Factores bioquímicos implicados en la degradación oxidativa de compuestos fenólicos durante el proceso de obtención del aceite de oliva virgen

Instituto de la Grasa Departamento de Fisiología y Tecnología de Productos Vegetales Universidad de Sevilla Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular FACTORES BIOQUÍMICOS IMPLICADOS EN LA DEGRADACIÓN OXIDATIVA DE COMPUESTOS FENÓLICOS DURANTE EL PROCESO DE OBTENCIÓN DEL ACEITE DE OLIVA VIRGEN Memoria que presenta Rosa María García Rodríguez para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla Fdo. Rosa María García Rodríguez Índice I I. INTRODUCCION………………………………………………………………………………..…1 I.1. EL OLIVO Y EL ACEITE DE OLIVA………………………………………………………….1 I.1.1. El cultivo del olivo…………………………………………………………………………....1 I.1.2. El aceite de oliva………………………………………………………………………………3 I.1.2.1. El proceso de elaboración del aceite de oliva………………………….………..…4 I.1.2.2. La clasificación del aceite de oliva………………………………..….…….………6 I.1.2.3. La composición del aceite de oliva virgen…………………………………………8 I.1.2.4. El aceite de oliva virgen y la salud humana……………………….………..……11 I.2. LOS COMPUESTOS FENÓLICOS Y LAS ENZIMAS OXIDO-REDUCTASAS………13 I.2.1. Los compuestos fenólicos en plantas……………………………………………....13 I.2.2. Los compuestos fenólicos en la aceituna y el aceite de oliva virgen…………..15 I.2.3. El metabolismo de los compuestos fenólicos: el papel de las enzimas óxido-reductasas……………………………………………………………………………21 I.3. LAS PROTEÍNAS PEROXIDASAS EN PLANTAS………………………………………..26 II. OBJETIVOS………………………………………………………………………………………..31 III. MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………………………………..32 III.1. MATERIAL BIOLÓGICO…………………………………………………………………...32 III.1.1 Frutos………………………………………………………………………………………...32 III.1.2. Aceites…………………………………………………..…………………………………..34 I.2.1. Ensayos tecnológicos…………………………………………………..……………..34 III.2. AISLAMIENTO Y MEDIDA DE ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS…………………..37 Índice II III.2.1. Obtención del extracto crudo a partir de polvo acetónico…………………………...37 III.2.2. Actividad peroxidasa……………………………………………………………………...37 III.2.2.1. Aislamiento de proteínas con actividad peroxidasa en semilla y pulpa de aceituna……………………………………………………………………………...37 III.2.2.2. Medida espectrofotométrica de la actividad peroxidasa……………..………38 III.2.2.3. Medida de la actividad peroxidasa por HPLC…………..…………………….39 III.2.3. Actividad polifenol oxidasa…………………………………………………..………….39 III.2.3.1. Extracción de proteínas con actividad polifenol oxidasa en semilla y pulpa de aceituna…………………………………………………………………………..39 III.2.3.2. Medida espectrofotométrica de la actividad polifenol oxidasa………………………………………………………………………………40 III.2.3.3. Medida de la actividad polifenol oxidasa por HPLC………………..………..41 III.2.4. Actividad β-glucosidasa…….………………………..…………………………………...42 III.2.4.1. Extracción de proteínas con actividad β-glucosidasa de pulpa y semilla de aceituna………………………………………………………………..42 III.2.4.2. Medida espectrofotométrica de la actividad β-glucosidasa………………….42 III.3. PURIFICACIÓN DE LA PEROXIDASA DE SEMILLA………………………………..43 III.3.1. Obtención del extracto crudo…………………………………………………………...43 III.3.2. Precipitación con sulfato amónico…………………………………………………..…44 III.3.3. Cromatografía de intercambio aniónico………………………………………………44 III.3.4. Cromatografía de intercambio catiónico……………………………………………...45 III.3.4.1. Determinación del peso molecular de las proteínas…………………………...46 III.3.4.1.1. Electroforesis de proteínas en condiciones desnaturalizantes……………………46 III.3.4.1.2. Tinción de los geles……………………………………………………………….47 III.4. CARACTERIZACIÓN DE LA PEROXIDASA DE SEMILLA…………………………..48 III.4.1. Especificidad y selectividad de sustrato………………………………………………..48 III.4.2. Determinación de parámetros cinéticos………………………………………………..49 Índice III III.4.3. Efecto del pH……………………………………………………………………………...49 III.4.4. Efecto de la temperatura………………………………………………………………...49 III.4.5. Efecto de la fuerza iónica………………………………………………….…………….50 III.4.6. Efecto de inhibidores de la oxidación…………………………………………………50 III.5. EXTRACCIÓN Y ANÁLISIS DE COMPUESTOS FENÓLICOS……………….……...50 III.5.1. Extracción de la fracción fenólica de aceite de oliva virgen…………………………50 III.5.2. Extracción de la fracción fenólica de pulpa y pasta de frutos de aceituna…………51 III.5.3. Extracción de la fracción fenólica de semilla…………………………………………..51 III.5.4. Purificación de demetiloleuropeína a partir de un extracto de fenoles de pulpa de aceituna……………………………………………………………………………………..52 III.5.5. Análisis de compuestos fenólicos mediante HPLC…………………………………...52 III.6. OTROS MÉTODOS ANALÍTICOS………………………………………………………..57 III.6.1. Determinación de proteínas……………………………………………………………...57 III.6.2. Análisis estadístico………………………………………………….…………………….57 III.7. REACTIVOS Y APARATOS………………………………………………………………..57 III.7.1. Reactivos…………………………………………………….……………………………...57 III.7.2. Aparatos…………………………………………………..………………………………...58 IV. RESULTADOS………………………………………………….……………………………….60 IV.1. ACTIVIDADES ÓXIDO-REDUCTASAS Y METABOLISMO DE COMPUESTOS FENOLICOS DURANTE LA MADURACIÓN DE LA ACEITUNA Y EL PROCESO DE EXTRACCION DEL ACEITE…………………………………………………………...60 IV.2. CONTRIBUCIÓN DE LA ACTIVIDAD PEROXIDASA A LA OXIDACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS DE ACEITUNA Y ACEITE DE OLIVA VIRGEN……68 IV.2.1. Extracción y medida de la actividad peroxidasa……………………………………....68 Índice IV IV.2.1.1. Extracción de proteínas con actividad peroxidasa……………………………68 IV.2.1.2. Optimización de la medida espectrofotométrica de la actividad peroxidasa………………………………………………………………………...69 IV.2.2. Distribución de la actividad peroxidasa en los distintos tejidos de la aceituna….72 IV.2.3. Evolución de la actividad peroxidasa durante la maduración de la aceituna……..73 IV.2.4. Actividad peroxidasa y oxidación de fenoles del olivo………………………………74 IV.2.3.1 POX y oxidación de compuestos fenólicos de la aceituna…………………..75 IV.2.3.2 POX y oxidación de compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen………77 IV.3. CONTRIBUCIÓN DE LA ACTIVIDAD POLIFENOL OXIDASA A LA OXIDACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS DURANTE EL PROCESO DE OBTENCIÓN DEL ACEITE DE OLIVA VIRGEN……………………………………………………………….82 IV.3.1. Extracción y medida de la actividad polifenol oxidasa………………………………82 IV.3.1.1. Extracción de proteínas con actividad polifenol oxidasa…………………….82 IV.3.1.2. Optimización de la medida espectrofotométrica de la actividad polifenol oxidasa…………………………………………….................................................83 IV.3.2. Distribución de la actividad polifenol oxidasa en los distintos tejidos de la aceituna……………………………………………………………………………………..86 IV.3.3. Evolución de la actividad polifenol oxidasa durante la maduración de la aceituna……………………………………………………………………………………..86 IV.3.4. Actividad polifenol oxidasa y oxidación de fenoles del olivo………………………88 IV.3.4.1. PPO y oxidación de compuestos fenólicos de la aceituna…………………….88 IV.3.4.2. PPO y oxidación de compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen……….94 IV.4. PURIFICACION y CARACTERIZACIÓN DE LAS PROTEINAS CON ACTIVIDAD POX EN SEMILLA DE ACEITUNA…………………………………………………..……97 IV.4.1. Purificación de proteínas con actividad peroxidasa en semilla de aceituna………97 IV.4.1.1. Obtención del extracto crudo…………………………………………………….97 IV.4.1.2. Precipitación con sulfato amónico………………………………………………98 Índice V IV.4.1.3. Cromatografía de intercambio aniónico………………………………………..99 IV.4.1.4. Cromatografía de intercambio catiónico……………………………………...100 IV.4.1.5. Electroforesis de proteínas en condiciones desnaturalizantes………….…...102 IV.4.2. Caracterización de las isoenzimas de peroxidasa de aceituna POXan y POXcat….103 IV.4.2.1. Especificidad de sustrato y selectividad de la enzima peroxidasa…………103 IV.4.2.2.1. Especificidad y selectividad de POXan y POX cat frente a los compuestos fenólicos de la aceituna………………………………………………………….104 IV.4.2.2.2. Especificidad y selectividad de POXan y POX cat frente a los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen………………………………………………109 IV.4.2.2. Determinación de parámetros cinéticos………………….……………………112 IV.4.2.3. Efecto del pH……………………………………………………………………...117 IV.4.2.4. Efecto de la temperatura………………………………………………………...118 IV.4.2.5. Efecto de la fuerza iónica………………………………………………………..121 IV.4.2.6. Efecto de los iones metálicos sobre la actividad peroxidasa………………..121 IV.4.2.6. Efecto de posibles inhibidores de la actividad oxidativa……………………122 IV.5. FACTORES BIOQUIMICOS QUE AFECTAN A LA OXIDACIÓN DE FENOLES CATALIZADA POR PEROXIDASA Y POLIFENOL OXIDASA DURANTE EL PROCESO DE OBTENCIÓN DEL ACEITE DE OLIVA VIRGEN……….……………..123 IV.5.1. Modificación de la temperatura y su efecto sobre el perfil fenólico del aceite de oliva virgen…………………………………………………………………………………124 IV.5.1.1. Modificación de las actividades POX y PPO durante la conservación postcosecha de la aceituna a diferentes temperaturas: efecto en el perfil fenólico del aceite…………………………………………………………………124 IV.5.1.1. Modificación de la temperatura durante la etapa de batido en el proceso de obtención del aceite de oliva virgen: efecto en el perfil fenólico del aceite…129 IV.5.2. Modulación de la actividad POX durante el proceso de obtención del aceite de oliva virgen y su efecto en el perfil fenólico del aceite……………………………….130 IV.5.2.1. Efecto de la adición de peroxidasa de rábano…………………………………130 Índice VI IV.5.2.2. Efecto de la adición de peroxidasa de aceituna……………………………….131 IV.5.2.3. Efecto de la adición de peróxido de hidrógeno…………………………….….136 IV.5.2.4. Efecto de la adición de azida sódica…………………………………………...138 IV.5.3. Modulación de la actividad PPO durante el proceso de obtención del aceite de oliva virgen y su efecto en el perfil fenólico del aceite……………………………….140 IV.5.3.1. Efecto de la adición de polifenol oxidasa de aceituna……………………….141 IV.5.3.2. Efecto de la adición de tropolona……………………….……………………...142 IV.5.4. Otros ensayos…………………………………………………..………………………….144 IV.5.4.1. Adición de lipoxigenasa…………………………………………………………144 IV.5.4.2. Adición de metabisulfito sódico y ácido cítrico……………………….……...145 IV.5.4.1. Adición de ácido ascórbico……………………………………………………...150 IV.5.4.2. Adición de ácido gálico y ácido oxálico……………………….………………150 V. DISCUSIÓN…………………………………………………..………………………………….152 VI. CONCLUSIONES…………………………………………………..…………………………..169 VII. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………..……………………………172 Introducción 7 a) Aceite de oliva virgen extra: Es el aceite de oliva de máxima calidad. Su acidez libre, expresada en ácido oleico, como máximo es 0,8%, no debe contener defectos y debe poseer un frutado superior a 0. b) Aceite de oliva virgen: Es un aceite de oliva de segunda categoría. Su acidez libre, expresada en ácido oleico, como máximo es 2%, puede contener defectos cuya mediana sea igual o inferior a 3.5 y debe poseer un frutado superior a 0. c) Aceite de oliva lampante: Su acidez libre, expresada en ácido oleico, es superior a 2%, contiene defectos cuya mediana superior a 3,5. A diferencia de los dos anteriores no se considera apto para el consumo humano y debe someterse a un proceso de refinado para rectificar sus defectos en el que pierde el olor, el color y el sabor. Para su comercialización es necesario mezclarlos con aceite de oliva virgen o virgen extra de acidez inferior al 1%. d) Aceite de oliva: Es el resultado se mezclar aceite de oliva refinado con aceite de olivar virgen o virgen extra. Su acidez libre, expresada en ácido oleico, es inferior al 1%. Además de los aceites de oliva vírgenes, aquéllos que se obtiene directamente de la aceituna, en las almazaras se pueden obtener otro tipo de aceite a partir de un subproducto: el orujo. e) Aceite de orujo de oliva crudo: Es el aceite obtenido a partir del orujo de oliva mediante tratamiento con disolvente o por medios físicos. No es apto para el consumo humano por lo que requiere refinado. f) Aceites de orujo de oliva refinado: Aceite obtenido mediante refinado de aceite de orujo de oliva crudo, cuya acidez libre, expresada en ácido oleico, no podrá ser superior al 0,3%. Éste tampoco es apto para el consumo humano. g) Aceite de orujo de oliva: Es el aceite constituido por una mezcla de aceite de orujo de oliva refinado y de aceites de oliva vírgenes distintos del lampante, cuya acidez libre, expresada en ácido oleico, no podrá ser superior al 1%. Introducción 8 I.1.2.3. La composición del aceite de oliva virgen El AOV está constituido principalmente por triglicéridos (≥98%) y mezclas complejas de componentes menores (∼2%) de naturaleza química muy diversa. Respecto a la composición de ácidos grasos, la principal diferencia entre el AOV y otros aceites es su alto contenido en ácido oleico, un ácido graso monoinsaturado que supone entre el 56% y 84% del contenido total de ácidos grasos, y la presencia de ácido linoleico (3-21%), un ácido poliinsaturado esencial en nuestra dieta. Bajo la denominación de componentes menores se engloban compuestos de muy diversa naturaleza como: compuestos volátiles, ácidos grasos libres, alcoholes terpénicos libres o esterificados con los ácidos grasos, esteroles, pigmentos (clorofilas y carotenoides), tocoferoles y compuestos fenólicos. Los compuestos fenólicos constituyen un grupo de especial interés dentro de los componentes minoritarios del AOV ya que son fundamentales en tres aspectos distintos. Desde el punto de vista nutricional confieren actividad antioxidante, desde el punto de vista tecnológico condicionan la estabilidad de los aceites y desde el punto de vista organoléptico son responsables del sabor amargo del AOV (Mateos et al., 2003). Compuestos volátiles Los compuestos volátiles responsables del aroma del AOV son componentes de naturaleza química muy diversa, aldehídos, cetonas, alcoholes y ésteres, entre otros, que están presentes en el aceite en muy bajas concentraciones. Algunos de los compuestos identificados en la fracción volátil del AOV están ya presentes en el tejido intacto de la aceituna, mientras que otros no aparecen, o se detectan sólo como trazas, dentro de las células del fruto (Montedoro et al., 1993), formándose rápidamente cuando se produce la rotura de la estructura celular (como ocurre durante el proceso de obtención de AOV), como resultado de reacciones enzimáticas en presencia de oxígeno. Dentro de este grupo de compuestos destacan los aldehídos y alcoholes de seis átomos de carbono, así como sus correspondientes ésteres volátiles que son los principales responsables de las notas aromáticas verdes características del AOV y cuyos precursores son los ácidos grasos linoleico y linolénico que son metabolizados a través de la ruta bioquímica de la lipoxigenasa (Olías et al., 1993). Sin embargo, además de estos compuestos volátiles, que podríamos clasificar como deseables, Introducción 9 existen una serie de compuestos que también se forman durante el procesado de la aceituna o durante la conservación del aceite que se identifican como notas aromáticas no deseadas y que son responsables de algunos defectos organolépticos de los aceites (Morales et al., 2005). El perfil de compuestos volátiles de un aceite está fuertemente condicionado por la variedad de aceituna y por su grado de maduración (Aparicio y Morales, 1998). Alcoholes alifáticos grasos Constituyen una clase importante de compuestos dentro de los componentes menores ya que se usan como criterio para la clasificación del aceite de oliva en las distintas categorías. Los principales alcoholes lineales presentes en el aceite de oliva son docosanol, tetracosanol, hexacosanol y octacosanol, mientras que los alcoholes con número impar de átomos de carbono se encuentran como trazas. El contenido total de alcoholes alifáticos no suele exceder de 350 mg/kg. Esteroles Los esteroles se clasifican en: fitoesteroles, alcoholes triterpénicos y metilesteroles. Están presentes en el intervalo de 1800-5000 mg/kg en el AOV (Mulinacci et al., 2005) y su contenido en el mismo permite, en ocasiones, identificar el origen geográfico y la variedad de las correspondientes aceitunas (Aparicio, 2000). También puede utilizarse como criterio de pureza del aceite. Pigmentos Las clorofilas y los carotenoides son los responsables del color del AOV. Los pigmentos clorofílicos son responsables del color verdoso del aceite, siendo las feofitinas (productos de oxidación de las clorofilas) los compuestos mayoritarios, mientras que los carotenoides son los que proporcionan el color amarillento al aceite. El carotenoide más abundante es la luteína, seguida del β-caroteno y las xantofilas. La cantidad de pigmentos en un aceite depende en gran medida de la variedad, grado de maduración de la aceituna, del sistema de obtención del aceite y de las condiciones de almacenamiento del mismo. Las pigmentos clorofílicos se cuantifican en el AOV en concentraciones de 10-30 mg/kg (Boskou, 2002) mientras que la concentración de los carotenoides no excede de 10 mg/kg (Boskou, 2002). Estos compuestos juegan un papel importante en la salud, en la trazabilidad del Introducción 10 alimento, en la autentificación y en la estabilidad oxidativa actuando como antioxidantes en condiciones de oscuridad y como prooxidantes en condiciones de luz. Tocoferoles Los α-, β-, γ- y δ-tocoferoles son fenoles lipofílicos y sólo los tres primeros se cuantifican en el AOV, siendo el α-tocoferol el más abundante, pudiendo estar presente en el intervalo de 12-400 mg/kg. Al igual que los pigmentos, los tocoferoles contribuyen a las propiedades antioxidantes del AOV y su perfil se usa con frecuencia como criterio de pureza. Ésteres no-glicéridos La mayor parte de los ácidos grasos presentes en el AOV se encuentran esterificados con el glicerol, como ya se ha mencionado anteriormente. Sin embargo, pequeñas cantidades de éstos forman ésteres con diferentes alcoholes como metanol, etanol y otros alcoholes de cadena larga y también con esteroles como β-sitoesterol, campesterol, estigmasterol y con alcoholes triterpénicos. La concentración total de este grupo de compuestos se encuentra entre 100-250 mg/kg. Hidrocarburos El principal hidrocarburo presente en el AOV es el escualeno, 1.250-7.500 mg/kg, y constituye alrededor del 50 % de la fracción insaponificable. Otros hidrocarburos (pentacosano, hexacosano, heptacosano, octacosano) se usan en la caracterización varietal y en el origen geográfico del aceite (Aparicio, 2000). El contenido total de hidrocarburos es de 1.500-8.000 mg/kg. Ceras Las ceras son ésteres de los ácidos grasos con alcoholes alifáticos de cadena larga y cuyo interés radica en que son indicadores tanto de la calidad como de la pureza de un AOV. El AOV se distingue del refinado y del aceite de orujo porque contiene alto contenido de ceras de 36 y 38 átomos de carbono y bajo contenido de ceras de 40, 42, 44 y 46 átomos de carbono, mientras que los otros aceites se caracterizan por una relación inversa. Fosfolípidos El contenido total de éstos está en el intervalo de 40-135 mg/kg. Estos compuestos pueden Introducción 11 afectar al estado fisicoquímico de aceites no filtrados y se consideran antioxidantes secundarios (Koidis y Boskou, 2006). Compuestos fenólicos Los compuestos fenólicos constituyen un grupo de especial interés dentro de los componentes menores del AOV ya que son fundamentales para las propiedades tanto nutricionales, como tecnológicas y organolépticas del AOV (Morales y Tsimidou, 2000). Los componentes mayoritarios de la fracción fenólica del AOV son los derivados secoiridoideos del hidroxitirosol y tirosol, formados a partir de dos glucósidos fenólicos presentes en la aceituna, la oleuropeina y el ligustrósido. Las características de estos compuestos se describen más ampliamente en el apartado I.2.2. I.1.2.4. El aceite de oliva virgen y la salud humana El AOV es la principal fuente de grasas de la dieta mediterránea (Boskou, 2000). El concepto de la dieta mediterránea, rica en vegetales, fruta, pescado y cereales, aflora en los años 50. Desde entonces han sido muchos los estudios epidemiológicos que demuestran que la incidencia de enfermedades coronarias y ciertos cánceres como el de mama, colon y próstata disminuye en aquellas regiones en las que se tienen estos hábitos alimenticios (Trichopoulou, 2004). En 1979, Keys et al., evidenciaron la relación existente entre la reducción del riesgo de padecer enfermedades coronarias con la dieta mediterránea a pesar de su alto contenido en grasa monoinsaturada; así como la disminución de sufrir cáncer, parkinson y alzheimer (Sofi, 2008). Los efectos beneficiosos del AOV se atribuyen a su peculiar perfil de ácidos grasos, con un alto contenido en ácido oleico, y a la presencia de componentes minoritarios entre los que destacan los compuestos fenólicos (Visioli, 1995). Ambas características lo distinguen de otros aceites vegetales (Boskou, 2000) y le proporcionan resistencia a la oxidación (Gutfinger, 1981) y un sabor muy peculiar. Estudios en animales han probado la fuerte actividad protectora del AOV contra la carcinogénesis, el carcinoma de colon y de mama (Fabiani, 2009), la protección contra el cáncer de piel inducido por la radiación UV (Ichihashi, 2000) y la reducción de la aparición de Introducción 12 tumores en el hígado en ratones (Thuy, 2001). También se ha comprobado que el consumo del aceite de oliva virgen con un alto contenido de fenoles reduce un 30% el daño oxidativo del ADN en mujeres durante la menopausia (Salvini, 2006). Según estudios in vivo, los compuestos fenólicos del AOV reducen el daño oxidativo de lípidos (Covas, 2006), la disfunción endotelial (Ruano, 2005), el perfil protrombótico (Ruano, 2007), y el estado inflamatorio (Fitó, 2008). Los compuestos orto-difenólicos presentes en la aceituna y en el AOV son los que parecen tener mayor actividad biológica. En este sentido, la contribución en la biosíntesis de tromboxano en células humanas fue evaluada por Petroni et al. (1995), así como la inhibición de la agregación plaquetaria, estudiada con hidroxitirosol posteriormente (Priora et al., 2008). Los estudios de Mann et al. (1999) demostraron que el hidroxitirosol reducía el daño oxidativo de los eritrocitos humanos, y poseía un efecto protector respecto al riesgo de padecer trombosis y al daño por aterosclerosis, sobre el que se investigó más adelante por González- Santiago et al. (2006). Además este compuesto también ejerce un papel protector frente al cáncer, induciendo la apoptosis de las células tumorales (Fabiani, et al., 2001), aumenta la resistencia de las células del cerebro a la oxidación (Schaffer, 2007) y mantiene su potencial antiinflamatorio (Bitler, 2005). La actividad antioxidante de la oleuropeína (principal glucósido fenólico presente en el fruto del olivo) ha sido también muy estudiada. Existen estudios in vivo de Briante et al. (2004) y Marsella et al. (2004) en los que se reporta la protección del LDL frente a Cu 2+ y la oxidación celular. Además la oleuropeína ha demostrado poseer actividad antioxidante ex vivo en el corazón de ratas (Manna et al., 2004); por otro lado, se ha visto su actividad antiinflamatoria in vitro (Carluccio et al., 2003) e in vivo (Miles et al., 2005; Puel et al., 2006) y su implicación en la reducción del riegos de padecer enfermedades cardiovasculares, efecto también observado para la aglucona de la oleuropeína que es uno de los compuestos mayoritarios del AOV (Dell’agli et al., 2006) . Aunque existen numerosos estudios científicos que apuntan que existe una relación directa entre el contenido fenólico y los efectos beneficiosos del AOV, para explorar y comprender el mecanismo de acción de estos compuestos y su papel en la prevención de Introducción 13 enfermedades y en la mejora de la salud humana, son necesarios amplios estudios de absorción, metabolismo, excreción, toxicidad, etc. En este sentido, y aunque los ensayos in vitro son de gran utilidad y proporcionan mucha información, parece evidente que se requieren más estudios in vivo. I.2. LOS COMPUESTOS FENÓLICOS Y LAS ENZIMAS OXIDO-REDUCTASAS I.2.1 Los compuestos fenólicos en plantas Los compuestos englobados bajo el término fenoles, poseen variadas estructuras químicas que en la mayoría de los casos contienen un grupo aromático con uno o más grupos –OH. Debido a la gran heterogeneidad de sus estructuras el término polifenoles no es el más adecuado para identificarlos y es preferible recurrir a una definición basada en su origen metabólico que describe a los fenoles de plantas como aquellas sustancias derivadas de la ruta del ácido shikímico y el metabolismo de los fenilpropanoides (Ryan et al., 2002) tal y como se recoge en el diagrama adjunto (Obied et al., 2008). Introducción 14 Figura 3. Diagrama resumen de la biosíntesis de compuestos fenólicos a partir de la ruta del ácido shikímico y del metabolismo de los fenilpropanoides (Obied et al., 2008). La biosíntesis de los compuestos fenólicos se inicia con la formación de ácido shikímico a partir de la glucólisis no oxidativa de la glucosa (Haslam, 1993) y a partir de él se desencadena una serie de reacciones en las que se sintetizan precursores de lignina y flavonoides. La ruta del ácido shikímico es la responsable de la formación de dos aminoácidos Metabolismo de los fenilpropanoides Ácido cinámico p-cumárico o-cumarato p-cumarato CoA GLUCÓLISIS Ácidos benzoicos Derivados del hidroxicinamato deoxilogánico Ácido Síntesis de terpenos Ácido mevalónico Escualeno Geraniol Esteroles Ácidos gálico y elágico Galotaninos y elagitaninos CUMARINAS FLAVONOIDES Taninos condensados Conjugados secoiridoideos FENOLES CPP Ácido shikímico Ruta del shikímico Eritrosa -4P Fosfoenolpiruvato Fenilalanina Introducción 15 aromáticos: fenilalanina y tirosina. La fenilalanina es el principal precursor de la mayoría de los compuestos fenólicos en las plantas superiores, siendo el sustrato inicial en el metabolismo de los fenilpropanoides. La enzima fenilalanina amonio liasa (PAL) tiene un papel clave en la biosíntesis de los fenilpropanoides catalizando, la eliminación estereoespecífica no oxidativa (Parr y Bolwell, 2000) de amonio a partir de la fenilalanina o la tirosina para dar transcinamato (Haslam, 1993). La ruta del ácido shikímico está básicamente restringida a los cloroplastos (Leuschner y Schultz, 1991), mientras que las enzimas relativas al metabolismo de los fenoles se localizan libres en el citoplasma, débilmente asociadas a la endomembrana citoplasmática o, en el caso de las hidrolasas, unidas a microsomas (Parr y Bolwell, 2000), por lo que debe existir un mecanismo para transportar los sustratos entre los distintos compartimentos (Fernández-Bolaños, 1995). Las rutas metabólicas son muy complejas, con múltiples caminos alternativos que varían significativamente de un tejido a otro, de unas condiciones de crecimiento a otras y en respuesta a distintos estímulos medioambientales. Los compuestos fenólicos se encuentran en todas las partes de la planta pero su naturaleza y concentración varía enormemente entre los distintos tejidos. Dentro de la célula, aunque algunos se localizan en las paredes celulares o en las cutículas extracelulares, la mayoría de los compuestos fenólicos se almacenan principalmente en las vacuolas (Hutzler, 1998; Subbotina, 1997; Bayliss, 1997). En la mayoría de los casos se almacenan como fenoles conjugados. La conjugación aumenta la solubilidad, de manera que podría potenciarse el transporte de los compuestos fenólicos a través de distintos compartimentos intracelulares (Damtoft et al., 1993). I.2.2. Los compuestos fenólicos en la aceituna y en el aceite de oliva virgen Los compuestos fenólicos más importantes en la aceituna y en el AOV son, como se ha mencionado con anterioridad, los compuestos secoiridoideos que son exclusivos de plantas de la familia Oleaceae a la que pertenece el olivo (Olea europaea L). Los secoiridoideos, que fueron identificados hace más de cincuenta años por Cantarelli et al., (1961) y Montedoro et al., (1969), son derivados de los iridoideos. Los compuestos iridoideos son monoterpenos que Introducción 16 poseen un anillo de seis carbonos fusionado con otro de cinco, siendo precisamente la apertura de este ciclopentano la que da lugar a la familia de los secoiridodeos. Los glucósidos fenólicos son los componentes importantes de la aceituna representando entre un 1-3% en peso de la pulpa fresca (Garrido, 1997). Los principales glucósidos secoiridoideos en la aceituna son la oleuropeína y el ligustrósido, cuyas agluconas son ésteres del ácido elenólico con hidroxitirosol y tirosol respectivamente (Soler-Rivas et al., 2000), la demetiloleuropeína y el nucénido (Garrido, 1997). Otros glucósidos fenólicos identificados en la aceituna son el verbascósido, un derivado del ácido hidroxicinámico (Andary, 1982; Servili, 1999), y ciertos glucósidos de flavonas como luteolin-7-glucósido y apigenin-7-glucósido (Ryan et al., 2002). La oleuropeína, demetiloleuropeína y verbascósido se encuentran en todas las partes constitutivas del fruto como la piel, la pulpa y la semilla; mientras que el nucénido únicamente se ha localizado en la semilla (Servili, 1999). En semilla, a pesar de que existen pocos estudios sobre la composición fenólica además del mencionado nucénido se ha identificado otro glucósido fenólico, el salidrósido (Maestro-Durán et al., 1994). Es importante destacar que aunque ninguno de estos glucósidos fenólicos está presente en el AOV, los principales compuestos fenólicos del aceite son compuestos derivados de la oleuropeína y del ligustrósido que se forman por hidrólisis de los anteriores durante el proceso de extracción del aceite (Angerosa et al., 1995; Montedoro et al., 1993). Una vez que los glucósidos fenólicos son liberados en la etapa de molturación del fruto durante el proceso mecánico de extracción del AOV (Vierhuis et al., 2001), se originan los compuestos secoiridoideos mayoritarios del aceite de oliva virgen, que son la forma aldehídica de la aglucona de la oleuropeína (FAAO) y la forma dialdehídica de la aglucona de la oleuropeína descarboximetilada (FDAO), identificados por Montedoro et al., (1992) y junto a estos compuestos se encuentran los correspondientes derivados del ligustrósido: la forma aldehídica de la aglucona del ligustrósido (FAAL) y la forma dialdehídica de la aglucona del ligustrósido descarboximetilado (FDAL), los cuales también se encuentran en cantidades elevadas. Además de estos derivados secoiridoideos existen fenoles simples como el hidroxitirosol y el tirosol (que también se encuentran en el fruto) que están presentes en los aceites frescos en bajas concentraciones pero cuyos niveles van incrementándose a medida Introducción 23 Figura 5. Mecanismo propuesto de formación y degradación de compuestos secoiridoideos en el AOV (modificado de Mateos et al., 2002). O COOMe OGlu O O HO R 1 OH HO R1 -glucosidasa O COOH OGlu O O HO R1 O O HO R1 O O COOMe O O HO R1 O O R1= OH Oleuropeína R1= H Ligustrósido O R2 OH O O HO R1 R1= OH HTy R1= H Ty R1= OH R2= COOMe R1= H R2= COOMe R1= OH R2= COOH R1= H R2= COOH R1= OH DAOD R1= H DALD R1= OH AAO R1= H AAL hidrólisis isomerización - CO2 R1= OH Demetiloleuropeína isomerización Compuestos fenólicos oxidados β-GLU POX PPO FDAO FDAL FAAO FAAL Introducción 24 Las enzimas endógenas de la aceituna tienen un papel fundamental durante la molturación de los frutos y el batido de las pastas durante el proceso de obtención del AOV ya que degradan los compuestos fenólicos del aceite (Servili et al., 2008). Además de los radicales libre, los principales agentes oxidativos de los fenoles en plantas son las enzimas óxido-reductasas POX y PPO como se ha comentado anteriormente. Además, la influencia de estas enzimas óxido-reductasas se corroboró, en base a estudios con atmósferas modificadas sobre las pastas que promovieron la reducción del contenido de o-difenoles en los aceites (García et al., 2001). Estudios recientes han permitido establecer una correlación directa con el contenido final de los compuestos fenólicos y las actividades óxido-reductasas en función de la disponibilidad de O 2 y de la estabilidad térmica que presentan éstas al emplear diferentes temperaturas en la etapa de batido durante el proceso de obtención del AOV (Taticchi et al., 2013). La PPO es la principal enzima implicada en la oxidación de fenoles, tanto en procesos fisiológicos asociados a la maduración como en procesos inducidos por cualquier forma de manipulación del fruto que implique daño o rotura de tejidos (Pourcel, 2006). En la oxidación de fenoles por PPO hay dos tipos de reacciones implicadas: la primera consiste en la hidroxilación de monofenoles para formar o-difenoles (EC 1.14.18.1) y la segunda en la oxidación de orto- y para-difenoles hasta las quinonas correspondientes (EC 1.10.3.1) (García- Molina et al., 2007) como se observa en la Figura 6. Posteriormente, una vez que se han formados las quinonas, éstas pueden reaccionar con proteínas o seguir reaccionando entre sí y formando polímeros (Spencer et al., 1988). Introducción 25 Figura 6. Esquema de las reacciones de oxidación producidas por la enzima PPO. Numerosos estudios han demostrado que la PPO de aceituna exhibe principalmente la actividad difenolasa (catecol oxidasa). Estas reacciones de oxidación han sido estudiadas en varios sistemas modelo pero no se ha podido profundizar en la caracterización de PPO en plantas debido a la complejidad de las reacciones acopladas a las quinonas, que son productos primarios de oxidación muy inestables y que pueden reaccionar a su vez con otros compuestos, fenólicos o no (Falguera, 2010). Así, es conocido que algunos fenoles de plantas no son oxidados directamente por PPO pero sí por reacciones secundarias de ésta (Pourcel et al., 2006). La contribución de la POX a la oxidación de fenoles está limitada por la disponibilidad de H 2 O 2 , cosustrato imprescindible de la reacción. Sin embargo, se ha demostrado que hay una contribución importante de la POX al pardeamiento enzimático iniciado por la PPO en productos vegetales, que se explicaría por el hecho de que las quinonas formadas por la PPO puedan ser sustrato de la POX (Cantos et al., 2002) y lo que es más importante porque la propia PPO genera H 2 O 2 en la oxidación de ciertos fenoles que serviría de cosustrato a la POX. En este sentido, diversos estudios, como los realizados en té y pera, demuestran que ciertas PPO de plantas generan H 2 O 2 durante la oxidación de la catequina en O2 Tirosinasa OH R R OH O2 Catecol oxidasa OH R R O O2 Lacasa OH R R O OH O O H O Pigmentos pardos OH Introducción 26 condiciones óptimas de pH (Jiang y Miles 1993; Richard-Forget y Gauillard, 1997), con lo cual estaríamos frente a un fenómeno de sinergia entre ambas óxido-reductasas. 3. LAS PROTEÍNAS PEROXIDASAS EN PLANTAS Las peroxidasas (EC. 1.11.1.X) son glicoproteínas con distribución ubicua en la naturaleza. Están producidas por un gran número de microorganismos, animales y plantas y catalizan una amplia variedad de reacciones en presencias de peróxidos. Se distinguen dos grandes grupos: las hemo-peroxidasas y las no hemo-peroxidasas tal y como está descrito en la base de datos PeroxiBase creada por Passardi et al., (2007). Dentro del primer grupo se incluyen las peroxidasas de organismos no animales que contiene a su vez tres subgrupos: la Clase I, que comprende las peroxidasas de procariotas y peroxidasas intracelulares de mitocondrias y cloroplastos como las citocromo c peroxidasas y las ascorbato peroxidasa; la Clase II, donde se engloban las peroxidasas extracelulares de hongos como la manganeso peroxidasa y la lignina peroxidasa; y la Clase III, que comprende las peroxidasas de plantas superiores (Passardi, 2005). La Clase III incluye tanto peroxidasas solubles como asociadas a membranas que suelen ser proteínas de cadena simple altamente glicosiladas. Las POX de plantas (EC. 1.11.1.7) son hemoproteínas que catalizan la oxidación dependiente de H 2 O 2 de una amplia variedad de sustratos, entre los que destacan los compuestos fenólicos, como ya se ha mencionado con anterioridad. Además, las peroxidasas de tipo III pueden catalizar la reducción de H 2 O 2 , captando electrones de otros compuestos tales como auxinas, metabolitos secundarios, precursores de lignina, etc. (Passardi, 2005). Las POX de plantas son miembros de una familia multigénica. Debido a su gran número de isoformas están involucradas en un gran número de procesos fisiológicos del ciclo de vida de las plantas. Están presentes desde los primeros momentos de la vida de la planta hasta el final ya que son enzimas clave en el control del crecimiento, en la diferenciación y el desarrollo de la planta: intervienen en procesos de lignificación (Wakamatsu y Takahama, 1993), en la defensa frente a daños en los tejidos o frente a infecciones (Biles y Martyn, 1993), generan especies reactivas de oxígeno, polimerizan compuestos de la pared celular, regulan Introducción 27 los niveles de agua oxigenada (Passardi, 2005), e intervienen en la respuesta a estrés (Veitch, 2004). Las POX de Clase III se localizan en las vacuolas y en la pared celular, son altamente resistentes a la temperatura (Almagro, 2009) y tienen una elevada capacidad de regeneración tras una inactivación térmica (Vámos-Vigýazó, 1981). Se han aislado tanto isoformas aniónicas como catiónicas de POX en frutas y hortalizas cuyos monómeros tienen un peso molecular que oscila entre 18 y 67 kDa. Las formas catalíticamente activas son muy variables, se han descrito desde formas monoméricas hasta tetraméricas, como es el caso de la POX de brócoli (Duarte-Vázquez, 2007) y la de vainilla (Márquez, 2008). Las múltiples formas de POX descritas y caracterizadas en plantas se diferencian en la función, el peso molecular, la estabilidad térmica, pH óptimo y la especificidad de sustrato (Sergio et al., 2007). Las POX tienen gran utilidad para el desarrollo de inmunoensayos, en la construcción de biosensores, en síntesis orgánica estereoespecífica (Day, 1990; Crowther, 2001; Colonna, 1999), como desintoxicadoras de suelos, intervienen en procesos de biorremediación, se emplean como decolorantes en la industria papelera, pueden utilizarse para determinar glucosa, alcoholes, glutamato, ácido úrico, colesterol, lactosa, entre otras (Hamid, 2009). Sin embargo, con frecuencia a las POX se le atribuyen connotaciones negativas dentro de la Tecnología de Alimentos ya que contribuyen al deterioro del flavor, color, textura y valor nutricional de los productos vegetales y de los alimentos producidos a partir de ellos (Fils, Sauvage y Nicolas, 1985). La POX de plantas más ampliamente estudiada es la POX de rábano. Concretamente la mejor caracterizada es la isoenzima C de la peroxidasa de raíz de rábano, HRP C, que está constituida por un polipéptido de 308 residuos aminoácidos y contiene dos centros metálicos diferentes, Fe(III) (integrado en el grupo hemo) y dos átomos de calcio, ambos necesarios para la estructura y la funcionalidad de la enzima. El grupo hemo está anclado en la enzima a través de la His170 y los dos átomos de calcio se encuentran unidos por puentes de hidrógeno al plano del grupo hemo en las posiciones distal y proximal (Veitch et al., 2004). Como se observa en la Figura 7, la estructura de la enzima se caracteriza por hélices-α a través de las Introducción 28 que se visualizan pequeñas regiones de láminas-β. También se pueden observar los dominios distal y proximal entre los que se localiza el grupo hemo, así como los átomos de calcio. Figura 7. Representación tridimensional de la estructura cristalina cuaternaria de HRP C caracterizada mediante difracción de rayos X por Welinder y Gajhede (1993). El mecanismo de actuación de la HRP C y otras peroxidasas en relación a su capacidad para oxidar compuestos fenólicos, se muestra en la Figura X. Introducción 29 Figura 8. Ciclo catalítico de HRP C para la oxidación del ácido ferúlico. Las constantes k1, k2 y k3 representan las velocidades de formación del compuesto 1, la reducción del compuesto 1 y la reducción del compuesto 2. El primer paso es la reacción entre H 2 O 2 y el Fe(III) del estado inicial de la enzima, y genera el compuesto 1, un intermedio con alto grado de oxidación que posee un centro oxoferril Fe(IV) y un catión radical de porfirina. Éste se comporta como un potente oxidante capaz de oxidar un sustrato (ácido ferúlico en el ejemplo de la Figura 8) liberando un radical y transformándose en el compuesto 2, que porta un centro Fe(IV) que de nuevo produce la oxidación de otra molécula de sustrato liberando al medio un segundo radical y restaurando el estado inicial de la enzima para comenzar un nuevo ciclo catalítico. La salida de dos radicales por cada ciclo puede producir un complejo perfil de productos de reacción. La mayoría de los productos formados son dímeros, los cuales reaccionar a su vez con un radical secundario en una reacción de acoplamiento (Aizawa y Kunugi, 1983). Además de los dímeros, también se podrían formar trímeros y oligómeros mayores, quinonas e Introducción 30 hidroquinonas derivadas del fenol en cuestión que podrían comportarse como nuevos sustratos susceptibles de oxidación. A pesar de que se presupone que la POX de aceituna pueda jugar un papel clave en la oxidación de compuestos fenólicos durante el proceso de obtención del AOV existen muy pocos datos acerca de la actividad de esta enzima en aceituna. En los primeros estudios realizados se detectó actividad POX en la pulpa de frutos en el estadio de envero (cambio de color) detectándose un incremento significativo de estos niveles a lo largo de la maduración (Garrido-Fernández et al., 1997). Posteriormente se ha descrito la purificación parcial de proteínas con actividad POX presentes en la pulpa de frutos maduros de la variedad Douro (Saraiva et al., 2007) y de la variedad Koroneiki (Tzika et al., 2009). En el primero de ellos se aislaron cuatro isoformas aniónicas y cuatro catiónicas, mientras que en la variedad Koroneiki se obtuvieron sólo dos isoformas. Más recientemente, en frutos de la variedad Hojiblanca, se ha descrito la posible implicación de la POX en la degradación de clorofilas a través de un mecanismo aún no completamente dilucidado (Vergara-Domínguez et al., 2013). En cualquier caso, ninguno de los estudios mencionados se han centrado en analizar las reacciones de oxidación de fenoles naturales del olivo catalizadas por POX. En resumen, los datos hasta ahora obtenidos acerca de las rutas bioquímicas implicadas en la calidad organoléptica, nutricional y tecnológica del AOV establecen una relación directa entre el contenido de los compuestos responsables de la calidad y la carga enzimática presente en los frutos. Pero es evidente que un conocimiento más profundo del modo de actuación de estas enzimas y de la regulación de los genes que las codifican, abriría posibilidades inmediatas de modulación de la calidad del AOV a través de la modificación de la tecnología de procesado a medio plazo mediante programas de mejora varietal y, a más largo plazo, si se revisa la actual normativa que regula el proceso de obtención del AOV, a través de actuaciones de tipo biotecnológico. Por ello, esta Tesis Doctoral se ha centrado en los objetivos que se presentan a continuación. Objetivos 31 OBJETIVOS Este trabajo se enmarca en un proyecto de Tesis Doctoral cuyo objetivo global es el estudio de los factores bioquímicos implicados en la degradación oxidativa de compuestos fenólicos durante el proceso de obtención del aceite de oliva virgen. Dicho objetivo global se articula en dos objetivos concretos: 1. Contribución de las actividades oxido-reductasas, POX y PPO, de aceituna a la composición fenólica del aceite de oliva. Influencia de factores tecnológicos. 2. Aislamiento, purificación y caracterización bioquímica de proteínas con actividad POX en aceituna. Materiales y Métodos 32 III.1. MATERIAL BIOLÓGICO III.1.1. Frutos Para el desarrollo de la mayor parte de este trabajo se han utilizado olivos (Olea europaea L.) de las variedades Picual y Arbequina. Los frutos de aceituna de dichas variedades se cosecharon en el olivar experimental del Instituto de la Grasa (CSIC), en Bellavista (Sevilla). En ambos casos los árboles fueron cultivados en régimen de regadío, con regado y fertilizado por goteo desde el momento de la floración hasta la maduración completa del fruto (abril – enero). Así mismo, en algunos ensayos se emplearon frutos de variedades pertenecientes a la Colección Nuclear de 36 genotipos del Banco Mundial de Olivo del IFAPA/UCO (Córdoba) previamente definida en el proyecto Oleagen. Para determinar con exactitud el estadio de desarrollo y maduración de los frutos, los árboles fueron marcados en la semana de floración y la edad de las aceitunas se determinó como semanas después de la floración (SDF). Paralelamente se utilizó el índice de maduración (IM), que en función del color de la piel y el mesocarpo de las aceitunas (Hermoso et al., 1991), permite establecer las siguientes categorías: - 0, aceitunas con epidermis verde intenso. - 1, aceitunas con epidermis amarilla o verde amarillento. - 2, aceitunas con epidermis amarillenta, con puntos o áreas rojizas. - 3, aceitunas con epidermis rojiza o violeta claro. - 4, aceitunas con epidermis negra y mesocarpo completamente blanco. - 5, aceitunas con epidermis negra y la mitad del mesocarpo violeta. - 6, aceitunas con epidermis negra y mesocarpo violeta casi en su totalidad. - 7, aceitunas con epidermis negra y mesocarpo completamente negro. Materiales y Métodos 39 III.2.2.3. Medida de la actividad peroxidasa por HPLC En este método de medida de actividad POX se sustituyó el sustrato colorimétrico guayacol por posibles sustratos naturales de la enzima en aceituna: compuestos fenólicos presentes en el fruto y compuestos fenólicos característicos del AOV, obtenidos según se detalla en el apartado III.5.1.-III.5.4. Medio de reacción: En la reacción de POX con fenoles de aceite se pusieron en contacto 90 µL de extracto fenólico de AOV concentrado en tampón fosfato sódico 25 mM pH 6,5, 2 mM H 2 O 2 , y 2-40 µL de extracto enzimático (EC, POX aniónica de semilla de aceituna, POX catiónica de semilla o POX comercial de rábano) en un volumen final de 100 µL. Los tiempos de incubación fueron 2, 5, 10, 20 y 30 min. Para la reacción de POX de polvo acetónico de semilla con fenoles de fruto se pusieron en contacto 90 µL de extracto fenólico en tampón fosfato sódico 25 mM pH 6,5, 2 mM H 2 O 2 y 2-40 µL de extracto enzimático (EC, POX an o POX cat de semilla o POX comercial de rábano) en un volumen final de 100 µL. Los tiempos de incubación fueron 2, 5, 10, 20 y 30 min. En ambos casos se hicieron blancos de las reacciones empleando enzima inactivada térmicamente además de blancos en los que se empleó extracto activo en ausencia de H 2 O 2 . La degradación oxidativa causada por la actividad POX sobre los distintos compuestos fenólicos se cuantificó mediante el análisis HPLC que se describe en el apartado III.5.5. III.2.3. Actividad polifenol oxidasa III.2.3.1. Extracción de proteínas con actividad polifenol oxidasa en semilla y pulpa de aceituna EL tampón empleado en la extracción de proteínas con actividad PPO fue tampón fosfato sódico 0,1 M pH 6,7, Tritón X-100 0,1 % (p/v), AEDT 1 mM, PMSF 0,1 mM, benzamidina 0,1 mM, ácido α-aminocaproico 5 mM, SDS 1mM (Tampón B). Materiales y Métodos 40 Para el aislamiento de la actividad enzimática PPO a partir de polvo acetónico de pulpa y semilla se partió de 0,25 g de dicho material al que se le añadieron 10 mL de tampón de extracción. La mezcla se homogeneizó en Ultra-Turrax con 3 pulsos de 1 minuto cada uno y posteriormente se centrifugó a 15.000 rpm durante 20 min. El sobrenadante, filtrado a través de Miracloth, constituyó el extracto crudo. Para la medida de PPO frente a los glucósidos fenólicos característicos del fruto, fue necesario realizar una purificación parcial de esta actividad enzimática debido a la interferencia que producía la presencia de actividad β-glucosidasa en el polvo acetónico de pulpa. Para ello, una vez que se obtuvo el extracto crudo, éste se fraccionó mediante precipitación con sulfato amónico, empleándose como extracto enzimático el precipitado proteico obtenido entre el 30-65% de saturación de esta sal que está prácticamente libre de actividad β-glucosidasa. III.2.3.2. Medida espectrofotométrica de la actividad polifenol oxidasa La actividad se cuantificó midiendo la absorbancia a 400 nm, longitud de onda a la que absorbe el compuesto formado por la oxidación del tert-butilcatecol (TBC) (Sigma) en presencia de proteínas con actividad PPO. Medio de reacción: La reacción se llevó a cabo en tampón fosfato sódico 25 mM pH 6,5, SDS 1mM, 7mM TBC con 2-10 µL de extracto enzimático en un volumen final de 1,5 mL. Esta mezcla se incuba directamente en la cubeta durante 1 min en paralelo a la incubación con extracto enzimático inactivado térmicamente. Una unidad de PPO se definió como la cantidad de enzima que cataliza la oxidación de 1 µmol de TBC por min. El coeficiente de extinción molar empleado para la quinona formada por oxidación del TBC es 1.200 M -1 ·cm -1 (García- Molina et al., 2007). Materiales y Métodos 41 III.2.3.3. Medida de la actividad polifenol oxidasa por HPLC En esta medida de actividad PPO se sustituyó el sustrato colorimétrico TBC por posibles sustratos naturales de la enzima en aceituna: compuestos fenólicos presentes en el fruto y compuestos fenólicos característicos del AOV, obtenidos según se detalla en el apartado III.5.1-III.5.4. Medio de reacción: En la reacción de PPO con fenoles de aceite se pusieron en contacto 120 µL de extracto fenólico de AOV concentrado en tampón fosfato sódico 25 mM pH 6,5, 1mM SDS, y 25 µL de extracto enzimático de polvo acetónico de pulpa de aceituna ó 0,5 µL de una disolución de PPO comercial de champiñón (Sigma) 2,5 mg/mL en un volumen final de 1 mL. Los tiempos de incubación fueron 2, 5, 10, 20, 30 y 40 min. Para la reacción de PPO de polvo acetónico de pulpa con fenoles de fruto se pusieron en contacto 90 µL de extracto fenólico de fruto en tampón fosfato sódico 25 mM pH 6,5, 5,7 µL de 1 mM de SDS, y 2 µL de extracto de PPO parcialmente purificado. En ambos casos se hicieron blancos de las reacciones empleando enzima inactivada térmicamente y la enzima activa en presencia de un inhibidor específico de la PPO, la tropolona (0,2 mM). Para estudiar la reacción de PPO comercial de rábano (5 mg/ml) con los fenoles de la aceituna se hizo reacionar 1 ml de una disolución 6,5 mM de oleuropeína en tampón fosfato sódico 25 mM, pH 6,5, 1mM SDS y 1 µL de la enzima. En la reacción de PPO de polvo acetónico de pulpa con los glucósidos de fruto oleuropeína y verbascósido, se pusieron en contacto 1 ml de una disolución de oleuropeína 1,2 mM y otra de verbascósido 1,2 mM en tampón fosfato sódico 25 mM pH 6,5, 1 mM SDS, con 50 µL de PPO de pulpa parcialmente purificada. TBC QuinonaTBC PPO Materiales y Métodos 42 III.2.4. Actividad β-glucosidasa III.2.4.1. Extracción de proteínas con actividad β-glucosidasa de pulpa y semilla de aceituna El tampón empleado en la extracción de proteínas con actividad β-glucosidasa fue tampón borato sódico 0,1 M pH 9,0, conteniendo ácido etilendiamino tetraacético (AEDT) 5 mM, fluoruro sulfonil de fenilmetano (PMSF) 1 mM, ditiotreitol (DTT) 0,25 % (p/v) (tampón C). Esta actividad enzimática se aisló tanto de pulpa como de semilla de frutos frescos. Para la obtención del extracto crudo de β-glucosidasa de pulpa se partió de 2 g de este tejido y se añadieron 0,7 g de polivinil polipirrolidona (PVPP) (5 % p/v) y 14 mL del tampón C. La mezcla se homogeneizó en Ultra-Turrax a máxima potencia en cinco pulsos de 1 min. El homogeneizado obtenido se filtró a vacío a través de papel Miracloth y el residuo se lavó 2 veces con 4 mL de tampón de extracción. El extracto filtrado se centrifugó a 27.000 x g durante 20 min a 4 ºC. El sobrenadante obtenido en esta primera centrifugación, se filtró de nuevo a través de Miracloth y se volvió a centrifugar a 10.000 x g durante 10 min a 4 ºC para eliminar la grasa remanente. El sobrenadante obtenido en esta segunda centrifugación constituyó el extracto crudo de β-glucosidasa de pulpa. Cuando se partió de semilla, a 0,5 g de tejido se les añadieron 0,18 g de PVPP (7 % p/v) y 2,5 ml de tampón C de extracción. La mezcla se homogeneizó en Ultra-Turrax a máxima potencia dando cinco pulsos de 1 min y se centrifugó a 10.000 x g durante 10 min a 4 ºC. El sobrenadante obtenido constituyó el extracto crudo de β-glucosidasa de semilla. Todo el proceso se realizó en frío a 0-4 ºC. III.2.4.2. Medida espectrofotométrica de la actividad β-glucosidasa La medida de actividad β-glucosidasa se realizó espectrofotométricamente a partir del método descrito por Briante et al. (2002) con ligeras modificaciones. La actividad se cuantificó midiendo la absorbancia de la mezcla de reacción a 405 nm, longitud de onda a la que absorbe el p-nitrofenol formado como consecuencia de la hidrólisis del sustrato sintético p-nitrofenil-β- D -glucopiranósido (pNPG) por acción de la enzima β-glucosidasa. Materiales y Métodos 43 El medio de reacción habitual contenía 1,5 mL de solución de 15 mM pNPG y la cantidad apropiada de extracto enzimático (5-100 µL). Para la medida de actividad β-glucosidasa en extractos de pulpa y semilla fresca de aceituna y en extractos de polvo acetónico de pulpa se utilizó tampón fosfato sódico 50 mM pH 5,5. La mezcla de reacción fue incubada directamente en la cubeta a 45 ºC durante 1 min. En todos los ensayos enzimáticos realizados se llevó a cabo en paralelo un blanco de la reacción en el que se añadía extracto enzimático inactivado térmicamente. Una unidad de actividad (U) β-glucosidasa se definió como la cantidad de enzima que hidroliza 1 µmol de p-NPG por min. Se calculó el coeficiente de extinción molar (ε) para el p-nitrofenol en el medio de reacción empleado, determinándose un ε = 552,8 M -1 ·cm -1 en tampón fosfato sódico 50 mM pH 5,5. III.3. PURIFICACIÓN DE LA PEROXIDASA DE SEMILLA La purificación de la POX de semilla de aceituna se realizó a partir de polvos acetónicos de semilla de Arbequina en el estadio de maduración correspondiente a 38 semanas después de la floración. III.3.1. Obtención del extracto crudo Para la obtención del extracto crudo (EC) se partió de polvo acetónico de semilla procedente de semillas frescas de frutos de Arbequina recién recolectados que fueron βGLU p-NPG p - nitrofenol Materiales y Métodos 44 procesadas según la metodología descrita en el apartado III.2.1. Para extraer las enzimas con actividad POX, fue necesario homogeneizar con Ultra-Turrax 3 gramos de polvo acetónico con 120 mL de tampón A (apartado III.2.2.1.), a la máxima potencia con tres pulsos de un minuto cada uno. La mezcla obtenida se centrifugó a 15.000 rpm durante 20 min manteniendo la temperatura a 4 ºC. El sobrenadante obtenido constituyó el extracto crudo. III.3.2. Precipitación con sulfato amónico Las proteínas contenidas en el EC fueron precipitadas añadiendo sulfato amónico lentamente, con agitación suave y a baja temperatura (4 ºC), hasta alcanzarse un 30% de saturación de la sal. Tras una hora de agitación se centrifugó la mezcla en las mismas condiciones de obtención del extracto crudo (15.000 rpm, 20 min, 4 ºC). Se procedió de la misma manera con el sobrenadante obtenido en esta segunda centrifugación saturando, en este caso, al 80% de sulfato amónico, concentración de sal que permitió precipitar todas las proteínas presentes en el sobrenadante del 30%. De nuevo se agitó lentamente en frío y se centrifugó. En esta ocasión, el sobrenadante del 80% de sulfato amónico se descartó y el precipitado proteico 30-80% se resuspendió en 2,5 mL de tampón HEPES (ácido N-2- hidroxietilpiperazina-N’-2-etanosulfónico) 50 mM, pH 7,2. III.3.3. Cromatografía de intercambio aniónico Una vez resuspendido el precipitado proteico del 30-80% de sulfato amónico, fue necesario retirar la sal del medio, utilizándose una columna PD-10 (Sephadex G-25), previamente acondicionada con tampón HEPES, que será el tampón utilizado en las cromatografías de intercambio iónico usadas en los pasos siguientes. El extracto obtenido de la columna PD-10 se sometió una primera cromatografía de intercambio, en este caso, aniónico, tras ser concentrado por ultrafiltración con un concentrador de proteínas con membrana de 30 kDa (Vivaspin 30 kDa MWCO, GE Healthcare) centrifugando a 3.100 rpm manteniendo la temperatura a 4 ºC. Se empleó para ello una columna HiTrap Q HP (1,6 x 2,5 Materiales y Métodos 45 cm) equilibrada con tampón HEPES 50 mM, pH 7,2 (Fase móvil A). Una vez lavada la columna, se llevó a cabo la elución de las proteínas retenidas en la fase estacionaria con tampón HEPES 50 mM, pH 7,2, NaCl 1,5 M (Fase móvil B) mediante un gradiente lineal tal y como se indica en la Tabla 1. El flujo empleado fue de 1 mL/min y las fracciones recogidas de 1 mL. La elución de las proteínas se siguió mediante la medida de absorbancia a 280 nm y la actividad POX se midió según el método espectrofotométrico descrito en el apartado III.2.2.2. Tabla 1. G radiente de la fase móvil B empleada en la cromatografía de intercambio aniónico mediante FPLC. Tiempo (min) % B 0-15 0 15-40 0-100 40-50 100 50-51 100-0 51-55 0 III.3.4. Cromatografía de intercambio catiónico La fracción no retenida en la cromatografía aniónica fue concentrada con un concentrador de proteínas con membrana de 30 kDa (Vivaspin 30 kDa MWCO, GE Healthcare) centrifugando a 3.100 rpm a 4 ºC y acondicionada para una segunda cromatografía de intercambio, en este caso, catiónico. Se empleó para ello una columna HiTrap CM FF (1,6 x 2,5 cm) equilibrada con tampón HEPES 50 mM, pH 7,2 (Fase móvil A). La elución de las proteínas retenidas en la fase estacionaria se llevó a cabo empleando tampón HEPES 50 mM, pH 7,2, NaCl 1,5 M (Fase móvil B) mediante un gradiente lineal tal y como se indica en la Tabla 2. El flujo empleado en este caso fue de 2 mL/min y las fracciones recogidas de 1 mL. Del mismo modo que en la cromatografía de intercambio aniónico, la elución de las proteínas se midió a 280 nm y la actividad POX según el método espectrofotométrico descrito en el apartado III.2.2.2. Materiales y Métodos 46 Tabla 2. Gradiente de la fase móvil B empleada en la cromatografía de intercambio aniónico mediante FPLC. Tiempo (min) % B 0-10 0 10-30 0-100 30-35 100 35-36 100-0 36-40 0 III.3.4.1. Determinación del peso molecular de las proteínas III.3.4.1.1. Electroforesis de proteínas en condiciones desnaturalizantes La electroforesis de proteínas en gel de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) se desarrolló de acuerdo con el método de Laemmli (1970) en el sistema de electroforesis BioRad. Las concentraciones de acrilamida de los geles de separación y de compactación fueron respectivamente de 10 y 4 % (p/v). El gel separador se preparó mezclando 5 ml de una disolución de acrilamida: bisacrilamida (37,5:1) 30 % (p/v), 3,75 ml de Tris-HCl 1,5 M pH 8,8, 150 µl de SDS 10 % (p/v), 75 µl de persulfato amónico (APS) 10 % (p/v) y 10 µl de N,N,N’,N’-tetrametil-1,2-diaminometano ( TEMED), completando con agua destilada hasta un volumen final de 15 ml. Posteriormente, una vez polimerizado el gel separador, se preparó el gel compactador mezclando 670 µl de una disolución de acrilamida:bisacrilamida (37,5:1) 30 % (p/v), 1,25 ml de Tris-HCl 0,5 M pH 6,8, 50 µl de SDS 10 % (p/v), 25 µl de APS 10 % (p/v) y 10 µl de TEMED, completando con agua destilada hasta un volumen final de 5 ml. Las muestras de proteínas (10 µg) se mezclaron en con el volumen adecuado de tampón de desnaturalización 6X (Tris-HCl 0,35 M pH 6,8, SDS al 10 % (p/v), glicerol al 30 % (v/v), ditiotreitol (DTT) 0,6 M y azul de bromofenol 0,175 mM), completando con agua destilada hasta un volumen final no superior de 24 µl. y se desnaturalizaron a 100 ºC durante 2 min. El tampón empleado en la electroforesis vertical estaba compuesto por Tris-HCl 25 mM pH 8,3, glicina 0,192 M y SDS 0,1 % (p/v), y la intensidad aplicada fue de 10 mA/placa durante Materiales y Métodos 47 el gel concentrador y de 20 mA/placa una vez que el frente hubo sobrepasado el gel de compactación. Además de las muestras, con el fin de determinar el peso molecular de las proteínas separadas en el gel, en el mismo gel se cargó el marcador patrón de proteínas de masa molecular conocida “PageRuler™ Plus Prestained Protein Ladder”, suministrado por Thermo Scientific. III.3.4.1.2. Tinción de los geles Una vez finalizada la electroforesis se procedió a la tinción del gel para visualizar las proteínas separadas. Para ello se empleó una disolución de tinción constituida por azul Coomasie R-250 al 0,1 % (p/v), metanol al 40 % (v/v) y ácido acético al 7 % (v/v). Se cubrió el gel con esta disolución durante 20 min con agitación suave y posteriormente se destiñó sumergiéndolo en disolución de desteñido (metanol al 5 % (v/v) y ácido acético al 7 % (v/v)) lavando con ésta hasta la total decoloración del gel. La determinación de las masas moleculares de las isoformas de POX purificadas se realizó de manera independiente para cada uno de los geles a partir de la representación gráfica del logaritmo de los pesos moleculares de las proteínas del marcador de peso molecular con respecto a sus movilidades electroforéticas, tomando como referencia el frente de electroforesis. La recta de calibrado con los pesos moleculares de las proteínas patrón se muestra en la Figura 11. Materiales y Métodos 48 Figura 11. Recta del calibrado del movimiento electroforético relativo de las proteínas patrón en geles SDS-PAGE en función del peso molecular. III.4. CARACTERIZACIÓN DE LA PEROXIDASA DE SEMILLA III.4.1. Especificidad y selectividad de sustrato El estudio de la especificidad de sustrato de las isoformas aniónica y catiónica purificadas se llevó a cabo tanto con los sustratos colorimétricos guayacol y ABTS según se describe en el apartado III.2.2.2, como con compuestos fenólicos naturales del olivo purificados y ensayados en disoluciones individuales de concentración 6,5 mM (hidroxitirosol, tirosol, demetiloleuropeína, verbascósido, y oleuropeína). Además de estos ensayos de especificidad de sustrato, se realizaron ensayos para caracterizar la selectividad de ambas isoformas purificadas, mediante una reacción con mezclas de glucósidos fenólicos y de compuestos secoiridoideos característicos del AOV. y = -1,1873x + 2,3721 R² = 0,9693 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 Log Pm Rf Materiales y Métodos 55 Figura 13. Perfiles fenólicos típicos de mesocarpo de Picual (A) y de Arbequina (B) registrados a 280 y 335 nm. Los picos cromatográficos de los análisis A y B corresponden a los compuestos: 1. Glucósido de hidroxitirosol + Hidroxitirosol, 2. Tirosol, 3. Demetiloleuropeína, 4. Verbascósido, 5. Nuzhénido; 6. Luteolin-7-glucósido, 7. Oleuropeína, 8. Apigenin-7-glucósido, 9. Ligustrósido. 600 0 0 11 22 33 44 280 335 Tiempo (min) Absorbancia (mAU) 300 150 450 800 0 0 11 22 33 44 280 335 Tiempo (min) Absorbancia (mAU) 400 200 600 1 23 4 6 7 9 8 1 2 3 4 67 9 8 5 5 A B Materiales y Métodos 56 Figura 14. Perfiles fenólicos típicos de aceites de la variedad Picual (A) y Arbequina (B) registrados a 280 y 335 nm. Los picos cromatográficos de los análisis A y B corresponden a los compuestos: 1. Hidroxitirosol, 2. Tirosol, P1 (patrón interno 1). Ácido p-hidroxiacético, 3. Ácido vaníllico, 4. Ácido p-cumárico, 5. Acetato de hidroxitorosol, 6. Ácido ferúlico, P2 (patrón interno 2). Ácido o-cumárico, 7. Forma dialdehídica de la aglucona de la oleuropeína descarboximetilada (DAOD), 8. Isómeros de AAO, 9. Forma dialdehídica de la aglucona del ligustrósido descarboximetilado (DALD), 10. Pinorresinol, 11. Ácido cinámico, 12. 1-Acetoxipinorresinol, 13. Luteolina, 14. Forma aldehídica de la aglucona de la oleuropeína (AAO), 15. Apigenina, 16. Forma aldehídica de la aglucona del ligustrósido (AAL). 200 0 0 11 22 33 44 280 335 Tiempo (min) Absorbancia (mAU) 100 50 150 200 0 0 11 22 33 44 280 335 Tiempo (min) Absorbancia (mAU) 100 50 150 123 4 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 P1 P2 5 1234 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 P1 P2 5 A B Materiales y Métodos 57 III.6. OTROS MÉTODOS ANALÍTICOS III.6.1. Determinación de proteínas El contenido de proteína en los distintos extractos enzimáticos se determinó según el método descrito por Bradford (1976). Se tomó una alícuota de la muestra y se llevó hasta un volumen final de 0,25 ml con agua destilada. Se añadieron 0,75 ml de reactivo Bradford de proteínas (Sigma) y, tras agitar vigorosamente, se incubó la muestra durante 20 min. A continuación, se determinó la absorbancia a 595 nm. Se empleó BSA como proteína patrón. El seguimiento de la elución de proteínas en las cromatografías empleadas para la purificación se hizo midiendo la absorbancia a 280 nm. Esta longitud de onda corresponde al máximo de absorción de los aminoácidos triptófano y tirosina presentes en el medio. III.6.2. Análisis estadístico Los datos obtenido en los ensayos tecnológicos de esta memoria fueron evaluados empleando Statgraphics Plus 5.1 (Manugistic Inc., Rockville, MD). Se aplicaron los análisis de varianza (ANOVA) y se compararon mediante el test de Student-Newman/Duncan con un nivel de significación del 0,05. III.7. REACTIVOS Y APARATOS III.7.1. Reactivos Todos los tampones orgánicos, sales orgánicas, metabolitos y enzimas usados en bioquímica, detergentes, compuestos orgánicos y el reactivo de Bradford, fueron proporcionados por Sigma-Aldrich (Estados Unidos). Materiales y Métodos 58 Los glucósidos fenólicos oleuropeína, verbascósido, hidroxitirosol, tirosol, luteolin-7- glucósido, apigenin-7-glucósido y rutina fueron suministrados por Extrasynthese (Francia). La demetiloleuropeína, al no estar disponible comercialmente, se aisló a partir de extractos fenólicos de mesocarpo de aceituna; el ligustrósido y el nuzhénido fueron obtenidos a partir de extractos fenólicos de semilla. Los disolventes orgánicos, ácidos y bases utilizados en bioquímica fueron suministrados por Panreac (Barcelona, España). Las columnas de Sephadex G-25 PD-10 y las columnas de intercambio aniónico y catiónico fueron suministradas por GE Healthcare, y las columnas de extracción en fase sólida Superclean LC-18 y fase diol fueron adquiridas a Supelco. El agua utilizada en los experimentos de bioquímica estaba purificada mediante ósmosis inversa y posteriormente desionizada mediante un desionizador “Sation”, modelo 8000P. III.7.2. Aparatos Las centrifugaciones se llevaron a cabo en diferentes tipos de centrífugas dependiendo del volumen y la velocidad requerida. Para centrifugaciones a baja velocidad se usaron las centrífugas de mesa Eppendorf J.P. Selecta y Heraeus refrigerada modelo Megafuge 1.0 R. Para las centrifugaciones a alta velocidad se usó una centrífuga refrigerada Sorvall modelo RC5C, equipada con los rotores SS-34 y GSA. Las cubetas para la electroforesis vertical de proteínas pertenecían al equipo Mini- PROTEAN® Tetra Cell de Bio-Rad (Estados Unidos). La visualización de las bandas separadas en geles de poliacrilamida se realizaron con una cámara FIREWIRE CCD de alta resolución acoplada a un ordenador con el programa GeneSnap para determinar las condiciones de captura de la fotografía del gel. La cuantificación de proteínas y las medidas de actividad POX, PPO y β-glucosidasa se llevaron cabo en un espectrofotómetro Beckman modelo DU-640, equipado con lámparas de tungsteno (visible) y deuterio (ultravioleta). Materiales y Métodos 59 Para el análisis de los compuestos fenólicos mediante HPLC se utilizó un cromatógrafo líquido Beckman Coulter (Beckman Inc., Estados Unidos ) equipado con un módulo de bomba 126 y detector diodo array 168 y una columna de fase inversa (C18) Mediterranea Sea 18 (4,0 mm d.i. x 250 mm, micropartícula de relleno 5 µm) (Teknokroma, Barcelona, España). La identificación de los compuestos fenólicos analizados fue confirmada mediante HPLC-MS usando el equipo antes mencionado acoplado a un detector de masas MAT 95S (Finnigan, Alemania) equipado con una interfase de electroevaporación ESI-II. El proceso de purificación enzimática mediante cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) se llevó a cabo en un cromatógrafo líquido AKTA Basic 10/100 (Amersham Pharmacia Biotech Freiburg, Alemania). Resultados 60 IV.1. ACTIVIDADES OXIDOREDUCTASAS Y METABOLISMO DE COMPUESTOS FENOLICOS DURANTE LA MADURACIÖN DE LA ACEITUNA Y EL PROCESO DE EXTRACCION DEL ACEITE Como se ha comentado en la Introducción, existen numerosas evidencias experimentales que sugieren que las actividades óxido-reductasas presentes en la aceituna catalizan la oxidación de compuestos fenólicos durante el proceso de obtención del AOV y afectan, por tanto, de manera decisiva al contenido final de compuestos fenólicos de los aceites. Sin embargo, no existen datos concluyentes acerca de actividad real de dichas óxido-reductasas frente a los compuestos fenólicos naturales del olivo. Como se recoge en la bibliografía, las tres actividades enzimáticas que podrían contribuir a este proceso de oxidación fenólica serían la LOX, la POX y la PPO. La enzima LOX juega un papel clave en la biosíntesis de los compuestos volátiles que caracterizan al AOV (Sánchez-Ortiz et al., 2012) y además mediante reacciones secundarias de oxidación puede degradar otros compuestos presentes en las pastas de aceituna como carotenos y clorofilas. Sin embargo, los ensayos realizados tanto con LOX comercial de soja como con extractos de LOX de aceituna utilizando fenoles de olivo como sustrato o cosustrato fueron negativos, sugiriendo que esta actividad enzimática no interviene de manera directa en la oxidación de compuestos fenólicos durante el proceso de obtención del AOV. Con el fin de estudiar la implicación de las enzimas POX y PPO de aceituna al perfil fenólico del AOV, se realizó un seguimiento de ambas actividades enzimáticas a lo largo de la maduración de cinco variedades de aceituna analizándose en paralelo el contenido fenólico de los correspondientes aceites. Las variedades de aceituna seleccionadas fueron Arbequina y Picual, por ser las variedades más importantes en nuestro país desde el punto de vista productivo, y Menya, Piñonera y Shengeh como variedades representativas de alto, medio y bajo contenido de compuestos fenólicos dentro de la colección nuclear del Banco Mundial de Olivo. El estudio se realizó en cuatro estadios seleccionados de maduración del fruto, IM = 2 a Resultados 61 IM = 5 que se corresponden con frutos recolectados las semanas 30, 34, 38 y 42 después de la floración. Los resultados quedan reflejados en la Figura 15. 0 20 40 60 80 100 120 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 Menya M2 Menya M3 Menya M4 Menya M5 Polifenoles totales o-difenoles POX PPO Contenido en polifenoles (µmol/kg aceite) Actividad relativa POX y PPO (%) 0 20 40 60 80 100 120 0 500 1000 1500 2000 2500 Piñonera M2 Piñonera M3 Piñonera M4 Piñonera M5 Polifenoles totales o-difenoles POX PPO Contenido en polifenoles (µmol/kg aceite) Actividad relativa POX y PPO (%) 0 20 40 60 80 100 120 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 Shengeh M2 Shengeh M3 Shengeh M4 Shengeh M5 Polifenoles totales o-difenoles POX PPO Contenido en polifenoles (µmol/kg aceite) Actividad relativa POX y PPO (%) Resultados 62 Figura 15. Evolución del contenido de polifenoles totales y o-difenoles, POX y PPO a lo largo de la maduración en Menya (A), Piñonera (B), Shengeh (C), Arbequina (D) y Picual (E). La evolución del contenido fenólico de los aceites a lo largo de la maduración sigue la misma tendencia en las cinco variedades analizadas: los niveles más altos se localizan en el estadio IM = 2, que se corresponde con los aceite más verdes y van descendiendo paulatinamente conforme va transcurriendo el período de maduración, siendo dicho descenso algo más brusco en Arbequina y Picual, que en las otras tres variedades analizadas. En cada uno de los casos se puede afirmar que, en mayor o menor medida, el descenso, tanto de los compuestos fenólicos totales como de los o-difenoles en los aceites a lo largo de la maduración, está íntimamente ligado con el progresivo aumento de la actividad 0 20 40 60 80 100 120 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 Arbequina M2Arbequina M3Arbequina M4 Arbequina M5 Polifenoles totales o-difenoles POX PPO Contenido en polifenoles (µmol/kg aceite) Actividad relativa POX y PPO (%) 0 20 40 60 80 100 120 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Picual M2 Picual M3 Picual M4 Picual M5 Polifenoles totales o-difenoles POX PPO Contenido en polifenoles (µmol/kg aceite) Actividad relativa POX y PPO (%) Resultados 63 POX de semilla, mientras que la correlación con los niveles de actividad PPO no es tan evidente. El contenido fenólico total en Piñonera es similar al cuantificado en Arbequina y Picual. Por el contrario, tal y como se observa en la Figura 15, el contenido de compuestos fenólicos en Menya es muy superior respecto a Piñonera, mientras que los niveles más bajos detectados se encontraron en Shengeh. Por tanto, cabría esperar que los niveles de POX más elevados fueran los correspondientes a la variedad Shengeh. Sin embargo, tal y como se comprueba en los datos recogidos en la Tabla 4, no es así. Las tres actividades enzimáticas que contribuyen de manera decisiva a la formación y degradación de compuestos fenólicos son: la actividad β-glucosidasa ( β–GLU), que hidroliza los principales glucósidos fenólicos para dar lugar a los derivados secoiridoideos, y las actividades óxido-reductasas POX y PPO que pueden oxidar tanto a los glucósidos fenólicos como a sus derivados secoiridoideos. Por ello, en la Tabla 4 se han incorporados las actividades enzimáticas β–GLU, POX y PPO para las tres variedades seleccionadas como alto, medio y bajo contenido en compuestos fenólicos en los cuatro estadios de maduración estudiados. Además, se ha confeccionado la Tabla 5, que recoge el contenido de los fenoles de fruto de cada una de las variedades a lo largo de la maduración. Resultados 64 Tabla 4. Actividades enzimáticas expresadas como U/g fruto relacionadas con el metabolismo de los compuestos fenólicos durante el proceso de obtención del aceite de oliva virgen de las variedades Menya, Piñonera y Shengeh. Actividad (U/g fruto) M2 M3 M4 M5 Menya β-GLU 295,84 439,41 242,34 342,33 POX 0,22 0,85 0,86 0,73 PPO 327,62 206,34 388,94 307,15 Piñonera β-GLU 794,75 308,38 190,05 0,00 POX 0,34 0,84 0,70 0,73 PPO 201,61 132,29 177,78 216,84 Shengeh β-GLU 86,72 109,81 50,94 65,56 POX 0,26 0,65 0,72 0,68 PPO 117,56 82,87 97,18 99,51 Tabla 5. Contenido de compuestos fenólicos en el fruto durante la maduración de las variedades Menya, Piñonera y Shengeh. Compuesto fenólico Menya (µmol/g fruto) Piñonera (µmol/g fruto) Shengeh (µmol/g fruto) M2 M3 M4 M5 M2 M3 M4 M5 M2 M3 M4 M5 Hidroxitirosol 0,16 1,16 1,40 2,20 0,22 6,02 5,46 6,16 4,41 4,56 5,86 4,59 Tirosol 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Dem.Oleurop. 1,69 25,33 38,83 74,10 0,00 21,01 24,30 23,98 0,00 0,00 0,00 0,00 Verbascósido 0,11 0,00 0,16 0,90 0,73 0,41 0,44 0,43 0,10 0,00 0,00 0,00 Lut-7-glu. 0,71 0,50 0,23 0,53 1,15 0,60 0,52 0,04 0,00 0,00 0,00 0,00 Oleuropeína 60,89 10,81 1,31 0,00 42,29 0,00 0,17 0,00 12,10 8,07 6,88 7,28 Apig-7-glu. 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Ligustrósido 5,93 0,70 0,00 0,00 3,73 6,96 0,00 0,00 1,13 0,00 0,00 0,00 Totales 69,48 38,50 41,94 77,74 48,12 35,00 30,89 30,61 17,74 12,63 12,74 11,87 Resultados 71 Figura 20. Actividad POX del EC de semilla de aceituna en función de la concentración de H 2 O 2 . Los resultados de actividad están expresados como U/ml de enzima y son el valor medio de tres extracciones enzimáticas independientes. El coeficiente de variación fue inferior al 6%. De igual modo, para determinar el pH óptimo de la actividad POX de aceituna se llevaron a cabo medidas de la actividad enzimática empleando diferentes soluciones tamponadas en un intervalo de pH entre 3 y 9. El pH óptimo de actuación de la actividad POX de aceituna en las condiciones descritas frente al sustrato colorimétrico guayacol fue 6,5 (Figura 21) mientras que el pH óptimo cuando se empleó ABTS fue 4,25. Figura 21. Efecto del pH sobre la actividad de la enzima peroxidasa de semilla de aceituna frente al sustrato colorimétrico guayacol. 0 1 2 3 4 5 6 7 01234567 Actividad POX (U/mL) [H2O2] (mM) 0 20 40 60 80 100 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Actividad POX relativa (%) pH Resultados 72 La temperatura óptima encontrada para la actividad POX resultó ser 10 ºC y fue descendiendo de manera lineal hasta los 70 ºC, pero debido a que la actividad no difería significativamente entre 10 y 30 ºC, la temperatura empleada para los ensayos con el EC fue de 25 ºC por aproximación con las condiciones en las que se lleva a cabo el proceso de obtención del AOV. IV.2.2. Distribución de la actividad peroxidasa en los distintos tejidos de la aceituna Una vez establecidas las condiciones óptimas de medida, se evaluó la contribución de semilla y mesocarpo de aceituna a la carga total de POX del fruto, comparándose así mismo los niveles de actividad de frutos de las variedades Picual y Arbequina recolectados en su momento óptimo de maduración, estadio IM = 3. Tabla 6. Actividad POX medida frente a guayacol en semilla y mesocarpo de aceitunas de las variedades Picual y Arbequina en el estadio óptimo de maduración en la campaña 2012-2013. Los extractos crudos se prepararon a partir de polvos acetónicos de mesocarpo y semilla y las determinaciones de actividades enzimáticas se llevaron a cabo por triplicado tal y como se describe en Materiales y Métodos (apartado III.2.2.). En base a los niveles de actividad POX cuantificados en mesocarpo de aceituna puede concluirse que efectivamente, tal y como indicaban estudios preliminares (Luaces et al., 2007), la actividad POX de aceituna se localiza prácticamente en su totalidad en la semilla del fruto, aportando el mesocarpo únicamente un 2,2% en la variedad Picual y un 1,0% en la variedad Arbequina respecto a la actividad total en el fruto. Material biológico Actividad POX (U/g pf) Semilla Arbequina 23,38 ± 1,30 Semilla Picual 17,45 ± 0,61 Mesocarpo Arbequina 0,0088 ± 0,00027 Mesocarpo Picual 0,0063 ± 0,00086 Resultados 73 IV.2.3. Evolución de la actividad peroxidasa durante el proceso de maduración de la aceituna Dado que la actividad POX se localiza mayoritariamente en la semilla de la aceituna, se eligió el polvo acetónico de semilla para realizar un seguimiento de la actividad POX en cinco estadios de maduración (IM = 1-5) de aceitunas de las variedades Arbequina y Picual durante los meses de septiembre a enero. Este período, que se corresponde con las semanas después de la floración (SDF) 22-38, coincide con la campaña de la recolección de la aceituna destinada a la producción de aceite de oliva. En la Figura 22 se muestra la evolución de la actividad POX a lo largo de la maduración. Se observó, para ambas variedades, una misma tendencia de aumento de la actividad POX a lo largo de la maduración. El máximo de actividad se encontró en el intervalo de 38-42 SDF. Figura 22. Evolución de la actividad peroxidasa de semilla de Arbequina y Picual en la campaña 2010-2011 durante la maduración del fruto. Las determinaciones de actividades enzimáticas expresadas como U/g peso fresco de semilla se llevaron a cabo por triplicado tal y como se describe en Materiales y Métodos (apartado III.2.2.). 0 5 10 15 20 25 30 25 30 35 40 45 Actividad POX (U/g pf) Tiempo (SDF) Arbequina Picual Resultados 74 IV.2.4. Actividad peroxidasa y oxidación de fenoles naturales del olivo Los primeros estudios realizados para evaluar la posible actividad de la POX de aceituna frente a los fenoles del olivo se centraron en determinar si dichos fenoles inhibían la reacción de oxidación del guayacol previamente caracterizada. Concretamente, se evaluó el efecto de la oleuropeína, como fenol más representativo de la aceituna, y el de un extracto fenólico de AOV obtenido como se detalla en el apartado III.2.1. de Materiales y Métodos. En la Tabla 7 se puede ver como una concentración 1 mM de oleuropeína es suficiente para inhibir casi en un 90% la oxidación del guayacol catalizada por la POX de aceituna. Tabla 7. Efecto de la oleuropeína sobre la actividad POX de aceituna medida frente a guayacol. Las reacciones enzimáticas se llevaron a cabo por triplicado tal y como se describe en Materiales y Métodos (apartado II.2.2.). De forma similar la Tabla 8 muestra el efecto de los compuesto fenólicos característicos del AOV sobre la actividad POX. Las concentraciones finales de estos fenoles de AOV en el medio de reacción fueron de 1 y 2,5 mM. Encontrándose también en este caso una fuerte inhibición a partir de concentraciones 1 mM. Tabla 8. Efecto de compuestos fenólicos del AOV sobre la actividad POX de aceituna medida frente a guayacol. Las reacciones enzimáticas se llevaron a cabo tal y como se describe en Materiales y Métodos. [Oleuropeína] (mM) Actividad POX vs guayacol (U/mL) Actividad % 0,0 6,60 100 1,0 1,04 11,0 2,5 1,16 12,3 5,6 1,08 11,4 [Fenoles AOV] (mM) Actividad POX vs guayacol (U/mL) Actividad % 0,0 6,60 100 1,0 0,88 9,3 2,5 0,72 7,6 Resultados 75 Una vez completados estos estudios preliminares se plantearon una serie de ensayos en los que se utilizaron como sustratos de la POX de aceituna los compuestos más característicos del fruto, y los compuestos más característicos del AOV, los derivados secoiridoideos. IV.2.4.1. POX y oxidación de compuestos fenólicos de la aceituna Igual que en el apartado anterior, el medio de reacción y las condiciones de incubación para estudiar la oxidación de compuestos fenólicos de la aceituna se diseñaron a partir de estudios preliminares realizados con POX de rábano disponible comercialmente. Posteriormente, y utilizando ya extractos enzimáticos de POX de aceituna y oleuropeína como glucósido fenólico más representativo, se optimizaron los distintos parámetros de la reacción. Así, se estudió el efecto de la concentración de oleuropeína sobre la actividad POX de aceituna, determinándose que la concentración de glucósido con la que se obtenían valores máximos de actividad era de 8 mM (Figura 23) y observándose una aparente inhibición de la actividad a partir de concentraciones 12 mM. Figura 23. Actividad POX de aceituna en función de la concentración de oleuropeína. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Actividad POX(U/mL) Concentración de oleuropeína (mM) Resultados 76 De igual modo, tras hacer un seguimiento de la oxidación de la oleuropeína con POX de aceituna (Figura 24) se determinó un tiempo óptimo de la reacción de 2 minutos. . Figura 24. Evolución de la reacción de oxidación de la oleuropeína por POX de aceituna durante 30 min. Los picos 2, 3 y 4 corresponden a productos de reacción no identificados. Tal y como se ha descrito en la introducción, la oleuropeína es el glucósido fenólico más abundante, pero no el único presente en el fruto de aceituna. En este sentido era de especial interés evaluar la capacidad oxidativa de la enzima POX con cuantos glucósidos naturales fuera posible. En este caso la aproximación experimental fue ligeramente distinta ya que la enzima POX de aceituna se incubó con una mezcla de oleuropeína, verbascósido y demetiloleuropeína en cantidades variables (Tabla 9). Es importante señalar que mientras que la oleuropeína y el verbascósido están disponibles comercialmente la demetiloleuropeína fue aislada y purificada a partir de un extracto fenólico de frutos de la variedad Arbequina (apartado III.5.4. de Materiales y Métodos). 260 0 0 10 20 30 40 Tiempo (min) Absorbancia (mAU) 130 65 195 1 B Oleuropeína6,5 mM R 2 min R 10 min R 30 min 3 2 4 Resultados 77 Tabla 9. Actividad de la enzima peroxidasa de aceituna frente a una mezcla de glucósidos naturales del fruto. Las reacciones enzimáticas se llevaron a cabo tal y como se describe en Materiales y Métodos. Los resultados obtenidos son especialmente interesantes ya que no sólo confirman niveles muy altos de oxidación del verbascósido por enzimas con actividad POX de aceituna sino que además al encontrarse los tres glucósidos fenólicos en el mismo medio de reacción podrían indicar una cierta preferencia de la POX de aceituna por este sustrato que es, sin embargo, el menos abundante en el medio de reacción. Las tasas de oxidación obtenidas con oleuropeína y demetiloleuropeína, muy parecidas a su vez a las obtenidas al incubar ambos glucósidos con POX de rábano, parecen indicar que las enzimas con actividad POX tienen una afinidad muy similar por ambos sustratos. IV.2.4.2. POX y oxidación de compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen Parece claro que las proteínas con actividad POX de la aceituna, podrían oxidar no sólo a los glucósidos fenólicos del fruto, sino también aquellos compuestos fenólicos producidos por la hidrólisis de dichos glucósidos mediada por enzimas β-GLU. Como en apartados anteriores y como paso previo al estudio de la contribución de la POX de aceituna a la oxidación de fenoles del AOV, se comprobó la capacidad de la POX comercial de rábano para oxidar dichos compuestos fenólicos. Los ensayos se realizaron con extractos fenólicos procedentes de aceites de Picual y Arbequina obtenidos según la metodología descrita en el apartado III.5.1. de Materiales y Métodos. En el cromatograma de la Figura 25 se muestra la alteración del extracto fenólico de Arbequina tras dos minutos de incubación con POX de rábano en las condiciones descritas en Materiales y Métodos (III.2.2.3.). Tal y como se observa en la Figura 5 los cuatro derivados secoiridoideos mayoritarios del aceite, FDAO (8), FAAO Sustrato POX Actividad relativa (%) Demetiloleuropeína 1,78 mM 32,5 Verbascósido 0,08 mM 100 Oleuropeína 2,35 mM 25,2 Resultados 78 (15), FDAL (10) y FAAL (17), son los compuestos más afectados por la oxidación de POX aunque también se afectan otros compuestos como la luteolina (pico 14 del cromatograma), que prácticamente desaparece. Figura 25. Alteración del perfil fenólico de un AOV de la variedad Arbequina tras dos minutos de incubación con POX de rábano. 1. Hidroxitirosol; 2. Tirosol; 3. p -HFA; 4. Ácido vaníllico; 5. Ácido p -cumárico; 6. Acetato de hidroxitirosol; 7. Ácido o -cumárico; 8. FDAO; 9. Isómeros FAO; 10. FDAL; 11. Pinorresinol; 12. Ácido cinámico; 13. 1- acetoxipinorresinol; 14. Luteolina; 15. FAAO; 16. Apigenina; 17. FAAL; P1-4 productos de oxidación por POX. La Figura 25 deja constancia de la desaparición de los compuestos presentes en el AOV y de la formación de algunos productos de reacción que son fácilmente detectables, ya que eluyen en zonas del cromatograma donde no eluye ningún componente fenólico del aceite, pero cuya estructura se desconoce. Entre estos productos de oxidación cabe destacar el producto de reacción que eluye justo delante de la FDAO y que por su espectro parece ser un producto de oxidación de FDAO. 32 0 0 15 30 45 60 B Fenoles de aceite R POX comercial Tiempo (min) Absorbancia (mAU) 16 24 8 12 P1 3 9 P2 45 8 7 P3 14 13 12 11 10 17 16 15 P4 6 Resultados 79 Figura 26. Cinética de la oxidación de los fenoles mayoritarios de un AOV de la variedad Arbequina por POX de rábano. Las concentraciones iniciales de cada uno de los sustratos se indican en la leyenda de la representación gráfica expresadas en mM. A pesar de las diferencias tanto cualitativas como cuantitativas existentes entre los extractos fenólicos de Arbequina y Picual (apartado III.5.2. de Materiales y Métodos) en ambos casos los compuestos derivados de la oleuropeína, los o-difenoles FDAO y FAAO, fueron los sustrato más rápidamente oxidados, mientras que para los derivados del ligustrósido se obtuvieron cinéticas de degradación más suaves, tal y como se observa en la Figura 26. En la degradación de los flavonoides, luteolina y apigenina, también se observaron cinéticas de oxidación muy diferentes entre ambas que parecen apoyar que la POX oxida más activamente a los o-difenoles que a los monofenoles (datos no mostrados). Para evaluar la actividad de la enzima POX de aceituna frente a los fenoles del AOV se utilizó como sustrato una mezcla de extractos fenólicos de aceites de las variedades Picual y Arbequina. El medio de reacción y las condiciones de incubación fueron las mismas que las empleadas con la POX de rábano comercial. La cinética de la reacción fue, sin embargo, ligeramente distinta. El análisis HPLC de la mezcla de incubación indica que la enzima POX de aceituna es muy poco activa en los dos primeros minutos de reacción, en los que no se 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 5 10 15 Contenido de compuestos fenólicos (%) Tiempo (min) FDAO (0,20) IsómeroFAO+FAAO (0,03) FDAL (0,09) FAAL (0 02) Resultados 80 observa prácticamente alteración del perfil fenólico original, y no es hasta el minuto 5 cuando se observa una degradación importante de los principales compuestos secoiridoideos del AOV. A este tiempo de reacción la degradación de los derivados FDAO (8) y FAAO (15) es ya claramente visible en el cromatograma de HPLC (Figura 27). Figura 27. Oxidación del perfil fenólico de la mezcla de aceites de Arbequina y Picual mediante la reacción con la POX de aceituna a tiempo 5 min. 1. Hidroxitirosol; 2. Tirosol; 3. p -HFA; 4. Ácido vaníllico; 5. Ácido p -cumárico; 6. Acetato de hidroxitirosol; 7. Ácido o -cumárico; 8. FDAO; 9. Isómeros FAO; 10. FDAL; 11. Pinorresinol; 12. Ácido cinámico; 13. 1-acetoxipinorresinol; 14. Luteolina; 15. FAAO; 16. Apigenina; 17. FAAL; P1-4 productos de oxidación por POX. La cinética de la degradación oxidativa de los principales derivados secoiridoideos por la POX de aceituna se muestra en la Figura 28 y la correspondiente a los flavonoides, luteolina (14) y apigenina (16), en la Figura 29. Ambas cinéticas se asemejan en cierto modo a la obtenida para la oxidación del guayacol (Figura 18) ya que presentan un cierto periodo de inducción en los dos minutos iniciales, máxima actividad en el minuto 5 y luego un aparente período de agotamiento de la reacción, probablemente atribuible también al hecho de que las 44 0 0 15 30 45 60 B Fenoles de aceite R POX aceituna Tiempo (min) Absorbancia (mAU) 22 33 11 12 P1 3 9P2 4 6 8 7 P3 14 13 12 11 10 17 16 15 P4 5 Resultados 87 encuentra localizada en el mesocarpo, el polvo acetónico de este material fue elegido para seguir la evolución de dicha actividad a lo largo de la maduración del fruto. La Figura 32 muestra la actividad PPO de los extractos crudos de mesocarpo cuantificada frente a TBC en las variedades Arbequina y Picual en cinco estadios de maduración del fruto (IM = 1-5) durante los meses de septiembre a enero. Tal y como se observa en la Figura 32, y al contrario de lo que sucedía con la POX, en ambas variedades los niveles de PPO van disminuyendo a lo largo de la maduración. El máximo de actividad en la variedad Picual se corresponde con el estadio con IM = 1 (22 SDF) y va disminuyendo hasta reducirse un 63% respecto del valor inicial a las 42 SDF. En Arbequina este descenso es mucho más suave, con una disminución neta del 22% desde el estadio con IM = 1 hasta el estadio con IM = 5. Figura 32. Evolución de la actividad PPO en extractos de polvos acetónicos de mesocarpo de Arbequina y Picual en la campaña 2010-2011 durante la maduración del fruto. Las determinaciones de actividades enzimáticas expresadas como U/g peso fresco de mesocarpo se llevaron a cabo por triplicado tal y como se describe en Materiales y Métodos (apartado III.2.3.2. ). Del mismo modo que se procedió con la actividad POX, una vez cuantificada la actividad frente a TBC, y como paso previo a la medida de actividad PPO frente a fenoles del olivo, se estudió el efecto de la adición de fenoles del olivo a la reacción de PPO con TBC. La Tabla 12 muestra el efecto de concentraciones crecientes de oleuropeína sobre la actividad PPO de aceituna medida frente a TBC. Aunque el efecto inhibidor de la oleuropeína es menor 0 50 100 150 200 250 300 350 20 25 30 35 40 45 Actividad PPO (U/g pf) Tiempo (SDF) Arbequina Picual Resultados 88 que el observado en la reacción con POX, se comprueba que la oleuropeína inhibe la oxidación de TBC por PPO de aceituna y que este efecto inhibidor aumenta con la concentración de este glucósido fenólico. Tabla 12. Efecto de la oleuropeína sobre la actividad PPO de aceituna medida frente a TBC. La reacción enzimática se llevó a cabo tal y como se describe en Materiales y Métodos. IV.3.4. Actividad polifenol oxidasa y oxidación de fenoles del olivo Para evaluar la contribución de la PPO a la degradación de compuestos fenólicos que tiene lugar durante el proceso de extracción del AOV, y que afecta tanto a los glucósidos fenólicos inicialmente presentes en la aceituna como a los compuestos secoiridoideos hidrolizados a partir de ellos, se cuantificó directamente la degradación oxidativa de los fenoles mediante análisis por HPLC, tal y como se hizo con la POX. IV.3.4.1. PPO y oxidación de compuestos fenólicos de la aceituna Al igual que se hizo en apartados anteriores, los estudios preliminares se llevaron a cabo con la enzima PPO comercial de champiñón con la que se probaron distintas concentraciones de sustrato y diferentes condiciones de incubación hasta llegar a las condiciones definitivas detalladas en Materiales y Métodos. El medio de reacción establecido con la enzima comercial consistió en 1 mL de tampón fosfato sódico, pH 6,5, 25 mM con una concentración 3 mM de oleuropeína al que se añadió 1 µL de la una solución de enzima comercial de 2,5 mg/mL. La disminución de dicho o-difenol en el medio se cuantificó Concentración oleuropeína (mM) Actividad PPO vs TBC (U/mL) Actividad % 0,0 10,8 100 1,0 10,7 99,1 2,5 9,8 90,7 7,0 7,3 68,0 Resultados 89 analizando por HPLC los medios de reacción frente a los correspondientes blancos (Materiales y Métodos III.5.5.). Una vez optimizado el método se procedió a estudiar la reacción de oxidación de glucósidos fenólicos con la PPO de aceituna, para ello tal y como se indica en el apartado III.2.3.1. se utilizó un extracto parcialmente purificado de PPO libre de actividad β-GLU. En primer lugar se estudió la actividad de la PPO de aceituna frente a la oleuropeína, realizándose un estudio cinético a diferentes tiempos de reacción (Figura 33). En paralelo a las reacciones mostradas en la figura y para cada tiempo de incubación se realizaron dos tipos de blancos: uno con enzima inactivada y otro con enzima activa en presencia de un inhibidor específico de PPO, la tropolona, con el fin de confirmar que toda desaparición de oleuropeína correspondía a la degradación oxidativa catalizada por la PPO. Figura 33. Evolución de la reacción de oxidación de oleuropeína por PPO de aceituna a diferentes tiempos de reacción. La reacción enzimática y el análisis de los datos de las reacciones se llevaron a cabo según los apartados III.2.3.3 . y III.5.5. de Materiales y Métodos. 1 552 34,6 0 35,0 35,4 36,0 36,4 B Oleuropeína6,5 mM R 2 min Tiempo (min) Absorbancia (mAU) 36,8 R 5 min R 10 min R 20 min R 30 min 276 138 414 Resultados 90 Las cinéticas obtenidas indican una oxidación lineal a lo largo de 30 minutos y permiten establecer un tiempo óptimo de reacción de 2 min, ya que a este tiempo se obtiene un descenso apreciable de oleuropeína que permite cuantificar máximos niveles de actividad (29,6 U/mL de extracto). Del mismo modo, se estudió el efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad PPO. Como se puede observar en la Figura 34, la concentración de oleuropeína a la que se alcanza la saturación estaba en torno a 12 mM. Figura 34. Actividad PPO de aceituna en función de la concentración de oleuropeína. Se llevaron a cabo ensayos adicionales en los que se utilizaron otros componentes fenólicos característicos del fruto como sustratos de la PPO de aceituna. Los valores de actividad obtenidos, expresados como actividad relativa, están recogidos en la Tabla 13 y pueden considerarse indicativos de la especificidad de la enzima. 0 20 40 60 80 100 120 0 5 10 15 20 25 Actividad PPO relativa (%) [Oleuropeína] (mM) Resultados 91 Tabla 13. Actividad PPO frente a los compuestos fenólicos del fruto aislados como sustrato. Resulta especialmente interesante que pese a obtenerse muy baja actividad relativa con el tirosol (1%) se detecte actividad frente a este sustrato, un monofenol, lo que indicaría una cierta actividad monofenolasa de la PPO de aceituna. Con el fin de corroborar esta observación, se realizaron nuevas incubaciones de PPO con tirosol a tiempos de incubación más largos. La Figura 35, muestra el cromatograma de la reacción con tirosol (pico 2) a tiempo 30 min y en él se observa la formación de hidroxitirosol (1) como producto de la oxidación del tirosol demostrándose, por tanto, la existencia de actividad tirosinasa o monofenolasa. Sustrato PPO Actividad relativa (%) Hidroxitirosol 6,5 mM 100 Tirosol 6,5 mM 1,0 Demetiloleuropeína 6,5 mM 9,7 Verbascósido 6,5 mM 25,6 Oleuropeína 6,5 mM 37,4 Resultados 92 Figura 35. Reacción de oxidación de tirosol por PPO de aceituna a 60 min. La reacción enzimática y el análisis de los datos de las reacciones se llevaron a cabo según los apartados III.2.3.3 . y III.5.5. de Materiales y Métodos. Por otra parte, la evolución de la reacción de PPO con hidroxitirosol que se muestra en el cromatograma de la Figura 36 permite comprobar que la PPO oxida los productos de oxidación inicialmente formados (2) al mismo tiempo que continúa la degradación oxidativa del hidroxitirosol (1). 500 0 0 6 12 18 24 Blanco Tirosol 6,5 mM Reacción PPO 60 min Tiempo (min) Absorbancia (mAU) 250 375 125 Resultados 93 Figura 36. Evolución de la reacción de oxidación de hidroxitirosol por PPO de aceituna durante 60 min. La reacción enzimática y el análisis de los datos de las reacciones se llevaron a cabo según los apartados III.2.3.3 . y III.5.5. de Materiales y Métodos. Para avanzar en la caracterización del papel desempeñado por la PPO en la degradación de compuestos fenólicos durante el proceso de obtención del AOV se realizaron varias incubaciones de la enzima PPO con mezclas de sustratos obtenidos a partir de extractos fenólicos de aceituna. Las incubaciones se llevaron a cabo según lo dispuesto en el apartado X de Materiales y Métodos. Como se observa en las Tablas 14 y 15 la actividad relativa frente a los distintos sustratos varía en función de los compuestos fenólicos presentes y de sus concentraciones. En cualquier caso a partir de estos ensayos de competencia de sustratos puede concluirse que la PPO de aceituna muestra mayor selectividad por el acetato de hidroxitirosol y el verbascósido y no es activa frente a tirosol, nuzhénido y ligustrósido en presencia de o-difenoles. 1200 8 10 12 14 16 Tiempo (min) Absorbancia (mAU) 0 600 300 900 1 2 B Hidroxitirosol 6,5 mM R 2 min R 30 min R 60 min Resultados 94 Tabla 14. Actividad PPO frente a una mezcla (mezcla x) de compuestos fenólicos de la aceituna Tabla 15. Actividad PPO frente a una mezcla (Mezcla X) de compuestos fenólicos de la aceituna IV.3.4.2. PPO y oxidación de compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen Como en apartados anteriores tanto el medio de reacción como las condiciones experimentales de incubación y el análisis de la degradación de sustratos y formación de productos fueron establecidos en ensayos preliminares realizados con la PPO de champiñón disponible comercialmente. El medio de reacción consistió en 1,81 mL de tampón fosfato sódico 25 mM, pH 6,5, 1 mM SDS, 240 µL de extracto fenólico de AOV y 2-50 µL de extracto enzimático. La evolución de la reacción se siguió a lo largo de 60 minutos de incubación. Sustrato PPO Actividad relativa (%) Hidroxitirosol 0,40 mM 38,9 Acetato de hidroxitirosol 6,44 mM 81,1 Demetiloleuropeína 3,63 mM 38,7 Verbascósido 0,09 mM 100 Sustrato PPO Actividad relativa (%) Hidroxitirosol 0,50 mM 0 Tirosol 1,71 mM 7,63 Acetato de hidroxitirosol 0,85 mM 100 Demetiloleuropeína 3,32 mM 0,80 Verbascósido 0,50 mM 68,40 Oleuropeína 4,58 mM 32,10 Ligustrósido 4,14 mM 0 Resultados 95 La Figura 37 muestra el análisis por HPLC de la cinética de oxidación de un extracto fenólico de AOV catalizada por un extracto parcialmente purificado de PPO de aceituna. Tal y como se observó en las reacciones previas con PPO de champiñón los compuestos secoiridoideos derivados de la oleuropeína son los sustratos más rápidamente oxidados, observándose ya en los primeros 5 minutos una degradación importante del acetato de hidroxitirosol (6) , FDAO (8), FAAO (15) y sus isómeros (9) . De los datos obtenidos se deduce que la oxidación no progresa de forma lineal y la velocidad de la reacción desciende notablemente a partir de los 20 minutos. A partir de este tiempo la reacción sigue avanzando aunque más lentamente debido a la escasa disponibilidad de sustratos presentes en el medio de reacción. En el cromatograma además del descenso de los compuestos fenólicos mencionados se identifican una serie de productos de oxidación, que también se obtuvieron en las reacciones modelo realizadas con PPO de champiñón. Figura 37. Alteración del perfil fenólico de un AOV a distintos tiempos de incubación con PPO de aceituna. 1. Hidroxitirosol; 2. Tirosol; 3. p -HFA(patrón interno 1); 4. Ácido vaníllico; 5. Ácido p -cumárico; 6. Acetato de hidroxitirosol; 7. Ácido o -cumárico (patrón interno 2); 8. FDAO; 9. Isómeros FAAO; 10. FDAL; 11. Pinorresinol; 12. Ácido cinámico; 13. 1-acetoxipinorresinol; 14. Luteolina; 15. FAAO; 16. Apigenina; 17. FAAL; P1-4 productos de oxidación por PPO. 0 0 15 30 45 60 Tiempo (min) Absorbancia (mAU) B fenoles aceite R 5 min R 10 min R 20 min R 40 min 24 12 18 6 P1 3 9 P2 4 57 6 P3 14 13 10 16 15 17 11 12 2 1 8 P4 Resultados 96 La Figura 38 muestra la degradación oxidativa de los cuatro compuestos secoiridoideos mayoritarios en el AOV a lo largo de 40 minutos de reacción. De nuevo se observa que los derivados de la oleuropeína (FDAO y FAAO) son los sustratos más susceptibles a la oxidación degradándose casi en un 50% en sólo 10 minutos de reacción, mientras que los niveles de los derivados secoiridoideos del ligustrósido (FDAL y FAAL) no se vieron afectados. Figura 38. Cinética de la oxidación de los compuestos fenólicos mayoritarios del AOV por la PPO de aceituna. Las concentraciones iniciales de cada uno de los sustratos se indican en la leyenda de la representación gráfica expresadas en mM. 0 20 40 60 80 100 120 140 0 10 20 30 40 Contenido en compuestos fenólicos (%) Tiempo (min) FDAO (0,39) IsómFAO+FAAO (0,36) FDAL (0,22) FAAL (0,08) Resultados 103 aparentemente purificado a homogeneidad electroforética, muestra un peso molecular menor en torno a los 18 kDa. Figura 50. Gel de electroforesis SDS-PAGE de extractos enzimáticos en las distintas etapas de purificación. (1) patrones de proteínas de pesos moleculares, (2) extracto crudo del polvo acetónico de semilla, (3) extracto resultante de la precipitación con sulfato amónico, (4) POXcat, (5) POXan. IV.4.2. Caracterización de las peroxidasas purificadas de semilla de aceituna Con el objeto de caracterizar las dos isoformas de POX de aceituna purificadas, POXan y POXcat, se determinaron los parámetros cinéticos básicos de ambas enzimas. IV.4.2.1 Especificidad de sustrato y selectividad de las isoformas de peroxidasa de aceituna La actividad de POXan y POXcat se ensayó tanto con sustratos colorimétricos sintéticos como con los compuestos fenólicos mayoritarios de la aceituna y el AOV, que serían los substratos naturales de la POX de aceituna, y en el proceso de extracción del aceite. Resultados 104 IV.4.2.1.1. Especificidad y selectividad de POXan y POXcat frente a los compuestos fenólicos de la aceituna En la Tabla 18 se muestran los datos de actividad relativa de ambas isoformas de POX de aceituna frente a los principales compuestos fenólicos presentes en la pulpa de aceituna. Este primer estudio de especificidad se realizó llevando a cabo incubaciones independientes con cada compuesto a concentraciones 6,5 mM, tal y como se indica en el apartado III.4.1. de Materiales y Métodos. La demetiloleuropeína utilizada fue fraccionada y purificada a partir de un extracto de fenoles de frutos de la variedad Arbequina. La POXan muestra mayor afinidad por el verbascósido, mientras la POXcat tiene máxima actividad con la demetiloleuropeína. El sustrato menos afín para ambas isoformas fue el tirosol, el único monofenol de los cinco sustratos naturales ensayados. Tabla 18. Actividad de las isoformas purificadas de peroxidasa frente a los principales compuestos fenólicos de la aceituna. Las reacciones enzimáticas se llevaron a cabo tal y como se describe en el apartado X de Materiales y Métodos. Una vez que se comprobó que las isoformas tenían actividad frente a todos los sustratos empleados, se realizaron ensayos de competencia con mezclas complejas que contenían todos los fenoles de la pulpa anteriormente mencionados y además incorporaban ligustrósido y nucénido (Figura 12). Estos dos últimos compuestos, no disponibles comercialmente, fueron extraídos de la semilla de aceituna ya que, como se indica en el apartado III.5.3. de Materiales y Métodos. El nucénido es el compuesto fenólico mayoritario Sustrato (6,5 mM) POX an Actividad relativa (%) POX cat Actividad relativa (%) Hidroxitirosol 79,31 88,12 Tirosol 41,50 54,21 Demetiloleuropeína 29,90 100 Verbascósido 100 83,39 Oleuropeína 93,93 98,96 Resultados 105 en el cotiledón, y el tegumento de la semilla resultó ser el tejido con mayores niveles de ligustrósido del fruto. Una vez obtenida una mezcla con concentraciones adecuadas de los principales compuestos fenólicos extraídos de pulpa y semilla (Mezcla 1) se realizaron las correspondientes incubaciones en las condiciones descritas en el apartado III.2.2.3. de Materiales y Métodos. Los cromatogramas correspondientes a las reacciones de 2 min se muestran en la figuras 51 y 52 y los resultados obtenidos se emplearon para confeccionar la Tabla 19. Figura 51. Actividad oxidativa de POXan frente a un extracto fenólico de aceituna que contiene cantidades variables de los principales compuestos fenólicos del fruto (Mezcla 1). La reacción enzimática y el análisis de dicha reacción se llevaron a cabo según se describe en los apartados III.2.2.3. y III.5.5. de Materiales y Métodos. 1.Acetato de hidroxitirosol; 2.Demetiloleuropeína; 3.Verbascósido; 4.Nucénido; 5.Oleuroepeína; 6.Ligustrósido. 300 0 20 25 30 35 B fenoles de fruto R POXan 2 min Tiempo (min) Absorbancia (mAU) 150 225 75 1 23 4 5 6 Resultados 106 Figura 52. Actividad oxidativa de POXcat frente a un extracto fenólico de aceituna que contiene cantidades variables de los principales compuestos fenólicos de la aceituna (Mezcla 1). La reacción enzimática y el análisis de dicha reacción se llevaron a cabo según se describe en los apartados III.2.2.3. y III.5.5. de Materiales y Métodos. 1.Acetato de hidroxitirosol; 2.Demetiloleuropeína; 3.Verbascósido; 4.Nucénido; 5.Oleuroepeína; 6.Ligustrósido. 300 0 20 25 30 35 B fenoles de fruto R POXcat 2 min Tiempo (min) Absorbancia (mAU) 150 225 75 1 23 4 5 6 Resultados 107 Tabla 19. Actividad de las isoformas POXan y POXcat frente a un extracto fenólico de aceituna que contiene cantidades variables de los principales compuestos fenólicos de la aceituna (Mezcla 1). A la vista de los datos recogidos en la Tabla 19 se puede afirmar que en presencia de una mezcla compleja con concentraciones variables de hidroxitirosol, tirosol, acetato de hidroxitirosol, demetiloleuropeína, verbascósido, nucénido, oleuropeína y ligustrósido las dos isoformas de POX purificadas muestran mayor selectividad (100%) por el acetato de hidroxitirosol a pesar de este compuesto estuviera presente a una concentración relativamente baja (0,76 mM). El verbascósido, también a muy baja concentración (0,49 mM), fue el segundo compuesto en orden de preferencia (35,73% para POXan y 42,38% para POXcat). Ambas isoformas presentaron una selectividad similar por demetiloleuropeína y oleuropeína y nula actividad frente a tirosol, nucénido y ligustrósido, todos ellos monofenoles. Estos datos son concordantes con los obtenidos las reacciones del EC de semilla con fenoles de fruto en los que, sin embargo, la máxima actividad oxidativa se encontró frente al verbascósido, al no existir acetato de hidroxitirosol en las mezclas empleadas. Dada la complejidad de las interacciones entre compuestos antioxidantes en mezclas complejas, y con el fin de conseguir información adicional sobre la selectividad de POXan y POXcat, se realizaron nuevas incubaciones con extractos fenólicos de distinta concentración. Sustrato (Mezcla 1) POX an Act relativa (%) POX cat Act relativa (%) Hidroxitirosol 0,49 mM 5,50 5,01 Tirosol 1,71 mM 0 0 Acetato de hidroxitirosol 0,76 mM 100 100 Demetiloleuropeína 2,19 mM 10,22 25,78 Verbascósido 0,49 mM 35,73 42,38 Nucénido 1,97 mM 0 0 Oleuropeína 4,58 mM 11,72 16,76 Ligustrósido 4,14 mM 0 0 Resultados 108 La Tabla 20 muestra la actividad de ambas proteínas frente a un nuevo extracto fenólico (Mezcla 2) en el que no existe acetato de hidroxitirosol y los tres glucósidos mayoritarios del fruto se encuentran en concentraciones equimolares (5 mM). En este caso, se observó una actividad relativa del 100% con el verbascósido, como ocurría en la reacción del EC de POX de semilla, y se comprobó que en presencia de concentraciones idénticas de oleuropeína y demetiloleuropeína la enzima muestra mayor selectividad por esta última. A pesar de que la concentración de ligustrósido en esta incubación también fue 5 mM no se observó reacción con este sustrato ni con ninguno de los otros dos monofenoles presentes (tirosol y nucénido). Tabla 20. Actividad de las isoformas POXan y POXcat frente a un extracto fenólico de aceituna que contiene cantidades variables de los principales compuestos fenólicos de la aceituna (Mezcla 2). Las mezclas 1 y 2 de compuestos fenólicos de fruto mostradas anteriormente se corresponden con mezclas de extractos fenólicos concentrados obtenidos a partir de pulpa de aceituna y tegumento de semilla, diseñadas de tal manera que permitiera conseguir unas concentraciones concretas de cada uno de los sustratos para poder evaluar la selectividad de cada isoforma en presencia o ausencia de ciertos compuestos y en mayor o menos proporción. Sustrato (Mezcla 2) POX an Act relativa (%) POX cat Act relativa (%) Hidroxitirosol 0,79 mM 0 0 Tirosol 3,9 mM 0 0 Acetato de hidroxitirosol 0 mM 0 0 Demetiloleuropeína 5,05 mM 51,60 66,29 Verbascósido 1,03 mM 100 100 Nucénido 5,06 mM 0 0 Oleuropeína 5,36 mM 4,00 3,80 Ligustrósido 5,00 mM 0 0 Resultados 109 A continuación, en la Tabla 21, se presentan los resultados obtenidos con una muestra real, y no una mezcla elaborada a conciencia, en la que se encuentran los fenoles típicos de un extracto de pulpa en las proporciones normales. Tabla 21. Actividad de las isoformas POXan y POXcat frente a un extracto fenólico de pulpa de la variedad piñonera (Extracto 1). Como se puede observar en la tabla anterior, en este extracto de pulpa no es posible encontrar nucénido ni cantidades significativas de ligustrósido. IV.4.2.1.2. Especificidad y selectividad de POXan y POXcat frente a los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen La Figuras 53 y 54 muestran los cromatogramas correspondientes a las reacciones de POXan y POXcat con un extracto fenólico de AOV que contiene cantidades significativas de los compuestos fenólicos más representativos. Ambas isoformas mostraron actividad fundamentalmente frente a los dos compuestos mayoritarios, FDAO e isómeros de FAO, siendo ligeramente superior (aproximadamente un 20%) la oxidación de este último compuesto. Al comparar estos datos con los resultados obtenidos en la reacción del EC de Sustrato (Extracto 1) POX an Act relativa (%) POX cat Act relativa (%) Hidroxitirosol 1,00 mM 6,42 4,95 Tirosol 0,27 mM 0 0 Acetato de hidroxitirosol 0,35 mM 100 100 Demetiloleuropeína 3,84 mM 4,25 13,54 Verbascósido 0,09 mM 24,46 27,39 Nucénido 0,00 mM 0 0 Oleuropeína 1,21 mM 17,13 12,22 Ligustrósido 0,16 mM 0 0 Resultados 110 POX de semilla con los fenoles de AOV se observa que ambas isoformas producen dos productos de oxidación anteriormente detectados en los ensayos con EC (*1 y *2). Figura 53. Degradación oxidativa de los compuestos fenólicos presentes en el AOV por acción de la isoforma POXan. La reacción enzimática y el análisis de dicha reacción se llevaron a cabo según se describe en los apartados III.2.2.3. y III.5.5. de Materiales y Métodos. *1 *2 220 0 0 10 20 30 40 B Fenoles de aceite R POXan Tiempo (min) Absorbancia (mAU) 110 165 55 1 2 Resultados 111 Figura 54. Degradación oxidativa de los compuestos fenólicos presentes en el AOV por acción de la isoforma POXcat. La reacción enzimática y el análisis de dicha reacción se llevaron a cabo según se describe en los apartados III.2.2.3. y III.5.5. de Materiales y Métodos. Una vez caracterizada la actividad de ambas isoformas frente a los principales fenoles de la aceituna y del AOV se llevó a cabo una incubación conjunta con oleuropeina, como glucósido más representativo del fruto, y los fenoles mayoritarios del AOV, FDAO y los isómeros FAO, a la misma concentración, 1,25 mM. Los valores de actividad relativa se muestran en la Tabla 22. Con ambas isoformas, POXan y POXcat, se obtuvo un resultado similar. La máxima actividad se encontró para los isómeros FAO (100%), seguida de FDAO con un 75-80% de actividad relativa, mientras que la oleuropeína resultó ser el sustrato menos oxidado por ambas isoenzimas (38-32%). *1 *2 220 0 0 10 20 30 40 B Fenoles de aceite R POXcat Tiempo (min) Absorbancia (mAU) 110 165 55 1 2 Resultados 112 Tabla 22. Actividad de las isoformas POXan y POXcat frente a un extracto fenólico que contiene concentraciones equimoleculares de oleuropeina, FDAO e isómeros FAO IV.4.2.2. Determinación de parámetros cinéticos Los sustratos seleccionados para determinar los parámetros cinéticos de las isoformas POXan y POXcat fueron el sustrato sintético guayacol y la oleuropeína como principal glucósido natural de la aceituna y el H 2 O 2 como co-sustrato. Se realizaron reacciones enzimáticas empleando concentraciones crecientes de cada uno se los sustratos obteniéndose las representaciones gráficas de Michaelis-Menten, en las que se enfrentaron las actividades enzimáticas frente a las concentraciones de guayacol,oleuropeína o H 2 O 2 , tal y como se observan en las Figuras 55-60. La representación de los dobles inversos, conocida como representación de Lineweaver-Burk, permitió la obtención de la constante aparente de Michaelis-Menten (Km) y de la velocidad máxima (Vmáx), de las isoformas purificadas para cada uno de los sustratos ensayados. Sustrato (1,25 mM) POX an Actividad relativa (%) POX cat Actividad relativa (%) Oleuropeína 37,98 32,31 FDAO 74,68 80,22 Isómeros FAO 100 100 Resultados 119 Figura 62. Efecto de la temperatura sobra la actividad de POXan y POXcat. Las peroxidasas descritas en la bibliografía son enzimas capaces de soportar altas temperaturas. Para evaluar la estabilidad térmica de POXan y POXcat se realizaron incubaciones de 1 hora con ambas isoenzimas en un amplio intervalo de temperaturas (30 - 75 ºC) midiéndose posteriormente la actividad frente a guayacol según el procedimiento descrito en Materiales y Métodos. Los resultados obtenidos, mostrados en las Figuras 63 y 64, indican en ambos casos una gran estabilidad térmica, manteniendo ambas isoformas altos niveles de actividad a temperaturas de 45-50 ºC. . 0 20 40 60 80 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Actividad relativa (%) Temperatura (ºC) POXcat POXan Resultados 120 Figura 63. Estabilidad térmica de POXan . Los extractos se incubaron a distintas temperaturas. Tras el tiempo indicado, se determinó la actividad enzimática según se describe en Materiales y Métodos. Figura 64. Estabilidad térmica de POXcat. Los extractos se incubaron a distintas temperaturas. Tras el tiempo indicado, se determinó la actividad enzimática según se describe en Materiales y Métodos. Resultados 121 IV.4.2.5. Efecto de la fuerza iónica Otra característica común a muchas proteínas con actividad POX es el notable efecto que la fuerza iónica del medio tiene sobre la actividad enzimática. Para evaluar el efecto de la fuerza iónica sobre las isoformas de POX de aceituna purificadas se emplearon disoluciones de tampón fosfato sódico, pH 6,5 con concentraciones crecientes (25-100 mM). El efecto de la fuerza iónica de dichos tampones sobre la actividad de POXan y POXcat frente a los sustratos guayacol y ABTS se muestra en la Tabla 25. Tabla 25. Efecto de la fuerza iónica sobre la actividad de POXan y POXcat. POX purificadas Actividad relativa (%) 25 mM 50 mM 75 mM 100 mM POXan vs. guayacol 100 90,63 95,61 83,83 POXcat vs. guayacol 100 89,40 89,72 79,53 POXan vs. ABTS 100 96,41 99,11 84,37 POXcat vs. ABTS 100 87,81 90,96 78,86 Se observa para ambas isoformas y para ambos sustratos que el máximo de actividad se obtiene con el tampón de menor fuerza iónica, 25 mM. Así mismo, se aprecia una mayor pérdida de actividad en el caso de la POXcat respecto a la POXan al aumentar la fuerza iónica. IV.4.2.6. Efecto de los iones metálicos sobre la actividad peroxidasa Las isoenzimas purificadas se incubaron durante 1 y 24 h a 4 ºC en presencia de diversos iones metálicos, determinándose tras dicha incubación su actividad enzimática frente al guayacol. Tal y como muestra la Tabla 26, muchos de los iones ensayados se comportaron como inhibidores inespecíficos de la actividad enzimática POX, mientras que Ca 2+ , Mg 2+ , K + y Zn 2+ tiene un marcado efecto positivo sobre la actividad de ambas proteínas. Resultados 122 Tabla 26. Efecto de los iones metálicos sobre la actividad de POXan y POXcat. POXan POXcat Ion metálico Actividad relativa (%) Actividad relativa (%) (1 mM) 1h 24h 1h 24h Ca 2+ 296,19 300,96 244,93 207,87 Mg 2+ 182,04 188,44 171,39 128,14 Na + 152,37 162,01 177,65 139,66 K + 130,84 118,16 171,82 160,20 Zn 2+ 155,40 135,13 174,10 135,12 Sin ión metálico 100 100 100 100 Fe 3+ 92,43 80,66 97,41 100,44 Ag + 117,56 90,17 142,95 43,23 Fe 2+ 83,49 60,19 90,76 31,25 Hg 2+ 2,61 0 17,93 0 Cu 2+ 9,62 13,85 18,29 5,44 IV.4.2.7. Efecto de otros inhibidores de la actividad peroxidasa Los estudios de inhibición de la actividad de las isoformas de POX de aceituna purificadas, POXan y POXcat, se llevaron a cabo utilizando inhibidores de enzimas oxidativas previamente descritos en la bibliografía. Las isoenzimas purificadas se incubaron durante 1 y 24 h a 4 ºC en presencia de los citados inhibidores y tras la incubación se determinó su actividad enzimática según las condiciones indicadas en Materiales y Métodos, tal y como se observa en la Tabla 27. Resultados 123 Tabla 27. Efecto de inhibidores de la actividad oxidativa sobre POXan y POXcat. POXan POXcat Inhibidor Actividad relativa (%) Actividad relativa (%) (1 mM) 1h 24h 1h 24h Sin inhibidor 100 100 100 100 Ác. cítrico 9,06 46,50 63,96 52,98 Glucosa 7,75 8,82 73,75 16,94 Metabisulfito 3,34 3,90 0 10,58 Ác. ascórbico 0 0 0 0 2-mercaptoetanol 0 0 0 0 Todos los inhibidores empleados mostraron el efecto esperado en mayor o menor medida. Incluso el SDS y la azida sódica (no mostrados en la Tabla 27), que pese a no mostrar efecto al pH en el que se ha realizado el ensayo (pH 6,5), mostraron su capacidad inhibitoria a pH más ácido; tal es así, que con una concentración 1mM de ambos se produjo una inhibición del 100% de la actividad POX. IV.5. FACTORES BIOQUIMICOS QUE AFECTAN A LA OXIDACIÓN DE FENOLES CATALIZADA POR POX Y PPO. En los apartados anteriores se han caracterizado las reacciones de oxidación de los principales compuestos fenólicos, de la aceituna y el aceite de oliva virgen, catalizadas por la POX y PPO de aceituna. Los ensayos in vitro ya descritos en esta memoria demuestran que ambas enzimas son capaces de oxidar a los principales compuestos fenólicos del olivo y apoyan el papel clave de ambas en la oxidación de compuestos fenólicos durante el procesado de la aceituna. En este último apartado, se describen los ensayos “in vivo” realizados con ambas enzimas con el fin de determinar cuál es su contribución real a la composición fenólica del AOV, estudiando a su vez cuales son los factores limitantes en el proceso. En este sentido, Resultados 124 utilizando el método Abencor que reproduce a escala de laboratorio el proceso de obtención del AOV, se han llevado a cabo una serie de experimentos en los que se modificaron las cargas enzimáticas de POX y PPO durante el proceso de molienda de la aceituna y posterior batido de la pasta. En el conjunto de experimentos realizados se pueden establecer distintos bloques, (IV.5.1.) centrado en estudiar las modificaciones inducidas por la temperatura, (IV.5.2) estudios de modulación de la actividad POX, (IV.5.3) estudios de modulación de actividad PPO y (IV.5.4.) efecto de moduladores inespecíficos de oxidación. IV.5.1. Modificación de la temperatura y su efecto sobre el perfil fenólico del aceite de oliva virgen IV.5.1.1. Modificación de las actividades POX y PPO durante la conservación postcosecha de la aceituna: efecto en el perfil fenólico del aceite Existen datos experimentales que relacionan las modificaciones de las actividades POX y PPO a lo largo de la maduración de la aceituna con los cambios en el contenido fenólico de los aceites obtenidos en esos estadios de maduración (apartado IV.I). En este mismo sentido, se estudió el efecto de la conservación de la aceituna a distintas temperaturas sobre las actividades POX y PPO y sobre el contenido fenólico de los aceites. Se utilizaron aceitunas de la variedad Arbequina (IM 1,5) que fueron almacenadas a dos temperaturas distintas, 4 y 25 ºC, durante el mes de octubre, manteniéndose en paralelo un control con frutos que prosiguieron su maduración en el árbol. La Figura 39 muestra imágenes de los tres lotes de frutos a lo largo de un mes. Resultados 125 Figura 39. Aspecto de las aceitunas de Arbequina recién recolectadas y almacenadas a las dos temperaturas de ensayo, 4 y 25 ºC durante el experimento de conservación a lo largo del mes de octubre de 2012. Semanalmente los frutos fueron analizados para determinar los niveles de actividad POX y PPO y paralelamente, utilizando el sistema Abencor, se obtuvieron los correspondientes aceites cuyo perfil fenólico fue también analizado. Los niveles de actividad POX y PPO detectados se muestran en la Figura 40, en la que también se han incluido los datos de actividad β-GLU por jugar un papel esencial en la formación de compuestos secoiridoideos del AOV. Resultados 126 Figura 40. Seguimiento de las actividades enzimáticas β–GLU (A), POX (B) y PPO (C) durante el experimento de conservación de aceitunas de la variedad Arbequina. 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 0 5 10 15 20 25 30 35 Actividad β-GLU (U/g pf) Tiempo (días) b-GLU fresco b-GLU 4 ºC b-GLU 25 ºC 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 5 10 15 20 25 30 35 Actividad POX (U/g pf) Tiempo (días) POX fresco POX 4 ºC POX 25 ºC 0 50 100 150 200 250 300 0 5 10 15 20 25 30 35 Actividad PPO (U/g pf) Tiempo (días) PPO fresco PPO 4 ºC PPO 25 ºC A B C Resultados 127 La evolución de las tres actividades enzimáticas es muy similar en las aceitunas recién cosechadas y en las conservadas a 4 ºC, siguiendo en ambos casos la tendencia ya descrita en la mayoría de las variedades analizadas, con un progresivo incremento de la POX y un suave descenso de los niveles de PPO. Sin embargo, se encontraron grandes diferencias en los frutos conservados a 25 ºC. La actividad β-GLU fue, sin duda, la que se vio más afectada a esta temperatura ya que, a partir de la segunda semana almacenada a 25 ºC, decae bruscamente haciéndose prácticamente cero a la tercera semana. El descenso de la actividad PPO en los frutos conservados a 25 ºC se hace muy pronunciado a partir de la segunda semana, en la que los niveles de PPO son ya significativamente menores (un 30 %) que en los frutos recién cosechados y conservados en frio, diferencias que se mantienen hasta el final del experimento. La actividad POX, también es ligeramente distinta en los frutos conservados a 25 ºC, alcanzando valores más altos que en los otros dos casos, aunque probablemente al localizarse en la semilla y estar protegida del entorno mediante el hueso de la aceituna, sus variaciones fueron menores. Así el contenido de compuestos fenólicos totales de los aceites obtenidos a partir de las aceitunas recogidas del árbol y de las aceitunas almacenadas a las dos temperaturas de ensayo fue el que se muestra en la Figura 41, mostrándose en la Figura 42 el contenido de secoiridoideos y el de o-difenoles. Resultados 128 Figura 41. Seguimiento del contenido de compuestos fenólicos durante el experimento de conservación de aceitunas de la variedad Arbequina. Figura 42. Seguimiento del contenido de derivados secoiridoideos y o-difenoles durante el experimento de conservación de aceitunas de la variedad Arbequina. Como puede deducirse a partir de estas dos figuras, las aceitunas almacenadas a la temperatura de 25 ºC no permiten obtener un perfil fenólico equivalente al que se consigue a 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 0 5 10 15 20 25 30 35 Contenido de compuestos fenólicos (µmol/kg aceite) Tiempo (días) polifenoles fresco polifenoles totales 4ºC polifenoles totales 25ºC 0 500 1000 1500 2000 0 5 10 14 21 24 28 31 Secoiridoideos fresco o-difenoles fresco Secoiridoideos 4 ºC o-difenoles 4 ºC Secoiridoideos 25 ºC o-difenoles 25 ºC Contenido de compuestos fenólicos (µmol/kg aceite) Tiempo (días) Resultados 135 Figura 44. Contenido en polifenoles totales y o-difenoles en aceites de Gordal y del zofairón de Gordal y en el aceite del ensayo de adición de semillas sobre los zofairones de Gordal. De manera más detallada, la composición fenólica de los aceites procedentes de los zofairones y del ensayo de adición de semilla sobre éstos se recoge en la Tabla 32. 0 200 400 600 800 1000 1200 Gordal Zofairón Adición semilla Polifenoles totales Contenido de compuestos fenólicos (µmol/kg aceite) Resultados 136 Tabla 32. Contenido fenólico (µmol/kg aceite) de los aceites obtenidos tras la adición de POX de semillas de aceitunas durante el procesado de frutos partenocárpicos de la variedad Gordal (IM 1). Efecto de la adición de POX semilla de aceituna Polifenoles (µmol/kg aceite) Control Zofairones G + POX sem (en molino) Hidroxitirosol 7,18 4,80 Tirosol 11,81 11,17 Ác. vaníllico 3,51 2,46 Ác. p-cumárico 29,50 26,26 Acetato hidroxitirosol 0 0 FDAO 302,540 185,24 Isómeros FAO 61,030 50,49 FDAL 363,70 291,74 Pinorresinol 3,04 3,38 Ác. cinámico 7,10 6,40 1-Acetoxipinorresinol 73,33 64,00 FAAO 46,37 27,65 FAAL 0 0 Ác. ferúlico 6,770 5,99 Luteolina 11,08 8,98 Apigenina 4,96 4,23 Polifenoles totales 931,91 692,78 o-difenoles 428,20 277,15 Secoiridoideos 773,64 555,12 *Cada dato es la media de tres determinaciones analíticas realizadas sobre dos experimentos diferentes. Los valores acompañados de letras distintas indican una diferencia significativa (p≤ 0.05). IV.5.2.3. Efecto de la adición de peróxido de hidrógeno Como se ha comentado en la Introducción la mayoría de las POX de plantas oxidan preferentemente los compuestos fenólicos a expensa de reducir especies peróxido, H 2 O 2 en la mayoría de los casos. Para explorar la posible limitación de este co-sustrato en las pastas de aceituna, se realizó un ensayo de adición de H 2 O 2 en un rango de 100-500 µL/kg aceituna Resultados 137 durante la molienda. Se observó una clara relación dosis/efecto de manera que, la mayor disponibilidad de H 2 O 2 se correlacionó con un menor contenido en compuestos fenólicos en los aceites. Se encontró un descenso del 10% de los fenoles totales cuando se añadió la dosis correspondiente a 100 µL H 2 O 2 /kg de aceituna, una disminución del 13% al añadir 200 µL H 2 O 2 /kg de aceituna y del 24% al adicionar la dosis más elevada, 500 µL H 2 O 2 /kg de aceituna (datos no mostrados). Teniendo en cuenta que, según los experimentos realizados in vitro el H 2 O 2 no es capaz de inducir por sí misma la oxidación de los compuestos fenólicos del AOV, los datos experimentales obtenidos sugieren que la oxidación mediada por POX está íntimamente ligada a la mayor o menor disponibilidad de peróxido en las pastas. En la Tabla 33 se muestran los cambios observados en el perfil fenólico de aceites obtenidos a partir de aceitunas de la variedad Picual en dos estadios de maduración extremos, IM = 1 e IM = 5 a las que se adicionó la dosis máxima de H 2 O 2 (500 µL H 2 O 2 /kg de aceituna). Los compuestos fenólicos más afectados por este tratamiento fueron los derivados secoiridoideos del hidroxitirosol, es decir FDAO, isómeros FAO y FAAO. La degradación oxidativa de estos compuestos se incrementó un 36% en el caso de aceitunas de la variedad Picual con IM = 1 y un 50% en Picual IM = 5. Dado que en ambos casos se añade un dosis idéntica, el que exista un mayor descenso de fenoles totales en el aceite producido a partir de aceitunas maduras (IM=5), estaría relacionado con la mayor carga de actividad POX que poseen los frutos en ese punto más avanzado de la maduración. Además de analizar las variaciones del perfil fenólico del AOV, en los ensayos se analizaron los contenidos de glucósidos fenólicos remanentes de las pastas de aceituna, comprobándose que la adición de H 2 O 2 también incrementa significativamente la oxidación de estos compuestos en algo más del 10%. Resultados 138 Tabla 33. Contenido fenólico (µmol/kg aceite) de los aceites obtenidos tras la adición de H 2 O 2 (510µL/ kg fruto) durante el procesado de frutos de la variedad Picual (IM=1 e IM=5) Efecto de la adición de H 2 O 2 Picual IM 1 Picual IM 5 Polifenoles (µmol/kg aceite) Control + H 2 O 2 Control + H 2 O 2 Hidroxitirosol 4,5 4,3 6,8 4,1 Tirosol 11,8 12,6 20,0 17,7 Ác. vaníllico 3,4 2,1 1,0 0,5 Ác. p-cumárico 5,0 1,5 4,6 2,6 Acetato hidroxitirosol 19,0 22,3 17,2b 6,7a FDAO 172,8b 80,5a 52,0b 29,1a Isómeros FAO 105,0b 59,4a 116,4b 48,7a FDAL 140,1 141,8 50,2 41,8 Pinorresinol 1,5 1,4 0,9 0,7 Ác. cinámico 6,6 0,7 1,4 1,0 1-Acetoxipinorresinol 19,9 14,5 19,3 17,7 FAAO 59,3b 31,8a 13,8b 6,6a FAAL 54,5 59,5 8,8 5,5 Ác. ferúlico 0,0 0,0 0,0 0,0 Luteolina 8,8 9,8 13,1 11,5 Apigenina 2,1 2,5 4,0 4,0 Polifenoles totales 614,5b 466,9a 329,5b 198,3a o-difenoles 369,6b 230,4a 219,4b 106,8a Secoiridoideos 531,9b 372,9a 241,3b 131,8a *Cada dato es la media de tres determinaciones analíticas realizadas sobre dos experimentos diferentes. Los valores acompañados de letras distintas indican una diferencia significativa (p≤ 0.05). IV.5.2.4. Adición de azida sódica. Además de los ensayos anteriormente descritos en los que se potenciaba el efecto de la POX, también se estudió el efecto de que tiene la reducción la carga enzimática POX. Después de valorar la efectividad y selectividad de distintos inhibidores se eligió la azida sódica (NaN 3 ) debido a su alta especificidad para suprimir la actividad peroxidativa Aunque es evidente Resultados 139 que, a causa de su toxicidad, este compuesto no podría ser empleado nunca como aditivo durante el proceso de elaboración el AOV sí resultaba el más adecuado para valorar individualmente la contribución de la POX dentro del conjunto de procesos oxidativos. Del mismo modo que en el ensayo de H 2 O 2 , se probaron diferentes dosis de NaN 3 (66-264 mg/kg aceituna). La Tabla 34 muestra las modificaciones inducidas en el perfil fenólico de los aceites obtenidos tras adicionar la dosis máxima de azida a frutos de la variedad Picual en dos estadios de maduración extremos. En ambos casos se observó un incremento significativo del contenido total de fenoles, un 34% en frutos de Picual IM = 1 y un 23% en frutos de Picual IM = 5, siendo de nuevo los compuestos más afectados la FDAO, FAO y sus isómeros. Resultados 140 Tabla 34. Contenido fenólico (µmol/kg aceite) de los aceites obtenidos tras la adición de azida sódica como inhibidor de POX (264 mg/ kg fruto) durante el procesado de los frutos de la variedad Picual (IM 1 e IM 5). Efecto de la adición de NaN 3 Picual IM 1 Picual IM 5 Polifenoles (µmol/kg aceite) Control + NaN 3 Control + NaN 3 Hidroxitirosol 6,0 5,9 5,6 5,4 Tirosol 18,0 17,1 17,7 20,3 Ác. vaníllico 3,7 2,7 2,0 1,9 Ác. p-cumárico 9,0 9,2 3,2 3 Acetato hidroxitirosol 0 0 0 0 FDAO 174,3b 235,4a 84,8a 127,4b Isómeros FAO 141,6 134,5 148,7b 165,7b FDAL 147,1 156,1 37,3 40,7 Pinorresinol 6,9 8,7 2,6 1,7 Ác. cinámico 19,3a 28,9b 4,6 5,8 1-Acetoxipinorresinol 0 0 11,9 16,1 FAAO 97,6a 155,9ba 10,2 14,2 FAAL 59,9 88,7 3,4 13,7 Ác. ferúlico 0,0 0,0 0,0 0,0 Luteolina 15,5 18,5 12,5 9,8 Apigenina 4,4 5,0 3,6 3,5 Polifenoles totales 703,3a 876,7b 348,0a 429,2b o-difenoles 435,0a 550,9b 261,7a 322,5b Secoiridoideos 642,3a 780,7b 284,3a 361,7b *Cada dato es la media de tres determinaciones analíticas realizadas sobre dos experimentos diferentes. Los valores acompañados de letras distintas indican una diferencia significativa (p≤ 0.05). IV.5.3. Modulación de la actividad PPO durante el proceso de obtención del aceite de oliva virgen: efecto en el perfil fenólico del aceite Igual que se ha descrito en el apartado anterior para la POX, se diseñaron una serie de experimentos tanto para implementar la carga enzimática PPO presente durante las etapas de Resultados 141 molturación de la aceituna y batido de la pasta como para reducirla, valorándose el efecto de esta modulación de la actividad sobre el perfil fenólico de los aceites. IV.5.3.1. Efecto de la adición de polifenol oxidasa de aceituna A diferencia de la POX, la actividad PPO se localiza prácticamente en su totalidad en el mesocarpo de la aceituna con valores medios en torno a 200 U de PPO /g pulpa fresca y con niveles casi indetectables en la semilla (en torno a 1 U/g semilla fresca). Estos valores tan altos de actividad PPO en la aceituna supusieron una importante dificultad a la hora de incrementar la carga efectiva de PPO mediante la adición de enzimas exógenas. En este sentido, la única enzima disponible comercialmente y con efectividad demostrada frente a los fenoles de olivo, la PPO de champiñón (SIGMA…) no poseía la suficiente actividad específica para lograr incrementos significativos de actividad PPO en las pastas de aceituna. La única fuente más efectiva de actividad PPO fue el propio polvo acetónico de pulpa de aceituna. Dado que el polvo acetónico contiene actividad β-GLU además de PPO, el experimento se llevó a cabo seleccionando polvos acetónicos de pulpa mesocarpo de aceituna conteniendo niveles diferentes de actividad PPO pero manteniendo idéntica actividad β-GLU. De este modo, se diseñaron dos tratamientos distintos, en el primero se adicionaron 6.100 U de PPO, que representan un 30% de aporte extra de actividad PPO, mientras que en el segundo el incremento del actividad fue del 100% al adicionar 20.000 U de PPO. El incremento de la carga enzimática de PPO causó un descenso proporcional del contenido fenólico tal que, con la adición del 30% de PPO la degradación oxidativa aumentó un 45% y con la adición del 100% de PPO el descenso fue de un 70%. Prácticamente, como se observa en los datos reflejados en la Tabla 35., los valores iniciales de FDAO y de los isómeros FAO caen hasta cero cuando se duplica la actividad PPO presente inicialmente en las aceitunas de la variedad Picual IM = 5 con las que se realizó el experimento. Resultados 142 Tabla 35. Contenido fenólico (µmol/kg aceite) de los aceites obtenidos tras la adición de PPO durante el procesado de los frutos de la variedad Picual (IM 5). *Cada dato es la media de tres determinaciones analíticas realizadas sobre dos experimentos diferentes. Los valores acompañados de letras distintas indican una diferencia significativa (p≤ 0.05). IV.5.3.2. Efecto de la adición de tropolona La tropolona es una sustancia natural usada para el control de patógenos en frutas que actúa como inhibidor específico de la actividad PPO. Se adicionó en distintas dosis en el intervalo de 18-480 mg/kg aceituna. La dosis más elevada se empleó para realizar ensayos de adición tanto en la molienda de los frutos de la variedad Picual IM = 1, como en el batido de Efecto de la adición de PPO de pulpa Polifenoles (µmol/ kg aceite) Control Picual IM 5 + 30% PPO + 100% PPO Hidroxitirosol 6,2 5,2 4,2 Tirosol 12,3 11,3 10,4 Ác. vaníllico 1,2 0,7 0,8 Ác. p-cumárico 0,0 0,0 0,0 Acetato hidroxitirosol 0,0 0,0 0,0 FDAO 173,7c 84,3b 15,4a Isómeros FAO 79,2c 10,3b 5,4b FDAL 224,8c 142,5b 92,9a Pinorresinol 5,4 3,2 1,7 Ác. cinámico 3,7b 0,8a 0,4a 1-Acetoxipinorresinol 50,3c 40,2b 24,8a FAAO 0,0 0,0 0,0 FAAL 0,0 0,0 0,0 Ác. ferúlico 0,0 0,0 0,0 Luteolina 9.9 9,4 10,3 Apigenina 4.4 3,7 3,4 Polifenoles totales 571,2c 311,6b 169,7a o-difenoles 269,1c 109,2b 35,3a Secoiridoideos 477,8c 237,1b 113,7a Resultados 143 las correspondientes pastas. Según se observa en la Tabla X el efecto del inhibidor resultó ser mayor cuando la adición se produjo sobre el molino, aumentando en este caso un 95% el contenido de los o-difenoles, mientras que cuando se hizo durante el batido el aumento del contenido de o-difenoles sólo llegó al 53%. Tabla 36. Contenido fenólico (µmol/kg aceite) de los aceites obtenidos tras la adición de tropolona como inhibidor de PPO (480 mg/ kg fruto) durante el procesado de los frutos de la variedad Picual (IM 1). Efecto de la adición de tropolona Polifenoles (µmol/kg aceite) Control Picual IM 1 + tropolona en molino + tropolona en batido Hidroxitirosol 9,0ab 8,0a 11,0b Tirosol 10,8a 15,8b 10,5a Ác. vaníllico 3,6a 6,4b 7,5b Ác. p-cumárico 2,7 3,1 3,1 Acetato hidroxitirosol 11,2a 19,0b 16,7b FDAO 223,6a 420,8c 321,8b Isómeros FAO 263,6a 608,7c 478,6b FDAL 162,1a 203,5b 176,7a Pinorresinol 0.0 0.0 0.0 Ác. cinámico 13,2a 25,2c 22,5b 1-Acetoxipinorresinol 0,0 0,0 0,0 FAAO 69,3a 87,6b 63,7a FAAL 15,9a 21,3b 19,5ab Ác. ferúlico 0,0 0,0 0,0 Luteolina 13,9a 16,1b 14,9ab Apigenina 7,0 6,6 6,6 Polifenoles totales 805,9a 1442,0c 1153,0b o-difenoles 590,6a 1160,1c 906,6b Secoiridoideos 734,5a 1341,8c 1060,2b *Cada dato es la media de tres determinaciones analíticas realizadas sobre dos experimentos diferentes. Los valores acompañados de letras distintas indican una diferencia significativa (p≤ 0.05). Igual que en los experimentos de modulación de la actividad POX, además de analizar las variaciones del perfil fenólico del AOV, en estos ensayos se analizaron los contenidos de Resultados 144 glucósidos fenólicos remanentes de las pastas de aceituna, comprobándose que la adición de tropolona también reduce significativamente la oxidación de estos compuestos que aumentan su contenido casi en un 40%. IV.5.4 Otros ensayos IV.5.4.1. Adición de lipoxigenasa Como se ha comentado al comienzo del apartado IV.1 la enzima LOX no parece estar implicada en la oxidación de compuestos fenólicos en la aceituna. Sin embargo, parece claro que al ser una enzima oxidativa con una potente actividad en la etapa de molturación del fruto parece claro que debe estudiarse su posible interacción con las oxidoreductasas que si oxidan a los compuestos fenólicos. Los ensayos se llevaron a cabo como en casos anteriores utilizando el sistema Abencor. Para valorar el efecto de la enzima LOX sobre la oxidación de compuestos fenólicos se realizaron adiciones de LOX comercial de soja sobre frutos de la variedad Arbequina en los dos estadios de maduración extremos IM = 1 y 5.molienda. Tal y como se puede apreciar en los resultados mostrados en la Tabla 37, la adición de LOX sobre Arbequina produjo un aumento del contenido fenólico del AOV. En Arbequina IM=1 el contenido total de fenoles aumentó un 56% y el de o-difenoles un 87% (principalmente acetato de hidroxitirosol y FDAO). En los frutos de IM=5 los incrementos fueron menores con un aumento del 17% en fenoles totales y un 31% el de o-difenoles (principalmente acetato de hidroxitirosol y, en menor medida, FDAO). Estos resultados podrían explicarse como un fenómeno de competencia, ya que tanto LOX como PPO requieren O 2 como cosustrato y el exceso de LOX limitaría la disponibilidad de O 2 para la PPO.