Determinación de edulcorantes en peces

DETERMINACIÓN DE EDULCORANTES EN PECES Estefanía Sánchez Chicharro Curso 2014-2015 Tutor: José Juan Santana Rodríguez Departamento de Química, grupo Análisis Químico Medioambiental. Universidad de las Palmas de Gran Canaria (ULPGC) Co-Tutor/es: Eva Pocurull Aixalà y Núria Fontanals Torroja Departamento de Química Analítica y Química Orgánica. Universidad Rovira i Virgili (URV) Trabajo Fin de Máster para la obtención del título: Máster en Gestión Costera ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 3 2. PARTE EXPERIMENTAL ...................................................................................... 9 2.1 MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................... 9 2.1.1 Reactivos y materiales .................................................................................. 9 2.1.2 Preparación de la muestra ............................................................................. 9 2.1.3 Extracción con líquidos presurizados ......................................................... 10 2.1.4 Clean-up ..................................................................................................... 10 2.1.5 Análisis mediante cromatografía de líquidos con detector de diodos en fila 11 2.1.6 Análisis mediante cromatografía de líquidosespectrometría de masas de alta resolución ...................................................................................................... 11 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................ 13 3.1 Optimización de la separación cromatográfica ................................................. 13 3.2 Optimización de la extracción con líquidos presurizados ................................. 14 3.3 Determinación de edulcorantes mediante espectrometría de masas .................. 17 3.4 Estrategia de limpieza de la matriz ................................................................... 18 3.5 Aplicación del método en muestras reales ........................................................ 21 4. CONCLUSIONES .................................................................................................. 21 5. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................... 23 2 Determinación de edulcorantes en peces Estefanía Sánchez Chicharro Agradecimientos Querría darle las gracias al grupo CROMA por haberme brindado la oportunidad de formar parte de su grupo y haberme acogido como una más. En especial, quería agradecérselo a Mireia por ayudarme en todo momento y tener mucha paciencia conmigo. También, me gustaría agradecerle a José Juan toda su ayuda recibida en todo momento. A David por aguantarme y apoyarme en todo momento. Y por último, a mis padres y iaia Montse por todo el apoyo que me han dado y porque sin ellos, esto no habría sido posible. Determinación de edulcorantes en peces Estefanía Sánchez Chicharro 3 1. INTRODUCCIÓN La contaminación ambiental y en particular, la contaminación marina costera son la introducción directa o indirecta por parte del hombre, de sustancias en el ecosistema que tiene como resultado el deterioro de los recursos vivos. Estas sustancias pueden ser nocivas para la salud humana y pueden resultar ser perjudiciales para los organismos. Por lo tanto, la contaminación marina costera es un tema actual de preocupación y de estudio [1]. Estas sustancias (denominadas contaminantes) pueden ser de diversos tipos: naturales o antropogénicas. Entre los contaminantes antropogénicos, un grupo de contaminantes que destaca hoy en día son los contaminantes orgánicos emergentes (COE), los cuáles son sustancias químicas emitidas constantemente al medioambiente y que pueden ser peligrosas para los ecosistemas y el hombre [2]. Los COE son un grupo muy amplio: fármacos, drogas de abuso, hormonas, compuestos perfluorados, retardantes de llama, nanopartículas, aditivos industriales, productos de higiene personal,… y que va en aumento gracias a los estudios que lleva a cabo la comunidad científica. Algunos de ellos están incluidos en la lista de contaminantes prioritarios de la EPA (Agencia de Protección Ambiental) y en la directiva marco de aguas de la Unión Europea (EU) [3, 4], sin embargo, la mayoría de ellos no están regulados debido a la falta de estudios sobre su presencia y toxicidad. Generalmente, estos compuestos se introducen en el medio ambiente a través de las plantas de tratamiento de aguas residuales, las cuáles no están diseñadas para eliminarlos completamente [5]. Por ello, muchos de estos contaminantes acaban siendo emitidos en los ríos y en el mar; motivo de preocupación científica y para las entidades ambientales reguladoras [2]. Un grupo de COE muy utilizado y de gran interés actual para la comunidad científica y en el que se ha centrado este trabajo son los edulcorantes (principalmente artificiales). Éstos, tal como se ha explicado anteriormente, son emitidos al medioambiente [6, 7]. Los edulcorantes pueden dividirse en dos categorías: edulcorantes naturales y edulcorantes artificiales. Los edulcorantes naturales son aquellos obtenidos a partir de frutas, bayas, vegetales y hongos. Algunos ejemplos de éstos son esteviósido, glicirricina, taumatina, brazzeína, entre otros [8]. Los edulcorantes artificiales no pueden ser metabolizados por el cuerpo humano, en consecuencia, éstos proporcionan muy pocas calorías -por ello reciben también el nombre de edulcorantes no nutritivos. En la década de 1950, se introdujo la primera generación de edulcorantes artificiales que fueron sacarina, ciclamato y aspartamo. Más tarde, se sintetizaron los denominados “nueva generación” que fueron acesulfamo, sucralosa, alitamo y neotamo [9]. Determinación de edulcorantes en peces Estefanía Sánchez Chicharro 4 Debido a las bajas calorías inherentes de éstos, los edulcorantes están sufriendo un aumento significativo de su uso como resultado de la conciencia pública sobre la diabetes y sus necesidades, además de que están aumentando los consumidores preocupados por padecer obesidad, hipertensión y caries dental. En consecuencia, los edulcorantes artificiales se han vuelto omnipresentes en muchos alimentos [10, 11]. Se utilizan en todo el mundo como sustitutos del azúcar en la industria de los alimentos (bebidas, industrias de confitería, industria de alimentación animal), industria del tabaco, productos farmacéuticos y sanitarios, tales como enjuagues bucales entre otros [11-13]. Para controlar el consumo de estos edulcorantes existe una legislación de las cantidades recomendadas en alimentos donde se indican los edulcorantes sintéticos autorizados, ya que estudios preliminares han demostrado que pueden llegar a ser perjudiciales para la salud [14]. En 2005, la universidad de Texas realizó un estudio sobre el uso de las bebidas de dieta (contienen edulcorantes) y concluyó que aquellos que consumían refrescos de dieta eran más propensos a ganar peso que aquellos que consumían refrescos endulzados naturalmente [15]. En la UE, los edulcorantes autorizados como aditivos en alimentos son acesulfamo, aspartamo, ciclamato, neotamo, NHDC, sacarina, ácido glicirricínico, sucralosa y esteviósido [14, 16]. No obstante, no existe ningún tipo de legislación de los edulcorantes referente al medio ambiente. En la Tabla 1, se presentan las principales características de los edulcorantes seleccionados para el presente estudio. Los edulcorantes artificiales han recibido mucha atención por la comunidad científica en los últimos años debido a su amplia presencia en el medio acuático, elevada persistencia y baja biodegradabilidad [9]. La excreción de los edulcorantes como consecuencia del consumo humano es, sin duda, una de las principales fuentes de su presencia en el medio ambiente, pero no es la única. En la UE, la sacarina está autorizada para su uso como aditivo en la alimentación animal para cochinillos, cerdos, bovinos y terneros [17]. Los vertidos procedentes de la industria, hogares, cría de animales colman de edulcorantes las plantas de tratamiento de aguas residuales que no son capaces de eliminar totalmente estos compuestos, por ello, los edulcorantes a través de los efluentes, entran al medio ambiente. De todos los edulcorantes artificiales, los estudios científicos llevados a cabo hasta el momento se han centrado especialmente en sacarina, ciclamato, acesulfamo y sucralosa, debido a dos razones: la primera, por sus altas concentraciones en el medio acuático y terrestre; y la segunda, su limitada eliminación en las aguas residuales [5]. Tabla 1. Características principales de los edulcorantes determinados [5, 18]. Nombre Fórmula molecular Masa monoisotópica Estructura Determinación de edulcorantes en peces Estefanía Sánchez Chicharro 5 Tabla 1. (Continuación) (Da) Alitame (ALI) L-alpha-Aspartyl-N-(2,2,4,4-tetramethyl3-thietanyl)-D-alaninamide. C 14 H 25 N 3 O 4 S 330,150 Sucralosa (SCL) 1,6 -Dichloro-1,6-dideoxy-β-Dfructofuranosyl -4-chloro-4-deoxy-α-Dgalactopyranoside. C12H19Cl3O8 395,008 Esteviósido (STV) 13 -[(2-O-beta-D-Glucopyranosyl-alphaD -glucopyranosyl)oxy]kaur-16-en-18-oic acid beta-D-glucopyranosyl ester. C 38 H 60 O18 849,378 Neoesperidina dihidrocalcona (NHDC) 1 -[4-[[(2S,3R,4S,5S,6R)-4,5-Dihydroxy-6- (hydroxymethyl) -3-[[(2S,3R,4R,5R,6S)- 3,4,5 -trihydroxy-6-methyl-2tetrahydropyranyl]oxy] -2tetrahydropyranyl]oxy] -2,6dihydroxyphenyl] -3-(3-hydroxy-4methoxyphenyl)propan-1-one. C28H36O15 611,199 Sacarina sódica (SAC) 2H-1λ6,2-benzothiazol-1,1,3-trione. C 7 H 5 NNaO 3 S 181,991 Ácido Glicirricínico (GLY) (3β,18α) -30-hydroxy-11,30-dioxoolean12 -en-3-yl 2-O-β-D-glucopyranuronosylβ-D-glucopyranosiduronic acid. C 42 H 65 NO 16 821,398 Neotame (NEO) (3S) -3-(3,3-Dimethylbutylamino)-4-[[(2S)- 1 -methoxy-1-oxo-3-phenylpropan-2yl]amino]-4-oxobutanoic acid. C 20 H 30 N 2 O 5 377,209 Aspartamo (ASP) N -(L-α-Aspartil)-L-fenilalanina, 1-metil ester. Ciclamato (CYC) Sodium N-cyclohexylsulfamate. C 14 H 18 N 2 O 5 293,115 C 6 H 13 NO 3 S 178,054 Acesulfamo K (ACS-K) Potassium 6-methyl-2,2-dioxo-2H1,2λ6,3oxathiazin-4-olate. C 4 H 4 KNO 4 S 161,986 Determinación de edulcorantes en peces Estefanía Sánchez Chicharro 6 Existen estudios acerca de la determinación de edulcorantes en lodos, aguas residuales, aguas subterráneas y ríos. Un estudio realizado en Alemania detectó sucralosa, acesulfamo, sacarina y ciclamato en las aguas residuales de plantas de tratamiento [11]. Las concentraciones en las aguas residuales de entrada a una planta de tratamiento oscilaban entre 34 y 50 µg/L en el caso de acesulfamo y sacarina, 190 µg/L para ciclamato y por debajo de 1 µg/L para sucralosa. En las plantas de tratamiento de aguas residuales, acesulfamo se logró eliminar hasta un 41% y sucralosa se eliminó aproximadamente el 20%, mientras que sacarina y ciclamato se eliminaron más del 90%. Además, en este mismo estudio se determinaron cuatro edulcorantes artificiales en las aguas superficiales alemanas; acesulfamo se encontró en concentraciones superiores a 2 µg/L, sacarina y ciclamato se hallaron en concentraciones entre 50 y 150 ng/L, y por último, sucralosa se determinó de 60 a 80 ng/L [11]. En Europa, se realizó un estudio sobre la distribución de sucralosa en el medio acuático. Este trabajo se centró en arroyos y ríos procedentes de 27 países. Los ríos de Reino Unido, Bélgica, Francia, Suiza, Italia, España, Países Bajos, Noruega y Suecia mostraron que las concentraciones obtenidas de sucralosa fueron en torno a 1 µg/L. Sin embargo, los datos obtenidos de los ríos de Alemania y Europa Oriental mostraron que las concentraciones de sucralosa fueron inferiores a 100 ng/L [19]. Por otra parte, se ha realizado un estudio sobre la determinación de sucralosa en aguas oceánicas costeras y abiertas de América del Norte. En este estudio destaca la distribución generalizada de sucralosa en las aguas de Estados Unidos (EE.UU) debido a la importante corriente oceanográfica del Golfo. Este estudio se llevó a cabo en la zona norte y centro de Florida Keys, Cape Fear River, el estuario de Carolina del Norte y se alcanzaron concentraciones de 67, 147, 372, y 392 ng/L, respectivamente [20]. Aunque recientemente se ha prestado especial atención a los ríos y al mar, existen pocos estudios de los edulcorantes en organismos acuáticos. De hecho, todos los estudios realizados en organismos acuáticos se han centrado exclusivamente en la sucralosa. Se sabe que la ingesta de sucralosa en humanos es segura pero sus efectos en el ecosistema todavía no han sido estudiados en profundidad [5]. Hasta ahora, la sucralosa tiene un bajo potencial de bioacumulación y baja toxicidad en organismos acuáticos, por ello, no parece que afecte a su crecimiento ni reproducción; sin embargo, no hay estudios de los efectos en combinación con otros contaminantes emergentes [21-23]. En 2010, se realizó un estudio sobre los efectos a corto plazo (96 h) de la sucralosa en los ecosistemas del Ártico. Se evaluó la producción de huevos, la tasa de eclosión, la ingesta de alimentos y la mortalidad de dos especies de copépodos árticos: C. glacialis y C. finmarchicus. Estas especies fueron expuestas a diversas concentraciones de sucralosa (0-50 mg/L), simulando las concentraciones que se encontraron en estudios previos. Los resultados obtenidos mostraron que ambas especies prácticamente no se Determinación de edulcorantes en peces Estefanía Sánchez Chicharro 7 veían alteradas por la sucralosa, aunque C. glacialis se veía un poco más afectada que C. finmarchicus [24]. Recientemente, se ha demostrado por primera vez que la exposición de sucralosa puede afectar a la fisiología y al comportamiento locomotor de D. magna. Se observó que el movimiento y la velocidad de natación de estos crustáceos se vio alterado debido a la exposición de este compuesto [23]. Así, estos estudios pueden apuntar a posibles efectos adversos de los edulcorantes hacía diferentes especies del ecosistema marino. Además, se espera que aumente la demanda de edulcorantes artificiales en los próximos años, en especial la sucralosa y acesulfamo, debido a esto se puedan observar efectos a largo plazo resultante de la exposición crónica a bajos niveles de estos compuestos [5]. En los estudios para la determinación de bajos niveles de concentración de edulcorantes se emplean diferentes tipos de técnicas de extracción: extracción en fase sólida (SPE) y extracción líquido-líquido para muestras líquidas [11, 17]. Para las muestras sólidas se utiliza la extracción con líquidos presurizados (PLE) [25, 26]. La PLE es conocida también como extracción con disolvente a alta presión (HPSE) o más comúnmente, extracción acelerada con disolventes (ASE). Se trata de una técnica sencilla y proporciona unas recuperaciones cuantitativas en poco tiempo [26]. La PLE funciona a altas temperaturas (normalmente hasta 200ºC) y altas presiones (generalmente hasta 200 bar) para extraer más rápido a volúmenes bajos de disolvente orgánico. Una de las muchas ventajas que posee la PLE frente a técnicas tradicionales (por ejemplo, extracción Soxhlet) son el tiempo de extracción, el bajo consumo de disolvente y la filtración adicional del extracto. Sin embargo, una de las principales desventajas/limitaciones de la PLE es la falta de selectividad lo cual provoca que muchos interferentes puedan ser co-extraídos durante el proceso de extracción [25, 27]. Debido a la complejidad de la matriz, en ocasiones, se utilizan diferentes técnicas de clean-up (SPE, florisil, silica gel) [11, 17, 19, 28-31]. Generalmente, el análisis de las muestras se realiza mediante la cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas [19, 28, 29, 31]. El objetivo del presente trabajo es el desarrollo y validación de un método analítico que nos permita la determinación simultánea de diez edulcorantes (acesulfamo K, alitame, aspartamo, ciclamato de sodio, ácido glicirricínico, neotame, neoesperidina dihidrocalcona, sacarina sódica, sucralosa y esteviósido) en peces empleando la PLE seguido de SPE como clean-up y cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas de alta resolución (LC-HRMS). Este objetivo general se divide en: o Optimizar el método de extracción de los edulcorantes en peces mediante la PLE a través de la modificación de los principales parámetros en el proceso de extracción (disolvente, temperatura y tiempo). Determinación de edulcorantes en peces Estefanía Sánchez Chicharro 8 o Estudiar diferentes estrategias para minimizar el efecto matriz y así, conseguir disminuirlo y lograr unos buenos resultados en las recuperaciones y en los límites de detección. o Validar el método en la determinación de edulcorantes y aplicarlo al análisis de diferentes especies de peces. o Aplicar los resultados de los análisis para el control de la calidad costera, es decir, gestión de los organismos marinos (en este caso los peces) en la zona costera. A continuación, se detallará como se prepararon las muestras de pez, y cómo se analizaron, incluyendo la optimización de las diferentes técnicas analíticas. También, se discutirán los resultados obtenidos comparándolos con otros trabajos suscritos en la bibliografía. Seguidamente, se expondrán las conclusiones derivadas del presente trabajo, y por último, se presentará la bibliografía consultada. Determinación de edulcorantes en peces Estefanía Sánchez Chicharro 15 y ACN se evaporaron a sequedad bajo una corriente de nitrógeno y se reconstituyeron en 25 mL de H2O:MeOH (9:1, v/v), para evitar la distorsión de los picos en LC-DAD. El extracto de la mezcla H2O:MeOH (1:1, v/v) se evaporó a la mitad (eliminar el MeOH) bajo una corriente de nitrógeno y se reconstituyó también en 25 mL, H2O:MeOH (9:1 v/v). Los extractos de H2O ajustada a pH=5 y H2O ajustada a pH=2,5 se llevaron a un volumen de 25 mL de H2O:MeOH (9:1, v/v). En la Tabla 2, se muestran las recuperaciones de todos los compuestos; excepto para ALI que no se disponía de su patrón en el momento de optimizar este parámetro, y SCL y CYC que no presentaban señal en el UV-visible. Se realizaron varias repeticiones (n=3) de todos los disolventes para comprobar que los resultados obtenidos eran reproducibles y como se observa en la Tabla 2, los mejores disolventes para la extracción fueron: MeOH y H2O:MeOH (1:1, v/v) ya que se obtuvieron mejores recuperaciones para la mayoría de los compuestos. De estos dos disolventes, se eligió H2O:MeOH (1:1 v/v) ya que, en general, obteníamos recuperaciones más altas que con MeOH, en particular GLY aumenta significativamente aunque para el caso de NHDC y NEO las recuperaciones seguían siendo bajas. Tabla 2. Recuperaciones obtenidas utilizando distintos disolventes de extracción. ACN MeOH Agua pH=5 Agua pH=2,5 Agua:MeOH (1:1 v/v) ACS 66 94 100 96 91 SAC 52 95 100 93 92 CYC n.d n.d n.d n.d n.d ASP 14 50 59 45 65 SCL n.d n.d n.d n.d n.d ALI n.d n.d n.d n.d n.d NHDC 0 12 0 0 15 STV 0 128 110 81 144 NEO 54 75 0 0 20 GLY 0 33 102 90 92 n.d= no determinado %RSD≤ 11 (n=3) Como se mencionó anteriormente, el extracto de PLE (aproximadamente 30 mL) se evaporó hasta la mitad (para eliminar el MeOH) y se reconstituyó en 25 mL con H2O:MeOH (9:1 v/v). La pérdida por evaporación mediante corriente de nitrógeno se evaluó de la siguiente forma: se preparó una mezcla de todos los compuestos a 10 mg/L, se disolvió en una solución de H2O:MeOH (1:1 v/v), posteriormente se evaporó bajo una corriente de nitrógeno y se reconstituyó con H2O:MeOH (9:1 v/v). Los resultados se compararon con la señal de cada compuesto a 10 mg/L disuelto en H2O:MeOH (9:1 v/v), sin ser sometidos a evaporación. No se observó pérdida por evaporación para ningún compuesto. Determinación de edulcorantes en peces Estefanía Sánchez Chicharro 16 En estudios previos se han descrito que algunos de los edulcorantes quedaban retenidos en el filtro cuando el extracto era filtrado previo al LC-DAD [28]. Por ello, se probaron diversos tipos de filtros: FILTER-LAB PTFE 0.45 µm, FILTER-LAB Nylon 0.22 µm, FILTER-LAB NY 0.22 µm y GHP Acrodisc 0.2 µm. El filtro que dio mejores resultados fue GHP Acrodisc ya que en el resto de los filtros quedaban retenidos algunos edulcorantes (NHDC, STV y GLY). Por tanto, este es el filtro que se usó en todas las pruebas descritas. El segundo parámetro optimizado fue la temperatura de extracción. Las temperaturas escogidas fueron 40ºC, 60ºC y 80ºC, siendo el resto de las condiciones las mismas que las iniciales pero usando H2O:MeOH (1:1 v/v) como disolvente de extracción. Se incluyó ALI puesto que ya se disponía del patrón. Se observó que a medida que iba aumentando la temperatura surgía una interferencia con un edulcorante (NEO), lo que provocaba que su cuantificación no fuese correcta y por tanto obtuviéramos una baja recuperación. Como se observa en la Tabla 3, para la mayoría de edulcorantes las recuperaciones eran similares en las temperaturas estudiadas, a excepción de GLY el cual se pasaba a extraer cuantitativamente a partir de 60ºC. Teniendo en cuenta las recuperaciones y la interferencia observada, se determinó que la mejor temperatura de extracción era 60ºC. Tabla 3.Recuperaciones obtenidas utilizando distintas temperaturas de extracción. 40ºC 60ºC 80ºC ACS 99 94 96 SAC 105 99 97 CYC n.d n.d n.d ASP 96 86 79 SCL n.d n.d n.d ALI 96 91 91 NHDC 45 39 20 STV 123 129 126 NEO 95 86 26 GLY 74 100 120 n.d= no determinado %RSD≤10 (n=3) En cuanto al tercer parámetro, se optimizó el tiempo estático y se probaron tres tiempos: 5 min, 10 min y 20 min. Las recuperaciones obtenidas fueron muy similares (no se muestran) entre ellas, con lo que, se seleccionó como mejor tiempo estático de extracción 5 min para acortar el tiempo de análisis. Determinación de edulcorantes en peces Estefanía Sánchez Chicharro 17 El volumen de descarga, que afecta al volumen final del extracto, fue el último parámetro que se optimizó. Se probaron tres volúmenes: 50%, 75% y 100%. Las recuperaciones de los diferentes compuestos fueron semejantes (no se muestran) y por ello, se decidió que el mejor volumen de descarga era 50% porque se obtenía el menor volumen de extracto, 20 mL aproximadamente, y se conseguía acortar el tiempo de evaporación, y por tanto el de análisis. 3.3 Determinación de edulcorantes mediante espectrometría de masas Los parámetros del LC-HRMS fueron optimizados para los edulcorantes mediante infusión directa. Los compuestos se inyectaron individualmente a una concentración de 1 mg/L y una mezcla de todos ellos en una solución de 1 mg/L preparadas en H2O:MeOH (9:1 v/v). Se incluyeron SCL y CYC puesto que sí dan respuesta en un espectrómetro de masas. Con todos los analitos se obtuvieron iones HESI-II en modo negativo. En cuanto a los parámetros de la fuente de ionización se eligieron a partir de estudios previos del grupo de investigación [33], los cuales también se comprobaron que fuesen los óptimos. Una vez obtuvimos el ión precursor, se optimizó la energía (denominada energía de colisión) para fragmentar los iones precursores, así, se podrá identificar y confirmar cada analito. La energía de colisión fue 20 eV para: ACS, SAC, CYC, ASP, SCL, ALI y NEO y 40 eV para NHDC, STV y GLY. Estas energías proporcionaban en cada caso fragmentos característicos de máxima respuesta. La Tabla 4 recoge toda la información referente a los iones precursores e iones fragmento. En la Figura 3, se muestra la separación de los diez compuestos seleccionados en menos de 17 minutos. Los tiempos de retención de estos compuestos son ligeramente diferentes debido al cambio de equipo. También puede observarse que la separación de SCL y CYC es buena, tal y como se esperaba según la bibliografía. Figura 3. Separación cromatográfica mediante LC-HRMS. Una vez optimizados los parámetros del HRMS, se determinó el límite de detección (LOD) y límite de cuantificación (LOQ) instrumentales para cada compuesto, los cuales Determinación de edulcorantes en peces Estefanía Sánchez Chicharro 18 se muestran en la Tabla 5. Todos los edulcorantes seleccionados mostraron buena linealidad (R2>0.9989) en el intervalo de 0.25 µg/L a 500 µg/L para ACS; de 2.5 µg/L a 500 µg/L para SAC, CYC y NHDC; de 10 µg/L a 500 µg/L para ASP, SCL y ALI y por último, de 5 µg/L a 500 µg/L para STV, NEO y GLY. Tabla 4. Resultados obtenidos de iones precursores e iones productos y su masa exacta Analito Fórmula Ión Precursor teórico (m/z) Ión Precursor experimental (m/z) Ión fragmento experimental (m/z) Energía de colisión (eV) ACS C 4 H 5 NO 4 S 161,987 161,986 82,028 20 SAC C 7 H 5 NO 3 S 181,992 181,991 105,960 20 CYC C 6 H 13 NO 3 S 178,054 178,054 79,956 20 ASP C 14 H 18 N 2 O 5 293,114 293,115 200,071 20 SCL C 12 H 19 Cl 3 O 8 395,007 395,008 397,005 20 ALI C 14 H 25 N 3 O 4 S 330,149 330,150 312,140 20 NHDC C 28 H 36 O 15 611,198 611,199 303,088 40 STV C 38 H 60 O 18 849,377 849,378 641,319 40 NEO C 20 H 30 N 2 O 5 377,208 377,209 200,072 20 GLY C 42 H 63 O 16 821,396 821,398 351,058 40 Tabla 5. Límites de detección (LODs) y cuantificación (LOQs) para cada compuesto. LODs (µg/L) LOQs (µg/L) ACS 0,025 0,25 SAC 1 2,5 CYC 1 2,5 ASP 0,25 10 SCL 0,25 10 ALI 0,1 10 NHDC 0,1 2,5 STV 0,1 5 NEO 1 5 GLY 2,5 5 3.4 Estrategia de limpieza de la matriz Es bien conocido que la matriz influencia la eficacia de ionización de los analitos principalmente cuando en un sistema LC-MS se utiliza interfase ESI. Este fenómeno se conoce como efecto matriz y dado que puede ocasionar tanto un aumento como una disminución de la señal, puede provocar una sobreestimación o subestimación de la Determinación de edulcorantes en peces Estefanía Sánchez Chicharro 19 concentración del analito. Dado que los peces son muestras con una alta complejidad, se observó que había efecto matriz, generalmente supresión iónica, y por tanto se provó la SPE como etapa de clean-up aplicando un método desarrollado previamente en el grupo de investigación [28], el cual está descrito en la sección 2.1.4. Diversos estudios han probado la SPE como clean-up para mejillones [34, 35]. Por ello, se decidió probar como clean-up la SPE en las muestras de salmonete y carpa e intentar disminuir el efecto matriz. Para evaluar la SPE se utilizaron muestras de pez enriquecidas en diferentes etapas del método a una concentración teórica final de 100 µg/L para cada compuesto. Así, se doparon antes de la PLE, antes de la SPE y después de la SPE. Además, se utilizaron muestras de pez sin dopar (denominadas blancos). Todas estas etapas son necesarias para poder calcular el efecto matriz (% ME), la recuperación aparente (% AppRE), la recuperación de la PLE (% PLE) y la recuperación de la SPE (% SPE). Para evaluar el ME (ecuación 1), el área obtenida de una muestra de pez enriquecida después de realizar la extracción PLE y SPE como clean-up, se comparó con un blanco y con un patrón (100 µg/L), inyectado directamente a LC-HRMS. El porcentaje de ME refleja el impacto de los componentes de la matriz en la respuesta analítica para los analitos. Si ME (%)˂0, el impacto de la matriz es negativo, esto genera una señal inferior a la medida por analito en una solución patrón (supresión iónica); sin embargo, si ME (%)˃0, la intensidad de la señal se ve aumentada; y por último, si ME (%) =0 no hay efecto matriz [36]. La % AppRE (ecuación 2) informa acerca de la recuperación de todo el método (incluye las recuperaciones de la etapa de extracción, clean-up y el ME). Se calcula comparando una muestra de pez enriquecida antes del proceso de extracción PLE con un blanco y con un patrón (100 µg/ L) inyectado directamente a LC-HRMS. % PLE (ecuación 3) se calcula comparando una muestra de pez enriquecida inicialmente y otra muestra de pez enriquecida después de realizar la PLE. En cuanto al % SPE (ecuación 4) se calcula comparando una muestra de pez enriquecida antes de realizar la SPE y después de la SPE. % ME = - (100 - ((B-C)/A)· 100) Ecuación 1 % AppRE = ((D-C)/ A)· 100 Ecuación 2 % RE PLE = ((D/E)·100) Ecuación 3 % RE SPE = ((E/B)·100) Ecuación 4 A= área de un patrón Determinación de edulcorantes en peces Estefanía Sánchez Chicharro 20 B= área de la muestra de pez enriquecida después de realizar la extracción PLE y SPE C= blanco de muestra (muestra de pez no enriquecida) D= área de la muestra de pez enriquecida antes de la extracción PLE E= área de la muestra de pez enriquecida antes de la SPE Los resultados obtenidos (Tabla 6) muestran las recuperaciones aparentes y el ME incluyendo o no la etapa de clean-up de la SPE. Como puede observarse en la Tabla 6, existe un elevado efecto matriz, en forma de supresión iónica, para la mayoría de los compuestos. Además, los valores RE PLE son mayores al 73%, a excepción del NHDC y GLY; sin embargo, los valores RE SPE son más bajos, ya que la mayoría de los compuestos se pierden, ya sea en la etapa de la carga, en la etapa de limpieza de los cartuchos o bien porque queden retenidos en éstos. Tabla 6. Recuperaciones aparentes y efecto matriz en muestras de salmonete. % App RE %App RE sin SPE %ME %ME sin SPE %RE PLE %RE SPE ACS 44 95 6 -4 93 51 SAC 45 54 -28 -34 93 73 CYC 20 44 -39 -8 93 40 ASP 13 14 -79 -50 78 58 SCL 36 47 -37 -9 85 71 ALI 19 30 -55 36 81 66 NHDC 2 1 -91 -71 42 75 STV 3 5 -97 -100 86 11 NEO 26 23 -62 -39 83 84 GLY 9 10 -78 -40 42 59 %RSD= 16 (n=2) Como la SPE no mejoraba el efecto matriz se probó a utilizar otro tipo de disolvente en la etapa de la elución. Se probó añadir 5 mL 100% MeOH en lugar de 2,5 mL MeOH y 2,5 mL MeOH:NH4OH (95:5 v/v). Los resultados obtenidos no mejoraban respecto a la anterior elución y por ello, se decidió seguir utilizando 2,5 mL MeOH y 2,5 mL MeOH:NH4OH (95:5 v/v). Para intentar compensar el efecto matriz se probó de introducir deuterados (aspartamod3 y sucralosa-d6). Para cada compuesto se calculó la recuperación relativa con cada uno de los deuterados para saber cuál de los dos funcionaba mejor. Para calcular la recuperación relativa se dopó una muestra de pez previamente a la etapa de extracción por PLE y se interpoló la relación área compuesto/área deuterado con una recta instrumental donde se había graficado área compuesto/área deuterado. Se vio que aspartamo-d3 sólo funcionaba bien con él mismo, mientras que para sucralosa-d6 se compensan las perdidas CYC, SCL, ALI, STV, NEO y GLY, obteniéndose una % APP RE >61% para estos compuestos. Para los compuestos ACS, SAC y NHDC no se Determinación de edulcorantes en peces Estefanía Sánchez Chicharro 21 obtenían unas recuperaciones correctas y se decidió que no se aplicarían los deuterados con estos compuestos. 3.5 Aplicación del método en muestras reales En este punto y con el método optimizado hasta el momento (descrito en la sección 2.1) se procedió a aplicar el método en muestras reales. Se analizaron varias especies de pez: salmonete (Mullus surmuletus), carpa (Cyprinus carpio), merluza (Merluccius merluccius) y atún (Thunnus thynnus) para buscar la presencia de los compuestos estudiados. Para poder identificar los compuestos en muestras reales se debe realizar todo el método con blancos y analizarlas en LC-HRMS. Una vez tenemos los resultados debemos fijarnos que los tiempos de retención de los compuestos y el ión precursor y fragmentado coincidan entre ellos (Figura 4). En el caso del salmonete, la carpa y la merluza no se hallaron ninguno de los compuestos. Sin embargo, en una de las muestras de atún aparecía el edulcorante ALI. Esta muestra constaba de una repetición, en la cual no se observaba la presencia de estos compuestos. Por ello, no podemos afirmar rotundamente que el atún pudiera contener este edulcorante, se deberían de hacer más repeticiones para afirmar que ALI está presente en el atún. Figura 4. Cromatograma ALI en la muestra de atún (Thunnus thynnus). Determinación de edulcorantes en peces Estefanía Sánchez Chicharro 22 4. CONCLUSIONES En este estudio se desarrolló un método para la determinación de diez edulcorantes en peces usando la PLE y Oasis HLB 500 mg como clean-up seguido del análisis por LCHRMS. Las principales conclusiones del presente trabajo se enumeran a continuación: • La separación cromatográfica de los compuestos se llevó a cabo con la columna Zorbax Eclipse XDB-C8 (150 X 4.6 mm, 5µm) mediante LC-DAD y LCHRMS. Se eligió utilizar LC-DAD para realizar la separación cromatográfica y la optimización de la PLE ya que es un equipo de manejo muy sencillo. Sin embargo, el LC-HRMS es un equipo mucho más selectivo y preciso, por ello, se utilizó para calcular el efecto matriz y la recuperación aparente de cada compuesto. • Se observó que las recuperaciones de los compuestos variaba en función de los parámetros de la PLE, por lo que se optimizaron los distintos parámetros de la PLE (disolvente, temperatura, tiempo y volumen de descarga) para obtener las recuperaciones más altas posibles. • Se decidió probar como clean-up la SPE ya que durante la extracción de los compuestos se observó que éstos se veían influenciados por interacciones de la matriz. • Aplicando la SPE como clean-up se observó que no había una mejora respecto al método sin esta etapa. Por ello, se decidió probar a añadir los deuterados aspartamo-d3 y sucralosa-d6 para intentar compensar el efecto matriz y así mejorar los resultados. • El método fue aplicado para analizar diversas muestras de distintas especies marinas. De entre todas las especies, en una muestra de atún se hallaron ALI. Sin embargo, esta muestra no es concluyente ya que la repetición de dicha muestra no presentaba los edulcorantes citados anteriormente. En futuras investigaciones se validará el método y se aplicará en más especies de peces. Determinación de edulcorantes en peces Estefanía Sánchez Chicharro 23 5. BIBLIOGRAFÍA [1] J. Escobar, La contaminación de los ríos y sus efectos en las áreas costeras y el mar, United Nations Publications, 2002. [2] L.M. Barceló D, Contaminación y calidad química del agua: el problema de los contaminantes emergentes, Jornadas de presentación de resultados: el estado ecológico de las masas de agua. 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