Filogeografía y actual flujo genético entre las poblaciones del lagarto canarión "Gallotia stehlini"

Agradecimientos Éste ha sido un trabajo de muchos años, el cual me ha permitido profundizar en el conocimiento de la metodología científica aplicada a mi campo de investigación, desde las técnicas básicas de cualquier laboratorio de Biología Molecular, hasta los últimos programas desarrollados en Bioinformática para el análisis de los resultados. Así mismo ha sido una gran oportunidad para conocer el mundo académico post-graduación. Por todo ello, quiero hacer mención a las siguientes personas que han participado, de algún modo en este gran proyecto que ha sido mi Tesis Doctoral. A mi familia: principalmente “A ellas”, apoyándome incondicionalmente en todo momento. Al Dr. Miguel Lizana Avia (Universidad de Salamanca), por haberme sabido aconsejar sabiamente y haber sido un gran profesor durante mi carrera. Al Dr. L.R.Noble (Universidad de Aberdeen, UK) por haberme aceptado en su laboratorio del Departamento de Zoología y especialmente a la Dra. Lorna MacLean que me enseñó la disciplina y profesionalidad necesaria en un laboratorio de Biología Molecular. Al Dr. R.Butlin (Universidad de Leeds, UK) y a la Dra. Tania King, en cuyo laboratorio de genética molecular realicé mi Suficiencia Investigadora, financiada por una beca “Marie Curie Training Site Fellowship”. Al Dr. Roberto Mioso (Universidad Federal de Recife, Brasil), por su inestimable colaboración en el trabajo de campo de esta tesis: 6 meses, y cerca de 500 animales trampeados. Al Dr. J.J.Pestano Brito (Universidad de Las Palmas de Gran Canaria) por haber aceptado ser codirector de mi tesis y haberme facilitado la financiación e instalaciones de laboratorio necesarias para los análisis genéticos de la tesis. Al Dr. Richard Brown (Universidad de John Moores de Liverpool, UK), como director de mi tesis, por el seguimiento constante, horas de trabajo personal y en definitiva tutela académica ejercida con mi tesis. Mi sincera gratitud. Finalmente, agradecer al CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brasil) por haberme concedido una beca modalidad Doutorado no Exterior-GDE, Processo número: 200722/2014-0, para la conclusión de esta tesis doctoral. Irma A la memoria de mi madre y a mis hijas: Paola & Amaya Índice 1. CAPÍTULO 1: Introducción general…………………………………….....1 1.1. Filogeografía: conceptos generales…….…………………………….2 1.2. Biotas insulares: importancia en los estudios sobre Evolución……..…………………………………………………..3 1.3. Gran Canaria: aspectos geológicos y ecológicos……….………......7 1.4. Gallotia stehlini (Schenkel, 1901): descripción de la especie.……………………………………………………………...13 1.5. Objetivos.………………………………………………….…………....19 2. CAPÍTULO 2: ADN mitocondrial………………………………………....21 2.1. Introducción…………………………………………………………….22 2.2. Material y métodos……………………………………………………..23 2.2.1. Trabajo de campo…………………………………………….23 2.2.2. Aislamiento del ADN genómico………….………………….25 2.2.3. Amplificación………………………………………………….26 2.2.4. Secuenciación………………………………………………..27 2.2.5. Análisis de las secuencias de ADN……….………………..28 2.2.6. Reconstrucción filogenética………………………………...29 2.3. Resultados………………………………………………………………31 2.3.1. Datos morfológicos…………………………………………...31 2.3.2. Diversidad haplotípica………………………………………..32 2.3.3. Reconstrucción filogenética………………….……………...34 2.4. Discusión………………………………………………...……………...44 3. CAPÍTULO 3: ADN nuclear……………………………………………….47 3.1. Microsatélites……………………………………………………………48 3.2. Aplicaciones y limitaciones……………………………………………49 3.3. Material y métodos……………………………………………………...50 3.3.1. Amplificación de los microsatélites…………………………50 3.3.2. Análisis de los datos genéticos……………………………..52 3.3.2.1. Diversidad genética………………………...…….52 3.3.2.2. Diferenciación y estructura poblacional………..52 3.4. Resultados……………………………………………………………...53 3.4.1. Características de los microsatélites y desviaciones de HWE…………………………………………………………………..53 3.4.2. Estructura poblacional: estadística descriptiva..…………...55 3.4.3. Parámetros poblacionales históricos: detección de mezcla genética intraespecífica…………………………………...56 3.5. Discusión………………………………………………………………..59 3.5.1. Desviaciones del equilibrio de Hardy Weinberg.………….59 3.5.2. Estructura poblacional……………………………………….59 CONCLUSIONES…………………………………………………………………...61 BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………...64 ANEXOS……………………………………………………………………………...75 Anexo I. Autorización para toma de muestras en Gallotia stehlini destinadas a uso científico…………………………………………………75 Anexo II. Median Joining Network (MJ) que representa las relaciones entre los distintos haplotipos mitocondriales……………76 Anexo III. Minimum Spanning Network (MSN)……..……………………..77 Anexo IV. Heterocigosidad observada (Ho), y heterocigosidad esperada (He), para cada locus por punto de muestreo………………...78 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Imagen de satélite del Archipiélago Canario (Google Earth).………...8 Figura 2. Distribución de las erupciones holocénicas y sectores del NE de Gran Canaria……………………………………………………………11 Figura 3. Mapa geológico de Gran Canaria……………………………………...12 Figura 4. Paisajes de la Costa norte, Centro y Sur de la isla de Gran Canaria……………………………………………………………………..14 Figura 5. Individuo de G.stehlini alimentándose de brotes vegetales….……...15 Figura 6. a/ Macho de G.stehlini, Caldera de Bandama (noreste de la isla) b/ Hembra de G.stehlini, Caldera de Bandama (noreste de la isla) c/ Macho de G.stehlini, Guía (norte de la isla) d/ Juvenil de G.stehlini, Mogán (suroeste de la isla)………………………….16 Figura 7. Comparativa entre un húmero de Gallotia galloti y otro de Gallotia goliath de yacimientos arqueológicos en la isla de Tenerife……....19 Figura 8. Esquema ADN mitocondrial…………………………………………...22 Figura 9. Localización de los puntos de muestreo……………………………...24 Figura 10. Mapa que representa las relaciones entre haplotipos resultantes de la MJ……………………………………………………………….36 Figura 11. Mapa que indica la distribución de los clusteres de los haplotipos identificados por el Minimum Spanning Network…………….38 Figura 12. Árbol consenso bayesiano en el que sólo los clados con una probabilidad del 95% HPD presentan la barra dibujada……………40 Figura 13. Cladograma con los tiempos medios de divergencia estimados al 95%HPD…………………………………………………………….41 Figura 14. Mapa con la distribución geográfica de los resultados de la inferencia Bayesiana del ADN mitocondrial de G.stehlini………………43 Figura 15. Comparación entre las distribuciones de los linajes mitocondriales de G.stehlini , Tarentola boettgeri y Chalcides sexlineatus ..46 Figura 16. Gráfico resultante de los análisis de ΔK……………..……………..57 Figura 17. Estructura genética poblacional, inferida para K=4 y 4 loci de microsatélites…………………………………………………………57 Figura 18. Representación geográfica de los 4 clústeres nucleares obtenidos………………………………………………………………58 Capítulo 1: Introducción general 6 descriptiva a una ciencia predictiva. En la que proponen que el número de especies que habitan en una isla es constante, con un equilibrio entre colonización y extinción, y que estos procesos dependen del tamaño de la isla y de su aislamiento. La teoría de MacArthur y Wilson ha tenido una gran aplicabilidad en la Biología de la Conservación al haber servido para la definición del tamaño mínimo viable de una población (Gilpin y Soulé, 1986), y para el diseño de Áreas Naturales Protegidas. En la región de estudio geográfico de este trabajo de tesis, la Macaronesia, los archipiélagos de Azores, Madeira, Salvajes, Canarias y Cabo Verde han sido objeto de numerosos estudios sobre biología evolutiva. Así por ejemplo, las relaciones filogeográficas de Lacerta dugesii, lacértido endémico de Madeira, han sido estudiadas, sugiriéndose que estas islas fueron colonizadas con bastante posterioridad a su emergencia, en comparación con las Islas Canarias, y probablemente debido a su aislamiento geográfico (Brehm et al., 2003). En Cabo Verde, los escíncidos Mabuya sp y Macroscincus sp han sido objeto de interés debido a su aparente gigantismo (gran tamaño corporal) y patrones de colonización (Carranza et al., 2001). En las Azores se ha intentado relacionar las bajas tasas de diversidad de los coleópteros, con los conceptos de especiación críptica y la reciente edad geológica del archipiélago (Amorim et al., 2012). En las Islas Canarias, se han estudiado con detalle las familias Lacertidae, Gekkonidae y Scincidae: Gallotia galloti (Brown et al., 2006); Gallotia atlantica (Bloor et al., 2008); Tarentola delalandii (Gübitz et al., 2000); Chalcides sexlineatus (Suarez et al., 2014), etc., entre otros. En general, las principales ventajas que ofrece el estudio de las islas son: los niveles de migración entre distintas islas son bajos; hay una rápida propagación de la especie colonizadora a partir de un genotipo inicial homogéneo; y posiblemente la existencia de una variedad de nichos disponibles para la creación de una divergencia adaptativa. Siendo además, los factores principales en la evolución de las especies isleñas: los cuellos de botella (“bottleneck”) genéticos, especialmente al colonizar un área previamente vacía; la adaptación en aislamiento; la oportunista (que no perfecta) naturaleza de la selección natural, ya que las poblaciones responden a la selección en base a la variabilidad disponible en Capítulo 1: Introducción general 7 ese momento y finalmente la historia ecológica de la especie, con sus patrones de colonización e interacciones (Berry, 1992). No pudiendo haber dudas en la contribución que la biología de islas ha hecho en la comprensión de la evolución, y en las paradojas que ha suscitado: las islas son pobres en especies pero ricas en endemismos, y son aparentemente estables (con biotas de millones de años) pero muy vulnerables a variables externas como el impacto antropogénico, o especies introducidas (Cronk, 1997). 1.3. Gran Canaria: aspectos geológicos y ecológicos. El Archipiélago Canario es uno de los mayores grupos de islas volcánicas en el Océano Atlántico, con un área de 7.447 km2. Formado por siete islas, cuatro islotes y seis roques, entre los 27º38´- 29º25´de latitud y 13º20´-18º90´ de longitud. Posee un clima subtropical, con temperaturas cálidas y pocas fluctuaciones estacionales, aunque fuertemente influenciado por los húmedos vientos alisios del noreste. Dadas las direcciones de estos vientos y de las corrientes marinas, el norte de África y la Península Ibérica son las fuentes más probables de potenciales colonizadores. El número de endemismos vegetales y faunísticos es muy elevado, y ha convertido al archipiélago en un centro de gran interés para los estudios sobre evolución y ecología. Así por ejemplo posee un total de 91 especies nativas de vertebrados, de las cuales 69 son aves, 13 son reptiles pertenecientes a los géneros Gallotia, Chalcides y Tarentola y 9 son mamíferos. Gran Canaria (27º00´N, 15º35´O) es la isla central del Archipiélago, con una superficie de 1.560 km2 distando 200 km de la costa oeste africana. Morfológicamente es un edificio cupuliforme, con una planta casi circular de 45 km de diámetro y un perfil transversal cónico con una altitud máxima de 1.949m. Está diseccionada radialmente por grandes cañones o barrancos, principalmente en su mitad suroeste. Capítulo 1: Introducción general 8 Figura 1. Imagen de satélite del Archipiélago Canario (Google Earth). Se pueden reconocer hasta cinco tipos distintos de pisos vegetales que proporcionan una diversidad potencial de nichos ecológicos para las distintas especies de la isla: un primer ecosistema de matorral árido subtropical (hasta los 250m de altitud). Por ejemplo, los matorrales costeros de cardonalestabaibales. Con precipitaciones anuales inferiores a 250mm y grandes niveles de insolación. Un segundo ecosistema de matorral húmedo y bosque termófilo, desde los 250m hasta los 600m de altitud, con precipitaciones entre 350 y 600mm anuales y niveles buenos de insolación. Este piso también se denomina sabinarpalmeral, por ser abundante en estas dos especies. En tercer lugar estarían los ecosistemas de bosques húmedos de laurisilva con plantas de la familia Lauraceae, entre los 600-1.000m de altitud, con una insolación reducida debida al “mar de nubes” producida por la condensación de la masa de aire de los vientos alisios, la cual aporta además una humedad adicional. Teniendo unas precipitaciones anuales entre 800 y 1.000mm. Entre este piso y el siguiente, habría un piso intermedio con comunidades de fayal-brezal. En cuarto lugar los Pinares formados exclusivamente por Pinus canariensis, desde los 1.000m hasta los 2.000m de altitud y por último los Capítulo 1: Introducción general 9 ecosistemas de matorral seco subalpino, alrededor de los 2.000m de altitud, representados por algún matorral de montaña en la isla, pero que no llega a constituir un piso vegetal en sí mismo. Hay que puntualizar, que actualmente las extensiones de los diversos ecosistemas de bosques se han visto muy disminuidas y fragmentadas en la isla de Gran Canaria, debido al impacto humano (Emerson, 2003). Con lo que a modo de síntesis se puede decir que hay varios factores ambientales que contribuyen a las particularidades ecológicas de Gran Canaria: la influencia de las corrientes frías oceánicas; los vientos alisios; las distintas altitudes; el siroco ocasional, proveniente del Sáhara occidental; los vientos de gran elevación procedentes de latitudes tropicales; y una topografía diseccionada por volcanes, acantilados, cuevas, cañones profundos y barrancos. Todo ello origina distintas zonas climáticas, con unos rangos de temperaturas diurnas muy variables y de precipitaciones a medida que se sube en altitud. La composición y edad de la parte submarina de la isla se desconoce, pero la parte sub-aérea data de unos 14.5 millones de años. Geológicamente, Gran Canaria se construyó fundamentalmente en tres fases magmáticas/ volcánicas: El Ciclo I: Mioceno (14 a 8.5 Ma). Comenzó en la costa oeste de la isla, terminando con la formación del complejo Tejeda-Fataga, con una caldera de 15-20 Km de diámetro en el centro de la isla, la Caldera de Tejeda. La actividad volcánica estuvo prácticamente ausente de Gran Canaria entre los 8.5-5 Ma, y fue muy baja entre los 10-9 Ma y entre los 5-4 Ma. Durante estos intervalos, en el que probablemente la isla alcanzó más de 2.000 m de altitud, resultó fuertemente erosionada. Formándose un sistema radial de cañones o barrancos, que han perdurado hasta la actualidad, ocupando muchos las mismas posiciones que sus ancestrales barrancos de los campos de volcanes del Mioceno (Schmincke, 1968). El Ciclo II: Plioceno inferior (5 a 3.4 Ma). Se corresponde con la formación del Roque Nublo, con un estratocono que llegó a medir 2.500 m de altitud (Anguita et al., 1991). Posteriormente el sector norte y el sector sur de este edificio volcánico sufrió un colapso gravitacional, seguido de una gran avalancha de depósitos (3-4 km3) que se desplazó hacia el SO, después hacia Capítulo 1: Introducción general 10 el S, y finalmente hacia el SE. Canalizándose principalmente por los Barrancos de Arguineguín, Fataga y Mogán, con una velocidad media de avance de 100 m/s. Cubriendo un área de unos 180 km2. Siendo la dirección NO-SE uno de los alineamientos volcanotectónicos más importante de la isla y del archipiélago, junto con el alineamiento E-O. Las avalanchas de lavas y sedimentos que invadieron el mar se extendieron 30-60 km, quedando superpuestas posteriormente por las avalanchas de Tenerife en el canal que hay entre estas dos islas. Mientras que entre Gran Canaria y Fuerteventura en el este, se formó una barrera topográfica submarina (Schmincke y Sumita, 1998). El Ciclo III: Plio-Cuaternario (3.1 Ma hasta la actualidad). Está caracterizado por pequeñas erupciones en el centro y mitad noreste de la isla (García Cacho et al., 1994). Apareciendo nuevas formaciones volcánicas como: la Caldera de Bandama. Durante este periodo post-Roque Nublo se desarrolló una cadena o “rift” volcánico de 2 km de ancho y 12 km de largo, activo entre los 3.5 y 1.9 Ma, que formó una ancha banda en sentido NO-SE cruzando la parte superior de la isla, coincidiendo con el contacto entre el viejo suroeste y el joven noreste (Guillou et al., 2004). También es importante hablar del crecimiento del grupo volcánico de La Isleta, ya que propició la división en dos sectores (según las localizaciones de las avalanchas), del NE de Gran Canaria. Sectores delimitados por una cresta NE-SO, que uniría la península de la Isleta con el centro de Gran Canaria. Capítulo 1: Introducción general 11 Figura 2. Distribución de las erupciones holocénicas y sectores del NE de Gran Canaria (Rodríguez-González et al., 2009). Hoy en día, vestigios de las avalanchas del Roque Nublo se encuentran en cinco áreas principales de la isla: el sector sur-suroeste, cubriendo un área de unos 30 km2; sector central de la isla incluyendo el monolito del Roque Nublo (13 km2); costa noroeste; costa noreste (entre la Caldera de Bandama y Jinámar) y finalmente en el oeste, Mesa del Junquillo (Mehl y Schmincke, 1999). Igualmente se puede hablar de cuatro afloramientos de basaltos de volcanes tipo escudo del Mioceno, cuya distribución se basa en estudios geológicos de la isla. Las localizaciones de Güigüi-Horgazales, Agüimes y Agaete, estarían bien apoyadas en datos de campo, mientras que la localización de Arucas es una conjetura (Schmincke y Sumita, 1998) que aún a fecha actual no ha sido confirmada. Capítulo 1: Introducción general 12 Figura 3. Mapa geológico de Gran Canaria (modificado de RodríguezGonzález et al., 2009). Durante la evolución de Gran Canaria se pueden reconocer tres grandes cambios climáticos, basándose en el estudio de los sedimentos marinos y en las evidencias de fósiles terrestres. Desde finales del Mioceno hasta mediados del Plioceno, se puede hablar de la existencia de un clima semejante al clima ecuatorial actual, en la zona de Canarias. Contrastado con la fauna presente en los depósitos mio-pliocenos de las tres islas occidentales mayores. Sería un clima muy cálido, sin estacionalidad, con constantes lluvias, y con huracanes o ciclones periódicamente. Los cuales podrían causar potentes avalanchas en la isla de Gran Canaria debido al relieve propicio y la presencia de materiales frágiles (Meco, 2008). Este período de un clima ecuatorial sin estaciones, se vería continuado por un clima árido y desértico en Euráfrica, a partir de unos 4.6 Ma (Ravelo et al., 2004), con el comienzo de un rápido ascenso del nivel del mar, causada por la fusión de hielos en latitudes más altas (Meco, 2008). Mostrando oscilaciones entre aridez y humedad que continuaron sucediendo hasta el Plio-Cuaternario, en el que hace unos 2.7 Ma ya se definiría una estacionalidad con inviernos muy húmedos continuados y veranos cálidos (Haug et al., 2005). Capítulo 1: Introducción general 13 Desde una perspectiva ecológica, las erupciones volcánicas producen nuevos hábitats estériles que cambian muy rápidamente, debido a que el estrato físico es muy inestable, con lo que la erosión actúa rápidamente, y están sujetos a las sucesiones primarias. Los primeros colonizadores suelen ser los animales aéreos, pero las especies terrestres pueden colonizar desde sustratos más antiguos adyacentes. Las Islas Canarias son un buen ejemplo para el estudio de las relaciones entre los procesos de colonización y de sucesión en las comunidades animales (Ashmole et al., 1992). En las isla de Gran Canaria, por ejemplo, las violentas erupciones que formaron el complejo del Roque Nublo fueron muy explosivas, y seguramente provocaron una masiva extinción de especies en la isla, sobreviviendo únicamente aquellas limitadas a los ambientes costeros (Marrero y Ortega., 2001), con lo que los ecosistemas boscosos de altitudes superiores fueron recolonizados y estarían datados con posterioridad al período eruptivo del Roque Nublo. Prediciéndose que la biodiversidad en Gran Canaria, medida como diversidad genética, sería inferior en los ecosistemas de bosques de laurisilva, y pinares, que en los demás ecosistemas presentes en la isla (Emerson, 2003). 1.4. Gallotia stehlini (Schenkel, 1901): descripción de la especie. Lagarto Canarión, Lagarto Gigante de Gran Canaria. Conocido vulgarmente como Lagarto Canarión o Lagarto Gigante de Gran Canaria, es un lacértido endémico de la isla de Gran Canaria, asignado taxonómicamente a la familia Lacertidae, y subfamilia Gallotiinae, con una amplia distribución desde el nivel del mar, habitando los cardonales-tabaibales, y malpaíses, hasta altitudes superiores a los 1.500 m. Pero con unas densidades muy bajas en los restos de pinares, laurisilva o faya-brezal que aún quedan en la isla. Capítulo 1: Introducción general 14 Figura 4. Paisajes de la Costa norte, Centro y Sur de la isla de Gran Canaria (Irma Herrera Bravo de Laguna). El Lagarto de Gran Canaria presenta un aspecto robusto, pudiendo alcanzar tamaños superiores a los 280 mm de longitud cabezacuerpo y pesos que sobrepasan los 950 g. Sin embargo desde la llegada del hombre al archipiélago el tamaño máximo de estos individuos ha disminuido, y raramente alcanzan los 140 mm de longitud cabeza-cuerpo. Se han encontrado evidencias del consumo de Gallotia stehlini por parte de la población aborigen en diversos yacimientos arqueológicos, aunque no parece responder a una estrategia dirigida, sino al aprovechamiento oportunista de un recurso alimenticio disponible en el medio (Martín et al., 1999).Con lo que aunque G.stehlini no es una especie en peligro de extinción, sí que ha habido una compresión en su estructura de edad-clase debido a factores antrópicos. Son animales omnívoros, aunque su dentición al presentar cada diente tres o más cúspides, junto con la presencia de un ciego intestinal, acompañado de una helmintofauna parásita asociada capaz de digerir la celulosa, podría indicar una cierta tendencia vegetariana (Carretero et al., 2006), que no es tan evidente en especie más pequeñas como G.atlantica, que aunque omnívora es básicamente insectívora, o G.galloti que sería fundamentalmente frugívora. Capítulo 1: Introducción general 15 Figura 5. Individuo de G.stehlini alimentándose de brotes vegetales (Irma Herrera Bravo de Laguna). Alcanzan la madurez sexual, en el cuarto o quinto año de vida (Castanet y Báez, 1991), poniendo las hembras una media de entre 6-14 huevos entre los meses de mayo y julio (Bannert, 1998). Los recién nacidos tienen un tamaño de unos 40 mm de longitud cabeza-cuerpo, y un diseño dorsal marcado que se pierde con la edad (Castanet y Baéz, 1991). Los adultos muestran un dorso pardo grisáceo, a veces con bandas transversales claras de borde oscuro, con ocelos claros redondeados en los costados; aunque en los machos adultos más viejos el dorso es negruzco. La región gular es anaranjada, a menudo con dos bandas oscuras a cada lado que convergen en la unión de las submaxilares. Siendo éste un carácter de dimorfismo sexual, ya que los machos presentan la coloración anaranjada de la garganta más conspicua, junto con un mayor tamaño corporal, y una cabeza de un mayor tamaño relativo (Bannert, 1998). Es una especie diurna (Bannert, 1998), y se ha comprobado que las hembras son más activas en primavera, que en verano y otoño (Vernet et al., 1995). Capítulo 2: ADN mitocondrial 22 2.1. Introducción. El ADN mitocondrial posee todas las ventajas deseadas en cualquier marcador molecular: es uniforme en su contenido genético, ya que tanto en animales multicelulares como en protozoos tiene una estructura genética sencilla compuesta de 37 genes (De la Cruz et al., 1984). Se distribuye universalmente en el reino animal; es fácil de aislar debido a que está dentro de un orgánulo y posee un gran número de copias. Las propiedades moleculares del ADN mitocondrial son: es una molécula bicatenaria, circular, cerrada, de 1620 kilobases de longitud. Con 13 subunidades polipéptidas esenciales para los procesos de fosforilación oxidativa, 2 ARN ribosómicos, 22 ARN de transferencia, y un área conocida como región control o “D-loop” (en vertebrados y equinodermos), de unos 0.8 kilobases de longitud que controla la replicación del ADN mitocondrial y la transcripción de los ARN. A diferencia del ADN nuclear no tiene intrones ni secuencias repetitivas. Figura 8. Esquema ADN mitocondrial. Posee un modo de transmisión genética directa, generalmente estrictamente materna, aunque hay reportados ejemplos de heteroplasmia debido a mutaciones o contribuciones paternas (Breton et al., 2007). No sufre procesos de recombinación, y presenta una alta tasa de evolución. Esta evolución al nivel de las secuencias de nucleótidos es rápida, siendo la mayoría Capítulo 2: ADN mitocondrial 23 de los cambios genéticos simples substituciones de bases; algunas son pequeñas inserciones o deleciones, aunque algunas pueden implicar hasta cientos de nucleótidos. Estas diferencias de tamaños suelen estar relacionadas con la región control de la molécula, que en general evoluciona muy rápido (Avise et al., 1987), y se deberían a aparentes fallos en los mecanismos de replicación del ADN y posteriores reparaciones. Consecuentemente la tasa efectiva de mutación es superior para el ADN mitocondrial que para el ADN nuclear, haciéndolo especialmente idóneo para el estudio de estructuras poblacionales a nivel intraespecífico, al ser más sensible en la detección de cuellos de botella y subdivisiones poblacionales que el ADN nuclear (Wilson et al., 1985). Las células somáticas típicas poseen cientos a miles de mitocondrias, cada una con varias copias de ADN mitocondrial, sin embargo, en general existe un haplotipo mitocondrial preponderante por cada individuo. Esta característica denominada homoplasmia, resulta fundamental para poder realizar un análisis filogeográfico, donde las unidades de estudio son los individuos. Así mismo su tipo de herencia, junto con la ausencia de procesos de recombinación, permite describir la historia matrilineal de organismos conespecíficos y con ello el poder aplicar estimaciones de reloj molecular y realizar análisis coalescentes. 2.2. Material y métodos. 2.2.1. Trabajo de campo. Campaña realizada entre abril y septiembre del 2000 con los permisos pertinentes solicitados al Cabildo de Gran Canaria, Servicio de Medio Ambiente (Anexo I). Los ejemplares de Gallotia stehlini (N=466) fueron trampeados utilizando trampas tipo “pit-fall”, enterradas a ras de suelo, en 22 puntos distribuidos independientemente y cubriendo toda la superficie de la isla de Gran Canaria. Se intentó obtener 20 individuos por punto o población muestreada, pero Capítulo 2: ADN mitocondrial 24 debido a las bajas densidades de G.stehlini en los ecosistemas de pinares y laurisilva, el número de muestra aquí varió entre 2 y 5 individuos. Figura 9. Localización de los puntos de muestreo. Punto Localidad N Latitud Longitud A=1 Mogán 20 27°52´31.34´´N 15°43´48.22´´O B=2 Guía 21 28°8´22.46´´N 15°36´6.69´´O C=3 Arucas 20 28°8´3.19´´N 15°31´5.64´´O D=4 La Atalaya de Sta. Brígida 21 28°1´57.00´´N 15°27´18.00´´O E=5 San Mateo 20 28°0´29.34´´N 15°31´52.68´´O F=6 Tejeda 20 28°0´17.71´´N 15°36´0.11´´O G=7 Teror 23 28°3´45.84´´N 15°32´0.60´´O H=8 San Isidro 21 28°1´51.66´´N 15°33´41.84´´O I=9 Gáldar 27 28°9´24.17´´N 15°39´23.11´´O J=10 Agaete 24 28°5´49.59´´N 15°41´59.93´´O K=11 Artenara 20 28°1´41.15´´N 15°41´59.68´´O L=12 Tamadaba 2 28°2´43.53´´N 15°44´48.67´´O M=13 Barranco del Laurel 3 28°4´20.73´´N 15°36´42.33´´O N=14 Tasartico 24 27°55´6.88´´N 15°48´39.94´´O O=15 Embalse Caidero de la Niña 26 27°58´53.08´´N 15°43´49.26´´O P=16 Telde 24 27°59´35.81´´N 15°23´43.90´´O Q=17 Barranco de Guayadeque 33 27°56´48.83´´N 15°32´0.79´´O R=18 Barranco de Tirajana 37 27°54´25.76´´N 15°33´47.95´´O S=19 Arinaga 22 27°51´42.46´´N 15°24´8.91´´O T=20 Arguineguín 28 27°48´36.93´´N 15°39´56.71´´O U=21 Fataga 25 27°48´42.03´´N 15°34´41.19´´O V=22 Ayacata 5 27°58´12.74´´N 15°36´45.17´´O Tabla 1. Localidades, tamaños de muestra, y coordenadas geográficas de los 22 puntos de muestreo. Capítulo 2: ADN mitocondrial 25 Se utilizaron métodos no invasivos para la obtención de las muestras de ADN, mediante la amputación de la punta de la cola. Siendo éste un método estándar, y muy utilizado, incluso para especies en peligro de extinción al no suponer ningún daño para los individuos, puesto que la autotomía de las colas es algo muy común en los lagartos, llegando a frecuencias del 80% en algunas poblaciones naturales (Van Sluys et al., 2002). Las muestras fueron conservadas en etanol al 90%, y ninguno de los animales fue extraído de su punto de muestreo. Los datos recopilados para este tipo de estudios pueden ser morfológicos y moleculares. Pero mientras los primeros reflejan cambios en el fenotipo, ej. genotipo-ambiente, los datos moleculares reflejan únicamente cambios genotípicos, con la peculiaridad de que una gran proporción de los cambios moleculares son fenotípicamente neutros y no son reflejados en los estudios puramente morfológicos. La selección Natural predice la adaptación de la especie a su ambiente, pero la habilidad de respuesta ante el cambio de estas condiciones, reside en la variabilidad del reservorio genético de las distintas poblaciones de la especie. Con lo cual, el componente genético es crítico. Se anotaron los tamaños corporales de los individuos en el campo: LCC (longitud cabeza-cola), LC (longitud cola), LP (longitud píleo), AP (anchura píleo) y la distribución sexual de los individuos. 2.2.2. Aislamiento del ADN genómico. En el estudio a nivel mitocondrial se aisló al ADN de 405 ejemplares: 20 ejemplares de 20 de los puntos de muestreo, más dos y tres ejemplares de los dos puntos restantes incompletos. Realizándose la extracción del ADN con el producto PUREGENE® Genomic DNA Isolation Kit de Gentra Systems. Siguiendo las pautas del protocolo, se colocaron 5 mm (5-10 mg) de cola fresca, previamente triturada en un eppendorf de 1.5 ml conteniendo 300 μl de solución de lisis (Cell Lysis Solution). Se añadió 4 μl de proteinasa K (Proteinase K Solution) (20 mg / ml) a la cola triturada y se mezcló mediante vórtex. Incubándose a 55ºC durante toda la noche o hasta que el tejido se Capítulo 2: ADN mitocondrial 26 hubiera disuelto, con lo que normalmente estuvieron incubándose una media de dos días. Tras este primer paso de lisis celular, se procedió a la precipitación de las proteínas, para ello se enfriaron las muestras a temperatura ambiente, y se centrifugó y cogió el sobrenadante, para tener un ADN más limpio. Se añadió 100 μl de solución de precipitación de proteínas (Protein Precipitation Solution) al lisado celular y además 250 μl de cloroformo, para ayudar a la separación de las proteínas. A continuación se aplicó un vórtex a alta velocidad, durante 20 segundos, para mezclar bien dicha solución con la muestra. Se incubó en hielo durante 5 minutos y finalmente se centrifugó a 13000-16000 G durante 3 minutos. El precipitado resultante de proteínas, formó un pellet compacto o precipitado de proteínas. Para la precipitación final del ADN se transfirió el sobrenadante (que contendría el ADN) a un nuevo eppendorf de 1.5 ml con 300 μl de isopropanol al 100%. Se mezcló la muestra invirtiéndola unas 50 veces y se centrifugó a 13000-16000 G durante 2 minutos; el ADN se visualizó como un pequeño pellet blanco. Se desechó el sobrenadante y se añadió 300 μl de etanol al 80%, invirtiéndose el tubo para lavar el pellet de ADN. Se centrifugó a 13000-16000 G durante 2 minutos, y se retiró el etanol. Se dejó secar el resto de alcohol que no se pudo retirar, a 37ºC durante 10-15 minutos. Tras ello, se añadió 50 μl de solución de hidratación (DNA Hydratation Solution), y se incubó la muestra a 37ºC durante 1 hora, o a temperatura ambiente durante toda la noche. Las concentraciones de ADN así obtenidas fueron valoradas mediante el espectrofotómetro, y las muestras aisladas fueron conservadas a –20ºC. 2.2.3. Amplificación. Se seleccionaron en un principio varias regiones mitocondriales para ser amplificadas, de las cuales finalmente se trabajó con el citocromo b, debido a su alta tasa de sustitución. Se seleccionaron 5 muestras de los ADN aislados con las mejores concentraciones y grados de pureza de cada uno de los puntos de muestreo, a excepción de los dos puntos en los que únicamente se contaba con 2 y 3 muestras. Eso dio un total de 105 muestras para amplificar. Para ello se utilizó el primer L14841 (Fu, 2000) para la cadena ligera, y el primer Capítulo 2: ADN mitocondrial 27 Gat_H15915, un primer modificado del primer H15915 original de Fu (Paul Bloor, comunicación personal), para la cadena pesada. Primer Secuencia primer sentido 5´-3´ Referencia Gat_H15915 5´ GTC CTC ATC TTT GGT TTA CAA GAC 3´ Este estudio L14841 5´ CCA TCC AAC ATC TCA GCA TGA TGA AA 3´ Fu, 2000. Tabla 2. Secuencias de los primers utilizados para la región citocromo b, designados por su extremo 3´ que corresponde a su posición en el genoma mitocondrial humano (Anderson et al., 1981). Las condiciones de amplificación utilizadas para la técnica de PCR fueron las siguientes: la reacción se realizó en un volumen de 30 μl utilizando 2ng de ADN genómico, 2.0 mM de cloruro de magnesio, 0.2 mM de cada nucleótido, 1X de tampón de PCR (Bioline, 16mM (NH4) SO4, 67mM Tris-HCL pH 8.8, 0.01% Tween-20), 0.2 unidades de Taq Polimerasa (Roche), y 0.4 μM de cada primer. Se aplicaron 35 ciclos en una PCR Eppendorf Mastercycler Gradient con los siguientes pasos : tras una desnaturalización inicial a 94°C durante 2 minutos, se programaron 35 ciclos a 94°C (30 segundos), una temperatura de anillamiento de 55°C (30 segundos), y 72°C (30 segundos) , con una extensión final a 72°C durante 10 minutos. Los productos así amplificados fueron chequeados en geles de agarosa al 2%, obteniéndose bandas únicas y limpias (sin “smears”) en torno a los 1200 pb. Estos productos amplificados de PCR se purificaron antes de realizarse las reacciones de secuenciación mediante columnas (MicrospinTM S-400 HR Columns) de Amersham Biosciences. 2.2.4. Secuenciación. Para la secuenciación de las muestras amplificadas, se siguió el protocolo pautado para la secuenciación con el kit de dRhodamina Terminator v 3.1 en el secuenciador automático ABI Prism 3100 Genetic Analyzer de Applied Biosystems. El cual proporciona todos los reactivos necesarios para la reacción Capítulo 2: ADN mitocondrial 28 de secuenciación. Así pues para un volumen total de 5 μl se añadieron: 0,5 μl de solución 1, 1,5 μl de solución 2, 8ng del ADN amplificado y purificado, 5pmoles de primer y agua bidestilada hasta completar el volumen final de la reacción. Llevándose al termociclador con las siguientes condiciones: 94ºC (2 minutos), 55ºC (30 segundos), 72ºC (30 segundos), 72ºC (10 minutos). A continuación se precipitaron las muestras, colocándolas en un Eppendorf de 1,5 ml con 16 μl de etanol al 95%, 4 μl de agua bidestilada y 5 μl de muestra. Tras aplicarles un vórtex, estuvieron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se centrifugaron a máxima velocidad durante 30 minutos, tras lo que se retiró el sobrenadante y se añadieron 62,5μl de etanol al 70%. Volviendo a centrifugarse a máxima velocidad durante diez minutos, para retirar nuevamente el sobrenadante. Dejándose evaporar los restos de alcohol a temperatura ambiente unos 15minutos. Por último, las muestras se resuspendieron en 10 μl de formamida en la gradilla del secuenciador, se pusieron en hielo (3 minutos), se desnaturalizaron a 95ºC durante tres minutos más, y se colocaron en la placa del secuenciador automático. 2.2.5. Análisis de las secuencias de ADN. Se obtuvieron secuencias de 1.200 pb de las que se removieron las regiones que contenían bases ambiguas (al comienzo y al final de las secuencias). Las secuencias fueron alineadas manualmente, corregidas y contrastadas las lecturas de las cadenas ligeras con las cadenas pesadas para cada muestra, mediante los programas BioEdit Sequence Alignment Editor (Hall, T.A. 1999) y Mega6 (Tamura et al., 2013). Las secuencias para los análisis quedaron con una longitud de 1.027 pb, las cuales al ser alineadas y traducidas no presentaron codones de parada en lugares impropios, ni presencia de pseudogenes amplificados. Los haplotipos fueron designados utilizando el programa TCS: Phylogenetic network estimation using statistical parsimony (Clement et al., 2000). De las 105 secuencias originales se descartaron aquellas cuyas lecturas no pudieron ser confirmadas por ambos primers, siempre con una perspectiva Capítulo 2: ADN mitocondrial 29 muy conservadora. Quedando entonces 90 secuencias para los análisis posteriores. 2.2.6. Reconstrucción filogenética. Se utilizaron tres métodos diferentes para investigar las relaciones entre los haplotipos, y se compararon los resultados: una Median Joining network (MJ), con la aplicación del programa Network 4.6.1.1 (Fluxus Technology Ltd. 2015); una Minimum spanning networks (MSN), por medio del programa HapStar (Teacher y Griffiths, 2011), y una inferencia Bayesiana (BEAUtiBEAST de Drummond et al., 2012). En todos los casos se crearon redes en vez de árboles, para representar más claramente las relaciones entre los haplotipos, al no limitarse las conexiones al modo lineal, o bifurcado característico de los árboles (Posada y Crandall, 2001). Una Median Joining network (MJ) comienza combinando los Minimum spanning trees en una sola red, añadiendo los vectores de conexión bajo un criterio de máxima parsimonia. Pero requiere la ausencia de recombinación, restringiéndose su uso al nivel poblacional. En los análisis se le dio el mismo peso a las transversiones que a las transiciones (1:1). Para épsilon, que es una medida del peso de la distancia genética, se eligió un valor de 0, ya que con valores en el rango de 0-5 no variaban los resultados, y con unos valores superiores se producía un colapso de los análisis que no superaban el 33 % de progreso. El cálculo de la distancia entre los vectores se realizó utilizando el criterio del coste de conexión (“connection cost”). Para el segundo método empleado, la creación de una Minimum spanning networks (MSN) se calcularon las distancias en Arlequín v.3.5.2.2 (Excoffier y Lischer, 2010), especificándose que en el análisis se incluyeran las posiciones perdidas (“missing sites”), con un nivel permitido máximo de pérdida por locus de 0.05. En HapStar se procesaron gráficamente los datos resultantes, conectándose todas las secuencias según el algoritmo de Prim (1957), sin la producción de bucles. Ambos métodos, basados en el concepto de máxima parsimonia han sido los más usados tradicionalmente debido a su simplicidad, no obstante no permiten la asignación de probabilidades a las incertidumbres asociadas con la Capítulo 2: ADN mitocondrial 30 reconstrucción de localidades ancestrales. Así mismo, al nivel intraespecífico, las relaciones entre los genes no son jerárquicas, al ser el resultado de una reproducción sexual y procesos de mutación. Muestran una divergencia conespecífica más lenta que en los individuos de distintas especies y esto limita el uso de sus caracteres para análisis filogenéticos (Posada y Crandall., 2001), disminuyendo la resolución de los métodos tradicionales: máxima probabilidad, máxima parsimonia… a favor de nuevas tendencias como el uso de redes en vez de árboles, y métodos de inferencia Bayesiana. De ahí que sea conveniente el uso de un modelo basado en una aproximación Bayesiana. De este modo, la inferencia Bayesiana de la filogenia permitió elucidar las incertidumbres con las relaciones entre los haplotipos y estimar los tiempos de divergencia simultáneamente. La inferencia Bayesiana, se distingue de otros métodos de inferencia, en que lo que se obtiene tras el análisis es una distribución de probabilidades, en las que se caracterizan sus distribuciones posteriores mediante el algoritmo de Monte Carlo (MCMC). Se evaluó cuál sería el mejor modelo de sustitución nucleotídica para las secuencias del estudio, mediante el programa jModelTest (Darriba et al., 2012). Para ello, las secuencias fueron partidas según sus posiciones (1+2) y (3) en el codón (Bofkin y Goldman, 2007). Se estudiaron las probabilidades para un total de 88 modelos, bajo un criterio bayesiano (BIC) para las comparaciones, y con tasas de variación para I y G. Se seleccionó BIC debido a que penaliza el uso excesivo de parámetros, con lo cual siempre elegirá aquellos modelos más simples, con un error absoluto y relativo menor, y consecuentemente con una mejor habilidad predictiva (Sullivan y Joyce, 2005). Para la estimación de los tiempos de divergencia, se utilizó un prior sobre los tiempos especificado por un modelo de Nacimiento-muerte (“Birthdeath model”). Se añadieron secuencias homólogas, adquiridas de GenBank de G.galloti, G.galloti palmae, G.caesaris caesaris, G.caesaris gomerae y G.atlantica para una mejor caracterización de los puntos de calibración. Los tiempos de divergencia fueron calculados calibrando los nodos a priori según Cox et al., (2010), teniendo en cuenta la edad geológica de cada una de las islas, para la datación de las distintas colonizaciones por parte de Gallotia sp. De tal modo que el nodo más basal correspondiente a la divergencia de G.stehlini del resto de los representantes del género, fue calibrado con un límite Capítulo 2: ADN mitocondrial 31 superior de 13.4 Ma. El siguiente nodo G.gallotiG.galloti palmae fue calibrado mediante una distribución uniforme con un límite superior de 1.77 Ma, y el nodo G.caesaris gomeraeG.caesaris caesaris fue calibrado con una distribución uniforme, pero con un límite superior de 1.12 Ma. Se añadió un árbol inicial de comienzo, como referencia para la ejecución de los análisis. Los análisis se repitieron para 50 millones de generaciones, muestreando la cadena cada 5.000 generaciones. A continuación tras comprobar con el programa Tracer v1.6 (Rambaut et al., 2014) que se había alcanzado la convergencia, y que el grado de confidencia de las estimaciones era aceptable, se utilizó el programa TreeAnnotator y FigTree (Morariu et al., 2008) para recopilar la información de los árboles obtenidos y obtener el árbol consenso de los resultados de los análisis. 2.3. Resultados. 2.3.1. Datos morfológicos. De los animales trampeados, en casi todos los puntos muestreados se encontró individuos que superaron los 140 mm de LCC, a excepción de en tres localidades: Tamadaba, Barranco del Laurel, y Ayacata. No se tienen datos de Mogán. En La Atalaya de Sta. Brígida y en Teror, sucedió todo lo contrario, la proporción de individuos con tallas grandes ˃ 140 mm LCC fue superior: 3 de 21, y 6 de 23 respectivamente. Indicando poblaciones de individuos con una gran longevidad, probablemente en torno a los 10-11 años de edad, según estimaciones realizadas con datos de crecimiento de las diáfisis femorales versus LCC (Castanet y Báez., 1991). Todos los individuos de estas tallas máximas eran machos. Capítulo 2: ADN mitocondrial 38 Figura 11. Mapa que indica la distribución de los clusteres de los haplotipos identificados por el Minimum Spanning Network. Con gráficos circulares indicando el número de muestra de cada clado en las distintas localidades. Capítulo 2: ADN mitocondrial 39 Finalmente, para la aplicación de la inferencia bayesiana (BEAST) en el estudio de las relaciones filogenéticas de G.stehlini, se eligieron los modelos de substitución transversional (TVM +I+G), equivalente al GTR en BEAST para las posiciones 1+2, y el modelo de substitución HKY+I+G (Hasegawa et al., 1985) para la tercera posición. Se obtuvieron valores de ESS (tamaño efectivo de muestra) superiores a 800, indicativo de una buena convergencia de las cadenas y de los priores. El árbol consenso resultante de los 10.000 árboles obtenidos, fue el árbol que en sus muestras posteriores obtuvo la máxima credibilidad de las probabilidades de los clados posteriores. Como era de esperar, la reconstrucción basada en el modelo de Nacimiento-muerte, muestra unos intervalos con un 95% HPD (representa al intervalo más compacto del parámetro seleccionado que contiene al 95% de la probabilidad posterior, es el análogo Bayesiano al intervalo de confianza) mayores a medida que se retrocede en el tiempo (Stadler et al., 2013), al permitir un número mayor de cambios en la estimación de los tamaños poblacionales que los métodos coalescentes. Capítulo 2: ADN mitocondrial 40 Figura 12. Árbol consenso bayesiano en el que sólo los clados con una probabilidad del 95% HPD presentan la barra dibujada. Capítulo 2: ADN mitocondrial 41 Figura 13. Cladograma con los tiempos medios de divergencia estimados al 95%HPD. Los valores sobre las ramas representan las probabilidades posteriores. Se identificaron 8 clados principales: un clado (coloreado de amarillo) nuevamente formado por los puntos de muestreo B y C, que estaría localizado en el norte de la isla; otro clado (coloreado de azul), representado en los puntos T, R, S, U y en V, F en menor medida, que se localizaría en la zona del sureste de Gran Canaria; un tercer clado (coloreado de rojo) que nuevamente estaría al cien por ciento en la localidad L (Tamadaba), y distribuida por las demás localidades siguiendo un transepto NO-SE. El clado coloreado de lila estaría localizado en la localidad D (La Atalaya de Santa Brígida) con un patrón de Capítulo 2: ADN mitocondrial 42 expansión hacia el sureste de la isla. El clado marcado de verde nuevamente predominaría en K (Artenara) expandiéndose por el oeste. El sexto clado (celeste) sólo estuvo presente en el punto P (Telde) y en el punto F (Tejeda). Los dos últimos clados fueron mayoritarios en el punto G (Teror; coloreado de naranja) y en el punto M (Barranco del Laurel; coloreado de fucsia), pero han sido los que han mostrado una mayor expansión geográfica; así pues el clado fucsia estaría representado en 9 de los 22 puntos de muestreo, mientras que el clado naranja lo estaría en 6 de los 22 puntos. En cuanto a la estimación de los tiempos de divergencia entre los distintos clados, el clado azul (Sur de la isla) sería el más antiguo con un tiempo estimado de divergencia de 12,4 Ma del resto de los clados. Siguiéndole el clado amarillo (Norte) con un tiempo estimado de divergencia de 11,3 Ma; el clado fucsia habría divergido hace unos 9,32 Ma de los otros clados; el clado rojo habría divergido hace 8,28 Ma. Hace 7,25 Ma habrían divergido el clado lila del clado verde, y los clados coloreados de naranja y de celeste. Llegando estos tiempos estimados de divergencia hasta un límite inferior de 1,03 Ma para algunos de los haplotipos. Nuevamente el individuo 7T (haplotipo 79) aparece como uno de los ejemplares más divergentes de todos los muestreados. Capítulo 2: ADN mitocondrial 43 Figura 14. Mapa con la distribución geográfica de los resultados de la inferencia Bayesiana del ADN mitocondrial de G.stehlini. Las localidades de muestreo están coloreadas según la pertenencia de sus individuos a cada uno de los 8 clústeres. Capítulo 2: ADN mitocondrial 44 2.4. Discusión. La isla de Gran Canaria es interesante para el estudio de patrones filogeográficos, debido a su edad geológica y a la diversidad tan amplia de nichos disponibles que ofrece, asociados a las distintas altitudes que presenta, extensión de la isla, y microclimas. Estudios filogeográficos ya se habían realizado con los dos otros saurios que cohabitan en la isla con G.stehlini. De este modo, en Tarentola boettgeri se identificaron 5 clados de haplotipos, relacionados a procesos vicariantes resultantes de la actividad volcánica de la isla, con un tiempo de divergencia de 11.0-4.6 Ma entre los dos clados principales. Coincidiendo con un período estable, antes del ciclo de actividad del Roque Nublo y Llanos de la Pez. Con mezclas de haplotipos mitocondriales, únicamente en la vertiente este de la isla. Representando estos linajes mitocondriales, procesos volcánicos de más de 2 Ma, debido probablemente a su poca capacidad de dispersión y filopatría en las hembras. Mientras que su variación morfológica estaría asociada a variables ambientales más que a sucesos históricos (Gübitz et al., 2005). La otra especie de reptil, Chalcides sexlineatus habría colonizado las isla mucho más recientemente, alrededor de unos 3.5 Ma (Brown y Pestano, 1998). En un principio, se reconocieron tres linajes: norte, sureste y suroeste (Pestano y Brown, 1999) debidos a procesos históricos de vicarianza, como consecuencia de la actividad volcánica de la isla. Estando las diferencias fenotípicas observadas en esta especie, relacionadas con adaptaciones a variables ambientales nuevamente. Estudios posteriores, han profundizado en el análisis de estos linajes, definiendo 4 linajes mitocondriales: norte, sureste, sur y oeste, y dos clusteres nucleares: norte y sur (Suárez et al., 2014). Asociándose estos resultados a procesos históricos de divergencia en alopatría y divergencias ecológicas, como ya se había conjeturado, pero se añade la idea de diversidad fenotípica asociada a distintas estrategias antidepredadoras. Se estima la colonización de Gran Canaria por Gallotia stehlini hace unos 11-13 Ma, procedente de las islas orientales del archipiélago (Cox et al., 2010), coincidiendo con el ciclo I de actividad volcánica que afectó a la costa oeste de Gran Canaria y formó el complejo geológico de Tejeda-Fataga. Sedimentos miocénicos se encuentran actualmente localizados en el sur y en Capítulo 2: ADN mitocondrial 45 algunos puntos del norte de la isla (Rodríguez-González et al., 2009). Esto concordaría con dos de los clados que aparecen bien delimitados en los tres análisis (MJ-MSNinferencia Bayesiana), con unos posteriores de valor máximo, y cuyas estimaciones de los tiempos de divergencia son las más antiguas: con un clado basal que representaría al sur de la isla, con un tiempo estimado de divergencia de 12.4 Ma del resto de los clados. Resto de clados, que se subdivirían en un clado localizado en dos localidades puntuales del norte de la isla (Guía y Arucas), cuya edad estimada estaría en torno a los 11.3 Ma; y otros dos clados con una distribución noreste-suroeste, y una distribución noroeste para el último. En general todas la edades iniciales de divergencia de los clados obtenidos giran en el intervalo de 147.5 Ma, con lo que G.stehlini nada más llegar a la isla habría experimentado una gran diversificación. Una posible explicación a estos patrones de distribución filogeográfica se sustentan en los procesos de vicarianza sufridos por G.stehlini. Durante la formación del complejo del Roque Nublo (5-3.4 Ma), con sus violentas erupciones, probablemente se extinguieron gran parte de las poblaciones, sobreviviendo las localizadas en los ambientes costeros (Marrero y Ortega., 2001) que recolonizarían nuevamente las zonas devastadas. De ahí la gran expansión que muestra el clado azul, que a partir de sus puntos costeros, ejemplo de ello es el individuo 7T (Arguineguín) que se encuentra en la base del árbol bayesiano (siendo uno de los individuos más divergentes), colonizaría toda la franja que se distribuye desde el suroeste de la isla hacia el centro de la misma, probablemente haciendo uso de la existencia de los ancestrales barrancos de los campos de volcanes del Mioceno: barranco de Fataga, barranco de Arguineguín y barranco de Mogán. El clado amarillo habría permanecido aislado en el norte, y no ha presentado procesos de expansión. Quedando a modo de refugio, debido probablemente a la actividad presentada en el norte de la isla durante el PlioCuaternario (3.4 Ma-actualidad). Ya que el grupo volcánico de La Isleta, delimitó con una cresta NE-SO toda la franja norte, desde La Isleta hacia el centro de Gran Canaria. Resultando diferenciados los clados amarillo, fucsia, rojo y verde (oeste de esta franja) de los clados naranja, lila y celeste (este de esta franja). Clados, que luego también en este período post-Roque Nublo mostraron procesos de expansión, siguiendo un patrón NO-SE dentro de sus Capítulo 2: ADN mitocondrial dos sectores iniciales, como se aprecia claramente en los clados rojos y lila, explicándose por la existencia de ancho y 12 km de largo coin et al., 2004). contacto secundario en el que se encontrarían representantes de los clados del norte, del sur del este estaría relacionada con procesos vicariantes históricos; mantenido una que muestran. C altos niveles de migración patrón exhibido por tratarse de dos especies que colonizaron Gran Canaria durante el Mioceno aunque con los distintos clados delimitados por unos límites más difusos en G.stehlini Figura 15. de (Suárez Capítulo 2: ADN mitocondrial dos sectores iniciales, como se aprecia claramente en los clados rojos y lila, explicándose por la existencia de ancho y 12 km de largo coincidiendo con el contacto entre el viejo suroeste y el joven noreste (Guillou et al., 2004). contacto secundario en el que se encontrarían representantes de los clados del norte, del sur del este estaría relacionada con procesos vicariantes históricos; mantenido una que muestran. C altos niveles de migración patrón exhibido por tratarse de dos especies que colonizaron Gran Canaria durante el Mioceno aunque con los distintos clados delimitados por unos límites más difusos en G.stehlini Figura 15. de G.stehlini (Suárez Capítulo 2: ADN mitocondrial dos sectores iniciales, como se aprecia claramente en los clados rojos y lila, explicándose por la existencia de ancho y 12 km de largo cidiendo con el contacto entre el viejo suroeste y el joven noreste (Guillou et al., 2004). contacto secundario en el que se encontrarían representantes de los clados del norte, del sur del este Así pues esta estructura diferenciada de estaría relacionada con procesos vicariantes históricos; mantenido una que muestran. C altos niveles de migración patrón exhibido por tratarse de dos especies que colonizaron Gran Canaria durante el Mioceno aunque con los distintos clados delimitados por unos límites más difusos en G.stehlini Figura 15. G.stehlini (Suárez Capítulo 2: ADN mitocondrial dos sectores iniciales, como se aprecia claramente en los clados rojos y lila, explicándose por la existencia de ancho y 12 km de largo cidiendo con el contacto entre el viejo suroeste y el joven noreste (Guillou et al., 2004). contacto secundario en el que se encontrarían representantes de los clados del norte, del sur del este Así pues esta estructura diferenciada de estaría relacionada con procesos vicariantes históricos; mantenido una que muestran. C altos niveles de migración patrón exhibido por tratarse de dos especies que colonizaron Gran Canaria durante el Mioceno aunque con los distintos clados delimitados por unos límites más difusos en G.stehlini Figura 15. G.stehlini (Suárez et al Capítulo 2: ADN mitocondrial dos sectores iniciales, como se aprecia claramente en los clados rojos y lila, explicándose por la existencia de ancho y 12 km de largo cidiendo con el contacto entre el viejo suroeste y el joven noreste (Guillou et al., 2004). contacto secundario en el que se encontrarían representantes de los clados del norte, del sur del este Así pues esta estructura diferenciada de estaría relacionada con procesos vicariantes históricos; mantenido una que muestran. C altos niveles de migración patrón exhibido por tratarse de dos especies que colonizaron Gran Canaria durante el Mioceno aunque con los distintos clados delimitados por unos límites más difusos en G.stehlini . Figura 15. G.stehlini et al Capítulo 2: ADN mitocondrial dos sectores iniciales, como se aprecia claramente en los clados rojos y lila, explicándose por la existencia de ancho y 12 km de largo cidiendo con el contacto entre el viejo suroeste y el joven noreste (Guillou et al., 2004). Y definiéndose el centro de la isla (Tejeda) como una zona de contacto secundario en el que se encontrarían representantes de los clados del norte, del sur del este Así pues esta estructura diferenciada de estaría relacionada con procesos vicariantes históricos; mantenido una que muestran. C altos niveles de migración patrón exhibido por tratarse de dos especies que colonizaron Gran Canaria durante el Mioceno aunque con los distintos clados delimitados por unos límites más difusos en Comparación entre las distribuciones de los linajes mitocondriales G.stehlini , et al., 2014). Capítulo 2: ADN mitocondrial dos sectores iniciales, como se aprecia claramente en los clados rojos y lila, explicándose por la existencia de ancho y 12 km de largo cidiendo con el contacto entre el viejo suroeste y el joven noreste (Guillou Y definiéndose el centro de la isla (Tejeda) como una zona de contacto secundario en el que se encontrarían representantes de los clados del norte, del sur del este Así pues esta estructura diferenciada de estaría relacionada con procesos vicariantes históricos; mantenido una cierta que muestran. C altos niveles de migración patrón exhibido por tratarse de dos especies que colonizaron Gran Canaria durante el Mioceno aunque con los distintos clados delimitados por unos límites más difusos en Comparación entre las distribuciones de los linajes mitocondriales , Tarentola boettgeri ., 2014). Capítulo 2: ADN mitocondrial dos sectores iniciales, como se aprecia claramente en los clados rojos y lila, explicándose por la existencia de ancho y 12 km de largo cidiendo con el contacto entre el viejo suroeste y el joven noreste (Guillou Y definiéndose el centro de la isla (Tejeda) como una zona de contacto secundario en el que se encontrarían representantes de los clados del norte, del sur del este Así pues esta estructura diferenciada de estaría relacionada con procesos vicariantes históricos; cierta que muestran. Con lo cual, prevalecería la divergencia genética a pesar de altos niveles de migración patrón exhibido por tratarse de dos especies que colonizaron Gran Canaria durante el Mioceno aunque con los distintos clados delimitados por unos límites más difusos en Comparación entre las distribuciones de los linajes mitocondriales Tarentola boettgeri ., 2014). Capítulo 2: ADN mitocondrial dos sectores iniciales, como se aprecia claramente en los clados rojos y lila, explicándose por la existencia de ancho y 12 km de largo cidiendo con el contacto entre el viejo suroeste y el joven noreste (Guillou Y definiéndose el centro de la isla (Tejeda) como una zona de contacto secundario en el que se encontrarían representantes de los clados del norte, del sur del este Así pues esta estructura diferenciada de estaría relacionada con procesos vicariantes históricos; cierta on lo cual, prevalecería la divergencia genética a pesar de altos niveles de migración patrón exhibido por Tarentola tratarse de dos especies que colonizaron Gran Canaria durante el Mioceno aunque con los distintos clados delimitados por unos límites más difusos en Comparación entre las distribuciones de los linajes mitocondriales Tarentola boettgeri ., 2014). dos sectores iniciales, como se aprecia claramente en los clados rojos y lila, explicándose por la existencia de ancho y 12 km de largo en sentido N cidiendo con el contacto entre el viejo suroeste y el joven noreste (Guillou Y definiéndose el centro de la isla (Tejeda) como una zona de contacto secundario en el que se encontrarían representantes de los clados del y del oeste. Así pues esta estructura diferenciada de estaría relacionada con procesos vicariantes históricos; divergencia a pesar de los altos niveles de on lo cual, prevalecería la divergencia genética a pesar de altos niveles de migración Tarentola tratarse de dos especies que colonizaron Gran Canaria durante el Mioceno aunque con los distintos clados delimitados por unos límites más difusos en Comparación entre las distribuciones de los linajes mitocondriales Tarentola boettgeri dos sectores iniciales, como se aprecia claramente en los clados rojos y lila, explicándose por la existencia de en sentido N cidiendo con el contacto entre el viejo suroeste y el joven noreste (Guillou Y definiéndose el centro de la isla (Tejeda) como una zona de contacto secundario en el que se encontrarían representantes de los clados del y del oeste. Así pues esta estructura diferenciada de estaría relacionada con procesos vicariantes históricos; divergencia a pesar de los altos niveles de on lo cual, prevalecería la divergencia genética a pesar de altos niveles de migración. C Tarentola tratarse de dos especies que colonizaron Gran Canaria durante el Mioceno aunque con los distintos clados delimitados por unos límites más difusos en Comparación entre las distribuciones de los linajes mitocondriales Tarentola boettgeri dos sectores iniciales, como se aprecia claramente en los clados rojos y lila, explicándose por la existencia de en sentido N cidiendo con el contacto entre el viejo suroeste y el joven noreste (Guillou Y definiéndose el centro de la isla (Tejeda) como una zona de contacto secundario en el que se encontrarían representantes de los clados del y del oeste. Así pues esta estructura diferenciada de estaría relacionada con procesos vicariantes históricos; divergencia a pesar de los altos niveles de on lo cual, prevalecería la divergencia genética a pesar de . C Tarentola tratarse de dos especies que colonizaron Gran Canaria durante el Mioceno aunque con los distintos clados delimitados por unos límites más difusos en Comparación entre las distribuciones de los linajes mitocondriales Tarentola boettgeri dos sectores iniciales, como se aprecia claramente en los clados rojos y lila, explicándose por la existencia de en sentido N cidiendo con el contacto entre el viejo suroeste y el joven noreste (Guillou Y definiéndose el centro de la isla (Tejeda) como una zona de contacto secundario en el que se encontrarían representantes de los clados del y del oeste. Así pues esta estructura diferenciada de estaría relacionada con procesos vicariantes históricos; divergencia a pesar de los altos niveles de on lo cual, prevalecería la divergencia genética a pesar de . Con un Tarentola sp que a tratarse de dos especies que colonizaron Gran Canaria durante el Mioceno aunque con los distintos clados delimitados por unos límites más difusos en Comparación entre las distribuciones de los linajes mitocondriales Tarentola boettgeri dos sectores iniciales, como se aprecia claramente en los clados rojos y lila, explicándose por la existencia de en sentido N cidiendo con el contacto entre el viejo suroeste y el joven noreste (Guillou Y definiéndose el centro de la isla (Tejeda) como una zona de contacto secundario en el que se encontrarían representantes de los clados del y del oeste. Así pues esta estructura diferenciada de estaría relacionada con procesos vicariantes históricos; divergencia a pesar de los altos niveles de on lo cual, prevalecería la divergencia genética a pesar de on un sp que a tratarse de dos especies que colonizaron Gran Canaria durante el Mioceno aunque con los distintos clados delimitados por unos límites más difusos en Comparación entre las distribuciones de los linajes mitocondriales Tarentola boettgeri dos sectores iniciales, como se aprecia claramente en los clados rojos y lila, explicándose por la existencia de una cadena o “rift” en sentido NO cidiendo con el contacto entre el viejo suroeste y el joven noreste (Guillou Y definiéndose el centro de la isla (Tejeda) como una zona de contacto secundario en el que se encontrarían representantes de los clados del Así pues esta estructura diferenciada de estaría relacionada con procesos vicariantes históricos; divergencia a pesar de los altos niveles de on lo cual, prevalecería la divergencia genética a pesar de on una reconstrucción filogenética, más similar al sp que a tratarse de dos especies que colonizaron Gran Canaria durante el Mioceno aunque con los distintos clados delimitados por unos límites más difusos en Comparación entre las distribuciones de los linajes mitocondriales (Gübitz 46 dos sectores iniciales, como se aprecia claramente en los clados rojos y lila, una cadena o “rift” O - SE cidiendo con el contacto entre el viejo suroeste y el joven noreste (Guillou Y definiéndose el centro de la isla (Tejeda) como una zona de contacto secundario en el que se encontrarían representantes de los clados del Así pues esta estructura diferenciada de estaría relacionada con procesos vicariantes históricos; divergencia a pesar de los altos niveles de on lo cual, prevalecería la divergencia genética a pesar de a reconstrucción filogenética, más similar al sp que a tratarse de dos especies que colonizaron Gran Canaria durante el Mioceno aunque con los distintos clados delimitados por unos límites más difusos en Comparación entre las distribuciones de los linajes mitocondriales (Gübitz 46 dos sectores iniciales, como se aprecia claramente en los clados rojos y lila, una cadena o “rift” SE cidiendo con el contacto entre el viejo suroeste y el joven noreste (Guillou Y definiéndose el centro de la isla (Tejeda) como una zona de contacto secundario en el que se encontrarían representantes de los clados del Así pues esta estructura diferenciada de estaría relacionada con procesos vicariantes históricos; divergencia a pesar de los altos niveles de on lo cual, prevalecería la divergencia genética a pesar de a reconstrucción filogenética, más similar al sp que a Chalcides tratarse de dos especies que colonizaron Gran Canaria durante el Mioceno aunque con los distintos clados delimitados por unos límites más difusos en Comparación entre las distribuciones de los linajes mitocondriales (Gübitz dos sectores iniciales, como se aprecia claramente en los clados rojos y lila, una cadena o “rift” SE que cruzó cidiendo con el contacto entre el viejo suroeste y el joven noreste (Guillou Y definiéndose el centro de la isla (Tejeda) como una zona de contacto secundario en el que se encontrarían representantes de los clados del Así pues esta estructura diferenciada de estaría relacionada con procesos vicariantes históricos; divergencia a pesar de los altos niveles de on lo cual, prevalecería la divergencia genética a pesar de a reconstrucción filogenética, más similar al Chalcides tratarse de dos especies que colonizaron Gran Canaria durante el Mioceno aunque con los distintos clados delimitados por unos límites más difusos en Comparación entre las distribuciones de los linajes mitocondriales (Gübitz et al dos sectores iniciales, como se aprecia claramente en los clados rojos y lila, una cadena o “rift” que cruzó cidiendo con el contacto entre el viejo suroeste y el joven noreste (Guillou Y definiéndose el centro de la isla (Tejeda) como una zona de contacto secundario en el que se encontrarían representantes de los clados del Así pues esta estructura diferenciada de estaría relacionada con procesos vicariantes históricos; divergencia a pesar de los altos niveles de on lo cual, prevalecería la divergencia genética a pesar de a reconstrucción filogenética, más similar al Chalcides tratarse de dos especies que colonizaron Gran Canaria durante el Mioceno aunque con los distintos clados delimitados por unos límites más difusos en Comparación entre las distribuciones de los linajes mitocondriales et al dos sectores iniciales, como se aprecia claramente en los clados rojos y lila, una cadena o “rift” que cruzó cidiendo con el contacto entre el viejo suroeste y el joven noreste (Guillou Y definiéndose el centro de la isla (Tejeda) como una zona de contacto secundario en el que se encontrarían representantes de los clados del Así pues esta estructura diferenciada de distintos estaría relacionada con procesos vicariantes históricos; divergencia a pesar de los altos niveles de on lo cual, prevalecería la divergencia genética a pesar de a reconstrucción filogenética, más similar al Chalcides tratarse de dos especies que colonizaron Gran Canaria durante el Mioceno aunque con los distintos clados delimitados por unos límites más difusos en Comparación entre las distribuciones de los linajes mitocondriales et al., 2005) y dos sectores iniciales, como se aprecia claramente en los clados rojos y lila, una cadena o “rift” que cruzó cidiendo con el contacto entre el viejo suroeste y el joven noreste (Guillou Y definiéndose el centro de la isla (Tejeda) como una zona de contacto secundario en el que se encontrarían representantes de los clados del distintos estaría relacionada con procesos vicariantes históricos; divergencia a pesar de los altos niveles de on lo cual, prevalecería la divergencia genética a pesar de a reconstrucción filogenética, más similar al Chalcides sp como cabría esperar, al tratarse de dos especies que colonizaron Gran Canaria durante el Mioceno aunque con los distintos clados delimitados por unos límites más difusos en Comparación entre las distribuciones de los linajes mitocondriales ., 2005) y dos sectores iniciales, como se aprecia claramente en los clados rojos y lila, una cadena o “rift” que cruzó la parte superior de la isla, cidiendo con el contacto entre el viejo suroeste y el joven noreste (Guillou Y definiéndose el centro de la isla (Tejeda) como una zona de contacto secundario en el que se encontrarían representantes de los clados del distintos estaría relacionada con procesos vicariantes históricos; divergencia a pesar de los altos niveles de on lo cual, prevalecería la divergencia genética a pesar de a reconstrucción filogenética, más similar al sp como cabría esperar, al tratarse de dos especies que colonizaron Gran Canaria durante el Mioceno aunque con los distintos clados delimitados por unos límites más difusos en Comparación entre las distribuciones de los linajes mitocondriales ., 2005) y dos sectores iniciales, como se aprecia claramente en los clados rojos y lila, una cadena o “rift” volcánico de 2 km de la parte superior de la isla, cidiendo con el contacto entre el viejo suroeste y el joven noreste (Guillou Y definiéndose el centro de la isla (Tejeda) como una zona de contacto secundario en el que se encontrarían representantes de los clados del distintos estaría relacionada con procesos vicariantes históricos; divergencia a pesar de los altos niveles de on lo cual, prevalecería la divergencia genética a pesar de a reconstrucción filogenética, más similar al sp como cabría esperar, al tratarse de dos especies que colonizaron Gran Canaria durante el Mioceno aunque con los distintos clados delimitados por unos límites más difusos en Comparación entre las distribuciones de los linajes mitocondriales ., 2005) y dos sectores iniciales, como se aprecia claramente en los clados rojos y lila, volcánico de 2 km de la parte superior de la isla, cidiendo con el contacto entre el viejo suroeste y el joven noreste (Guillou Y definiéndose el centro de la isla (Tejeda) como una zona de contacto secundario en el que se encontrarían representantes de los clados del distintos haplogrupos estaría relacionada con procesos vicariantes históricos; divergencia a pesar de los altos niveles de on lo cual, prevalecería la divergencia genética a pesar de a reconstrucción filogenética, más similar al sp como cabría esperar, al tratarse de dos especies que colonizaron Gran Canaria durante el Mioceno aunque con los distintos clados delimitados por unos límites más difusos en Comparación entre las distribuciones de los linajes mitocondriales ., 2005) y Chalcides sexlineatus dos sectores iniciales, como se aprecia claramente en los clados rojos y lila, volcánico de 2 km de la parte superior de la isla, cidiendo con el contacto entre el viejo suroeste y el joven noreste (Guillou Y definiéndose el centro de la isla (Tejeda) como una zona de contacto secundario en el que se encontrarían representantes de los clados del haplogrupos estaría relacionada con procesos vicariantes históricos; los cuales divergencia a pesar de los altos niveles de on lo cual, prevalecería la divergencia genética a pesar de a reconstrucción filogenética, más similar al sp como cabría esperar, al tratarse de dos especies que colonizaron Gran Canaria durante el Mioceno aunque con los distintos clados delimitados por unos límites más difusos en Comparación entre las distribuciones de los linajes mitocondriales Chalcides sexlineatus dos sectores iniciales, como se aprecia claramente en los clados rojos y lila, volcánico de 2 km de la parte superior de la isla, cidiendo con el contacto entre el viejo suroeste y el joven noreste (Guillou Y definiéndose el centro de la isla (Tejeda) como una zona de contacto secundario en el que se encontrarían representantes de los clados del haplogrupos los cuales divergencia a pesar de los altos niveles de on lo cual, prevalecería la divergencia genética a pesar de a reconstrucción filogenética, más similar al sp como cabría esperar, al tratarse de dos especies que colonizaron Gran Canaria durante el Mioceno aunque con los distintos clados delimitados por unos límites más difusos en Comparación entre las distribuciones de los linajes mitocondriales Chalcides sexlineatus dos sectores iniciales, como se aprecia claramente en los clados rojos y lila, volcánico de 2 km de la parte superior de la isla, cidiendo con el contacto entre el viejo suroeste y el joven noreste (Guillou Y definiéndose el centro de la isla (Tejeda) como una zona de contacto secundario en el que se encontrarían representantes de los clados del haplogrupos los cuales divergencia a pesar de los altos niveles de on lo cual, prevalecería la divergencia genética a pesar de a reconstrucción filogenética, más similar al sp como cabría esperar, al tratarse de dos especies que colonizaron Gran Canaria durante el Mioceno aunque con los distintos clados delimitados por unos límites más difusos en Comparación entre las distribuciones de los linajes mitocondriales Chalcides sexlineatus dos sectores iniciales, como se aprecia claramente en los clados rojos y lila, volcánico de 2 km de la parte superior de la isla, cidiendo con el contacto entre el viejo suroeste y el joven noreste (Guillou Y definiéndose el centro de la isla (Tejeda) como una zona de contacto secundario en el que se encontrarían representantes de los clados del haplogrupos los cuales divergencia a pesar de los altos niveles de introgresión on lo cual, prevalecería la divergencia genética a pesar de a reconstrucción filogenética, más similar al sp como cabría esperar, al tratarse de dos especies que colonizaron Gran Canaria durante el Mioceno aunque con los distintos clados delimitados por unos límites más difusos en Comparación entre las distribuciones de los linajes mitocondriales Chalcides sexlineatus dos sectores iniciales, como se aprecia claramente en los clados rojos y lila, volcánico de 2 km de la parte superior de la isla, cidiendo con el contacto entre el viejo suroeste y el joven noreste (Guillou Y definiéndose el centro de la isla (Tejeda) como una zona de contacto secundario en el que se encontrarían representantes de los clados del haplogrupos o clados los cuales habrían introgresión on lo cual, prevalecería la divergencia genética a pesar de a reconstrucción filogenética, más similar al sp como cabría esperar, al tratarse de dos especies que colonizaron Gran Canaria durante el Mioceno aunque con los distintos clados delimitados por unos límites más difusos en Comparación entre las distribuciones de los linajes mitocondriales Chalcides sexlineatus dos sectores iniciales, como se aprecia claramente en los clados rojos y lila, volcánico de 2 km de la parte superior de la isla, cidiendo con el contacto entre el viejo suroeste y el joven noreste (Guillou Y definiéndose el centro de la isla (Tejeda) como una zona de contacto secundario en el que se encontrarían representantes de los clados del o clados habrían introgresión on lo cual, prevalecería la divergencia genética a pesar de a reconstrucción filogenética, más similar al sp como cabría esperar, al tratarse de dos especies que colonizaron Gran Canaria durante el Mioceno aunque con los distintos clados delimitados por unos límites más difusos en Comparación entre las distribuciones de los linajes mitocondriales Chalcides sexlineatus dos sectores iniciales, como se aprecia claramente en los clados rojos y lila, volcánico de 2 km de la parte superior de la isla, cidiendo con el contacto entre el viejo suroeste y el joven noreste (Guillou Y definiéndose el centro de la isla (Tejeda) como una zona de contacto secundario en el que se encontrarían representantes de los clados del o clados habrían introgresión on lo cual, prevalecería la divergencia genética a pesar de los a reconstrucción filogenética, más similar al sp como cabría esperar, al tratarse de dos especies que colonizaron Gran Canaria durante el Mioceno aunque con los distintos clados delimitados por unos límites más difusos en Comparación entre las distribuciones de los linajes mitocondriales Chalcides sexlineatus dos sectores iniciales, como se aprecia claramente en los clados rojos y lila, volcánico de 2 km de la parte superior de la isla, cidiendo con el contacto entre el viejo suroeste y el joven noreste (Guillou Y definiéndose el centro de la isla (Tejeda) como una zona de contacto secundario en el que se encontrarían representantes de los clados del o clados, habrían introgresión los a reconstrucción filogenética, más similar al sp como cabría esperar, al tratarse de dos especies que colonizaron Gran Canaria durante el Mioceno, aunque con los distintos clados delimitados por unos límites más difusos en Comparación entre las distribuciones de los linajes mitocondriales Chalcides sexlineatus dos sectores iniciales, como se aprecia claramente en los clados rojos y lila, volcánico de 2 km de la parte superior de la isla, cidiendo con el contacto entre el viejo suroeste y el joven noreste (Guillou Y definiéndose el centro de la isla (Tejeda) como una zona de contacto secundario en el que se encontrarían representantes de los clados del , habrían introgresión los sp como cabría esperar, al , Comparación entre las distribuciones de los linajes mitocondriales Capítulo 3: ADN nuclear 47 CAPÍTULO 3: ADN NUCLEAR Capítulo 3: ADN nuclear 54 homólogos pueden ser muy largos y variables en una de las especies, y muy cortos y monomórficos en la otra (Ellegren et al., 1997). El número promedio de alelos por locus varió de 2 a 13 para los loci Gat2 y Gat3, y de 1-2 alelos por loci para Gat4 y Gat5. Todos los loci fueron polimórficos para todas las localidades, menos el locus Gat5 que fue monomórfico para los puntos C, G, L, O, R, S y T, y el locus Gat4 que también resultó monomórfico en el punto V. El valor medio de la heterocigosidad observada fue de 0.462±0.037, y el valor medio de la heterocigosidad esperada fue de 0.481±0.034 (ver Anexo IV para valores de Ho y He desglosados por punto de muestreo). Locus Número de alelos Rango de Tm de los alelos (pb) H o H e G.stehlini G.atlantica Gat2 2-13 135-205 183-209 0.858±0.026 0.805±0.737 Gat3 2-13 91-144 103-215 0.653±0.044 0.737±0.022 Gat4 1-2 130-134 161-308 0.292±0.033 0.280±0.029 Gat5 1-2 364-368 397-442 0.047±0.013 0.102±0.027 Tabla 6. Datos de los microsatélites amplificados en G.stehlini. Ho y He se correponden con la heterocigosidad observada y esperada promedio, para cada locus respectivamente. De los 22 puntos de muestreo, aquellos que se desviaron del equilibrio de Hardy-Weinberg tras aplicar una chi-cuadrada de Pearson, fueron A, B, N y P, para el locus Gat5 dando estadísticamente altamente significativo con un nivel de significación (p˂0.001). Mientras que A, B, H, I, Q dieron significativo (p˂ 0.005) para el locus Gat3. El punto N dio también significativo para el locus Gat2, y finalmente el punto Q para el locus Gat5. Indicando que en estos 7 puntos de muestreo se estaría dando algún tipo de fuerza evolutiva: selección, flujo genético, deriva genética, o procesos de mutación, que estarían modificando el equilibrio de Hardy-Weinberg de esas poblaciones. Capítulo 3: ADN nuclear 55 Punto de muestreo Gat2 Gat3 Gat4 Gat5 A: Mogán p˂ 0.005 p˂0.001 B: Guía p˂ 0.005 p˂0.001 H: San Isidro p˂ 0.005 I: Gáldar p˂ 0.005 N: Tasartico p˂ 0.005 p˂0.001 P: Telde p˂0.001 Q: Barranco de Guayadeque p˂ 0.005 p˂ 0.005 Tabla 7. Loci alejados del equilibrio de Hardy-Weinberg por localidad. 3.4.2. Estructura poblacional: estadística descriptiva. Valores negativos del índice de fijación F, se obtuvieron para dos o más de los cuatro loci en 16 de los 22 puntos de muestreo del estudio. Con el caso extremo del punto J, en el que los cuatro loci dieron negativo, mostrando un exceso de heterocigosidad. Lo contrario sucedió para los 5 puntos restantes: AB-P-Q-S-V, en los que se obtuvieron resultados cercanos al cero, indicando fenómenos de apareamiento al azar; pero de endogamia (con un valor de 1) para el locus Gat5 (en los puntos B y V) y para el locus Gat3 (en los puntos M y P). No obstante, el valor medio de este índice considerando a todos los puntos muestreados y por loci, indicaría una selección heterótica o emparejamientos selectivos para Gat2 y Gat4, y la prevalencia de los apareamientos al azar para Gat3 y Gat5. Locus F F is F it F st N m Gat2 -0.078 ±0.035 -0.066 0.039 0.098 2.309 Gat3 0.123 ± 0.062 0.114 0.205 0.103 2.186 Gat4 -0.044± 0.038 -0.042 0.047 0.086 2.658 Gat5 0.337 ±0.103 0.534 0.592 0.126 1.737 Tabla 8. Valores medios del índice de fijación F, de los índices estadísticos de F de Wright, y del número de migrantes efectivos, por loci y poblaciones. Capítulo 3: ADN nuclear 56 Para los coeficientes F de Wright, los valores promedio que se han obtenido para los 4 loci de Fst están en el intervalo de 0.08-0.12. Valores bastante distantes del valor máximo posible para Fst, con lo que el análisis indicaría una diferenciación genética moderada (Hartl y Clark, 1997) para las frecuencias alélicas, en los distintos puntos de muestreo estudiados. Lo cual corrobora los datos anteriores obtenidos de selección heterótica, ya que al no haber prácticamente diferenciación genética entre poblaciones, no habría reducción en la heterocigosis, con un fenómeno de sobredominancia o favorecimiento del genotipo heterocigoto por parte de la selección natural, manteniéndose el polimorfismo. Igualmente, los valores negativos del índice Fis para Gat2 y Gat4 estarían confirmando la desviación de las proporciones de Hardy-Weinberg de estos dos loci en las distintas subpoblaciones. El estimador Nm, nos estaría indicando el número de migrantes efectivos. El valor promedio de Nm para todas las poblaciones y con los 4 loci fue de 2.222 (± 0.190), valor intermedio entre 0-4, con lo que habría un cierto desequilibrio a favor del flujo genético y no de la deriva genética como fuerza evolutiva que estaría actuando, ya que valores altos indicarían prevalencia del flujo genético mientras que valores bajos indicarían que la deriva genética estaría actuando independientemente en cada una de las poblaciones. 3.4.3. Parámetros poblacionales históricos: detección de mezcla genética intraespecífica. Con STRUCTURE los mejores clústeres son aquellos que aplican los datos más realistas de K, para ello es aconsejable obtener el menor valor de K que maximice la probabilidad total de los datos (Kalinowski, 2011). K=4 fue la mejor inferencia del valor de K, calculada según la tasa de cambio de segundo orden de la probabilidad (Evanno et al., 2005). Con un valor de ΔK= 5.739741 para 4 poblaciones, siendo el segundo valor más alto un ΔK= 2.943614 para 8 poblaciones. Capítulo 3: ADN nuclear 57 Figura 16. Gráfico resultante de los análisis de ΔK. Con lo cual se distinguieron 4 clústeres genéticamente, representados en el siguiente gráfico de barras poblacional, en el que se apuntan las 22 localidades estudiadas. Figura 17. Estructura genética poblacional, inferida para K=4 y 4 loci de microsatélites. En general, los grupos estuvieron relacionados con sus localidades geográficas, con valores de r˂1 (en el intervalo 0.1881-0.4762 para cada una de las interacciones). Este parámetro indica, cuando es menor que uno, que existe una estructura poblacional, y que ésta es dependiente de las localidades muestreadas. El clúster I (amarillo) obtuvo su mayor valor de Q= 0.6772 en la localidad 2 (Punto de muestreo B: GuíaNorte de Gran Canaria). El clúster II (rosa) predominó en la localidad 19 (Punto de muestreo S: ArinagaSureste) con un valor de Q=0.8116. El clúster III (fucsia) con un valor de Q=0.8316 predominó en la localidad 15 (Punto de muestreo O: embalse Caidero de la Capítulo 3: ADN nuclear 58 NiñaSuroeste), y el clúster IV (verde) obtuvo su máximo valor Q= 0.91 en la localidad 10 (Punto de muestreo J: AgaeteNoroeste).Todos los clústeres presentan individuos mezclados de los otros clústeres, en mayor o menor proporción, lo cual indica un gran flujo genético entre las poblaciones. Pero sí, se pueden marcar los 4 linajes principales, teniendo en cuenta el clúster predominante en cada punto muestreado. De tal modo que el clúster I estaría formado por: GuíaTejedaGáldarBarranco del Laurel y Tasartico. El clúster II englobaría a: TeldeArinagaArguineguínMogánArucasSan MateoSan Isidro y Tamadaba. Del clúster III serían: Artenara y Caidero de la Niña. Y el clúster IV estaría compuesto por: La Atalaya de Sta. BrígidaTerorAgaeteGuayadequeSanta LucíaFataga y Ayacata. Figura 18. Representación geográfica de los 4 clústeres nucleares obtenidos. Cada número se corresponde con un punto de muestreo, y cada color con un clúster: amarillo=clúster I, rosa=clúster II, fucsia=clúster III y verde= clúster IV. Capítulo 3: ADN nuclear 59 3.5. Discusión. 3.5.1. Desviaciones del equilibrio de Hardy Weinberg. Los marcadores más informativos y polimórficos fueron Gat2 y Gat3, mientras que los valores obtenidos de una baja variabilidad alélica para los loci Gat4 y Gat5 podrían estar indicando un cuello de botella demográfico, ya que las poblaciones que experimentan una reducción en su tamaño geográfico, muestran frecuentemente una reducida variabilidad genética (Bouzat et al., 1998). El exceso de heterocigosidad observada (Luikart y Cornuet, 1998) apoya nuevamente la posibilidad de que las poblaciones de G.stehlini hayan pasado por un fenómeno de cuello de botella. Ya que la heterocigosis puede reducir el efecto negativo de este fenómeno enmascarando mutaciones deletéreas (Keller y Waller, 2002), y permitiendo la expresión de sobredominancia (Fitzpatrick y Shaffer, 2007), con la emergencia de nuevos genotipos no encontrados en las poblaciones parentales. Favoreciendo la expansión de los rangos de distribución de las diversas subpoblaciones (Praebel et al., 2013), las colonizaciones exitosas y reduciendo el riesgo de extinción a largo plazo de la especie. Apoyado por los valores obtenidos de migrantes efectivos, sin embargo lo complicado es calcular la magnitud del flujo genético necesario para prevenir la evolución independiente de las poblaciones de una especie, ya que ello dependerá de la intensidad de las otras fuerzas evolutivas (Hedrick, 2005). 3.5.2. Estructura poblacional. Los análisis mostraron una estructura poblacional basada en cuatro clústeres principales: noroeste (con Guía como su localidad representante), noreste (Teror, La Atalaya de Santa Brígida…), sur (con Arinaga, y Mogán como localidades representantes) y oeste (con el embalse Caidero de la Niña como localidad en la que predominó). El clúster representando al noroeste estaría bastante bien diferenciado al igual que el clúster representando al oeste. Mientras que los dos clústeres restantes (noreste y sur) serían los que Capítulo 3: ADN nuclear 60 estarían mostrando unos índices de expansiones mayores, extendiéndose sus rangos geográficos por toda la franja este de la isla principalmente, aunque se encontrarían presentes, con distintas probabilidades, en cada uno de los 22 puntos de muestreo. Mostrando un gran flujo genético entre las poblaciones, debido probablemente a la gran capacidad de dispersión de Gallotia stehlini, el cual en experimentos en cautividad ha demostrado que exhibe unas velocidades de carrera superiores a la de otros lacértidos (Cejudo y Márquez, 2001) y también debido a fenómenos de desplazamiento competitivo entre los machos adultos y juveniles de G.stehlini (Barquin y Martín, 1982). Lo cual obligaría a que los machos juveniles expandieran sus rangos de distribución en busca de nuevos territorios en los cuales asentarse. Debido a estos grandes niveles de introgresión detectados, es por lo que la estructura poblacional obtenida a nivel nuclear queda reducida a 4 linajes, mientras que a nivel mitocondrial se obtuvieron 8 linajes mitocondriales. No obstante, su representación al nivel geográfico señaló 4 áreas principales, concordantes tanto mitocondrialmente como nuclearmente: norte, sur, este y oeste. Mostrando la vertiente este, los mayores índices de introgresión, con la presencia de zonas de contacto secundario nuevamente en el centro de la isla: Tejeda, San Mateo, como ejemplos. Sin embargo, se ha logrado mantener una considerable diferenciación genética entre las subpoblaciones, debido probablemente a la prevalencia de los fenómenos históricos de vicarianza ante la homogeneidad que pudiera provocar la migración de individuos entre localidades. Conclusiones 61 CONCLUSIONES Conclusiones 62 La distribución geográfica de los linajes evolutivos, junto con los patrones de flujo genético entre las zonas de contacto secundario, muestran los procesos de especiación y divergencia de las especies. Éste, constituye el primer estudio realizado a nivel mitocondrial y nuclear del lacértido Gallotia stehlini, con el objetivo de discernir la historia evolutiva de esta especie en la isla de Gran Canaria. Del estudio de una región del citocromo b de 1.027 pb, y con la aplicación de tres métodos de reconstrucción filogenética (MJ, MSN y inferencia Bayesiana), que han mostrado sus índices de robutez al compararse los resultados entre ellos, se han obtenido 8 linajes mitocondriales principales. Con unos tiempos de divergencia de los distintos clados, consistentes con el origen Miocénico de G.stehlini en Gran Canaria. Mostrando un patrón filogeográfico relacionado con la actividad volcánica experimentada por la isla durante la formación del complejo del Roque Nublo (5-3.4 Ma), y a la actividad presentada en el norte de la isla durante el Plio-Cuaternario (3.4 Maactualidad). A nivel del ADN nuclear, se estudiaron 4 loci de microsatélites. Los cuales, se alejaron del equilibrio de Hardy-Weinberg. Indicando fenómenos de selección heterótica, con una sobredominancia o favorecimiento de los genotipos heterocigotos por parte de la selección natural. Confirmado con los valores obtenidos de los índices descriptivos estadísticos: índice de fijación F y coeficientes F de Wright. El número de migrantes efectivos (Nm) también indicaría una prevalencia del flujo genético, antes que la deriva genética, como causa de la explicación de estos elevados niveles de heterocigotos. Las poblaciones se han estructurado a nivel nuclear en 4 clústeres, pero con altos índices de introgresión entre todas las localidades. Explicado probablemente, por la gran vagilidad y comportamiento territorial que muestran los machos adultos de Gallotia stehlini desplazando competitivamente a los individuos juveniles. Los patrones de estructura genética obtenidos y de introgresión, muestran una relativa concordancia citonuclear. Ya que su representación geográfica ha señalado 4 áreas principales, concordantes tanto mitocondrialmente como nuclearmente: norte, sur, este y oeste. A pesar de que Conclusiones 63 los 4 clústeres nucleares hayan englobado a los 8 linajes mitocondriales, debido a los altos índices de introgresión hallados. Así pues han prevalecido los fenómenos históricos de vicarianza, a pesar de los altos índices de flujo genético observados, en la explicación del patrón filogeográfico presentado por G.stehlini. Es un hecho interesante, que marca el inicio de estudios posteriores más concretos de las zonas de contacto secundario, y de hibridación. Esta estabilidad mostrada, en la estructura poblacional de la especie a lo largo de una gran escala temporal, a pesar de las variaciones en las condiciones ecológicas de los hábitats, migraciones… también ha sido estudiada en especies caribeñas de Anolis (Sherratt et al., 2015), abriendo interesantes perspectivas en el estudio de las comunidades ecológicas. Finalmente añadir, que los datos obtenidos de longitud corporal indican un buen estado general de todas las poblaciones muestreadas, con presencia de individuos con edades alrededor de los 10-11 años en todas ellas; sinónimo de un buen estado de conservación de la especie en la isla. Aunque es recomendable hacer un seguimiento de la misma, debido a la introducción reciente de la serpiente Rey de California (Lampropeltis getula californiae) en varios puntos de la isla. Bibliografía 70 Kurata, N. y Sasaki, T. (1997). “DNA Markers: protocols, applications and overviews”. Editado por Gustavo Caetano-Anollés y Peter M. Gresshoff. New York; Chichester: Wiley-VCH. pp 271-282. Levinson, G. y Gutman, G.A. (1987). Slipped-strand mispairing: a major mechanism for DNA sequence evolution. Molecular Biology and Evolution,4, 203-21. Litt, M. y Luty, J.A.(1989). A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of dinucleotide repeats within the cardiac muscle actin gene. 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Median Joining N distintos haplotipos muestreo al que pertenecen. Median Joining N distintos haplotipos muestreo al que pertenecen. Median Joining N distintos haplotipos muestreo al que pertenecen. Median Joining N distintos haplotipos mitocondriales muestreo al que pertenecen. Median Joining N mitocondriales muestreo al que pertenecen. Median Joining N mitocondriales muestreo al que pertenecen. Median Joining Network mitocondriales muestreo al que pertenecen. etwork mitocondriales etwork mitocondriales (MJ) mitocondriales. Haplotipos coloreados según el punto de 76 (MJ) . Haplotipos coloreados según el punto de 76 (MJ) que representa las relaciones entre los . Haplotipos coloreados según el punto de que representa las relaciones entre los . Haplotipos coloreados según el punto de que representa las relaciones entre los . Haplotipos coloreados según el punto de que representa las relaciones entre los . Haplotipos coloreados según el punto de que representa las relaciones entre los . Haplotipos coloreados según el punto de que representa las relaciones entre los . Haplotipos coloreados según el punto de que representa las relaciones entre los . Haplotipos coloreados según el punto de que representa las relaciones entre los . Haplotipos coloreados según el punto de que representa las relaciones entre los . Haplotipos coloreados según el punto de que representa las relaciones entre los . Haplotipos coloreados según el punto de que representa las relaciones entre los . Haplotipos coloreados según el punto de que representa las relaciones entre los . Haplotipos coloreados según el punto de que representa las relaciones entre los . Haplotipos coloreados según el punto de que representa las relaciones entre los . Haplotipos coloreados según el punto de que representa las relaciones entre los . Haplotipos coloreados según el punto de que representa las relaciones entre los . Haplotipos coloreados según el punto de que representa las relaciones entre los . Haplotipos coloreados según el punto de Anexos 77 Anexo III. Minimum Spanning Network (MSN). Los círculos coloreados representan los puntos de muestreo de cada haplotipo. Los haplotipos encontrados en más de una población, están coloreados según la proporción de su presencia en cada una de ellas. Anexos 78 Anexo IV. Heterocigosidad observada (Ho), y heterocigosidad esperada (He) para cada locus por punto de muestreo, junto con tamaños de muestra. Locus Gat2 Gat3 Gat4 Gat5 N: tamaño de muestra Localidad Ho He Ho He Ho He Ho He A 0,632 0,726 0,526 0,672 0,158 0,145 0,053 0,229 19 B 0,762 0,762 0,571 0,844 0,048 0,046 0,000 0,172 21 C 1,000 0,839 0,800 0,824 0,450 0,349 0,000 0,000 20 D 1,000 0,894 0,500 0,509 0,500 0,480 0,100 0,095 20 E 0,800 0,821 0,550 0,784 0,450 0,349 0,050 0,049 20 F 0,900 0,888 0,700 0,799 0,200 0,180 0,200 0,180 20 G 0,913 0,874 0,739 0,698 0,217 0,258 0,000 0,000 23 H 0,905 0,865 0,333 0,704 0,143 0,210 0,095 0,091 21 I 0,909 0,874 0,864 0,794 0,273 0,298 0,182 0,165 22 J 0,875 0,861 0,792 0,765 0,292 0,249 0,083 0,080 24 K 0,850 0,794 0,600 0,796 0,350 0,439 0,050 0,049 20 L 0,500 0,375 1,000 0,625 0,500 0,375 0,000 0,000 2 M 1,000 0,778 0,667 0,667 0,333 0,278 0,000 0,444 3 N 0,864 0,821 0,773 0,772 0,273 0,351 0,091 0,397 22 O 0,885 0,868 0,731 0,721 0,500 0,493 0,000 0,000 26 P 0,958 0,880 0,625 0,717 0,375 0,430 0,000 0,080 24 Q 0,840 0,854 0,760 0,827 0,200 0,180 0,040 0,113 25 R 0,917 0,879 0,667 0,794 0,361 0,361 0,000 0,000 36 S 0,750 0,808 0,750 0,866 0,500 0,413 0,000 0,000 24 T 0,857 0,816 0,821 0,804 0,143 0,133 0,000 0,000 28 U 0,750 0,818 0,600 0,789 0,150 0,139 0,100 0,095 20 V 1,000 0,611 0,000 0,444 0,000 0,000 0,000 0,000 3