito especializado son expuestos a este medio perjudicial, y otros tantos tampoco llegan a ser realmente fagocitados por estas células. Los microorganismos, en muchos casos, invaden las células y forman una vacuola con características que son controladas por las bacterias patógenas y no por la célula fagocítica (Arenas y cols., 2000). Los macrófagos están presentes en todos los sistemas orgánicos, y constituyen una de las primeras barreras que un microorganismo encuentra cuando entra en un organismo superior. Los macrófagos tienen un papel importante en la respuesta inmune, pues son los primeros en eliminar microorganismos invasores a través de la fagocitosis y la liberación de sustancias bactericidas como los radicales superóxido. Además, pueden atraer rápidamente otras células con capacidad de respuesta inmune, de los tejidos, sangre y hematopoyéticas, neutrófilos y monocitos por la liberación de citoquinas y sustancias quimiotácticas. Dado que los macrófagos son uno de los tipos de células que los patógenos intracelulares facultativos tienen probabilidades de encontrarse, tras su entrada en un hospedador, y debido a su destacado papel en la respuesta inmune, no resulta sorprendente que algunos de estos patógenos se hayan adaptado a vivir dentro de estas células como parte de su ciclo de vida, usando la parasitación intracelular como un 82 Discusión escudo contra otras respuestas inmunes de naturaleza humoral, que podrían resultarles perjudiciales. Tal y como sucede en el organismo vivo, en la estrategia antifagocítica de C. pseudotuberculosis intervienen dos componentes de la célula bacteriana, la exotoxina y la capa lipídica externa. La exotoxina ejerce una acción en parte inhibidora del factor de agregación de los macrófagos, mientras que la capa lipídica presente en la zona externa de la pared bacteriana interviene decisivamente en la diseminación de la infección, actuando a tres niveles: 1) como un elemento quimiotáctico de atracción de los fagocitos, 2) mayor persistencia endofagocitaria al inducir una resistencia bacteriana a los enzimas líticos lisosomales, correspondiéndose directamente con el grosor de la capa lipídica de la pared celular de una cepa (Hard, 1972 y 1973), y 3) desarrollando un efecto patógeno leucotóxico que origina degeneración y lisis de macrófagos y polimorfonucleares (Tashjian y Campbell, 1983). Estudios previos demostraron que, microorganismos intracelulares, como es el caso de C. pseudotuberculosis, desarrollan una serie de estrategias para sobrevivir en el interior celular. Hasta ahora, solamente pocos estudios (Stefanska y cols., 2010) investigaron las interacciones de C. pseudotuberculosis con los macrófagos. Pero se ha demostrado que este microorganismo se comporta esencialmente como una bacteria endocelular facultativa (Jolly, 1965; Cameron y Fuls, 1973), cualificada para la persistencia en el interior del fagocito, sobre todo en los macrófagos. Y es el lípido externo de la bacteria el que permite la formación de agregados bacterianos en el interior del fagocito, resistiendo de esta forma los enzimas lisosomales (Muckle y Gyles, 1983). Otros estudios realizados con yersinias patógenas humanas (Y. enterocolitica, Y. pestis y Y. pseudotuberculosis) han demostrado que estas bacterias son también capaces de sobrevivir y multiplicarse dentro de los macrófagos (Cavanaugh y Randall, 1959; Une, 1977; Yamamoto y cols., 1996; Pujol y Bliska, 2003). En el presente trabajo se utilizaron cuatro cepas diferentes de C. pseudotuberculosis, CECT-808T, IUSA-1, IUSA-2 y TARA-1, cuyos datos sobre su origen y fuente se presentan en la Tabla 2. Nuestros resultados reflejan que, tras 2 horas de incubación, las cuatro cepas de C. pseudotuberculosis analizadas, presentaron valores similares en las tasas de fagocitosis en la línea celular J774 (Figuras 14 y 15). 83 Discusión Asimismo, concluimos que la tasa de fagocitosis aumenta con el tiempo de incubación. Dicha tasa comenzó a ser efectiva, para las cuatro cepas señaladas, a los 30 minutos postincubación (Figura 14), obteniendo un valor máximo a los 240 minutos. Pero no podemos ligar a estos resultados ningún efecto distintivo de nuestras cepas desde el punto de vista microbiológico, pues todas tuvieron un comportamiento similar, ni formaba parte de los objetivos del presente trabajo la búsqueda de diferencias en el grosor de la capa lipídica, que podría haberse realizado mediante estudios de microscopía electrónica. Sería muy útil la comparación de los resultados obtenidos con la línea celular J774 con los que ofrecerían macrófagos obtenidos directamente de ganado ovino y caprino, de rebaños en su medio natural, así como de animales gnotobióticos, pues se sugiere la existencia de diferencias patogénicas entre la oveja y la cabra, con respecto tanto a la difusión hemolinfática como al embolismo pulmonar de corinebacterias (Batey, 1986b). Y estos resultados serían especialmente relevantes investigando también lotes de animales previamente inmunizados con el anacultivo de C. pseudotuberculosis. Nuestros resultados también permitieron concluir que C. pseudotuberculosis no se multiplica activamente en el interior celular de la línea J774 (Figura 16), ya que a partir de las 6 horas post-infección, se produce una drástica disminución del número de bacterias viables en el interior celular. Pero pudimos encontrar bacterias intracelulares hasta las 72 horas post-inoculación. Este hecho representa una clara ayuda, por parte del hospedador, a la hora de facilitar la progresión del patógeno en los animales infectados. Debemos enfatizar el papel que juega en el animal vivo la exotoxina bacteriana (Pépin y cols., 1991) como un factor de difusión de la infección, facilitando el transporte y la diseminación del microorganismo por vía linfática hasta el estrato linfático inmediato, pues las corinebacterias se difunden por vía linfática, normalmente transportadas por los macrófagos, pero también libres, hasta los nódulos linfáticos regionales e incluso hasta órganos internos (León y cols., 2002b). Además, con posterioridad, puede ocurrir una difusión secundaria, por vía hemática y linfática, que origina metástasis en vísceras diversas (Brogden y cols., 1984). Al comparar los modelos in vitro e in vivo, el tiempo limitado de supervivencia de C. pseudotuberculosis en la línea celular macrofágica J774 (Figura 16) contrasta con 84 Discusión la persistencia frecuente de la infección que sucede en el hospedador vivo, cuya causa podríamos relacionar con diferentes hechos que suceden en el hospedador, como la difusión intraorgánica favorecida por la corriente linfática y hemática y la propia respuesta celular en la reacción anti-C. pseudotuberculosis. Por su parte, su supervivencia “in vitro” (Figura 16) está constreñida a la capacidad de las células para mantenerse viables en el medio de cultivo, una vez que se activan los mecanismos de muerte celular. En definitiva, la supervivencia de las corinebacterias en los macrófagos y su destrucción es un hecho conocido que permite su difusión intraorgánica (Tashjian y Campbell, 1983). No obstante, nuestros resultados se asemejan a los descritos por otros estudios previos que, tanto mediante inmunofluorescencia como por recuento bacteriano, encontraron bacterias dentro de estas células (McKean y cols., 2005, Stefanska y cols., 2010). Además, los resultados que obtuvimos por microscopia de fluorescencia demostraron un considerable potencial de C. pseudotuberculosis para ser fagocitado por la línea celular de ratón (J774) (Figura 17). Estos experimentos, siendo limitados en cierta medida a la hora de establecer comparaciones con lo que ocurriría en un animal vivo, ayudan a entender mejor varios aspectos de la patogenia de la seudotuberculosis. Pero se necesita en el futuro una mejor identificación y caracterización de los factores de virulencia de este patógeno, para poder comprender mejor la patocronia de la enfermedad (Dorella y cols., 2006), y los factores que intervienen en el desarrollo de este proceso morboso en los animales vivos. De otra parte, llama la atención que el estímulo con el patógeno sea capaz de inducir la inhibición de la explosión respiratoria de los fagocitos de oveja, respecto de los valores que presentan los fagocitos de ratón y cabra (Figura 18), siendo las diferencias encontradas estadísticamente significativas (p < 0,05). A pesar de que el tamaño de la muestra, en este caso, no fue suficientemente representativo como para concluir de manera tajante en este sentido, los resultados indican la posibilidad de que existan diferencias interespecíficas importantes, que pueden ser manifiestas, incluso entre ovejas y cabras. Sin embargo, tales diferencias no se producen cuando comparamos el contenido de peroxidasa de leucocitos de ratón, oveja y cabra (Figura 19). 85 Discusión Y, en la misma línea, sí encontramos diferencias interespecíficas, entre ovejas y cabras, al estudiar el efecto bactericida del suero de cada una de estas especies sobre Corynebacterium pseudotuberculosis (Figuras 20 y 21), pues todas las cepas estudiadas fueron susceptibles al efecto bactericida del suero de cabra, pero resistentes al de oveja. 86 Conclusiones VI.- CONCLUSIONES PRIMERA.- La capacidad de invadir la línea celular FLK-BLV-044 por parte de C. pseudotuberculosis se ve influenciada, al menos, por los siguientes mecanismos: 1) metabolismo celular, y 2) presencia de receptores bacterianos y/o ligandos bacterianos específicos. SEGUNDA.- Corynebacterium pseudotuberculosis es capaz de adherirse e invadir la línea celular FLK-BLV-044 y, una vez en su interior, se replica ligeramente permaneciendo viable durante al menos 6 días, planteando la posibilidad de que dicho patógeno se difunda a través de células no fagocíticas, pudiendo así facilitar la progresión de la infección en un hospedador. TERCERA.- La línea celular macrofágica de ratón J774 ejerce una buena cinética de fagocitosis sobre C. pseudotuberculosis a partir de 120 minutos postinfección, donde la bacteria persiste, al menos, hasta las 72 horas postinoculación, aunque no se replica activamente en su interior. CUARTA.- Demostrada la persistencia de C. pseudotuberculosis, al menos durante 72 horas, en la línea celular no fagocítica FLK-BLV-044 y fagocítica J774, sin embargo, la cantidad de bacteria presente en ambos casos es muy distinta en tiempos similares; tasa de invasión del 0,13% en la no fagocítica y una tasa de fagocitosis del 54,38% en la fagocítica a los 240 minutos postinfección. QUINTA.- En las condiciones de nuestro estudio, la oveja se comporta como una especie más sensible que la cabra al estímulo inhibitorio de la explosión respiratoria de los macrófagos y al efecto bactericida del suero, promovidos tras el contacto previo con C. pseudotuberculosis, hecho que podría dificultar la eliminación del patógeno por el sistema inmunológico. 87 Bibliografía VII.- BIBLIOGRAFIA A brigo, J. 1984. Pseudotuberculosis o apostemas de los ovinos. Informe URISA Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Bariloche. Argentina. Acord, J., Maskell, J. y Sefton, A. 2005. A rapid microplate method for quantifying inhibition of bacterial adhesion to eukaryotic cells. Journal of Microbiology Methods 60 (1), 55-62. Acosta, F., Real, F., Caballero, M.J., Sieiro, C., Fernández, A., Rodríguez, L.A. 2002. Evaluation of immunohistochemical and microbiological methods for the diagnosis of brown trout infected with Hafnia alvei. Journal of Aquatic Animal Health 14, 77-83. Acosta, F., Vivas, J., Padilla, D., Vega, J., Bravo, J., Grasso, V y Real, F. 2009. Invasion and survival of gilt-head seabream (Sparus aurata) non-phagocytic cells by Photobacterium damselae subsp. piscicida. Journal of Fish Diseases 32 (6), 535-541. Addo, P.B. y Dennis, S.M. 1977. Corynebacteria associated with diseases of cattle, sheep and goats in northern Nigeria. British Veterinary Journal, 135, 334-339. Aleman, M. y Spier, S.J. 2001. Corynebacterium pseudotuberculosis infection. In: “Large Animal Internal Medicine”, 3d ed. Edited by Smith P.B. St Louis: Mosby Co. pp. 1078-1084. Aleman, M., Spier, S.J., Wilson, W.D., Doherr, M. 1996. Corynebacterium pseudotuberculosis infection in horses: 538 cases (1982-1993). Journal of the American Veterinary Medical Association, 209 (4): 804-809. Ali, H.S., Zaitoun, A.M. 1999. Studies on cutaneous suppurative lymphangitis in buffaloes at Assiut Governorate-Egypt. Assiut Veterinary Medical Journal 41, 208-222. Alonso J.L., Simón, M.C., Girones O., Múzquiz, J.L., Ortega, C., García, J. 1992. The effect of experimental infection with Corynebacterium pseudotuberculosis on reproduction in adult ewes. Research in Veterinary Science 52, 267-276. Anderson, V.M., Nairn, M.E. 1984. Control of caseous lymphadenitis in goats by vaccination. En: Les Maladies de la Chevre. Les Colloques de l’INRA 28, 605-609. Arenas, N., Staskevich, S., Avallay, A. y Mayorga, L. 2000. Intracellular trafficking of Brucella abortus in J774 macrophages. Infection and Immunity 68, 4255-4263. Arsenault, J., Girard, C., Dubreuil, P., Daignault, D., Galarneau, J.R., Boisclair J., Simard, C., Belanger, D. 2003. Prevalence of and carcass condemnation from Maedivisna, paratuberculosis and caseous lymphadenitis in culled sheep from Québec, Canada. Preventive Veterinary Medicine 30 (59), 67-81. 88 Bibliografía Ayers, J.L. 1977. Caseous lymphadenitis in goats and sheep: a review of diagnosis, pathogenesis, and immunity. Journal of the American Veterinary Medical Association 171, 1251-1254. B aird, G.J., Fontaine, M.C. 2007. Corynebacterium pseudotuberculosis and its role in ovine caseous lymphadenitis. Journal of Comparative Pathology 137, 179-210. Baird, GJ., Malone, FE. 2010. Control of caseous lymphadenitis in six sheep flocks using clinical examination and regular ELISA testing. Veterinary Record 166 (12), 35862. Barta, O. 1993. Serum´s lymphocyte inmunoregulartory factors (SLIF). Veterinary Immunology and Immunopathology 4, 279-306. Bartolomé, J., Roca, MJ., Marcote, E., Moreno, R. 1995. Corynebacterium pseudotuberculosis adenitis in a shepherd. Medicina Clínica 104, 699-701. Batey, R.G. 1986a. "Frequency and consequence of caseous lymphadenitis in sheep and lambs slaughtered at Western Australian abattoir". American Journal of Veterinary Research 47 (2), 482-485. Batey, R.G. 1986b. Pathogenesis of caseous lymphadenitis in sheep and goats. Australian Veterinary Journal 63, 269-272. Bauer, A.W., Kirby, W.M., Sherris, J.C. y Turck, M. 1966. Antibiotic susceptibility testing by standardized single disk method. American Journal of Clinical Pathology 45, 493-496. Beer, J. 1981. La seudotuberculosis en “Enfermedades Infecciosas de los Animales Domésticos”. Edit Acribia. Vol. 2, 38-39. Benham, C.L., Seaman, A. y Woodbine, M. 1962. Corynebacterium pseudotuberculosis and its role in diseases of animals. Veterinary Bulletin., 32, 645-657. Bernheimer, A.W., Linder, R., Avigad, L.S. 1980. Stepwise degradation of membrane sphingomyelin by corynebacterial phospholipases. Infection and Immunity 29, 123-131. Blood, D.C., Henderson, J.A. y Radostits, O.M. 1979. Caseous lymphadenitis in sheep. In: “Veterinary Medicine”. 5th ed. Bailliere Tindall. Londres. págs. 420-421. Boesen, J.T., Larsen, M.H., Larsen, J.L., Ellis, A.E. 2001. In vitro interactions between rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) macrophages and Vibrio anguillarum serogroup O2a. Fish and Shellfish Immunology 11, 415-431. Bofill, P., Rivas, C.A., Ramírez, W., Montañés, J., Martínez, M., Quincoses, T., Reinaldo, L., Fustes, E. 1988. Manual de enfermedades infecciosas. Tomo I. ISCAH. ENPES. 132-138. Braga, W.U., Chavera, A.E., González, A.E. 2006. Clinical, humoral, and pathologic findings in adult alpacas with experimentally induced Corynebacterium 89 Bibliografía Keisari, Y., Kabha, K., Nissimov, L., Schlepper-Schafer, J., Ofek, Y. 1997. Phagocytebacteria interactions. Advances in Dental Research 11 (1), 43-49. Ketterer, MR., Shao, J., Hornick, D., Buscher, B., Bandi, V., Apicella, M. 1999. Infection of primary human bronchial epithelial cells by Haemophilus influenzae: macropinocytosis as a mechanism of airway epithelial cell entry. Infection and Immunity 67, 4161-4170. Kim, KS. 2001. Escherichia coli translocation at the blood-brain barrier. Infection and Immunity 69, 5217-5222. Koneman, E.W., Allen, SD., Janda, W.M., Schreckenberger, P.C., Winn, W.C. 1999. Diagnóstico Microbiológico. Editorial. Médica Panamericana, Argentina, 653. Kotwal, G.J. 1997. Microorganisms and their interaction with the immune system, Journal of Leukocytes Biology 62 (4), 415-429. Kuria, J.K.N., Holstad, G. 1989. Serological investigation of Corynebacterium pseudotuberculosis infection in sheep-correlation between the hemolysis inhibition test and the ELISA test. Acta Veterinaria Escandinavica 30 (1), 109-110. L aak, E.A., Schreuder, B.E. 1991. Serological diagnosis of caseous lymphadenitis in goat and sheep. Veterinary Record 128 (18), 436-438. Laak, E.A., Bosch, J., Bijl, C.G., Schreuder, B.E.C. 1992. Double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay and immunoblot analysis used for control of caseous lymphadenitis in goats and sheep. American Journal of Veterinary Research 53 (7), 1125-1132. LeaMaster, B.R., Shen, D.T., Gorham, J.R., Leathers, C.W., Wells, H.D. 1987. Efficacy of Corynebacterium pseudotuberculosis bacterin for the immunologic protection of sheep against development of caseous lymphadenitis. American Journal of Veterinary Research 48 (5), 869-872. Leardini, N., Prieto, M., Martínez, C., Aguirre, L., Loaysa, R. 2002. Infecciones por bacilos Gram positivos aeróbicos, corinebacterias, Bacillus y Actinomycetes. En: “Curso A.N.L.I.S. Dr. Carlos Malbrán”. Departamento de Bacteriología, Servicio de Bacteriología Especial. Lee, C.A. 1996. Pathogenicity islands and the evolution of bacterial patogens. Infectious Agents and Disease Journal 5 (1), 1-7. León, L. 1985. Patología y control de las infecciones animales por corinebacterias. IX Congreso Nacional de Microbiología. Sociedad Española de Microbiología (ed.), 2, 411-416. León, L., Garrido, F., González, M. 2002a. Anatomía patología de la pseudotuberculosis. Revista Ovis 78, 77-90. 96 Bibliografía León, L., Garrido, F., González, M., Cubero, M.J. 2002b. Patogenia de la pseudotuberculosis. Revista Ovis 78, 41-61. León, L., Real, F., González, M., Garrido, F. y Cubero, M.J. 2002c. Diagnóstico de la seudotuberculosis o linfadenitis caseosa. Revista Ovis, 79: 33-49. Lipsky, B.A., Goldberger, A.C., Tompkins, L.S., Plorde, J.J. 1982. Infections caused by non diphtheria corynebacteria. Reviews of Infectious Diseases 4, 1220-1235. Literak, I., Horvathova, A., Jahnova, M., Rychlik, I., Skalka, B. 1999. Phenotype and genotype characteristics of the Slovak and Czech Corynebacterium pseudotuberculosis strains isolated from sheep and goats. Small Ruminant Research 32, 107-111. Loewen, P.C. 1997. Bacterial catalases. En: “Oxidative Stress and the Molecular Biology of Antioxidants Defenses”. (Scandalios, JG, ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Woodbury, New York, pp 273-308. López-Doriga, M.V., Barnes, A.C., Dos Santos, N.M. 2000. Invasion of fish epithelial cells by Photobacterium damselae subsp. piscicida: evidence for receptor specificity and effect of capsule and serum. Microbiology 146, 21-30. Liu, D.T.L., Chan, W.M., Fan, D.S.P., Lam, D.S.C. 2005. An infected hydrogel buckle with Corynebacterium pseudotuberculosis. British Journal of Ophthalmology 89, 245246. Luo, D. Y., Li, P., Xing, L., Zhao, G. Y., Shi, W., Zhang, S. L., Wang, X. L. 2006. DNA vaccine encoding L7/L12-P39 of Brucella abortus induces protective immunity in BALB/c mice. Chinese Medical Journal 119 (4), 331-334. Lynch, M. y Kuramitsu, H. 2000. Expression and role of superoxide dismutases (SOD) in pathogenic bacteria. Microbes and Infection 2 (10), 1245-1255. M agariños, B., Romalde, J.L., Noya, M., Barja, J.L. y Toranzo, A.E. 1996. Adherence and invasive capacities of the fish pathogen Pasteurella piscicida. FEMS Microbiology Letters 138, 29-34. Maki, L.R., Shen, S.H., Bergstrom, R.C., Stetenbach, L. 1985. Diagnosis of Corynebacterium pseudotuberculosis infection in sheep, using an enzyme linked immunosorbent assay. American Journal of Veterinary Research 46 (1), 212-214. Martin, D.W. y Mohr, C.D. 2000. Invasion and intracellular survival of Burkholderia cepacia. Infection and Immunity 68, 24–29. McCaffrey, R.L., Allen, L.A. 2006. Francisella tularensis LVS evades killing by human neutrophils via inhibition of the respiratory burst and phagosome escape. Journal of Leukocyte Biology 80, 1224-1230. McKean, S., Davies, J. y Moore, R. 2005. Identification of macrophage induced genes of Corynebacterium pseudotuberculosis by differential fluorescence induction. Microbes and Infection 7, 1352-1363. 97 Bibliografía McNamara, P.J., Cuevas, W.A., Songer, J.G. 1995. Toxic phospholipases D of Corynebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterium ulcerans and Arcanobacterium haemolyticum: cloning and sequence homology. Gene 156, 113-118. Medrano, G., Hung, A., Alvarado, A., Li, O. 2003. Evaluación de una vacuna contra Corynebacterium pseudotuberculosis en ratones albinos. Revista de Investigaciones Veterinarias de Perú 14 (1), 61-67. Meier, C., Oelschlaeger, T., Merkert, H., Korhonrn, T., Hacker, J. 1996. Ability of Escherichia coli that cause meningitis in newborns to invade epithelial and endothelial cells. Infection and Immunity 64, 2391-2399. Menzies, P., Muckle, A. 1989. The use of micro agglutination assay for the detection of antibodies to Corynebacterium pseudotuberculosis in naturally infected sheep and goat flocks. Canadian Journal of Veterinary Research 53, 313-318. Menzies, P.I., Muckle, C.A., Hwang, Y.T., Songer, J.G. 1994. Evaluation of an Enzyme-linked immunosorbent assay using and Escherichia coli recombinant phospholipase D antigen for the diagnosis of Corynebacterium pseudotuberculosis infection. Small Ruminant Research 13 (2), 193-198. Mills, S.D. y Finlay, B.B. 1994. Comparison of Salmonella typhi and Salmonella typhimurium invasion, intracellular growth and localization in cultured human epithelial cells. Microbial Pathogenesis 17, 409–423. Moller, K., Agerholm, J.S., Ahrens, P. 2000. Abscess disease, caseous lymphadenitis, and pulmonary adenomatosis in imported sheep. Journal of Veterinary Medicine B: Infectious Diseases and Veterinary Public Health 47, 55-62. Monteville, MR., Konkel, ME. 2002. Fibronectin-facilitated invasion of T84 eukaryotic cells by Campylobacter jejuni occurs preferentially at the basolateral cell surface. Infection and Immunity 70, 6665-6671. Monteville, MR., Yoon, JE., Konkel, ME. 2003. Maximal adherence and invasion of INT 407 cells by Campylobacter jejuni requires the CadF outer-membrane protein and microfilament reorganization. Microbiology 149, 153-165. Morrison, JR., Tillotson, GS. 1988. Identification of Actinomyces (Corynebacterium) pyogenes with the API 20 Strep system. Journal of Clinical Microbiology 26 (9), 18651866. Mostafa, A.S., Khater, A., Satyour, E.M. y El-Sawaf, S.A. 1973. Some aspects of reproductive failure due to Corynebacterium ovis infection in Merino ewes. Journal of Egyptian Veterinary Medical Association, 33, 127-132. Muckle, C.A. y Gyles, C.L. 1982. Characterization of strains of Corynebacterium pseudotuberculosis. Canadian Journal of Comparative Medicine 46, 206-208. 98 Bibliografía Muckle, C.A. y Gyles, C.L. 1983. Relation of lipid content and exotoxin production to virulence of Corynebacterium pseudotuberculosis in mice. American Journal of Veterinary Research 44 (6), 1149-1153. Muckle, C.A., Gyles, C.L. 1986. Exotoxic activities of Corynebacterium pseudotuberculosis. Current Microbiology 13, 57-60. N agy, G. 1976. Caseous lymphadenitis in sheep: methods of Infection. Journal of the South African Veterinary Medical Association 47, 197-199. Nairn, M.E., Robertson, J.P. 1974. Corynebacterium pseudotuberculosis infection of sheep: role of skin lesions and dipping fluids. Australian Veterinary Journal 50, 537542. Nairn, M.E., Robertson, J.P., McQuade, N.C. 1977. The control of caseous lymphadenitis in sheepby vaccination. En: Proceedings of the 54th Annual Conference of the Australian Veterinary Association, 159-161. O elschlaeger, T., Tall, B. 1997. Invasion of cultured human epithelial cells by Klebsiella pneumoniae isolated from urinary tract. Infection and Immunity 65, 29502958. Ojcius, D.M., Gachelin, G., Dautry-Varsat, A. 1996. Presentation of antigens derived from microorganisms residing in host-cell vacuoles. Trends in Microbiology 4 (2), 5359. P acheco, L., Pena, R., Castro, T., Dorella, F., Bahia, R., Carminati, R., Frota, M., Oliveira, S., Meyer, S., Alves, F., Miyoshi, A., Azevedo, V. 2007. Multiplex PCR assay for identification of Corynebacterium pseudotuberculosis from pure cultures and for rapid detection of this pathogen in clinical samples. Journal of Medical Microbiology 56(4), 480-6. Padilla, D., Acosta, F., Bravo, J., Grasso, V., Real, F. y Vivas, J. 2008. Invasion and intracellular survival of Hafnia alvei strains in human epithelial cells. Journal of Applied Microbiology 105, 1614–1622. Padilla, D., Acosta, F., Vega, J., Sorroza, L., Román, L., Bravo, J., Real, F. y Vivas, J. 2010. Study of adherence, invasion and survival of Hafnia alvei in rainbow trout gonad fish cell line (RTG-2). Fish Pathology 45, 179-182. Palmer, L., Reilly, T., Utsalo, S., Donnenberg, M. 1997. Internalization of Escherichia coli by human renal epithelial cells is associated with tyrosine phosphorylation of specific host cell proteins. Infection and Immunity 65, 2570-2575. Paton, M.W., Mercy, A.R., Sutherland, S.S., Ellis, T.M. 1988. The influence of shearing and age on the incidence of caseous lymphadenitis in Australian sheep flocks. Acta Veterinaria Scandinavica, 84, 101-103. 99 Bibliografía Paton, M.W., Rose, I.R., Hart, R.A., Sutherland, S.S., Mercy, A.R., Ellis, T.M., Dhaliwal, J.A. 1994. New infection with Corynebacterium pseudotuberculosis reduces wool production. Australian Veterinary Journal 71, 47-49. Paton, M.W., Rose, I.R., Hart, R.A., Sutherland, S.S., Mercy, A.R., Ellis, T.M. 1996. Post-shearing management affects the sero incidence of Corynebacterium pseudotuberculosis infection in sheep flocks. Preventive Veterinary Medicine 26, 275284. Paton, M.W. 2000. Applying the experience of CLA in the Southern Hemisphere. En: Proceedings of the Moredun Research Institute/Scottish Agricultural College Workshop on Caseous Lymphadenitis, 3-15. Paton, M.W., Collett, M.G., Pepin, M., Bath, G.F. 2005. Corynebacterium pseudotuberculosis infections. En: Infectious Diseases of Livestock, 3rd Edit., J.A.W. Coetzer y R.C. Tustin, Eds, Oxford University Press Southern Africa, Cape Town, 1917-1930. Peel, M.M., Palmer, G.G., Stacpoole, A.M., Kerr, T.G. 1997. Human lymphadenitis due to Corynebacterium pseudotuberculosis: report of ten cases from Australia and review. Clinical of Infectious Diseases 24, 185-191. Pepin, M., Bisrame, J., Marly. 1989. Corynebacterium pseudotuberculosis, biochemical properties, production of toxin and virulence of ovine and caprine strains. Annales de Recherches Vétérinaires 20, 111-115. Pépin, M., Pardon, P., Lantier, F., Marley, J., Levieus, D. y Lamand, M. 1991. Experimental Corynebacterium pseudotuberculosis infection in lambs: kinetics of bacterial dissemination and inflammation. Veterinary Microbiology 26, 381-392. Pépin, M., Paton, M. y Hodgson, A.L. 1994a. Pathogenesis and epidemiology of Corynebacterium pseudotuberculosis infection in sheep. Current Topics in Veterinary Research 1, 63-82. Pépin, M., Pittet, J.C., Olivier, M., Gohin, I. 1994b. Cellular composition of Corynebacterium pseudotuberculosis pyogranulomas in sheep. Journal of Leukocyte Biology 56, 666-670. Pizarro-Cerdá, J., Moreno, E., Gorvel, JP. 2000. Invasion and intracellular trafficking of Brucella abortus in nonphagocytic cells. Microbes and Infection 2, 829–835. Pizarro-Cerdá, J., Lecuit, M., Cossart, P. 2002. Measuring and analysing invasion of mammalian cells by bacterial pathogens: the Listeria monocytogenes system. Veterinary Microbiology 31, 161-176. Pizarro-Cerdá, J., Cossart, P. 2006. Subversion of cellular functions by Listeria monocytogenes. Journal of Pathology 208 (2), 215-23. 100 Bibliografía Podschun, R., Teske, E., Ullman, U. 1991. Serum resistance properties of Klebsiella pneumonie and Klebsiella oxytoca isolated from different sources. Zentralblatt für Hygiene und Umweltmedizin 192, 279-285. Pollard, T.D. 1995. Actin cytoskeleton. Missin link for intracellular bacterial motility. Current Biology 5 (8), 837-840. Ponce De León, P.E.L.J., Gomes, P. 1983. Utilitárias informaoes sobre linfoadenite caseosa de caprinos e ovinos e seu control. Serie de Producao e Sanidade Animal, 1. Prasadarao, N.V., Wass, C.A., Huang, S.H., Kim, K.S. 1999. Identification and characterization of a nivel IbelO binding protein that contribuyes to Escherichia coli invasion of brain mien oscular endotelial cells. Infection and Immunity. 67, 1131-1138. Preissner, KY., Shingh, C. 2000. Extracellular matrix and host cell surface. En: Cellular Microbiology. Cossart P, Boquet P, Normark S, Rappuoli R. (eds). ASM Press, Washington DC. 46-69. Prospert, F., Lemoine, O., Serruys, E., Sternon, J. 1991. A case of febrile axillary adenopathy. Acta Clinica Belgica. 46, 183-188. Pujol, C. y Bliska, J.B. 2003. The ability to replicate in macrophages is conserved between Yersinia pestis and Yersinia pseudotuberculosis. Infection and Immunity 71, 5892-5899. Q uinn, P. J., Carter, M. E., Markey, B., Carter, G. R. 1994. Corynebacterium species and Rhodococcus equi. En: “Clinical Veterinary Microbiology”, Wolfe Publishing Company, London, 137-143. Quinn, F.D., Newman, G.W., King, C.H. 1997. In search of virulence factors of human bacterial disease. Trends in Microbiology 5 (1), 20-26. R adostits, O.M., Gay, C.C., Blood, D.C., Hinchcliff, K.W. 2000. Caseous lymphadenitis in sheep and goats. En: “Veterinary Medicine”, 9th Edit., W.B. Saunders, London, 727-730. Real, F. 1989. Inmunoprevención de la linfadenitis caseosa ovina (por Corynebacterium pseudotuberculosis) mediante BCG (Bacilo de Calmette y Guerin). Tesis doctoral. Universidad de Murcia. Real, F., León, L. 1990. La linfadenitis caseosa ovina por C. pseudotuberculosis: estudio clínico e inmunoprevención mediante B.C.G. (Bacilo de Calmette y Guerín). Medicina Veterinaria 7 (12), 681-688. Real, F., Leon, L., Acosta, B., Ferrer, O., Gutierrez, C. y Deniz, M.S. 1993. Seudotuberculosis caprina: descripción de una nueva forma clínica de la enfermedad. A.Y.M.A., 33(6):177-179. 101 Bibliografía Reeves, E.P., Lu, H., Jacobs, H.L., Messina, C.G., Bolsover, S., Gabella, G., Potma, E.O., Warley, A., Roes, J. y Segal, A.W. 2002. Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux. Nature 416, 291–297. Renshaw, H.W., Graff, V.P., Gates, N.L. 1979. Viceral caseous lymphadenitis in thin ewe syndrome: isolation of Corynebacterium, Staphylococcus and Moraxella spp. from internal abscesses in emaciated ewes. American Journal of Veterinary Research 40, 1110-1114. Rizvi, S., Green, L.E., Glover, M.J. 1997. Caseous lymphadenitis: an increasing cause for concern. Veterinary Record 140, 586-587. Robins, R. 1991. Focus on caseous lymphadenitis. State Veterinary Journal 1, 7-10. Robles, C., Olachea, F. 2001. Salud y enfermedades de las majadas. En: "Ganadería ovina sustentable en la Patagonia Austral, tecnología de manejo extensivo". Editado por P. Borrelli y G. Oliva. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Argentina, pp. 225-243. Romero, J.C., Suner, M., Batista, N. 2004. Linfadenitis por Corynebacterium pseudotuberculosis en una paciente joven. Revista Clínica Española. 204, 388-389. Romero, S., Aparecido, R., Pinheiro, J., Soares, G. y Soares, R. 2008. Perfil de sensibilidade antimicrobiana in vitro de isolados de Corynebacterium pseudotuberculosis de caprinos e ovinos com linfadenite caseosa no sertão de pernambuco, Brasil. Veterinária e Zootecnia. 15 (3), 502-509. Roos, D., van Bruggen, R., Meischl, C. 2003. Oxidative killing of microbes by neutrophils. Microbes and Infection 5 (14), 1307-1315. Ruiz, J., Quintana, M., Barreda, M. 1995. Aislamiento y clasificación bioquímica de una cepa de Corynebacterium pseudotuberculosis en la provincia de La Habana. Revista de Salud Veterinaria 17, 307-309. Ruiz, J.L., Bulnes, C., Duran, R., Barrera, M., Rodríguez, N., Muñoz, M. 2003. Evaluación de un ELISA Indirecto para el diagnóstico de la linfadenitis caseosa ovina mediante la reproducción experimental y aspectos clínicos. Revista Electrónica Veterinaria (REDVET) 4 (5). Ruiz, L., Jerónimo, R., Barrera, M., Frías, M. 2007. Linfadenitis Caseosa I: Aspectos históricos, etiológicos y clínicos. Revista Electrónica Veterinaria 2 (8). S chmiel, D.H., Miller, V.L. 1999. Bacterial phospholipases and pathogenesis. Microbes and Infection 1, 1103-1112. Schreuder, B.E., Ter Laak, E.A., Dercksen, D.P. 1994. Eradication of caseous lymphadenitis in sheep with the help of a newly developed ELISA technique. Veterinary Record 135, 174-176. 102 Bibliografía Senturk, S., Temizel, M. 2006. Clinical efficacy of rifamycin SV combined with oxytetracycline in the treatment of caseous lymphadenitis in sheep. Veterinary Record 159, 216-217. Sharon, N. 2006. Carbohydrates as future anti-adhesion drugs for infectious diseases. Biochemical and Biophysical Acta 1760 (4), 527-537. Shen, D.T., Jen, L.W., Gorham, J.R. 1982. The detection of Corynebacterium pseudotuberculosis antibody in goats by enzymelinked immunosorbent assay (ELISA). Proceeding 3rd International Conference on Goat production and disease. Tucson Arizona, 445-448. Shigidi, M.T. A.1978. An indirect haemagglutination test for the sero-diagnosis of Corynebacterium ovis infection in sheep. Research in Veterinary Science 24, 57-60. Simón, M.C., Negredo, M.P., García, J., Gironés, O., Múzquiz, J.L., Alonso Martinez, J.L. 1987. Técnica de inmunofluorescencia indirecta aplicada a la detección de anticuerpos frente a la célula de Corynebacterium pseudotuberculosis biovar ovis. Medicina Veterinaria 4, 7-8. Smith, H. 1998. What happens to bacterial pathogens in vivo? Trends in Microbiology 6 (6), 239-243. Songer, J.G., Beckenbach, K., Marshall, M.M., Olson, G.B., Kelly, L. 1988. Biochemical and genetic characterization of Corynebacterium pseudotuberculosis. American Journal of Veteterinary Research 49, 223-226. Songer, J.G., Libby, S., Iandolo, J.J., Cuevas, W.A. 1990. Cloning and expression of Phospholipase D gene from Corynebacterium pseudotuberculosis in Echerichia coli. Infection and Immunity 58 (1), 131-136. Stefańska, I., Gieryńska, M., Rzewuska, M. y Binek, M. 2010. Survival of Corynebacterium pseudotuberculosis within macrophages and induction of phagocytes death. Polish Journal of Veterinary Science 13 (1), 143-149. Stevens, M.P., Friebel, A., Taylor, L.A., Wood, M.W., Brown, P.J., Hardt, W.D. y Galyov, E.E. 2003. A Burkholderia pseudomallei type III secreted protein, BopE, facilitates bacterial invasion of epithelial cells and exhibits guanine nucleotide exchange factor activity. Journal of Bacteriology 185, 4992–4996. Stoops, S.G., Renshaw, H.W., Thilsted, J.P. 1984. Ovine caseous lymphadenitis: Disease prevalence, lesion, distribution and thoracic manifestation in a population of mature culled sheep from western United States. American Journal of Veterinary Research 45 (3), 558-558. Sutherland, S.S., Ellis, T.M., Mercy, A.R., Paton, M., Middleton, H. 1987. Evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of Corynebacterium pseudotuberculosis infection in sheep. Australian Veterinary Journal 64, 263-266. 103 Bibliografía Tachedjian, M., Krywult, J., Moore, R.J., Hodgson, A.L. 1995. Caseous lymphadenitis vaccine development: site-specific inactivation of the Corynebacterium pseudotuberculosis phospholipase D gene. Vaccine 13, 1785-1792. Tashjian, J.J. y Campbell, S.G. 1983. Interaction between caprine macrophages and Corynebacterium pseudotuberculosis: an electron microscopic study. American Journal of Veterinary Research 44, 690-693. Taylor, P.W., Kroll, H.P. 1983. Killing of an encapsulated strain of Escheríchia coli by human serum. Infection and Immunity 39 (1), 122-131. Tejedor, M.T., Lupiola, P., Caballero, M.J., Corbera, J.A., Gutierrez, C. 2009. Multiple abscesses caused by Salmonella enterica and Corynebacterium pseudotuberculosis in a dromedary camel. Tropical Animal Health and Production 41(5), 711-714. Ter Laak, E.A., Bosch, J., Bijl, G.C., Schreuder, B.E. 1992. Double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay and immunoblot analysis used for control of caseous lymphadenitis in goats and sheep. American Journal of Veterinary Research 53 (7), 1125-1132. Tran Van, G., Sansonetti, P. 2000. Cell adhesion molecules and bacterial pathogens. En: “Cellular Microbiology”. Cossart P, Boquet P, Normark S, Rappuoli R. (eds). ASM Press, Washington D.C. 46-69. U nanian, M.M., Felicinao-Silva, A.E., Pant, K.P.1985. Abscesses and caseous lymphadenitis in goats in tropical semi-arid north-east Brazil. Tropical Animal Health and Production 17, 57-62. Une, T. 1977. Studies on the pathogenicity of Yersinia enterocolitica: II. Interaction with cultured cells in vitro. Microbiology and Immunology 21, 365-377. V alli, V.E.O., Parry, B.W. 1993. Caseous lymphadenitis, En: “Pathology of domestic animals”, Vol. 3, 4th Edit., K.V.F. Jubb, P.C. Kennedy y N. Palmer, (Eds.). Academic Press, San Diego, pp 238-240. Vay, C., Almuzara, M. 2002. Actualización en bacilos Gram positivos, taxonomía, identificación e importancia clínica. II Simposio de Infectología y Microbiología Clínica. Von Graevenitz, A. y Krech, T. 1992. The genus Corynebacterium-Medical. En "The prokaryotes". Ballows A, Trüper H, Dworkin M, Harder W y Heinz Schleifer K, eds. Handbook on the Biology of Bacteria: ecophysiology, isolation, identification applications., Vol 2, Springer-Verlag. W est, D.M., Bruere, A.N., Ridler, A.L. 2002. Caseous lymphadenitis. En: “The Sheep: Health, Disease and Production”. Foundation for Continuing Education, Palmerston North, pp 274-279. 104 Bibliografía Williamson, L.H. 2001. Caseous lymphadenitis in small ruminants. Veterinary Clinics of North America - Food Animal Practice 17, 359-371. Wong, T.P., Groman, N. 1984. Production of diphteria toxin by select isolated of Corynebacterium ulcerans and Corynebacterium pseudotuberculosis. Infection and Immunity 43, 1114-1116. Yamamoto, T., Hanawa, T., Ogata, S. y Kamiya, S. 1996. Identification and characterization of the Yersinia enterocolitica gsrA gene, which protectively responds to intracellular stress induced by macrophage phagocytosis and to extracellular environmental stress. Infection and Immunity 64, 2980-2987. Yeruham, I., Braverman, Y., Shpigel, N.Y., Chizov-Ginzburg, A., Winkler, M. 1996. Mastitis in dairy cattle caused by Corynebacterium pseudotuberculosis and feasibility of transmission by houseflies. Veterinary Quarterly 18, 87-89. Yeruham, I., Elad, D., Van-Ham, M., Shpigel, N.Y., Peri, S. 1997. Corynebacterium pseudotuberculosis infection in Israel cattle: Clinical and epidemiological studies. Veterinary Record 140, 423-427. Yeruham, I., Friedman, S., Elad, D., Perl, S. 2000. Association between milk production, somatic cell count and bacteria dermatoses in three dairy cattle herds. Australian Veterinary Journal 78, 250-253. Yozwiak, M.L., Songer, J.G. 1993. Effect of Corynebacterium pseudotuberculosis phospholipase D on viability and chemotactic responses of ovine neutrophils. American Journal of Veterinary Research 54, 392-397. Z aki, M.M. 1976. Relation between the toxogenicity and pyogenicity of Corynebacterium ovis in experimentally infected mice. Research in Veterinary Science 20, 197-200. Zarzuelo, E. 1981. Linfadenitis caseosa. En: “Patología Infecciosa”. Publicaciones Científicas Ovejero. León, pp 361-369. Zhao, H.K., Morimura, H., Hiramune, T., Kikuchi, N., Yanagawa, R. y Serikawa, S. 1991. Antimicrobial susceptibility of Corynebacterium pseudotuberculosis isolated from lesions of caseous lymphadenitis in sheep in Hokkaido, Japan. Journal of Veterinary Medicine Science 53 (2), 355-356. Zierler, M.K. y Galán, J.E. 1995. Contact with cultured epithelial cells stimulates secretion of Salmonella typhimurium invasion protein Inv. Journal of Infection and Immunity 63, 4024-4028. 105