Separação, identificação e caracterização dos compostos neutros da Pitch por HPLC-MS, ESI-MS/MS, GC-MS, FTIR-ATR e RMN e avaliação da sua atividade antioxidante e antibacteriana

Margarida Lago Lima Separação, Identificação e Caracterização dos compostos neutros da Pitch por HPLC-MS, ESI-MS/MS, GC-MS, FTIR-ATR e RMN e Avaliação da sua Atividade Antioxidante e Antibacteriana outubro de 2022 UMinho | 2022 Margarida Lago Lima Separação, Identificação e Caracterização dos compostos neutros da Pitch por HPLC-MS, ESI-MS/MS, GC-MS, FTIR-ATR e RMN e Avaliação da sua Atividade Antioxidante e Antibacteriana Universidade do Minho Escola de Ciências Margarida Lago Lima Separação, Identificação e Caracterização dos compostos neutros da Pitch por HPLC-MS, ESI-MS/MS, GC-MS, FTIR-ATR e RMN e Avaliação da sua Atividade Antioxidante e Antibacteriana Dissertação de Mestrado Mestrado em Técnicas de Caracterização e Análise Química Trabalho efetuado sob a orientação do Professor Doutor Pier Parpot e da Engenheira Maria José Caridade Costa Rego Universidade do Minho Escola de Ciências outubro de 2022 ii DIREITOS DE AUTOR E CONDIÇÕES DE UTILIZAÇÃO DO TRABALHO POR TERCEIROS Este é um trabalho académico que pode ser utilizado por terceiros desde que respeitadas as regras e boas práticas internacionalmente aceites, no que concerne aos direitos de autor e direitos conexos. Assim, o presente trabalho pode ser utilizado nos termos previstos na licença abaixo indicada. Caso o utilizador necessite de permissão para poder fazer um uso do trabalho em condições não previstas no licenciamento indicado, deverá contactar o autor, através do RepositóriUM da Universidade do Minho. Licença concedida aos utilizadores deste trabalho Atribuição CC BY https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ iii Agradecimentos Gostaria de começar por agradecer ao Doutor Pier Parpot e à Engenheira Maria Rego, pela orientação fornecida ao longo do estágio, conhecimentos transmitidos, disponibilidade que demonstraram em responder a todas as minhas dúvidas e por todas as sugestões de correções que fizeram acerca do meu trabalho. Quero agradecer o Doutor Davide Gameiro por disponibilizar as pitch , o material de estudo deste trabalho, e o Engenheiro Nuno Costa pela disponibilidade que demonstrou em ler a minha dissertação e dar sugestões de correções. Agradeço também a Doutora Susana Costa por toda a ajuda que me forneceu ao longo deste trabalho e a Mestre Ana Teixeira pela realização dos ensaios de atividade antioxidante e antibacteriana da pitch. Obrigada a todas as pessoas da empresa Eurochemicals Pine Rosins Portugal S.A. por me receberem tão bem, especialmente a Engenheira Isabel Faria e a Mestre Sara Costa por toda a amizade e por sempre se mostrarem disponíveis para me ajudar ao longo do estágio. Agradeço ainda a minha família pelo apoio incondicional e pela paciência demonstrada ao longo do meu percurso académico. Um agradecimento especial aos meus amigos Carolina Taborda e Hugo Alvarães pelo apoio e por terem tornado o mestrado mais divertido. Obrigada por todas as gargalhadas e momentos que nunca vou esquecer. Muito obrigada a todos. iv DECLARAÇÃO DE INTEGRIDADE Declaro ter atuado com integridade na elaboração do presente trabalho académico e confirmo que não recorri à prática de plágio nem a qualquer forma de utilização indevida ou falsificação de informações ou resultados em nenhuma das etapas conducente à sua elaboração. Mais declaro que conheço e que respeitei o Código de Conduta Ética da Universidade do Minho. v Separação, Identificação e Caracterização dos compostos neutros da Pitch por HPLC-MS, ESI-MS/MS, GC-MS, FTIR-ATR e RMN e Avaliação da sua Atividade Antioxidante e Antibacteriana Resumo A resina é um líquido viscoso produzido pelos pinheiros como um mecanismo de defesa contra herbívoros e patógenos, sendo um dos seus componentes a colofónia. A colofónia é a fração sólida e não volátil da resina, sendo a principal matéria-prima utilizada pela empresa Eurochemicals Pine Rosins Portugal S.A.. Este material é constituído maioritariamente por diversos ácidos resínicos e a empresa foca-se na transformação química desta fração acídica de modo a dar origem a vários produtos utilizados por diversas indústrias químicas. Para além dos ácidos resínicos, na composição da colofónia é possível encontrar compostos neutros em pequenas quantidades. A pitch consiste no resíduo resultante do processo de destilação molecular (refinação) da colofónia para obter a colofónia water white, uma colofónia transparente de elevada pureza. A pitch contém uma quantidade de ácidos resínicos bastante menor relativamente à colofónia water white e maior quantidade de compostos neutros. Existe a possibilidade dos compostos neutros da pitch apresentarem atividade antioxidante devido a se verificar uma degradação de cor mais significativa da colofónia water white à medida que a temperatura aumenta em comparação com a colofónia. Isto indica que a colofónia possui certos compostos com resistência à oxidação e que estes podem ter constituído a composição da pitch durante o processo de refinação. Por este motivo, é de interesse avaliar a atividade antioxidante dos compostos neutros deste material. Além do mais, uma vez que a resina é produzida como um mecanismo de defesa, os compostos neutros presentes na pitch podem vir a demonstrar atividade antimicrobiana. Neste estudo pretendeu-se separar, identificar e caracterizar os compostos neutros presentes na pitch proveniente de duas espécies de pinheiro - Pinus elliotii e Pinus pinaster - através das técnicas de ionização por eletrospray acoplada a espetrometria de massa em tandem (ESI-MS/MS), cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espetrometria de massa (HPLC-MS), cromatografia gasosa acoplada a espetrometria de massa (GC-MS), espetroscopia de infravermelho com transformada de Fourier com acessório de refletância total atenuada (FTIR-ATR) e ressonância magnética nuclear (RMN). Também se avaliou o impacto destes compostos no desempenho das colofónias através da realização de análises de qualidade da pitch e a sua atividade antioxidante e antibacteriana. Palavras–chave: colofónia, compostos neutros, GC-MS, HPLC-MS, pitch vi Separation, Identification and Characterization of Pitch's neutral compounds by HPLC-MS, ESI-MS/MS, GC-MS, FTIR-ATR and RMN and Evaluation of their Antioxidant and Antibacterial Activity Abstract Resin is a viscous liquid produced by pine trees as a defense mechanism against herbivores and pathogens, one of its components being rosin. Rosin is the solid and non-volatile fraction of the resin, being the main raw material used by the company Eurochemicals Pine Rosins Portugal S.A.. This material consists mainly of different resin acids and the company focuses on the chemical transformation of this acidic fraction in order to give rise to various products used by various chemical industries. In addition to resin acids, in the composition of rosin it is possible to find neutral compounds in small quantities. Pitch consists of the residue resulting from the process of molecular distillation (refining) of rosin to obtain water white rosin, a transparent rosin of high purity. Pitch contains a much smaller quantity of resin acids than water white rosin and a greater quantity of neutral compounds. There is a possibility that the neutral compounds of the pitch have antioxidant activity due to a more significant color degradation of the water white rosin as the temperature increases compared to the rosin. This indicates that the rosin has certain compounds with oxidation resistance and that these may have constituted the pitch composition during the refining process. For this reason, it is of interest to evaluate the antioxidant activity of the neutral compounds of this material. Furthermore, since the resin is produced as a defense mechanism, the neutral compounds present in the pitch may demonstrate antimicrobial activity. This study aimed to separate, identify and characterize the neutral compounds present in the pitch from two pine species - Pinus elliotii and Pinus pinaster - through electrospray ionization techniques coupled with tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS), high performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry (HPLC-MS), gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS), Fourier transform infrared spectroscopy with attenuated total reflectance accessory (FTIR-ATR) and nuclear magnetic resonance (RMN). It was also evaluated the impact of these compounds on the performance of rosins by performing analyzes of the quality of the pitch and its antioxidant and antibacterial activity. Keywords: rosin, neutral compounds, GC-MS, HPLC-MS, pitch vii Índice Agradecimentos ...............................................................................................................iii Resumo ............................................................................................................................. v Abstract ............................................................................................................................ vi Índice .............................................................................................................................. vii Lista de Abreviaturas e Siglas .......................................................................................... xii Lista de Figuras .............................................................................................................. xiv Lista de Tabelas ............................................................................................................. xxi Capítulo 1. Introdução ...................................................................................................... 1 1.1) Contextualização do trabalho................................................................................................ 2 1.2) Objetivos do estágio ............................................................................................................. 3 Capítulo 2. Eurochemicals Pine Rosins Portugal S.A. ....................................................... 4 Capítulo 3. Enquadramento teórico .................................................................................. 8 3.1) Género Pinus ....................................................................................................................... 9 3.1.1) Pinus pinaster .............................................................................................................. 9 3.1.2) Pinus elliottii .............................................................................................................. 10 3.2) Goma ................................................................................................................................ 10 3.3) Terebentina ....................................................................................................................... 12 3.4) Colofónia ........................................................................................................................... 12 3.5) Pitch .................................................................................................................................. 20 3.6) Parâmetros de controlo de qualidade da colofónia .............................................................. 22 xiv Lista de Figuras Figura 1: Esquema dos diversos produtos desenvolvidos pela empresa Eurochemicals Pine Rosins Portugal S.A.. .............................................................................................. …………………………………5 Figura 2: Fluxograma da empresa Eurochemicals Pine Rosins Portugal S.A.. ………………………………..6 Figura 3: Recolha de goma segregada pelo corte no tronco do pinheiro. Extraído de: Resipinus Associação de Destiladores e Exploradores de Resina.14…………………………………..………………………..11 Figura 4: Estruturas químicas dos hidrocarbonetos monoterpénicos mais comuns, A) α-pineno, B) βpineno e C) 3-careno. …………………………………………………………………………………………………………12 Figura 5: Estruturas químicas dos ácidos do tipo abiético mais comuns, A) ácido abiético, B) ácido neoabiético, C) ácido palústrico, D) ácido levopimárico e E) ácido dehidroabiético. .... ……………………14 Figura 6: Estruturas químicas dos ácidos do tipo pimárico mais comuns, A) ácido pimárico, B) ácido isopimárico e C) ácido sandaracopimárico. ................................................................ …………………..14 Figura 7: Estruturas químicas dos ácidos do tipo labdano mais comuns, A) ácido lambertiánico, B) ácido mercúsico e C) ácido comúnico. …………………………………………………………………………………………..15 Figura 8: Fotografia da pitch resultante do processo de refinação da colofónia de A) Pinus pinaster e B) Pinus elliottii. .……………………………………………………………………………………………………………………21 Figura 9: Esquema das principais etapas do procedimento para a obtenção da colofónia water white , terpenos de elevado peso molecular e pitch . …………………………………………………………………………..21 Figura 10: Equipamento habitualmente utilizado numa titulação ácido-base………………………………..22 Figura 11: Reação química ácido-base que ocorre durante a titulação de uma amostra de um derivado de colofónia com uma solução de KOH…………………………………………………………………………………..23 Figura 12: Padrões de cor da escala de Gardner de 1963. Adaptado de: Are.na.33……………………….23 Figura 13: Fotografia do equipamento utilizado para determinar a viscosidade.…………………………….24 Figura 14: Fotografia da presença de cristais numa solução de colofónia de razão 70:30.……………….25 Figura 15: Fotografia do equipamento utilizado para determinar o ponto de amolecimento.…………….26 Figura 16: Gráfico dos resultados experimentais obtidos no ensaio do ponto de turvação. As curvas a amarelo, rosa e verde correspondem à variação da turvação, em %, temperatura, em ℃, e velocidade de agitação, em rotações por minuto (rpm), respetivamente, ao longo do tempo.…………………………….27 Figura 17: Esquema do modo de funcionamento da ESI no modo de ionização positivo. Adaptado de: So, Hu e Yao, 2013.43.…………………………………………………………………………………………………………28 Figura 18: Esquema do princípio da MS/MS. Adaptado de: Mellon, 2003.49………………………………….31 xv Figura 19: Representação esquemática dos principais componentes do equipamento de HPLC com um sistema de fase móvel de modo isocrático. Adaptado de: Verma e Santoyo, 2007.57………………………….32 Figura 20: Representação esquemática dos principais componentes do equipamento de HPLC com um sistema de fase móvel de modo de gradiente binário. Adaptado de: Verma e Santoyo, 2007.57……………33 Figura 21: Representação esquemática dos principais componentes do equipamento de cromatografia gasosa. Adaptado de: Stauffer, Dolan e Newman, 2008.44.………………………………………………………….36 Figura 22: Esquema do processo de amostragem da SPME, A) inserção do holder no vial da amostra e adsorção dos analitos presentes na amostra para a fibra e B) inserção do holder no injetor do cromatógrafo gasoso e posterior dessorção dos analitos para o injetor. Adaptado de: Sparkman, Penton e Kitson, 2011.67.……………………………………………………………………………………………………………….38 Figura 23: Esquema do princípio da técnica de amostragem do HS estático. Adaptado de: Gong et al ., 2019.68…………………………………………………………………………………………………………………………….39 Figura 24: Princípio da DI-SPME. Adaptado de: Weggler et al ., 2020.71..………………………………………40 Figura 25: Reação química de metilação.……………………………………………………………………………..41 Figura 26: Representação esquemática do modo de funcionamento da técnica de espetroscopia de FTIR. Adaptado de: Gurumurthy e Ramesh, 2018.76.………………………………………………………………….42 Figura 27: Representação esquemática do sistema de FTIR-ATR. Adaptado de: Ausili, Sánchez e GómezFernández, 2015.82………………………………………………………………………………………………………….…44 Figura 28: Representação esquemática de um espetrómetro de RMN. Adaptado de: Course Hero.85.…45 Figura 29: Representação esquemática do princípio energético da técnica RMN. Adaptado de: Course Hero.85……………………………………………………………………………………………………………………………..46 Figura 30: Estrutura química do composto DPPH.………………………………………………………………….46 Figura 31: Reação química da redução do radical DPPH para DPPHH.……………………………………….47 Figura 32: Fotografia da A) montagem do condensador do refluxo adaptado ao balão Erlenmeyer e B) montagem da ampola de decantação para a etapa de extração.……………………………………………….56 Figura 33: Fotografia da A) montagem do equipamento para a etapa da evaporação do éter e B) placa de Petri contendo a amostra.………………………………………………………………………………………………..56 Figura 34: Fotografia do A) tubo Falcon contendo a solução de amostra ibérica após a etapa de sonicação e B) balão Erlenmeyer contendo a solução após as etapas de centrifugação e filtração a vácuo………………………………………………………………………………………………………………………………59 Figura 35: Fotografia dos equipamentos utilizados nas análises de ESI-MS/MS e HPLC-MS..…………60 xvi Figura 36: Gráfico da composição dos eluentes A e B em função do tempo de análise das soluções dos padrões ácido abiético, ácido oleico, ácido palmítico, acetato de linalilo, 2-amino-1,3,4-octadecanotriol e hidrato de quercetina e das soluções 80:20 de metanol e éter etílico de amostra ibérica e amostra brasileira.………………………………………………………………………………………………………………………...61 Figura 37: Gráfico da composição dos eluentes A e B em função do tempo de análise da solução de hidrato de (+)-catequina e das soluções filtradas de amostra ibérica e amostra brasileira.……………….…62 Figura 38: Gráfico da composição dos eluentes A e B em função do tempo de análise das soluções filtradas de amostra ibérica e amostra brasileira..……………………………………………………………………..62 Figura 39: Fotografia dos cristais de pitch brasileira.……………………………………………………………….64 Figura 40: Fotografia da A) montagem do equipamento para a etapa da HS-SPME e B) do equipamento utilizado na análise de GC-MS……………………………………………………………………………………………….67 Figura 41: Fotografia do equipamento de GC-MS da empresa Eurochemicals.………………………………68 Figura 42: Fotografias dos espetrómetros de FTIR com acessório ATR da A) empresa Eurochemicals e B) universidade do Minho.……………………………………………………………………………………………………70 Figura 43: Fotografia do espetrómetro de RMN.……………………………………………………………………..72 Figura 44: Representação esquemática das etapas 3-7 do procedimento experimental do ensaio DPPH.……………………………………………………………………………………………………………………………..75 Figura 45: Representação esquemática do procedimento experimental do ensaio da microdiluição.….79 Figura 46: Cromatogramas obtidos das análises de HPLC-MS das soluções 80:20 de metanol e éter etílico da amostra ibérica no A) modo positivo e B) modo negativo e da amostra brasileira no C) modo positivo e D) modo negativo..………………………………………………………………………………………………..84 Figura 47: Cromatogramas obtidos das análises de HPLC-MS no modo positivo das soluções dos padrões A) ácido abiético, B) hidrato de quercetina, C) ácido palmítico, D) ácido oleico, E) acetato de linalilo e F) 2-amino-1,3,4-octadecanotriol.………………………………………………………………………………85 Figura 48: Cromatogramas obtidos das análises de HPLC-MS no modo negativo das soluções dos padrões A) ácido abiético, B) hidrato de quercetina, C) ácido palmítico, D) ácido oleico, E) acetato de linalilo e F) 2-amino-1,3,4-octadecanotriol..……………………………………………………………………………..86 Figura 49: Cromatogramas extraídos para um m/z de 301 no modo negativo das soluções 80:20 de metanol e éter etílico da A) amostra ibérica e B) amostra brasileira e das soluções dos padrões C) ácido abiético e D) hidrato de quercetina..……………………………………………………………………………………….87 Figura 50: Espetros de massa no modo negativo do A) ião 301 e do seu B) ião “filho” 151 da solução filtrada de amostra ibérica...…………………………………………………………………………………………………88 xvii Figura 51: Esquema da proposta de fragmentação do ácido abiético.…………………………………………89 Figura 52: Espetros de massa no A) modo positivo do ião 283 da solução filtrada de amostra brasileira e no B) modo negativo do ião 195 da solução filtrada de amostra ibérica.……………………………………….91 Figura 53: Esquema da proposta de fragmentação do ácido oleico.……………………………………………92 Figura 54: Esquema da proposta de fragmentação do acetato de linalilo.…………………………………….93 Figura 55: Cromatogramas extraídos para um m/z de 318 no modo positivo das soluções 80:20 de metanol e éter etílico da A) amostra ibérica, B) amostra brasileira e C) solução do padrão 2-amino-1,3,4octadecanotriol..………………………………………………………………………………………………………………..94 Figura 56: Espetros de massa no modo positivo do ião 318 da solução filtrada de amostra ibérica……94 Figura 57: Esquema da proposta de fragmentação do 2-amino-1,3,4-octadecanotriol.……………………95 Figura 58: Espetros de massa no modo positivo do A) ião 287 e do seu B) ião “filho” 269 da solução 80:20 de metanol e éter etílico da amostra ibérica…………………………………………………………………….96 Figura 59: Esquema da proposta de fragmentação da cianidina………………………………………………..97 Figura 60: Cromatogramas obtidos das análises de HPLC-MS da solução do padrão hidrato de (+)- catequina no A) modo positivo e B) modo negativo..…………………………………………………………………..98 Figura 61: Cromatogramas obtidos das análises de HPLC-MS no modo positivo das soluções filtradas da A) amostra ibérica e B) amostra brasileira. ………………………………………………………………………100 Figura 62: Cromatogramas obtidos das análises de HPLC-MS no modo negativo das soluções filtradas da A) amostra ibérica e B) amostra brasileira.…………………………………………………………………………101 Figura 63: Espetros de massa no modo positivo do A) ião 260, do seu B) ião “filho” 200, C) ião 171, D) ião 187 e do seu E) ião “filho” 145 da solução filtrada de amostra brasileira e do F) ião 181 e G) ião 269 da solução filtrada de amostra ibérica..…………………………………………………………………………..105 Figura 64: Esquema da proposta de fragmentação da ribalinina………………………………………………106 Figura 65: Esquema da proposta de fragmentação do 2-fenilfenol……………………………………………107 Figura 66: Esquema da proposta de fragmentação da ficusina………………………………………………..107 Figura 67: Esquema da proposta de fragmentação do ácido cafeico…………………………………………108 Figura 68: Esquema da proposta de fragmentação da formononetina……………………………………….108 Figura 69: Espetros de massa no modo positivo do A) ião 1019 e B) ião 793 da solução filtrada de amostra brasileira.………………………………………………………………………………………………….………..110 Figura 70: Espetros de massa no modo negativo do A) ião 223, do seu B) ião “filho” 179, C) ião 375, D) ião 141 e E) ião 337 da solução filtrada de amostra brasileira e do F) ião 387, G) ião 305 e do seu H) ião “filho” 201 da solução filtrada de amostra ibérica.……………………………………………………………..114 xviii Figura 71: Esquema da proposta de fragmentação do ácido 13-oxo-9,11-tridecadienóico.…………..115 Figura 72: Esquema da proposta de fragmentação do ácido mussaenosídico …………………………….116 Figura 73: Esquema da proposta de fragmentação do ácido cis , cis -mucónico.……………………………117 Figura 74: Esquema da proposta de fragmentação do ácido erúcico…………………………………………118 Figura 75: Esquema da proposta de fragmentação do ácido isocalolongico.……………………………..119 Figura 76: Esquema da proposta de fragmentação da (+)-gallocatequina.………………………………..120 Figura 77: Espetros de massa no modo positivo do A) ião 529 e do seu B) ião “filho” 491 da solução filtrada de amostra brasileira.……………………………………………………………………………………………..121 Figura 78: Esquema da proposta de fragmentação do metil (2 R )-2-(acetiloxi)-2- [(1 S ,3 S ,7 R ,8 R ,9 R ,12 S ,13 R )-13-(furan-3-il)-6,6,8,12-tetrametil-17-metilideno-5,15-dioxo-2,14dioxatetraciclo[7.7.1.01,12.03,8]heptadecan-7-il]acetato……………………………………………………………..123 Figura 79: Espetros de massa no modo negativo do A) ião 349, do seu B) ião “filho” 317, C) ião 333 e do seu D) ião “filho” 289 da solução filtrada de amostra brasileira..………………………………………….125 Figura 80: Esquema da proposta de fragmentação da andrografolida.………………………………………126 Figura 81: Esquema da proposta de fragmentação do (2 S ,3 S )-3,5,7-trihidroxi-6-metil-2-(3,4,5trihidroxifenil)croman-4-ona.……………………………………………………………………………………………….127 Figura 82: Cromatograma obtido da análise de HS-SPME/GC-MS recorrendo à fibra de PDMS de 7 µm da amostra ibérica.…………………………………………………………………………………………………………..131 Figura 83: Cromatogramas obtidos das análises de HS-SPME/GC-MS recorrendo à fibra de PDMS de 100 µm da A) amostra ibérica e B) amostra brasileira………………………………………………………..…….132 Figura 84: Cromatograma obtido da análise de HS-SPME/GC-MS dos cristais de pitch brasileira…….134 Figura 85: Cromatogramas obtidos das análises de GC-MS precedidas por metilação da A) amostra ibérica e B) amostra brasileira…………………………………………………………………………………………….135 Figura 86: Cromatograma obtido da análise de GC-MS precedida por metilação dos cristais de pitch brasileira………………………………………………………………………………………………………………………..136 Figura 87: Espetros FTIR-ATR da A) amostra ibérica e B) amostra brasileira……………………………….141 Figura 88: Espetros FTIR-ATR do A) precipitado ibérico e B) precipitado brasileiro………………………..143 Figura 89: Espetro FTIR-ATR dos cristais da pitch brasileira…………………………………………………….143 Figura 90: Fotografia da parte insolúvel observada na solução de 10 mg de amostra ibérica em DMSO D6……………………………………………………………………………………………………………………….146 Figura 91: A) Espetro de 1H-RMN de 10 mg da amostra ibérica em clorofórmio deuterado e B) alargamento da zona espetral entre 2,5-7,5 ppm………………………………………………………………..147 xix Figura 92: Espetro de 1H-RMN de 5 mg de ácido abiético em clorofórmio deuterado…………………….149 Figura 93: Espetro de 1H-RMN de acetato de linalilo em clorofórmio deuterado……………………………150 Figura 94: Espetro de 1H-RMN de ácido oleico em clorofórmio deuterado…………………………………..151 Figura 95: Espetro de 1H-RMN de 5 mg de 2-amino-1,3,4-octadecanotriol em clorofórmio deuterado.......................................................................................................................................152 Figura 96: A) Espetro de 1H-RMN de 5 mg dos cristais de pitch brasileira em clorofórmio deuterado e B) alargamento da zona espetral entre 0,5-6,0 ppm…………………………………………………………………153 Figura 97: Gráficos da absorvância lida a 600 nm das bactérias fitopatogénicas A) Xylophilus ampelinus , B) Xanthomonas arboricola , C) Pseudomonas syringae e D) Pectobacterium parmenteri em função do tempo de incubação…………………………………………………………………………………………………………155 Figura 98: Fotografia do colorímetro…………………………………………………………………………………..174 Figura 99: Fotografia do início do ensaio do ponto de amolecimento……………………………………….177 Figura 100: Fotografia do equipamento Chemotronic Cool utilizado no ensaio do ponto de turvação…………………………………………………………………………………………………………………………178 Figura 101: Gráfico resultante do ensaio do ponto de turvação realizado para a amostra pitch ibérica. As curvas a amarelo, rosa e verde correspondem à variação da turvação, em %, temperatura, em ℃, e velocidade de agitação, em rpm, respetivamente, ao longo do tempo………………………………………….197 Figura 102: Gráfico resultante do ensaio do ponto de turvação realizado para a amostra pitch brasileira. As curvas a amarelo, rosa e verde correspondem à variação da turvação, em %, temperatura, em ℃, e velocidade de agitação, em rpm, respetivamente, ao longo do tempo………………………………………….197 Figura 103: Espetros de massa no modo positivo correspondentes a um tempo de retenção de 15,2 min da A) solução do padrão ácido oleico e B) solução 80:20 de metanol e éter etílico da amostra brasileira e no modo negativo correspondentes a um tempo de retenção de 0,8 min da C) solução do padrão acetato de linalilo e D) solução 80:20 de metanol e éter etílico da amostra ibérica.……………….199 Figura 104: Cromatogramas obtidos das análises de HPLC-MS no modo positivo das soluções filtradas da A) amostra ibérica e B) amostra brasileira. Os picos que surgem entre 8 e 12 min são provenientes de impurezas nas soluções filtradas das amostras.………………………………………………………………….200 Figura 105: Cromatogramas obtidos das análises de HPLC-MS no modo negativo das soluções filtradas da A) amostra ibérica e B) amostra brasileira. Os picos que surgem entre 8 e 12 min são provenientes de impurezas nas soluções filtradas das amostras.………………………………………………………………….201 Figura 106: Espetros de massa no modo positivo da solução filtrada de amostra ibérica correspondente a um tempo de retenção de 0,12 min.…………………………………………………………………………………..202 xx Figura 107: Espetros de massa no modo positivo da solução filtrada de amostra brasileira correspondentes a um tempo de retenção de A) 4,19 min, B) 5,43 min e C) 6,37 min.……………………203 Figura 108: Espetros de massa no modo negativo da solução filtrada de amostra ibérica correspondentes a um tempo de retenção de A) 4,97 min, B) 5,50 min e C) 6,37 min.…………………...205 Figura 109: Espetros de massa no modo negativo da solução filtrada de amostra brasileira correspondentes a um tempo de retenção de A) 5,68 min, B) 6,37 min e C) 6,74 min.…………………...206 Figura 110: Espetros de massa no modo positivo da A) solução filtrada de amostra ibérica de 1502000 m/z e B) de 285-800 m/z e da C) solução filtrada de amostra brasileira de 150-2000 m/z e D) de 150-800 m/z………………………………………………………………………………………………………………….208 Figura 111: Espetros de massa no modo negativo da A) solução filtrada de amostra ibérica de 1502000 m/z e B) de 75-400 m/z e da C) solução filtrada de amostra brasileira de 150-2000 m/z e D) de 150-400 m/z.…………………………………………………………………………………………………………………210 Figura 112: Espetro de 1H-RMN de 10 mg da amostra brasileira em clorofórmio deuterado…………..211 Figura 113: Espetro de 13C-RMN de 10 mg da amostra ibérica em clorofórmio deuterado………………211 xxi Lista de Tabelas Tabela 1: Compostos neutros presentes na colofónia proveniente de diversas espécies de árvore e respetivas técnicas de caracterização utilizadas para os identificar……………………………………………….16 Tabela 2: Materiais e equipamentos utilizados nos procedimentos experimentais e respetivas marcas e incertezas.………………………………………………………………………………………………………………………..50 Tabela 3: Nome, fórmula química, massa molar e número do Serviço de Resumos Químicos (CAS) dos reagentes utilizados nos procedimentos experimentais. …………………………………………………………….51 Tabela 4: Materiais e equipamentos utilizados no procedimento experimental e respetivas marcas e incertezas.………………………………………………………………………………………………………………………..52 Tabela 5: Nome, fórmula química, massa molar e número CAS dos reagentes utilizados no procedimento experimental………………………………………………………………………………………………….53 Tabela 6: Materiais e equipamentos utilizados nas análises de ESI-MS/MS e HPLC-MS e respetivas marcas e incertezas..………………………………………………………………………………………………………….57 Tabela 7: Nome, fórmula química, massa molar e número CAS dos reagentes utilizados nas análises de ESI-MS/MS e HPLC-MS…………………………………………………………………………………………………..58 Tabela 8: Materiais e equipamentos utilizados nas análises de HS-SPME/GC-MS e DI-SPME/GC-MS e respetivas marcas e incertezas..……………………………………………………………………………………………65 Tabela 9: Materiais e equipamentos utilizados nas análises de GC-MS precedida pela etapa de metilação e respetivas marcas e incertezas…………………………………………………………………………………………..65 Tabela 10: Nome, fórmula química, massa molar e número CAS dos reagentes utilizados nas análises de GC-MS precedida pela etapa de metilação………………………………………………………………………….66 Tabela 11: Materiais e equipamentos utilizados nas análises de FTIR-ATR e respetivas marcas….…….69 Tabela 12: Materiais e equipamentos utilizados nas análises de RMN e respetivas marcas e incertezas…………………………………………………………………………………………………………………………71 Tabela 13: Nome, fórmula química, massa molar e número CAS dos reagentes utilizados nas análises de RMN.. ………………………………………………………………………………………………………………………….71 Tabela 14: Materiais e equipamentos utilizados no ensaio DPPH e respetivas marcas e incertezas.…..73 Tabela 15: Nome, fórmula química, massa molar e número CAS dos reagentes utilizados no ensaio DPPH………………………………………………………………………………………………………………………………73 Tabela 16: Materiais e equipamentos utilizados no ensaio da microdiluição e respetivas marcas e incertezas…………………………………………………………………………………………………………………………76 xxii Tabela 17: Nome, fórmula química, massa molar e número CAS dos reagentes utilizados no ensaio da microdiluição. ……………………………………………………………………………………………………………………76 Tabela 18: Valores dos parâmetros de controlo da qualidade obtidos para as amostras de pitch ibérica e pitch brasileira. ……………………………………………………………………………………………………………….81 Tabela 19: Compostos identificados nas análises de ESI-MS/MS e HPLC-MS.…………………………..128 Tabela 20: Identificação dos picos numerados presentes nos cromatogramas..………………………….137 Tabela 21: Números de onda e atribuição das bandas de absorção observadas nos espetros FTIR-ATR das amostras ibérica e brasileira.………………………………………………………………………………………..142 Tabela 22: Números de onda e atribuição das bandas de absorção observadas nos espetros FTIR-ATR dos precipitados sólidos ibérico e brasileiro e dos cristais de pitch brasileira.. ……………………………..144 Tabela 23: Massa de amostra de colofónia a pesar em função do índice de acidez.......…………………173 Capítulo 1. Introdução 8 Capítulo 3. Enquadramento teórico 9 3.1) Género Pinus O pinheiro ( Pinus spp.) é o maior e mais heteromórfico género da família dos pinheiros ( Pinaceae ) e, com mais de 100 espécies diferentes amplamente distribuídas em todo o mundo, representa o maior género de coníferas.2 Por estar muito difundido no Hemisfério Norte e também, devido ao seu uso intensivo nas indústrias de madeira e celulose, Pinus spp. é considerado o maior produtor de resina.3 O pinheiro é uma árvore de crescimento rápido, resistente a baixas temperaturas e pode crescer em solos pobres em nutrientes.4 Os pinheiros são ecologicamente importantes como um componente principal e frequentemente dominante das florestas boreais, subalpinas, temperadas e tropicais, bem como das florestas áridas, podendo crescer em florestas mistas com outras coníferas. Algumas espécies são especialmente adaptadas a incêndios florestais, por exemplo, Pinus banksiana , em que o fogo é essencial para a abertura do cone e a dispersão de sementes. Além disso, algumas espécies de pinheiros podem ter uma vida muito longa como Pinus longaeva , que pode viver mais de 3000 anos.5 3.1.1) Pinus pinaster Pinus pinaster , descrito em 1789 por William Aiton, é habitualmente conhecido por pinheirobravo.6 Ocorrendo naturalmente na bacia do Mediterrâneo de Portugal à Argélia , P. pinaster é uma espécie de pinheiro de copa aberta que pode crescer até 40 metros.7 Esta espécie cresce frequentemente em solos arenosos e dunas entre carvalhos e arbustos e em altitudes baixas a moderadas, mas estendendo-se até 1500 metros. Valorizado pelo potencial de resina e para controlo de erosão, P. pinaster tem sido vastamente plantado na América do Sul, Australásia (região que inclui a Austrália, Nova Zelândia, Nova Guiné e algumas ilhas menores da parte oriental da Indonésia) e África do Sul.7 Além destas utilizações, o pinheiro-bravo é também uma árvore ornamental popular, frequentemente plantada em parques e jardins, e é usada como fonte de flavonóides, catequinas, proantocianidinas e ácidos fenólicos.6 10 3.1.2) Pinus elliottii Pinus elliotii , conforme descrito em 1880 por Georg Engelmann, é habitualmente conhecido por pinheiro de corte, pinheiro de corte amarelo ou pinheiro de pântano.8 O nome comum de P. elliottii referese ao terreno pantanoso coberto de vegetação conhecido como "cortes" que constituem o seu habitat nativo; P.elliotti cresce nas áreas de planícies, ao longo de riachos e margens de pântanos e baías onde há bastante humidade no solo.9 Esta espécie é composta de duas variedades distintas - Pinus elliottii var. elliottii e Pinus elliottii var. densa – e é nativa do sudeste dos Estados Unidos da América.8 P.elliotti é uma espécie de árvore conífera perene que atinge alturas de 30 metros com um tronco de até 0,8 metros de diâmetro e apresenta uma copa cónica que se torna arredondada ou achatada com a idade. A variedade típica (var. elliottii ) é a de crescimento mais rápido e é muito plantada nos Estados Unidos fora da sua área nativa. Esta variedade é valorizada pela resina, mas é considerada cada vez mais importante nas plantações como fonte de madeira e celulose.8 Devido ao seu rápido crescimento e produção de produtos de madeira de elevado valor, esta variedade foi amplamente introduzida noutros países, como, por exemplo, no Brasil, dando uma importante contribuição para a indústria de produção de resinas.9 Ao contrário da variedade mais comum, var. densa não é usada nesta indústria, no entanto, é plantada para produção de madeira.8 3.2) Goma A goma ou gema, vulgarmente denominada de resina, proveniente dos pinheiros é um líquido viscoso inflamável amarelo/castanho que apresenta um odor forte e é produzida pela árvore como um mecanismo de defesa contra herbívoros e patógenos devido à toxicidade e função aderente.10 Existem vários métodos de extração da goma (resinagem). Um dos métodos mais utilizados consiste em fazer um corte no tronco e aplicar um composto químico para estimular e manter o fluxo da goma (Figura 3).11 A profundidade do corte e o componente estimulante variam entre os países.11 Geralmente, o estimulante mais utilizado é o ácido sulfúrico uma vez que estimula e acelera a produção da goma durante quatro semanas.12 São muitos os países produtores de goma, sendo que a China tem dominado a produção e o comércio mundial, mas a Indonésia e o Brasil também são importantes produtores.13 11 Figura 3: Recolha de goma segregada pelo corte no tronco do pinheiro. Extraído de: Resipinus Associação de Destiladores e Exploradores de Resina.14 A goma é constituída por dois componentes: terebentina e colofónia. A terebentina é a fração líquida da goma, apresentando uma cor clara e um gosto amargo. Esta fração contém os elementos mais voláteis da goma, sendo responsável pelo odor característico da mesma. A colofónia é a fração sólida e não volátil da goma, tendo um aspeto vítreo, quebradiço, semi-transparente e brilhante.3,15 A goma extraída dos pinheiros (goma bruta) é enviada para indústrias de 1ª transformação, onde é limpa e filtrada. O processo de limpeza a que este material é submetido é designado de malaxagem. Esta etapa é necessária para remover as várias impurezas presentes na goma tais como, cascas e agulhas de pinheiro, insetos, entre outras. Após os processos de malaxagem e filtração a goma bruta é designada de goma limpa. Para ocorrer a separação da fração volátil da goma da fração não volátil realiza-se um processo de destilação. A terebentina pode ser removida da colofónia por destilação descontínua ou contínua, sendo que a destilação descontínua é o método mais utilizado, apesar da destilação contínua ser mais eficiente por ser muito mais simples de operar.16 Após o processo de destilação a colofónia e a terebentina são encaminhadas para indústrias de 2ª transformação, onde são convertidas em diversos derivados resínicos. A produção mundial de colofónia por ano é, aproximadamente, 1,2 milhões de toneladas enquanto a produção anual mundial de terebentina é 330 mil toneladas aproximadamente.17 12 3.3) Terebentina A terebentina é um líquido inflamável, imiscível em água e possui um ponto de ebulição acima de 150℃. Ela apresenta na sua composição diversos compostos orgânicos e esta pode variar substancialmente dependendo da espécie de pinheiro da qual é extraída, o que acaba por influenciar bastante o seu valor comercial e aplicação industrial.13 Em geral, a terebentina contém quatro classes principais de componentes: hidrocarbonetos, álcoois terpénicos, éteres e sesquiterpenos. O principal componente é o hidrocarboneto monoterpénico bicíclico e insaturado com fórmula molecular C10H16. Os três isómeros mais predominantes na terebentina são α-pineno, β-pineno e 3-careno (Figura 4), além de possuir quantidades menores de canfeno e tricicleno. Os hidrocarbonetos monocíclicos também estão presentes em baixas concentrações.16 Figura 4: Estruturas químicas dos hidrocarbonetos monoterpénicos mais comuns, A) α-pineno, B) βpineno e C) 3-careno. No passado a terebentina era usada como solvente em tintas mas atualmente é utilizada como matéria-prima na síntese de fragrâncias e sabores químicos.18,19 Geralmente, a terebentina é submetida a destilação fracionada para isolar compostos químicos desejáveis, principalmente α-pineno e β-pineno, que são convertidos em derivados de elevado valor comercial.13 Um desses derivados é óleo de pinho sintético, sendo este posteriormente usado em solventes, desodorizantes, bactericidas e na indústria têxtil.18,19 3.4) Colofónia A colofónia é um material amorfo, sólido e não volátil cuja cor varia entre amarelo-claro e amarelo-avermelhado, consoante a sua composição e grau de oxidação. A colofónia é insolúvel em água, mas solúvel na maioria dos solventes orgânicos tais como, tolueno e etanol. Por ser um material amorfo C A B 13 e com uma composição bastante complexa não apresenta ponto de fusão, mas amolece para um fluido viscoso à medida que a temperatura aumenta.16 Existem três tipos distintos de colofónia que se diferenciam pelo método utilizado para a sua extração: colofónia de goma ( Gum rosin ), obtida pela destilação da goma colhida diretamente de árvores resinosas vivas, colofónia de madeira ( Wood rosin ) que é extraída dos cepos de árvores resinosas virgens através da utilização de um solvente orgânico sendo, posteriormente, destilada e a colofónia de Tall-oil ( Tall-oil rosin ), obtida pela destilação do Tall-oil bruto, sendo este um subproduto do fabrico da pasta de papel pelo método de Kraft.16 Independentemente da sua origem (colofónia de goma, madeira ou Tall-oil ), a colofónia é composta principalmente por ácidos diterpénicos monocarboxílicos (90–95%), habitualmente conhecidos como ácidos resínicos, cuja fórmula genérica é C19H29COOH. Os restantes 5-10% são essencialmente compostos neutros, cuja natureza depende da origem específica da colofónia.16 Os ácidos resínicos mais comuns encontrados na colofónia do pinheiro são derivados de três esqueletos de carbono tricíclicos básicos: abiético, pimárico e isopimárico. Os ácidos resínicos menos comuns derivam do esqueleto de carbono bicíclico, o labdano. O esqueleto abiético é partilhado por quatro ácidos resínicos, nomeadamente, os ácidos abiético, neoabiético, palústrico e levopimárico cujas estruturas estão representadas na Figura 5. Estes ácidos são conhecidos como ácidos abietadienóicos e diferem apenas na posição do sistema de ligação dupla conjugada da sua estrutura.3 Os ácidos abietadienóicos, ao sofrerem desidrogenação (remoção de hidrogénio), são convertidos no ácido dehidroabiético aromático.16 Embora os ácidos do tipo abiético sejam as estruturas dominantes na maioria das colofónias, a sua abundância relativa é bastante variável, dependendo da espécie de pinheiro, origem geográfica, condições de processamento e manuseio (por exemplo, temperatura e pH).3 Os ácidos do tipo pimárico mais comuns são os ácidos pimárico, isopimárico e sandaracopimárico (Figura 6). Em contraste com os ácidos do tipo abiético, este grupo de ácidos possui um sistema de ligação dupla não conjugada, o que reduz significativamente a reatividade química destes compostos.3 Além disso, possui grupos substituintes diferentes no carbono 13 do anel, enquanto os ácidos do tipo abiético possuem um grupo isopropilo, os ácidos do tipo pimárico possuem um grupo etil e um grupo metil no carbono 13.16 Os ácidos do tipo pimárico e isopimárico diferem apenas em serem 14 epiméricos no carbono 13, isto é, neste átomo de carbono apresentam α-metil e β-metil, respetivamente.16 O ácido sandaracopimárico é um isómero ótico do ácido pimárico. Figura 5: Estruturas químicas dos ácidos do tipo abiético mais comuns, A) ácido abiético, B) ácido neoabiético, C) ácido palústrico, D) ácido levopimárico e E) ácido dehidroabiético. Figura 6: Estruturas químicas dos ácidos do tipo pimárico mais comuns, A) ácido pimárico, B) ácido isopimárico e C) ácido sandaracopimárico. A B C D E A B C 15 Os ácidos do tipo labdano geralmente apresentam o grupo carboxílico (COOH) no carbono 19.16 As estruturas mais comuns deste grupo de ácidos estão representadas na Figura 7. Figura 7: Estruturas químicas dos ácidos do tipo labdano mais comuns, A) ácido lambertiánico, B) ácido mercúsico e C) ácido comúnico. A reatividade química dos ácidos resínicos é determinada pela presença do sistema de ligação dupla (sistema oleofínico) e do grupo COOH.16 O grupo COOH está sobretudo envolvido na esterificação, formação de sal, descarboxilação, formação de nitrilo e anidridos, entre outras reações químicas. Por sua vez, o sistema olefínico pode estar envolvido em reações de oxidação, redução, hidrogenação e desidrogenação. Dado o caráter conjugado deste sistema nos ácidos do tipo abiético, e a maior reatividade associada a ele, muita mais atenção tem sido dedicada a estas estruturas. Em termos de aplicações industriais, a formação de sal, esterificação e adições de Diels-Alder são as reações mais relevantes dos ácidos resínicos.3 Os compostos neutros presentes na colofónia podem ser classificados como saponificáveis (anidridos e ésteres) ou insaponificáveis (outros compostos não-acídicos). A quantidade de compostos neutros em todas as colofónias, tanto do tipo saponificável como do não saponificável, variam, mas, habitualmente, são da ordem dos 10%. A porção saponificável da fração neutra pode ser estimada para qualquer colofónia a partir das diferenças entre o índice de acidez e o índice de saponificação. A fração insaponificável de colofónias não modificadas varia cerca de 2 a 4%.16 O primeiro trabalho sobre a composição da colofónia foi publicado em 1826 por Baupe. Desde esse ano muitos mais trabalhos sobre este tema foram publicados, mas a grande maioria deles abordam a composição acídica das colofónias. Alguns autores investigaram a composição da fração neutra das colofónias, nomeadamente, Smith et al .20 que descobriram a presença de diversos aldeídos nos fumos A B C 16 produzidos pelas colofónias quando estas quebram ao estarem expostas a temperaturas de soldagem tais como, formaldeído, acetaldeído, propionaldeído e hexanal. Num artigo mais recente diversas classes de compostos neutros foram identificadas na colofónia de abeto ( Abies cilicica subsp. isaurica), nomeadamente, álcoois, aldeídos, hidrocarbonetos e ésteres.15 Na Tabela 1 é possível observar compostos neutros que foram identificados na colofónia e as diversas técnicas analíticas utilizadas para os caracterizar e identificar tais como, GC-MS, cromatografia gasosa com detetor de ionização por chama (GC-FID) e cromatografia gasosa acoplada a espetroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (GC-FTIR). Tabela 1: Compostos neutros presentes na colofónia proveniente de diversas espécies de árvore e respetivas técnicas de caracterização utilizadas para os identificar. Classe do composto e nome Espécie Técnica de caracterização Hidrocarbonetos kaur-16-eno; cicloisolongifoleno,9,10desidro; abieta-8(14),9(11),12-trieno Abies cilicica subsp. isaurica GC-MS e GC-FID15 β-felandreno; α-felandreno; paracimeno; alocimeno; pimaradieno; dehidroabietano; abietadieno Pinus ponderosa GC-FID21 3-careno Pinus ponderosa GC-FID21 Pinus brutia GC-MS22 canfeno; β-pineno; limoneno; terpinoleno Pinus ponderosa GC-FID21 _ GC-FID e GC-FTIR23 Pinus brutia GC-MS22 α-pineno; β-cariofileno Pinus ponderosa GC-FID21 _ GC-FID e GC-FTIR23 Pinus brutia GC-MS22 Pinus merkusii GC-MS24 α-terpineno Pinus ponderosa GC-FID21 _ GC-FID e GC-FTIR23 17 longifoleno Pinus ponderosa GC-FID21 _ GC-FID e GC-FTIR23 Pinus heldreichii GC-MS25 Pinus brutia GC-MS22 ciclohexeno; tolueno; у-fencheno; tricicleno; longipineno; longicicleno; isolongifoleno; isocariofileno; α-humuleno _ GC-FID e GC-FTIR23 у-terpineno; β-mirceno _ GC-FID e GC-FTIR23 Pinus brutia GC-MS22 cembreno; isocembreno Pinus heldreichii GC-MS25 valenceno; pregn-14-eno, (5β) _ GC-MS26 ciclofencheno Pinus pinaster GC-MS26 _ GC-FID e GC-FTIR23 biciclo[5.2.0]nonano, 4-metileno2,8,8-trimetil-2-vinil; 2,4b-dimetil-8metileno-2-vinil-1,2,3,4,4a,4b, 5,6,7,8,8a,9-dodecahidrofenantreno _ GC-MS27 Aldeídos propanal; acroleína; butanal; isobutanal; valeraldeído; isovaleraldeído; 2-metilbutanal; furfural; hexanal; ciclohexanocarboxaldeído; benzaldeído _ GC-MS20 formaldeído; acetaldeído _ GC-MS20, Cromatografia de camada fina23 abieta-8,11,13-trieno-18-al Abies cilicica subsp. isaurica GC-MS e GC-FID15 pimarinal; palustrinal; isopimarinal; dehidroabietinal; abietinal; neoabietinal Pinus ponderosa GC-FID21 24 colofónia é uma propriedade muito importante a nível industrial. Muitas indústrias preferem colofónias mais claras às mais escuras como, por exemplo, a indústria da produção de papel. Para a produção de papel, os graus de cor clara da colofónia são preferíveis pois os graus mais escuros reduzem a claridade do papel, uma propriedade que a indústria do papel tenta melhorar meticulosamente.16 3.6.3) Viscosidade Para a determinação da viscosidade das colofónias, segue-se a norma ASTM D 2196 – 99, recorrendo-se à utilização do viscosímetro de Brookfield (Figura 13). Segundo esta norma para determinar a viscosidade coloca-se 8 g de amostra numa cuba, em seguida, a cuba é colocada no viscosímetro e define-se uma temperatura de aquecimento e um spindle . O spindle é escolhido com base na gama de viscosidade da amostra. O valor da viscosidade é medido em centipoise (cP) apresentado no mostrador do viscosímetro. Um fluido que apresente um valor de cP baixo fluirá e mover-se-á com maior facilidade e rapidez, demonstrando menor viscosidade relativamente a um fluido com um valor de cP mais elevado, que fluirá muito mais devagar.36 Figura 13: Fotografia do equipamento utilizado para determinar a viscosidade. 3.6.4) Cristalização Embora a cristalização das colofónias tenha apresentado problemas por muitos anos, não existe um teste padronizado para medir a tendência de uma colofónia cristalizar.16 O teste geralmente usado é 25 o que foi desenvolvido por Palkin e Smith.37 Num tubo de ensaio introduz-se 14 g de amostra e 6 g de acetona para fazer uma proporção de 70:30 ou, no caso de se querer fazer uma proporção 50:50, pesase 10 g de amostra e 10 g de acetona. Monitoriza-se o tempo decorrido desde a preparação da solução até ao aparecimento da primeira cristalização, quanto maior o intervalo de tempo decorrido, menor a tendência para cristalizar. O resultado obtido é descrito como “cristalizou” quando, ao longo do tempo de ensaio, formaremse cristais, precipitação ou turvação na solução (Figura 14), ou “não cristalizou” quando, no final do tempo de ensaio, a solução encontra-se com um aspeto semelhante ao que se verificava no início do ensaio, ou seja, não ocorreu a formação de cristais, precipitação ou turvação na solução. Figura 14: Fotografia da presença de cristais numa solução de colofónia de razão 70:30. 3.6.5) Ponto de amolecimento O ponto de amolecimento da colofónia é determinado segundo a norma ASTM E 28 – o método de anel e bola. Inicialmente a amostra é aquecida numa placa de aquecimento até se tornar suficientemente viscosa para ser transferida para duas argolas e é deixada a arrefecer. De seguida, as argolas são niveladas para garantir que tem sempre a mesma quantidade de colofónia no seu interior. Coloca-se as argolas num suporte com duas esferas de aço (com peso e dimensões padronizadas) por cima, sendo depois o suporte mergulhado num copo contendo um fluido inerte. A escolha do fluido inerte a utilizar depende do ponto de amolecimento esperado e pode ser água, glicerina, óleo de silicone, entre outros. O fluido inerte sofre uma subida de temperatura gradual até se atingir o ponto de amolecimento, que corresponde à temperatura a que uma argola de colofónia se deforma até atingir a flecha de 25,4 26 mm, pela ação do peso da esfera de aço. Na Figura 15 observa-se o equipamento utilizado na determinação do ponto de amolecimento. Figura 15: Fotografia do equipamento utilizado para determinar o ponto de amolecimento. O ponto de amolecimento é reduzido por compostos neutros, ácidos gordos e componentes resínicos oxidados.38 Reações que aumentam o peso molecular da colofónia induzem um aumento do seu ponto de amolecimento; o aumento mais significativo do ponto de amolecimento ocorre quando a colofónia é fortificada com ácido fumárico.16 3.6.6) Ponto de turvação O ensaio do ponto de turvação, também designado por ponto nuvem, determina a temperatura à qual a mistura homogénea de colofónia e test oil inicia a sua precipitação provocando, deste modo, a turvação da amostra em análise. A determinação do ponto de turvação da amostra segue o procedimento descrito na norma ASTM D 6038. Num tubo de ensaio são colocados 2 g de amostra e 18 g de test oil , em seguida, introduz-se um agitador magnético e uma sonda de temperatura no tubo e insere-se o tubo no analisador de turbidez Chemotronic. Ao longo do ensaio existe um aumento gradual da temperatura até atingir 230℃, após a estabilização neste valor, há uma progressiva diminuição da temperatura até se atingir o ponto de 27 turvação, sendo possível determiná-lo por observação do gráfico que se forma durante a análise da amostra (Figura 16). Figura 16: Gráfico dos resultados experimentais obtidos no ensaio do ponto de turvação. As curvas a amarelo, rosa e verde correspondem à variação da turvação, em %, temperatura, em ℃, e velocidade de agitação, em rotações por minuto (rpm), respetivamente, ao longo do tempo. 3.7) Técnicas de caracterização 3.7.1) ESI-MS/MS A ionização por eletrospray (ESI) é uma técnica de ionização à pressão atmosférica habitualmente usada em sistemas de cromatografia líquida acoplada a espetrometria de massa (MS).39 Esta técnica requer a introdução de amostras no estado líquido e usa energia elétrica para auxiliar na transferência de iões da solução para a fase gasosa antes de serem submetidos à análise de MS, deste modo, espécies iónicas em solução podem ser analisadas com maior sensibilidade. Compostos neutros também podem ser convertidos para a forma iónica em solução ou em fase gasosa por protonação ou cationização.40 Em ESI a fonte de eletrospray consiste num tubo capilar, através do qual é bombeada a amostra dissolvida, seja ela um efluente de uma coluna de cromatografia líquida ou de uma bomba de seringa, e um contra elétrodo.39 Uma diferença de potencial elevada (2-6 kV) é aplicada entre a ponta do capilar e o contra elétrodo criando um forte campo elétrico, o que resulta na dispersão da solução da amostra num aerossol de gotículas altamente carregadas.39,41 A nebulização da solução pode ser facilitada pela introdução de um gás nebulizador tal como o azoto. Este fluxo de gás também ajuda a direcionar o spray 28 que sai da ponta do capilar para o espetrómetro de massa. As gotículas carregadas diminuem de tamanho à medida que o solvente evapora, sendo esta evaporação auxiliada pelo fluxo de azoto (gás de secagem).41 À medida que o solvente evapora, a densidade de carga elétrica na superfície da gotícula aumentará até que as forças repulsivas de Coulomb entre cargas semelhantes excederão as forças de tensão superficial levando à quebra da gotícula inicial em gotículas menores. Este processo repete-se, produzindo-se gotículas cada vez menores e, eventualmente, um ião da gotícula é ejetado. Estes iões em fase gasosa passam por um cone de amostragem e são concentrados em regiões de vácuo bombeadas diferencialmente antes de serem transportados para o analisador do espetrómetro de massa.39 A ESI pode ser usada em modo de ionização positivo ou negativo, dependendo da afinidade de protão do composto em análise. No modo de ionização positivo (Figura 17) apenas analitos com, pelo menos, uma carga elementar positiva podem ser detetados, em contraste, no modo de ionização negativo apenas analitos com, pelo menos, uma carga elementar negativa são detetados. No modo de ionização positivo moléculas que possuem características básicas podem ser facilmente ionizadas através da produção de aductos com protões, enquanto as moléculas que apresentam grupos funcionais acídicos e não apresentam grupos funcionais básicos, normalmente, dão melhores espetros no modo de ionização negativo.42 Figura 17: Esquema do modo de funcionamento da ESI no modo de ionização positivo. Adaptado de: So, Hu e Yao, 2013.43 Agulha de pulverização Solução de ESI Fonte de energia Corrente (i) Cone de Taylor Cone de Taylor Oxidação Gotículas Excesso de carga na superfície Excesso de carga na superfície Solvente e iões neutros Redução Espetrómetro de massa 29 A técnica ESI é de ionização suave, permitindo uma menor transferência de energia para as moléculas em análise, em consequência, as partículas carregadas ficam num estado de leve excitação e tendem a ter muito menos fragmentação.44 Além disso, a ESI é particularmente útil porque espécies com carga múltipla podem ser formadas, permitindo a análise de moléculas com pesos moleculares superiores a 50 000 dalton (Da). Como a maioria dos espetrómetros de massa pode detetar apenas razões massa-carga (m/z) inferiores a 2000 ou 3000 Da, a utilização desta técnica melhorou muito a capacidade de estudar grandes biomoléculas, como, por exemplo, proteínas.45 Se a ESI é acoplada à cromatografia líquida, o modo de ionização positivo é geralmente escolhido, uma vez que é esperado que mais compostos ionizem neste modo, no entanto, o modo de ionização negativo tem a grande vantagem de fornecer menor ruído de fundo.46,47 Os espetrómetros de massa fornecem informações estruturais sobre compostos químicos por meio de uma série de processos que geram um espetro de massa e podem ser aplicados a análises quantitativas, no entanto, eles são usados com mais frequência para análises qualitativas.44 A deteção de MS é baseada no fenómeno de que moléculas podem ser ionizadas em alto vácuo, produzindo espécies carregadas.48 Estas espécies são, posteriormente, separadas com base na sua m/z e detetadas, sendo a quantidade relativa de iões de vários valores de m/z organizada e apresentada na forma de um espetro de massa. O espetro de massa pode ser considerado uma forma de identificação para a maioria dos compostos orgânicos, porém, no caso de isómeros pode ser difícil diferenciá-los, principalmente com estereoisómeros.44 Todos os espetrómetros de massa têm quatro componentes principais: uma fonte de iões, onde as moléculas da amostra podem ser ionizadas por vários métodos, um analisador de massa que separa os iões de acordo com a sua m/z, um detetor que mede a abundância dos iões separados como um sinal elétrico e um dispositivo de gravação que converte o sinal do detetor numa forma adequada para estudo e processamento adicionais.49 Existem vários tipos de analisadores de massa tais como, tempo-de-voo, sector magnético, armadilha iónica quadropolo, entre outros. Os analisadores de massa de armadilha iónica usam uma combinação de campos elétricos ou magnéticos para capturar ou “aprisionar” iões dentro do analisador.50 Existem várias configurações de armadilhas de iões, sendo um deles a armadilha iónica linear. Este tipo 30 de analisador é composto por quatro varas paralelas com forma hiperbólica, segmentadas em três secções, acopladas com elétrodos em cada extremidade para facilitar o aprisionamento de iões. Esta armadilha aprisiona os iões radialmente através de um campo elétrico de radiofrequência bidimensional e axialmente num campo elétrico estático utilizando voltagens de corrente direta, o que gera um campo homogéneo em toda a região de aprisionamento. A análise de massa envolve ejetar os iões presos na direção radial através de duas fendas paralelas na seção central da armadilha iónica linear, sendo um detetor colocado em cada lado da armadilha para maximizar a sensibilidade de deteção de iões. Duas grandes vantagens deste tipo de analisador de massa é que possui maiores volumes de captura e, portanto, pode analisar mais iões por ciclo e pode fazer várias fragmentações sucessivas de iões (MSn, sendo n < 10).51 Além disso, apresenta taxas de varrimento mais rápidas e maior sensibilidade.52 Nos últimos anos a espetrometria de massa em tandem tem sido bastante utilizada. A espetrometria de massa em tandem, também conhecida como MS/MS ou MS2, é útil em estudos com compostos conhecidos e desconhecidos. Com esta técnica, um ião "parental" da fragmentação inicial – a fragmentação que dá origem ao espetro de massa convencional – é selecionado e permitido ou induzido a fragmentar-se ainda mais dando origem a iões "filhos". Em misturas complexas, estes iões “filhos” fornecem evidências da presença de um composto conhecido e para compostos novos ou desconhecidos eles providenciam informações estruturais adicionais.53 No caso do analisador armadilha iónica quadropolo cada etapa das análises de MS/MS é realizada no mesmo analisador, sequencialmente no tempo. Inicialmente uma amostra é ionizada, os iões são aprisionados na armadilha e, posteriormente, ejetados e detetados dando origem a um espetro de massa. Em seguida, para fragmentar um valor m/z de interesse do espetro de massa obtido, os iões de m/z inferior e superior ao ião “parental” devem ser ejetados da armadilha. Isto é feito através da aplicação de uma voltagem suplementar suficientemente alta na armadilha, à medida que as frequências dos iões entram em ressonância com a voltagem suplementar eles serão ejetados. Posteriormente, o ião “parental” é excitado vibracionalmente pela colisão com um gás neutro, sendo este fenómeno conhecido como dissociação induzida por colisão (Figura 18), resultando na geração de iões fragmentados (iões “filhos”).54 Uma utilização habitual de MS/MS consiste em ionizar uma amostra em bruto, escolher de forma seletiva um ião característico para o composto em análise e obter o espetro dos iões “filhos” produzidos a partir desse ião, permitindo a deteção de um composto numa amostra em bruto sem a necessidade de cromatografia ou outras etapas de separação prévias. Deste modo, a MS/MS tem a 31 vantagem de não necessitar de separações complexas de misturas para várias análises qualitativas de rotina.53 Figura 18: Esquema do princípio da MS/MS. Adaptado de: Mellon, 2003.49 Desvantagens da técnica ESI-MS/MS incluem uma baixa tolerância a contaminantes na amostra e uma maior complexidade dos espetros resultantes devido à presença de estados de carga múltipla.55 Além disso, não é uma técnica adequada para analisar compostos apolares e não existem atualmente bibliotecas espetrais desta técnica, o que dificulta a identificação de compostos com base nos espetros de massa observados. 3.7.2) HPLC-MS A cromatografia é definida como um método físico de separação em que os componentes a serem separados são distribuídos entre duas fases, uma delas é estacionária (fase estacionária) enquanto a outra move-se numa direção definida (fase móvel).56 Independentemente do tipo de cromatografia, as amostras são dissolvidas na fase móvel que viaja através da fase estacionária. A separação é possível devido a diferentes compostos terem diferentes afinidades para as fases móvel e estacionária, afetando, deste modo, a sua distribuição entre as duas fases e o seu comportamento resultante no sistema.44 Existem vários tipos de métodos cromatográficos como, por exemplo, a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Espetro de massa: MS 1 Espetro de MS-MS: MS 2 Célula de colisão Dissociação induzida por colisão 32 A HPLC é uma técnica para a separação de diferentes analitos numa amostra com base nos seus coeficientes de distribuição entre uma fase estacionária (coluna) e uma fase móvel (eluente) num sistema de alta pressão. Um sistema HPLC consiste, basicamente, em cinco componentes principais: um sistema de abastecimento de fase móvel, sistema de injeção de amostra, sistema de separação, sistema de deteção e um sistema de interface e processamento de dados. Quando apenas um eluente (ou fase móvel) é introduzido no sistema usando uma única bomba mecânica de elevada pressão e este flui através do sistema a uma determinada taxa de fluxo, denomina-se este modo de HPLC de modo isocrático (Figura 19). O analito da amostra é geralmente dissolvido na fase móvel antes de ser injetado na coluna analítica através do uso de uma micro-seringa (modo manual) ou um mecanismo de injeção automática mais sofisticado como um amostrador automático.57 Figura 19: Representação esquemática dos principais componentes do equipamento de HPLC com um sistema de fase móvel de modo isocrático. Adaptado de: Verma e Santoyo, 2007.57 Sistema de abastecimento de fase móvel (modo isocrático) Filtro Reservatório de eluente com desgaseificador Bomba mecânica de elevada pressão Sistema de injeção de amostra (manual ou automático) Coluna analítica Pré-coluna Sistema de separação Sistema de deteção Detetor Computador Gravador Sistema de interface e processamento de dados Resíduos Resíduos Módulo de reação pós-coluna (opcional) 33 Quando duas bombas, em vez de uma única bomba, estão envolvidas no sistema de abastecimento da fase móvel para misturar dois eluentes o modo é chamado de gradiente binário (Figura 20). Tal como no modo isocrático este sistema cromatográfico consiste em cinco módulos, a principal diferença está no primeiro módulo, no qual duas fases móveis (A e B) podem ser bombeadas usando o controlador de gradiente da bomba. Com o modo de gradiente binário, a composição da fase móvel muda continuamente para alcançar uma separação eficiente dos componentes da amostra, o que resulta, habitualmente, num melhor desempenho relativamente ao modo isocrático.57 Figura 20: Representação esquemática dos principais componentes do equipamento de HPLC com um sistema de fase móvel de modo de gradiente binário. Adaptado de: Verma e Santoyo, 2007.57 Em HPLC os componentes da amostra são separados à medida que migram através da coluna a diferentes velocidades e eluem do sistema em tempos diferentes. Analitos que são fortemente retidos na fase estacionária eluem tarde, em contrapartida, analitos que não interagem fortemente com a fase estacionária migram mais rápido e eluem mais cedo. A deteção de analitos eluídos pode ser realizada por um único detetor ou por vários detetores conectados em série.58 Sistema de abastecimento de fase móvel (modo de gradiente binário) Sistema de injeção de amostra (manual ou automático) Sistema de separação Sistema de deteção Sistema de interface e processamento de dados Filtro Reservatórios de eluentes com desgaseificadores Bomba 1 Bomba 2 Pré-coluna Coluna analítica Filtro Detetor Gravador Computador Controlador de gradiente da bomba Zona de elevada pressão Zona de baixa pressão Misturador Resíduos Resíduos Módulo de reação pós-coluna (opcional) 40 Como referido anteriormente, no caso da SPME por imersão direta (DI-SPME) a fibra do holder é imersa num pequeno volume da amostra no estado líquido ou gasoso (Figura 24). Os analitos da amostra são concentrados no revestimento da fibra sob as condições ideais de trabalho (tempo, temperatura, agitação e pH).69,70 Após um determinado tempo a concentração do analito na fibra atinge um nível de equilíbrio com o seu ambiente, esta etapa de concentração permite que a quantidade máxima de analito seja retirada nas respetivas condições de amostragem.71 Posteriormente, a fibra é inserida no injetor do cromatógrafo gasoso para dessorção térmica ou num solvente de dessorção apropriado para posterior análise de HPLC.69,70 Este modo de SPME é mais habitualmente usado para amostras polares e não-voláteis.72 Figura 24: Princípio da DI-SPME. Adaptado de: Weggler et al ., 2020.71 É comum recorrer à técnica de derivatização na cromatografia gasosa de modo a aumentar a volatilidade e estabilidade térmica e diminuir a polaridade dos compostos.62–64 Também é utilizada para aumentar a sensibilidade e o desempenho do cromatógrafo gasoso para compostos específicos, como, por exemplo, ácidos, álcoois e aminas. Este tipo de compostos é difícil de analisar devido à presença de hidrogénios ativos na sua composição, a sua análise por GC-MS pode induzir uma reação com a superfície interna do injetor ou com a coluna analítica, resultando em picos de rejeição e de baixa resposta. A derivatização remove os hidrogénios ativos destes compostos e substitui-os por outros grupos funcionais, consequentemente, aumentando a sua volatilidade e reduzindo o potencial de adsorção quando entram no sistema de cromatografia gasosa.73 Analito Matriz 41 Existem três métodos de derivatização diferentes, consoante o reagente utilizado e a reação química que ocorre, que são a acetilação, sililação e alquilação. A escolha da técnica de derivatização a utilizar depende de vários fatores, nomeadamente da massa do produto derivatizado, que não deve exceder os limites de deteção do equipamento de GC-MS, e das condições necessárias para que a reação seja completa, garantindo que os produtos sejam obtidos com o maior rendimento possível. Além disso, a técnica escolhida não deve ser seletiva em relação aos componentes presentes numa mistura, assegurando a derivatização de todos eles.13 A reação de derivatização mais comum é a sililação, que envolve a substituição de um átomo de hidrogénio ativo por um grupo trimetilsilil. Este método é bastante utilizado devido aos derivados trimetilsilil serem muito fáceis de preparar e a reação ser muito rápida.62– 64 A sililação é habitualmente empregada na derivatização de metabolitos tais como, esteróis, álcoois, aminoácidos e monossacarídeos.74 A acetilação envolve a substituição dos átomos de hidrogénio por grupos acetil e é utilizada para derivatizar álcoois, fenóis e aminas. Por sua vez, a reação de alquilação consiste na adição de um grupo alquilo a um grupo funcional ativo. A reação de alquilação mais comum consiste na conversão de um ácido carboxílico no respetivo éster metílico (Figura 25).62–64 Figura 25: Reação química de metilação. 3.7.4) FTIR-ATR A espetroscopia de infravermelho (IR) auxilia na elucidação e identificação de grupos químicos dos compostos orgânicos e inorgânicos de amostras sólidas, líquidas ou gasosas com base nas ligações químicas que têm níveis de energia e capacidades de alongamento e torção diferentes.75 A espetroscopia de IR com transformada de Fourier (FTIR) usa o processo matemático (transformada de Fourier) para traduzir os dados brutos (interferograma) no espetro real. O espetro FTIR é traçado com os valores de intensidade das bandas, que podem ser expressas em transmitância ou absorvância, em função dos valores de número de onda, geralmente, da região do IR médio – MIR (4000400 cm− 1) – onde vibrações de alongamento e de torção de grupos químicos característicos da amostra surgem. Na Figura 26 é possível observar um esquema do funcionamento da espetroscopia de FTIR. 42 Figura 26: Representação esquemática do modo de funcionamento da técnica de espetroscopia de FTIR. Adaptado de: Gurumurthy e Ramesh, 2018.76 Um espetrómetro FTIR típico inclui uma fonte de IR, interferómetro, detetor, laser e um computador. O feixe policromático de radiação IR que surge da fonte entra no interferómetro onde um padrão especial do sinal - o interferograma - é produzido. O feixe resultante passa pelo compartimento da amostra, onde é transmitido através da amostra ou refletido na sua superfície, dependendo do tipo de análise que está sendo realizada. As frequências específicas de energia, que são exclusivas da amostra, são absorvidas.77 Depois de passar pelo interferómetro a radiação atinge o detetor, sendo o sinal amplificado e convertido num sinal digital, posteriormente, o sinal é transferido para o computador onde a transformada de Fourier é realizada.78 Os espetrómetros FTIR podem ser de feixe único ou feixe duplo, produzindo um espetro de transmitância. A maioria dos sistemas multiplica o valor da transmitância por 100 para obtê-la em percentagem, no entanto, a escala de absorvância é cada vez mais usada para análises quantitativas, seguindo a lei de Beer que afirma que há uma relação linear entre a absorvância e a concentração de amostra.77 A radiação IR não tem energia suficiente para provocar transições eletrónicas, apenas ocorrem transições vibracionais acompanhadas de transições rotacionais, ocorrendo excitação das moléculas até atingirem um estado vibracional mais elevado. Todas as vibrações de uma ligação ocorrem a uma frequência caraterística; a espetroscopia de IR mede as frequências de vibração das ligações na molécula, originando um espetro em que a quantidade de luz absorvida pela amostra é medida enquanto a frequência vai sendo variada. Espetrómetro Amostra Fonte Interferómetro Detetor Interferograma Computador Espetro 43 O espetro de IR é característico de cada molécula, mas certos grupos de átomos originam bandas numa gama de frequências - bandas de absorção características dos grupos funcionais - independentemente da estrutura do resto da molécula. O espetro de IR também apresenta uma região de impressão digital. Uma vez que cada molécula possui uma impressão digital única, isto torna a espetroscopia de FTIR uma ferramenta preciosa para identificação química dos compostos (análise qualitativa).79 O tamanho dos picos no espetro consiste numa indicação direta da quantidade de material presente na amostra o que torna a espetroscopia de FTIR uma ferramenta que pode ser usada, também, em análise quantitativa.76 Atualmente, a técnica da refletância total atenuada (ATR) também é usada na região do MIR para resolver problemas específicos para os quais os métodos de transmissão tradicionais não fornecem informações adequadas.77 ATR é uma das técnicas de amostragem mais populares usadas porque é uma técnica rápida, não destrutiva, não requer preparação de amostra e é muito simples e conveniente de usar.80,81 ATR permite a análise de amostras sólidas e líquidas e, por ser uma técnica de contacto, é muito usada na análise de superfícies ou materiais demasiado espessos ou altamente absorventes para serem analisados por métodos de transmissão mais tradicionais.80,81 Na técnica FTIR-ATR a amostra é depositada sobre um cristal que possui um índice de refração muito elevado e baixa absorção no IR. Os cristais habitualmente podem ser de seleneto de zinco, germânio, silício, diamante e KRS-5 (iodeto de tálio ou brometo de tálio).81 O feixe IR irá incidir no cristal e sofrer refração no interior do cristal antes de atingir a amostra. A reflexão do feixe será total quando o ângulo de incidência for maior do que o ângulo crítico, sendo este fenómeno denominado de reflexão interna total. Nestas condições, parte do feixe no limite do cristal penetrará na amostra a uma profundidade de alguns micrómetros sob a forma de “onda evanescente”, ocorrendo a redução da intensidade da luz refletida, sendo este fenómeno chamado de refletância total atenuada.81 Após uma ou várias reflexões o feixe IR atenuado sai do cristal e segue em direção ao detetor, onde é analisado originando o espetro de IR. Um esquema deste princípio de FTIR-ATR é demonstrado na Figura 27. Nos espetros obtidos por ATR a espessura da amostra não influencia a intensidade das bandas de absorção pois apenas a zona interfacial da amostra vai interagir com o feixe IR refletido no cristal, sendo estes semelhantes aos espetros de IR obtidos por transmissão relativamente à posição das bandas, mas variando em termos de intensidade das mesmas. 44 Figura 27: Representação esquemática do sistema de FTIR-ATR. Adaptado de: Ausili, Sánchez e GómezFernández, 2015.82 3.7.5) RMN A RMN é uma técnica espetroscópica utilizada para a determinação de estruturas químicas das moléculas.83 Além de permitir obter informação estrutural também se pode obter informação física, química e eletrónica das moléculas e informação acerca da estrutura tridimensional e da dinâmica das moléculas no estado líquido ou sólido de um modo não destrutivo.84 A RMN de protão (1H-RMN) baseia-se na absorção de energia na gama das radiofrequências por parte do núcleo de hidrogénio, na presença de um campo magnético forte, permitindo diferenciar protões que possuem diferentes ambientes químicos numa molécula através das suas frequências.83,84 Efetivamente, a posição onde se situa o sinal de frequência de um núcleo depende das características do próprio núcleo, mas depende também da sua vizinhança química e, consequentemente, da estrutura da molécula em que esse átomo está inserido, ou seja, protões ligados a diferentes grupos funcionais têm valores de frequência diferentes.84 Os valores de frequência são apresentados num espetro de RMN como "desvios químicos", que são definidos como diferenças de frequência em relação a uma referência (tetrametilsilano - TMS) e expressos em partes por milhão (ppm).83 A RMN requer spin nuclear, que é o momento magnético resultante do momento angular total de certos núcleos, como aqueles com um número ímpar de protões ou neutrões. Um espetrómetro de RMN é um instrumento que usa o momento magnético para obter informações sobre a estrutura de um composto.85 O espetrómetro é basicamente constituído por um magnete capaz de criar um campo homogéneo numa região onde é introduzida a amostra, um sistema de transmissão-receção de radiofrequências, uma sonda e um computador (Figura 28).84 Feixe IR Polarizador Cristal Amostra Onda evanescente Detetor Fonte de IR 45 Figura 28: Representação esquemática de um espetrómetro de RMN. Adaptado de: Course Hero.85 Os spins individuais, que são normalmente aleatórios na orientação, alinham-se paralelamente ao campo magnético aplicado (com o campo) ou antiparalelo (contra o campo). Como podemos ver pela Figura 29, o estado energético que é paralelo ao campo e requer menos energia é chamado de estado α, em contrapartida, o estado energético que é antiparalelo ao campo e requer energia mais alta é chamado de estado β. Os protões podem absorver energia para mudar o seu spin do estado α para o estado β. O espetrómetro de RMN envia pulsos de ondas de rádio através do campo magnético para fornecer aos protões a energia necessária para alterar os spins , quando isto ocorre o protão está em ressonância com o campo nuclear, ou seja, está em RMN. Posteriormente, é libertada energia pelos protões quando eles relaxam de volta ao estado fundamental (estado α) e essa energia é registada pelo espetrómetro.85 A RMN é uma técnica altamente reprodutível que fornece bom poder de quantificação e facilidade de manuseamento da amostra. Algumas limitações desta técnica são as dificuldades na automação e nas análises de alto rendimento.86,87 Experiências de RMN com outros núcleos para além do hidrogénio podem ser realizadas, como o carbono (13C), azoto (5N) e fósforo (31P). A sensibilidade espetral é maior em 1H-RMN relativamente à RMN de carbono-13 (13C-RMN) devido à elevada abundância natural e maior razão giromagnética de hidrogénio em relação a 13C. No entanto, 13C-RMN tem uma maior seletividade espetral devido à maior dispersão dos “desvios químicos”, permitindo uma caracterização estrutural mais detalhada.88 Câmara de vácuo Azoto líquido Hélio líquido Amostra Magnete supercondutor Bobina Sonda 46 Figura 29: Representação esquemática do princípio energético da técnica RMN. Adaptado de: Course Hero.85 Também podem ser realizadas experiências com vários níveis de correlação usando RMN uni e bidimensional, bem como espetroscopia de correlação, espetroscopia de correlação total e espetroscopia quântica simples heteronuclear. As técnicas bidimensionais tem a vantagem de melhorar a sensibilidade e reduzir os tempos de aquisição.87 3.8) Ensaio DPPH O ensaio 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) é utilizado para determinar a atividade antioxidante de amostras através do uso de um radical livre, estável à temperatura ambiente, com uma cor violeta intensa – o composto DPPH (Figura 30). Este ensaio colorimétrico foi desenvolvido por Blois em 1958 e baseiase na medição da capacidade de eliminação dos antioxidantes em relação ao radical DPPH.89 Figura 30: Estrutura química do composto DPPH. Energia Sem campo magnético aplicado Campo magnético aplicado Campo magnético aplicado Campo magnético aplicado Espetrómetro de RMN mede a frequência da energia libertada Espetrómetro de Estado α Estado α Estado α Estado β Estado β Estado β β Ondas rádio Relaxamento Energia necessária para mudar estados 47 O radical DPPH é caracterizado por apresentar deslocalização do eletrão extra sobre a molécula como um todo, deste modo, ele não dimeriza ao contrário da maioria de outros radicais livres. Esta deslocalização dá origem à cor violeta intensa, com uma absorção em solução de etanol a 517 nm. Como se pode ver pela Figura 31 ao misturar a solução de DPPH com moléculas antioxidantes, o eletrão ímpar do átomo de azoto no DPPH é reduzido ao receber um átomo de hidrogénio dos antioxidantes ocorrendo a conversão do radical DPPH para 2,2-difenil-1-picrilhidrazina (DPPHH).89,90 Esta redução induz a perda da cor violeta, dando origem a uma solução de etanol incolor, e consequentemente, ocorre a diminuição da absorção a 517 nm, que é proporcional à atividade antioxidante da amostra examinada.90,91 Deste modo, a diminuição da absorvância dos radicais DPPH pode ser monitorizada para avaliar o potencial antioxidante de amostras. Figura 31: Reação química da redução do radical DPPH para DPPHH. Os resultados deste ensaio são expressos em termos de percentagem do DPPH reduzido num estado de equilíbrio (DPPHr). Esta percentagem calcula-se usando os valores da absorvância registada no estado de equilíbrio (Absr) e absorvância inicial (registada a t = 0 min, Absi) do seguinte modo: O método DPPH é uma maneira fácil e rápida de avaliar antioxidantes por espetrofotometria, sendo útil para avaliar vários produtos ao mesmo tempo.92 Além disso, é um método simples, barato e amplamente utilizado para medir a capacidade de compostos de atuarem como retiradores de radicais livres ou doadores de hidrogénio e também pode ser usado para quantificar antioxidantes em sistemas biológicos complexos, para amostras sólidas ou líquidas.90 Este ensaio pode ser utilizado em solventes orgânicos aquosos e apolares para examinar antioxidantes hidrofílicos e lipofílicos.93 (Equação 3) %DPPHr = [(Absi − Absr) Absi]×100 48 3.9) Ensaio da microdiluição Um dos primeiros métodos de teste de suscetibilidade antimicrobiana foi o da macrodiluição, também chamado de método de diluição em tubo. Este procedimento envolve a preparação de diluições de antibióticos em série duas vezes (por exemplo, 1, 2, 4 e 8 mg/mL) em tubos de ensaio contendo meio de crescimento líquido.94,95 Posteriormente, estes tubos são inoculados com uma suspensão bacteriana padronizada. Após a incubação durante a noite, os tubos são examinados quanto ao crescimento bacteriano visível e determina-se a concentração mínima inibitória (MIC) por medições de intensidade de fluorescência ou turbidez do tubos.96 A MIC representa a menor concentração de antibiótico que inibe completamente o crescimento de microrganismos.97 A vantagem desta técnica consiste na geração de um resultado quantitativo – a MIC. As principais desvantagens do método de macrodiluição são a possibilidade de erros na preparação das soluções antibióticas e a quantidade relativamente grande de reagentes, espaço e tempo necessários para cada ensaio.96 Por este motivos foi desenvolvido um método de macrodiluição miniaturizado através do uso de placas de poços de plástico para preparar as suspensões celulares. A este método deu-se a designação método da microdiluição. Geralmente, o método da microdiluição envolve a utilização de microplacas de 96 poços, permitindo o estudo de um máximo de 12 antibióticos com diluições em série oito vezes numa única microplaca. Baixos volumes de antibióticos diluídos são introduzidos nos poços da microplaca, após a adição de uma pequena quantidade de suspensão bacteriana padronizada a cada poço a microplaca é incubada durante a noite. Após a incubação determina-se a MIC. Com este método é possível a preparação de centenas de microplacas idênticas a partir de um único conjunto mestre de diluições num período de tempo relativamente curto.95,98 Outras vantagens deste método incluem o baixo custo e a redução de espaço de trabalho e reagentes.99,100 49 Capítulo 4. Parte experimental 56 Figura 32: Fotografia da A) montagem do condensador do refluxo adaptado ao balão Erlenmeyer e B) montagem da ampola de decantação para a etapa de extração. Figura 33: Fotografia da A) montagem do equipamento para a etapa da evaporação do éter e B) placa de Petri contendo a amostra. 4.3) Caracterização dos compostos neutros das frações insaponificáveis de pitch A caracterização dos compostos neutros presentes nas amostras ibérica e brasileira foi efetuada com recurso às técnicas de ESI-MS/MS, HPLC-MS, GC-MS, FTIR-ATR e RMN. Solução etérea Solução de sabão A B A B 57 4.3.1) ESI-MS/MS e HPLC-MS 4.3.1.1) Material, equipamento e reagentes As características de todos os materiais e equipamentos utilizados nas análises de ESI-MS/MS e HPLC-MS estão apresentadas na Tabela 6. As características dos reagentes utilizados estão exibidas na Tabela 7. Todos reagentes usados são de grau analítico com a exceção do ácido abiético, que tem uma pureza de 85%. Tabela 6: Materiais e equipamentos utilizados nas análises de ESI-MS/MS e HPLC-MS e respetivas marcas e incertezas. Material/Equipamento Marca Incerteza Balança analítica Precisa 40SM-200A 0,00001 g Espátulas SELECTA _ Pipetas de Pasteur de vidro de 230 mm de comprimento NORMAX _ Balões Erlenmeyer de 150 mL e 50 mL Linex _ Provetas de 100 mL Linex 1 mL Provetas de 50 mL Linex 0,50 mL Espetrómetro de massa Thermo Finnigan LXQ _ Cromatógrafo Thermo Finnigan Surveyor _ Sonicador Struers Metason 60 _ Seringa de 500 µL Hamilton Company _ Vials de dimensões 45 × 14,75 mm ALWSCI Technologies _ Tubos Falcon de 50 mL DELTALAB _ Centrifugadora HERMLE Z 300 _ Filtros de membrana de nylon com tamanho de poro de 0,45 µm BRANCHIA _ Bomba de vácuo BUCHI _ Estufa memmert _ 58 Tabela 7: Nome, fórmula química, massa molar e número CAS dos reagentes utilizados nas análises de ESI-MS/MS e HPLC-MS. Nome Fórmula química Massa molar (g/mol) CAS Ácido acético glacial C2H4O2 60,05 64-19-7 Metanol CH4O 32,04 67-56-1 Éter etílico C4H10O 74,12 60-29-7 Água ultra-pura H2O 18,02 7732-18-5 Acetonitrilo C2H3N 41,05 75-05-8 Ácido abiético C20H30O2 302,50 514-10-3 Ácido oleico C18H34O2 282,50 112-80-1 Ácido palmítico C16H32O2 256,42 57-10-3 Acetato de linalilo C12H20O2 196,29 115-95-7 2-amino-1,3,4-octadecanotriol C18H39NO3 317,50 13552-11-9 Hidrato de quercetina C15H10O7•xH2O 320,25 849061-97-8 Hidrato de (+)-catequina C15H14O6•xH2O 308,28 88191-48-4 4.3.1.2) Métodos experimentais As soluções preparadas para as análises de HPLC-MS consistiram em soluções de 100 mg de amostra ibérica e de amostra brasileira dissolvidas em 100 mL dos solventes metanol e éter etílico de razão 80:20. A adição do éter etílico foi necessária para facilitar a dissolução da pitch . Recorreu-se ao uso de banho de ultrasons durante 55 min para ocorrer a dissolução completa das amostras. Também se tentou dissolver 100 mg das amostras em 100 mL dos solventes metanol e água de razão 50:50. No entanto, constatou-se que as soluções ficaram turvas. O facto da pitch demorar a dissolver no metanol e apresentar turbidez na presença de água demonstra que a composição deste material é maioritariamente apolar, o que pode dificultar a sua análise por ESI-MS. De modo a obter uma solução contendo os compostos polares presentes na pitch recorreu-se à sonicação, centrifugação e filtração a vácuo destas soluções. Estas três etapas realizaram-se da seguinte forma: 1) Introduzir o balão Erlenmeyer contendo a solução dentro do sonicador. Manter o recipiente no banho de ultrassons durante 1 h; 59 2) Transferir 40 mL de solução para um tubo Falcon. Inserir os tubos na centrifugadora. Centrifugar as soluções durante 30 min a 7000 rpm. Após a centrifugação verifica-se a precipitação da solução no fundo do tubo. Estes precipitados sólidos são apolares; 3) Recorrer ao equipamento da bomba de vácuo e a filtros de membrana de nylon para realizar a filtração a vácuo da solução. Após a filtração a vácuo obtém-se uma solução límpida como se pode ver na Figura 34.B; 4) Em seguida, colocar os tubos Falcon na estufa a 40℃ durante 2-3 h para os precipitados secarem. Deste modo, os precipitados sólidos apolares são recuperados. Posteriormente, estes serão analisados por FTIR-ATR. As soluções filtradas e as soluções em metanol e éter etílico de amostra ibérica e amostra brasileira também foram analisadas por ESI-MS/MS. Figura 34: Fotografia do A) tubo Falcon contendo a solução de amostra ibérica após a etapa de sonicação e B) balão Erlenmeyer contendo a solução após as etapas de centrifugação e filtração a vácuo. Adicionalmente prepararam-se soluções de sete padrões diferentes: • Ácido abiético, Thermo Scientific • Ácido oleico, Thermo Scientific • Ácido palmítico, Thermo Scientific • Acetato de linalilo, Acros Organics A B 60 • 2-amino-1,3,4-octadecanotriol, Sigma-Aldrich • Hidrato de quercetina, Aldrich • Hidrato de (+)-catequina, TCL Para preparar estes padrões dissolveu-se 30 mg de cada um em 100 mL de metanol com a exceção do hidrato de (+)-catequina em que se dissolveu 30 mg do mesmo em 100 mL de metanol e água de razão 50:50. Estes padrões foram analisados por HPLC-MS. As análises de HPLC-MS foram realizadas no cromatógrafo Thermo Finnigan Surveyor composto por um detetor de matriz de fotodíodos (PDA) Plus, um Autosampler Plus e um LC Pump Plus, acoplado ao espetrómetro de massa Thermo Finnigan LXQ (Figura 35). Os compostos foram separados numa coluna de fase reversa C18 Phenomenex (Synergi 4 µm Hydro-RP 80A, 150 mm x 4,60 mm, com um tamanho de partículas de 4 µm). Figura 35: Fotografia dos equipamentos utilizados nas análises de ESI-MS/MS e HPLC-MS. A fase móvel foi constituída por água com 0,2% de ácido acético glacial (eluente A) e acetonitrilo (eluente B). O fluxo da fase móvel foi de 0,3 mL/min nas condições de gradiente que se podem observar na Figura 36: início da injeção 30% de A e 70% de B, dos 0 aos 15 min de 30% a 5% de A, dos 15 aos 25 min de 5% a 30% de A, dos 25 aos 30 min 30% de A. O volume injetado para cada amostra foi de 25 µL. O tempo de análise de cada amostra foi de 30 min para cada modo de ESI (positivo e negativo). Entre análises de soluções diferentes a seringa do equipamento foi limpa com uma solução de lavagem (50:50 água/acetonitrilo). Dissociação induzida por colisão foi utilizada para fragmentar os iões. Usou- 61 se como gás de nebulização o azoto. A energia de colisão normalizada foi de 35 V e o intervalo de massas foi de 50-2000 m/z. O software utilizado para analisar os cromatogramas foi o Xcalibur. Estas condições experimentais foram empregues para analisar as soluções dos padrões ácido abiético, ácido oleico, ácido palmítico, acetato de linalilo, 2-amino-1,3,4-octadecanotriol e hidrato de quercetina e as soluções de amostra ibérica e amostra brasileira em metanol e éter etílico. Figura 36: Gráfico da composição dos eluentes A e B em função do tempo de análise das soluções dos padrões ácido abiético, ácido oleico, ácido palmítico, acetato de linalilo, 2-amino-1,3,4-octadecanotriol e hidrato de quercetina e das soluções 80:20 de metanol e éter etílico de amostra ibérica e amostra brasileira. No caso da solução de hidrato de (+)-catequina e das soluções filtradas de amostra ibérica e amostra brasileira as condições experimentais usadas são iguais às descritas acima com a exceção do tempo de análise, intervalo de massas e gradiente. O tempo de análise de cada amostra foi de 25 min para cada modo de ionização e o intervalo de massas foi de 50-2000 m/z e 50-1000 m/z para o modo de ionização positivo e negativo, respetivamente. Quanto ao gradiente procedeu-se do seguinte modo: início da injeção 70% de A e 30% de B, dos 0 aos 5 min 70% de A, dos 5 aos 15 min de 70% a 20% de A, dos 15 aos 25 min de 20% a 70% de A (Figura 37). Adicionalmente, obtiveram-se resultados nos comprimentos de onda do PDA de 200 a 700 nm enquanto os espetros de UV foram obtidos a 210 nm e 254 nm no canal A e B, respetivamente. Também se fez uma segunda análise de HPLC-MS das soluções filtradas de amostra ibérica e amostra brasileira nos modos de ionização positivo e negativo. Esta segunda análise foi feita com um gradiente diferente relativamente à análise das soluções filtradas descrita previamente, tendo-se procedido da seguinte maneira: início da injeção 90% de A e 10% de B, dos 0 aos 5 min 90% de A, dos 5 aos 15 min de 90% a 40% de A, dos 15 aos 25 min de 40% a 90% de A (Figura 38). 62 Figura 37: Gráfico da composição dos eluentes A e B em função do tempo de análise da solução de hidrato de (+)-catequina e das soluções filtradas de amostra ibérica e amostra brasileira. Figura 38: Gráfico da composição dos eluentes A e B em função do tempo de análise das soluções filtradas de amostra ibérica e amostra brasileira. Para a obtenção dos espetros de massa dos picos dos cromatogramas recorreu-se à utilização do espetrómetro de massa. A fonte de ionização utilizada foi o ESI em modo positivo e negativo e o analisador de massa foi a armadilha iónica linear. O método experimental aplicado para todas as análises de HPLC-MS seguiu as seguintes condições: voltagem da fonte de ionização a 5 kV, voltagem do capilar a 35 V, temperatura do capilar a 275℃ e voltagem da lente tubular a 110 V. Também se realizaram injeções diretas das amostras no espetrómetro de massa para se efetuar as análises de ESI-MS/MS. O fluxo de introdução foi de 10 µL/min, foram usadas energias de colisão que variaram entre 12 e 23 V e o intervalo de massas foi dos 50-2000 m/z. 63 A identificação dos compostos presentes nas amostras foi feita pela comparação dos padrões de fragmentação observados nos espetros de massa com os espetros das bibliotecas MassBank Europe, mzCloud e MassBank of North America. As probabilidades mencionadas na secção dos resultados são da compatibilidade dos espetros de massa das amostras com os espetros dos compostos da biblioteca mzCloud. A elucidação das possíveis estruturas dos fragmentos obtidos nos espetros de massa foi feita com recurso a pesquisa bibliográfica. O procedimento de HPLC-MS realizou-se da seguinte forma: 1) Em primeiro lugar é preciso preparar os eluentes A e B. Para tal introduzir 500 mL de água ultrapura e 500 mL de acetonitrilo em dois recipientes de vidro e colocá-los no sonicador. Esta etapa é necessária para desgaseificar os eluentes e impedir a formação de bolhas de ar. Manter o recipiente contendo água no banho de ultrassons durante 25 min, após este período, adicionar 1 mL de ácido acético glacial. Manter o recipiente contendo acetonitrilo no banho durante 20 min; 2) Após a preparação dos eluentes transferir, com o auxílio de pipetas de Pasteur, quantidade de solução de amostra suficiente para encher até metade o vial . Introduzir os vials no cromatógrafo; 3) Ligar o cromatógrafo e o respetivo software . Estabelecer os valores dos parâmetros necessários e iniciar a análise. As injeções diretas das soluções de amostra ibérica e amostra brasileira no espetrómetro de massa para se efetuar as análises de ESI-MS/MS ocorreram do seguinte modo: 1) Ligar o espetrómetro de massa e o respetivo software . Selecionar o programa Default_ESI existente no software. Deste modo, os valores dos parâmetros experimentais necessários já ficam estabelecidos; 2) Retirar 500 µL de solução com a seringa. Conectar a ponta da seringa ao capilar do espetrómetro. Ligar a bomba para iniciar a análise; 3) Após a obtenção do espetro total da amostra é possível obter o espetro de massa de certos iões de interesse e analisar os seus padrões de fragmentação. Para tal é necessário fazer um tune do ião de interesse (ião “parental”). Em maior parte dos casos a realização do tune otimiza as condições experimentais através da mudança dos valores dos parâmetros estabelecidos inicialmente; 64 4) Após o tune escolher a energia de colisão necessária de modo a fragmentar o ião “parental” até este ter uma intensidade aproximada de 10%. Repetir este passo para fragmentar os iões “filhos” e obter os seus espetros de massa; 5) Entre análises de soluções diferentes passar 500 µL de metanol pelo equipamento. Esta etapa é necessária para não ocorrerem interferências nas análises. 4.3.2) GC-MS Uma vez que a colofónia corresponde à fração não volátil da goma e, sendo a pitch o resíduo refinado da colofónia este material é não volátil, foi necessário realizar a metilação das amostras antes da análise no sistema de cromatografia de modo a tornar os compostos presentes nas amostras mais voláteis, permitindo a sua posterior separação e identificação. Adicionalmente, também se fez HSSPME/GC-MS e DI-SPME/GC-MS. É importante salientar que alguns meses após a realização do ensaio de cristalização observouse a formação de cristais no tubo contendo a solução 70:30 de pitch brasileira e acetona (Figura 39). Estes cristais também foram analisados por HS-SPME/GC-MS, GC-MS precedido por uma etapa de metilação e por FTIR-ATR e RMN. Figura 39: Fotografia dos cristais de pitch brasileira. 65 4.3.2.1) Material, equipamento e reagentes Tabela 8: Materiais e equipamentos utilizados nas análises de HS-SPME/GC-MS e DI-SPME/GC-MS e respetivas marcas e incertezas. Material/Equipamento Marca Incerteza Espátulas SELECTA _ Cromatógrafo Varian 450-GC _ Espetrómetro de massa Varian 4000 performance _ Vials de 10 mL ALWSCI Technologies _ Placa de aquecimento SELECTA AGIMATIC-E _ Agitador magnético Thermo Fisher Scientific _ Termómetro Quickfit MF31/0/250 _ Suporte, garras e noz SELECTA _ Recipiente de vidro SIMAX _ Holder SUPELCO _ Fibras de PDMS de 7 µm e 100 µm com núcleos de sílica fundida/SS SUPELCO _ Tabela 9: Materiais e equipamentos utilizados nas análises de GC-MS precedida pela etapa de metilação e respetivas marcas e incertezas. Material/Equipamento Marca Incerteza Espátulas SELECTA _ Cromatógrafo Agilent Tecnologies 7820A _ Espetrómetro de massa Agilent Tecnologies 5977b _ Vials de 10 mL Agilent _ Balança analítica Mettler Toledo 0,0001 g Pipeta volumétrica de 5 mL Linex 0,03 Pipetas de Pasteur Labbox _ Seringa de 1 mL Agilent _ Todos reagentes utilizados nas análises de GC-MS precedida pela etapa de metilação são de grau analítico. 72 4.3.4.2) Método experimental Os espetros de RMN foram registados à temperatura ambiente num espetrómetro Bruker Avance III 400 (Figura 43), operando a 400 Hz e com um número médio de 45 varrimentos. Clorofórmio deuterado e dimetilsulfóxido deuterado (DMSO D6) foram utilizados como solventes e o padrão interno foi o TMS. Os desvios químicos surgem em ppm relativamente ao TMS (0 ppm). Figura 43: Fotografia do espetrómetro de RMN. O procedimento realizou-se do seguinte modo: 1) No caso de amostras sólidas pesar 5-10 mg de amostra num vial e, com o auxílio de uma micropipeta, adicionar ao vial 700 µL do solvente clorofórmio deuterado ou DMSO D6. Agitar o vial para ocorrer a dissolução da amostra; 2) No caso de amostras líquidas mergulhar a ponta da micropipeta na amostra e depois mergulhar a mesma ponta num vial contendo 700 µL do solvente e misturar; 3) Quando a amostra estiver dissolvida introduzir 700 µL da solução para um tubo de amostra de RMN; 4) Analisar o tubo no espetrómetro de RMN. 73 4.4) Avaliação da atividade antioxidante das frações insaponificáveis de pitch De modo a determinar se as amostras ibérica e brasileira possuem atividade antioxidante recorreu-se ao ensaio colorimétrico DPPH. 4.4.1) Material, equipamento e reagentes Tabela 14: Materiais e equipamentos utilizados no ensaio DPPH e respetivas marcas e incertezas. Material/Equipamento Marca Incerteza Balança analítica Mettler Toledo 0,1 mg Espátulas _ _ Pipetas de Pasteur _ _ Balão volumétrico de 50 mL _ _ Tubos Eppendorf _ _ Tubos Falcon _ _ Micropipetas de 10-100 µL e 100-1000 µL _ _ Microplaca de 96 poços _ _ Leitor de microplacas Molecular Devices SpectraMax Plus _ Os reagentes usados no ensaio DPPH são de grau analítico. Tabela 15: Nome, fórmula química, massa molar e número CAS dos reagentes utilizados no ensaio DPPH. 4.4.2) Método experimental 1) Preparar uma solução etanólica do radical DPPH a 0,4 mM. Para preparar esta solução pesa-se 19,7 mg do DPPH em pó num balão volumétrico de 50 mL e perfaz-se o volume com etanol a 100%. Manter esta solução no frigorifico envolta em papel alumínio quando não estiver em uso, de modo a reduzir a sua degradação induzida pela luz; Nome Fórmula química Massa molar (g/mol) CAS DPPH C18H12N5O6 394,32 1898-66-4 Etanol C2H6O 46,07 64-17-5 74 2) Transferir 200 µL da solução de DPPH para um poço de uma microplaca de 96 poços e medir a absorvância da solução no leitor de microplacas a um comprimento de onda de 517 nm. Esta solução vai dar uma absorvância de, aproximadamente, 3. Após a medição transferir a solução do balão para um tubo Falcon. Adicionar aos poucos etanol ao tubo e medir a absorvância até que esta seja de, aproximadamente, 1; 3) Preparar uma solução stock de amostra ibérica de 50 mg/mL através da pesagem de 25 mg de amostra para um tubo Eppendorf e adição de 500 µL de etanol. A partir desta solução preparar uma solução de trabalho de 15 mg/mL. Para preparar esta solução retira-se 150 µL, com o auxílio de uma micropipeta, da solução stock para outro tubo Eppendorf e adiciona-se 350 µL de etanol. Repetir esta etapa para a amostra brasileira; 4) É necessário preparar 5 soluções de concentrações diferentes para cada amostra (1; 0,5; 0,25; 0,125 e 0,0625 mg/mL). A preparação da solução de concentração de 1 mg/mL é feita através da diluição da solução de 15 mg/mL para um tubo Eppendorf. Considerando um volume final em cada tubo Eppendorf de 500 µL retirar 33,3 µL da solução de trabalho para o tubo e adicionar 466,7 µL de etanol para dar uma concentração de 1 mg/mL. Para preparar as restantes concentrações fazse diluições seriadas considerando sempre um volume final de 500 µL; 5) Na microplaca de 96 poços introduzir 10 µL de etanol para um poço e adicionar 140 µL da solução de DPPH com absorvância aproximada de 1 para fazer um volume final de 150 µL. Repetir este procedimento mais duas vezes. Estes 3 poços consistem no controlo; 6) Introduzir 10 µL de cada uma das soluções etanólicas de amostra contidas nos tubos Eppendorf para um poço e adicionar 140 µL da solução de DPPH com absorvância aproximada de 1 a cada um deles. Fazer 3 réplicas para cada concentração diferente de amostra; 7) Preparar 3 réplicas de brancos para cada concentração de amostra adicionando 10 µL de solução etanólica de amostra e 140 µL de etanol em poços da microplaca; 8) Incubar a microplaca à temperatura ambiente, sem agitação e protegida da luz, durante 1 h; 75 9) Após a incubação observar os poços da microplaca que contém amostras de pitch para verificar se ocorreram alterações colorimétricas, comparando a cor destes com a cor do controlo. Se não se observarem alterações deixar a microplaca incubar mais 15 min e fazer uma nova observação; 10) Caso se observe uma mudança de cor visível medir a absorvância dos poços no leitor de microplacas a 517 nm. Fazer nova medição 60 min depois da incubação. Após este período as amostras atingem a sua capacidade máxima de eliminação do radical DPPH, ou seja, estão num estado de equilíbrio ( steady state ). Usar os valores da absorvância inicial (Absi) e da absorvância registada no estado de equilíbrio (Absr) para calcular a percentagem do DPPHr de acordo com a equação 3. Figura 44: Representação esquemática das etapas 3-7 do procedimento experimental do ensaio DPPH. 4.5) Avaliação da atividade antibacteriana das frações insaponificáveis de pitch Para determinar se as amostras ibérica e brasileira possuem atividade antibacteriana recorreu-se ao método da microdiluição. O objetivo deste ensaio consistiu em avaliar se a pitch atrasava o crescimento das bactérias. A monitorização da absorvância foi feita num leitor de microplacas. Solução stock 50 mg/mL 1 mg/mL 0,5 mg/mL 0,25 mg/mL 0,125 mg/mL 0,0625 mg/mL 150 µL 33,3 µL 250 µL Solução de trabalho 15 mg/mL 250 µL 250 µL 250 µL Amostra ibérica Amostra brasileira 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H 1 mg/mL 0,5 mg/mL 0,25 mg/mL 0,125 mg/mL 0,0625 mg/mL Branco Controlo (Equação 3) %DPPHr = [(Absi − Absr) Absi]×100 76 4.5.1) Material, equipamento e reagentes Tabela 16: Materiais e equipamentos utilizados no ensaio da microdiluição e respetivas marcas e incertezas. Material/Equipamento Marca Incerteza Balança analítica Mettler Toledo 0,1 mg Espátulas _ _ Placas de Petri _ _ Leitor de microplacas Molecular Devices SpectraMax Plus _ Espetrofotómetro de luz visível _ _ Cuvetes _ _ Micropipetas de 10-100 µL e 100-1000 µL _ _ Microplaca de 96 poços _ _ Incubadora INFORS HT 0,1℃ Tubos Falcon de 15 mL e 50 mL _ _ O etanol usado neste ensaio foi de grau analítico. Tabela 17: Nome, fórmula química, massa molar e número CAS dos reagentes utilizados no ensaio da microdiluição. 4.5.2) Método experimental 1) Fazer um pré-inóculo de cada uma das 4 bactérias fitopatogénicas ( Xanthomonas arboricola, Xylophilus ampelinus, Pseudomonas syringae e Pectobacterium parmenteri ). Para tal inocular as estirpes em placas de Petri contendo meio de cultura LB sólido separadamente. Posteriormente, retirar uma colónia de cada uma das placas para tubos Falcon de 50 mL contendo 5 mL de meio LB líquido e incubar os 4 tubos durante a noite a 30℃ e 200 rpm; Nome Fórmula química Massa molar (g/mol) CAS Etanol C2H6O 46,07 64-17-5 Tween 80 C32H60O10 604,80 9005-65-6 Meio Luria Bertani (LB) _ _ _ 77 2) Aproximadamente 12 h depois, medir a absorvância dos pré-inóculos no espetrofotómetro de luz visível a um comprimento de onda de 600 nm. Em primeiro lugar definir o branco transferindo 1 mL de meio LB para uma cuvete e medindo a absorvância, posteriormente, transferir 1 ml de cada suspensão celular para novas cuvetes e medir as absorvâncias; 3) Após a medição proceder à diluição das 4 suspensões celulares de modo a darem uma absorvância de 0,1 (Absinóculo). Com o valor da absorvância obtida na etapa 2 (Abspré-inóculo) e considerando um volume final de 5 mL (Vf), recorrer à equação 4 para obter o volume a retirar de pré-inóculo (Vi). Transferir este volume para novos tubos Falcon de 50 mL estéreis e perfazer até ao volume final com meio LB. Estes 4 tubos consistem nos inóculos; 4) Incubar os 4 tubos Falcon durante, aproximadamente, 4 h a 30℃ e 200 rpm até que atinjam uma absorvância de 0,4. Este valor indica que que as bactérias estão na fase exponencial do seu crescimento; 5) Preparar uma solução stock de amostra ibérica de 80 mg/mL através da pesagem de 80 mg de amostra para um tubo Eppendorf. Adicionar 1 mL de etanol a 100% ao tubo. A partir desta solução preparar uma solução stock de 50 mg/mL através da transferência de 625 µL da solução de 80 mg/mL para um tubo Eppendorf, com o auxílio de uma micropipeta, e a adição de 375 µL de Tween 80. A adição do emulsificante Tween 80 é necessária para garantir que a solução etanólica de pitch não precipite quando for adicionada ao meio LB aquoso das suspensões celulares. Repetir esta etapa para a amostra brasileira; 6) A partir das soluções stock de 50 mg/mL de amostra ibérica e amostra brasileira preparadas previamente preparar duas soluções de concentração 1 mg/mL. A preparação desta solução é feita através da diluição da solução de 50 mg/mL para um tubo Eppendorf. Considerando um volume final em cada tubo Eppendorf de 3 mL retirar 60 µL da solução stock para o tubo e adicionar 2,94 mL de etanol para dar uma concentração final de 1 mg/mL; (Equação 4) Abspré-inóculo x Vi = Absinóculo x Vf 78 7) Inocular cada uma das bactérias com as duas soluções de pitch a 1 mg/mL. Para tal transferir 2,94 mL de cada uma das 4 suspensões celulares com absorvância aproximada de 0,4 para tubos Falcon de 15 mL e adicionar 60 µL das soluções de pitch a 1 mg/mL para dar um volume final de 3 mL em cada tubo; 8) Transferir 30 µL de etanol e 30 µL de Tween 80 para um tubo Falcon de 15 mL. Adicionar 2,94 mL das suspensões celulares com absorvância aproximada de 0,4 ao tubo. Estes 4 tubos consistem nos controlos do solvente; 9) Transferir 2,94 mL das suspensões celulares para tubos Falcon de 15 mL e acrescentar 60 µL de meio LB. Estes 4 tubos consistem nos controlos do meio; 10) Incubar os 16 tubos Falcon de 15 mL previamente preparados a 30℃ e 200 rpm durante 1 h; 11) Ao fim do tempo de incubação retirar 150 µL de cada tubo para poços de uma microplaca de 96 poços. Fazer 3 réplicas para cada condição; 12) Adicionar 150 µL de meio LB num poço. Este poço consiste no branco do meio. Preparar brancos das duas soluções de pitch . Considerando um volume final em cada poço de 150 µL e para dar uma concentração final de pitch de 1 mg/mL transferir 3 µL da solução stock de amostra ibérica de 50 mg/mL para um poço e adicionar 147 µL de meio LB. Repetir este passo para a amostra brasileira. Fazer 3 réplicas para cada branco; 13) Após a preparação da microplaca introduzir os 16 tubos de volta à incubadora. Proceder à leitura da absorvância a 600 nm de cada um dos poços com o leitor de microplacas e registar os valores; 14) Repetir as etapas 11, 13 e 14 ao fim de 3, 4, 5 e 6 h de incubação dos tubos Falcon; 15) Utilizar os valores da absorvância dos poços contendo amostra inoculada com bactérias e os poços dos controlos para elaborar curvas do crescimento bacteriano ao longo do tempo de incubação. 79 Figura 45: Representação esquemática do procedimento experimental do ensaio da microdiluição. Inóculos (absorvância a 0,4) Incubação a 30℃ e 200 rpm durante 4 h X. arboricola X. ampelinus P. syringae P. parmenteri 2,94 mL Amostra ibérica Amostra brasileira 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H Leitor de microplacas Incubação a 30℃ e 200 rpm Culturas de bactérias fitopatogénicas Incubação a 30℃ e 200 rpm durante 12 h Pré-inóculos Inóculos (absorvância a 0,1) Leitura da absorvância a 600 nm Soluções de pitch inoculadas Controlos do meio Controlos do solvente Diluição dos pré-inóculos 1 h, 3 h, 4 h, 5 h e 6 h Pitch 1 mg/mL + X. arboricola Pitch 1 mg/mL + X. ampelinus Pitch 1 mg/mL + P. syringae Pitch 1 mg/mL + P. parmenteri Branco do meio LB Branco da pitch Controlo do meio da X. arboricola Controlo do meio da X. ampelinus Controlo do meio da P. syringae Controlo do meio da P. parmenteri Controlo do solvente da X. arboricola Controlo do solvente da X. ampelinus Controlo do solvente da P. syringae Controlo do solvente da P. parmenteri 80 Capítulo 5. Apresentação e discussão de resultados 81 Neste capítulo são apresentados os resultados experimentais obtidos ao longo do trabalho laboratorial e encontra-se dividido em quatro subcapítulos principais. O primeiro subcapítulo engloba os resultados das análises da qualidade das amostras de pitch , o segundo é dedicado aos resultados da caracterização dos compostos neutros presentes nas frações insaponificáveis de pitch por ESI-MS/MS, HPLC-MS, GC-MS, FTIR-ATR e RMN e nos cristais de pitch brasileira por GC-MS, FTIR-ATR e RMN, o terceiro aborda os resultados da avaliação da atividade antioxidante das frações insaponificáveis de pitch e o quarto é dedicado aos resultados da atividade antibacteriana das frações insaponificáveis de pitch. 5.1) Análises da qualidade de amostras de pitch Na Tabela 18 estão representados os resultados das análises da qualidade obtidos para as amostras de pitch ibérica e pitch brasileira. Tabela 18: Valores dos parâmetros de controlo da qualidade obtidos para as amostras de pitch ibérica e pitch brasileira. Parâmetros de controlo de qualidade Pitch ibérica Pitch brasileira Índice de acidez 130,9 mg KOH/g 147,7 mg KOH/g Cor da escala de Gardner 13/14 11/12 Viscosidade (140℃) 7330 cP 1065 cP Cristalização Não cristalizou Não cristalizou Ponto de amolecimento 112,1℃ 99,0℃ Ponto de turvação 199,1℃ 190,3℃ Verificou-se que a amostra de pitch ibérica apresenta um índice de acidez inferior ao da pitch brasileira. Isto indica que a amostra de pitch ibérica possui uma menor quantidade de ácidos resínicos na sua composição, ou seja, apresenta uma maior quantidade de compostos neutros relativamente à amostra de pitch brasileira. Segundo a escala de Gardner ambas as amostras apresentam cores escuras, sendo que a pitch brasileira apresenta uma cor ligeiramente mais clara em comparação com a pitch ibérica. A cor escura da pitch poderá dever-se à presença de lignina – a principal fonte renovável de compostos fenólicos – e outros compostos que são fontes de compostos fenólicos. Isto poderá indicar presença de compostos fenólicos nas duas amostras de pitch . 88 Figura 50: Espetros de massa no modo negativo do A) ião 301 e do seu B) ião “filho” 151 da solução filtrada de amostra ibérica. PITCHIBERFILT neg 301_220502154534 #1RT: 0.00 AV: 1NL: 1.77E2 T: ITMS - c ESI Full ms2 [email protected] [80.00-350.00] 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 220.18 178.95 283.26 150.93 257.12 273.18 205.10 286.20 233.20 271.29 255.14 213.10 241.12 192.95 301.26107.01 136.11 120.91 161.24 A B PITCHIBERFILT neg 301 ms151_220502160156 #4-141 RT: 0.02-0.76 AV: 138 NL: 3.64E1 T: ITMS - c ESI Full ms3 [email protected] [email protected] [50.00-200.00] 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 106.96 150.99 82.95 64.93 89 Figura 51: Esquema da proposta de fragmentação do ácido abiético. Constatou-se que não há presença de ácido palmítico na pitch. Analisando o cromatograma do ácido palmítico observa-se um pico bem definido no modo negativo a 14,4 min correspondente a um pico do ião com m/z = 255, o pico M-1 deste composto. No entanto, o pico do ião com m/z = 255 não aparece nos cromatogramas da amostra ibérica e da amostra brasileira. Além disso, não se observou um pico do ião com m/z = 257 no modo positivo nos cromatogramas deste padrão e das amostras. O cromatograma do ácido oleico apresenta um pico do ião com m/z = 281 bem definido no modo negativo, o pico M-1 do ácido oleico, a 15,3 min. Este pico não aparece na amostra ibérica nem na amostra brasileira, mas no modo positivo a 15,2 min no cromatograma da amostra brasileira e do ácido oleico observa-se alguns iões em comum nos espetros de massa desses picos tais como, 686, 728, 962, 1391 e 1432 (Figuras 103.A e 103.B do Anexo C.2). Estes iões podem dever-se a reações de adição e polimerização do ácido oleico que ocorreram graças à voltagem elevada da fonte de ionização m/z = 205 m/z = 301 m/z = 273 m/z = 220 m/z = 179 m/z = 283 m/z = 257 - 18 m/z - H2O - 28 m/z - C2H4 - 81 m/z - C6H9 - 26 m/z - C2H2 - 16 m/z - CH4 - 41 m/z - C3H5 - 68 m/z - C5H8 m/z = 241 90 do espetrómetro de massa. O espetro de massa do ião 283 da solução filtrada de amostra brasileira mostra dois iões “filhos” característicos do ácido oleico, o 265 e 241 (Figura 52) e alguns dos iões existentes no espetro podem ser explicados por determinadas fragmentações do ácido oleico (Figura 53). Além disso, com recurso ao software da mzCloud, determinou-se que o ácido oleico tem uma probabilidade de 88% de ter dado origem ao espetro do ião 283. Tendo em consideração estes resultados o ácido oleico aparenta estar presente apenas na amostra brasileira. Por sua vez, o cromatograma do acetato de linalilo não apresenta os picos M-1 e M+1 mas, no modo negativo a, aproximadamente, 0,8 min no cromatograma da amostra ibérica e do acetato de linalilo observa-se alguns iões em comum nos espetros de massa desses picos tais como, 223, 387, 633, 715 e 961 (Figuras 103.C e 103.D). Tal como no caso do ácido oleico estes iões podem dever-se a reações de adição e polimerização do acetato de linalilo. Além disso, constatou-se que, ao fazer injeções diretas deste padrão no espetrómetro de massa, o padrão de fragmentação do ião 195 (M-1) deste padrão é muito semelhante ao padrão de fragmentação do ião 195 da solução filtrada de amostra ibérica (Figura 52.B). O espetro de massa da amostra mostra iões “filhos” característicos do acetato de linalilo, nomeadamente, 177, 167, 153, 151 e 137. As possíveis estruturas químicas do acetato de linalilo que podem ter originado alguns destes iões estão presentes na Figura 54. Considerando estes resultados acetato de linalilo aparenta estar presente apenas na amostra ibérica. PITCHBRASFILT pos 283_220505102558 #1RT: 0.00 AV: 1NL: 2.40E2 T: ITMS + c ESI Full ms2 [email protected] [75.00-300.00] 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 265.22 247.27 223.18 241.19 225.13 145.06 255.27 268.19199.16 239.16 273.80 209.26 149.15 183.20173.15 159.15 133.19 283.19 123.05 97.14 105.02 82.99 291.82 A 91 Figura 52: Espetros de massa no A) modo positivo do ião 283 da solução filtrada de amostra brasileira e no B) modo negativo do ião 195 da solução filtrada de amostra ibérica. Como se pode ver na Figura 55.C os dois picos do ião com m/z = 318 (M+1) do 2-amino1,3,4-octadecanotriol surgem no intervalo de tempo 0,5-2 min. Os tempos de retenção dos picos do ião 318 nos cromatogramas das duas amostras de pitch surgem neste intervalo de tempo de retenção a 1,1 e 0,7 min para a amostra ibérica e brasileira, respetivamente (Figura 55.A e 55.B). Conclui-se, assim, que o composto 2-amino-1,3,4-octadecanotriol está presente em ambas as amostras. Com recurso ao software da mzCloud, determinou-se que este composto tem uma probabilidade de 54% de ter dado origem ao espetro do ião 318. O espetro de massa do ião 318 no modo positivo da solução filtrada de amostra ibérica e o esquema da proposta de fragmentação do 2-amino-1,3,4-octadecanotriol estão apresentados na Figura 56 e Figura 57, respetivamente. PITCHIBERFILT neg 195_220505143447 #1RT: 0.00 AV: 1NL: 6.77E1 T: ITMS - c ESI Full ms2 [email protected] [50.00-200.00] 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 151.09 135.94 167.05 162.99 177.09 152.98 123.04 137.01 195.14 128.89 180.13 96.91 108.08 B 92 Figura 53: Esquema da proposta de fragmentação do ácido oleico. Além das análises de HPLC-MS das soluções 80:20 de metanol e éter etílico da amostra ibérica e amostra brasileira também se fez análises de ESI-MS/MS destas soluções. Um dos iões analisados foi o 287 cujo espetro de massa está presente na Figura 58. O padrão de fragmentação deste ião foi comparado com os de compostos presentes nas bibliotecas de modo a descobrir o composto mais provável de ter dado origem a este espetro específico. Pensa-se que a cianidina dá o espetro de massa do ião 287 devido à probabilidade deste composto ter dado origem ao espetro do ião 287 ser de 67%. A proposta de fragmentação deste componente está esquematizada na Figura 59. Cianidina é um composto natural encontrado em plantas que possui atividade antioxidante e a sua presença foi previamente reportada em agulhas de Pinus spp..111 Este composto aparenta estar presente nas duas amostras de pitch . - CH4 - 18 amu - H2O - 28 amu - CH4O - 18 amu - H2O - 16 amu - C11H24 - 56 amu - C4H8 - 156 amu - C2H4 - 44 amu - CO2 - 26 amu - C9H16 - 124 amu m/z = 283 m/z = 265 m/z = 255 m/z = 239 m/z = 247 m/z = 199 m/z = 83 m/z = 183 m/z = 123 m/z = 97 - C2H2 93 Figura 54: Esquema da proposta de fragmentação do acetato de linalilo. A - CH3 - 15 amu - CH3 - 28 amu - C2H4 - 29 amu - C2H5 - 16 amu - 15 amu - C3H4 - 44 amu - C2H4O - 40 amu - C2H2O - 42 amu - CH4 m/z = 195 m/z = 180 m/z = 151 m/z = 97 m/z = 153 m/z = 137 m/z = 167 m/z = 123 m/z = 108 94 Figura 55: Cromatogramas extraídos para um m/z de 318 no modo positivo das soluções 80:20 de metanol e éter etílico da A) amostra ibérica, B) amostra brasileira e C) solução do padrão 2-amino-1,3,4octadecanotriol. Figura 56: Espetros de massa no modo positivo do ião 318 da solução filtrada de amostra ibérica. PITCHIBERFILT pos 318_220505162309 #1RT: 0.00 AV: 1NL: 3.04E1 T: ITMS + c ESI Full ms2 [email protected] [85.00-350.00] 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 300.26 309.14 272.30 226.28 258.22 276.37 314.43 255.37 288.24 199.32 147.09 262.32 236.30 244.28 214.17 173.25 184.50 134.95 159.23 208.10 131.15 318.28 95.97 124.20 108.05 B C 95 Figura 57: Esquema da proposta de fragmentação do 2-amino-1,3,4-octadecanotriol. m/z = 272 m/z = 184 - 73 amu - C3H5O2 - 18 amu - H2O - CH3 m/z = 318 m/z = 300 - 18 amu - H2O m/z = 288 - 30 amu - C2H6 m/z = 208 - 15 amu m/z = 226 - 32 amu - CH4O m/z = 258 - C3H6 - 42 amu m/z = 199 - 16 amu - NH2 - 60 amu m/z = 124 - C3H8O m/z = 108 m/z = 96 - 100 amu - C7H16 - 28 amu - C2H2 96 Figura 58: Espetros de massa no modo positivo do A) ião 287 e do seu B) ião “filho” 269 da solução 80:20 de metanol e éter etílico da amostra ibérica. PITCHIBER 100mg pos 287_220510141942 #1RT: 0.00 AV: 1NL: 2.81E2 T: ITMS + c ESI Full ms2 [email protected] [75.00-300.00] 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 269.32 241.21 227.17 135.04 229.20 259.25213.20 161.09 147.16 199.15 179.15 231.24 123.10 257.26 187.08 109.14 159.20 173.16 145.17 149.19 245.30217.22 286.45 251.31 107.14 272.22133.16 189.23 119.04 95.10 277.85 93.02 84.99 A B PITCHIBER 100mg pos 287 ms269_220510161723 #1RT: 0.00 AV: 1NL: 2.37E1 T: ITMS + c ESI Full ms3 [email protected] [email protected] [70.00-300.00] 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 213.25 227.28 199.15 241.25 185.20 254.35171.20 187.17 251.26 173.17 269.18 189.25157.12 147.21 209.10 175.13 105.30 133.11 238.85 135.16 131.14 108.99 97 Figura 59: Esquema da proposta de fragmentação da cianidina. A (+)-catequina é um dos monómeros de procianidinas poliméricas, sendo as procianidinas compostos fenólicos que estão amplamente distribuídas nas folhas, frutas e madeira de uma vasta variedade de plantas112, e observou-se perdas de massa de 288 e 152 nos espetros de massa de determinados iões precursores nas soluções de pitch que poderiam ser pertencentes a procianidinas poliméricas, sendo estas perdas características da perda de uma molécula de (+)-catequina e da clivagem retro-Diels-Alder do sistema do anel heterocíclico da (+)-catequina, respetivamente. Além disso, a (+)- catequina já foi encontrada em extratos vegetais de Pinus spp..108–110,113 Por estes motivos também se - 18 amu - H2O - 138 amu - C7H6O3 - C2H6 - CO - 28 amu - CH2O2 - 46 amu - 30 amu m/z = 287 m/z = 241 m/z = 269 m/z = 213 m/z = 187 m/z = 149 104 PITCHIBERFILT pos 181_220506145329 #1RT: 0.00 AV: 1NL: 5.50E1 T: ITMS + c ESI Full ms2 [email protected] [50.00-200.00] 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 163.06 148.95 166.09 171.94 135.02 123.11 153.17 139.15 173.38 181.05 160.66 109.01 133.09 99.05 145.04 119.11 93.07 81.11 F E PITCHBRASFILT pos 187 ms145_220509142609 #1RT: 0.00 AV: 1NL: 1.12E2 T: ITMS + c ESI Full ms3 [email protected] [email protected] [50.00-150.00] 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 117.02 105.03 130.09 145.15 91.12 128.15 105 Figura 63: Espetros de massa no modo positivo do A) ião 260, do seu B) ião “filho” 200, C) ião 171, D) ião 187 e do seu E) ião “filho” 145 da solução filtrada de amostra brasileira e do F) ião 181 e G) ião 269 da solução filtrada de amostra ibérica. Através da comparação dos padrões de fragmentação do ião 260 com os de compostos das bibliotecas pensa-se que o composto que dá este espetro de massa seja a ribalinina. A ribalinina é um composto natural encontrado em plantas e determinados fragmentos da sua estrutura podem dar origem aos iões existentes nos espetros das Figuras 63.A e 63.B. Este composto aparenta estar presente em ambas as amostras de pitch . Por sua vez, pensa-se que os compostos que dão os espetros de massa do ião 171 e do ião 187 sejam o 2-fenilfenol e a ficusina, respetivamente. A proposta de fragmentação destes componentes está esquematizada na Figura 65 e Figura 66. 2-fenilfenol e ficusina são metabolitos de plantas, sendo que foi reportado que o 2-fenilfenol possui atividade antifúngica. Ambos os compostos aparentam estar presentes nas duas amostras de pitch . G PITCHIBERFILT pos 269_220506145329 #1RT: 0.00 AV: 1NL: 8.83E2 T: ITMS + c ESI Full ms2 [email protected] [70.00-300.00] 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 227.15 213.16 161.12 251.17 209.10 185.16 199.13 187.16 241.36 135.08 173.11 183.06147.17 159.17 99.02 254.17 237.19 225.21 109.15 149.08 95.06 123.15 269.14 93.11 81.12 286.95 277.12 296.28 106 Figura 64: Esquema da proposta de fragmentação da ribalinina. Ácido cafeico e formononetina aparentam estar presentes nas duas amostras de pitch . Ácido cafeico pode originar o espetro de massa da Figura 63.F. A proposta de fragmentação deste componente está esquematizada na Figura 67. Alguns fragmentos da estrutura da formononetina podem dar origem aos iões existentes no espetro da Figura 63.G. Ácido cafeico e formononetina são metabolitos de plantas. O ácido cafeico apresenta atividade anti-inflamatória e antioxidante e a sua presença foi previamente reportada em extratos vegetais de Pinus spp..108,109 m/z = 200 - C2H4 - 18 amu - H2O - 60 amu - C2H4O2 - 60 amu - C3H8O - 28 amu - 28 amu - CO m/z = 260 m/z = 242 m/z = 182 m/z = 144 m/z = 172 107 Figura 65: Esquema da proposta de fragmentação do 2-fenilfenol. Figura 66: Esquema da proposta de fragmentação da ficusina. - 28 amu - C2H4 - 42 amu - 15 amu - CH3 - 28 amu - C2H2O - CO m/z = 171 m/z = 129 m/z = 143 m/z = 115 m/z = 156 - 28 amu - CO - 42 amu - C2H2O - C2H2O - C2O2 - 56 amu - 42 amu m/z = 187 m/z = 159 m/z = 145 m/z = 117 m/z = 131 108 Figura 67: Esquema da proposta de fragmentação do ácido cafeico. Figura 68: Esquema da proposta de fragmentação da formononetina. É importante notar que os picos dos cromatogramas das soluções filtradas da Figura 104 cujos espetros de massa mostravam o ião 181 estão incluídos no intervalo de 5,3-6,3 min em que se observa a banda larga e intensa dos espetros de UV do canal B mencionada previamente. O pico do cromatograma da solução filtrada de amostra brasileira a 5,43 min cujo espetro de massa mostra o ião - 18 amu - H2O - 32 amu - CH4O - 18 amu - H2O - C2H2 - 42 amu - CH2O2 - 26 amu - 46 amu - C2H2O m/z = 181 m/z = 163 m/z = 149 m/z = 145 m/z = 135 m/z = 109 m/z = 93 - 56 amu - C3H4O - 42 amu - C2H2O - 52 amu - C4H4 - H2O - 54 amu - 18 amu - C3H2O m/z = 269 m/z = 251 m/z = 161 m/z = 227 m/z = 213 m/z = 173 109 269 (Figura 107.B) está incluído no pico do espetro UV do canal B a 5,2 min desta solução (Figura 61.B). Como o ácido cafeico e a formononetina são compostos fenólicos e absorvem radiação UV a 254 nm, isto é uma indicação da possível presença destes compostos na pitch e dos mesmos estarem presentes em grandes quantidades. É também importante notar que no espetro de massa do pico a 6,37 min do cromatograma da solução filtrada de amostra brasileira da Figura 107.C observa-se o ião 197, que pode ser proveniente do acetato de linalilo. Através da observação do espetro de massa da Figura 107.C verifica-se a presença de iões cuja diferença de massa entre eles aparenta ser de 113, nomeadamente, os iões 906 e 793. Analisando estes iões por ESI-MS/MS verificou-se que, de facto, ocorrem perdas de massa consecutivas de 113, tendo-se notado o seguinte padrão de fragmentação: 1019, 906 e 793. Os espetros de massa dos iões 1019 e 793 estão representados na Figura 69. Perdas de 113 podem dever-se à perda simultânea de duas moléculas de água (18+18 amu) e de uma estrutura cíclica com seis carbonos (C6H5, 77 amu). Isto indica que poderá haver um composto de massa molar de 1018 na pitch que possua, pelo menos, duas unidades polifenólicas repetidas com massa equivalente a 113. PITCHBRASFILT pos 1019_220509163203 #1RT: 0.00 AV: 1NL: 3.34E2 T: ITMS + c ESI Full ms2 [email protected] [280.00-1050.00] 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 1001.03 887.91 774.74 906.00 661.73 548.62 1017.94 715.65 435.54 322.48 985.86 453.52 810.93 643.82341.55 566.66 968.30 756.79 869.80 311.60 529.49 417.79 1037.20 A 110 Figura 69: Espetros de massa no modo positivo do A) ião 1019 e B) ião 793 da solução filtrada de amostra brasileira. Nas Figuras 108 e 109 vê-se os espetros de massa no modo negativo dos picos observados nos cromatogramas da Figura 62. Alguns dos iões observados nesses espetros foram analisados por ESI-MS/MS, nomeadamente, os iões 387, 375, 337, 305, 223 e 141 (Figura 70). Muitos destes iões estavam presentes com elevada intensidade nos espetros de massa dos picos dos cromatogramas da Figura 105. Iões de maior m/z tais como, o 709, 469 e 425 não puderam ser analisados por ESIMS/MS devido ao sinal destes iões ser muito baixo. Ácido 13-oxo-9,11-tridecadienóico e ácido mussaenosídico aparentam estar presentes na pitch . Ácido 13-oxo-9,11-tridecadienóico pode originar os espetros de massa das Figuras 70.A e 70.B. A proposta de fragmentação deste componente está esquematizada na Figura 71. Vários fragmentos da estrutura do ácido mussaenosídico podem dar origem aos iões existentes nos espetros da Figura 70.C. Ácido 13-oxo-9,11-tridecadienóico é um ácido gordo de cadeia longa e o ácido mussaenosídico é um composto encontrado em plantas. B PITCHBRASFILT pos 793_220509163203 #1RT: 0.00 AV: 1NL: 2.95E3 T: ITMS + c ESI Full ms2 [email protected] [215.00-800.00] 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 774.81 661.72 548.60 792.86 435.47 322.33 679.75 566.68 453.57 584.84 341.42 471.50 756.88 228.22 643.68 358.52 530.51 417.54 720.53304.21 616.04256.37 111 B PITCHBRASFILT neg 223 ms179_220509103218 #1RT: 0.00 AV: 1NL: 2.28E1 T: ITMS - c ESI Full ms3 [email protected] [email protected] [50.00-200.00] 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 179.14 163.07 135.05 161.11 150.97 137.06 123.04 110.14 164.04 PITCHBRASFILT neg 223_220509103218 #1RT: 0.00 AV: 1NL: 2.49E2 T: ITMS - c ESI Full ms2 [email protected] [60.00-250.00] 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 179.04 195.04 205.04 151.04 180.98161.04 135.02 177.05 187.05 136.97 207.26 167.06 125.02 96.90 223.06139.02 111.09 A 112 PITCHBRASILFILT neg 375_220713141944 #139 RT: 0.63 AV: 1NL: 1.79E1 T: ITMS - c ESI Full ms2 [email protected] [100.00-400.00] 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 331.44 347.32 317.33 343.37 357.42 359.19 313.28 305.12 291.31 285.31 375.42 242.24 277.43255.26 165.22 237.39 C D PITCHBRASFILT neg 141_220509103218 #1RT: 0.00 AV: 1NL: 1.62E2 T: ITMS - c ESI Full ms2 [email protected] [50.00-150.00] 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 96.94 113.00 123.02 99.03 141.00 82.95 126.05 69.01 94.91 78.98 108.83 85.00 113 F PITCHIBERFILT neg 387_220712165458 #4-224 RT: 0.01-1.01 AV: 221 NL: 2.06E1 T: ITMS - c ESI Full ms2 [email protected] [105.00-400.00] 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 387.43 343.44 355.46 368.40 299.40 311.34 281.40 327.70 218.11 241.25 257.08186.26164.31 PITCHBRASFILT neg 337_220509103218 #1RT: 0.00 AV: 1NL: 2.74E1 T: ITMS - c ESI Full ms2 [email protected] [90.00-350.00] 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 319.30 293.23 275.21 291.24 309.18 277.25 239.21 337.25 305.16 223.12 251.17 265.26 279.25 261.22 322.25 221.13 179.24 126.92 E 120 Figura 76: Esquema da proposta de fragmentação da (+)-gallocatequina. Através da observação dos espetros de massa no modo de ionização positivo verifica-se a presença de alguns iões que não pertencem à pitch , nomeadamente, os iões 1041, 928, 815 e 702. Estes iões devem-se à existência de impurezas nas amostras, que resultaram dos filtros de membrana de nylon usados durante o processo de filtração à vácuo. Inclusive, alguns dos picos observados nos cromatogramas das Figuras 104 e 105 devem-se à presença destas impurezas nas soluções filtradas de amostra ibérica e amostra brasileira. - C2H2O - 44 amu - CO2 - 32 amu - CH4O - 100 amu - C5H8O2 - 42 amu - C5H2O - 30 amu - CH2O - H2O - 18 amu - 78 amu m/z = 305 m/z = 287 m/z = 273 m/z = 243 m/z = 201 m/z = 161 m/z = 83 m/z = 261 121 Figura 77: Espetros de massa no modo positivo do A) ião 529 e do seu B) ião “filho” 491 da solução filtrada de amostra brasileira. PITCHBRASFILT pos 529_220503155638 #1RT: 0.00 AV: 1NL: 7.71E3 T: ITMS + c ESI Full ms2 [email protected] [145.00-550.00] 150 200 250 300 350 400 450 500 550 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 293.93 520.23 350.50 237.28 529.60 407.08 491.41 463.67 284.91 472.36 378.40280.91 228.29 302.82 415.85 322.40 209.10 511.35 435.55 246.15 548.68 166.10 454.70 384.91 180.51 A D B D PITCHBRASFILT pos 529 ms491_220503162017 #1RT: 0.00 AV: 1NL: 4.17E2 T: ITMS + c ESI Full ms3 [email protected] [email protected] [135.00-550.00] 150 200 250 300 350 400 450 500 550 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 491.46 360.38 378.34 265.21 473.46 283.31 152.04 247.17 446.65 395.30 342.34316.48 122 Através da comparação dos padrões de fragmentação do ião 529 com os de compostos das bibliotecas pensa-se que o composto que dá este espetro de massa seja o metil (2 R )-2-(acetiloxi)-2- [(1 S ,3 S ,7 R ,8 R ,9 R ,12 S ,13 R )-13-(furan-3-il)-6,6,8,12-tetrametil-17-metilideno-5,15-dioxo-2,14dioxatetraciclo[7.7.1.01,12.03,8]heptadecan-7-il]acetato, um composto natural encontrado em plantas. Vários dos iões existentes na Figura 77 podem ser explicados por fragmentações deste composto (Figura 78). Nos espetros da Figura 111 vê-se com elevada intensidade o ião 301, que se deve à presença do ácido abiético. Os padrões de fragmentação dos iões 349 e 333 podem ser explicados pela fragmentação de andrografolida e (2 S ,3 S )-3,5,7-trihidroxi-6-metil-2-(3,4,5-trihidroxifenil)croman-4-ona, respetivamente (Figura 80 e Figura 81). Andrografolida é um metabolito de plantas com atividade anti-inflamatória e (2 S ,3 S )-3,5,7-trihidroxi-6-metil-2-(3,4,5-trihidroxifenil)croman-4-ona é um composto pertencente ao grupo das catequinas, que são conhecidos por terem atividade antioxidante. As análises de HPLC-MS e ESI-MS/MS das soluções 80:20 de metanol e éter etílico e soluções filtradas de amostra ibérica e amostra brasileira permitiram a confirmação da presença de ácido abiético, 2-amino-1,3,4-octadecanotriol, ácido oleico e acetato de linalilo na pitch e a provável identificação de outros 15 compostos. No total identificou-se 8 ácidos diferentes na composição da pitch , isto indica que o procedimento experimental utilizado para obter frações insaponificáveis da pitch não é completamente eficaz. Todos os compostos discutidos nesta secção estão representados na Tabela 19, onde é possível observar as suas massas molares e estruturas química. 123 Figura 78: Esquema da proposta de fragmentação do metil (2 R )-2-(acetiloxi)-2- [(1 S ,3 S ,7 R ,8 R ,9 R ,12 S ,13 R )-13-(furan-3-il)-6,6,8,12-tetrametil-17-metilideno-5,15-dioxo-2,14dioxatetraciclo[7.7.1.01,12.03,8]heptadecan-7-il]acetato. - 48 amu - C2H5 - H2O - 113 amu - C6H9O2 - 56 amu - C3H4O - 29 amu - C4H8 - CO - 18 amu - 28 amu - C13H28O5 - 264 amu - CH4O2 - 56 amu - C4H2O - 66 amu m/z = 529 m/z = 416 m/z = 360 m/z = 294 m/z = 265 m/z = 237 m/z = 473 m/z = 455 m/z = 407 m/z = 378 124 PITCHBRASFILT neg 349_220503114104 #1RT: 0.00 AV: 1NL: 1.78E2 T: ITMS - c ESI Full ms2 [email protected] [95.00-400.00] 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 319.33 317.21 331.28 299.22 287.22 235.19 223.15 269.29 263.22 277.23 251.21 207.18 149.29 349.40 112.96 165.08 189.08 136.93 PITCHBRASFILT neg 349 ms317_220503114104 #6-183 RT: 0.03-1.01 AV: 178 NL: 2.19E1 T: ITMS - c ESI Full ms3 [email protected] [email protected] [85.00-350.00] 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 299.27 273.25 255.28 275.26 317.27 289.07 233.01217.22 271.35253.32119.12 137.08 A D B D 125 Figura 79: Espetros de massa no modo negativo do A) ião 349, do seu B) ião “filho” 317, C) ião 333 e do seu D) ião “filho” 289 da solução filtrada de amostra brasileira. PITCHBRASFILT neg 333_220503114104 #1RT: 0.00 AV: 1NL: 2.47E2 T: ITMS - c ESI Full ms2 [email protected] [90.00-350.00] 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 315.29 289.20 271.22 287.27 303.21 301.21 275.27 263.15 245.16 247.17 219.14 235.14 193.18 201.16 228.98 177.08123.02 161.08 318.19151.04 333.33 108.88 PITCHBRASFILT neg 333 ms289_220503114104 #1RT: 0.00 AV: 1NL: 1.59E1 T: ITMS - c ESI Full ms3 [email protected] [email protected] [75.00-300.00] 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 289.21 271.33 245.18 205.18 261.12 274.31 259.31 193.12 217.10 C D D D 126 Figura 80: Esquema da proposta de fragmentação da andrografolida. m/z = 273 - 18 amu - H2O - 30 amu - CH2O - 32 amu - CH4O - 26 amu - C3H2O3 - 40 amu - C3H6O - 32 amu - C3H4 - 18 amu - CH4O - 58 amu - H2O - 86 amu - C2H2 m/z = 349 m/z = 331 m/z = 299 m/z = 255 m/z = 263 m/z = 223 m/z = 165 m/z = 319 m/z = 287 m/z = 235 - 52 amu - C4H4 127 Figura 81: Esquema da proposta de fragmentação do (2 S ,3 S )-3,5,7-trihidroxi-6-metil-2-(3,4,5trihidroxifenil)croman-4-ona. - 110 amu - CO - C2H2O - 18 amu - H2O - 30 amu - CH2O - 44 amu - C2H4O - 26 amu - 28 amu - C2H4O - 42 amu - 44 amu - C2H4O - 44 amu - C6H6O2 - C2H2 m/z = 333 m/z = 315 m/z = 271 m/z = 151 m/z = 289 m/z = 245 m/z = 219 m/z = 303 m/z = 261 m/z = 123 128 Tabela 19: Compostos identificados nas análises de ESI-MS/MS e HPLC-MS. Nome do composto Massa molar (g/mol) Estrutura química Ácido abiético 302,50 2-amino-1,3,4-octadecanotriol 317,50 Ácido oleico 282,50 Acetato de linalilo 196,29 Cianidina 287,24 Ácido 13-oxo-9,11-tridecadienóico 224,30 Ácido isocalolongico 388,50 129 Ácido mussaenosídico 376,36 (+)-Gallocatequina 306,27 Ribalinina 259,30 Ficusina 186,16 Ácido cafeico 180,16 2-fenilfenol 170,21 Formononetina 268,26 Ácido cis , cis -mucónico 142,11