Desarrollo de herramientas de tipificación y diagnóstico aplicadas al estudio de Mycoplasma hyorhinis y evaluación de un modelo experimental de neumonía en lechones

                        Agradecimientos            Agradecimientos  ComodiríaIsmaelSerrano,hoyessiempretodavía,todalavidaesahora,porqueayerno lohicimos,porquemañanaestarde…yahora,despuésdellargocaminorecorridohastapoder llegaraestepunto,haymuchaspersonasquedealgunaformauotrahanjugadounpapel importanteeneldesarrollodeestatesisyqueporlotantomegustaríaagradecerespecialmente: Amidirector,elDr.JoséB.PovedaGuerrero,porconcedermedesdeelprimermomentoy conelentusiasmoquelecaracterizalaoportunidaddeempezar,desarrollarycontinuarmi carrerainvestigadoraencienciasveterinarias. Amicodirectora,laDra.AnaSofíaRamírezCorbera,queapesardetodaslasidasy venidas,dificultadesymomentosdifícilesqueeldesarrollodeestatesishapresentadosiempre mehademostradosuapoyo,optimismoyamistad,actuandocomounfaro,unpuntode referenciaconstantedurantetodoelcaminosinelqueprobablementenohubierapodidollegar abuenpuerto. Iwouldliketoexpressmygratitudetomyco‐supervisorDr.RobinA.J.Nicholasforgiving metheopportunitytodevelopmycareerintheUK,“adopting”mefromthefirstmomentI arrivedandformakingmefeellikehomeduringmyBritishexperience.Hispersonalityand positiveoutlookonscienceandlifewillalwaysbelinkedtohissuccessandIwillalwaysfeel privilegedfortheknowledgeandexperienceacquiredduringthetimespentworkingwithhim. SpecialthankstoDr.RogerAylingforhisconstantunderstanding,support, encouragementandadviceduringalltheseyearswhichfacilitatedthecompletionofthisthesis.           Agradecimientos  IwouldalsoliketothankColinChurchward,“Churchy”,forguidingmeduringmyfirst stepsinthelabatAHVLA,MiroslavHlúšekforallhishelpandtoallthecolleaguesinthe Mycoplasmagroupforalltheirassistanceprovidedalongtheway. APfizerporproporcionarelsoporteeconómicoparagranpartedeltrabajoexperimental realizadoenestatesis. AlaDra.RosarioGonçalves,“Rosarinho”,mimadreportuguesa,porsuamistadyapoyo queempezóenesosdurosprimerosmesesquepasamosjuntosaliniciodemiaventurainglesay quehemosseguidomanteniendohastalafecha. AlosDres.PatriciaAssunçãoyNunoAntunes,porsuayudadurantemisprimerospasos dentrodellaboratorioenGranCanaria,alDr.CarlosPovedaporlostiemposcompartidosenel laboratorioysuayudaenladistanciayatodoslosmiembrosdellaboratoriodeepidemiología quedealgunaformameayudaronduranteeliniciodeestatesis. AmiamigoelDr.AlejandroSuárez,portodosesosbuenosratos,recuerdos,experienciasy risasinolvidablesquedurantetodosestosañosmehanservidoparasobrellevarmuchos momentosdurosyaltibajosdentroyfueradellaboratorio. AAlessandraporaguantarmeyentendermedurantelaúltimafasedeestatesis,porque siemprehasidocapazdedarlotodosinimportarlenadaparaayudarmeyparaqueestatesis llegaraasufinyporcontagiarmesiempredesupositividad,alegríayenergíaúnica.           Agradecimientos  Yporúltimoamispadresporsuconstanteapoyoyamor,porayudarmeaserquiensoyy porcreerenmíentodomomento.Amishermanosyatodamifamilia,porqueapesardela distanciasiempremehanhechosentirsupresenciayamor,sinelquesindudanadadeloquehe conseguidohastalafechahubierasidoposible.                                   Índice              Índice VIII 4.1.INTRODUCTION......................................................................................................................195 4.2.MATERIALANDMETHODS.....................................................................................................197 4.2.1.MycoplasmahyorhinisindirectELISA.................................................................................197 4.2.1.1.Generalchemicals,reagentsandequipment..............................................................197 4.2.1.2.Antigenpreparation.....................................................................................................199 4.2.1.3.Antigenchequerboardandconjugateselection..........................................................200 4.2.1.4.Testprocedure.............................................................................................................202 4.2.1.5.Sampleselection..........................................................................................................203 4.2.1.6.EstimationofthepredictiveabilityoftheELISAtest..................................................204 4.2.1.7.Kappa‐statisticmeasureofinter‐rateragreement(strengthofagreement)..............206 4.2.2.MycoplasmahyorhinisqPCR...............................................................................................207 4.2.2.1.Primerdesign...............................................................................................................207 4.2.2.2.Primerconcentrationevaluation.................................................................................208 4.2.2.3.Limitofdetection,efficiencyanddynamicrangeestimation.....................................210 4.2.2.3.1.Plasmidcontrolpreparation.................................................................................210 4.2.2.3.2.Limitofdetection,efficiencyanddynamicrangeestimationreactions...............216 4.2.2.4.EvaluationofclinicalandresearchDNAsamples........................................................217 4.3.RESULTS.................................................................................................................................221 4.3.1.ELISAdevelopment.............................................................................................................221 4.3.1.1.Antigenandconjugateselection.................................................................................221 4.3.1.2.EstimationofthepredictiveabilityoftheELISAtest..................................................222 4.3.1.3.Crossreactivity............................................................................................................224 4.3.1.4.Kappa‐statisticmeasureofinter‐rateragreement(strengthofagreement)..............224 4.3.2.MycoplasmahyorhinisqPCRdevelopment........................................................................226 4.3.2.1.Primerdesign...............................................................................................................226 4.3.2.2.Primerconcentrationevaluation.................................................................................227 4.3.2.3.Limitofdetection,efficiencyanddynamicrangeestimation.....................................227           Índice  IX 4.3.2.4.EvaluationofclinicalandresearchDNAsamples........................................................229 4.4.DISCUSSION............................................................................................................................229 CHAPTER4–APPENDICES............................................................................................................237 APPENDIX4.1.CLONINGREAGENTS.............................................................................................239 APPENDIX4.2.QPCRRESULTS......................................................................................................242 5.CONCLUSIONES.........................................................................................................................251 6.RESUMEN..................................................................................................................................259 7.SUMMARY.................................................................................................................................265 REFERENCIASBIBLIOGRÁFICAS.....................................................................................................269                                          Índicedetablasyfiguras           Índicedetablas  XIII Índicedetablas Tabla1.1.PrincipalescaracterísticasdelaclaseMollicutes……………………………….Pág.10 Tabla1.2.Principalesmicoplasmasporcinos……………………………………………………..Pág.18 Tabla1.3.Sistemadepuntuacióndelesionesmacroscópicaspulmonaresen cerdos……………………………………………………………………………………………….Pág.30 Tabla1.4.Principalestécnicasdetipificaciónmolecularempleadasen microbiología…………………………………………………………………………………….Pág.59 Tabla1.5.UsodePFGEparalatipificacióndelasprincipalesespecies patógenasdemicoplasmas……………………………………………………………….Pág.66 Tabla2.1.Volumendereactivosusadosparalapreparacióndegelesde acrilamida………………………………………………………………………………………….Pág.77 Tabla2.2.VolúmenesdereactivosempleadosporreaccióndeRAPD……………….Pág.81 Tabla2.3.CaracterísticasdelosoligonucleótidosseleccionadosparaelanálisisPág.92           Índicedetablas XIV deVNTR……………………………………………………………………………………………. Tabla2.4.VolúmenesdereactivosempleadosporreaccióndeVNTR………….......Pág.93 Tabla2.5.ClasificacióndelosaisladosanalizadosporlatécnicadeWestern blotbasadaenladiferenciasobservadasenlaregiónvariablede40 a46kDa…………………………………………………………………………………………….Pág.98 Tabla2.6.DistribucióndeaisladosportipodeRAPD…………………………………………Pág.103 Tabla2.7.Distribucióndepulsotipospororigengeográfico………………………………Pág.108 Tabla2.8.DistribucióndeaisladosporgruposdeSouthernblot.Elvalorentre paréntesisindicaelnúmerodecepasporeltotaldelrespectivo origen………………………………………………………………………………………………..Pág.113 Tabla2.9.DistribucióndeVTspororigen…………………………………………………………..Pág.116 Tabla2.10.IDSeICdecadaunadelastécnicasdetipificaciónevaluadas…………..Pág.118 Tabla2.11.AnálisisdelosnivelesdesignificaciónentreIDS(IC)delasdiferentesPág.118           Índicedetablas  XV técnicasanalizadas Tabla2.12.Resultadosdelanálisisdeasociaciónentretécnicasdetipificación basadoenelcoeficienteajustadodeWallace……………………………………Pág.119 Tabla3.1.Puntuacióndelesionespulmonaresmacroscópicasbasadaenel sistemadevaloracióndelesionespulmonarescompatiblescon neumoníaenzoóticadescritoporGoodwinyWhittlestone(1973)…...Pág.163 Tabla3.2.Resultadosdelavaloraciónsemicuantitativadelesionespulmonares enpreparacioneshistológicas(Livingstonetal., 1972)………………………………………………………………………………………………...Pág.164 Tabla3.3.Resultadosdelanálisisdehisoposnasalesytejidopulmonarpor PCR/DGGE.aPositivoporPCR/DGGEfrenteaM.hyorhinisbPositivo porPCR/DGGEfrenteaM.hyopneumoniae………………………………………Pág.167 Tabla3.4.ResultadosdelELISAdebloqueoIDEIA™Mycoplasma hyopneumoniae.Lasmuestrassospechosasseencuentran resaltadasenamarillo.Lasmuestraspositivasseencuentran resaltadasenrojo……………………………………………………………………………..Pág.171           Índicedetablas XVI Table4.1.Platelayout–antigendilutions………………………………………………….........Pág.200 Table4.2.Platelayout–positiveandnegativeserumdistribution…………………….Pág.200 Table4.3.Platelayout–distributionsofdifferentconjugatedilutions………………Pág.201 Table4.4.InterpretationofKappa‐statisticmeasureofinter‐rateragreement values………………………………………………………………………………………………..Pág.207 Table4.5.M.hyorhinisqPCRprimercharacteristics………………………………………….Pág.208 Table4.6.FieldsamplesanalysedbyM.hyorhinisrpoBqPCR……………………………Pág.218 Table4.7.PCR/DGGEresultsfromnasalswabsandlungtissueobtainedafter experimentalinfection.aPositivebyPCR/DGGEagainstM.hyorhinis bPositivebyPCR/DGGEagainstM.hyopneumoniae………………………….Pág.219 Table4.8.ResearchsamplesanalysedbyM.hyorhinisrpoBqPCR…………………….Pág.220 Table4.9.CommonMycoplasmaspeciesreferencestrainsandporcine bacterialisolatesusedinM.hyorhinisqPCRspecificitytesting.a Pág.221           Índicedetablas  XVII NCTCreferencestrain,bCourtesyofJonRogers(AHVLABurySt. Edmunds,UK) Table4.10.Positivecut‐offpointsandrelativespecificityandsensitivity…………….Pág.223 Table4.11.ContingencytablecomparingWesternBlottingandiELISApositive andnegativeresults…………………………………………………………………………Pág.223 Table4.12.Agreementcalculationbetweentwodifferentoperators………………….Pág.224 Table4.13.AgreementcalculationbetweeniELISArepeats…………………………………Pág.225 Table4.14.Antigenbatchvariationagreementcalculationbetweentworepeats ‐samplesetB(samples1to90)………………………………………..................Pág.225 Table4.15.Antigenbatchvariationagreementcalculationbetweentworepeats ‐samplesetB(samples91to180)…………………………………………………….Pág.225                             Abreviaturas/Abbreviations             Abreviaturas/Abbreviations  XXIII Abreviaturas  Abbreviations  AFLP Análisisdepolimorfismosenla longituddefragmentosamplificados deADN ‐ Amplifiedfragmentlength polymorphism ADNÁcidodesoxirribonuclelcoDNADesoxyribonucleicacid ARNÁcidoribonucleicoRNARibonucleicacid ARNr: ÁcidoribonucleicoribosomalrRNARibosomalribonucleicacid CqCiclodecuantificación‐ Quantificationcycle CRPComplejorespiratorioporcinoPRDCPorcinerespiratorydisease complex DaDalton‐ ‐ dNTPsDesoxirribonucleótidostrifosfato‐ Deoxyribonucleotidetriphosphate DPIDíaspostinfección‐ Dayspostinfection DTMDestetetempranomedicado MEWMedicatedEarlyWeaning gGramo‐ Gram hHoras‐ Hours HCIÁcidoclorhídrico‐ Hydrochloricacid HISHibridacioninsituISHInsituhybridization IHQInmunohistoquimicaIHCImmunohistochemistry IPTGIsopropil‐β‐D‐1‐tiogalactopiranósido‐ Isopropylβ‐D‐1‐ thiogalactopyranoside kbKilobase‐ ‐ KClCloruropotásico‐ Potassiumchloride kDaKilodalton‐ ‐ lLitro‐ Litre LBLuria‐Bertani ‐ ‐ MMolar‐ ‐ mMinutos‐ Minutes mAMiliamperio‐ Milliamps mAbAnticuerpomonoclonal‐ Monoclonalantibody mlMililitro‐ Millilitre MLSTTipificaciónmultilocusdesecuencias‐ Multilocussequencetyping mmMilímetro‐ Millimetre mMMilimolar‐ Millimolar MSTÁrbolrecubridormínimo‐ Minimumspanningtree NaClClorurosódico‐ Sodiumchloride NaOHHidróxidosódico‐ Sodiumhydroxide NCTCNationalCollectionofTypeCultures‐ ‐ NEPNeumoníaEnzoóticaPorcinaPENPorcineenzooticpneumonia ngNanogramo‐ Nanogram nmNanómetro‐ Nanometre nMNanomolar‐ ‐           Abreviaturas/Abbreviations  XXIV pbParesdebasesbpBasepairs PBSBúferfosfatosalino ‐ Phosphatebuffersaline PCRReacciónencadenadelapolimerasa‐ Polymerasechainreaction PCR‐ RFLP Análisisdepolimorfismosenla longituddelosfragmentosde restriccióntrasPCR ‐ polimerasechainreaction‐ restrictionfragmentlength polymorphism PFGEElectroforesisengeldecampo pulsado‐ Pulsedfieldgelelectrophoresis PIPostinfección‐ Postinfection PRRSvVirusdelsíndromereproductivoy respiratorioporcino‐ Porcinereproductiveand respiratorysyndromevirus qPCRPCRcuantitativaatiemporeal‐ QuantitativerealtimePCR RAPDAmplificaciónaleatoriadeADN polimórfico‐ Randomamplifiedpolymorphic DNA rpmRevolucionesporminuto‐ Revolutionsperminute sSegundos‐ Seconds SBSouthernblotting‐ ‐ SDS‐ PAGE ElectroforesisenGelde PoliacrilamidaconDodecilSulfatode Sodio ‐ Sodiumdodecylsulfate polyacrylamidegelelectrophoresis SIVVirusdelainfluenzaporcina‐ Swineinfluenzavirus SOCCaldosúperóptimoconrepresión catabólica ‐ Superoptimalbrothwith cataboliterepression TBE Tris‐borato‐EDTA‐ Tris‐borate‐EDTA TD‐TFSistematododentro‐todofueraAIAOAll‐in,all‐outsystem UUnidades‐ Units UCCUnidadesCambiadorasdeColorCCUColor‐changingunits µgMicrogramo‐ Microgram µlMicrolitro‐ microlitre µmMicrómetro‐ Micrometre VVoltios‐ Volts VNTRAnálisisderepeticionesentándem denúmerovariable‐ Variablenumbertandemrepeat VTTipodeVNTR‐ VNTRtype WBWesternblotting‐ ‐  Legend:‐NovariationinEnglishlanguage                          Capítulo1 Introducciónyrevisiónbibliográfica             CapítuloI‐Introducción  3 1.1. Introducción Laneumoníaenzoóticaporcina(NEP)destacacomounadelasprincipalesenfermedades queafectanalganadoporcino.Presentaunadistribuciónglobal,evidenciandounaalta morbilidadyunalimitadamortalidadasociadaprincipalmenteacombinacionescondiferentes patógenosporcinosinvolucradosgeneralmenteenelcomplejorespiratorioporcino(CRP). Debidoaestascaracterísticas,elprincipalinterésporestaenfermedadresideenlagran repercusióneconómicaenlaindustriaporcina,causandopérdidasmillonariasaproductoresde estesector.Mycoplasma(M.)hyopneumoniaehasidoconsideradocomoelprincipalagente etiológicodeestaenfermedad,aunquemúltiplesevidencias,tantodesdeelpuntodevista epidemiológicocomopatológico,hacenpensarqueM.hyorhinisjuegaunpapelsignificativoenla neumoníaenzoóticaporcinayenelCRP. M.hyorhinisesunmicroorganismocomensaldelaparatorespiratoriosuperiordelcerdo normalmenteasociadoconcuadrosdeartritis,otitis,pericarditisypoliserositis(Ross,1999). Ademásesconsideradocomounpatógenosecundarioencasosdeneumoníaencerdossinque supapelcomoagenteetiológicoprimarioencuadrosrespiratoriosestécompletamenteaceptado enlacomunidadveterinaria.Desdeelpuntodevistaexperimentaldiferentesestudioshan demostradolacapacidaddeM.hyorhinisparaproducircuadrosdeenfermedadrespiratoriaen lechones(Goišetal.,1968a;Linetal.,2006).Estosestudioshansidocapacesdeevidenciarcómo existeunaaltavariabilidadenlacapacidaddediferentescepasdecampoparaproducir enfermedadclínicaylesionesmicroymacroscópicas,loquepuedeexplicarcómoelpapelde           CapítuloI‐Introducción  4 estemicroorganismomiembrodelaflorabacteriananormalpresenteenelepiteliorespiratorio porcinopuedevariardesdecomensalhastaagenteetiológicoprimario. Apesardeestosdatosexperimentales,nohasidohastahacepoco,cuandoatravésde análisisepidemiológicosbasadosenestudioscomparativosdeanimalesclínicamenteenfermos concuadrosrespiratoriosfrenteaanimalessanos(Palzeretal.,2008)yenelanálisisdemuestras delaparatorespiratorioobtenidasenmatadero(Hansenetal.,2010)cuandosehaempezadoa valorarelpapeldeestemicroorganismoencuadrosdeenfermedadrespiratoriaporcina.Gracias aestosestudiossehaobservadocómoM.hyorhinisjuegaunpapelimportanteencuadrosde enfermedadrespiratoriaporcina,presentandoasociacionespositivasconotrosagentes etiológicospertenecientesalCRPtantoencuadrosdeenfermedadclínicacomoenlesiones pulmonaresobservadasenmatadero,loquedaindiciosdeunapotencialrelaciónsinérgicaentre M.hyorhinisyotrosimportantespatógenosporcinos. Desdeelpuntodevistadiagnóstico,elestudiodelasenfermedadescausadaspor micoplasmasincluyeunagranvariedaddetécnicas,siendoelcultivo,ylastécnicasenfocadasala deteccióndeanticuerposespecíficos,comoelELISAyWesternblottingylosensayosbasadosen lareacciónencadenadelapolimerasa(PCR),losmétodosdeelecciónporexcelencia(Milesy Nicholas,1998).EnloquerespectaaM.hyorhinis,eldiagnósticomolecularsebasaúnicamente enprotocolosdePCRdetipoconvencionalcombinadoscondeteccióndeADNamplificadoen gelesdeagarosa(Caronetal.,2000a)odepoliacrilamidacongradientedeureaenloquese denominaPCR/DGGE(McAuliffeetal.,2005).Estastécnicas,aunqueempleadasdeforma extensivatantodeformaexperimentalcomoeneldiagnósticodemuestrasclínicashastala           CapítuloI‐Introducción  5 fecha,presentanciertasdesventajasencomparaciónconotrastécnicasdedesarrollomás recientes,siendoelprincipalejemplolaPCRcuantitativaatiemporeal(qPCR),lacualpresenta numerosasventajasencomparaciónconlaPCRconvencionalentrelasquedestacanlacapacidad deprocesarnumerosasmuestrasdeformasimultánea,unincrementoensensibilidady especificidad,rapidezycapacidaddecuantificacióndeADNespecíficoenmuestrasclínicasoen cultivos(Higuchietal.,1993). Aligualqueenelcasodeldiagnósticomolecular,yapesardesuimportanterolcomo herramientadiagnósticaaplicadaalestudiodelarespuestainmunedetipohumoralencuadros clínicosdetipoinfeccioso,hastaelmomentonosehadesarrolladoningúntestdediagnóstico serológicoaplicadoalestudiodeanticuerposfrenteaM.hyorhinis.Contrariamente,enloque respectaaotrasenfermedadescausadaspormicoplasmas,tantoenhumanoscomoenotros animales,lastécnicasserológicasrepresentanunaherramientaindispensableenelestudiodela respuestainmune.Diversastécnicasserológicashansidoempleadashastalafechaparael estudiodemicoplasmas,siendolasmáscomuneselELISA(Bruggmannetal.,1977),graciasasu capacidaddeanalizarmúltiplesmuestrasdeformasimultáneayfacilidadderealización,yel Westernblotting,empleadonormalmentecomotécnicaserológicadeconfirmacióndebidoasu mayorsensibilidadyespecificidad(KennyyCartwright,1984;YoungyRoss,1987).Otrastécnicas serológicasqueseempleancomúnmenteenelcampodelamicoplasmologíaincluyenlafijación delcomplementoylaaglutinaciónporlátex(McKeanetal.,1979)entreotras. Unaramadelamicrobiologíaquehademostradounagranutilidadparaelestudiodelas poblacionesbacterianaseslatipificacióngenética.Estavertientedelamicrobiologíatradicional           CapítuloI‐Introducción  12                Figura1.1.Árbolfilogenéticobasadoenlassecuencias del genARNr16Sdemicoplasmas(Brown,2010)           CapítuloI‐Introducción  13 deelongaciónTu(EF‐Tu,tuf)(Kamlaetal.,1996),gencodificanteparalaproteínaftsZ(Kukekova, 1999),secuenciasespaciadorasintergénicas16S‐23S(ISRoITS)(Harasawa,1999;Volokhovetal., 2012),elgencodificanteparalasubunidadβdelaARNpolimerasa(genrpoB)(Kim,2003),y combinacionesdediferentesgenesconservados(Manso‐Silvánetal.,2007). Hastahacepoco,laclasificacióntaxonómicabasadaenelgenARNr16Sincluíaalaclase MollicutesenelphylumFirmicutes(Garrityetal.,2007).Unareclasificaciónrecientedelphylum Firmicutes(DeVosetal.,2009),basadaenmarcadoresfilogenéticosalternativostalescomoel análisisdelgenrpoB,análisisdelachaperoninaGroELyanálisisdesubunidadesdelaATPasaF0F1 (LudwigySchleifer,2005)sitúaalaclaseMollicutesfueradeestephylum,siendolaclasificación actualaceptadaoficialmentelamismapublicadaporMurrayen1984,dondelaclaseMollicutes seencuentraclasificadadentrodelphylumTenericutes(Brown,2010). 1.2.1.2. Estructuracelularycápsula. LaausenciadeparedcelularenlosorganismosdelaclaseMollicutesexplicavariasdesus característicasprincipales.Entreellasseencuentralaresistenciaaantibióticoscuyadianase encuentraenlasíntesisdepeptidoglicano(betalactámicosyglicopéptidos). Lasseccionesultrafinasdemicoplasmasobservadasconmicroscopíaelectrónica generalmentenoproporcionanunagrancantidaddeinformación.Estatécnicapermite identificarlamembranacelularconsuestructurabilaminaryelcitoplama,dondesepueden diferenciarlosribosomasymaterialnucleico.Lastincionesconrojorutenio,quetiñe mucopolisacáridosdeformaespecífica,observadasbajomicroscopíaelectrónica,han           CapítuloI‐Introducción  14 demostradolapresenciadeunamatrizextracelularfibrilaro“cápsula”(WilsonyCollier,1976; MinionyRosenbush,1993).Estacápsulasepresentaenestrecharelaciónconlamembrana celularyhasidodocumentadaenvariasespeciesdelosgénerosMycoplasmayUreaplasma, entrelasqueseencuentranM.mycoidessubesp.mycoidesSmallColony,M.dispar,M. gallisepticum,M.hominis,M.hyopneumoniae,M.meleagridis,M.pneumoniae,M.pulmones,M. synoviae,M.capricolumsubesp.capricolumyUreaplasmaurealyticum(BoatmanyKenny,1971; RobertsonySmook,1976;Rurangirwaetal.,1987). Lafuncióndelacápsulaenmicoplasmasnoestácompletamenteclara(Miniony Rosenbush,1993),aunquesecreequepuededesempeñarunpapelenlapatogenicidaddeestas bacterias,favoreciendolaadhesiónaltejidohospedador(Robb,1984),incrementandosu toxicidadoevadiendolarespuestainmunecelularaldificultaroinhibirlosprocesosde fagocitosis(RosenbuschyMinion,1992,Marshalletal.,1995). 1.2.1.3. Membranacelularyestructuraantigénica. Lamembranacelulardelosmicoplasmas,aligualqueenotrascélulas,esunamembrana permeableselectivaqueenvuelvealcitoplasmayestáformadaporunabicapadefosfolípidos conproteínasdemembranainsertadasenella. Enlosmollicutes,dosterciosdelamembranaplasmáticaestánformadosporproteínas, siendoelterciorestantelípidosdemembrana(Razinetal.,1998).Lamayoríadelasproteínas presentesenlamembranadelosmicoplasmaseencuentranancladasalaparteexternadela membranaplasmática,adiferenciadelasbacteriasGram‐negativas,dondepresentandiferentes           CapítuloI‐Introducción  15 localizacionesdependiendodesufunción.Untipocaracterísticodeestasproteínasdemembrana sonlaslipoproteínas,quealigualqueloslipopolisacáridosenbacteriasGram‐negativas,pueden modificarsusecuencia,incrementandolavariabilidadantigénicadeestosorganismosyjugando unpapelimportanteenlamodulacióndelarespuestainmunedelorganismohospedador (Chambaudetal.,1999). Apesardelagranvariedaddeproteínasdemembrana,solamenteexisten4funciones reconocidas:lipoproteínaconfunciónestructural,proteínasdetransporteABC,funciones enzimáticasycapacidaddeadherencia(SutcliffeyRussell,1995;HayashiyWu,1990). 1.2.1.3.1. Proteínasvariablesdesuperficie(Vsps) Lapresenciaenmicoplasmasdeproteínascapacesdemodificarsuestructuradeforma reversibleyalterardeestaformasucomposiciónantigénicafuedescritaporprimeravezen1990 porRosengartenyWise.Estavariabilidadpermitealosmicoplasmasobtenerunamayor capacidaddecolonizaciónydeadaptaciónalmedioatravésdelavariacióndesuarquitecturade superficiecelular. Apesardelaaltasusceptibilidadteóricaalosanticuerposyalalisismediadaporel complementodebidoalaausenciadeunaparedcelularrígida,losmicoplasmassecaracterizan porcausarnormalmenteinfeccionesdetipocrónico,evidenciandolaincapacidaddelsistema inmuneparaacabarconellos(Cittietal.,1997).Laselecciónconstantedesubpoblaciones celulares,enlugardelaadaptacióndeunapoblacióncompleta,podríaexplicarlanaturaleza crónicadelasinfeccionescausadaspormicoplasmas.Lacapacidaddevariaciónantigénicaparece           CapítuloI‐Introducción  16 estarrelacionadaprincipalmenteconlipoproteínasancladasalasuperficieexternadela membranacelular(Razinetal.,1998). Otrométododemodificarlaantigenicidadylarespuestainmunedehospedadoresel denominadoenmascaramientoantigénico,dondelosmicoplasmassoncapacesderealizar modificacioneseneltamañooenlacomposiciónlipídicadelaslipoproteínasdemembranacon elfindedificultarlaaccesibilidadaciertosantígenosdesuperficie(RosengartenyYogev,1996). Ademásdeestacapacidaddemodificaciónantigénicaalgunosmicoplasmashandemostrado presentarlahabilidaddemodificarsurepertorioantigénicoconelfindeasemejarseal organismohospedador,enloquesehadenominadocomomimetismomolecular(Jacobsetal., 1995). Diferentesproteínasvariablespertenecientesafamiliasdemultigeneshansido identificadasenM.bovis(vsps:familiasdemultigenesdondeunaaltavariacióndefasetiene lugar),enM.gallisepticumeM.imitans(pMGA:variacióneneltamañodelipoproteínasde membrana)(Cittietal.,1999).M.hyorhinispresentaunodelosmecanismosdevariabilidad antigénicamásestudiados.Estesistema,compuestoporsietegenesquecodificanparaelmismo númerodelipoproteínasvariablesdemembrana(vlp),permiteaestemicroorganismoexpresar diferentescombinacionesproteicasenfuncióndelainfluenciadelmedioodelsistemainmune delhospedador(Cittietal.,2000).Estegrupodeproteínas,presentesenlasuperficiecelular,se encuentranreguladas,aligualqueenotrosmicoplasmas,porcambiosensutamaño,y constituyenelcomponenteantigénicoprincipaldeM.hyorhinis(RosengartenyWise,1990).            CapítuloI‐Introducción  17 1.2.1.4. Patogenicidadyfactoresdevirulencia LosorganismospertenecientesalaclaseMollicutessonensugranmayoríabacterias comensales,siendolosaisladosdeartrópodosconsideradosinclusocomomicroorganismos simbiontes(HackettyClark,1989).Encasodelosmicoplasmaspatógenos,lasinfeccionesque éstoscausansuelenserensumayoríadetipocrónico.Apesardelaclaraasociaciónentre micoplasmasyenfermedadenanimales,plantaseinsectosnoexistemuchainformaciónsobre losmecanismosexactosqueinfluyenenlapatogenicidaddeciertosmicoplasma. Entrelosposiblesfactoresdepatogenicidaddescritosseencuentralaproducciónde peróxidodehidrógenoyradicalessuperóxidocomoproductosmetabólicosdedesecho,capaces decausardañooxidativoenlamembranadelascélulasdelhospedador(Almagoretal.,1984, 1985y1986). Existenotrosmecanismosposiblesporlosquelosmicoplasmaspuedencausar enfermedad.Entreellosseencuentralapresenciadeureasas,quepuedendarlugarala produccióndeamoníaco,lapresenciadefosfolipasaA2enUreaplasmas,queinfluenciael metabolismodelaprostaglandina,generandoproblemasdurantelagestación(Razinetal., 1998),lacapacidaddefusionarseparcialmenteconlascélulashospedadoras,incrementadoel dañocausadoporlosradicalessuperóxido(Wangetal.,1993)yporúltimo,elpapelquela cápsulaexternadepolisacáridojuegaenreducirlacapacidaddefagocitosisenelorganismo hospedador,favoreciendoporlotantolacolonizacióndelosmicoplasmas(Marshalletal.,1995).            CapítuloI‐Introducción  18 1.2.2. Micoplasmosisenganadoporcino Losprincipalesmicoplasmasaisladosdelganadoporcinoseencuentranrepresentadosen latabla1.2. Lasmicoplasmosisporcinaspresentanunadistribuciónmundial,afectandoenmayor medidaalossistemasdeproducciónintensivos.Dentrodeestasmicoplasmosisdestacacon diferencialaneumoníaenzoóticaporcina(NEP),causadaprincipalmenteporM.hyopneumoniae, aunquetrabajosrecienteshandemostradoqueM.hyorhinistambiénjuegaunpapelimportante tantoenlaNEPcomoenelcomplejorespiratorioporcino(CRP)(Linetal.,2006;Palzeretal., 2008;Hansenetal.,2010). EspecieFechadeaislamientoPresentaciónclínica M.hyopneumoniaeMareySwitzer,1965Neumoníaenzoóticaporcina(NEP) M.hyorhinisSwitzer,1955Neumonía,artritis,pericarditis,poliserositis, otitismedia, M.hyosynoviaeRossyKarmon,1970Poliartritis M. f locculareMeylingyFriis,1972Apatógeno – nodemostrado M.hyopharyngisEricksoneta l .,1986Apatógeno – nodemostrado M.suisSplitter,1950Anemiainfecciosaporcina Tabla1.2.Principalesmicoplasmasporcinos 1.2.2.1. Mycoplasmahyopneumoniae Aisladoporprimeraporen1965porMaréySwitzer,M.hyopneumoniaeestáconsiderado comounodelosmicoplasmasmásimportantesenelámbitodelasanidadanimal, principalmentedebidoalasimplicacioneseconómicasquelaenfermedadproducidaporeste           CapítuloI‐Introducción  19 microorganismo,laneumoníaenzoóticaporcina,tieneenlossistemasdeproducciónintensiva deporcino(Stärketal.,1992). 1.2.2.1.1. Característicasgenerales LascélulasdeM.hyopneumoniaesecaracterizanporposeerformacoccoideo cocobacilar,nopresentanmotilidadyproducencoloniaspequeñascarentesderegióncentral, normalmenteconvexasygranularesalserobservadasconmagnificación. Presentanuncrecimientolentoalsercultivadosinvitro,pudiendoserutilizadoparaeste findiferentesmediosdecultivo,entrelosqueseencuentranelmediodeFriis,SP4ymedioA26. Lascondicionesóptimasdecultivoseencuentrana37°Cconagitaciónconstante(Brown,2010). DesdeelpuntodevistabioquímicoM.hyopneumoniaesecaracterizaporfermentarla glucosamientrasnoescapazdehidrolizarlaureaolaarginina(Friis,1972;RossyWittlestone, 1983). 1.2.2.1.1.1. Principalesproteínasantigénicasypredominantes Hastalafechasehandescritodiferentesproteínasinmunodominantesinvolucradasenla patogeniadeM.hyopneumoniae. Numerososestudiosdecaracterizaciónproteicayantigénicadetipogeneraldescritos hastalafechahandemostradounagranvariabilidadantigénicaenestabacteria.Dentrodelos principalescomponentesantigénicosdescritosseencuentranlasproteínasdepesomolecular 110,64,50,41y36kDa(YoungyRoss,1987),96,70,46y38kDa(Morietal.,1988),110,78,64,           CapítuloI‐Introducción  20 50,41y36kDa(Strasseretal.,1992),200,114,94,76,43y36kDa(Scarmanetal.,1997)y97, 74,65,46y36kDa(Caronetal.,2000ayb). EnunestudiollevadoacaboencepasdecampodeM.hyopneumoniaeaisladasenGran Canariasedemostróquelasprincipalesproteínaspredominantescorrespondíanaaquellascon unpesomolecularaparentede160,120,97,93,74,65,57,52,46,40y36kDa(Assunção,2003). Deformamásespecífica,WiseyKim(1987ayb)demostraronatravésdelusode anticuerposmonoclonalesqueloscomponentesantigénicosp41,p44,p50yp65eran lipoproteínasespecíficasenM.hyopneumoniae. Lacapacidaddeadhesiónjuegaunpapeldestacadodentrodelosdiferentesfactoresde virulenciapresentesenM.hyopneumoniae(RossyYoung,1993).Estacapacidaddeadhesión juntoconelefectocitopáticoproducidoencélulasdelepiteliociliardelatráqueaseencuentra estrechamenterelacionadoconlapresenciadeunaproteínade97kDadepesomolecular, descritaporprimeravezporYoungycolaboradoresen1992.Estaproteína,denominada comúnmentecomop97,esunaadhesinaqueseencuentralocalizadaenlamembranacelularde M.hyopneumoniaeyesconsideradacomounodelosprincipalesmarcadoresdevirulenciaen estabacteria(Zhangetal.,1995). Elgenquecodificaestaproteínapresentadosregionesrepetitivasbiendiferenciadas, denominadasR1yR2(Hsuetal.,1997).En1998,HsuyMinioncomprobaronquelaregiónR1 jugabaunpapelesencialenelprocesodeadhesión,demostrándoseposteriormentequeera necesariounnúmerosuperiora8repeticionesporregiónR1paraqueseprodujeralaadhesióna           CapítuloI‐Introducción  21 ciliosdetejidorespiratorioporcino(Minionetal.,2000).SehapostuladoquelaregiónR2esuna porciónnoesencialdelaproteínap97,queactúacomoseñueloparaelsistemainmune(Wilton etal.,1998). ApesardeserreconocidacomouncomponenteantigénicoimportanteenM. hyopneumoniae,diferentesestudioshandemostradoquelaactividaddelaproteínap97noesel únicocomponentenecesarioparalaadhesiónaciliosdelepiteliorespiratorioporcino(Chenet al.,1998;HsuyMinion,1998). Aellosesumalarecientedescripcióndevariasproteínasdemembranacapacesdeunirse aciliosyotroscomponentesbiológicosinvitro(Chenetal.,1998;Burnetetal.,2006;Wiltonet al.,2009;Deutscheretal.,2010;Seymouretal.,2010;Bogemaetal.,2011;Seymouretal., 2011),dandomayorpesoalateoríaquedefiendeunprocesodeadherenciareguladopormásde unaproteínademembranaenM.hyoneumoniae. Ademásdeestasadhesinas,existenotroscomponentesproteicosimportantesenM. hyopneumoniaequehansidopartedenúmerososestudiosdecaracterizaciónconelfinde obtenerposiblescandidatosparavacunasrecombinantes(Chenetal.,2008)ocomobasepara técnicasdiagnósticas. Dentrodelosmásimportantesseencuentralap74,caracterizadaporFeldy colaboradoresen1992.Estaproteína,descritaanteriormentecomounaproteínadechoque térmicooheat‐shockprotein(BrookyFaulds,1989),sirviócomobasedeunodelosprincipales           CapítuloI‐Introducción  28 ElmediodeFriis(Friis,1971a)esconsideradocomoelmediodecultivodeelecciónparael aislamientodeM.hyopneumoniae.Setratadeunmediodecultivocomplejoquerequiereuna altaconcentracióndesueroporcinoensucomposición. DentrodelasprincipalesmuestrasrecomendadasparaelaislamientodeM. hyopneumoniaeseencuentranloshisopostraquealesyloslavadostraqueobronquiales(Marois etal.,2007),seguidosportejidopulmonar.Loshisoposnasalesnoserecomiendandebidoal limitadoperiododetiempodentrodelqueM.hyopneumoniaepuededetectarseenlacavidad nasal(Mattssonetal.,1995)yalincrementoenelriesgodecontaminaciónconbacteriasno específicas(Cardonaetal.,2005). ElaislamientodecepasdecampodeM.hyopneumoniaeesunprocesoaltamente laborioso,pudiendoabarcarperiodosdehasta8semanas,complicándosefrecuentementecon otrosmicoplasmasporcinos(Maesetal.,1996). 1.2.2.1.4.2. Diagnósticoserológico EldiagnósticoserológicoenM.hyopneumoniaesebasaenlatécnicadeELISA(enzyme‐ linkedimmunosorbentassay),debidoalarapidezensurealización,asucapacidadparatestarun altonúmerodemuestrasalmismotiempoyasubajocoste. LosprincipalesmétodosdediagnósticoserológicobasadosenlatécnicadeELISAdescritos paraM.hyopneumoniaeincluyenunELISAdebloqueo(bELISA)(Feldetal.,1992)ydostestde ELISAindirectos(iELISA),unocomercializadoporIDEXX(IDEXXM.hyo.AbTest)yelotroun           CapítuloI‐Introducción  29 ensayoampliamenteutilizadobasadoenelusodeantígenospreviamenteprocesadoscon Tween‐20(Nicoletetal.,1980;Kazamaetal.,1989). ElusodeWesternblottingeneldiagnósticodeM.hyopneumoniaeselimitaasuaplicación comotestconfirmatorioparamuestrasdondeelELISApresentaunresultadodudoso(Ameriet al.,2006). Otrastécnicasserológicasincluyenlafijacióndelcomplemento(Morietal.,1983)yla hemoaglutinaciónindirecta(Freemanetal.,1984),aunqueactualmenteseencuentranen desuso. 1.2.2.1.4.3. Valoracióndelesionesmacroscópicasydiagnósticohistopatológico Lavaloracióndelaslesionesmacroscópicasdepulmonesesampliamenteutilizadatanto encontrolesdemataderocomoenlaevaluacióndelaeficaciadeinoculacionesexperimentales, yaque,aunquedecapacidaddiagnósticalimitadasinelapoyodeotrastécnicaslaboratoriales,se consideraunaherramientaesencialparaelestudiodelasinfeccionescausadaspormicoplasmas (Sibilaetal.,2009). Existennumerosossistemasdepuntuacióndelesionesdescritoshastalafecha(tabla1.3). Enlamayoríadeestossistemas,elvalormáximoasignadoacadalóbuloesponderadoenfunción delaprevalenciaenlapresentacióndelesionesasociadasaneumoníaenzoóticaencadaregión pulmonar.           CapítuloI‐Introducción  30 Alahoradeevaluarlaslesionesmacroscópicasenpulmón,hayvariasconsideracionesa tenerencuentaparaunacorrectainterpretacióndelosdatos,yaque,apesardeseraltamente indicativas,laslesionescausadaspormicoplasmasenporcinonosonpatognomónicas,pudiendo serconfundidasporejemploconcasosdeinfluenzaporcina(Thackeretal.,2001),ademásde existirelriesgodequeotraslesiones,comolascausadasporActinobacilluspleuropneumoniae puedanenmascararinfeccionessubyacentescausadaspormicoplasmas. Tabla1.3.Sistemadepuntuacióndelesionesmacroscópicaspulmonaresencerdos,modificadodeSibilaetal.,2009 Elusodetécnicasinmunohistoquímicas(IHQ)paraladeteccióndeM.hyopneumoniaeha sidoempleadoennumerasocasionesparaladeteccióndeantígenosdemicoplasmacomo Autor Unidadde puntuación PuntuaciónporlóbuloTotal   ApicalCardíacoDiafragmáticoIntermedio    DIDIDI   Goodwiny Whittlestone (1973) De0a5ode0a10 puntosporlóbulo 10101010 5(sólo borde craneal) 5(sólo borde craneal) 555 Hannanetal. (1982) De0a5puntospor lóbulo 5/75/75/75/75/195/195/835 Madecand Kobisch (1982) De0a4cuatro puntosporlóbulo dependiendodel porcentajede lóbuloafectado 0puntos=nolesiones;1punto=<25%dellóbulo;2puntos=25–49%;3 puntos=50–74%;4points>75%.Puntosparacadaunodelos7lóbulos 28 Morrisonet al.(1985) Porcentajede lóbuloafectado 10107730306100 Strawetal. (1986) Porcentajede lóbuloafectado 10101010252510100 Christensen etal.(1999) Porcentajede lóbuloafectado 7415935255100           CapítuloI‐Introducción  31 técnicaaccesoriaparalaevaluaciónhistopatológicadelesionespulmonares(Andrada,2001; Sarradelletal.,2003;Opriessnigetal.,2004;Redondoetal.,2009),aunquesuescasa sensibilidadhacequenoseaunatécnicadeelecciónendiagnósticorutinario. Elmétodomásextendidoparalavaloraciónsemicuantitativadelesionesenpreparaciones histológicaseseldescritoporLivingstonycolaboradoresen1972.Enélseestablecencuatro diferentesvalores(+,++,+++,++++)quevaríandependiendodelagradodelaslesiones,taly comoseexponeacontinuación: +:Unoomásnóduloslinfoidesenlasubmucosaperosinpenetrarenlacapamuscularde lamucosa. ++:Unoomásnóduloslinfoidesextendidosatravésdelacapamusculardelamucosa, escasoinfiltradoinflamatorio(principalmenteneutrófilos),tantoanivelseptalcomoenlaluz bronquialyalveolar.Laparedalveolargeneralmentepocoengrosada. +++:Hiperplasialinfoideperivascularyperibronquiolarconnumerosascélulasseptalesy neutrófilosenlaluzalveolar.Enlasáreasafectadaselbronquiocontienegeneralmenteungran númerodeneutrófilosenlaluz. ++++:Hiperplasialinfoideperivascularyperibronquiolarintensaenáreasextensasdel parénquimapulmonar.Elinfiltradoseptalointraluminal(compuestopormacrófagosy neutrófilos)esescasoysepuedeencontraredemaalveolarenlasáreasafectadas.           CapítuloI‐Introducción  32 Lahibridacióninsitu(HIS)suponeunaalternativaalaIHQ,yaqueelusodesondas sintetizadascomercialmentemarcadascondigoxigenina,fluoresceínauotrosmarcadores, reducelavariabilidadbiológicaobservadaentrediferentesanticuerpos,mejorandola repetitividaddelatécnica(LinyLloyd,1991).LaHISsehausadoconéxitoparaladetecciónde ADNespecíficodeM.hyopneumoniaetantoenanimalesinfectadosexperimentalmentecomo muestrasprocedentesdeinoculacionesexperimentales(KwonyChae,1999;Boyeetal.,2001; Kwonetal.,2002). 1.2.2.1.4.4. Diagnósticobasadoenlareacciónencadenadelapolimerasa(PCR) Existennumerosastécnicasbasadasenlareacciónencadenadelapolimerasadescritas hastalafechaparaladeteccióndeM.hyopneumoniae. Loslímitesdedeteccióndelosdiferentesprotocolosdesarrolladoshastalafechavarían entre5nanogramos(Harasawaetal.,1991)hasta0,5ficogramos(Kurthetal.,2002)deADN genómico. DentrolosprincipalesgenesevaluadosparaeldiseñodetécnicasdePCRparaladetección deM.hyopneumoniaecabedestacarelgendelARNribosómico16S(Stemkeetal.1994, Mattssonetal.,1995;Calsamigliaetal.,1999a;Stakenborgetal.,2006;Caietal.,2007).Otros genesincluyentransportadoresABCputativos(Verdinetal.,2000;Dubossonetal.,2004)yvarias proteínasespecíficas(Artiushinetal.,1993;Caronetal.,2000;Kurthetal.,2002yMaroisetal., 2010).AlahoradedetectarM.hyopneumoniaeutilizandoPCR,lasmuestrasrecomendadas           CapítuloI‐Introducción  33 incluyenhisopostraqueobronquiales,lavadosbronquialveolaresytejidopulmonar(Kurthetal., 2002;Maroisetal.,2007). 1.2.2.1.5. Profilaxis,controlyerradicación Porlogeneral,lasmedidasdeprofilaxisycontroldelaNEPsesostienensobretrespilares básicos:optimizacióndesistemasdemanejoyproducción,usodeantibióticosyvacunación. Dentrodelasprincipalespautasdemanejoenfocadasalcontrolyprofilaxisdeesta enfermedadcabedestacarelsistemadeproducción“tododentro‐todofuera”(TD‐TF),yaque permitereducirengranmedidaelcontactoentreanimalesmásviejosconanimalesjóvenes,más susceptiblesalaenfermedad(Clarketal.,1991).Deformaadicional,sehademostradoqueeste sistemafavorecelareduccióndelesionespulmonaresyayudaamejorarlosíndicesde producción,porloqueserecomiendasuempleoenlossistemasdeproducciónporcina. Elusodeantibióticoscomométododecontrolyprofilaxisestáaltamenteextendidoenla producciónporcinaindustrial.Lapautademedicaciónmásutilizadaincluyeelusodepiensos medicadosdeunaatressemanas,empezandounasemanaantesdelcomienzodelaenfermedad (Thackeretal.,2004).EstesistemareducenotablementeelnúmerodecélulasdeM. hyopneumoniaepresentes,peronolograevitarporcompletolainvasiónporpartedeeste agentebacteriano.Otrosistemaempleadodeformarutinariaeslamedicaciónpulsada, administradadeformaintermitenteduranteperiodosdeespecialriesgodeenfermedad(Le GrandyKobisch,1996).Laprincipalcontrapartidadeestemétodoradicaenlaposibilidadde           CapítuloI‐Introducción  34 desarrolloderesistenciaaagentesantimicrobianoscuandoseusadeformaprolongada(Maeset al.,2008). Actualmente,lamayoríadelospaísesconsistemasdeproducciónintensivosdeporcino incluyenpautasdevacunaciónfrenteaM.hyopneumoniae.Comoindicadordeestedato,cabe destacarquelavacunafrenteaM.hyopneumoniaeesunadelasdosvacunasmásvendidasenel mercadodelasanidadanimalanivelglobal(Meeusenetal.,2007). TodaslasvacunascomercialesfrenteaNEPsebasanenbacterinasinactivadas químicamenteencombinacióncondiferentesadyuvantes.Aunquelasvacunascomercializadas hastalafechanodanlugaraunaproteccióncompletaynoevitanlacolonizacióndeM. hyopneumoniae(Thackeretal.,1998),sehademostradoquesuusoayudaamejorarelíndicede gananciadepesodiarioyelíndicedeconversión,ademásdereducirlamortalidad,eltiempoen alcanzarelpesodematadero,laslesionespulmonaresysignosclínicos(Maesetal.,1998;Maes etal.,1999). VariospaísesdelaUniónEuropeasiguenactualmenteprogramasdestinadosala erradicacióndeM.hyopneumoniaedesusgranjas(Baekboetal.,1994;Rautiainenetal.,2001; Stärketal.,2004).Lamayoríadelosprogramasdeerradicaciónpropuestoshastalafecha incluyenprocesosdedespoblacióncompleta,odespoblaciónparcialencombinacióncondietas medicadasbasadasenelusodetiamulina,ocombinacionesdeclortetraciclina,tilosinay sulfadimidina(Zimmermanetal.,1989).Variacionesdeesteprogramadedespoblación,utilizado principalmenteengrandesexplotacionesdeEstadosUnidosyCanada,incluyenademáselusode vacunasyelllamadodestetetempranomedicado(DTM),dondelosanimalessondestetadosa           CapítuloI‐Introducción  35 loscincodíasdeedadyaisladosmientrasrecibentratamientoantimicrobianodurantediezdías (HarrisyAlexander,1999).ElDTMtambiénincluyelaadministraciónintensivade antimicrobianosalasmadrestantoenelúltimoperíododelagestacióncomoaliniciodela lactación. 1.2.2.2. Mycoplasmahyorhinis 1.2.2.2.1. Característicasgenerales LaprimeradescripcióndeM.hyorhinisdatade1955,cuandoSwitzer,comopartedeun estudioparadeterminarlascausasderinitisatróficainfecciosa,aislódelacavidadnasalde cerdosloquedenominópleuropneumonia‐likemicroorganismomicroorganismosimilaral causantedepleuroneumonía(PPLO).M.hyorhinisestáconsideradocomounabacteria contaminanteaisladafrecuentementedeltractorespiratoriodecerdo.Seconsideranlas superficiesmucosasdeltractorespiratoriosuperiordelcerdoylastonsilascomoelhábitat naturalparaestemicroorganismo(FriisyFeenstra,1994).Presentaunadistribuciónmundial, encontrándosenormalmenteasociadoconcasosdepoliartritis,pericarditisypoliserositisen cerdosjóvenes(KobischyFriis,1996).Ademássehademostradosuasociaciónconcasosdeotitis media(Moritaetal.,1995)yneumonía(Linetal.,2006). AligualquetodoslasbacteriasdelgéneroMycoplasma,M.hyorhinispresentauntamaño degenomarelativamentepequeño,variandoentre829y839kb(Liuetal.,2010;Kornspanetal., 2011),conuncontenidoenG+Cde25.9%.           CapítuloI‐Introducción  36 Desdeelpuntodevistafilogenético,M.hyorhinispresentabastantessimilitudesconotros dosmicoplasmasporcinos,M.hyopneumoniaeyM.flocculare,agrupándoseconjuntamenteenel clusterneurolyticumenanálisisbasadosenelgenARNr16S,genrpoBeITS16S‐23S(Volokhovet al.,2012). BioquímicamenteM.hyorhinisfermentalaglucosa,noutilizaargininaynohidrolizala urea,reducetetrazolio,tantodeformaaeróbicacomoanaeróbica,esfosfatasapositivoy negativoenlapruebadedigestióndelacaseína(Friis,1971b). EncomparaciónconM.hyopneumoniae,M.hyorhinisesrelativamentefácildeaislar, siendoconsideradocomounmicoplasmadecrecimientorápido(Friis,1971b).Enmediosólidose puedenobservarcoloniastípicasdemicoplasmaconmorfologíade“huevofrito”trasincubación a37°Centre2a5días,conundiámetrofinalde0.5a1mm. 1.2.2.2.1.1. Mecanismosdevariaciónantigénica ElsistemavlprepresentaelprincipalmecanismodevariaciónantigénicaenM.hyorhinis. Estesistemaproporcionalacapacidadalmicroorganismodemodificarsurepertorioantigénicoy característicasestructuralesdesuperficieconelfindeevadirlaaccióndelsistemainmunedel organismohospedador(Cittietal.,1997). Hastalafechasehaencontradountotaldehastasietegenesinvolucradosenelsistema vlp:vlpA,vlpB,vlpC,vlpD,vlpE,vlpFyvlpG(Cittietal.,2000).Solamentesepresentaunacopia decadagen,siemprelocalizadosconjuntamente.Deformageneralsepresentanagrupadosenel genomadeM.hyorhinisencombinaciónconlasecuenciadeinserciónIS1221,untransposóno           CapítuloI‐Introducción  37 elementogenéticotransponibleconvariascopiasdispersasenelgenomayresponsablede reordenamientosgenómicosagranescala,incluyendodeleciones,insercioneseinversiones génicas(ZhengyMcintosh,1995). Elsistemavlpestáreguladomediantediferentesmecanismos: ‐ SistemaON/OFFodeencendidoyapagado:Sistemaquemediantedelecioneso insercionesenlaregiónpromotoraregulalaexpresióndelosgenesvlp(RosengartenyWise, 1990;CittiyWise,1995). ‐ Variaciónentamaño:Basadoenladeleciónoinsercióndesecuenciasintragénicas repetitivas,dandolugarenconsecuenciaavariaciónantigénica(Yogevetal.,1991;Cittietal., 1997). ‐ Variaciónenelnúmerodegenespresentesencadacepa,variandoporlotantoel númerodevlpsexpresadosenlamembranadelmicroorganismo(Yogevetal.,1995;Cittietal., 2000). Graciasaestosmecanismos,M.hyorhinisescapazdevariarrápidamente,adaptándosea diferentescondicionesdelmediouhospedadorydandolugaralaseleccióndepoblaciones resistentesalarespuestahumoral(Rosengartenetal.,2000). 1.2.2.2.2. Epidemiología M.hyorhinispresentaunadistribuciónmundial,encontrándoseencualquierlugardonde hayaproducciónintensivaporcina(Schulmanetal.,1970).           CapítuloI‐Introducción  44 2‐5díasdeincubación.Elcultivoesunatécnicadiagnósticaconunaaltaespecificidadperobaja sensibilidad. 1.2.2.2.4.2. Diagnósticoserológico Dentrodelosensayosdediagnósticoserológicoempleadoshastalafecha,lainhibición delcrecimientoyeltestdelainhibicióndelmetabolismorepresentanlastécnicasmásutilizadas (Goiš,1968b;Tayloretal.,1971).Otrotest,comolaaglutinaciónporlátex,desarrolladaporGoiš ycolaboradores(1972),fuecapazdedetectarseroconversiónfrenteaM.hyorhinistras14DPI. Lahemoaglutinaciónindirectatambiénhasidoutilizadaconéxito,siendocapazdedetectar anticuerposespecíficoshasta42DPI(Kobisch,1983).Hastalafechanosehadescritoningúntest serológicobasadoenWesternblottingoELISA. 1.2.2.2.4.3. DiagnósticoporPCR Hastalafechasehandescritonumerososensayosbasadosenlareacciónencadenadela polimerasa(PCR)paraladeteccióndeM.hyorhinis,destacandolassecuenciasdeADN específicasdelgenARNr16Scomoobjetivomayoritarioenestosensayos(Stemkeetal.,1994, Kobayashietal.,1996a). Caronycolaboradores(2000)desarrollaronunaPCRespecíficabasadaenladeteccióndel gencodificanteparalaproteínap37deM.hyorhinis,aunqueaparentementeesmenossensible queelcultivo.           CapítuloI‐Introducción  45 ElusodelgenARNr16Scomodianatambiénhasidoevaluadoparaladetecciónmúltiple deM.hyorhinisjuntoaotrosmicoplasmasporcinos,incluyendoM.hyopneumoniae(Linetal., 2006)yM.hyopneumoniaeyM.flocculare(Stakenborgetal.,2006).Otratécnicautilizada ampliamenteeslaPCRmúltipledesarrolladaporTangycolaboradores(2000).Estatécnica,que empleadosoligonucleótidosuniversalesparalasecuenciaespaciadoraintergénica16S‐23Sde bacteriasdelgéneroMycoplasmasyAcholeplasma,escapazdediferenciarlosprincipales micoplasmasporcinosasociadosacuadrosdeinfecciónrespiratoriaydeartritis(M.hyorhinis,M. hyopneumoniae,M.hyosynoviae,M.flocculare,Mhyopharyngis),habiendosidousadaconéxito enestudiosepidemiológicosdeprevalenciademicoplasmasrespiratoriosporcinos(Nathueset al.,2011). RecientementesehadesarrolladounaPCRmúltiplecapazdedetectardeforma simultáneaochopatógenosrespiratoriosporcinosdiferentesincluyendoM.hyopneumoniae,M. hyorhinisademásdecircovirusporcinotipo2,citomegalovirusporcino,coronavirusrespiratorio porcino,SIVyelgenotipoEuropeoyNorteamericanodelPRRSv(HarderyHuebert,2004),cuyo usohaconfirmadoserdeexcelenteayudaendiferentesestudiosepidemiológicos(Palzeretal., 2008;Hansenetal.,2010). Latécnicadeelectroforesisengeldesnaturalizanteengradiente(DGGE)representaun granavanceeneldiagnósticodeenfermedadescausadaspormicoplasmas.Estatécnicapermite ladiferenciacióndeproductosespecíficosobtenidosporPCRtraslaamplificacióndelgenARNr 16S,medianteelusodeoligonucleótidosparaladetecciónuniversaldebacterias(McAuliffeet al.,2003)oparaladetecciónespecíficademollicutes(McAuliffeetal.,2005),encombinación           CapítuloI‐Introducción  46 conelectroforesisdelproductoamplificadoengelesdepoliacrilamidaconungradientedeurea. DGGEpermiteevaluarenunamismareacciónlapresenciadecultivosmixtos,tantocon diferentesmicoplasmascomoconotrosagentesbacterianos. 1.2.2.2.4.4. Diagnósticoportécnicasinmunohistoquímicas,inmunofluorescencia indirectaehibridacióninsitu. EldiagnósticoporIHQeinmunofluorescenciaindirectahasidoempleadoconéxitoparala deteccióndeM.hyorhinisendiferentesinoculacionesexperimentales,tantoenelepitelio auditivo(Moritaetal.,1995;Moritaetal.,1998)comoentejidopulmonar(Goišetal.,1971; Kinneetal.,1991;Kawashimaetal.,1996).Lastécnicasdescritashastalafechausananticuerpos policlonalesobtenidosenconejosparaladeteccióndeM.hyorhinisloquehaceque,debidoala cantidaddecomponentesantigénicoscompartidosentremicoplasmas,suusonosea recomendadohastalaaparicióndeanticuerposmonoclonalesespecíficos. Comoalternativa,HISrepresentaunaopciónespecífica,sensibleydebajocosteparala deteccióndeADNdeM.hyorhinisenseccionesdetejidofijadosconformalina,tantodeorigen respiratorio(Boyeetal.,2001)comoenmuestrasprocedentesdecuadrosdepoliserositisy pericarditis(Kimetal.,2010). 1.2.2.2.5. Profilaxisycontrol ElrangodeantibióticosempleadosparatratarlasinfeccionescausadasporM.hyorhinis essimilaraaquellosqueseutilizanparaelcontroldeM.hyopneumoniae,aunqueexisten           CapítuloI‐Introducción  47 indiciosquedemuestranqueenalgunoscasos,eltratamientodeanimalesclínicamente enfermospuedenoresultardeltodosatisfactorio(Ross,1999). Variosestudiosinvitrohandemostradolaefectividaddeunampliorangodeantibióticos frenteaM.hyorhinis,demostrándoseunpatróndeconcentracionesmínimasinhibitoriascomún enaisladoscondiversoorigengeográficoytemporal(Williams,1978;Hannanetal.,1997;Wuet al.,2000). Losmacrólidostilosina,tilvalosina,josamicina,lincomicinaytiamulinapresentanbajas concentracionesinhibitoriasfrenteaM.hyorhinis(Aarestrupetal.,1998;Makhanonetal.,2008), perosuutilizacióndebeserevaluadadetenidamentedebidoalaaparicióndecepasresistentes, asociadasamutacionesenlosdominiosIIyVdelARNribosómico23S(Kobayashietal.,2005). Lastetraciclinasyfluoroquinolonaspresentannivelesdeinhibiciónmedio‐alto,ademásde ungrandevariabilidadenlosvaloresentrediferentesaislados(Wuetal.,2000).Variosautores handemostradoeldesarrollodemutacionescodificantesparaeldesarrolloderesistenciasfrente atetraciclinasyfluoroquinolonas(Dégrangeetal.,2008;Viccaetal.,2007)enmicoplasmas,lo quesugiereunaposibleasociaciónentreladisminucióndelassensibilidadaestosagentes antimicrobianosenM.hyorhinis,observadaalcomparardatoshistóricos(Kobayashietal., 1996b;Kobayishietal.,2005)yeldesarrolloderesistencias. Lavalnemulinaylatiamulina,agentesantimicrobianospertenecientesalgrupodelas pleuromutilinas,poseenunaaltacapacidaddeinhibicióninvitrofrenteaM.hyorhinis (Makhanonetal.,2008).Actualmentesonampliamenteutilizadasenproducciónporcinasinque           CapítuloI‐Introducción  48 sehayademostradounadisminucióndelasensibilidadenmicoplasmasfrenteaestos antibióticos(Thongkamkoonetal.,2010)porloquejuntoconlatilosinaytilmicosina,ademásde otrosmacrólidosdenuevageneracióncomolatulatromicina(Nutschetal.,2005;Godinho,2008) constituyenlosantibióticosdeelecciónparaeltratamientodelainfeccióncausadaporM. hyorhinisencerdos. NoexistenprogramasdeprevenciónycontrolfrenteaM.hyorhinisdescritoshastala fecha.Elavancedelainvestigaciónenelcampodeldesarrollovacunalesescaso,aunqueseha demostradoqueelusodevacunasinactivadasencombinaciónconadyuvantesoleosos administradasporvíaintramuscularpuedenproporcionarprotecciónencerdosinfectados experimentalmenteconM.hyorhinis(Leeetal.,2010).Tambiéncabedestacarlapresenciade unapatentequedescribelaproduccióndeunavacunacombinadaconM.hyorhinisyM. hyopneumoniae(UnitedStatesPatentandTrademarkOfficehttp://patft.uspto.gov,USPatent 7381414),enlaqueseconfirmalaproteccióndeanimalesvacunadostrasinfecciónconunoo ambospatógenosdeformasimultánea,sinquehastalafechaexistaningunapublicación científicarevisadaporparespublicadahastalafechaconfirmandoestosdatos. 1.2.2.3. Mycoplasmahyosynoviae RossyKarmon(1970a)realizaronlaprimeradescripcióndeestaespecie,asociándolaa cuadrosdeartritisencerdosdetresaseismesesdeedad. Enmediosólido,M.hyosynoviaedalugaracoloniastípicasenformade“huevofrito”, normalmenteasociadasalaproducciónde“películasycristales”.Bioquímicamentesecaracteriza           CapítuloI‐Introducción  49 pormetabolizarargininaysernegativoparalaspruebasdemetabolizacióndelaurea, fermentacióndelaglucosayreduccióndeltetrazolio.Esunmicoplasmadecrecimientorápido, especialmenteenmediosdecultivoenriquecidosconmucinaporcina(Friisetal.,1991;Kobischy Friis,1996).ElhábitatprincipaldeM.hyosynoviaeseencuentraenelaparatorespiratorio superiordelcerdo,principalmenteeneláreadelatonsilapalatina(RossySpear,1973).Apartir deestalocalización,ydeformahematógena,elorganismoescapazdealcanzarlasmembranas serosas,conunaespecialpredilecciónporlasmembranassinoviales(Hagedorn‐Olsenetal., 1999a),aunqueotrasmembranasserosas,comoporejemplolamembranapericárdica,pueden verseafectadas(Jensenetal.,1995;Buttenschønetal.,1997). Clínicamente,lainfeccióncausadaporM.hyosynoviaesecaracterizaporlaproducciónde artritisnopurulentaasociadaacojerademoderaasevera.Lasusceptibilidadalaenfermedadse localizaentrelas10y20semanasdeedad,siendorarasupresentaciónenanimalesadultos(Ross ySpear,1973;KobischyFriis,1996).Lossignosclínicosmásclarosincluyenladificultadde movimientoyanimalesquepermanecenrecostadosoenposicióndeperrosentado, mostrándosereaciosalmovimiento(RossyDuncan,1970b).Normalmentenosepresenta aumentodelatemperaturanidisminucióndelapetito.Loscasosdeartritisproducidosporeste microorganismoraravezdesembocanenunapresentaciónclínicacrónica,observándoseuna recuperaciónentreunaydossemanastraseliniciodelacojera(Hagedorn‐Olsenetal.,1999b). Dentrodelosfactorespredisponentesparalapresentacióndelaenfermedadcabedestacar factoresambientales,comoeltipodesuelo(Ross,1973)ylamezcladeanimalesdediferentes edadesyorigen(Blowey,1993).           CapítuloI‐Introducción  50 Hastalafechasehanempleadodiferentestécnicasdiagnósticasparaladetecciónde anticuerposfrenteaM.hyosynoviae,aunquesólolafijacióndelcomplemento(Blowey,1993)y latécnicadeELISA(Nielsenetal.,2005)hansidoutilizadasparaladetecciónsistemáticade anticuerposenmuestrasclínicas.EldiagnósticoporPCResmuylimitado,basándose principalmenteentécnicasdestinadasaladeteccióndelgenARNr16S(Arhensetal.,1996)o másrecientementeencombinaciónconlatécnicadeDGGE(McAuliffeetal.,2005).Además,la técnicadeHIShademostradoserdeutilidadparaladetecciónespecíficadeM.hyosynoviaeen tejidoporcino(Boyeetal.,2001). Lasmedidasdecontrolyprofilaxissebasanúnicamenteenmedidasdemanejoysobre todoenelusodeantibióticos.ElusodevacunasfrenteaM.hyosynoviaeeslimitadoaunquese hademostrandounaciertacapacidaddeprotecciónalusarformulacionesbasadasenla tecnologíadeISCOM(Lauritsenetal.,2010).Actualmentenoexistenvacunascomercialesfrente aestemicroorganismo.Enloquerespectaalasmedidasdemanejo,NielsenyBusch(1998) evaluaronelusodelsistemaTD‐TF,sinconseguirladesaparicióndelmicroorganismo. DiferentesagentesantimicrobianoshandemostradoserefectivosfrenteaM.hyosynoviae invitro,entrelosquedestacanlalincomicina,tiamulinaylaenrofloxacina(Schultzetal.,2012).A pesardesuacciónfrenteamicoplasmasporcinos,elusodelatilosinaparaeltratamientode infeccionesfrenteaM.hyosynoviaeestádesaconsejadodebidoalaapariciónderesistenciasen diferentescepasdecampo(AarestrupyFriis,1998).            CapítuloI‐Introducción  51 1.2.2.4. Mycoplasmasuis M.suisesunmicoplasmahemotrópicoqueafectaacerdosproduciendoanemia hemolíticaimmunomediada(Messick,2004).Descritoinicialmenteen1950porSplittercomo Eperythrozoonsuis,hasidorecientementeincluidoenelgéneroMycoplasmadebidoasu relaciónfilogenéticaconestosmicroorganismos(Neimarketal.,2001y2002) Desdeelpuntodevistamorfológico,M.suisesunmicroorganismodecarácter pleomórfico,deunos0.40a0.6µmdediámetro,quesesuelepresentarenformadecocos, bacillosoanillos,tantolibresenelplasma(ZacharyySmith,1985),comoenhendiduras formadasenlasuperficiedeglóbulosrojos(PospischilyHoffmann,1982). Latransmisiónnaturalocurreprincipalmentedebidoaaccionesmecánicas(agujaso materialquirúrgico)(Henry,1979).Tambiénexistenevidenciasquesugierenelpapeldealgunos artrópodosenlatransmisióndeM.suis,sinquehastalafechasehayapodidodemostrar definitivamentesupapelenlaepidemiologíadeestaenfermedad(Heinritzi,1990;Messick, 2004).Deformaexperimental,M.suisescapazdeinducirpresentacionclínicatrasinoculación porviasubcutánea,intravenosa,intraperitonealyoral(Hoelzle,2006). LasinfeccionesporM.suispresentanunclínicavariable.Laanemiahemolíticarepresenta elprincipalsignoclinicoencuadrosagudos,llegandoaserletalenalgunoscasos(Messick,2004). Otrossignosclínicosincluyenhipoglucemia,disnea,fiebre,cianosis,ictericia,necrosisdel extremoapicaldelasorejasydisminucióndelagananciadepeso(Heinritzi,1990).En           CapítuloI‐Introducción  52 presentacionescrónicaslosprincipalessignosclínicosdescritossonanemia,retrasoenel crecimientoydisminucióndelosíndicesreproductivos(Henry,1979;Zinnetal.,1983). Aunqueelusodefrotisdirectoapartirdemuestrasdesangrehademostradoserdegran utilidadparaeldiagnósticodeM.suis,suslimitacionesencuestióndesensibilidady especificidad,juntoconeldesarrollodetécnicasmolecularesmásrobustas,hanposicionadoal diagnósticoporPCRcomolatécnicadeelecciónparaladeteccióndeM.suisapartirtantode muestrasdesangrecomodetejidos(Hoelzleetal.,2007a). LosprimerosprotocolosdePCRutilizadosparaladeteccióndeM.suissebasaneneluso deensayosconvencionales(Gwaltneyetal.,1993;Messicketal.,1999;Hoelzleetal.,2003), aunqueactualmente,debidoeldesarrollodelaPCRatiemporeal,hacequeestaúltimaseala técnicadeelecciónparaladeteccióndeADNespecíficodeM.suis.Estudiosrecienteshan demostradoquelosensayosbasadosenPCRatiemporealsoncapacesdeproporcionaruna sensibilidadcienvecesmayoralaobtenidaconPCRconvencionalenladeteccióndeM.suisa partirdemuestrasdesangre(Guimaraesetal.,2011). EldiagnósticoserológicosebasaprincipalmenteenelusodetécnicasdeELISAyWestern blotting.ElusodetécnicasdeiELISAconantígenocompletohademostradoserdeutilidadpara ladeteccióndeanticuerposespecíficosfrenteaM.suis(Hsuetal.,1992),aunqueestudios recienteshanconfirmadocómoensayosbasadosenelusodeproteínasrecombinantes,entrelas queseincluyenunaproteínadechoquetérmico(HspA1),unaadhesinalocalizadaenla membranacelular(MSG1)yelgencodificanteparapirofosfatasainorgánica(ppi),proporcionan           CapítuloI‐Introducción  53 unamayorsensibilidadyespecificidadalcompararlostantofrentealiELISAdeantígeno completocomoatécnicasdehemoaglutinaciónindirecta(Hoelzleetal.,2007b;Liuetal.,2011). EltratamientodeelecciónparainfeccionesporM.suissebasaenelusodetetraciclinas (Hoelzle,2008),aunqueexisteevidenciaquecorroboraque,aunsiendocapacesdecontrolarla enfermedad,notienenelpoderdeeliminaralmicroorganismo,dandoporlotantolugara animalesinfectadosdeformapersistente,loscualesjueganunpapelimportantísimoenel mantenimientoytransmisióndelaenfermedad(Greshametal.,1994). 1.2.2.5. Mycoplasmaflocculare M.flocculareseencuentracomúnmentelocalizadoenelaparatorespiratoriosuperiordel cerdo.Poseeunadistribuciónmundialyhastalafechanosehademostradosucapacidad patogénica,porloquesuimportanciaselimitaúnicamentealasimilitudquepresentaconM. hyopneumoniae(KobischyFriis,1996). Estemicroorganismo,descritoporprimeravezporMeylingyFriis(1972),tomasunombre delcaracterísticocrecimientomicelarqueproduceenmediolíquido,dandolugaralaformación depequeñaspartículasoflóculos,quepuedenobservarseasimplevistaomásendetalle empleandomicroscopíaelectrónicaydecontrastedefase(Hovind‐HougenyFriis,1991). Ademásdelospulmones,lacavidadnasal(KobischyFriis,1996)yelsacoconjuntival (Friis,1970)representanlosprincipalesórganosdianadeM.flocculare.           CapítuloI‐Introducción  60  MétodosbasadosenelanálisisdeltamañodelasbandasdeADN.Estacategoría presentaasuvezdossubdivisiones: ‐ Análisisdebandasobtenidastrasdigestiónenzimática. ‐ AnálisisdebandasobtenidastrasamplificacióndelADN.  MétodosbasadosenelanálisisdesecuenciasdeADN.  Métodosbasadosenlahibridacióndesondasdeoligonucleótidosmarcadas. 1.2.3.2.1. MétodosbasadoseneltamañodelasbandasdeADNobtenidastrasdigestión enzimáticaoamplificación. Enestacategoríaseincluyelagranmayoríadelastécnicasdetipificaciónempleadashasta lafechaenelestudiodemicoplasmas,debidoprincipalmenteasufacilidadderealización,coste yreproducibilidadenlamayoríadeloscasos. ElanálisisdebandasdeADNrepresentaunaformasencilladeotorgarunperfilúnicoaun microorganismo. GraciasalagrandisponibilidadybajocostedelatécnicadePCR,losmétodosbasadosen estesistemapresentanunagranaceptación,siendolatécnicadeamplificaciónaleatoriadeADN polimórficooRAPD(Williamsetal.,1990)yelanálisisderepeticionesentándemdenúmero variableoVNTR(VanBelkumetal.,1997)losejemplosmásdestacados.           CapítuloI‐Introducción  61 Lasenzimasderestricciónsonendonucleasasaisladasdebacteriasyarqueobacterias capacesdeescindirfragmentosdeADNtrasreconocercombinacionesdenucleótidosespecíficas denominadossitiosderestricción(SmithyWilcox,1970,Roberts,2005).Aligualqueenelcaso delaPCR,estasenzimaspresentanunbajocosteyampliadisponibilidad. Entipificaciónbacteriana,estasenzimassehanutilizadoendiferentessistemas,tantopor sísolas,comoenelcasodelaelectroforesisengeldecampopulsadooPFGE(SchwartzyCantor, 1984)oenprocesosderestriccióncombinadosconlatécnicadePCR,comoenelcasodeel análisisdepolimorfismosenlalongituddefragmentosamplificadosdeADNoAFLP(Vosetal., 1995)yanálisisdepolimorfismosenlalongituddelosfragmentosderestricciónoRFLP(Frostet al.,1991;Linetal.,1991;Cousin‐Alleryetal.,2000;Dorigo‐Zetsmaetal.,2000). 1.2.3.2.1.1. MétodosbasadosenelanálisisdebandasobtenidasporlatécnicadelaPCR. 1.2.3.2.1.1.1. AmplificaciónaleatoriadeADNpolimórfico. Estatécnica,abreviadacomúnmentecomoRAPD(delinglésrandomamplified polymorphicDNA)oAP‐PCR(arbitrarilyprimedPCR),fuedescritaporprimeravezporWilliamsy colaboradores(1990)conelfindecaracterizarADNdeplantasyhumanos,siendo posteriormenteWelshyMcClellanden1990losquedemostraronporprimeravezsupotencial paralatipificacióndemicroorganismosaplicándolaalestudiodecepasdeestafilococosy estreptococos. LatécnicadeRAPDsebasaenelusodeunsolooligonucleótidooprimernoespecíficoy relativamentecorto(sobre10bases)queescapazdeunirsedeformaaleatoriaalADNsujetode           CapítuloI‐Introducción  62 estudio,elcualesposteriormenteamplificadoporPCR.Conelfindemejorarlacapacidadde unióndelprimeralADNmoldeseempleaunavariacióndelaPCRdenominadaPCRdebaja astringencia,enlaqueseusantemperaturasdealineaciónoannealingmásbajasdelonormal conelfindepotenciarlauniónalazardeloligonucleótidoalADNmolde.Estacaracterística permiteelusodeoligonucleótidosnoespecíficosquepuedenhibridarconvariasregionesdel ADNdianadandolugaraproductosdePCRdediferentestamañosdeformasencillayenunsolo paso. Esunatécnicarápidaysencillaquerequierepocoequipamientoyningúnanálisiso conocimientopreviodelassecuenciasdeADNaestudiar.Comocontrapartida,debidoalas característicasintrínsecasasociadasaestatécnica,presentaunabajareproducibilidadentre laboratoriosporloquesuusocomotécnicadetipificacióndereferenciaquedadescartada (Penneretal.,1993). Enloquerespectaasuusoenelestudiodemicoplasmasestatécnicahagozadodeuna ampliadifusiónhabiéndoseaplicadoconéxitoenelestudiodeM.hyopneumoniae(Artiushiny Minion,1996;Nathuesetal.,2011),M.bovis(Butleretal.,2001;McAuliffeetal.,2004;Pinhoet al.,2012),M.ovipneumoniae(Parhametal.,2006),M.cynos(Manneringetal.,2009),siendosu usoenelanálisisdecepasdemicoplasmasdeorigenaviardondeestatécnicahagozadodel mayoréxito,evidenciandounagranheterogeneidadenteaisladosyademásdedemostraruna posibletransmisiónhorizontalendeterminadoscasosdebrotesdeenfermedadenaves(Geary etal.,1994;Fanetal.,1995;Leyetal.,1997;Charltonetal.,1999;Pillaietal.,2003).           CapítuloI‐Introducción  63 Ademásdeenestudiosdeepidemiologíamolecular,RAPDtambiénhasidoempleada comounaherramientaindicativadelavirulenciadecepasdeM.hyopneumoniae, demostrándoselaasociaciónentrelapresenciadeunabandade5000paresbasesdepeso molecularycepasdemoderadaaaltavirulencia(Viccaetal.,2003). 1.2.3.2.1.1.2. Análisisderepeticionesentándemdenúmerovariable. Latécnicadeanálisisderepeticionesentándemdenúmerovariable,tambiénconocida comoVNTR(variablenumbertandemrepeat)oMLVA(multi‐locustandemrepeatanalysis) representaunadelastécnicasdetipificaciónbacterianamásextendidasanivelactual.Descrita inicialmenteporVanBelkumycolaboradores(1997ay1997b),hasidoaplicadaparala caracterizacióndemultituddeespeciesbacterianasdegranimportanciadesdeelpuntodevista veterinarioydelasaludpública,entrelosqueseencuentranStaphylococcusaureus(Sabatetal., 2003),Bacillusanthracis(Keimetal.,2000)yMycobacteriumtuberculosis,considerándose actualmentecomolatécnicadetipificacióndereferenciaglobalparaesteúltimomicroorganismo (Supplyetal.,2006). Elmotivodeléxitoactualdeestatécnicaresideenlarapidezyfacilidadderealización juntoconsureproducibilidadycosterelativo(Lindstedt,2005;VanBelkum,2006).Otrodesus grandesbeneficioshasidoeldesarrollodenumerosasbasesdedatosenlíneadelibreacceso quepermiteneldiseño,análisisdesistemasdetipificaciónbasadosenVNTRademásdepermitir larecopilaciónycomparacióndedatosdelaboratoriosdiferentesatravésdelusodeinternet (DenoeudyVergnaud,2004;Allix‐Béguecetal.,2008).           CapítuloI‐Introducción  64 Metodológicamente,latécnicadeVNTRsebasaenelanálisisdeltamañodefragmentos deADNcorrespondientesazonasrepetitivasencontradasenelgenomayamplificadosatravés delatécnicadePCR.Unavezamplificados,estosfragmentossepuedenanalizarpormediode gelesdeagarosaysecuenciacióncapilar,oporotrasaplicacionesmenoscomunescomoloschips deADNyespectrometríademasas(VanBelkumetal.,2006). Laprincipallimitacióndeestatécnicaeslanecesidaddeconocerlasecuenciacompletade ADNdelmicroorganismoaestudiar,porloquehastalafechasehaaplicadosolamenteaun reducidonúmerodeespeciesdemicoplasmas,siendoM.pneumoniae(Dégrangeetal.,2009),M. genitalium(Cazanaveetal.,2012),M.bovis(Pinhoetal.,2012),M.agalactiae(McAuliffeetal., 2008),M.mycoidessubesp.mycoidesSC(McAuliffeetal.,2007),M.hyopneumoniae(Vranckxet al.,2011)lasúnicasespeciescaracterizadashastalafechasgraciasaella.LatécnicadeVNTRha demostradotambiénsuaplicabilidadparaelestudiodecuadrosendémicosybrotesde enfermedaddeformaefectivagraciasasualtopoderdiscriminatorio(Pereyreetal.,2012). 1.2.3.2.1.2. Métodosbasadosenelanálisisdebandasobtenidastrasdigestión enzimática. 1.2.3.2.1.2.1. Electroforesisengeldecampopulsado. LaelectroforesisengeldecampopulsadooPFGE(pulsedfieldgelelectrophoresis)esla técnicadetipificaciónmásutilizadahastalafechaenelcampodelamicrobiologíabacteriana, siendoconsideradacomolatécnicadetipificacióndereferenciaestándar(Goering,2010).Su éxito,apesardesertécnicamentemáscomplejaqueotrascomoRAPDoVNTR,sedebeasugran           CapítuloI‐Introducción  65 reproducibilidadysobretodoalpapeldesarrolladoporPulseNet,laprimerabasededatosdedica alaestandarizaciónyrecopilacióndeperfilesdePFGE,disponiblegraciasaunainiciativade centrodecontrolyprevencióndeenfermedades(CDC)deAtlanta,Estadosunidos,desde1996 (Rangeletal.,2006). YaquenoesnecesarioconocerlasecuenciadeADNdelmicroorganismoaestudiaroel desarrolloalgunodeoligonucleótidosespecíficos,lacapacidaddeaplicarestatécnicasebasa simplementeenunaseriederequisitosdetipotécnico,queaunquedefácilrealizaciónrequieren unagranmanodeobraencomparaciónconotrastécnicasdetipificación.Básicamente,la bacteriaenestudioescultivadahastaalcanzarunaaltaconcentracióndeADN.Entonceslas célulasintactassonrecolectadaseincluidasenpequeñosbloquesdeagarosa,que posteriormenteseránsometidosaunprocesoderestricciónenzimáticaconelfindeescindirel genomadelmicroorganismoenmúltiplesfragmentosdeADNqueseránsometidosauna electroforesisconcambiosdevoltajeofase(electroforesisdecampopulsado)engeldeagarosa dandoalugaraperfilesespecíficosdeADN(Goering,2010). EnelcampodelamicoplasmologíalaPFGEsehaaplicadodeformageneralizadaalagran mayoríadeespeciespatógenas(vertabla1.5). Comounadesusprincipalesaplicacionesenmicoplasmasdestacaelestudiosde variabilidadaniveldeindividuo,dondesehapodidodemostrarcómocepaspuedenpersistir durantelargosperiodosenelmismoindividuoconcambiosmínimosoinexistentesensuperfil dePFGE(Jensenetal.,1998)oaniveldegranja,dondeaisladosobtenidosdentrodelmismo           CapítuloI‐Introducción  66 recintopresentanelmismoperfildeADNapesardegranvariabilidadintraespecíficapresenteen laespeciedeestudio(Kokotovicetal.,2002). EspecieEnzimasderestricciónusadasAñoReferencia M.agalactiaeSmaI,EclXI,BsiWI,MluI,BssHII,SalI,XhoI,NruI,ApaI1999Tolaetal. M.bovisSmaI,EclXI,BsiWI,MluI,BssHII,SalI,XhoI,NruI,ApaI1999Tolaetal. M.capricolumsubesp. capripneumoniae BglII,BamHI,EcoRI,HindIII,NheI,PstI,SmaIandXbaI2001Kusilukaetal. M.fermentansEcoRI,HindIIIyXbaI1998Schaeverbekeetal. M.gallisepticumSmaI2001Maroisetal.(a) M.hominisSmaI,BamHI,XhoI,SalI,ApaI1992 Ladefogedy Christiansen M.hyopneumoniaeApaI,SalI2005Stakenborgetal. M.hyosynoviaeBssHII2002Kokotovicetal. M.mycoidessubesp. capri AviII,BamHI,BlnI,BsiWI,KpnI,SmaI,MluI,SalI,NaeI, SphI,NcoI,StuI 2007Tardyetal. M.mycoides subesp.mycoidesSC BglII,BamHI,EcoRI,HindIII,NheI,PstI,SmaI,XbaI, ApaI,NaeI,SalI,Sau3AI,XhoI 2001Kusilukaetal. M.pneumoniaeApaI,AvaI,NciI,BglI,NaeI,SacII,SmaI,XhoIandSstII2000Cousin‐Alleryetal. M.synoviaeSmaI2001Maroisetal.(b)  Enloqueserefiereaestudiosdevariabilidadentreaislados,losresultadosobtenidos dependendelaespeciedemicoplasmaestudiado.Porejemplo,enelcasodeM.agalactiaeseha demostradounagranhomogeneidadentreaisladosrelacionadosestrechamente(Tolaetal., 1996;Solsonaetal.,1996),algoquehasidoconfirmadoigualmenteenelcasodeM.mycoides subesp.mycoidesSCyM.capricolumsubesp.capripneumoniae(Kusilukaetal.,2001)yM. hyopneumoniae(Stakenborgetal.,2005).Sinembargo,enelcasodeM.bovis(McAuliffeetal., 2004),aligualqueenM.hyosynoviae,sehademostradounagranvariabilidadintraespecie, Tabla1.5.UsodePFGEparalatipificacióndelasprincipalesespeciespatógenasdemicoplasmas           CapítuloI‐Introducción  67 demostrandolainfluenciadelaespecieydesuniveldeconservaciónenlosresultadosobtenidos atravésdePFGE. 1.2.3.2.1.2.2. Análisisdepolimorfismosenlalongituddefragmentosamplificadosde ADN. ElanálisisdepolimorfismosenlalongituddefragmentosamplificadosdeADNoAFLP (amplifiedfragmentlengthpolymorphism)esunatécnicadetipificacióndiseñadaen1995por Vosycolaboradoresysuponeunadelastécnicasdetipificaciónmásrobustasyconmayorpoder dediscriminacióndescritas.OtradelasventajasdeAFLPesquepuedeusarsesinconocimiento previodelassecuenciasdeADNaestudiar.Apesardeestosaspectospositivos,elgran inconvenientedesuelevadocosteylimitadadistribuciónanivelcientíficohacequesuaplicación alestudiodemicoplasmahayasidolimitadayactualmenteseaunatécnicaendesuso. Estatécnicacombinaelusodeenzimasderestriccióndecortefrecuenteycorteraroo infrecuenteconPCRespecíficaqueesaplicadaposteriormentealosfragmentosdeADN obtenidostrasdigestiónenzimática.LaPCRespecíficaesrealizadagraciasaunprocesopreviode ligacióndelosfragmentosdeADNobtenidospordigestiónconenzimasderestriccióna adaptadoresdeADNconsecuenciaconocida,frentealosquesehandiseñadooligonucleótidos específicos.UnavezamplificadoslosfragmentosdeADNobtenidosporrestricción,éstospueden serdetectadospordiferentestécnicas,siendolasecuenciacióncapilarelmétododepreferencia (MuelleryWolfenbarger,1999).           CapítuloI‐Introducción  68 AunquelatécnicadeAFLPsehaaplicadoconéxitoenM.hyopneumoniae(Kokotovicet al.,1999),M.bovis(Kusilukaetal.,2000;McAuliffeetal.,2004)yM.capricolumsubesp. capripneumoniae(Kokotovicetal.,2000),esenelestudiodelosmicoplasmasaviares,ymás particularmenteenelcasodeM.gallisepticum,dondeAFLPhademostradoserunaherramienta extremadamenteútil.Usandoestatécnicaparadeanalizarlaevolucióndelaepidemiainiciada porestemicroorganismoenEstadosUnidosen1994yapoyándoseenlosdatosobtenidospor tipificación,laAFLPayudóaconfirmarlateoríadeunorigenúnicodelaepidemiaylaposible introduccióndeunacepaepidémicaindependienteen2001,demostrandosuutilidaden estudiosdetipoepidemiológico(Cherryetal.,2006). 1.2.3.2.1.2.3. Análisisdepolimorfismosenlalongituddelosfragmentosderestricción trasPCR. Estatécnica,denominadacomúnmentecomoPCR‐RFLP(polimerasechainreaction‐ restrictionfragmentlengthpolymorphism)esunatécnicasencillaquecombinaunprocesoprevio deamplificaciónporPCRdeunasecuenciadeADNdianaseguidodeunareacciónenzimáticade restriccióndelADNamplificado.Debidoasunaturaleza,estatécnicapresentaunalimitada capacidaddiscriminatoria,yaquesólopodránllegaraestudiarseaquellasmutacionespresentes enelgendeestudio.Enmicoplasmas,laPCR‐RFLPsehausadoparadistinguirentrecepasdeM. pneumoniaetrasanálisisdelgenP1(Cousin‐Alleryetal.,2000)ocomoherramientaparala diferenciacióndecepasaustralianasyafricanasdeM.mycoidessubesp.mycoidesSCgraciasa unamutaciónmutualdeunsolonucleótidoenelgenbgl(VileiyFrey,2004).           CapítuloI‐Introducción  69 1.2.3.2.2. MétodosbasadosenanálisisdesecuenciasdeADN 1.2.3.2.2.1. Análisisdesecuenciasdegenessencillos Enelanálisisdegenessencillos,dondelainformaciónobtenidaselimitaalanálisisdeun únicogen,presentaciertaslimitacionesdesdeelpuntodevistadelatipificaciónmolecular debidoprincipalmentealalimitadainformaciónpresenteenlasecuenciadeunsologenenlo querespectaavariabilidadintraespecífica. Sinembargoestalimitaciónenelcampodelatipificaciónsetornaenventajaalaplicarse aláreadelataxonomíabacteria,dondelasecuenciacióndegenesúnicos,ymásenparticularen elcasodelgenARNr16S,suponelaprincipalbasedelaclasificaciónbiológicaactualcompuesta portresdominiosyestablecidaporWoeseycolaboradoresen1990.Ademásestegensupone unadelasprincipalesherramientasusadasenlaclasificacióntaxonómicademicoplasmas descritashastalafecha(Johanssonetal.,1998) Aunasí,variostrabajoshandemostradolaaplicabilidaddeestatécnicaalatipificaciónde micoplasmas.Porejemplo,elanálisisdelnúmeroderepeticionesdelaminoácidoserina presentesensecuenciasdelgenp146sehausadosatisfactoriamenteparaelanálisisdecepasde M.hyopneumoniae,ayudandoademostrarlapresenciadecepasespecíficasoclones responsablesdebroteslocalesdeNEP(Mayoretal.,2007).             CapítuloII–Análisisdevariabilidadgenéticayproteica  76 Conestosantecedentesdecidimosenfocaresteprimercapítuloeneldesarrolloyanálisis delusopotencialdediferentestiposdetécnicasdetipificaciónaplicadasalanálisisdeM. hyorhinis,ademásdeevaluarlavariabilidadantigénicadeestemicroorganismopormediodela técnicadeWesternblotting. 2.2. Materialesymétodos 2.2.1. Aislados Todoslosaisladosanalizadosconcadaunadelastécnicasdesarrolladasenestecapítulo seencuentranrepresentadosenelanexo2.1deestatesis. 2.2.2. Westernblotting 2.2.2.1. Obtenciónycuantificacióndeantígenos Lascepasdescritasenelanexo2.1fueroncultivadasenmediodeFriis(anexo2.2)a37°C envolúmenesde40ml.Unavezalcanzadalafaselogarítmicadecrecimiento,loscultivosfueron centrifugadosa8000rpmdurante30minutos.Elpelletcelularobtenidofueentoncestransferido atubosdeplásticode2mldevolumentotalylavadosportriplicadoenPBSestéril0.1MpH7.4 (anexo2.3),estavezusandovelocidaddecentrifugaciónde14.000rpm.Todoelprocesode lavadoyrecoleccióndecélulasserealizóa4°C. Traselúltimolavado,lascélulasrecolectadasfueronresuspendidasenPBSestéril0.1M pH7.4usando1/200delvolumeninicialdecultivo.Enestepuntosetomó30µldelasuspensión quefueronreservadosparaposteriorcuantificacióndelaconcentraciónproteica.           CapítuloII–Análisisdevariabilidadgenéticayproteica  77 Lascélulasrecolectadasseconservarona‐80°Chastalapreparacióndelantígenopara electroforesis. Laestimacióndelaconcentraciónproteicaserealizóusandounkitcomercialbasadoel métododelácidobicinconínicoysiguiendolasinstruccionesdelfabricante(BCAprotein estimationkit‐Pierce). 2.2.2.2. Preparacióndegeles,muestrasySDSPAGE Paranuestrotrabajoempleamosgelesdeacrilamidaal10%loscualesseprepararon usandoelsistemadeelectroforesisPROTEAN®IIxiCell(Bio‐Rad),siguiendolasinstruccionesdel fabricante.Enlatabla2.1seexponenlosvolúmenesdereactivosutilizadosparaprepararlos gelesde15x15centímetrosconseparadoresde1.5mmempleadosennuestrotrabajo. Unavezpreparadoelgelderesoluciónal10%,éstesedejósolidificarparaprocederala adicióndegeldecargaal4%alqueseleinsertóunpeinede15pocillos(5mm/pocillo)antesde quesolidificarayevitandolaformacióndeburbujas.  ReactivosGelderesolución Geldecarga 1geles 2geles2geles 10 %10%4 % Acrilamida30%16.6ml 33.2ml5.2ml AguaHPLC20.2ml 40.4ml24.4ml 1.5MTris‐HClpH8.812.5ml 25ml ‐ 0.5MTris‐HClpH6.8 ‐ ‐ 10ml SDS10%500  l1ml200  l APS10%250  l500l200  l TEMED50  l100l20  l Tabla2.1.Volumendereactivosusadosparalapreparacióndegelesdeacrilamida           CapítuloII–Análisisdevariabilidadgenéticayproteica  78 Trascalcularlaconcentracióndeproteínasencadaunadelasmuestras,éstasseajustaron aunaconcentraciónde2.5µgporµlempleandoPBSestéril0.1MpH7.4.Conelfindepreparar lasmuestrasparaelectroforesissecombinóuntotalde10µldemuestra(25µgdeproteína total)con10µldebúferdeLaemmli(Sigma‐Aldrich).Unavezcombinadosamboscomponentes, lasmuestrassecolocaronenaguahirviendodurante10minutosparadespuésconservarseen hielohastasuusoposterioruso. Unavezsolidificadoslosgelesseprocedióacargarunvolumentotalde20µldemuestra porcadapocillo,incluyendounmarcadordepesomolecularporgel(PrecisionPlusProtein™Dual ColorStandards,Bio‐Rad)conelfindecompararlospesosmolecularesaparentesdelos determinantesproteicosobservados. Conelfindesepararlasproteínas,losgelessesometieronaunprocesodeelectroforesis utilizandounvoltajeconstantede75vdurante14horasenbúferdeelectroforesis(veranexo 2.3).Unavezfinalizadalaelectroforesisseprocedióalprocesodetransferenciaymarcajede antígenosoWesternblotting. 2.2.2.3. Westernblotting Enprimerlugarseprocedióatransferirlasproteínasseparadasennuestrosgelesde poliacrilamidaaunamembranadenitrocelulosa(Bio‐Rad).Conestefinseempaparonlos papelessecantes(Bio‐Rad)juntoconelgeldurante10minutosenbúferdetransferencia(ver anexo2.3).Trasestepasoseincorporólamembranaalbúferyseesperóotros10minutos.           CapítuloII–Análisisdevariabilidadgenéticayproteica  79 Acontinuaciónseprocedióalatransferenciaelectroforéticao“blotting”trasprepararun sándwichformadopordospapelessecantesconteniendoelgelylamembranaensuinteriorel cualsesometióaunacorrientecontinuade15Vdurante30minutos.Elblottingserealizó empleandounsistemadetransferenciasemiseco(WolfLaboratoriesLimited). Unavezfinalizado,selavólamembranadenitrocelulosaconaguadestiladaysemarcó posteriormentecontincióndePonceauS(veranexo2.3)conelfindeconfirmarelprocesode transferencia.Unavezdemostradalacorrectatransferenciadelasproteínasalamembranase retirólatincióndePonceautrasvarioslavadosconPBSestéril0.1MpH7.4enexcesohasta eliminarporcompletocualquierindiciodetinción.Loslugaresdeunióninespecíficapresenteen lamembranasebloquearonconsolucióndebloqueo(veranexo2.3)a4°Cdurante16horascon elfindeevitarinmunomarcajeinespecíficoenlamembrana. Traselprocesodebloqueo,lamembranaselavótresvecesconPBST(veranexo2.3)yuna vezconPBS.Cadalavadoduró10minutos.Trasestepaso,lasmembranasseconservarona temperaturaambienteenunlugarfrescoysecohastasuusoporunmáximodetresmeses. Paraelprocesodemarcajeseañadiócomoanticuerpoprimariounantisueroproducido enconejoapartirdelacepadereferenciadeM.hyorhinisBTS‐7(RAS173‐2000,AHVLA Weybridge)usadoaunadiluciónde1/1000enbúferdedilución(veranexo2.3)yenunvolumen finalde20ml,loscuálesseincubaronconlamembranadurante2horasa37°Cyconagitación continua.           CapítuloII–Análisisdevariabilidadgenéticayproteica  80 Unavezfinalizadalaincubación,lasmembranasselavaroncomosedescribió anteriormente,paraacontinuaciónañadirelanticuerpoconjugadoconperoxidasa(Recombinant ProteinG,Pierce)aunadiluciónde1/1000enbúferdedilución(volumenfinal:20ml).Tras añadirelanticuerposecundariolamembranaseincubódurante2horasa37°Cyenagitación continua. Unavezterminadalaincubaciónconelanticuerposecundariosevolvióarepetirel procesodelavadoparaacontinuaciónrevelarlamembranatrasañadirlasolucióndesubstrato enzimático(4CN4‐cloro1‐naftol,Pierce),lacualseincubóenagitaciónconstanteatemperatura ambientehastaqueseobservóelcambiodecolordeseado(de5a30minutos).Unavez revelada,lareacciónsefinalizóañadiendoaguadestilada. 2.2.3. RandomAmplifiedPolymorphicDNA(RAPD) ElADNempleadoenesteexperimentoseextrajoapartirde1mldecultivodeM. hyorhinisenfaseestacionariausandoelkitdeextraccióndeADNgenómicoGenelutegenomic DNAkit(Sigma‐Aldrich)siguiendolainstruccionesdelfabricante.UnavezextraídoelADNfue cuantificadoporespectrofotometríausandoelsistemaNanodrop1000(ThermoFisher Scientific),paraposteriormenteconservarloa‐20°Chastasuposterioruso. LareaccióndeRAPDsebasóenlametodologíadescritaanteriormenteporArtiushiny Minionen1996,usandounúnicooligonucleótidoindividual(OPB‐105’‐GTCCACACGG‐3’).El procesodeamplificaciónserealizóenunvolumenfinaldereacciónde50µl.Losprincipales componentesdelareaccióndeRAPDseencuentranrecogidosenlatabla2.2.           CapítuloII–Análisisdevariabilidadgenéticayproteica  81 Unavezcombinadoslosreactivosseañadióun1µldeADNpormuestraconuna concentracióndeentre75y100ng. LareaccionesdeRAPDsellevaronacaboenuntermocicladoriCicler(Bio‐Rad)e incluyeronunprocesodedesnaturalizacióninicialde5minutosa94°C,seguidosde40ciclos divididosen94°Cdurante15segundos,37°Cdurante60segundosy72°Cdurante90segundos. Lasreaccionesseterminaronconunúltimociclode7mina72°C.  Reactivo Concentraciónen reacción Volumen(µl)Identificación/fabricante Agua‐ 36.5‐ Búferdereacción10x1X5 Goldbúfer(Applied Biosystems) MgCl21.5nM3AppliedBiosystems Desoxiribonucleótidos trifosfato(dNTPs) 400µM2Promega Oligonucleótido400nM2OPB‐10(ArtiushinyMinion, 1996) Taqpolimerasa2.5unidades0.5AmpliTaqGold(Applied Biosystems) Tabla2.2.VolúmenesdereactivosempleadosporreaccióndeRAPD Losproductosobtenidosunavezfinalizadaslasreaccionessedetectarontrasser sometidosaunprocesodeelectroforesisengelesdeagarosaal2%(Promega)de10cmbajouna corrienteconstantede90Vdurante1.5horasenbúferdeelectroforesis(TBE1X,veranexo2.4).           CapítuloII–Análisisdevariabilidadgenéticayproteica  82 Cadagelincluyódospocilloscargadosconunpatróndepesomolecular(Amplisize50–2000bp, Bio‐Rad)encadaextremodelgelconelfindecompararlosperfilesdebandasobtenidostrasla electroforesisyfacilitarelanálisisfilogenético. Traslaelectroforesis,losgelessetiñeronenunasolucióndebromurodeetidio(Sigma‐ Aldrich)aunaconcentraciónde0.5µg/ml.Unavezteñidosseretiróelexcesodetincióncon aguadestiladayseprocedióavisualizaciónbajoiluminaciónultravioletaconelfindeobservar losperfilesdebandas,loscualesfuerongrabadosenformatojpegusandounsistemadecaptura deimágenesdigital(Syngene). LosperfilesdebandasobtenidastrasRAPDseanalizaronempleandoelsoftware bioinformáticodeanálisisdedatosdetipificaciónBioNumericsversión4.5(AppliedMaths, Bélgica).Lasimilitudentrelosperfilesdecepasdiferentesfuecalculadousandoelcoeficientede Dice(1945)conunatoleranciayoptimizacióndel0.5%paraambosparámetros.Laconstrucción dedendrogramassebasóenelusodelmétododeparesnoponderadosutilizandomedia aritméticaoUPGMA(unweightedpairgroupmethodusingarithmeticmeans). 2.2.4. Pulsedfieldgelelectrophoresis(PFGE) 2.2.4.1. Cultivodelascepasyobtencióndelascélulas LascepasdeM.hyorhinissecultivaronenvolúmenesde40mldecultivohastaalcanzarla faseestacionaria.           CapítuloII–Análisisdevariabilidadgenéticayproteica  83 Unavezalcanzadalaconcentracióncelulardeseadaseprocedióarecolectarlascélulas porcentrifugación,lacualserealizóa8000rpmdurante30minutos.Traselprimerpasode centrifugaciónlascélulasselavaronen10mldePBS+glucosa(veranexo2.5)conelfinde maximizarlacantidaddecélulasintactasalfinaldeprocesoderecolección.Estepasodelavado serepitiótresvecesparafinalmenteresuspenderlascélulasen250µldePBS+glucosa.Todoel procesodeobtencióndecélulasserealizóa4°C. 2.2.4.2. Preparacióndelosdadosdeagarosa Unavezobtenidaslascélulas,éstasseinmovilizaronendadosdeagarosaultrapurade bajopuntodefusión(Bio‐Rad)conelfinpreservarlascélulasyfacilitarelprocesodedigestión enzimática. Losdadosseprepararonapartirdeunasolucióndeagarosaal2%preparadatrasla adiciónde0.2gdeagarosaen10mldeaguabidestilada.Unavezpreparadalasoluciónse calentóenelmicroondashastadisolverlaagarosaporcompletoparaposteriormente conservarlaa45°Cenunbañohastaequilibrarlatemperaturadelamismaparasuposterioruso. AcontinuaciónseprepararondosdilucionesdecélulasenPBS+glucosaenlas proporciones1/5y1/10paraacontinuaciónprocederalapreparacióndelosdadosdeagarosa. Enprimerlugarseprepararontrestubosdeplásticode600µldevolumenfinaldondese distribuyeron60µldecadaunadelasdilucionespreparadasanteriormentejuntoconlasolución inicialnodiluida.Estastresdilucionesseprepararonconelfindeevaluarlaconcentraciónideal decélulasparaelprocesodedigestiónenzimáticayposteriorvisualizacióndelosperfilesde           CapítuloII–Análisisdevariabilidadgenéticayproteica  84 bandastraslaelectroforesisengeldecampopulsante.Unavezdistribuidaslascélulasse tomaron60µldesolucióndeagarosalacualsemezclósuavementeconlasuspensióncelular evitandoformarburbujasdeaire. Paraformarlosdadosseañadiócuidadosamente100µldelasoluciónconteniendolas célulasylaagarosaenmoldesdedadosreutilizablesde5mmx5mm(Bio‐Rad).Losdadosse mantuvieronatemperaturaambientedurante30minparaposteriormentetrasladarlosa4°C conelfindeobtenerlasolidificacióntotaldelosmismos. 2.2.4.3. Lisiscelularydigestiónproteica Enprimerlugarsellevóacabolalisiscelularydigestiónproteicaconelfindeexponerel ADNdeM.hyorhinisalaenzimaderestricciónyeliminarcualquierproteínaquepudiera interferirconelprocesodedigestiónenzimáticayelectroforesis. Conestefinseprepararontantostubosdeplásticode2mlcomodadosdeagarosafueron obtenidosenelpasoanterior.Estostubosseidentificaronconlacepaydilucióncorrespondiente paraposteriormenteañadir0.5mldebúferdelisis(veranexo2.5)acadauno.Acontinuaciónse añadieronlosdadosdeagarosadentrodelostubosasegurandoelcontactoconelbúferdelisisy secolocaronenunagradillaalbañomaríaa45°Cdurante24horas. Traselprocesodelisisydigestiónselavaronlosdadosconelfindeeliminarelexcesode búferdelisisyproteinasaK.Paraelloseañadieron2mldebúferTE1X(Sigma‐Aldrich)quese dejaronreposarconlosdadosdurante20minutosantesdeserretirados.Esteprocesoserepitió           CapítuloII–Análisisdevariabilidadgenéticayproteica  85 tresveces.Unavezterminadosloslavadosseañadió1mldeTE1Xyseconservarona4°Chasta suposteriorusoyporunmáximode6meses. 2.2.4.4. Digestiónenzimática Enprimerlugarsecortaron3mmdeagarosadecadaunodelosdadosysecolocaronen 200µldeTE0.1Xparaposteriormenteserincubadosatemperaturaambientedurante30min. Acontinuaciónseprepararonlasreaccionesdedigestiónenzimáticasiguiendolas instruccionesdelfabricanteyutilizando40unidadesdecadaunadelasenzimasderestricción evaluadasporreacción.Todaslasenzimasderestricción,susrespectivosbúferesderestriccióny laalbúminaséricabovinausadaenlasreaccionesdedigestiónenzimáticaparaPFGEse obtuvierondeNewEnglandBiolabs.Conelfindeconocerlaenzimaderestricciónidealse evaluaronlassiguientesenzimas:ApaI,SalI,SmaI,BamHI,SacI,KpnI,XhoI,SacIIyNheIHF.Las reaccionesdedigestiónenzimáticaseprepararondelasiguienteforma:  Volumenfinalpormuestra–200µl: o Aguabidestilada:    176l o 10xBúfer1‐4*(NewEnglandBiolabs): 20l o 100xalbúminaséricabovina(NewEnglandBiolabs): 2l o Enzimaderestricción(20U/l)**(NewEnglandBiolabs): 2l *dependiendodelaenzimaautilizar **añadirtrasequilibradoconbúfer           CapítuloII–Análisisdevariabilidadgenéticayproteica  92 IdentificaciónSecuencia5’‐3’Tamañoenbp LocalizaciónM.hyorhinisHUB‐1 MHR‐TR1‐FTGACTTGTTTTCCTGTAGC268pb456600–457150 MHR_0358–proteínahipotética MHR‐TR1‐RCTAACAAGTGCTTCTATGCC MHR‐TR2‐FGAATACGATTAGTTTGTAC436pb58100–58700 MHR_0044–reguladordetranscripción MHR‐TR2‐RATAACCGTGGTTTTAAGGC MHR‐TR3‐FGAACAACCACTGGAACTGGC371pb433700–434300 MHR_0337–vlpD MHR‐TR3‐RGTATCTATATTTTAGACAC MHR‐TR4‐FTCTGGAACAACAACAGGTG785pb442700–443500 MHR_0349–vlpC MHR‐TR4‐RGTGGCAGTAGCCATAGC MHR‐TR5‐FGCAAATGGTTCAGGAAACG452pb434600–435100 MHR_0338–vlpE MHR‐TR5‐RCAGTCTGTTTTATATGAC MHR‐TR6‐FGCTCTTACATTGTGTCC205pb815100–815400 MHR_0660–proteínaputativasincaracterizar MHR‐TR6‐RCGGTTGTAGTTAATCCGC MHR‐TR7‐FCACCAACTGAAGTATATGC244pb690300–690600 MHR_0561–proteasaLadependientedeATP MHR‐TR7‐RGAATTTATAATCAGAAGC MHR‐TR8‐FGAATAATAATAACCTTCAG253pb478700–478950 MHR_0370–transportadorputativoABC MHR‐TR8‐RCTTTTGTTATTACAGTTGC MHR‐TR9‐FCACACCTAGAAAAGCAGC210pb 182500–182850 MHR_0149–sistemadetransporte multidrogasABC MHR‐TR9‐RGCACAACGTTTTGAACAAGC MHR‐TR10‐FCACCACATAATTACGAGAC285pb82100–82500 MHR_0061–lipoproteínasincaracterizar MHR‐TR10‐RGGTGAAAGAGCTAATGTTGC MHR‐TR11‐FTTTAATAATGTCTTCTCAGTC369pb384000–384300 MHR_0298–proteínahipotética MHR‐TR11‐RGTTGATCCCAAACTTGCTTCAC MHR‐TR12‐FTTAAGAAAAGGGTATCACCTC209pb48000–48300 MHR_0040–transportadorABC MHR‐TR12‐RATTCAAGTTATAAATTCTGGA MHR‐TR13‐FCTTTACATTAATTCTCCTTTGTG201pb322600–322900 MHR_0251–proteínaputativasincaracterizar MHR‐TR13‐RGACAAAGATACAATAGCAGATGATC MHR‐TR14‐FTGTAACTTGTCCTCTAACTGGG323pb487422to487861 MHR_0683–proteínaribosómica50SL36 MHR‐TR14‐RACAAGGATTAATGAAATATGGC MHR‐TR15‐FATAATTGCCATCGCAACTGC392pb 573100–573500 MHR_0466–sistemadetransportede espermidina MHR‐TR15‐RAACATGACTAGAATCCTTGAC MHR‐TR16‐FGAAGAGGTAATGACGACTCC438pb587500–588000 MHR_0479–proteínaribosómica50SL27 MHR‐TR16‐RATTGCTTCACTTTCTTCAGC MHR‐TR17‐FTGTTCATTTGCTTGGGTTGG 343pb 640672–641159 MHR_0523–proteínahipotética MHR_0524–posibleGTPasa,posiblefactorde translación MHR‐TR17‐RTCGCCATATGTAATTACATC MHR‐TR18‐FAAAGGAGATGATTTACACAGTG242pb675400–675850 MHR_0551–proteínahipotética MHR‐TR18‐RGTATCTGTATAGTGTTCTAAGG MHR‐TR19‐FCTAAAGCAAAGTCATCGTG237pb751950–752300 MHR_0610–chaperoninahipotéticade33kDa MHR‐TR19‐RTATCTGATTTTACACAAGTAGC MHR‐TR20‐FCTTGAAGAACTAAGATAATGTG 273pb 826400–826800 MHR_0669–proteínahipotética MHR_0670–proteínahipotética MHR‐TR20‐RTGGTTGAGAAAGATAATTCAC Tabla2.3.CaracterísticasdelosoligonucleótidosseleccionadosparaelanálisisdeVNTR           CapítuloII–Análisisdevariabilidadgenéticayproteica  93 Todoslosoligonucleótidossediseñaronconunatemperaturadealineamientocercanaa los58°CconelfindeestandarizarlasreaccionesdePCR.Latemperaturadealineamientoideal secomprobótrasunaPCRcongradientedetemperaturasdealineamiento.EstaPCRdemostró que58°Cfuelatemperaturaidealenestepaso,porloqueseempleóentodoslosprocesosde amplificacióndeVNTR. 2.2.6.3. ReaccionesdePCR,electroforesisyanálisisdedatos Lassecuenciasrepetitivasseleccionadasseamplificaronusandolosoligonucleótidos descritosanteriormente.LacomposicióndecadareaccióndePCRseencuentrarecogidaenla tabla2.4. Reactivo Concentraciónen reacción Volumen(µl)Identificación/fabricante Agua‐ 35.75‐ 5XGreenGoTaqbúfer1X10Promega Desoxiribonucleótidos trifosfato(dNTPs) 0.2mMcadauno1Promega OligonucleótidoF200Nm1Sigma‐Aldrich OligonucleótidoR200nM1Sigma‐Aldrich Taqpolimerasa1.25unidades0.25GoTaq(Promega) ADN‐ 1‐ Tabla2.4.VolúmenesdereactivosempleadosporreaccióndeVNTR           CapítuloII–Análisisdevariabilidadgenéticayproteica  94 LascondicionesdelareaccióndePCRincluyeronunciclodedesnaturalizacióninicialde5 minutosa95°Cseguidode35ciclosdivididosentrespasos:desnaturalizacióna95°Cdurante45 s,alineamientoa58°Cdurante30syextensióna72°Cdurante30s.Parafinalizarserealizóun pasodeextensiónfinalde5minutosa72°C.Todaslasreaccionessellevaronacaboenun termocicladoriCicler(Bio‐Rad). LaamplificacióndelVNTResperadosecomprobótrassepararlosproductosdePCRen gelesdeagarosade27cmdelongitudyconunaconcentraciónde2.5%duranteunprocesode electroforesisde2.5haunvoltajeconstantede75v.Acontinuaciónsetiñeronlosgelesen bromurodeetidio(Sigma‐Aldrich)aunaconcentraciónde0.5µg/ml.Trasteñirseseretiróel excesodebromurodeetidioconaguadestiladayseobtuvounaimagendelosperfilesdebandas enformatojpegempleandounsistemadecapturadeimágenesdigital(Syngene)trasiluminación ultravioleta. CadaVNTRseanalizóporseparadootorgándoseacadabandadeADNobservadaenlos gelesunnúmerodeidentificacióndependiendodelpesomoleculardelamisma.Lacombinación deindentificadoresindividualesprodujounidentificadorúnicodenominadotipodeVNTR(VT). Unavezobtenidoslosdiferentesindicadoresnuméricos,yconelfindeevaluarlasposibles relacionesevolutivasentretipoddeVNTR(VTs),seprocedióalanálisisgráficodelosmismos mediantelacreacióndeunárbolrecubridormínimooMST(delinglésminimumspanningtree) obtenidoatravésdelusodelalgoritmomatemáticogoeBURST(Franciscoetal.,2009).Este algoritmofueimplementadograciasalsoftwarebioinformáticoPhyloviz(Franciscoetal.,2012).           CapítuloII–Análisisdevariabilidadgenéticayproteica  95 2.2.7. Análisisestadístico ElíndicedediversidaddeSimpson(IDS),empleadoparacalcularlacapacidad discriminatoriadetécnicasdetipificación,secalculódeacuerdoalametodologíadescritapor HunteryGaston(1988)paraelíndicedediversidadyladescritaporGrundmannycolaboradores (2001)paraelcálculodeintervalosdeconfianza(IC)delmismo.ElIDS,quepuedepresentar valoresentre0(mínimadiversidad)y1(máximadiversidad),determinalaprobabilidaddeque dosaisladosmuestreadosalazarenunapoblaciónpertenezcanadosgruposdiferentes, proporcionandoporlotantounindicadordelacapacidaddediscriminacióndecualquiertécnica detipificación.Estevalorindicaporejemploqueenunsistemadetipificaciónmolecularconun IDSde0.91,dosmuestrasseleccionadasdeformaarbitrariaenunapoblaciónbacterianatienen un91%deposibilidadesdeperteneceragruposdiferentesalseranalizadosconlatécnicade caracterizaciónmolecularcorrespondiente. Losintervalosdeconfianzaentretécnicasdetipificaciónmolecularjuntoconelnivel cuantitativodecongruenciaentretécnicassecalculósiguiendolametodologíadescritapor Severianoycolaboradores(2011)empleandoelcoeficienteajustadodeWallaceconelfinde cuantificarelnivelderelaciónentremétodoseindicarlaposibilidaddequedosaislados clasificadosenundeterminadoclusterporunatécnicadetipificacióndeterminadapertenezcan almismoalclusteralusarunatécnicadetipificacióndiferente.           CapítuloII–Análisisdevariabilidadgenéticayproteica  96 2.3. Resultados 2.3.1. Westernblotting LosresultadosdeWesternblottingincluyendolas41cepasanalizadasporestatécnicase puedenobservarenlasfiguras2.2,2.3y2.4. LosperfilesdeWesternblottingdemostraronunagranhomogeneidadentrelosaislados. Dentrodelosprincipalescomponentesantigénicoscabedestacardosproteínasde aproximadamente75kDa,60kDay49kDadepesomolecularaparente,quesepresentaronde formainvariableentodoslosaisladosanalizadosconuninmunomarcajebastanteevidente, presentandolimitadavariabilidadenintensidad. Ademásdeestasdosproteínas,otroepítopobastanteconservadoselocalizóenelárea correspondientealos23kDadepesomolecularaparente,aunquelavariabilidadenlaintensidad delareacciónfrenteaestaproteínaesbastantemenorquelaobservadaenloscasosanteriores. Laprincipaláreadevariabilidadobservadacorrespondióalaregióncomprendidaentre40 y46kDadepesomolecularaparente.Dentrodeestaáreasepudierondiferenciar4diferentes tiposdeperfilesdebandas,cadaunodeellosformadosporentre4y2proteínasintensamente marcadas.Enlafigura2.1sepuedeobservarladistribucióndecadaunodeestostiposenlas cepasestudiadas.             CapítuloII–Análisisdevariabilidadgenéticayproteica  97        Figura2.1.TiposdeWesternblottingydistribuciónpororigen Siguiendoestaclasificaciónsepudoobservarcómolamayoríadelascepasanalizadasse localizaroneneltipodeWesternblottingnúmero2(56.1%deltotaldecepas).Lamayoríadelas cepasconorigenenlasIslasCanarias(66.7%‐12de18)yenlaEspañapeninsular(72.7%‐8de 11)seagruparondentrodeestetipodeWesternblotting,incluyendoademásunapequeña proporcióndecepasdelReinoUnido(27.3%‐3de11). ElsegundogrupoenvolumendeaisladoscorrespondealtipodeWesternblotting1(36.6 %deltotaldecepasanalizadas).Estegrupo,ademásdeconteneralamayoríadelascepasde ReinoUnido(54.5%‐6de11),incluyealacepadereferenciaBTS‐7yacasiunterciodelas cepasrepresentativasdelasIslasCanarias(27.8%)ylaEspañapeninsular(27.3%).Ademásde estosdostiposdeWesternblottingmayoritariosdestacalapresenciadedosgruposatípicos caracterizadosporlafaltadeinmunomarcajeenlasproteínasdemayorpesomoleculardentro Tipode inmunoblotOrigenAislados portipo Porcentaje de aislados portipo Porcentaje de aislados pororigen 1 Cepadereferencia12,4%100,0% España 37,3% 27,3% IslasCanarias512,2%27,8% ReinoUnido614,6% 54,5%  Totalperfil1 1536,6% 2 España 819,5% 72,7% IslasCanarias1229,3%66,7% ReinoUnido37,3% 27,3%  Totalperfil2 2356,1% 3IslasCanarias12,4% 5,6% ReinoUnido12,4%9,1%  Totalperfil3 24,9% 4ReinoUnido12,4% 9,1%  Totalperfil4 12,4% Númerototalde aislados41100,0%            CapítuloII–Análisisdevariabilidadgenéticayproteica  98 deestegrupoycercanasalos47kDadepesomolecularaparente.Eltipo3deWesternblotting incluyesólodosrepresentantesconorigenenelReinoUnidoeIslasCanarias.Eltipo4de Westernblottingincluyesolamenteunrepresentante(cepa80p04),conorigenenelReino Unido.Losperfilesasignadosacadaunadelascepasseencuentranrepresentadosacontinuación enlatabla2.5. IdentificaciónOrigenTipoIdentificaciónOrigenTipo BTS‐7Cepadereferencia1Rmr16España1 GC37IslasCanarias1Rmr7España2 DIslasCanarias1Rmr12España2 36IslasCanarias1Rmr17España2 65IslasCanarias1Rmr19España2 8B1IslasCanarias1Rmr8España2 22IslasCanarias2Rmr15España2 25IslasCanarias2Rmr21España2 54IslasCanarias2Rmr9España2 62IslasCanarias264p04ReinoUnido1 UIslasCanarias261p07ReinoUnido1 8IslasCanarias210p04ReinoUnido1 46IslasCanarias235p06ReinoUnido1 GC91IslasCanarias267p07ReinoUnido1 76IslasCanarias257p05ReinoUnido1 4IslasCanarias2112p03ReinoUnido2 PIslasCanarias258p04ReinoUnido2 ZIslasCanarias235p07ReinoUnido2 Ove1IslasCanarias390p03ReinoUnido3 Rmr14España180p04ReinoUnido4 Rmr3España1   Tabla2.5.ClasificacióndelosaisladosanalizadosporlatécnicadeWesternblottingbasadaenladiferenciasobservadas enlaregiónvariablede40a46kDa.              CapítuloII–Análisisdevariabilidadgenéticayproteica  99   Figura2.2.MembranainmunomarcadarepresentandoalgeldeSDSPAGEnúmero1           CapítuloII–Análisisdevariabilidadgenéticayproteica  100                              Figura2.3.MembranainmunomarcadarepresentandoalgeldeSDSPAGEnúmero2           CapítuloII–Análisisdevariabilidadgenéticayproteica  101                         2.3.2. RAPD ElanálisisdeRAPDrealizadoconelcebadorOPB‐10produjo27perfilesdiferentesenun totalde41cepasanalizadas.Elnúmerodebandasporperfilvarióentre3y9bandasconunpeso Figura2.4.MembranainmunomarcadarepresentandoalgeldeSDSPAGEnúmero3           CapítuloII–Análisisdevariabilidadgenéticayproteica  108 Tabla2.7.Distribucióndepulsotipospororigengeográfico PulsotipoOrigenPorcentajeenrelaciónal origen Porcentajetotalde aislados ARU,ESP,IC RUESP IC 57.5%(23/40) 90.9% (10/11) 40% (4/10) 50% (9/18) A1RU,ESP,IC RUESP IC 47.5%(19/40) 90.9% (10/11) 40 % (4/10) 27.8 % (5/18) A1aRU,ESP,IC RUESP IC 42.5%(17/40) 72.7% (8/11) 40 % (4/10) 27.8 % (5/18) A1a1RU,ESP,IC RUESPIC 27.5%(11/40) 72.7% (8/11) 20 % (2/10) 5.5 % (1/18) A1a1aRU,ICRU IC 17.5%(7/40) 54.5%(6/11)5.5%(1/18) A1a1bRU,ESP RU ESP 10%(4/40) 18.2%(2/11)20 % (2/10) A1a2ESP,ICESPIC15%(6/40) 20%(2/10)22.2%(4/18) A1bRURU 5%(2/40) 18.2 %(2/11) A2IC IC10%(4/40) 22.2%(4/18) BESP,IC,REF ESP IC REF 37.5%(15/40) 50% (5/10) 50 % (9/18) 100 % (1/1) B1ESP,IC,REF ESP IC REF 17.5%(7/40) 50% (5/10) 5.5 % (1/18) 100 % (1/1) B2ICIC 20%(8/40) 44.4 %(8/18) CRURU 2.5%(1/40) 9.1 %(1/11) DESPESP 2.5%(1/40) 10 %(1/10)           CapítuloII–Análisisdevariabilidadgenéticayproteica  109                           Figura2.7.Distribucióndepulsotipospororigengeográfico           CapítuloII–Análisisdevariabilidadgenéticayproteica  110 2.3.4. Southernblotting–IS1221 2.3.4.1. Producciónyevaluacióndesondamarcada ElproductodePCRobtenidoconlosoligonucleótidosIS1221‐F‐2yIS1221‐Rpresentóuna homologíadel100%conlasecuenciaderefenciaU01217.1traselanálisisrealizadocon MegaAlign. Laeficienciadelareaccióndemarcajecondigoxigeninasecomprobóporelectroforesisen geldeagarosadelproductoamplificadoenlareaccióndemarcajeysiguiendolasinstrucciones delfabricante.Debidoalapresenciadedigoxigenina,losproductosdePCRmarcadosmigranmás lentamentequelosproductosdePCRsinmarcaraúnteniendoelmismopesomolecular(figura 2.8).         Figura2.8.Evaluacióndesondasmarcadas           CapítuloII–Análisisdevariabilidadgenéticayproteica  111 2.3.4.2. Análisisdeperfilesdebandasdehibridación Enlafigura2.9sepuedeobservarunejemplorepresentativodelosperfilesdebandasen unamembranadenilónmarcada.ElanálisisderepeticionesdelasecuenciadeinserciónIS1221 porSouthernblottingdemostrólapresenciadeentre14y23repeticionesporaislado. Figura2.9.Imagenrepresentativadeunamembranadenylonreveladatrasla hibridaciónconlasondamarcadaparaladeteccióndelasecuenciaIS1221.Cadabanda correspondeaunacepadeM.hyorhinis           CapítuloII–Análisisdevariabilidadgenéticayproteica  112 ElanálisisdebandasbasadoenBioNumericsdemostróunagrandiferenciaentreaislados, conunporcentajedesimilitudcomprendidoentreel35y90%(figura2.10).Apesardeestas grandesdiferenciasentreaisladossedemostróunamarcadaasociaciónentreaquellosconel mismoorigengeográfico.ElgrupoA,compuestopor20aislados,agrupóalagranmayoríadelos representantesdelReinoUnido,englobandoal94%delosaisladosbritánicos(16de17deltotal deaisladosconesteorigen)conlaexcepcióndelaislado80p04,queselocalizóenelgrupoB1. Además,elgrupoAincluyóadosaisladosprocedentesdelasIslasCanariasydelapenínsula española,representandoel11.7%(2de17deltotaldeaisladosconesteorigengeográfico)yel 13.3%(2de15deltotaldeaisladosconesteorigengeográfico)respectivamente. ElgrupoB1,formadopor8representantes,presentóunacomposiciónmixtaformada mayoritariamenteporaisladosprocedentesdelasIslasCanarias(5de17deltotaldeaisladoscon esteorigengeográfico),juntoconlosaisladosRmr3yRmr11,conorigenenlaEspañapeninsular (2de15deltotaldeaisladosconesteorigengeográfico),ademásdelaisladoprocedentedel ReinoUnidoanteriormentemencionado. ElgrupoB2agrupóalagranmayoríadelosaisladosprocedentesdelapenínsulaespañola, concentrandoal73.3%detodoslosaisladosconesteorigengeográfico(11de15cepastotales analizadas).Ademásenestegrupotambiénselocalizaron4aisladosconorigenenlasIslas Canarias(23.5%deltotaldeaisladosconesteorigen)juntoconlacepadereferenciadeM. hyorhinis. ElgrupoCconstituyóelgrupoconmenornúmeroderepresentantes,conuntotalde6 aisladosentotal.Estegrupoestuvocompuestoexclusivamenteporaisladosprocedentesdelas           CapítuloII–Análisisdevariabilidadgenéticayproteica  113 Tabla2.8.DistribucióndeaisladosporgruposdeSouthernblotting.Elvalorentre paréntesisindicaelnúmerodecepasporeltotaldelrespectivoorigengeográfico IslasCanarias(35.2%deltotaldeaisladosconesteorigengeográfico).Ladistribucióndeaislados portipodeSouthernblottingsepuedeobservarenlatabla2.8. Grupode Southern blotting OrigenPorcentajeenrelaciónal origen Porcentajetotalde aisladosengrupo ARU,ESP,IC RU ESP IC 40%(20/50) 94.1% (16/17) 13.3% (2/15) 11.7% (2/17) BRU,ESP,IC,REF RU ESP IC REF 48%(24/50) 5.9 % (1/17) 86.7 % (13/15) 53% (9/17) 100 % (1/1)  B1ESP,IC,RU ESP IC RU 16%(8/50) 13.3 % (2/15) 29.4 % (5/17) 5.9 % (1/17) B2ESP,IC,REF ESP IC REF 32%(16/50) 73.4 % (11/15) 23.6 % (4/17) 100 % (1/1) CICIC 12%(6/50) 35.3 %(6/17)           CapítuloII–Análisisdevariabilidadgenéticayproteica  114 Figura2.10.DendrogramaobtenidotraselanálisisdeperfilesdebandasdeSouthernblotting                                        CapítuloII–Análisisdevariabilidadgenéticayproteica  115 2.3.5. VNTR Laevaluacióndelosdiferentesparesdeoligonucleótidospreviamentediseñados demostrócómosolamente2regionesrepetitivasenelgenomadeM.hyorhinisBTS‐7 presentarondiferenciassuficientesparaserdetectablestraslaelectroforesisengelesde agarosa.Porlotanto,sólolasregionesMHR‐TR‐2(reguladordetranscripción)yMHR‐TR‐6 (proteínaputativasincaracterizar)fueranempleadasparaelanálisisdeaisladosatravésdeesta técnica.   Figura2.11.MSTrepresentandolasrelacionesfilogenéticasentretiposdeVNTR(VT) obtenidastraselanálisisdeVNTR           CapítuloII–Análisisdevariabilidadgenéticayproteica  116 Tabla2.9.DistribucióndeVTpororigen Entotalseobtuvieron21VTsdiferentestraslacombinacióndelosdiferentesperfilesde bandasobservadosapartirdelanálisisdelasregionesrepetitivasanteriormentedescritas.La distribucióndeaisladosporVTseencuentrarepresentadaenlatabla2.9. VT Número de aislados porVT Porcentaje con respectoal totalde aislados ReinoUnido España IslasCanarias M.hyorhinis ref. 4711,5%322‐ 1269,8%3‐3‐ 1469,8%1‐5‐ 1769,8%6‐ ‐ ‐ 1058,2%2‐3‐ 346,6%13‐ ‐ 946,6%‐4‐ ‐ 1134,9%‐‐3‐ 1334,9%111‐ 234,9%‐21‐ 1623,3%2‐ ‐ ‐ 1823,3%2‐ ‐ ‐ 2023,3%2‐ ‐ ‐ 111,6%‐‐‐1 1511,6%‐1‐ ‐ 1911,6%1‐ ‐ ‐ 2111,6%1‐ ‐ ‐ 511,6%‐‐1‐ 611,6%‐1‐ ‐ 711,6%‐1‐ ‐ 811,6%‐1‐ ‐ Total:612516191            CapítuloII–Análisisdevariabilidadgenéticayproteica  117 Lafigura2.11representaunMSTobtenidotraselanálisisfilogenéticoconelsoftware bioinformáticoPhyloviz.EsteanálisisseñalaalST4(11.5%deltotaldeaisladosanalizados), formadoporrepresentantesdelReinoUnido(3de25),Españapeninsular(2de16)eIslas Canarias(2de19)comoelancestrocomún,relacionándoloestrechamenteconelVT12,VT14y VT19,queasuvezfueronconsideradosporesteanálisiscomosub‐ancestros.LosdemásVTs fueronconsideradosconVTsasociados.VT11,VT13,VT16yVT19,unidosporunalíneaamarillaa cadaunodesusgruposasociados,presentaronelmayorniveldevariabilidadencomparación coneltotaldelosdiferentesgruposdeVNTRdescritos. 2.3.6. Análisisestadístico Sólolosaisladostipificadosempleandocadaunadelastécnicasdescritasanteriormente fueronutilizadosenelanálisisestadísticofinal.Losaisladosempleadosjuntoconlosperfiles asignadosacadaunodeellosporlasdiferentestécnicasdetipificaciónseencuentranrecogidos enelanexo2.1. LosresultadosobtenidostraselanálisisdelindicedediversidaddeSimpson(IDS)delas diferentestécnicasdemuestracómolatécnicadeSBpresentalamayorcapacidaddiscriminatoria encomparaciónconlasotrastécnicastestadas,seguidaestrechamentepordelatécnicade PFGE,RAPDyVNTR.Todaslastécnicaspresentaronunniveldediscriminacióncercanoal0.95 porloqueseconsiderancomobuenossistemadetipificación(vertabla2.10).             ChapterIV–Developmentofdiagnostictechniques  220 statisticaldifferencesinbacterialloadobservedbetweennasalswabsandlungtissueat28DPI wasalsoevaluatedfollowingthesameprocedure. Inaddition35researchsamplesobtainedfromdeUniversityofLasPalmasdeGran Canaria–VeterinaryFacultyandisolatedfromdifferentareasoftheSpanishmainlandand CanaryIslandsandM.hyorhinisBTS‐7(referencestrain)wereevaluated(table4.8).  IsolateIDOriginIsolationdateIsolateIDOriginIsolationdate Reference strain‐BTS‐7UnitedStates19558CanaryIslands ‐Spain2002 Rmr3Spain200522CanaryIslands ‐Spain2002 Rmr7Spain200525CanaryIslands ‐Spain2002 Rmr8Spain200536CanaryIslands ‐Spain2002 Rmr9Spain200545CanaryIslands ‐Spain2002 Rmr10Spain200546CanaryIslands ‐Spain2002 Rmr11Spain200554CanaryIslands ‐Spain2002 Rmr12Spain200562CanaryIslands ‐Spain2002 Rmr14Spain200565CanaryIslands ‐Spain2002 Rmr15Spain200576CanaryIslands ‐Spain2002 Rmr16Spain2006DCanaryIslands ‐Spain2002 Rmr17Spain2006PCanaryIslands ‐Spain2002 Rmr18Spain2006UCanaryIslands ‐Spain2002 Rmr19Spain2006ZCanaryIslands ‐Spain2002 Rmr20Spain20068B1CanaryIslands ‐Spain2002 Rmr21Spain2006Ove1CanaryIslands ‐Spain2006 Rmr22Spain2006GC37CanaryIslands ‐Spain2006 4CanaryIslands‐ Spain2002GC91CanaryIslands ‐Spain2006 Table4.8.ResearchsamplesanalysedbyM.hyorhinisrpoBqPCR           ChapterIV–Developmentofdiagnostictechniques  221 OthercommonMycoplasmaspeciesreferencestrainsandgeneralbacteriaisolatedfrom pigswerealsotested(table4.9).  IsolateSpecies JM.hyopneumoniaea S16M.hyosynoviaea H3‐6B‐FM.hyopharyngisa Ms42M.floccularea G230M.argininia Y04779Bordetellabronchisepticab Y04744Pasteurellamultocidab Y04243Actinobacillussuisb Y04436Trueperellapyogenesb 1374Haemophilusparasuisa 735Streptococcussuisa M62Actinobacilluspleuropneumoniaea Table4.9.CommonMycoplasmaspeciesreferencestrainsandporcinebacterialisolatesusedinM.hyorhinisqPCR specificitytesting.aNCTCreferencestrain,bCourtesyofJonRogers(AHVLABurySt.Edmunds,UK) 4.3. Results 4.3.1. ELISAdevelopment 4.3.1.1. Antigenandconjugateselection Therewasnosignificantdifferencebetweenthepositiveandthenegativecontrolwiththe wholewashedantigenandTween20washedcellandsupernatant. Pre‐boiledantigenwasthebestperformingantigenanOD450of1to1.5forthepositive (136b‐28DPI)and0.08to0.14forthenegativecontrol(RVC111b‐0DPI)andwastherefore selectedasthestandardantigenforourtest.           ChapterIV–Developmentofdiagnostictechniques  222 ProteinG(Pierce)wasselectedasthebestperformingconjugate.Workingdilutionranged from1/2000to1/4000alwaysdeterminedbychequerboardaftereachnewbatchofantigenwas produce. ArepresentativeM.hyorhinisiELISAchequerboardplatecanbeseeninfigure4.7.   4.3.1.2. EstimationofthepredictiveabilityoftheELISAtest ThehighestOD450valueprovidingthebestspecificity‐sensitivitycombinedvaluewas selectedascut‐offpointforpositivesamples(table4.10). Acut‐offpointof0.25wasselectedtodetermineapositivesamplewhentestedwithM. hyorhinisiELISAmethodinaccordancewiththehighestcombinedSe‐Spvalue(141.26).Suspect rangewasestablishedbetweenOD4500.2and0.25. Usingthiscut‐offpoint,aspecificityof82.93%andasensitivityof58.33%wasobtained. Figure4.7.M.hyorhinisiELISAchequerboardplate.Positiveserumaddedin columns1,3,5,7,9,11.Negativeserumaddedincolumns2,4,6,8,10,12.           ChapterIV–Developmentofdiagnostictechniques  223 Table4.10.Positivecut‐offpointsandrelativespecificityandsensitivity A2x2contingencytablecomparingWesternblottingandiELISAresultsandincludingthe standardandcorrectedpositiveandnegativepredictivevalueoftheiELISAcanbeobservedin table4.11. Table4.11.ContingencytablecomparingWesternblottingandiELISApositiveandnegativeresults Whenusingthe0.25cut‐offpointappliedtosamplesetC,anestimatedseroprevalenceof 55.7%wasdeterminedforthisarrayofsamplescollectedthroughoutUK(n=798). Cut‐offpoint (OD450) Se(%)Sp(%)CombinedCut‐offpoint (OD450) Se(%)Sp(%)Combined 0,187,57,3294,820,5531,2597,56128,81 0,1585,4237,8123,220,629,1797,56126,73 0,17579,1759,76138,930,6527,0897,56124,64 0,272,9267,07139,990,722,9297,56120,48 0,22562,575,61138,110,7522,9298,78121,7 0,2558,3382,93141,260,820,83100120,83 0,352,0887,8139,880,8520,83100120,83 0,3547,9291,46139,380,916,67100116,67 0,441,6795,12136,790,9516,67100116,67 0,4539,5895,12134,7110,42100110,42 0,531,2596,34127,59  WesternBlotting   ELISAresult+‐ GrandTotalStandardPPV andNPV Corrected PPVand NPV +281442PPV 66.7% PPVb 81.1% ‐ 206888NPV 77.3% NPVb 61.2% GrandTotal4882130 Se=58.33%Sp=82.92%           ChapterIV–Developmentofdiagnostictechniques  224 APPVandNPVof66.7%and77.3%respectivelywereobtainedwhenusingstandard formulae.Whentheprevalence‐correctedformulaewereappliedagreatincreaseinthePPVand reductionintheNPVoftheiELISAwasobserved. 4.3.1.3. Crossreactivity NocrossreactivitywiththecloselyrelatedmycoplasmaM.hyopneumoniaewasobserved aftertestingpositivesamplesobtainedfromtheexperimentalinfection. 4.3.1.4. Kappa‐statisticmeasureofinter‐rateragreement(strengthofagreement) Theagreementbetweenprocedureswascalculatedusing0.25OD450cut‐offpoint.Theκ valuesobtainedrangedfromgoodtoverygood.Averygoodagreementbetweenoperatorswas obtained(table4.12,κvalue:0.91).SamplesetB(samples1to90)wasusedforthispurpose. Table4.12.Agreementcalculationbetweentwodifferentoperators Goodagreementwasobservedbetweenrepeats(table4.13,κvalue:0.73).SamplesetB (samples1to90)werealsousedinthissituation.  Operator1Operator2  Total   +‐  +32234   ‐ 26062   Total346296   AgreementExpectedagreementKappaStd.Err.ZProb>Z 95.83%54.25%0.90890.10218.910.0000           ChapterIV–Developmentofdiagnostictechniques  225 Repeat1Repeat2Total   +‐  +17320   ‐ 67076   Total237396   AgreementExpectedagreementKappaStd.Err.ZProb>Z 90.63%65.19%0.73070.10167.190.0000 Table4.13.AgreementcalculationbetweeniELISArepeats Agoodagreementwasalsoobservedbetweendifferentantigenbatches(κvalue:0.68‐ samplesetB(1‐90),table4.14,0.85‐samplesetB(91to180)table4.15). Batch1(1‐90)Batch2(1‐90)Total   +‐  +13720   ‐ 27476   Total158196   AgreementExpectedagreementKappaStd.Err.ZProb>Z 90.63%70.05%0.68700.10056.830.0000 Table4.14.Antigenbatchvariationagreementcalculationbetweentworepeats‐samplesetB(samples1to90) Batch1(91to 180) Batch2(91to180)Total   +‐  +10313   ‐ 08383   Total108696   AgreementExpectedagreementKappaStd.Err.ZProb>Z 96.88%78.86%0.85220.10098.440.0000 Table4.15.Antigenbatchvariationagreementcalculationbetweentworepeats‐samplesetB(samples91to180)           ChapterIV–Developmentofdiagnostictechniques  226 4.3.2. MycoplasmahyorhinisqPCRdevelopment 4.3.2.1. Primerdesign Nosignificantsimilaritieswereobservedbetweentheprimersdesignedandanyother bacterialspeciesafterBLASTanalysis.Figure4.8showsarepresentativesequencealignment includingbothforwardandreverseprimersalignedagainstthemostcommonMycoplasma speciesisolatedfrompigs.          Figure4.8.Forwardandreverseprimeralignment Nucleotidesinredrepresentidentitymatcheswitheachprimer.Afullmatchagainstour primerswasobservedwhencomparedallM.hyorhinisrpoBgenesequencesavailable.           ChapterIV–Developmentofdiagnostictechniques  227 4.3.2.2. Primerconcentrationevaluation TheprimercombinationofMHR‐rpobFat300nMandMHR‐rpobRat900nM demonstratedtobethebestperformingfinalconcentrationperreactionandthereforeselected forallsubsequentreaction.Figure4.9representstheamplificationcurvesshowingthe differencesinamplificationefficiencyobtainedaspartoftheprimerconcentrationevaluation.      Figure4.9.Differencesinamplificationefficiencyassociatedtotheuseofdifferentprimerconcentrations 4.3.2.3. Limitofdetection,efficiencyanddynamicrangeestimation Standardcurveanalysisprovedanefficiencyof92.4%andcorrelationofR2=0.999(figure 4.10).              ChapterIV–Developmentofdiagnostictechniques  228 Figure4.10.StandardcurveforM.hyorhinisrpoBqPCR       Figure4.11.DynamicrangeforM.hyorhinisrpoBqPCR.Reddotsrepresentmultiplestandardsforeachdilution LODevaluationprovedasensitivityoflessthan3genomecopyequivalents,with10 copiesbeingreliablydetectedbetweentheupperandlower95%confidencelevel(figure4.11).           ChapterIV–Developmentofdiagnostictechniques  229 4.3.2.4. EvaluationofclinicalandresearchDNAsamples Specificitytestingdemonstrateda100%correlationwithPCR/DGGEresults.Noother Mycoplasmaspeciesorporcinebacterialspecieswasamplified.TheqPCRresultsofeachsample, includingtheirrelativecopynumbercanbeobservedinappendix4.2. Relativecopynumbervaluesobtainedrangedfrom4.75to1.54x105copiesofM. hyorhinis.Nostatisticallysignificantdifferenceswereobservedbetweenthebacterialloads detectedinthedifferentanimalgroupsatthesameweekofsamplingwhenanalysingthe samplesobtainedduringtheexperimentalinfectionexperiment.Thislackofstatistical differenceswasalsoobservedbetweentheloaddetectedinnasalswabsandlungtissuesamples obtainedfromthesamegroup. 4.4. Discussion M.hyorhinisrepresentsanexcellentexampleofanemergingendemicpathogen.Arecent reportpublishedbyPalzerandco‐authors(2008)provingthestatisticalassociationbetween diseasedanimalsshowingsignsofpneumoniaandthepresenceofM.hyorhinisbyPCRvindicates thispathogeninporcinerespiratorydiseasewithaprimaryroleintheporcinerespiratorydisease complex. Serology Thedataobtainedfromtestingfieldserumsamples(setC,n=798)usingthenewiELISA testdevelopedaspartofthisthesisevidencedaclearseroconversionagainstM.hyorhinisinthe            Chapter4–Appendices                ChapterIV‐Appendices  239 Appendix4.1.Cloningreagents ‐IPTGstocksolution(0.1M) IPTG1.2g Addwaterto50mlfinalvolume. Filtersterilizeandstoreat4°C. ‐X‐Gal(2ml) 5‐bromo‐4‐chloro‐3‐indolyl‐β‐D‐galactoside100mg Dissolvein2mlN,N´‐dimethylformamide. Coverwithaluminiumfoilandstoreat–20°C. ‐LBmedium(perlitre) Bacto®‐tryptone(BD)10g Bacto®‐yeastextract(BD)5g NaCl5g AdjustpHto7.0withNaOH.           ChapterIV‐Appendices  240 ‐LBplateswithampicillin Add15gagarto1litreofLBmedium. Autoclave. Allowthemediumtocoolto50°Cbeforeaddingampicillintoafinalconcentrationof100 μg/ml. Pour30–35mlofmediuminto85mmPetridishes. Lettheagarharden. Storeat4°Cforupto1monthoratroomtemperatureforupto1week. ‐LBplateswithampicillin/IPTG/X‐Gal MaketheLBplateswithampicillinasabove;thensupplementwith0.5mMIPTGand80 μg/mlX‐Galandpourtheplates. Alternatively,100μlof100mMIPTGand20μlof50mg/mlX‐Galmaybespreadoverthe surfaceofanLBampicillinplateandallowedtoabsorbfor30minutesat37°Cpriortouse.              ChapterIV‐Appendices  241 ‐SOCmedium(100ml) Bacto®‐tryptone2g Bacto®‐yeastextract0.5g 1MNaCl1ml 1MKCl0.25ml 2MMg2+stock,filter‐sterilized1ml 2MGlucose,filter‐sterilized1ml AddBacto®‐tryptone,Bacto®‐yeastextract,NaClandKClto97mldistilledwater. Stirtodissolve.Autoclaveandcooltoroomtemperature. Add2MMg2+stockand2Mglucose,eachtoafinalconcentrationof20mM.Bringto100 mlwithsterile,distilledwater.ThefinalpHshouldbe7.0. 2MMg2+stock MgCl2∙6H2O20.33g MgSO4∙7H2O24.65g Adddistilledwaterto100ml.Filtersterilize.           ChapterIV‐Appendices  242 Appendix4.2.qPCRresults Table1.qPCRresults–fieldsubmissions IDPCR/DGGEresultCq Relative copy number IDPCR/DGGEresultCq Relative copy number 101P11M.arginini‐ ‐ 279P11M.hyorhinis16.421.54x105 102P11M.hyopneumoniae‐ ‐ 282P11M.hyopneumoniae‐ ‐ 105P11Negative‐ ‐ 283P10M.hyosynoviae‐ ‐ 106P11M.hyopneumoniae‐ ‐ 287P11Unidentifiedband‐ ‐ 108P11Negative‐ ‐ 28P11M.hyorhinis28.141.45x102 113P11M.hyopneumoniae‐ ‐ 292P10M.hyorhinis andM. hyopneumoniae 29.217.69x101 14P10M.hyopneumoniae‐ ‐ 293P11M.hyorhinis andM. hyopneumoniae 28.511.16x102 151P11Negative‐ ‐ 294P11M.hyorhinis andM. hyopneumoniae 32.381.16x101 155P11M.hyorhinis24.841.03x103296P10M.hyopneumoniae‐ ‐ 157P11Negative‐ ‐ 29P10M.hyorhinis andM. hyopneumoniae 31.981.48x101 158P11M.hyorhinis  300P10M.hyorhinis andM. hyopneumoniae 24.131.57x103 15P10Negative‐ ‐ 308P10M.hyorhinis20.641.26x104 165P10Negative‐ ‐ 30P10M. hyorhinis andM. hyopneumoniae 33.894.75 165P11Negative‐ ‐ 30P11M.arginini‐ ‐ 176P10M.hyopneumoniae‐ ‐ 31P10M.hyopneumoniae‐ ‐ 179P11M.hyorhinis16.481.49x105328P11Negative‐ ‐ 184P10Negative‐ ‐ 336P10Negative‐ ‐ 184P11Negative‐ ‐ 347P10Negative‐ ‐ 186P11Negative‐ ‐ 362P10M.hyorhinis20.151.68x104 187P10M.hyopneumoniae‐ ‐ 365P10M.hyopneumoniae‐ ‐ 188P10M.hyorhinisandM. hyopneumoniae 29.217.69x101374P10M.hyorhinis21.348.27x103 188P11M.hyopneumoniae‐ ‐ 375P10M.hyopneumoniae‐ ‐ 192P11M.hyopneumoniae‐ ‐ 376P10M.hyorhinis25.616.53x102 194P11M.hyopneumoniae‐ ‐ 378P10M.arginini‐ ‐ 196P11M.hyorhinisandM. hyopneumoniae 25.168.55x102381P10M.hyorhinis27.282.23x102 197P10Nomycoplasmas‐ ‐ 382P10M.arginini‐ ‐ 197P11M.hyorhinis16.711.30x105393P10M.arginini‐ ‐           ChapterIV‐Appendices  243 1P10M.hyorhinisandM. hyopneumoniae 33.445.74396P10M.hyorhinisandM. hyopneumoniae 26.873.08x102 203P11M.hyopneumoniae‐ ‐ 39P11M.suis‐ ‐ 204P11M.hyorhinis28.061.52x1023P10M.hyorhinisandM. hyopneumoniae 17.169.94x104 20P10M.hyopneumoniae‐ ‐ 42P11M.hyopneumoniae‐ ‐ 216P10Negative‐ ‐ 43P10Negative‐ ‐ 216P11Negative‐ ‐ 477P10M.hyorhinisandM. hyopneumoniae 20.741.18x104 217P11Negative‐ ‐ 54P11Negative‐ ‐ 219P10Negative‐ ‐ 55P11Negative‐ ‐ 232P10Negative‐ ‐ 59P11Negative‐ ‐ 242P10Negative‐ ‐ 60P11Negative‐ ‐ 242P11M.hyorhinis24.441.30x10363P11Negative‐ ‐ 246P11M.hyopneumoniae‐ ‐ 65P11Negative‐ ‐ 249P11M.arginini‐ ‐ 73P11M.hyopneumoniae‐ ‐ 24P11M.hyorhinis21.866.08x1037P11M.hyorhinis18.255.20x104 253P10Negative‐ ‐ 81P11M.hyorhinisandM. hyopneumoniae 29.217.69x101 25P10M.hyorhinis30.583.39x10182P11M.hyorhinisandM. hyopneumoniae 32.779.24 261P10Negative‐ ‐ 83P10M.hyorhinisandM. hyopneumoniae 27.941.63x102 261P11M.hyorhinisandM. hyopneumoniae 24.631.17x10383P11Negative‐ ‐ 263P10Negative‐ ‐ 84P10M.hyorhinis22.613.89x103 264P10Negative‐ ‐ 86P11M.arginini‐ ‐ 266P10Negative‐ ‐ 87P11M.arginini‐ ‐ 267P10M.hyosynoviae‐ ‐ 88P10M.hyorhinis16.611.38x105 268P10Negative‐ ‐ 89P10M.hyosynoviae‐ ‐ 268P11Negative‐ ‐ 8P10M.hyorhinis21.348.27x103 269P11M.hyorhinis30.682.96x10190P10M.floculare‐ ‐ 26P10M.hyorhinis21.626.55x10390P11M.hyorhinisandM. hyopneumoniae 27.352.16x102 273P10M.hyopneumoniae‐ ‐ 91P10M.hyorhinis30.673.03x101 275P11M.hyorhinisandM. hyopneumoniae 30.752.85x10195P10Nomycoplasmas‐ ‐ 278P10M.hyopneumoniae‐ ‐ 9P10Nomycoplasmas‐ ‐               ChapterIV‐Appendices  244 Table2.qPCRresults–experimentalinfection.Cqandrelativecopynumberinbrackets.(aPositive byPCR/DGGEagainstM.hyorhinisbPositivebyPCR/DGGEagainstM.hyopneumoniae)                             Nasalswabs(DPI)Lungtissue 07142128PM(28DPI) M.hyorhinis Rmr16 127a‐ ‐ ‐ +a(18.69, 3.72x104)‐ ‐ 129a‐ ‐ ‐ ‐ ‐ +a(18.48,4.22 x104) 130a‐ ‐ +a(30.47, 3.36x101)‐ ‐ ‐ 132a‐ ‐ ‐ ‐ +a(18.89, 1.80x104)+a(16.81,1.13 x105) 134a‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 135a‐ ‐ ‐ +a(22.03, 3.89 x103)‐ ‐ M.hyorhinis 67p07 111b‐ ‐ ‐ ‐ ‐ +a(25.78,4.13 x102) 113b‐ ‐ +a(31.48, 1.96x101)‐ +a(29.33, 6.63 x101)+a(20.68,1.13 x104) 124b‐ ‐ +a(30.64, 3.04x101)‐ ‐ ‐ 133b‐ ‐ ‐ ‐ +a(22.98, 2.89 x103)+a(22.52,2.84 x103) 136b‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 137b‐ ‐ +a(28.02, 1.44x102)‐ +a(27.46, 1.41 x102)+a(24.44,1.21 x103) M.hyorhinis 80p04 116c‐ ‐ +a(23.61, 1.99x103)‐ ‐ +a(25.16,7.93 x102) 119c‐ ‐ ‐ +a(23.13, 1.95 x103)‐ +a(22.84,3.16 x103) 122c‐ ‐ ‐ +a(22.38, 3.09 x103) +a(23.60, 2.00 x103)‐ 123c‐ ‐ +a(23.12, 1.96x103)‐ +a(23.95, 1.63 x103)+a(27.68,1.23 x102) 128c‐ +a(27.59, 1.30 x102) +a(25.61, 4.33x102)‐ +a(25.78, 5.46 x102)+a(20.85,1.03 x104) 131c‐ ‐ +a(26.96, 2.71x102) +a(26.42, 2.65 x102) +a(24.96, 8.92 x102)+a(24.46,8.74 x102) M. hyopneumoniae RVC 112d‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 114d‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 115d‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 121d‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ 126d‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ Control 117e‐‐‐‐‐ ‐ 118e‐‐‐‐‐ ‐ 125e‐‐‐‐‐ ‐           ChapterIV‐Appendices  245 Table3.qPCRresults–researchsamples IDOriginCq Relative copy number IDOriginCq Relative copy number Reference strain‐ BTS‐7 United States 14.988.68x1048Canary Islands‐Spain 15.298.86x104 Rmr3Spain16.653.32x10422Canary Islands‐Spain 15.934.54x104 Rmr7Spain14.891.16x10525Canary Islands‐Spain 14.581.13x105 Rmr8Spain16.264.64x10436Canary Islands‐Spain 16.313.25x104 Rmr9Spain14.679.89x10445Canary Islands‐Spain 14.501.20x105 Rmr10Spain14.971.01x10546Canary Islands‐Spain 16.133.68x104 Rmr11Spain15.783.19x10454Canary Islands‐Spain 14.801.23x105 Rmr12Spain16.633.36x10462Canary Islands‐Spain 16.463.76x104 Rmr14Spain15.041.17x10565Canary Islands‐Spain 14.951.24x105 Rmr15Spain16.424.68x10476Canary Islands‐Spain 15.803.15x104 Rmr16Spain15.131.02x105DCanary Islands‐Spain 15.448.95x104 Rmr17Spain16.803.40x104PCanary Islands‐Spain 14.431.12x105 Rmr18Spain15.623.57x104UCanary Islands‐Spain 15.764.49x104 Rmr19Spain14.828.59x104ZCanary Islands‐Spain 16.123.26x104 Rmr20Spain14.529.79x1048B1Canary Islands‐Spain 14.351.19x105 Rmr21Spain15.963.64x104Ove1Canary Islands‐Spain 16.143.22x104 Rmr22Spain14.191.18x105GC37Canary Islands‐Spain 15.594.45x104 4 Canary Islands‐ Spain 15.973.18x104GC91Canary Islands‐Spain 15.793.60x104                   Conclusiones  252 Cuarta:  M.hyorhinisencapazdeproducirlesionesrespiratoriasindistinguiblesanivel macroscópicoehistopatológicodeaquellasobservadasencasosdeNEPcausadosporM. hyoneumoniae,ademásdedemostrarseunavariabilidadenlavirulenciadecepasdecampode M.hyorhinis.  Quinta:  Elusodeinoculacióntrans‐traquealencombinaciónconlaaplicacióndeisofluoranocomo agenteanestésicopuedeserusadosatisfactoriamenteparaeldesarrollodemodelos experimentalesdeinfeccióncausadospormicoplasmaencerdosademásdeproducirunamejora enlareproducibilidadybienestaranimaldebidoalimitadainvasividadyrápidainduccióny recuperacióndelosanimalestraslaanestesia.  Sexta:  ElusodePCR/DGGEparaelseguimientodelaexcreciónopresenciadeM.hyorhinisyM. hyopneumoniaeenhisoposnasalesytejidopulmonaresdemostrósergranutilidadaunquela correlaciónentrelosresultadosobtenidosentrelosdiferentestiposdemuestraesbaja.El análisisdetejidopulmonarpresentóunamayorcorrelaciónconlaspresentaciónylesiones macroymicroscópicasporlosedebeconsiderarcomounamuestraindispensableeninfecciones experimentalesconestosmicroorganismos.            Conclusiones  253 Séptima:  LatécnicadeWesternblottingpresentaunagranutilidadparaelestudiodelaevolución delarespuestainmuneyparaeldiagnósticoserológicodeM.hyorhinis.Asuvezelhallazgode variasproteínasinmunodominates,entrelasquedestacanlaspresentadasenlaregión comprendidaentrelos40y46kDadepesomolecularaparente,presentanungranpotencial paraserutilizadaseneldesarrollodetécnicasdediagnósticomejoradasademásdepoderjugar unpapeldentrodeldesarrollodevacunasdesubunidadorecombinantesfrentealaenfermedad causadaporM.hyorhinis.  Octava:  ElusodelatécnicadeELISAindirectoparaladeteccióndeM.hyorhinispuedeserútilpara elestudiosdeseroprevalenciaenM.hyorhinisademásdepresentarelpotencialdeser combinadaconlatécnicadeWesternblottingconelfindeproducirunanálisisserológicomás sensibleyespecífico.  Novena:  LatécnicadeqPCRaplicadaaladeteccióndeM.hyorhinisdemostróserunatécnica rápidayfiableparaladeteccióndeADNdeestemicroorganismo,comounaaltasensibilidad, menora10copias,yun100%deespecificidadycorrelaciónconlosresultadosobtenidospor PCR/DGGE.Además,lacapacidaddecuantificaciónpermitequeestatécnicapuedaserusada           Conclusiones  254 comoindicadordelacargabacterianaquepuedaservircomodatasuplementarioparaelanálisis delaposibleimplicacióndeM.hyorhinisencuadrosdeneumoníaporcina.  Decima:  Lafaltadediferenciasestadísticamentesignificativasentreelnúmerodecopiasrelativo deM.hyorhinisencontradaengruposcondiferentesgradosdelesionespulmonaresanivel microymacroscópicosugierequelasdiferenciasenvirulenciaentrecepasdeeste microorganismonoestánasociadasaunincrementoenelnúmerodecélulasdeM.hyorhinisen hisoposnasalesotejidopulmonar,debiendoseprobablementeavariacionesgenéticas intraespecie.                                       Resumen           Resumen  259 6. Resumen  AunqueelpapeldeMycoplasmahyorhiniscomoorganismopatógenoenganadoporcino sehaencontradoasociadoporlogeneralacuadrosdeartritis,otitisypoliserositis,diversos estudiosepidemiológicorecienteshansidocapacesdedemostrarlaposibleimplicacióndeeste microorganismocomoagenteetiológicoprimarioencuadrosdeenfermedadrespiratoriaen cerdos,conunapresentaciónclínicacompatibleconaquellacausadaporM.hyopneumoniae,el agenteetiológicoclásicodelaneumoníaenzoóticaporcina,yconcuadrosdeenfermedad respiratoriaasociadaalcomplejorespiratorioporcino. Debidoallimitadoconocimientodelavariabilidadgenéticayantigénicadeeste microorganismodecidimosenfocarlaprimeradepartedeestatesisalestudioydesarrollode diversastécnicasdetipificaciónmolecularparaelanálisisdeM.hyorhinis.Dentrodeestegrupo detécnicasdesarrolladas,entrelasqueseencontraronlastécnicasdeRAPD,PFGE,Southern blotting,cabedestacarlatécnicadeVNTR,quetrasnuestroanálisisdestacacomolaherramienta deelecciónparalatipificaciónyanálisisdelaepidemiologíamoleculardeM.hyorhinis.Enloque respectaalanálisisantigénicosedemostróunaescasavariabilidadentreaisladosconorígenes geográficosdistantes,evidenciándoselapresenciadecomponentesantigénicos inmunodominantesaltamenteconservadosquepuedenjugarunpapelimportanteenelfuturo desarrollodeherramientasenfocadasalaprevenciónycontroldeestemicroorganismo,como puedeserelcasodevacunasdesubunidadesorecombinantes. Juntoconelestudiodelavarabilidadproteicaygenética,yconelfindedemostrarla capacidaddeM.hyorhinisparacausarcuadrosdeneumoníaenlechones,sedesarrollóun           Resumen  260 modeloexperimentaldeinfecciónenestosanimales.Graciasaestemodelosepudodemostrar comoM.hyorhinisescapazdeproducirlesionespulmonaresindistinguiblesanivelmicroy macroscópicadeaquellasproducidasporelagenteclásicodelaNEP,M.hyopenumoniae.Estos datos,ademásdedemostrarlaevidenciaobservadaenestudiosepidemiológicosdecampo, ponenendudatodosaquellosresultadosdiagnósticosbasadosúnicamenteenlaevidencia clínicaypatológicasindemostracióndelagenteetilógico. ConelfindemejorarlasherramientasdiagnósticasaplicadasaM.hyorhinisypara proporcionarherramientasfiablesparaladeteccióndelarespuestainmuneypresenciadeeste microorganismoencerdosdecidimosdesarrollardostécnicasampliamenteempleadasenel diagnósticodeenfermedadeneláreadelasanidadanimal,latécnicadelELISAindirectoparala deteccióndeanticuerposfrenteaM.hyorhinisylaPCRcuantitativaatiemporealparala detecciónrápida,sensibleyespecíficadeADNdeestemicroorganismo.Ambastécnicas demostraronserdegranutilidadparaelanálisisdeinfeccionescausadasporM.hyorhinisyjunto conlatécnicadeWesternblottingdesarrolladaenestatesissuponenunacontribuciónrealenel campodeldiagnósticoveterinarioaplicadoalanálisisdeinfeccionescausadasporeste importantemicroorganismopatógenoporcino.                          Referenciasbibliográficas             Referenciasbibliográficas  271 AarestrupFM,FriisNF,SzancerJ.(1998).AntimicrobialsusceptibilityofMycoplasmahyorhinisin aliquidmediumcomparedtoadiscassay.ActaVetScand.39(1):145‐7. AarestrupFM,FriisNF.(1998).AntimicrobialsusceptibilitytestingofMycoplasmahyosynoviae isolatedfrompigsduring1968to1971andduring1995and1996.VetMicrobiol.Mar15;61(1‐ 2):33‐9. AhrensP,KokotovicB,Hagedorn‐OlsenT,FriisNF.(1996).IdentificationofMycoplasma 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