Aportaciones tecnológicas en la preservación del semen en la raza caprina

UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA PROGRAMA DE DOCTORADO DE CLíNICA E INVESTIGACIÓN TERAPÉUTICA. DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA ANIMAL, PRODUCCIÓN ANIMAL, BROMATOLOGÍA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS TESIS DOCTORAL APORTACIONES TECNOLÓGICAS EN LA PRESERVACIÓN DEL SEMEN EN LA RAZA CAPRINA MAJORERA TARA NIÑO GONZÁLEZ LAS PALMAS DE GRAN CANARIA 2013 DEPARTAMENTO DE PATOLOGíA ANIMAL, PRODUCCIÓN ANIMAL, BROMATOLOGíA Y TECNOLOGíA DE LOS ALIMENTOS. UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA D. MIGUEL BATISTA ARTEAGA, PROFESOR TITULAR DE UNIVERSIDAD, DOCTOR EN VETERINARIA Y ADSCRITO AL DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA ANIMAL, PRODUCCIÓN ANIMAL, BROMATOLOGÍA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA INFORMA: Que Dª TARA NIÑO GONZÁLEZ, licenciada en Veterinaria, ha realizado bajo mi dirección el presente trabajo titulado “Aportaciones tecnológicas en la preservación del semen en la raza caprina Majorera" y considero que reúne las condiciones y calidad científica necesarias para optar al grado de Doctor en Veterinaria por la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. La Doctoranda El Director Fdo. Tara Niño González Fdo. Miguel Batista Arteaga Las Palmas de Gran Canaria, a 26 de abril de 2013 El presente trabajo es una compilación de los siguientes artículos publicados en diferentes revistas científicas: - Batista M, Niño T, Álamo D, Castro N, Santana M, González F, Cabrera F, Gracia A (2009): Successful artificial insemination using semen frozen and stored in an ultrafreezer in the Majorera goat breed. Theriogenology 71: 1307-1315. - Batista M, Niño T, Álamo D, Castro N, Santana M, González F, Cabrera F, Gracia A (2011): Influence of the preservation temperature (37ºC, 20ºC, 4ºC, - 196ºC) and the mixing of semen over sperm quality of Majorera bucks. Reproduction in Domestic Animals 46: 281-286. - Batista M, Santana M, Niño T, Álamo D, Cabrera F, González F, Gracia A (2012): Sperm viability of canine and caprine semen samples preserved in a dry shipper. Animal Reproduction Science 130: 105-110. AGRADECIMIENTOS La verdad es que la realización de esta tesis doctoral ha sido un proceso tan largo, que por el camino han pasado muchísimas personas a las que agradecerles su colaboración. A nivel académico debo agradecer a todos los integrantes de mi equipo de trabajo, empezando por mi director de tesis, el Dr. Miguel Batista Arteaga con el que he compartido risas y lágrimas y al que siempre veré como mi mentor y llamaré “Jefe”, siempre te queda mi respeto y gratitud. A los doctores Anselmo Gracia, Fernando González, Fernando Cabrera, Desirée Álamo y Melania Santana, agradecerles tanta (tanta, tanta) ayuda y apoyo moral. No debo nunca olvidarme de los amigos de Producción Animal y su política del “yo te ayudo y tú me ayudas”, Tacho, Noemí, Baifo, Lorenzo, Isa y Davinia, en muchos momentos he sentido que éramos un único departamento, y esa forma de trabajar ha sido muy agradable. Trabajar con animales conlleva siempre unas tareas extras, como es cuidar de su bienestar. Gracias a todas esas personas que cuidaron este aspecto para que, personas como yo, podamos llevar a cabo trabajos como éste. Ese apoyo logístico debo agradecerlo a todo el personal de granja (incluidos los jubilados): Antonio, Juan (él lleva aquí mas años que nadie), Rosario, Luis, Pino, Serafín, Bernardo, Primi y Lourdes. Que no me olvide yo de “Ventu” y “Santi”, que además de ayudarme a “tirarle besitos a los machos” han llegado a convertirse en buenos amigos con los que se puede contar. Nuria y Ricardo, que me han llevado de la manita por toda la burocracia que implica hacer una tesina y una tesis, no dejando nunca que se me pase un plazo, gracias. Y, como no, a Manolo Ruiz, o “Manolo el de Correos”, que me proporcionó la materia prima, los machos cabríos usados en el estudio A nivel personal, han sido muchas las personas que han aguantado mis historias y mis desahogos, empezando por mis padres Luis y Ada, mi hermana Silvia y mi supernovio Simón, que me han aguantado nerviosismos, malos humores y estreses. Gracias. A mi familia política Túbal, Lupe, Pedro José, Mari, Fran, Marisa, Inma y Rosa María. A mis “tíos de Sardina”, tíos de verdad, primos y abuelitas (son tantísimos que si los nombro a todos, ocupa más los agradecimientos que el resto de la tesis) muchísimas gracias, de verdad. A ese grupo de grandes amigos, personas que están ahí, que no te juzgan y te apoyan y sujetan en la vida real, a esos con los que se comparten momentos buenos, divertidos y relajados, zenkiu. A Patry, Nuri y Carmencita, que han sido un apoyo especial. A Dácil por la portada y a Dani por sus correcciones. Y a todas esas personas que directa o indirectamente han colaborado en la realización de esta tesis doctoral. Y una vez terminada y defendida esta tesis, VÄMONOS A CELEBRARLO!!! Indice I 1. INTRODUCCIÓN................................................................................................................................................. 1 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA…………………………………………………………………………………………… 6 2.1. Anatomía del aparato reproductor masculino en la especie caprina……………………………………. 7 2.1.1. Testículos y escroto...................................................................................................................... 7 2.1.2. Epidídimo y conducto deferente……………………………………………………………………….. 8 2.1.3. Cordón espermático……………………………………………………………………………………... 9 2.1.4. Glándulas accesorias……………………………………………………………………………………. 9 2.1.5. Genitales externos ……………………………………………………………………………………….. 11 2.2. Gametogénesis en el macho cabrío ………………………………………………………………………….. 12 2.2.1. Espermatogénesis ………………………………………………………………………………………. 12 2.2.1.1. Fases de la espermatogénesis …………………………………………………………………... 13 2.2.2. Morfología del espermatozoide……………………………………………………………………….. 14 2.2.3. Transporte del semen …………………………………………………………………………………… 15 2.3. Producción seminal en el macho cabrío …………………………………………………………………….. 16 2.3.1. Métodos y frecuencia de recogida ……………………………………………………………………. 16 2.3.1.1. Métodos de extracción seminal …………………………………………………………………. 16 2.3.1.2. Frecuencia de recogida …………………………………………………………………………… 18 2.3.2. Factores que pueden influir sobre la producción seminal ……………………………………….. 19 2.3.2.1. Edad de los machos ………………………………………………………………………………. 19 2.3.2.2. Alimentación ……………………………………………………………………………………….. 19 2.3.2.3. Individuo y raza ……………………………………………………………………………………. 20 2.3.2.4. Variación estacional de actividad reproductiva ………………………………………………… 20 2.3.3. Características del semen en la especie caprina ………………………………………………….. 21 2.3.3.1. Características macroscópicas …………………………………………………………………... 21 2.3.3.2. Características microscópicas …………………………………………………………………… 22 2.3.3.3. Características bioquímicas ……………………………………………………………………… 26 2.4. Diluyentes seminales ……………………………………………………………………………………………. 28 2.4.1. Componentes básicos de un diluyente ……………………………………………………………... 28 2.4.1.1. Fuentes de energía ……………………………………………………………………………….. 28 2.4.1.2. Soluciones tampones y electrolitos ……………………………………………………………… 29 2.4.1.3. Estabilizadores de membrana …………………………………………………………………… 29 2.4.1.4. Antibióticos …………………………………………………………………………………………. 30 2.4.1.5. Agua ………………………………………………………………………………………………… 30 2.4.2. Clasificación de los diluyentes ………………………………………………………………………... 31 2.4.2.1. Diluyentes naturales……………………………………………………………………………….. 31 2.4.2.2. Diluyentes sintéticos ………………………………………………………………………………. 31 2.5. Conservación del semen caprino ….………………………………………………………………………….. 32 2.5.1. Semen fresco .……………………………………………………………………………………………. 32 2.5.2. Semen refrigerado ……………………………………………………………………………………….. 33 2.5.3. Semen congelado ……………………………………………………………………………………….. 34 2.5.3.1. Contrastación y selección de eyaculados ……………………………………………………… 34 2.5.3.2. Proceso y tasa de dilución ……………………………………………………………………….. 34 2.5.3.3. Período de equilibrado ……………………………………………………………………………. 35 2.5.3.4. Métodos de envasado ……………………………………………………………………………. 36 2.5.3.5. Congelación en nitrógeno líquido ………………………………………………………………. 37 Indice II 2.5.3.6. Congelación en ultracongeladores …..…………………………………………………………….. 38 2.5.3.7. Transporte de semen congelado .….………………………………………………………………. 39 2.5.4. Descongelación y contrastación seminal post-descongelación .………………………………….. 40 2.5.4.1. Procedimiento …………………………………………………………………………………………. 40 2.5.4.2. Contrastación del semen congelado-descongelado ……………………………………………… 40 2.6. Anatomía del aparato reproductor femenino en la especie caprina ……………………………………….. 42 2.6.1. Ovarios y oviducto ………………………………………………………………………………………….. 42 2.6.2. Útero …………………………………………………………………………………………………………... 42 2.6.3. Cuello uterino ………………………………………………………………………………………………… 43 2.6.4. Vagina ……………………………………………………………………………………………………........ 43 2.6.5. Genitales externos ………………………………………………………………………………………...... 43 2.7. El ciclo estral de la cabra …………………………………………………………………………………………... 44 2.7.1. Estacionalidad ……………………………………………………………………………………………….. 44 2.7.2. Pubertad ………………………………………………………………………………………………………. 45 2.7.3. Ciclo estral ……………………………………………………………………………………………………. 45 2.7.3.1. Estro ……………………………………………………………………………………………………. 46 2.7.3.2. Fase folicular ………………………………………………………………………………………….. 47 2.7.3.3. Fase luteal …………………………………………………………………………………………….. 47 2.8. Tratamientos de inducción del celo y ovulación en la especie caprina …………………………………… 48 2.8.1. Inducción del estro con ovulación ……………………………………………………………………….. 48 2.8.1.1. Inducción del estro con ovulación mediante el efecto macho …………………………………… 48 2.8.1.2. Inducción del estro con ovulación mediante control del fotoperiodo …………………………… 49 2.8.1.3. Inducción del estro con ovulación mediante tratamientos hormonales…………………………. 50 2.8.2. Sincronización del estro con ovulación ………………………………………………………………… 51 2.8.2.1. Sincronización del estro con ovulación utilizando progestágenos............................................ 51 2.8.2.2. Sincronización del estro con ovulación utilizando prostaglandinas F2α ………………………… 52 2.9. Gestación y su diagnóstico en la cabra …………………………………………………………………………. 53 2.9.1. Fisiología de la gestación …………………………………………………………………………………. 53 2.9.1.1. Progestación ………………………………………………………………………………………...... 53 2.9.2. Endocrinología de la gestación …………………………………………………………………………... 54 2.9.2.1. Progesterona ………………………………………………………………………………………….. 54 2.9.2.2. Estrógenos …………………………………………………………………………………………….. 55 2.9.2.3. Lactógenos placentarios …………………………………………………………………………….. 55 2.9.2.4. Prolactina.……………………………………………………………………………………………… 55 2.9.3. Métodos de diagnóstico de gestación …………………………………………………………………… 56 2.9.3.1. Métodos clínicos ……………………………………………………………………………………… 57 2.9.3.2. Métodos laboratoriales ……………………………………………………………………………….. 60 2.10. Inseminación artificial en la especie caprina …………………………………………………………………. 63 2.10.1. Aplicaciones, ventajas y desventajas de la inseminación artificial..……………………………. 63 2.10.2. Momento óptimo de inseminación …………………………………..……………………………… 64 2.10.3. Técnicas de inseminación artificial………………………………….………………………………… 65 2.10.3.1. Inseminación intravaginal …………………………………..………………………………….. 65 2.10.3.2. Inseminación pericervical ………………………………..…………………………………….. 65 2.10.3.3. Inseminación cervical profunda ……….……………….……………………………………... 66 2.10.3.4. Inseminación intrauterina por laparoscopia………………………………………………... 66 Indice III 3. MATERIAL Y MÉTODOS (GENERAL)……………..………………………………………………………………….. 68 3.1. Valoración de la calidad seminal in vitro …………………………………………………………………….. 69 3.1.1. Animales …………………………………………………………………………………………………… 69 3.1.2. Alojamiento, alimentación y plan sanitario …………………………………………………………. 69 3.1.3. Recogida seminal ………………………………………………………………………………………… 71 3.1.4. Contrastación seminal ………………………………………………………………………………….. 72 3.1.4.1. Pruebas macroscópicas ………………………………………………………………………….. 72 3.1.4.2. Pruebas microscópicas …………………………………………………………………………… 72 3.1.5. Procedimientos de diluyoconservación seminal ………………………………………………….. 76 3.1.5.1. Lavado ……………………………………………………………………………………………… 76 3.1.5.2. Dilución …………………………………………………………………………………………….. 77 3.1.5.3. Equilibrado …………………………………………………………………………………………. 78 3.1.6. Protocolos de congelación y conservación seminal ……………………………………………… 79 3.1.7. Descongelación y valoración de la calidad seminal post-descongelación …………………… 79 3.2. Sincronización del celo, inseminación artificial y tasa de fertilidad ……………………………………. 81 3.2.1. Animales …………………………………………………………………………………………………… 81 3.2.2. Tratamiento de inducción y sincronización del celo y la ovulación ……………………………. 81 3.2.3. Momento y procedimiento de la inseminación artificial ………………………………………….. 82 3.2.4. Preparación de las dosis de inseminación artificial ………………………………………………. 83 3.2.5. Diagnóstico de gestación ………………………………………………………………………………. 84 3.2.6. Parto, fertilidad y prolificidad …………………………………………………………………………. 84 4. EXPERIENCIAS …………………………………………………………………………………………………………. 86 4.1. Experiencia I: Utilización de los ultracongeladores de -152ºC para la preservación del semen en la especie caprina: resultados in vitro y fertilidad tras inseminación artificial ……………………… 88 4.1.1. Introducción ………………………………………………………………………………………………. 88 4.1.2. Material y métodos ………………………………………………………………………………………. 90 4.1.2.1. Experimento 1 ……………………………………………………………………………………… 90 I. Animales …………………………………………………………………………………….. 90 II. Diseño experimental ………………………………………………………………………... 90 III. Recogida y evaluación seminal …………………………………………………………… 90 IV. Procesado seminal …………………………………………………………………………. 91 V. Congelación y descongelación seminal …………………………………………………. 92 4.1.2.2. Experimento 2 ……………………………………………………………………………………… 93 I. Animales …………………………………………………………………………………… 93 II. Sincronización del celo y ovulación. Detección de celos ………………………………. 93 III. Diseño experimental e inseminación artificial …………………………………………… 94 IV. Diagnostico de gestación y tasas de fertilidad ………………………………………….. 95 4.1.2.3. Análisis estadístico ……..…………………………………………………………………………. 95 4.1.3. Resultados ……………………………………………………………………………………………….. 98 4.1.4. Discusión ………………………………………………………………………………………………….. 104 Indice IV 4.2. Experiencia II: Influencia de la temperatura de conservación (37, 20, 4, -196ºC) y del pool seminal en la calidad espermática de los machos cabríos de raza Majorera……………………………………… 109 4.2.1. Introducción …………………………………………………………………………………………………. 110 4.2.2. Material y métodos …………………………………………………………………………………………. 111 4.2.2.1. Experimento I …………………………………………………………………………………………. 111 I. Animales ………………………………………………………………………………………... 111 II. Diseño experimental …………………………………………………………………………... 111 III. Recogida y valoración espermática …………………………………………………………. 112 IV. Procesado seminal: congelación y descongelación ……………………………………… 112 4.2.2.2. Experimento II ……………………………………………………………………………………..... 114 I. Animales ……………………………………………………………………………………... 114 II. Diseño experimental ………………………………………………………………………... 114 III. Sincronización y detección de celos ……………………………………………………… 114 IV. Inseminación artificial, diagnóstico de gestación y fertilidad ………………………… 115 4.2.2.3. Análisis estadístico..........…………………………………………………………………………. 116 4.2.3. Resultados…..…………………………………………………………………………………………….. 119 4.2.4. Discusión..………………………………………………………………………………………………….. 126 4.3. Experiencia III: Viabilidad espermática en muestras de semen caprino conservadas en un contenedor de transporte (vapores de nitrógeno líquido)……………………………………………….. 130 4.3.1. Introducción ………………………………………………………………………………………………. 131 4.3.2. Material y métodos ………………………………………………………………………………………. 132 4.3.2.1. Animales ……………………………………………………………………………………………. 132 4.3.2.2. Recogida seminal …………………………………………………………………………………. 132 4.3.2.3. Evaluación y procesado seminal ………………………………………………………………… 132 4.3.2.4. Congelación seminal, almacenamiento y descongelación …………………………………… 133 4.3.2.5. Características del contenedor del transporte seco ………………………………………….. 134 4.3.2.6. Análisis estadístico ………………………………………………………………………………... 135 4.3.3. Resultados ………………………………………………………………………………………………… 137 4.3.4. Discusión ………………………………………………………………………………………………….. 140 5. CONCLUSIONES ……………………………………………………………………………………………………… 143 6. RESUMEN ……………………………………………………………………………………………………………….. 146 7. ABSTRACT ……………………………………………………………………………………………………………… 150 8. BIBLIOGRAFÍA.………………………………………………………………………………………………………….... 153 1. INTRODUCCIÓN Revisión bibliográfica 8 La masa parenquimatosa fundamental del testículo es mantenida por un armazón o estroma de tejido conectivo fibroso. La fracción más densa y compacta de dicho estroma corresponde a la túnica albugínea envolvente. Desde la cara profunda de la misma se proyectan, hacia el interior del testículo, pequeños tabiques o septos, de tal modo que generalmente confluyen hacia el centro, generando una franja conectiva que se describe como mediastino del testículo (Orsi y cols., 1984; Delgadillo, 2005). Dicho parénquima se reagrupa en los espacios intersticiales como lobulillos testiculares, integrados por un número variable de túbulos seminíferos y de intersticio. Los lobulillos se dirigen hacia la periferia como túbulos seminíferos contorneados (largos y de trayecto tortuoso) para transformarse en túbulos seminíferos rectos a la altura del mediastino (Smith, 1986; Batista y cols., 2002). Adyacente a la membrana basal de los túbulos, se desarrolla una densa capa de células epiteliales espermatogénicas mantenidas por otras de sostén, las células de Sertoli, de marcada actividad metabólica (Ahmad y Noakes, 1995). La fracción extratubular la constituye el intersticio, que se agrupa longitudinalmente entre los túbulos adyacentes (Orsi y cols., 1984). Las grandes células que lo integran, células de Leydig, sintetizan testosterona, encargada de activar la gametogénesis e imprimir en el macho los atributos y caracteres sexuales secundarios, así como la líbido. 2.1.2. EPIDÍDIMO Y CONDUCTO DEFERENTE El epidídimo aparece como un órgano coniforme, alargado y adosado a la extremidad cefálica y borde epididimario del testículo (Delgadillo, 2005). La primera porción es la cabeza del epidídimo, íntimamente unida a dicha extremidad del testículo, pues sirve como receptáculo de los espermatozoides producidos por el mismo. El cuerpo del epidídimo es la porción adyacente al borde epididimario del testículo; esta estructura se va estrechando progresivamente, permaneciendo unido al borde testicular por el mesorquio. Por último, la cola del epidídimo es continua a la extremidad caudal del testículo (Ahmad y Noakes, 1995). En el caso de los rumiantes, la cabeza del epidídimo se tuerce sobre la extremidad cefálica del testículo, pero el cuerpo desciende por la cara medial testicular (Smith, 1986; Constantinescu, 2001). En cuanto a su constitución intrínseca, en la cabeza del epidídimo podemos distinguir un número indeterminado de lobulillos epididimarios glandulares (Batista y cols., 2002). A los centros tubulares de cada lobulillo van a desembocar los conductillos eferentes, procedentes de Revisión bibliográfica 9 la red testicular y que alcanzan el epidídimo atravesando la túnica albuguínea. Éstos se encargan de transportar los espermatozoides inmaduros y de favorecer el contacto con las secreciones del epidídimo, dotándolos de motilidad. Los espermatozoides son recogidos por el conducto del epidídimo, que recorre el cuerpo y cola del mismo. Consta de numerosas asas y circunvoluciones, donde se almacenan billones de espermatozoides, completando su maduración hasta que tenga lugar la eyaculación (Smith, 1986; Constantinescu, 2001). Desde este punto, las contracciones peristálticas irán empujando a los espermatozoides hacia el conducto deferente. Los conductos deferentes son los encargados de vehicular los espermatozoides hasta la porción pelviana de la uretra. Presenta, a lo largo de todo su recorrido, tres trayectos principales: extraabdominal, intraabdominal y un último trayecto intrapélvico (Constantinescu, 2001). Camina, al principio, por la cara medial del testículo, adyacente al epidídimo hasta su incorporación al cordón espermático, ocupando en este último una posición craneomedial en el caso de los rumiantes (Delgadillo, 2005). Posteriormente, a través del canal inguinal, se integra directamente a la cavidad abdominal para alcanzar el pliegue genital, cruzando medialmente el uréter del lado correspondiente, iniciando así la porción pelviana del conducto (Smith, 1986). A la altura del cuello de la vejiga se engrosa formando la ampolla, antes de convertirse en conducto eyaculador en su unión con la uretra. 2.1.3. CORDÓN ESPERMÁTICO De origen básicamente vascular, se extiende entre el canal inguinal y la extremidad cefálica del testículo. Está constituido por vasos testiculares, los plexos nerviosos y linfáticos y el conducto deferente. La referencia central corresponde al trayecto de la arteria testicular y sus ramas terminales. En torno a su trayecto tortuoso y dependiente de la vena testicular, se agrupa un denso plexo venoso, o plexo pampiniforme, formando una red tupida en el caso de los ungulados (Garrett, 2001; Delgadillo, 2005). 2.1.4. GLÁNDULAS ACCESORIAS Las glándulas accesorias se encuentran localizadas en la pared dorsal de la uretra pelviana, a cuyo interior vierten su secreción, dotando al material seminal de las propiedades físico-químicas necesarias para la viabilidad, motilidad y capacitación fecundante de los espermatozoides Revisión bibliográfica 10 (Delgadillo, 2005). Las glándulas accesorias son la próstata, las glándulas bulbouretrales y las glándulas vesiculares. I. Próstata Esta glándula accesoria es de emplazamiento retroperitoneal y está localizada inmediatamente caudal a las glándulas vesiculares. En el caso de los rumiantes, está compuesta por el cuerpo de la próstata, adosado a la pared dorsal de la uretra y de escaso desarrollo, y por una abundante porción diseminada presente en la pared uretral (Constantinescu, 2001). La cápsula prostática es fibromuscular, cuya naturaleza permite, en el momento de la eyaculación, de la extrusión de las secreciones a la luz uretral a través de numerosos conductillos prostáticos que desembocan en la mucosa (Smith, 1986). II. Glándulas bulbouretrales El par de glándulas bulbouretrales (de Cowper) se localizan, en general, sobre la pared dorsal de la extremidad caudal de la uretra pelviana, relacionándose con el bulbo del pene (Delgadillo, 2005). Aparecen cubiertas por músculos concretos (bulboesponjoso y bulboglandular) pertenecientes a la porción urogenital del periné, muchas de cuyas fibras pueden penetrar entre los septos conectivos de la glándula (Garrett, 2001). El líquido segregado, lubricante de la mucosa uretral, es rico en iones fundamentales que ejercen sobre el material seminal una decidida actividad espermiocinética. Cada cuerpo glandular drena hacia la uretra por su propio y único conducto bulboglandular, cuya desembocadura reside en el llamado receso uretral, una invaginación dorsal de la mucosa que marca en los rumiantes el comienzo de la porción peneana de la uretra (Constantinescu, 2001). III. Glándulas vesiculares Son dos porciones glandulares asociadas al origen de la porción pelviana de la uretra y prolongadas sobre el cuello de la vejiga urinaria, lateral a las ampollas de los conductos deferentes (Delgadillo, 2005). En el caso del ganado caprino, son muy compactas y de superficie lobulada, de forma casi esférica, de aspecto nodular y aparecen unidas entre sí por una franja de tejido conectivo no glandular. Los dos conductos excretores atraviesan la próstata antes de terminar en el colículo seminal, anexo a la desembocadura ipsilateral del conducto deferente (Constantinescu, 2001). Revisión bibliográfica 11 2.1.5. GENITALES EXTERNOS I. Uretra La uretra se origina en el cuello de la vejiga de la orina. Su porción pélvica, envuelta por el músculo uretral estriado, recibe secreciones de diversas glándulas y las conduce a una segunda porción peneana fuera de la cavidad pélvica (Constantinescu, 2001). A este nivel, se le unen otros dos cuerpos cavernosos para formar el cuerpo del pene, que se proyecta por debajo de la piel de la pared corporal. II. Pene En todos los mamíferos domésticos, el pene presenta un sustrato vascular de tejido eréctil que garantiza la turgencia o erección necesaria para la protrusión, intromisión y eyaculación. Este tejido eréctil (cavernoso y esponjoso) es, además, determinante de la forma general y grado de desarrollo del órgano, el cual comprende un tamaño medio en el caso de los rumiantes (Smith, 1986). Por otro lado, la naturaleza fibroelástica del pene de los rumiantes condiciona el tipo de reflejos eyaculadores (Garrett, 2001). De manera general, podemos distinguir diferentes regiones de relevancia anatómica: la raíz, el cuerpo y el glande del pene. La raíz del pene corresponde a su extremo proximal y la forman un par de pilares y el bulbo del pene. Los primeros representan el origen de los cuerpos cavernosos; el segundo constituye la expansión globulosa que marca el principio del cuerpo esponjoso del pene. El bulbo del pene manifiesta una notable protrusión, resultado del especial desarrollo del tejido esponjoso y también al espesor del músculo bulboesponjoso que lo cubre (Constantinescu, 2001). El cuerpo del pene es la parte comprendida entre la convergencia de los pilares y el glande, por lo que su base anatómica se corresponde con los cuerpos cavernosos. Está especialmente desarrollado en el caso de los ungulados, al menos en longitud, pues no solo comprende la larga porción prepucial, sino también la llamada porción libre, que se prolonga más allá de la inserción del prepucio (Constantinescu, 2001). En el caso de los rumiantes, el cuerpo del pene es largo pero bastante fino y cilíndrico (Smith, 1986). El glande del pene constituye el ensanchamiento o expansión del cuerpo esponjoso del extremo distal del cuerpo peneano. En pequeños rumiantes, está poco desarrollado en virtud de Revisión bibliográfica 12 la escasa cantidad de tejido esponjoso y, como resultado, el glande del pene del macho cabrío es corto y casi hemisférico (Smith, 1986). Sin embargo, lo más característico es la gran longitud del proceso uretral (tejido eréctil); desde la base ventral del glande, se proyecta libremente en una longitud de 2-3 cm en el macho cabrío (Delgadillo, 2005). III. Prepucio El prepucio es la vaina o envoltura cutánea que protege a la porción libre del pene no erecto (Delgadillo, 2005). La piel del mismo se continúa dorsalmente con la de la pared del abdomen y caudalmente con la del escroto. Cranealmente aparece abierto al exterior por un orificio prepucial, a través del cual se evagina la porción libre del pene (Garrett, 2001). 2.2. GAMETOGÉNESIS EN EL MACHO CABRÍO 2.2.1. ESPERMATOGÉNESIS La espermatogénesis es el proceso mediante el cual las células germinales indiferenciadas, asentadas en la base de los túbulos seminíferos, se dividen por mitosis para mantener el mismo número de espermatogonias y cíclicamente producir espermatocitos primarios que en su momento, por meiosis, producen espermátidas haploides, que finalmente se diferencian en espermatozoides que se liberan en el lumen del túbulo seminíferos (Jonhson, 1991). En la mayoría de los mamíferos, este proceso se lleva a cabo en los túbulos seminíferos a lo largo de toda la vida reproductiva del macho; sin embargo, en algunas especies, la espermatogénesis puede resultar interrumpida o subdividida en una serie de fases, basadas en situaciones ambientales que se traducen en señales hormonales que estimulan o inhiben la espermatogénesis (Kretser y Kerr, 1994). En la reproducción sexual, presente en los animales domésticos, el genoma de las células reproductoras se mezcla por meiosis para dar origen a una célula genéticamente diferente. En el ciclo reproductivo sexual, las generaciones de células haploides llevan un juego sencillo de cromosomas y cuando los genomas de dos células haploides se mezclan y fusionan dan origen a una célula diploide. Las células proliferan mediante división mitótica (fase diploide) y posteriormente estas células diploides generarán nuevas células haploides mediante el proceso conocido como meiosis (Alberts y cols., 2002) Revisión bibliográfica 13 2.2.1.1. Fases de la espermatogénesis I. Espermatocitogénesis La espermatocitogénesis es la primera fase de la espermatogénesis e involucra a las células germinales o espermatogonias, localizadas en la capa más próxima a la base del túbulo seminífero (Johnson, 1991). Existen diferentes clasificaciones de estas células, las cuales se basan en el tipo de coloración que adquiere el núcleo (cromatina). De esta forma, se pueden distinguir 3 tipos de espermatogonias: la espermatogonia A que tiene un núcleo con granulaciones finas de cromatina, la espermatogonia intermedia que se diferencia básicamente por la presencia de finas placas de cromatina junto a la membrana nuclear y la espermatogonia B que tiene un núcleo con gránulos fuertemente teñidos próximos a la membrana nuclear (Setchell, 1984; Johnson, 1991; Kretser y Kerr, 1994). A partir de las espermatogonias B, tiene lugar un proceso de meosis que terminará por generar los espermatocitos primarios y secundarios. El proceso de meiosis involucra dos tipos de divisiones celulares: en la primera, que involucra los espermatocitos primarios, los cromosomas aparecen como pares de cromátidas (Kretser y Kerr, 1994). Durante esta primera división meiótica, en los espermatocitos primarios, rápidamente se desvanece la membrana nuclear, ocurre la metafase, anafase y la telofase: los espermatocitos secundarios son el resultado de esta división y contienen un número haploide de cromosomas duplicados (Johnson, 1991). Los espermatocitos secundarios permanecen en un período corto de interfase, hasta justo antes de la segunda división meiótica, produciendo espermátidas con un número haploide de cromosomas (Kretser y Kerr, 1994). II. Espermiogénesis Como continuación del proceso de espermatocitogénesis, las espermátidas esféricas resultantes del mismo se transforman en espermátidas maduras, en la última fase de diferenciación conocida como espermiogénesis. Este proceso incluye un complejo número de cambios conformacionales que consisten básicamente en la pérdida de orgánulos y citoplasma, quedando solamente vestigios del Aparato de Golgi (que posteriormente formará el acrosoma), mitocondrias y centriolos, que permitirán la formación del espermatozoide maduro. Las etapas básicas de los cambios metamórficos de los espermatocitos son cuatro: Revisión bibliográfica 14 - Fase de Golgi: se forman gránulos proacrosómicos que convergen posteriormente en un solo gránulo (dentro del aparato de Golgi) y se inicia la formación de la cola (Kretser y Kerr, 1994). - Fase de encasquetamiento: en esta fase, el gránulo acrosómico se adhiere a la superficie del núcleo y el flagelo primitivo comienza a alongarse (Kretser y Kerr, 1994). - Fase acrosómica: en esta fase ocurren cambios en el núcleo, el acrosoma y la cola de las espermátidas. En su fase final, el acrosoma se condensa y se alarga y hay un desplazamiento del citoplasma en sentido contrario al núcleo (Ramalho-Santos y cols., 2002). - Fase de maduración: en el núcleo, la cromatina se condensa en el núcleo, así como se forma una vaina fibrosa alrededor del axonema, cubriéndolo desde el cuello hasta el inicio de la pieza terminal (Kretser y Kerr, 1994). III. Espermiación Representa la liberación de los espermatozoides en el interior de los túbulos seminíferos. Al desprenderse, los espermatozoides aún conservan pequeños restos de citoplasma, estas estructuras se conocen como gotas citoplasmáticas. El resto del citoplasma de la espermátida (cuerpos residuales) es fagocitado por las células de Sertoli (Garner y Hafez, 2000). 2.2.2. MORFOLOGÍA DEL ESPERMATOZOIDE El producto final de la espermatogénesis es una célula altamente especializada, el espermatozoide. La estructura del espermatozoide maduro está compuesto por las siguientes partes: cabeza, cuello y flagelo. La característica principal de la cabeza del espermatozoide es el núcleo aplanado oval, que contiene cromatina muy compacta. La cromatina condensada consiste en un complejo formado por ácido desoxirribonucléico (ADN) y proteínas básicas llamadas protaminas espermáticas. Su contenido de ADN nuclear es haploide; esto es, posee la mitad de cromosomas que el núcleo de las células somáticas de la misma especie (Johnson, 1991). El extremo anterior del núcleo espermático está cubierto por el acrosoma, un delgado saco membranoso de doble capa ubicado sobre el núcleo y que se desarrolla durante las últimas etapas de la formación del espermatozoide. Esta estructura, en forma de casquete, contiene Revisión bibliográfica 15 acrosina, hialuronidasa y otras enzimas hidrolíticas que participan en el proceso de la fecundación. El segmento ecuatorial del acrosoma, junto con el segmento anterior de la región post-acrosómica, son las regiones que se fusionan inicialmente con la membrana del oocito durante la fecundación (Dadoune, 1993). La cola espermática está formada por el cuello y los segmentos medio, principal y caudal. El cuello forma la placa basal que se une a una depresión en el extremo posterior del núcleo. Ésta es continua en sentido posterior, y tiene nueve fibras gruesas que se proyectan hacia atrás a través de la mayor parte de la cola. La región comprendida entre el cuello y el anillo citoplasmático es el segmento medio. El centro de este segmento medio, junto con toda la longitud de la cola, comprende el axonema, el cual se compone de nueve pares de túbulos dispuestos radialmente alrededor de dos filamentos centrales. El axonema y las fibras densas asociadas del segmento medio están cubiertos por numerosas mitocondrias. La vaina mitocondrial, dispuesta en un patrón helicoidal alrededor de las fibras longitudinales de la cola, es la fuente de energía necesaria para la motilidad espermática (Dadoune, 1993). La gota citoplasmática, que suele desprenderse de los espermatozoides tras la eyaculación, está compuesta de citoplasma residual (Johnson, 1991).. Esta gota citoplasmática puede retenerse en la región del cuello, donde se conoce como gota proximal, o cerca del anillo citoplasmático, donde se conoce como gota distal. 2.2.3. TRANSPORTE DEL SEMEN Los espermatozoides provenientes de la rete testis son en su mayoría inmóviles e incapaces de mostrar un desplazamiento lineal. Por tanto, a su llegada a la cabeza del epidídimo, los espermatozoides son inmaduros. La motilidad progresiva se adquiere gradualmente cuando el espermatozoide se desplaza a lo largo del epidídimo; por lo tanto, el número de células móviles se incrementa en el cuerpo y alcanza su máximo cuando entra a la región de la cola, al mismo tiempo, el movimiento cambia de vibratorio a un desplazamiento rectilíneo (Setchell, 1991; Yanagimachi, 1994; Gatti y cols., 2004). Revisión bibliográfica 16 2.3. PRODUCCIÓN SEMINAL EN EL MACHO CABRÍO 2.3.1. MÉTODOS Y FRECUENCIA DE RECOGIDA SEMINAL 2.3.1.1. Métodos de extracción seminal Cualquier método de recogida seminal debería garantizar la calidad de los eyaculados recogidos, no entrañar peligro ni dolor para el animal y permitir la obtención de volúmenes seminales semejantes a los de la monta natural, evitando tanto la contaminación como el shock térmico. Bajo estas características, la recogida seminal en macho cabrío suele realizarse mediante vagina artificial (Ritar y SÁlamon, 1982; Greyling y Grobbelaar, 1983) o electroeyaculación (Greyling y Grobbelaar, 1983; Loubser y cols., 1983a). Otro método menos extendido de recogida seminal es mediante punción, a través de la cola del epidídimo (Gilmore y cols., 1998). La vagina artificial es, hoy en día, el método más extendido para la obtención de semen de macho cabrío, ya que permite utilizar presiones y temperaturas adecuadas para estimular la eyaculación. Existen diversas variedades de vaginas artificiales, pero todas tienen en común el hecho de que proporcionan los estímulos elásticos, mecánicos (presión) y térmicos (temperatura) primordiales para la erección del pene y eyaculación (Evans y Maxwell, 1987). De manera general, la vagina artificial consiste en un cilindro rígido externo de aproximadamente 20 x 5.5 cm de goma fuerte, plástico o cualquier material sintético que tenga buenas propiedades aislantes; también incluye un cilindro interno de goma flexible de unos 2-3 cm y con una longitud superior al cilindro externo que nos permita reinvertir para formar un depósito estanco donde introduciremos agua atemperada. En el momento de la recogida seminal, la temperatura de la cara interna de la vagina artificial no deberá ser superior a 40-44ºC, para evitar quemaduras en la mucosa del pene. Finalmente, para conseguir una adecuada turgencia y presión, se insufla aire para dar la presión adecuada a la vagina. La vagina va unida a un embudo y a un tubo colector, donde quedara recogido el semen tras el momento del eyaculado (Ritar y SÁlamon, 1982; Greyling y Grobbelaar, 1983). Para la recogida suele recurrirse a la inmovilización de una hembra ovariectomizada (Roca y cols., 1992a; Pérez y Mateos, 1996), ya que la ausencia de ovarios en la hembra le proporciona un estado reproductivo constante a lo largo de las sucesivas recogidas. Muchos autores Revisión bibliográfica 17 practican una estrogenización periódica de la hembra mientras se prolonguen los períodos de recogida seminal (Chemineau, 1986; Pérez y Mateos, 1996). Sin embargo la estrogenización puede restringirse únicamente a las primeras recogidas (Peskovatskov, 1985), cuando los machos no han adquirido la suficiente confianza como para permitir la cercanía del operario durante la monta. Esta tarea de aprendizaje depende de varios factores como la destreza del técnico, del temperamento del animal y de su comportamiento sexual (Leboeuf y cols., 2000) entre otros. De manera general, el operario se coloca en el lado derecho de la hembra de una forma tranquila y discreta. En el momento en que el macho sube sobre la hembra, el operario desviará el pene hacia la vagina artificial para que el macho eyacule dentro. Cuando el semental empuja para la eyaculación, el operario permite que la vagina artificial se mueva con el empuje, manteniéndola alineada con el pene. Una vez se produce la eyaculación, la vagina que estaba en posición horizontal se coloca ahora en posición vertical y el eyaculado fluye hacia el interior del tubo graduado (Batista y cols., 2011). La electroeyaculación es un mecanismo que nos permite obtener semen de todos los animales que posean intacta la vía neuronal implicada. Sin embargo, la principal limitación es la necesidad de someter al animal a un tratamiento de tranquilización o incluso anestesia general, ya que este método puede producir molestias al animal. El electroeyaculador consta de un vástago (fuente de electrodos) y una fuente de voltaje. El vástago debe introducirse entre 7 y 9 cm en el recto con los electrodos en posición ventral. Se necesita de unas 3 a 8 series, entre 2 y 5 voltios, para lograr un eyaculado, los estímulos se aplican siguiendo un patrón de varios segundos de estímulo seguido de varios segundos de parada. Sin embargo, este método proporciona eyaculados de peor calidad, con mayor volumen, pero menor concentración, menor motilidad y/o menor porcentaje de espermatozoides vivos (Greyling y Grobbelaar, 1983), así como peores resultados para la criopreservación seminal (Jiménez-Rabadán y cols., 2012). Una tercera forma de recoger semen consiste en la recogida seminal de la cola del epidídimo directamente (Fournier-Delpech y cols., 1979; Gilmore y cols., 1998). Este método es de gran utilidad en aquellos casos que se precise recoger semen de un macho recién muerto. Revisión bibliográfica 24 Más recientemente, se han utilizado diferentes sistemas automatizados de análisis espermático, que permiten definir de una manera más objetiva y precisa el porcentaje de espermatozoides motiles, así como las características del movimiento espermático (Salvador y cols., 2006; Dorado y cols., 2007; Batista y cols., 2009, 2011). Estos sistemas permiten establecer, de un modo muy fiable, correlaciones entre la calidad del movimiento de los espermatozoides y la capacidad fecundante de los mismos. Los valores de motilidad progresiva del semen fresco presentan resultados que oscilan entre un 53% en la Moxoto (Feliciano-Silva y cols., 1992) a un 87% en la Murciano-Granadina (Roca y cols., 1992a). En el caso de las razas caprinas canarias, la motilidad progresiva media se encuentra en valores en torno a un 65-80% (Cabrera y cols., 2005; Batista y cols., 2009, 2011). La vitalidad espermática o porcentaje de espermatozoides vivos, se determina habitualmente mediante tinción supravital donde los espermatozoides vivos (con membrana intacta) no permitirán la entrada del colorante a su citoplasma, y se observarán sin teñir. Por otro lado, los espermatozoides que tengan la membrana citoplasmática dañada, permitirán la entrada de la tinción y el espermatozoide adquirirá una coloración determinada. Entre las tinciones vitales, la técnica más tradicional es la tinción de eosina-nigrosina, siendo una técnica muy fácil y rápida de realizar, valorándose la extensión resultante bajo microscopio a 400-1000 aumentos (Greyling y Grobbelaar, 1983; Loubser y Van Niekerk, 1983a,b; Karatzas y cols., 1997) y se hace un recuento de 200 espermatozoides, determinando el porcentaje de espermatozoides con membrana intacta (células no teñidas) y el porcentaje de espermatozoides dañados y/o muertos (células teñidas de color rosado). No obstante, el principal inconveniente de esta técnica es que al tratarse de un colorante hipotónico que se añade a una muestra en fresco, puede favorecer la presentación de morfologías anormales de los espermatozoides, especialmente de la cola (Lebouef y cols., 2000). Por esta razón, en la mayoría de los laboratorios más sofisticados de tecnología seminal, este procedimiento ya no se utiliza para determinar la vitalidad de las muestras seminales (Salvador y cols., 2006; Hidalgo y cols., 2007; Batista y cols., 2009), siendo reemplazados por técnicas más específicas (hypo-osmotic swelling test, HOST). Revisión bibliográfica 25 El porcentaje de morfoanoamalías se corresponde con el porcentaje de espermatozoides que presenten cualquier tipo de alteración en las distintas partes que componen esta célula: cabeza, pieza intermedia y cola. La determinación de morfoanomalías espermáticas es un aspecto de importancia fundamental en los procesos de contrastación seminal, puesto que la motilidad espermática y, por tanto, la capacidad fertilizante de los espermatozoides están íntimamente relacionadas con la morfología espermática. Tradicionalmente, la determinación del porcentaje de morfoanomalías se realiza mediante la utilización de la tinción de eosina-nigrosina, de manera similar a lo descrito en el procedimiento de vitalidad espermática (Loubser y Van Niekerk, 1983; Ali y Mustafa, 1986; Skalet y cols., 1988) o mediante la técnica de la “gota gruesa”, fijando la muestra de semen en solución fosfato tamponada con glutaraldehído al 2% y a 37ºC, para contar a continuación 100-400 espermatozoides bajo microscopio de contraste de fases a 1000 aumentos (Roca y cols., 1992a,b; Salvador y cols., 2006). Asimismo, otros autores (Paulenz y cols., 2005; Batista y cols., 2011) utilizan una tinción específica denominada Spermac®, que permite distinguir además de las acrosomías, el porcentaje de espermatozides con morfología anormal. Finalmente, algunos investigadores (Hidalgo y cols., 2006, 2007; Dorado y cols., 2007) utilizan equipos más sofisticados (análisis computerizado de la morfología espermática) para la evaluación de las morfoanomalías presentes en el eyaculado. El porcentaje de morfoanomalías del semen fresco suele situarse por debajo del 10-15% (Dorado y cols., 2007; Batista y cols., 2009, 2011), mientras que una vez congeladodescongelado, el porcentaje de espermatozoides con morfología anormal oscilaba entre un 20 y un 50% (Singh y cols., 1995; Hidalgo y cols., 2007; Dorado y cols., 2007; Batista y cols., 2009). La valoración del estado del acrosoma presenta un gran interés a la hora de determinar la calidad seminal de un eyaculado, sobre todos en los procesos de congelación y descongelación seminal, ya que la alteración y/o separación del acrosoma antes de tiempo, se relaciona con un proceso prematuro de capacitación espermática y, por tanto, con una efectividad limitada (Hidalgo y cols., 2006; Dorado y cols., 2007). Entre las diferentes técnicas que se pueden utilizar para valorar el porcentaje de acrosomas alterados, se encuentran prácticamente las mismas descritas para la valoración de las morfoanoamalías. De esta forma, se puede utilizar la prueba Revisión bibliográfica 26 de la “gota gruesa” (Memon y cols., 1985; Pintado y Pérez, 1992; Pérez y Mateos, 1996), mediante tinción Giemsa (Singh y cols, 1995) o mediante tinción supravital (Spermac®), en la que cada porción del espermatozoide (cabeza, acrosoma, pieza intermedia y cola) toma una tonalidad diferente, pudiéndose observar de esta forma más claramente cada una de las partes (Hidalgo y cols., 2007; Dorado y cols., 2007; Batista y cols., 2009, 2011). En semen fresco, los porcentajes de acrosomías se sitúan habitualmente entre un 5-10% (Hidalgo y cols., 2006; Dorado y cols., 2007; Batista y cols., 2009, 2011), se incrementan ligeramente en el semen refrigerado (Batista y cols., 2011), y muestran unos valores menos uniformes en muestras congeladas-descongeladas, con valores que oscilan entre 15 y un 50% (Chang-Yong y cols., 2006; Dorado y cols., 2007; Hidalgo y cols., 2007; Batista y cols. 2011). 2.3.3.3. Características bioquímicas I. Capacidad de endosmósis Jeyendran y cols. (1984) desarrollaron un sencillo test que determinaba la integridad funcional de la membrana espermática y cuyos resultados parecen altamente correlacionados con la fertilidad del individuo. Este test se denominó test de resistencia osmótica o HOST (Hipoosmotic Swelling Test). La funcionalidad de este test se relaciona con la capacidad de la membrana celular de permitir el paso selectivo de moléculas a través de ella. Cuando un espermatozoide es expuesto a condiciones hipoosmóticas, el agua entra en un intento de conseguir el equilibrio osmótico. Esta entrada produce un aumento del volumen celular y la membrana plasmática se expande drásticamente (Drevius y Eriksson, 1966). La zona de la cola del espermatozoide parece ser aún más sensible a este fenómeno, probablemente porque se encuentra unida de forma más débil a los filamentos de la cola; de esta manera, el enroscamiento de la cola indica también la integridad de la membrana de la cabeza (Jeyendran y cols., 1984). Revisión bibliográfica 27 El uso del HOST se recomienda como prueba adicional a las pruebas estándar de contrastación. Incluso, se ha postulado que al definirse su correlación significativa con varias de estas pruebas, podría sustituir a alguna de ellas (Garcia y cols., 1984). II. pH El pH del semen recién eyaculado se encuentra próximo a 7.4, valor próximo al detectado en otros fluidos orgánicos. Al reducir el pH seminal, se reduce también el metabolismo energético de la célula y por tanto su motilidad. El metabolismo glucolítico del espermatozoide provoca que el pH intracelular disminuya y el metabolismo celular quede reducido. El ácido láctico es principal metabolito resultante de esta reacción metabólica y se ha utilizado como indicador de calidad seminal (Rigau y cols., 1996). La adición de sustancias tamponadoras ayudan a limitar este efecto. Con este fin se pueden utilizar tampones sencillos como bicarbonato o citrato sódico, o bien algunos más complejos (TES, HEPES, MOPS, TRIS), que además de regular el pH en un rango más amplio, no son dependientes de la temperatura (SÁlamon y Maxwell, 1995; El-Alamy y Foote, 2001) III. Osmolaridad Diversos estudios han llegado a la conclusión que ni la motilidad ni la vitalidad espermáticas se ven afectadas por la presión osmótica en rangos comprendidos entre 250 y 290 mOsm (Fraser y cols., 2001), mientras que cuando desciende por debajo de los 200 mOsm, se detecta una significativa reducción de la motilidad (Gilmore y cols., 1996; Fraser y cols., 2001) Sin embargo, los diluyentes isotónicos (300mOsm) o ligeramente hipertónicos son los que mejores resultados han dado en condiciones de utilización comercial (Meque, 2004). Revisión bibliográfica 28 2.4. DILUYENTES SEMINALES Por diluyente entendemos la solución acuosa que permite aumentar el volumen del eyaculado hasta conseguir la concentración espermática deseada y que, además, es capaz de preservar las características funcionales de las células espermáticas, así como mantener el nivel de fertilidad adecuado (Meque, 2004). De forma natural, los espermatozoides se encuentran englobados el líquido seminal, que contiene los nutrientes necesarios para que puedan mantener su actividad metabólica y le permita avanzar por el tracto genital femenino. Pero, estos nutrientes garantizan una actividad por un tiempo limitado. Para conservar espermatozoides durante periodos más prolongados sería necesario reducir su actividad metabólica, lo que se consigue mediante la dilución en un medio adecuado y reduciendo progresivamente la temperatura, de forma que no produzca shock térmico a las células seminales (Pursel y cols., 1973). 2.4.1. COMPONENTES BÁSICOS DE UN DILUYENTE De manera general, se considera que un buen diluyente debe reunir una serie de propiedades, entre las que se deberían incluir: - Aportar nutrientes necesarios para el mantenimiento metabólico de la célula espermática (carbohidratos) - Controlar el pH del medio (Bicarbonato, TRIS, HEPES) - Proteger frente al shock térmico por frío (básicamente yema de huevo) - Controlar la presión osmótica (sales, NaCl, KCl) - Evitar el desarrollo microbiano (antibióticos) 2.4.1.1. Fuentes de energía El espermatozoide tiene capacidad de obtener la energía necesaria para mantener su metabolismo celular y generar movimientos; este metabolismo tiene lugar básicamente en las mitocondrias de la pieza intermedia. Existen diversas opiniones sobre cuál es el tipo de azúcar más conveniente para un diluyente seminal. Valorando la vitalidad espermática postdescongelación, algunos investigadores han elegido la fructosa o glucosa como fuente energética (SÁlamon y Maxwell, 1995) mientras que otros ha usado la galactosa, ribosa o Revisión bibliográfica 29 trehalosa, aunque los resultados obtenidos no han superado los obtenidos con el uso de glucosa (Barrios y cols., 2000; Paulenz y cols., 2000). 2.4.1.2. Soluciones tampones y electrolitos Los espermatozoides y las bacterias contenidas en el semen producen metabolitos como el ácido láctico, por lo que son necesarias las sustancias tampón para su preservación (El-Alamy y Foote, 2001). El compuesto Tris (Hidroximetil aminometano) y el citrato sódico proporcionan una solución tampón en los diluyentes que contienen yema de huevo (Gomes y cols., 1984). Por su parte, los electrolitos son utilizados para regular la presión osmótica, siendo el cloruro de potasio y el cloruro de sodio los más habitualmente utilizados (SÁlamon y Maxwell, 1995; El-Alamy y Foote 2001). Los espermatozoides diluidos en medios hiper o hipotónicos pueden sufrir turgescencia o plasmolisis de las cabezas, respectivamente. La mayoría de los diluyentes son hipertónicos con respecto al plasma seminal, ya que estas diluciones son menos dañinas que las hipotónicas. 2.4.1.3. Estabilizadores de membrana La principal función de los estabilizadores de membrana en los diluyentes seminales consiste en prevenir o retardar las alteraciones no deseadas en la estructura y la función de las membranas de los espermatozoides (Lebouef y cols., 2000). En 1981, Watson puso de manifiesto la acción protectora de los componentes de la yema de huevo, afirmando que la lecitina y las lipoproteínas son responsables de la protección frente al choque térmico. Las lipoproteínas de la yema de huevo proporcionan la mejor protección, reduciendo la viscosidad de la membrana plasmática, aunque la albúmina sérica bovina, la fracción proteica de la yema de huevo, la caseina, los triglicéridos de la leche y el colesterol también han mostrado cierta eficacia (Gebauer y cols., 1970) Asimismo, la porción proteica que tiene la leche en el diluyente muestra funciones protectoras (Lebouef y cols., 2000), especialmente la lacto-albúmina, que permite la conservación de la integridad de la membrana plasmática y de la motilidad espermática (Watson, 1995; Ollero y cols., 1998). Revisión bibliográfica 30 Por tanto, es evdiente que la yema de huevo desempeña una función protectora sobre la integridad de la membrana espermática, aunque también puede estar implicada en la desestabilización de la misma. Este fenómeno ha sido observado por algunos investigadores, que han demostrado que al aumentar su concentración, aumenta también la frecuencia en el daño del acrosoma (Watson y Martin, 1973). 2.4.1.4. Antibióticos En machos sanos, el tejido testicular y las glándulas accesorias están libres de carga bacteriana. No obstante, durante el proceso de recogida seminal, los eyaculados pueden contaminarse (Byrne y cols., 2000). Esta contaminación bacteriana puede favorecerse por algunos componentes de los diluyentes como la glucosa y las temperaturas de conservación del semen. Para controlar el crecimiento bacteriano, es necesario añadir agentes antibióticos a los diluyentes. La contaminación bacteriana en las muestras seminales pueden producir efectos adversos como disminución de la motilidad espermática, aglutinaciones, aumento del porcentaje de acrosomías y reducción del pH hasta niveles ácidos (5.7-6.4; Althouse y cols., 2000), efectos todos que reducen el tiempo de conservación de dichas muestras. La adición de penicilina y estreptomicina fue en un principio la combinación más utilizada, posteriormente se han utilizado con éxito aminoglicósidos, entre los que se encuentra la gentamicina, neomicina y kanamicina (Anel y cols., 1998). 2.4.1.5. Agua La elaboración de los diluyentes seminales requiere de la inclusión de agua destinada a la dilución de sus diferentes compuestos. El agua debe poseer una serie de características específicas, siendo el agua bidestilada o ultrapura las más habitualmente utilizadas (Leboeuf y cols., 2000). Revisión bibliográfica 31 2.4.2. CLASIFICACIÓN DE LOS DILUYENTES La preservación seminal a temperaturas entre 0-5ºC o su congelación implica una reducción del metabolismo de los espermatozoides (Leboeuf y cols., 2000) pero no queda totalmente detenido. Por esta razón, resulta de vital importancia conservar el semen en medios que le aporten nutrientes, siendo múltiples las variedades de diluyentes que se han desarrollado, pudiendo agruparse en diluyentes naturales y diluyentes sintéticos. 2.4.2.1. Diluyentes naturales Dentro de los diluyentes naturales, el más comúnmente utilizado es la leche de vaca, bien entera, desnatada o en polvo para reconstituir. Con independencia de la presentación, debe ser calentada previamente a 92-95ºC al baño María, para de esta forma inactivar la fracción proteica que podría resultar tóxica para los espermatozoides (Evans y Maxwell, 1987). Con el mismo fin pueden ser usadas las leches vegetales, como las de frutos secos (almendras, nueces, sésamo; Sabate, 2003) o legumbres, que pueden ser un sustituto igual de válido que la leche de vaca. 2.4.2.2. Diluyentes sintéticos Los diluyentes sintéticos se caracterizan por contener amortiguadores como Tris o citrato, glucosa o fructosa como fuente de energía y yema de huevo para proteger la membrana del espermatozoide contra los bruscos cambios de temperatura (Evans y Maxwell, 1987). Los más habitualmente utilizados son aquellos a base de: - Diluyente yema de huevo-tris-fructosa - Diluyente yema de huevo-glucosa-citrato Revisión bibliográfica 32 2.5. CONSERVACION DEL SEMEN CAPRINO 2.5.1. SEMEN FRESCO El almacenamiento del semen caprino conlleva un daño ultraestructural, bioquímico y funcional, en especial el conservado a temperaturas de congelación. Un problema específico para la conservación de semen caprino ha sido el detrimento que produce el plasma seminal en la viabilidad de los espermatozoides, específicamente cuando se conserva en un medio a base de yema de huevo o de leche (Iritani y cols., 1961). Las glándulas bulbouretrales secretan una enzima (lipasa) que interacciona con los constituyentes de la leche o la yema de huevo, provocando una intensa inhibición de la motilidad espermática (Leboeuf y cols., 2000). Por esta razón, si el semen va a ser procesado (refrigeración y/o congelación) y requiere la adición de diluyentes que contengan yema de huevo o leche, es necesario retirar el plasma seminal presente en el eyaculado, mediante el lavado de los espermatozoides, justo tras su recogida (Pellicer, 1995). Mediante este proceso, conseguimos aumentar la vitalidad y la motilidad de los espermatozoides durante su almacenamiento en medios a base de yema de huevo o de leche (Corteel, 1975; Leboeuf y cols., 2000). Los eyaculados obtenidos en la estación reproductiva contienen mayor cantidad de plasma seminal que los obtenidos durante la estación no reproductiva, y se observa una correlación negativa entre el volumen de plasma seminal en el eyaculado y el porcentaje de células móviles tras la conservación del mismo (Corteel, 1981). En relación con el lavado, hay que señalar que se trata de un proceso complejo y lento, y también provoca una cierta pérdida de espermatozoides (Corteel, 1981). Además, no parece mejorar la fertilidad de los espermatozoides en razas caprinas de leche (Corteel, 1975) ni de lana (Ritar y SÁlamon, 1983). Por otro lado, la viabilidad del semen conservado a temperaturas de 20-25ºC, en diluyentes a base de leche (Paulenz y cols., 2005; Salvador y cols., 2006; Mara y cols., 2007) presenta valores inferiores al 50% tras 12 horas de conservación, alcanzando valores más bajos (que podrían limitar su aplicabilidad en condiciones de campo) tras 24 horas de preservación a temperatura ambiente. Revisión bibliográfica 33 2.5.2. SEMEN REFRIGERADO El semen caprino se ha conservado a temperaturas de refrigeración que oscilan entre 2 y 15ºC, pero sobre todo se ha evaluado entre 4-5ºC (Leboeuf y cols., 2000). Se han testado números diluyentes, cara a definir in vitro la viabilidad y longevidad del semen, así como la fertilidad asociada. De esta forma, se han evaluado diluyentes a base de citrato de sodio-yema de huevo, citrato de sodio-fructosa-yema de huevo, con leche entera, desnatada, o reconstituida, con o sin yema de huevo, CUE (Universidad Cornell Extender), Spermasol, Neoseminan,, entre otros muchos (Leboeuf y cols., 2000). La fertilidad y vitalidad de los espermatozoides conservados a temperatura de refrigeración, en los diluyentes ya mencionados, durante 5 a 72 horas (Roca y cols., 1997; Leboeuf y cols., 2000; Paulenz y cols., 2005; Salvador y cols., 2006), muestran una gran variabilidad. La elevada variabilidad que se detecta en la viabilidad espermática del semen conservado como semen refrigerado, puede deberse a que la mayoría de los investigadores utilizan semen sin lavar. En consecuencia, las interacciones que el plasma seminal experimenta con la yema de huevo y los constituyentes de la leche presente en los diluyentes, puede terminar generando esa disminución de la viabilidad espermática, sobre todo cuanto más se prolongue esa interacción. Lla mayoría de los resultados descritos para viabilidad y fertilidad de espermatozoides no lavados, conservados en refrigeración durante 5-8 horas son satisfactorios, pero períodos de almacenamiento superiores (por encima de 12-24 horas) muestran una reducción de la fertilidad (Leboeuf y cols., 2000; Paulenz y cols., 2005; Salvador y cols., 2006). Revisión bibliográfica 40 2.5.4. DESCONGELACIÓN Y CONTRASTACIÓN SEMINAL POST-DESCONGELACION 2.5.4.1. Procedimiento Tradicionalmente, la descongelación del semen se realiza en baño María, a temperaturas de 3040ºC durante 10-120 segundos (Corteel, 1975; Ritar y SÁlamon 1991; Sinha y cols., 1995; Dorado y cols., 2007), con ventajas frente a la descongelación a temperatura ambiente o a 5ºC. En algunos trabajos se ha obtenido mejor calidad seminal con mayores velocidades de descongelación, comprendiendo temperaturas del orden de 55-70ºC durante 7 segundos (Tuli y cols., 1991). 2.5.4.2. Contrastación del semen congelado-descongelado A la hora de evaluar el semen congelado y descongelado, el factor mas estudiado es la motilidad, seguida por el porcentaje de acrosomías, la resistencia osmótica, el porcentaje de espermatozoides vivos, porcentaje de anormalidades espermáticas, actividad enzimática intracelular o extracelular y, finalmente, otras como la aglutinación o penetración de ovocitos. La motilidad suele valorarse de forma similar a como se ha descrito para el semen fresco, pero con menores tasas de dilución (Tuli y cols., 1991). Tras congelar y descongelar semen, la calidad del movimiento espermático se ve muy deteriorada. En el caso del semen de caprino, la calidad del semen descongelado suele quedar muy reducida comparada con la del mismo semen antes de ser congelado, con valores de motilidad desde el 20-30% (Corteel,1981) al 60-70% (Delgadillo y cols, 1991; Batista y cols., 2011), siendo lo más habitual encontrarla entre un 30 y un 60% (Sinha y cols., 1995; Hidalgo y cols., 2007; Dorado y cols., 2009) Con respecto al porcentaje de espermatozoides morfológicamente normales, se suele determinar también mediante tinción supravital (Loubser y Van Niekerk, 1983; Ali y Mustafa, 1986; Skalet y cols., 1988) o la técnica de la “gota gruesa”, fijando la muestra de semen en solución de fosfato tamponada y glutaraldehido al 2% y a 37ºC. A continuación, se realiza un recuento de 100-400 espermatozoides bajo el microscopio de contraste de fases a 1000 aumentos (Roca y cols., 1992a,b; Pérez y Mateos, 1996). Otros estudios utilizan la tinción Revisión bibliográfica 41 Spermac® para valorar el grado de espermatozides anormales (Batista y cols., 2011), con una eficacia similar. Tras la descongelación, los valores medios de espermatozoides con morfoanomalías son muy variables, con valores que oscilan entre un 5 y un 25% (Singh y cols., 1995; Dorado y cols., 2007; Batista y cols., 2009, 2011). El porcentaje de espermatozoides con acrosoma normal se determina mediante la prueba de la “gota gruesa”, valorando un número medio entre 100 y 200 espermatozoides (Memon y cols., 1985; Roca y cols., 1992b; Pérez y Mateos 1996), mediante tinción Giemsa (Deka y Rao, 1986, Singh y cols., 1995), o bien mediante la tinción Spermac® (Batista y cols., 2009, 2011). El porcentaje de acrosomas intactos en el semen descongelado varía según la literatura entre el 30 y el 40% (Dunner, 1993), incrementándose al 40-70% (Memon y cols., 1985; Batista y cols., 2009), mientras otros autores obtienen valores de un 70-90% de acrosomas normales (Sinha y cols., 1995; Batista y cols., 2011). El porcentaje de endósmosis positiva se determina diluyendo una gota de semen (unos 50 µl) en 1 ml de una solución de citrato trisódico (1g/100ml) y fijando la muestra en glutaraldehido para observarla mediante microscopio de contraste de fases (Dunner y Vázquez, 1991). La mayoría de los autores (Corteel, 1980, Singh y cols., 1995, Karatzas y cols., 1997) descartan para inseminación aquellas dosis que muestran valores de espermatozoides móviles inferior al 30-45% y/o la puntuación en motilidad menor de 3 (puntuando de 0 a 5). Revisión bibliográfica 42 2.6. ANATOMÍA DEL APARATO REPRODUCTOR FEMENINO EN LA ESPECIE CAPRINA Los órganos del aparato reproductor femenino incluyen ovarios, oviductos, el útero, cuello uterino, la vagina y los genitales externos (Delgadillo, 2005). 2.6.1. OVARIOS Y OVIDUCTOS Existe una íntima relación anatómica entre el ovario y el oviducto. En los rumiantes domésticos, el ovario se encuentra en una bolsa ovárica abierta, la cual consiste en un delgado pliegue peritoneal del mesosálpinx, que está unido a un asa suspendida en la porción superior del oviducto (Lyngset, 1968a). El tamaño de los ovarios varía notablemente dependiendo de los estados de reposo o actividad sexual y también del momento del ciclo estral (fase folicular/fase luteal) en que se encuentre la hembra (Delgadillo, 2005). De manera general, los ovarios son alongados, planos, con un tamaño medio de 2-3 cm x 2-2.5 cm (Lyngset,1986; Garrett, 2001). Los oviductos son unos conductos estrechos, sinuosos, de naturaleza músculomembranosa, que siempre se localizan adyacentes al ovario correspondiente (Delgadillo, 2005). Representa la estructura responsable de la captación del óvulo (mediante un ensanchamiento a modo de embudo denominado infundíbulo), así como constituye la región donde se produce la fecundación y las primeras fases de desarrollo del embrión, antes de que desemboque en el útero, a través de la extremidad ístmica del oviducto (Smith, 1980). 2.6.2. ÚTERO El útero, en el caso de los rumiantes, se encuentra casi enteramente dentro de la cavidad abdominal (Constantinescu, 2001). El cuerpo del útero es relativamente corto y su longitud no suele ser superior a 2 cm de largo. Los cuernos uterinos tienen de 10 a 12 cm de largo y están dispuestos de forma que, en su unión con las trompas uterinas, no existe una distinción clara entre ellos. Forman una espiral cerrada de 2.5 cm o más y sus extremos caudales aparecen unidos (Lyngset,1986; Smith, 1986). La cubierta muscular del útero (miometrio) está formada por una capa longitudinal externa y dos estratos circulares. La mucosa (endometrio) de los cuernos y cuerpo presentan, Revisión bibliográfica 43 como hecho característico, las carúnculas uterinas que son prominencias ovales, distribuidas irregularmente sobre la superficie uterina (Delgadillo, 2005). 2.6.3. CUELLO UTERINO El cuello del útero es una estructura parecida a un esfínter que se proyecta caudalmente hacia el interior de la vagina. Se caracteriza por presentar una pared gruesa y una luz estrecha (Smith, 1986). En los rumiantes, presenta unas prominencias con forma de bordes transversales o alternados en espiral que se conocen como anillos cervicales, cuya función es cerrar completamente el cuello del útero (Constantinescu, 2001). El orificio uterino externo se halla en la parte ventral de la vagina. Esta estructura anatómica se encuentra perfectamente cerrada, excepto durante el estro, cuando se relaja ligeramente y permite la entrada de los espermatozoides en el útero (Lyngset, 1968a). 2.6.4. VAGINA Es el órgano tubular que, como continuación del útero, se extiende longitudinalmente por la cavidad pelviana, interpuesto entre el recto dorsalmente y el cuello de la vejiga y uretra centralmente (Garrett, 2001). En el caso de los pequeños rumiantes tiene una longitud aproximada de 10 a 15 centímetros de largo (Delgadillo, 2005). Solo el tercio craneal aparece englobado por el peritoneo, ya que hasta aquí se prolonga caudalmente el mesometrio, quedando los dos tercios restantes en posición retroperitoneal (envueltos en túnica adventicia). La parte más craneal del interior del órgano corresponde al fórnix vaginal, o sea, a la hendidura circular que circunscribe la porción vaginal del cuello uterino. Este fórnix presenta gran número de rugosidades vaginales en el caso de los rumiantes (Smith, 1986). 2.6.5. GENITALES EXTERNOS El vestíbulo, los labios mayores, labios menores, el clítoris y las glándulas vestibulares constituyen los genitales externos (Constantinescu, 2001). Revisión bibliográfica 44 El vestíbulo vaginal es corto, de unos 2.5 a 3 cm de longitud. Las glándulas vestibulares mayores son inconstantes en el caso de los pequeños rumiantes (Smith, 1986). Cuando existen pueden tener el tamaño de un guisante en la oveja y no encontrarse presentes en la cabra. En el vestíbulo vaginal se produce la desembocadura de la uretra, representando por tanto un área anatómica común de los aparatos genital y urinario (Smith, 1980; Garrett, 2001). La comisura ventral del vestíbulo oculta el clítoris, que está compuesto de tejido eréctil cubierto de epitelio escamoso estratificado, con abundantes terminaciones nerviosas sensoriales. Es corto en el caso de los pequeños rumiantes y las glándulas están ocultas por la fosa clitoridiana (Smith, 1986). El integumento de los labios mayores está ricamente poblado por glándulas sebáceas y tubulares. Contiene depósito de grasa, tejido elástico y una capa delgada de músculo liso; en su superficie exterior tiene la misma estructura que la piel externa. Los labios menores tienen un núcleo de tejido conectivo esponjoso; la unión de los labios termina constituyendo la hendidura vulvar que aparece más abierta dorsalmente (Garrett, 2001). 2.7. EL CICLO ESTRAL EN LA CABRA 2.7.1. ESTACIONALIDAD Los animales de la especie caprina, desde el punto de vista reproductivo, se definen como animales poliéstricos estacionales, es decir, presentan una época de actividad reproductiva caracterizada por la aparición de ciclos sucesivos y un período de reposo sexual, denominado anoestro estacional. Por otro lado, hay razas sin una definición clara de la estacionalidad, localizadas principalmente en regiones ecuatoriales. La estacionalidad esta básicamente regida por el fotoperiodo. La respuesta reproductiva al fotoperiodo esta mediada por la glándula pineal a través de la secreción de melatonina; esta secreción es alta durante la noche y baja durante el día (Maeda y cols., 1984). En los días largos existe menor secreción de melatonina, mientras en días cortos se genera una más prolongada secreción de melatonina. En el hemisferio norte, el período reproductivo comienza con el solsticio de verano, que es cuando comienza el fotoperíodo decreciente y dura hasta el solsticio de invierno, cuando comienza el fotoperíodo creciente (Shelton, 1978). De esta forma, en Revisión bibliográfica 45 latitudes templadas, la mayor parte de las cabras son anovulatorias y no presentan celos durante primavera y verano (Febrero-Agosto), pero comienzan a ciclar cuando la duración del día disminuye. Conforme las noches se alargan, el incremento en la duración de la secreción de melatonina parece que estimula una respuesta endocrina que genera el inicio de la estación reproductiva y el estro en las hembras. En las zonas tropicales, donde hay menor variación de la duración del día, las cabras tienden a reproducirse todo el año, presentando en todo caso, un anoestro breve y poco intenso (Tielgy y cols., 1982). 2.7.2. PUBERTAD Las cabras tienden a alcanzar la pubertad entre los 6 y los 8 meses de edad, si bien existen notables variaciones en función de la raza, alimentación, peso corporal y momento del nacimiento. Las cabras europeas con una correcta alimentación alcanzan la pubertad a los 6-7 meses, si bien no es conveniente cubrir a los animales hasta que hayan alcanzado un mínimo del 60% de su peso adulto, para conseguir una mejor tasa de fertilidad y no comprometer su futuro reproductivo (Pineda, 1989). El momento de nacimiento tiene influencia sobre la aparición de la pubertad. De esta manera, en razas de latitudes templadas, aquellas cabras que nacen en primavera pueden alcanzar la pubertad a los 6-7 meses, puesto que cuando alcanzan la edad y el peso adecuados, ya se encuentran en plena estación reproductiva. Sin embargo, los animales nacidos en otoño, pueden no alcanzar la pubertad hasta los 10-12 meses de edad, puesto que cuando adquieren la edad y el peso adecuado de la pubertad, se encuentran en anoestro estacional (Pineda, 1989). 2.7.3. CICLO ESTRAL El ciclo estral, también denominado ciclo ovárico o ciclo sexual, se puede definir como el ciclo biológico reproductivo de la hembra, cuyo acontecimiento central es la ovulación o liberación de un oocito maduro del folículo preovulatorio (Illera, 1994). Revisión bibliográfica 46 La duración del ciclo estral en la mayoría de las razas caprinas se estima entre 19-21 días (Shelton, 1978; Song y cols., 1984a), aunque puede oscilar de forma normal entre 18 y 22 días (Fredriksson y cols., 1984; Chemineau, 1986). En la raza Majorera, la duración media del ciclo estral se ha definido en 21.8 ± 0.9 días (Batista y cols., 1999). La duración del ciclo estral suele ser muy irregular al comienzo y al final de la estación reproductiva, sobre todo en hembras jóvenes (Smith, 1986). Al inicio de la estación reproductiva, las cabras presentan pocas ovulaciones silenciosas, pero hay una incidencia relativamente alta de ciclos cortos, con intervalos inter-estro de unos 8 días, debido a una corta fase luteal de 5-6 días (Bretzlaff y cols., 1988). Tras estos ciclos cortos se instaura una actividad cíclica normal. La longitud del ciclo puede modificarse por diferentes factores. El alojamiento de las hembras con los machos, al comienzo de la estación reproductiva, parece acortar la duración del ciclo estral (Shelton, 1978). Asimismo, factores climatológicos adversos como temperaturas frías o muy altas, humedad relativa baja, pueden incrementar el porcentaje de ciclos estrales de menor duración (Singh y cols., 1995). 2.7.3.1. Estro El celo o estro se define como el intervalo de tiempo durante el cual la cabra permite la monta y cubrición del macho (Mori y Kano, 1984; Metha y cols., 1991; Llewelyn y cols., 1993). La duración media del celo se viene a situar en torno a las 36 horas (Shelton, 1978), con variaciones entre 26 y 40 horas (Hulet y Shelton, 1984). Mayores duraciones del celo se han descrito en diferentes razas caprinas, como la raza Majorera con 42 horas (González, 1995) y en la raza Nubian con 67 horas (Camp y cols., 1983). La duración del celo puede verse modificada por diferentes factores. Se ha confirmado una menor duración del celo en cabras nulíparas que en cabras multíparas (Cerbito y cols., 1995), y al igual que en la oveja, parece que en aquellas razas más prolíficas, la duración del celo es mayor que en razas con una menor tasa de ovulación (Pathiraja y cols., 1991). Del mismo modo, si las cabras son cubiertas durante el celo, éste se puede acortar (Romano, 1994). Revisión bibliográfica 47 2.7.3.2. Fase folicular La fase folicular, definida como el periodo comprendido entre la luteolisis y la ovulación, tiene una duración media de 4-5 días. Tras la regresión luteal, se reducen los niveles plasmáticos de progesterona y desaparece el efecto de retroalimentación negativa sobre la secreción de LH (Goodman y Karsch, 1980), lo cual va a provocar el aumento de la concentración basal de LH (Baird y Scaramuzzi, 1976). Los niveles de estrógenos comienzan a ascender unas 48 horas antes a la onda preovulatoria de LH. El aumento de los niveles de estrógenos coincide con una disminución de los niveles plasmáticos de progesterona, consecuencia de la luteolisis (Bono y cols., 1983; Smith, 1986), que ocurre de 1 a 3 días antes del estro. El pico de LH tiene lugar entre 6 y 24 horas después del comienzo de los síntomas del celo y sobre las 60-65 horas del inicio de la luteolisis (Llewelyn y cols., 1993; González, 1995). La duración del pico preovulatorio de LH es de unas 9-10 horas. El período de tiempo comprendido entre el pico preovulatorio de LH y la ovulación es relativamente constante, entre 20 y 25 horas, por lo que la ovulación acontecerá al final del celo o justo inmediatamente tras el mismo (Mori y Kano, 1984; Greyling y Van-Niekerk, 1990; González, 1995). 2.7.3.3. Fase luteal La fase luteal, definida como el período de tiempo comprendido entre la ovulación y la luteolisis, tiene una duración media de 16-17 días en la especie caprina. Se caracteriza por un incremento progresivo de los niveles plasmáticos de progesterona (González, 1995). A partir de los días 5-6 tras el inicio del celo y hasta el momento de la luteolisis, estos niveles se mantienen en unos valores funcionales, que varían dependiendo del número de cuerpos lúteos funcionales (Fredriksson y cols., 1984; Sawada y cols., 1995). La lisis del cuerpo lúteo y el inicio de una nueva fase folicular, se produce de manera consecutiva a una liberación de prostaglandinas durante varios días. Asimismo, se produce una síntesis de oxitocina de origen luteal en el momento de la luteolisis que estimula la síntesis de prostagladina F-2alfa (PGF2α) que, a su vez, favorece la síntesis de oxitocina luteal; de esta manera, se establece un circuito de retroalimentación positiva mutua (Freeman y Currie, 1985; Homeida y Cooke, 1989; Homeida y Khalafalla, 1990). Revisión bibliográfica 48 2.8. TRATAMIENTOS DE INDUCCIÓN DEL CELO Y OVULACIÓN EN LA ESPECIE CAPRINA 2.8.1. INDUCCIÓN DEL ESTRO CON OVULACIÓN La inducción del estro con ovulación se realiza cuando los animales están en anoestro y por lo tanto, está bloqueado el eje hipotálamo-hipófisis-gónadas y no hay secreción apropiada de gonadotropinas. Entre los tratamientos de inducción de la actividad sexual aplicables en el ganado caprino se pueden incluir el efecto macho, el control del fotoperiodo y los tratamientos hormonales. 2.8.1.1. Inducción del estro con ovulación mediante el efecto macho El “efecto macho” puede definirse como la inducción de la ovulación y las manifestaciones estrales, tras la introducción súbita de machos en un rebaño de hembras no cíclicas, tras un período de completa separación de, al menos, 3 semanas (Corteel y cols., 1982; Chemineau, 1985). En aquellos rebaños donde el macho permanece todo el año con las hembras, puede resultar difícil que llegue a presentarse la estimulación de manera efectiva. Esta mayor eficacia se obtiene cuando la separación entre machos y hembras es total, no debiendo existir ningún tipo de interacción visual, olfativa o auditiva (Bondurant y cols., 1986); asimismo, también se ha puesto de manifiesto que el macho debe ser sexualmente activo en el momento de su introducción (Rodríguez y cols., 2002) para incrementar su eficacia. No obstante, este efecto puede ser también inducido con machos castrados o hembras a las cuales se les aplica un tratamiento corto con testosterona o estrógenos, obteniendo una respuesta semejante (Lynch y cols., 1992; Vandenbergh, 1994). El contacto con los machos induce en las hembras un rápido y brusco incremento en la frecuencia y amplitud de los pulsos plasmáticos de LH. Este incremento de la actividad hipofisaria estimula el crecimiento folicular ovárico, desencadenándose entonces la descarga masiva de GnRH y la consecuente onda preovulatoria de LH a nivel hipofisario (Ott y cols., 1980; Chemineau 1983, 1987). Estas modificaciones a nivel hipotálamico-hipofisario y ovárico se traducen en la presentación de ovulaciones y manifestaciones estrales en un muy importante porcentaje de hembras, en un plazo entre 3-6 días (Ott y cols., 1980; Chemineau 1983, 1987) Revisión bibliográfica 49 El grado de respuesta al efecto macho viene determinado por el momento de la ovulación, la aparición de manifestaciones estrales asociadas a esa primera ovulación y la frecuencia de ciclos cortos. Estos parámetros son dependientes de diferentes factores, que se pueden agrupar en dos categorías: la profundidad del anoestro y la intensidad del estímulo. De esta manera, a mayor profundidad del anoestro se obtiene un menor grado de reactivación ovárica (Chemineau, 1985). Asimismo, la intensidad del estímulo ejercido por los machos sobre las hembras tiene su reflejo sobre la presentación de ovulaciones y manifestaciones estrales (Chemineau, 1987; Walkden-Brown y cols., 1999). El principal inconveniente que implica el efecto macho es la falta de sincronización de celos que genera, lo que convierte a esta técnica en algo arriesgada para asociarla a la inseminación artificial. Una solución para minimizar este problema sería aplicar un tratamiento con progestágenos en las hembras anovulatorias, antes de la introducción de los machos, o bien la inyección de progestágeno justo en el momento de la entrada de los machos (Chemineau, 1985). Este tratamiento evita la aparición del primer ciclo acortado y se consigue una mayor sincronización de celos y ovulaciones. 2.8.1.2. Inducción del estro con ovulación mediante el control del fotoperiodo La estación reproductiva en los pequeños rumiantes coincide con los días decrecientes del año. Sin embargo, esta actividad reproductiva solo tendrá lugar en los días cortos, si antes ha existido un periodo de días largos. En los días largos existe una más breve secreción de melatonina por parte de la glándula pineal, mientras en los días largos se genera una más prolonga secreción de melatonina (Karsch y cols., 1984; Abecia y cols., 2012). Mediante la regulación del fotoperiodo y la administración exógena de melatonina sería posible modificar la estacionalidad reproductiva y acortar el periodo de anoestro estacional en la especie caprina (Malpaux y cols., 1997). Existen numerosos protocolos para inducir un adelanto de la estación reproductiva, en el que el control del fotoperiodo y la administración exógena de melatonina están implicados. La mayoría de esos tratamientos tienen en común que constan de un primer periodo de días largos artificiales y una segunda fase de días cortos artificiales (Chemineau, 1986; Zarazaga y cols., 2011, 2012). Revisión bibliográfica 56 alcanzando sus niveles máximos unos pocos días antes del parto (Currie y cols., 1988; Kornalijnslijper y cols., 1997). Como ya se ha indicado, la prolactina también interviene en la regulación de la vida media del cuerpo lúteo constituyendo, conjuntamente con la hormona luteinizante (LH), el denominado complejo luteotrófico (Buttle y Morant, 1983). 2.9.3. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE GESTACIÓN La duración media de la gestación en la mayoría de las razas caprinas se sitúa cercano a los 151 días (Asdell, 1964), con un rango que comprende entre 147 y 155 días. Entre los factores que modifican la duración de la gestación se encuentran la edad de los animales y el número de fetos presentes. De esta manera, la duración de la gestación es más prolongada en animales adultos que en hembras jóvenes (Asdell, 1964), mientras existe una correlación negativa entre la duración de la gestación y el número de productos que geste la cabra (Sambraus y Wittmann, 1993). La identificación rápida y fiable de la gestación tiene una importancia esencial en el manejo de los pequeños rumiantes. El diagnóstico de gestación permite una organización que mejora la rentabilidad de la producción en los rebaños, con evidentes ventajas prácticas y económicas (Restall y cols., 1990; Wani y cols., 1998). Entre otras ventajas, se pueden señalar la alimentación del ganado acorde a su estado productivo, la distribución de las parideras anuales, la identificación de animales infértiles o subfértiles, así como una previsión fiable de la producción de leche/carne. De forma general, las técnicas de diagnóstico de gestación se pueden agrupar en dos categorías: métodos clínicos y métodos laboratoriales. Existen numerosos métodos clínicos, si bien los más frecuentemente utilizados son el no retorno al celo, palpación y distensión abdominal (Pratt y Hopkins, 1975) y diagnóstico de gestación mediante ultrasonidos (Haibel, 1990; Bretzlaff, 1993). Entre los métodos laboratoriales podemos citar la determinación de niveles plasmáticos de estrógenos, progesterona y proteínas específicas de la gestación (Murria y Newstead, 1988; Ruder y cols., 1988; González y cols., 1999, 2001). Revisión bibliográfica 57 La elección del método adecuado depende del estado de gestación. Unos métodos presentan una mayor precisión en el diagnóstico precoz de gestación, mientras que otros métodos son más adecuados para el diagnóstico en gestaciones avanzadas (Bernard, 1994). 2.9.3.1. Métodos clínicos I. No retorno al celo El sistema más elemental para diagnosticar la gestación en los pequeños rumiantes se basa en la incompatibilidad entre la presencia del celo y la gestación. Las hembras que presenten manifestaciones estrales generalmente no están gestantes, mientras que la ausencia de síntomas de celo después del período de cubrición, puede ser indicativa de gestación. La técnica de no retorno al celo debe efectuarse coincidiendo con el final del ciclo estral consecutivo a la cubrición o IA, alrededor de 20-22 días en el caso de la especie caprina (Gordon, 1996) Esta técnica, aparentemente eficaz y sencilla, en la práctica aporta resultados poco concluyentes, ya que produce un elevado porcentaje de diagnósticos falsos positivos y falsos negativos (Corteel y cols., 1982; Restall y cols., 1990). Entre falsos positivos (cabras que no manifiestan celos, pero no se encuentran gestantes), se pueden citar aquellas situaciones donde el chequeo de celos no se haga de manera rigurosa, al comienzo o final del periodo de celo, cuando las hembras requieran de una gran insistencia para manifestar el celo; asimismo, cuando se induce la reactivación ovárica durante el anoestro estacional, la ausencia de celo puede indicar simplemente que la hembra ha retornado a su condición de anoestro (Gordon, 1996). Del mismo modo, aquellas hembras con ciclos alargados o acortados, con cuerpo lúteo persistente, quistes ováricos luteinizados o hidrómetra, pueden inducir también diagnósticos falsos positivos de gestación, cuando se realizan entre los 20 y 22 días (Smith, 1986; Williams, 1986; Restall y cols., 1990; Gordon, 1996). Como falsos negativos (cabras que manifiestan celos, pero se encuentran gestantes) podemos citar aquellas situaciones donde los animales son identificados por error (p.e. marcados por el macho) y menos frecuentemente, en aquellas cabras que aún presentando síntomas de celo, podrían estar gestantes (Williams, 1986). Revisión bibliográfica 58 II. Ultrasonografía La ecografía es un procedimiento fiable y práctico para el diagnóstico de gestación en los pequeños rumiantes. Entre las diferentes alternativas, distinguimos la ultrasonografía en modo-A, que detecta las interfases de los tejidos mediante diferentes resistencias acústicas (Lindhal, 1972), y el sistema Doppler basado en la detección de la circulación fetal o de los movimientos fetales (Wani, 1981; Berkley, 1982). Sin embargo, la ultrasonografía en tiempo real (modo B), ofrece sin lugar a duda, la vía más efectiva para el diagnóstico precoz de gestación (Taverne, 1984). Mediante el sistema de ultrasonidos en modo B, la valoración ecográfica puede realizarse tanto por vía transabdominal como transrectal. Con respecto al tipo de transductor, las sondas sectoriales ofrecen una mejor imagen que las lineales para el diagnóstico de gestación en cabra. Las frecuencias que normalmente se utilizan por vía transabdominal oscilan entre 3 y 5 MHz, mientras que por vía transrectal se han usado más las frecuencias de 5 y 7.5 MHz (Bretzlaff y cols., 2001; González y cols., 2004). Utilizando la vía transabdominal, la valoración ecográfica se suele iniciar sobre la zona inguinal, con el animal de pié. Se prefiere realizar la exploración por el lado derecho, ya que por el lado izquierdo nos encontramos con el rumen que nos puede impedir ver con claridad el útero. Sin embargo, si la imagen obtenida por el lado derecho no es la más adecuada, podemos abordar por el lado izquierdo del abdomen, obteniendo en algunos casos mejores resultados. La sonda debe orientarse hacia la parte interna de la pelvis, por lo que la parte caudal del abdomen se explora deslizando la sonda longitudinalmente (Dorn y cols., 1989). Se comienza localizando la vejiga de la orina, que se reconoce fácilmente como un órgano hueco anecogénico de contorno característico. Cuando se utiliza la vía transrectal, en primer lugar, se extraen las heces presentes en el recto, que dificultan la visualización de las estructuras internas; posteriormente, la sonda lubricada se inserta en el recto, con la superficie de emisión de ultrasonidos orientada hacia abajo. La vía transrectal es más precoz que la transabdominal, pero existen riesgos de ocasionar daños, tales como laceraciones y perforaciones rectales (González y cols., 2004), y se precisa de un mayor tiempo por animal, para la realización del diagnóstico de gestación. Revisión bibliográfica 59 Ultrasonográficamente, la indicación más precoz de una posible gestación es la acumulación de fluido en el interior del lumen uterino, que puede ser detectado unos pocos días antes por vía transrectal que por vía transabdominal (Martínez y cols., 1998). Utilizando la vía transabdominal, la presencia de fluido en el lumen uterino puede ser observado a partir del día 22 en la cabra (Hesselink y Taverne, 1994). No obstante, un diagnóstico fiable se debe sustentar en signos específicos de gestación, como son la visualización de membranas fetales o el mismo embrión (Lavoir y Taverne, 1989; González y cols., 2004). El embrión no puede ser observado con claridad hasta el día 25-30 de gestación (Bretzlaff, 1993; Bretzlaff y Romano, 2001), y el latido cardíaco puede ser detectado solamente a partir del día 30-35 de gestación en todos los embriones (Lavoir y Taverne, 1989). Usando la vía transrectal, la gestación se detecta por la identificación de las vesículas embrionarias en la parte anterior y ventral de la vejiga de la orina. La detección de los embriones y su latido se inicia a partir de los días 21-22 de gestación, alcanzado una fiabilidad completa a partir de los 24-26 días (Martínez y cols., 1998; González y cols., 2004), mientras el periodo óptimo para determinar el nº de conceptos se sitúa entre los días 25 a 30 de gestación. La ultrasonografía en modo-B, aparte de permitirnos determinar con precisión la gestación de forma precoz, el número de fetos y la vitalidad fetal (Lavoir y Taverne, 1989; Bretzlaff, 1993), nos facilita estimar el estadio de gestación que presentan los animales (Haibel y cols., 1989), así como la diferenciación de la gestación con respecto a ciertas patologías como hidrómetra, mucómetra, quistes endometriales, quistes ováricos y diferentes tipos de tumores (Haibel, 1990; Batista y cols., 2009). Con esta técnica, los falsos positivos son raros, y suelen ser debidos a una muerte embrionaria temprana, o bien a una confusión entre la vejiga urinaria llena y el útero; asimismo, en la fases iniciales de la gestación, también puede detectarse un falso positivo en aquellos hembras que han desarrollado una hidrómetra (Haibel, 1990). Por otro lado, los falsos negativos pueden ser resultado de que se realice la técnica demasiado temprano, o por la inexperiencia del examinador (Haibel, 1990). Revisión bibliográfica 60 2.9.3.2. Métodos laboratoriales I. Concentración de Progesterona El diagnóstico de gestación está basado en la diferencia entre las concentraciones de progesterona de las hembras gestantes, que mantienen el cuerpo lúteo funcional y por tanto presentarán niveles estables o crecientes, frente a las concentraciones de las hembras vacías, que han sufrido la luteolisis al final del ciclo estral consecutivo a la cubrición o inseminación artificial y que, por tanto, mostrarían niveles bajos. Los niveles de progesterona se pueden determinar tanto por enzimoinmunoensayo o radioinmunoensayo (Gordon, 1996; González y cols., 2004) En la cabra, la muestra para el análisis de progesterona debe tomarse los días 20-22 de gestación, es decir, al final del ciclo estral consecutivo a la fecundación. Por tanto, este método exige conocer con exactitud la fecha de monta o inseminación artificial, ya que no existen diferencias discriminantes entre la concentración de progesterona en la fase luteal del ciclo y en el período precoz de gestación. El análisis se puede realizar sobre muestras de plasma o suero y en la leche. Las muestras de leche tienen la ventaja que tienen una mayor concentración de progesterona y pueden recogerse durante el ordeño; como desventajas existe una gran variabilidad entre las concentraciones medias de hembras gestantes y vacías entre rebaños, así como que la diferencia entre las concentraciones de diagnóstico positivo y negativo es muy pequeña (Thibier y cols., 1981). Por tanto, en la práctica, es más preciso trabajar con muestras de plasma que con muestras de leche (Gordon, 1996; González y cols., 2004). La determinación de los niveles de progesterona constituye un método exacto para el diagnóstico de no-gestación (Holdsworth y Davies, 1979). Sin embargo, la capacidad para detectar la gestación es menos específica, ya que solo alrededor del 80-85% de las hembras diagnosticadas como positivas (presuntamente gestantes) llegan a parir. Esta baja especificidad se debe a que la existencia de niveles elevados de progesterona al final del ciclo estral consecutivo a la fecundación, puede deberse a condiciones distintas de la gestación, tales como: cuerpo lúteo persistente, ciclos alargados o acortados, mortalidad embrionaria precoz, hidrómetra, etc., situaciones que producen diagnósticos falsos positivos (Smith, 1986; Lavoir y Taverne, 1989). Revisión bibliográfica 61 II. Concentración de Estrógenos En la cabra gestante, el principal estrógeno producido dentro de los cotiledones fetales es la estrona. La estrona se reduce a estradiol-17-alfa en la circulación fetal, pero permanece como estrógeno primario en la circulación maternal. La concentración plasmática de estrona, así como la de su conjugado sulfato de estrona, comienzan a aumentar gradualmente en las cabras gestantes, de tal forma que el sulfato de estrona puede detectarse en muestras de plasma o leche alrededor de los días 45 y 50 postcubrición, respectivamente (Chaplin y Holdsworth, 1982; Refsal y cols., 1991; King y Thatcher, 1993; Sawada y cols., 1995), proporcionando un diagnóstico de gestación exacto a partir del día 50 de gestación. III. Proteínas asociadas a la gestación En los rumiantes, la placentación es superficial y relativamente poco invasiva. Cuando se inicia la implantación (alrededor del día 18 post-fecundación), las células binucleadas migran desde el trofoblasto embrionario y se fusionan con las células epiteliales del endometrio, formando un extenso sincitio feto-maternal (Zoli y cols., 1991). Las células binucleadas tienen la capacidad de liberar sus productos de secreción en el sistema maternal; entre estos productos se encuentran las proteínas específicas de la gestación (pregnancy specific protein-B, PSP-B) y las proteínas asociadas a la gestación (pregnancy-associated glycoproteins, PAGs). Las PAGs constituyen una gran familia de glicoproteínas, expresadas específicamente en la capa externa de las células epiteliales (corion y trofoectodermo) de la placenta de las especies unguladas (Zoli y cols., 1991; Guruprasad y cols., 1996). Pertenecen a la familia de las proteínas aspárticas, teniendo una alta coincidencia de la secuencia de aminoácidos con los pepsinógenos. Diferentes moléculas de la familia de las PAGs, han sido aisladas desde cotiledones de vaca (Zoli y cols., 1991), de oveja (Zoli y cols., 1991) y de cabra (Garbayo y cols., 1998). Las concentraciones de PSP-B en cabras gestantes son significativamente mayores que en las cabras vacías el día 24 después de la inseminación artificial, y aumentan hasta 40 ng/ml al final de la gestación (Humblot y cols., 1990). Revisión bibliográfica 62 Por otro lado, en el caso concreto de la especie caprina, la presencia de antígenos inmunológicamente similares a la PAG y PSP-B bovinas se demostró mediante la utilización de sistemas de RIA heterólogos (Humblot y cols., 1990; Sousa y cols., 1999). Más recientemente, a partir de placentas caprinas, se han aislado y caracterizado 3 tipos diferentes de PAGs que presentan diferencias en su secuencia de aminoácidos y en su peso molecular. El uso de estas 3 PAGs caprinas ha permitido el desarrollo de sistemas de RIAs semihomólogos y homólogos, que aportan un diagnóstico de gestación en cabra más precoz y específico (González y cols., 1999, 2001, 2004). Las concentraciones de PAGs comienzan a incrementarse justo durante el periodo de implantación, alcanzando sus niveles más elevados entre las semanas 8 y 9 de gestación, permaneciendo en niveles detectables hasta justo antes del parto. Después del parto, las concentraciones de PAGs disminuyen rápidamente, alcanzando los valores más bajos en la cuarta semana postparto (Sousa y cols., 1999). Por tanto, la fiabilidad de este procedimiento es mayor del 95% en los días 21-22 post-fecundación, y a partir de los 24 días de gestación, la exactitud del método para diagnosticar la gestación es cercano al 100% (González y cols., 1999, 2004). Por otro lado, los niveles plasmáticos de PAGs en cabras con gestación múltiple son mayores que en cabras con gestaciones simples (Chentout y cols., 2008); probablemente, esta circunstancia obedece a que, en gestaciones múltiples, se desarrollan un mayor número de lugares de placentación y, en consecuencia, existe una actividad secretoria incrementada por las diferentes placentas. Además de detectarse en sangre, la determinación de las PAGs se ha confirmado en leche de cabras gestantes (González y cols., 2004). En ese estudio, ya se detectaron diferencias significativas en las concentraciones de PAGs en leche, entre cabras gestantes y cabras no gestantes, desde el día 21 de gestación en adelante, si bien la completa exactitud con este procedimiento se presentó a partir del día 32 de gestación (González y cols., 2004). Finalmente, las PAGs también pueden utilizarse para evaluar la funcionalidad placentaria. La medición secuencial de PAGs en el plasma de cabras puede proporcionarnos un eficiente método para la detección de alteraciones en la unión feto-placentaria (Zarrouk y cols., 1999 a,b). Revisión bibliográfica 63 2.10. INSEMINACION ARTIFICIAL EN LA ESPECIE CAPRINA 2.10.1. APLICACIONES, VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA INSEMINACIÓN ARTIFICIAL La inseminación artificial (IA) constituye uno de los procedimientos más ampliamente utilizados dentro de las técnicas de reproducción asistida. La aplicación de la IA en la reproducción de las especies domésticas, permite básicamente el mejoramiento genético de las mismas. Al igual que en bovino y ovino, el semen caprino se puede diluir en medios especiales, de tal forma que un elevado número de hembras puede ser inseminado con el semen de los mejores machos de una población, lo que permite incrementar de manera muy notable, en comparación con la monta natural, el número de descendientes por padre (Leboeuf y cols., 2000, 2008; Cseh y cols., 2012). Además de la posibilidad de incrementar el número potencial de hembras fertilizables mediante el uso racional de la IA, la posibilidad de preservar el semen (bien mediante refrigeración o crioconservación), permite diseminar los genotipos deseados para los diferentes sistemas de explotación (Leboeuf y cols., 2008). Otra ventaja de la IA es que el semen congelado puede permanecer almacenado durante un periodo indefinido (Cseh y cols., 2012); en las razas estacionales, esta circunstancia permite disociar la recogida del semen y la IA. Asimismo, el semen congelado puede ser enviado a cualquier parte del mundo sin disminuir drásticamente sus cualidades fecundantes y se reduce la transmisión de enfermedades (Batista y cols., 2012). Del mismo modo, la evaluación del semen previo a la IA, permite la identificación y, en su caso, eliminación de machos infértiles o con fertilidad reducida. El control de la reproducción de los machos y de las hembras para la IA permite a los ganaderos definir los mejores periodos del año para que ocurran los partos, de acuerdo con el mercado y las condiciones ambientales locales (Leboeuf y cols., 2000; Cseh y cols., 2012). Las principales desventajas de la IA son que requiere la presencia de personal cualificado y que garantice al propietario una alta probabilidad de éxito (Leboeuf y cols., 2000; Cseh y cols., 2012). Asimismo, es necesario el control de técnicas que permitan determinar con precisión el momento del ciclo sexual en el que se encuentra la hembra y que la detección del celo se realice con absoluta fiabilidad (Martemucci y cols., 2011). Revisión bibliográfica 64 Por tanto, el resultado final de un programa de IA depende del conocimiento de la fisiología reproductiva tanto de machos como de hembras, así como de las herramientas utilizadas para controlar su actividad sexual (Bretzlaff y Romano, 2001; Delgadillo, 2005). Las técnicas para la recogida, manejo, dilución, almacenamiento, conservación y utilización del semen, influyen en el éxito de un programa de IA (Leboeuf y cols., 2000). 2.10.2. MOMENTO ÓPTIMO DE INSEMINACIÓN La detección del estro es una de las fases críticas de la inseminación artificial, ya que la aplicación del semen en el momento adecuado, depende de una adecuada identificación de las hembras en celo (Leboeuf y cols., 2008; Martemucci y cols., 2011). Para garantizar un mayor porcentaje de éxito, se recomienda una detección individualizada de cada hembra, para de esta forma concretar al máximo el inicio y duración de las manifestaciones estrales (Leboeuf y cols., 2000; Batista y cols., 2009; Cseh y cols., 2012). La detección por observación directa e individual puede emplearse cuando el número de hembras no es muy alto y se dispone del tiempo suficiente. Si no se pudiese detectar de la anterior forma, se puede optar por la utilización de machos marcadores, preferentemente vasectomizados o bien machos enteros, pero provistos de cualquier tipo de mecanismo que limitase su capacidad fertilizante (Martemucci y cols., 2011). Con un celo natural, la IA puede efectuarse una sola vez, alrededor de 18 horas tras el inicio del celo, aunque se obtienen mejores índices, si se realizan dos inseminaciones, a las 12 y 24 horas de iniciado el celo (Leboeuf y cols., 2000; Delgadillo, 2005). Cuando se utilizan diferentes combinaciones de hormonas exógenas para inducir o/y sincronizar el celo, se puede realizar inseminaciones a tiempo fijo tras la retirada de la esponjas, siendo el mejor procedimiento dos inseminaciones a las 36 y 60 horas tras la retirada de las esponjas (Menchaca y Rubianes, 2007; Cseh y cols., 2012). No obstante, evidentemente resulta mejor detectar celos e inseminar en función del celo visto (Leboeuf y cols., 2008; Batista y cols., 2009); en este caso, los mejores resultados se consiguen con dos inseminaciones a las 12 y 24 horas de comenzado el celo (Leboeuf y cols., 2000; Cseh y cols., 2012). Revisión bibliográfica 65 2.10.3. TÉCNICAS DE INSEMINACIÓN ARTIFICIAL En función de la profundidad de deposición del semen, existen diferentes variantes en el procedimiento de inseminación artificial: inseminación intravaginal, inseminación pericervical, inseminación cervical profunda e inseminación intrauterina (Delgadillo, 2005). 2.10.3.1. Inseminación intravaginal La inseminación artificial intravaginal es un procedimiento relativamente sencillo, que no precisa de equipamiento muy sofisticado, ni requiere de mucho tiempo en su realización (Leboeuf y cols., 2000; Cseh y cols., 2012). Se puede realizar sin el uso de un espéculo vaginal (inseminaciones “a ciegas”) o bien puede utilizarse un espéculo que incluye algún tipo de fuente de iluminación adicional. Asimismo, una ventaja de esta técnica es que no requiere la manipulación prolongada de las hembras, utilizando un sistema de contención mínimo (Delgadillo, 2005). Los porcentajes de fertilidad que se obtienen mediante este procedimiento muestran notables diferencias en función de si se utiliza semen fresco, refrigerado o congeladodescongelado. De esta forma, con semen fresco o refrigerado (hasta 24 horas), los porcentajes de fertilidad oscilan entre un 60 a un 75% (Roca y cols., 1997; Karatzas y cols., 1997; Paulenz y cols., 2005), mientras que cuando se utiliza semen congelado-descongelado, los porcentajes se fertilidad son mucho más variables, con resultados de fertilidad desde un 20 a un 55% (Karatzas y cols., 1997; Leboeuf y cols., 2000; Nordstoga y cols., 2010, 2011). 2.10.3.2. Inseminación pericervical Este tipo de técnica es la más difundida para la utilización de semen fresco y refrigerado. Precisa de un cierto grado de inmovilización del animal, para facilitar su manipulación y evitar o reducir al máximo, daños y/o laceraciones en la vagina o cérvix. En todo caso, salvo situaciones excepcionales, no se requiere la aplicación de ningún tipo de sedación o tranquilización para la realización del procedimiento (Leboeuf y cols., 2000; Cseh y cols., 2012). Si bien no es siempre necesario, se recomienda una limpieza previa de la vulva con una solución no espermicida, para posteriormente introducir un espéculo y, ayudado con un vaginoscopio o una fuente luminosa de luz fría, se localiza la entrada del cérvix en el fondo de la vagina (Delgadillo, 2005; Batista y cols., 2009). Una vez que las pajuelas se hayan cargado en la Material y Métodos 72 3.1.4. CONTRASTACIÓN SEMINAL Una vez recogido el semen en los tubos colectores, éstos se depositaban en un baño María a 37ºC para proceder a la determinación de los distintos parámetros seminales. Las características macroscópicas valoradas fueron el volumen y el color, mientras que a nivel microscópico se determinaba la concentración espermática, la motilidad progresiva, la vitalidad espermática y los porcentajes de morfoanomalías y acrosomías. 3.1.4.1. Pruebas macroscópicas I. Volumen del eyaculado El volumen del eyaculado se registró en mililitros mediante observación directa en el tubo colector graduado utilizado para la recogida. II. Color del eyaculado El color del eyaculado se valoraba de forma visual, directamente en el tubo colector de recogida, aceptando como colores normales toda la gama que oscilaba desde el blanco lechoso hasta el amarillento. De esta forma, fueron descartados todos los eyaculados que tuviesen colores rojizos (presencia de sangre), amarillo (presencia de pus), o cualquier otra tonalidad fuera de lo normal. La valoración del color se realizaba siempre por el mismo técnico, no pasando nunca más de 5 minutos desde la recogida. 3.1.4.2. Pruebas microscópicas I. Motilidad individual progresiva La motilidad individual progresiva se analizó tras diluir una muestra de semen a razón de 1:20 en solución de lavado (Tabla 1) a 37ºC y observando una gota de dicha solución entre portaobjetos y cubreobjetos, generando una fina película que permitía determinar el número de espermatozoides móviles en la muestra. Los portaobjetos y cubreobjetos, así como las pipetas Pasteur utilizadas para procesar el semen, eran mantenidos a 37ºC mediante una placa calefactora HT-200 (Minitübe Ibérica, España), que calentaba a su vez la pletina del microscopio. La determinación subjetiva de la motilidad progresiva se realizaba utilizando un microscopio Olympus BH2-NIC-2 de contraste de interferencia diferencial provisto de una placa calefactora atemperada a 37ºC, entre 200 y 400 aumentos, valorando un mínimo de 8-10 Material y Métodos 73 campos localizados en la zona central del cubreobjetos (Cabrera y cols., 2005). La valoración del movimiento se realizaba sobre aquellos espermatozoides que presentaban un movimiento progresivo de avance, descartando aquellos espermatozoides que presentasen movimientos circulares, rotatorios o vibratorios. La determinación subjetiva de la calidad seminal fue siempre realizada por el mismo observador durante todas las experiencias in vitro. El valor de motilidad de cada muestra era el resultado de hallar la media de las valoraciones de los diferentes campos observados, aproximándolo al 5% más cercano. Tabla 1. Solución de lavado utilizada en el procesado del semen Tris (Hidroximetil) Aminometano ………….. 3.029 g Glucosa ……………………………………… 0.500 g Ácido cítrico …………………………..…….. 1.589 g Penicilina ……………………………………. 50.000 UI Estreptomicina ………………………..……... 50 mg dH2O ……………………………………..….. Hasta 100 ml La valoración objetiva de la motilidad individual progresiva se realizó mediante un sistema computerizado asistido de análisis espermático (Sperm Vision Lite®, Minitübe Ibérica, España). Las variables seminales incluidas en el análisis fueron el porcentaje total de espermatozoides móviles, el porcentaje de espermatozoides con movilidad progresiva, el porcentaje de espermatozoides con movilidad local y el porcentaje de espermatozoides no móviles. Para cada muestra diluida, se tomaba de 1 a 2 alícuotas de 10 µL que se depositaban en una cámara Makler a 37ºC, y los espermatozoides contenidos en al menos 7 campos (seleccionados de manera aleatoria) de cada una de las alícuotas eran evaluados para determinar la motilidad espermática; al menos 2000 espermatozoides/alícuota fueron evaluados para definir los parámetros de motilidad. Los parámetros del análisis espermático eran los siguientes: número de fotogramas, 16; fotogramas por segundo, 25; velocidad límite para espermatozoides no mótiles, 10 µm/s; velocidad límite para espermatozoides con motilidad local, 20 µm/s; velocidad límite para espermatozoides con motilidad baja, 30 µm/s; velocidad límite para espermatozoides con velocidad media, 60 µm/s; filtro para partículas, 20%. Material y Métodos 74 II. Concentración espermática Para la determinación de la concentración espermática de cada eyaculado, se hacía una dilución 1:400 del semen en solución salina formolada al 0.3% (Tabla 2). De esta forma, los espermatozoides podían ser contados mediante el uso de un hemocitómetro. La cámara del hemocitómetro era cargada con la dilución mediante capilaridad. La valoración se realizaba en un microscopio óptico a 400 aumentos (Olympus BH2-NIC-2). El número de espermatozoides observados en una superficie de 0.2 mm2 (80 cuadros pequeños de 0.0025 mm2 cada uno y distribuidos en 5 cuadros mayores), era multiplicado por 20.050.000, teniendo en cuenta la dilución realizada (1/401) y el volumen cubierto con el recuento (0.2 mm2 x 0.1 mm de altura = 0.02 mm3). De esta forma, obtenemos la concentración de espermatozoides por mililitro. Tabla 2. Solución salina formolada NaCl.….…………………………………………. 9 g dH2O.………………………………….………… Hasta 1000 ml Solución de formaldehído (35-40%)..…………... 8,5 ml Una vez hallada la concentración de espermatozoides por mililitro y conociendo también el volumen del eyaculado, podíamos calcular el número de espermatozoides totales por eyaculado, multiplicando estos dos datos entre sí. La determinación de la concentración (por ml y total) se realizaba por duplicado. Del mismo modo, en numerosas ocasiones al comienzo de las diferentes experiencias, la determinación del número de espermatozoides presente en cada eyaculado se realizaba también mediante un fotómetro especialmente diseñado para la medición de la concentración espermática (Fotómetro Spermacue®, modelo 12300/0500, Minitübe Ibérica, España). Para ello, sirviéndonos de una pipeta Pasteur, se rellenaba una microcubeta del sistema con una pequeña muestra de semen. Acto seguido, la microcubeta era introducida en el fotómetro, determinando la concentración de espermatozoides por ml de eyaculado. III. Vitalidad espermática El porcentaje de espermatozoides vivos se analizó mediante el uso de una tinción supravital (Barth y Oko, 1989), con los colorantes eosina y nigrosina (Tabla 3). Sobre un portaobjetos a Material y Métodos 75 37ºC, se mezclaba una gota de semen diluido a razón 1:20 en solución de lavado (mantenida a 37ºC) con una gota de colorante, también atemperado a 37ºC. Una vez mezcladas ambas gotas, se realiza una extensión con ayuda de otro portaobjetos que se deslizaba sobre el primero, formando un ángulo de 30-40º entre ambos. Esta extensión se secaba rápidamente al aire y se observa a microscopio óptico a 1000 aumentos (Olympus BH2-NIC-2), con aceite de inmersión. Los espermatozoides que mostraban algún indicio de coloración rosada en su estructura, indicativo de alteración de la membrana, eran considerados muertos. Por su parte, los que se presentaban totalmente blancos, indicativo de que presentaban una membrana funcional que impedía el paso de los colorantes, eran considerados como vivos. Para determinar el porcentaje de espermatozoides vivos se procedió al recuento de 200 espermatozoides en total por cada muestra seminal. Tabla 3. Tinción supravital para determinar el porcentaje de espermatozoides vivos Eosina B azulada……………………………… 1 g Nigrosina……………………………………… 8 g dH2O…………………………………………... Hasta 100 ml IV. Porcentaje de morfoanomalías Para la determinación de este parámetro, se colocaba una gota del semen diluido a razón de 1:20 (en solución de lavado) en un portaobjetos a 37ºC. Con ayuda de otro cubreobjetos a 37ºC se hacía extensión de la gota y se dejaba secar al aire. Una vez seca, se teñía mediante la batería de colorantes Spermac® (Minitübe Ibérica, España), siguiendo las instrucciones del fabricante de la batería de colorantes. Posteriormente, mediante la utilización de un microscopio óptico de contraste de fases (Olympus BH2-NIC-2), a 1000 aumentos, con el objetivo de inmersión, se hacía recuento de 200 espermatozoides de cada muestra, valorando las distintas morfoanomalías que se presentaban. Las morfoanomalías que se valoraron se diferenciaron en morfoanomalías de cabeza Material y Métodos 76 (microcefalia, macrocefalia, malformación, cabezas sueltas, etc.), de pieza intermedia (gota citoplasmática, pieza intermedia rota, etc.) o de cola (colas rotas, colas enrolladas o dobles colas, etc.). V. Acrosomías El porcentaje de acrosomías se determinaba en la misma extensión realizada para el porcentaje de morfoanomalías y siguiendo la misma pauta. Se valoraban 200 espermatozoides de cada muestra distinguiendo entre espermatozoides con acrosoma normal y aquellos que presentaron alguna alteración de cualquier tipo en su estructura acrosómica (acrosoma desprendido, acrosoma rugoso, otros defectos en acrosoma), para luego calcular el porcentaje correspondiente. 3.1.5. PROCEDIMIENTOS DE DILUYOCONSERVACIÓN SEMINAL Tras la recogida, contrastación y selección de los eyaculados que iban a formar parte del estudio, se comenzaba con el proceso de diluyoconservación, que constaba de 3 fases: lavado, dilución y equilibrado. 3.1.5.1. Lavado El lavado del semen es un proceso necesario en el caso de congelación de semen de caprino, ya que los líquidos espermáticos son ricos en lipasas. Estas lipasas han de eliminarse, si no fuera así, la membrana lipídica de los espermatozoides iría degradándose, acortando la vida de los espermatozoides criopreservados (Leboeuf y cols., 2000; Cseh y cols., 2012). Con este objetivo, se realizaban dos lavados consecutivos de cada eyaculado. En primer lugar, el eyaculado era diluido hasta 10 ml, con solución de lavado atemperada a 37ºC (Tabla 1) y era posteriormente centrifugado durante 15 minutos a 700 x g. De esta forma, los espermatozoides quedaban precipitados, y con la ayuda de una pipeta Pasteur, se eliminaba el sobrenadante. A continuación, se realizaba el segundo lavado, adicionando la solución de lavado (hasta 10 ml) a temperatura de laboratorio (20-25ºC), y se centrifugaba de similar forma que en la primera ocasión. El objetivo de este procesado era que la temperatura del eyaculado fuese disminuyendo progresivamente y evitar o reducir al mínimo los efectos nocivos de un shock térmico. Material y Métodos 77 Una vez centrifugado, se retiraba el sobrenadante con la ayuda de una pipeta Pasteur, y ya se comenzaba con el proceso de dilución del semen. 3.1.5.2. Dilución Para la dilución y conservación de semen se utilizaban básicamente diluyentes a base de yema de huevo, TRIS (hidroximetil), glucosa, ácido cítrico, antibióticos (penicilina y estreptomicina) y en su caso glicerol, tal y como se muestra en la Tabla 4. Estos diluyentes ya habían sido testado con éxito para la criopreservación del semen caprino en las razas canarias (Cabrera y cols., 2005). Tabla 4. Composición de los diluyentes empleados en la experiencia (por cada 100 ml) Diluyente I Tris…………………….................................. 2.666 g Yema de huevo……………………………… 12 ml Glucosa…………………….......................... 0.44 g Ácido cítrico………………………………….. 1.398 g Penicilina…………………………………….. 44.000 UI Estreptomicina……………………………… 44 mg Diluyente II Tris…………………….................................. 2.45 g Yema de huevo……………………………… 11.04 ml Glucosa…………………….......................... 0.40 g Ácido cítrico………………………………….. 1.29 g Penicilina…………………………………….. 40.480 UI Estreptomicina……………………………… 40.48 mg Glicerol………………………………………. 8% La cantidad de diluyente a añadir se calculaba partiendo de los datos, ya conocidos, de concentración de cada eyaculado. Conociendo esta concentración, se le añadía la cantidad de diluyente suficiente para obtener la concentración final buscada, que fue distinta en cada uno de los experimentos. De manera general, una vez definida la cantidad total de diluyente a añadir, ésta se dividía a su vez entre 2. La primera fracción (diluyente I) sería de diluyente que no contiene Material y Métodos 78 glicerol; la segunda fracción (diluyente II) habría de contener un 8% de glicerol, solamente en el caso del semen que fuese a ser conservado mediante congelación. Si el semen iba a ser conservado a otra temperatura que no fuese la de congelación (temperatura ambiente, refrigeración), la segunda fracción del diluyente (si fuese necesario añadir) era similar que la primera fracción. Los diluyentes se añadían habitualmente a temperatura de laboratorio (20-25ºC). El diluyente I o fracción no glicerolada se añadía de una vez, y tras resuspender la dilución mediante la utilización de pipetas Pasteur, se aguardaba 10 minutos antes de añadir el diluyente II. Por su parte, el diluyente II o fracción glicerolada, utilizada únicamente en eyaculados destinados a la congelación, se adicionaba (gota a gota, dejando resbalar por las paredes del tubo que contenía la dilución), dividido en 3 alícuotas, de igual volumen, separadas entre sí 10 minutos. De esta forma, transcurría el tiempo suficiente para que los espermatozoides se adaptasen a las nuevas condiciones de pH y osmolaridad. Una vez diluido el semen, se procedía a envasarlo en pajuelas de plástico de 0.5 ml, que fueron llenadas mediante aspiración, a temperatura ambiente, dejando una cámara de aire de aproximadamente 1 centímetro de longitud en el extremo abierto de las pajuelas. El sellado de las pajuelas se llevó a cabo mediante bolitas selladoras de distintos colores para identificarlo. 3.1.5.3. Equilibrado En todas aquellas experiencias en las que el semen se conservó congelado o refrigerado, las pajuelas una vez llenas y selladas, se introducían en una nevera (Liebherr®, Pamplona, España) a 4ºC, que permitía el descenso de la temperatura desde los 20-25ºC hasta los 4-5ºC de forma paulatina. Este descenso se monitorizaba con un termómetro Crison TM 65 con sonda de inmersión, confirmando que tardaba alrededor de 1.5-2 horas hasta alcanzar la temperatura de 4-5ºC. Una vez que el semen diluido llegaba a la temperatura de 4-5ºC, el tiempo que las pajuelas permanecían a 4-5ºC oscilaba entre 2-4 horas, en función de los experimentos programados. Una vez finalizado el periodo de equilibrado y antes de continuar con el proceso de congelación, se seleccionaban algunas pajuelas de manera aleatoria y se procedía a estimar Material y Métodos 79 el grado de calidad seminal, mediante la valoración de la motilidad espermática y los porcentajes de acrosomías y morfoanomalías. 3.1.6. PROTOCOLOS DE CONGELACIÓN Y CONSERVACIÓN SEMINAL En función de las experiencias que posteriormente serán explicadas con detalle, el semen fue conservado mediante distintos sistemas, variando ligeramente el protocolo en función del diseño experimental. De esta manera, una vez finalizado el periodo de equilibrado, se comenzaba con el protocolo de crio-preservación. Este proceso se llevó a cabo básicamente de dos formas distintas en función del método de congelación que fuéramos a utilizar. Los protocolos que se utilizaron en las experiencias eran alguno de los siguientes: - Pajuelas congeladas en nitrógeno líquido: tras el período de equilibrado, las pajuelas se depositaban en una rampa metálica, que se situaba dentro de una caja de poliestireno, con nitrógeno líquido en su interior. De esta forma, las pajuelas se situaban a unos 4-5 cm sobre la superficie del nitrógeno líquido, permaneciendo durante unos 15-20 minutos sometidas al efecto de los vapores de nitrógeno (Cabrera y cols., 2005). Una vez transcurrido el tiempo correspondiente, las pajuelas se sumergían en el nitrógeno líquido y se almacenan en este medio hasta el momento de su utilización. - Pajuelas congeladas en ultracongeladores de -152ºC: tras el proceso de equilibrado, las pajuelas eran trasladadas (a 4ºC) desde la cámara frigorífica hasta el ultracongelador de -152ºC (Álamo y cols., 2005), para ser directamente introducidas en el ultracongelador, quedando almacenadas de esta forma hasta el momento de su utilización. Las características del ultracongelador y el procedimiento de congelación se describen al detalle en la primera de las experiencias. 3.1.7. DESCONGELACIÓN Y VALORACIÓN DE LA CALIDAD SEMINAL POSTDESCONGELACIÓN La descongelación de las dosis seminales se llevó a cabo sumergiéndolas directamente en agua atemperada a 37ºC durante 30 segundos como mínimo. Con aquellas pajuelas que no habían sido bien selladas mediante microbolitas selladoras, había que tener la precaución de no Material y Métodos 80 sumergirlas por su extremo abierto para evitar que pasase agua a su interior, circunstancia que sería letal para los espermatozoides. Una vez transcurridos los 30 segundos, las muestras destinadas a ser valoradas in vitro fueron sometidas al siguiente protocolo: el contenido de cada pajuela fue diluido en 1.0 ml (dilución 1:2) de buffer TRIS (2.4 gr de Tris Aminometano, 1.4 g de ácido cítrico, 0.8 g de glucosa, 0.06 g de Bencilpenicilina, 0.218 gr de estreptomicina, agua destilada hasta 100 ml), atemperado a 37ºC. Tras diluir la muestra, ésta se mantenía a 37ºC (baño María) y se aguardaba unos 5 minutos antes de valorar la calidad seminal. El propósito de esta práctica era dar tiempo a los espermatozoides para que se reactivasen correctamente de su letargo gracias a una temperatura óptima para su actividad. Transcurrido este período de tiempo, procedíamos a la determinación de los parámetros de motilidad individual progresiva, porcentaje de acrosomías y porcentaje de morfoanomalías, haciendo distinción entre los distintos tipos existentes. Todas estas valoraciones se llevaron a cabo según lo ya explicado en el apartado de contrastación seminal. Material y Métodos 81 3.2. SINCRONIZACIÓN DEL CELO, INSEMINACIÓN ARTIFICIAL Y TASA DE FERTILIDAD 3.2.1. ANIMALES Los animales que formaron parte de la fase in vivo de los diferentes experimentos, se encontraban en las condiciones de alojamiento, alimentación y plan sanitario ya descritas en el apartado 3.1.2. I. Hembras En esta fase de las experiencias se utilizaron hembras de diversas edades, si bien todas las cabras eran mayores de 12 meses, y habían alcanzado la pubertad, al menos 2 meses antes de ser sometidas a ningún tratamiento. Previamente a cualquier experiencia, se confirmaba que las hembras se encontraban en un buen estado de salud, mostraban celos regulares cada 20-21 días y se realizaba un examen ecográfico del aparato genital, para confirmar que los animales no presentasen ningún tipo de problema reproductivo que pudiese limitar su fertilidad. II. Machos Los machos utilizados en esta fase experimental fueron los mismos que en el apartado anterior. En este caso, fueron utilizados para detectar los celos. 3.2.2 TRATAMIENTO DE INDUCCIÓN Y SINCRONIZACIÓN DEL CELO Y LA OVULACIÓN Las hembras fueron sincronizadas mediante la inserción de esponjas intravaginales impregnadas con acetato de fluorogestona (20-45 mg de FGA, Chronogest®, Intervet) durante 11 días. El día 9 tras la colocación de las esponjas se inyectó, vía intramuscular, 7.5 mg de luprostiol (1 ml, Prosolvin®, Intervet) para asegurar la regresión luteal y 200 UI de Gonadotropina Coriónica Equina (eCG, Foligon®, Intervet), retirando las esponjas 2 días más tarde. Para determinar el momento óptimo de la inseminación artificial, se realizó una exhaustiva detección de los celos mediante la utilización de machos enteros. Esta detección de celos se iniciaba entre 12 a 24 horas tras la retirada de las esponjas y, a partir de este momento, se realizaban chequeos cada 8-12 horas. De manera general, cada cabra se testaba de manera individual, presentándose a un macho entero, provisto con arnés, durante un periodo mínimo de 3 a 5 minutos. Se consideraba que la hembra se encontraba en celo, cuando permitía el cortejo y el salto por parte del macho testador. Experiencia I 88 4.1. EXPERIENCIA I: UTILIZACIÓN DE LOS ULTRACONGELADORES DE -152ºC PARA LA PRESERVACIÓN DEL SEMEN EN LA ESPECIE CAPRINA: RESULTADOS IN VITRO Y FERTILIDAD TRAS INSEMINACIÓN ARTIFICIAL 4.1.1. INTRODUCCIÓN La inseminación artificial (IA) con semen fresco, refrigerado o congelado-descongelado es una herramienta básica para la cría de ganado caprino, facilitando la difusión del semen caprino con alto valor genético (Leboeuf y cols., 2000; Hidalgo y cols., 2007). En los últimos años, la inseminación artificial con semen fresco se ha convertido en una técnica común en ganado caprino (Roca y cols., 1997; Leboeuf y cols., 2003a; Paulenz y cols., 2005), sin embargo, el uso comercial del semen congelado y conservado se encuentra relativamente limitado en la reproducción caprina. Al igual que en otros mamíferos domésticos, el proceso de congelación reduce la viabilidad de los espermatozoides caprinos; el porcentaje de fertilidad de cabras inseminadas con semen congelado-descongelado, oscila entre el 30 y el 70% (Ritar y cols., 1983; Ritar y cols., 1990; Baril y cols., 1993; Singh y cols., 1995; Karatzas y cols., 1997; Leboeuf y cols., 2003a; Salvador y cols., 2005; Dorado y cols., 2007), mientras que con semen fresco o refrigerado se registran valores entre el 60 y el 80% (Dauzier y cols., 1966; Ritar y cols., 1983; Roca y cols., 1997; Paulenz y cols., 2005). Mediante inseminación artificial transcervical, una baja proporción de espermatozoides atraviesan el canal cervical; en consecuencia, se precisa de un mayor número de espermatozoides para obtener tasas razonables de fertilidad (Baril y cols., 1993; Roca y cols., 1997; Gacitua y cols., 2005). Diferentes estudios han señalado este hecho como un obstáculo a la hora de realizar inseminación artificial en pequeños rumiantes (Gacitua y cols., 2005; Kaabi y cols., 2006). Por otro lado, se obtienen mejores resultados de fertilidad si la inseminación se realiza de manera intrauterina, mediante laparoscopia (Ritar y cols., 1990; Eppleston y cols., 1994); sin embargo, los altos costes asociados con este procedimiento y la necesidad de técnicos cualificados para llevarla a cabo, son factores limitantes para el uso de esta técnica en caprino. La criopreservación de las pajuelas en nitrógeno líquido (NL) es el protocolo estándar para congelar y almacenar semen caprino. Otros estudios han descrito la congelación seminal Experiencia I 89 mediante la colocación de pellets de semen en hielo seco a -79ºC, pero requiere igualmente de nitrógeno líquido para su almacenaje (Leboeuf y cols., 2000). En algunas áreas geográficas, el NL no siempre es fácil de conseguir y su coste es relativamente elevado. El desarrollo de la liofilización y los métodos de vitrificación, evitando el uso de NL, se ha postulado como alternativas viables para la criopreservación espermática (Holt, 1997). Sin embargo, no se han desarrollo un número suficiente de ensayos in vivo como para confirmar la efectividad de estas estrategias alternativas. Por otro lado, otro estudio (Gacitua y cols., 2005) realizado en la especie caprina, describe mayores tasas de fertilidad tras realizar inseminación artificial con semen congelado usando una máquina de congelación direccional; sin embargo, en este estudio también se utilizó NL para almacenar el semen. En la especie canina, diferentes experiencias (Álamo y cols., 2005; Batista y cols., 2006) han confirmado que el uso de ultracongeladores de -152ºC para la congelación y conservación de muestras de semen, puede representar una alternativa potencial al NL. Un estudio preliminar desarrollado por nuestro grupo de investigación (Medrano y cols., 2002) valoró, por primera vez, el uso de ultracongeladores de -152ºC para la congelación y almacenamiento de semen procedente de machos cabríos de la raza Majorera. Los resultados de este estudio confirmaron que la calidad seminal in vitro (hasta dos meses tras la congelación) no mostraba diferencias estadísticamente significativas entre pajuelas congeladas y almacenadas en NL, y pajuelas congeladas y conservadas exclusivamente en ultracongeladores de -152ºC. Sin embargo, hasta el momento de la presente experiencia, no se habían evaluado los resultados de calidad seminal tras un largo período de almacenamiento mediante este método; asimismo, no se han completado ensayos de fertilidad que permitan definir la capacidad fertilizante de semen congelado y conservado mediante ultracongeladores de -152ºC. El objetivo de este experimento fue evaluar el uso de ultracongeladores de -152ºC tanto para congelar como para almacenar semen caprino durante pequeños períodos de tiempo (1, 3 meses) y períodos más prolongados (12 meses). Además, se llevaron a cabo ensayos in vivo para determinar la fertilidad del semen caprino de la raza Majorera, congelado y conservado mediante ultracongeladores de -152ºC durante dos periodos definidos (1 mes, 6 meses) de almacenamiento. Experiencia I 90 4.1.2. MATERIAL Y MÉTODOS 4.1.2.1. Experimento 1 I. Animales En este primer experimento, cinco machos cabríos de la raza Majorera, con edades comprendidas entre 3.5 y 5 años, fueron seleccionados por su valor reproductivo. El estudio se llevó a cabo en la granja de la Facultad de Veterinaria de la ULPGC. Los animales se encontraban alojados, con una alimentación y plan sanitario como ya se ha descrito en la sección general de Material y Métodos. Todo el trabajo experimental se desarrollo de acuerdo con la legislación española de bienestar y experimentación animal. II. Diseño experimental El objetivo de la primera fase del experimento (Figura I) era comparar la calidad seminal in vitro del semen congelado y conservado en nitrógeno líquido (NL) y la del semen congelado y conservado en ultracongelador de –152ºC (ULF). Asimismo, se perseguía comprobar si la calidad seminal sufría alguna modificación en función del periodo de almacenamiento, en los dos protocolos de crioconservación anteriormente reseñados. Finalmente, un último objetivo de este experimento era comprobar si existía variabilidad individual en la congelabilidad del semen. Con tal fin, se recogieron diferentes eyaculados a un total de 5 machos, que se procesaban de manera individual y que una vez finalizado el proceso de diluyoconservación, eran sometidos a dos protocolos diferentes de crioconservación (NL, ULF). Posteriormente, el semen era valorado mediante los procedimientos habituales de contrastación (motilidad individual progresiva, porcentaje de morfoanomalías, porcentaje de acrosomías), tras diferentes periodos de conservación (1 día, 1 mes, 3 meses, 12 meses). III. Recogida y evaluación seminal. Durante la estación reproductiva (Septiembre-Noviembre 2006), se recogió, mediante vagina artificial, semen de cada macho, dos veces a la semana durante 5 semanas (10 eyaculados por animal). Inmediatamente tras la recogida, los eyaculados fueron colocados al baño María (37ºC) y se separó una alícuota de cada muestra para ser valorada. A nivel macroscópico, se valoraba el volumen y el color del eyaculado, mientras que a nivel microscópico se determinó la motilidad individual (total y progresiva), la concentración espermática y los porcentajes de morfoanomalías Experiencia I 91 y acrosomías. Los métodos y criterios utilizados para valorar las características seminales ya se han descrito con anterioridad; brevemente reseñar que la concentración espermática se determinaba tanto mediante hemocitómetro como mediante la utilización del Spermacue®. La motilidad individual progresiva se analizó aproximadamente 5 minutos tras la recogida seminal, con objeto de que el semen se estabilizase a una temperatura constante, y para que todas las muestras se evaluasen de manera similar. Tras diluir (ratio 1:20) una alícuota en solución de lavado, se procedía a la determinación del porcentaje de espermatozoides con motilidad individual, tanto de forma subjetiva como objetiva (sistema CASA). Finalmente, el porcentaje de morfoanomalías y acrosomías se determinaban mediante el protocolo de tinción Spermac® (Minitübe Ibérica, España), valorando un mínimo de 200 espermatozoides por muestra. Para el estudio, solo se seleccionaron aquellos eyaculados con una motilidad progresiva superior al 75%, un porcentaje de acrosomas intactos >75% y un porcentaje de espermatozoides sin morfoanomalías >85%. IV. Procesado seminal Entre 5 y 10 minutos tras la recogida seminal, los eyaculados de cada macho fueron lavados para retirar el plasma seminal, mediante la utilización de una solución de lavado, tal y como se ha explicado en apartados previos. Tanto los lavados como el posterior procesado del semen se realizo de manera individualizada para cada macho cabrío. Una vez finalizada la centrifugación y retirado el sobrenadante, el pellet era diluido (1:3) con un primer diluyente (no glicerolado) a base de TRIS (Tabla 4). De esta manera, una vez calculada la concentración espermática, cada muestra era diluida (a temperatura ambiente, 20ºC) con este primer diluyente, hasta alcanzar una concentración de 800 x 106 espermatozoides/ml. Unos 5 minutos más tarde, se realizaba una segunda dilución (Tabla 4), en tres pasos y separados 10 minutos entre sí, añadiendo esta fracción glicerolada a temperatura ambiente, hasta alcanzar una concentración de 400 x 106 espermatozoides/ml. Finalmente, el semen diluido era envasado en pajuelas de plástico de 0.5 ml y estas pajuelas fueron selladas mediante unas microbolitas plásticas de colores. Una vez envasadas, las pajuelas se colocaron en el interior de una cámara frigorífica, siendo enfriadas desde temperatura ambiente hasta 5ºC durante 2 horas; a continuación, las pajuelas se mantuvieron dos horas más en el refrigerador (5ºC) antes de empezar con el Experiencia I 92 proceso de congelación. Tras el período de equilibrado y justo antes de empezar el protocolo de congelación, se extrajo una alícuota de cada muestra para la valoración de la calidad seminal. V. Congelación y descongelación seminal Se llevaron a cabo congelaciones seminales en 15 ocasiones diferentes. La mitad de las pajuelas obtenidas de cada eyaculado se congelaron y conservaron mediante la utilización de nitrógeno líquido, mientras la restante mitad se congelaba y conservaba mediante la utilización de ultracongeladores de –152ºC. Concretamente, los procesos de crioconservación fueron los siguientes:  Protocolo NL, las pajuelas se congelaron sobre vapores de nitrógeno líquido (rampa de congelación, a 4 cm de la superficie del nitrógeno) durante 15 minutos. Una vez finalizado este periodo, las pajuelas se sumergían en NL y se almacenaron en un criocontenedor (Criocontenedor MVE, XC 47/11-10) de NL, hasta el momento de la descongelación.  Protocolo ULF, tras el período de equilibrado, las pajuelas se trasladaron (en el interior de una caja de poliestireno) directamente desde la cámara frigorífica (4-5ºC) y se introdujeron en el ultracongelador de -152ºC, donde el semen permaneció almacenado hasta el momento de su descongelación. El modelo de ultracongelador empleado fue el Sanyo (MDF-1155 ATN, Sanyo Electric Co., Japan) equipado con un microprocesador de temperatura que mantenía el interior del ultracongelador a –152ºC; este equipo se alimenta de corriente eléctrica y tiene una capacidad volumétrica de 160 litros, con una capacidad de almacenaje entre 8000 y 10000 pajuelas de 0.5 ml. Antes del inicio de la experiencia, la curva del descenso de temperatura del ultracongelador de –152ºC fue definida, mediante la utilización de un termómetro Crison TM 65 (Barcelona), con sonda de inmersión introducida en el ultracongelador, dentro de las pajuelas llenas de semen y diluyente. El descenso de temperatura quedó establecida de la siguiente forma: una velocidad de congelación de 4.5ºC/min entre los 5 y los -10ºC, y una mayor velocidad de congelación de -25ºC/min desde los -10ºC hasta los -110ºC; a partir de esta temperatura, la velocidad de congelación fue de -10ºC/min desde los -110ºC hasta los -140ºC. Experiencia I 93 La descongelación se llevó a cabo a los 1, 30, 90 y 365 días tras la congelación. Las pajuelas congeladas fueron sumergidas en agua a 37ºC durante 30 segundos, para luego verter el semen de cada pajuela en 1 ml de PBS a 37ºC; las muestras fueron entonces mantenidas a 37ºC hasta su completa valoración. Tras la descongelación, en cada pajuela, se determinaba la motilidad espermática, el porcentaje de morfoanomalías y de acrosomías, utilizando los mismos procedimientos que se han descrito. Quince pajuelas de cada macho fueron evaluadas cada día (1, 30, 90 y 365 días) y en cada protocolo (NL, ULF). 4.1.2.2. Experimento 2 I. Animales Ciento cincuenta cabras lecheras de la raza Majorera (59 nulíparas y 91 multíparas) fueron usadas en este experimento. Las cabras mostraban ciclos estrales regulares de 20-21 días y, antes del inicio de los tratamientos de sincronización, se les realizó un examen ultrasonográfico del tracto reproductivo para intentar descartar hembras con pseudogestaciones. La alimentación, alojamiento y plan sanitario era similar al descrito para los machos cabríos. II. Sincronización del celo y la ovulación. Detección de celos. Los ciclos estrales fueron sincronizados mediante la inserción de esponjas vaginales impregnadas en progestágeno (45 mg de acetato de fluorogestona, Chronogest®, Intervet) durante 11 días. Dos días antes de su retirada, las cabras recibieron una inyección intramuscular de eCG (200UI, Foligon®, Intervet) y 7.5 mg de análogo de Prostaglandina F2α (Luprostiol, Prosolvin®, Intervet). La detección de celo se llevó a cabo 3 veces al día (separadas 8 horas entre sí), empezando 12 horas tras la retirada de las esponjas. Como ya se ha indicado previamente, cada cabra era presentada individualmente al macho y los machos estaban provistos de un mandil para evitar penetraciones. Experiencia I 94 III. Diseño experimental e inseminación artificial Los eyaculados se recogieron de los tres machos que presentaron mejor calidad del semen postdescongelación en el experimento 1. Tras la recogida, el semen era mezclado (pool) y procesado como ya se ha explicado con anterioridad, hasta alcanzar una concentración final de 400 x 106 espermatozoides/ml. Posteriormente, el semen diluido fue envasado en pajuelas de 0.5 ml y tras los correspondientes procesos de refrigeración y equilibrado, las pajuelas fueron congeladas por los dos protocolos (NL y ULF). Antes de realizar las inseminaciones, las pajuelas eran descongeladas al baño María a 37ºC durante 30 segundos. Para cada grupo experimental, se valoraban las pajuelas para confirmar que las hembras eran inseminadas cada vez con un mínimo de 100 x 106 espermatozoides móviles. Las cabras fueron asignadas a cuatro grupos experimentales (Figura II), teniendo en cuenta su edad, fecha de parto previo y producción láctea, y realizando una distribución uniforme: en el grupo NL-1 (n=40), las cabras fueron inseminadas con semen descongelado, previamente congelado y almacenado en nitrógeno líquido durante un mes; en el grupo NL-6 (n=35), las cabras fueron inseminadas con semen descongelado tras haber estado almacenado en nitrógeno líquido durante 6 meses; en el grupo ULF-1 (n=40), las cabras fueron inseminadas con semen descongelado, después de permanecer congelado en ultracongelador de -152ºC durante un mes; finalmente, las cabras del grupo ULF-6 (n=35) fueron inseminadas con semen descongelado, previamente congelado y conservado en ultracongelador de -152ºC durante 6 meses. Las inseminaciones siempre se realizaban de manera uniforme, de tal forma que cada vez que se producían las inseminaciones, un lote de hembras era inseminada con semen congelado-descongelado en nitrógeno líquido y otro lote, con un número similar de cabras, con semen congelado-descongelado en ultracongelador de –152ºC. La primera inseminación se realizaba 12 horas tras la detección de los primeros síntomas de celo (aproximadamente a las 18 horas tras el inicio del celo) y, a partir de este momento, cada 12 horas hasta el final del celo, con un mínimo de 2 (18 y 30 horas tras el inicio del celo) y un máximo de 3 (18, 30 y 42 horas tras el inicio del celo) inseminaciones. Experiencia I 95 Las cabras fueron inseminadas vía cérvix con una pipeta de inseminación, mediante visualización directa de la entrada del cérvix (Andersen y cols., 1973). El semen fue depositado los más profundamente posible en el tracto genital, definiendo que el tiempo máximo empleado en realizar la inseminación artificial nunca fuese superior a los 60 segundos por animal. Todas las inseminaciones se llevaron a cabo por dos técnicos especializados. IV. Diagnóstico de gestación y tasas de fertilidad La gestación fue confirmada mediante ultrasonografía trasabdominal el día 35 tras la inseminación, usando un ecógrafo portátil de tipo B a tiempo real (Aloka SSD-500), equipado con una sonda lineal de 5.0 a 7.5 MHz. Se consideraba que las cabras estaban gestantes cuando se detectaba, con total fiabilidad, el latido cardíaco del embrión. Posteriormente, las cabras fueron reevaluadas para confirmar la viabilidad fetal a los 60, 90, 120 y 140 días de gestación. Finalmente, tras del parto, las tasas de fertilidad y prolificidad fueron registradas en cada una de las hembras. 4.1.2.3. Análisis estadístico Los resultados se expresan como media ± desviación estándar de la media (SEM). Los datos de viabilidad espermática del experimento 1 fueron analizados usando el modelo lineal general (ANOVA) de SPSS 10.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.). El modelo lineal incluía el efecto de los machos (n=5), los protocolos de congelación (dos protocolos) y el tiempo de almacenamiento (1, 30, 90 y 365 días), así como las interacciones entre ellos. Las variables dependientes expresadas como porcentajes (motilidad espermática, integridad del acrosoma y morfoanomalías) eran sometidas a transformación arcosénica antes de su análisis. Las diferencias entre las medias fueron analizadas mediante la prueba de Duncan. Con respecto a los resultados de fertilidad, las diferencias entre grupos experimentales, estado reproductivo de las cabras (nulíparas/multíparas) y el efecto del tiempo de criopreservación, se compararon por la prueba exacta de Fisher. Los valores se consideraron estadísticamente significativos cuando p <0.05. Experiencia I 96 Figura I. Planificación de la recogida de muestras, contrastación, criopreservación y descongelación seminal (experimento 1) ANIMALES RECOGIDA SEMINAL CONTRASTACIÓN SEMINAL Volumen Motilidad Concentración Acrosomías Morfoanomalías DILUCIÓN SEMINAL 12% yema huevo 4% glicerol 400 x 106 espermat/ml CRIOPRESERVACION SEMINAL CONGELACIÓN Y CONSERVACIÓN EN NITROGENO LÍQUIDO CONGELACIÓN Y CONSERVACIÓN EN ULTRACONGELADOR EVALUACIÓN POST-DESCONGELACIÓN DIAS DE CONSERVACION 1 30 90 365 MOTILIDAD ACROSOMÍAS MORFOANOMALÍAS Experiencia I 97 Figura II. Diseño experimental de los procedimientos de sincronización, inseminación artificial y control de la gestación en los diferentes grupos experimentales (experimento 2) ANIMALES SINCRONIZACIÓN DEL CELO FGA eCG 11 días PGF-2α Día 9 INSEMINACIÓN ARTIFICAL GRUPOS EXPERIMENTALES GRUPO NL-1 (n = 40) GRUPO NL-6 (n = 35) GRUPO ULF-1 (n = 40) GRUPO ULF-6 (n = 35) Inseminación con semen crioconservado 1 mes en nitrógeno líquido Inseminación con semen crioconservado 6 meses en nitrógeno líquido Inseminación con semen crioconservado 1 mes en ultracongelador Inseminación con semen crioconservado 6 meses en ultracongelador DIAGNÓSTICO-MONITORIZACÓN GESTACIÓN 35 60 90 120 140 ECOGRAFÍA PARTO Inducción Día 145 Experiencia I 104 4.1.4. DISCUSIÓN Este estudio define, por primera vez, la calidad del semen caprino tras una criopreservación prolongada (1 año) usando un ultracongelador de -152ºC. Además, los resultados muestran que el almacenamiento a largo plazo de semen caprino no altera su calidad, con independencia del protocolo de preservación. Finalmente, los ensayos de fertilidad confirmaron que las muestras congeladas y almacenadas en ultracongeladores de -152ºC permanecen fértiles tras 6 meses de criopreservación. La calidad del semen fresco fue muy similar entre machos y solo se observaron diferencias significativas en el volumen eyaculado y en la concentración espermática. Tras la descongelación, la motilidad espermática (total y progresiva) mostraba valores medios similares entre protocolos de congelación, siendo comparables a los registros con semen congeladodescongelado en otras razas caprinas (Tuli y Holtz, 1994; Singh y cols., 1995; Hidalgo y cols., 2007; Cabrera y cols., 2005; Chang-Yong y cols., 2006). La mayoría de estudios de criopreservación del semen en la especie caprina han incluido el uso de nitrógeno líquido para congelar semen (Singh y cols., 1995; Cabrera y cols., 2005; Chang-Yong y cols., 2006; Hidalgo y cols., 2007) y solo algunos estudios han congelado las muestras de semen sin nitrógeno líquido (Leboeuf y cols., 2000; Gacitua y cols., 2005); sin embargo, todos los estudios publicados siempre utilizaron nitrógeno líquido para el almacenamiento posterior. Un trabajo preliminar desarrollado en nuestro laboratorio (Medrano y cols., 2002), pero con un menor número de animales, propuso el uso de ultracongeladores para la criopreservación seminal, donde no era necesario el uso de nitrógeno líquido, ni para la congelación ni para su posterior conservación. En dicho estudio (Medrano y cols., 2002), el semen congelado-descongelado mostró unos valores medios de motilidad progresiva que oscilaron entre el 31% y el 42% (evaluado subjetivamente), en comparación con los valores de 29-45% (evaluado por el sistema CASA), obtenido en nuestro estudio. Parece evidente que el ULF no modificó los parámetros de la motilidad tras la congelación seminal, registrando valores medios altamente correlacionados entre los dos protocolos. La motilidad espermática no se vio modificada a lo largo de todo el período experimental para ninguno de los machos, mostrando valores medios razonablemente constantes hasta el año Experiencia I 105 de congelación. Estos resultados coinciden con otros datos publicados que no refieren variación de la calidad seminal durante todo el período de crioconservación (Waide y cols., 1977); sin embargo, otros estudios han encontrado un deterioro en la viabilidad espermática después de un almacenamiento a largo plazo utilizando nitrógeno líquido como medio de criopreservación (Corteel, 1975; Ritar y cols., 1991). Por otra parte, los resultados de nuestro estudio detectaron diferencias entre los machos en la viabilidad seminal después de la congelación. Esta variabilidad individual en la motilidad espermática tras la congelación parece resultar relativamente independiente de la calidad seminal en fresco que presenten los machos; en consecuencia, podemos asumir que es fundamental evaluar la calidad seminal tras la congelación-descongelación para definir los machos donantes como “bueno congeladores'' o “malos congeladores” (Leboeuf y cols., 2000). El porcentaje de espermatozoides con la membrana acrosómica intacta en ambos protocolos de crioconservación mostraba valores (medios) en torno al 60-70%. En otras razas caprinas, tras la congelación y almacenamiento con nitrógeno líquido, el porcentaje de espermatozoides con acrosomas intactos oscilaba entre el 40 y el 70% (Singh y cols., 1995; Cabrera y cols., 2005; Dorado y cols., 2007). Del mismo modo, la integridad acrosómica registrada en muestras seminales congeladas y almacenadas en un ULF, alcanzó valores medios del 55% (Medrano y cols., 2002). En consecuencia, nuestros valores son asimilables a los registrados tanto con NL como con ULF, siendo ligeramente superiores a la mayor parte de los estudios publicados. Con respecto al porcentaje de morfoanomalías tras la descongelación, ambos protocolos (NL y ULF) presentaron resultados estadísticamente similares; además, cuando los machos se compararon entre ellos, los porcentajes de espermatozoides sin morfoanomalias fueron similares durante todo el período experimental. Diferentes estudios han evaluado el porcentaje de espermatozoides normales post-descongelación, registrando resultados que oscilaron entre un 50 y un 80%, tras la congelación en NL (Singh y cols., 1995; Salvador y cols., 2005; Dorado y cols., 2007; Hidalgo y cols., 2007); hasta el momento presente, no se han descrito resultados de morfoanomalías tras la conservación seminal mediante ULF. De acuerdo con nuestros resultados, el ULF no generó un mayor porcentaje de morfoanomalías en los espermatozoides cuando se conserva mediante este protocolo. Experiencia I 106 El índice de fertilidad observado en nuestra experiencia (43.2 y 39.2% para NL y ULF, respectivamente) era comparable a los obtenidos en otras razas caprinas después de realizar inseminación artificial cervical con semen congelado y descongelado: 39% en cabra Cashmere (Ritar y cols., 1990), y 39-42% en Saanen (Gacitua y cols., 2005). Otros estudios registraron valores superiores tras realizar inseminación artificial con semen congelado-descongelado: 47.6% en la raza Florida (Dorado y cols., 2007), 51% en la cabra de Angora (Ritar y cols., 1991), 57% en la Murciano-Granadina (Salvador y cols., 2005) y 57-61% en Saanen y Alpina (Leboeuf y cols., 2000). Sin embargo, la mayoría de estos trabajos se llevaron a cabo con cabras multíparas, mientras en nuestro estudio se utilizaron tanto cabras multíparas como nulíparas. De hecho, nuestros resultados mostraron una marcada influencia del número de partos previos de las hembras sobre la tasa de fertilidad; concretamente, las cabras nulíparas presentaron una tasa de fertilidad significativamente inferior (28-33%) que las multíparas (45-50%). Dorado y cols. (2007) describieron una tasa de fertilidad mayor en cabras multíparas (58.8%) que en cabras uníparas (0%) tras realizar inseminación artificial con semen congelado-descongelado; además, se ha demostrado que, tras la inducción de celos con tratamientos hormonales, las cabras nulíparas eran menos fértiles que las multíparas tras realizar inseminación intra-cervical (Leboeuf y cols., 2000). En nuestro estudio, la menor tasa de fertilidad observada en cabras nulíparas podría explicarse por el momento en el que tuvo lugar la inseminación con respecto a la ovulación; en cabras multíparas, la inseminación se llevó a cabo en torno a la mitad del período de celo (duración media del celo: 41.2 h.), mientras que en las cabras nulíparas, la inseminación se realizo en la segunda mitad del celo (duración media del celo: 32.0 h.). Estos hallazgos son coherentes con lo descrito por Leboeuf y cols. (2000), que reportan mejores tasas de fertilidad en las cabras inseminadas durante la primera parte del período estral. Por otro lado, debería tenerse en cuenta que las cabras nulíparas muestran un mayor nivel de nerviosismo que las multíparas, y el estrés asociado con el manejo al que las hembras se ven sometidas por la técnica de inseminación, podría haber generado la menor tasa de fertilidad registrada en nuestro estudio. Se han realizado diferentes estudios que evaluaban distintos factores que pudiesen afectar a la tasa de fertilidad tras inseminaciones con semen congelado-descongelado (Leboeuf Experiencia I 107 y cols., 2000; Salvador y cols., 2005; Dorado y cols., 2007). De esta manera, se ha descrito que cuando el semen era recogido en la estación reproductiva, la fertilidad era mejor en comparación a cuando el semen se extraía en la estación no reproductiva (Corteel y cols., 1988); en nuestro estudio, la recogida seminal siempre tuvo lugar en la estación reproductiva. De esta forma, la influencia de la estacionalidad sobre la congelabilidad del semen y, en consecuencia, sobre la posterior fertilidad podría descartarse en nuestro caso. Además, el semen fue mezclado antes de la congelación, para evitar la influencia de las diferencias entre machos en la “congelabilidad” del semen (Leboeuf y cols., 2000); asimismo, las pajuelas fueron evaluadas antes de llevar a cabo las inseminaciones, y solo las pajuelas con una motilidad progresiva mínima, fueron destinadas para realizar las inseminaciones artificiales. Por otro lado, la influencia del técnico inseminador sobre la fertilidad puede ser obviada, ya que ambos técnicos tenían la misma experiencia, y no se observaron diferencias de fertilidad en las hembras inseminadas por ambos técnicos. Finalmente, diferentes investigadores han establecido la relación entre el lugar donde es depositado el semen y la tasa de fertilidad (Ritar y cols., 1983; Corteel y cols., 1988; Paulenz y cols., 2005), mostrando un mayor porcentaje de fertilidad cuando el semen era depositado en el cérvix o en el útero, en comparación a cuando el semen se depositaba a nivel vaginal. En nuestro estudio, la mayoría de las inseminaciones (90%) fueron intra-cervicales y, por tanto, esta circunstancia no debería haber influido sobre la tasa de fertilidad registrada. Se han desarrollado muy pocos estudios que hayan valorado la influencia del tiempo de conservación de las pajuelas sobre la fertilidad, tras IA con semen congelado-descongelado. Fougner y cols. (1979) obtuvieron tasas de fertilidad de un 63.4% tras realizar inseminaciones intra-cervicales con semen conservado en NL durante 1-3 años y no hallaron diferencias significativas en la tasa de fertilidad a lo largo del período experimental. Sin embargo, otros estudios han descrito un declive en la calidad seminal (in vitro) tras un almacenamiento del semen durante 6 meses en NL (Ritar y cols., 1983). En nuestro estudio, no se observaron diferencias en la tasa de fertilidad tras realizar IA con semen congelado y descongelado durante 1 ó 6 meses de almacenamiento. Por lo tanto, estos resultados confirman que el tiempo de almacenamiento del semen no tiene influencia en la consecuente fertilidad. Experiencia I 108 Antes de nuestra experiencia, solamente un trabajo (Medrano y cols., 2002) había propuesto el uso de ULF para la congelación y el almacenamiento de semen caprino, pero ese estudio se llevó a cabo durante un corto período de almacenamiento (2 meses) y no se desarrollaron ensayos de fertilidad. En nuestro estudio, no se encontraron diferencias entre ambas técnicas de congelación, presentando resultados similares en calidad espermática in vitro durante todo el período experimental (1 año). Además, los resultados de fertilidad confirman que el semen caprino permanece fértil tras la criopreservación en ULF, mostrando tasas de fertilidad y prolificidad prácticamente iguales a las observadas tras IA con semen congelado con NL. Los congeladores de temperaturas ultra-bajas presentan evidentes ventajas sobre el uso de nitrógeno líquido. De esta forma, se ha descrito (Álamo y cols., 2005; Batista y cols., 2006) una mayor capacidad de almacenamiento del ULF, el menor tiempo empleado para la congelación de las pajuelas tras el equilibrado y un manejo mucho más sencillo de las muestras almacenadas. Además, al contrario que la criopreservación con el uso de nitrógeno líquido, no hace falta una reposición periódica del medio de congelación, y el coste global del proceso de congelación, es menor. Sin embargo, una manifiesta desventaja de este protocolo es la limitada movilidad del congelador, que podría reducir la eficacia de la IA en explotaciones ganaderas alejadas del laboratorio. Para evitar esta limitación, podrían plantearse nuevas experiencias, donde el semen congelado y almacenado en ULF sería posteriormente depositado en nitrógeno líquido, para luego evaluar la calidad seminal (in vitro e in vivo). Además, parecería interesante realizar nuevos ensayos de fertilidad, para determinar la tasa de fertilidad del semen caprino tras ser almacenado en ULF durante varios años. EXPERIENCIA II Experiencia II 110 4.2. EXPERIENCIA II. INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA DE CONSERVACIÓN (37ºC, 20ºC, 4ºC, -196ºC) Y DEL POOL SEMINAL SOBRE LA CALIDAD ESPERMÁTICA EN LOS MACHOS CABRÍOS DE RAZA MAJORERA. 4.2.1. INTRODUCCIÓN En los últimos años, distintos estudios han intentado definir cuáles son los mejores indicadores de la calidad seminal in vitro (Dorado y cols., 2007; Hidalgo y cols., 2007; Batista y cols., 2009). Diferentes parámetros como la motilidad espermática, el porcentaje de acrosomías y el porcentaje de morfoanomalías espermáticas se han propuesto como indicadores que permiten predecir la capacidad fertilizante del semen (Peterson y cols., 2007; Dorado y cols., 2009). Algunas investigaciones han evaluado la influencia de la temperatura de conservación sobre la calidad seminal en distintas especies de mamíferos (Leboeuf y cols., 2000; Barbas y Mascarenhas, 2009). En concreto, la calidad seminal del macho cabrío ha sido evaluada en muestras conservadas entre 4 y 15-20ºC (Leboeuf y cols., 2000; Paulenz y cols., 2005); del mismo modo, las características del semen fresco y las del semen congelado-descongelado han sido ampliamente definidas en diferentes estudios (Cabrera y cols., 2005; Salvador y cols., 2005; Dorado y cols., 2007, 2009). Sin embargo, hasta el momento, ningún estudio había comparado al mismo tiempo, la viabilidad espermática de muestras conservadas a 37, 20 y 4ºC durante 24 horas, y la longevidad del semen congelado-descongelado. La variabilidad individual en la calidad seminal tras la congelación-descongelación ha sido bien estudiada en verracos (Holt y cols., 2005) y perros (Batista y cols., 2006). En bovino, un estudio reciente revela que no existe variabilidad individual en cuanto a motilidad, porcentaje de acrosomías y estado de capacitación de semen crioconservado en nitrógeno líquido (Gillan y cols., 2008). Por otro lado, diferentes estudios han evaluado la importancia del uso de dosis heterospérmicas para mejorar la eficacia reproductiva en el caso de las cerdas (Roca y cols., 2006; Hernández y cols., 2007). Se ha confirmado que la utilización de un pool de semen incrementaba la tasa de fertilidad, cuando se comparaba con inseminaciones con semen procedente de ejemplares individuales (Godet y cols., 1996). Finalmente, distintos estudios (Paulenz y cols., 2000; Haugan y cols., 2005) han descrito la influencia del tiempo de almacenamiento sobre la calidad seminal en verraco, sugiriendo que el uso de dosis Experiencia II 111 heterospérmicas puede prevenir la disminución del índice reproductivo cuando se usa semen conservado. En caprino, la mayoría de los estudios se han desarrollado usando dosis heterospérmicas (Leboeuf y cols., 2003a; Salvador y cols., 2006; Mara y cols., 2007). La variabilidad individual sobre la calidad del semen fresco, refrigerado y congelado también ha sido objeto de diferentes estudios (Paulenz y cols., 2005; Salvador y cols., 2005). Sin embargo, ningún estudio se ha llevado a cabo con el fin de estudiar si el uso de dosis heterospermicas de semen caprino incrementa la calidad seminal y la consecuente fertilidad tras la inseminación artificial. El primer objetivo de este experimento era establecer la calidad y longevidad del semen caprino (raza Majorera) conservado a diferentes temperaturas (37, 20, 4, -196ºC) y procesado de manera individual o tras realizar un pool de eyaculados. Por otro lado, este trabajo trataba de definir la fertilidad tras realizar inseminaciones con semen fresco y congelado-descongelado, procesado bien de manera individual o tras realizar un pool de eyaculados. 4.2.2. MATERIAL Y MÉTODOS 4.2.2.1. Experimento 1 I. Animales Para este estudio se usaron cinco machos sanos de la raza Majorera, con edades comprendidas entre los 4 y los 6 años. Las condiciones de estabulación, alimentación y plan sanitario eran similares a las ya descritas en el apartado general de material y métodos. Todo el trabajo experimental se desarrolló de acuerdo a la legislación española referente a investigación y experimentación animal. Antes del comienzo de la experiencia, una evaluación ecográfica confirmó la ausencia de alteraciones a nivel de los testículos y la próstata. II. Diseño experimental Este experimento (Figura III), pretendía definir la viabilidad y longevidad del semen, sometido a diferentes temperaturas de preservación (37ºC, 20ºC, 4ºC y – 196ºC), y procesado de manera individual o en forma de pool. De esta manera, se usaron eyaculados (n=30) de cinco machos cabríos, procesados de forma individual (semen individual: SI) y tras la primera dilución (porción Experiencia II 112 no glicerolada), cada eyaculado fue dividido en alícuotas y parte de estas alícuotas se mezclaron (pool de semen: PS). Posteriormente, las muestras seminales (SI y PS) fueron conservadas como semen fresco (37 y 20ºC), semen refrigerado (4ºC) y semen congelado (nitrógeno líquido). La motilidad espermática del semen fresco y refrigerado fue evaluado (análisis espermático computerizado, CASA) tras 2, 4, 8, 12 y 24 horas de preservación; asimismo, los porcentajes de acrosomías y morfoanomalías fueron evaluadas a las 1, 8 y 24 horas. Finalmente, muestras de semen (20 muestras por cada macho y 20 de PS) fueron descongeladas y conservadas a 37ºC durante 12 horas; la motilidad se pretendía evaluar a las 1, 2, 4, 8 y 12 horas tras la descongelación. Además, los porcentajes de morfoanomalías y acrosomías fueron determinados a las 1, 8 y 12 horas tras la descongelación. III. Recogida y valoración espermática Seis eyaculados de cada macho fueron recogidos mediante vagina artificial, dos veces en semana, durante la estación reproductiva. Tras la recogida, el semen fue conservado a 37ºC hasta su evaluación, donde se definía el volumen, concentración seminal, la motilidad progresiva (subjetiva y mediante CASA) y los porcentajes de acrosomías y morfoanomalías. Todo el procedimiento de recogida seminal, así como las diferentes valoraciones de la calidad seminal se realizaron de manera similar a lo descrito en los apartados correspondientes de material y métodos. Las muestras seleccionadas en este estudio debían presentar una concentración espermática superior a 2000 x 106 espermatozoides/ml, motilidad espermática progresiva > 70%, porcentaje de acrosomías < 20% y porcentaje de morfoanomalías <90%. IV. Procesado seminal: congelación y descongelación. Tras la recogida seminal, cada eyaculado fue “lavado” para retirar el plasma seminal y se procesó individualmente. El proceso de lavado de los espermatozoides fue similar al descrito en la parte general de material y métodos (doble centrifugado, 700 x g, 15 minutos). Una vez eliminado el sobrenadante, se determinaba la concentración seminal y se ajustaba el volumen (a 20ºC) con el diluyente I (diluyente no glicerolado, ver composición en Tabla 4), hasta alcanzar una concentración final de 800 x 106 espermatozoides/ml. En este momento, una alícuota (1 ml) del semen diluido de cada uno de los machos se añadía a un tubo de cristal, siendo mezclado y Experiencia II 113 homogeneizado (PS). Posteriormente, el semen diluido de cada macho (SI) y el pool seminal (PS) fueron divididos en cuatro nuevas alícuotas, siendo procesadas de la siguiente forma (figura III): la primera alícuota se depositaba en un tubo de cristal y se conservaba al baño María a 37ºC; la segunda muestra se situaba en un tubo de cristal y se preservaba a temperatura ambiente (20º), una tercera alícuota se depositaba también en un tubo de cristal y era enfriada desde temperatura ambiente a 4ºC (en un plazo de 1.5 horas), y conservada a 4ºC (cámara de refrigeración); finalmente, la cuarta alícuota era destinada a ser criopreservada en nitrógeno líquido. En las alícuotas destinadas a criopreservación, se añadió un segundo diluyente (diluyente glicerolado, ver composición en tabla 4), a temperatura ambiente (20ºC), en un volumen similar al primer diluyente hasta alcanzar una concentración final de 400 x 106 espermatozoides/ml. Finalmente, el semen era envasado en pajuelas plásticas de 0.5 ml y selladas mediante microbolitas plásticas. Las pajuelas fueron depositadas dentro del refrigerador a 4ºC durante 5 horas (enfriamiento de 2 horas desde temperatura ambiente a 4ºC y 3 horas más de equilibrado). Tras la dilución y justo antes del período de equilibrado, se valoró la motilidad de cada una de las alícuotas. Una vez finalizado el período de equilibrado, las pajuelas se depositaron a unos 4 cm sobre el nivel del nitrógeno líquido durante 15 minutos. Finalmente, esas pajuelas fueron sumergidas y conservadas en nitrógeno líquido. Estas muestras fueron conservadas en este medio durante 30 días. Se realizaron un total de 6 protocolos de criopreservación en este experimento (se congelaron 6 eyaculados por macho). Para la descongelación de las pajuelas, se procedió a sumergirlas en agua a 37ºC (durante 30 segundos) y el semen era depositado en 1 ml de PBS a 37ºC y mantenido a esta temperatura durante el resto del experimento. Para determinar la longevidad seminal, la motilidad fue evaluada a las 1, 2, 4, 8 y 12 horas tras la descongelación; además, los porcentajes de espermatozoides con morfoanomalías y acrosomías fue determinada a las 1, 8 y 12 horas tras la descongelación. El número de pajuelas evaluadas de cada macho (SI) y del pool seminal (PS) fue de 20. Experiencia II 120 conservación. En las muestras preservadas a 20ºC se observa que en 4 de los 5 ejemplares, la motilidad espermática apenas se modifica durante las 24 horas de incubación, con valores entre un 60 a un 70%; el macho 2 presenta los valores más bajos de motilidad desde el primer momento. Un patrón similar se observa en las muestras conservadas a 4ºC, con valores que no varían a lo largo del periodo de preservación, si bien en uno de los machos (macho 2), los valores de motilidad espermática son entre un 20 a un 30% inferiores (p<0.01) al resto de ejemplares. Por otro lado, al comparar la motilidad espermática de las muestras individuales y la del pool seminal, no se detectan diferencias significativas (entre la mayor parte de los machos y el pool) durante todo el periodo experimental, en muestras preservadas a 37, 20 y 4ºC; solo el macho 2 mostraba una motilidad progresiva inferior (p<0.01) que el pool, en todas las temperaturas evaluadas (37, 20, 4 ºC) y para todos y cada uno de los periodos evaluados (2, 4, 8, 12 y 24 horas). Finalmente, cuando se procesaron las muestras congeladas y descongeladas, pudimos observar una proporción prácticamente similar (35-45%) de motilidad progresiva entre los eyaculados individuales y el pool tras las dos primeras horas post-descongelación; a partir de este momento, se registró un descenso de los valores medios de motilidad progresiva, siendo estos valores inferiores al 25%, en todas las muestras evaluadas, a partir de 8 horas tras la descongelación. Al igual que para el resto de temperaturas evaluadas, el macho 2 presentaba los valores más bajos de motilidad (p<0.05), ya desde el primer periodo de tiempo evaluado, y mostrando valores inferiores al 10% a partir de las 4 horas de incubación. Tabla 4.2.2. Porcentajes (media ± SEM) de motilidad progresiva a lo largo del periodo experimental en semen fresco (37ºC, 20ºC) Machos Tª Horas 1 2 3 4 5 Pool 37ºC 2 72.5 ± 8.6ab,1 55.0 ± 5.2b,1 80.5 ± 3.5a,1 72.5 ± 3.7a,1 80.0 ± 4.5a,1 74.7 ± 4.1a,1 4 65.0 ± 7,0a,12 45.0 ± 9.9b,1 75.5 ± 3.4a,1 70.0 ± 7.2a,1 75.1 ± 3.1a,1 70.0 ± 6.1a,1 8 62.5 ± 9.7a,1,2 15.3 ± 8.3b,2 62.5 ± 2.5a,2 57.5 ± 3.6a,2 62.5 ± 3.5a,2 62.4 ± 2.5a,12 12 55.0 ± 5.1a,2 16.3 ± 9.2b,2 60.0 ± 1.0a,2 60.0 ± 0.5a,2 62.3 ± 3.4a,2 66.7 ± 4.1a,2 24 24.5 ± 3.2a,3 8.3 ± 4.5b,3 2.7 ± 3.4b,3 5.5 ± 2.3b,3 10.0 ± 2.3b,3 13.3 ± 6.7b,3 20ºC 2 68.3 ± 9.4a 48.3 ± 5.4b 71.7 ± 5.4a 67.0 ± 3.5a 68.1 ± 3.1a 74.7 ± 2.0a 4 70.1 ± 3.5a 43.3 ± 10.8b 68.3 ± 7.4a 70.6 ± 5.4a 73.1 ± 5.1a 75.0 ± 3.4a 8 69.3 ± 4.1a 48.3 ± 4.1b 66.7 ± 7.4a 71.3 ± 5.4a 67.0 ± 7.0a 70.2 ± 3.5a 12 70.2 ± 3.5a 47.4 ± 11.3b 70.7 ± 7.4a 66.5 ± 4.3a 70.8 ± 4.1a 70.7 ± 4.1a 24 63.3 ± 5.4a 43.3 ± 10.4b 69.0 ± 6.1a 70.9 ± 7.4a 70.0 ± 3,5a 65.0 ± 9.3a abc Diferentes letras (superíndice) en la misma fila y categoría (37ºC, 20ºC) denota diferencias significativas (p<0.05) 123Diferentes números (superíndice) dentro de la misma columna y categoría (37ºC, 20ºC) denota diferencias significativas (p<0.05) Tabla 4.2.3. Porcentajes (media ± SEM) de motilidad progresiva a lo largo del periodo experimental para semen refrigerado (4ºC) y semen congelado-descongelado Machos Tª Horas 1 2 3 4 5 Pool 4ºC 2 68.3 ± 5.9a 43.3 ± 8.4b 71.4 ± 2.0a 68.3 ± 7.4a 71.0 ± 7.1a 69.0 ± 1.7a 4 66.6 ± 2.0a 41.7 ± 7.4b 68.3 ± 8.9a 65.0 ± 7.1a 72.3 ± 2.0a 66.1 ± 2.0a 8 65.0 ± 3.5a 35.0 ± 6.1b 64.3 ± 2.4a 61.7 ± 5.3a 68.3 ± 4.5a 65.6 ± 4.1a 12 60.3 ± 1.1a 38.3 ± 8.3b 63.9 ± 3.5a 65.0 ± 5.3a 67.1 ± 2.1a 60.7 ± 7.1a 24 60.0 ± 2.9a 38.3 ± 5.4b 63.7 ± 4.1a 60.3 ± 4.8a 66.7 ± 2.2a 59.9 ± 6.7a -196ºC 1 44.0 ± 1.9a,1 32.6 ± 4.8b,1 40.0 ± 4.1a,1 42.3 ± 2.2a,1 45.1 ± 3.1a,1 45.3 ± 5.9a,1 2 41.7 ± 2.3a,1 27.1 ± 5.1b,1 35.9 ± 3.2a,1 38.0 ± 4.3a,1 42.3 ± 1.4a,1 43.2 ± 6.0a,1 4 40.0 ± 3.5a,1 6.3 ± 4.1b,2 30.5 ± 6.4c,1 27.8 ± 3.9c,2 33.8 ± 3.1c,2 32.3 ± 4.5c,2 8 19.7 ± 9.3a,2 4.0 ± 1,0b,2 2.0 ± 2.2b,2 5.6 ± 2.0b,3 5.3 ± 2.6b,3 12.7 ± 2.5c,3 12 9.6 ± 1.5a,3 0.0 ± 0.0b,3 0.0 ± 0.0b,2 0.0 ± 0.0b,3 0.0 ± 0.0b,3 10.5 ± 2.2a,3 abc Diferentes letras (superíndice) en la misma fila y categoría (4ºC,-196ºC) denota diferencias significativas (p<0.05) 123Diferentes números (superíndice) dentro de la misma columna y categoría (4ºC, -196ºC) denota diferencias significativas (p<0.05) Experiencia II 123 Los porcentajes de acrosomías (Tabla 4.2.4.) fueron prácticamente similares en las muestras conservadas a 20 y a 4ºC (valores medios comprendidos entre 6.1 y 11.7%). Además, no se detectaron diferencias significativas en la proporción de acrosomías entre las dosis individuales y las muestras de pool durante todo el período de conservación. Sin embargo, todas las muestras de semen individual (menos en el caso del macho 4) conservadas a 37ºC mostraron un aumento progresivo en el porcentaje de acrosomas alterados, a lo largo del periodo experimental. Finalmente, en las muestras congeladas-descongeladas no se encontraron diferencias significativas para las primeras 8 horas tras la descongelación; sin embargo, 12 horas tras la descongelación, la proporción de alteraciones del acrosoma se había incrementado notablemente, y únicamente las muestras PS mostraron valores medios de integridad del acrosoma por encima del 70%. Tabla 4.2.4. Porcentajes (media ± SEM) de acrosomías a lo largo del periodo experimental para semen fresco (37, 20ºC), refrigerado (4ºC) y congelado-descongelado Machos Tª Horas 1 2 3 4 5 Pool 37ºC 1 9.0 ± 5.51 9.5 ± 2.11 11.0 ± 2.81 9.9 ± 1.4 8.2 ± 2.21 12.1 ± 2.0 8 17.5 ± 3.6a,12 16.0 ± 2.7a,2 10.5 ± 2.9ab,1 8.4 ± 2.1b 7.8 ± 2.5b,1 14.2 ± 1.4ab 24 24.5 ± 2.1a,2 22.7 ± 4.9a,2 23.3 ± 3.9a,2 10.0 ± 2.8b 23.0 ± 0.5a,2 19.3 ± 4.9a 20ºC 1 7.3 ± 3.3 8.0 ± 1.9 7.1 ± 1.9 8.7 ± 3.3 6.3 ± 0.41 7.3 ± 2.8 8 9.7 ± 2.2 8.7 ± 0.4 10.0 ± 3.7 9.0 ± 2.9 7.4 ± 1.812 9.3 ± 1.6 24 9.0 ± 1.4 8.3 ± 3.6 11.7 ± 3.0 9.2 ± 2.5 10.1 ± 2.32 11.4 ± 3.2 4ºC 1 8.2 ± 1.8 10.3 ± 4.1 6.4 ± 3.2 8.2 ± 1.6 6.1 ± 1.4 7.7 ± 2.9 8 10.3 ± 4.8 11.5 ± 4.6 10.3 ± 3.2 10.5 ± 8.7 8.0 ± 1.3 10.0 ± 3.5 24 8.9 ± 2.7 10.5 ± 1.2 9.7 ± 0.8 9.2 ± 1.5 7.4 ± 1.2 9.7 ± 2.8 1 14.2 ± 3.01 14.7 ± 2.41 13.7 ± 1.51 12.6 ± 1.61 11.9 ± 1.51 12.7 ± 1.11 -196ºC 8 15.3 ± 4.81 13.9 ± 4.71 15.3 ± 2.01 17.5 ± 4.91 15.7 ± 2.21 14.3 ± 3.91 12 39.2 ± 2.9a,2 52.3 ± 2.3b,2 37.5 ± 3.4a,2 44.3 ± 2.3a,2 41.2 ± 2.2a,2 27.1 ± 2.4c,2 abc Diferentes letras en la misma fila y categoría (37, 20, 4,-196ºC) denota diferencias significativas (p<0.05) 123Diferentes números (superíndice) dentro de la misma columna y categoría (37, 20, 4, -196ºC) denota diferencias significativas (p<0.05) Experiencia II 124 El porcentaje de morfoanomalías espermáticas (Tabla 4.2.5.) fue inferior al 10% en todos los machos (rango: 2-10%), sin observarse diferencias significativas a lo largo de todo el período experimental, ni entre temperaturas de conservación. Asimismo, los porcentajes de morfoanomalías de las muestras SI y PS fueron prácticamente similares. Tabla 4.2.5. Porcentajes (media ± SEM) de morfoanomalías a lo largo del período experimental para semen fresco (37, 20ºC), refrigerado (4ºC) y congelado-descongelado. Machos Tª Horas 1 2 3 4 5 Pool 37ºC 1 2.5 ± 2.1 3.0 ± 2.2 2.9 ± 2.2 2.9 ± 1.5 2.0 ± 1.4 3.1 ± 1.2 8 3.0 ± 1.4 3.5 ± 1.4 3.6 ± 0.3 2.6 ± 0.7 2.4 ± 1.1 3.5 ± 1.1 24 2.9 ± 1.7 4.0 ± 2.1 2.9 ± 0.7 3.7 ± 2.8 3.8 ± 1.7 3.0 ± 1.0 20ºC 1 1.8 ± 0.4 1.8 ± 1.2 3.7 ± 0.9 2.8 ± 0.7 3.0 ± 0.9 2.2 ± 0.9 8 2.3 ± 1.2 2.5 ± 0.4 4.0 ± 2.0 2.6 ± 2.2 3.3 ± 0.7 3.0 ± 1.2 24 1.9 ± 2.1 2.1 ± 2.0 3.9 ± 0.8 2.7 ± 1.8 3.2 ± 2.1 3.3 ± 1.6 4ºC 1 2.8 ± 0.8 2.4 ± 0.5 3.9 ± 2.3 3.3 ± 0.8 3.3 ± 0.8 2.9 ± 1.1 8 2.3 ± 1.5 3.0 ± 1.2 3.8 ± 2.0 4.2 ± 1.5 4.1 ± 1.2 3.3 ± 1.4 24 2.8 ± 0.4 2.4 ± 0.9 3.0 ± 0.8 3.9 ± 0.8 3.7 ± 0.4 2.4 ± 1.7 1 3.2 ± 0.4 2.7 ± 0.8 3.0 ± 2.8 3.4 ± 0.9 3.2 ± 1.2 2.5 ± 0.4 -196ºC 8 2.0 ± 0.7 2.6 ± 1.2 3.9 ± 0.7 2.8 ± 1.1 3.1 ± 0.9 2.8 ± 1.0 12 3.1 ± 1.0 2.9 ± 0.4 4.0 ± 1.3 3.7 ± 1.2 3.5 ± 1.4 2.5 ± 1.0 Finalmente, la Tabla 4.2.6 muestra la tasa de fertilidad tras la inseminación artificial con semen fresco y semen congelado-descongelado. La tasa de gestación y la fertilidad a término fueron muy similares en los grupos SIF y SPF (73.3% vs 76.7% y 70.0% vs 73.3% para SIF y SPF, respectivamente), sin mostrar diferencias en prolificidad y con un porcentaje similar de Experiencia II 125 partos múltiples (85.7%, 18/21 vs 90.0%, 20/22; SIF vs SPF respectivamente) Por otro lado, no se observaron diferencias significativas en las tasas de fertilidad de cabras inseminadas con semen congelado-descongelado (SIC y SPC), presentando valores medios aproximadamente del 50%; además, la prolificidad fue muy parecida entre grupos experimentales, mostrando un valor muy cercano al obtenido con semen fresco. Tabla 4.2.6. Tasa de gestación, fertilidad a término y prolificidad tras inseminación artificial con semen fresco y congelado-descongelado procesado de forma individual o en pool Semen fresco Seme congelado-descongelado SIF1 SPF2 SIC3 SPC4 Fertilidad día 35 (%) 73.3a (22/30) 76.7a (23/30) 46.7b (14/30) 53.3b (16/30) Fertilidad a término (%) 70.0a (21/30) 73.3a (22/30) 46.7b (14/30) 50.0b (15/30) Prolificidad 1.90 (40/21) 1.95 (43/22) 1.85 (26/14) 1.87 (28/15) 1 Cabras inseminadas con semen fresco individual (SIF) 2 Cabras inseminadas con semen fresco en pool (SPF) 3 Cabras inseminadas con semen congelado-descongelado procesado individualmente (SIC) 4 Cabras inseminadas con pool de semen congelado-descongelado (SPC) ab Diferentes letras (superíndice) en la misma fila denotan diferencias significativas (p<0.05) Experiencia II 126 4.2.4. DISCUSIÓN Este estudio ha contrastado la viabilidad del semen caprino tras diferentes protocolos de procesado, mostrando que la conservación a 20 y 4ºC no altera la calidad seminal durante las primeras 24 horas; sin embargo, la conservación del semen a 37ºC causa un dramático descenso en la viabilidad seminal desde las 12 horas en adelante. Además, este estudio pretendía definir si al realizar un pool de semen de varios donantes, la calidad seminal y la consecuente fertilidad se veían modificadas; los resultados in vivo e in vitro revelaron que al mezclar semen, los parámetros seminales o las tasas de fertilidad no se ven modificados significantemente, comparado con los resultados obtenidos tras procesar el semen de manera individual. Al analizar los resultados de motilidad espermática progresiva, no se encontraron diferencias significativas entre las muestras conservadas a 20 y a 4ºC, manteniendo los valores medios superiores al 60%, en cuatro de los cinco machos, durante las primeras 24 horas. Nuestros resultados fueron superiores a los obtenidos por otros autores donde se utilizaron diluyentes a base de leche y sin la adición de yema de huevo (Paulenz y cols., 2005; Salvador y cols., 2005; Mara y cols., 2007); estos estudios registraron un ligero declive en la motilidad a medida que avanza el tiempo (24 horas), concluyendo que la aplicabilidad de este diluyente en condiciones de campo puede ser limitada (Paulenz y cols., 2005). Respecto a las muestras de semen preservadas a 37ºC, presentaban una considerable reducción de la motilidad tras 12 horas de incubación, mostrando valores medios inferiores al 25% en todas las muestras. La baja longevidad observada en las muestras conservadas a 37ºC parece ser consecuencia de un rápido agotamiento metabólico de los espermatozoides, disminuyendo de esta forma la motilidad espermática, a medida que se incrementa el tiempo de conservación (Leboeuf y cols., 2000). Finalmente, tras la congelación-descongelación, los valores medios obtenidos coinciden con los rangos observados por otro autores, donde la motilidad fue definida justo tras la descongelación y atemperamiento de las muestras (Cabrera y cols., 2005; Hidalgo y cols., 2007; Batista y cols., 2009); sin embargo, distintos autores han sugerido que la valoración de la motilidad progresiva tras la incubación del mismo (37ºC) es un método más fiable para valorar la calidad seminal in vitro que la valoración justo tras la descongelación (Roth y cols., 1999; Dorado y cols., 2007). De esta manera, en el semen congelado-descongelado no se detectaron apenas modificaciones durante las dos primeras horas de incubación (37ºC), pero a las 8 horas de incubación, la Experiencia II 127 motilidad progresiva disminuyó drásticamente en todas las muestras. Estos resultados parecen indicar que el semen parece permanecer viable solo durante 4-6 horas tras la descongelación, siendo éste el periodo límite para obtener tasas razonables de fertilidad. El porcentaje de espermatozoides con acrosomas intactos permaneció prácticamente inalterado durante el período de incubación en las muestras conservadas a 20 y 4ºC. Nuestros resultados son consistentes con aquellos obtenidos en diversos estudios en los que se conservó el semen a 4-5ºC (Roca y cols., 1997) o a 20ºC (Paulenz y cols., 2005) con diluyentes a base de yema de huevo; sin embargo, en aquellos estudios donde el medio de dilución era a base de leche, se confirmó que la proporción de acrosomas alterados aumentaban tras las primera 24 horas de preservación (Salvador y cols., 2006). Con respecto al semen congelado y descongelado, observamos un aumento notable de las acrosomías tras las primeras 8 horas de incubación, con valores medios muy parecidos entre machos y en cada período. Estos resultados son comparables con aquellos obtenidos en diferentes razas caprinas, para muestras de semen congeladas-descongeladas y conservadas con diluyentes a base de leche (Dorado y cols., 2007; Hidalgo y cols., 2007) o a base de TRIS (Leboeuf y cols., 2000; Chang-Yong y cols., 2006; Batista y cols., 2009). Por otro lado, el porcentaje de morfoanomalías no experimentó variaciones a lo largo del período de incubación, y no se observaron diferencias entre los cuatro protocolos de conservación testados; estos resultados coinciden con diferentes estudios que muestran proporciones de morfoanomalías poco variables tras su conservación a 4-5ºC (Roca y cols., 1997; Paulenz y cols., 2005) o tras la congelación (Singh y cols., 1995; Dorado y cols., 2007; Batista y cols., 2009). Por lo tanto, se puede asumir que el protocolo de preservación y el tiempo (horas) de incubación favorecen, en mayor medida, el desarrollo de alteraciones en la integridad estructural del acrosoma, más que el desarrollo de otras morfoanomalías espermáticas. Con respecto a las experiencias in vivo, la tasa de fertilidad tras la inseminación artificial con semen fresco estuvo entorno al 70%, sin encontrar diferencias significativas entre los grupos SIF y SPF. Nuestros resultados son comparables con aquellos obtenidos por diferentes autores tras realizar inseminación artificial con semen conservado a 20ºC (Paulenz y cols., 2005) y 5ºC (Roca y cols., 1997) y ligeramente inferiores a los obtenidos tras inseminación artificial con semen fresco y diluido (Leboeuf y cols., 2000, 2003a). Con semen congelado-descongelado, los Experiencia II 128 índices de fertilidad observados en nuestros estudio (46.7 % y 50.0%, SIC y SPC, respectivamente) quedan entre los descritos para diferentes razas caprinas (Ritar y cols., 1990; Karatzas y cols., 1997; Salvador y cols., 2005; Dorado y cols., 2007; Batista y cols., 2009), si bien bastante alejados del 70% de tasa de nacimientos descrito por Leboeuf y cols. (2000, 2003b) tras realizar inseminación transcervical, con semen congelado-descongelado. Otro propósito de nuestro estudio fue comparar la calidad seminal de muestras individuales y de muestras tras realizar un pool. Los resultados in vitro no mostraron variaciones en ninguno de los parámetros estudiados (motilidad espermática, morfoanomalías y acrosomías) independientemente del protocolo de conservación. Además, la tasa de gestación tras realizar inseminación artificial con semen fresco o congelado-descongelado no fue diferente entre muestras individuales y las muestras procedentes del pool de eyaculados. Diferentes estudios han demostrado que no existen diferencias significativas en los índices de fertilidad tras inseminación artificial con semen líquido conservado (Paulenz y cols., 2005) o semen congeladodescongelado, de diferentes machos cabríos (Salvador y cols., 2005). Por su parte, Gacitua y Arav (2005) obtuvieron una tasa de fertilidad similar tras realizar inseminación artificial con semen congelado-descongelado procedente de machos individuales o tras realizar un pool de sus eyaculados. Esta similar tasa de fertilidad que se obtiene, con independencia de su procedencia (muestras individuales o pool), puede explicarse por la selección que realizamos de las muestras seminales antes de llevar a cabo la inseminación, de tal forma que todas las hembras fueron inseminadas con al menos 120 x 106 espermatozoides móviles. A este respecto, Salvador y cols. (2005) propusieron que la influencia de los machos sobre el índice de prolificidad podría verse atenuada por el hecho de que el semen congelado-descongelado es evaluado antes de ser usado para inseminación y que solo las pajuelas con una calidad mínima fueron usadas para este fin. En la especie porcina, al mezclar semen de diferentes verracos, se ha demostrado un incremento de diferentes parámetros reproductivos comparado con los obtenidos con el uso de dosis homoespermicas (Godet y cols., 1996; Haugan y cols., 2005). Además, se ha definido que verracos con calidades similares en su semen fresco, muestran diferencias tras su congelación y descongelación; en consecuencia, los verracos podrían ser considerados como “buenos congeladores” o “malos congeladores” (Holt y cols., 2005; Hernández y cols., 2007). En nuestro Experiencia II 129 estudio, tras congelar y descongelar las muestras, no se observaron diferencias entre muestras individuales y las heterospérmicas. La explicación de este hecho puede residir en que cuatro de los cinco machos utilizados podrían catalogarse como “buenos congeladores”, y tras realizar el pool, el semen heterospérmico no aumentase la calidad seminal de manera significativa. Por otro lado, en la especie porcina, cuando se lleva a cabo la inseminación artificial con semen procesado de manera individual y de alta calidad, no se observan diferencias significativas en las tasas de fertilidad comparado cuando se utiliza semen heterospérmico (Haugan y cols., 2007). Nuestros resultados no revelan diferencias en las tasas de fertilidad tras realizar inseminaciones con semen fresco procesado de manera individual o tras realizar un pool; de cualquier manera, haría falta seguir investigando este campo para poder confirmar los hallazgos obtenidos. Los resultados de este estudio demuestran que el semen conservado en un medio a base de yema de huevo puede ser conservado a 20 y 4ºC, sin mostrar diferencias relevantes en la calidad seminal durante las primeras 24 horas. Además, en nuestro laboratorio hemos realizado otra serie de experiencias (resultados no recogidos en el presente estudio) que han confirmado que las muestras de semen conservadas a 20 y 4ºC mantienen valores prácticamente similares de motilidad progresiva (>50%), hasta las 96 horas de incubación. Por otro lado, en la presente experiencia no hemos constatado una mejoría de la calidad seminal tras procesar muestras heterospermicas cuando lo comparamos con muestras de machos individuales, mostrando resultados similares en cada uno de los protocolos de conservación (37, 20, 4 y -196ºC), en el periodo de preservación testado (24 horas). De cualquier manera, sería interesante confirmar si en períodos de incubación más prolongados, las muestras seminales (individuales o en forma de pool) podrían experimentar diferencias en su viabilidad, dependiendo del protocolo de conservación usado. Además, se hace necesario desarrollar estudios específicos con objeto de evaluar la calidad del semen conservado a 4 y 20ºC, para luego ser sometido a incubación a 37ºC durante diferentes periodos de tiempo. Del mismo modo, otra posible línea de investigación podría orientarse a evaluar la longevidad del semen congeladodescongelado, de tal forma que una vez el semen fuese descongelado, en lugar de ser preservado a 37ºC (como se realiza de manera tradicional), fuese conservado 20 y 4ºC, con objeto de evaluar si de esta manera se podría incrementar el período de viabilidad espermática (longevidad) tras la descongelación. Experiencia III 136 e MACHOS CABRIOS Recogida y contrastación seminal POOL - Volumen - Concentración - Motilidad - Morfoanoamalías - Acrosomías PROCESADO SEMINAL 400 X 106 espermat/ml 12% yema huevo 4% glicerol CONGELACION EN NITROGENO LÍQUIDO ALMACENAMIENTO NITRÓGENO LÍQUIDO NITRÓGENO SECO DESCONGELACIÓN. VALORACIÓN DIA 1 DIA 2 DIA 3 DIA 5 DIA 7 - Motilidad - Morfoanoamalías - Acrosomías Figura V. Plan experimental de la experiencia 3 Experiencia III 137 4.3.3. RESULTADOS La Tabla 4.3.1. muestra las características seminales del semen fresco. La concentración espermática total fue prácticamente similar entre machos, mientras la motilidad espermática total y progresiva fue superior al 90 y 85%, respectivamente y no se observaron diferencias significativas entre los distintos machos. Finalmente, el porcentaje de espermatozoides con morfoanomalías fue inferior al 5% en todos los machos y el porcentaje de acrosomías se situó entre el 8 y el 13%, con un valor medio de acrosomas intactos cercano al 90%. Tabla 4.3.1. Media ± SEM de concentración espermática, porcentaje de espermatozoides móviles, motilidad progresiva, morfoanomalías y porcentaje de espermatozoides con el acrosoma intacto en semen fresco de los machos donantes (n=6) Concentración espermática1 Espermatozoides móviles (%) Motilidad progresiva (%) Morfoanomalías (%) Acrosomas intactos (%) 42.5 ± 2.5 90.4 ± 2.5 86.0 ± 3.0 3.0 ± 0.7 88.9 ± 5.4 1: Concentración espermática expresada en x 108 espermatozoides/ml Las características de motilidad espermática en cada grupo experimental se muestran en la Tabla 4.3.2. Las dosis seminales conservadas en nitrógeno líquido (NL) no mostraron diferencias significativas en los porcentajes de espermatozoides móviles (rango valores medios: 60-70%) y motilidad progresiva (rango: 50-57%) durante el período experimental. Sin embargo, las dosis seminales conservadas en DS mostraron unos valores significantemente inferiores de movilidad espermática (p<0.01) tras 5 y 7 días de conservación, llegando a alcanzar, tras 7 días de almacenamiento, valores medios inferiores al 20% y 13%, para motilidad total y motilidad progresiva respectivamente. Además, cuando ambos protocolos fueron comparados, no se encontraron diferencias significativas durante los 3 primeros días de conservación, pero sí se detectaron valores significantemente mayores (p<0.01) de motilidad espermática para las muestras conservadas en NL comparado con los conservados en DS, tras 5 y 7 días de almacenamiento. Experiencia III 138 Tabla 4.3.2. Porcentajes (media ± SEM) de espermatozoides móviles totales y motilidad progresiva (espermatozoides con movimiento rápido) en semen congelado-descongelado conservado en nitrógeno líquido y contenedor de transporte seco Días de conservación Espermatozoides móviles totales Motilidad progresiva NL DS NL DS 1 70.1 ± 4.5 66.7 ± 2.9a 57.4 ± 2.9 55.4 ± 3.2a 2 62.4 ± 1.8 62.2 ± 3.6a 51.6 ± 3.0 49.9 ± 3.7a 3 64.7 ± 3.0 58.9 ± 3.8a 55.4 ± 2.9 50.0 ± 2.3a 5 60.1 ± 1.51 44.2 ± 1.7b,2 52.0 ± 2.11 32.1 ± 1.9b,2 7 62.3 ± 4.81 19.1 ± 4.3c,2 50.2 ± 3.11 12.3 ± 4.6c,2 NL: congelación en nitrógeno líquido; DS: congelación en nitrógeno líquido y conservación en contenedor de transporte. abc Diferentes letras en la misma columna denotan diferencias significativas (p<0.01); 12:Diferentes números en la misma fila denota diferencias significativas (p<0.01). El porcentaje de morfoanomalías y de acrosomas intactos de las muestras seminales se muestran en la Tabla 4.3.3. El porcentaje de células anormales fue bajo en todas las muestras (rango: 0.0-10.0%) a lo largo del periodo experimental, tanto en las muestras conservadas en NL como en DS, y no se encontraron diferencias significativas cuando ambos protocolos fueron evaluados. El tipo de morfoanomalías más frecuente en ambos protocolos y en los diferentes periodos evaluados fue el que afectaba a la cola espermática. Con respecto a la proporción de acrosomas dañados, se comprobó que la integridad acrosómica presentaba valores medios que se mantenían prácticamente inalterados en las muestras almacenadas en LN; un comportamiento similar se detectó durante los primeros tres días de almacenamiento en DS, sin embargo, tras 5 días de conservación en DS, el porcentaje de espermatozoides con acrosomas intactos experimentaron un notable descenso (p<0.01) comparado con el semen conservado durante los 3 primeros días. Finalmente, cuando se compararon ambos protocolos (NL vs DS), se encontraron diferencias significativas (p<0.01) tras 5 y 7 días de conservación, mostrando valores notablemente inferiores tras 7 días de conservación en DS. Experiencia III 139 Tabla 4.3.3. Porcentajes (media ± SEM) de espermatozoides con morfoanomalías y de espermatozoides con acrosomas intactos en semen congelado y descongelado, conservado en nitrógeno líquido y contenedor de transporte seco. Días de conservación Morfoanomalías Espermatozoides con acrosomas intactos NL DS NL DS 1 4.0 ± 0.9 5.2 ± 1.2 69.2 ± 2.7 68.0 ± 1.5a 2 3.4 ± 0.6 4.4 ± 1.4 66.6 ± 1.1 71.4 ± 1.8a 3 4.0 ± 0.7 5.2 ± 1.5 69.0 ± 2.4 72.2 ± 2.0a 5 4.9 ± 0.8 4.2 ± 1.0 72.7 ± 1.91 55.8 ± 3.2b,2 7 3.8 ± 1.2 3.7 ± 0.3 68.3 ± 2.81 36.8 ± 0.9c,2 NL: congelación en nitrógeno líquido; DS: congelación en nitrógeno líquido y conservación en contenedor de transporte. abc Diferentes letras en la misma columna denotan diferencias significativas (p<0.01); 12:Diferentes números en la misma fila denota diferencias significativas (p<0.01). Experiencia III 140 4.3.4. DISCUSIÓN En esta experiencia, la motilidad espermática y la integridad de la membrana acrosómica postdescongelación del semen congelado y conservado en nitrógeno líquido presentaron valores consistentes durante todo el periodo experimental, mostrando resultados similares a los observados en otras razas caprinas (Sirat y cols., 1996; Dorado y cols., 2007). Sin embargo, las muestras seminales conservadas en el contenedor de transporte (vapores de nitrógeno líquido) solo mantuvieron valores equivalentes de motilidad e integridad acrosómica durante los primeros tres días de conservación, para posteriormente manifestar un notable descenso en sus valores. El porcentaje de espermatozoides con morfoanomalías tras la descongelación no mostró diferencias significativas entre ambos protocolos durante el período evaluado, presentando valores medios comparables con los registrados en estudios previos desarrollados en la misma raza (Batista y cols., 2011). En macho cabrío, la motilidad espermática del semen fresco solo permanece en niveles elevados durante unas pocas horas, a no ser que sea diluido para reducir la actividad metabólica y se descienda su temperatura (Leboeuf y cols., 2000). Distintos estudios confirman que la refrigeración del semen genera una disminución de la calidad seminal, que se traduce en un descenso de la motilidad y la integridad estructural, acompañado de un declive en la supervivencia dentro del tracto reproductor femenino (Leboeuf y cols., 2000; Salvador y cols., 2006). De esta forma, se ha contrastado que la motilidad espermática y la integridad del acrosoma en las muestras seminales caprinas (Tuli y Holtz, 1995) mantienen valores aceptables hasta los 3 días tras la conservación a 4-5ºC; sin embargo, a partir de este momento, muestran una gran variabilidad, para terminar perdiendo por completo la capacidad fertilizante tras 6 días de conservación (Leboeuf y cols., 2000; Salvador y cols., 2006). En nuestro estudio, la viabilidad espermática se mantuvo en niveles similares durante los 3 primeros días de almacenamiento en DS, empezando a descender los valores a partir del quinto día; por su parte, la calidad de las muestras conservadas en nitrógeno líquido no manifestó ningún tipo de alteración a lo largo del periodo de estudio. Este diferente comportamiento registrado entre ambos protocolos, podría obedecer a que el semen de macho cabrío sea más sensible a una manipulación continuada cuando se conserva en DS que cuando es conservado en nitrógeno líquido. De esta forma, una excesiva manipulación de las pajuelas en el protocolo DS podría haber modificado la calidad Experiencia III 141 seminal aunque la temperatura en el interior de la cámara de almacenamiento del DS no registrase cambios sustanciales. Hasta el momento, ningún estudio había evaluado la viabilidad espermática de las muestras conservadas en vapores de nitrógeno líquido en animales domésticos. El único estudio asimilable al nuestro (Carolsfeld y cols., 2003) se desarrolló utilizando semen de peces, evaluando la motilidad espermática de muestras conservadas en vapores de nitrógeno líquido; este estudio mostraba que la motilidad espermática registrada en dosis congeladasdescongeladas se situaba en un rango entre el 5 y el 85%, tras 7 días de conservación en el contenedor de transporte seco. Por otro lado, diferentes estudios desarrollados en las especies caprina y canina (Álamo y cols., 2005; Batista y cols., 2009) han propuesto un protocolo de criopreservación alternativo, mediante la utilización de ultracongeladores donde las muestras eran conservadas entre -140 y -150ºC, temperaturas similares a las registradas en el contenedor de transporte. Nuestros resultados podrían ser comparables con los obtenidos con el uso de ultracongeladores de -152ºC, donde la motilidad espermática y los porcentajes de morfoanomalías y acrosomías no mostraron cambios a lo largo del período de conservación. Por lo tanto, podría asumirse que la conservación del semen en un ambiente de vapores de nitrógeno líquido no modifica la viabilidad espermática durante, al menos, los 3 primeros días de almacenamiento. Se encuentra generalmente asumido que la calidad seminal muestra una mayor viabilidad y longevidad cuando el semen es refrigerado comparado con semen congeladodescongelado (Leboeuf y cols., 2000). De cualquier manera, la viabilidad del semen refrigerado decrece a lo largo del tiempo, de tal manera que aproximadamente tras los 5 primeros días de almacenamiento a 5ºC, las características del semen refrigerado podrían considerarse equivalentes a las obtenidas con semen congelado-descongelado. Por otro lado, es necesario tener en cuenta que el transporte de semen refrigerado puede verse afectado por diferentes factores tales como la necesidad de una infraestructura específica, el mantenimiento apropiado de la temperatura de refrigeración y evitar la contaminación de la muestra (Roth y cols., 1999). En este sentido, diferentes estudios han confirmado que los vapores de nitrógeno líquido previenen la transmisión bacteriana y vírica entre muestras seminales localizadas en el interior del contenedor de transporte (Bielanski, 2005a,b) y la temperatura en el interior del contenedor Experiencia III 142 de transporte se mantiene prácticamente inalterada durante un mínimo de 7 a 8 días. De esta forma, el transporte de semen mediante contenedores de transporte podría convertirse en una alternativa viable frente al uso del semen refrigerado, sobre todo cuando el transporte de las muestras podría prolongarse por encima de los 2-3 días. En conclusión, bajo las circunstancias descritas en este estudio, la eficacia del contenedor de transporte (vapores de nitrógeno líquido) para conservar las pajuelas de semen caprino durante un corto período de tiempo (3 días con niveles aceptables) ha quedado completamente confirmada. No obstante, sería muy interesante realizar una nueva experiencia donde se reduzca la manipulación de las pajuelas almacenadas en el contenedor de transporte, para comprobar si la viabilidad de las muestras se prolonga por encima de los valores registrados en el presente estudio. Del mismo modo, se hace necesario desarrollar ensayos de fertilidad de las muestras conservadas durante varios días en el contenedor de transporte seco, y compararlos con la tasa de fertilidad que se obtendría tras inseminar con semen refrigerado durante diferentes días, así como con semen congelado-descongelado y almacenado en nitrógeno líquido. 5. CONCLUSIONES Conclusiones 144 5. CONCLUSIONES Experimento 1: Utilización de los ultracongeladores de -152ºC para la preservación del semen en la especie caprina (raza Majorera) 1. No se detectan diferencias entre ambas técnicas de congelación (nitrógeno líquido vs ultracongelador de –152ºC), presentando resultados similares en la calidad espermática in vitro durante todo el período experimental. 2. El almacenamiento a largo plazo (1 año) de semen caprino no altera su calidad postdescongelación, con independencia del protocolo de criopreservación utilizado. 3. El efecto de la variabilidad individual (en machos de raza Majorera) sobre la calidad seminal post-descongelación, resulta más evidente en la motilidad espermática que sobre los porcentajes de espermatozoides anormales y de acrosomías. 4. Las muestras de semen caprino (raza Majorera) conservadas en ultracongeladores de -152ºC permanecen fértiles hasta 6 meses tras la criopreservación. 5. El estado reproductivo de la cabra (multípara vs nulípara) influye marcadamente sobre la fertilidad, con independencia del método de crioconservación empleado (nitrógeno líquido o ultracongelador de –152ºC). 6. En base a los resultados in vitro de calidad seminal post-descongelación y los ensayos de fertilidad, los ultracongeladores de –152ºC representan un procedimiento alternativo a la congelación en nitrógeno líquido, para la preservación de muestras seminales caprinas. Experimento 2: Influencia de la temperatura de conservación y del pool seminal sobre la calidad espermática en los machos cabríos de raza Majorera 7. El semen caprino conservado a 37ºC sufre un marcado detrimento a partir de las 12 horas, limitando su grado de aplicación a partir de ese momento. Conclusiones 145 8. La conservación de semen caprino a 20 y 4ºC, en un diluyente a base de Tris-glucosa-yema no altera la calidad seminal durante las primeras 24 horas. 9. Tras la descongelación, el semen parece permanecer viable solo durante 4-6 horas, siendo éste el periodo límite para obtener tasas razonables de fertilidad. 10. El porcentaje de morfoanomalías es el parámetro espermático post-descongelación que menos modificaciones experimenta, con independencia del protocolo de preservación evaluado (37, 20, 4 y -196ºC). 11. Cuando el semen se procesa en forma de pool en lugar de individualmente, no se registran modificaciones en la calidad seminal post-descongelación, mostrando resultados similares en el periodo de preservación testado (24 horas), para cada uno de los protocolos de conservación evaluados (37, 20, 4 y -196ºC). 12. Con independencia del procesado seminal (de forma individual o en forma de pool), la tasa de fertilidad registrada tras inseminar con semen fresco o congelado-descongelado no manifiesta variaciones en la raza caprina Majorera. Expriencia III: Viabilidad espermática en muestras de semen caprino conservadas en un contenedor de transporte (vapores de nitrógeno líquido) 13. La temperatura en el interior del contenedor de transporte (vapores de nitrógeno líquido) se mantiene prácticamente inalterable durante un mínimo de 7 días. 14. El semen caprino conservado en contenedores de transporte mantiene niveles aceptables de motilidad espermática, integridad acrosómica y espermatozoides normales durante, al menos, 3 días. 15. En las condiciones descritas en el estudio, la aplicabilidad del semen preservado en contenedores de transporte quedaría limitada a un breve periodo de tiempo (inferior a 5 días).