Factores genéticos y ambientales relacionados con la génesis de cáncer vesical

3 FACTORES GENÉTICOS Y AMBIENTALES RELACIONADOS CON LA GÉNESIS DEL CÁNCER VESICAL Autor: Director: Fdo: D. Patricio Navarro Medina Fdo: Dr.D. Luis Domínguez Boada Codirector: Codirector: Fdo: Dr.D. Octavio Pérez Luzardo Fdo: Dra.Dña. Eva Elisa Alvarez León Codirector: Fdo: Dr.D. Nicolás Chesa Ponce Tesis Doctoral Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Programa de Doctorado: Clínica e Investigación Terapéutica. Departamento de Ciencias Clínicas Las Palmas de Gran Canaria Noviembre de 2012 5 7 FACTORES GENÉTICOS Y AMBIENTALES RELACIONADOS CON LA GÉNESIS DEL CÁNCER VESICAL Patricio Navarro Medina Tesis Doctoral Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Departamento de Ciencias Clínicas Las Palmas de Gran Canaria Noviembre de 2012 9 PROGRAMA DE DOCTORADO CLINICA E INVESTIGACIÓN TERAPÉUTICA Factores genéticos y ambientales relacionados con la génesis del Cáncer Vesical. Memoria para optar al grado de Doctor por la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, que presenta el Licenciado PATRICIO NAVARRO MEDINA Director Dr. Luis Domínguez Boada Profesor Titular de Toxicología de la ULPGC Codirectores Dr. Octavio Pérez Luzardo Profesor Titular de Toxicología de la ULPGC Dra. Eva Elisa Álvarez León Profesora Asociada de Medicina Preventiva de la ULPGC Dr. Nicolás Chesa Ponce Profesor Asociado de Urología de la ULPGC LAS PALMAS DE GRAN CANARIA – NOVIEMBRE 2012 11 LUIS DOMÍNGUEZ BOADA, PROFESOR TITULAR DE TOXICOLOGÍA DEL DEPARTAMENTO DE CIENCIAS CLÍNICAS, DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA CERTIFICA: Que el trabajo de investigación titulado “FACTORES GENÉTICOS Y AMBIENTALES RELACIONADOS CON LA GÉNESIS DEL CÁNCER VESICAL ”, ha sido realizado por D. PATRICIO NAVARRO MEDINA, en el Departamento de Ciencias Clínicas de la Universidad de Las Palmas, bajo su dirección y asesoramiento técnico y científico, y que una vez revisada la presente Memoria, la encuentra apta para su defensa ante el tribunal. Y para que así conste y surta los efectos oportunos, extiende el presente certificado en Las Palmas de Gran Canaria a dos de noviembre de dos mil doce. Fdo: Luis Domínguez Boada 13 OCTAVIO PÉREZ LUZARDO, PROFESOR TITULAR DE TOXICOLOGÍA DEL DEPARTAMENTO DE CIENCIAS CLÍNICAS, DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA CERTIFICA: Que el trabajo de investigación titulado “FACTORES GENÉTICOS Y AMBIENTALES RELACIONADOS CON LA GÉNESIS DEL CÁNCER VESICAL ”, ha sido realizado por D. PATRICIO NAVARRO MEDINA, en el Departamento de Ciencias Clínicas de la Universidad de Las Palmas, bajo su codirección y asesoramiento técnico y científico, y que una vez revisada la presente Memoria, la encuentra apta para su defensa ante el tribunal. Y para que así conste y surta los efectos oportunos, extiende el presente certificado en Las Palmas de Gran Canaria a dos de noviembre de dos mil doce. Fdo: Octavio Pérez Luzardo 15 EVA ELISA ALVAREZ LEÓN, PROFESORA ASOCIADA DE MEDICINA PREVENTIVA Y SALUD PÚBLICA DEL DEPARTAMENTO DE CIENCIAS CLÍNICAS, DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA CERTIFICA: Que el trabajo de investigación titulado “FACTORES GENÉTICOS Y AMBIENTALES RELACIONADOS CON LA GÉNESIS DEL CÁNCER VESICAL ”, ha sido realizado por D. PATRICIO NAVARRO MEDINA, en el Departamento de Ciencias Clínicas de la Universidad de Las Palmas, bajo su codirección y asesoramiento técnico y científico, y que una vez revisada la presente Memoria, la encuentra apta para su defensa ante el tribunal. Y para que así conste y surta los efectos oportunos, extiende el presente certificado en Las Palmas de Gran Canaria a dos de noviembre de dos mil doce. Fdo: Eva Elisa Álvarez León 17 NICOLÁS CHESA PONCE, PROFESOR ASOCIADO DE UROLOGÍA DEL DEPARTAMENTO DE CIENCIAS MÉDICAS Y QUIRÚRGICAS, DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA CERTIFICA: Que el trabajo de investigación titulado “FACTORES GENÉTICOS Y AMBIENTALES RELACIONADOS CON LA GÉNESIS DEL CÁNCER VESICAL ”, ha sido realizado por D. PATRICIO NAVARRO MEDINA, en el Departamento de Ciencias Clínicas de la Universidad de Las Palmas, bajo su codirección y asesoramiento técnico y científico, y que una vez revisada la presente Memoria, la encuentra apta para su defensa ante el tribunal. Y para que así conste y surta los efectos oportunos, extiende el presente certificado en Las Palmas de Gran Canaria a dos de noviembre de dos mil doce. Fdo: Nicolás Chesa Ponce 19 A mis padres, esposa y en especial, a mi hija Daniela María. 28 c. Variables clínicas (sólo entre los casos) __________________ i. Tratamiento de los pacientes _____________________ d. Variables analíticas _________________________________ i. Análisis de los niveles de contaminantes ambientales (plaguicidas organoclorados, bifenilos policlorados hidrocarbuross aromáticos policíclicos) en suero ______ __ ii. Factor de crecimiento dependiente de insulina tipo I (IGF-I) proteína transportadora tipo 3 del factor de crecimiento dependiente de insulina (IGFBP-3) _________________ e. Variables genéticas ___________________________________ f. Análisis estadístico ___________________________________ g. Dificultades y limitaciones del estudio ____________________ RESULTADOS Y DISCUSIÓN _____________________________________ 1. Características de los sujetos incluidos _________________________ 2. Variables antropométricas y cáncer de vejiga ____________________ 3. Factores de crecimiento similares a la insulina (IGF) ______________ 4. La profesión y cáncer vesical _________________________________ 5. Hábito tabáquico __________________________________________ 6. Consumo de bebidas y cáncer vesical _________________________ 7. Hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) y cáncer vesical ______ 8. Plaguicidas organoclorados (OCs) y cáncer vesical _______________ 9. Bifenilos policlorados (PCBs) y cáncer vesical ___________________ 10. Variables hereditarias y cáncer vesical _________________________ 11. Polimorfismos genéticos y cáncer vesical _______________________ CONCLUSIONES _______________________________________________ REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS _________________________________ ANEXOS ______________________________________________________ 1. ANEXO I.: Aprobado comité de ética ___________________________ 2. ANEXO II: Hoja de recogida de datos __________________________ 3. ANEXO III: Lista hidrocarburos aromáticos policíclicos, organoclorados y bifenilos policlorados ______________________________________ 4. ANEXO IV ________________________________________________ Pág. 93 93 95 96 100 101 103 105 106 107 111 114 119 125 134 137 149 161 171 173 188 194 222 224 228 236 241 29 INTRODUCCIÓN 30 2 1. EL TRACTO URINARIO El sistema urinario humano se compone fundamentalmente de dos partes: los órganos secretores (riñones) que se encargan de producir la orina, y el tracto urinario o vías excretoras (pelvis renales, uréteres, vejiga urinaria y uretra) que básicamente conducen y almacenan la orina para que posteriormente sea evacuada al exterior. De entre los componentes del tracto urinario, las pelvis renales y los uréteres constituyen el tracto urinario superior (TUS), mientras que la vejiga y la uretra forman el tracto urinario inferior. Todo el tracto urinario comparte una estructura histológica similar, la cual está compuesta básicamente por tres capas: -Urotelio o epitelio de células transicionales: formado habitualmente por seis capas que se agrupan en tres tipos celulares: las células basales (localizadas en la base del urotelio), las células poliédricas (situadas sobre las basales) que se organizan en un número variable de capas dependiendo de la zona del tracto urinario de la que se trate, y las células de superficie o “en paraguas” (las más superficiales) que son células aplanadas de gran tamaño. Además de estos tres tipos celulares, a lo largo del urotelio pueden encontrarse de manera normal nidos de Brunn y focos dispersos de metaplasia escamosa o glandular. Se trata de un epitelio estratificado formado por un número variable de capas de células (entre 2 y 6) dispuestas de un modo un tanto irregular. Reviste los tractos urinarios, desde los cálices renales (con dos capas celulares) hasta la uretra (con 4 a 5 capas), pasando por la vejiga urinaria (hasta 6 capas celulares). Es un epitelio impermeable a las sales y al agua por lo que forma una barrera osmótica entre la orina y los líquidos intersticiales. Tiene gran capacidad de distensión, demostrable con el llenado de la vejiga urinaria, gracias a que las células de las capas superficiales se aplanan por estiramiento, tomando aspecto de epitelio escamoso. Esta capacidad deriva de las características especiales de las células más superficiales que presentan zonas de mayor grosor en su parte apical denominadas placas. Estas placas están separadas por unas franjas más delgadas, dándole un aspecto rugoso a la porción apical de la célula sobre todo 3 cuando la vejiga se vacía (Figura 1). Algunas de las células más superficiales de este epitelio son binucleadas (Figura 1). En la parte basal del epitelio, las células son menos voluminosas y más numerosas, creciendo en tamaño a medida que nos aproximamos a la zona apical. No existen interdigitaciones desde el tejido conectivo similares a las que normalmente se encuentran en los epitelios estratificados, siendo en este caso el límite epitelio-conectivo prácticamente plano. Como en el resto de los epitelios, en dicho límite existe una matriz extracelular especializada denominada lámina basal o lámina propia. Figura 1. Imagen histológica del epitelio de transición, que recubre la práctica totalidad del tracto urinario. (Fuente: www.kumc.edu). -Lámina propia: es la capa sobre la que descansa el urotelio. Consiste en una capa de tejido conectivo fibroelástico relativamente gruesa que permite una distensión considerable. Esta capa es atravesada por numerosos vasos sanguíneos y contiene fibras de músculo liso. -Capa muscular: está formada por haces de músculo liso que se ramifican y entrelazan de manera laxa configurando tres capas: la longitudinal externa, la circular media y la longitudinal interna. Esta malla muscular es responsable del peristaltismo del tracto urinario y permite el vaciado de la vejiga. La estructura y 4 composición de esta musculatura varía ligeramente a lo largo del tracto urinario así como en función del sexo. Externa a la capa muscular se encuentra una capa de grasa perivesical. La irrigación sanguínea de la vejiga se realiza a través de arterias originadas de la arteria ilíaca interna. Las venas que surgen de la vejiga desembocan también en la vena ilíaca interna. A nivel linfático, la mayor parte del drenaje pasa a los ganglios linfáticos ilíacos externos, aunque también existe drenaje a los ganglios obturadores, ilíacos internos y comunes. Finalmente, la inervación de la vejiga corresponde tanto al sistema nervioso simpático como al parasimpático. 2. EL CÁNCER VESICAL El carcinoma urotelial (CU), también llamado carcinoma de células transicionales, es una enfermedad neoplásica que se origina en el urotelio. La localización más frecuente del CU es la vejiga (>90%), aunque puede aparecer en cualquier nivel del tracto urinario (el 5% de los casos aparecen en el TUS y 1% en la uretra). Figura 2. Imagen histológica de un carcinoma urotelial in situ (Fuente: www.uropatologia.com). 5 3. EL CÁNCER VESICAL: PRESENTACIÓN CLÍNICA, TIPOS Y CLASIFICACIÓN Aproximadamente el 75% de los CUs se diagnostican inicialmente como no músculo-infiltrantes. Desafortunadamente, estos tumores están caracterizados por unos índices de recurrencia en la vejiga que oscilan entre el 60 y el 85%, una vez que el tumor primario ha sido tratado. Además, entre un 15-30% de los CU no músculo-infiltrantes progresarán a infiltrar la capa muscular, hecho que empeorará mucho el pronóstico del paciente (Amira y cols. 2002). Así, tanto la naturaleza insidiosa de estos tumores como su variable manifestación clínica han llevado a la mayoría de profesionales clínicos a minimizar la agresividad terapéutica a la hora del seguimiento y el tratamiento, pensando en la calidad de vida del paciente (Fernando y cols. 2005) Según el patrón de crecimiento, el CU puede ser de varios tipos: 􂀀 Papilar: este patrón aparece en un 75-80% de los CUs. Los tumores papilares se caracterizan por presentar, tal y como su nombre indica, papilas, que consisten en prolongaciones tapizadas por células uroteliales que contienen un estroma fibrovascular en su interior. Tienden a ser lesiones multifocales y a recurrir. Este patrón de crecimiento también es característico de una forma benigna de cáncer vesical llamada papiloma, que representa el 2,5% de todos los tumores papilares de la vejiga. En este caso las papilas están formadas por un eje fibroconjuntivo vascular revestido de un epitelio de células transicionales normales. 􂀀 Sólido: este patrón se da aproximadamente en el 10% de los CUs. Supone una lesión formada por islotes celulares que contienen grandes núcleos hipercromáticos. La presencia de este patrón implica un mal pronóstico de la enfermedad. 􂀀 Mixto: aparece en el 20% de CUs. Los tumores con este patrón de 6 crecimiento presentan características papilares y sólidas al mismo tiempo. 􂀀 Plano: al CU con este patrón de crecimiento se le confiere una identidad propia, de manera que pasa a llamarse carcinoma in situ (CIS o Tis). Queda limitado al urotelio y tiene una elevada capacidad invasiva y metastásica. Puede presentarse asociado a lesiones papilares. A nivel histológico, el CU se clasifica teniendo en cuenta básicamente dos aspectos: el estadio de invasión del tumor en las capas del tracto urinario y el grado de desdiferenciación celular. A continuación se explica más detalladamente cada uno de estos aspectos (Wittekind y cols. 2002). Estadio. Clasificación TNM de tumores malignos (TNM Classification of Malignant Tumours), 6ª edición, 2004. Clasificación utilizada en la actual tesis doctoral. El estadio indica el nivel de extensión del tumor entre las capas del tracto urinario e incluso si alcanza otros órganos. El sistema para clasificarlo se denomina TNM (del inglés, Tumor, Node, Metastasis) y hace referencia a los siguientes parámetros: 􂀀 T: indica el grado de infiltración del tumor en las capas del tracto urinario. 􂀀 N: indica la presencia o ausencia de células tumorales en los ganglios linfáticos regionales. 􂀀 M: informa de la presencia o ausencia de metástasis a distancia. T: Tumor primario Tx, No se puede evaluar el tumor T0, No hay evidencia de tumor Tis, Carcinoma in situ: "tumor plano" Ta, Carcinoma papilar no infiltrante 7 T1, Tumor que invade el tejido conjuntivo subepitelial T2, Tumor que invade la capa muscular T2a, Tumor que invade la capa muscular superficial (mitad interna) T2b, Tumor que invade la capa muscular profunda (mitad externa) T3, Tumor que invade la grasa perivesical T3a, Tumor que invade microscópicamente la grasa perivesical T3b, Tumor que invade macroscópicamente (masa extravesical) T4, Tumor que invade cualquiera de las siguientes estructuras: próstata, útero, vagina, pared pélvica o abdominal T4a, Tumor que invade la próstata, el útero o la vagina T4b, Tumor que invade las paredes pélvica o abdominal N: Ganglios linfáticos regionales Nx, no se pueden evaluar los ganglios linfáticos regionales N0, no se demuestran metástasis ganglionares regionales N1, metástasis a único ganglio linfático, de diámetro máximo ≤ a 2 cm N2, metástasis en un único ganglio linfático, de diámetro máximo mayor de 5 cm, o en varios, ninguno de ellos mayor de 5 cm de diámetro máximo N3, metástasis en un ganglio linfático de diámetro máximo mayor de 5 cm M: Metástasis a distancia Mx, no se puede evaluar las metástasis a distancia M0, no hay metástasis a distancia M1, metástasis a distancia Estos parámetros pueden evaluarse a partir del tejido extraído en la resección transuretral del tumor (estadiaje clínico) y/o después de la cirugía radical en la que se extirpa la vejiga (estadiaje patológico). Cuando se habla de estadiaje patológico, 8 a las categorías T, N y M se las denomina pT, pN y pM, respectivamente Según el estadio, el CU puede recibir diferentes denominaciones. Cuando el tumor no llega a invadir la capa muscular (Tis, Ta y T1), se le denomina comúnmente carcinoma no músculo-infiltrante o tumor no invasivo de la capa muscular o superficial (este último término está en desuso). En cambio, cuando el tumor llega a infiltrar el músculo o las capas exteriores a éste (T2 o más), se le denomina carcinoma músculo-infiltrante. Grado Los sistemas de gradación de los tumores uroteliales más difundidos y ampliamente aceptados han sido los propuestos por la Organización Mundial de la Salud (OMS). Así, en 1973 se estableció una gradación que se ha estado utilizando durante décadas, la cual clasificaba a los tumores en 4 categorías: papiloma, grado 1, grado 2 y grado 3 (Mostofi y cols. 1984). En esta clasificación, los papilomas fueron definidos como lesiones exofíticas no malignas, formadas por un eje fibroconjuntivo recubierto por un epitelio transicional normal. Por otro lado, las categorías 1, 2 y 3 correspondían a los diferentes grados de anaplasia celular, siendo los tumores con grado 3 los que presentaban un grado de anaplasia más severo, asignándoseles un peor pronóstico de la enfermedad. La anaplasia en esta clasificación se definió por la presencia de células grandes, con irregularidad morfológica, polaridad atípica, presencia de figuras mitóticas anormales y con variaciones en los patrones de cromatina nucleares, entre otras características. Una crítica recurrente de este sistema de gradación fue la definición poco exacta de los puntos de corte entre estos tres grados de malignidad. En 1998, este sistema fue modificado, de manera que la clasificación pasó únicamente a considerar tres grupos de lesiones: papiloma, lesiones de bajo grado y lesiones de alto grado. Posteriormente en 2004 la OMS añadió al sistema de 1998 una nueva categoría que incluye las neoplasias uroteliales papilares con bajo potencial de malignidad o PUNLMP (del inglés, papillary urothelial neoplasm of low malignant potencial). Mención aparte requiere el carcinoma in situ (CIS), que puede definirse 15 Figura 7. Incidencia edad-específica de cáncer de vejiga entre los hombres (A) y las mujeres (B) según países (Adami y cols. 2008). blancas y los varones negros y de un 0.5% entre las mujeres negras. El predominio masculino es observado en todos los grupos de edad. La incidencia es generalmente mayor entre individuos de ambientes urbanos, posiblemente debido a un mayor nivel de exposición a contaminantes, fundamentalmente derivados del petróleo como los hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) o de origen industrial como dioxinas y bifenilos policlorados 16 (PCBs), aunque este hecho no está del todo comprobado (Adami y cols. 2008). También se ha observado mayor prevalencia de la enfermedad entre individuos de clases sociales bajas, hecho que se explica posiblemente por los mayores hábitos tabáquicos de estas clases sociales. Además, el tipo de ocupación profesional también suele ser de mayor riesgo (trabajos con mayor componente manual, manipulación de sustancias químicas, etc.). La mortalidad entre esta clase social es también mayor (Adami y cols. 2008). 5.3. Tabaco El tabaco (fumado en cigarrillo) es la causa más importante de cáncer de vejiga, particularmente entre los hombres. Esta asociación se ha comprobado en muchos estudios de casos y controles. De manera general, todos los estudios ven un aumento del riesgo de sufrir esta patología entre los fumadores. Ese riesgo está en torno a las dos veces si comparamos a los exfumadores y a los no fumadores. Entre los fumadores, en aquellos que consumen más de 20 cigarrillos al día, ese riesgo aumenta hasta unas 5 veces (Adami y cols. 2008). El efecto del tabaco parece ser similar entre hombres y mujeres (Puente y cols. 2006). El riesgo parece ser diferente según el tipo de tabaco consumido, el modo y número de cigarros fumados. En este sentido, la duración del hábito tabáquico y la edad a la que el individuo se inicia en el hábito tabáquico parecen ser parámetros críticos en relación al riesgo (Doll y cols. 1994; Brennan y cols. 2000). Así, el riesgo aumenta entre aquellos que se iniciaron en el hábito antes de los 20 años. Tanto la edad de inicio, como la duración del hábito o la edad a la que se finaliza, son variables íntimamente relacionadas. Tras dejar de fumar, el riesgo disminuye entre un 20 y un 30% en los primeros 5 años. Algunos estudios han reportado que el riesgo de desarrollo de este tipo de tumores sigue siendo mayor entre exfumadores de más de 20 años que entre los no fumadores (Brennan y cols. 2000; Adami y cols. 2008). 17 El tabaco rubio es el mayoritariamente consumido en el norte de Europa y Norteamérica, mientras que en el sur de Europa y Suramérica, se consume más tabaco negro. Algunos estudios que han comparado ambos tipos de tabaco han encontrado un mayor riesgo de cáncer de vejiga entre los individuos que consumen tabaco negro (Adami y cols. 2008). El tabaco negro tiene una mayor concentración de aminas aromáticas (4-aminobifenilo, b-naftilamina, o-toluidina) y otros agentes químicos. Más aún, los fumadores de tabaco negro excretan 1,8 veces más mutágenos en orina que los fumadores de tabaco rubio (Malaveille y cols. 1989). Asimismo, los cigarros sin filtro aumentan entre un 30 y 50% el riesgo de desarrollo de cáncer de vejiga, en comparación con los individuos consumidores de tabaco con filtro (Hartge y cols. 1987; Samanic y cols. 2006; Adami y cols. 2008). A día de hoy, ningún estudio ha demostrado que el riesgo de cáncer de vejiga aumente entre los fumadores pasivos. En líneas generales puede decirse que existen más de 60 carcinógenos presentes en el humo de cigarrillo. Los carcinógenos potenciales incluyen el 4 - aminobifenilo, los hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs), compuestos nitrosos y aldehídos no saturados (Hoffman y cols. 1969). 5.4. Dieta Salvo por una ligera asociación protectora entre el consumo de frutas y verduras, no hay demasiadas evidencias científicas acerca del consumo de determinados alimentos como factores de riesgo para el cáncer de vejiga. Las frutas, zumos de frutas y verduras (zanahorias, crucíferas y vegetales verde oscuro) parecen proteger frente a este tipo de tumores. Steinmaus y cols. han reportado un meta-análisis donde encontraron que la baja ingesta de este tipo de alimentos incrementa el riesgo de cáncer de vejiga (RR = 1,4 y 1,2 para frutas y verduras, respectivamente) (Steinmaus y cols. 2000). Parece que este efecto protector es debido al consumo de vitaminas A y C, folatos y carotenos (Knekt y cols. 1990; Michaud y cols. 1999b), si bien existe mucha controversia al respecto (Steinmaus y cols. 2000; Zeegers y cols. 2001b). Los estudios acerca del papel de la vitamina E y 18 de la ingesta de selenio han reportado resultados inconsistentes (Brinkman y cols. 2006). En resumen, podemos decir que las evidencias protectoras del consumo de frutas y verduras son similares a lo observado en otros tipos tumorales. Respecto a otros alimentos, hay autores que han sugerido que las dietas bajas en grasa protegen frente al cáncer de vejiga, mientras que el consumo de carne, aves de corral e incluso ciertos pescados parecen incrementar ese riesgo (Steinmaus y cols. 2000). No obstante, los resultados están lejos de ser concluyentes. Tampoco hay evidencias claras para otros grupos de alimentos (productos lácteos) o de macronutrientes (ingesta de proteínas, lípidos, carbohidratos o de calorías) (Adami y cols. 2008). Se ha estudiado si la forma de cocción de los alimentos puede influir en el riesgo de cáncer de vejiga, ya que las aminas heterocíclicas, potentes mutágenos y carcinógenos en animales, se generan en los asados y los fritos, principalmente. Mientras que algunos autores han reportado un incremento del riesgo de cáncer de vejiga entre los consumidores de alimentos cocinados de esa forma, otros no han encontrado tal asociación (Augustsson y cols. 1999). Aunque es posible que exista una asociación entre los alimentos y el cáncer de vejiga, no existen evidencias claras acerca de qué alimentos o de qué formas de cocción son las más relacionadas con un incremento de riesgo. En teoría, la presencia de aminas heterocíclicas en contacto con el epitelio de la vejiga, puede aumentar las posibilidades de carcinogénesis, por lo que podría asumirse que el consumo de alimentos asados, al grill o cocinados a altas temperaturas podrían ser una fuente relevante de aminas y PAHs. De hecho, se considera que la dieta contribuye a un porcentaje muy importante de la carga total de PAHs de un adulto occidental (Jedrychowski y cols. 2012). Finalmente, reseñar que los alimentos modifican el pH de la orina (se acidifica por el consumo de queso y carne y se basifica por el consumo de frutas y verduras), y que tal efecto en un momento dado puede aumentar la agresión de la orina al 19 epitelio y promover o facilitar procesos de carcinogénesis. Aún con todo, a día de hoy, la potencial relación existente entre cáncer de vejiga y dieta no es clara (Adami y cols. 2008). Mención aparte merece la potencial relación existente entre el riesgo de cáncer vesical y el consumo de café y té. Desde que en 1971 se reportó la primera asociación entre el consumo de café y el cáncer de vejiga, han sido numerosos los estudios que han intentado comprobar este hecho. En general, la asociación entre ambas variables es débil (Adami y cols. 2008). Un grupo de trabajo de la IARC, en 1991, propuso al café como un posible carcinógeno para el cáncer humano de vejiga urinaria. Tanto la cantidad como el tiempo de consumo parecen ser relevantes para aumentar el riesgo. La principal dificultad a la hora de establecer relaciones claras entre el consumo de café y el cáncer de vejiga, viene dada por la asociación tan íntima que existe entre los consumidores de este tipo de bebidas y el hábito tabáquico. En individuos no fumadores, aquellos con mayores niveles de consumos de café parecen tener mayor riesgo de desarrollo de cáncer vesical (Sala y cols. 2000; Zeegers y cols. 2001d). Respecto al té, las evidencias son todavía menores, considerándose a día de hoy que no existe asociación alguna entre el consumo de té y el cáncer de vejiga (Michaud y cols. 1999a; Zeegers y cols. 2001d). Estudios realizados en animales han mostrado que los compuestos antioxidantes del té, principalmente los polifenoles del té verde, podrían ser protectores del cáncer de vejiga. De forma similar, el consumo de alcohol y su relación con el cáncer vesical, merece ser tratado en mayor profundidad. De manera general, las evidencias epidemiológicas actuales parecen indicar que no existe asociación alguna entre el consumo de alcohol y el cáncer de vejiga (Adami y cols. 2008). Solo algunos estudios han observado un aumento del riesgo de cáncer de vejiga únicamente entre los hombres, sin que se haya reportado tendencia dosis-respuesta alguna (Zeegers y cols. 2001e). Los resultados, en cualquier caso, son inconsistentes. 20 Dado que la exposición prolongada del epitelio vesical a los carcinógenos presentes en la orina parece afectar al desarrollo del cáncer vesical, y que el volumen de la orina así como la frecuencia de micción condicionan la concentración de carcinógenos en la orina, hemos de realizar algunos breves comentarios acerca de la relevancia que la ingesta total de fluidos podría tener en el riesgo de cáncer vesical. En contra de lo pensado, algunos estudios han reportado que aquellos individuos con mayores niveles de ingesta de líquidos presentan un ligero aumento del riesgo de sufrir cáncer de vejiga (Arsenault y cols. 1986; Michaud y cols. 1999a; Geoffroy-Perez y cols. 2001). Sin embargo, otros estudios han encontrado un efecto protector. Así, Michaudy cols. describieron en un estudio de cohortes (población masculina norteamericana) que aquellos con ingestas superiores a 240 ml por encima de la media del grupo, presentaban un descenso del riesgo del 7% (Michaud y cols. 1999a) y que aquellos individuos con ingestas de líquidos superiores a los 2.531 ml al día presentaban hasta un 49% menos de riesgo que aquellos que ingerían menos de 1.290 ml de líquidos al día (Michaud y cols. 1999a). El riesgo también va asociado al tipo de agua consumida, siendo únicamente la de abasto la única que parece incrementar el riesgo de sufrir esta patología (Villanueva y cols. 2006). El incremento del riesgo observado en algunos estudios puede ser explicado por el tipo de bebida o por lo que se considera “alta ingesta de líquidos” para los diversos estudios. 5.5. Variables antropométricas No se han realizado estudios acerca del papel que las medidas antropométricas puedan tener en el cáncer de vejiga (Adami y cols. 2008). Solo se ha estudiado la obesidad en relación al pronóstico, habiéndose observado que aquellos pacientes con cáncer de vejiga y obesidad tienen una peor supervivencia. De hecho, la obesidad supone un importante factor de riesgo para el cáncer, a la que se atribuye entre el 14 y 20% de las muertes causadas por esta enfermedad entre hombres y mujeres, respectivamente (Calle y cols. 2003). Sin embargo, revisiones recientes apuntan la posibilidad de que la mayor altura pueda ser un factor de riesgo para diferentes tipos de patologías tumorales (cáncer colorrectal, de 21 próstata, mama, sistema nervioso central, piel, endometrio, tiroides y tumores hematopoyéticos) (Batty y cols. 2009). En este sentido, la potencial asociación positiva entre altura y riesgo de cáncer podría ser consecuencia de mayores niveles de hormonas anabólicas como la Hormona del crecimiento (GH) o de sus principales mediadores, los factores de crecimiento celular similares a la insulina (Insulin-like Growth Factors; IGF). Hemos de reseñar aquí que niveles elevados de IGF se han relacionado con el desarrollo de ciertos tipos de tumores, entre ellos el vesical (Probst-Hensch y cols. 2003; Zhao y cols. 2003). 5.6. Factores de crecimiento celular mediadores de la acción de la hormona del crecimiento: Insulin-like growth factor-1 (IGF-I) Diferentes estudios epidemiológicos han mostrado un aumento del riesgo de desarrollo de patologías tumorales en aquellos individuos con diabetes, especialmente cáncer de hígado, colorectal, pancreático, de mama, endometrio, riñón y mieloma múltiple (Vigneri y cols. 2009). Estudios recientes han reportado una asociación entre el riego de desarrollo de tumores y el uso de terapia insulínica exógena (Currie y cols. 2009; Hemkens y cols. 2009). La asociación entre la obesidad, la diabetes mellitus tipo 2 (T2DM) y el cáncer se explica en parte por la hiperinsulinemia secundaria a la resistencia insulínica y al incremento de los niveles del principal factor de crecimiento insulínico (Insulin-like growth factor tipo 1; IGF-I). En estados hiperinsulínicos, el incremento de los niveles de insulina en la circulación portal produce un aumento de la expresión del receptor de la hormona de crecimiento (GHR), y por tanto, un aumento de la señalización dependiente de este receptor, como el incremento de la producción hepática de IGF-I (Baxter y cols. 1980). Altos niveles de IGF-I se han visto asociados a un aumento del riesgo de desarrollo de cáncer colorectal, cáncer de mama en mujeres premenopáusicas y cáncer de próstata (Chen y cols. 2009; Rinaldi y cols. 2010). Aquellos individuos con niveles de IGF-I superiores a 100 ng/ml presentan un riesgo de muerte asociada a cáncer 1,82 veces superior a aquellos pacientes con niveles circulantes de IGF-I inferiores. Ese riesgo aumentaba hasta 2,61 veces entre los individuos con niveles 22 séricos de IGF-I superiores a 200 ng/ml, tras más de 18 años de seguimiento (Major y cols. 2010). Altos niveles de IGF-I parecen estar asociados a un aumento del riesgo de desarrollo de determinados tipos tumorales. Este hallazgo supone que aquellos pacientes con resistencia insulínica pueden desarrollar cáncer como consecuencia del aumento de la producción hepática de IGF-I. En modelos animales, la deficiencia de IGF-I provocada por restricción calórica, en ratones deficientes de p53, disminuye la velocidad de crecimiento de cáncer de vejiga. Es más, cepas de ratones transgénicos con deficiencia de IGF-I, presentaban una disminución del crecimiento y de las metástasis de adenocarcinoma colónico inducido por benzoantraceno (Dunn y cols. 1997; Wu y cols. 2002; Wu y cols. 2003b). Y lo que es más interesante, la adición de IGF-I en estos modelos animales experimentales revierte el efecto protector que la deficiencia tenía inicialmente (Dunn y cols. 1997; Wu y cols. 2002). IGF-I no solo aumenta la velocidad de crecimiento tumoral, también aumenta la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y la inducción de la expresión del factor inducible de hipoxia-1 (HIF-1) (Fukuda y cols. 2002; HeronMilhavet y cols. 2002), conduciendo al desarrollo de neovascularización y metástasis en modelos animales de cáncer de colon con deficiencia de producción de IGF-I (Dunn y cols. 1997; Wu y cols. 2002). En las metástasis inducidas por IGF-I, parece que éste ejerce algún tipo de acción relacionada con la recolocación de integrinas de las células que van a migrar, tal y como se ha observado en células de cáncer de colon y de neuroblastoma (Meyer y cols. 2001; Canonici y cols. 2008). En modelos animales de ratas con cáncer prostático hormono-dependiente, se ha observado que existe un aumento intrínseco de la producción de IGF-I por parte de las células tumorales, lo que lleva a la regulación propia por parte del tumor de su propio crecimiento, con cierta independencia de los niveles de IGF-I existentes en el suero (Wang y cols. 1998). Algunos tipos tumorales aumentan los niveles de receptores de insulina (IR), y en condiciones de hiperinsulinemia secundaria al aumento de la resistencia insulínica secundaria a T2DM u obesidad, algunos tipos tumorales aumentan 23 también la activación de las vías de señalización dependientes de IR (Papa y cols. 1990; Novosyadlyy y cols. 2010). Los estados hiperinsulinémicos aumentan los niveles de IGF-I biodisponible mediante la inhibición directa e indirecta de las proteínas que unen IGF-I: insulin-like growth factor binding proteins 1 y 3 (IGFBP-1 e IGFBP-3) (Frystyk y cols. 1995; Grinspoon y cols. 1995). La disminución de los niveles de IGFBP-1 y 3 provoca el aumento de los niveles circulantes de IGF-I que interaccionará con su receptor (receptor para el factor de crecimiento insulínico; IGF1R) mediando las acciones celulares derivadas, asociadas fundamentalmente a un incremento de la proliferación celular y a una disminución de la apoptosis (Figura 8). Adicionalmente, muchos tipos tumorales sobreexpresan IGF-II, que activa tanto a IGF-1R como a IR. Por tanto, la acción compleja y combinada de IGF-I, IGF-II, IGFBPs y los receptores IR e IGF-1R, sugieren una situación celular compleja no del todo conocida actualmente. El IGF-1R aparece sobreexpresado en diferentes tipos tumorales. Algunos estudios han demostrado que los niveles circulantes de IGF-I no se correlacionan con la progresión tumoral, mientras que el incremento local de la producción de IGFI por el tumor, así como el incremento de la expresión de IGF-1R, son factores de peor pronóstico para los procesos cancerosos (Huang y cols. 2008). A nivel clínico, en pacientes con cáncer de mama, la sobreexpresión de IGF1R es frecuente y se asocia a la transformación mamaria maligna (Surmacz 2000; Jones y cols. 2009). Más aún, el aumento de la expresión de IGF-1R condiciona el pronóstico de la enfermedad y la respuesta a los tratamientos, en pacientes con cáncer ginecológico y de cabeza y cuello (Lloret y cols. 2007; Lara y cols. 2011). Todos estos hallazgos han provocado un interés creciente en el desarrollo de fármacos para bloquear a IGF-1R. También se están desarrollando anticuerpos contra IGF-I e IGF-II, con resultados todavía contradictorios, debido a las consecuencias derivadas sobre la activación de otros receptores como el receptor insulínico (IR) (Olmos y cols. 2010; Gao y cols. 2011). 24 Figura 8. Señalización celular dependiente de la activación de IGF-1R por parte de la insulina, IGF-I e IGF-II (Gallagher y cols.) El papel de IGF-I también ha sido analizado en el contexto del cáncer vesical, aunque con resultados contradictorios. La mayoría de los estudios hace referencia a los niveles de expresión de IGF-I o a polimorfismos en genes que codifican para la proteína. Son muy pocos los estudios que exploran la asociación de IGF-I circulante en suero con el cáncer vesical. Mahmoud y cols. estudió el papel del IGF-I circulante como factor de riesgo de cáncer vesical, en 51 pacientes y 45 controles de nacionalidad egipcia. A pesar de que encontraron diferencias significativas respecto a los niveles séricos de interleuquina-8, no observaron diferencias estadísticamente significativas respecto a IGF-I (Mahmoud y cols. 2010). Algo parecido había sido anteriormente reportado por otros autores. Así, Serel y cols. concluyeron, en un estudio realizado con 30 casos de cáncer vesical y 30 controles, que los niveles séricos de IGF-I no era un factor predictivo de este tipo de tumor (Serel y cols. 2003). Por su parte, Shariat y cols. llegaron a la misma conclusión en una cohorte de pacientes compuesta por 51 pacientes y 44 controles (Shariat y cols. 2003). Sin 31 Figura 9. Estructura química de algunos hidrocarburos aromáticos policíclicos. A, benzo(a)pireno; B, benzo(b)fluoranteno; C, benzo(k)fluoranteno; D, benzo(g,h,i)perileno. Las principales fuentes antropogénicas son: - Tráfico, el transporte por carretera, así como de otro tipo de vehículos a motor que usen combustibles fósiles, representa una importante fuente de emisión de PAHs ya que además de los constituyentes de éstos, las temperaturas de un motor de combustión son lo suficientemente altas para convertir una fracción del combustible en PAHs vía pirólisis. Se ha estimado que los vehículos de motor representan más de 1/3 del total de emisiones de PAHs a la atmósfera en los Estados Unidos. Debido al tráfico rodado, y como consecuencia del desgaste de los neumáticos, el polvo de la carretera también es una fuente adicional de PAHs (Van Metre 2000). - Plantas de producción de aluminio: representan un proceso industrial históricamente asociado con emisiones y vertidos de PAHs (Naes 1997) . - Industria del hierro y acero: las emisiones proceden fundamentalmente de los procesos térmicos que usan carbón y coque. Los PAHs formados en los procesos de combustión dependen de varios factores, como tipo de 32 combustible, proceso de manufactura o los dispositivos utilizados para el control de las emisiones. En la literatura, se han descrito relaciones entre ciertos componentes que resultan útiles para distinguir entre las diferentes fuentes. Así, por ejemplo, el benzo(a)pireno es usado como PAH de referencia debido a su estabilidad química y su presencia asociada casi exclusivamente a partículas (Daisey y cols. 1986). - Plantas de generación de energía: Muchas plantas de generación de calor y electricidad (centrales térmicas) queman combustibles fósiles y producen como subproductos residuos líquidos, sólidos y gaseosos que son ricos en PAHs. Estas fuentes, liberan PAHs al medio ambiente por la formación de éstos durante el proceso industrial o bien a través de la pirólisis de los combustibles mencionados para producir energía. Estos PAHs no se degradan en la atmósfera, sino que son adsorbidos sobre las partículas suspendidas en el aire, entrando en los medios acuáticos y terrestres por deposición atmosférica (Calvo-Revuelta y cols. 1999). - Incineradoras de residuos industriales y municipales: La incineración es una valiosa forma de eliminar y reducir residuos pero el principal inconveniente de este proceso es la emisión de compuestos tóxicos, incluyendo los PAHs. Se han descrito en la literatura concentraciones entre cientos y miles de microgramos de PAHs por kilogramo de cenizas, sin embargo hay diferencias importantes entre los diferentes PAHs a considerar. - Combustión doméstica: está bien documentado que la combustión de sólidos, especialmente madera y otro tipo de biomasa, en hornos pequeños y plantas de combustión de tamaño medio, ocasionan emisiones relativamente altas de estos compuestos, debido a las deficientes condiciones de combustión en instalaciones anticuadas. - Madera tratada con creosota: que es el nombre usado para describir una mezcla de unos 200 compuestos químicos, la mayoría de los cuales son 33 hidrocarburos aromáticos. En zonas de clima templado y cálido, las emisiones de PAHs procedentes del tratamiento de la madera con creosota y alquitrán pueden ser significativas, de hecho España censó en el año 2000, hasta 53.000 m3 de madera creosotada. Durante años, esta sustancia ha sido utilizada como agente de impermeabilización en hogares, traviesas de ferrocarril, postes del tendido eléctrico y telefónico, cercas etc., sin embargo, su uso se ha visto reducido con la entrada en vigor de la Directiva 2001/90/CE y su transposición a la legislación española, por la cual no puede usarse para el tratamiento de la madera. - Pintura de barcos, astilleros y estructuras marinas sumergidas: se ha identificado como fuente de PAHs en ciertas áreas, las pinturas de barco basadas en preparaciones de brea, a pesar de que en muchos países europeos se han dejado de usar este tipo de sistemas y en otros sólo se puede usar en determinadas condiciones. - Material dragado: durante el dragado de sedimentos contaminados, los contaminantes se movilizan y pueden pasar de nuevo a la columna de agua y a la biota. - Plataformas petrolíferas en mar abierto: el agua que producen estas instalaciones contiene PAHs y naftalenos. - Navegación y vertidos accidentales de petróleo: que son consecuencia inevitable del transporte de crudo de petróleo y productos petrolíferos refinados por el mar. Aunque el número de vertidos importantes ocurridos cada año ha descendido desde la década de los 70, vertidos y descargas operacionales constituyen una importante entrada de hidrocarburos al medio marino. De entre todos los PAHs conocidos, la Agencia para Sustancias Tóxicas y el Registro de Enfermedades (ATSDR) seleccionó 16 de ellos por ser considerados los 34 más peligrosos y exhibir los efectos más representativos de los PAHs. Además, por su alta presencia en el medioambiente, existe una mayor posibilidad de estar expuesto a alguna de estas 16 sustancias (ATSDR 1995). Los 16 PAHs prioritarios son: acenaftileno, acenafteno, antraceno, benzo(a)antraceno, benzo(a)pireno, benzo(b)fluoranteno, benzo(k)fluoranteno, benzo(g,h,i)perileno, criseno, dibenzo(a,h)antraceno, fluoranteno, fluoreno, indeno(1,2,3-c,d)pireno, naftaleno, fenantreno y pireno. Todos ellos, con sus diferencias físico-químicas, son considerados lipofílicos (Douben Peter 2003). No obstante, a pesar de su carácter lipofílico, su vida media en el medio ambiente es corta. Se tienen algunos datos de tiempo de vida media de los PAHs basados en experimentos en laboratorio, en los cuales se han simulado las condiciones atmosféricas. Estos tiempos oscilan entre las 0,15 horas del antraceno y las 21,10 horas del benzo(a)pireno. Se estima que en el aire los PAHs se asocian a partículas de hollín, las cuales tienen tiempos de residencia de semanas y están sujetas al transporte a grandes distancias (Ravindra y cols. 2008). No obstante, su carácter lipofílico propicia la entrada de estas sustancias a diferentes compartimentos de la biosfera, donde son capaces de persistir durante periodos muy largos de tiempo, motivo por el cual se considera a los PAHs contaminantes tóxicos persistentes. Los PAHs se absorben por cualquiera de sus vías de exposición, y debido a su capacidad lipofílica, se facilita su paso a través de las membranas celulares. Estos compuestos son metabolizados principalmente en el hígado y pulmones mediante la activación enzimática de las isoenzimas CYP1A1 y CYP1B1 del citocromo P-450 responsables de las activación metabólica de los PAHs para la formación de derivados epóxidos, que una vez formados pueden ser transformados a dihidrodioles y posteriormente a dioles-epóxidos, o transformarse a fenoles en una reacción catalizada por la enzima epóxido hidrolasa. Los fenoles a su vez son transformados a quinonas y dioles-fenol, que posteriormente reaccionan covalentemente con las moléculas de glutatión y sulfatos mediante reacciones enzimáticas con glutatión-s-transferasa y sulfatasas, formando así complejos orgánicos glucurónidos o sulfónicos que son eliminados del organismo a través de heces y orina (Shimada y cols. 1999; Misaki y cols. 2007; Ruan y cols. 2007). 35 Al ser compuestos tóxicos, persistentes, hidrofóbicos y que se acumulan en la biota (Meador y cols. 1995) el ser humano puede estar expuesto a ellos por vía dérmica, inhalatoria u oral. A día de hoy se consideran los siguientes mecanismos de acción de los PAHs: a) Conversión metabólica a intermediarios reactivos electrofílicos que pueden unir covalentemente blancos nucleofílicos en el ADN, ARN y proteínas, por lo que, además de formar aductos en el ADN e inducir mutaciones y eventualmente tumores, los metabolitos reactivos pueden reaccionar con otras células blanco e interferir con la transcripción, replicación del ADN y la síntesis de proteínas. Asimismo, ciertos metabolitos de los PAHs pueden inducir procesos inflamatorios (Bostrom y cols. 2002). b) Alta afinidad por el aryl hydrocarbon receptor (AhR), y la subsecuente sobreregulación transcripcional de una batería de genes involucrados en la biotransformación, crecimiento y diferenciación celular. La estimulación del crecimiento parece ser el principal componente de promoción en la carcinogénesis química mediada por algunos PAHs (Bostrom y cols. 2002). c) Efecto inhibitorio sobre la comunicación intercelular (Bostrom y cols. 2002). Como consecuencia de la existencia de más de 100 PAHs diferentes y de un escaso conocimiento de sus potenciales mecanismos de acción los efectos sobre la salud de los PAHs individuales son limitados y dispares. Algunos autores han sugerido una asociación entre los niveles de exposición a estas sustancias y el desarrollo cognitivo en niños. El riesgo de presentar déficits en el lenguaje, la lectura y las matemáticas en los primeros años escolares es mayor entre los niños más intensamente expuestos (Perera y cols. 2006). 36 A nivel inmunológico, está descrito que la exposición a altas concentraciones atmosféricas de benzo(a)pireno (0,5 mg/m3) reduce los niveles de las inmunoglobulinas séricas IgG, IgA e IgM. En un estudio realizado en niños residentes en Estados Unidos que estuvieron expuestos en la etapa prenatal a concentraciones de 0,49-34,48 ng/m3 de ocho PAHs diferentes, asocian estos niveles de exposición un aumento del riesgo del desarrollo de asma (Perera y cols. 2006). Como ya se ha dicho, presentan ciertos efectos genotóxicos, esto es, incremento de mutaciones en linfocitos periféricos y formación de aductos en el ADN (Schoket 1999; Tang y cols. 2006). Algunos PAHs son carcinógenos transplacentarios en bioensayos experimentales, por lo que producen tumores en hígado, pulmón, tejido linfático y sistema nervioso. El número de aductos encontrados en madres e hijos expuestos a altas concentraciones de PAHs es mayor; y el peso al nacimiento, así como el diámetro de la cabeza de los niños con mayores niveles de exposición es significativamente menor (Choi y cols. 2006; Tang y cols. 2006). También se han reportado asociaciones entre el daño al ADN y la reducción del crecimiento fetal (Choi y cols. 2006). Según la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (International Agency for Research on Cancer; IARC), a día de hoy, hay evidencia suficiente de que algunos PAHs son agentes que pueden relacionarse con el cáncer de pulmón, vejiga y piel (Armstrong y cols. 2004; Ruan y cols. 2007). Los ocho PAHs que han sido considerados típicamente como posibles o probables carcinógenos son: benzo(a)antraceno, cryseno, benzo(b)fluoranteno, benzo(k)fluoranteno, benzo(a)pireno e indeno(1,2,3-c,d)pireno (Menzie y cols. 1992). Aunque no existen datos en humanos para cada uno de los PAHs, la IARC ha reevaluado los efectos carcinogénicos de estos compuestos (IARC 2002). De acuerdo a la última lista de agentes evaluados por la IARC, el benzo(a)pireno se encuentra clasificado como grupo 1, esto es: carcinogénico para el hombre. Esta categoría se aplica cuando existen pruebas suficientes de 37 carcinogenicidad en humanos o excepcionalmente, como es en este caso, si las pruebas en humanos no son suficientes pero si lo son en animales de experimentación y existen pruebas contundentes en humanos expuestos de que el agente actúa mediante mecanismos relevantes para la carcinogenicidad. Dentro del grupo 2A (probablemente carcinogénico para el hombre) se encuentra el dibenzo(a,h)antraceno. Esta categoría se usa cuando existen pruebas limitadas de la carcinogenicidad en humanos y pruebas suficientes en experimentación animal. Por último benzo(a)antraceno, criseno, benzo(b)fluoranteno, benzo(k)fluoranteno, indeno(1,2,3-c,d)pireno y el naftaleno se encuentran clasificados como dentro del grupo 2B, (posiblemente carcinogénicos en humanos). Esta categoría incluye compuestos para los que existen pruebas limitadas de carcinogenicidad en humanos y pruebas insuficientes de carcinogenicidad en experimentación animal. Existen otras agencias de clasificación de sustancias según sus efectos carcinogénicos, sin embargo, en esta tesis Doctoral, se hace referencia a lo reportado por la IARC (Tabla 2). 38 Tabla 2 . Clasificación de distintos PAHs respecto a su carcinogenicidad PAH Carcinogenicidad IARC (Grupo) Naftaleno 2B Acenafteno 3 Acenaftileno - Fluoreno 3 Fenantreno 3 Antraceno 3 Fluoranteno 3 Pireno 3 Benzo(a)antraceno 2B Criseno 2B Benzo(a)pireno 3 Benzo(b)fluoranteno 2B Benzo(k)fluoranteno 2B Benzo(a)pireno 1 Benzo(g,h,i)perileno 3 Dibenzo(a,h)antraceno 2A Indeno(1,2,3-c,d)pireno 2B IARC: International Agency for Research on Cancer. 5.9. Exposición a contaminantes de origen industrial a través del ambiente laboral y/o tabaco y/o dieta: bifenilos policlorados (PCBs) Debido a la mayor incidencia de cáncer vesical en población urbana y fumadora, se decidió incluir en este trabajo la cuantificación de los niveles de contaminantes de origen industrial potencialmente carcinogénicos, como son los bifenilos policlorados, ya que es precisamente la población fumadora, de hábitat urbano y de mayor edad la que presenta mayores niveles de estos contaminantes tóxicos persistentes (CTPS) en la población canaria (Henriquez-Hernandez y cols. 2011a) 39 Los PCBs se incluyen en el gran grupo de contaminantes englobados bajo el nombre genérico de “dioxinas y compuestos análogos”. Este grupo engloba a un grupo de sustancias químicas complejas que se caracterizan por tener varios aspectos en común, entre ellos, contener cloro en sus moléculas y una alta liposolubilidad, lo que las convierte en sustancias estructural, ambiental y biológicamente persistentes, además de acumularse y biomagnificarse a lo largo de la cadena trófica (Van den Berg y cols. 1998; Van den Berg y cols. 2006). Además, las dioxinas y análogos son sustancias ampliamente conocidas por su potente capacidad carcinogénica, estando incluidas en el Grupo I de sustancias de la IARC. Los PCBs son una serie de compuestos organoclorados, que constituyen una serie de 209 congéneres, los cuales se forman mediante la cloración de diferentes posiciones del bifenilo, 10 en total. Cada posición puede ser sustituida por un átomo de cloro. Si las posiciones 2, 2’, 6 y 6’ no tienen ningún cloro los bifenilos se mantienen coplanares, hablando por tanto de PCBs coplanares o no-orto. Si tenemos una posición sustituida en cada lado, son PCBs mono-orto sustituidos, y el resto son los PCBs no coplanares. Su fórmula empírica es C12H10-nCln, donde n puede variar entre 1 y 10, siendo mayoritarios los congéneres con 2 a 7 cloros (Figura 10). Las propiedades fisicoquímicas de estos compuestos también dependen del grado de cloración y de si son no-orto, mono-orto o no coplanares. El periodo de semivida puede variar desde 10 días a un año y medio; por lo general estos compuestos son termoestables, no se degradan con la luz y son difícilmente biodegradables. Son ligeramente solubles en agua y muy liposolubles, por lo que se disuelven, en su mayor parte, en disolventes orgánicos (Headrick y cols. 1999; Huwe 2002; Schecter y cols. 2006). 40 Figura 10. Esquema general de la estructura química de los bifenilos policlorados (PCBs). A diferencia de las dioxinas, que aparecen como subproductos indeseables, los PCBs fueron intencionadamente fabricados. Fueron sintetizados por primera vez en 1881 por Schmidt y Schultz. Sin embargo, su producción comercial para una gran variedad de aplicaciones, comenzó mayoritariamente por la compañía Monsanto en los Estados Unidos en 1929 y se extendió hasta 1977 (Headrick y cols. 1999). Debido a sus características físico-químicas fueron utilizados para una gran variedad de usos; en sistemas cerrados tales como transformadores eléctricos, condensadores y sistemas de traspaso térmico (en todos ellos como retardantes de llama para evitar el incendio de dichos aparatos), así como también, en sistemas hidráulicos. Fueron utilizados en formulaciones de pinturas, polímeros, pegamentos, lubricantes, plastificantes, formulaciones de plaguicidas y como agentes para la suspensión de pigmentos en el papel de copia sin carbón (Safe 1990; Headrick y cols. 1999). Entre 1930 y 1977, se fabricaron alrededor de 2 millones de toneladas de PCBs (Kimbrough 1987; Safe 1990; Kimbrough 1995). Su fabricación está prohibida desde 1977 en Estados Unidos y desde entonces se fueron prohibiendo en todos los países en donde se fabricaba, siendo Alemania el último país en dejar de fabricarlos, en 1983 (Schecter y cols. 2006). Sin embargo, se estima que de los dos millones de toneladas que se fabricaron, un 31%, es decir 370.000 toneladas, todavía están presentes en el medioambiente global, donde aún no han sufrido degradación. Además, se estima que unas 780.000 toneladas más siguen funcionando hoy día en equipos eléctricos antiguos. Las dioxinas (polichlorodibenzodioxins; PCDDs) son un grupo amplio y estructuralmente relacionado de hidrocarburos aromáticos clorados (Institute of Medicine (U.S.). Committee on the Implications of Dioxin in the Food Supply. y cols. 47 el 4% restante de una mezcla de otros compuestos. Su volatilidad es intermedia entre la del lindano y la del DDT. Es prácticamente insoluble en agua y soluble en éteres, cetonas, hidrocarburos aromáticos y alifáticos. Es relativamente estable ante los ácidos, mientras que en medio alcalino libera ácido clorhídrico con facilidad. De manera similar, el heptacloro y el endosulfán tienen limitada solubilidad en agua, se disuelven preferentemente en cloroformo, tetracloruro de carbono, xileno y otros disolventes orgánicos y son moderadamente solubles en etanol. Son estables ante la humedad, el aire y el calor, y no se degradan por la acción de la luz ultravioleta. El heptacloro es moderadamente estable en presencia de agua, ácidos, bases y agentes oxidantes. En el ambiente, se transforma para dar su epóxido, el cual es todavía más estable. El endosulfán es sensible a los ácidos y a las bases y, en presencia de agua, se hidroliza, dando lugar a endosulfandiol, el cual carece de acción insecticida. La aldrina es muy poco soluble en agua. Este compuesto es estable ante los ácidos débiles, las bases y el calor y es sensible a la acción de la luz ultravioleta. En presencia de ácidos fuertes y tras su biotransformación en los seres vivos, se transforma en dieldrina, la cual es mucho más estable. La dieldrina y endrina poseen características físicoquímicas similares a las de la aldrina. El mírex forma cristales incoloros, y es prácticamente insoluble en agua, pero moderadamente soluble en benceno, tetracloruro de carbono, xileno y otros disolventes orgánicos. En condiciones ambientales, es extremadamente estable y persistente. La clordecona es muy similar al mirex. Terpenos clorados (Canfeclor): El canfeclor, más conocido por su primer nombre comercial toxafeno, tiene un contenido de cloro del orden del 67-69%. El número de productos químicos individuales que forman parte del toxafeno así como sus estructuras es desconocido. Al igual del resto de los OCs, es poco soluble en agua. Se descompone por la acción de la luz solar, liberando ácido clorhídrico. Bencenos policlorados (pentaclorobenceno, hexaclorobenceno): El hexaclorobenceno es un sólido blanco cristalino que no se encuentra de forma natural en el medio ambiente. Es prácticamente insoluble en agua y muy soluble en disolventes orgánicos, como hexano, benceno o cloruro de metileno. En condiciones 48 ambientales, es extremadamente estable y persistente. Además de haber sido utilizado hasta el año 1965 como plaguicida, se forma espontáneamente a partir de otros compuestos orgánicos policlorados, como subproducto industrial y en la combustión de residuos sólidos urbanos. El pentaclorobenceno tiene unas características muy similares a las del hexaclorobenceno. Todos los OCs comparten varias características físicoquímicas, principalmente su liposolubilidad, la estabilidad química y sobre todo su elevada resistencia a la degradación. En la Tabla 3 se muestra el periodo durante el que permanecen inalterados en el suelo. Desde principios de los años 70 del siglo pasado, un país tras otro han ido restringiendo o prohibiendo el uso de la mayor parte de los OCs, a menudo con el DDT como única excepción para el control de vectores de enfermedades infecciosas, principalmente la malaria. Los datos sobre el uso real actual de determiTabla 3. Vida media en el suelo de los POCs incluidos en el convenio de Estocolmo Plaguicida Vida media aproximada Aldrina 5 años en suelos templados Camfeclor (Toxafeno) 3 meses - 12 años Clordano 2 - 4 años DDT 10 - 15 años Dieldrina 5 años en suelos templados Endrina Hasta 12 años HCB 3 - 6 años Heptacloro Hasta 2 años Mirex Hasta 10 años HCH Días - 3 años nados OCs son muy difíciles de obtener, y en ocasiones los que hay, ofrecen poca fiabilidad (Tabla 4). 49 A fecha de 2010, la producción y utilización de la mayoría de los OCs, con la ya mencionada excepción del DDT, había cesado prácticamente por completo en todos los países desarrollados, si bien algunos de ellos, como los que se utilizan para el control de las termitas (aldrina, heptacloro, mirex) han seguido siendo utilizados en países como Australia o Estados Unidos hasta finales de los años 90. Algunos otros, como el HCB, si bien ya ha dejado de fabricarse y utilizarse en prácticamente todo el mundo, sigue siendo liberado al medioambiente, ya que es un subproducto frecuente de numerosos procesos químicos industriales y también, en menor medida, de la incineración de residuos sólidos urbanos. En los países en vías de desarrollo, si bien ha habido una reducción importante en su uso, debida principalmente a las restricciones al comercio de productos agrícolas con residuos de plaguicidas, algunos de los cuales son ampliamente utilizados. Una buena parte de estos son el ya mencionado DDT, como plaguicida residual para el control de vectores de enfermedades, y el clordano y heptacloro para proteger la madera del ataque de las termitas. Con respecto al lindano (gamma hexaclorociclohexano), en noviembre de 2006, 52 países habían prohibido su uso, y 33 más lo habían restringido, pero 17 países más, entre ellos Estados Unidos o Canadá, continuaban usándolo en la agricultura y en aplicaciones farmacéuticas (Commission-for-EnvironmentalCooperation 2006). Tras la inclusión por la UNEP del lindano en el “Convenio de Estocolmo sobre Contaminantes Tóxicos Persistentes” el 8 de mayo de 2009 (United-Nations-Environmental-Program 2001), el uso agrícola ha cesado por completo en todos los países que han ratificado el Convenio, pero las aplicaciones farmacéuticas - para el control de piojos y la sarna - constituyen una excepción y puede seguirse utilizando durante 5 años más. Estados Unidos, país que aún no ha ratificado el Convenio de Estocolmo, también ha prohibido el uso agrícola del lindano en su territorio, y reserva los usos farmacéuticos como tratamiento de segunda elección para piojos/sarna (Environmental-Protection-Agency 2006 ). 50 Tabla 4. Últimos usos registrados de los OCs incluidos en el Convenio de Estocolmo Plaguicida Últimos usos conocidos Aldrina Contra termitas y otras plagas rastreras, almacenamiento de cereales, control de vectores. Camfeclor (Toxafeno) Insecticida en cultivos de algodón. Clordano Contra termitas y otras plagas rastreras. DDT Control de vectores transmisores de enfermedades infecciosas para el hombre y animales (anopheles spp., mosca tse-tse, pulgas). Dieldrina Control de la langosta, termitas, y vectores de enfermedades humanas. Endrín Antiguamente utilizado para el control de roedores e insectos. No se conocen usos actuales ni recientes. HCB Antiguamente utilizada para el tratamiento de semillas contra enfermedades fúngicas, así como para fines industriales. No se conocen usos agrícolas o industriales actuales o recientes. Heptacloro Contra termitas y otras plagas rastreras. Mirex Contra hormigas cortadoras de hojas, termitas y como retardante de llama y otros fines industriales. HCH Uso agrícola general. Aplicaciones farmacéuticas. Aplicaciones veterinarias. Insecticida para instalaciones ganaderas. Endosulfan Uso agrícola común. El clordano (también denominado kepona), aunque dejó de utilizarse en la mayor parte de los países hace décadas prácticamente al mismo tiempo que el DDT, no fue incluido en el Convenio de Estocolmo hasta 2009 junto con el lindano. Sólo en algunos países su uso continuó hasta mediados de los 90 (Cabidoche y cols. 2009). 51 Finalmente, mencionar que el endosulfán no está aún regulado por el Convenio de Estocolmo. No obstante, ha sido incluido entre los analitos de interés para este trabajo de Tesis Doctoral ya que sin duda es uno de los firmes candidatos a una próxima inclusión, y cuyos efectos sobre la salud en general y el cáncer de vejiga en particular, no son del todo conocidos. Hasta la fecha su uso ha sido prohibido en más de 62 países, incluidos los de la Unión Europea y por consiguiente España, donde dejó de utilizarse en enero de 2008 (Commission-for-EnvironmentalCooperation 2006). Hasta entonces, era ampliamente utilizado en nuestro país, por ejemplo en el cultivo de tomates en Almería, Murcia o Canarias. Este plaguicida fabricado por Bayer sigue siendo ampliamente utilizado en muchos países del mundo para el control de plagas agrícolas, preservación de madera, jardinería o control de la mosca tse-tse (Srivastava y cols. 2009). Cuando hablamos del mecanismo de acción tóxica de los OCs hay que distinguir claramente entre el mecanismo que produce la toxicidad aguda, responsable de la amplia utilización que durante décadas han tenido estos compuestos en el control de plagas, de los mecanismos de toxicidad a largo plazo, comunes además a gran parte del resto de CTPs, que se producen tras la exposición inadvertida a bajas concentraciones de estos compuestos durante toda la vida de un individuo. Debido a que los mecanismos de toxicidad aguda, responsables de su efecto insecticida, no tienen relación alguna con su potencial efecto carcinogénico sólo se exponen a continuación de forma breve. Existen varios mecanismos de toxicidad aguda de los OCs. Un mecanismo común a todos ellos es la interferencia con el arco reflejo que se establece entre los nervios sensoriales, el sistema nervioso central y los nervios motores, que activan la respuesta muscular a los estímulos externos (Mariussen y cols. 2006). En insectos o mamíferos intoxicados por acción del DDT o compuestos similares, se observan temblores y convulsiones persistentes. El estudio de la conducta eléctrica de las fibras nerviosas muestra que los POCs inducen un alargamiento considerable de la fase descendente del potencial de acción, manteniendo así a la membrana de la neurona en un estado parcialmente despolarizado, muy susceptible a una nueva 52 despolarización total ante los menores estímulos. Esta modificación del comportamiento eléctrico de las células nerviosas se produce por varios mecanismos (Narahashi 2002; Mariussen y cols. 2006). El DDT, además, inhibe la calmodulina, necesaria para el transporte de iones calcio, a su vez imprescindible en la secreción de neurotransmisores en la sinapsis. También inhibe la adenosina trifosfatasa (ATPasa) de las neuronas, en particular las bombas de sodio, potasio y calcio, esenciales en la repolarización (Janik y cols. 1992). Los clorobencenos, clorociclohexanos y clorociclodienos también son inhibidores potentes de las bombas de Na+, K+ y Ca2+ en las membranas de las neuronas, provocando potenciales de acción disminuidos (Narahashi 2002; Mariussen y cols. 2006). Pero estos plaguicidas actúan también por estimulación del sistema nervioso central, ya que son antagonistas del ácido y-aminobutírico (GABA), con lo que bloquean el paso de iones cloruro inducido por este neurotransmisor (Coats 1990; Sunol y cols. 1998). El mecanismo inhibitorio de GABA explica los efectos colinérgicos de la dieldrina y del lindano en varias especies. A diferencia del DDT, para el que existen pocos casos de intoxicación con resultado de muerte, los clorociclodienos han sido causantes de numerosas muertes, además de ser muy persistentes y tóxicos para el medio ambiente. Se absorben rápida y eficazmente por vía cutánea, lo que contribuye a la mayor toxicidad que se ha observado en exposiciones ocupacionales. Además de los efectos sobre el sistema nervioso, la exposición a lindano y al llamado lindano técnico (una mezcla de todos los isómeros del HCH) produce efectos tóxicos sobre el hígado y los túbulos renales, aunque se desconoce el mecanismo de toxicidad sobre estos órganos (Srinivasan y cols. 1984; Reddy y cols. 1994). La intoxicación aguda en los mamíferos y el hombre se manifiesta con un cuadro sintomatológico derivado de su interferencia con los mecanismos de neurotransmisión: parestesia en la lengua, labios y cara, hipersensibilidad a estímulos externos, como la luz, sonido o tacto, irritabilidad, mareos, vértigo, 53 temblores y convulsiones (Milne 1995). Actualmente, debido a las restricciones del uso de estos productos, apenas se describen casos de este tipo de intoxicación. Sin embargo, los efectos crónicos de la exposición a dosis bajas pero continuadas a estos compuestos son el principal motivo de preocupación actualmente, y responden a mecanismos extremadamente complejos de disrupción endocrina que están sometidos a múltiples variables dependientes del individuo y de la presencia simultánea de otras sustancias químicas. Gran parte de los efectos adversos que tiene sobre la salud humana la exposición crónica a dosis bajas de estas sustancias se relacionan con el fenómeno denominado disrupción endocrina. Así, a los CTPs del tipo de los OCs y PCBs capaces de producir disrupción endocrina se les denomina “disruptores endocrinos”, esto es, “agente exógeno que interfiere con la síntesis, secreción, transporte, metabolismo, unión o eliminación de las hormonas que de forma natural están presentes en el cuerpo y que son las responsables de la homeostasis, la reproducción y el desarrollo” (Diamanti-Kandarakis y cols. 2009). La capacidad de los OCs para interferir en la función endocrina fue establecida hace más de 30 años. El hecho inicial fue la constatación de que la población de pájaros piscívoros había declinado en los Estados Unidos debido a problemas reproductivos graves. Tales observaciones permitieron la identificación del DDE, principal metabolito del DDT, como agente causante de las alteraciones reproductivas observadas (Hickey y cols. 1968). El problema fue parcialmente resuelto con la retirada del pesticida en 1972, aunque sus residuos continúan estando presentes en el medioambiente, afectando por tanto a las poblaciones expuestas incluida la especie humana. Otras observaciones medioambientales relacionadas con la exposición masiva de poblaciones animales, han ayudado a entender el problema de la disrupción hormonal. Los casos recogidos en la literatura científica son múltiples. Sirva de ejemplo lo ocurrido con la población de caimanes del lago Apopka en 54 Florida, que se expusieron al pesticida dicofol tras un vertido accidental en 1980. Diez años más tarde, la población de caimanes había descendido significativamente, habiendo aumentando la mortalidad en los huevos y la mitad de las crías nacidas languidecían y morían antes de los diez días; se encontraron, además, hembras adolescentes que tenían anormalidades severas en los ovarios y presentaban niveles de estrógenos en sangre dos veces más altos de lo normal. Por otro lado, los caimanes machos jóvenes estaban fuertemente feminizados, presentaban penes anormalmente pequeños y tenían niveles de estrógenos más altos en su sangre que los normales. Las investigaciones llevadas a cabo sirvieron para concluir que el plaguicida organoclorado dicofol que fue vertido al lago había alterado el sistema endocrino de los embriones, limitando la capacidad de los caimanes para reproducirse y dando lugar a las malformaciones descritas (Guillette y cols. 1995a; Guillette y cols. 1995b). Actualmente, el conocimiento acerca del mecanismo de acción de los OCs como disruptores endocrinos es bastante profundo, pero quedan aún grandes lagunas en la comprensión global de sus efectos sobre la salud del hombre y el resto de los seres vivos. En un principio, se pensaba que los OCs ejercían sus efectos principalmente a través de su unión con los receptores nucleares para hormonas, incluyendo los receptores de estrógenos (REs), los receptores de andrógenos (RAs), los receptores de progesterona (RPs), los receptores de hormonas tiroideas (RTs) y los receptores de retinoides, entre otros. En términos muy amplios, las dioxinas, PCBs y OCs contienen grupos halogenados en su estructura (con sustituciones por átomos de cloro y bromo) y muchas de estas moléculas contienen un grupo fenólico que se piensa que es el responsable de conferirles similitud con las hormonas esteroideas, siendo así reconocidos como ligandos por los receptores de dichas hormonas, ya sea como agonistas o como antagonistas. Hoy en día, la base científica de conocimiento sobre el tema ha aumentado y muestra que el espectro de mecanismos de acción es mucho mayor. Así, se sabe que los OCs actúan mediante su unión a los receptores nucleares, pero también a los receptores no nucleares (o de membrana) para hormonas esteroideas, 55 receptores no esteroideos (por ejemplo, receptores para neurotransmisores, como el receptor de serotonina, el receptor de dopamina o el receptor de norepinefrina), receptores huérfanos (como el receptor de aril hidrocarburos, AhR), rutas enzimáticas implicadas en la biosíntesis de esteroides y/o metabolismo, y numerosos otros mecanismos que convergen en la afectación de los sistemas endocrino o reproductivo. En este sentido se ha de reseñar que recientemente se ha descrito la capacidad de los OCs para alterar la actividad del sistema hormonal dependiente de la hormona del crecimiento (Sistema GH-IGF), lo cual abre nuevas puertas a la acción tóxica de estos compuestos (Boada y cols. 2007; Zumbado y cols. 2010). Muchos de los efectos que ejercen los OCs son paradójicos. Lo primero que llama la atención de estas sustancias, es que incluso a dosis infinitesimales, pueden producir anormalidades endocrinas o reproductivas, particularmente si la exposición tiene lugar en un periodo crítico del desarrollo. En algunos casos, las dosis bajas pueden producir efectos más potentes que las dosis más altas, dando lugar a curvas de dosis-respuesta en forma de “U” o de “U invertida” (Boada y cols. 2007; vom Saal y cols. 2007). Por otra parte, la literatura también demuestra que los OCs juegan un papel relevante en enfermedades de etiología compleja como la obesidad, la diabetes mellitus, la enfermedad cardiovascular o el cáncer, si bien la dimensión de sus implicaciones es todavía poco conocida. Aunque la evidencia es limitada, los datos apuntan a asignar un papel potencial de los OCs (y también PCBs y dioxinas), ya sea directa o indirectamente, en la patogenia de la adipogénesis y la diabetes (Diamanti-Kandarakis y cols. 2009). A muchos de estos compuestos estamos expuestos durante toda nuestra vida, incluso antes de nacer, como lo demuestra el hecho de que hayan podido ser medidos en el líquido amniótico de mujeres gestantes (Luzardo y cols. 2009). Las consecuencias de la exposición a los CTPs pueden ser muy diferentes dependiendo de la edad a la que se produzca la exposición. Es decir, que la exposición de un adulto a CTPs puede tener consecuencias muy diferentes a la de un feto en desarrollo o un niño, siendo el 56 desarrollo y la infancia los periodos más críticos a los efectos adversos de estos compuestos. Tanto es así que en la literatura científica se ha acuñado el concepto de “las bases fetales de las enfermedades del adulto", para describir la forma en que las sustancias presentes en el medio ambiente en el que se desarrolla un organismo (la madre en los mamíferos o el huevo en el resto de los vertebrados) interactúan con los genes del individuo para determinar su propensión a desarrollar una enfermedad o disfunción en el futuro. En términos más amplios, la Endocrine Society ha extendido este concepto a la infancia, (Barker 2003). El concepto de las “bases del desarrollo de las enfermedades del adulto” lleva implícito el hecho de que existe un lapso de tiempo entre el inicio de la exposición y las manifestaciones clínicas de las consecuencias de la misma. En otras palabras, las consecuencias de la exposición a los OCs (o PCBs o dioxinas) pueden no aparecer inmediatamente ni de forma precoz en la vida, sino que pueden manifestarse con el transcurso del tiempo, incluso muchos años después, durante la vida adulta (Barker 2003). Así por ejemplo, la alteración del pico fisiológico de IGF que tiene lugar en la pubertad, debido a la exposición a OCs, va marcar los niveles de IGF en la edad adulta, determinando como consecuencia la aparición de mayor riesgo para la aparición de ciertas patologías (Zumbado y cols. 2010). Si los individuos y las poblaciones están expuestos a un determinado contaminante, es muy probable que lo estén a otros muchos de forma simultánea, ya que rara vez los ecosistemas están contaminados por un único compuesto. Esto tiene mucha relevancia de cara a los efectos clínicos, ya que, independientemente de los efectos que hayan podido ser demostrados en experimentos in vitro o in vivo, la presencia de otros contaminantes en las situaciones reales de exposición puede inducir fenómenos de adición de efectos, pero también de sinergismo y de potenciación (Kortenkamp 2007). La acción tóxica de la exposición crónica a OCs no sólo puede afectar a la persona expuesta, sino también a las generaciones subsiguientes. Los mecanismos no están claros, si bien investigaciones recientes sugieren que los mecanismos pueden ser no genómicos, es decir. que no se transmitirían por una mutación en la 63 para no fumadores, lo que sugiere que la actividad de esta enzima protege por igual contra sustancias relacionadas con el tabaco y no asociadas a él. La disminución del riesgo entre los individuos con función normal de la enzima parece no estar relacionada con los fenómenos de detoxificación de los PAHs entre los fumadores. Otro posible mecanismo de acción de estas enzimas es la detoxificación de especies reactivas de oxígeno, lo que protegería al ADN del daño provocado por este tipo de sustancias (Hayes y cols. 2000). La asociación entre otros polimorfismos de GST, por ejemplo GSTT1 o GSTP1, y el cáncer de vejiga ha sido explorada en distintos estudios, con resultados contradictorios. Por otra parte, el citocromo P-450 CYP1A2 está relacionado con procesos de activación de aminas aromáticas mediante N-hidroxilación, y es en la especie humana un gen bastante polimórfico. No obstante, la relevancia funcional de las variables genéticas de CYP1A2 no están bien caracterizadas (Landi y cols. 1999), y no se conoce exactamente el papel que juega este gen en la carcinogénesis vesical. Desde luego, polimorfismos en otros genes del metabolismo de xenobióticos pueden tener más o menos relevancia. Es el caso de los genes CYP1A1, CYP1B1, CYP2C19, CYP2D6 o CYP2E1; sulfotransferasas relacionadas con la activación de aminas aromáticas; e hidrolasas relacionadas con el metabolismo de los epóxidos que se forman durante el metabolismo oxidativo de sustancias como los PAHs. El papel jugado por genes relacionados con la reparación del ADN también parece ser relevante. Una compleja e intrincada red de procesos repara los daños causados al ADN por sustancias exógenas al organismo. La vía de reparación por escisión de nucleótidos (NER) es la principal a la hora de resolver los aductos formados en el ADN como consecuencia de la exposición a aminas aromáticas y otras sustancias del tabaco. Algunos estudios epidemiológicos han sugerido que polimorfismos en genes relacionados con mecanismos NER podrían ejercer algún tipo de papel en el riesgo de cáncer vesical (Sanyal y cols. 2004; Sak y cols. 2005; Schabath y cols. 2005; Garcia-Closas y cols. 2006), este hecho no está aún establecido. Los procesos de reparación por escisión de bases (BER), se encargan de eliminar bases nucleotídicas dañadas por la acción de agentes alquilantes y 64 oxidativos. Esta vía participa de la reparación de roturas dobles de la cadena de ADN y se encarga de mantener la integridad genómica (Andrew y cols. 2006; Wu y cols. 2006). Aunque se han hecho estudios de polimorfismos en este tipo de genes en relación al cáncer de vejiga, los resultados son bastante inconsistentes. Se ha intentado determinar la capacidad de reparación del daño al ADN tras la exposición a carcinógenos en linfocitos de sangre periférica, como medida integrada de sensibilidad a este tipo de sustancias. Los casos de cáncer de vejiga parecen ser más sensibles que los controles a los efectos del benzo(a)pireno diol epóxido (Schabath y cols. 2003). La determinación de la longitud de los telómeros también se ha usado como marcador de estabilidad genética y susceptibilidad al cáncer. Existen algunos trabajos que asocian la presencia de telómeros más cortos con el aumento del riesgo de padecer cáncer vesical (Wu y cols. 2003a; Broberg y cols. 2005). Debido a todo lo apuntado anteriormente, en el presente trabajo se procedió a estudiar en los casos y controles de nuestro estudio la expresión de una serie de polimorfismos de genes relacionados con la eliminación de tóxicos (glutatión-Stransferasa, GST), con la proliferación celular y la angiogénesis (factor de crecimiento endotelial vascular; VEGF) y con la incorporación de xenobióticos a la célula (resistencia a multidrogas; MDR) (Henriquez-Hernandez y cols. 2011b). 65 66 67 68 JUSTIFICACIÓN 69 70 El cáncer vesical es el cáncer más frecuente en el tracto urinario y, como cualquier neoplasia, su etiología se relaciona con múltiples factores tanto intrínsecos como extrínsecos. Entre los factores extrínsecos, la exposición a potenciales carcinógenos ambientales se considera que contribuye de forma relevante a la mayoría de los casos de carcinomas uroteliales. En este sentido, se ha de tener en cuenta que el 90% de los tumores del tracto urinario inferior se originan a partir de células transicionales y que la superficie urotelial de la mucosa de la vejiga está expuesta a múltiples sustancias químicas que son excretadas por la orina. Muchas de esas sustancias pueden ser, per se, carcinógenos, o bien serlo los metabolitos generados tras sufrir procesos de biotransformación (bioactivación). Los agentes carcinógenos inducen lesiones del ADN de las células, y de este modo desencadenan y perpetúan los procesos de tumorigénesis. A día de hoy se puede afirmar que la exposición a sustancias químicas puede jugar un papel etiológico relevante en este tipo de patología tumoral. Sin embargo, parece claro que el riesgo inducido por la exposición a contaminantes ambientales carcinogénicos resulta altamente modulado por factores intrínsecos, tales como, entre otros, la capacidad individual de metabolización y biotransformación, o la expresión y actividad de factores de proliferación celular tipo Insulin-like Growth Factors (IGF). La capacidad individual de metabolización y biotransformación viene marcada por la expresión de genes que codifican para enzimas de biotransformación y eliminación, de tal forma que de la actividad de estas enzimas dependen los procesos de activación y la generación de metabolitos carcinogénicos. Por ello, la distribución de determinados polimorfismos de estos genes en las diferentes poblaciones parece jugar un papel crucial en la relevancia de la exposición a carcinógenos ambientales como factor de riesgo de cáncer de vejiga. La actividad del sistema GH-IGF, debido a su efecto como factor de proliferación celular, también se ha postulado como un potencial factor de riesgo, más aún cuando se ha descrito la posibilidad de que los niveles de IGF se vean influenciados por la exposición a contaminantes ambientales. 71 Diversos factores se han tenido en cuenta a la hora de plantear el presente trabajo de Tesis Doctoral: En primer lugar, la población de las Islas Canarias es una de las pocas poblaciones españolas y europeas en las que se ha estudiado en profundidad el nivel de contaminación por compuestos tóxicos persistentes (CTPs), presentando esta población, en general, unos niveles elevados de contaminación por plaguicidas organoclorados (OCs), especialmente en la población de edad superior a los 55-60 años; y unos niveles de contaminación por contaminantes industriales clorados (bifenilos policlorados; PCBs) inferiores a los descritos en otras poblaciones occidentales, con la excepción de la población canaria fumadora, urbana y mayor de 55-60 años, que presenta niveles de contaminación similares a los de otras regiones occidentales. En segundo lugar, en Canarias, como en todo el mundo occidental, la incidencia de cáncer vesical ha aumentado a partir de los años 50 del pasado siglo, al igual que se ha incrementado la exposición a contaminantes químicos, ya sean de origen industrial o agrícola. A este respecto se ha de destacar que la profesión de agricultor se ha postulado como un factor de riesgo para esta patología relacionándose con una mayor exposición a plaguicidas. En las Islas Canarias, el uso de plaguicidas es muy superior al que se registra en el resto del territorio nacional, probablemente por la expansión de un modelo de cultivo intensivo (invernaderos) que se extendió exitosamente en estas islas en los últimos 50 años del siglo pasado, debido a las características geográficas y climatológicas de este territorio. Es de destacar que muchos de estos plaguicidas son considerados sustancias potencialmente carcinogénicas para el ser humano, según informes de la Agencia Internacional de Investigación del Cáncer (International Agency for Cancer Research; IARC). En tercer lugar, la población de las Islas presenta peculiaridades en cuanto a la expresión de polimorfismos de genes de relevancia para los procesos de 72 metabolización y excreción, así como para los procesos de malignización y proliferación celular. En cuarto lugar, los niveles de contaminación por CTPs y las mezclas de contaminantes existentes en la población canaria parecen modular los niveles de los factores de proliferación celular ya citados, esto es los IGF y otros factores relacionados con la GH. En quinto lugar, hasta el momento y según nuestros conocimientos, no se han realizado estudios tendentes a evaluar la potencial relación existente entre los niveles plasmáticos de contaminantes químicos persistentes (PAHs, PCBs y OCs) con la presencia de cáncer vesical, teniendo en cuenta las variantes polimórficas de la población en lo relativo a genes de relevancia para los procesos de metabolización y tumorigénesis (GST, VEFG, MDR), así como la distribución de los niveles de IGF-I en la población estudiada. 79 80 Este estudio se ha llevado a cabo en los Servicios de Urología y Medicina Preventiva del Complejo Hospitalario Universitario Materno-Insular de Gran Canaria (CHUIMI), y en el Departamento de Ciencias Clínicas de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. 1. SUJETOS DEL ESTUDIO 1.1. UNIVERSO El universo de este estudio lo han constituido todos los habitantes de la zona de referencia del CHUIMI, que incluye: Centros de Salud de Gran Canaria (Cono Sur, San Roque, Polígono de San Cristóbal, San José, Triana, Miller Bajo, Tafira, El Calero, San Gregorio, San Juan, Las Remudas, Telde, Jinámar, Valsequillo, Ingenio, Agüimes, Vecindario, Tirajana, Maspalomas y Mogán), e Isla de Fuerteventura. En total, la población de referencia la forman 395.155 habitantes de ambos sexos, según censo del 2007 (fecha de inicio del estudio). 1.2. SELECCIÓN DE CASOS Para este estudio, se incluyeron a todos los casos incidentes y prevalentes de cáncer de vejiga, mayores de 14 años, que pertenecían al área de referencia del CHUIMI. El estudio se llevó a cabo entre febrero del 2007 y agosto del 2009 en el Servicio de Urología del CHUIMI para el tratamiento y seguimiento de cáncer vesical. Previamente a la cirugía se contactó con los pacientes seleccionados para solicitarles su colaboración en el estudio, y la firma del documento de “Consentimiento Informado” (ver Anexo I de la presente Tesis Doctoral), revisar los criterios de inclusión y no exclusión, cumplimiento del cuestionario y extracción de muestra de sangre. Para la recolección de datos, se elaboró un cuestionario basado en los factores de riesgo conocidos para el cáncer de vejiga. Posteriormente a la entrevista y extracción de sangre, se confirmó el diagnóstico clínico de cáncer de vejiga mediante los resultados del análisis histopatológico de los tejidos obtenidos en 81 quirófano según rutina del Servicio de Urología. En todos los casos se confirmó el diagnóstico de cáncer de vejiga mediante estudio histológico, por lo que no se excluyó a ninguno de los participantes por este motivo. Solo 2 casos rechazaron la participación en el trabajo por expreso deseo de no realizarse extracción de sangre alguna. Así, el número final de casos quedó establecido en 140. Los criterios de inclusión fueron: • Caso incidente o prevalente de cáncer de vejiga • Edad mayor de 14 años • Pertenecer al área de referencia del CHUIMI Los criterios de exclusión fueron: • Cáncer de vejiga secundario a otro tumor (caso secundario) • Residencia actual fuera de la zona de referencia del CHUIMI • Negativa a participar en el estudio • Dificultad para la comprensión del cuestionario (dificultades idiomáticas y/o cognitivas) • Imposibilidad de obtener muestra de sangre u orina 1.3. SELECCIÓN DE CONTROLES Se incluyó un control hospitalario por cada caso incluido, apareados individualmente por sexo y área de residencia. Los controles del estudio se seleccionaron de un listado predefinido de diagnósticos de enfermedades no oncológicas y no asociadas a los factores de riesgo conocidos de cáncer vesical ni a la exposición a contaminantes. Los criterios de inclusión fueron: • Diagnóstico de ingreso NO relacionado con los factores de riesgo conocidos de cáncer vesical. Por ejemplo: traumatismos y otros problemas ortopédicos, cirugía menor, hernias, otra cirugía abdominal, problemas dermatológicos, problemas oftalmológicos, y otras enfermedades. 82 • Diagnóstico de ingreso NO relacionado con los factores de riesgo conocidos de exposición a contaminantes (intoxicación aguda o crónica por pesticidas) • Edad mayor de 14 años • Pertenecer al área de referencia del CHUIMI Los criterios de exclusión fueron: • Diagnóstico previo de cáncer de cualquier origenç • Antecedentes de hematuria • Residencia actual fuera de la zona de referencia del CHUIMI • Negativa a participar en el estudio • Dificultad para la comprensión del cuestionario (dificultades idiomáticas y/o cognitivas) • Imposibilidad de obtener muestra de sangre y orina Tabla 5. Distribución de servicios y motivos de ingreso de los CONTROLES (n=206) Servicio hospitalario n % Servicio Médico 96 46,6 Servicio Quirúrgico 53 25,7 Servicio Médico-quirúrgico 57 27,7 Motivo de ingreso Cardiovasculares 50 24,3 Infecciosas 41 19,9 Litiasis 54 26,2 Traumatismos 40 19,4 La mayoría de los controles incluidos en esta Tesis Doctoral procedían de Servicios Médicos (46,6%). Así mismo, los motivos de ingreso mayoritarios fueron por litiasis (26,2%) y afectaciones cardiovasculares (24,3%). La Tabla 5 recoge de manera detallada el resto de información a este respecto. 83 2. DISEÑO El presente trabajo de Tesis se ha diseñado como un estudio de casos y controles de base hospitalaria. Para la recolección de datos, se elaboró un cuestionario (cuestionario contenido en el Anexo II de esta Tesis Doctoral). Dicho cuestionario estuvo basado en los factores de riesgo conocidos para la génesis y desarrollo de cáncer vesical, en el cuestionario desarrollado para el estudio EPICURO y por último en la hoja de recogida de datos de la Encuesta Nutricional de Canarias (Estudio ENCA). Para evaluar el nivel de comprensibilidad de las preguntas, se llevó a cabo un estudio piloto en una muestra de pacientes ingresados en el Servicio de Urología del CHUIMI. El cuestionario se suministró por un profesional sanitario específicamente formado. Para la selección de casos, un miembro del Servicio de Urología del CHUIMI revisó, de lunes a viernes, la lista de pacientes programados para cirugía o revisión en Pruebas Funcionales de Urología para cistoscopias. Una vez seleccionados los sujetos incluidos en el estudio, el autor de esta Tesis o personal de enfermería previamente adiestrado informaba a los mismos del objetivo del estudio y sus pormenores, y les facilitaba el documento de “Consentimiento informado”. Dicho consentimiento, aprobado por la Comisión de Ética de este Complejo Hospitalario se muestra en el Anexo I. A continuación se les explicaba el cuestionario que debían contestar (ver Anexo II) y se aclaraban las dudas al respecto, dando tiempo al paciente para que lo cumplimentara adecuadamente. Se ha de resaltar que la correcta cumplimentación del cuestionario es uno de los pasos críticos en un estudio de casos y controles. Como ya se ha dicho el sesgo de información es uno de los principales problemas que se plantea en este tipo de 84 estudios. Puesto que los casos se reclutan únicamente una vez presentan la enfermedad, con frecuencia refieren cualquier exposición de forma más cuidadosa y detallada por la natural tendencia a hallar una explicación a su padecimiento. Otro problema adicional es que el entrevistador no es ciego a la situación de caso o control del paciente entrevistado, por lo que puede contribuir de forma inconsciente a diferencias sistemáticas en la información procedente de casos y controles (por ejemplo mediante una entrevista más intensa a los casos). En nuestro estudio, mediante entrevista directa y cuestionario se recogieron datos demográficos y socioeconómicos (edad, sexo, actividad profesional, procedencia geográfica, lugar de residencia los últimos cinco años, nivel cultural y social, etc.), datos antropométricos (peso y talla), antecedentes personales y familiares (de patologías tumorales u otras enfermedades), datos sobre hábitos (tabaco, alcohol, consumo de agua, café y otras bebidas, etc.). Por cada caso incluido, se seleccionó un control emparejado por sexo, y área de residencia, tal y como ya se ha dicho. Para ello, se revisaron diariamente los pacientes ingresados en los servicios de cirugía general, oftalmología, traumatología, dermatología, neurocirugía y cirugía mayor ambulatoria del CHUIMI. Se procedió a la selección de aquellos controles que cumplían los criterios de inclusión y no exclusión. Una vez incluidos los pacientes (casos y controles) definitivamente en el estudio se procedía a la recogida de una muestra de sangre por parte del personal de Enfermería del Servicio de Urología del CHUIMI. Las muestras se mantuvieron refrigeradas en tubos de vidrio con oxalato cálcico, hasta su centrifugación (3000 x g) para la obtención de suero por el autor de esta Tesis. En ningún caso transcurrieron más de 8 h. entre la recogida de la muestra y la obtención de suero. El sobrenadante (elementos formes) y cada una de las muestras de suero fueron entonces cuidadosamente etiquetadas mediante el nº de Historia Clínica del paciente y trasladadas al Laboratorio de Toxicología del Departamento de Ciencias Clínicas de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, donde se llevó a cabo 85 de forma inmediata la extracción de ADN en los sobrenadantes (en aquellos casos y controles que se incluyeron en el estudio de polimorfismos), mientras que las restantes muestras de suero permanecieron congeladas a -80 ºC hasta la realización del análisis toxicológico. El personal del laboratorio desconocía la identidad de las muestras, para asegurar que los análisis se realizaban de manera ciega. 3. VARIABLES Se recogieron las siguientes variables que fueron codificadas de la siguiente forma en una base de datos diseñada al efecto: 3.1. VARIABLES DEMOGRÁFICAS Datos administrativos: Nº de historia clínica: único en el hospital. Se comprobaba en cada caso que a la persona entrevistada correspondían nombre, apellidos y número de seguridad social. Fecha de la entrevista (fecha entrada en el estudio): recogida como dd/mm/aaaa. Servicio responsable del ingreso actual y motivo de ingreso: según criterio del médico responsable del paciente. Edad: recogida como fecha de nacimiento (dd/mm/aaaa). Sexo (1 = varón; 2 = mujer). Talla actual en centímetros: habitualmente registrada por el servicio de anestesia, o en su defecto, en el momento de la entrevista. Peso actual en kilogramos: registrada por el servicio de anestesia, o en su defecto, en el momento de la entrevista (recogida hasta decigramos). Domicilio actual: en el cual residía al menos durante el último año, comprobándose así el cumplimiento de ese criterio de inclusión. Se procedió a codificar el lugar de residencia de la siguiente forma: área urbana (>100.000 86 habitantes), área semirrural (10.000-100.000 habitantes) o área rural (<10.000 habitantes). Domicilios anteriores en los que residió más de un año (codificado según área urbana (>100.000 habitantes), semirrural (10.000-100.000 hab) o Rural (<10.000 hab)). Los datos demográficos de la población control están resumidos en la Tabla 6. De los 206 individuos incluidos, 168 eran hombres (81,6%). La media de edad de la población control fue de 65.1 años, estando casi un tercio de la misma contenida en el segmento de edad comprendido entre los 61 y los 70 años (64 individuos). El peso medio fue de casi 76 kilogramos, mientras que la estatura media de la población control fue de 169 centímetros. Así, más de la mitad de la población registró un índice de masa corporal (IMC) comprendido entre los 25 y los 29,99 kg/m2 (107 individuos, 51,1%), que es considerado por la Organización Mundial de la Salud (OMS) como sobrepeso. La mayoría de los individuos eran de la isla de Gran Canaria y habitan en entornos urbanos (161 sujetos, 78,2%) con más de 100.000 habitantes. Los datos demográficos de la población de casos están resumidos en la Tabla 7. La edad media de los casos era de 66.7 años, siendo la mayoría de ellos varones (85,7%). La mitad de la población presentaba sobrepeso (70 sujetos, 50%), vivía en la isla de Gran Canaria y habitaba entornos urbanos. 87 Tabla 6. Análisis descriptivo de las variables demográficas de la población control (n = 206) Variable N (%) Media ± SD Mediana (Rango) Sexo Hombre 168 81,6 Mujer 38 18,4 Edad (años) 65,1 ± 13,2 67 (37-93) <50 40 19,4 51-60 29 14,1 61-70 64 31,1 71-80 45 21,8 >80 28 13,6 Peso (Kg) 75,9 ± 12.1 72,5 (49-120) Altura (cm) 169 ± 8,3 170 (150-188) IMC (Kg/m2) 26,3 ± 3,3 25,9 (19-40) <20 2 1,0 20-24.99 72 35,0 25-29.99 107 51,9 >30 25 12,1 Isla Gran Canaria 202 98,1 Fuerteventura 4 1,9 Entorno Rural 7 3,4 Semirural 38 18,4 Urbano 161 78,2 Abreviaturas: SD, desviación estándar; IMC, índice de masa corporal. 88 Tabla 7. Análisis descr iptivo de las variables demográficas de la población de casos (n = 140) Variable N (%) Media ± SD Mediana (Rango) Sexo Hombre 120 85,7 Mujer 20 14,3 Edad (años) 66,7 ± 12,1 67 (41-92) <50 13 9,3 51-60 30 21,4 61-70 42 30,0 71-80 36 25,7 >80 19 13,6 Peso (Kg) 78,6 ± 11,5 79,0 (56-120) Altura (cm) 172 ± 6,7 172 (153-189) IMC (Kg/m2) 26,4 ± 3,6 25,8 (19-41) <20 2 1,4 20-24.99 51 36,4 25-29.99 70 50,0 >30 17 12,1 Isla Gran Canaria 134 95,7 Fuerteventura 6 4,3 Entorno Rural 4 2,9 Semirural 34 24,3 Urbano 102 72,9 Abreviaturas: SD, desviación estándar; IMC, índice de masa corporal. 95 3.4. VARIABLES ANALÍTICAS 3.4.1. Análisis de los niveles de contaminantes ambientales (plaguicidas organoclorados, bifenilos policlorados e hidrocarburos aromáticos policíclicos) en suero. La determinación de los contaminantes orgánicos persistentes se realizó a partir del suero tomado tanto en las muestras del grupo control como de casos. Se determinó un total de 52 contaminantes distintos tal y como se detalla en el Anexo III de esta Tesis Doctotal. La determinación de los niveles séricos de los contaminantes ambientales incluidos en este estudio se llevó a cabo mediante Cromatografía de Gases (GC) acoplada a Espectrometría de Masas de simple Cuadrupolo (GC-MS) tras extracción previa de los mismos mediante extracción en fase sólida (SPE) empleando para ello la metodología estandarizada y puesta a punto por investigadores del Grupo de Investigación en Medio Ambiente y Salud del Departamento de Ciencias Clínicas de esta Universidad. En el procedimiento de extracción en fase sólida de los contaminantes del suero, se sometieron las alícuotas de suero (2 ml) a una extracción mediante columnas C18 (200 mg (3 ml) Chromabond® C18ec columns (Macherey-Nagel, Alemania), previamente acondicionadas con metanol (3 ml) y agua ultrapura (3 ml) bajo vacío a un flujo de 1,5 ml/min. Las columnas C18 se montaron en una estación de vacío (Waters Corporation, EE.UU.) y se hizo pasar la muestra a un flujo de 0,5 ml/min. Posteriormente, las columnas se lavaron con 3 ml de agua al 5% de metanol y las columnas fueron desecadas bajo vacío durante 15 min. Los contaminantes retenidos en la columna fueron eluidos mediante 2 lavados consecutivos con 2 ml de diclorometano. El solvente obtenido tras la extracción se evaporó a sequedad mediante corriente de nitrógeno, para ser posteriormente solubilizado en 200µl of ciclohexano, que fue la muestra empleada en el análisis cromatográfico (Luzardo y cols. 2009; Henriquez-Hernandez y cols. 2011a). 96 Los analitos cuantificados en el presente estudio incluyen: 1. Los 16 Hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) más prevalentes y de mayor relevancia ambiental que son el naftaleno, acenaftileno, acenafteno, fluoreno, antraceno, fenantreno, fluoranteno, pireno, benzo[a]antraceno, criseno, benzo[b]fluoranteno, benzo[k]fluoranteno, benzo[a]pireno, indeno[1,2,3,-c,d]pireno, dibenzo[a,h]antraceno, benzo[g,h]perileno. 2. Los plaguicidas organoclorados (POCs), tipo difenilalifáticos: como metoxicloro y difeniltricloroetano (p,p’-DDT) y sus metabolitos difenildicloroetileno (p,p’-DDE), y difenildicloroetano (p,p’-DDD); el contaminante ambiental altamente persistente y acumulativo hexachlorobenceno (HCB); los cuatro isómeros derivados del hexaclorociclohexano (alfa-, beta-, gammay delta-HCHs); los ciclodienos dieldrin, aldrin, endrin, heptacloro (y sus metabolitos), mírex, clordano (isómeros cis y trans) y endosulfan (isómeros alfa y beta). 3. Los principales congéneres de bifenilos policlorados (PCBs; nº IUPAC: #28, 52, 77, 81, 101, 105, 114, 118, 123, 126, 138, 153, 156, 157, 167, 169, 180 y 189). Este grupo de PCBs cuantificados en este trabajo incluye dos grupos: de un lado aquellos congéneres más prevalentes y que se consideran marcadores de contaminación ambiental por PCBs y que son los denominados PCBs-Marcadores (M-PCBs; congéneres #28, 52, 101, 118, 138, 153 y 180); y por otro lado hemos incluido en este estudio los PCBs de acción similar a las dioxinas (dioxin-like PCBs; DL-PCBs: #77, 81, 105, 114, 118, 123, 126, 156, 157, 167, 169 y 189). Se realizaron cálculos previos de recuperación de estos analitos en muestras de suero “blancas”, contaminadas con mezclas de los mismos a dos 97 concentraciones conocidas diferentes, obteniéndose valores de recuperación de entre 89-107% para los PAHs, >85% para todos los POCs y de un 87-101% para los congéneres de PCBs. Los análisis cromatográficos para la determinación de COPs fueron realizados en un cromatógrafo de gases acoplado en tándem a un espectrómetro de masas de simple cuadrupolo Thermo-Finnigan TRACE DSQ (GC/MS), tal y como ha sido previamente descrito (Luzardo y cols. 2009). Se inyectó un volumen de 2 µl de los estándares o muestras en modo splitless. Se realizaron 3 análisis cromatográficos por muestra, con el fin de obtener los espectros de masas en dos modos de ionización diferentes. Las temperaturas del horno del cromatógrafo se programaron de la siguiente manera: inicialmente la temperatura fue de: 80ºC durante 1 min, seguido de un incremento de 10ºC/min hasta alcanzar los 300ºC, temperatura a la que permaneció durante 9 minutos más. En total cada carrera cromatográfica duró 30 minutos. En ese punto las compuertas traseras del horno se abrieron y el ventilador se puso en marcha permitiendo el enfriamiento de la cámara hasta 80ºC, dejándolo preparado para un nuevo análisis. La temperatura del puerto de inyección Split/splitless del cromatógrafo se programó a 250ºC con el fin de facilitar la volatilización de todos los analitos objeto de estudio, incluidos aquellos con mayor número de átomos de cloro en su estructura. La temperatura de la línea de transferencia que conecta el cromatógrafo con el espectrómetro de masas se programó a 310ºC. Para los congéneres de PCBs 28, 52, 101, y 118, para los PAHs y para los POCs 2,4’-DDT, 4,4’-DDT, 2,4’-DDE, 4,4’-DDE y metoxicloro, los espectros de masas se obtuvieron en el modo de ionización por impacto electrónico (GC/EIMS) a 70 eV, con una temperatura de la fuente de iones de 200ºC. Para el resto de COPs incluidos en este estudio los espectros de masas se obtuvieron en el modo de ionización química negativa (GC/NCIMS), usando metano como gas de ionización, a un flujo de 2,5 ml/min, en dos carreras cromatográficas diferentes. La primera se hizo para la obtención de datos correspondientes a los 98 siguientes analitos: aldrina; dieldrina; endrina; heptacloro; cis-clordano; transclordano; alfa endosulfán; beta endosulfán; alfa hexaclorociclohexano; beta hexaclorociclohexano; lindano; delta hexaclorociclohexano; hexaclorobenceno. La segunda carrera cromatográfica en modo GC/NCIMS se realizó para la obtención de datos de los congéneres de PCBs 77, 81, 105, 114, 123, 126, 138, 153, 156, 157, 167, 169, 180 y 189. El espectrómetro de masas se programó para que realizara la adquisición de datos en el modo de monitorización de iones seleccionados (SIM). Con el fin de lograr la máxima sensibilidad para cada analito la adquisición de datos se programó por segmentos de tiempo, de manera que en cada segmento se incluyera la adquisición de datos para un máximo de 2 analitos, si bien para la mayor parte de ellos la adquisición se hizo de forma individual. Para el estudio de los tiempos de retención en columna de cada compuesto de interés, la selección de los iones a monitorizar y las abundancias relativas de los mismos, se hizo un estudio previo con patrones certificados individuales de cada analito. Los patrones se inyectaron en el cromatógrafo de forma individual bajo las mismas condiciones cromatográficas que se usarían posteriormente en el análisis de muestras y en ambos modos de ionización, con el fin de determinar cuáles eran las condiciones óptimas de sensibilidad para cada uno de ellos. De esta manera se inyectó en el cromatógrafo 2 µl de una solución preparada a 1 µg/ml en ciclohexano de cada analito o estándar interno utilizado en este estudio. La adquisición de datos del espectrómetro de masas se programó en este caso en el modo de barrido completo en rango de 50 a 600 m/z. Partiendo de los espectros de masas obtenidos se seleccionaron 3 iones característicos para cada analito. Se seleccionó como ión cualificador aquel que presentaba una abundancia del 100% y se calcularon las abundancias relativas de los iones seleccionados para confirmación y cuantificación con respecto a éste. 99 Consideramos como límite de cuantificación (LOQ) un valor 5 veces superior al límite de detección (LOD) de cada analito. El LOQ fue de 0.05 mg/ml para los PAHs, de 0,01 ng/ml para el 2,4’-DDT, 4,4’-DDT, 2,4’-DDE, 4,4’-DDE, metoxicloro y PCBs 28, 52, 101, 118 y 138, de 0,005 ng/ml para los PCBs 153 y 180, y de 0,001 ng/ml para el resto de los analitos. La cuantificación se basó en el factor resultante de dividir el área del analito por el área del estándar interno y se realizó frente a una recta de calibrado de 6 puntos a partir de muestras de suero fortificadas en un rango de concentraciones que fue desde el LOQ de cada analito hasta 20 ng/ml. Para la cuantificación se usó el programa Xcalibur versión 2.11 de ThermoFisher Scientific Corporation (San José, EE.UU.). 3.4.2. Factor de crecimiento dependiente de insulina tipo I (IGF-I) proteína transportadora tipo 3 del factor de crecimiento dependiente de insulina (IGFBP-3) El factor de crecimiento para la insulina I fue determinado mediante medición cuantitativa en suero heparinizado de los pacientes haciendo uso de un analizador IMMULITE 2000®. Se trata de una prueba inmunométrica quimioluminiscente marcada enzimáticamente, de fase sólida. La medición cuantitativa de IGFBP-3 se realizó de la misma manera en un IMMULITE 2000® siguiendo las instrucciones del fabricante, en el Servicio de Análisis Clínico del Hospital Universitario Insular de Gran Canaria. 100 3.5. VARIABLES GENÉTICAS El ADN se extrajo a partir de la muestra de sangre de cada paciente, haciendo uso de un kit específico de aislamiento de ADN de sangre de mamíferos (Roche, Indianápolis, IN). Tras el aislamiento, se procedió al cuantificado y posterior conservado de la muestra a -20ºC. La determinación de los polimorfismos GSTM1 y GSTT1 se realizó por PCR de tipo multiplex según lo previamente publicado por Kim y cols. haciendo uso de la pareja de primers detallada en la Tabla 11 (Kim y cols. 2000). Un total de 100 ng de ADN se amplificaron en un volumen total de reacción de 25 l tal y como se detalla a continuación: desnaturalización inicial a 94ºC durante 3 minutos; amplificación con 35 ciclos a 94ºC durante 45 segundos, 60ºC durante 45 segundos y 74ºC durante 45 segundos; y una fase de elongación final a 74ºC durante 5 minutos. Se introdujo un control interno amplificando el gen beta-2-microglobulina (beta2m). El genotipado de GSTM1 y GSTT1 no se realizó si no amplificaba correctamente el control interno. Tabla 11. Detalles técnicos de la PCR-RFLP Gen Polimorfismo Primers (5’-3’) Producto de PCR (bp) Enzima de restricción (Tª) Producto digestión (bp) GST GSTM1 a GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC bGTTGGGCTCAAATATACGGT GG (+) = 210 GSTT1 aTTCCTTACTGGTCCTCACATCTC b TCACCGGATCATGGCCAGCA (+) = 473 MDR1 C3435T a TGCTGGTCCTGAAGTTGATCTGT GAAC bACATTAGGCAGTGACTCGAT GAAGGCA 248 Mbo I (37C) C/C = 170, 60; T/T = 238 C/T = 238, 170, 60 VEGF A2578C aATAAGGGCCTTAGGACACCA bGCTACTTCTCCAGGCTCACA 422 Bgl II (37C) A/A = 422; C/C = 264, 158 A/C = 422, 264, 158 beta 2 m a ACCCCCACTGAAAAAGATGA bATCTTCAAACCTCCATGATG 120 beta 2 m, beta-2-microglobulina; aForward primer; bPrimer Reverso. 101 Figura 15. Imagen de un gel de poliacrilamida al 9% que muestra el genotipado de GSTM1 y GSTT1. La ausencia de la banda de 473 pares de bases (bp) indica nulidad para GSTT1; la ausencia de la banda de 210 bp indica nulidad para GSTM1; el control positivo (beta2m) fue coamplificado en todas las muestras. Línea M, marcador de peso molecular; línea 1, GSTT1-nulo/GSTM1-nulo; línea 2, GSTT1-nulo/GSTM1-positivo; línea 3, GSTT1-positivo/GSTM1-nulo; línea 4, GSTT1-positivo/GSTM1positivo. Figura 16. Imagen de un gel de agarosa al 2% que muestra el genotipado del polimorfismo MDR1 C3435T. Línea 1, T/T; línea 2, C/T; línea 3, C/C. Se incluye además el marcador de peso molecular. 102 El polimorfismo C3435T del gen MDR1 y el polimorfismo A2578T del gen VEGF se determinaron por PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism) según lo previamente publicado (Kim y cols. 2005; Henriquez-Hernandez y cols. 2009). Las condiciones de la PCR para el polimorfismo MDR1 C3435T fueron las siguientes: desnaturalización inicial a 94ºC durante 2 minutos; amplificación con 35 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 30 segundos; y una fase de elongación final a 74ºC durante 4 minutos (HenriquezHernandez y cols. 2009). Las condiciones de la PCR para el polimorfismo VEGF A2578T fueron las siguientes: desnaturalización inicial a 95ºC durante 5 minutos; amplificación con 35 ciclos a 95ºC durante 15 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 30 segundos; y una fase de elongación final a 74ºC durante 8 minutos (Kim y cols. 2005). Para ambos polimorfismos, el amplicon generado fue posteriormente digerido con la enzima de restricción adecuada (New England BioLabs, Ipswich, MA), tal y como se detalla en la Tabla 10. El producto de digestión se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa de tipo low melting al 2-3% con bromuro de etidio (Pierce, Rockford, IL), y posterior visionado bajo luz ultravioleta haciendo uso de un Sistema ChemiDoc (Bio-Rad, Hercules, CA). El resto de los materiales usados en las reacciones de PCR fueron suministrados por Applied Biosystems (AmpliTaq Gold polimerasa, oligonucleótidos, 10X buffer de reacción). 3.6. ANALISIS ESTADÍSTICO Los formularios de recogidas de datos, han sido informatizados en una base de datos diseñada al efecto, manteniendo en todo momento la confidencialidad de los pacientes. La clasificación de los pacientes, como caso o control, se ha realizado de tal manera que se asegure el ciego de la persona que ha analizado dichos datos. Los análisis estadísticos de la presente Tesis Doctoral se han llevado cabo con el programa informático Statistical Package for Social Sciences (SPSS; versión 17.0; SPSS, Chicago, IL). 103 Las variables estudiadas han sido de dos tipos: continuas y discretas. Se estudió si las variables continuas se ajustaban o no a una distribución normal haciendo uso del test de Kolmogorov-Smirnov. El ajuste de las variables continuas a la distribución normal condiciona los subsecuentes análisis estadísticos. Las variables continuas se expresan mediante media (desviación típica) si siguen una distribución normal o mediante medianas (rango intercuartil, percentiles 25 y 75) si siguen una distribución asimétrica. Las diferencias de las medias de dos o más variables de distribución normal se llevaron a cabo mediante la prueba t de student (t-test) o prueba ANOVA según se compararan dos o más variables. Para variables continuas de distribución no normal, los test estadísticos empleados para determinar diferencias significativas entre ellas fueron U de Mann-Whitney y H de Kruskal-Wallis, según se usaran dos o más variables de agrupación. Las variables categóricas se expresan mediante porcentajes. Las diferencias en estas variables entre casos y controles se evaluaron mediante la prueba de Chicuadrado (χ2). En concreto, la prueba de χ2 se empleó para determinar diferencias en frecuencias alélalicas entre casos y controles en el análisis de polimorfismos. Además este test de χ2 se empleó en el análisis de polimorfismos también para determinar la desviación del equilibrio de Hardy-Weinberg. El coeficiente de correlación de Pearson o de Spearman se usó cuando se estudió la correlación entre variables continuas. Para valorar el potencial efecto de los contaminantes o alguna de las otras variables estudiadas (por ejemplo el consumo de café o el hábito tabáquico) sobre el riesgo de padecer cáncer de vejiga, se emplearon métodos multivariantes basados en modelos de regresión logística multinomial ajustando por las covariables adecuadas según se precisara, para así calcular la “odds ratio” y su correspondiente intervalo de confianza al 95%. 104 Todos los análisis fueron de dos colas y se consideraron significativos si el valor de p era menor de 0,05. 3.7. DIFICULTADES Y LIMITACIONES DEL ESTUDIO La principal limitación de los estudios de casos y controles, es la presencia de sesgos. Entre ellos destacan: sesgo de selección, sesgo de clasificación y efectos indeseables del emparejamiento. Sesgo de selección: es un sesgo frecuente cuando los casos son personas ingresadas en hospital, ya que es posible que sólo una proporción de los diagnósticos de cáncer vesical se hagan en el servicio de urología del CHUIMI mientras que el resto de los casos de cáncer vesical acudan preferentemente a otros centros. Podría surgir un problema si el hecho de que un paciente con cáncer vesical acudiera al servicio de urología del CHUIMI estuviera relacionado con la exposición del estudio. Sin embargo, debido a que la exposición fundamental del estudio es la exposición a pesticidas, y dicha exposición está generalizada en la población general, de forma inadvertida, como han demostrado investigadores del presente estudio, dicho sesgo es muy improbable. Sin embargo, y para minimizar este posible sesgo, la selección de controles fue emparejada por área de residencia, y se seleccionaron entre personas ingresadas durante el mismo periodo en el CHUIMI por otras causas y en distintos servicios, excluyendo diagnósticos relacionados positivamente o negativamente con el factor de riesgo en estudio. Otra posible limitación relacionada con un sesgo de selección serían las negativas a participar, generalmente más frecuentes entre los controles, pudiéndose dar el caso de que el hecho de no participar esté relacionado con la exposición. Para evitar esta limitación, el encuestador fue un profesional sanitario, lo cual puede reforzar la participación de los sujetos (casos y controles) al estar en un ambiente hospitalario. De todas maneras en la fase de análisis se ha estudiado si se ha introducido algún tipo de sesgo, comparando respondedores y no respondedores en algunas variables de las que se puedan disponer de información (sexo, edad, área de residencia). 111 en la carga de contaminantes de un sujeto, como ya se ha descrito en Canarias, por estudios previos de nuestro grupo (Zumbado y cols. 2005; Luzardo y cols. 2006; Henriquez-Hernandez y cols. 2011a) y, por ende, en la incidencia y/o prevalencia de patología tumoral. El hecho de que no se observen diferencias significativas entre casos y controles en cuanto a edad, sexo y lugar de residencia, indica que la selección de controles se hizo correctamente y nos permite pensar que éstos son similares a los casos en lo que a esas posibles variables de confusión se refiere. Tabla 13. Distribución de variables sociodemográficas Variable Controles (n = 206) Casos (n = 140) p Sexo hombre: n (%) 168 (81,6) 120 (85,7) NS Edad en años: media ± DT 65,1 ± 16,6 66,7 ± 12,1 NS Residencia en Gran Canaria: n (%) 202 (98,1) 133 (95,7) NS Entorno de residencia: n (%) NS Rural (<10.000 hab.) 7 (3,4) 4 (2,9) Semirural (10-100.000 hab.) 38 (18,4) 34 (24,3) Urbano (>100.000 hab.) 161 (78,2) 102 (72,9) Residencia >5 años 178 (88,1) 119 (90,2) NS Abreviaturas: NS, no significativo; DT, desviación típica. 112 2. VARIABLES ANTROPOMÉTRICAS Y CÁNCER DE VEJIGA Como es bien conocido, determinadas variables antropométricas, tales como el peso o el índice de masa corporal (IMC), parecen ser importantes factores de riesgo de desarrollo de cáncer. Por ello decidimos contemplar este tipo de variables en el presente proyecto de Tesis Doctoral. Considerando a los individuos sin distinción de sexos, observamos que los casos registraban una media de peso y estatura significativamente mayor que los controles (Tabla 14). Esta diferencia significativa se mantenía entre los hombres para el caso de la talla y permanecía al borde de la significación para el peso. Entre las mujeres no detectamos diferencias significativas en ningún caso. No obstante, tampoco detectamos diferencias en ningún caso respecto a la variable IMC. Pocos estudios han estudiado la relación entre las diferentes variables antropométricas (altura, peso e IMC) y el riesgo de cáncer de vejiga. Respecto al IMC, en nuestro estudio no se observaron diferencias estadísticamente significativas ni en hombres ni en mujeres entre casos y controles. Estos resultados coinciden con los descritos por otros autores en estudios prospectivos realizados en población norteamericana (Holick y cols. 2007) y sueca (Larsson y cols. 2008) que tampoco encontraron asociación entre el IMC y el riesgo de CaV. Aunque parece claro que el IMC sí supone un factor de riesgo para cierto tipo de tumores, como por ejemplo el de mama, no parece ser un factor determinante en la patología tumoral vesical. En relación a la potencial relación entre la talla y el riesgo de CaV las evidencias encontradas en la literatura son poco concluyentes y contradictorias. Así, mientras el estudio de cohortes desarrollado en población norteamericana por Holick y cols. sugería una asociación inversa significativa, sólo en hombres, entre la altura y el riesgo de cáncer de vejiga en sujetos que medían > 1,80 m (RR 0,69 con IC 95%, 0,50-0,95) al compararlos con aquellos que medían ≤ 1,50 m (Holick y cols. 2007), la 113 altura no se asoció con el cáncer de vejiga en los estudios de casos y controles desarrollados en población italiana (La Vecchia y cols. 1990b) ni en estudios prospectivos desarrollados en nuestro país vejiga tras de ajustar por edad, tabaquismo activo y actividad profesional (Leon y cols. 1995). Sin embargo, tal y como se puede observar en la Tabla 14, en nuestro estudio hemos encontrado que los hombres con CaV son, de media, 3 centímetros más altos que los hombres sin esta patología. Estos resultados coinciden con recientes revisiones que apuntan la posibilidad de que la mayor altura pueda ser un factor de riesgo de diferentes tipos de patologías tumorales (cáncer colorrectal, de próstata, mama, sistema nervioso central, piel, endometrio, tiroides y tumores hematopoyéticos) (Batty y cols. 2009). Tabla 14. Distribución de variables antropométricas Grupo Variable Casos Controles p TODOS N = 140 N = 206 Peso Actual Kg (DT) 78,6 (11,5) 75,9 (12,1) 0,036 Talla (metros) (DT) 1,73 (0,1) 1,70 (0,1) <0,001 IMC (Kg/m2) 26,4 (3,6) 26,3 (3,3) NS HOMBRES N = 120 N = 168 Peso Actual Kg (DT) 80,2 (10,9) 77,7 (12,1) 0,074 Talla (metros) (DT) 1,74 (0,05) 1,71 (0,08) <0,001 IMC (Kg/m2) 26,4 (3,6) 26,5 (3,1) NS MUJERES N = 20 N = 38 Peso Actual Kg (DT) 69,5 (11,1) 68,1 (8,8) NS Talla (metros) (DT) 1,63 (0,05) 1,63 (0,06) NS IMC (Kg/m 2 ) 25,1 (3,7) 25,6 (3,8) NS Abreviaturas: DT, desviación típica; IMC, índice de masa corporal; NS, no significativo La potencial asociación positiva entre altura y riesgo de cáncer que encuentran estos estudios podría relacionarse con varios factores. Por ejemplo, una mayor ingesta energética en la infancia, o bien que la altura sea un “marcador” de 114 exposición temprana a otros factores relevantes (dieta, estrés, enfermedades crónicas infantiles, etc.) que pudieran afectar al ulterior desarrollo de un cáncer. Además la altura puede reflejar factores hereditarios, estilos de vida (la dieta y la ingesta calórica como ya se ha dicho) o puede ser consecuencia de mayores niveles de mediadores de hormonas anabólicas como la hormona del crecimiento (GH). En este sentido se ha de destacar el hecho de que los principales mediadores de los efectos anabólicos de la GH, esto es, los factores de crecimiento similares a la insulina (Insulin-like Growth Factors; IGF) han sido relacionados con el desarrollo de ciertos tipos de tumores debido a su efecto mitogénico y antiapoptótico sobre diversos tejidos, incluido el vesical (Probst-Hensch y cols. 2003; Zhao y cols. 2003). Además de todo lo expuesto, la exposición a contaminantes químicos del tipo de los plaguicidas organoclorados (POCs) o bifenilos policlorados (PCBs) puede modificar los niveles séricos de IGF (Boada y cols. 2007; Zumbado y cols. 2010). Por ello, en este estudio decidimos explorar los niveles de IGF en los sujetos incluidos en nuestro estudio, tanto en los afectos de CaV (casos) como en los controles. En el siguiente apartado de esta Tesis Doctoral se presentan y discuten los resultados obtenidos en relación a los niveles de IGF y cáncer de vejiga. 115 3. FACTORES DE CRECIMIENTO SIMILARES A LA INSULINA (IGF) Y CÁNCER DE VEJIGA. Como quedó debidamente explicado en el capítulo de Material y Métodos de esta Tesis, en este trabajo se evaluaron los niveles séricos del mediador de la acción de la GH más relevante, el factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1 (Insulin-like Growth factor-1; IGF-I). Asimismo se evaluaron los niveles séricos de la principal proteína transportadora de IGF, la proteína transportadora de factores de crecimiento similares a la insulina tipo 3 (Insulin-like Growth factor binding protein-3; IGFBP-3). En los sujetos incluidos en nuestro estudio, los valores de IGF-I siguieron una distribución normal tanto entre los casos como entre los controles. Los valores de IGF-I se cuantificaron en 137 controles y 114 casos. Se ha de reseñar que los niveles séricos de IGF-I están influenciados por el sexo, la edad, el IMC y otros factores externos como la dieta y diferentes hábitos de vida (Baibas y cols. 2003) y que, además, muestran un dimorfismo sexual, detectándose mayores niveles en los hombres que en las mujeres especialmente en las edades más avanzadas (LandinWilhelmsen y cols. 1994). En cualquier caso, el papel del género en este sentido no es del todo conocido (Brabant y cols. 2007). En nuestro estudio no se observaron diferencias significativas respecto a los niveles séricos de IGF-I entre hombres y mujeres, tomando la serie completa sin tener en cuenta que los pacientes pertenecieran al grupo de casos o de controles, aunque los hombres presentaban niveles mayores de IGF-I (47,6 vs. 44,5 ng/ml para hombres y mujeres, respectivamente). No obstante, al segmentar a la población por edad, observamos que en el segmento de edad comprendido entre los 51 y 70 años, los hombres presentaban niveles significativamente mayores de IGF-I que las mujeres (103,8 vs. 83,8 ng/ml respectivamente, p = 0,042), lo cual coincide con lo publicado por otros autores (Landin-Wilhelmsen y cols. 1994). Existe una clara asociación inversa entre la edad y los niveles de IGF-I en adultos (Holmes y cols. 2002; Baibas y cols. 2003). El papel de la edad a este respecto sí es claro. En nuestro caso, observamos claramente una disminución de 116 los niveles de IGF-I en suero a medida que la edad aumentaba, estando nuestros resultados en concordancia con lo reportado por otros. Así, los niveles de IGF-I descendían significativamente conforme aumentaba la edad (122,9, 101,1 y 90,0 ng/ml para los segmentos de edad <51, 51-70 y >71 años respectivamente, p = 0,01). No se observaron diferencias en los niveles séricos de IGF-I en relación al IMC, el hábito tabáquico, el hábitat o la práctica de profesiones de riesgo. Sin embargo, sí fue evidente que los individuos que declaraban hacer uso de pesticidas presentaban niveles significativamente inferiores de IGF-I en comparación con los individuos que no usaban este tipo de sustancias (89,2 vs. 104,0 ng/ml, p = 0,047). Este resultado coincide con lo reportado en la literatura, en el sentido que la exposición a pesticidas organoclorados se asocia a menores niveles de IGF en niños y adultos (Boada y cols. 2007; Zumbado y cols. 2010). Se ha descrito una asociación inversa entre los valores de IGF-I y el IMC (Gomez y cols. 2003; Succurro y cols. 2010), aunque recientes estudios sugieren que esta asociación no es lineal: los individuos con IMC <20 y >35 kg/m2 se asociaban a niveles más bajos de IGF-I en comparación con los individuos de IMC entre 20 y 35 (Schneider y cols. 2006; Crowe y cols. 2011). La población del archipiélago canario presenta unos altos índices de sobrepeso y obesidad (Serra Majem y cols. 2000); y en la población incluida en el presente estudio, el porcentaje de individuos con sobrepeso y obesidad fue también elevado (63,3% del total: 64% en los controles y 62,1% entre los casos). No obstante, no detectamos diferencias en la distribución de IGF-I en función del IMC en nuestra muestra, posiblemente debido a la influencia de otros factores dietéticos y/o medioambientales (Boada y cols. 2007; Zumbado y cols. 2010; Henriquez-Hernandez y cols. 2011a). En este sentido es bien conocido que la dieta juega un claro papel en la regulación de los niveles de IGF-I (Baibas y cols. 2003), disminuyendo claramente los niveles circulantes de IGF-I la restricción dietética (Fontana y cols. 2008). La dieta en los grupos de población de mayor edad (como los incluidos en nuestro estudio) ha sido sujeto de análisis, aceptándose de manera general la existencia de unos mayores 117 niveles de malnutrición en ancianos (Miquel 2001). Dada la influencia que la dieta ejerce sobre los niveles de IGF-I, la ausencia de diferencias en valores séricos de IGF-I en función del IMC en los sujetos estudiados podrían deberse, al menos parcialmente, a factores dietéticos sobreañadidos. Tal y como se ha dicho, el papel de IGF-I como factor de riesgo en cáncer de vejiga no está demostrado, pero dado que, tras los resultados obtenidos en el análisis de las variables antropométricas era de interés conocer el potencial papel jugado por el IGF-I en el desarrollo de CaV, se estudiaron los niveles de IGF-I en los casos y controles, segmentando a la población en diferentes grupos a tenor de su género, edad, IMC y uso de pesticidas (Tabla 15). Nuestros resultados demostraron que los niveles de IGF-I no variaban entre casos y controles cuando se tomaban a ambos grupos sin segmentar (p = 0,496), pero que cuando se segmentaban por estas variables eran los controles los que presentaban niveles mayores de IGF-I. Así, observamos que los pacientes de cáncer vesical menores de 51 años presentaban niveles séricos de IGF-I significativamente menores que los controles en ese mismo segmento de edad (103,6 vs. 129,6, p = 0,045). Al segmentar por IMC, observamos igualmente que los individuos con cáncer vesical y con IMC por encima de 25 kg/m2 tenían unos niveles séricos de IGF-I menores a los que presentaban los controles en ese mismo rango de IMC. Lo mismo ocurría en el rango de casos y controles con IMC < 25, pero el escaso tamaño de ese subgrupo nos obliga a no considerar ese resultado. En cualquier caso, los resultados significativos obtenidos en estos análisis deben tomarse con cautela, debido a los reducidos tamaños muestrales de los subgrupos analizados. Además se realizaron análisis univariante y multivariante (ajustando por IMC, edad e IGFBP-3 y segmentando por sexo) no encontrando ningún resultado estadísticamente significativo, lo que nos permite plantear que, en esta población, los niveles de IGF-I puedan considerarse como factor de riesgo de CaV. En este sentido, otros autores tampoco han encontrado diferencias en niveles de IGF-I 118 Tabla 15. Distribución de los niveles séricos de IGF-I (ng/ml) entre casos y controles Grupo N (Co/Ca) Controles Casos p Serie completa(media ± DT) 123/114 102, 9 ± 50,5 98,9 ± 42,6 0,496 Sexo Hombres 11/7 101,3 ± 50,5 99,2 ± 44,2 0,748 Mujeres 19/16 110,6 ± 50,7 97,4 ± 32, 4 0,362 Edad (años) <51 210/11 129,6 ± 39,6 103,6 ± 33,1 0,045 51-70 1 93,2 ± 50,1 109,0 ± 47,0 0,074 >71 12/41 97,2 ± 52,4 82,4 ± 32,2 0,125 IMC (Kg/m2) <20 1 135,0 ± 9,9 56,8 ± 12,2 0,020 20-24,99 18/41 94,3 ± 47,6 103,1 ± 43,9 0,368 25-29,99 14/29 102,9 ± 50,9 99,7 ± 45,2 0,710 >25 17/13 120,9 ± 54,7 88,4 ± 21,3 0,050 Uso de pesticidas Sí 22/27 99,2 ± 36,7 81,0 ± 28,6 0,058 No 128/87 103,7 ± 52,8 104,4 ± 44,8 0,915 Abreviaturas: Co/Ca, número de pacientes según Controles y Casos; DT, desviación típica; IMC, índice de masa corporal. entre grupos en estudios de casos y controles, concluyendo que los niveles de IGF-I no eran un factor de riesgo para el CaV (Serel y cols. 2003). Lo mismo ha sido reportado por otros autores (Shariat y cols. 2003). Sin embargo, Zhao y cols observaron en 154 pacientes con cáncer de vejiga, que sus niveles séricos de IGF-I era significativamente mayores que los registrados en 154 individuos control (175,8 vs. 153,2 ng./ml., p < 0,01), concluyendo que IGF-I podría ser un factor de riesgo para el cáncer de vejiga (Zhao y cols. 2003). De nuevo, ha de tenerse en cuenta que los factores dietéticos y el estilo de vida influyen claramente sobre los niveles de IGF-I (consumo de alcohol, de grasas, así como otras enfermedades asociadas) (Kirschner y cols. 1986; Wu y cols. 1988; Juul y cols. 1994; Goodman-Gruen y cols. 119 1997), lo que puede condicionar los resultados obtenidos. En este sentido, los cambios dietéticos y los tratamientos médicos a los que puedan estar sometidos los sujetos afectos de CaV pueden influenciar los niveles de IGF-I. A día de hoy, los niveles de expresión del receptor para IGF-I (IGF-1R) parecen ser un mejor factor a la hora de valorar no solo el riesgo sino también el pronóstico y la respuesta a los tratamientos, no sólo en el caso del cáncer de vejiga, sino también en otras patologías tumorales malignas (Li y cols. 1998; Lloret y cols. 2007; Lara y cols. 2011). Sin embargo, analizar los niveles de expresión de este receptor están fuera del objetivo de esta Tesis, aunque pudiera ser un interesante tema de investigación en un futuro. 120 4.- ESTILO DE VIDA Y CÁNCER DE VEJIGA: PROFESIÓN. Como ya se ha dicho a lo largo de este trabajo, la población objeto de estudio estaba compuesta por 206 controles y 140 casos incidentes de CaV. Respecto a la actividad profesional, el 34% de los sujetos sanos se había dedicado al menos a una profesión que se ha asociado a niveles elevados de exposición a contaminantes. La exposición más frecuente en ese grupo estaba referida a la agricultura (13,6%) seguida por la profesión de conductor/chófer (9,7%). Solamente un 2,9% de los sujetos sanos ha trabajado en la industria química, lo cual es coherente con la distribución de los sectores productivos en las Islas Canarias. (http://www2.gobiernodecanarias.org/istac/jaxiweb/menu.do?path=/05011/E30308A/ P0002&file=pcaxis&type=pcaxis&L=0). En nuestra muestra, al comparar casos y controles observamos diferencias estadísticamente significativas respecto a la distribución por profesiones de riesgo. Así, como se muestra en la Tabla 16, el 47.1% de los casos ejercía una profesión de riesgo en comparación con el 34% de la población control (p = 0,018). Al analizar cada profesión de riesgo por separado, se observó que, excepto el turismo, el resto de las profesiones consideradas “de riesgo” son más frecuentes entre los casos, destacando particularmente la profesión de “chófer” que es casi 2 veces más frecuente entre los casos que entre los controles (p = 0,034) y la de “pintor” (frecuencia casi 3 veces superior y al borde de la significación estadística, p = 0,056). Más concretamente, identificamos diferencias significativas de distribución respecto a las profesiones de “chófer” y “pintor”, lo que sugiere que ambas podrían ser relevantes en el origen y/o desarrollo del CaV. Se ha de resaltar que no se observaron diferencias significativas entre ambos grupos respecto a la condición de agricultor ni respecto a la frecuencia de uso de plaguicidas (Tabla 16). En este aspecto, es bien conocido el hecho de que existen múltiples actividades profesionales que se han vinculado a mayor riesgo de CaV. Si bien en muchos casos tal evidencia no está claramente establecida (Baena y cols. 2006). 127 Observamos que el porcentaje de individuos no fumadores era mayor entre la población control que entre los casos (35 vs. 15,7%). Por su parte, el porcentaje de individuos que “fuman o han fumado” era significativamente mayor entre los casos (84,3 vs. 65%) (p < 0,0001). Además, la edad de inicio en el hábito tabáquico fue significativamente mayor entre los casos (Tabla 18; p = 0,006), observándose diferencias significativas en la distribución de la intensidad del hábito tabáquico, parámetro determinado como el número de cigarrillos que refieren fumar por el número de años que llevan fumando. Así, entre los casos, la intensidad del habito tabáquico era mayor que entre los controles (Tabla 18; p < 0,001). No observamos diferencias significativas respecto al resto de variables recogidas y relacionadas con el hábito tabáquico. Como ya se ha dicho en nuestro estudio, el porcentaje de fumadores (actuales o pasados) fue significativamente superior entre los casos de CaV que entre los controles. El tabaco ha sido relacionado en numerosos estudios como un potente factor de riesgo de CaV, siendo el factor de riesgo más importante para el desarrollo del cáncer urotelial en los países occidentales. Los compuestos cancerígenos del tabaco y responsables del cáncer de vejiga no han sido identificados de forma concluyente. Hay más de 60 carcinógenos presentes en el humo de cigarrillo. Los carcinógenos potenciales incluyen el 4 - aminobifenilo, los hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs), compuestos nitrosos y aldehídos no saturados (Hoffman y cols. 1969). Como han evidenciado numerosos estudios, los fumadores tienen un riesgo 4 veces superior de desarrollar un tumor vesical que los no fumadores, (Morrison 1984; Morrison y cols. 1984; Burch y cols. 1989; Zeegers y cols. 2002; Alberg y cols. 2007; Baris y cols. 2009). Este riesgo está directamente relacionado con: 1) el número de cigarrillos fumados, 2) la duración del hábito y 3) el grado de inhalación del humo. Se ha descrito que el 66% del CaV en hombres y el 30% en mujeres eran atribuibles a fumar cigarrillos (Brennan y cols. 2001). En nuestro estudio, el 94,2% de los hombres con CaV fuma o ha fumado, frente al 72,6% de los hombres sin CaV 128 (p <0,001). Sólo 2 casos de CaV eran fumadores ocasionales (1,4%), el resto lo eran regulares. Curiosamente, entre las mujeres de nuestro estudio la prevalencia de tabaquismo (actual o pasado) fue superior entre las mujeres control (31,6%) que entre las mujeres con CaV (25%), si bien las diferencias no eran significativas (p = 0,853). La falta de asociación entre fumar y padecer CaV en mujeres puede deberse al escaso número de mujeres fumadoras en esta muestra, lo que se traduce en una falta de potencia estadística. Pero también puede ser debido a que en las mujeres con CaV, el factor de riesgo puede haber sido la exposición “pasiva” al tabaco, (fundamentalmente en el ambito familiar) dato no recogido en este estudio. En este sentido, la exposición pasiva al tabaco en mujeres parece ser un factor de riesgo para el desarrollo de CaV (Skipper y cols. 2003; Jiang y cols. 2007). De hecho, el papel del tabaco en los fumadores pasivos ha sido estudiado en población norteamericana concluyendo que de 148 personas con CaV (y 292 controles) ninguno de los sujetos incluidos había fumado nunca, lo que parece indicar que la exposición pasiva al humo del tabaco puede jugar un papel relevante (Jiang y cols. 2007). Asimismo, aunque sólo en mujeres, se ha comprobado que la convivencia con fumadores durante la infancia o durante periodos superiores a 10 años incrementan el riesgo de CaV. Así, las mujeres expuestas al humo de tabaco en la infancia presentan un riesgo 3 veces superior de sufrir CaV que las mujeres que no habían sido expuestas al tabaco en su infancia, y las mujeres que han convivido durante más de 10 años con un fumador presentan un riesgo 2 veces superior que el grupo control de desarrollar CaV (Jiang y cols. 2007). En lo referente al hábito de fumar puros, en nuestra muestra el número de sujetos con este hábito era muy bajo: sólo 13 individuos fumaban puros. Sin embargo, la prevalencia de fumar puros entre casos era de 7,9% frente a 1% en controles (p = 0,001). Aunque significativo, este resultado debe ser tomado con precaución debido al bajo número de sujetos analizados. No obstante, estos resultados van en concordancia a lo publicado previamente por otros autores. Así Pitardy cols. han puesto de manifiesto que los fumadores de puros y los de pipa presentan un riesgo incrementado de CaV respecto a los no fumadores(OR 2,3 IC 95% 1,6-3,5, y OR 1,9 IC 95% 1,2-3,1, respectivamente), si bien este riesgo era de 129 menor magnitud que el hallado entre fumadores de cigarrillos (OR 3,5 IC 95% 2,94,2) (Pitard y cols. 2001). Está poco claro si otras formas de consumo del tabaco (tabaco de mascar) también están relacionados con un riesgo incrementado de cáncer de vejiga (Zeegers y cols. 2004), aunque en población española este hábito es poco frecuente. Entre los casos de CaV de nuestro estudio, la edad de inicio en el tabaquismo era de casi un año y medio menor que la de los controles (Tabla 18), siendo esta diferencia estadísticamente significativa. La edad precoz de inicio del tabaquismo como factor de riesgo de CaV ha mostrado resultados contradictorios en diferentes estudios. Así mientras los estudios en población norteamericana de Brennan y cols. (2000) no demostraron la existencia de relación alguna entre el inicio del hábito tabáquico y el riesgo de CaV, otros estudios sí han demostrado que el inicio precoz del hábito tabáquico incrementa el riesgo de CaV respecto al inicio tardío (RR 1,33, IC 95% 1,18-1,51) (Bjerregaard y cols. 2006). Se ha de tener en cuenta que sí parece existir una correlación significativa entre el tiempo de exposición al humo de cigarrillo y el riesgo de CaV (OR = 1,96 tras 20 años fumando (IC95% 1,48-2,61), OR = 5,57 tras 60 años (IC 4,18-7,44) (Brennan y cols. 2000). Por otro lado la edad de inicio del tabaquismo entre los participantes de este último estudio fue de 17 años en los casos y de 18 años entre los controles, datos muy similares a los nuestros. Respecto al número de cigarrillos al día, no se observaron diferencias significativas en el presente estudio. Sin embargo, cuando se combinó el número de cigarrillos que refieren fumar, por el número de años que llevan fumando (intensidad del hábito, medido mediante paquetes-año) sí se observaron diferencias significativas. En las tablas 19 y 20 se muestran los riesgos relativos de presentar CaV en función de los paquetes-año, en análisis crudo y ajustado por co-variables. El análisis “crudo” muestra como el riesgo de desarrollar CaV aumenta a medida que aumenta la intensidad del hábito tabáquico (3,27 vs. 4,25; Tabla 19). En la Tabla 20 se observa un análisis de regresión logística ajustado por edad 130 y sexo que muestra como el riesgo de presentar CaV es mayor entre los fumadores que entre los no fumadores, incluso en los que menos fuman (de 1 a 20 paquetes al Tabla 19. Odds Ratio entre exposición a tabaco (paqueteaño) y riesgo de CaV (modelo crudo) Paquetes-año (%) Odds ratio (IC 95%) p 0 1 - 1-20 3,27 (1,64-6,52) 0,001 21-38 1,88 (0,93-3,79) 0,077 39-59 1,50 (0,64-3,54) 0,355 60+ 4,25 (1,64-11,03) 0,003 Perdidos 4,51 (2,30-8,87) <0,001 año), aumentando hasta 5 veces entre los que fuman más de 60 paquetes al año. Tabla 20. Odds Ratio entre exposición a tabaco (paqueteaño) y riesgo de CaV (modelo ajustado por edad y sexo) Paquetes-año (%) Odds ratio (IC 95%) p 0 1 - 1-20 4,37 (2,01-9,51) <0,001 21-38 2,38 (1,10-5,16) 0,028 39-59 1,81 (0,72-4,56) 0,207 60+ 5,16 (1,86-14,29) 0,002 Perdidos 5,35 (2,54-11,24) <0,001 En nuestro estudio el 38,6% de los casos se definen como exfumadores, frente al 12,1% de los controles (p < 0,001). Esta mayor prevalencia de exfumadores entre los casos de CaV puede deberse al efecto disuasorio que tiene el diagnóstico de una neoplasia sobre el paciente. En otros estudios, se ha observado que dejar de fumar 131 reduce el riesgo de cáncer de vejiga. En este sentido estudios recientes sugieren un evidente descenso en el riesgo de padecer CaV (mayor del 30 % entre 1 y 4 años después de abandonar el hábito, y superior al 60 % tras 25 años después del cese del hábito) (Brennan y cols. 2000). Sin embargo, incluso después de 25 años, el riesgo de CaV no llega al nivel de los que nunca han fumado (Weir y cols. 1970; Augustine y cols. 1988; Samanic y cols. 2006; Chen y cols. 2007) siendo el efecto dañino más prolongado para el CaV que para otras patologías como las enfermedades cardiovasculares o el cáncer de pulmón (Walsh 2004). 132 6. ESTILO DE VIDA Y CÁNCER DE VEJIGA: CONSUMO DE BEBIDAS. Se ha asociado el CaV al consumo de determinadas bebidas, entre las que destacan el café y el té, aunque otras bebidas con y sin alcohol también se han asociado a esta patología. Por ello, se ha decidido incluir el consumo de bebidas como variable de interés en la presente Tesis Doctoral. Como se muestra en la tabla 21, en nuestro estudio no se observaron diferencias significativas en el consumo diario total de líquidos, ni de agua, en sus diferentes formas de comercialización en Gran Canaria (con gas o sin gas añadido). Un mayor consumo total de líquidos puede diluir la concentración urinaria de carcinógenos excretados y consecuentemente reducir su tiempo de contacto con el urotelio. De hecho el estudio de casos y controles realizado por Silverman y cols. demostró una asociación protectora para la frecuencia aumentada de micción, particularmente nicturia, frente al CaV (Silverman y cols. 2008). En el mismo sentido, otros estudios de cohortes han puesto de manifiesto que el consumo diario total de agua mostraba un efecto protector frente al riesgo de cáncer de vejiga (RR 0,51; 95 % IC: 0,32 – 0,80) para un consumo diario > 2,5 litros al día comparado con un consumo diario < 1,3 litros al día (Michaud y cols. 1999a). En nuestro estudio, sin embargo, los sujetos que consumían >1,5 litros diarios de líquido eran poco numerosos y esta exposición no se asoció al riesgo de CaV. Respecto al consumo de agua potable, en Canarias el consumo de agua del grifo no se encuentra muy extendido, menor del 50% en la población general (Estudio ENCA) (Diaz Romero y cols. 2002) siendo aún menor en las islas orientales como Gran Canaria (<25% en nuestro estudio). La cloración es el proceso más común por el que el agua potable es tratada antes de su uso por la población general. En los procesos de cloración se pueden generar trihalometanos (compuestos tales como cloroformo, fluoroformo o bromoformo) que se forman cuando el cloro, reacciona con la materia orgánica de origen natural presente en el agua captada de los ríos o pozos. El agua de mar desalinizada (principal método usado para la generación de agua potable en la isla de Gran Canaria), al no tener 133 residuos orgánicos, tiene menor riesgo de formación de trihalometanos. Se ha demostrado que el consumo a largo plazo de agua potable clorada estaba relacionada con un riesgo aumentado de CaV en hombres (OR 1,4 IC95% 1,1 - 1,9) y un aumento no significativo en mujeres (OR 1,2 IC95% 0,7 - 1,8) (Villanueva y cols. 2003). En España, se ha relacionado la concentración de trihalometanos en agua potable con el riesgo de CaV (Villanueva y cols. 2001). Como ya se ha reseñado, en Canarias, por su peculiaridades orográficas, el consumo de agua del grifo es poco frecuente (<30%) siendo más frecuente el consumo de agua embotellada o de agua procedente de desalinizadoras donde la cloración está muy poco presente. Además, cuando se ha medido la concentración de trihalometanos en diferentes puntos de España, en Tenerife, se encuentran los niveles más bajos de España (7 μg/l) (Villanueva y cols. 2001). Por lo tanto, no es esperable que el consumo de agua del grifo se asocie en Canarias a CaV. Numerosos trabajos han estudiado una posible asociación del café y té con el cáncer de vejiga. En nuestro estudio, el consumo de café fue significativamente mayor en los casos que en los controles, 90 mililitros/día de mediana en casos frente a 45 mililitros/día en controles (p = 0,005), y además, el porcentaje de sujetos que consumían café (con cafeína) era significativamente mayor entre los pacientes afectos de CaV que entre la población control (72,7 vs. 61,2, p = 0,027). No se observaron diferencias en el consumo de té, aunque éste era muy reducido en la muestra estudiada. No obstante, en el análisis de estas variables hay que ser cauto, puesto que el consumo de café suele ir asociado en mayor o menor medida al consumo de tabaco. Aunque la cafeína es un sustancia potencialmente mutagénica in vitro, no se ha podido establecer una relación definitiva entre el consumo regular de café y CaV, no encontrándose efecto dosis-respuesta y atribuyéndose el efecto a la presencia del tabaquismo como factor de confusión, ya que los consumidores de café suelen fumar más (Pelucchi y cols. 2009; Villanueva y cols. 2009). Por ello, decidimos realizar un análisis de regresión logística multivariante para determinar el riesgo de CaV entre los sujetos que con sumían café, ajustando consumo de tabaco. Ajustado por el hábito tabáquico actual, los análisis de regresión muestran como el consumo de café aumenta 1,73 veces el riesgo de padecer CaV (Tabla 22). 134 Tabla 21. Distribución de variables relacionadas con el consumo de bebidas (ml/día) Controles Casos p Consumo total de líquidos: N (%) <1,5 litros/día 183 (88,8) 121 (87,7) 0,735 >= 1,5 litros/día 23 (11,2) 17 (12,3) Consumo de bebidas (ml/día): media (DT) Refresco SIN gas 22,09 (97,3) 17,7 (88,45) 0,532 Refresco CON gas 56,9 (144,9) 54,6 (146,7) 0,064 Café CON cafeína 61,5 (57,1) 66,8 (58,8) 0,004 Café SIN cafeína 29,92 (43,09) 29,3 (43,5) 0,672 Té 8,68 (43,31) 6,9 (34,7) 0,848 Cerveza 44,06 (83,21) 41,4 (80,2) 0,560 Vino 25,91 (57,43) 26,4 58,7 0,986 Otras bebidas alcohólicas 3,47 (13,43) 3,2 (10,9) 0,143 Agua del grifo 126,14 (238,49) 128,6 (243,5) 0,143 Agua embotellada SIN gas 504,43 (457,42) 508,6 (459,8) 0,421 Agua embotellada CON gas 164,53 (313,91) 157,1 (320,8) 0,100 Consumo de bebidas (ml/día): mediana (p25-p75) Refresco SIN gas 0 (0-0) 0 (0-0) 0,384 Refresco CON gas 0 (0-0) 0 (0-57) 0,050 Café CON cafeína 45 (0-90) 90 (0-90) 0,005 Café SIN cafeína 0 (0-90) 0 (0-45) 0,478 Té 0 (0-0) 0 (0-0) 0,128 Cerveza 0 (0-57,1) 0 (0-47,1) 0,507 Vino 0 (0-19,3) 0 (0-19,3) 0,489 Otras bebidas alcohólicas 0 (0-0) 0 (0-0) 0,673 Agua del grifo 0 (0-200) 0 (0-151,6) 0,189 Agua embotellada SIN gas 600 (0-800) 600 (0-800) 0,567 Agua embotellada CON gas 0 (0-200) 0 (0-200) 0,114 Porcentaje de sujetos que SÍ consumen cada bebida (%) Refresco SIN gas 8,3 5,8 0,380 Refresco CON gas 28,6 20 0,069 Café CON cafeína 61,2 72,7 0,027 Café SIN cafeína 41,3 35,7 0,299 Té 3,4 7,1 0,114 Cerveza 37,9 41,4 0,505 Vino 28,2 32,1 0,426 Otras bebidas alcohólicas 16 18,6 0,536 Agua del grifo 20,4 25,7 0,245 Agua embotellada SIN gas 67 68,6 0,758 Agua embotellada CON gas 31,1 25,7 0,281 135 Tabla 22. Riesgo (OR) de presentar CaV en función del consumo de CAFÉ, ajustado por tabaquismo actual Variable Odds ratio (IC 95%) p Consumo de café - No 1,00 Sí 1,73 1,05-2,86 0,033 Sexo Mujer 1,00 Hombre 0,66 0,30-1,27 0,196 EDAD (años) 1,014 0,995-1,033 0,142 Hábito tabáquico No fuma 1,00 Ex-fumador 8,51 3,99-18,1 <0,001 Fumador actual 2,27 1,17-4,42 0,015 Constante 0,108 0,003 Tal resultado se mantiene incluso si lo que consideramos es la intensidad de la exposición al tabaco (actual + pasada) mediante el nº de cajetillas-año (Tabla 23). Estos resultados coinciden con los obtenidos por Zeegers y cols. en población holandesa en los que se sugirió una posible asociación positiva entre el consumo de café y el riesgo de CaV en los hombres, sobre todo para aquellos grandes consumidores (>7 tazas/día) y este efecto no era modificado sustancialmente al ajustar por el consumo de tabaco (Zeegers y cols. 2001a). Sin embargo, la asociación entre el consumo de café y un mayor riesgo de CaV no es clara. Así, mientras unos autores sugieren que el consumo de café (y no el de té) incrementa el riesgo de cáncer de tracto urinario en aproximadamente un 20% (Sala y cols. 2000; Zeegers y cols. 2001d), otros no encuentran tal asociación, como tampoco la encuentran entre el consumo de café y otros tumores (tales como mama, cavidad oral y faringe, colon y recto, endometrio, esófago, hepatocelular, leucemia, páncreas y próstata) (Yu y cols. 2011). Un reciente metaanálisis ha realizado un pool-análisis 136 (análisis combinado de los datos agrupados de diferentes estudios) de los datos de 23 estudios de casos y controles y 5 estudios de cohortes y ha determinado que, en los estudios de casos y controles, comparado con los no bebedores de café el riesgo de CaV ajustado por tabaquismo es de 1,07 para los bebedores de 1 taza/día; 1,15 para 2 tazas/día; 1,22 para 3 tazas/día y 1,29 para 4 tazas/día (todos p<0,05). En los estudios de cohorte los resultados no fueron significativos (Zhou y cols. 2012). Tabla 23. Riesgo (OR) de presentar CaV en función del consumo de CAFÉ, ajustado por intensidad de exposición al tabaco Variable Odds ratio (IC 95%) p Consumo de café No 1,00 - Sí 1,67 1,02-2,75 0,041 Sexo Mujer 1,00 Hombre 1,51 0,74-3,06 0,255 EDAD (año) 1,02 1,00-1,04 0,052 Paquetes-año 0 1,00 1-20 4,14 1,89-9,08 <0,001 21-38 2,36 1,08-5,13 0,031 39-59 1,67 0,66-4,24 0,280 >= 60 4,70 1,67-13,2 0,003 En resumen, se ha de destacar que el consumo de café se asocia en nuestro estudio a un mayor riesgo de CaV, incluso una vez tenida en cuenta la exposición al tabaco. Finalmente, resaltar que nuestros resultados indican que la cantidad de refresco con gas consumida por los casos superaba significativamente a la de los controles (Tabla 21). A pesar de que la mediana para ambos era de 0, el percentil 75 de la distribución deja patente esa diferencia (57 vs. 0 ml/día en p75, p = 0,05). Sin 239 PCB de tipo dioxin-like (mono-ortho) 46. PCB-105 47. PCB-114 39. PCB-118 48. PCB-123 49. PCB-156 50. PCB-157 51. PCB-167 52. PCB-189 240 ANEXO IV 241 242