Estudio de la adherencia a la dieta sin gluten en pacientes celíacos pediátricos mediante la cuantificación de péptidos inmunogénicos del gluten en heces

Estudio de la adherencia a la dieta sin gluten en pacientes celíacos pediátricos mediante la cuantificación de péptidos inmunogénicos del gluten en heces Francisco Ángel Lao Domínguez TRABAJO FIN DE GRADO Grado en Farmacia Departamento de Microbiología y Parasitología Facultad de Farmacia Universidad de Sevilla [Escriba aquí] [Escriba aquí] UNIVERSIDAD DE SEVILLA Facultad de Farmacia Departamento de Microbiología y Parasitología Grado en Farmacia Estudio de la adherencia a la dieta sin gluten en pacientes celíacos pediátricos mediante la cuantificación de péptidos inmunogénicos del gluten en heces TRABAJO FIN DE GRADO presentado por FRANCISCO ÁNGEL LAO DOMÍNGUEZ Este trabajo, de carácter experimental, se ha realizado en el Departamento de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Farmacia, bajo la dirección de Isabel María Comino Montilla y Carolina Sousa Martín. Lugar y fecha de presentación: Sevilla, 5 de julio de 2016 Fdo: Carolina Sousa Martín Fdo: Isabel Mª Comino Montilla Fdo: Fco Ángel Lao Domínguez [Escriba aquí] RESUMEN RESUMEN La enfermedad celíaca (EC) es un desorden clínico basado en una intolerancia al gluten presente en ciertos cereales como el trigo, la cebada, el centeno, la avena y sus derivados. El único tratamiento actualmente disponible para la EC es la dieta sin gluten (DSG), lo cual supone un auténtico reto para los pacientes ya que el gluten es frecuente en muchos productos alimentarios. El control de la adherencia a la DSG puede realizarse empleando varios métodos como marcadores serológicos, cuestionarios dietéticos, entrevistas o biopsias de repetición. Sin embargo, ninguno de ellos proporciona una medida fiable. Por ello, en trabajos previos, se ha desarrollado un nuevo método basado en la detección de péptidos inmunogénicos del gluten (GIP) en heces. El objetivo de este trabajo es detectar el cumplimiento de la DSG en individuos celíacos pediátricos recién diagnosticados mediante la detección y cuantificación de GIP en las heces y comparar los resultados obtenidos mediante los marcadores serológicos. En el estudio participaron un total de 12 pacientes celíacos y 6 pacientes controles, todos en edad pediátrica. A los pacientes se les tomó muestras de heces y suero en 4 visitas (0, 6, 12, 18 meses aproximadamente) y se estudió GIP fecal y marcadores serológicos. En el diagnóstico, periodo en el que los pacientes celíacos consumían gluten, se detectó GIP en heces en todos ellos. No obstante, durante el seguimiento, un tercio de los pacientes muestra transgresiones en la DSG. Los marcadores serológicos no consiguieron detectar las transgresiones mostradas mediante GIP fecal en su totalidad. En conclusión, la detección de GIP en heces es un método eficaz y fiable, por lo que su inclusión en clínica permitiría el control de la DSG en los pacientes celíacos. Palabras claves: enfermedad celíaca, dieta sin gluten, péptidos inmunogénicos del gluten. ÍNDICE ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN 1 1.1. PATOGENIA 2 1.2. EPIDEMIOLOGÍA 3 1.3. MANIFESTACIONES CLÍNICAS 4 1.3.1. Forma clásica 4 1.3.2. Otras formas de EC 5 1.3.2.1. Forma asintomática 5 1.3.2.2. Forma subclínica 5 1.3.2.3. Forma potencial 5 1.4. DIAGNÓSTICO 6 1.4.1. Marcadores serológicos 6 1.4.2. Marcadores genéticos 6 1.4.3. Biopsia intestinal: clasificación modificada de Marsh 7 1.4.4. Protocolo del diagnóstico 7 1.5. TRATAMIENTO Y SEGUIMIENTO 8 2. OBJETIVOS 10 3. MATERIALES Y MÉTODOS 11 3.1. DISEÑO DEL ESTUDIO 11 3.2. MUESTRAS 12 3.2.1. Muestras serológicas 12 3.2.2. Muestras fecales 12 3.3. MATERIALES 12 3.3.1. Material para la inmunocromatografía 12 3.3.2. Material para ELISA 13 3.3.3. Programas 13 3.4. MÉTODOS 13 3.4.1. Extracción de GIP 13 3.4.2. Tiras inmunocromatográficas 13 3.4.3. ELISA sándwich 14 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 17 4.1. DETERMINACIÓN DE GIP EN HECES DE PACIENTES CELÍACOS 17 4.2. EVALUACIÓN DE MARCADORES SEROLÓGICOS EN PACIENTES CELÍACOS 22 ÍNDICE 5. CONCLUSIONES 26 6. BIBLIOGRAFÍA 27 INTRODUCCIÓN 1 1. INTRODUCCIÓN La enfermedad celíaca (EC) es un desorden clínico basado en una intolerancia al gluten presente en ciertos cereales como el trigo, la cebada, el centeno, la avena y derivados. Dicha intolerancia se desarrolla mediante una reacción inmune en la que son reconocidos como antígenos péptidos del gluten en individuos genéticamente predispuestos (haplotipos HLA-DQ2/DQ8) (Sollid y Jabri, 2013). La respuesta inmune generada va a producir daños en el tejido intestinal (Figura 1), que pueden ir desde leves y reversibles hasta graves e irreversibles según la cantidad y tiempo de exposición al gluten. Actualmente el único tratamiento de la EC es la eliminación del gluten de la dieta, hecho que supone un reto para los pacientes debido a la presencia de gluten en numerosos alimentos procesados, influyendo inevitablemente en la calidad de vida del paciente (Rocha y cols., 2016). El problema en las transgresiones en la dieta, voluntarias o involuntarias, es que pueden implicar la aparición de síntomas intestinales y no intestinales que van a ir acompañados de un aumento del daño de la mucosa intestinal. Si este último es grave, puede llegar hasta tal punto en el que el daño sea irreparable y se genere un estado de EC refractaria, en el que el individuo deja de responder a la DSG y padece una inflamación crónica que se relaciona con una alta aparición de linfomas de origen intestinal (Rubio-Tapia y cols., 2013). Imágenes obtenidas mediante endoscopia intestinal (Endoscopias Murcia, 2012). A) Mucosa duodenal de un paciente control no celíaco. B) Mucosa duodenal de un paciente celíaco en el momento del diagnóstico. C) Endoscopia intestinal realizada a un enfermo celíaco. Figura 1 A B C INTRODUCCIÓN 8 estudios de los marcadores genéticos y debe hacerse biopsias intestinales. El diagnóstico se confirma si en la biopsia aparecen lesiones tipo 2 – 3 (Tabla 2) y los marcadores muestran ser positivos para HLA-DQ2/DQ8. Es recomendable estudiar los marcadores genéticos para comprobar que, en caso de existir daño en las mucosas, realmente la patología se debe a la EC (Husby y cols., 2012). En el caso de niños y adolescentes que sufran síntomas sugerentes de EC y que tengan valores de anti-tTG 10 veces por encima de los valores normales es posible realizar el diagnóstico sin llegar a realizar una biopsia, ya que en estas circunstancias se estima que el estado de las mucosas es de tipo Marsh 3. Para ello, deberá hacerse el estudio del anticuerpo EMA en una nueva prueba de sangre y si este da positivo se dará el diagnóstico por confirmado. En adultos el procedimiento es semejante al descrito para niños con sintomatología, pero no debe abandonarse el diagnóstico en el caso de mostrar carencia en los marcadores de IgA con valores normales de IgA total, sino que debe continuarse midiendo marcadores de tipo IgG y, en caso negativo, proceder con los marcadores genéticos, reevaluar el diagnóstico y/o considerar medir la serología de nuevo. En el caso de los adultos la biopsia siempre debe hacerse para confirmar finalmente el diagnóstico (Moscoso y Quera, 2015). 1.5. TRATAMIENTO Y SEGUIMIENTO El único tratamiento actualmente disponible para la EC es la DSG. La DSG consiste en la eliminación total del gluten de la dieta de por vida, lo cual supone un auténtico reto para los pacientes debido a las numerosas restricciones sociales y económicas que conlleva (Kinsey y cols., 2008; Missbach y cols., 2015; Rocha y cols., 2016). La manera en que la DSG condiciona la vida de los pacientes tiende a hacer que estos incumplan la dieta y como consecuencia reaparecen síntomas como dolor y diarrea. Además, las transgresiones continuas exponen a los pacientes a problemas de salud que se manifiestan a largo plazo, como infertilidad, osteoporosis e incluso cáncer intestinal (Dowd y cols., 2014). De hecho, el consumo de continuo de gluten, intencionado o no, en pacientes con EC ya diagnosticada es la principal causa de EC refractaria relacionada con una alta aparición de linfomas (Rubio-Tapia y cols., 2013) Numerosas investigaciones trabajan en el desarrollo de tratamientos alternativos a la DSG. Se ha planteado el empleo de bacterias degradadoras de gluten y de proteasas que, administradas oralmente, actuarían sobre los péptidos procedentes del gluten no degradables por el organismo (Cerf-Bensussan y cols., 2007; Helmerhorst y Wei, 2014), el uso de polímeros secuestradores de péptidos del gluten (Pinier y cols., 2012) y el empleo de fármacos antiinflamatorios como la INTRODUCCIÓN 9 budesonida (Ciacci y cols., 2009; Brar y cols., 2007). Todos estos tratamientos alternativos parecen prometedores, pero aún están en fase de estudio. Por ello, es muy importante un control exhaustivo de la dieta. Dicho control de la adherencia a la DSG se puede realizar empleando varios métodos: marcadores serológicos basados en anticuerpos resultantes de la respuesta del organismo ante la presencia de gluten, como son los anticuerpos anti-tTG y los anticuerpos anti-DGP; seguimientos realizados por un nutricionista mediante cuestionarios o entrevistas al paciente e incluso la observación periódica del estado de la mucosa intestinal mediante biopsias. Sin embargo, ninguno de ellos ofrece una medida precisa del cumplimiento de la DSG. En cuanto a las entrevistas y cuestionarios, los pacientes no suelen describir con exactitud su nivel de adherencia, además de que es probable que existan transgresiones no intencionadas (Missbach y cols., 2015). Por otro lado, las biopsias de repetición son métodos invasivos para el control de la DSG (Pietzak, 2005; Husby y cols., 2012) por lo que los médicos suelen emplear la serología como método de seguimiento para monitorizar el cumplimiento de la dieta. No obstante, se ha comprobado que la serología tiene poca correlación con la curación de la mucosa intestinal y, por tanto, basarse solo en la serología como método de seguimiento no parece ser muy eficiente. (Vahedi y cols., 2003; Leffler y cols. 2007; Kaukinen y cols., 2007; Bannister y cols., 2014; Vécsei y cols., 2014; de Chaisemartin y cols., 2015). OBJETIVOS 10 2. OBJETIVOS La única terapia existente a día de hoy para los pacientes celíacos es una rigurosa DSG. Por lo tanto, una vez confirmado el diagnóstico de la EC se debe realizar un seguimiento clínicoanalítico periódico del paciente con el fin de detectar posibles complicaciones y enfermedades asociadas que pueden aparecer en cualquier momento de la evolución de la enfermedad por la falta del cumplimiento de la dieta. El seguimiento de la adherencia a la DSG se basa fundamentalmente en la determinación periódica de marcadores serológicos de la enfermedad. Sin embargo, la respuesta de los distintos marcadores serológicos tras la dieta es muy variable. Los anticuerpos anti-DGP, EMA o anti-tTG han sido propuestos como indicadores del cumplimiento de la DSG. Sin embargo, los anticuerpos de clase IgA pueden tardar en normalizarse varios meses y los de clase IgG periodos superiores a un año después de que el antígeno haya desaparecido de la dieta. Además, se ha descrito que estos anticuerpos pueden perder sensibilidad para detectar pequeñas transgresiones dietéticas. En trabajos previos, Comino y cols. (2012) describieron un nuevo método para detectar y monitorizar la presencia de péptidos inmunogénicos del gluten (GIP) en heces humanas de pacientes celiacos sobre la base de los anticuerpos anti-33-mer G12. Estos anticuerpos se obtuvieron frente a uno de los péptidos más tóxicos descritos para la EC, el péptido 33-mer de la α-2-gliadina. En base a los antecedentes descritos, el OBJETIVO GENERAL de este Trabajo Fin de Grado fue detectar el cumplimiento de la DSG en una población de individuos celíacos pediátricos recién diagnosticados mediante la detección y cuantificación de GIP en las heces y comparar los resultados obtenidos con los marcadores serológicos. Este objetivo fue desarrollado en los siguientes OBJETIVOS CONCRETOS: 1. Detectar el cumplimiento de la DSG mediante tiras inmunocromatográficas en muestras de heces obtenidas de pacientes pediátricos en dieta normal con gluten en el momento del diagnóstico (visita 1) y durante las 3 visitas siguientes (visitas 2, 3 y 4 a los 6, 12 y 18 meses, respectivamente) de control en el hospital. 2. Cuantificar los niveles de GIP, mediante técnica ELISA, en muestras de heces obtenidas de pacientes pediátricos en dieta normal con gluten en el momento del diagnóstico (visita 1) y durante las 3 visitas siguientes (visitas 2, 3 y 4 a los 6, 12 y 18 meses, respectivamente) de control en el hospital. 3. Comparar los resultados obtenidos de GIP en las heces de estos pacientes con los niveles de los anticuerpos anti-tTG y anti-DGP IgA. MATERIALES Y MÉTODOS 11 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. DISEÑO DEL ESTUDIO En el estudio participaron un total de 12 pacientes celíacos en edad pediátrica (5 hombres y 7 mujeres, con edades comprendidas entre los 0 y 14 años) que fueron reclutados de 3 hospitales españoles: Hospital Universitario Virgen de Valme de Sevilla, Hospital Regional Carlos Haya de Málaga y Hospital Nuestra Señora de la Candelaria de Tenerife. Estos pacientes fueron recién diagnosticados en base a una biopsia intestinal y/o marcadores serológicos y no habían iniciado aún el tratamiento de DSG en el momento de su inclusión en el estudio. A cada uno de ellos se les realizó 4 visitas a los 0, 6, 12 y 18 meses (± 2 meses en cada visita), recogiéndose muestras de heces y suero en cada una (Tabla 3 y 4). En la visita 1 (0 meses) los participantes están en dieta normal con gluten y en el resto de visitas (de seguimiento) ya fueron instruidos para seguir una DSG. Se emplearon como controles otros 6 participantes, también de edad pediátrica (3 hombres y 3 mujeres). De ellos, 3 fueron controles positivos, es decir, personas sanas sin la enfermedad y consumidoras de gluten (con edad comprendida entre 1 y 2 años). Como controles negativos se usaron a otros 3 participantes (con < 6 meses), los cuales eran lactantes que en su dieta solo incluían leche de fórmula, de tal forma que nunca habían ingerido gluten. Por cada participante control se tomó una muestra de heces. Características de los pacientes celíacos y controles del estudio. Los 12 pacientes se muestran clasificados según su sexo y edad, al igual que los 6 individuos controles. La edad media fue calculada teniendo en cuenta la edad de cada individuo, no el grupo de edad. Tabla 3 n (%) Pacientes totales 12 Edad de incorporación 0-3 años 3 25,00 4-12 años 7 58,33 >12 años 2 16,67 Edad media: 6,67 Sexo Hombre 8 66,67 Mujer 4 33,33 Controles totales Edad de incoporación 0-3 años 6 100,00 Edad media: 0,83 Sexo Hombre 3 50,00 Mujer 3 50,00 MATERIALES Y MÉTODOS 12 3.2. MUESTRAS 3.2.1. Muestras serológicas Se tomaron 2 viales de 3 mL con anticoagulante EDTA-K3 y se centrifugaron a 2000 g tras los 30 primeros minutos de su obtención. El plasma resultante se conservó a – 80 ºC hasta su posterior procesamiento. Las muestras de suero se analizaron en los mismos hospitales en los que se realizó la toma de muestra y se determinó los niveles de anti-tTG IgA y anti-DGP IgA. 3.2.2. Muestras fecales Los participantes fueron instruidos para que recogiesen entre 2 y 4 g de heces en recipientes sellados. Estas muestras se conservaron a – 20 ºC hasta su posterior análisis en el laboratorio. 3.3. MATERIALES 3.3.1. Materiales para la inmunocromatografía Para el ensayo inmunocromatográfico se emplearon las tiras iVYCHECK GIP-Stool para detección rápida de gluten en heces (Biomedal, Sevilla, España) y placas multipocillos (Nunc de Roskilde, Dinamarca). La dilución y elución de las muestras se realizó con solución de dilución para inmunocromatografía, suministradas por el proveedor. Características de los pacientes celíacos en el diagnóstico. Los criterios para el diagnóstico empleados fueron anti-tTG, EMA, biopsia de la mucosa intestinal (clasificación Marsh) y presencia de los alelos HLA-DQ2 o HLA-DQ8. Tabla 4 H: Hombre, M: Mujer. Paciente Sexo Edad (años) Anti-tTG IgA EMA Biopsia Genotipo 1 H 8 Dudoso 1/640 Marsh 3b HLA DQ2 2 H14 Positivo 1/320 Marsh 3c HLA DQ2 3 M10 Positivo 1/640 Marsh 3c HLA DQ2 4 M 4 Positivo 1/640 Marsh 3a HLA DQ2 5 M 2 Positivo 1/160 - HLA DQ2 6 H 8 Positivo 1/320 Marsh 3b HLA DQ8 7 M 4 Positivo 1/640 - HLA DQ2 8 M 2 Positivo - Marsh 3a HLA DQ2 9 H11 Positivo 1/160 - HLA DQ2 10 M 4 Positivo 1/160 Marsh 3b HLA DQ2 11 M 0 Positivo - Marsh 3c - 12 H13 Positivo - Marsh 3a HLA-DQ2 MATERIALES Y MÉTODOS 13 3.3.2. Material para ELISA En la realización del ELISA se empleó el kit iVYLISA GIP-S (Biomedal S.L., Sevilla, España) con las siguientes soluciones y reactivos:  12 tiras multipocillos (8 pocillos/tira) tapizadas con el anticuerpo G12.  Solución de lavado concentrada 10 veces.  Solución de dilución para ELISA.  Solución de extracción.  Solución sustrato.  Solución stop.  Anticuerpo G12-HRP conjugado.  5 patrones: 50; 25; 6,25; 3,12 y 1,56 ng/mL de GIP. 3.3.3. Programas Para el análisis estadístico se empleó el programa GraphPad 6.01 de Prism para Windows. La creación de tablas y gráficas se realizó con el programa Excel 2013 perteneciente al paquete de programas Office 2013 de Microsoft para Windows y el programa GraphPad 6.01. 3.4. MÉTODOS 3.4.1. Extracción de GIP En primer lugar, se acondicionó las muestras de heces a temperatura ambiente. Tras ello, se procedió a la extracción de los GIP de las muestras añadiéndo solución de extracción a las muestras según su peso, de tal manera que se empleó un volumen, en mL, equivalente a 9 veces la cantidad de muestra pesada en gramos. La solución de extracción con la muestra incluida se mezcló empleando un agitador tipo vortex (modelo Classic Advanced, de VELP Scientifica, Usmate-Velate, Italia). Las muestras se incubaron a 50 ºC durante 60 minutos en un baño termostático (modelo WB4, Biosan, Riga, Letonia), agitando periódicamente durante este intervalo de tiempo. Finalizado el periodo de tiempo las muestras fueron centrifugadas a 2.500 g durante 10 minutos (centrífuga modelo 5804R de Eppendorf, Hamburgo, Alemania). Finalmente, se recuperó el sobrenadante. 3.4.2. Tiras inmunocromatográficas Finalizada la extracción se realizó el ensayo con las tiras inmunocromatográficas iVYCHECK GIP-Stool. Acondicionadas a temperatura ambiente la solución de dilución, se prepararó una dilución 1:10 a partir de las muestras previamente extraídas. Se añadieron 30 µL de la extracción MATERIALES Y MÉTODOS 14 de GIP y 270 µL de solución de dilución en un tubo de 1,5 mL y se agitó mediante agitador tipo vortex. Como soporte para las tiras se empleó una placa multipocillos sin tapizar. Se añadieron 100 µL de cada muestra a los pocillos y se colocó una tira verticalmente en cada uno de ellos. La muestra ascendió por las tiras, siguiendo la representación gráfica mostrada en la Figura 4A. A los 10 minutos se dio por finalizada la prueba y se retiraron las tiras. Los resultados se leyeron siguiendo el esquema de la Figura 4B. 3.4.3. ELISA sándwich La concentración de GIP en heces se determinó mediante ELISA sándwich iVYLISA GIP-S Kit, el cual emplea el anticuerpo monoclonal anti-33-mer G12 que reconoce los péptidos semejantes al péptido 33-mer de la α-2-gliadina, uno de los péptidos más inmunogénicos del gluten (Morón y cols., 2008). El método empleado presenta una sensibilidad del 98,5 % y una especificidad del 100% (Comino y cols., en revisión). El ensayo se realizó conforme al protocolo incluido en el kit iVYLISA GIP-S. Para comenzar se acondicionó los reactivos del ensayo a temperatura ambiente (a excepción del anticuerpo G12- HRP, mantenido a 4 ºC) y se realizó una dilución 1:10 con agua destilada de la solución de lavado. Técnica de inmunocromatografía. A) Representa la técnica de inmunocromatografía: los GIP de la muestra se unen a unos anticuerpos (G12) marcados con latex específicos para estos y el complejo migra por la tira hasta encontrar anticuerpos adsorbidos (A1) que se unen al mismo antígeno por otro epítopo reteniendo el complejo (banda test). El antígeno control migra hasta una banda control donde hay anticuerpos que lo reconocen. B) Posibles resultados del procedimiento. No se considerará válido un ensayo en el que no se muestre coloreada la banda control, ya que indica una elución incompleta. La banda test corresponde a T y la banda control a C. Figura 4 A B MATERIALES Y MÉTODOS 15 Para el ensayo se empleó una dilución 1:10 de las muestras previamente extraídas. Se añadieron 30 µL de sobrenadante de la extracción de GIP a 270 µL de la solución de dilución en tubos de 1,5 mL (Eppendorf, Hamburgo, Alemania) y se mezcló mediante agitador tipo vortex. Finalizada la preparación de la diluciones, se procedió a comenzar el ELISA sándwich (Figura 5). Se añadió entonces en la placa 100 µL de los distintos patrones y controles incluidos, así como de cada muestra diluida, todo ello por duplicado. Se prosiguió a su posterior incubación en oscuridad durante 60 minutos, a temperatura ambiente. Transcurrido el tiempo, se realizaron 5 lavados de la placa empleando la solución de lavado en el lavador automático (Asys Atlantis de Biochrom, Cambridge, Reino Unido). Una vez finalizado el lavado, se añadió 100 µL del anticuerpo G12-HRP, se volvió a realizar una incubación empleando las mismas condiciones anteriores y se lavó de la misma manera. A la placa se le adicionaron 100 µL de solución de sustrato por pocillo y se incubó durante 30 minutos en oscuridad, tras lo cual se añadió 100 µL de solución stop a todos los pocillos. Por último, se procedió a la lectura de absorbancia de la placa a 450 nm (lector Asys UVM340 de Biochrom, Cambridge, Reino Unido). Una vez obtenidos los valores de absorbancia, se calculó los valores medios de cada duplicado, desviación estándar y coeficiente de variación de cada muestra y se construyó una curva patrón representando la concentración de GIP (eje x) frente a los valores medios de absorbancia previamente obtenidos (eje y) (Figura 6). Tras realizar la curva se procedió al cálculo de la concentración de GIP de cada muestra a partir de dicha ecuación. Posteriormente, el resultado obtenido se multiplicó por el factor de dilución (1:10) y el factor de extracción (1:10) empleados. Representación gráfica de la técnica ELISA sándwich. Figura 5 MATERIALES Y MÉTODOS 16 B Figura 6 Representación de la curva patrón. A) Datos empleados para construir la curva. C.V.% es el coeficiente de variación. B) Se representa la curva de calibrado obtenida mediante ELISA. La curva resultante (curva experimental) se ajustan con una curva sigmoidea proporcionada por el proveedor del kit (curva teórica) para comprobar su coeficiente de correlación. A Eje X Eje Y Concentración (ng/mL) Absorbancia 1 Absorbancia 2 Media C.V.% 50 0,789 0,840 0,815 4,43 25 0,701 0,705 0,703 0,40 6,25 0,347 0,348 0,348 0,20 3,13 0,263 0,261 0,262 0,54 1,56 0,160 0,190 0,175 12,12 Control negativo 0,171 0,169 0,170 0,83 Control positivo 1,034 1,019 1,027 1,03 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 17 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1. DETERMINACIÓN DE GIP EN HECES DE PACIENTES CELÍACOS Los péptidos procedentes del gluten, y sobre todo los péptidos relacionados con el 33-mer de la α-2-gliadina, son resistentes a la digestión gastrointestinal, lo cual implica que una cantidad considerable del gluten ingerido es excretado a través de las heces. Como consecuencia, la detección de fracciones inmunotóxicas cuantificables de estas proteínas del gluten en las heces es indicativo del no cumplimiento de la DSG. En este estudio se han analizado los niveles de GIP en pacientes celíacos desde el momento del diagnóstico (visita 1), en el que los pacientes se encontraban en dieta normal con gluten, y en su posterior seguimiento en DSG. Durante el periodo en DSG, los niveles de GIP fueron evaluados a los 6 (visita 2), 12 (visita 3) y 18 meses (visita 4). Así mismo, se incluyeron sujetos controles tanto consumidores de gluten (controles positivos), como no consumidores de gluten (lactantes que nunca habían consumido gluten). Las tiras inmunocromatográficas permiten realizar la detección de GIP en heces de manera cualitativa y de una forma rápida y cómoda obteniendo resultados en unos minutos (Figura 6). Como ya se ha mencionado, las tiras iVYCHECK GIP-Stool emplean 2 anticuerpos (G12 y A1), ambos obtenidos frente al péptido 33-mer, pero con epítopos de reconocimiento distintos (Morón y cols., 2008a y 2008b). La facilidad de uso y la rapidez en la obtención de resultados sería beneficioso para la práctica clínica en el seguimiento de pacientes. Los resultados de las tiras en los pacientes controles concuerda con lo que cabía de esperar: en el grupo de controles positivos, sujetos sanos consumidores de gluten, todos fueron positivos para GIP. Así mismo, en el grupo de controles negativos, lactantes que nunca han ingerido gluten, no se detectó GIP (Tabla 5). Fotografía de las tiras inmunocromatográficas iVYCHECK GIP-Stool. A) Tiras con resultados negativos. B) Tiras con resultados positivos. Figura 6 A B RESULTADOS Y DISCUSIÓN 24 Los métodos inmunológicos basados en los anticuerpos G12 y A1 son una herramienta no invasiva y más fiable que las pruebas serológicas para evaluar el cumplimiento de la DSG en los pacientes celíacos. La metodología que se describe en este trabajo, puede ser muy útil en:  El diseño de ensayos clínicos relacionados con la enfermedad celíaca  El seguimiento a corto plazo de la dieta sin gluten  La evaluación de la eficacia de las terapias alternativas para esta enfermedad, y  El diagnóstico de las transgresiones dietéticas debidas a contaminaciones involuntarias en los alimentos. Las perspectivas futuras del trabajo realizado es, primero, aumentar el número de individuos pediátricos hasta llegar a un número adecuado para realizar un estudio estadístico y, segundo, realizar un estudio similar en una población celíaca adulta. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 25 Figura 10 Resultados obtenidos de los marcadores serológicos en comparación con los valores obtenidos de GIP en las visitas 2, 3 y 4. A, B, C) Representación de anti-tTG por visita respecto GIP. D, E, F) Representación de anti-DGP por visita respecto GIP. A B C D E F CONCLUSIONES 26 5. CONCLUSIONES 1. Las tiras inmunocromatográficas han demostrado ser una herramienta rápida y eficaz para comprobar la adherencia a la DSG en los pacientes celíacos. 2. La cuantificación de GIP en heces mediante la técnica ELISA ha permitido cuantificar el nivel de transgresiones realizadas por el paciente celíaco. 3. En el diagnóstico, periodo en el que los pacientes celíacos consumían gluten, se detectó GIP en heces en todos los casos. No obstante, durante el seguimiento, un tercio de los pacientes pediátricos incluidos mostraron transgresiones en la DSG. 4. La determinación de GIP en heces ha demostrado ser más eficaz que los métodos serológicos para el seguimiento de la DSG en los pacientes celíacos pediátricos. BIBLIOGRAFÍA 27 6. BIBLIOGRAFÍA  Abadie V, Jabri B. IL-15: a central regulator of celiac disease immunopathology. Immunological Reviews. 2014; 260 (1): 221-234.  Adriaanse M, Leffler DA. Serum Markers in the Clinical Management of Celiac Disease. Digestive Diseases. 2015; 33 (2): 236–243.  Alzaben AS, Turner J, Shirton L, Samuel TM, Persad R, Mager D. Assessing Nutritional Quality and Adherence to the Gluten-free Diet in Children and Adolescents with Celiac Disease. Revue Canadienne de la Pratique et de la Recherche en Diététique. 2015, 76 (2): 56–63.  Arranz E, Farré C. Enfermedad celíaca. 1ª edición. Madrid: Ergón; 2008.  Arranz E, Garrote JA. Enfermedad celíaca: introducción al conocimiento actual de la enfermedad celíaca. 2ª edición. 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