Scaffolds de nanocompósitos de grafeno para regeneração do ligamento cruzado anterior

de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior Hugo Jorge Alves de Sousa Gonçalves Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior Hugo Jorge Alves de Sousa Gonçalves UMinho | 2021 Julho de 2021 de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior Escola de Engenharia Hugo Jorge Alves de Sousa Gonçalves Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior Tese de Mestrado Mestrado Integrado em Engenharia de Polímeros Trabalho efetuado sobre a orientação de: Professora Doutora Maria de Conceição de Jesus Rego Paiva Professora Doutora Natália Maria de Araújo Alves Julho 2021 DECLARAÇÃO Nome: Hugo Jorge Alves de Sousa Gonçalves Endereço eletrónico: [email protected] Telefone: +351 914184899 Número do Bilhete de Identidade: 15366693 Título da Dissertação: Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior Orientadores: Professora Doutora Natália Maria de Araújo Alves Professora Doutora Maria da Conceição de Jesus Rego Paiva Ano de conclusão: 2021 Designação do Mestrado: Mestrado Integrado em Engenharia de Polímeros Área de Especialização: Engenharia de Polímeros Escola de Engenharia Departamento de Engenharia de Polímeros É AUTORIZADA A REPRODUÇÃO INTEGRAL DESTA DISSERTAÇÃO APENAS PARA EFEITOS DE INVESTIGAÇÃO, MEDIANTE DECLARAÇÃO ESCRITA DO INTERESSADO, QUE A TAL SE COMPROMETE. Universidade do Minho, 15/07/2021 Assinatura: ___________________________________________________ Hugo Jorge Alves de Sousa Gonçalves S Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anteriorcaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior DECLARAÇÃO DE INTEGRIDADE Declaro ter atuado com integridade na elaboração do presente trabalho académico e confirmo que não recorri à prática de plágio nem a qualquer forma de utilização indevida ou falsificação de informações ou resultados em nenhuma das etapas conducente à sua elaboração. Mais declaro que conheço e que respeitei o Código de Conduta Ética da Universidade do Minho. UNIVERSIDADE DO MINHO ii DIREITOS DE AUTOR E CONDIÇÕES DE UTILIZAÇÃO DO TRABALHO POR TERCEIROS Este é um trabalho académico que pode ser utilizado por terceiros desde que respeitadas as regras e boas práticas internacionalmente aceites, no que concerne aos direitos de autor e direitos conexos. Assim, o presente trabalho pode ser utilizado nos termos previstos na licença abaixo indicada. Caso o utilizador necessite de permissão para poder fazer um uso do trabalho em condições não previstas no licenciamento indicado, deverá contactar o autor, através do RepositóriUM da Universidade do Minho. UNIVERSIDADE DO MINHO iii Agradecimentos A realização desta dissertação põe um ponto final num percurso muito importante da minha vida. É o culminar de muitos anos de ensino. Muitos anos de dificuldades, sucessos, trabalho, mas acima de tudo, anos de aprendizagem, felicidade e superação. Apesar de todas as dificuldades que temos passado neste último ano, dou por concluído o meu mestrado em Engenharia de Polímeros e, como tal, quero agradecer a todos que de uma maneira ou de outra fizeram com que isto fosse possível. Primeiramente, quero agradecer às minhas orientadoras, Maria da Conceição Paiva e Natália Alves, que apesar de todas as dificuldades e obstáculos que este último ano nos trouxe, se mostraram sempre, com uma simpatia enorme, presentes e prontas a ajudar, transmitindo conhecimentos e orientação que me ajudaram na realização desta dissertação. Gostava de agradecer, do fundo do meu coração, à Magda Silva por toda a paciência e por me ter acompanhado sempre durante todo este meu percurso, sem nunca ter desistido de mim e sem nunca me ter recusado ajuda. Quero também agradecer pela companhia e por todo o conhecimento que me transmitiu. Foi sem dúvida alguma um pilar neste trabalho e uma surpresa muita boa que eu tive em todo o meu percurso académico. Agradeço também aos técnicos e professores do departamento que sempre se mostraram disponíveis quer para ajudar quer para me ouvir. Obrigado aos amigos que criei neste meu percurso académico. Obrigado por estes anos maravilhosos que percorreram ao meu lado, sempre unidos nos bons e maus momentos. Fico grato por vos ter conhecido e levo-vos comigo no coração e para o resto da minha vida. Obrigado aos meus amigos de sempre. Aqueles que eu já trazia antes de entrar nesta aventura. Obrigado por estarem sempre lá para mim, obrigado por serem um dos meus maiores refúgios e por tudo o que fizeram por mim. Sem vocês não seria possível. Obrigado à minha família, e em especial aos meus avós, que sempre acreditaram em mim e sempre celebraram as minhas conquistas. Esta conquista é para vocês, os que estão comigo e os que infelizmente já partiram. UNIVERSIDADE DO MINHO iv Obrigado ao amor da minha vida, à minha namorada e companheira, que andou lado a lado comigo todos estes anos. Obrigado pela pessoa que és para mim, por todo amor e força que me dás, por seres um dos maiores pilares da minha vida, por nunca me teres recusado ajuda e acima de tudo por acreditares sempre em mim. Esta vitória também é tua. Por fim, quero agradecer aquelas que são das pessoas mais importantes da minha vida. Quero agradecer aos meus pais, irmã, cunhado e afilhado por tudo o que fizeram e fazem por mim, por acreditarem em mim e tornarem isto possível. Obrigado por nunca terem desistido de mim, pelas palavras, pela educação, pela força e por todo o amor. UNIVERSIDADE DO MINHO xi Índice de Tabelas TABELA 1PROPRIEDADES DO LIGAMENTO CRUZADO ANTERIOR HUMANO. (13) ............................................................................... 9 TABELA 2 - ANÁLISE DA POROSIDADE PARA DIFERENTES TIPOS DE COMPOSIÇÕES POLIMÉRICAS. (15) .................................................. 11 TABELA 3PROPRIEDADES DE POLÍMEROS SINTÉTICOS APROVADOS PARA UTILIZAÇÃO EM IMPLANTES MÉDICOS. (14) ............................... 12 TABELA 4PROPRIEDADES DO PLA. (18) ........................................................................................................................... 14 TABELA 5ALGUMAS DAS PROPRIEDADES DA GRAFITE. (19) ..................................................................................................... 15 TABELA 6PRINCIPAIS ESTUDOS NA ÁREA DA ENGENHARIA DE TECIDOS PARA REGENERAÇÃO DE LIGAMENTOS. (14) (27) .......................... 22 TABELA 7VANTAGENS E DESVANTAGENS DE MATERIAIS POLIMÉRICOS NA REGENERAÇÃO DE TECIDOS. ................................................ 23 TABELA 8PARÂMETROS DE PROCESSAMENTO PARA A PRODUÇÃO DE FILAMENTOS COMPÓSITOS COM 0,25%, 0,5%, 1% E 2% DE GRAFITE. .. 31 TABELA 9VELOCIDADES DOS ROLOS DE PUXO PARA OS COMPÓSITOS COM 0,25%, 0,5%, 1 E 2% DE GRAFITE. ..................................... 32 TABELA 10RESULTADOS DOS ESPECTROS RAMAN. (28) ........................................................................................................ 47 TABELA 11TEMPERATURAS INICIAIS DE DEGRADAÇÃO. .......................................................................................................... 49 TABELA 12PERCENTAGEM DE REFORÇO PRESENTES NOS COMPÓSITOS...................................................................................... 49 TABELA 13IMAGENS SEM DO FILAMENTO DE PLA. ......................................................................................................... 51 TABELA 14IMAGENS SEM DOS FILAMENTOS DE COMPÓSITOS: PLA+0.25EG E PLA+0.5EG. ................................................ 51 TABELA 15IMAGENS SEM DOS FILAMENTOS DE COMPÓSITOS: PLA+1EG E PLA+2EG. ........................................................ 52 TABELA 16IMAGENS SEM DOS FILAMENTOS DE COMPÓSITOS: PLA+0.25F-EG E PLA+0.5F-EG. ........................................... 53 TABELA 17IMAGENS SEM DOS FILAMENTOS DE COMPÓSITOS: PLA+1F-EG E PLA+2F-EG. ................................................... 53 TABELA 18IMAGENS SEM DOS FILAMENTOS DE COMPÓSITOS: PLA+0.25F-EG+AG E PLA+0.5F-EG+AG. .............................. 54 TABELA 19IMAGENS SEM DOS FILAMENTOS DE COMPÓSITOS: PLA+1F-EG+AG E PLA+2F-EG+AG. ...................................... 54 TABELA 20IMAGENS SEM E ANÁLISE EDS DO PLA+ 0,25% E 0,5% (F-EG+AG). ........................................................................ 55 TABELA 21IMAGENS SEM E ANÁLISE EDS DO PLA+ 1% E 2% (F-EG+AG). ........................................................................ 56 TABELA 22IMAGENS DO MICROSCÓPIO ÓTICO DA SECÇÃO TRANSVERSAL DOS FILAMENTOS. ..................................................... 57 TABELA 23IMAGENS DO MICROSCÓPIO ÓTICO DA SECÇÃO TRANSVERSAL DOS FILAMENTOS. ..................................................... 58 TABELA 24CARACTERIZAÇÃO DA SECÇÃO TRANSVERSAL DOS FILAMENTOS. ........................................................................... 59 TABELA 25PROPRIEDADES TÉRMICAS DO PLA E DOS FILAMENTOS COMPÓSITOS RELATIVOS AO 1º AQUECIMENTO. ...................... 62 TABELA 26PROPRIEDADES TÉRMICAS DO PLA E DOS FILAMENTOS COMPÓSITOS RELATIVOS AO 2º AQUECIMENTO. ...................... 62 TABELA 27RESISTIVIDADE ELÉTRICA DO PLA E DOS FILAMENTOS COMPÓSITOS.......................... ERRO! MARCADOR NÃO DEFINIDO. TABELA 28SCAFFOLDS PRODUZIDOS PARA O PLA E PARA OS FILAMENTOS COMPÓSITOS DE 0.5% E 2% F-EG+AG....................... 68 TABELA 29RESULTADOS DMA DOS SCAFFOLDS FIBROSOS. ............................................................................................... 69 UNIVERSIDADE DO MINHO xii Lista de Abreviaturas A ACL Anterior cruciate ligament Ag Prata Ag/NPs Nanopartículas de Prata Au Ouro C Cu Cobre C Carbono D DNA Ácido desoxirribonucleico DMF Dimetilformamida DSC Calorimetria Diferencial de Varrimento DMA Análise Mecânica dinâmica E E Módulo de young EDS Espectroscopia de raios X por energia dispersiva EG Grafite Exfoliada F f-EG Grafite Exfoliada Funcionalizada H HOPG Grafite pirolítica altamente orientada K K-GIC Compostos de grafite intercalado L LCA Ligamento Cruzado Anterior N NPs Nanopartículas Metálicas AgNO3 Nitrato de Prata P PCL Poli-ε-caprolactona PLA Poli (ácido lático) PDLA Poli (D-lático) PDLLA Poli (DL-lático) PLLA Poli (L-lático) PGA Poli (ácido glicólico) PBS Tampão Fosfato Salino UNIVERSIDADE DO MINHO xiii S SEM Microscopia Eletrónica de Varrimento T TE Engenharia de Tecidos Tc Temperatura de Cristalização TGA Análise Termogravimétrica Tg Temperatura de transição Vítrea Tf Temperatura de fusão O O Oxigénio Z Zn Zinco Símbolos ∆Hc Entalpia de cristalização ∆Hf Entalpia de fusão ∆Hf0 Entalpia de fusão teórica ∆Cp Capacidade Calorifica Ø Fração em massa ε Deformação µm Micrótomos ρ Densidade σ Resistência à tração χ Grau de Cristalinidade pV Resistividade Volumétrica I Intensidade V Volt R Resistência TS Temperatura da amostra TR Temperatura de referência Números 2D Duas dimensões 3D Três Dimensões S Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anteriorcaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 1 Capítulo 1 Introdução UNIVERSIDADE DO MINHO 2 1. Introdução 1.1. Motivação Os tendões e ligamentos são tecidos conectivos densos que unem ossos a músculos e ossos a ossos respetivamente. As lesões nestes tecidos estão entre as lesões mais comuns relativas ao corpo humano e são particularmente comuns em população jovem e fisicamente ativa (1). O ligamento cruzado anterior (LCA) é o ligamento do joelho mais comumente lesionado, com mais de 250.000 pacientes a cada ano com diagnóstico de rutura do LCA e aproximadamente 150.000 cirurgias de LCA realizadas anualmente. O LCA é um ligamento intra-articular que controla movimento normal e atua como um estabilizador articular, conectando o fêmur à tíbia. Devido à sua pobre capacidade intrínseca de cura e vascularização limitada, estas ruturas não cicatrizam sendo geralmente necessária intervenção cirúrgica (2). A alta incidência de patologias e ruturas de tendões e ligamentos e a ausência de tratamentos adequados que garantam a recuperação total da função conjunta ou da área afetada do sistema locomotor, tornam necessário pesquisar novos materiais que possam ser implantados e substituir temporariamente o tecido danificado até sua regeneração completa (3). Tradicionalmente, estas lesões são tratadas com enxertos biológicos (autoenxertos ou aloenxertos). Os autoenxertos e os aloenxertos possuem boa resistência mecânica inicial, promovem a proliferação celular e o crescimento de novos tecidos. No entanto, possuem também algumas desvantagens. Os autoenxertos requerem uma cirurgia adicional que é conhecida por causar morbidade local, aumento do tempo de recuperação e possível dor no local da colheita. Os aloenxertos por sua vez apresentam limitação no seu fornecimento, podendo transmitir doenças ou infeções bacterianas e provocar uma resposta imunogénica negativa do hospedeiro (4). A utilização de polímeros como biomateriais teve bastante impacto no avanço da medicina moderna. Em particular, os biomateriais poliméricos biodegradáveis possuem a capacidade de se decompor, não sendo necessária a sua remoção após terem cumprido a sua função. S Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anteriorcaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 3 As aplicações são profusas, por exemplo, com polímeros biodegradáveis a serem aplicados clinicamente como suturas e implantes cirúrgicos. Para atender à demanda funcional, materiais com as propriedades físicas, químicas, biológicas, biomecânicas e de degradação adequadas para uma determinada aplicação devem ser selecionados. Felizmente, uma ampla gama de polímeros biodegradáveis naturais e sintéticos tem sido investigada para aplicações biomédicas, com novos materiais sendo constantemente desenvolvidos para enfrentar novos desafios (5). Todos os dias, milhares de procedimentos cirúrgicos são realizados para substituir ou reparar tecidos danificados por doenças ou traumas. O campo em desenvolvimento da engenharia de tecidos (TE) procura regenerar tecidos danificados, combinando células humanas com scaffolds altamente porosos, que atuam como suportes para a regeneração de tecidos (6). A Engenharia de Tecidos é multidisciplinar, abrangendo, conhecimentos das áreas da ciência e engenharia de materiais, biologia e medicina. Nesta estratégia, tipicamente é efetuada a expansão in vitro de células provenientes do paciente dador sobre suportes de polímeros biodegradáveis, designados por scaffolds. Este suporte degrada enquanto um novo órgão ou tecido é formado. Numa fase inicial, os biomateriais foram concebidos para que se mantivessem inertes no organismo. Desta maneira, os estudos concentraram-se na forma de prevenir/minimizar as reações teciduais indesejáveis. Atualmente, os polímeros correntes são concebidos para que haja uma interação com os tecidos, provocando respostas fisiológicas como proliferação e/ou diferenciação celular no local do implante. Nas últimas décadas, foram obtidos avanços expressivos na compreensão dos mecanismos de interação das células animais com o seu ambiente natural, a matriz extracelular, bem como a influência da mesma na proliferação e diferenciação celular. Muitas vezes, este conhecimento tem sido utilizado para o desenvolvimento de polímeros que possam simular as propriedades da matriz extracelular, exercendo assim um papel ativo na regeneração tecidual. Os biomateriais aplicados podem ser classificados como permanentes ou temporários. Os materiais permanentes são utilizados com o objetivo de substituir um tecido danificado por tempo indeterminado. Dessa forma, são produzidos de modo a S Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anteriorcaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 4 reter as suas propriedades mecânicas e físico-químicas por longos períodos. Esses tipos de dispositivos são frequentemente utilizados como próteses, por exemplo, para substituir articulações danificadas. Em contrapartida, existem situações onde é necessário um suporte que preencha apenas temporariamente a região lesada, até que a regeneração dos tecidos ocorra, ou ainda que direcione o processo regenerativo. Neste caso, uma alternativa são os biomateriais temporários (7). Os poli (α-hidróxi ácidos), tal como o poli (ácido lático) (PLA) e o poli (ácido glicólico) (PGA), representam uma das classes de polímeros sintéticos biodegradáveis mais utilizados nesta área. Para o desenvolvimento e seleção desses materiais, o tempo de degradação é primordial para o sucesso do implante. Os estudos e os desafios atuais são normalmente direcionados para a compreensão da relação entre a composição química, morfologia, e a técnica de processamento utilizada (8). Este trabalho concentra-se no desenvolvimento de fibras de compósito de grafite exfoliada e funcionalizada com o polímero PLA, através da extrusão de filamento, para aplicar na produção de suportes porosos ( scaffolds ) para regeneração de ligamentos. Espera-se que estes compósitos apresentem propriedades mecânicas superiores e menor resistividade elétrica. 1.2. Esquema da Tese Esta tese está dividida em cinco capítulos: No Capítulo 1 é apresentada a motivação deste trabalho, assim como o esquema da tese. O Capítulo 2, apresenta uma visão geral do estado da arte das funções e propriedades do ligamento cruzado anterior (LCA), assim como abordagens atuais no tratamento da rotura deste ligamento. É também apresentado um sumário dos materiais usados neste trabalho, assim como as suas principais propriedades, e a sua utilização na área biomédica. O método de torção e entrançamento para a produção de scaffolds também é abordado neste capítulo, assim como os métodos utilizados para produzir as fibras utilizadas nestes scaffolds . S Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anteriorcaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 5 O Capítulo 3 descreve os materiais e métodos adotados neste trabalho, nomeadamente as técnicas usadas para a funcionalização da grafite exfoliada, incorporação de nanopartículas de prata, processamento de filamentos através de extrusão e produção dos scaffolds fibrosos. Todas as técnicas usadas para caracterizar os materiais produzidos também são apresentadas. O Capítulo 4 divide-se em dois subcapítulos, onde serão descritos: i) caracterização e discussão de resultados relativos aos filamentos compósitos e ii) caracterização e discussão de resultados relativos aos scaffolds fibrosos. No Capítulo 5 são apresentadas as principais conclusões deste trabalho assim como algumas propostas para trabalhos futuros de investigação. Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 6 Capítulo 2 Estado de Arte Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 7 2. Estado de Arte 2.1. Ligamento Cruzado Anterior A rutura do ligamento cruzado anterior (LCA), representada na figura 1, é uma das lesões ligamentares mais comuns do joelho (9). Mais de 800.000 pessoas procuram assistência médica a cada ano para lesões nos ligamentos e tendões. Estas roturas geralmente causam dor, inchaço e instabilidade articular e requerem cirurgia para reconstruir o tecido. O ligamento cruzado anterior (LCA) é vital para a estabilidade mecânica da articulação do joelho; funciona para restringir o movimento excessivo para a frente da tíbia em relação ao fémur, limitando o movimento rotacional do joelho. A lesão neste ligamento resulta em rutura completa ou parcial do mesmo, sendo frequentemente observada no cenário clínico e particularmente em pacientes mais jovens e ativos [1]. Embora as ruturas sejam bastante comuns, a sua reconstrução cirúrgica apresenta baixas taxas de sucesso (10). A lesão ocorre quando uma tensão excessiva é aplicada ao ligamento, geralmente devido a movimentos bruscos de torção e / ou desaceleração realizados no pé de apoio (11). As mesmas podem resultar em disfunção articular significativa, o que pode levar a lesões de outros tecidos e ao Figura 1Rutura do Ligamento Cruzado Anterior. (61) Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 14 2.3.2. Grafite A grafite é um cristal formado por camadas tridimensionais (3D) de grafeno, como representado na figura 9. É por natureza um material com superfície lisa, constituído por camadas de carbonos hibridizados 𝑠𝑝2 ligados entre si na forma de um anel hexagonal planar. Essas camadas de grafeno têm 0,335 mm de distância de separação entre elas e o comprimento da ligação carbono-carbono no plano é de 0,142 nm. Além disso, as restantes orbitais p formam orbitais moleculares do tipo π deslocalizadas que se estendem paralelamente aos planos dos átomos de carbono e dão origem à mobilidade eletrónica (condutividade elétrica) assim como ás atrações de van der Waals fracas entre os planos. A diferença entre as forças de ligação entre os carbonos no plano e entre os diferentes planos é responsável por diversas propriedades anisotrópicas e industrialmente relevantes da grafite, como a sua condutividade térmica, dureza, porosidade, condutividade elétrica, efeitos de superfície e reatividade química (20). Tabela 4Propriedades do PLA. (18) Densidade (ρ) 1.26 (g/cm3) Toxicidade Não Módulo de Young (E) 3.4-3.8 (GPa) Deformação (ε) 2.3-2.5 (%) Temperatura de Transição Vítrea (T g) 49-63 (°C) Temperatura de Fusão (T m) 144-186 (°C) Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 15 A seleção de matérias-primas e condições de processamento é fundamental para a definição das propriedades do compósito final. Essas propriedades dependem da morfologia e do grau de anisotropia da grafite acabada. A tabela 5 ilustra o efeito da anisotropia nas propriedades da grafite (20). Tabela 5Algumas das propriedades da grafite. (19) Propriedade Unidade Paralelo ao Plano Perpendicular ao Plano (eixo z) Resistividade µΩ·m 0.40 60 Módulo de elasticidade GPa 1020 36 Força de tensão GPa 96 34 Condutividade térmica W/m·K 2000 10 Expansão térmica 1/°C -0.5x10−6 27x10−6 Do ponto de vista industrial, a mistura através da fusão é a técnica mais utilizada para a preparação de compósitos, por ser uma técnica direta, um processo económico e ambientalmente correto, uma vez que não são envolvidos solventes durante a preparação do compósito. Equipamentos de mistura tradicionais, como a extrusora, misturador interno e moinho de dois rolos podem ser adotados para as operações de mistura por fusão e geralmente estão disponíveis na maioria das unidades de composição (21). Figura 9Estrutura molecular da grafite. (19) Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 16 2.3.2.1. Exfoliação da grafite Quando a grafite é aquecida para lá da sua temperatura crítica ou exposta a radiações microondas, ocorre uma grande expansão (até centenas de vezes) de flocos de grafite ao longo do eixo e depois na direção do plano, formando acordeões, com baixa densidade e resistência a altas temperaturas, sendo este produto expandido conhecido como grafite expandida (EG), representada na figura 10. Esta é composta por pilhas de nano folhas que podem variar de 100 a 400 nm. Industrialmente, a grafite expandida é produzida submetendo flocos de grafite naturais a ácido sulfúrico seguido de um choque térmico brutal. Esta exibe uma estrutura em camadas semelhante a camadas de silicatos e apresenta uma boa afinidade com polímeros e compostos orgânicos (21) 2.3.3. Grafeno O grafeno, é uma folha individual bidimensional, com a espessura de um átomo de carbono, composta por uma rede hexagonal de átomos de carbono, que tem sido intensamente investigado desde o seu primeiro isolamento em 2004, baseado na exfoliação mecânica de grafite pirolisada altamente orientada (HOPG). As suas extraordinárias propriedades fazem dele um candidato promissor para diversas aplicações práticas no ramo da eletrónica, sensorização, catálise, armazenamento de energia, conversão, etc. Figura 10Esfoliação/Expansão da grafite. (20) Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 17 Tanto os estudos teóricos como os experimentais provaram que as propriedades do grafeno são principalmente dependentes da sua estrutura geométrica. Na figura 11 está representada a estrutura do grafeno de acordo com a sua escala de tamanho (22). Para regenerar o tecido muscular esquelético, as terapias baseadas em células-tronco são frequentemente usadas com nanomateriais que podem atuar como estruturas funcionais para estimular a viabilidade e diferenciação celular. A esse respeito, como os materiais à base de grafeno possuem excelente flexibilidade, condutividade elétrica relativamente alta e fortes propriedades mecânicas com densidade ultralateral, eles podem atuar como excelentes substratos celulares para engenharia de tecido muscular. Para além disso, estes materiais melhoram ainda a adesão, proliferação, miogênese das células musculares e o alinhamento celular, maximizando, estas últimas duas, o poder contrátil celular dos tecidos musculares (23). Os biomateriais são componentes cruciais na engenharia de tecidos, pois podem induzir funções celulares específicas, diferenciação direta de células e modular interações célula-célula. No entanto, todos os tecidos no corpo possuem propriedades mecânicas, elétricas ou físicas diferentes. Materiais únicos podem não imitar as propriedades físicas e biológicas do tecido nativo; portanto, materiais híbridos com múltiplos componentes que podem atender a diferentes requisitos são amplamente utilizados para fabricar tecidos artificiais. As extraordinárias propriedades mecânicas e elétricas dos materiais à base de grafeno motivaram os pesquisadores a usá-los na engenharia de tecidos e na medicina regenerativa. O grafeno pode ser combinado com uma grande variedade de materiais bioativos para projetar materiais com as características desejadas. Figura 11Ilustração esquemática da terminologia do grafeno de acordo com a sua escala de tamanho. (21) Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 18 O grafeno e seus derivados têm sido uma nova classe essencial de nanomateriais e um sistema modelo para o comportamento quântico. A excelente condutividade elétrica e térmica, área superficial, resistência térmica do material e possível biocompatibilidade são de grande interesse para a comunidade científica. Os materiais bidimensionais de grafeno têm sido amplamente utilizados em várias áreas de pesquisa biomédica, como bioeletrónica, libertação controlada de fármacos e engenharia de tecidos (22). 2.3.4. Funcionalização do grafeno A funcionalização do grafeno, exemplificada na figura 12, aparece como uma estratégia adequada para aumentar a compatibilidade entre o grafeno e uma matriz polimérica, resultando na produção de compósitos com propriedades estruturais excecionais com baixas cargas de reforço. A funcionalização do grafeno pode ser alcançada por meio de modificações covalentes e não covalentes. O primeiro leva à formação de interfaces fortes e estáveis com matrizes polimérica através da adição de grupos funcionais à superfície de grafeno, que fornece reatividade para certos compostos, polímeros ou moléculas com atividade biológica (24). Figura 12Funcionalização do grafeno. (46) Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 19 2.3.5. Grafeno decorado com nanopartículas de prata A presença de um material estranho, como um biomaterial sintético, no corpo do recetor do implante representa um local potencial para a atividade microbiana. Reduzir a adesão bacteriana é muito importante, pois a fixação da superfície do microrganismo é o primeiro passo crítico no desenvolvimento de infeções associadas ao implante. Para superar as limitações dos tratamentos com antibióticos para a prevenção de infeções periprotéticas, é dada uma atenção especial ao uso de agentes antimicrobianos alternativos, como cobre (Cu), zinco (Zn) e prata (Ag). Este último, é um agente antibacteriano de amplo espectro e é usado nas formas iónica e metálica e é particularmente usado na forma de nanopartículas em soluções coloidais. A atividade antimicrobiana tem sido relacionada principalmente à sua forma oxidada (𝐴𝑔+), causando a rutura das membranas celulares bacterianas, inibição de atividades enzimáticas, produção de ATP nos processos de transporte de iões e replicação do DNA. A reatividade da prata é ainda mais potenciada quando é usada na forma de nanopartículas, que possuem uma enorme relação superfície /volume, sendo por isso, que a funcionalização do grafeno com as mesmas deve cumprir a sua função com o mínimo de prata possível, para que a toxicidade que pode advir da concentração da mesma em excesso seja evitada (25). Os vários modos de ataque das nanopartículas de prata sob bactérias são representados na figura 13. Figura 13Vários modos de ataque das nanopartículas de prata sob as bactérias. (45) Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 20 Nanomateriais e, especialmente, nanopartículas metálicas (NPs), como o caso da prata (Ag), surgiram como uma nova classe de compostos particularmente interessantes para a ciência dos materiais devido a uma basta gama de propriedades únicas. Podem ser aplicados em diversas áreas, da química à física, ciências dos materiais, biologia e medicina. A combinação desses materiais com nanoestruturas de carbono pode levar a uma integração bem-sucedida das propriedades dos dois componentes nos novos materiais híbridos que apresentam características importantes para catálise e nanotecnologia (26) (27). É de prever que a decoração de grafeno com nanopartículas de prata possa ter efeito benéfico na condutividade elétrica de compósitos à base de grafeno e, por sua vez, levar a uma diminuição na resistividade do scaffold , podendo ser considerado uma vantagem, uma vez que se sabe que os campos elétricos aplicados (estáticos e pulsantes) são amplamente utilizados em práticas ortopédicas e têm demonstrado melhorar a cicatrização do ligamento in vivo (26) (27). 2.4. Técnicas têxteis de processamento de scaffolds para regeneração de ligamentos Na última década, técnicas têxteis, tais como tecelagem, tricô, trança e eletrofiação surgiram como plataformas promissoras para o processamento de scaffolds para regeneração de tecidos humanos. Para fabricar um scaffold funcional, a construção projetada deve simular as suas propriedades estruturais, topográficas e mecânicas. Além disso, o scaffold deve facilitar a difusão de nutrientes e oxigénio (O), bem como a remoção de resíduos metabólicos durante a regeneração do tecido, como foi anteriormente mencionado. Dois designs aplicados recentemente na produção de scaffolds , representados na figura 14, são a torção e o entrançamento ( braid-twist ). A combinação destas duas técnicas é normalmente usada no fabrico de materiais têxteis e ambas as técnicas têm sido usadas separadamente para produzir scaffolds para regenerar LCA. O entrançamento é uma técnica usada para produzir produtos que suportem cargas axiais e fornecer reforço mecânico. As estruturas entrançadas são resistentes ao corte, conformáveis e podem transferir grandes cargas enquanto fornecem extensão, e em comparação com outras estruturas têxteis, oferecem maior força axial. A porosidade e as propriedades mecânicas podem ser ajustadas espacialmente. Assim, além dos tecidos conjuntivos, as estruturas entrançadas podem ter o potencial de serem usadas em tecidos de engenharia que requerem alta resistência mecânica. Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 21 A torção das fibras é usada na indústria têxtil para formar fios. A direção e o grau de torção afetam a resistência do fio, a resistência à abrasão e a flexibilidade. Um baixo grau de torção produz fios mais frágeis que se separam e partem mais facilmente e podem desenvolver saliências nas suas superfícies devido a abrasões. O aumento do grau de torção melhora a resistência e a abrasão do fio. A combinação de torção com o entrançamento das fibras produz uma estrutura mecanicamente estável, com maior capacidade de carga e maior grau de extensibilidade. Os graus de entrançamento e de torção podem ser alterados para ajustar as propriedades mecânicas do scaffold às do tecido que se pretende regenerar [19]. A tabela 6 e 7 resumem os principais resultados dos estudos relacionados com a utilização de técnicas têxteis para a produção de scaffolds baseadas em poliésteres na regeneração de ligamentos, assim como algumas vantagens e desvantagens associados a cada um desses materiais poliméricos. Figura 14Métodos têxteis utilizados para a produção de scaffolds. As imagens apresentam os scaffolds entrançados (a), com torção (b) e a combinação do entrançamento com a torção (c). (10) S Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anteriorcaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 22 Tabela 6Principais estudos na área da engenharia de tecidos para regeneração de ligamentos. (14) (27) Biomaterial Estudos Técnicas Têxteis Refs. PGA Um scaffold de PLLA tem maior integridade estrutural e propriedades mecânicas ao longo do tempo, apresentando uma maior contagem de células in vitro, quando comparado com scaffolds de PGA. Entrançamento (16) (28) PLLA Implantes entrançados de PLLA degradam-se mais rapidamente in vivo do que in vitro. Implantes de 2.0 mm perderam 69% da carga de tração inicial em 46 semanas de degradação in vitro. Em condições in vivo, ambos os implantes de 2.0 e 3.2 mm retiveram apenas 3% e 4% da sua carga de tração inicial. Entrançamento Torção EntrançamentoTorção (16) (28) PLGA Propriedades mecânicas diminuem na degradação in vitro, mas ainda dentro dos valores fisiologicamente relevantes. Entrançamento (16) (28) PGA/PLA O scaffold puro de PGA/PLA não conseguiu regenerar tecido com propriedades mecânicas adequadas, atingindo apenas 14% da força normal do tendão após o implante. - (16) (28) PCL Após 16 semanas, enxertos acelulares contendo fatores de crescimento alcançaram 58.8% da rigidez e 40.7% da carga do LCA nativo, e sem fatores de crescimento adicionados, alcançaram apenas 31.3% da rigidez e 28.2% da carga. Entrançamento (16) (28) Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 23 Tabela 7Vantagens e desvantagens de materiais poliméricos na regeneração de tecidos. Material Vantagens Desvantagens Refs. PCL Considerado um polímero nãotóxico, compatível com o tecido e com outros polímeros e tem uma taxa de degradação lenta em comparação com o PLA; Propriedades mecânicas reduzidas; (29) (28) PLLA Boa adesão celular e proliferação, fácil de produzir e taxa de degradação lenta; Biologicamente inerte; Produção de soluções tóxicas devido à sua degradação acida; (28) PGA Boas propriedades mecânicas iniciais; Degradação demasiado rápida aquando comparado com outros materiais e rápida perda de propriedades mecânicas; (28) PLA-PGA Biocompatível, não-tóxico e não inflamatório. Promovem reações adversas durante o processo de reparação de tecido. (29) É importante sublinhar, que a área da engenharia de tecidos ainda está numa fase embrionária e muitas abordagens diferentes estão a ser alvo de investigações experimentais. Assim, ainda não está claro o que define um conjunto scaffold/célula ou scaffold/tecido recém-formado ideal, mesmo para um tipo de tecido específico. De fato, uma vez que alguns tecidos desempenham múltiplas funções, é improvável que um único scaffold sirva de base universal para a regeneração de um único tecido. Portanto, as considerações para o seu desenvolvimento são complexas e incluem a composição do material, arquitetura porosa, propriedades mecânicas, propriedades da superfície, propriedades dos produtos de degradação, e ainda a composição de quaisquer componentes biológicos adicionados e, é claro, as variações de todos esses fatores com o tempo. 2.5. Produção de filamentos de compósito para regeneração do LCA Os polímeros termoplásticos semicristalinos amolecem ou fundem quando aquecidos acima do seu ponto de fusão, este tipo de processamento tem sido uma técnica muito valiosa no fabrico de compósitos reforçados com nanopartículas. Em geral, este tipo de processamento envolve a mistura do polímero fundido com as nanopartículas por aplicação de forças de corte intensas. Dependendo da morfologia/forma final dos compósitos, as amostras podem ser processadas através de diversas técnicas, como por exemplo a extrusão. Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 30 3.2.3. Produção dos filamentos Os filamentos foram produzidos com recurso a uma mini extrusora Rondol Microlab Twin Screw com PLA e PLA com 0,25, 0,5, 1 e 2% em massa de EG, f-EG e (f-EG) + Ag, individualmente. O equipamento foi inicialmente desenhado/projetado para processar pequenas quantidades de material, mantendo desta maneira as características térmicas e hidrodinâmicas de equipamentos de maiores dimensões. A extrusora possui um diâmetro de rosca de 10 mm, sendo o fuso configurado com diferentes elementos que permitem o escoamento do material ao longo do canal, promovendo ainda uma mistura intensiva e eficaz do material por inclusão de elementos de mistura, conforme ilustra a figura 17. Para obter um filamento com 0,25 mm de diâmetro, que possa ser utilizado posteriormente na produção de scaffolds com recurso a técnicas têxteis, as condições de processamento variam de acordo com o filamento a ser processado da seguinte forma: • Para a produção dos filamentos de PLA, a velocidade de rotação dos parafusos foi de 15 rpm, a zona de alimentação e a fieira eram mantidas a 160 e 130 °C, respetivamente, e um alimentador volumétrico miniaturizado era ajustado a 37,4 g/h. • Em filamentos compósitos, as condições de processamento variaram dependendo do tipo de grafite a ser adicionado (EG, f-EG ou f-EG + Ag) e da percentagem de reforço necessária, tal como está indicado na tabela 8. Figura 17Parafusos da mini extrusora constituídos por diferentes elementos de mistura e transporte. Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 31 Tabela 8Parâmetros de processamento para a produção de filamentos compósitos com 0,25%, 0,5%, 1% e 2% de grafite. Para uma extrusão controlada de cada filamento, em particular para o controlo do diâmetro do filamento extrudido, é exigido um par de rolos de puxo, posicionados em sequência de forma a puxar, ajustando o diâmetro e orientando a fibra horizontalmente. Durante este processo o filamento arrefece e consolida ao ar. Após isto, os filamentos foram enrolados e recolhidos. Durante a extrusão de cada tipo de filamento, a velocidade de ambos os rolos foi semelhante, tal como indicado na Tabela 9. No entanto, foram necessários alguns pequenos ajustes para cada composição, variando ligeiramente sua velocidade. Material Temperatura (oC) Zona de Alimentação/Meio/Fieira Débito (g.𝒉−𝟏) Velocidade do Parafuso(rpm) PLA+ 0,25% 160/170/130 0.096 15 PLA+ 0,5% EG 0.186 PLA+ 1% 160/170/130 0.376 25 PLA+ 2% 0.759 45 PLA+ 0,25% 160/170/123 0.108 25 PLA+ 0,5% f-EG 0.2 PLA+ 1% 160/170/130 0.376 45 PLA+ 2% 0.759 65 PLA+ 0,25% 160/170/123 0.126 25 PLA+ 0,5% f-EG+Ag 0.240 PLA+ 1% 160/170/130 0.376 45 PLA+ 2% 0.759 65 Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 32 Tabela 9Velocidades dos rolos de puxo para os compósitos com 0,25%, 0,5%, 1 e 2% de grafite. 3.2.4. Caracterização estrutural dos filamentos compósitos 3.2.4.1. Análise Termogravimétrica (TGA) A análise termogravimétrica é uma técnica importante usada para avaliar informações sobre a composição (alterações físicas -/- químicas) e estabilidade térmica de materiais de base polimérica. Este método avalia a alteração de massa de um material em função de um programa de temperaturas, permitindo avaliar a sua estabilidade térmica ao longo desse programa. A TGA também pode ser usado para determinar os teores de umidade, voláteis e de carga, para estudar os efeitos dos aditivos e para obter a separação de alguns componentes. Na tentativa de determinar os mecanismos exatos de degradação do polímero, a TGA foi acoplada a técnicas espectroscópicas para esclarecer os mecanismos de degradação e identificar componentes (36). Os equipamentos TGA consistem em dois componentes principais: uma microbalança e um forno. As amostras são colocadas no cadinho inerte e colocadas no forno. A variação de massa é medida enquanto as amostras são submetidas a um programa de temperaturas definido. Um fluxo de Material Velocidade dos rolos(rpm) Rolo 1 Rolo 2 PLA 33.38-33.62 33.72-33.84 PLA + 0.25% EG 33.52-33.56 33.76-34.02 PLA + 0.5% EG 36.60-36.58 36.80-36.82 PLA + 1% EG 33.04-33.24 40.72-41.02 PLA + 2% EG 33.02-33.24 43.98-44.14 PLA + 0.25% f-EG 38.88 39.08-39.12 PLA + 0.5% f-EG 39.28 39.4-39.48 PLA+ 1% f-EG 35.54-35.86 42.86-43.14 PLA+ 2% f-EG 33.02-33.24 44.64-44.86 PLA+ 0.25% (f-EG+Ag) 39.24-39.30 39.44-39.48 PLA+ 0.5% (f-EG+Ag) 39.34 39.54-35.58 PLA+ 1% (f-EG+Ag) 35.58-35.88 43.66-43.9 PLA+ 2% (f-EG+Ag) 32.98-33.18 45.12-45.30 Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 33 gás flui a uma velocidade constante através do forno para limpá-lo dos gases de degradação e aumentar a condutividade térmica da atmosfera do forno (36). A análise de TGA foi realizada no equipamento Q500 (TA Instruments, EUA) para o rendimento da funcionalização da EG. quantificação do rendimento de funcionalização de EG e avaliar a sua estabilidade térmica. Aproximadamente 4 mg de cada amostra foi colocada no cadinho de platina e aquecida sob uma atmosfera de nitrogênio (fluxo constante de 50 mL/min) variando a temperatura entre 40 ºC e 950 ºC. Os ensaios foram realizados a uma velocidade de aquecimento de 10 ºC/min (37). 3.2.4.2. Espectroscopia Raman A espectroscopia Raman tem um papel importante no estudo e caracterização de materiais à base de grafite, sendo amplamente utilizado nas últimas quatro décadas para caracterizar grafite pirolítica, fibras de carbono (C), nanotubos de carbono, grafeno, entre outros, identificando os tipos de ligações e fornecendo informações sobre o grau de desordem da rede cristalina (38). A espectroscopia Raman tem vindo a ser utilizada para analisar as características estruturais e eletrónicas do grafeno, grafite e seus derivados, fornecendo informações úteis sobre as três principais bandas, típicas do grafeno e derivados. A banda D, centrada próximo de 1350 𝑐𝑚−1, que resulta de defeitos estruturais, que têm origem na inserção de grupos funcionais no plano de carbono originando hibridização 𝑠𝑝3. A intensidade desta banda diminui com perfeição da ligação da rede hexagonal de carbono, indicativa de uma diminuição dos defeitos. A banda G, cerca de 1580 𝑐𝑚−1, está diretamente relacionada com a vibração no plano de átomos de carbono 𝑠𝑝2, refletindo a qualidade da rede de grafite do material, uma vez que avalia a hibridização 𝑠𝑝2 da estrutura. A banda 2D ou G’, em torno dos 2670 S Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anteriorcaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 34 𝑐𝑚−1, corresponde ao “espalhamento” ou dispersão de segunda ordem da banda D, fornecendo informações sobre o número de camadas do grafeno. Estas bandas surgem no espectro de Raman em torno dos 1350 𝑐𝑚−1, 1580 𝑐𝑚−1 e 2670 𝑐𝑚−1conforme ilustrado na figura 18 (38) (39). De forma a avaliar o rendimento da funcionalização, a qualidade da estrutura e o nível de exfoliação através de Espectroscopia Raman, os filamentos de grafite exfoliada (EG), grafite exfoliada funcionalizada (f-EG) e (f-EG)+Ag, foram colocados sobre uma lamela de vidro e analisados num espectrómetro LabRAM HR Evolution Raman (Horiba Scientific, Japão) usando um laser com um comprimento de onda de 532 nm. Os resultados foram analisados e normalizados com o software LabSpec6. Figura 18Comparação do Espetro Raman da grafite e do grafeno. (63) Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 35 3.2.4.3. Microscopia Eletrónica de Varrimento (SEM) O microscópio eletrónico de varrimento (SEM), cujas características estão ilustradas na figura 19, é um instrumento que cria imagens ampliadas, revelando informações em escala microscópica sobre o tamanho, forma, composição, cristalografia e outras propriedades físicas e químicas de uma amostra, através de sinais de eletrões espalhados pela superfície, sendo habitualmente aplicado para visualização de materiais à base de grafite. (40) No SEM, os eletrões são gerados por um canhão de eletrões e focalizados num feixe de alta energia da ordem dos 2–10 nm de largura quando atinge a amostra. O feixe é controlado eletronicamente por uma série de lentes e permite digitalizar uma área desejada de uma superfície. Este feixe pode variar em energia de 1 a 40 keV. Os eletrões interagem com os átomos na amostra e são espalhados pela superfície da amostra produzindo uma variedade de sinais. Os sinais secundários e retro-difundidos são geralmente capturados e convertidos numa imagem da superfície (20). O feixe de eletrões, extremamente estreito, produz imagens com uma grande profundidade de campo, de modo a que aspetos 3D da superfície possam ser visualizados. Usando detetores adequados, esses sinais podem ser usados para realizar análises químicas da superfície permitindo a identificação qualitativa e quantitativa dos elementos da amostra. A Figura 19 mostra as principais características de um microscópio eletrônico de varredura (SEM). Para imagens convencionais de SEM, as amostras devem ser eletricamente condutoras para evitar a acumulação de carga. As amostras não condutoras são revestidas com ouro, tornando as suas superfícies condutoras evitando distorções de imagem devido à acumulação de carga (20). Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 36 A morfologia e a distribuição do reforço dos filamentos de PLA, PLA com grafite exfoliada (EG), PLA com grafite exfoliada funcionalizada (f-EG) e do PLA com grafite exfoliada funcionalizada decorada com nanopartículas de prata (f-EG + Ag) foram caracterizadas por SEM, utilizando o instrumento FEI Nova 200 FEG-SEM/EDS. 3.2.4.4. Microscopia Ótica O microscópio ótico, representado na figura 20, é um dispositivo que contém uma ou mais lentes que produzem uma imagem ampliada da amostra colocada no plano focal da lente. A resolução do microscópio ótico é limitada pelos efeitos de difração e aproxima-se dos comprimentos de onda da luz transmitida, na região dos 200 nm. Existem duas opções disponíveis em microscopia ótica: (1) Microscopia de transmissão, em que o feixe de luz passa por um objeto transparente ou por uma secção fina, e (2) microscopia de reflexão, na qual a luz incidente é refletida na superfície de uma amostra sólida. Uma possibilidade adicional destes dispositivos é o uso de luz polarizada no plano. Figura 19Principais características de um microscópio eletrónico de varredura (SEM). (20) Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 37 Esta técnica é particularmente adequada para o estudo de materiais anisotrópicos, como a grafite. A luz branca normal abrange todos os comprimentos de onda de luz visível que vibram em todas as direções em um plano perpendicular à direção de propagação. Quando essa luz passa através de um filtro de polarização, uma onda com apenas uma única direção de vibração paralela ao polarizador, ou luz planopolarizada, emerge (20). A microscopia ótica foi utilizada para confirmar a presença de grafite nos compósitos, analisar a dispersão e possível formação de aglomerados e quantificar a razão de área das partículas de reforço na matriz. Para tal, foram cortadas secções transversais de cada filamento no micrótomo Leica EM UC6, colocadas sobre uma lamela de vidro com bálsamo do Canadá e, a seguir, analisadas no microscópio óptico Olympus BH-2 com as lentes de 10x e 40x, em modo de transmissão. As imagens obtidas por microscopia ótica foram analisadas com o software ImageJ para análise estatística. Figura 20Representação de um microscópio ótico de luz polarizada configurado para reflexão e transmissão. (20) Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 38 3.2.4.5. Calorimetria Diferencial de Varrimento (DSC) A Calorimetria Diferencial de Varrimento (DSC) permite medir a diferença entre o fluxo de calor fornecido a uma amostra e a uma referência enquanto ambas estão sujeitas a um programa de temperatura controlada (41). O DSC é provavelmente das técnicas mais populares de análise térmica devido à sua ampla gama de áreas de aplicação e também ao facto de que as medições são rápidas e fáceis (42). Como as reações químicas e muitas transições físicas estão relacionadas com a libertação ou absorção de calor, a calorimetria é um método universal para investigar tais processos. Dispositivos de medição onde uma quantidade exatamente conhecida de calor é introduzida numa amostra, ou abstraída dela, e a mudança de temperatura na amostra é medida (determinação da capacidade de calor, por exemplo), também são conhecidos como calorímetros. Os componentes do sistema de medição são representados esquematicamente na figura 21 (41). Quando o forno é aquecido (de forma linear no tempo), o fluxo de calor principal do forno passa para a amostra simetricamente através de um disco, de condutividade térmica média, que contém sensores de temperatura embutidos. Os recipientes das amostras são posicionados neste disco simétrico ao centro e o mesmo calor flui para a amostra e para a amostra de referência. A diferença de temperatura ∆T é então zero. Se este equilíbrio de estado estacionário é perturbado por uma transição de amostra, é gerado um diferencial que é proporcional à diferença entre as taxas de fluxo de calor para a amostra e para a amostra de referência, que é dado pela equação 1 (41): ∆T = 𝑇𝑆− 𝑇𝑅 Figura 21Componentes de medição do DSC. (62) (1) Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 39 A energia geralmente flui para dentro ou para fora de um material em resposta a uma mudança na temperatura, portanto, o DSC aquece ou arrefece um material de maneira controlada e mede o fluxo de energia para dentro ou para fora do material. Isso revela todas as transições que ocorrem no material ao longo da gama de temperaturas investigada, assim como as temperaturas em que ocorrem, como fusão, recristalização e também temperaturas de transição vítrea (Tg) (42). Um exemplo típico de curva de fluxo de calor é apresentado na Figura 22, onde a fusão de um material é demonstrada em função da temperatura. A área do pico fornece a entalpia da transição, neste caso a entalpia de fusão (42). Neste trabalho, foram realizados ensaios de DSC no equipamento DSC 200 F3 sob fluxo constante de nitrogénio, para analisar a influência da EG, f-EG e (f-EG) + Ag na temperatura de fusão e na cristalização dos compósitos. As amostras foram aquecidas e reaquecidas entre 30 e 190 °C a 5 °C/min. Figura 22Típica curva de fluxo de calor. (28) Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 46 4. Discussão de resultados 4.1. Caracterização estrutural do grafeno 4.1.1. Espectroscopia Raman da grafite e de derivados de grafeno Como já foi referido no capítulo anterior, a espectroscopia Raman tem um papel importante na análise das características estruturais e eletrónicas do grafeno, grafite e seus derivados, fornecendo informações úteis pela análise das três principais bandas. Num estudo anterior, foi possível comprovar que o espectro Raman da grafite e de derivados de grafeno exibem normalmente 3 bandas, bandas D, G e 2D, como está representado na figura 26. Os espectros Raman normalizados obtidos para EG, f-EG e f-EG + Ag estão representados na Figura 26, e os resultados obtidos para a razão de intensidade entre a banda D e a banda G, assim como o número de onda a que se encontra a banda 2D, estão representados na tabela 10. A relação entre as Figura 26Espectro Raman dos compósitos EG, f-EG e f-EG+Ag. (28) Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 47 bandas D e G (ID / IG) mostra que a banda D diminuiu com a funcionalização de 0,15 para 0,10, o que pode indicar uma menor quantidade de defeitos na grafite exfoliada funcionalizada quando comparada com a grafite exfoliada pura. Isso pode estar relacionado com a alta concentração de defeitos na forma pura de EG, causada principalmente pela técnica de produção. Além disso, a grafite original advém de uma mistura de flocos com diferentes níveis de defeitos, e como a funcionalização é uma reação de cicloadição às ligações duplas do grafeno, ocorre preferencialmente nos flocos mais perfeitos, separandoos dos mais defeituosos e levando a uma banda D mais fraca. Tabela 10Resultados dos espectros Raman. (28) Intensidade Raman Shift [cm-1] ID/IG 2D-Band EG 0.15 2710 f-EG 0.10 2706 f-EG+Ag 0.12 2700 Com a adição de nanopartículas de prata, a razão de intensidade ID/IG entre f-EG e f-EG + Ag aumentou ligeiramente de 0,10 para 0,12, podendo estar relacionado com uma redução do caráter sp 2 no plano e aumento na hibridização de 𝑠𝑝3 devido à adição de nanopartículas de Ag nas camadas de grafeno. Relativamente ao terceiro pico, designado como banda 2D, a frequência da mesma é quase o dobro da banda D. Como já relatado em diversos estudos, o pico 2D muda para valores de comprimento de onda mais altos tornando-se mais largo para um número crescente de camadas, enquanto o grafeno puro apresenta um único pico 2D nítido com dupla intensidade em relação ao pico G. Além do pico 2D um pouco mais nítido que foi obtido para f-EG e f-EG + Ag, quando comparado com o EG puro, o deslocamento do comprimento de onda do pico 2D pode ser observado de 2710 𝑐𝑚−1, para EG, para 2706 e 2700 𝑐𝑚−1, para os picos 2D de f-EG e f-EG + Ag, respetivamente. Isso pode resultar da funcionalização seletiva dos flocos EG mais finos e estruturalmente mais perfeitos. Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 48 4.2. Caracterização estrutural dos filamentos compósitos 4.2.1. Análise Termogravimétrica (TGA) A Análise Termogravimétrica foi realizada com o intuito de avaliar a estabilidade térmica dos filamentos e calcular a percentagem do reforço através da massa dos resíduos finais. As Figuras 27 e 28 mostram a perda de massa e a derivada da perda de massa, respetivamente, do PLA e dos filamentos compósitos quando aquecidos até 900 °C, sob atmosfera inerte. Figura 27Resultados de TGA relativos à perda de massa em função da temperatura. Figura 28Resultados de TGA relativos à derivada de perda de massa em função da temperatura. Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 49 A maior perda de massa, ocorre entre os 300 e os 400 ° C, devido à decomposição do material polimérico e dos grupos funcionais de f-EG e f-EG+Ag. Pode também observar-se na figura 27 que todos os filamentos apresentam uma estabilidade térmica semelhante, independentemente da presença de grafite funcionalizada. Os valores da temperatura à qual o PLA e os compósitos começam a degradar estão apresentadas na tabela 11, sendo aproximadamente 300 °C para todas as composições. Assim, todos os materiais estudados são termicamente estáveis à temperatura de interesse para a aplicação pretendida, isto é, a 37°C. Um comportamento semelhante foi descrito por Novais et al. (34) para compósitos com PLA. Tabela 11Temperaturas iniciais de degradação. A grafite adicionada ao PLA durante a extrusão do filamento foi adicionada manualmente, portanto, de maneira a averiguar se a percentagem do reforço nos filamentos foi a pretendida recorreuse ao TGA para analisar os resíduos e desta maneira calcular o reforço. Estes dados estão apresentados na Tabela 12. Tabela 12Percentagem de reforço presentes nos compósitos. Filamento Reforço (wt. %) PLA+ 0,25% 0.2±0.25 PLA+ 0,5% EG 0.39±0.31 PLA+ 1% 1.14±1.3 PLA+ 2% 2.34±1.74 PLA+ 0,25% 0.48±0.74 PLA+ 0,5% f-EG 0.36±0.58 PLA+ 1% 1.15±0.26 PLA+ 2% 2.18±1.72 PLA+ 0,25% 0.21±0.85 PLA+ 0,5% f-EG+Ag 0.53±0.44 PLA+ 1% 1.06±1.10 PLA+ 2% 1.02±0.22 Material PLA 0.25EG 0.5EG 1EG 2EG 0.25fEG 0.5fEG 1f-EG 2f-EG 0.25fEG+Ag 0.5fEG+Ag 1fEG+Ag 2fEG+Ag T(C°) 301.6 318.3 294.5 307.1 301.1 310.4 309.8 307.1 311.6 322.5 326.5 309.4 303.6 Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 50 Os resultados mostram que apesar de alguns erros, que podem estar associados à dispersão não uniforme devido à alimentação não continua do reforço nos filamentos, assim como a presença de alguns aglomerados, praticamente todos os filamentos foram produzidos com a quantidade prevista de reforço. 4.2.2. Espectroscopia Raman 4.2.2.1. Espectroscopia Raman dos filamentos de compósitos A espectroscopia Raman foi executada nos filamentos de maneira a examinar e analisar a presença de EG no compósito. Na Figura 29 estão presentes os espectros Raman de todos os filamentos compósitos analisados. Como o PLA não apresenta dispersão na região da banda G, o comprimento de onda correspondente pode ser usado para confirmar a presença de EG. O espectro Raman do filamento relativo ao PLA (linha vermelha) também apresenta um pico em torno dos 2740 𝑐𝑚−1. Todos os filamentos apresentam a banda associada ao PLA, porém é mais larga devido à contribuição da banda 2D, mais próxima de 2700 𝑐𝑚−1, do material EG. A banda G, caraterística da EG, está presente em todos os compósitos, e a intensidade aumenta com a concentração de EG no compósito. Figura 29Espectros Raman dos filamentos compósitos. Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 51 4.2.3. Microscopia Eletrónica de Varrimento (SEM) A morfologia da secção transversal de cada um dos filamentos foi analisada por microscopia eletrónica de varrimento (SEM). Os resultados obtidos para cada uma das composições são apresentados nas tabelas 13-19. Tabela 13Imagens SEM do filamento de PLA. PLA 500 x 15 000 x 50 000 x 0 wt % Tabela 14Imagens SEM dos filamentos de compósitos: PLA+0.25EG e PLA+0.5EG. PLA + EG 500 x 15 000 x 50 000 x 0.25 wt % Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 52 0,5 wt % Tabela 15Imagens SEM dos filamentos de compósitos: PLA+1EG e PLA+2EG. PLA + EG 500 x 15 000 x 50 000 x 1 wt % 2 wt % Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 53 Tabela 16Imagens SEM dos filamentos de compósitos: PLA+0.25f-EG e PLA+0.5f-EG. PLA + f-EG 500 x 15 000 x 50 000 x 0.25 wt % 0.5 wt % Tabela 17Imagens SEM dos filamentos de compósitos: PLA+1f-EG e PLA+2f-EG. PLA + f-EG 500 x 15 000 x 50 000 x 1 wt % 2 wt % Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 54 Tabela 18Imagens SEM dos filamentos de compósitos: PLA+0.25f-EG+Ag e PLA+0.5f-EG+Ag. PLA + f-EG + Ag 500 x 15 000 x 50 000 x 0.25 wt % 0.5 wt % Tabela 19Imagens SEM dos filamentos de compósitos: PLA+1f-EG+Ag e PLA+2f-EG+Ag. PLA + f-EG+Ag 500 x 15 000 x 50 000 x 1 wt % 2 wt % Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 55 Ao analisar as imagens obtidas, é possível observar que o aumento da quantidade de reforço no filamento torna a sua superfície mais rugosa, como seria de prever. É ainda possível observar, uma boa interface entre a matriz polimérica e o reforço para todas as composições, podendo concluir-se também que a interface é melhorada após a funcionalização. As amostras também foram analisadas por espectroscopia de raios X por energia dispersiva (EDS) para as composições decoradas com nanopartículas de prata, para confirmar a presença de prata. As Tabela 20 e 21 apresenta imagens dos filamentos com 0,25%, 0,5%, 1% e 2%, onde as zonas Z1 e Z2 marcadas foram analisadas por EDS. É possível observar através destas imagens que a matriz polimérica foi degradada pelo feixe de eletrões, necessário para visualizar as partículas de prata mais brilhantes na imagem. O sinal C aparece devido à presença da grafite e do polímero, o sinal O aparece devido à presença de oxigénio, o sinal Au devido à presença de ouro (recobrimento da fibra para observação no SEM) e o sinal Ag confirma a presença de prata. Tabela 20Imagens SEM e análise EDS do PLA+ 0,25% e 0,5% (f-EG+Ag). PLA+ 0,25% (f-EG+Ag) PLA+ 0,5% (f-EG+Ag) Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 62 onde ∆H𝑓 representa a entalpia de fusão medido para a amostra, ∆Hc é entalpia de cristalização, ∆H𝑓0 é a entalpia de fusão teórica tabelado para o PLA (93J/g) e ∅ é a fração em massa da grafite no compósito. Estes resultados são apresentados nas tabelas 25 e 26. 1. 1ºAquecimento Tabela 25Propriedades térmicas do PLA e dos filamentos compósitos relativos ao 1º aquecimento. 2. 2ºAquecimento Tabela 26Propriedades térmicas do PLA e dos filamentos compósitos relativos ao 2º aquecimento. Amostra Tg (ºC) Tcc (ºC) Tm (ºC) ∆Hc (J/g) ∆Hm (J/g) Xc (%) ∆Cp (J/(g*K)) PLA 59,4 103,6 159,2 26,8 29,3 2,63 0,36 PLA+0.25% 59,8 102,8 158,8 28,3 29,7 1,46 0,37 PLA+0.5% EG 59,4 104,2 158,8 27,0 28,1 1,20 0,38 PLA+1% 61,9 111,3 160,7 30,8 31,4 0,62 0,50 PLA+2% 55,7 107,2 142,7 30,4 30,6 0,24 0,26 PLA+0.25% 59,5 103,4 158,6 27,6 28,6 1,08 0,39 PLA+0.5% f-EG 59,2 105,3 159,2 30,4 31,0 0,72 0,43 PLA+1% 56,3 110,7 161,0 28,3 28,7 0,41 0,25 PLA+2% 57,0 107,8 161,1 28,8 29,0 0,15 0,20 PLA+0.25% 59,8 103,3 159,2 25,5 26,9 1,46 0,34 PLA+0.5% f-EG+Ag 59,7 104,1 159,6 25,4 26,8 1,52 0,41 PLA+1% 54,6 112,1 161,0 29,1 29,5 0,47 0,31 PLA+2% 55,2 107,5 160,8 26,5 26,8 0,3 0,54 Amostra Tg (ºC) Tcc (ºC) Tm (ºC) ∆Hc (J/g) ∆Hm (J/g) % Xc ∆Cp (J/(g*K)) PLA 59,4 103,6 159,1 26,8 29,3 2,63 0,44 PLA+0.25% 58,8 112,1 159,0 30,7 31,7 1,09 0,31 PLA+0.5% EG 58,4 112,8 159,1 30,7 31,4 0,78 0,36 PLA+1% 58,7 112,3 160,6 29,3 31,6 2,60 0,46 PLA+2% 52,0 116,7 160,1 18,3 31,6 14,6 0,75 PLA+0.25% 58,9 116,8 157,0 28,7 31,0 2,43 0,25 PLA+0.5% f-EG 59,1 118,2 155,6 32,6 33,6 1,10 0,44 PLA+1% 59,1 114,1 160,8 26,2 28,6 2,62 0,38 PLA+2% 58,8 111,0 160,6 28,1 28,9 0,91 0,42 PLA+0.25% 60,1 118,2 156,2 30,6 32,1 1,68 0,46 PLA+0.5% f-EG+Ag 59,6 118,8 154,2 26,7 30,5 4,11 0,38 PLA+1% 60,4 116,2 160,8 23,4 30,0 7,17 1,03 PLA+2% 58,8 112,8 160,8 26,3 26,5 0,26 0,40 Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 63 Os resultados mostram que o grau de cristalinidade (Xc) no 1º aquecimento diminui com a adição do reforço na matriz poliméricas, podendo estes resultados estar inerentes à forma como o material foi processado e à sua história térmica. A presença/adição de reforço no 1ºaquecimento interfere com o processo de cristalização do PLA, não promovendo estruturas cristalinas. Relativamente ao 2º aquecimento, após a história térmica do material ser apagada, algumas percentagens de reforço promoveram a formação de estruturas cristalinas. De uma forma geral, para ambos os aquecimentos, a adição do reforço, principalmente nas grafites funcionalizadas, retarda o início da cristalização. 4.2.6. Análise Mecânica Dinâmica (DMA) Foram realizados testes de DMA, para avaliar os efeitos da incorporação de grafeno funcionalizado nas propriedades mecânicas e viscoelásticas no PLA. A Figura 33 apresenta a variação do módulo de armazenamento E’ ao longo da temperatura. É possivel observar que para a maior parte dos filamentos compósitos, o módulo aumenta com o aumento da incorporação de grafeno no PLA, resultando num aumento da rigidez da matriz polimérica, o que era de esperar pois o grafeno é um material rigido. Foram obtidos em estudos anteriores resultados idênticos nas propridades mecânicas após a incorporação de grafeno no PLA (37) (51). Figura 33Módulo de armazenamento do PLA e dos filamentos compósitos em função da temperatura, na região da transição vítrea. Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 64 O fator de amortecimento mecânico, tan δ, é a razão entre a energia dissipada e a energia armazenada de um material. É um fator que mede a energia perdida, fornecendo informações sobre as propriedades de amortecimento do material. Na Figura 34 é apresentada a variação do tan δ com a temperatura. De uma maneira geral, os filamentos compósitos com reforço apresentam valores de tan δ mais elevados do que o filamento de PLA na região da transição vítrea, indicando que os compósitos reforçados com grafeno possuem uma maior capacidade de dissipar energia, aumentando as suas capacidades de amortecimento mecânico (37) (51). Relativamente às amostras 2% f-EG e 2% f-EG+Ag, as curvas das mesmas apresentam uma grande discrepância em comparação às restantes, devido a possíveis erros experimentais ou à reduzida aquisição de dados aquando a realização dos ensaios experimentais. Nas figuras 35 e 36 estão representados os resultados de DMA para o PLA e para os filamentos compósitos a 37°C, para analisar as propriedades mecânicas e viscoelásticas de cada amostra à temperatura normal do corpo humano. Figura 34Fator de amortecimento mecânico do PLA e dos filamentos compósitos em função da temperatura, na região da transição vítrea. Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 65 Figura 35Módulo de armazenamento do PLA e dos filamentos compósitos a 37°C. De um modo geral, verifica-se uma tendência para um aumento do módulo de armazenamento a 37°C, com a incorporação do reforço na matriz polimérica, conferindo uma rigidez superior ao PLA. Figura 36Fator de dissipação de energia do PLA e dos filamentos compósitos a 37°C. Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 66 Relativamente ao fator de dissipação, é possível verificar que todas as amostras dissipam energia, como seria de prever, uma vez que são materiais viscoelásticos, apresentando todas valores de Tanδ entre 0,02 e 0,08. Segundo a literatura, o LCA apresenta um valor de módulo de young que varia de 100 a 300 MPa. (52) (53) (13) Assim, estes resultados indicaram que o PLA reforçado com grafeno é um material promissor, demonstrando valores de rigidez adequados para a aplicação pretendida e os valores de amortecimento mecânico são valores típicos apresentados por tecidos humanos, que também apresentam um comportamento viscoelástico. (54) 4.2.7. Resistividade Elétrica A aplicação de campos elétricos é regularmente utilizada para fins ortopédicos, e tem vindo a mostrar-se uma técnica muito promissora, aumentando a capacidade de regeneração de um ligamento in vivo. Num estudo, aplicaram campos elétricos de corrente continua no ligamento cruzado anterior (LCA), comprovando que estes podem ser utilizados para melhorar a cicatrização do ligamento (28) (27). A Tabela 27 mostra a variação da resistividade elétrica medida nos filamentos em função da quantidade de EG adicionada. É possível observar que o maior valor de resistividade obtido foi o do filamento de PLA+0.25EG, com 6,98x109Ω.cm, e o menor valor de resistividade foi o do filamento de PLA+2 EG, com 5,48x108Ω.cm. Assim, a adição do reforço não altera significativamente a resistividade elétrica do filamento pois as concentrações de reforço utilizadas na realização deste trabalho são reduzidas. De qualquer modo, a presença deste reforço, reduz a resistividade elétrica, em duas ou três ordens de magnitude, o que é um indicador promissor para a produção de filamentos compósitos condutores com reforço à base do grafeno, conforme foi relatado em diversos estudos (24) (55). Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 67 Tabela 27Resistividade elétrica do PLA e dos filamentos compósitos. Num estudo realizado recentemente, concluíram que a resistividade elétrica do PLA sem a presença de grafite é da ordem de grandeza dos 1012Ω.m. Ficou claramente demonstrado neste estudo que, com a adição do reforço ao compósito, a resistividade elétrica diminui gradualmente, levando à formação de caminhos condutores no compósito, interconectando as partículas de grafite, até atingir valores mais baixos na ordem dos 108Ω.cm (56). 4.3. Produção dos Scaffolds Com recurso a um kumihimo, foram produzidos com sucesso scaffolds para as composições previamente selecionadas, através da técnica de entrançamento de fibra. De todas as composições, foi escolhido o PLA sem qualquer tipo de reforço e duas amostras com incorporação de reforço, o PLA + 0,5% f-EG+Ag e o PLA + 2% f-EG+Ag, para termos de comparação. Na tabela 28, estão apresentados os scaffolds produzidos para o PLA e para os compósitos 0,5% e 2 % f-EG+Ag, observados com recurso a uma lupa estereoscópica Leica. Amostra Resistividade Elétrica (Ω.cm) PLA+0.25% EG 6,98E+09 ± 2,97E+09 PLA+0.5% EG 1,82E+09 ± 6,09E+08 PLA+1% EG 9,41E+08 ± 5,02E+07 PLA+ 2% EG 5,48E+08 ± 1,23E+08 PLA+0.25% f-EG 1,12E+09 ± 2,43E+08 PLA+0.5% f-EG 8,10E+08 ± 4,24E+06 PLA+1% f-EG 7,49E+08 ± 4,93E+06 PLA+2% f-EG 6,44E+08 ± 3,04E+07 PLA +0.25% (f-EG+Ag) 3,44E+09 ± 3,66E+09 PLA+0.5% (f-EG+Ag) 4,36E+09 ± 5,19E+09 PLA+1% (f-EG+Ag) 6,96E+08 ± 3,83E+07 PLA+2% (f-EG+Ag) 5,96E+08 ± 1,14E+08 Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 68 Tabela 28Scaffolds produzidos para o PLA e para os filamentos compósitos de 0.5% e 2% f-EG+Ag. 1,6x 4x 6x PLA PLA+0.5 f-EG+Ag PLA+2 f-EG+Ag É possível observar através da análise das imagens obtidas, que todos os scaffolds produzidos apresentam uma estrutura bastante porosa, com poros interconectados, o que é extremamente importante para possibilitar a regeneração do tecido humano com sucesso. (57) (19) 4.4. Caracterização Estrutural dos Scaffolds 4.4.1. Análise Mecânica Dinâmica (DMA) De maneira a avaliar as propriedades mecânicas e viscoelásticas dos scaffolds fibrosos, foram realizados ensaios de DMA a 37°C e a uma frequência crescente de 0,1 Hz a 1 Hz, para simular as frequências fisiológicas do corpo humano. Os resultados obtidos estão apresentados na tabela 29. Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 69 Tabela 29Resultados DMA dos scaffolds fibrosos. Compressão (1Hz) Amostra Comprimento (mm) Diâmetro (mm) E’ (MPa) Tan δ PLA 8,82 7,19 0,682±0,026 0,201±0,015 PLA + 0,5% f-EG+Ag 8,63 7,25 1,420±0,422 0,257±0,018 PLA + 2% 8,9 7,45 0,987±0,068 0,200±0,034 É possível observar que o módulo de armazenamento (E’) tende a aumentar com a incorporação do grafeno funcionalizado na matriz polimérica, isto é, a rigidez dos scaffolds compósitos parece ser superior. O fator de amortecimento mecânico (tan δ) a 37ºC é semelhante para todas as amostras e diferente de 0, o que evidencia a capacidade de dissipação de energia dos scaffolds. Em estudos realizados por outros autores, foram obtidos valores de módulos de armazenamento (E’) e de fator de dissipação (Tanδ) semelhantes, que variavam com a porosidade do scaffold fibroso em causa. (58) (59) Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 70 Capítulo 5 Conclusões Scaffolds de Nanocompósitos de Grafeno para Regeneração do Ligamento Cruzado Anterior UNIVERSIDADE DO MINHO 71 5. Conclusões Com a realização deste trabalho, procurou-se desenvolver filamentos compósitos com boas propriedades térmicas e mecânicas de maneira a produzir scaffolds com recurso a técnicas têxteis de entrançamento de fibra. De maneira a melhorar as propriedades mencionadas, procedeu-se previamente à funcionalização da grafite exfoliada e à ancoragem de nanopartículas de prata, sendo ambos os processos realizados com sucesso. Posteriormente, procedeu-se à extrusão do PLA e dos filamentos compósitos com cerca de 0,25%, 0,5%, 1% e 2% de cada uma das grafites exfoliadas, sendo testadas de seguida quanto à sua morfologia, propriedades térmicas, mecânicas e elétricas. Relativamente à morfologia dos filamentos, foi possível observar um ligeiro aumento de rugosidade com a adição do reforço. Para além disso, é possível observar uma boa adesão do reforço à matriz polimérica. Em relação às propriedades térmicas dos filamentos, é possível concluir que a adição do reforço à matriz polimérica em nada afeta a sua estabilidade térmica, sendo todos os filamentos produzidos adequados para a aplicação pretendida. No que diz respeito às propriedades mecânicas, a adição do reforço à matriz aumentou o módulo de armazenamento e o fator de dissipação de energia (Tan δ), o que era de prever, uma vez que a funcionalização da grafite exfoliada melhorou a interface matriz-reforço. No que se refere aos testes elétricos, pode-se concluir que apesar de a adição do reforço não alterar significativamente a resistividade elétrica dos filamentos, uma vez que as suas concentrações são reduzidas, a sua presença diminui de facto a mesma, sendo um indicador promissor para a aplicação pretendida. De seguida, procedeu-se à produção e caracterização mecânica de scaffolds com o PLA e os filamentos compósitos produzidos e caracterizados anteriormente. Estes foram produzidos manualmente, com a ajuda de um dispositivo kumihimo, com recurso a técnicas têxteis de entrançamento de fibra. Foram produzidos três scaffolds para cada amostra a testar, cada um com oito feixes e cada feixe com oito filamentos, sendo testados de seguida quanto às suas propriedades mecânicas. Relativamente às propriedades mecânicas dos scaffolds, o módulo de armazenamento e o fator dissipativo aumentam com a adição do reforço, o que era de prever uma vez que o mesmo aconteceu na caracterização dos filamentos, podendo-se concluir que a adição da grafite exfoliada funcionalizada melhora as propriedades mecânicas de toda a estrutura fibrosa.