Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos
Abstract
A administração de fármacos e outros compostos bioativos através da pele é uma área de investigação de crescente interesse para o desenvolvimento de formulações com aplicações farmacêuticas e cosméticas. A via cutânea é bem tolerada e aceite e, por isso, pode ser explorada para um efeito local ou sistémico, desde que seja possível garantir a permeação transdérmica dos compostos administrados. Quando se pretende uma permeação trans(dérmica) é muito importante também ter em conta as barreiras da pele (principalmente a camada mais externa, o estrato córneo) que, devido à sua matriz lipídica intercelular e ao seu arranjo estrutural, dificulta a permeação de compostos. Assim, neste trabalho é proposto o desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos miméticos da matriz lipídica do estrato córneo. Pretende-se que os modelos propostos mimetizem a barreira cutânea, constituindo uma alternativa mais económica, de simples preparação e reprodutível comparativamente aos modelos de pele humana e animal, que não se justificam por questões funcionais e éticas. Os modelos desenvolvidos foram validados pela aplicação de ensaios clássicos de difusão em células de Franz com compostos modelo de permeabilidade bem conhecida (cafeína, diclofenac e testosterona). Numa tentativa de desenvolver uma solução de triagem rápida (HTS, do inglês “high throughput screening”) capaz de testar um grande número de compostos em simultâneo, como alternativa aos ensaios clássicos de avaliação de permeabilidade dos compostos, os modelos validados foram incorporados numa plataforma microfluídica. A adaptação dos modelos para plataformas microfluídicas permitirá reduzir o volume de reagentes utilizado e aumentar a fiabilidade e reprodutibilidade dos ensaios de permeação através da padronização dos procedimentos analíticos, enquanto permite simular o fluxo observado em fenómenos fisiológicos de difusão que não podem ser imitados pelos métodos convencionais. Resumindo, este trabalho pretende demonstrar a relevância quer da aplicação de modelos lipídicos, quer da microfluídica para estudar a permeabilidade de compostos bioativos para servir de suporte à descoberta de fármacos e/ou desenvolvimento de formulações.
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Universidade do Minho Escola de Ciências Paulo Alexandre Cardoso Teles Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos janeiro de 2023 Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos Paulo Alexandre Cardoso Teles UMinho | 2023
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos. UMinho | 2021
Paulo Alexandre Cardoso Teles Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos Dissertação de Mestrado Mestrado em Biofísica e Bionanossistemas Trabalho efetuado sob a orientação da Professora Doutora Marlene Lúcio e da Doutora Vanessa Fernandes Cardoso 021 janeiro de 2023
I DIREITOS DE AUTOR E CONDIÇÕES DE UTILIZAÇÃO DO TRABALHO POR TERCEIROS Este é um trabalho académico que pode ser utilizado por terceiros desde que respeitadas as regras e boas práticas internacionalmente aceites, no que concerne aos direitos de autor e direitos conexos. Assim, o presente trabalho pode ser utilizado nos termos previstos na licença abaixo indicada. Caso o utilizador necessite de permissão para poder fazer um uso do trabalho em condições não previstas no licenciamento indicado, deverá contactar o autor, através do RepositóriUM da Universidade do Minho. Atribuição-Não comercial-Sem Derivações CC BY-NC-ND https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
II DECLARAÇÃO DE INTEGRIDADE Declaro ter atuado com integridade na elaboração do presente trabalho académico e confirmo que não recorri à prática de plágio nem a qualquer outra forma de utilização indevida ou falsificação de informações ou resultados em nenhuma das etapas conducente à sua elaboração. Mais declaro que conheço e que respeitei o Código de Conduta Ética da Universidade do Minho.
III AGRADECIMENTOS Terminada mais uma etapa do meu percurso académico, a mais importante de todas e um dos meus maiores objetivos desde bastante cedo, tenho alguns agradecimentos especiais a fazer. Primeiro agradecer à Prof. Dra Marlene Lúcio por desde início ter aceite o desafio de me orientar. Queria agradecer pela oportunidade, pela orientação, por todos os conhecimentos transmitidos, pelas críticas construtivas, pela paciência com as minhas dificuldades, pela ajuda e pelo apoio emocional em momentos em que estive mais em baixo e em que duvidei das minhas capacidades. Agradecer à Prof. Dra Vanessa Cardoso pela orientação, por toda a ajuda, críticas construtivas, disponibilidade e conhecimentos valiosos que me passou, por todo o apoio e por todas as vezes que me deu força e me fez valorizar cada etapa ultrapassada na tese. Agradecer também à Mestre Eduarda Fernandes que desde o primeiro dia me recebeu, me deixou à vontade para tirar qualquer dúvida, me orientou e me acompanhou tanto na parte laboratorial como na escrita da tese. No geral, agradecer a estas pessoas pela influência em todo o processo e por puxarem por mim para sair da minha zona de conforto e evoluir. O mais sincero obrigado! Quero agradecer aos meus amigos que muitas vezes me ouviram, me apoiaram em todo este processo, me ajudaram a descontrair quando foi necessário e me fizeram acreditar em mim. Tenho muita sorte por vos ter comigo, obrigado! Por último, mas não menos importante, agradecer à minha família que me transmitiu os valores necessários para chegar até aqui e que sempre acreditaram nas minhas capacidades e me incentivaram a lutar pelos meus objetivos. Em especial à pessoa mais importante que tenho, a minha irmã, por ser a melhor pessoa que conheço, a minha maior inspiração e orgulho e que me faz querer ser melhor em todos os aspetos todos os dias. Obrigado, Daniela!
IV RESUMO A administração de fármacos e outros compostos bioativos através da pele é uma área de investigação de crescente interesse para o desenvolvimento de formulações com aplicações farmacêuticas e cosméticas. A via cutânea é bem tolerada e aceite e, por isso, pode ser explorada para um efeito local ou sistémico, desde que seja possível garantir a permeação transdérmica dos compostos administrados. Quando se pretende uma permeação trans(dérmica) é muito importante também ter em conta as barreiras da pele (principalmente a camada mais externa, o estrato córneo) que, devido à sua matriz lipídica intercelular e ao seu arranjo estrutural, dificulta a permeação de compostos. Assim, neste trabalho é proposto o desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos miméticos da matriz lipídica do estrato córneo. Pretende-se que os modelos propostos mimetizem a barreira cutânea, constituindo uma alternativa mais económica, de simples preparação e reprodutível comparativamente aos modelos de pele humana e animal, que não se justificam por questões funcionais e éticas. Os modelos desenvolvidos foram validados pela aplicação de ensaios clássicos de difusão em células de Franz com compostosmodelo de permeabilidade bem conhecida (cafeína, diclofenac e testosterona). Numa tentativa de desenvolver uma solução de triagem rápida (HTS, do inglês “high throughput screening” ) capaz de testar um grande número de compostos em simultâneo, como alternativa aos ensaios clássicos de avaliação de permeabilidade dos compostos, os modelos validados foram incorporados numa plataforma microfluídica. A adaptação dos modelos para plataformas microfluídicas permitirá reduzir o volume de reagentes utilizado e aumentar a fiabilidade e reprodutibilidade dos ensaios de permeação através da padronização dos procedimentos analíticos, enquanto permite simular o fluxo observado em fenómenos fisiológicos de difusão que não podem ser imitados pelos métodos convencionais. Resumindo, este trabalho pretende demonstrar a relevância quer da aplicação de modelos lipídicos, quer da microfluídica para estudar a permeabilidade de compostos bioativos para servir de suporte à descoberta de fármacos e/ou desenvolvimento de formulações. PALAVRAS-CHAVE: permeação trans(dérmica); estrato córneo; modelos miméticos lipídicos; ensaios HTS; microfluídica.
V ABSTRACT The administration of drugs and other bioactive compounds through the skin is a research area of growing interest for the development of formulations with pharmaceutical and cosmetic applications. The cutaneous route is well tolerated and accepted and, therefore, can be explored for a local or systemic effect, if it guarantees the transdermal permeation of the administered compounds. When trans(dermal) permeation is intended, it is also very important to consider the skin barrier (mainly the outermost layer, the Stratum Corneum ) which, due to its intercellular lipid matrix and its structural arrangement, makes the permeation of compounds difficult. Thus, this work proposes the development and optimization of lipid mimetic models of the Stratum Corneum lipid matrix as a cheaper alternative, with simple preparation and reproducible compared to human and animal skin models, that are additionally unjustified by functional and ethical matters. The developed models were validated by applying classical diffusion assays in Franz cells with well-known permeability model compounds (caffeine, diclofenac and testosterone). Towards a high throughput screening (HTS) strategy capable of testing a large number of bioactive compounds simultaneously, as an alternative to traditional permeability methods, the validated models were incorporated in a microfluidic platform. The adaptation of the lipid biomimetic models to microfluidic platforms will allow to reduce chemical volumes used and increase reliability and reproducibility of permeation studies through standardization of the analytical processes, and simultaneously mimic the flux observed in physiological conditions of the diffusion phenomenon, which is not possible through traditional methods. Summarizing, the main goal of this research is to demonstrate the potential of lipid models and microfluidics for studying the permeability of bioactive compounds and support the drug discovery process and formulation development. KEYWORDS: trans(dermal) permeation; Stratum Corneum; lipid mimetic models; HTS assays; microfluidics.
VI ÍNDICE AGRADECIMENTOS ...................................................................................................................... III RESUMO ..................................................................................................................................... IV ABSTRACT .................................................................................................................................... V ÍNDICE ........................................................................................................................................ VI Índice de Figuras ......................................................................................................................... XI Índice de Tabelas ....................................................................................................................... XIII CAPÍTULO 1 .................................................................................................................................. 1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................................... 1 1.1. Motivação para o desenvolvimento do trabalho ......................................................................... 2 1.2. Objetivo principal, objetivos específicos e enquadramento do trabalho desenvolvido .............. 3 1.3. Organização da dissertação .......................................................................................................... 4 CAPÍTULO 2 .................................................................................................................................. 5 ESTADO DE ARTE .......................................................................................................................... 5 2.1. Tipos de administração cutânea e suas vantagens/desvantagens relativamente a outras vias de administração ...................................................................................................................................... 6 2.2. Estrutura da pele .......................................................................................................................... 7 2.3. Principal barreira à permeação cutânea: o estrato córneo ......................................................... 9 2.4. Influência das propriedades físico-químicas de compostos na permeação cutânea................. 10 2.4.1. Permeação cutânea e lipofilicidade .................................................................................... 10 2.4.2. Permeação cutânea e ionização .......................................................................................... 11 2.5. Métodos tradicionais de avaliação da permeabilidade no estrato córneo ............................... 12 2.6. Modelos lipídicos miméticos do estrato córneo ........................................................................ 13 2.7. Lipossomas ................................................................................................................................. 13 2.8. Bicamadas lipídicas em suporte sólido....................................................................................... 15 2.9. Testes de alto rendimento ......................................................................................................... 16 2.10. Microfluídica ............................................................................................................................. 16 2.10.1. Fabrico de plataformas microfluídicas .............................................................................. 17 2.10.2. Materiais utilizados para o fabrico de plataformas microfluídicas ................................... 17 2.11. Fabrico de plataformas microfluídicas em Polidimetilsiloxano por fotolitografia suave......... 19 2.12. Material fotossensível: SU-8 .................................................................................................... 20 2.13. Material elastomérico: PDMS .................................................................................................. 21 CAPÍTULO 3 ................................................................................................................................ 22 MATERIAIS, MÉTODOS ............................................................................................................... 22
XIII Índice de Tabelas Tabela 1. Métodos tradicionais e alternativas para a mimetização do SC. ....................................................... 12 Tabela 2. Materiais utilizados no fabrico de dispositivos microfluídicos [29, 30]. ............................................ 18 Tabela 3. Lista de reagentes e instrumentos utilizados ao longo do projeto..................................................... 23 Tabela 4. Classificação da permeação cutânea de um composto em função do valor de fluxo máximo de permeação (Jmáx) [103]................................................................................................................................... 37 Tabela 5. Dados obtidos da previsão in silico das propriedades da cafeína através do software MarvinSketch®. ....................................................................................................................................................................... 46 Tabela 6. Dados obtidos da previsão in silico das propriedades do diclofenac através do software MarvinSketch®. ....................................................................................................................................................................... 49 Tabela 7. Dados obtidos da previsão in silico das propriedades da testosterona através do software MarvinSketch®. ....................................................................................................................................................................... 52 Tabela 8. Parâmetros para a validação do método analítico de doseamento dos compostos. .......................... 54 Tabela 9. Resumo da caraterização físico-química dos modelos lipídicos na ausência e na presença de cada composto. Os resultados são apresentados como valores médios ± desvio padrão de pelo menos 3 determinações. ....................................................................................................................................................................... 55 Tabela 10. Resumo da caraterização biofísica dos modelos membranares na presença e na ausência de cada composto. Os resultados são apresentados como valores médios ± desvio padrão de pelo menos 3 determinações. ....................................................................................................................................................................... 57 Tabela 11. Tabela que resume e compara os valores de log D obtidos em sistemas membranares lipossoma/água obtidos in vitro e valores de log D octanol/água in silico. ........................................................ 61 Tabela 12. Cálculo do Sp e Jmáx com base no log D determinado in silico no módulo MarvinSketch® do software da Chemaxon®. Classificação da permeação de acordo com os valores de Jmáx obtidos e comparação com a permeação descrita em estudos reportados na literatura. ................................................................................ 63 Tabela 13. Cálculo do Sp e Jmáx com base no log D determinado in vitro em modelos miméticos membranares de DPPC e DPPC: CHOL (2:1). Classificação da permeação de acordo com os valores de Jmáx obtidos e comparação com a permeação descrita em estudos reportados na literatura. .................................................. 65 Tabela 14. Valores de Jmáx obtidos in vitro com recurso a células de difusão de Franz e respetiva classificação de permeação cutânea de cada composto. ...................................................................................................... 67
CAPÍTULO 1 INTRODUÇÃO
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos INTRODUÇÃO 2 1.1. Motivação para o desenvolvimento do trabalho Atualmente, os modelos animais/celulares são bastante utilizados no desenvolvimento de formulações para administração tópica na pele e para a administração transdérmica fazendo parte de testes in vitro , in vivo ou ex vivo . Porém, embora estes modelos tenham a vantagem de ser, em termos de complexidade, o substituto mais próximo da pele humana, sendo, portanto, usados para mimetizar os processos de permeabilidade no organismo humano, têm também inúmeras desvantagens, tais como o facto de serem dispendiosos, serem demorados e precisarem de requisitos específicos em termos de infraestruturas e, principalmente, por razões éticas e regulamentares. De facto, o regulamento Cosmético da União Europeia (EU) (EC 1223/2009) baniu a comercialização de cosméticos que, a certo ponto, para o seu desenvolvimento fossem submetidos a testes utilizando animais. Da mesma forma, também o regulamento REACH da UE (Registo, Avaliação, Autorização e Restrição de Substâncias Químicas) incita à procura e ao uso de alternativas a testes que utilizem modelos animais. Além dos problemas regulamentares, estes modelos permitem uma informação da permeabilidade cutânea quanto ao fluxo de permeação e quanto ao resultado (permeia ou não permeia), mas não permitem obter uma explicação biofísica que relacione a estrutura química do composto com o seu efeito na permeação (relação estrutura-atividade). Assim, os modelos lipídicos biomiméticos tornam-se modelos promissores para estabelecer este tipo de relações e para constituir uma alternativa aos modelos animais/celulares. Outra desvantagem importante do uso de modelos animais/celulares é o seu baixo rendimento, requerendo altos custos e elevados tempos de preparação, limitando o seu uso no âmbito do desenvolvimento de novos compostos, em que há uma necessidade de testar rapidamente centenas de compostos. A triagem de alto rendimento (HTS, do inglês, “ high throughput screening ”) é uma abordagem com interesse crescente para aplicação ao nível da descoberta de fármacos e outros compostos bioativos e traduz-se na testagem de grandes “bibliotecas químicas” através de ensaios miniaturizados e análise de dados em larga escala de forma autónoma [1, 2]. Assim, a avaliação de novos compostos e formulações para administração tópica cutânea e/ou transdérmica é uma área que requer ainda esforços na investigação para: (i) o desenvolvimento de modelos cutâneos apropriados ao estabelecimento de relações entre as estruturas químicas dos compostos e a sua capacidade de permeação ; (ii) a integração desses modelos em plataformas HTS que permitam maior rendimento, menores custos e maior padronização no processo de desenvolvimento de compostos e formulações.
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos INTRODUÇÃO 3 1.2. Objetivo principal, objetivos específicos e enquadramento do trabalho desenvolvido Este trabalho constituí uma primeira abordagem para desenvolver uma alternativa ao uso de modelos animais/celulares no estudo da permeação cutânea. Como tal, o objetivo principal do presente trabalho é o desenvolvimento de modelos lipídicos biomiméticos da matriz lipídica do estrato córneo (SC) da pele para avaliação da permeação cutânea de compostos bioativos, com sua posterior integração numa plataforma microfluídica HTS apelativa às indústrias farmacêuticas e cosméticas, bem como a todos os investigadores que se dediquem à descoberta de novos compostos bioativos. Assim, a plataforma microfluídica incorporando modelos lipídicos poderá constituir um avanço do estado da arte dos métodos que visam a utilização de modelos que são ou demasiado complexos, como enxertos de pele humana e/ou de animais (com todas as desvantagens já enumeradas), ou demasiado simples, como as membranas poliméricas sintéticas que não são capazes de mimetizar as condições fisiológicas das biomembranas da pele. Desta forma, os objetivos específicos do trabalho são os seguintes: - Desenvolvimento/caracterização de modelos biomiméticos da matriz lipídica do SC explorando uma composição simples à base de fosfatidilcolina (PC) e uma composição mais complexa de mistura de PC e colesterol (CHOL) e testando modelos de diferente dimensionalidade (lipossomas e bicamadas lipídicas suportadas); - Determinação in silico de propriedades físico-químicas de compostos bioativos, aqui usados como modelo (cafeina, diclofenac e testosterona); - Aplicação dos modelos biomiméticos lipídicos (lipossomas) para determinar efeitos nas propriedades biofísicas membranares dos compostos bioativos por metodologia não HTS; - Cálculo teórico dos valores de fluxo máximo de permeação dos compostos-modelo por aplicação das propriedades extensivas determinadas in vitro ou in silico (e.g., coeficiente de distribuição, peso molecular); - Determinação experimental dos valores de fluxo máximo de permeação dos compostos-modelo, usando a metodologia clássica das células de Franz, usando modelos membranares sintéticos; - Comparação dos dados de permeabilidade dos compostos-modelo obtidos experimentalmente com os valores teóricos calculados e os valores reportados na literatura; - Aplicação dos modelos biomiméticos lipídicos na forma de bicamadas lipídicas suportadas em microcanais de plataformas microfluídicas; - Determinação do coeficiente de distribuição nas plataformas microfluídicas e comparação com os valores obtidos no protocolo não HTS;
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos INTRODUÇÃO 4 Este trabalho está contextualizado no âmbito de um projeto de doutoramento “BIOMYSKIN – “Biomimicry profiling supporting drug discovery for topical applications” da Mestre Eduarda Fernandes, a decorrer no Departamento de Física da Universidade do Minho, sob supervisão da Doutora Marlene Lúcio, do Professor Senentxu Lancéros-Méndez e da Doutora Vanessa Cardoso. O projeto de doutoramento visa o desenvolvimento de uma solução HTS baseada em plataformas microfluídicas destinada às indústrias farmacêuticas e cosméticas para avaliar a capacidade de um determinado composto atravessar a barreira da pele. Os objetivos, os modelos miméticos lipídicos e as técnicas biofísicas de caracterização utilizadas neste projeto de mestrado permitiram explorar alguns dos primeiros objetivos do referido projeto de doutoramento e estão perfeitamente inseridos nas linhas estratégicas do Centro de Física das Universidades do Minho e Porto, nomeadamente na Linha 2 e 3. 1.3. Organização da dissertação A presente dissertação de mestrado encontra-se dividida em cinco capítulos: Capítulo 1 – Introdução Neste capítulo introduz-se a motivação, os objetivos e o respetivo enquadramento da dissertação; Capítulo 2 – Estado da Arte Neste capítulo é apresentada uma breve revisão da literatura sobre a administração tópica e/ou transdérmica de compostos; as barreiras cutâneas à administração dos compostos; os métodos clássicos de avaliação da permeabilidade cutânea e os modelos miméticos da pele; e as estratégias microfluídicas como potenciais plataformas HTS. Capítulo 3 – Materiais e Métodos Este capítulo é dedicado a uma breve descrição dos reagentes, materiais e metodologias experimentais utilizados. Capítulo 4 – Resultados e Discussão Neste capítulo apresentam-se os resultados obtidos ao longo do trabalho experimental, assim como uma breve discussão dos mesmos. Capítulo 5 – Conclusões e Perspetivas Futuras Neste capítulo são enumeradas as principais conclusões obtidas no trabalho desenvolvido assim como sugestões de futuros ensaios a serem realizados no âmbito do tema que deu origem a esta dissertação.
CAPÍTULO 2 ESTADO DE ARTE
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos ESTADO DE ARTE 6 De acordo com o exposto no capítulo anterior, o objetivo deste trabalho é o desenvolvimento de modelos lipídicos e a sua integração numa plataforma HTS para avaliar a capacidade de permeação cutânea de compostos. Desta forma o estado da arte que se segue focará diversos aspetos importantes para o proposto, nomeadamente: a administração cutânea de compostos (tipos, vantagens/desvantagens); a pele, sua constituição e principais barreiras à administração de compostos; as propriedades físico-químicas dos compostos que afetam a sua permeação cutânea; os métodos clássicos de avaliação da permeação cutânea; o tipo de modelos miméticos lipídicos e as plataformas microfluídicas como estratégias de HTS. 2.1. Tipos de administração cutânea e suas vantagens/desvantagens relativamente a outras vias de administração As vias de administração de compostos mais comuns são a via oral e parentérica. A via oral apresenta vantagens como a autoadministração do composto por parte do paciente, a predeterminação das doses a administrar e ainda a portabilidade das mesmas [3]. No entanto, apresenta algumas desvantagens: o grande conteúdo enzimático e gradiente de valores de pH característico do trato gastrointestinal (GI), que poderão levar à degradação dos compostos antes destes serem absorvidos; e as limitações na absorção dos compostos por dificuldades ao nível do transporte através do epitélio GI [4]. No caso das vias parentéricas (por injeção intravenosa, intramuscular e subcutânea) também existem desvantagens, como a natureza invasiva destas vias, o facto de serem uma alternativa dolorosa para o paciente, bem como a necessidade de especialização da pessoa que faz a administração [3]. Tendo em conta as desvantagens enumeradas das outras vias de administração, a administração na pele oferece uma oportunidade acessível e conveniente para a administração de compostos de uma forma não invasiva. A administração cutânea dos compostos pode ser feita localmente na pele, designando-se administração tópica, ou com o objetivo de fazer chegar os compostos à corrente sanguínea através da qual serão distribuídos pelos locais alvo, designando-se administração transdérmica [5]. A administração cutânea, é, portanto, alvo de um forte estudo e investimento na tentativa de encontrar abordagens inovadoras e que permitam otimizar resultados tanto ao nível da cosmética como do desenvolvimento farmacêutico.
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos ESTADO DE ARTE 7 Algumas das vantagens da administração cutânea incluem: a possibilidade de obter uma duração prolongada da ação pretendida; o facto de ser uma via não invasiva (desde que não seja uma administração parentérica do tipo subcutâneo), provocando pouco desconforto ao paciente que pode ainda variar as zonas de aplicação já que a pele tem uma grande área de superfície; o facto desta via poder reduzir os efeitos adversos dos compostos administrados (se a administração é tópica e se pretende um efeito local); evita o efeito de primeira passagem do metabolismo hepático e GI, correlacionando melhor as concentrações do fármaco com a sua atividade (se a administração é transdérmica) [3, 4, 5]. Não obstante, a administração cutânea apresenta também alguns desafios, sendo o maior deles o facto de apenas alguns compostos apresentarem uma permeação eficaz, que é limitada quer pelo seu peso molecular (<400-500 Da), quer pelas suas características físico-químicas (é favorecida a permeação de moléculas lipofílicas e anfifílicas devido à matriz lipídica existente na barreira mais externa e principal da pele, o SC) [5, 6, 7, 8]. Como tal é muito importante uma triagem dos compostos que tenham capacidades de permeação cutânea e é também importante que as metodologias de triagem possibilitem obter uma informação biofísica dos motivos pelos quais determinado composto não apresenta boa permeação, como forma de desenvolver uma relação entre a estrutura dos compostos e a sua permeação. Este tipo de informação só será possível com metodologias de triagem que integrem modelos lipídicos miméticos da matriz lipídica da pele, pelo que o investimento no desenvolvimento destes modelos é um dos pontos fulcrais deste trabalho. 2.2. Estrutura da pele A pele é o maior órgão do corpo humano e atua como uma barreira que protege o corpo do mundo exterior. A pele forma uma barreira eficaz entre o organismo e o meio ambiente evitando a invasão de agentes patogénicos e afastando agressões químicas e físicas, bem como a perda desregulada de água e solutos [9]. A sua estrutura divide-se em três camadas distintas: A hipoderme (camada mais interior), a derme (camada intermédia) e a epiderme (camada mais exterior) (Figura 1). A hipoderme apresenta uma espessura variável de acordo com a região do corpo e contém células adiposas com função de proteção mecânica, contendo ainda neurónios sensoriais e vasos sanguíneos [10]. A derme consiste em duas camadas de tecido conjuntivo (1-2 mm) e é composta por: células adiposas dérmicas, células com atividade imunológica (mastócitos) e fibroblastos que produzem fibras de colagénio, elastina, reticulina e proteoglicanos e que constituem a matriz
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos ESTADO DE ARTE 8 extracelular que serve de suporte para a pele. A derme contém ainda apêndices cutâneos tais como os folículos pilosos, glândulas sudoríparas, sebáceas e é inervada e vascularizada, contendo vasos sanguíneos e linfáticos [11] A epiderme, por sua vez, é a parte superficial da pele, não é vascularizada e tem uma espessura entre os 100 e os 150 µm estando separada da derme por uma membrana basal. A epiderme é dividida em quatro camadas: estrato basal (SB), estrato espinhoso (SS), estrato granuloso (SG) e SC [11]. Destas, apenas o SC é constituído por células não viáveis (mortas). As camadas viáveis da epiderme são compostas essencialmente por queratinócitos (95% da constituição total da epiderme), por desmossomas produzidos pelos queratinócitos, que têm a capacidade de os conectar, e por outros tipos de células com funções específicas: os melanócitos (função de proteção contra a radiação conferindo cor à pele), as células de Langerhans (com funções imunológicas) e as células de Merkel (com funções de transmissão sensorial). A epiderme viável possui ainda uma variedade de enzimas catabólicas (esterases, fosfatases, proteases, nucleotidases e lipases) [10, 12, 13]. A camada não viável da epiderme, SC, tem especial interesse pois constitui a primeira e principal barreira à permeação cutânea de compostos e por esse motivo será descrita com mais detalhe na secção seguinte. Figura 1. Estrutura da pele [14] .
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos ESTADO DE ARTE 9 2.3. Principal barreira à permeação cutânea: o estrato córneo Tal como já referido, a pele atua como a principal barreira entre o corpo e o meio exterior. Para esta função é absolutamente crucial a camada mais externa da pele, o SC. A sua função é proteger o organismo da perda excessiva de água e prevenir a entrada no organismo, através da epiderme, de agentes infeciosos ou compostos que possam provocar uma resposta imunológica [15, 16, 17]. O SC é constituído por células mortas (queratinócitos não viáveis) que tomam a designação de corneócitos. A organização estrutural do SC é muitas vezes descrita pelo modelo “tijolos e cimento” (em inglês referido como “ brick and mortar” ) onde os corneócitos (cerca de 25 camadas) representam os “tijolos” e o “cimento” é representado por uma matriz lipídica (Figura 2). Esta estrutura divide-se, portanto, em dois domínios: a) uma região celular (corneócitos) rica em água e proteínas (e.g., enzimas, filagrina e queratina) e b) uma região intercelular rica em lípidos [18]. A filagrina existente nos corneócitos tem uma função de alinhar os filamentos de queratina e os seus metabolitos são importantes para a hidratação do SC, pois são parte integrante do chamado fator de hidratação natural (NMF, do inglês “ natural moisturizing factor” ). Figura 2. Estrutura do estrato córneo representada pelo modelo “brick and mortar” . A matriz intercelular lipídica do SC organiza-se em bicamadas multilamelares densamente compactadas compostas por três principais classes de lípidos: ceramidas, CHOL e uma mistura de ácidos gordos [15, 16] presentes em igual razão molar (1:1:1) [17, 19]. Estas estruturas multilamelares são constituídas por duas fases lamelares de diferente periocidade com
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos ESTADO DE ARTE 16 No método Langmuir-Blodgett o substrato sólido é desenhado através de uma monocamada de um lípido A e depois impulsionado através de outra monocamada contendo o lípido B, podendo originar uma camada assimétrica. Cada monocamada tem uma pressão superficial controlada, o que oferece grande controlo da composição da SLB. O método de fusão vesicular é o mais simples, mas não favorece a preparação de bicamadas assimétricas. No método de Langmuir-Schaeffer , monocamadas inteiras são transferidas para o substrato sólido sequencialmente. Os métodos híbridos podem combinar os métodos Langmuir-Blodgett ou Langmuir-Schaeffer com fusão vesicular e possibilitam que bicamadas assimétricas sejam preparadas in situ sendo ideais para realizar medições em SLBs imediatamente após a sua preparação. As bicamadas com base em polímeros consistem em moléculas anfifílicas ancoradas a um substrato por intermédio de um polímero (como por exemplo, o polietilenoglicol) e têm uma maior profundidade da camada de água entre a superfície proximal da bicamada e o suporte sólido [47]. 2.9. Testes de alto rendimento A utilização de modelos animais/celulares tem vindo a diminuir devido a elevados tempos de espera, elevados custos e proibições impostas pelo regulamento cosmético da União Europeia (EC 1223/2009) que baniu a comercialização de cosméticos que, a certo ponto, para o seu desenvolvimento fossem submetidos a testes utilizando estes modelos. Também o regulamento REACH da UE (Registo, Avaliação, Autorização e Restrição de Substâncias Químicas) incita à procura e ao uso de alternativas a testes que utilizem modelos animais [48, 49]. Os testes de alto rendimento ou HTS (do inglês “ high throughput screening ”) surgem como alternativa aos testes únicos e de grande volume, apresentando vantagens para a descoberta de fármacos/compostos bioativos, nomeadamente aqueles que visam a administração na pele (tópica ou transdérmica). Além disso, neste projeto é utilizada uma plataforma microfluídica que pelas suas características de HTS será uma mais-valia para a avaliação de diferentes modelos biomiméticos da matriz lipídica do SC e da interação de compostos com estes modelos. 2.10. Microfluídica A microfluídica é uma área relativamente recente que combina os princípios da física, química, biologia, dinâmica de fluidos, microeletrónica e ciência dos materiais [50]. É a ciência e tecnologia
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos ESTADO DE ARTE 17 de sistemas que processam e/ou manipulam pequenos volumes de fluidos (10-9 a 10-18 litros) através de canais com dimensões de dezenas a centenas de micrómetros [51]. Os sistemas microfluídicos, em comparação com os tradicionais ensaios in vitro à macro escala, fornecem uma representação mais realista das condições fisiológicas e patológicas de sistemas complexos para investigação fundamental e desenvolvimento de fármacos. De facto, os sistemas microfluídicos têm sido usados para modelar ambientes biológicos e mimetizar as complexas interações célulacélula e célula-microambiente encontradas em tecidos e órgãos biológicos; bem como alguns dos processos fisiologicamente relevantes relacionados com a absorção, distribuição, metabolismo e processos de eliminação (ADME), que podem ajudar a acelerar o desenvolvimento de fármacos e a reduzir a necessidade de testes em animais. Isto ocorre porque os sistemas microfluídicos têm a capacidade de controlar com precisão o microambiente fluídico, o que é especialmente relevante e representativo porque muitos processos biológicos ocorrem à escala micrométrica, coincidente com as dimensões do canal microfluídico [52, 53]. A microfluídica apresenta outras vantagens comuns aos sistemas HTS, como a sua facilidade de integração numa grande variedade de sistemas, o seu automatismo que minimiza a intervenção humana (“ sample to answer ”), o facto de requerer quantidades de amostra reduzidas e ainda a portabilidade dos dispositivos microfluídicos para a sua aplicação in situ [54, 55, 56, 57]. 2.10.1. Fabrico de plataformas microfluídicas Tendo em conta que o objetivo da utilização da microfluídica neste projeto é a obtenção de um sistema HTS com um modelo lipídico do SC, apresentam-se seguidamente alguns materiais e métodos de fabrico que podem ser empregues para a produção destas plataformas. 2.10.2. Materiais utilizados para o fabrico de plataformas microfluídicas Um dos pontos iniciais e mais relevantes no fabrico das plataformas microfluídicas prende-se pela escolha do material correto para o seu fabrico. Aspetos como aplicação, função requerida e grau de integração são cruciais pois determinam tanto as propriedades inerentes da plataforma quanto as possíveis tecnologias de fabrico que podem ser utilizadas [58]. Ao escolher um material, características como flexibilidade, permeabilidade ao ar, condutividade elétrica, compatibilidade com solventes, transparência ótica e biocompatibilidade devem ser consideradas [59]. Outra
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos ESTADO DE ARTE 18 consideração importante é o custo, que deve ser mantido o menor possível para fabricar itens e dispositivos descartáveis de uso único que evitem a contaminação cruzada entre os ensaios. A Tabela 2 sumariza alguns dos materiais mais utilizados no fabrico de plataformas microfluídicas e ainda as suas vantagens e limitações. Tabela 2. Materiais utilizados no fabrico de dispositivos microfluídicos [29, 30] . Materiais Vantagens Limitações Silício - Compatibilidade química; - Termoestabilidade; - Facilidade de fabrico; - Propriedades semicondutoras; - Permite modificações de superfície. - Elevado custo; - Opacidade do silício, o que o torna incompatível para deteção ótica nas regiões do visível e ultravioleta. Vidro - Quimicamente inerte; - Termoestabilidade; - Isolamento elétrico; - Rigidez; - Biocompatibilidade; - Permite fácil funcionalização da superfície; - Excelente transparência ótica. - Apesar de ser um material pouco dispendioso, o fabrico de plataformas microfluídicas tem elevados custos e requer bastante tempo. Polímeros PDMS (do inglês “ Polydimethylsiloxane ”) - Barato; - Fácil de moldar; - Adequado para prototipagem; - Transparência ótica; - Permeabilidade a gases; - Biocompatibilidade; - Baixa autofluorescência; - Grande elasticidade. - A porosidade do PDMS torna-o um material com elevada capacidade de adsorção, no qual as moléculas se podem difundir; -Incompatível com solventes orgânicos (por exemplo hexano, tolueno e clorofórmio), pois as suas moléculas podem ser adsorvidas ao PDMS; PMMA (do inglês “ Polymethylmethacrylate ”) - Transparência ótica; - Boas propriedades mecânicas; - Permite modificação da superfície; - Bom para prototipagem em pequena escala de produção. - Baixa permeação a gases; - Rigidez dificulta o fabrico de plataformas funcionais. -Polímeros perfluorados: Teflon PFA (do inglês “Perfluoroalkoxy” ), Teflon FEP (do inglês “Perfluorinated ethylene–propylene” ) e PTFE (do inglês “Polytetrafluoroethylene”) - Termoprocessabilidade; - Inércia química; - Compatibilidade com solventes orgânicos; - Transparência ótica; - Permeabilidade moderada a gases; - Altas temperaturas de fusão; - Elevada toxicidade.
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos ESTADO DE ARTE 19 Materiais Vantagens Limitações Resinas epóxi - Material termofixo; - Maior estabilidade em altas temperaturas; - Resistência química; - Transparência ótica; - Resolução elevada. - Elevado custo. Hidrogéis - Redes tridimensionais altamente porosas de cadeias poliméricas hidrofílicas que permitem a difusão de pequenas moléculas e biopartículas; - Biocompatibilidade; - Baixa citotoxicidade; - Biodegradabilidade; - Tamanho dos poros controlável; - Alta permeabilidade. - Manter a integridade do dispositivo é bastante desafiante e pode limitar o seu uso a longo prazo. De seguida será dado especial ênfase ao fabrico de estruturas microfluídicas recorrendo ao PDMS (elastómero amplamente usado em microfluídica pelas propriedades e vantagens referidas na Tabela 2) e à obtenção de réplicas das mesmas através de moldes fabricados em SU-8 (resina fotossensível) recorrendo à técnica de fotolitografia suave, materiais e técnica de fabrico utilizados neste trabalho. 2.11. Fabrico de plataformas microfluídicas em Polidimetilsiloxano por fotolitografia suave Para a criação rápida de réplicas de plataformas microfluídicas de materiais elastoméricos como o PDMS, a abordagem de fotolitografia suave é comumente utilizada [60]. Esta técnica permite a microfabricação de estruturas na ordem dos micrómetros, com diferentes formas e tamanhos. A técnica de fotolitografia suave recorre, em primeiro lugar à padronização de um material fotossensível, neste projeto o SU-8, que quando exposto a um tipo específico de radiação, permite a obtenção de moldes. Para a padronização do material utiliza-se um fotolito, colocado entre o material e a radiação (fotolitografia), de forma a controlar as áreas expostas à radiação [61], conforme apresentado na Figura 6. Os fotolitos são desenhados recorrendo ao desenho computadorizado (CAD, do inglês” computer aided design ”) e posteriormente impressos comercialmente. É nos fotolitos que estão impressos os padrões bidimensionais pretendidos nos moldes em SU-8 (espelhos do que serão as estruturas em PDMS). A transferência dos padrões desejados é assegurada pela incidência da luz UV no
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos ESTADO DE ARTE 20 material fotossensível que promove a sua polimerização e cria uma elevada densidade de ligações cruzadas neste material [62]. Este é um passo crucial na microfabricação de estruturas microfluídicas. Figura 6. Processo da fotolitografia suave: obtenção de moldes em resina fotossensível por fotolitografia e PDMS por moldagem por réplica [46]. As áreas não protegidas pelo fotolito reagem de forma diferente daquelas que se encontram protegidas, dependendo do tipo de material fotossensível. As áreas desprotegidas de materiais fotorresistentes positivos desintegram-se em solventes orgânicos e podem ser removidas, enquanto as áreas expostas de materiais fotorresistentes negativos, como o caso do SU-8, formam uma estrutura em rede e tornam-se insolúveis [63]. Os moldes obtidos são, de seguida, utilizados para a obtenção das estruturas em PDMS por moldagem por réplica. De seguida, será descrito de forma mais detalhada o material fotossensível utilizado neste projeto que servirá como “molde mestre” (a resina baseada em epóxi negativa SU-8) para a obtenção de moldes reutilizáveis, padronizados e replicados de PDMS. A utilização deste material possibilita a obtenção dos canais microfluídicos com espessura/altura controláveis. 2.12. Material fotossensível: SU-8 Nos últimos anos, a resina SU-8 tem vindo a ser utilizada numa variedade de aplicações incluindo a construção de microcanais para plataformas microfluídicas e lab-on-a-chip [64] e como
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos ESTADO DE ARTE 21 componente estrutural em dispositivos MEMS (do inglês “ micro-electro-mechanical systems ”) [65, 66, 67]. A SU-8 é uma resina baseada em epóxi negativa muito utilizada para a construção de microestruturas, com baixo custo e de fácil processamento [68] e possui caraterísticas como fotossensibilidade e transparência à luz visível que permitem a sua padronização por fotolitografia de raios UV e boa deteção por sistemas óticos. É também um material biocompatível, mecânica e quimicamente estável/inerte [65, 62]. Devido a todas estas propriedades de interesse, a resina SU-8 padronizada, resultante da fotolitografia, é utilizada como um “molde mestre” para a réplica do respetivo padrão em materiais elastoméricos, como é o caso do PDMS (descrito no próximo ponto). 2.13. Material elastomérico: PDMS O PDMS é um elastómero do grupo dos siloxanos que apresenta propriedades muito interessantes para o desenvolvimento de microestruturas com vários tipos de aplicações na área da microfluídica [69, 70]. Este permite o fabrico de estruturas à microescala com alta-fidelidade e reprodutibilidade, por métodos de moldagem por réplica. Algumas das suas vantagens são o seu baixo custo, fácil manuseamento, biocompatibilidade, elasticidade, permeabilidade e transparência ótica nos intervalos de 290-1100 nm. Além disso, possui facilidade de ligação a outros materiais, como é o caso do vidro, ou estruturas de PDMS, boa estabilidade térmica e baixa tensão superficial. Para além disto é térmica e eletricamente isolante, e quimicamente inerte [71]. A superfície do PDMS é hidrofóbica devido aos grupos metilo (CH3), sendo que a mesma pode ser modificada recorrendo, por exemplo, a tratamento com plasma de oxigénio que induz a oxidação da superfície tornando-a hidrofílica [72]. De um modo geral, ao longo dos últimos pontos foram apresentados os materiais empregues para a obtenção de plataformas microfluídicas com caraterísticas HTS e a forma como estas foram desenvolvidas para satisfazer as condições necessárias à avaliação dos diferentes modelos biomiméticos da matriz lipídica do SC e a interação destes com os compostos bioativos a testar.
CAPÍTULO 3 MATERIAIS E MÉTODOS
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos MATERIAIS E MÉTODOS 23 3.1. Materiais utilizados Na Tabela 3 estão sumarizados todos os instrumentos e reagentes utilizados no desenvolvimento deste projeto. Tabela 3. Lista de reagentes e instrumentos utilizados ao longo do projeto. Reagentes Instrumentos Designação Empresa fabricante Designação Empresa fabricante Ácido cítrico Sigma Aldrich Agitador magnético MSH 300, BOECO Ácido clorídrico Sigma Aldrich Balança analítica Denver instruments Cafeína Sigma Aldrich Banho de ultrassons Branson ultrasonics Cloreto de potássio May and Baker Banho termostatizado VWR CHOL Avanti Polar Lipids Canais microfluídicos CMEMS (do inglês “ Centre for Microelectrome-chanical Systems ”), UMinho Diclofenac Sigma Aldrich Célula de Franz Permegear DPPC (do inglês “Dipalmitoylphosphatidylc holine”) Avanti Polar Lipids Dipcell Malvern Instruments Ltd. Etanol absoluto Fisher Chemical Drop Shape Analysis System DSA100 Krüss Scientific Fosfato de potássio Sigma Aldrich Espetrofotómetro de varrimento UV-3101PC UV-Vis-NIR Shimadzu Corporation Hidróxido de sódio Sigma Aldrich Extrusor Lipex Northern Lipids Inc . Kit Sylgard TM 184 Silicone Elastomer Kit (base do pré-polímero e agente de cura do PDMS) SU-8 100, MicroChem ; SU-8 Developer, Microchem ; Filtros de membrana de policarbonato Whatman PDMS (do inglês “ Poly(dimethylsiloxane)” ) Dow Chemical Company Lâmina de vidro (26×76 mm) LabBox PVA (do inglês “Poly (Vinyl alcohol)” ) AlfaAesar Filtros de membrana de polissulfona (Tuffryn®) Pall Testosterona Sigma Aldrich pHmetro de bancada 691 Metrohm Tetraborato de sódio Sigma Aldrich Vórtex Ibx Instruments Tris (do inglês “ tris(hydroxymethyl)amino methane” ) Merck Spin-coater Spin-coater Polos 200
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos MATERIAIS E MÉTODOS 24 3.2. Determinação in silico das propriedades físico-químicas dos compostos A descoberta e desenvolvimento de fármacos ou outros compostos bioativos tornou-se inconcebível sem a ajuda de métodos computacionais que permitam prever e analisar as suas propriedades físico-químicas, bem como a sua estrutura molecular e o seu comportamento biológico. Neste sentido, in silico é a designação atribuída à previsão teórica das propriedades dos compostos que permite ajudar a estabelecer uma correlação entre testes in vitro e in vivo , sendo ainda um auxiliar precioso no desenvolvimento de formulações [73]. Neste projeto os compostos-modelo (cafeína, diclofenac e testosterona) foram analisados in silico tendo sido possível prever propriedades tais como: a estrutura molecular, a distribuição de microespécies e pKa, o perfil de log D e log P e ainda, a sua análise elementar. 3.2.1. Estrutura molecular A estrutura molecular dos compostos é, sem dúvida, um parâmetro importante uma vez que determina a absorção e orientação dos compostos nas biomembranas. Para além disso, a estrutura molecular é determinante na forma como os compostos ultrapassam as barreiras cutâneas, bem como na escolha e desenvolvimento de uma formulação que funcionará como veículo para os compostos e os encaminhará para o lugar de atuação. A estrutura molecular dos compostos-modelo foi desenhada recorrendo ao módulo MarvinSketch® do software da Chemaxon®. 3.2.2. Grau de ionização e pKa O pKa, cologaritmo da constante de acidez (Ka), pode ser relacionado com o pH através da relação de Henderson-Hasselbalch (Equação 1). 𝑝𝐻 = 𝑝𝐾𝑎 + 𝑙𝑜𝑔10 [𝐴−] [𝐻𝐴] Em que [A-] representa a concentração de moléculas do fármaco que se encontram no estado ionizado e [HA] representa a concentração de moléculas do fármaco não ionizado. Por observação da equação anterior é possível perceber que o valor de pH é igual ao valor de pKa quando a razão [A-]/[HA]=1. Ou seja, o pKa define-se como o valor de pH ao qual 50% das moléculas de um Equação 1
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos MATERIAIS E MÉTODOS 25 composto se encontram no estado ionizado e 50% se encontram no estado neutro ou não ionizado [74]. Posto isto, através do pKa do composto é possível: (i) prever o grau de ionização do composto a diferentes valores de pH e estimar a sua absorção durante o seu percurso no organismo; (ii) entender a ligação do composto a proteínas plasmáticas bem como ao seu alvo terapêutico e (iii) antever a disponibilidade do composto para participar em reações biológicas [75, 76]. A determinação do valor de pKa dos compostos permite ainda compreender determinadas interações estabelecidas entre o composto e os componentes da formulação, sendo, por isso, um importante fator em estudos de pré-formulação [77, 78, 79]. 3.2.3. Coeficientes de distribuição e de partição Os compostos com grupos ionizáveis existem numa solução como uma mistura de diferentes formas iónicas, não iónicas (sem carga e eletricamente neutras) ou ainda zwitteriónicas (com igual número de cargas positivas e negativas e, portanto, eletricamente neutras). A ionização desses grupos, isto é, a proporção das formas iónicas e neutras, varia com o pH. Traçando o perfil do coeficiente de distribuição (log D) e do coeficiente de partição (log P) no módulo MarvinSketch® do software da Chemaxon® é possível determinar a lipofilicidade de um composto que se traduz na razão entre a afinidade desse composto para um meio lipídico/orgânico ou para a água. O log D indica a distribuição de um dado composto entre uma fase lipídica/orgânica e uma fase aquosa a um determinado valor de pH (ao qual as moléculas se podem encontrar no estado ionizado ou neutro) enquanto o log P indica a partição do composto a um pH em que todas as moléculas deste composto se encontram na forma neutra. Entre as formas ionizadas e não ionizadas de uma molécula é sabido que as mais solúveis em água (hidrofílicas) são as formas ionizadas, enquanto as formas mais solúveis nas fases lipídicas (lipofílicas) são as formas neutras. Por outro lado, quanto mais lipofílica uma molécula, mais esta se dissolve na fase lipídica/orgânica e consequentemente maior o log D e o log P e maior a sua capacidade de distribuição nas membranas biológicas. No software da Chemaxon®, o cálculo destes dois parâmetros de avaliação da lipofilicidade tem como base o método descrito por Viswanadhan et al. [80] que tem em conta o efeito da concentração de contra-iões.
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos MATERIAIS E MÉTODOS 32 testosterona) em termos de tamanho (obtido pelo raio hidrodinâmico) e PDI colocou-se uma alíquota de LUVs (≈600-1000 μL) em células descartáveis de polistireno (com a inserção do acessório DIP Cell® no caso das medidas ELS) e procedeu-se à análise de DLS e ELS, usando um Zetasizer Nano ZS (Malvern® Instruments Ltd., UK). Todas as medidas foram realizadas em condições de temperatura controlada a 25,0 ± 1,0 °C no dia da preparação. O tamanho e o PDI foram obtidos a partir do correlograma do software Zetasizer Nano ZS (Malvern®, UK), após análise dos cumulantes, conforme ISO 22412: 2017 [92]. O potencial-zeta foi obtido pela conversão da mobilidade eletroforética de acordo com o método de Helmholtz-von Smoluchowski [93]. 3.5.2. Temperatura de transição de fase principal e cooperatividade A Tm é outro parâmetro muito importante na caraterização biofísica de sistemas lipídicos, pois o seu estudo permite otimizar sistemas lipídicos que estejam em desenvolvimento para transporte e libertação de fármacos, bem como, estudar a interação fármaco-membrana quando os sistemas lipídicos são usados como modelos miméticos de membranas. Alterações nas propriedades das membranas como a sua estabilidade, permeabilidade ou fluidez podem ser intimamente relacionadas com alterações nas propriedades biofísicas dos lípidos que as compõe, nomeadamente alterações da Tm desses lípidos [94]. A Tm define assim uma temperatura à qual se dá uma passagem de uma fase lipídica mais ordenada (fase gel ou sólido-cristalina) para uma fase lipídica mais desordenada (fase fluida ou líquido-cristalina) [95]. Uma vez que as diferentes fases lipídicas apresentam diferentes propriedades de dispersão da luz [96], é possível, recorrendo à técnica de DLS e fazendo um estudo num intervalo de temperaturas determinar a Tm de sistemas lipídicos. Para determinar a Tm de LUVs de DPPC e DPPC: CHOL (2:1), na ausência e na presença de compostos bioativos, procedeu-se da mesma forma descrita na secção anterior, no entanto, as medidas de DLS do tamanho hidrodinâmico e intensidade de luz dispersa foram efetuadas numa gama de 25 a 55 °C com intervalos de 1°C. Para cada temperatura foram efetuadas 3 medidas com um tempo de estabilização de 1 min. A intensidade de luz dispersa (dada pela taxa de contagens média, TCM) é correlacionada com a temperatura (T), tal como ilustra a Figura 8, por aplicação de uma equação modificada de Boltzmann usando o módulo de ajuste não linear do software OriginLab® (Equação 6) [97].
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos MATERIAIS E MÉTODOS 33 𝑇𝐶𝑀 = 𝑟𝑠1 + 𝑝1𝑇 + 𝑟𝑠2 − 𝑟𝑠1 + 𝑝2𝑇 − 𝑝1𝑇 1 + 10𝐵 ( 1 𝑇−1 𝑇𝑚) Em que rs1 e p1 são respetivamente o declive e a ordenada na origem da tendência linear anterior à Tm; rs2 e p2 correspondem ao declive e à ordenada na origem na tendência linear a temperaturas acima da Tm e B corresponde à cooperatividade do sistema. Deste ajuste é, portanto, possível determinar dois parâmetros: Tm e B. B é um parâmetro cujo valor permite avaliar homogeneidade da composição do nanossistema lipídico. Se o nanossistema é constituído por um único tipo de moléculas, ou se a mistura de moléculas que o constitui se encontra bem distribuída, estas transitarão de fase (da fase gel para a fase fluida) em simultâneo, pelo que o perfil sigmoide correspondente à transição de fase apresenta um decaimento abrupto. Por outras palavras, o intervalo no qual as fases lipídicas gel e fluída coexistem é muito diminuto. Uma transição de fase com um baixo valor de B apresenta um perfil sigmoide com um decaimento prolongado, o que indica que não existe uma homogeneidade das moléculas que constituem o nanossistema. Assim, algumas moléculas transitarão de fase a uma dada temperatura e outras a uma temperatura diferente, pelo que não existe uma temperatura de transição única, mas um intervalo de temperaturas durante o qual a transição ocorre. Neste caso, o intervalo no qual as fases lipídicas gel e fluída coexistem é mais alargado. Portanto, B, tal como a Tm, são parâmetros que podem indiciar mudanças no sistema lipídico na presença de moléculas diferentes no sistema e sugerir alterações na biofísica das membranas. Uma variação nos valores destes parâmetros poderá sugerir a incorporação de um composto no meio lipídico e permite ainda concluir sobre a localização mais provável do composto. Equação 6
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos MATERIAIS E MÉTODOS 34 Figura 8. Figura exemplificativa de um ajuste sigmoide que correlaciona a taxa média de contagens ao longo da temperatura. 3.6. Determinação in vitro do coeficiente de distribuição Tal como referido anteriormente o log D é um parâmetro que caracteriza a distribuição de um dado composto entre uma fase lipídica e uma fase aquosa a um determinado valor de pH. Assim, para a determinação do log D dos compostos em estudo nos modelos lipídicos miméticos de membranas é necessário proceder ao doseamento do composto quer na fase lipídica quer na fase aquosa. Recorrendo à técnica de espetroscopia derivativa UV-Vis é possível fazer a determinação do log D sem ter de recorrer à separação de fases lipídica e aquosa, o que evita dificuldades como o controlo da temperatura, e também evita o facto desta separação de fases (recorrendo por exemplo a centrifugação e filtração) poder afetar o equilíbrio estabelecido entre os compostos e as fases lipídica e aquosa [98, 99]. A técnica de espetroscopia derivativa UV-Vis aplicada à determinação do log D assenta no princípio de que quando um determinado composto se distribui nas membranas lipídicas (passa de um meio aquoso ou polar para um meio lipídico ou apolar) há uma mudança num parâmetro de absorção como o comprimento de onda máximo de absorção ou no coeficiente de absortividade molar desse composto. Assim, os espetros de absorção de um composto que se distribui em modelos miméticos membrana/água são adquiridos para concentrações crescentes de modelo mimético, procedendo-se posteriormente à derivação dos espetros. A derivação dos espetros é essencial pois permite a eliminação de interferências espetrais provocadas pela difusão de luz dos modelos miméticos, permite uma deteção mais apurada das caraterísticas espetrais e aumenta a
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos MATERIAIS E MÉTODOS 35 resolução das bandas de absorção [100]. Seguidamente à derivação dos espetros de absorção procede-se à representação gráfica dos valores máximos ou mínimos da derivada dos espetros de absorção em função da concentração do modelo mimético lipídico. A Figura 9 (A) representa um exemplo do espetro de absorção de um composto e subsequente aplicação do método derivativo. Figura 9. (A) Exemplo de um espetro de absorção de um determinado composto. (B) Terceira derivada do espetro de absorção e consequente eliminação das interferências espetrais. (C) Exemplo de um ajuste não linear aplicando a equação 7 aos valores da derivada de absorvância em função da concentração de lípido [99]. O ajuste destes dados é feito por aplicação de uma equação de ajuste não linear no software OriginLab®, permitindo obter o valor do coeficiente de distribuição (D) cujo logaritmo permite a determinação do log D [100]: () 1 − =+ + membranar aquosa total aquosa DAbs DAbs D Modelo membranar DAbs DAbs D Modelo membranar Em que DAbstotal, DAbsmembranar, DAbsaquosa são respetivamente o valor da derivada da absorvância do composto determinada espectralmente a um dado comprimento de onda, no sistema membrana/água (total), na fase membranar e na fase aquosa, respetivamente. [Modelo membranar] é a concentração (em M) do modelo lipídico utilizado. Para a determinação do coeficiente de distribuição dos compostos bioativos (cafeina, diclofenac sódio e testosterona) em modelos membranares (LUVs de DPPC e de DPPC: CHOL (2:1)) foram preparadas suspensões contendo concentrações fixas de composto bioativo (8,00×10-5 M para a cafeína; 4,00×10-5 M para o diclofenac e 3,00×10-5 M para a testosterona) e concentrações crescentes de LUVs (5,00×10-5 M a 2,50×10-3 M para a cafeína; 1,00×10-4 M a 3,00×10-3 M para o diclofenac e 5,00×10-5 M a 2,50×10-3 M para a testosterona). As concentrações de compostos Equação 7
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos MATERIAIS E MÉTODOS 36 bioativos foram escolhidas de forma a estarem contidas na zona linear das respetivas retas de calibração. Foram preparadas ainda referências contendo apenas as mesmas concentrações acima referidas de LUVs (sem composto bioativo) e controlos contendo apenas soluções aquosas de compostos bioativos na concentração já referida. Seguiu-se uma incubação durante 30 min das amostras, referências e controlos em banho termostatizado a uma temperatura de 35±1°C de modo a permitir estabelecer a distribuição dos compostos nos modelos membranares e mimetizar a temperatura fisiológica no SC [101]. Após a incubação traçaram-se espetros de absorção num espetrofotómetro SHIMADZU UV-2501 PC, entre 200 e 400 nm, usando cuvetes de quartzo de volume reduzido (1 mL) com percurso ótico de 1 cm. Por fim procedeu-se à análise dos dados obtidos recorrendo à folha de cálculo desenvolvida em Excel “ Kp calculator ” [100] que permite a derivação dos espetros e ao software OriginLab® que permitiu ajustar, recorrendo à equação 7, os valores das derivadas a um dado comprimento de onda (em que a difusão de luz pelos sistemas lipídicos é eliminada) em função da concentração. 3.7. Determinação in silico e in vitro da permeação cutânea e fluxo máximo de permeação A permeação de fármacos e outros compostos bioativos através da barreira do SC é definida pelo coeficiente de permeabilidade (log Sp), que relaciona o gradiente de concentração do composto (descrito pela sua distribuição, log D, ao nível da matriz lipídica que compõe o SC) e o peso molecular desse fármaco ou composto bioativo (PM), de acordo com a seguinte equação: 𝑙𝑜𝑔𝑆𝑝(𝑐𝑚. ℎ−1)= −2,7 + 0,71 × 𝑙𝑜𝑔𝐷 − 0,0061 × 𝑃𝑀 Substituindo na equação acima, log D pelos valores de coeficiente de distribuição obtidos in silico , ou in vitro para cada um dos compostos bioativos estudados (cafeína, diclofenac e testosterona), é possível determinar o coeficiente de permeabilidade para cada um destes compostos. O coeficiente de permeabilidade poderá assim ser utilizado para calcular teoricamente o fluxo máximo de permeação (Jmáx) dos compostos através da seguinte equação: 𝐽𝑚á𝑥(𝑚𝑔. 𝑐𝑚2. ℎ−1)= 𝑆𝑝× 𝐶𝑠𝑎𝑡 𝑒𝑚 𝐻20 Equação 8 [147] Equação 9 [147]
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos MATERIAIS E MÉTODOS 37 Em que Csat refere-se à máxima concentração de composto (em mg/cm3) que se consegue solubilizar em água. A determinação experimental do Jmáx foi realizada in vitro com recurso a células de difusão de Franz (V-Series Stirrers for Franz Cells; PermeGear, USA). Estas células de difusão são constituídas por um compartimento dador onde se coloca o composto em estudo e por um compartimento recetor que contém o meio de dissolução. Para além disso, a separar os dois compartimentos é colocada uma membrana com o objetivo de mimetizar a membrana epitelial. A utilização de membranas sintéticas (e.g. silicone, celulose ou polissulfona) neste tipo de ensaios é considerada adequada pela FDA para a avaliação do desempenho terapêutico de formulações tópicas [102]. Apesar de não mimetizarem o ambiente lipídico natural, estas membranas permitem retirar ilações acerca da partição e difusão de compostos bioativos [103]. O procedimento experimental consistiu então na adição de 400 μL de uma solução aquosa de composto bioativo livre (1,54x10-2 M de cafeina; 6,75x10-3 M de diclofenac e 1,04x10-5 M de testosterona) no compartimento dador e 5 mL de tampão universal (pH=5.5) no compartimento recetor. O sistema foi mantido a 37 °C utilizando um banho de água circulante continuamente homogeneizado com agitação magnética. Entre os compartimentos dador e recetor foi colocada uma membrana de polissulfona (Tuffryn®, Palls, EUA) com uma área de difusão de 0,64 cm2. A diferentes tempos de ensaio (0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0; 10,0; 11,0; 12,0 e 24 h), foram retiradas alíquotas de 400 μL do compartimento recetor (volume que foi sempre substituído por 400 μL de tampão universal) procedendo-se à quantificação de cada composto pelo método de doseamento por espetrofotometria UV/Vis previamente validado. Em função dos valores de Jmáx teóricos ( in silico/in vitro ) ou experimentais (in vitro ) é possível perceber se um determinado composto tem maior ou menor capacidade de permeação cutânea de acordo com a classificação esquematizada na Tabela 4. Tabela 4. Classificação da permeação cutânea de um composto em função do valor de fluxo máximo de permeação (Jmáx) [104] . Jmáx (mg/cm2/h) Classificação da permeação cutânea 2,78×10-8 a 6,64×10-5 Muito fraca 1,07×10-4 a 9,79×10-4 Fraca 1,18×10-3 a 7,76×10-3 Moderada 1,03x10-2 a 7,53×10-2 Elevada 1,14×10-1 a 1,38 Muito elevada
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos MATERIAIS E MÉTODOS 38 3.8. Determinação in vitro do coeficiente de distribuição com recurso a uma plataforma microfluídica 3.8.1. Fabrico das estruturas microfluídicas Como previamente descrito, moldes em SU-8 foram fabricados e utilizados para a obtenção de estruturas microfluídicas em PDMS. Os moldes em SU-8 consistem numa matriz de canais 3D com largura de 50, 100 e 200 µm, comprimento de 15 mm e espaçadas por 2 mm. A altura/profundidade de 150 µm é obtida através do controlo do tipo de SU-8 utilizado e parâmetros de processamento, como descrito na secção seguinte. O fabrico foi realizado no Centro CMEMSUMinho, Departamento de Eletrónica Industrial da Universidade do Minho. 3.8.2. Fabrico dos moldes em SU-8 A resina fotossensível SU-8 100 ( MicroChem ) foi utilizada para o fabrico de moldes em SU-8 com espessura de ⁓150 µm. Para o efeito, em primeiro lugar desenharam-se as estruturas pretendidas recorrendo ao programa AutoCad (versão experimental) para posterior impressão em fotolitos. Na Figura 10 está ilustrada uma representação gráfica do fotolito utilizado para o fabrico dos moldes em SU-8, que por sua vez irão dar lugar a estruturas em PDMS com canais com as mesmas dimensões, inclusive altura/profundidade. Figura 10. Representação gráfica do fotolito para a produção dos moldes em SU-8 e posterior obtenção das estruturas microfluídicas em PDMS. As linhas representam os canais com larguras de 50, 100 e 200 µm (3 réplicas de cada), comprimento de 15 mm e espaçadas de 2 mm. As entradas e saída apresentam um diâmetro de 1 mm. O fabrico dos moldes em SU-8 requer vários passos e os parâmetros de processamento foram definidos adaptando o protocolo descrito em [64]. Resumidamente, pesou-se 1 g de SU-8 100
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos MATERIAIS E MÉTODOS 39 para cada lâmina de vidro (26×76 mm) previamente limpa (obtendo-se um total de 6 réplicas de moldes em SU-8, num total de 6 lâminas de vidro). De seguida, cada lâmina foi colocada num spin-coater seguindo dois ciclos. O primeiro ciclo tem como objetivo a dispersão da resina na lâmina de vidro e foi definida a uma velocidade de 500 rpm e aceleração de 300 rpm/s durante 7 s. O segundo ciclo define a espessura do filme, pelo que os parâmetros foram definidos a uma velocidade de 2500 rpm e aceleração de 300 rpm/s durante 30 s para a obtenção de uma estrutura final em SU-8 de aproximadamente 150 µm. Nos próximos passos, à exceção do processo de exposição à luz UV e aquando do processo de revelação, as amostras foram sempre mantidas no escuro recorrendo a uma simples tampa de alumínio. Deste modo, após o processo de deposição, as lâminas revestidas com SU-8 (e protegidas da luz) foram colocadas numa placa de aquecimento com o objetivo de evaporar o solvente gama-butirolactona (GBL) presente no SU8 e assim promover um endurecimento e uma maior aderência ao substrato ( Prazitherm PZ28-2 ). Este processo envolveu dois ciclos de temperatura, ambas a uma taxa de aquecimento controlada de 2,5ºC/min de forma a reduzir a tensão induzida nos filmes de SU-8. O primeiro ciclo passou pelo aquecimento dos filmes até atingir 65ºC durante 45 min enquanto no segundo passo a temperatura foi aumentada até atingir 95 ºC durante 90 min (esses tempos incluem os tempos para atingir a temperatura desejada e os tempos expostos a essa mesma temperatura). Após arrefecimento, as lâminas foram expostas a luz UV com uma faixa de emissão entre os 347 e 377 nm recorrendo a 10 lâmpadas UV de 20 W, colocando os fotolitos na superfície de cada lâmina revestidas com SU-8 e recorrendo a um sistema de vácuo para garantir um máximo contacto entre os fotolitos e as amostras. Este passo permite formar um fotoácido nas zonas expostas que irá promover a polimerização do SU-8 exposto durante a próxima etapa de aquecimento. O tempo de exposição depende igualmente do tipo de SU-8 e da espessura deseja, tendo sido definido um tempo de 9 min, considerando as características dos moldes pretendidos. De seguida, procedeuse a um novo processo de aquecimento, similar ao definido anteriormente de forma a reticular o SU-8 exposto a luz UV e torná-lo resistente a ação de solventes. Neste caso, os tempos foram de 23 min a 65 ºC e 35 min a 95 ºC a uma taxa de aquecimento de 2,5 ºC/min. Por fim, as amostras foram imersas em solvente comercial da MicroChem sobre agitação magnética de forma a remover de forma eficiente e rápida as áreas não expostas à luz UV e assim obter os moldes em SU-8. O processo demorou 15 min e de seguida os moldes foram finalmente limpos com isopropanol (IPA) e secos com pistola de azoto.
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos MATERIAIS E MÉTODOS 40 3.8.3. Fabrico das estruturas microfluídicas em PDMS Antes da preparação da solução de PDMS, foram criadas barreiras em cada lâmina contendo os moldes de SU-8 recorrendo a fita adesiva de alumínio rígida de forma a possibilitar a deposição da solução polimérica no seu interior. De seguida, aproximadamente 5 g de solução de PDMS com uma razão agente de cura/base de 1:10 ( Ellsworth ) desgaseificada (com recurso a um sistema de vácuo fabricado no laboratório) foi vertida lentamente em cada lâmina de vidro. Após ficar homogeneamente distribuída, colocando as lâminas de vidro numa superfície plana durante 10 min, as amostras foram colocadas numa placa de aquecimento a 80 ºC durante aproximadamente 1 h de forma a curar o PDMS. Por fim, após arrefecimento das amostras, foi utilizado um bisturi de forma a recortar o PDMS nas laterais e possibilitar a remoção das estruturas em PDMS dos moldes em SU-8. Após abrir as entradas e saídas dos canais microfluídicos em PDMS, as estruturas foram ligadas irreversivelmente em substratos de vidro com recurso a tratamentos de plasma com oxigénio ( Diener Zepto ). Para o efeito, as estruturas em PDMS e os substratos de vidro foram colocadas no interior de uma câmara de plasma, com as superfícies a ligar viradas para cima. A potência utilizada foi de 50 W sob uma pressão total de 80 Pa durante 45 s. Por fim retirou-se as amostras da câmara, colocou-se as superfícies de PDMS em contacto com as superfícies das lâminas de vidro e colocou-se numa placa de aquecimento a 80 ºC durante 5 min de forma a maximizar a ligação irreversível entre ambas as superfícies. 3.9. Hidrofilização dos canais Tal como referido no estado de arte, o PDMS é o material mais utilizado no fabrico de dispositivos microfluídicos, no entanto as suas propriedades hidrofóbicas constituem um desafio à formação de bicamadas lipídicas que requerem uma superfície hidrofílica para facilitar a sua formação. Posto isto, surgiu a necessidade de encontrar uma forma de modificar a superfície dos canais microfluídicos tornando-a hidrofílica. Com base na bibliografia optou-se por revestir a superfície dos canais microfluídicos com álcool polivinílico (PVA), um polímero hidrofílico adaptando a metodologia descrita em [105]. Inicialmente, fez-se uma passagem de água ultrapura pelos canais. Seguidamente preencheramse os canais microfluídicos com uma solução de NaOH (0,5 M) preparada através da diluição da solução comercial em água ultrapura. Esta solução ficou a repousar nos canais durante 30 min.
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos MATERIAIS E MÉTODOS 41 Após este tempo, a solução de NaOH é retirada e é injetada novamente água ultrapura nos canais. De seguida, uma solução de PVA a 1% (w/w) previamente preparada no dia anterior foi injetada nos microcanais e deixada a repousar durante 10 min com a plataforma microfluídica à temperatura ambiente. Para a preparação da solução de PVA, 100 mg de PVA foram dissolvidos em 10 mL de água desionizada previamente aquecida a 90 ºC e sob agitação magnética. Após os 10 min foi aplicada uma corrente de azoto e a plataforma microfluídica foi colocada no forno a 110 °C por 15 min para assegurar a completa remoção de resíduos/solventes [105]. Este processo de deposição de PVA seguida de evaporação do solvente foi repetido 3 vezes. 3.10. Avaliação da eficiência de hidrofilização pelo método do ângulo de contacto Os ângulos de contacto da água na superfície de placas de PDMS, com e sem revestimento de PVA foram medidos num equipamento Drop Shape Analysis System DSA100 (Krüss Scientific, Alemanha) equipado com uma câmara CCD. Em cada medição, e usando uma microseringa colocou-se uma gota de água desionizada sobre as placas. Quando uma gota de água é colocada sobre uma superfície sólida forma-se uma interface tripla entre o sólido (superfície), o líquido (gota) e o vapor (ar). O ângulo formado entre a superfície sólida e a tangente à superfície do líquido no ponto de contacto com o sólido é definido como o ângulo de contacto [106]. As imagens da gota sobre cada uma das superfícies foram obtidas imediatamente após a gota ser colocada na superfície da placa. A partir dessas imagens, foram calculados os valores dos ângulos de contacto que podem ser relacionados com a lipofilicidade das superfícies [106]. 3.11. Preparação dos modelos miméticos lipídicos a aplicar na plataforma microfluídica: bicamadas lipídicas suportadas Após a hidrofilização dos microcanais procedeu-se à formação das SLBs através do protocolo SALB (do inglês “Solvent Assisted Lipid Bilayers” ) descrito em [105]. O método SALB é um processo rápido e eficiente que tem como base a deposição de uma mistura lipídica num suporte sólido seguida pela troca de um solvente orgânico com um tampão aquoso resultando na formação espontânea de bicamadas lipídicas. No protocolo realizado, o etanol foi utilizado como solvente
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos RESULTADOS E DISCUSSÃO 47 Relativamente ao número de dadores e aceitadores de hidrogénios é possível inferir que a molécula de cafeína não tem grupos químicos dadores de hidrogénios e tem 5 grupos químicos aceitadores de hidrogénios. Segundo Lipinski et al. [112] prevê-se uma menor absorção e permeação nas membranas celulares de compostos com mais de 5 grupos químicos dadores de hidrogénios e mais de 10 grupos de aceitadores de hidrogénios. Assim, é sugerido que, apesar de o log D e log P da cafeína a apontarem como um composto hidrofílico com dificuldade de permeação, os outros descritores moleculares indicam uma probabilidade da cafeína permear e ser absorvida pelas membranas celulares, entre as quais as que constituem a matriz lipídica do SC. 4.1.2. Diclofenac Na Figura 14 está representada a estrutura molecular do diclofenac. Figura 14. Estrutura molecular do diclofenac (composto anfifílico). No caso do diclofenac, é possível observar através da Figura 15 que log P obtido in silico é de 4,25, e que corresponde ao valor que é obtido quando toda a molécula está na sua forma neutra (100% da microespécie 1). O log D obtido ao pH cutâneo é de 2,75, o que sugere um composto moderadamente lipofílico e solúvel ao nível cutâneo. Também o log P, de acordo com a classificação descrita em Avdeef et al . [75] classifica o diclofenac como um composto com moderada lipofilicidade tendo relativa facilidade de permear a matriz lipídica do SC, o que é corroborado pela literatura [113, 114, 115]. Uma das ilações a retirar da curva de titulação do diclofenac (Figura 16) é o pKa a pH 4, pois existe, a este valor de pH, um equilíbrio entre as formas protonada e desprotonada da molécula do diclofenac. Sengupta et al. [116] obtiveram um valor de pKa do diclofenac semelhante (pKa=3,9). Para pH > 4 o diclofenac está na forma ionizada e para pH < 4 este composto
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos RESULTADOS E DISCUSSÃO 48 encontra-se na forma neutra. É sabido que, quando no estado ionizado, as moléculas de um composto apresentam maior afinidade para a fase polar (fase aquosa ou grupos polares dos constituintes lipídicos das membranas) e as moléculas neutras têm mais afinidade para a fase apolar (caudas de ácidos gordos dos lípidos constituintes das membranas). Assim sendo, ao pH da pele (≈ 5,5) as moléculas de diclofenac encontram-se ionizadas o que indica maior afinidade deste composto para a fase polar, o que se traduz numa maior permeabilidade do composto ao nível das cabeças polares dos fosfolípidos da membrana. Apesar da sua ionização não favorecer a permeação profunda nas regiões apolares das membranas, é seguro afirmar que o diclofenac é um ácido orgânico fraco com propriedades anfifílicas com capacidade de permeação na maioria das membranas celulares e matrizes lipídicas entre as quais as que constituem o SC [117]. Figura 15. Distribuição do log D do diclofenac em função do pH calculado in silico no Marvin Sketch® do software Chemaxon®.
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos RESULTADOS E DISCUSSÃO 49 Figura 16. Curva de titulação do diclofenac: distribuição de microespécies em função do pH calculado in silico no Marvin Sketch® do software Chemaxon®. Na Tabela 6 estão sumarizados outros parâmetros que descrevem o diclofenac. Tabela 6. Dados obtidos da previsão in silico das propriedades do diclofenac através do software MarvinSketch®. Composto Massa molecular (g/mol) Área de superfície polar (Å2) Área de superfície molecular (Å2) Nº de dadores de hidrogénios Nº de aceitadores de hidrogénios Diclofenac 296,14 52,16 357,82 1 5 A massa molecular do diclofenac obtida in silico é 296,14 g/mol. Assim, de acordo com a classificação descrita por Palareti et al. [109], este valor indica que o diclofenac tem boa capacidade de permear as membranas celulares pois tem uma massa molecular abaixo dos 500 g/mol. A área de superfície polar do diclofenac obtida in silico é de 52,16 Å2. Este valor é bastante inferior aos 140 Å2 descritos na literatura [111] como valor a partir do qual as moléculas têm mais dificuldade em permear a pele. Assim, é possível prever que este valor indica que a o diclofenac tem eficácia na permeação das membranas celulares. Na Tabela 6 retira-se a informação de que a molécula de diclofenac tem 1 grupo químico dador de hidrogénios e 5 grupos químicos aceitadores de hidrogénios o que, segundo Lipinski et al .
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos RESULTADOS E DISCUSSÃO 50 [112], é indicador de facilidade de permeação e absorção das moléculas de diclofenac por parte das membranas celulares como as existentes ao nível da matriz lipídica do SC. 4.1.3. Testosterona Na Figura 17 está representada a estrutura molecular da testosterona. Figura 17. Estrutura molecular da testosterona (composto lipofílico). Na Figura 18 e Figura 19 observa-se o log D em função do pH e a distribuição de microespécies para a testosterona (modelo lipofílico). A partir da análise destas figuras infere-se que a microespécie neutra (microespécie 1) predomina sobre a microespécie carregada (microespécie 2) ao longo de quase toda a gama de valores de pH (pH de 2 a 14). Ao pH da pele o log D da testosterona é de 3,37 o que indica um composto com maior lipofilicidade e menor solubilidade do que os compostos anteriormente descritos (cafeína e diclofenac). Além disso, como a microespécie maioritária é sempre a microespécie neutra em praticamente toda a gama de valores de pH (pH de 2 a 14), o log P da testosterona é também de 3,37. Segundo a classificação descrita por Avdeef et al . [75], a testosterona é um composto lipofílico com maior afinidade para a fase orgânica e, portanto, mais suscetível à permeação das membranas lipídicas embora tenha menor solubilidade. Tal como no caso da cafeína, observando a Figura 19, pode-se concluir que a testosterona não apresenta nenhum pka. A microespécie neutra (microespécie 1) é maioritária em toda a gama de valores de pH. Segundo Takács-Novák et al. [118], quando há uma predominância da microespécie neutra, a molécula é solúvel em fases apolares o que aliado a um log P elevado reforça a natureza lipídica das moléculas de testosterona.
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos RESULTADOS E DISCUSSÃO 51 . Figura 18. Distribuição do log D da testosterona em função do pH calculado in silico no Marvin Sketch® do software Chemaxon®. Figura 19. Curva de titulação da testosterona: distribuição de microespécies em função do pH calculado in silico no Marvin Sketch® do software Chemaxon®. Na Tabela 7 estão sumarizados outros parâmetros que descrevem o composto testosterona.
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos RESULTADOS E DISCUSSÃO 52 Tabela 7. Dados obtidos da previsão in silico das propriedades da testosterona através do software MarvinSketch®. Composto Massa molecular (g/mol) Área de superfície polar (Å2) Área de superfície molecular (Å2) Nº de dadores de hidrogénios Nº de aceitadores de hidrogénios Testosterona 288,42 37,30 477,56 1 3 Os valores de massa molecular e área de superfície polar da testosterona indicados na Tabela 7 sugerem também que as moléculas de testosterona são propícias a permear a matriz lipídica do SC, tendo por base as classificações descritas por Palareti et al. [109], Hitchcock et al. [111] e Lipinski et al . [112]. As moléculas de testosterona têm 1 grupo químico dador de hidrogénios e 3 grupos químicos aceitadores de hidrogénios. As moléculas de testosterona cumprem mais um requisito da classificação de Lipinski et al. [112] , o que confirma as suas propriedades lipofílicas e tendência para permear as membranas lipídicas. 4.2. Doseamento espetrofotométrico dos compostos-modelo por espetroscopia UV-visível Os compostos-modelo foram quantificados por espetroscopia UV-visível. Através do espetro de absorvância de cada um dos compostos foram obtidos parâmetros como coeficiente de absortividade molar (ε) e comprimento de onda onde se verifica a máxima absorção. A partir do espetro de absorvância procedeu-se ao traçado da reta de calibração de cada um dos compostos bem como, à escolha de uma concentração fixa de composto, que obedeça à Lei de LambertBeer, a utilizar nos ensaios posteriores de determinação do coeficiente de partição. A título de exemplo na Figura 20 estão representados os espetros de absorvância da cafeína em tampão universal (pH 5.5) com concentrações crescentes de cafeína (4,00×10-5 M a 1,00×10-4 M). Os espectros de absorvância obtidos para o diclofenac e testosterona em tampão universal (pH 5.5) apresentam-se em anexo (Figura Anexo 1A e Figura Anexo 2A).
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos RESULTADOS E DISCUSSÃO 53 Figura 20. Espetro de absorvância das soluções padrão com concentrações crescentes de cafeína em tampão universal a pH 5.5. Para quantificar cada composto é fundamental estabelecer uma correlação entre a absorvância e a sua concentração. Deste modo, com base no comprimento de onda de absorção máxima de cada composto e representando a absorvância máxima em função da concentração do composto é possível traçar uma reta de calibração. Por exemplo, no caso da cafeína procedeu-se à representação gráfica dos valores da absorvância a 273 nm em função da concentração de composto e procedeu-se ao traçado da reta de calibração da cafeína através de um ajuste linear utilizando o software Origin Lab® (Figura 21). Os ajustes lineares e respetivas retas de calibração obtidos para o diclofenac e testosterona são apresentados em anexo (Figura Anexo 1B e Figura Anexo 2B).
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos RESULTADOS E DISCUSSÃO 54 Figura 21. Reta de calibração da cafeína em tampão universal (pH 5.5) ao comprimento de onda de absorção máxima de 273 nm. A partir de cada ajuste linear é possível determinar o ε de cada composto (declive da reta de calibração), que permitirá dosear o composto através da determinação da sua absorvância. Este parâmetro assim como outros parâmetros de validação do método analítico de doseamento espectrofotométrico dos compostos estudados encontram-se sumarizados na Tabela 8. Tabela 8. Parâmetros para a validação do método analítico de doseamento dos compostos. Composto ε (M-1.cm-1) Limite de deteção (M) Limite de quantificação (M) Precisão (%) Intervalo de determinação (M) Linearidade Cafeína 6311 1,04×10-8 3,17×10.8 2,08 4,00×10-5 a 1,00×10-4 0,99 Diclofenac 9880 3,34×10-9 1,01×10-8 0,58 4,12×10-7 a 2,04×10-5 0,99 Testosterona 2140 3,08×10-8 9,35×10-8 1,66 1,00×10-5 a 1,00×10-4 0,99 A partir da Tabela 8 é possível constatar que o doseamento espetrofotométrico de cada um dos compostos para cada intervalo de determinação apresenta precisão (pois o coeficiente de variação não excede os 20%) e linearidade (pois o coeficiente de determinação é próximo de 1) [119]. Apesar de não serem apresentados os espetros comparativos do analito e da matriz ou solvente,
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos RESULTADOS E DISCUSSÃO 55 o método de doseamento apresentou também especificidade para o analito dado a distinção clara entre os espetros anteriores. Com base no doseamento espetrofotométrico dos compostos foi usada uma concentração nos estudos subsequentes, que foi selecionada considerando o intervalo de determinação para garantir a proporcionalidade entre a absorvância do composto e a sua concentração em tampão universal (pH 5.5). 4.3. Caraterização físico-química e biofísica dos modelos lipídicos 4.3.1. Diâmetro hidrodinâmico, potencial zeta e índice de polidispersão Inicialmente foi feita a caraterização físico-química dos modelos lipídicos na presença e na ausência de cada composto. Esta caraterização assenta no estudo do diâmetro hidrodinâmico por DLS e em estudos de potencial zeta por ELS para avaliar o efeito da presença dos compostos quer no tamanho, quer na carga de superfície dos modelos lipídicos. O efeito do CHOL no diâmetro hidrodinâmico e no potencial zeta foi também avaliado. Tabela 9. Resumo da caraterização físico-química dos modelos lipídicos na ausência e na presença de cada composto. Os resultados são apresentados como valores médios ± desvio padrão de pelo menos 3 determinações. Modelos membranares Diâmetro hidrodinâmico (nm) Índice de polidispersão (PDI) Potencial zeta (mV) DPPC 107 ± 8 0,11 ±0,03 +3,6 ± 0,3 DPPC+CAFEÍNA 112 ± 4 0,06 ±0,01 +0,3 ± 2,7 DPPC+DICLOFENAC 151 ± 39 0,29 ±0,24 +1,7 ± 0,7 DPPC+TESTOSTERONA 189 ± 54 0,18 ±0,07 +0,8 ± 0,4 DPPC: CHOL (2:1) 153 ± 12 0,15 ±0,06 +1,7 ± 0,9 DPPC: CHOL (2:1) +CAFEÍNA 136 ± 12 0,21 ±0,08 +2,4 ± 1,7 DPPC: CHOL (2:1) + DICLOFENAC 163 ± 26 0,28 ±0,09 +1,2 ± 0,1 DPPC: CHOL (2:1) +TESTOSTERONA 166 ± 44 0,26 ±0,20 +1,2 ± 0,7 A comparação estatística dos valores da Tabela 9 por análise de variância (ANOVA) permitiu concluir que, num intervalo de confiança 95%, isto é P<0,05, não existem diferenças significativas entre os modelos lipídicos e entre os modelos lipídicos na ausência ou na presença dos compostos. Assim estes modelos lipídicos apresentam um diâmetro hidrodinâmico médio da ordem dos 147±28 nm e uma carga superficial muito próxima da neutralidade uma vez que o potencial zeta
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos RESULTADOS E DISCUSSÃO 56 apresenta valores médios de +1.6±1.0 mV. De referir também que o valor de PDI indica a polidispersão associada à distribuição dos diâmetros hidrodinâmicos e quanto maior o valor de PDI, mais heterogénea a dispersão de nanossistemas. Os modelos lipídicos quer na ausência quer na presença dos compostos apresentam um valor de PDI baixo (0.19±0.08) indicativo de uma dispersão homogénea de modelos lipídicos [120]. 4.3.2. Temperatura de transição de fase e cooperatividade da transição Como já foi referido no capítulo 3, a Tm é um parâmetro relevante para avaliar as alterações biofísicas provocadas quer pela inserção de um determinado componente numa membrana (por exemplo para perceber o efeito da inserção de CHOL num modelo membranar lipídico), quer pela interação de compostos com as membranas. Na Figura 22, apresenta-se um exemplo dos perfis sigmoides correspondentes à variação da intensidade de luz dispersa (Taxa de contagem média, TCM) por modelos membranares de DPPC e de DPPC: CHOL (2:1) para a cafeína no intervalo de temperaturas dos 25 °C aos 60 °C de forma a garantir a análise das duas fases membranares: fase gel, mais ordenada, que ocorre a temperaturas inferiores à Tm e fase fluida, mais desordenada, que ocorre a temperaturas superiores à Tm. Os perfis sigmoides obtidos para o diclofenac e testosterona em modelos membranares de DPPC e de DPPC: CHOL (2:1) no intervalo de temperaturas dos 25 °C aos 60 °C apresentam-se em anexo (Figura Anexo 1C e Figura 2C). Figura 22. A) Tm e B de DPPC e DPPC +Cafeína. (B) Tm e B de DPPC: CHOL (2:1) e DPPC: CHOL (2:1) +Cafeína.
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos RESULTADOS E DISCUSSÃO 63 relativa facilidade em permear e interagir ao nível das membranas lipídicas bem como capacidade em alterar as suas propriedades biofísicas. Finalmente, é necessário referir que na presença do CHOL os valores de log D obtidos nos sistemas miméticos membranares são significativamente maiores para todos os compostos do que o previsto in silico . Tal parece realçar a importância do CHOL ao nível das membranas nas interações estabelecidas entre estas e os compostos que nela se distribuem. 4.5. Classificação da permeação cutânea dos compostos-modelo 4.5.1. Permeação cutânea teórica avaliada com recurso a valores de coeficientes de distribuição determinados in silico Tendo em conta os valores de log D determinados in silico é possível calcular, teoricamente, para cada um dos compostos-modelo dois parâmetros relevantes na descoberta de compostos: o coeficiente de permeação cutânea (Sp) e fluxo máximo de permeação (Jmáx) que permitirão classificar o tipo de permeação apresentado pelos compostos. Para o efeito, é necessário considerar as equações 8 e 9 descritas no Capítulo 3. Os valores teóricos obtidos de Sp e Jmáx encontram-se representados na Tabela 12 onde se apresenta também os valores de Jmáx experimentais determinados em ensaios ex vivo em pele humana e de ratinho descritos na literatura. Tabela 12. Cálculo do Sp e Jmáx com base no log D determinado in silico no módulo MarvinSketch® do software da Chemaxon®. Classificação da permeação de acordo com os valores de Jmáx obtidos e comparação com a permeação descrita em estudos reportados na literatura. Composto Massa molar (g/mol) Csat em água (mg/cm3) Sp (cm/h) Jmáx teórico (mg/cm2/h) e classificação da permeação Jmáx experimental (mg/cm2/h) e classificação da permeação Cafeína 194,19 21,6 5,31×10-5 1,15×10-3 fraca 6,65×10-3 [140] moderada Diclofenac 296,14 2,37×10-3 2,79×10-3 6,62×10-6 muito fraca 2,37×10-6 [141] muito fraca Testosterona 288,42 2,34×10-2 8,58×10-3 2,01×10-4 fraca 2,69×10-3 [142] moderada
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos RESULTADOS E DISCUSSÃO 64 Tendo em conta os valores de Jmáx teórico apresentados na Tabela 12 e segundo a classificação da permeação teórica esquematizada na Tabela 4 do Capítulo 3 conclui-se que a permeação teórica é fraca para a cafeína, muito fraca para o diclofenac e fraca para a testosterona. Apesar da diferença existente entre os valores Jmáx teóricos e os valores Jmáx experimentais obtidos por ensaios in vitro reportados na literatura, a classificação da permeação é semelhante no caso do diclofenac, o que indica que os modelos in silico podem constituir uma ferramenta interessante de previsão da permeabilidade dos compostos. No entanto, para os casos da cafeína e testosterona a discrepância na classificação da permeabilidade com base em determinações in silico mostra que embora estes preditores teóricos possam ser úteis, não poderão substituir metodologias in vitro experimentais de previsão que contenham modelos miméticos de membranas. De facto, os cálculos in silico de log D são efetuados tendo em conta um sistema octanol/água, que é bastante interessante para triagens rápidas iniciais, mas que apresenta dificuldades em traduzir as interações de compostos ionizados ou com grupos polares como com as membranas [97, 143]. Como o octanol é um composto estritamente apolar, este não consegue replicar a interação composto/membrana que pode decorrer de ligações eletrostáticas, de pontes de hidrogénio ou outro tipo de ligações dipolo-dipolo que se estabelecem entre os compostos e as cabeças polares lipídicas e que podem justificar uma maior partição membranar dos compostos, do que o seria previsto com o sistema octanol/água. 4.5.2. Permeação cutânea teórica avaliada com recurso a valores de coeficientes de distribuição determinados in vitro Procedendo da mesma forma que na secção anterior, mas usando os valores de log D determinados in vitro , i.e., experimentalmente em modelos miméticos membranares de DPPC e DPPC: CHOL (2:1), foi possível determinar os valores de Sp e Jmáx que permitirão classificar o tipo de permeação apresentado pelos compostos-modelo e compará-los com valores de Jmáx experimentais determinados em ensaios ex vivo em pele humana e de ratinho descritos na literatura (Tabela 13).
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos RESULTADOS E DISCUSSÃO 65 Tabela 13. Cálculo do Sp e Jmáx com base no log D determinado in vitro em modelos miméticos membranares de DPPC e DPPC: CHOL (2:1). Classificação da permeação de acordo com os valores de Jmáx obtidos e comparação com a permeação descrita em estudos reportados na literatura. Composto Modelo membranar DPPC Modelo membranar DPPC: CHOL (2:1) Jmáx experimental (mg/cm2/h) e classificação da permeação Sp (cm/h) Jmáx teórico (mg/cm2/h) e classificação da permeação Sp (cm/h) Jmáx teórico (mg/cm2/h) e classificação da permeação Cafeína 8,73×10-2 1,89 muito elevada 1,95×10-1 4,20 muito elevada 6,65×10-3 [140] moderada Diclofenac 1,46×10-2 3,45×10-5 muito fraca 3,70×10-2 8,76×10-5 muito fraca 2,37×10-6 [141] muito fraca Testosterona 5,27×10-2 1,23×10-3 moderada 8,19×10-2 1,92×10-3 moderada 2,69×10-3 [142] moderada Pela análise da Tabela 13 é observável que a permeação cutânea e, consequentemente, o Jmáx é maior nos sistemas em que há presença de CHOL. El Maghraby e os seus colaboradores [144] concluíram que a adição de CHOL em grandes quantidades tem um efeito perturbador das propriedades de vesículas de DPPC. Nas bicamadas lipídicas constituídas somente por fosfolípidos de estrutura cilíndrica, estes tendem a agrupar-se de uma forma organizada, designando-se esta propriedade por empacotamento lipídico. Quando às bicamadas de fosfolípidos se adicionam moléculas volumosas de CHOL, estas irão perturbar o empacotamento dos fosfolípidos da bicamada atuando como disruptores das interações intermoleculares, o que pode justificar o aumento de permeabilidade membranar. Como tal, os modelos membranares com CHOL numa proporção de 2:1, apresentam uma percentagem considerável de CHOL (33,3%) que poderá justificar o aumento da permeabilidade membranar explicando assim os valores superiores de Jmáx obtidos para estes modelos membranares. Apesar do efeito do CHOL no aumento da permeação cutânea, observável ao nível dos valores de Jmáx obtidos, é de salientar que este efeito, nas condições da temperatura da pele, tem sido descrito como pouco relevante no ordenamento e no empacotamento das bicamadas lipídicas [145]. De facto, também neste trabalho se observou um aumento de Jmáx nos modelos membranares contendo CHOL, mas este aumento não foi, no entanto tão drástico que implique uma alteração na classificação de permeação dos compostos. Assim, verificou-se que em ambos os modelos: a permeação da cafeína é muito elevada; seguindose a testosterona que apresenta uma permeação moderada e por fim o diclofenac que apresenta uma permeação muito fraca.
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos RESULTADOS E DISCUSSÃO 66 Apesar da diferença existente entre os valores Jmáx teóricos calculados através dos log D obtidos in vitro nos modelos membranares e os valores Jmáx experimentais, obtidos por ensaios in vitro reportados na literatura, a classificação da permeação é concordante para o diclofenac e testosterona, o que parece indicar que os modelos membranares in vitro possam constituir uma ferramenta mais interessante na previsão da permeabilidade dos compostos do que os modelos in silico . No caso da cafeína os modelos membranares superestimaram a sua permeação em comparação com o que foi reportado. Convém, no entanto, referir que a constituição dos modelos membranares mimetiza apenas a matriz lipídica existente no SC, pelo que outros obstáculos à permeação da cafeína existentes nas restantes camadas cutâneas não são considerados com este modelo simples, o que pode justificar os valores de permeação superiores obtidos nos modelos membranares lipídicos comparativamente aos obtidos ex-vivo nas amostras de pele. 4.5.3. Permeação cutânea experimental avaliada com recurso a ensaios in vitro em células de difusão de Franz contendo membranas sintéticas Tal como referido no ponto 3.7 do Capítulo 3 procedeu-se à determinação experimental in vitro do Jmáx de cada um dos compostos com recurso a células de difusão de Franz contendo membranas sintéticas de polissulfona. Na Figura 25 encontram-se representados os perfis de permeação de cada um dos compostos ao longo do tempo. Figura 25. Perfis de permeação in vitro dos diferentes compostos traçados ao longo do tempo obtidos com recurso a células de difusão de Franz contendo membranas sintéticas de polissulfona.
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos RESULTADOS E DISCUSSÃO 67 Na Figura 25 é visível que para todos os compostos há um aumento acentuado da permeação até a t=10h. A partir desse instante os valores de permeação aproximam-se da estabilização. A partir da zona linear dos perfis de permeação dos compostos é possível calcular o Jmáx tendo por base a primeira lei de Fick da difusão. Estes valores de Jmáx obtidos encontram-se sumarizados na Tabela 14. Tabela 14. Valores de Jmáx obtidos in vitro com recurso a células de difusão de Franz e respetiva classificação de permeação cutânea de cada composto. Composto Jmáx experimental (mg/cm2/h) e classificação da permeação Jmáx experimental reportado (mg/cm2/h) e classificação da permeação Cafeína 1,76×10-2 ± 0,02072 elevada 6,65×10-3 [140] moderada Diclofenac 7,93×10-4 ± 0,00005 fraca 2,37×10-6 [141] muito fraca Testosterona 2,02×10-4 ± 0,00004 fraca 2,69×10-3 [142] moderada Fazendo uma análise da Tabela 14 constata-se que neste ensaio verificou-se uma elevada permeação cutânea para a cafeína e fraca permeação cutânea para o diclofenac e testosterona. Estabelecendo uma comparação entre os resultados deste ensaio com os Jmáx experimentais obtidos ex vivo em amostras de pele humana ou de ratinho, observa-se uma grande discrepância na classificação da permeação destes compostos. Esta diferença poderá estar relacionada, mais uma vez, com o uso de modelos membranares sintéticos que não mimetizam inteiramente o que acontece na matriz lipídica intercelular do SC. Quer o sistema octanol/água, quer a membrana sintética de polissulfona não conseguem replicar a interação composto/membrana que pode decorrer de ligações eletrostáticas, de pontes de hidrogénio ou outro tipo de ligações dipolo-dipolo que se estabelecem entre os compostos e as cabeças polares lipídicas. Assim, é possível concluir que não basta determinar experimentalmente o Jmáx com recurso a células de Franz, é também necessário ter atenção ao tipo de modelos membranares cutâneos utilizados. De facto, a permeação depende grandemente dos modelos membranares usados e poderá ser mais eficaz o cálculo teórico do Jmáx partindo de um log D determinado num modelo membranar que mimetize cabalmente a matriz lipídica do SC do que a determinação experimental do Jmáx usando membranas sintéticas que não mimetizam de todo a matriz lipídica do SC.
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos RESULTADOS E DISCUSSÃO 68 4.6. Desenvolvimento de uma plataforma microfluídica para determinação in vitro do coeficiente de distribuição 4.6.1. Caracterização das plataformas microfluídicas fabricadas Tal como descrito nas metodologias foi fabricada uma plataforma microfluídica com 9 canais (Figura 26). Figura 26. Fotografia representativa de uma das plataformas microfluídicas desenvolvida. Foram obtidos canais com 30 mm de comprimento e com larguras variáveis. Os primeiros três canais com largura de 0,05 mm, os três canais seguintes com 0,10 mm de largura e os últimos com 0,20 mm de largura. A altura média dos canais obtida experimentalmente foi de 0,198 ± 0,005 mm. Com base nos cálculos dimensionais, obteve-se um volume no caso dos canais de 100 µm (usados como primeira abordagem no âmbito deste trabalho) de 596,50 µL e uma área de superfície de 6,05×103 mm2. As restantes dimensões são previstas serem estudadas num trabalho futuro de forma a avaliar a sua influência. 4.6.2. Avaliação da eficiência de hidrofilização pelo método do ângulo de contacto Após o fabrico e caracterização das plataformas microfluídicas os seus canais foram hidrofilizados através do seu revestimento com um polímero hidrofílico, o PVA, conforme o descrito na secção 3.9. das metodologias experimentais. Seguidamente, e com o intuito de provar e otimizar as
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos RESULTADOS E DISCUSSÃO 69 condições de hidrofilização dos canais microfluídicos, realizaram-se medidas de ângulo de contacto em filmes de PDMS previamente produzidas cujos resultados aqui se descrevem. Foram realizados dois ensaios de medidas de ângulo de contacto de uma gota de água depositada em filmes de PDMS não revestidos por PVA, um deles pré-tratado com NaOH e outro sem qualquer pré-tratamento. Estes dois ensaios serviram de controlo para avaliar o efeito de diferentes concentrações de PVA na presença e na ausência de NaOH. Foram também realizados ensaios de medidas de ângulo de contacto de uma gota de água depositada em filmes de PDMS tratados ou não tratados com NaOH e revestidos por concentrações crescentes de PVA (1,2 e 5%). Na Figura 27 é apresentada a comparação entre os ângulos de contacto obtidos, ao longo do tempo, para amostras de PDMS previamente tratadas com NaOH e com diferentes concentrações de PVA. Figura 27. Comparação entre os ângulos de contacto obtidos em amostras de PDMS pré-tratadas com NaOH para diferentes tempos (t=0, t=5, t=10 e t=15 min) na ausência de PVA e na presença de PVA a diferentes concentrações. Analisando a Figura 27 verifica-se que há uma diminuição considerável do ângulo de contacto nos canais microfluídicos revestidos com PVA em comparação com o controlo. Este resultado comprova a natureza hidrofílica do PVA pois as gotas de água desionizada conseguiram espalharse melhor pela superfície dos canais microfluídicos diminuindo o ângulo de contacto. A presença de NaOH também têm influência neste processo pois atua como base forte libertando grupos hidroxilo (OH) que estabelecem ligações covalentes com o PVA tendo um efeito semelhante à
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos RESULTADOS E DISCUSSÃO 70 câmara oxigénio-plasma [146]. Estabelecendo a comparação entre as diferentes concentrações de PVA testadas, verifica-se que o ângulo de contacto é menor no instante t=0 quando se tem PVA a 1% (w/w), o que constitui uma vantagem pois indica que a hidrofilização do PDMS ocorreu de forma mais rápida. Com o decorrer do tempo verifica-se que os valores de ângulo de contacto com as diferentes concentrações de PVA vão convergindo (t=15 s). À partida, se a presença de PVA é sinónimo de maior facilidade na hidrofilização dos canais e consequentemente menor ângulo de contacto, seria de esperar que o ângulo de contacto fosse menor para concentrações mais elevadas de PVA. Como tal não se verifica, isto poderá indicar que no processo de hidrofilização dos canais não se deve ter em conta apenas fatores químicos, mas também fatores topográficos como a rugosidade da superfície dos canais que influenciam o espalhamento da gota de água desionizada. Na Figura 28 é apresentada a comparação entre os ângulos de contacto obtidos, ao longo do tempo, para amostras de PDMS sem tratamento prévio com NaOH e com diferentes concentrações de PVA. Figura 28. Comparação entre os ângulos de contacto obtidos em amostras de PDMS sem prétratamento com NaOH para diferentes tempos (t=0, t=5, t=10 e t=15 min) na ausência de PVA e na presença de PVA a diferentes concentrações. Analisando a Figura 28 verifica-se que mesmo sem pré-tratamento com NaOH, ocorre hidrofilização dos canais, pois o ângulo de contacto é menor para todas as concentrações de PVA comparativamente com o controlo. Estes resultados devem-se à natureza hidrofílica do PVA. Verifica-se ainda que os valores de ângulo de contacto são maiores inicialmente nos filmes de
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos RESULTADOS E DISCUSSÃO 71 PDMS que não foram tratados previamente com NaOH (Figura 28) em comparação com os filmes de PDMS previamente tratados com NaOH (Figura 27). Estes resultados reforçam a ação catalisadora do NaOH na hidrofilização dos canais. Na Figura 28 é observável (a vermelho) que os ângulos de contacto obtidos ao longo do tempo são menores na presença de PVA a 5% (w/w) e maiores na presença de PVA a 1% (w/w) o que contraria os resultados obtidos na Figura 27. Esta diferença comprova, mais uma vez, que deverão ser tidos em consideração outros fatores, como a rugosidade, e que a hidrofilização dos canais não está exclusivamente relacionada com as concentrações de PVA. Foi também estabelecida uma comparação entre dois filmes de PDMS pré-tratadas com NaOH e com PVA a 1% (w/w) mas um deles foi preparado no mesmo dia e outro foi preparado no dia anterior (Figura 29). Figura 29. Comparação entre os ângulos de contacto obtidos em amostras de PDMS pré-tratadas com NaOH no próprio dia (a azul) VS no dia anterior (a castanho) e com a mesma concentração de PVA – 1% (w/w). Com base nos resultados apresentados na Figura 29 verifica-se um ângulo de contacto menor nos filmes com PVA preparados no mesmo dia em comparação com o do dia anterior. A partir destes resultados é possível inferir que a hidrofilização dos canais é mais eficiente no próprio dia no qual se processa à hidrofilização dos canais. Ou seja, a propriedade hidrofílica dos microcanais vai-se perdendo com o tempo.
Desenvolvimento e otimização de modelos lipídicos para avaliação da permeação cutânea de fármacos RESULTADOS E DISCUSSÃO 72 Tendo em conta os resultados obtidos, concluiu-se que neste trabalho seria mais vantajoso revestir os canais com PVA a 1% (w/w), pois no caso de pré-tratamento com NaOH, obteve-se um ângulo de contacto menor de forma mais rápida. Dos resultados aqui apresentados também se concluí que a deposição das bicamadas lipídicas nos microcanais deve ser feita imediatamente a seguir ao processo de hidrofilização, a fim de aproveitar o ponto máximo desta propriedade. Na Figura 30 estão representadas as imagens obtidas da gota de água desionizada nas condições escolhidas para este trabalho nos instantes t=0 min, t=5min, t=10 min e t=15 min. Figura 30. Imagem obtida da gota de água desionizada ao longo do tempo com pré-tratamento com NaOH e na presença de PVA a 1% (w/w). 4.6.3. Determinação in vitro do coeficiente de distribuição da cafeína usando uma plataforma microfluídica Após a confirmação, através das determinações do ângulo de contacto, de que a hidrofilização dos microcanais tinha sido bem-sucedida procedeu-se à formação das SLBs de DPPC no interior dos microcanais com largura de 100 µm (como primeira abordagem) através do protocolo SALB descrito no capítulo 3, secção 3.11. Para determinação do log D na plataforma microfluídica hidrofilizada e com canais revestidos de SLBs de DPPC foi testado o composto cafeína. Para o efeito, foi injetada nos canais uma solução de cafeína com concentração de 1,2×10-4 M (em tampão universal a pH 5.5). A solução de cafeína foi injetada na entrada dos canais microfluídicos e alíquotas desta solução foram recolhidas a cada minuto na saída dos canais. A quantificação de cafeína em cada alíquota foi efetuada pelo método de doseamento por espetrofotometria UV/Vis previamente validado e a Figura 31, mostra a
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91 ANEXO D Figura 1. A) Espetro de absorvância das amostras e referências preparadas para a determinação log D da cafeína em LUVs de DPPC. B) 2ª derivada do espetro, importante para eliminar as interferências espetrais e a dispersão de luz. Figura 2. A) Espetro de absorvância das amostras e referências preparadas para a determinação log D do diclofenac em LUVs de DPPC. B) 3ª derivada do espetro, importante para eliminar as interferências espetrais e a dispersão de luz.
92 Anexo E Figura 1. Ajuste não linear dos valores da derivada das absorvâncias a 270 nm e 273 nm em função da concentração de modelos membranares: (A) DPPC e (B) DPPC: CHOL (2:1). A partir deste ajuste não linear foi possível determinar o log D do composto diclofenac ao pH 5.5. Figura 2. Ajuste não linear dos valores da derivada das absorvâncias a 280 nm e 288 nm em função da concentração de modelos membranares: (A) DPPC e (B) DPPC: CHOL (2:1). A partir deste ajuste não linear foi possível determinar o log D do composto testosterona ao pH 5.5.