Agentes funcionais de base biológica para obtenção de propriedades de retardança à chama em substratos têxteis

ii DIREITOS DE AUTOR E CONDIÇÕES DE UTILIZAÇÃO DO TRABALHO POR TERCEIROS Este é um trabalho académico que pode ser utilizado por terceiros desde que respeitadas as regras e boas práticas internacionalmente aceites, no que concerne aos direitos de autor e direitos conexos. Assim, o presente trabalho pode ser utilizado nos termos previstos na licença abaixo indicada. Caso o utilizador necessite de permissão para poder fazer um uso do trabalho em condições não previstas no licenciamento indicado, deverá contactar o autor, através do RepositóriUM da Universidade do Minho. Licença concedida aos utilizadores deste trabalho Atribuição-CompartilhaIgual CC BY-SA https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/ iii AGRADECIMENTOS Ao longo deste projeto e destes cincos anos de curso foram várias as pessoas e instituições que me ajudaram a concretizar este sonho que sempre tive, o sonho de um dia ser engenheira. Primeiramente gostaria de agradecer à instituição que há cerca de cinco anos me acolheu a Universidade do Minho. A todos os professores que passaram pela minha vida ao longo destes cinco anos, uma muito obrigada por todos os ensinamentos e toda a formação que me deram. Quero também agradecer à empresa que me permitiu realizar este projeto, ao CeNTI. Agradeço a toda a gente que nesta empresa tão bem me recebeu e acolheu e que tanto me ensinou, mas principalmente aos meus colegas de estágio. Ao Nuno, o meu orientador, por todo o apoio, paciência, compreensão e disponibilidade, por todo o conhecimento e sugestões transmitidas ao longo destes seis meses, por todas as gargalhadas e todo o tempo que dedicou a mim e a este projeto, um muito obrigado, sem ti esta dissertação não seria possível. Ao Professor Eugénio por toda compreensão, ajuda, apoio, orientação e conselhos dados, por toda a disponibilidade e sugestões cedidas ao longo da realização da dissertação, bem como ao longo de todo o mestrado, tanto na qualidade de Professor como de orientador, um muito obrigado. Aos meus amigos, principalmente aqueles que vêm desde o início, tanto os de Fafe como aquelas 8, por tudo ao longo destes 5 anos, porque sem vocês isto não teria sido a mesma coisa e a concretização do sonho não seria tão especial, só quero agradecer pela paciência que tiveram, pela atenção que me deram, pelo apoio e acima de tudo por estarem sempre presentes. Aos que foram aparecendo ao longo dos anos, um muito obrigado com um especial agradecimento a todos que fazem parte da direção da Associação Académica da Universidade do Minho, junto comigo, por acreditarem e me fazerem acreditar que tudo é possível, basta querer e lutar por isso. Por último e mais importante, a toda à minha família, principalmente aos meus pais, que desde o início lutaram comigo para que este sonho se concretizasse, estiveram sempre presentes, ajudaram e apoiaram-me com tudo o que podiam e nas minhas decisões, sou eternamente agradecida, a eles eu dedico esta dissertação, é um orgulho ser vossa filha e pertencer a esta família! E porque estes 5 anos passaram a correr, um muito obrigada! Este trabalho foi desenvolvido no âmbito do projeto “TEXBOOST – LESS COMMODITIES MORE SPECIALITIES”, cofinanciado pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER), no âmbito do Portugal 2020 através do COMPETE2020 – Programa Operacional Competitividade e Internacionalização (POCI). iv DECLARAÇÃO DE INTEGRIDADE Declaro ter atuado com integridade na elaboração do presente trabalho académico e confirmo que não recorri à prática de plágio nem a qualquer forma de utilização indevida ou falsificação de informações ou resultados em nenhuma das etapas conducente à sua elaboração. Mais declaro que conheço e que respeitei o Código de Conduta Ética da Universidade do Minho. v RESUMO Agentes funcionais de base biológica para obtenção de propriedades de retardança à chama em substratos têxteis O objetivo principal deste projeto foi a investigação e obtenção de propriedades de retardança à chama em substratos têxteis a partir do uso de agentes funcionais. Os agentes funcionais utilizados ao longo do projeto foram o soro do leite, o ácido fítico e a lecitina. Relativamente aos substratos têxteis utilizados foi apenas utilizado tecido 100% algodão. Para obtenção de propriedades de retardança à chama foram produzidas nanopartículas de soro do leite com incorporação de ácido fítico ou lecitina. Para proceder à preparação de nanopartículas recorreuse à utilização da técnica de encapsulação ultrassónica. Foram várias as condições testadas ao longo do projeto para a preparação de nanopartículas. Relativamente às nanopartículas de soro do leite com incorporação de ácido fítico testou-se a utilização de proteína de soro do leite concentrada ou isolada, o pH da solução e a desnaturação da proteína. Já para as nanopartículas de soro do leite com incorporação de lecitina testou-se a concentração de lecitina, a concentração de proteína de soro do leite concentrada, a desnaturação da proteína e a concentração do ligante. Após a formação de nanopartículas foi medido o seu diâmetro, o índice de dispersividade e potencial Zeta pelo método Espalhamento de Luz Dinâmico, “Dynamic light scattering” (DLS). Para todas as amostras de nanopartículas que apresentaram bons resultados realizou-se a funcionalização dos tecidos 100% algodão, utilizando a técnica de impregnação-secagem por Foulard . Para todas as amostras funcionalizadas analisou-se a resistência à lavagem da funcionalização pelo método Acid Orange, quantificou-se a quantidade total de fósforo presente no tecido, antes e após sofrer um ciclo de lavagem, através da adaptação da Norma Portuguesa 1842-1:2008 e por último realizou-se o teste da chama, antes e após o tecido funcionalizado sofrer um ciclo de lavagem., através da adaptação da Norma Portuguesa EN ISO 6941:2005. As nanopartículas que apresentaram maior resistência à lavagem foram as nanopartículas de soro do leite com incorporação de lecitina assim como foram as que apresentaram melhores resultados no teste da chama. Concluiu-se que para tecidos que não sofram lavagem qualquer um dos agentes funcionais utilizados confere alguma propriedade de retardança à chama, mas apenas para os tecidos com o agente funcional lecitina se obteve propriedades de retardança à chama após sofrerem um ciclo de lavagem. PALAVRAS-CHAVE: Ácido Fítico, Lecitina, nanopartículas, proteína de soro do Leite, retardança. vi ABSTRACT Biologically based functional agents for flame retardant properties on textile substrates The main objective of this project was to investigate and obtain flame retardation properties in textile substrates using functional agents. The functional agents used throughout the project were whey, phytic acid and lecithin. For the textile substrates only 100% cotton fabric was used. To obtain flame retardation properties whey nanoparticles with incorporation of phytic acid or lecithin were produced. The nanoparticles were prepared using the ultrasonic encapsulation technique. Several conditions were tested throughout the project for the preparation of nanoparticles. For whey nanoparticles with phytic acid incorporation, the use of concentrated or isolated whey protein, the pH of the solution and the denaturation of the protein were tested. For lecithin-incorporated whey nanoparticles, lecithin concentration, concentrated whey protein concentration, protein denaturation and binder concentration were tested. After nanoparticle formation, its diameter size, polydispersity index and Zeta potential were measured by the Dynamic Light Scattering (DLS) method. For all nanoparticle samples that showed good results, 100% cotton tissue was functionalized using the Foulard impregnation-drying technique. For all functionalized samples the washing fastness of the functionalization was analyzed by the Acid Orange method, the total amount of phosphorus present in the fabric was quantified before and after undergoing a wash cycle, following an adaptation of the Portuguese Standard 1842-1: 2008 The flame test was performed before and after the functionalized fabric underwent a wash cycle, following an adaptation of the Portuguese Standard EN ISO 6941: 2005. The nanoparticles that presented higher washing resistance were the whey nanoparticles with incorporated lecithin, and these were the ones that presented the best results in the flame test. It was concluded that for nonwashed fabrics any of the functional agents used confer flame retardant properties, but only for tissues with the lecithin functional agent flame retardant properties were obtained after a wash cycle. KEY WORDS: Lecithin, nanoparticles, Phytic Acid, retardance, whey protein. vii ÍNDICE AGRADECIMENTOS ............................................................................................................................ iii RESUMO ............................................................................................................................................ v ABSTRACT .......................................................................................................................................... vi ÍNDICE .............................................................................................................................................. vii LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................................. xi LISTA DE TABELAS ........................................................................................................................... xiv LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E ACRÓNIMOS ............................................................................ xvi 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................................. 1 1.1 Entidade de acolhimento .................................................................................................... 1 1.2 Enquadramento e apresentação do projeto ......................................................................... 1 2. ESTADO DE ARTE ....................................................................................................................... 3 2.1 Indústria de laticínios ......................................................................................................... 3 2.1.1 Produtos e subprodutos ................................................................................................. 4 i. Leite .................................................................................................................................. 4 ii. Queijo ................................................................................................................................ 4 2.1.2 Subproduto: soro do leite ............................................................................................... 5 i. Proteína do soro do leite ..................................................................................................... 5 ii. Aplicações industriais do soro do leite ................................................................................. 7 2.2 Indústria têxtil e de Vestuário .............................................................................................. 8 2.2.1 Substratos têxteis ........................................................................................................... 9 i. Fibras naturais ................................................................................................................. 10 ii. Fibras não naturais .......................................................................................................... 11 2.3 Inovações na indústria têxtil baseada na nanotecnologia ................................................... 11 2.3.1 Técnicas de nanoencapsulação .................................................................................... 11 2.3.2 Têxteis funcionais ........................................................................................................ 12 i. Retardança à chama ........................................................................................................ 13 2.4 Retardantes à chama: agentes funcionais ricos em fósforo ................................................ 14 2.4.1 Agentes retardantes sintéticos ...................................................................................... 15 viii 2.4.2 Agentes retardantes biológicos ..................................................................................... 16 i. Proteína de soro do leite ................................................................................................... 16 ii. Ácido Fítico ...................................................................................................................... 17 iii. Lecitina de soja ................................................................................................................ 17 3. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................................ 19 3.1 Materiais .......................................................................................................................... 19 3.2 Métodos ........................................................................................................................... 19 3.2.1 Preparação de nanopartículas de concentrado proteico de soro de leite com incorporação do agente funcional ................................................................................................................... 20 i. Preparação da solução mãe de concentrado proteico de soro de leite (WPC ou WPI) ......... 20 ii. Preparação da solução mãe de WPC desnaturado ............................................................ 20 iii. Formulações de WPC ou WPI com incorporação do agente funcional Ácido Fítico .............. 20 iv. Formulações de WPC com incorporação do agente funcional Lecitina ............................... 21 v. Preparação de nanopartículas WPC ou WPI com o agente funcional incorporado ............... 21 3.2.2 Medição do tamanho, índice de dispersividade e potencial zeta das nanopartículas ....... 23 i. Tamanho e índice de dispersividade ................................................................................. 23 ii. Potencial Zeta .................................................................................................................. 24 3.2.3 Funcionalização do substrato têxtil ............................................................................... 25 i. Funcionalização por Impregnação-secagem ...................................................................... 26 3.2.4 Avaliação da durabilidade da funcionalização ................................................................ 27 i. Acid-Orange ..................................................................................................................... 27 ii. Espetroscopia ultravioleta-visível (UV-visível) ...................................................................... 28 3.2.5 Determinação do fósforo total após funcionalização ...................................................... 30 i. Preparação do reagente colorimétrico ............................................................................... 30 ii. Curva de calibração ......................................................................................................... 30 iii. Determinação do fósforo total presente nos tecidos previamente funcionalizados .............. 31 3.2.6 Medição das propriedades de propagação da chama em amostras de tecido orientadas verticalmente ............................................................................................................................ 33 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................................................... 35 4.1 Tamanho, índice de dispersividade (Đ) e potencial Zeta (ζ) das nanopartículas de concentrado proteico de soro de leite com incorporação do agente funcional ..................................................... 35 ix 4.1.1 Nanopartículas de WPC ou WPI com incorporação de Ácido Fítico (PA) ......................... 36 i. Influência do pH ............................................................................................................... 37 ii. Influência da desnaturação da proteína de soro do leite .................................................... 40 4.1.2 Nanopartículas de WPC com incorporação de Lecitina (Lec) ......................................... 41 i. Influência da concentração de Lecitina ............................................................................. 41 ii. Influência da concentração de WPC .................................................................................. 44 iii. Influência da desnaturação da proteína de soro do leite .................................................... 44 4.2 Avaliação da durabilidade da funcionalização dos tecidos com as nanopartículas de concentrado proteico de soro de leite com incorporação do agente funcional ................................. 45 4.2.1 Nanopartículas de WPC com incorporação de Ácido Fítico (PA) ..................................... 46 i. Influência do pH ............................................................................................................... 46 ii. Influência da desnaturação da proteína de soro do leite .................................................... 47 4.2.2 Nanopartículas de WPC com incorporação de Lecitina (Lec) ......................................... 49 i. Influência da concentração de Lecitina, de WPC e de ligante e da desnaturação da proteína de soro do leite ......................................................................................................................... 49 4.3 Determinação do fósforo total presente nos tecidos após funcionalização com as nanopartículas de concentrado proteico de soro de leite com incorporação do agente funcional ..... 51 4.3.1 Nanopartículas de WPC com incorporação de Ácido Fítico (PA) ..................................... 51 i. Influência do pH ............................................................................................................... 51 ii. Influência da desnaturação da proteína de soro do leite .................................................... 53 4.3.2 Nanopartículas de WPC com incorporação de Lecitina (Lec) ......................................... 54 i. Influência da concentração de Lecitina ............................................................................. 54 ii. Influência da concentração de WPC .................................................................................. 56 iii. Influência da desnaturação da proteína de soro do leite .................................................... 56 iv. Influência da concentração de ligante ............................................................................... 57 4.4 Teste da chama nos tecidos após funcionalização com as nanopartículas de concentrado proteico de soro de leite com incorporação do agente funcional ..................................................... 58 4.4.1 Nanopartículas de WPC com incorporação de Ácido Fítico (PA) ..................................... 60 4.4.2 Nanopartículas de WPC com incorporação de Lecitina (Lec) ......................................... 62 5. CONCLUSÕES FINAIS ............................................................................................................... 66 xvi LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E ACRÓNIMOS Abs – Absorvância CeNTI – Centro de Nanotecnologia e Materiais Técnicos, Funcionais e Inteligentes CITEVE – Centro Tecnológico Têxtil e Vestuário Đ – Índice de dispersividade DLS – “Dynamic light scattering” Etanol* – Etanol evaporado Lec – Lecitina Lig – Agente de ligação PA – Ácido Fítico pI – ponto isoeléctrico s – Erro associado à amostra UV-Vis – Ultravioleta-visível WPC – Proteína de soro do leite concentrada WPI – Proteína de soro do leite isolada ζ – Potencial Zeta 1 1. INTRODUÇÃO 1.1 Entidade de acolhimento O tema da dissertação desenvolveu-se no CeNTI - Centro de Nanotecnologia e Materiais Técnicos, Funcionais e Inteligentes. Este centro de investigação encontra-se sediado em Vila Nova de Famalicão, tendo sido fundado no ano de 2006 pelo Centro Tecnológico de Indústrias Têxteis e do Vestuário, pelo Centro Tecnológico da Indústria do Couro e pelas Universidades do Minho, Porto e Aveiro. Este instituto de novas tecnologias possui uma abordagem business to business, procurando inovar no scalling-up de materiais e dispositivos funcionais e inteligentes. Deste modo, o CeNTI tem como principal objetivo o desenvolvimento de novos materiais aplicáveis em diversas áreas de interesse, necessitando de equipas multidisciplinares com conhecimentos diversificados, o que proporciona o desenvolvimento de diversos produtos como fibras multicomponentes, materiais e dispositivos funcionais, revestimentos multifuncionais e sistemas eletrónicos orgânicos e incorporados (CeNTI, 2019). 1.2 Enquadramento e apresentação do projeto Durante décadas o design e produção de tecidos e materiais funcionais de alta performance têm sido o grande desafio da indústria têxtil, consequência direta de um aumento de conhecimento, exigência e procura por parte de clientes e mercados. Com os avanços da nanotecnologia abrem-se novos horizontes no sector têxtil que permitem o desenvolvimento de uma nova geração de têxteis high-tech, com novas funcionalidades e propriedades, oferecendo produtos inovadores e diferenciadores. Assim, este trabalho enquadra-se no âmbito do desenvolvimento de têxteis funcionais. O potencial de inovação ao nível das fibras é vasto com aplicação nos mais diversos setores de atividade levando ao aparecimento de fibras funcionais, sendo que estas podem ser definidas como um conjunto de todos os componentes que vão para além da estética e decoração, permitindo obter materiais com características inovadoras, eficientes e inteligentes. O seu desenvolvimento representa o núcleo de uma progressão tecnológica que permite à indústria responder mais facilmente às necessidades do mercado atual e futuro. No âmbito deste projeto, a componente de inovação associada será o desenvolvimento de aditivos para potenciar a retardança à chama de substratos têxteis, como o algodão sendo que estes aditivos terão como origem uma fonte biológica, mais subprodutos da indústria alimentar, como grãos, sementes e oleaginosas. Deste modo, seria este o pressuposto que levaria o consumidor a considerar este produto 2 de valor acrescentado, inserido numa perspetiva ecológica que é a utilização de subprodutos da indústria alimentar que poderiam acabar por ser descartados como resíduos, tornando uma indústria poluente mais “verde”. A fácil inflamabilidade dos substratos têxteis tem sido combatida nos últimos anos pelo desenvolvimento e aplicação de substâncias retardantes à chama, ou, por outras palavras, de aditivos que possam diminuir o risco de fogo pela inibição da ignição do material, ou pelo decréscimo da propagação da chama, quando necessário. Tal efeito cria, no imediato, um valor acrescentado a qualquer substrato têxtil funcionalizado, devido à menor quantidade de compostos químicos voláteis libertados na atmosfera. Dependendo das propriedades térmicas e de chama, as fibras e substratos têxteis necessitam de elementos halogenados ou não-halogenados, para potenciar a propriedade de retardança à chama. Os compostos convencionais retardantes de chama usam normalmente moléculas halogenadas que contém elementos altamente reativos, como o cloro e o bromo, que levantam grandes preocupações relativamente ao seu impacto ambiental e sobre a saúde humana. Simultaneamente, e através da natureza biológica do retardante, é esperado que se consiga promover uma solução com caráter biocompatível, não-tóxico e ecológico, para salvaguardar os interesses ambientais. As condições de impregnação do agente retardante terão de ser otimizadas, quer a nível da sua concentração ótima, no substrato têxtil, quer ao nível da sua resistência à lavagem. O têxtil funcional será então testado, à escala laboratorial, relativamente à sua retardança à chama e ao seu comportamento térmico. 3 2. ESTADO DE ARTE 2.1 Indústria de laticínios Desde a domesticação de pequenos ruminantes, cerca de 8000 a.C. na Ásia Menor, que o consumo de leite tem uma forte presença na vida da população. Este consumo é explicado pelos benefícios que se extraem do elevado valor nutricional deste alimento (Miranda, 2018). Este é visto como um “alimento completo” pois fornece todos os nutrientes, proteínas, aminoácidos essenciais, gordura, vitaminas e sais minerais em proporções consideradas adequadas. A indústria dos laticínios é a indústria transformadora do leite e seus derivados, como por exemplo o queijo. Esta produz uma grande quantidade de resíduos sólidos e líquidos, sendo que se consideram resíduos sólidos todos os restos de matéria-prima, produto acabado, embalagens, entre outros. Já como resíduos líquidos considera-se o soro do leite. Contudo, este último, por ter um valor acrescentado devido à sua riqueza em sólidos com um teor importante em proteínas de elevado valor biológico, é considerado um subproduto da produção de queijo (Azevedo, 2015). Atualmente, a nível mundial, existe uma produção de leite de cerca de 616 milhões de toneladas, sendo que cerca de 26% desta produção é realizada na União Europeia, tornando-se o segundo maior produtor de leite a nível mundial. A Índia aparece em primeiro, com um valor de produção correspondente a 28% da produção a nível mundial. Relativamente à produção de queijo, esta corresponde a cerca de 21 milhões de toneladas, sendo a União Europeia a maior produtora, produzindo cerca de 48% de todo o queijo produzido no mundo (Milk, 2019). Em Portugal, no ano de 2017, a indústria de laticínios apresentou uma produção total de leite de 1963 mil litros, correspondendo esta produção à soma da produção do leite de vaca, de ovelha e de cabra (ANILACT, 2018b). Esta indústria é o segmento mais importante da indústria alimentar, representando cerca de 15% do volume de vendas desta (ANILACT, 2018a). Devido à elevada produção de laticínios por todo o mundo, o aproveitamento do soro de leite tornase cada vez mais uma aposta do mercado devido ao seu baixo valor monetário e ao seu elevado valor nutricional, como já mencionado anteriormente. Com o intuito de lutar contra o elevado impacte ambiental deste subproduto, tendo em consideração que por dia uma fábrica produz em média 300 000 litros de soro de leite e que este tem um impacto ambiental equivalente a uma cidade com 150 000 habitantes, cada vez mais existem estudos à volta deste problema ambiental, quer ao nível de possíveis novas aplicações como também ao nível do desenvolvimento de novas tecnologias de processamento (Azevedo, 2015). 4 2.1.1 Produtos e subprodutos i. Leite De acordo com o Regulamento (UE) Nº 1308/2013, a designação leite fica exclusivamente reservada ao “produto de secreção mamária, normal, proveniente de uma ou mais ordenhas, sem qualquer adição ou extração.” Esta designação pode ser utilizada para o leite que tenha sido submetido a um “tratamento” do qual não resulte qualquer alteração da sua composição e pode ser utilizada, com um ou mais termos, para designar o “tipo, classe qualitativa, a origem e/ou a utilização prevista do leite, para descrever o tratamento físico a que o leite foi submetido ou a alterações verificadas na composição do mesmo, desde que tais alterações se limitem à adição e/ou à extração de componentes naturais do leite”. O leite é um alimento bastante completo sendo rico em cerca de nove nutrientes essenciais ao corpo humano: proteínas, hidratos de carbono, gordura, riboflavina (vitamina B2), vitamina B12, cálcio, fósforo, potássio e iodo. Este é também o único alimento rico em cálcio que permite uma fácil absorção do mesmo, pois o cálcio é um dos elementos mais importantes do corpo humano, sendo imprescindível para o bom funcionamento das células e estando presente nos ossos, dentes e também no sangue. A sua presença é fundamental para a transmissão dos estímulos nervosos, coagulação sanguínea, contração muscular e funcionamento celular (Park & Haenlein, 2013). ii. Queijo O queijo é um produto fresco ou curado obtido a partir da precipitação das caseínas do leite, isto é, existe um processo de concentração do leite no qual parte dos componentes sólidos, principalmente proteína e gordura, são concentrados na coalhada enquanto as proteínas do soro, lactose e sólidos solúveis, são removidas no soro. O rendimento de fabrico e a composição do queijo estão diretamente relacionados com o tipo de leite usado e as etapas do processo de fabrico. A composição do leite tem uma elevada importância na coagulação enzimática, na firmeza da coalhada, na sinérese e na textura do queijo. O processo de produção do queijo tem várias etapas, sendo as principais a coagulação, acidificação, sinérese, moldagem e prensagem, salga e cura. Uma intervenção nestas etapas permite o controlo da composição do queijo influenciando diretamente a sua cura e qualidade no produto final (Paula et al ., 2009). 5 2.1.2 Subproduto: soro do leite O soro do leite é a porção líquida produzida durante o fabrico do queijo, correspondendo a cerca de 90% do volume do leite, sendo considerado um subproduto do processo de produção de queijo e não um resíduo. Parte deste subproduto é usado para ração para animais e em aplicações alimentares. Contudo, o soro do leite que não é reaproveitado gera problemas ambientais significativos, devido ao seu conteúdo orgânico e elevado volume de produção. Os fatores responsáveis pela alta carga orgânica do soro do leite são nutrientes como lactose, proteínas, lípidos e vitaminas (Yadav et al ., 2015). Para o mesmo tipo de leite, a composição do soro varia de acordo com o tipo de queijo produzido e com o processo de coagulação usado, por acidificação ou adição de coalho, dando origem a dois tipos de soro: o soro doce que é obtido pela coagulação com coalho (enzima de origem bovina) e o soro ácido obtido pela coagulação acidificada (“Uso do soro de leite na indústria de laticínios,” 2019). A tabela 1 apresenta os valores aproximados da composição do soro doce e do soro ácido. Tabela 1 Composição do Soro doce e do Soro ácido de origem bovina. Adaptado de Yadav et al ., 2015 Constituintes Soro doce (g/L) Soro ácido (g/L) Sólidos totais 63,0 - 70,0 63,0 - 70,0 Lactose 46,0 - 52,0 44,0 - 46,0 Proteínas 6,0 - 10,0 6,0 - 8,0 Gordura 5,0 0,4 Lactato 2,0 6,4 Cinzas 5,0 8,0 Cálcio 0,4 - 0,6 1,2 - 1,6 Fosfato 1,0 - 3,0 2,0 - 4,5 Cloreto 1,1 1,1 O problema da gestão do soro do leite produzido tem vindo a ser resolvido, sendo que nos dias de hoje uma grande parte do soro do leite é utilizado e transformado em produtos com valor acrescentado. Contudo, ainda há uma quantidade significativa de soro que permanece inutilizada, o que leva a que este deva ser processado para diminuir o impacto no ambiente, preferencialmente gerando valor acrescentado. i. Proteína do soro do leite 6 O tratamento direto do soro por métodos físicos ou térmicos permite obter soro em pó, proteína de soro do leite concentrada, proteína de soro do leite isolada, lactose e outras frações também presentes no soro como apresentados na tabela 1. A procura por soro de leite para a produção de proteínas de soro tem aumentado devido aos elevados valores funcionais e nutricionais. Existem vários produtos de interesse que podem ser obtidos a partir do soro do leite com diferentes teores proteicos como soro de leite em pó, soro de leite com redução de lactose, proteína de soro do leite concentrada (WPC) e proteína de soro do leite isolada (WPI). Estes produtos são obtidos de várias maneiras, sendo que o soro em pó é obtido por remoção de água, secagem e pulverização, o soro de leite com redução de lactose é um produto com um teor de lactose inferior a 60%. O WPC resulta da remoção de frações não proteicas para atingir um conteúdo de proteína definido. Os produtos WPC normalmente disponíveis são WPC34, WPC50, WPC60, WPC75 e WPC80. O valor numérico define qual a percentagem de proteína no produto; o WPC34, por exemplo, não deve conter menos que 34% de proteína. Da mesma forma, o WPI é obtido através da remoção da fração não proteica para atingir concentrações de proteína superiores a 90% no produto final. Na figura 1 e figura 2 estão representados os processos de produção dos dois tipos de proteína de soro do leite, WPC e WPI, respetivamente (Yadav et al ., 2015). Figura 1 Processo de produção de proteína de soro do leite concentrada. Adaptado de Yadav et al ., 2015. 7 Figura 2 Processo de produção de proteína de soro do leite isolada. Adaptado de Yadav et al ., 2015. ii. Aplicações industriais do soro do leite O soro do leite tem presente alguns nutrientes residuais do leite conferindo-lhe um excelente valor nutricional, como já mencionado e apresentado anteriormente na tabela 1. Este valor nutricional despertou o interesse da indústria, que o transforma em produtos de valor acrescentado, levando a que cerca de 50% do total de soro de leite produzido seja incorporado em diferentes alimentos. Destes alimentos, cerca de 45% estão na forma líquida, 30% em pó e 15% como vários subprodutos da sua eliminação que permanecem concentrados de proteína do soro do leite (Yadav et al ., 2015). Na tabela 2 são apresentados alguns exemplos de produtos à base de soro do leite e respetivas aplicações. Contudo, não são apenas estas as aplicações possíveis para o soro do leite. Como a parte sólida deste é constituída maioritariamente por lactose juntamente com proteínas solúveis, vitaminas e minerais, existem vários processos biotecnológicos e físico-químicos nos quais o soro do leite é aplicado como substrato para produção industrial de produtos com elevado valor acrescentado A fermentação da lactose por via anaeróbia através de bactérias, por exemplo, produz etanol, ácido cítrico, ácido lático e entre outros (Yadav et al ., 2015). 8 Tabela 2 Aplicação de produtos à base do soro de leite. Adaptado de Gouveia, 2016. Produto Aplicação Soro lático pasteurizado Bebidas com soro, sopa, queijos Proteína de soro lático Hidrolisados proteicos, queijos, queijo processado, alimentação para animais, produtos para panificação Soro em pó Sobremesas congeladas, produtos de panificação, alimentos para desportistas Concentrado proteico de soro Produtos de panificação e confeitaria, queijos, produtos lácteos fermentados, bebidas, alimentos para desportistas Lactose Caramelos, alimentos infantis, xarope de lactose, preparados em pó para bebidas e sopas, produtos de confeitaria, sobremesas congeladas, produtos de panificação 2.2 Indústria têxtil e de Vestuário A Indústria Têxtil e de Vestuário (ITV) é uma das maiores e mais importantes indústrias para a economia portuguesa. Representa cerca de 10% do total das exportações portuguesas, 20% do emprego, 9% do volume de negócios e 9% da produção da indústria transformadora (ATP, 2018). Após um máximo histórico no volume de negócios em 2001, superior a 8000 milhões de euros, o fim do período derrogatório do Acordo Multifibras de 1973 (AMF), com efeito em 2004, teve efeitos dramáticos sobre o setor Têxtil e de Vestuário com uma redução significativa do volume de negócios e do emprego nos anos subsequentes, com a consequência do encerramento de muitas empresas e redução de emprego no setor em Portugal, como no resto da Europa. 9 Contudo, a ITV reagiu adotando novos métodos de criação de valor nas aplicações têxteis e de vestuário, recorrendo à renovação de processos, qualificação de ativos e apostando em inovação e criatividade com base científica e tecnológica, dos materiais aos produtos, com o intuito de alcançar novos mercados e maior satisfação do cliente e consumidor, contribuindo de forma sistemática para a sustentabilidade e crescimento dos negócios deste setor industrial. Nos dias de hoje, a indústria têxtil desenvolve e fabrica produtos para aplicações tão diferenciadas como têxtil-lar, vestuário casual, interiores automóveis e fibras de reforço estrutural de compósitos para a aeronáutica. A incessante aposta na inovação em materiais, tecnologias, processos industriais e modelos de negócio são fundamentais para o sucesso da indústria têxtil no mercado global (CITEVE, 2012). Portugal tem cerca de 6 mil empresas laborando em todos os subsetores da indústria têxtil e do vestuário, algumas das quais são unidades verticais, embora na sua maioria sejam pequenas e médias empresas, todas bem conhecidas pela sua flexibilidade e resposta rápida, know-how e inovação. Localizam-se maioritariamente no Norte de Portugal (Porto, Braga, Guimarães e Famalicão), mas também se encontram algumas na Covilhã (Leste de Portugal) dedicadas aos produtos de lã (ATP, 2018). 2.2.1 Substratos têxteis A transformação das matérias-primas têxteis em produtos finais obriga a que haja uma grande produção de produtos intermédios, principalmente fibras, fios e tecidos que são submetidos a intervenções sucessivas como a fiação, transformação em fibras têxteis e acabamentos. As fibras têxteis caracterizam-se pela sua elasticidade, fineza e longo comprimento em relação à dimensão transversal máxima, sendo que cada uma se adequa à respetiva aplicação têxtil. Estas aplicações realizam-se através de operações de transformação industrial, tais como fiação, tecelagem e entre outras (Troficolor Têxteis, 2013). Os substratos têxteis classificam-se em dois grupos distintos de acordo com a sua origem, podendo esta ser origem natural ou não natural (Sinclair, 2014). Nas fibras naturais destacam-se as fibras animais e as vegetais, que representam cerca de 50% das fibras têxteis produzidas anualmente no mundo. As fibras de origem animal incluem a lã, a seda e a alpaca, sendo que todas estas fibras são à base de proteínas. Já o algodão, linho e cânhamo são fibras de origem vegetal e a sua constituição baseia-se em celulose (Sinclair, 2014). A figura 3 representa esquematicamente a classificação geral das fibras têxteis, exemplificando algumas dentro de cada tipo. 16 Dos quatro grupos os retardantes à chama, os halogenados são os mais eficazes na inibição da propagação da chama devido à sua maior eficiência na captura de radicais livres produzidos durante o processo de combustão (Eljarrat & Barceló, 2011; Silva et al ., 2014). Dos vários compostos orgânicos halogenados, organoiodados, organobromados, organoclorados e organofluorados, apenas os organobromados e os organoclorados são aplicados como retardantes à chama, pois os compostos organofluorados são muito estáveis devido à sua decomposição se dar a temperaturas muito superiores às dos substratos têxteis a queimar. Já os compostos organoiodados não são muito estáveis e decompõese a temperaturas baixas (Silva et al ., 2014). Por último, os retardantes à chama bromados são os mais relevantes no mercado mundial devido à sua baixa temperatura de decomposição e por apresentarem maior eficiência na captura de radicais livres. Os retardantes à chama bromados atuam por ação química e interferem nas reações de fase gasosa (Silva et al ., 2014). 2.4.2 Agentes retardantes biológicos i. Proteína de soro do leite Os retardantes à base de halogéneos e seus derivados têm-se mostrado bastante persistentes, bioacumuláveis e tóxicos para o meio ambiente, os animais e até mesmo os humanos levando a que haja uma busca persistente por novos retardantes à chama que não sejam nocivos para o meio ambiente e ao mesmo tempo sejam rentáveis. Esta procura levou à conclusão que uso de biomacromoléculas como proteínas e ácidos nucleicos poderiam representar uma alternativa bastante promissora relativamente às abordagens tradicionais (Alongi et al ., 2014). A utilização da proteína de soro do leite como retardante à chama apresenta-se assim como uma alternativa. Depois de terem sido tratados com este material vários tecidos demonstraram um aumento no tempo total de queima assim como uma menor taxa de queima. Este sistema demonstra assim que a utilização de biomacromoléculas pode representar um acabamento “verde” bastante desafiador, inovador e promissor para substratos celulósicos. Além disso, a sua origem a partir de fontes naturais renováveis, representa uma vantagem adicional do ponto de vista ambiental (Alongi et al ., 2014). A proteína de soro do leite, como a maioria das proteínas derivadas de fontes animais, contém fósforo e enxofre que exibem um grande potencial como retardantes à chama para substratos têxteis (Alongi et al ., 2014). A aplicação de revestimentos deste subproduto da indústria de laticínios, numa 17 atmosfera inerte e oxidativa, acaba por afetar significativamente a degradação térmica do algodão e de alguma forma a sua combustão quando uma chama é aplicada (Bosco et al ., 2013). ii. Ácido Fítico O ácido fítico, com o nome IUPAC (1R,2S,3R,4R,5S,6S) -cyclohexane-1,2,3,4,5,6-hexayl hexakis [dihydrogen (phosphate)], foi identificado pela primeira vez em 1855. É um composto vegetal natural com uma estrutura única que é responsável por suas propriedades características. O ácido fítico é constituído por 12 protões substituíveis, permitindo que se complexe com catiões multivalentes e proteínas carregadas positivamente o que o leva a poder ser encontrado em muitas formas (figura 4). O fitato é o sal do ácido fítico. O ácido fítico pode existir como ácido livre ou fitato de acordo com o pH da solução e os iões metálicos presentes (Oatway et al ., 2001). O ácido fítico é encontrado na maioria dos grãos de cereais, legumes, nozes, oleaginosas, tubérculos, pólen, esporos e solos orgânicos. Atua como reserva primária de fósforo, correspondendo até 85% do fósforo total em cereais e leguminosas. Em grãos de cereais, sementes oleaginosas e leguminosas, o fitato constitui a porção principal (60-97%) do fósforo total, e nas raízes e tubérculos 2125% do fósforo total pode ocorrer como fitatos (Pei et al ., 2019) Figura 4 Estrutura básica do ácido fítico. Adaptado de Oatway et al ., 2001. iii. Lecitina de soja A lecitina de soja é o material obtido a partir da degomagem de óleos vegetais e da secagem de gomas hidratadas. Esta consiste numa mistura de fosfolípidos, triglicerídeos e outros compostos não fosfolipídicos (tabela 5) (Scholfield, 1981). Alguns dos fosfolípidos presentes na lecitina de soja são a fosfatidiletanolamina, o fosfatidilinositol e a fosfatidilcolina (Mertins, Sebben, Schneider, Pohlmann, & Silveira, 2008). A fosfatidilcolina é o fosfolípido mais específico da lecitina e consiste numa mistura de fosfolípidos naturais constituídos por uma extremidade polar formada por um grupo colina e um grupo fosfato ligados 18 à parte hidrofóbica da molécula, duas cadeias longas alifáticas de 16 a 22 carbonos, por ligações ésteres com o glicerol (figura 5). Devido à sua estrutura polar-apolar, ou seja, anfifilíca, estas moléculas tendem a organizar-se em bicamadas com importantes funções biológicas, como por exemplo, membranas celulares de organismos vivos (Mertins et al ., 2008). A lecitina de soja é um importante emulsionante utilizado na indústria alimentar, farmacêutica e na biomedicina uma vez que tem a possibilidade de formar emulsões água/óleo e óleo/água, o que lhe permite ser um ótimo emulsionante (Van Nieuwenhuyzen, 1976). Tabela 5 Componentes da lecitina de soja. Adaptado de Scholfield, 1981 Componente Percentagem presente na lecitina (%) Fosfatidilcolina 19-21 Fosfatidiletanolamina 8-20 Fosfatos de inositol 20-21 Outros fosfatos 5-11 Óleo de Soja 33-35 Esteróis 2-5 Hidratos de carbono livres 5 Figura 5 Estrutura molecular da fosfatidilcolina. R representa longa cadeia hidrocarbonada que pode conter insaturações. Retirada de Mertins et al., 2008. 19 3. MATERIAIS E MÉTODOS Neste capítulo serão descritos os procedimentos experimentais utilizados para o desenvolvimento de projeto incluindo os reagentes e a instrumentação usada. 3.1 Materiais Na tabela 6 encontram-se todos os reagentes e solventes utilizados ao longo da realização das atividades laboratoriais necessárias para o desenvolvimento deste projeto, assim como o respetivo fornecedor. Tabela 6 Listagem dos reagentes utilizados ao longo do projeto Reagentes e Solventes Fornecedor Ácido fítico (C9H19O24P6; 98%) Sigma-Aldrich Acid Orange - Ácido nítrico (HNO3; 65%) Sigma-Aldrich Água destilada - Azida de sódio (NaN3; 99%) Acros Organics Concentrado proteico de soro de leite 80% - WPC Nutripar Concentrado proteico de soro de leite 90% - WPI Nutripar Dihidrogenofosfato de potássio (KH2PO4) Sigma-Aldrich ECE Detergente com fosfato (B) SDC Enterprises Limited Etanol (C2H6O; 99,5%) VWR Heptamolibdato de amónio tetrahidratado ([(NH4)6MO7O24. 4H2O]; 99%) Sigma-Aldrich Monovanadato de amónio ((NH4VO3); Analitical reagent) VWR O substrato têxtil utilizado foi 100% algodão. 3.2 Métodos 20 3.2.1 Preparação de nanopartículas de concentrado proteico de soro de leite com incorporação do agente funcional i. Preparação da solução mãe de concentrado proteico de soro de leite (WPC ou WPI) Inicialmente preparou-se uma solução com uma concentração de 10 % em massa de WPC ou WPI (20 g de WPC ou WPI e 200 mL de água destilada). Colocou-se a solução em agitação até o concentrado se encontrar totalmente dissolvido, recorrendo a um agitador magnético e a uma placa de agitação, à qual previamente se adicionou 0,02 % de um bacteriostático, neste caso Azida de Sódio, correspondente a 40 mg. Após a solução estar preparada colocou-se num frasco de vidro, devidamente identificado, e ficou em repouso durante 24 h no frigorífico. ii. Preparação da solução mãe de WPC desnaturado Para proceder à desnaturação de proteínas utilizou-se um solvente orgânico, o Etanol. A preparação da solução mãe de WPC desnaturado foi análoga à preparação da solução mãe anterior sendo a única diferença a adição de 100 mL de água de destilada e 100 mL de Etanol. Depois da preparação da solução, nas mesmas condições que a solução anterior, esta foi colocada num evaporador rotativo, representado na figura 6, para proceder à evaporação do solvente orgânico. Após todo o etanol estar evaporado perfez-se o volume da solução com água de modo a que esta voltasse a ter a concentração inicial. Figura 6 Evaporador rotativo presente no CENTI. iii. Formulações de WPC ou WPI com incorporação do agente funcional Ácido Fítico 21 Para preparar as formulações de WPC ou WPI com incorporação do agente funcional Ácido Fítico primeiramente preparou-se uma solução de Ácido Fítico com uma concentração 1 % m/m, sendo que para tal pesou-se 5 g do reagente Ácido Fítico e dissolveu-se em 500 mL de água destilada. De seguida prepararam-se as formulações de WPC ou WPI incorporando o Ácido Fítico, para tal, num gobelé de 250 mL, de modo a que a formulação final tivesse uma concentração de concentrado proteico de 5 % m/m e de 0,5 % m/m de Ácido Fítico, juntou-se 25 mL da solução mãe de WPC ou WPI e 25 mL da solução de Ácido Fítico, assim como 1 mL de óleo vegetal. Por último, de modo a que as formulações tivessem diferentes pH, adicionou-se solução de Hidróxido de Sódio (NaOH) para obter formulações mais básicas e solução de Ácido Clorídrico (HCl) para obter formulações mais ácidas, sendo que os pH testados foram 3, 5, 7, 8 e 9. As quantidades adicionadas das soluções de acerto de pH foi a necessária até obter o pH desejado. O pH das soluções foi medido com a ajuda de um medido de pH digital. iv. Formulações de WPC com incorporação do agente funcional Lecitina Foram preparadas várias formulações com diferentes concentrações de WPC e Lecitina, respetivamente 5 e 10 % m/m e 25 e 50 % m/m. As concentrações de Lecitina são referentes à quantidade de WPC, e não refletem a concentração final de Lecitina na solução final. Para todas as formulações foi utilizado um gobelé de 250 mL para a preparação de formulações com um volume total de 50 mL. Para a preparação da formulação de 5 % de WPC juntaram-se 25 mL de água destilada e 25 mL de solução mãe de concentrado proteico. Já para a preparação da formulação de 10 % de WPC utilizou-se 50 mL de solução mãe de concentrado proteico. Posteriormente adicionou-se o agente funcional Lecitina previamente pesado sendo adicionado o peso de acordo com a concentração de Lecitina desejada, sendo que se testaram duas concentrações 25 % e 50 % em relação à percentagem de WPC presente, por exemplo, para a concentração de 25 % numa solução de 5 % de WPC, que corresponde a 2,5 g, será necessário adicionar 0,625 g de Lecitina (0,25x2,5=0,625). De seguida, com a ajuda de um agitador magnético e uma placa de agitação, colocou-se a solução em agitação até a Lecitina se encontrar toda dissolvida. O mesmo procedimento se aplica aquando da utilização da solução mãe de WPC desnaturado. v. Preparação de nanopartículas WPC ou WPI com o agente funcional incorporado 22 Para proceder à preparação de nanopartículas recorreu-se à utilização da técnica de encapsulação ultrassónica. O ultrassom é uma tecnologia que é utilizada com sucesso para sonoquímica, síntese, desaglomeração, dispersão, emulsionante, de funcionalização e de ativação das partículas. Particularmente em nanotecnologia, o ultrassom é uma técnica essencial para a síntese e processamento de nanomateriais. A sonoquímica é uma das primeiras técnicas utilizadas para preparar compostos de tamanho nanométrico (“Hielscher – Tecnologia de Ultra-Som,” 2019). A figura 7 representa o equipamento de ultrassons utilizado. Figura 7 Dispositivo de ultrassons hielscher presente no CENTI. As soluções previamente preparadas foram colocadas no dispositivo de ultrassons durante 15 minutos num banho de gelo, de modo a que não ocorra sobreaquecimento da solução. No caso das nanopartículas com incorporação do agente funcional Lecitina foi utilizado um sistema bifásico. Após os 15 minutos retirou-se a solução e a mesma permaneceu em repouso até assentar toda a espuma formada durante a ultrassonicação. De seguida procedeu-se à centrifugação das soluções numa centrifuga durante 20 minutos, a uma velocidade de 9000 rpm e a 20 °C. A centrifuga utilizada está representada na seguinte figura 8. 23 Figura 8 Centrífuga da Hettich ZentrifugenUniversal 320R presente no CENTI. 3.2.2 Medição do tamanho, índice de dispersividade e potencial zeta das nanopartículas i. Tamanho e índice de dispersividade A análise do tamanho de partículas e o índice de dispersividade (Đ) das soluções de nanopartículas são obtidas pelo método Espalhamento de Luz Dinâmico, “Dynamic light scattering” (DLS), realizado em aparelho Zetasizer (Malvern Instruments) a uma temperatura de 25 °C. Esta técnica baseia-se no facto de que as partículas se movem aleatoriamente sob o impacto das moléculas do solvente sobre a sua superfície. A frequência e a amplitude deste movimento, denominado browniano, é dependente do tamanho da partícula e da viscosidade do solvente, ou seja, quanto menor a partícula, maior será a frequência do movimento browniano numa amplitude relativa importante (“Malvern Instruments,” 2019). A tabela 7 apresenta valores de referência para Đ. Tabela 7 Tabela de referência para Đ Đ Características 0,00 A 0,05 Usualmente, medidas somente encontradas com padrões de látex ou partículas propositadamente produzidas como monodispersas. 0,05 A 0,08 Amostra quase monodispersa. 0,08 A 0,70 Faixa de dispersividade média. >0,70 Amostra muito polidispersa; deve-se ter cuidado na interpretação dos resultados pois a amostra pode não ser adequada para a técnica de DLS. 24 Para a medição do tamanho e do Đ das nanopartículas de WPC ou WPI com o agente funcional incorporado, utilizou-se uma cuvete à qual se adicionou 20 μL da solução de nanopartículas e 980 μL de água, de modo a perfazer 1 mL. Esta diluição foi realizada pois a solução de nanopartículas é muito concentrada e não permite uma análise correta do espalhamento da luz, impossibilitando a medição do tamanho médio e do Đ das nanopartículas. A figura 9 representa o equipamento utilizado para a medição do tamanho médio e do Đ. Figura 9 Zetasizer (Malvern Instruments) presente no CENTI. ii. Potencial Zeta A análise do potencial Zeta das soluções de nanopartículas realiza-se num aparelho Zetasizer (“Malvern Instruments,” 2019) a uma temperatura de 25 °C. As nanopartículas possuem carga eletrostática superficial. Nas figuras 10 e 11, tem-se a representação esquemática de partícula e o seu comportamento de acordo com a existência ou não de carga superficial eletrostática. O potencial Zeta é uma medida do potencial elétrico da superfície das partículas, que é influenciado por mudanças na interface com o meio externo, decorrente da dissociação de grupos funcionais presentes na superfície ou da adsorção de espécies iônicas do meio de dispersão (D. Attwood, Alexander Taylor Florence, 2003). A medida de potencial Zeta permite avaliar a estabilidade das dispersões coloidais. 25 Elevados valores de potencial Zeta, acima de 25 mV, positivos ou negativos, sugerem suspensões de nanopartículas mais estáveis, devido à repulsão entre as partículas que previne a sua agregação. A medição do potencial Zeta foi realizada em células específicas que se encontram representadas na figura 12, exemplificando o mecanismo de medição. Nesta célula foi colocado 1 mL de solução correspondente a 20 μL da solução de nanopartículas e 980 μL de água. Figura 12 Célula de medição de potencial Zeta e respetivo mecanismo de medição. 3.2.3 Funcionalização do substrato têxtil O substrato têxtil utilizado neste projeto foi um tecido 100 % algodão. Para todos os ensaios foram cortados provetes em formato A4, que foram pesados antes de iniciar o processo, apresentado um peso de aproximadamente 9 g. Os ensaios de funcionalização foram efetuados sempre para 3 folhas de tecido A4. Os agentes de inclusão utilizados foram as soluções de nanopartículas de WPC com os diferentes agentes funcionais incorporados. Utilizou-se sempre um agente de ligação. A técnica utilizada para a funcionalização do substrato foi a funcionalização por Foulard, pelo método de impregnação-secagem. Figura 10 Representação esquemática de partículas com carga superficial. Figura 11 Representação esquemática de partículas sem carga superficial. 32 Procedeu-se à mineralização da toma por incineração, de com acordo com o referido na NP 1615, isto é, numa mufla, figura 18, a 550 °C ± 25 °C durante 5 h a 6 h. A amostra fica em cinzas como apresentado na figura 19. Depois de se retirar as amostras da mufla dissolveram-se as cinzas em 10 mL de ácido nítrico, usando uma vareta para auxiliar a dissolução. Cobriu-se o cadinho com um vidro de relógio e aqueceuse por 30 minutos em banho de água fervente. Deixou-se arrefecer e transferiu-se quantitativamente para um balão volumétrico de 100 mL, dilui-se até à marca com água, misturou-se e filtrou-se através de papel de filtro. Pipetou-se 10 mL do filtrado límpido e transferiu-se para um balão volumétrico de 50 mL, adicionou-se 15 mL do reagente colorimétrico. Dilui-se até à marca, misturou-se e permaneceu em repouso pelo menos durante 15 minutos obtendo-se soluções como as apresentadas na figura 20. Figura 20 Soluções obtidas após a realização de todo o procedimento para determinação do fósforo total presente nas amostras funcionalizadas. Figura 18 Mufla utilizada para mineralização das amostras por incineração presente no CENTI. Figura 19 Cinzas obtidas após mineralização da amostra por incineração na Mufla. 33 No final de todo o procedimento descrito mediram-se as absorvâncias no espetrofotómetro UV-visível, a um comprimento de onda de 430 nm ± 2 nm, de todas as soluções, em duplicado. De salientar que se procedeu sempre à leitura da absorvância duma das soluções padrão aquando da realização de novas leituras de soluções. 3.2.6 Medição das propriedades de propagação da chama em amostras de tecido orientadas verticalmente A medição das propriedades de propagação da chama de amostras de tecido orientadas verticalmente foi realizada a partir da adaptação da Norma Portuguesa EN ISO 6941:2005, Têxteis, Comportamento ao fogo, Medição das propriedades de propagação da chama de provetes orientados verticalmente . De acordo com a norma foi necessário ter um suporte, para as amostras de tecido, como demonstrado na figura 21 e uma estrutura para segurar o mesmo. Foi também necessário um cronómetro para contabilizar o tempo de propagação da chama assim como um queimador para pegar fogo aos tecidos. Figura 21 Equipamento utilizado para a realização da medição das propriedades de propagação da chama em amostras de tecidos orientadas verticalmente. As amostras de tecido foram todas cortadas com um tamanho de 17 cm de comprimento por 5,6 cm de largura. 34 Devido a ser um procedimento perigoso foi necessário ter algumas precauções como o uso de material no equipamento não inflamável, corrosivo e que não fosse afetado por fumos e a realização dos ensaios numa hote para extração dos fumos no final de cada ensaio realizado. O procedimento de medição das propriedades de propagação da chama em amostras de tecido orientadas verticalmente consiste nos seguintes passos: primeiro existiu a montagem da amostra de tecido no suporte destinado a esta e posteriormente ajustado à estrutura para o segurar. De seguida colocou-se o queimador perpendicular à superfície da amostra de modo a que o eixo do queimador estivesse alinhado com a linha central vertical da amostra, acender o mesmo e deixar aceso durante 3 segundos. No momento que se acende o queimador deve-se também dar início à cronometragem do tempo no cronómetro e apenas parar este quando a chama na amostra se apagar ou toda a amostra tiver sido consumida pelo fogo. No final de todo o procedimento descrito retirar o restante da amostra do suporte e dar início a um novo ensaio nos mesmos parâmetros. 35 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO Neste capítulo são apresentados e discutidos os resultados obtidos ao longo do projeto. Não são apresentados todos os resultados obtidos, mas sim todos aquele que foram considerados relevantes para perceber a influência de certas condições nos resultados obtidos ao longo do projeto com o objetivo de se atingir os resultados propostos. Os dados apresentados neste capítulo foram todos previamente tratados e são apresentados de modo a que se consiga ter perceção das mudanças provocadas pelas alterações sistemáticas às condições experimentais. Primeiramente foram realizados estudos com nanopartículas de soro do leite com incorporação de Ácido Fítico e apenas após análise dos resultados obtidos para esta condição, se optou pela utilização de Lecitina. Este capítulo está dividido em 4 subcapítulos que abordam os seguintes temas: análise do tamanho e índice de dispersividade das nanopartículas, análise do potencial Zeta, análise da durabilidade da funcionalização, análise da quantidade de fósforo total presente nos tecidos após funcionalização e teste da chama dos tecidos após funcionalização. Dentro de cada subcapítulo existem duas secções principais, uma para as nanopartículas com Ácido Fítico incorporado e outra para as nanopartículas com Lecitina incorporada. Por último dentro das subsecções existem pontos para as várias condições estudadas. 4.1 Tamanho, índice de dispersividade (Đ) e potencial Zeta (ζ) das nanopartículas de concentrado proteico de soro de leite com incorporação do agente funcional A medição do tamanho das nanopartículas de concentrado proteico de soro de leite com incorporação do agente funcional foi efetuada de acordo com o descrito em Materiais e Métodos, a partir do método DLS utilizando um aparelho Zetasizer. Este aparelho fornece resultados relativos ao tamanho médio da nanopartícula, em nm, à uniformidade de tamanhos de nanopartículas e ao valor de potencial Zeta, apresentado valores como os nas tabelas 11, 12, 13, 14, 15 e 16 presentes nos Anexos A e B. Para além dos valores do tamanho médio das nanopartículas fornece também gráficos e relatórios que ajuda a aferir a qualidade dos resultados., sendo que o mesmo pode ser identificado pelo valor de Đ. Quando um relatório indica que os valores não são confiáveis, tal significa que não foi possível obter um valor para o tamanho médio das partículas, não dando qualquer indicação sobre a amostra em si. Isto poderá ser devido a amostras com tamanhos demasiado dispersos, demasiado elevados ou uma mistura 36 dos dois fatores, entre muitos outros possíveis. Nestes casos, em que não se sabe nada sobre a amostra, não faz sentido medir o potencial Zeta. O potencial Zeta (ζ) é uma medida do potencial elétrico da superfície das partículas, que é influenciado por mudanças na interface com o meio externo, decorrente da dissociação de grupos funcionais presentes na superfície ou da adsorção de espécies iônicas do meio de dispersão (D. Attwood, Alexander Taylor Florence, 2003). A medida de potencial Zeta permite avaliar a estabilidade das dispersões coloidais. Elevados valores de ζ, acima de 25mV, positivos ou negativos, sugerem suspensões de nanopartículas mais estáveis, devido à repulsão entre as partículas que previne a sua agregação. A análise do potencial Zeta das soluções de nanopartículas de concentrado proteico de soro de leite com incorporação do agente funcional foi efetuada de acordo com o descrito em Materiais e Métodos, utilizando um aparelho Zetasizer. De salientar que apenas se realizou medições das amostras que após análise do tamanho médio das nanopartículas e respetiva Đ se constatou apresentarem populações consideradas monodispersas. 4.1.1 Nanopartículas de WPC ou WPI com incorporação de Ácido Fítico (PA) A formação de nanopartículas a partir de sonicação é uma técnica de encapsulação sendo geralmente definida como o processo de cobrir uma substância (núcleo) com diferentes materiais (invólucro) para produzir micro/nanopartículas, beneficiando da combinação das propriedades de diferentes tipos de materiais orgânicos e inorgânicos (Montazer & Harifi, 2018). Neste trabalho utiliza-se o termo encapsulação como um significado mais lato, em que a organização dos diferentes materiais não apresenta uma estrutura tão rígida. Neste caso, realizou-se a encapsulação de Ácido Fítico em partículas de WPC ou WPI, formando nanopartículas contendo os dois materiais, não se podendo afirmar que a composição do núcleo da partícula diverge da composição das camadas mais externas da mesma. Dependendo das condições testadas estas nanopartículas podem apresentar vários valores de diâmetros e de Đ, sendo que nos pontos i e ii serão apresentados todos os resultados obtidos relativamente ao tamanho, Đ e potencial Zeta das nanopartículas de WPC ou WPI com incorporação de Ácido Fítico. 37 i. Influência do pH Nas figuras 22, 23 e 24 encontram-se representados os resultados obtidos para os diferentes valores de pH testados para soluções de nanopartículas de WPC ou WPI com incorporação de Ácido Fítico, sendo estes valores médios pois todas as amostras são medidas em triplicado. Foram realizadas várias soluções com pH diferente para permitir compreender a influência do pH na formação de nanopartículas, estando estes valores representados nas figuras 22, 23 e 24: testou-se uma gama de valores de pH que variaram de 3,5 a 8. Não se mediu o potencial Zeta da amostra com pH 3,5 pois após medição do diâmetro das nanopartículas e respetivo Đ, constatou-se que a amostra era polidispersa. Em Anexo A são apresentadas as tabelas 12 e 14 com todos os resultados obtidos assim como os valores das soluções de controlo nas tabelas 11 e 13, sendo estas soluções de WPC ou WPI sem incorporação de Ácido Fítico com os mesmos valores de pH que estas soluções. Figura 22 Resultados obtidos a partir de DLS para a análise do tamanho das nanopartículas de WPC ou WPI, com uma concentração de 5% m/m, e incorporação de PA para diferentes valores de pH e respetivos valores de controlo, com respetivas barras de erro. pH 3,5 pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 Controlo 5% WPC 217 188 172 197 5% WPC+PA 2142 195 180 193 239 Controlo 5% WPI 1006 319 365 251 5% WPI+PA 406 558 195 521 415 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Tamanho médio das nanopartículas na amostra (nm) pH da amostra 38 Figura 23 Resultados obtidos a partir de DLS para a análise da Đ das nanopartículas de WPC ou WPI, com uma concentração de 5% m/m, e incorporação de PA para diferentes valores de pH e respetivos valores de controlo. A partir da análise das figuras 22 e 23 verifica-se que o pH da solução afeta significativamente o tamanho médio das nanopartículas assim como o índice de dispersividade. Para um pH de 3,5 a solução de WPC/PA apresenta um valor de Đ igual a 1. Isto significa que os valores dos tamanhos médios das partículas na amostra são demasiado dispersos, não sendo possível quantificá-lo. Assim o valor de 2142 nm apresentado não tem qualquer significado. Muito provavelmente tal deve-se ao facto de o valor de pH de 3,5 ser um valor muito baixo para esta proteína, que apresenta um valor de pI de 5,5; abaixo deste valor a proteína não é solúvel, e por isso precipita e forma agregados grandes. Relativamente aos restantes valores de pH estudados, para nanopartículas de WPC, verifica-se que pH 6 e pH 7 apresentam menor tamanho assim como um Đ menor, o que significa que foram os valores de pH em que a amostra se encontra com partículas de menor dimensão, e com uma distribuição de tamanhos mais uniforme. Para pH 5 e 8 a distribuição de tamanhos continua a apresentar valores considerados baixos. Não havendo um valor máximo de Đ para se considerar uma amostra como monodispersa, é comummente aceite que valores abaixo de 0,4 indicam amostras com uma distribuição apertada de tamanhos. Para alguns autores este limite pode mesmo chegar aos 0,7. Por último, as nanopartículas de WPI apresentam tamanhos entre 195 e 557 nm. Contudo todas as amostras apresentam valores de Đ acima de 0,4 podendo considerar-se que a amostra se encontra demasiado polidispersa, não sendo por isso possível falar em tamanho médio de partículas. Conclui-se então que relativamente ao tamanho das nanopartículas assim como do índice de dispersividade, o estudo de pH permitiu perceber que para valores muito baixos de pH, apesar de ocorrer formação de partículas estas apresentam uma grande variedade de tamanhos, não existindo então um pH 3,5 pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 Controlo 5% WPC 0,24 0,19 0,18 0,24 5% WPC+PA 1,00 0,23 0,18 0,16 0,26 Controlo 5% WPI 1,00 0,48 0,55 0,27 5% WPI+PA 0,59 0,70 0,58 0,78 0,50 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 Đ pH da amostra 39 tamanho médio de partículas levando a valores de Đ elevados. O mesmo se pode concluir para amostras de WPI, apresentando todos os valores de pH tamanhos de partículas bastante elevados, exceto para pH 5 mas, mesmo este apresenta um valor de Đ acima de 0,5. Figura 24 Resultados obtidos a partir de DLS para a análise do Potencial Zeta das nanopartículas de WPC com uma concentração de 5% m/m, e incorporação de PA para diferentes valores de pH e respetivos valores de controlo, com respetivas barras de erro. Analisando a figura 24 constata-se que o pH da solução tem influência no potencial Zeta das nanopartículas. É de salientar novamente que apenas se realizou medições das amostras que após análise do tamanho do diâmetro das nanopartículas e respetiva Đ se constatou apresentarem populações consideradas monodispersas. Os valores de potencial Zeta apresentados estão entre -24,1mV e -42,5mV, correspondendo o menor valor ao pH mais baixo, 5, e o maior valor ao pH neutro, 7. Todos os valores são negativos devido à presença de grupos fosfato que conferem uma carga negativa à nanopartícula. Pela análise da figura 24 é então possível verificar que as nanopartículas mais estáveis são as que se encontram a pH 7 e pH 8 pois são as que apresentam valores de potencial Zeta mais elevados, respetivamente -42,5mV e -42,3mV. Conclui-se então que os melhores valores de pH para formar nanopartículas são então pH 7 e pH 8 pois apresentam potencias Zeta elevados o que confere estabilidade à nanopartícula permitindo que não ocorram modificações da mesma ao longo do tempo, como por exemplo aumento do tamanho, e ao mesmo tempo são as soluções que apresentam nanopartículas com um menor tamanho e população monodispersa. pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 Controlo 5% WPC -17,4 -25,0 -29,3 -28,5 5% WPC+PA -24,1 -34,4 -42,5 -42,2 -50,0 -45,0 -40,0 -35,0 -30,0 -25,0 -20,0 -15,0 -10,0 -5,0 0,0 ζ/mV pH da amostra 40 ii. Influência da desnaturação da proteína de soro do leite Nas figuras 25 e 26 encontram-se representados os valores obtidos para nanopartículas de WPC com incorporação de Ácido Fítico de proteína não desnaturada e desnaturada, sendo estes valores médios pois todas as amostras são medidas em triplicado. Foram realizadas estas duas amostras para perceber se existia alguma influência da desnaturação da proteína de soro de leite na formação de nanopartículas de WPC com incorporação de Ácido Fítico. Realizaram-se amostras apenas com WPC e pH 8 pois a partir dos resultados obtidos no ponto i deste capítulo as nanopartículas de WPI apresentavam valores de tamanho médio e Đ muito elevados. Como se pode verificar nas figuras 22 e 23, as partículas obtidas a pH 8 não são as mais pequenas, nem as que apresentam valores de dispersividade menores. No entanto, em ensaios preliminares, verificou-se que estas amostras são as que maximizam a quantidade de fósforo no substrato têxtil funcionalizado, razão pela qual se optou por fazer os ensaios seguintes com as amostras obtidas a pH 8. Em Anexo A é apresentada a tabela 12 e 14 com todos os resultados obtidos para as duas amostras aqui apresentadas. A análise das figuras 25 e 26 permite concluir que a desnaturação da proteína de soro do leite leva à formação de uma população muito dispersa de partículas, com um tamanho de cerca de 300 nm e um índice de dispersividade de cerca de 0,8. Este valor de Đ tão elevado significa que a amostra se encontra bastante polidispersa permitindo a conclusão que ocorre formação de partículas, contudo com um tamanho muito variado não existindo assim um tamanho médio. Figura 25 Resultados obtidos a partir de DLS para a análise do tamanho das nanopartículas de WPC, com concentração de 5% m/m, e incorporação de PA para amostras com proteína não desnaturada (5% WPC+PA) e com desnaturada (5% WPC+PA+Etanol) e respetivas barras de erro. 5% WPC+PA 5% WPC+PA+Etanol pH 8 239 296 0 50 100 150 200 250 300 350 Tamanho médio das nanopartículas na amostra (nm) Amostra 41 Figura 26 Resultados obtidos a partir de DLS para a análise da Đ das nanopartículas de WPC, com concentração de 5% m/m, e incorporação de PA para amostras com proteína não desnaturada (5% WPC+PA) e com desnaturada (5% WPC+PA+Etanol). 4.1.2 Nanopartículas de WPC com incorporação de Lecitina (Lec) Neste caso realizou-se a encapsulação de Lecitina em partículas de WPC. Dependendo das condições testadas estas nanopartículas podem apresentar vários valores de tamanho, de Đ e de ζ sendo que nos pontos i, ii e iii serão apresentados todos os resultados obtidos relativamente ao tamanho, Đ e ζ das nanopartículas de WPC com incorporação de Lecitina. i. Influência da concentração de Lecitina Nas figuras 27, 28 e 29 encontram-se representados os valores obtidos para nanopartículas de WPC com incorporação de Lecitina para os dois valores de concentração de Lecitina estudados, 25% e 50% em relação à quantidade de WPC presente, sendo estes valores médios pois todas as amostras são medidas em triplicado. Foram realizadas amostras com estas duas concentrações para perceber se existia alguma influência da concentração de Lecitina na formação de nanopartículas. Em Anexo B são apresentadas as tabelas 15 e 16 com todos os resultados obtidos para diferentes condições testadas. 5% WPC+PA 5% WPC+PA+Etanol pH 8 0,26 0,76 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 0,80 Đ Amostra 48 Em Anexo C é apresentada a tabela 17 com todos os resultados obtidos para as duas amostras aqui apresentadas, antes e após os tecidos funcionalizados com as amostras sofrerem um ciclo de lavagem. Figura 31 Resultados obtidos a partir de Acid Orange para análise da durabilidade da funcionalização dos tecidos a uma lavagem, com as nanopartículas de WPC com a incorporação de PA, para proteína não desnaturada (5% WPC+PA) e desnaturada (5% WPC+PA+Etanol) e respetivas barras de erro. A partir da análise da figura 31 é possível notar que a desnaturação da proteína de soro do leite provoca um aumento da resistência à lavagem dos tecidos previamente funcionalizados, isto é, as nanopartículas de soro do leite com incorporação de Ácido Fítico ligam-se melhor ao tecido. A amostra com proteína desnaturada, 5% WPC+PA, apresenta um valor de delta de absorvância de 0,46 e a amostra de proteína não desnaturada, 5% WPC+PA+Etanol, de 0,72. A desnaturação da proteína leva a que esta se encontre mais exposta e possa ocorrer uma melhor ligação com o tecido de algodão provocando uma maior resistência às lavagens sendo por isso uma mais valia comparativamente com a amostra de proteína não desnaturada. 5% WPC+PA+2,5%Lig 5% WPC+PA+Etanol+2,5%Lig 1 Lav 0,46 0,72 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 0,80 DAbs Amostra 49 4.2.2 Nanopartículas de WPC com incorporação de Lecitina (Lec) i. Influência da concentração de Lecitina, de WPC e de ligante e da desnaturação da proteína de soro do leite Na figura 32 encontram-se representados os valores obtidos para nanopartículas de WPC com incorporação de Lecitina para os dois valores de concentração de Lecitina estudados, 25% e 50% em relação à percentagem de WPC presente, sendo estes valores médios pois todas as amostras são medidas em duplicado. São apresentados os valores registados após um ciclo de lavagem. Foram realizadas amostras com estas duas concentrações para perceber se existia alguma influência da concentração de Lecitina na durabilidade da funcionalização das nanopartículas de soro do leite com incorporação de Lecitina. Em Anexo D é apresentada a tabela 18 com todos os resultados obtidos para diferentes condições testadas, antes e após os tecidos funcionalizados com as amostras sofrerem um ciclo de lavagem. Figura 32 Resultados obtidos a partir de Acid Orange para análise da durabilidade da funcionalização dos tecidos a uma lavagem, com as nanopartículas de WPC com a incorporação de Lec, para as diferentes condições testadas e respetivas barras de erro. Observando a figura 32 é possível constatar que a concentração de Lecitina tem influência na durabilidade da funcionalização de nanopartículas de soro do leite com incorporação de Lecitina, mas esta influência está intimamente relacionada com outros fatores. 5% WPC+2,5% Lig 5% WPC+Etanol*+2,5% Lig 10% WPC+Etanol*+2,5% Lig 10% WPC+Etanol*+5% Lig 25% Lec 0,63 0,65 0,88 0,85 50% Lec 0,78 0,80 0,72 0,72 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 0,80 0,90 1,00 DAbs Amostra 50 Para valores de WPC mais baixos, 5%, a concentração de Lec tem uma influência positiva na durabilidade do acabamento. Por outro lado, para a maior concentração de WPC, 10%, a concentração de Lecitina apresenta uma influência negativa na durabilidade da funcionalização. Por outro lado, as amostras com concentração de 50% de Lecitina apresentam valores de deltas de absorvância bastante uniformes para todas as condições testadas, variando entre 0,72 e 0,80, o que significa que para os valores mais elevados de Lecitina, a resistência à lavagem do acabamento é quase independente dos outros fatores. Analisando a figura 32 é possível inferir que, relativamente à concentração de WPC esta tem influência na durabilidade da funcionalização dos tecidos com as amostras de nanopartículas de soro do leite com incorporação de Lecitina. Verifica-se que para uma concentração de Lecitina de 25% a amostra apresenta maior resistência à lavagem para uma concentração de WPC de 10%, correspondendo a um valor de delta de absorvância de 0,88. Contudo, o mesmo não se verifica para uma concentração de Lecitina de 50% pois a amostra que apresenta maior resistência à lavagem, nesta condição, é a amostra com uma concentração de WPC de 5%, correspondendo a um valor de delta de absorvância de 0,80. As restantes amostras apresentam os seguintes valores de absorvância: para concentração de 25% de Lecitina e 5% de WPC verifica-se um valor de 0,65 e para uma concentração de 50% de Lecitina e 10% de WPC verifica-se um valor de 0,72. Já a concentração de ligante utilizado não tem qualquer influência na durabilidade da funcionalização de tecidos com nanopartículas de soro do leite com Lecitina incorporada. Por último, atesta-se que a desnaturação da proteína de soro do leite também não tem influência na durabilidade da funcionalização de tecidos com nanopartículas de soro do leite com Lecitina incorporada. Conclui-se então que a concentração de Lecitina presente nas nanopartículas é o fator que tem maior influência na durabilidade da funcionalização sendo que as amostras que apresentam maior durabilidade, isto é, maior resistência a um ciclo de lavagem são amostras com 25% de concentração de Lecitina. 51 4.3 Determinação do fósforo total presente nos tecidos após funcionalização com as nanopartículas de concentrado proteico de soro de leite com incorporação do agente funcional Após a funcionalização dos tecidos pelo método de impregnação-secagem foi necessário verificar a presença de fósforo nas amostras das diferentes soluções de nanopartículas de WPC e o substrato têxtil. Todas as amostras sofreram um ciclo de lavagem para se verificar a permanência da quantidade de fósforo após lavagem e procedeu-se à determinação do fósforo total nos tecidos previamente funcionalizados, antes e após o ciclo de lavagem. Seria de prever a existência de fósforo em todos os tecidos, antes e após lavagem, pois todos os tecidos foram funcionalizados com amostras que continham fósforo e os resultados obtidos para a durabilidade da funcionalização também permitiram inferir que existia alguma durabilidade após um ciclo de lavagem. Para a realização da quantificação de fósforo presente nas amostras de tecido, previamente funcionalizadas, foi necessário adaptar a Norma Portuguesa 1842-1:2008, Carnes e produtos - Determinação total de fósforo . No final de todo o procedimento descrito anteriormente no capítulo Materiais e Métodos mediramse as absorvâncias no espetrofotómetro UV-visível, a um comprimento de onda de 430nm, de todas as soluções, em duplicado. De salientar que se procedeu sempre à leitura da absorvância duma das soluções padrão aquando da realização de novas leituras de soluções. Após a realização da medição de absorvâncias foi calculado o valor de percentagem de fósforo presente no tecido, sendo estes cálculos realizados a partir do descrito em Anexo F e apresentados nas figuras dos pontos 4.3.1 e 4.3.2. De salientar que apenas se realizou funcionalização dos tecidos com as amostras que apresentaram melhores resultados tanto de tamanho de diâmetro como de potencial Zeta e apenas se procedeu à determinação da quantidade de fósforo total das amostras que apresentaram bons resultados na determinação da resistência à lavagem pelo método de Acid Orange. 4.3.1 Nanopartículas de WPC com incorporação de Ácido Fítico (PA) i. Influência do pH Na figura 33 encontram-se representados os resultados obtidos para os diferentes valores de pH testados para soluções de nanopartículas de WPC com incorporação de Ácido Fítico, sendo estes valores 52 médios pois para todas as amostras se realizaram duas soluções e foram medidas as absorvâncias destas soluções em duplicado. Foram realizadas várias soluções com pH diferente para permitir compreender a influência do pH na formação de nanopartículas tendo-se então realizado um estudo de pH, representado nas figuras 22 e 23, testando-se uma vasta gama de valores de pH, desde ácidos (3,5; 5; 6), passando pelo neutro (7) e um básico (8) sendo que após análise do tamanho médio das nanopartículas e respetivo potencial Zeta assim como da durabilidade da funcionalização pelo método de Acid Orange se concluiu que as amostras com pH 7 e 8 apresentavam os melhores resultados, relativamente a todos os parâmetros, para se proceder à determinação de fósforo total das mesmas. Em Anexo F é apresentada a tabela 21 com todos os resultados obtidos assim como os valores das amostras controlo que são amostras que sofreram as mesmas condições de funcionalização, mas apenas com ligante, sem adição de soluções de nanopartículas de WPC com incorporação de Ácido Fítico. Os resultados apresentados para as duas amostras aqui representadas são para antes e após os tecidos funcionalizados com as amostras sofrerem um ciclo de lavagem. Figura 33 Resultados obtidos a partir da adaptação da Norma Portuguesa 1842-1:2008 para determinação do fósforo total presente nos tecidos após funcionalização com as nanopartículas de WPC com a incorporação de PA, para diferentes valores de pH testados e respetivas barras de erro. A análise da figura 33 permite inferir que os tecidos funcionalizados com nanopartículas de WPC com incorporação de Ácido Fítico contém fósforo, contudo apenas antes da realização de um ciclo de lavagem. 5%WPC+PA pH=7 5%WPC+PA pH=8 0 Lavagens 0,183 0,101 1 Lavagem 0,007 0,004 0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250 Percentagem de fósforo no tecido Amostra 53 A amostra com menor pH, 5% WPC+PA pH=7, apresenta uma maior percentagem de fósforo presente comparativamente com a amostra de maior valor de pH, 5% WPC+PA pH=8 antes da lavagem. As percentagens obtidas antes da lavagem são de 0,183 e 0,101 respetivamente para pH 7 e pH 8, sendo que após a lavagem estas percentagens descem para valores próximos de zero sendo de 0,007 e 0,004 o que comprova que a funcionalização dos tecidos não resiste a um ciclo de lavagem. Conclui-se que o pH tem influência na quantidade de fósforo presente nos tecidos após funcionalização e que após um ciclo de lavagem praticamente todo o fósforo presente antes da lavagem desaparece. ii. Influência da desnaturação da proteína de soro do leite Na figura 34 encontram-se representados os valores obtidos para nanopartículas de WPC com incorporação de Ácido Fítico de proteína não desnaturada e desnaturada, sendo estes valores médios pois para todas as amostras se realizaram duas soluções e foram medidas as absorvâncias destas soluções em duplicado. São apresentados os valores registados antes e após um ciclo de lavagem. Foram realizadas estas duas amostras para perceber se existia alguma influência da desnaturação da proteína de soro de leite na quantidade de fósforo presente após funcionalização das nanopartículas de soro do leite com incorporação de Ácido Fítico. Em Anexo F é apresentada a tabela 21 com todos os resultados obtidos para as duas amostras aqui apresentadas, antes e após os tecidos funcionalizados com as amostras sofrerem um ciclo de lavagem. A figura 34 permite inferir que a desnaturação da proteína de soro do leite provoca um aumento da percentagem de fósforo presente no tecido após funcionalização do mesmo com nanopartículas de soro do leite com incorporação de Ácido Fítico. Para a amostra de proteína não desnaturada, antes da realização do ciclo de lavagem, o tecido apresenta uma percentagem de fósforo total de 0,101. Contudo após lavagem esta concentração diminui significativamente para um valor muito próximo de zero, o que leva à conclusão que todo o fósforo presente desapareceu durante a lavagem. As partículas preparadas nestas condições apresentaram resistência à lavagem pelo método Acid Orange, o que significa que depois de um ciclo de lavagem a proteína continua ligada ao têxtil, mas o fósforo, maioritariamente PA, não apresenta resistência à lavagem. Relativamente à amostra de proteína desnaturada, previamente ao ciclo de lavagem o tecido apresenta uma percentagem de fósforo total de 0,200%, sendo quase o dobro da percentagem obtida, nas mesmas condições, para a amostra de proteína não desnaturada. Todavia também esta amostra 54 após lavagem apresenta uma percentagem de fósforo próxima de zero, uma diminuição de cerca de 98,5% comparativamente com a amostra que não sofreu lavagem, levando à conclusão que mesmo com desnaturação de proteína o fósforo presente nas partículas não resiste às lavagens. Conclui-se que a desnaturação da proteína de soro do leite tem influência na percentagem de fósforo total presente nos tecidos funcionalizados com nanopartículas de soro do leite com incorporação de Ácido Fítico, mas apenas nos tecidos que não sofreram um ciclo de lavagem o que leva a concluir que as nanopartículas de soro do leite não são a melhor opção para encapsular fósforo e sua aplicação num substrato têxtil, principalmente para tecidos que necessitem de ser submetidos a ciclos de lavagem durante o seu ciclo de vida. Figura 34 Resultados obtidos a partir da adaptação da Norma Portuguesa 1842-1:2008 para determinação do fósforo total presente nos tecidos após funcionalização com as nanopartículas de WPC com a incorporação de PA, para proteína não desnaturada (5% WPC+PA) e desnaturada (5% WPC+PA+Etanol) e respetivas barras de erro. 4.3.2 Nanopartículas de WPC com incorporação de Lecitina (Lec) i. Influência da concentração de Lecitina Nas figuras 35 e 36 encontram-se representados os valores obtidos para nanopartículas de WPC com incorporação de Lecitina para os dois valores de concentração de Lecitina estudados, 25% e 50% em relação à percentagem de WPC presente, sendo estes valores médios pois para todas as amostras se realizaram duas soluções e foram medidas as absorvâncias destas soluções em duplicado. São apresentados os valores registados antes, figura 35, e após um ciclo de lavagem, figura 36. 5%WPC+PA 5%WPC+PA+Etanol 0 Lavagens 0,101 0,200 1 Lavagem 0,004 0,003 0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250 Percentagem de fósforo no tecido Amostra 55 Foram realizadas amostras com estas duas concentrações para perceber se existia alguma influência da concentração de Lecitina na quantidade de fósforo presente após funcionalização das nanopartículas de soro do leite com incorporação de Lecitina. Em Anexo G é apresentada a tabela 22 com todos os resultados obtidos para diferentes condições testadas, antes e após os tecidos funcionalizados com as amostras sofrerem um ciclo de lavagem. A partir da análise das figuras 35 e 36 observou-se que a concentração de Lecitina tem influência na quantidade de fósforo presente no tecido após funcionalização, antes e após sofrer um ciclo de lavagem. Os valores obtidos para a quantidade de fósforo total das amostras que não sofreram um ciclo de lavagem estão representados na figura 35 que permite retirar que para uma concentração de Lecitina de 50% a quantidade de fósforo presente é maior para todas as amostras apresentado um maior valor a amostra com maior quantidade de concentração de WPC com proteína desnaturada e menor concentração de ligante, com um valor de 0,151%. Seria de esperar maiores valores de percentagem para as amostras com maior concentração de Lecitina pois como a Lecitina contém fósforo uma concentração mais leva desta é diretamente proporcional a uma maior quantidade de fósforo total presente nos tecidos. A amostra que apresenta menor quantidade de fósforo é a que tem uma concentração de 25% de Lecitina, 5% de WPC com proteína desnaturada e uma concentração de ligante de 2,5%. Relativamente aos valores obtidos de percentagem de fósforo total para as amostras após sofrerem um ciclo de lavagem estes encontram-se representados na figura 36 permitindo averiguar que estas amostras apresentam alguma resistência à lavagem pois ainda apresentam alguma quantidade de fósforo presente. A amostra que apresenta uma maior percentagem de fósforo total é a amostra com 50% de Lecitina, 10% de WPC com proteína desnaturada e 5% de ligante. Concluiu-se que tanto antes como após um ciclo de lavagem para maiores concentrações de Lecitina existe uma maior quantidade de fósforo total presente nos tecidos após funcionalização com nanopartículas de soro do leite com incorporação de Lecitina, para as várias condições testadas. 56 ii. Influência da concentração de WPC Observando novamente as figuras 35 e 36 é possível confirmar que a concentração de WPC tem influência na percentagem de fósforo presente nos tecidos após funcionalização. Na figura 35 é possível observar que para uma maior concentração de WPC, 10%, existe uma maior percentagem de fósforo presente nos tecidos, tanto para uma concentração de 25% como de 50% de Lecitina. Relativamente aos valores representados na figura 36, estes correspondem aos resultados obtidos após 1 ciclo de lavagem, sendo a sua análise análoga aos valores obtidos antes da lavagem, isto é, a amostra que apresenta maior concentração de fósforo é a amostra com maior concentração de WPC e de Lecitina, correspondendo a um valor de 0,048%, o que leva à conclusão que após lavagem a quantidade de fósforo diminuiu cerca de 68% comparativamente com o tecido sem lavagem. Concluiu-se assim que a concentração de WPC presente na amostra tem influência na percentagem de fósforo presente, antes e após um ciclo de lavagem. iii. Influência da desnaturação da proteína de soro do leite As figuras 35 e 36 permitem também verificar que a desnaturação da proteína de soro do leite tem influência na percentagem de fósforo total presente nos tecidos após funcionalização com nanopartículas de soro do leite com incorporação de Lecitina. A figura 35 apresenta os valores obtidos para os tecidos funcionalizados sem sofrerem um ciclo de lavagem. Analisando estes resultados é possível observar que a desnaturação da proteína de soro do leite leva a uma ligeira diminuição da percentagem de fósforo total presente nos tecidos, quer para a concentração de 25% quer para a de 50% de Lecitina, tendo valores respetivos de 0,043% e 0,072% para proteína não desnaturada e de 0,034% e 0,058% para proteína desnaturada. Estes resultados indicam que para tecidos que não sofram ciclos de lavagem é preferível usar nanopartículas com proteína não desnaturada. A figura 36 apresenta os valores obtidos para os tecidos funcionalizados após sofrerem um ciclo de lavagem e o mesmo se verifica comparativamente com os tecidos antes da lavagem, maiores valores de percentagem de fósforo para os tecidos funcionalizados com proteína não desnaturada. Conclui-se então que a desnaturação da proteína de soro do leite provoca uma diminuição da percentagem de fósforo total presente, antes e após os tecidos funcionalizados sofrerem um ciclo de lavagem. 57 Figura 35 Resultados obtidos a partir da adaptação da Norma Portuguesa 1842-1:2008 para determinação do fósforo total presente nos tecidos após funcionalização com as nanopartículas de WPC com a incorporação de Lec, para diferentes condições testadas e sem lavagem e respetivas barras de erro. Figura 36 Resultados obtidos a partir da adaptação da Norma Portuguesa 1842-1:2008 para determinação do fósforo total presente nos tecidos após funcionalização com as nanopartículas de WPC com a incorporação de Lec, para diferentes condições testadas e após 1 lavagem e respetivas barras de erro. iv. Influência da concentração de ligante Analisando novamente as figuras 35 e 36 aufere-se que a percentagem de ligante utilizada tem influência na percentagem de fósforo total presente nos tecidos após serem funcionalizados com nanopartículas de soro do leite com incorporação de Lecitina, principalmente depois de um ciclo de lavagem. 5% WPC+2,5% Lig - 0L 5% WPC+Etanol*+2,5% Lig - 0L 10% WPC+Etanol*+2,5% Lig - 0L 10% WPC+Etanol*+5% Lig - 0L 25% Lec 0,043 0,034 0,083 0,098 50% Lec 0,072 0,058 0,151 0,144 0,000 0,020 0,040 0,060 0,080 0,100 0,120 0,140 0,160 0,180 Percentagem de fósforo no tecido Amostra 5% WPC+2,5% Lig - 1L 5% WPC+Etanol*+2,5% Lig - 1L 10% WPC+Etanol*+2,5% Lig - 1L 10% WPC+Etanol*+5% Lig - 1L 25% Lec 0,021 0,016 0,039 0,044 50% Lec 0,029 0,019 0,048 0,060 0,000 0,020 0,040 0,060 0,080 0,100 0,120 0,140 0,160 0,180 Percentagemde fósforo no tecido Amostra 64 1 40 Não 10%WPC+Etanol* +2,5%Lig 0 29 Sim 1 36 Sim 10%WPC+Etanol* +5%Lig 0 29 Sim 1 44 Sim A partir da análise da tabela 10 observa-se que os tecidos funcionalizados com as amostras de nanopartículas de soro do leite com incorporação de Lecitina, antes de sofrerem um ciclo de lavagem, apresentam alguma retardança à chama, levando à formação de cinzas e apenas à combustão parcial do tecido. Para além disso, existem amostras que mesmo após sofrerem um ciclo de lavagem apresentam propriedades de retardança à chama, quer para a concentração mais baixa de Lecitina, 25%, quer para a mais alta, 50%. Para a menor concentração de Lecitina, 25%, as amostras antes da lavagem, apresentam boas propriedades de retardança à chama, com formação de cinzas e combustão parcial do tecido 65 funcionalizado, sendo que a amostra com 10% de WPC, com proteína desnaturada e uma concentração de ligante de 5% apresenta também propriedades de retardança à chama após a um ciclo de lavagem. Estes resultados demonstram que para uma maior concentração de proteína de soro do leite desnaturada e uma maior concentração de ligante, o fósforo presente nos tecidos, que apresenta percentagens mais elevadas nos tecidos, como apresentado no capítulo 4.4 “Determinação do fósforo total presente nos tecidos após funcionalização com as nanopartículas de concentrado proteico de soro de leite com incorporação do agente funcional”, confere ao tecido maiores propriedades de retardança à chama. Relativamente à maior concentração de Lecitina estudada, 50%, existem duas condições que apresentam boas propriedades de retardança à chama apenas antes da lavagem, sendo estas as amostras com uma concentração de WPC de 5%, tanto com proteína de soro do leite não desnaturada como com proteína desnaturada e uma concentração de ligante de 2,5%. Já as restantes amostras com uma concentração de WPC de 10%, proteína desnaturada e concentrações de ligante de 2,5% e 5% apresentam propriedades de retardança à chama antes e após a realização de um ciclo de lavagem, comprovando também os resultados obtidos no capítulo 4.4 “Determinação do fósforo total presente nos tecidos após funcionalização com as nanopartículas de concentrado proteico de soro de leite com incorporação do agente funcional”, pois estes eram os tecidos que apresentavam maior percentagem de fósforo total. Concluiu-se assim que as amostras de nanopartículas de soro do leite com incorporação de Lecitina que conferem maiores propriedades de retardança à chama são as amostras com maior concentração de WPC, Lecitina, ligante e com proteína desnaturada, comprovando que quanto maior a quantidade de fósforo presente nos tecidos maior é a retardança à chama dos mesmos. 66 5. CONCLUSÕES FINAIS Ao longo de todo o projeto são várias as conclusões retiradas, mas a conclusão principal é que as nanopartículas de soro do leite com a incorporação de agentes funcionais ricos em fósforo, como o Ácido fítico e Lecitina, conferem propriedades de retardança à chama a tecidos 100% algodão. Quanto ao tamanho médio assim como o seu respetivo índice de dispersividade para as nanopartículas de soro do leite com incorporação de Ácido Fítico o estudo de pH permitiu perceber que para valores muito baixos de pH, apesar de ocorrer formação de partículas estas apresentam uma grande variedade de tamanhos, não se podendo falar então de um tamanho médio de partículas, levando a valores de Đ elevados. O mesmo se pode concluir para amostras de WPI, apresentando todos os valores de pH tamanhos de partículas bastante elevados, exceto para pH 5, mas mesmo este apresenta um valor de Đ acima de 0,5. A partir do potencial Zeta destas nanopartículas foi possível inferir que os melhores valores de pH para formar nanopartículas são então pH 7 e pH 8 pois apresentam potencias Zeta elevados, o que confere estabilidade à nanopartícula permitindo que não ocorram modificações da mesma ao longo do tempo, como por exemplo aumento do tamanho, e ao mesmo tempo são as soluções que apresentam nanopartículas com um menor tamanho e população monodispersa. Foi também possível concluir que a desnaturação da proteína de soro do leite leva a que não ocorra formação de nanopartículas, mas sim apenas de partículas com um tamanho de cerca de 300 nm e um índice de dispersividade de cerca de 0,8. Este valor de Đ tão elevado significa que a amostra se encontra bastante polidispersa permitindo a conclusão que ocorre formação de partículas, contudo com um tamanho muito variado não existindo assim um tamanho médio. As nanopartículas de soro do leite com incorporação de Lecitina, para uma concentração de 25% Lecitina são um pouco maiores comparativamente a uma concentração de 50%. Concluiu-se que a concentração de Lecitina não tem grande influência no Đ pois esta apresenta uma gama de valores entre 0,2 e 0,3 e tem também influência no potencial Zeta das nanopartículas sendo que o seu aumento provoca um aumento, em módulo, do potencial Zeta que se traduz num aumento de estabilidade das nanopartículas. Para uma concentração de WPC mais elevada, neste caso de 10%, as nanopartículas apresentam tamanhos maiores do que para uma concentração mais baixa, de 5%, assim como valores de Đ e a desnaturação da proteína de soro do leite influência o tamanho das nanopartículas, apresentando maior diâmetro as nanopartículas com proteína desnaturada. Todavia a desnaturação da proteína não apresenta grande influência no índice de dispersividade, mas provoca um aumento do 67 potencial Zeta das nanopartículas o que significa um aumento da estabilidade das mesmas. Ainda relativamente à concentração de WPC, foi possível inferir que esta tem influência no potencial Zeta das nanopartículas, sendo que para menores valores de concentração de WPC, os valores de potencial Zeta são maiores e superiores, em módulo, a 25 mV significando que as nanopartículas com esta concentração são mais estáveis do que com concentração mais elevada de WPC. Através da realização do método Acid Orange foi possível determinar durabilidade da funcionalização dos tecidos. Concluiu-se, para as nanopartículas de soro do leite com incorporação de Ácido Fítico, o pH tem influência na resistência à lavagem da funcionalização e pH neutro não é o valor de pH mais indicado, mas sim pH 6 ou 8. Desnaturação prévia da proteína leva também a uma maior resistência. Relativamente às nanopartículas de soro do leite com incorporação de Lecitina a concentração de Lecitina presente nas nanopartículas é o fator que tem maior influência na durabilidade da funcionalização sendo que as amostras que apresentam maior durabilidade, isto é, maior resistência a um ciclo de lavagem, são amostras com 25% de concentração de Lecitina e que a desnaturação da proteína de soro do leite, tal como a concentração de ligante, não tem influência na durabilidade da funcionalização de tecidos com nanopartículas de soro do leite com Lecitina incorporada. A determinação do fósforo total presente nos tecidos permitiu concluir para as nanopartículas de soro do leite com incorporação de Ácido Fítico, que o pH tem influência na quantidade de fósforo presente nos tecidos após funcionalização e que após um ciclo de lavagem praticamente todo o fósforo presente antes da lavagem desaparece. A desnaturação da proteína de soro do leite tem influência também na percentagem de fósforo total presente, mas apenas nos tecidos que não sofreram um ciclo de lavagem o que leva a concluir que as nanopartículas de soro do leite não são a melhor opção para encapsular fósforo e sua aplicação num substrato têxtil, principalmente para tecidos que necessitem de ser submetidos a ciclos de lavagem durante o seu ciclo de vida. Relativamente às nanopartículas de soro do leite com incorporação de Lecitina concluiu-se que tanto antes como após um ciclo de lavagem para maiores concentrações de Lecitina existe uma maior quantidade de fósforo total presente nos tecidos para as várias condições testadas. A concentração de WPC presente na amostra tem também influência na percentagem de fósforo presente, antes e após um ciclo de lavagem, e para maiores concentrações de WPC e Lecitina existe maior quantidade de fósforo. Relativamente à desnaturação da proteína de soro do leite esta provoca uma diminuição da percentagem de fósforo total presente, antes e após os tecidos funcionalizados com nanopartículas com 5% de WPC e 25% ou 50% de Lecitina e 2,5% de ligante sofrerem um ciclo de lavagem. Por último relativamente a este assunto, auferiu-se que o aumento da concentração de ligante leva a um aumento da percentagem de 68 fósforo total presente nos tecidos após funcionalização com nanopartículas com 10% de WPC, com proteína desnaturada e concentrações de 25% ou 50% de Lecitina. A medição das propriedades de propagação da chama de amostras de tecido orientadas verticalmente levou à conclusão para nanopartículas de soro do leite com incorporação de Ácido Fítico que estas não são a melhor opção para proporcionar aos tecidos propriedades de retardança à chama. Contudo para os tecidos que não sofram ciclos de lavagem estas partículas podem ser uma opção promissora. Já relativamente as amostras de nanopartículas de soro do leite com incorporação de Lecitina concluiu-se que as amostras que conferem maiores propriedades de retardança à chama são as amostras com maior concentração de WPC, Lecitina, ligante e com proteína desnaturada, comprovando que quanto maior a quantidade de fósforo presente nos tecidos maior é o potencial de retardança à chama dos mesmos. 69 BIBLIOGRAFIA Alongi, J., Carletto, R. A., Bosco, F., Carosio, F., Di Blasio, A., Cuttica, F., Malucelli, G. (2014). Caseins and hydrophobins as novel green flame retardants for cotton fabrics. Polymer Degradation and Stability , 99 (1), 111–117. ANILACT. (2018a). “Leite – Produto Nacional De Excelência”. Consultado a 26 de março, 2019, em www.anilact.pt/info/actual/sector/item/1854-leite-produto-nacional-de-excelencia ANILACT. (2018b). Produção de leite mantém volume em 2017. 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Tabela 11 Valores de tamanho do diâmetro e respetivo índice de dispersividade (Đ) obtidos a partir de DLS das nanopartículas de soro do leite apenas com acerto de pH, sem incorporação de Ácido Fítico Nome da amostra pH Tamanho do diâmetro (nm) Tamanho médio Đ Đ média 5% WPC Controlo 5 218,8 216,8 0,235 0,243 212,8 0,239 218,8 0,256 6 186,6 188,3 0,197 0,186 187,6 0,161 190,8 0,199 7 171,8 172,2 0,196 0,175 172,0 0,159 172,8 0,17 8 195,2 196,7 0,263 0,238 197,0 0,246 197,9 0,206 5% WPI Controlo 5 1002 1005,9 1,000 1,000 1049 1,000 966,8 1,000 6 325,0 319,1 0,48 0,475 310,3 0,45 321,9 0,496 7 393,0 365,1 0,598 0,549 372,1 0,57 330,2 0,479 8 251,5 250,6 0,244 0,269 252,7 0,281 247,7 0,282 73 A tabela 12 apresenta os valores obtidos a partir de DLS para todas as amostras de nanopartículas de soro do leite com incorporação de Ácido Fítico. Tabela 12 Valores de tamanho do diâmetro e respetivo índice de dispersividade (Đ) obtidos a partir de DLS das nanopartículas de soro do leite com incorporação de Ácido Fítico de todas as amostras Nome da amostra pH Tamanho do diâmetro (nm) Tamanho médio Đ Đ média 5% WPC+PA 3,5 2713,0 2141,5 1,000 1,000 1570,0 1,000 5 202,3 195,3 0,323 0,229 192,1 0,193 191,4 0,17 6 180,3 180,3 0,217 0,177 180,4 0,164 180,1 0,150 7 194,2 193,2 0,197 0,164 191,1 0,149 194,3 0,147 8 238,3 239,2 0,259 0,261 237,9 0,262 241,3 0,263 5% WPI+PA 3,5 462,8 406,0 0,696 0,592 399,5 0,573 355,6 0,508 5 976,7 557,8 1,000 0,698 413,4 0,642 283,3 0,452 6 371,3 195,3 0,619 0,575 381,7 0,624 290,7 0,483 7 627,9 521,3 0,949 0,782 504,7 0,757 431,2 0,641 8 419,3 415,3 0,509 0,499 416,2 0,534 410,3 0,454 5% WPI+PA+ETANOL 8 303,2 295,8 0,786 0,760 311,9 0,714 272,3 0,781 São agora apresentados todos os resultados obtidos ao longo do projeto para o potencial Zeta das nanopartículas de soro do leite com incorporação de Ácido Fítico. De salientar que apenas se mediu o 80 ANEXO E – DETERMINAÇÃO DO FÓSFORO TOTAL PRESENTE NOS TECIDOS APÓS FUNCIONALIZAÇÃO COM AS NANOPARTÍCULAS DE CONCENTRADO PROTEICO DE SORO DE LEITE COM INCORPORAÇÃO DE AGENTE FUNCIONAL – CURVAS DE CALIBRAÇÃO Neste anexo são apresentados valores das absorvâncias medidas e respetivas curvas de calibração para concentrações de fósforo conhecidas de modo a posteriormente determinar as percentagens de fósforo total presente nos tecidos. Realizaram-se duas curvas de calibração, uma com as concentrações de 10μg, 20μg, 30μg, 40μg, 50μg e 60μg de pentóxido de fósforo por mililitro e outra com a concentração de 5μg, 10μg, 15μg, 20μg, 25μg e 30μg de pentóxido de fósforo por mililitro. Esta última foi necessária para se ter uma maior sensibilidade para valores de baixa concentração de fósforo. Estabeleceu-se a curva de calibração marcando os valores das absorvâncias medidas, corrigidas com o valor do ensaio em branco, contra as concentrações das soluções padrão de fosfato, obtendo os valores apresentados nas tabelas 19 e 20, para as primeiras e segundas concentrações respetivamente. As curvas de calibração assim como respetivas retas encontram-se representadas nas figuras 37 e 38. As leituras das absorvâncias de cada solução foram obtidas através de espetroscopia ultravioletavisível a um comprimento de onda de 430nm ± 2nm. Os valores de DAbs foram calculados de acordo com a equação 3. ∆𝐴𝑏𝑠=𝑀é𝑑𝑖𝑎𝐴𝑏𝑠34.5013 −𝑀é𝑑𝑖𝑎𝐴𝑏𝑠B13/-. Equação 3 81 Tabela 19 Valores das absorvâncias medidas, através de espetroscopia ultravioleta-visível a um comprimento de onda de 430nm ± 2nm, corrigidas com o valor do ensaio em branco, contra as concentrações das soluções padrão de fosfato Concentração da amostra ( 𝜇 g/mL) Abs Média Abs D Abs 0 (Branco) 0,043 0,043 0 0,042 10 0,233 0,235 0,193 0,237 20 0,346 0,347 0,304 0,347 30 0,586 0,589 0,547 0,592 40 0,739 0,740 0,698 0,741 50 0,955 0,965 0,923 0,975 60 1,045 1,045 1,003 1,045 Figura 37 Curva de calibração obtida a partir dos valores das absorvâncias medidas, através de espetroscopia ultravioletavisível a um comprimento de onda de 430nm ± 2nm, corrigidas com o valor do ensaio em branco, contra as concentrações das soluções padrão de fosfato. y = 0,0174x + 0,0028 R² = 0,9914 010 20 30 40 50 60 70 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 Concentração (𝜇g/mL) DAbs 82 Tabela 20 Valores das absorvâncias medidas, através de espetroscopia ultravioleta-visível a um comprimento de onda de 430nm ± 2nm, corrigidas com o valor do ensaio em branco, contra as concentrações das soluções padrão de fosfato Concentração da amostra ( 𝜇 g/mL) Abs Média Abs D Abs 0 (Branco) 0,047 0,047 0 0,047 5 0,151 0,152 0,105 0,152 10 0,243 0,243 0,196 0,243 15 0,341 0,339 0,292 0,337 20 0,424 0,424 0,377 0,424 25 0,519 0,519 0,472 0,519 30 0,625 0,625 0,578 0,624 Figura 38 Curva de calibração obtida a partir dos valores das absorvâncias medidas, através de espetroscopia ultravioletavisível a um comprimento de onda de 430nm ± 2nm, corrigidas com o valor do ensaio em branco, contra as concentrações das soluções padrão de fosfato. y = 0,0189x + 0,0047 R² = 0,9994 0 5 10 15 20 25 30 35 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 Concentração (𝜇g/mL) DAbs 83 ANEXO F – DETERMINAÇÃO DO FÓSFORO TOTAL PRESENTE NOS TECIDOS APÓS FUNCIONALIZAÇÃO COM AS NANOPARTÍCULAS DE CONCENTRADO PROTEICO DE SORO DE LEITE COM INCORPORAÇÃO DE ÁCIDO FÍTICO Neste anexo são apresentados todos os resultados obtidos ao longo do projeto para a percentagem de fósforo total presente nos tecidos após funcionalização com nanopartículas de soro do leite com incorporação de Ácido Fítico. Os resultados aqui representados foram obtidos a partir da adaptação da Norma Portuguesa 18421:2008, Carnes e produtos - Determinação total de fósforo . No final de todo o procedimento descrito anteriormente no capítulo Materiais e Métodos mediram-se as absorvâncias no espetrofotómetro UVvisível, a um comprimento de onda de 430nm ± 2nm, de todas as soluções, em duplicado. Após obtenção das absorvâncias para cada amostra os resultados foram tratados da seguinte forma: 1. Após obter as absorvâncias de todas as amostras, sendo que todas as amostras foram realizadas em duplicado e posteriormente as absorvâncias medidas em duplicado, calculou-se a média das mesmas. 2. A partir da média das absorvâncias calculou-se a concentração de fósforo a que corresponde usando a reta obtida na curva de calibração de menores concentrações, de fósforo, y = 0,0189x + 0,0047, em ordem a x. 3. Como as cinzas obtidas após incineração dos tecidos foram submetidas a várias diluições foi necessário calcular as concentrações intermédias até chegar a concentração final, isto é, após obter a concentração de fósforo na amostra, como descrito no ponto 2, esta é multiplicada por 50 e posteriormente dividida por 10. 4. Após se obter o valor da concentração de fósforo na solução intermédia, determina-se a massa de fósforo nas cinzas, M de P nas cinzas, a partir da equação 4. 5. A massa obtida no ponto 4 é posteriormente corrigida com a massa correspondente ao controlo, M. 6. Por último, determina-se a percentagem total de fósforo presente no tecido, %P no tecido, a partir da equação 5. 𝑀<𝑑𝑒<𝑃<𝑛𝑎𝑠<𝑐𝑖𝑛𝑧𝑎𝑠=𝐶.𝑠𝑜𝑙.𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑚é𝑑𝑖𝑎×100 1000 Equação 4 %𝑃<𝑛𝑜<𝑡𝑒𝑐𝑖𝑑𝑜= 𝑀÷1000 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎<𝑑𝑜<𝑡𝑒𝑐𝑖𝑑𝑜×100 Equação 5 84 Tabela 21 Valores obtidos a partir da adaptação da Norma Portuguesa 1842-1:2008 para determinação do fósforo total presente nos tecidos após funcionalização com nanopartículas de soro do leite com incorporação de Ácido Fítico para todas as amostras Nome da amostra Ciclos de lavagem Massa de fósforo nas cinzas (mg) % de fósforo total no tecido s Controlo 2,5%Lig 0 1,704 0,000 0,000 1 1,572 0,000 0,000 5% WPC+PA+2,5%Lig pH=7 0 12,004 0,183 0,012 1 1,942 0,007 0,002 5% WPC+PA+2,5%Lig pH=8 0 7,405 0,101 0,003 1 1,783 0,004 0,002 5% WPC+PA+Etanol+2,5Lig 0 13,014 0,200 0,004 1 1,717 0,003 0,002 85 ANEXO G – DETERMINAÇÃO DO FÓSFORO TOTAL PRESENTE NOS TECIDOS APÓS FUNCIONALIZAÇÃO COM AS NANOPARTÍCULAS DE CONCENTRADO PROTEICO DE SORO DE LEITE COM INCORPORAÇÃO DE LECITINA Neste anexo são apresentados todos os resultados obtidos ao longo do projeto para a percentagem de fósforo total presente nos tecidos após funcionalização com nanopartículas de soro do leite com incorporação de Lecitina. Os resultados aqui representados foram obtidos a partir da adaptação da Norma Portuguesa 18421:2008, Carnes e produtos - Determinação total de fósforo . No final de todo o procedimento descrito anteriormente no capítulo Materiais e Métodos mediram-se as absorvâncias no espetrofotómetro UVvisível, a um comprimento de onda de 430nm ± 2nm, de todas as soluções, em duplicado. Após obtenção das absorvâncias para cada amostra os resultados foram tratados de acordo com o descrito anteriormente no Anexo F de modo a obter os resultados apresentados na tabela 22. Tabela 22 Valores obtidos a partir da adaptação da Norma Portuguesa 1842-1:2008 para determinação do fósforo total presente nos tecidos após funcionalização com nanopartículas de soro do leite com incorporação de Lecitina, para todas as amostras Concentração de Lecitina Nome da amostra Ciclos de lavagem Massa de fósforo nas cinzas (mg) % de fósforo total no tecido s Controlo 5%Lig 0 1,175 0,000 0,000 1 1,267 0,000 0,000 25% Lecitina 5% WPC+2,5%Lig 0 4,105 0,043 0,004 1 2,736 0,021 0,003 5% WPC+ Etanol*+2,5%Lig 0 3,880 0,034 0,002 1 2,564 0,016 0,003 10% WPC+ Etanol*+2,5%Lig 0 7,127 0,083 0,002 1 3,986 0,039 0,003 10% WPC+ Etanol*+5%Lig 0 7,537 0,098 0,004 1 4,138 0,044 0,002 50% Lecitina 5% WPC 0 5,765 0,072 0,002 1 3,225 0,029 0,003 5% WPC+ Etanol*+2,5%Lig 0 5,527 0,058 0,002 1 2,742 0,019 0,003 10% WPC+ Etanol*+2,5%Lig 0 11,810 0,151 0,004 1 4,733 0,048 0,003 10% WPC+ Etanol*+5%Lig 0 9,998 0,144 0,005 1 5,342 0,060 0,004