Historia evolutiva de los sapillos moteados (pelodytes SPP) en la Península Ibérica

A mi hijo, Leo por permitirnos crecer nuestro árbol de la vida juntos, a lomos del segundo caballo. En Tassili y otras comarcas del Sáhara, las pinturas rupestres nos ofrecen, desde hace unos seis mil años, estilizadas imágenes de vacas, toros, antílopes, jirafas, rinocerontes, elefantes... ¿Esos animales eran pura imaginación? ¿O bebían arena los habitantes del desierto? ¿Y qué comían? ¿Piedras? El arte nos cuenta que el desierto no era desierto. Sus lagos parecían mares y sus valles daban de pastar a los animales que tiempo después tuvieron que emigrar al sur, en busca del verdor perdido. Eduardo Galeano. Espejos "The affinities of all the beings of the same class have been represented by a great tree... The buds give rise to growth to fresh buds, and these if vigorous, branch out and overtop on all sides many a feebler branch, so By generation I believe it has been with the great Tree of Life, which fills with its dead and broken branches the crust of the earth, and covers the surface with its ever branching and beautiful ramifications." Charles Darwin, 1859 AGRADECIMIENTOS Esta tesis no hubiera sido posible sin la ayuda y experiencia de un grupo de personas que trabajan constantemente para que investigadores y doctorand*s puedan llevar adelante sus experimentos. Quiero dar las gracias a todo el personal del Laboratorio de Ecología Molecular de la EBD (Estación Biológica de Doñana) en Sevilla y al personal del CTM (Centro de tests moleculares) del CIBIO en Oporto. El análisis de laboratorio no sería posible sin un trabajo de previo, por ello debo dar las gracias a I. Martínez- Solano, F. Sequeira, M. Vences y a mis directores M. Tejedo y H. Gonçalves por su dedicación. Aunque el trabajo de campo es tan duro como gratificante, sin duda, fue de ayuda inestimable contar con el apoyo de un número interesante de personas que, la mayoría de ellas de forma desinteresada, empujaron el carro cuando se atascó. Quien haya muestreado alguna vez Pelodytes sabe lo que quiero decir. Agradezco haber compartido muestras con: E. Ayllón, J. A. M. Barnestein, B. Estanque, E. Gomes, J. P. González, M. Katzenberger, I. Martínez-Solano, A. Montori, N. Oromí, R. Rebelo, M. A. Romeo Lafuente, J. Teixeira y W. de Vries. Muchas de las muestras provienen de museos y colecciones, agradezco a Teresa García Diez, Eva Albert, J.W. Arntzen, Miguel Ángel Carretero, Daniele Canestrelli, Philippe Geniez, Thibaut Couturier, Eduardo G. Crespo, Michel Dominguez y Luis Ceríaco. Y como no puede ser de otra manera, tengo que agradecer también a todas las personas que han compartido generosamente conmigo su tiempo durante tantos kilómetros de búsqueda “incansable”: S. Cano, A. Carta, F. Ceacero, A. Cordero, D. Donaire, L. García, R. de la Fuente, A. Luque, A. Rodríguez de Austria, M. Jowers, G. Schreur, E. Dimitriadi, A. Theodoridou, J. Xau y sobre todo a G. Dimuro por su ánimo y paciencia durante los últimos meses. Sin ell*s, nunca habríamos llegado tan lejos. Agradezco también las fotos amablemente cedidas por P.A. Crochet, A. Sánchez Vialas, Godfried Schreur y Ana Cordero; a R. D. Randrianiaina por la ayuda en la descripción de las larvas; a E. Matheu, Richard G. Bowker y A. González (Fonoteca Zoológica) haber compartido grabaciones de cantos con nosotros; al personal del Cibio (especialmente a Sarita y Teresa) y de la EBD, especialmente al personal de seguridad (Enrique) y de administración (Carmen Moro) que realiza eficiente labor. Y como no a los colegas de despacho: Airam Rguez., David Canal, Marco Katzenberger, Helder Duarte, Luis Miguel Gutierrez, José Sarasola y Carlos Camacho por su compañía y disponibilidad durante tantas horas. Especialmente, quiero dar las gracias a Miguel Ángel Carretero, Xavi Santos, F. Martínez-Freiría, Fernando Sequeira y al pollo al ajillo de Kike García, que me han levantado el ánimo cuando más falta me hacía. Gracias a ellos, los momentos de desánimo y “desamparo científico” en los que se encuentra habitualmente el doctorando, con más llevaderos. Esta aventura habría tenido otro final si no es por el último tramo en el que me han acompañado Glenda y Graçaliz Dimuro, mi agradecimiento especial para ellas por el apoyo moral y logístico. Finalmente quiero dar las gracias a mi amor, Glenda porque con su cariño, comprensión y temple me ha enseñado lo maravillosa que puede ser la vida y porque, fruto de este amor, ha traído al mundo, de la manera más generosa y valiente que nunca he visto, un regalo para toda la vida: Leo, una nueva personita que ya está compartiendo su camino junto a nosotras y que, sin duda, es quien me ha aportado la fuerza final para comenzar un nuevo ciclo. La presente tesis doctoral se organizó en un periodo de muestreo entre España y Portugal y otro de análisis que se realizó en la Estación Biológica de Doñana (C.S.I.C) (España) y el Centro de Investigación en Biodiversidad y Recursos Genéticos (Cibio) de la Universidad de Oporto (Portugal) y se enmarcó dentro de los programas de ayudas predoctorales de formación del personal investigador financiados por la FCT (Fundación para la Ciencia y Tecnología de Portugal) (SFRH/BD/70631/2010) y el CSIC (Ministerio de Ciencia e Innovación) CGL2005-02931/BOS. Resumen La familia Pelodytidae, es un grupo relicto de anuros primitivos presentes en la región Paleártica, constituido por un único género (Pelodytes) que comprende en la actualidad tres especies. Los análisis sobre la divergencia genética, morfológica y bioacústica de las poblaciones distribuidas dentro de la Península Ibérica plantean que la diversidad dentro del grupo podría estar subestimada. En esta tesis, tratamos de esclarecer los procesos evolutivos, históricos y contemporáneos, que determinan los patrones actuales de variación del género en Europa Occidental. Usando el análisis basado en un modelo de coalescencia mediante una aproximación multilocus, mitocondrial y nuclear, recuperamos cuatro unidades evolutivas principales, bien soportadas y delimitadas, que exhiben historias demográficas contrastadas, indicando trayectorias evolutivas independientes. La estructura genética es coincidente entre los individuos en el análisis nuclear de agregación bayesiana de marcadores de evolución lenta y rápida (microsatélites). A excepción de un número limitado de individuos, localizados en los límites geográficos de sus distribuciones y pertenecientes a estrechas zonas de contacto secundario, todos los individuos analizados genéticamente son perfectamente identificables, de forma fiable y sin ambigüedad, a cada uno de los linajes, principal criterio de especiación. En consecuencia, la Península Ibérica cuenta con los mayores índices de biodiversidad conocidos hasta la fecha para la familia y un nivel de complejidad taxonómica mayor que el propuesto en la actualidad, con tres endemismos con distribución exclusivamente ibérica, dos de ellos descritos en esta tesis: Pelodytes ibericus, Sánchez-Herráiz, Barbadillo, Machordom & Sanchíz, 2000, en el sureste de Portugal y suroeste de España; Pelodytes atlanticus en localidades a lo largo de la costa atlántica y centro de Portugal y Pelodytes hespericus en la zona centro y levante española, intercalado en los rangos de distribución de Pelodytes ibericus y P. punctatus. Esta última incluye el área de la localidad tipo ("aux alrededores de Beauvais", Departamento Oise, al norte de Francia: Daudin, 1802) y todas las poblaciones al norte de los Pirineos dentro dos sublinajes, uno que se distribuye ampliamente, desde Cataluña hasta el norte de Francia, y otro restringido al sur de Francia y norte de Italia. Cómo en otros taxones ibéricos, la distribución de la variación genética en el género responde a un patrón filogeográfico resultado de una divergencia ocurrida en refugios separados durante largos periodos glaciales. El proceso de fragmentación y aislamiento de las poblaciones, sufrido probablemente en repetidas ocasiones a lo largo del Plioceno y Pleistoceno, sería el origen de la separación este-oeste entre los distintos linajes en la península. Con el objetivo de explorar los patrones de mezcla y contrastar estos resultados, se analizaron los niveles de hibridación y estructura génica en poblaciones pertenecientes a los tres endemismos en dos áreas de contacto secundario del sur de la Península, observándose una barrera al flujo génico, con un patrón claramente desigual entre unas especies y otras. Aunque en ambas existe introgresión, debida principalmente a la dispersión de las hembras sobre los machos, entre P. atlanticus y P. ibéricus hay una zona de tensión, a pesar de que el aislamiento reproductivo entre los linajes no se ha completado, con barreras al flujo génico promovidas por factores intrínsecos; mientras que entre P. ibericus y P. hespericus, existe una barrera importante al flujo de genes debida principalmente a factores abióticos asociados con el hábitat ecológico. Palabras clave: especiación, especies crípticas, pelodytes atlanticus sp. nov., pelodytes hespericus sp. nov., península ibérica, zona hibrida. HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 14 prisioneros en la alegoría platónica del “mito de la caverna”, las características de las especies que percibimos son solo sombras. Si queremos conocerlas realmente, necesitamos recurrir a ideas y conceptos, salir de la caverna. Si, usando este razonamiento señalado en la teoría de las ideas (Fedón, Platón), aplicamos el núcleo de la filosofía clásica a la delimitación de las especies, debemos ser partícipes del concepto de especie perteneciente al mundo inteligible, que no se percibe fácilmente por los sentidos. Al basarnos exclusivamente en el estudio de las propiedades adquiridas durante el transcurso de la evolución, cometemos un error inherente pues dichas propiedades proceden de la gran variedad existente en el mundo sensible. El concepto biológico de especie es una de las ideas clave en biología evolutiva. Cuando miembros de dos poblaciones tienen la oportunidad de encontrarse en la naturaleza en condiciones adecuadas para que tenga lugar el reconocimiento mutuo y la reproducción y, además, están aislados reproductivamente de otros grupos afines, estamos hablando biológicamente de especie (Mayr, 1942). Considerar evolutivamente una especie implica, además de asumir que se trata de una población natural de individuos reproductivamente aislados por barreras de carácter biológico, mantener una identidad frente a otras con un origen independiente (Wiley, 1978), constituyendo un linaje evolutivo separado. Los nuevos desarrollos en el estudio de la evolución tienen que ver con este concepto y con la aceptación generalizada de la definición de Queiroz (1998, 2007). El estudio de las especies como “linajes independientes que evolucionan por separado” reconoce un periodo de existencia suficiente que les haya permitido diferenciarse y adquirir propiedades emergentes a lo largo del desarrollo evolutivo. Según esta definición, que las especies pertenezcan a categorías delimitadas por atributos o criterios secundarios de especiación, no constituye una razón, en absoluto, determinante. Sin embargo, las características adquiridas en el transcurso de la evolución por linajes que se desarrollan independientemente son relevantes porque evidencian dicha separación. Cuando hablamos de especies, por tanto, nos referimos indirectamente al tiempo evolutivo y a la capacidad de reproducirse. En el primer caso, la interacción génica puede verse interrumpida cuando dos poblaciones biológicas se desarrollan independientemente, en lugares separados o no, el tiempo necesario durante el cual se acumulan características diferentes y estas se fijan en las poblaciones. Las nuevas mutaciones surgidas en este proceso pueden provocar incompatibilidades entre los genes responsables de la diferenciación ecológica, fisiológica y/o comportamentales, que se pone de manifiesto cuando las poblaciones diferenciadas se reencuentran y tratan de reproducirse entre sí (Coyne y Orr, 2004). La capacidad de que especies pertenecientes a linajes evolutivos independientes, tengan o no características similares, puedan convivir en simpatría y permanecer como especies distintas, es el único test objetivo de especiación (Jiggins y Mallet, 2000). Por otro lado, el concepto de biodiversidad fue ya apuntado por la propia teoría de la evolución de Darwin. La diversidad biológica actual es el resultado de la evolución de los seres vivos sobre el INTRODUCCIÓN 15 planeta y de los factores externos que han permitido su diversificación y continuidad. Los patrones que conforman estos procesos actúan constantemente sobre genes, especies y ecosistemas. Sin embargo, el concepto biodiversidad, por su carácter intuitivo, ha presentado ciertas dificultades para su definición precisa y el abuso en su empleo puede vaciarlo de contenido (Martín Piera, 1991). Se distinguen habitualmente tres niveles de diversidad biológica: • Genética o diversidad intraespecífica de los genes y de su distribución, • Específica, entendida como diversidad de los genomas que distinguen a las especies. • Ecosistémica, la diversidad de las comunidades biológicas cuya suma integrada constituye la biosfera. A lo largo de esta tesis cuando nos usemos “diversidad”, nos referiremos indistintamente a las dos primeras, mientras que cuando hablemos de biodiversidad será exclusivamente haciendo referencia a la segunda definición en términos cualitativos, no cuantitativos, de variedad de especies. La influencia del Mediterráneo en la historia evolutiva de las especies La región Euroasiática acoge dos áreas de gran riqueza biológica y altos niveles de endemismos 1 : la cuenca del Mediterráneo y la región del Caúcaso. El Mediterráneo, es considerado, en su conjunto, uno de los 25 puntos calientes o “hotspots” de biodiversidad del planeta (Myers et al., 2000). Son diversos los factores que lo convierten en una región excepcionalmente rica en términos de diversidad biológica y comprenden aspectos como la geología, ecología, biogeografía e historia. Cualquier intento de interpretar patrones biogeográficos requiere una investigación de las dinámicas pasadas a escalas de tiempo y espacio adecuadas. De los procesos históricos que han influenciado la diversidad biológica actual en las zonas templadas, los cambios climáticos cíclicos u oscilaciones de Milankovitch (Milankovitch, 1941) son probablemente los procesos ambientales más importantes ocurridos durante el Cuaternario llegando a afectar profundamente la distribución de la variación genética (Hewitt, 2000). Hace cuarenta años, el estudio del movimiento de translación del planeta reveló que las oscilaciones en la órbita terrestre han sido una de las causas fundamentales de las alteraciones climáticas del Cuaternario (Hays et al 1976). Esto unido a un proceso de retroalimentación en el planeta provocó repetidos episodios de enfriamiento conocidos como edades de hielo o glaciaciones. Durante estos periodos hubo un descenso generalizado de las temperaturas que desencadenó cambios en cascada con repercusión en todo el planeta: se expandieron los hielos desde los polos hacia el Ecuador, lo que originó un descenso del nivel del mar de alrededor 120 m. (abriendo zonas de paso entre continentes e islas) y un descenso 1 Endemismos son aquellas especies exclusivas de un lugar o área geográfica concreta. HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 16 de las cotas de nieve y hielos en todos los sistemas montañosos continentales. Aunque las fluctuaciones climáticas comenzaron durante un periodo anterior, el Plioceno, la primera gran capa de hielo en el hemisferio Norte comenzaría a crecer alrededor de hace 2,5 millones de años y los mayores episodios de oscilación climática ocurrieron sobre todo durante el Pleistoceno con un ciclo dominante de 100.000 años (Webb y Bartlein, 1992), siendo las principales denominadas en Eurasia como Günz (600-500 ka), Mindel (450-350 ka.), Riss (200-135 ka.) y Würm (120-18 ka.) (ka = miles de años antes del presente). El Cuaternario debió ser probablemente, para las regiones dominadas por el hielo, una época fría interrumpida periódicamente por eventos cálidos catastróficos, las breves interglaciaciones, con climas similares al actual (Davis, 1976). Por consiguiente, la relativa estabilidad climática registrada durante los últimos 8000 años parece ser la excepción que confirma la regla. Los patrones biogeográficos actuales pertenecen a un período interglacial poco común en la historia reciente de Europa. El área mediterránea fue mucho más extensa y sus características biogeográficas más complejas de lo que son en la actualidad, como resultado de la bajada del nivel del mar, entre 100 y 150 m., por el intenso secuestro de agua dentro de las grandes masas de hielo. Aunque el tipo de clima mediterráneo, tal y como se conoce en la actualidad, se estableció hace alrededor 3,2 millones de años, época clave en la Península Ibérica como veremos más adelante, esta larga serie de fluctuaciones climáticas ocurridas en el pasado, condicionó notablemente la vida bajo su influencia, afectando de manera decisiva en la composición y distribución de las especies y las comunidades biológicas de la región. En general, se viene considerando que las edades de hielo tuvieron una influencia notable en la estructura genética de las poblaciones y en la supervivencia de las especies de todo el mundo (ver Hewitt 2000). Existen pruebas aportadas por una gran diversidad de estudios (paleobotánicos, paleontológicos, palinológicos y paleolimnológicos) que revelan la naturaleza transitoria del ambiente y los profundos cambios sucedidos a lo largo del tiempo geológico. Los análisis de los depósitos de polen fósil muestran que, incluso durante los periodos glaciales más severos, existieron diversos refugios que acogieron gran cantidad plantas y animales en la cuenca mediterránea. La permanencia en ellos a largo plazo, cambió la estructura de las comunidades, alterando de forma notable la evolución posterior de cada especie. En Europa, las condiciones frías y secas que caracterizaron los períodos glaciales del Pleistoceno, dieron lugar a la contracción de los rangos de distribución de las especies hacia las regiones del sur, debido al avance de la capa de hielo desde las latitudes más altas (Hewitt, 1996; 1999; 2000). Los periodos glaciales provocaron la mezcla de muchas comunidades, especialmente sobre la fauna debido a su capacidad elevada de dispersión. Por ejemplo, en los depósitos de fauna fósil en el sur de Francia que datan de la fase más severa de la glaciación de Würm (hace unos 80.000 años), se encuentran especies de distribución nórdica, tan dispares como el búho nival (Nyctea scandiaca) o el reno (Rangifer tarandus), y especies mediterráneas termófilas, como la tortuga mediterránea (Testudo hermanni). Esto indica que las condiciones climáticas permitían la INTRODUCCIÓN 17 coexistencia de ambos tipos de especies, boreales y meridionales, limitadas a un área geográfica concreta (Blondel y Aronson, 1999). A escala de tiempo grande, es perfectamente aceptable usar el término “migración” sensu stricto, en relación a estas especies en el mismo sentido que se usa para referirse a las migraciones estacionales de los animales. Durante los periodos interglaciales, plantas y animales que habían sobrevivido en poblaciones aisladas, se propagaron hacia el centro y norte de Europa nuevamente, sin abandonar las regiones más meridionales. Luego, la supervivencia de las especies de origen boreal, al abrigo de estos refugios durante los periodos glaciales, incrementó el número de especies a bajas latitudes, alternándose entre pequeños núcleos supervivientes, aislados durante periodos climatológicos adversos, y extensas poblaciones durante las cálidas interglaciaciones (Taberlet et al. 1998; Hewitt, 1996, 1999). La influencia de las penínsulas del Mediterráneo en los patrones de biodiversidad europeos, ha sido destacada por un amplio número de estudios que coinciden, a escala continental, en su contribución, desde refugios glaciales del sur de Europa (Hewitt 2000, 2004; Provan y Bennet, 2008), aunque éstos no han sido únicos y han existido otros refugios tanto para la flora como para la fauna en el continente (p. ej. Stewart y Lister 2001; Weiss et al. 2002; Rendell y Ennos 2002, Schmitt y Seitz 2001; Jaarola y Searle 2002; Haynes et al. 2003; Deffontaine et al. 2005; Nieberding et al. 2005; Sommer y Benecke, 2005). Si bien las penínsulas Ibérica, Itálica, Balcánica o Egéa y Anatólica, experimentaron, obviamente, una mayor estabilidad climática que las regiones frecuentadas por los glaciares, también las islas, los valles de los grandes ríos y ciertas laderas montañosas de la cuenca del Mediterráneo, así como áreas cercanas al Cáucaso y el mar Caspio, han sido relevantes durante estos periodos de climatología adversa, especialmente para aquellas especies que encontraron abrigo a bajas latitudes (Taberlet et al 1998; Petit et al. 2003; Hewitt, 2004). A lo largo del tiempo, se debieron dar repetidas oportunidades que permitieron la divergencia evolutiva y la especiación a partir de las áreas de distribución iniciales. La fragmentación cíclica en diferentes poblaciones alopátricas en el interior de las principales áreas de refugio, permitió historias demográficas complejas e independientes. Por tanto, mucha de la diversidad genética intra- e interespecífica que observamos en el presente, es el legado de los procesos de diferenciación ocurridos cuando la biota europea estuvo restringida y separada en diversos refugios mediterráneos durante sucesivos periodos en condiciones climatológicas adversas. Estas áreas actuaron a la vez en tres sentidos: a) como refugio permitiendo la supervivencia de las especies de distribución boreal, b) como centros y origen de nuevos endemismos y c) como reservorio y fuente en la recolonización de especies hacia zonas anteriormente heladas ocupadas de nuevo en periodos interglaciales cálidos (Hewitt, 2001; Weiss y Ferrand 2007). Como anticiparon los primeros estudios (Cooper y Hewitt, 1993; Hewitt, 1996) la compleja topografía y el mosaico geográfico de hábitats en las penínsulas del sur de Europa habrían favorecido, muy probablemente, la existencia de múltiples refugios aislados, permitiendo la persistencia en ellos HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 18 de poblaciones durante periodos glaciales. De acuerdo con el concepto de “refugios dentro de refugios” (Gómez y Lunt 2007), las características geográficas de áreas como la Península Ibérica, fragmentada por cadenas montañosas y bordeada por mares, permitió la diversificación de los organismos creando paisajes altamente heterogéneos. Causas y consecuencias genéticas del proceso evolutivo de diferenciación Cuando dos poblaciones se desarrollan aisladamente, la interacción génica puede verse interrumpida el tiempo suficiente durante el cual se acumulen mutaciones que, posteriormente, pueden ser fijadas por efecto de la selección natural o a través la deriva genética. Con el aumento de divergencia ocurre una disminución gradual en el flujo génico hasta que se alcanza un umbral de especiación a partir del cual el genoma se encuentra fuertemente ligado a cada linaje y la introgresión se reduce considerablemente entre ellos (Barton y Hewitt, 1989). Un gran número de evidencias paleontológicas y estudios moleculares sugieren que los mayores cambios climáticos ocurridos, no solo en el Pleistoceno sino desde el Plioceno, produjeron aislamiento biológico favorable para la diferenciación genética en un gran número de especies. Los periodos climáticos cíclicos y los procesos asociados de contracción hacia refugios del sur y expansión posterior hacia el norte, dejaron profundas huellas en la distribución geográfica de la diversidad genética (Taberlet et al. 1998; Hampe y Petit 2005). Las expansiones y contracciones en los rangos de distribución espacial de las especies marcan su acervo genético y este hecho ha sido utilizado para la reconstrucción histórica de las poblaciones actuales (Avise, 2000). En general, las poblaciones que han colonizado áreas recientemente, muestran una variabilidad genética más baja que aquellas que sobreviven en refugios, exhibiendo menor tamaño efectivo de población, debido al cuello de botella poblacional de la colonización (efecto fundador). Esto ocurre principalmente debido a eventos de difusión casi continua durante la colonización (Hewitt 1996). Por otro lado, los fenómenos vicariantes en el pasado pueden quedar reflejados por una segregación espacial de los linajes. Tradicionalmente, los patrones de distribución de las especies se interpretan con referencia a eventos biogeográficos históricos y la distribución espacial de los caracteres, a menudo, se interpreta en términos de vicarianza (Avise 2000). Muchas especies muestran una orientación geográfica de los distintos linajes genéticos, es lo que se conoce como unidades filogeográficas. Dependiendo del grupo taxonómico que nos ocupe, así como de la duración del aislamiento y el rango de distribución de la especie, encontramos más o menos posibilidades de diferenciación regional a varios niveles de organización, desde la estructura genética intraespecífica de las poblaciones hasta las subespecies y especies. INTRODUCCIÓN 19 El papel de la filogeografia en el estudio de la diversidad biológica Como hemos explicado, las especies modifican sus rangos de distribución a lo largo del tiempo. La distribución de la variación genética es extremadamente variable y está influenciada por diversos factores temporales. Entre ellos se encuentran los principales eventos geológicos, oscilaciones climáticas y cambios en el hábitat ecológico de muchas especies que han promovido eventos vicariantes y que, como venimos tratando, son utilizados a menudo como argumentos para explicar la diversificación de las especies. Por lo tanto, la distribución actual de la variación genética está determinada, no solo por los requerimientos ecológicos de cada especie, sino también por su historia evolutiva. El conocimiento de la variabilidad genética ha sido fundamental para la reconstrucción de la historia evolutiva de las especies. La estructura de esta variabilidad, considerada en un marco geográfico, es el resultado de las relaciones históricas entre las poblaciones y la propia dinámica poblacional (Avise, 2000). Con la intención de analizar e interpretar los factores históricos que condujeron a la distribución geográfica actual de las diferentes unidades evolutivas (a nivel intra e interespecifíco), surgió a finales de la década de los ochenta una nueva disciplina, la filogeografía, que trata de establecer nexos entre la genética poblacional y la sistemática, integrando ciencias como la genética molecular y poblacional, la filogenia, la ecología, la etología, la paleogeografía y la paleontología (Avise et al., 1987). El término filogeografía, descrito la primera por vez Avise et al. (1987), se refiere a la disciplina que estudia el papel que tuvieron los factores históricos en la formación de la distribución geográfica de los linajes genealógicos. Atendiendo a esta primera definición, la filogeografía se ocupa de los principios y procesos que rigen la distribución de los linajes y considera conjuntamente tiempo y espacio como ejes de un mapa ideal para una determinada genealogía de genes (Avise, 2000). Así mismo, establece paralelismos con la biogeografía histórica desde el momento en que puede revelar el papel de la vicarianza en la estructura biótica (Riddle et al., 2000). Aunque la filogeografia representa la interconexión de dos campos tradicionalmente distintos, la genética de poblaciones y la filogenia, la universalidad de esta perspectiva es subrayada por la observación de que casi todas las especies en la naturaleza presentan algún nivel de estructuración genética asociada con la geografía (Avise, 2000). El desafío de la filogeografía deriva de la dificultad de descubrir las causas históricas de los procesos geográficos en la conformación de la arquitectura genética actual. El número de trabajos publicados sobre la filogeografía de multitud de especies de flora y fauna viene aumentando de manera considerable desde finales del siglo pasado (Avise, 2000; Hewitt, 2000) y existen, desde principios del presente siglo, numerosos estudios para diversos grupos taxonómicos en todas las regiones del planeta (Hewitt 2004; Emerson y Hewitt, 2005). Los patrones de similaridad entre la distribución geográfica y los linajes evolutivos de especies co-distribuidas o complejos de especies, no suelen ser aleatorios (Gómez y Lunt, 2007). En un intento de identificar los patrones HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 20 filogeográficos comunes entre distintos taxones (Taberlet et al., 1998; Arbogast y Kenagy, 2001) apareció la filogeografía comparada, una herramienta fundamental que permite aclarar el papel de la geografía en la distribución de especies, la asociación entre esta y los ciclos climáticos, y puede ayudar a identificar cuáles son las áreas que albergan una elevada diversidad, “hotspots” importantes desde el punto de vista de las políticas de conservación. Además, los análisis en filogeografía comparada han proporcionado información pionera en el desarrollo de patrones regionales históricos de distintos linajes genéticos (Bernatchez y Wilson 1998; Avise et al, 1998; Riddle et al. 2000; Arbogast y Kenagy 2001). Para explicar estos patrones, han sido propuestos diferentes escenarios de diferenciación en los llamados “refugios glaciales” alopátricos y posteriores expansiones del rango de distribución de las unidades filogeográficas, tanto en aves como en otros grupos de animales y plantas. Un ejemplo clásico de diferenciación entre especies emparentadas lo constituye el caso de los trepadores o sítidos (Sittidae). Existen tres especies de trepadores estrictamente endémicos de la cuenca mediterránea, el trepador corso (S. whiteheadi) en Córcega, el trepador de Kabilia (S. ledanti) que ocupa una pequeña región de Argelia y el trepador de Krüper (S. krueperi) en Turquia. Las tres son muy parecidas y sus preferencias ecológicas, morfologías y cantos son similares; sin embargo, se distribuyen de manera fragmentada a lo largo del Mediterráneo. Se esperaría pensar que su diferenciación es reciente, no obstante estudios moleculares sobre el gen mitocondrial citocromo-b indican que pertenecen a linajes separados que divergieron durante el Plioceno (Pasquet, 1998). De la misma manera, el trepador azul (S. europaea), el trepador siberiano (S. arctica), el trepador de las Naga (S. nagaensis), el trepador de Cachemira (S. cashmirensis), el trepador indio (S. castanea), el trepador ventricastaño (S. cinnamoventris) y el trepador indochino (S. neglecta) también forman un clado cuyas especies componentes se sustituyen geográficamente entre sí de sur a norte y de oeste a este a través de Eurasia. Europa está caracterizada por un gran número de refugios glaciares pleistocénicos. Las rutas de colonización post-glacial y las zonas de sutura para las especies terrestres han sido bien establecidas y muestran patrones coincidentes (Hewitt, 1996; Taberlet et al 1998; Hewitt, 1999). Los procesos cíclicos de contracción poblacional a refugios del sur y consiguientes expansiones a los territorios del norte han dejado una marcada huella en la distribución geográfica de la diversidad genética dentro de un gran número de especies. Las especies o complejos de especies que se distribuyen ampliamente en Europa, a menudo presentan un gradiente latitudinal en cuanto a la distribución de la diversidad genética. A diferencia de las poblaciones nórdicas, habitualmente menos diversas como consecuencia de la pérdida de estructura causada por la expansión a partir de poblaciones más al sur, la persistencia de las especies confinadas en estos subrefugios alopátricos a largo plazo permitió la diferenciación en una amplia gama de linajes evolutivos independientes. El gradiente de variación genética junto al evidente nivel de diversidad y subestructura que se observa a bajas latitudes en una amplia variedad de taxones –patrón denominado “pureza del norte frente a la riqueza del sur” (Hewitt, 1996; 2000)– constituye una prueba de la existencia de estos múltiples subrefugios glaciales meridionales. INTRODUCCIÓN 21 Este modelo lleva implícito varias premisas:  que los refugios meridionales albergan mayores niveles de biodiversidad en cuanto a riqueza de especies, diversidad genética y endemismos,  que llevan asociados procesos de radiación evolutiva y sirven como fuente de expansiones demográficas futuras para numerosos organismos,  que describen rutas de recolonización similares reconocibles en los patrones filogeográficos de especies diferentes,  que proponen el establecimiento de un escenario de zonas híbridas, donde genomas divergentes entran en contacto secundario y que es especialmente complejo cuando estos ocurren entre linajes con historias evolutivas independientes muy antiguas. El patrón descrito está bien ilustrado en los primeros estudios filogeográficos europeos realizados en una variedad de taxones (por ejemplo, en los erizos, Erinaceus europaeus / concolor (Santucci et al., 1998; Seddon et al., 2001), saltamontes, Chorthippus parallelus (Cooper et al, 1995). oso, Ursus arctus (Taberlet y Bouvet, 1994) y tritón crestado, Triturus spp, (Wallis y Arntzen, 1989), entre otros. Por otra parte y debido a los patrones generales de rutas de recolonización descritos en diferentes especies (Hewitt, 1999; Taberlet et al., 1998), aparecen con frecuencia conjuntos de zonas de contacto secundario en el norte de Europa, promoviendo escenarios coincidentes y relativamente complejos en el sur. En la Península Ibérica, estas historias evolutivas están bien investigadas y se describen para una gran variedad de taxones, mostrando patrones notables de concordancia filogeográfica (véase Gómez y Lunt, 2007 y referencias) que implican subdivisiones genéticas profundas, alta riqueza de especies y zonas de contacto secundario entre ellas. De hecho, la complejidad de las historias evolutivas descubiertas, subraya el importante papel que esta región ha jugado en el pasado, no sólo facilitando la redistribución hacia el norte de especies después de repetidos enfriamientos climáticos, sino también fomentando la diversificación mediante patrones concordantes de fragmentación, contracción, expansión y mezcla de las poblaciones. La placa “Ibero- Mauritánica” que derivó en la actual Península Ibérica y la parte norte de Marruecos, fue una matriz fértil que dio origen a la mayor parte de los grupos de animales y plantas que conviven hoy en esa región de Europa y que, gracias a las fluctuaciones Pleistocénicas, modelaron su distribución mediante extinciones y nuevas olas de especiación, que permitieron la diferenciación en los patrones filogeográficos actuales como veremos a continuación. HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 22 El papel de la Península Ibérica en los estudios filogeográficos La Península Ibérica es extremadamente rica en diversidad de especies y endemismos. Aunque ocupa sólo una pequeña parte de Europa Occidental (menos del 6%), el 50% de las especies de vertebrados terrestres y plantas europeas se encuentran en ella. Entre las 8.000 y 9.000 especies de plantas vasculares (helechos y plantas con flores) que existen en la península, más de 6.500 son autóctonas, incluyendo unos 1.500 endemismos únicos en el mundo, y otros 500 compartidos con el Norte de África, lo cual representa el 80% de las especies vegetales existentes en la Unión Europea y casi el 60% de las que se hallan en todo el subcontinente europeo. En cuanto a la fauna, la Península Ibérica posee la mayor riqueza de Europa Occidental, entre 50.000 y 60.000 especies animales, lo que equivale a más del 50% de las existentes en la Unión Europea. El número total de especies endémicas estimado está en torno a un millar, es decir, de las especies endémicas de Europa alrededor del 31% se encuentran en la Península Ibérica (Williams et al., 2000) ocupando una gran variedad de hábitats. De los 226 tipos de hábitats reconocidos como de alto interés por la Unión Europea (Directiva relativa a la conservación de los hábitats naturales y de la fauna y flora silvestres o Directiva Hábitats), 121 (54%) se encuentran en territorio español y 88 (39%) en la región continental de Portugal. Por estas razones, su importancia para la conservación de la biodiversidad ha sido reconocida en las distintas políticas de conservación comunitarias. La Organización No Gubernamental “Conservation International” incluye casi el 80% de la zona de la Península Ibérica dentro del hotspot de biodiversidad Mediterránea. España es el país mayor de la UE en términos de superficie dentro de la red europea de sitios importantes para la conservación (Red Natura 2000) con un promedio total del 30% del territorio, si el ámbito normativo no se modifica y las Directivas de la Naturaleza se mantienen intactas, como recientemente nueve Estados de la Unión Europea han manifestado, incluido el Estado Español 2 La Península Ibérica fue uno de los más importantes refugios pleistocénicos del subcontinente europeo (Hewitt 1999, 2001). Los altos niveles de biodiversidad y endemismos se acompañan también de un alto grado de diversidad genética intraespecífica. Numerosas son las características que han favorecido la supervivencia de gran parte de la flora y fauna europea en la Península Ibérica durante el Pleistoceno. Primero, la Península posee una compleja orografía con montañas orientadas principalmente en dirección este-oeste. Esta orientación ofrece una variedad microclimática que ha podido favorecer la supervivencia de poblaciones a diferentes altitudes, haciendo posible diversos microclimas. Segundo, debido a su posición geográfica la Península Ibérica está bajo la influencia del Atlántico Norte y el Mediterráneo y disfruta de una amplia variedad de climas, que incluye sub- 2 En vísperas de la Cumbre del Clima de las Nacione Unidas, que comemzó en París en el mes de noviembre de 2015, donde 195 estados trataron de alcanzar un acuerdo global y vinculante contra el calentamiento del planeta y sus impactos, se celebraba una Conferencia en la Comisión Europea. Más de 300 expertos, incluyendo representantes de instituciones de la Unión, de los ministerios nacionales y ONGs, discutieron las conclusiones del proceso de consulta pública sobre las Directivas de la Naturaleza ("Fitness Check"). La revisión de la Estrategia Europea de Biodiversidad destaca su importancia como pilar sobre el que se asienta la red de espacios naturales protegidos (Red Natura 2000). A nivel social una importante campaña en defensa de las directivas comunitarias de protección de la naturaleza, respaldada por un gran número de personas (más de medio millón) y organizaciones ecologistas europeas, se convertía en la mayor respuesta ciudadana a una consulta pública lanzada desde la Comisión Europea en la historia. INTRODUCCIÓN 23 desértico, mediterráneo, alpino y atlántico. Estas características, junto con su gran superfície (580.000 km2) nos lleva a considerar que no existiera un solo refugio, sino que constituyeran un escenario de refugios dentro de refugios, “refugia-within-refugia” (Gómez y Lunt, 2007). Esta hipótesis es corroborada por un número cada vez mayor de estudios y, actualmente, es ampliamente aceptado que las razones que sostienen la riqueza biológica de la región están relacionadas con la persistencia de las poblaciones a largo plazo en múltiples subrefugios glaciales. Los datos paleontológicos, palinológicos y paleolimnológicos demuestran la coexistencia de especies templadas durante la Edad de Hielo (Huntley y Borks 1983). La repetición de los mísmos patrones filogeográficos en el rango de distribución de multitud de taxones de flora y fauna, pone de manifiesto, en primer lugar, el aislamiento genético al que se vieron sometidas las poblaciones durante el máximo glacial pleistocénico. Los sucesivos periodos de calentamiento y enfriamiento habrían contribuido a la fijación de las diferencias genéticas entre las poblaciones a lo largo del tiempo. Y en segundo lugar, el hecho de que gran número de especies ampliamente distribuidas, hayan entrado desde entonces en un periodo de expansión desde los refugios europeos más meridionales al resto del continente (Hewitt 1996) un proceso que continúa hasta la actualidad. Así, podemos encontrar grosso modo, mamíferos, aves, anfibios y plantas que muestran patrones determinados por el hecho de colonizar el oeste y norte de Europa desde la Península Ibérica después de la Edad de Hielo (Taberlet et al. 1998; Hewitt 1999; Lenk et al. 1999; Beebee y Rowe 2000; Griswold y Baker 2002; Grivet y Petit 2002; Jaarola y Searle 2002; Vernesi et al. 2002; Michaux et al. 2003). Ventajas e inconvenientes del uso de marcadores genéticos en los estudios filogeográficos En los últimos años, el estudio filogeográfico ha adquirido un gran auge gracias al rápido desarrollo de técnicas moleculares que ha permitido extenderlo a un gran número de organismos en todo el planeta (Hewitt 2004). La aplicación de las técnicas moleculares ha revelado que el análisis exclusivo de caracteres morfológicos puede inducir a interpretaciones erróneas de la historia evolutiva de los organismos (Avise y Nelson 1989; Bernatchez y Dondson, 1994; Babik et al. 2005). La dificultad de cuantificar la variación a partir de caracteres morfológicos o ecológicos supone un problema importante a nivel específico e intraespecífico, ya que muchos de esos caracteres suelen resultar homoplásicos debido a que los procesos de presión selectiva y adaptación pueden generar convergencia en su expresión y plasticidad. En cambio, bajo algunos supuestos de la Biología Molecular, las técnicas moleculares permiten obviar en gran parte este sesgo (Hillis et al., 1996; Avise, 2001; Edwards, 2009). Por otra parte, la creciente necesidad de delimitar unidades de biodiversidad para su conservación debiera tener un fundamento sólido evolutivamente significativo (ej. Moritz, 1994; Waples et al. 2006; Leaché et al., 2009; Rivera et al., 2011; Camargo et al., 2012), HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 30 1998; García-París et al., 2003). Atendiendo a las hipótesis morfológicas (Ford and Cannatella, 1995; Gao and Wang, 2001) y basadas en la sistemática molecular (Hay et al., 1995; Ruvinsky and Maxon, 1996) las relaciones de estos anuros difieren en cuanto a la posición de Pelobatidae (García-París et al., 2003), lo que unido a la existencia de un limitado registro fósil (Sanchíz, 1998; Rocek and Rage, 2000; Sánchez-Herráiz, 2000) plantea hipótesis biogeográficas no del todo concluyentes. En cualquier caso, Pelodytidae es un grupo monofilético, que forma junto a Pelobatidae, Megophryidae y Scaphiopodidae una agrupación igualmente monofilética (Pelobatoidea) y bien diferenciada del resto de los anuros. De acuerdo con la clasificación actual, la familia Pelodytidae comprende tres especies morfológicamente similares. Pelodytes caucasicus- (Boulenger, 1896), con una distribución aislada y fragmentada que se extienden desde la costa oriental del Mar Negro hasta la ladera norte del Cáucaso (regiones caucásicas y transcaucásicas). Sus poblaciones se encuentran amenazadas y restringidas al noroeste de Azerbaiyán (en la parte Belokany de State Reserve Zakatala), Georgia (sudoeste y Osetia del Sur), Rusia (distrito de Krasnodar) hasta su límite sur en el noreste de Turquía, cerca de la frontera de Georgia (Steiner, 1968; Darevsky et al 1971; Bannikov y Drozdov, 1975, Golubev, 1980, Kuzmin, 1997; Iskanderov, 2009). Pelodytes ibericus Sánchez-Herráiz, Barbadillo, Machordom y Sanchíz, 2000, es una especie endémica del sur de la Península Ibérica (Portugal y España), estrechamente relacionada con charcas muy temporales de Alentejo a Andalucía, ocupando casi toda la extensión de esta última región, excepto las provincias orientales (Crespo y Oliveira, 1989; Barbadillo, 2002a; Ceacero et al., 2007). Y, por último, Pelodytes punctatus (Daudin, 1803) que, según los conocimientos actuales, se distribuye de manera discontinua por Europa Occidental, desde la Península Ibérica, en el sureste de España y el suroeste de Portugal, a Francia y el noroeste de Italia (Sindaco y Andreone, 1988; Le Garff, 1988; Guyétant, 1999; Barbadillo, 2002b; Crespo et al., 2008; Denoël et al 2009). En la figura 1 se pueden apreciar los rangos de la distribución actuales de las tres especies según el listado de especies amenazadas de la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza o IUCN (acrónimo de sus siglas en inglés: The International Union for Conservation of Nature, Red List of Threatened Species. www.iucnredlist.org 2015). INTRODUCCIÓN 31 La distribución actual de las especies de pelodítidos está limitada a la región Paleártica occidental, en áreas mediterráneas y caucásicas caracterizadas por sus altos niveles de diversidad biológica, ocupando la franja de clima mesotérmico (Escoriza y Ruhi, 2014). No obstante, el restringido límite actual de distribución contrasta con la amplia procedencia de sus taxones fósiles. En base al registro fósil, la familia Pelodytidae estuvo ampliamente distribuida en Europa en el pasado, con presencia documentada, al menos, desde el Eoceno medio, donde parecen haber convivido formas que morfológicamente pueden ser consideradas Pelodytes o géneros muy próximos. Se han encontrado en los depósitos Pleistocénicos de Europa y en depósitos de Norteamérica en el Mioceno (Sanchíz, 1998a; Roček y Rage, 2000). Según la información paleontológica disponible, los escasos restos estudiados del Mioceno inferior no son adscribibles a ningún linaje específico actual. En la Península Ibérica, se han identificado Pelodytes a lo largo de todo el Neogeno (depósitos de Soria y Teruel). En el Mioceno medio se ha descrito una especie ibérica, P. arevacus, similar a las vivientes actualmente en la península, y considerado posible antecesor de ellas (Sanchíz, 1978; Sanchíz et al. 2002). El registro paleontológico del mioceno y plioceno no aporta datos cronológicos fiables sobre la hipotética diferenciación de Pelodytes en los actuales linajes oriental (P. caucasicus) y occidental (P. punctatus y P. ibericus). Hasta finales del siglo XX, todas las poblaciones del género del sapillo moteado común en Europa occidental fueron asignados a una sola especie, P. punctatus (Arnold et al., 1978). Después del descubrimiento de ciertas diferencias bioacústicas entre poblaciones francesas e ibéricas del sur Figura 1: Rangos de la distribución actual de las tres especies del género Pelodytes en Eurasia según la IUCN: P. ibericus en color azúl, P. punctatus en color amarillo y P. caucasicus en color verde. HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 32 (Paillette et al., 1992), estudios detallados de la morfología, osteología y aloenzimas, llevaron a la descripción de las poblaciones españolas más meridionales como una nueva especie, el sapillo moteado ibérico, P. ibericus (Sánchez-Herráiz et. al 2000). La diferenciación de esta especie se confirmó posteriormente por una serie de estudios adicionales (Pargana et al 2003; García-París et al 2003; Veith et al 2006; Crespo et al 2010) aunque hasta muy recientemente se carecía de análisis que pusieran de manifiesto la existencia de zonas de contacto entre ambas especies (Van Vliet et al. 2012). Estudios genéticos a escala detallada han revelado que el patrón de diferenciación genética es más complejo de lo que originalmente se pensaba, con dos linajes adicionales, lo que sugiere una historia evolutiva de diferenciación alopátrica con contacto secundario reciente entre ellos (Díaz-Rodríguez et al., 2015). A continuación, pasaremos a enumerar los objetivos de esta tesis, tanto de modo genérico, como pormenorizado a través de una serie de objetivos específicos. Figura 2. Yacimientos del Cuaternario conocidos de pelodítidos en Europa. La distribución (UTM 50x50 km) modificada sigue a Gasc et al. (1997). 1: Kozi Grzbiet (Polonia). 2: Steinbruch Schmid (Alemania). 3: Westbury (Reino Unido). 4: Baradla (Hungría). 5: Jebel Irhoud (Marruecos), con presencia dudosa de Pelodytes. Azul: Pelodytes punctatus. Rojo: Pelodytes ibericus. Amarillo: especie indeterminada de Pelodytes. Verde: Pelodytes caucasicus. INTRODUCCIÓN 33 OBJETIVOS Y ORGANIZACIÓN DE LA TESIS Objetivos de la Tesis Doctoral El objetivo general de la presente tesis es reconstruir la historia evolutiva del género Pelodytes y los procesos macro y micro evolutivos que han determinado (y determinan) los patrones de diversidad genética de las poblaciones distribuidas en el interior de la Península Ibérica. El objetivo último, es poner de manifiesto mediante el desarrollo de una hipótesis robusta, la relevancia de los procesos, históricos y contemporáneos, en la arquitectura genética de estas especies, determinando el grado de diferenciación actual y discutiendo las posibles implicaciones taxonómicas de los resultados. Para ello, se tratarán de esclarecer los procesos evolutivos que determinan los patrones de variación genética de las poblaciones y la relación entre los procesos genealógicos y demográficos. De una parte, se explorarán los fenómenos que originaron la diversidad genética actual mediante el uso de una metodología integrada, combinando un enfoque molecular multilocus (polimorfismo de genealogías de ADN mitocondrial, ADN nuclear y de marcadores de evolución rápida, microsatélites) al análisis de los caracteres fenotípicos de las especies, partiendo de un diseño de muestreo a distintas escalas en base al tipo de preguntas que se plantean en cada caso. Para lograrlo planteamos los siguientes objetivos específicos: i) definir la diversidad actual mediante el empleo de diferentes marcadores moleculares (nucleares y mitocondriales), ii) identificar los principales linajes evolutivos en Iberia y estimar los tiempos de divergencia entre ellos; iii) analizar el grado de diferenciación genotípica y fenotípica encontrada; iv) delinear la distribución de las unidades filogegráficas existentes y determinar las posibles áreas de contacto secundario; v) detectar los niveles de introgresión e hibridación entre las diferentes formas; vi) inferir los procesos responsables que han dado origen a los patrones de estructura y distribución actual de las especies; vii) y en última instancia, discutir las implicaciones evolutivas y taxonómicas que permitan contribuir a la conservación de la diversidad genética de sus poblaciones. HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 34 Organización general de la Tesis Doctoral La estructura de la tesis seguirá los objetivos específicos a lo largo de los diferentes capítulos (artículos publicados o en proceso de publicación) como se detalla a continuación: Capítulo primero: Evidencia molecular de especies candidatas crípticas en los Pelodytes ibéricos. Molecular evidence for cryptic candidate species in Iberian Pelodytes (Anura, Pelodytidae). Díaz-Rodríguez, J., Gonçalves, H., Sequeira, F., Sousa-Neves, T., Tejedo, M., Ferrand, N. y Martínez-Solano, I. (2015). Molecular Phylogenetics and Evolution, 83, 224–241. 1. En primer lugar, se investiga la variación genética y las relaciones entre las distintas poblaciones del género que cohabitan la Península Ibérica. Para ello, se identifican los principales linajes evolutivos, partiendo de un extenso número de muestras pertenecientes a todo el rango de distribución en Europa Occidental, a través de un enfoque multilocus basado en un modelo coalescente, que permita evaluar la congruencia entre diferentes loci nucleares y mitocondriales, y delimitar estos linajes a posteriori con métodos de validación de especies. 2. Se tratan de definir, partiendo de un exhaustivo muestreo, los patrones filogeográficos, los límites de distribución actuales e identificar las zonas de contacto secundario entre las diferentes formas en base a los resultados del análisis de las genealogías moleculares. 3. Como tercer objetivo, exploramos mediante diferentes medidas de diversidad genética, la influencia de los factores demográficos que han determinado los patrones de distribución y la estructura poblacional actual. Capítulo segundo: Taxonomía de cara de la especiación críptica: integración de datos moleculares, bioacústicos y morfológicos sugieren dos nuevas especies de Pelodytes de la Península Ibérica Taxonomy in face of cryptic speciation: integration of molecular, bioacoustic and morphological data suggest two new species of Pelodytes from the Iberian Peninsula. Díaz- Rodríguez, J., Gehara, M., Márquez, R., Vences, M., Tejedo, M. (2015). Accepted in Zootaxa. 4. En este segundo capítulo, se describe, de manera integrada, la estructura genética al interior del complejo de especies que ha dado lugar a una variedad de caracteres. Mediante el uso de INTRODUCCIÓN 35 múltiples marcadores nucleares de evolución más lenta (y ampliando los análisis precedentes), se investiga de forma más completa el mosaico de patrones genealógicos observados. 5. También se analizan de forma comparada la diferenciación genética, morfológica y bioacústica en cada uno de los clados detectados integrando los resultados en la delimitación de especies 6. Por último, se evalúan sus implicaciones taxonómicas dentro del género aportando un nuevo punto de vista a los conocimientos sobre la historia evolutiva del género en la Península. Capítulo tercero: Análisis genético de dos zonas de contacto secundario entre P. atlanticus, P. ibericus y P. hespericus en el sur de la Península Ibérica Genetic analysis of two secondary contact zones between P. atlanticus, P. ibericus and P. hespericus in Southern Iberian Peninsula. 7. El objetivo del tercer capítulo es analizar los procesos de flujo genético, introgresión e hibridación y determinar la contribución de los individuos híbridos al proceso de especiación. Para ello se exploran, de manera independiente, los patrones de mezcla en el interior de dos zonas hibridas a través de la variación mitocondrial y el polimorfismo de marcadores nucleares de evolución rápida (microsatélites). 8. Por otro lado, se tratan de determinar específicamente los factores que influyen en la estructura genética de estas dos zonas, sean principalmente intrínsecos o extrínsecos, debidos a barreras de aislamiento reproductivo pre y post-cigóticas o asociados a la adaptación diferencial al hábitat. Discusión general 9. Finalmente profundizamos, a partir de los patrones filogeográficos de los resultados obtenidos, en las dinámicas de fragmentación, diferenciación y expansión postglacial que han dado origen a dicha estructura aportando una visión integradora al conocimiento actual sobre el tiempo de separación y la localización geográfica de la diversificación genética en el género Pelodytes en la Península Ibérica. 10. Se tratan de identificar las áreas de refugio y compararlas a los patrones publicados para otras especies y plantar las bases para un estudio que permita en el futuro delinear medidas de conservación prioritarias y esfuerzos eficaces para la conservación de las especies. HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 36 Referencias Ahrens, D., Fabrizi, S., Šipek, P., Lago, P.K., (2013). Integrative analysis of DNA phylogeography and morphology of the European rose chafer (Cetonia aurata) to infer species taxonomy and patterns of postglacial colonisation in Europe. Molecular Phylogenetics and Evolution 69, 83–94. Alex Smith, M., y M Green, D. (2005). Dispersal and the metapopulation paradigm in amphibian ecology and conservation: are all amphibian populations metapopulations?. Ecography, 28(1), 110-128. Alexandrino, J., Arntzen, J. W., y Ferrand, N. (2002). 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The role of molecular genetics in sculpting HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 46 (40 s), annealing at 56 °C (1 min), extension at 72 °C (1 min and 20 s); and final extension of 72 °C for 5 min. Additionally, sequences of PPP3CAint4 were amplified with PCR conditions described by Pinho et al. (2010), consisting of an initial denaturation at 94 ºC for 3 min; 40 cycles with a denaturing temperature of 94 ºC (30 s), annealing at 53 ºC (1min), and extension at 72 ºC (1 min and 30 s), with a final extension at 72 ºC for 5 min. Amplified fragments were sequenced in both directions. For βfibint7 a two-step amplification procedure was used, with a combination of two primer pairs (PCR1: FIBX7 and FIBX8; PCR2: BFXF and BFXR) as described by Sequeira et al. (2006), with an initial denaturation at 94 °C for 3 min, followed by 40 cycles of denaturing at 94 °C (40 s), annealing at 50 °C (PCR1) and 56 °C (PCR2), (1 min), extension at 72 °C (1min 30 s) and a final extension of 72 °C for 5 min. Amplified fragments of PCR2 were also sequenced in both directions using the primers BFXF and BFXR. In both nuclear markers, indels present only in the outgroup and regions in the alignment that could not be unambiguously edited or aligned due to the presence of short repeats were excluded prior to further analyses (reported alignment sizes take into account exclusion of these sites). PCRs were performed in a total volume of 10 µl, including 0.1 µl Taq polymerase (5 U/µl Biotaq® and Bioline DNA Polymerase); 0.1 µl BSA (20 mg/ml); 0.5 µl of each primer (5 µM); 0.1 µl dNTPs (25 mM); and 0.3 µl of MgCl2 (50 mM) plus 1 µl of reaction Buffer. For PPP3CAint4, PCRs were performed in a total volume of 10 µl, including 0.1 µl of EcoTaq polymerase (5 U/µl Taq DNA Polymerase, EcoGen); 0.3 µl of each primer (10 µM); 0.5 µl dNTPs (40 µM); and 0.5 µl of MgCl2 (50 mM) plus 1 µl of reaction Buffer NH3 (Bioline). After PCR products were purified with Montage PCR columns (Millipore), samples were cyclesequenced using ABI Prism Big Dye Terminator Cycle in an ABI PRISM® 310 automated sequencer (Applied Biosystems) following the manufacturers’ instructions. 2.3. Lineage identification and delineation Sequences were checked by eye, edited and aligned using the program Bioedit version 7.2.5 (Hall, 1999). All sequences generated for this study are deposited in GenBank under Accession Nos. KP165846-KP167135 (Table 1). Polymorphic positions corresponding to heterozygous individuals in nuclear loci were coded with IUPAC ambiguity codes. Haplotypes were phased using PHASE v2.1 (Stephens et al., 2001; Stephens and Donnelly, 2003), using SeqPHASE (Flot, 2010) to format the input files. Length variant heterozygotes (LVHs), which resulted from the amplification of alleles with different sizes from a single individual, were phased interpreting directly the mixed trace in the electropherogram formed by the two allelic peaks superimposed onto each other downstream of the EVIDENCIA MOLECULAR DE ESPECIES CANDIDATAS CRÍPTICAS EN LOS PELODYTES IBÉRICOS 47 indel (e.g. Sousa-Neves et al., 2013). All known haplotypes were incorporated for subsequent haplotype inference. We accepted haplotypes with a minimum probability of 0.9. We performed phylogenetic analyses in MrBAYES v3.2.1 (Huelsenbeck and Ronquist, 2001; Ronquist et al., 2012) to estimate relationships between mtDNA and nDNA haplotypes. Full alignments were collapsed into haplotypes using the online tool Fabox (Villesen, 2007). For the mtDNA dataset, we used PartitionFinder v1.1.1 (Lanfear et al., 2012) to choose the optimal partitioning strategy. Best support was obtained for three partitions, corresponding to first positions in cob and nad4 and the fragment containing the tRNAs; second positions in cob and nad4; and third positions in cob and nad4. Analyses in MrBAYES were set to explore the full GTR parameter space in each of the three partitions using the commands nst=mixed rates=invgamma. Convergence of results was assessed by examination of values of the standard deviation of split frequencies across runs and visual inspection of parameter values during the run in Tracer v1.6 (Rambaut et al., 2014). Genealogical relationships among haplotypes for each locus were estimated using phylogenetic algorithms as implemented in Haploviewer (Salzburger et al., 2011). Phylogenetic relationships among haplotypes for each locus were estimated using a Maximum Likelihood (ML) approach, as implemented in the software RAxML v.7.0.4 (Silvestro & Michalak, 2010), using the graphical frontend RAxML GUI v.0.93 (Randomized Accelerated Maximum Likelihood; Stamatakis, 2006). Using default options we ran the program with the best fit model for each locus as selected by PartitionFinder v0.9 (Lanfear et al., 2012) under the Akaike information criterion (AIC; Akaike, 1973), and the generated trees were used to estimate each haplotype network. We assessed probability of recombination in nuclear sequences with TOPALi v2.5 (Milne et al., 2004), using the difference of sums of squares (DSS) method with a sliding window of 100-bp and 10- bp step size, and also with the PhiTest implemented in Splitstree v4.2 (Huson and Bryant, 2006). Four major lineages of Iberian Pelodytes were recovered in previous analyses (see results below) and for each of them, several genetic diversity parameters were estimated. In addition, we performed a pairwise mismatch distribution analysis (Rogers and Harpending, 1992), and calculated several statistics including Tajima’s D (Tajima, 1989), Ramos-Onsins and Rozas’ R2 (Ramos-Onsins and Rozas, 2002) and Fu’s Fs (Fu, 1997) to test for signatures of demographic expansion in each of the four lineages using DnaSP v 5.10 (Librado and Rozas, 2009). Genetic distances (p-uncorrected) within and between species lineages were calculated with Mega6 (Tamura et al., 2011). Species trees were reconstructed based on two different methodologies. First, we used the coalescent-based method implemented in *BEAST (Heled and Drummond, 2010). We used a Yule speciation prior with strict molecular clock. Each marker was analyzed as an independent partition, with nucleotide substitution models selected by jModeltest v 2.1.1, based on the Bayesian Information HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 48 Criterion (Darriba et al., 2012). Tree topologies and molecular clocks across partitions were unlinked. We specified a lognormal prior for the substitution rate of the mtDNA partition with a mean of 0.0075 substitutions/site/myr and a standard deviation of 0.2, encompassing values typically reported in the literature (see for example Recuero et al., 2012). Three independent analyses were run for one hundred million generations and trees and other parameters were sampled every 10,000 generations. Traces were visualized in Tracer v 1.6 (Rambaut et al., 2014) to check for adequate mixing and convergence of results across runs, and log and treefiles were subsequently combined. Additionally, we used the pseudo-likelihood approach implemented in MP-EST v. 1.3 (Liu et al., 2010) to infer the Pelodytes species tree. To estimate branch support, 1,000 replicate gene trees for each marker (taken from the post burn-in sample of trees from a MrBAYES run, see above) were subjected to MP-EST analyses to derive bootstrap proportions of inferred clades in the species tree. MP-EST analyses were run in the STRAW server (Shaw et al., 2013). Both *BEAST and MP-EST attribute gene-tree discordance to incomplete lineage sorting and do not take into account gene flow across population lineages; therefore, individuals and populations identified as admixed based on inspection of the mtDNA tree and nDNA haplotype networks (see results below) were excluded from the datasets prior to analyses. All other individuals from populations where mtDNA haplotypes from different lineages were found in sympatry were also excluded. 2.4. Validation approach We used SpedeSTEM (Ence and Carstens, 2011) as a validation approach to evaluate support for the previously identified candidate species. SpedeSTEM calculates the likelihood of multiple arrangements of putative evolutionary lineages based on externally generated gene trees and ranks them by model probability using information theory. Gene trees were estimated by maximumlikelihood inference in Garli v 0.951 (Zwickl, 2006) using alignments with a single representative per haplotype (excluding admixed populations, as in previous analyses). We used a weighted average across loci calculated in DnaSP as the estimate for theta (theta= 0.03093), with a scaling (variable sites/total sites) of 1:0.47:0.32 for mtDNA, β-fibint7 and PPP3CAint4, respectively. Pelodytes caucasicus was used as outgroup, with the remaining samples divided into two major groups corresponding to P. ibericus and P. punctatus, with the latter subdivided into the three lineages recovered in previous analyses. Analyses were run online in the SpedeSTEM server at: https://spedestem.osu.edu/runspedestem. EVIDENCIA MOLECULAR DE ESPECIES CANDIDATAS CRÍPTICAS EN LOS PELODYTES IBÉRICOS 49 3. Results Amplification of the two mtDNA fragments was successful in 367 individuals (including seven outgroup samples, Table 1), yielding an alignment of 1493 bp with 155 unique haplotypes (375 variable sites, 321 parsimony-informative). Additionally, 139 individuals (278 phased sequences) from the ingroup plus two from the outgroup were sequenced for PPP3CAint4 (393 bp) and β-fibint7 (752 bp). Different individuals were sequenced for each nuclear marker (see Table 1). An A+T-biased content (70%) was observed in PPP3CAint4 sequences, which is consistent with values reported for this marker in other species (according to Prychitko and More, 1997, this feature of A-T rich sequences is a peculiarity of non-coding regions that are not under functional constraint). There were 23 unique haplotypes in PPP3CAint4 (25 variable sites, 13 parsimony-informative); and 40 haplotypes in β-fibint7 (45 polymorphic sites, 31 parsimony-informative). Table 1 lists individuals sequenced for each marker. We did not find significant evidence of recombination in the nuclear markers. Phylogenetic analyses of mtDNA data recovered a well-resolved tree with four major haplotype clades (labeled A to D), with a strong association with geography (Figs. 1 and 2). Clade B corresponds to P. ibericus, whereas the remaining clades (A, C and D) are ascribed to P. punctatus: A is distributed in the south-west of the Iberian Peninsula, along the Atlantic coast and part of central Portugal; C occupies central and eastern Spain; and D is present in north-eastern Spain, France and north-western Italy. All four major clades are well supported by Bayesian Posterior Probabilities (BPP) of 0.99-1.0. Clade D is subdivided in two well-supported sub-clades, one containing samples from NW Italy and SE France (localities 152 to 157, BPP: 1.0) and the other with the remainder of samples (BPP: 0.99). Clades A, C and D form a monophyletic group (BPP: 0.96), with D being the sister taxon to (A+C), although with moderate support (BPP: 0.86). In some populations, we found haplotypes of different clades co-occurring (Table 1 and Fig. 1). These include localities 17-21 (clades A + B), and 75, 88 (clades B+C). We found no localities with mtDNA haplotypes of clades C+D occurring in sympatry. Estimates of genetic diversity and intra- and interpopulation genetic distance are shown in Tables 2 and 3, respectively. For mtDNA, we found moderate levels of genetic diversity in haplotype clades B and C, with higher values of haplotype and nucleotide diversity in clades A and D. Mismatch distribution plots revealed a clearly unimodal pattern in clades A, B and C, suggesting demographic expansion (Fig. S1). This is in accordance with significant values of Tajima’s D, Fu’s Fs and Ramos- Onsins & Rozas’ R² statistics in the same clades (Table 2). In contrast, clade D exhibits a multimodal mismatch distribution, with no significant values for any statistic, suggesting demographic stability or genetic substructuring. The average number of pairwise sequence differences (p-uncorrected distance) between clades ranged from 3.3% to 4.4% (Table 3), whereas between each of the Iberian clades and P. caucasicus the values ranged from 15.7-16.8%. Within clades, p-distances were higher in clade D HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 50 (0.64%) than in the other clades (0.12-0.37%, Table 3). We interpret haplotype clades A-D to diagnose four species lineages. Haplotype networks based on mtDNA and nuclear sequences are shown in Fig. 3. In mtDNA, lineages B and C exhibit star-like topologies, with one high frequency, central haplotype and several additional haplotypes connected by one-step mutations, again suggesting recent demographic expansion. The most frequent haplotype in lineage B was present in 42 out of 94 sequences and was widely distributed, with 23 haplotypes occurring only once and 10 additional haplotypes with frequencies 2-9. The most frequent haplotype in lineage C occurred in 50 out of 151 individuals from the center and east of the Iberian Peninsula, with 37 haplotypes with a frequency of 1 and an additional 17 haplotypes with frequencies 2-9. Lineage A was subdivided into two main haplotype groups, one of them largely distributed in central (Setúbal, Lisboa and Santarém) and Northern Portugal (Porto and Coimbra), and the other geographically restricted to the south (Faro). We found 42 haplotypes in this lineage, with a highest frequency of 15 and 30 haplotypes observed only once. Finally, lineage D includes two major haplotype groups: a) from Catalonia to Northwestern France; and b) from Southern France (Provence-Côte D’Azur) to Northern Italy (Liguria). We found a total of 20 haplotypes in this lineage, with frequencies ranging from 1-6. Nuclear networks were congruent with mtDNA, with four major haplotype groups in each marker (Fig. 3), but we also detected the presence of heterozygous individuals with alleles clustering with different lineages, especially in areas of close geographic proximity between them (lineages A+B: populations 17, 18, 21; lineages B+C: population 88; lineages C+D: population 143, see Table 1 and Fig. 1). Some individuals had mtDNA haplotypes characteristic of one lineage and nuclear alleles of a different lineage (lineages C+D, populations 143, 144, 150, Table 1, Fig. 1). Species tree analyses recovered concordant, robust topologies, with P. ibericus (lineage B) being the sister taxon to a clade including the other three major linages (BPP: 0.89, bootstrap support – Bs: 100), with lineage D being the sister taxon to (A+C) (BPP: 0.75; Bs: 87.6). According to *BEAST results, major speciation events in Iberia were concentrated in the Pliocene and Lower Pleistocene (Fig. 4). Median and 95% highest posterior density intervals (HPDs) for inferred splits were 3.63 (2.07-5.50) myr (P. ibericus vs. lineages A, C and D; 2.91 (1.68-4.51) myr for lineage D vs. lineages A+C; and 2.86 (1.54-4.48) myr for lineages A and C (Fig. 4). The SpedeSTEM-based validation approach provided the highest support for the four-lineage arrangement (Table 4), supporting their qualification as candidate species (P. ibericus plus three candidate species, one of which would retain the name P. punctatus, see Discussion). EVIDENCIA MOLECULAR DE ESPECIES CANDIDATAS CRÍPTICAS EN LOS PELODYTES IBÉRICOS 51 4. Discussion Initial attempts at probabilistic, molecular-based species delineation were received with criticism (Bauer et al., 2011; Fujita and Leaché, 2011), but in a short time these methods have become more popular. However, they have not replaced character-based species descriptions, and thus the lineages identified in species delineation analyses are best treated as candidate species, or species hypotheses amenable to further testing with as many different sources of evidence as possible. Our approach, based on multilocus analyses of a comprehensive sample, consistently recovered four historical lineages in Iberian Pelodytes, showing strong geographic structuring (lineages A-D, Figs. 1- 4). Of these, one corresponds to Pelodytes ibericus (lineage B), which has been shown to differ in morphological, osteological, behavioral (mating calls), and molecular characters from populations ascribed to P. punctatus (Sánchez-Herráiz et al., 2000; Sanchiz et al., 2002; Pargana et al., 2003; García-París et al., 2003; Veith et al., 2006). In our analyses, P. ibericus is also recovered as diverging from the rest of the Iberian lineages around 3.6 myr ago, in accordance with previous estimates based on allozymes and mtDNA data (3.3-3.8 myr, see Sánchez-Herráiz et al., 2000; Sanchiz et al., 2002; García-París et al., 2003). Contact zones with lineages A and C have been approximately identified (Fig. 1), and further fine-scale sampling coupled with detailed analysis using a large set of fastevolving nuclear markers (microsatellites or single nucleotide polymorphisms) will be of crucial importance to assess the extent of reproductive isolation across lineages (which is incomplete, as shown by our observation of several instances of cyto-nuclear discordance; see also van de Vliet et al., 2012, where boundaries between lineages A and B slightly differ from our results). The second most differentiated lineage (lineage D) includes all populations north of the Pyrenees, and since it includes the type locality of P. punctatus ("aux environs de Beauvais", Department Oise, northern France: Daudin, 1802) it would retain this name. Two sub-clades were strongly supported in phylogenetic analyses of mtDNA sequences. One of these groups includes populations in SE France and NW Italy, whereas the other one is more widely distributed from NE Spain (Catalonia) to northern France. Remarkably, there is little genetic differentiation in this second sub-clade. The pattern of haplotypic diversity, with more haplotypes in populations south of the Pyrenees, suggests a rapid, recent expansion, probably along the Garonne river basin, which provides a corridor connecting the Atlantic and Mediterranean coasts of France. The genetic distinctiveness of these populations had previously been noted by Sánchez-Herráiz et al. (2000) and García-París et al. (2003). Relatively high levels of genetic diversity in lineage D are consistent with a long fossil record, possibly dating back to 3.2 myr ago (Sète, see Blain, 2009). Further research is needed to delineate the contact zone with lineage C, although the finding of instances of cyto-nuclear discordance in populations 143, 144 and 150 suggests a wide area of admixture. Surprisingly, haplotypes of lineages HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 52 C and D were never found in sympatry, although this may be an artifact of sparser sampling at the potential contact zone. Lineage A is endemic to Portugal, with populations all along its Atlantic coast. Genetic distinctiveness of populations in this area was initially reported by Pargana (1998), who also noted differences in bioacoustic parameters, and more recently by van de Vliet et al. (2012), who reported strong cross-amplification failure in microsatellite markers developed from samples in SW Portugal when tested in samples from northern Spain (which would correspond to lineage C in our study, see Fig. 1). The existence of well-differentiated linages in SW Portugal has been previously reported for other amphibian species, like Salamandra salamandra, Lissotriton boscai or Alytes cisternasii (Reis et al., 2011; Martínez-Solano et al., 2006; Gonçalves et al., 2009). The addition of Pelodytes to an increasing group of taxa with important genetic reservoirs in this region makes it one of the key Iberian “refugia within refugia” (Gómez & Lunt, 2007; Abellán and Svenning, 2014). The existence of putative Pleistocene glacial refugia in Southern Portugal, Spain and France, on the basis of our data and previous studies with other taxa, has strong implications for regional conservation planning. Understanding cryptic diversity is a concern as amphibian habitat, temporary ponds in traditional Mediterranean farmland, is disappearing at a fast rate (Ferreira and Beja, 2013). Finally, lineage C is the most widespread in Iberia, with populations in the two major plateaus in central Spain. The presence of Pelodytes in the Northern Plateau dates back at least to the Early Pleistocene in Atapuerca (Cuenca-Bescós et al., 2010) and is relatively well documented in other (more recent) sites within the current range of this lineage (for example, see Blain et al., 2007, 2011). In spite of this, levels of genetic diversity are comparatively low in this lineage, and with lineage B (P. ibericus), it is the only one where all tests of demographic expansion were significant (Table 2, Fig. S1). The harsher climatic conditions of central Spain may have subjected Pelodytes populations to strong demographic fluctuations through time, although it remains unclear what circumstances governed long-term demographic trends in P. ibericus. Species distribution models (SDMs) are a powerful tool to identify potential differences across lineages in their ecological niche, which may have been important in the speciation process (Fitze et al., 2011). However, a recent approach to examining functional divergence between lineages A, B and C revealed weak differentiation in thermal physiology (M. Katzenberger, J. Díaz-Rodríguez, H. Duarte, J.F. Beltrán and M. Tejedo, unpublished data). Molecular-based species delimitation approaches are rapidly becoming popular in molecular systematics because they allow rapid and objective identification of major historical lineages as candidate species. Results of our species-delimitation approach suggest that species diversity in Iberian Pelodytes may be currently underestimated, with up to two additional lineages that may warrant recognition as new species. More detailed analyses of contact zones, as well as morphological EVIDENCIA MOLECULAR DE ESPECIES CANDIDATAS CRÍPTICAS EN LOS PELODYTES IBÉRICOS 53 and ecological comparisons of populations representing all major lineages are underway in order to provide robust evidence supporting (or rejecting) these species hypotheses. Acknowledgments For technical support during lab work we thank Susana Lopes, C. Pinho, M.J. Fernández Benéitez and Bruno Carvalho. We also thank E. Albert, J.W. Arntzen, E. Ayllón, M. Barbosa, A. Bermejo, M. Berroneau, W. Böhme, G. Caballero, D. Canestrelli, T. Couturier, E.G. Crespo, D. Donaire, L. García, M. García París, P. Geniez, I. Gómez Mestre, J. P. González, E.G. González, A. Gosá, J. Gutiérrez, P. Hernández, A. Montori, J.C. Monzó, N. Oromí,B. Paños, P. Pavón, E. Recuero, V. Sancho, I. Urbán, A. Valdeón and M. Veith for sharing samples and/or help during fieldwork. A. Sánchez Vialas kindly provided pictures of individuals of lineages A and D, and Godfried Schreur and Ana Cordero, of lineage B (P. ibericus). This work was supported through Project “Genomics and Evolutionary Biology” cofinanced by North Portugal Regional Operational Programme 2007/2013 (ON.2 – O Novo Norte), under the National Strategic Reference Framework (NSRF), through the European Regional Development Fund (ERDF); the Program Operacional Factores de Competitividade (COMPETE), and by national funds from Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), through the research Projects PTDC/BIA-BEC/099915/2008 and PTDC/BIA-BEC/105083/2008 to HG and FS, respectively; and by partial funds provided by grants CGL2008-04271-C02-01/BOS and CGL2011-28300 (Ministerio de Ciencia e Innovación, Ministerio de Economía y Competitividad, Spain, and FEDER) and PPII10-0097- 4200 (Junta de Comunidades de Castilla la Mancha and FEDER) to IMS, who is currently funded by Project “Biodiversity, Ecology and Global Change”, co-financed by North Portugal Regional Operational Programme 2007/2013 (ON.2–O Novo Norte), under the National Strategic Reference Framework (NSRF), through the European Regional Development Fund (ERDF). Additional funds were provided by grants: “Anfibios Endémicos de Andalucía” (Consejería de Medio Ambiente, Junta de Andalucía, Spain), and CGL2005‐02931/BOS (Ministerio de Ciencia e Innovación, Spain) to MT. JDR is supported by a PhD grant from FCT (SFRH/BD/70631/2010), HG and FS are supported by postdoctoral grants from FCT (SFRH/BPD/26555/2006 and SFRH⁄BPD⁄87721⁄2012, respectively) and TSN by a research grant (BI) from ICETA/UP. References Abellán, P., Svenning, J.C., 2014. Refugia within refugia–patterns in endemism and genetic divergence are linked to Late Quaternary climate stability in the Iberian Peninsula. Biological Journal of the Linnean Society 113, 13–28. Ahrens, D., Fabrizi, S., Šipek, P., Lago, P.K., 2013. Integrative analysis of DNA phylogeography and morphology of the European rose chafer (Cetonia aurata) to infer species taxonomy and patterns of postglacial colonisation in Europe. Molecular Phylogenetics and Evolution 69, 83–94. Akaike, H., 1973. 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HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 62 Polvorines PP22 C La Boyeriza, camino de Polvorines Spain 40,26 -3,56 X X X 129 PP42 C Carabaña Spain 40,27 -3,25 X X X X PP43 C Carabaña Spain 40,27 -3,25 X X X X 130 IMS1511 C Camino de Preresa (La Aldehuela) Getafe Spain 40,30 -3,60 X X X X IMS1512 C Camino de Preresa (La Aldehuela) Getafe Spain 40,30 -3,60 X X X X 131 PP166 C Arroyo de la Vega Spain 40,32 -3,20 X X X PP167 C Arroyo de la Vega Spain 40,32 -3,20 X X X 132 PP102 C Pozuelo del Rey Spain 40,37 -3,32 X X X X PP103 C Pozuelo del Rey Spain 40,37 -3,32 X X X X 133 PP248 C Pezuela del Rey Spain 40,37 -3,18 X X X PP249 C Pezuela del Rey Spain 40,37 -3,18 X X X X 134 PP62 C La Yesera, Rivas Vaciamadrid Spain 40,39 -3,52 X X X X PP63 C La Yesera, Rivas Vaciamadrid Spain 40,39 -3,52 X X X X PP82 C La Guindalera, San Fernando de Henares Spain 40,41 -3,50 X X X PP83 C La Guindalera, San Fernando de Henares Spain 40,41 -3,50 X X X X 135 PP228 C Las Cruces, Pezuela del Rey Spain 40,42 -3,17 X X X X PP229 C Las Cruces, Pezuela del Rey Spain 40,42 -3,17 X X X X 136 IMS2116 C Cedrillas Spain 40,46 -0,86 X X X X IMS2117 - Cedrillas Spain 40,46 -0,86 X X 137 IMS2081 C Ares del Maestre Spain 40,46 -0,17 X X IMS2082 C Ares del Maestre Spain 40,46 -0,17 X X X X 138 PP122 C Santorcaz a Los Santos de la Humosa Spain 40,48 -3,24 X X X X PP123 C Santorcaz a Los Santos de la Humosa Spain 40,48 -3,24 X X X X 139 IMS3203 C Revilla de Campos Spain 42,01 -4,71 X X X X IMS3204 C Revilla de Campos Spain 42,01 -4,71 X X X X 140 IMS3918 C Loma de los Perdigones Spain 42,11 -1,39 X X X IMS3919 C Loma de los Perdigones Spain 42,11 -1,39 X X X 141 IMS3876 C Arnedo, La Maja Spain 42,29 -2,04 X X X IMS3877 C Arnedo, La Maja Spain 42,29 -2,04 X X X 142 BUR02 C Páramo de Masa Spain 42,66 -3,78 X X X X 143 Barna01 D Castellet i la Gornal Spain 41,25 1,59 X X X X Cyto-nuclear discordance (βfibint7) Barna02 D Castellet i la Gornal Spain 41,25 1,59 X X X Cyto-nuclear discordance (PPP3CAint4) (clades C+D) 144 GAR03 D El Garraf Spain 41,27 1,84 X X GAR01 D El Garraf Spain 41,27 1,84 X X X X Cyto-nuclear discordance (PPP3CAint4) (clades C+D) GAR02 D El Garraf Spain 41,27 1,84 X X X X 145 IMS2498 D Prades Spain 41,80 1,58 X X X X IMS2499 D Prades Spain 41,80 1,58 X X X 146 BRU128 D El Brull (Osona) Spain 41,80 2,26 X X X X BRU06 D El Brull (Osona) Spain 41,80 2,26 X X X X BRU08 D El Brull (Osona) Spain 41,80 2,26 X X 147 RIV01 D Riudarenes Spain 41,83 2,72 X X X RIV02 D Riudarenes Spain 41,83 2,72 X X X 148 IMS2477 D Suria Spain 41,85 1,79 X X X IMS2478 D Suria Spain 41,85 1,79 X X X X 149 SOS04 D Solsona Spain 42,10 1,65 X X SOS05 D Solsona Spain 42,10 1,65 X X X X SOS06 D Solsona Spain 42,10 1,65 X X X 150 LLA01 D Llança Spain 42,37 3,16 X X X X Cyto-nuclear discordance (βfibint7) (clades C+D) LLA02 D Llança Spain 42,37 3,16 X X 151 Pataris D Mare de Pataris France 43,57 3,70 X X X X Devois D Mare de Devois France 43,57 3,69 X X X X 152 SUE2310 D Mare du Mas de Sueuilles France 43,57 3,70 X X EVIDENCIA MOLECULAR DE ESPECIES CANDIDATAS CRÍPTICAS EN LOS PELODYTES IBÉRICOS 63 Table 2. Polymorphism statistics for the mitochondrial and nuclear markers analyzed in this study. (n) number of sequences; (h) number of haplotypes; (S) number of segregating sites; (Hd) haplotype diversity; (π) nucleotide diversity; (θw) Watterson’s (1975) mutation parameter Theta. * P<0.05; ** P<0.01; *** P<0.001. Table 3. Average number of pairwise sequence differences (p-uncorrected distance) within (on the diagonal) and between the four major mtDNA clades in Pelodytes. The outgroup P. caucasicus is included for reference. Clade A B C D P. caucasicus A 0.0037 B 0.0445 0.0012 C 0.0334 0.0408 0.0015 D 0.0377 0.0444 0.0348 0.0064 P. caucasicus 0.1574 0.1625 0.1683 0.1618 0.002 Table 4. SpedeSTEM results (multiple AIC calculations, similar results are recovered with the single AIC calculation, data not shown). K=number of clades; -lnL=negative logarithm of the likelihood function; AIC: Akaike information criterion; delta: difference in AIC score. k -lnL AIC delta 2 -28537.5314 57079.0628 1983.0597 3 -28547.5068 57101.0135 2005.0105 CAZ1920 D Cazevieille France 43,57 3,69 X X X 153 MLT10271 D St. Martin de Castries France 43,78 3,47 X X X 154 SML1808 D La Boissière France 43,83 3,75 X X MSE2150 D Mare de St-Etienne France 43,81 3,78 X X 155 SMI10280 D Saint-Michel France 43,85 3,39 X X X 156 SAV02 D Savona Italy 44,18 8,37 X X SAV04 D Savona Italy 44,18 8,37 X X SAV06 D Savona Italy 44,18 8,37 X X 157 SBC01 D Saint-Bonnet-en-Champsaur France 44,68 6,08 X X X SBC02 D Saint-Bonnet-en-Champsaur France 44,68 6,08 X X 158 IMS4024 D Libourne France 44,91 -0,27 X X X IMS4026 D Libourne France 44,91 -0,27 X X X 159 HAV01 D Estuaire de la Seine France 49,46 0,21 X X 160 AMB01 D Ambleteuse France 50,80 1,62 X X X X AMB03 D Ambleteuse France 50,80 1,62 X X AMB04 D Ambleteuse France 50,80 1,62 X X 161 Cauc01 Rize Turkey X X Cauc02 Rize Turkey X X 162 IMS4649 Uzungol Turkey X X IMS4650 Uzungol Turkey X X IMS4651 Uzungol Turkey X X IMS4652 Uzungol Turkey X X IMS4653 Uzungol Turkey X X Marker n h S Hd Π Θw Tajima's D Fu's Fs R² mtDNA All 360 151 219 0.962 ± 0.005 0.02780 ± 0.00053 0.02270 ± 0.00466 0.44539 -27.587* 0.0940 Clade A 77 42 54 0.950 ± 0.016 0.00372 ± 0.00022 0.00736 ± 0.00209 -1.65515 -29.493** 0.0473* Clade B 94 34 41 0.792 ± 0.043 0.00123 ± 0.00015 0.00537 ± 0.00153 -2.45213** -38.589** 0.0244** Clade C 151 55 67 0.881 ± 0.024 0.00154 ± 0.00012 0.00803 ± 0.00203 -2.51337*** -74.408*** 0.0178** Clade D 38 20 35 0.940 ± 0.021 0.00640 ± 0.00061 0.00558 ± 0.00185 0.40513 -2.345 0.1298 β-fibint7 278 40 45 0.869 ± 0.014 0.00940 ± 0.00040 0.00965 ± 0.00144 -0.19297 -5.910 0.0783 PPP3CAint4 278 23 25 0.709 ± 0.027 0.00745 ± 0.00039 0.01026 ± 0.00289 -0.88614 -5.044 0.0577 HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 64 4 -27544.0015 55096.0030 0.000000 Fig. 1. Location of the 160 populations of Pelodytes sampled. Redclade A; yellowclade B (P. ibericus); greenclade C; and blueclade D. The different background colors represent IUCN ranges for P. punctatus (blue) and P. ibericus (yellow). Insets show details of putative secondary contact zones. EVIDENCIA MOLECULAR DE ESPECIES CANDIDATAS CRÍPTICAS EN LOS PELODYTES IBÉRICOS 65 Fig. 2. Bayesian tree showing relationships between haplotypes in the combined mtDNA dataset. Colors as in Fig. 1. Values next to nodes are Bayesian posterior probabilities (BPP). . Fig. 3. Haplotype genealogy from Maximum likelihood analysis of mtDNA, β-fibint7 and PPP3CAint3 performed in the software Haploviewer. Colors represent the different mtDNA clades (labeled A-D as in Figs. 1 and 2, see text for details). Each circle represents a different haplotype and its size is proportional to its relative frequency. Dots represent inferred unsampled or extinct haplotype HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 66 Fig. 4. Species tree of Pelodytes. Maximum clade credibility tree recovered by *BEAST, showing 95% highest posterior density intervals for split times (bars) and posterior probabilities for each node. Also shown are values of bootstrap support (in %) recovered in MP-EST analyses. Scale (bottom) in millions of years. Fig. S1. Mismatch distribution plots for each mtDNA clade in Pelodytes. The blue curve shows the distribution of the observed pairwise nucleotide site differences and red curves the expected values in growing and declining populations. INTEGRACIÓN DE DATOS MOLECULARES, BIOACÚSTICOS Y MORFOLÓGICOS REVELAN DOS NUEVAS ESPECIES DE PELODYTES DE LA PENÍNSULA IBÉRICA 67 CAPÍTULO 2: Taxonomía de cara a la especiación críptica: integración de datos moleculares, bioacústicos y morfológicos revelan dos nuevas especies de Pelodytes en la Península Ibérica Integration of molecular, bioacoustical and morphological data reveals two new cryptic species of Pelodytes (Anura, Pelodytidae) from the Iberian Peninsula JESÚS DÍAZ-RODRÍGUEZ1,2,*, MARCELO GEHARA3, RAFAEL MÁRQUEZ4, MIGUEL VENCES5, HELENA GONÇALVES2,6, FERNANDO SEQUEIRA2, IÑIGO MARTÍNEZ-SOLANO7, MIGUEL TEJEDO1. Accepted in Zootaxa. 1 Department of Evolutionary Ecology, Estación Biológica de Doñana (EBD-CSIC), Avenida Américo Vespucio, s/n, 41092 Sevilla, Spain 2 CIBIO-InBIO, Centro de Investigação em Biodiversidade e Recursos Genéticos, Campus Agrário de Vairão, Universidade do Porto, 4485-661 Vairão, Portugal 3 DBEZ—Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Campus Universitário Lagoa Nova, Natal, RN 59078-900, Brazil 4 Fonoteca Zoológica & Dept. Biodiversidad y Biología Evolutiva. Museo Nacional de Ciencias Naturales (CSIC) José Gutiérrez Abascal, 2. 28006 Madrid. Spain 5 Division of Evolutionary Biology, Zoological Institute, Technical University of Braunschweig, Mendelssohnstr. 4, 38106 Braunschweig, Germany 6 Museu de História Natural e da Ciência da Universidade do Porto (MHNC-UP), Praça Gomes Teixeira, 4099-002 Porto, Portugal 7 Department of Wetland Ecology, Estación Biológica de Doñana (EBD-CSIC), Avenida Américo Vespucio, s/n, 41092 Sevilla, Spain * Corresponding author: e-mail: byoss[email protected] Abstract Parsley frogs (Pelodytes) comprise the only genus in the family Pelodytidae, an ancient anuran lineage that split from their closest relatives over 140 million years ago. Pelodytes is a Palearctic group restricted to Western Eurasia including three extant species: the eastern species P. caucasicus, endemic to the Caucasus area, and two closely species inhabiting Western Europe: the Iberian endemic P. ibericus and the more widespread P. punctatus. Previous studies based on mitochondrial and nuclear DNA markers have revealed the existence of two additional lineages of Parsley frogs in the Iberian Peninsula, which have been flagged as candidate species. Here, we integrate novel molecular, morphological and bioacoustical data to assess the differentiation of the four western Parsley frog lineages. Species trees and Bayesian population assignment analyses based on nuclear markers confirm previous studies and concordantly delineate four parapatric lineages with narrow hybrid zones. Mitochondrial divergence is low (< 2% pairwise distances in the 16S rRNA gene), in line with previously reported low mitochondrial substitution rates in non-neobatrachian frogs. Based on concordance between mitochondrial and nuclear markers, we conclude that four species of Parsley HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 68 frogs occur in Western Europe: Pelodytes punctatus, distributed from northern Italy to northeastern Spain; Pelodytes ibericus, inhabiting southern Spain and southern Portugal; Pelodytes atlanticus sp. nov., from the Portuguese Atlantic coast; and Pelodytes hespericus sp. nov., occurring in central and eastern Spain. However, bioacoustical and morphological differentiation of these species is low, with no obvious and qualitative diagnostic characters allowing full species discrimination. Differences in the relative size of metacarpal tubercles exist but this character is variable. Pelodytes ibericus and Pelodytes atlanticus are smaller than the other two species, and P. ibericus has shorter limbs and various distinctive osteological characters. Bioacoustically, the pattern by which two different note types are combined in advertisement calls separates P. hespericus from the remaining species. Despite these differences, we emphasize that the taxonomic status of all four western Parsley frogs requires additional investigation, especially the patterns of genetic admixture across contact zones. While a status of separate species best conforms to the currently available data, alternative hypotheses are also discussed. Key words: Amphibia, Pelodytidae, cryptic species, species delimitation, population assignment, Pelodytes punctatus, Pelodytes ibericus, Pelodytes atlanticus sp. nov., Pelodytes hespericus sp. nov. 1. Introduction Recognition of species as independent evolutionary lineages (de Queiroz 1998, 2007), rather than based on alternative species concepts, has been paramount for the development of integrative taxonomic approaches (Dayrat 2005), leading to improved operational protocols for species delimitation (Sites & Marshall 2003; Padial et al. 2010; Camargo & Sites 2013; Miralles & Vences et al. 2013; Carstens et al. 2013). The understanding of speciation as a lineage splitting process, with subsequent accumulation of emerging properties acquired during the course of divergence, has also served to define more clearly the sources of discordance among taxonomists. At what level of lineage splitting should diverging entities be recognized as species? Almost necessarily, there will be a vast number of incipient species that many taxonomists would fail to recognize –and name– as separate species-level entities, even if some of the properties required by different species criteria are met. From a molecular perspective, species delimitation approaches based on a single locus tend to be misleading because of the pervasiveness of discordance among gene trees and species tree. Genealogies do not always match the speciation process due to recent divergence, hybridization, recombination, gene duplication and loss (Degnan & Rosenberg 2009). This undermines approaches relying on a single locus, especially for mtDNA, which is prone to showing genealogical discordance with respect to population history (e.g. see Ballard & Whitlock 2004). Focusing just on herpetology, INTEGRACIÓN DE DATOS MOLECULARES, BIOACÚSTICOS Y MORFOLÓGICOS REVELAN DOS NUEVAS ESPECIES DE PELODYTES DE LA PENÍNSULA IBÉRICA 69 there are multiple examples of deeply divergent, co-occurring mitochondrial lineages (Zhang et al. 2008; Hauswaldt et al. 2011; Vences et al. 2013) suggesting patterns of recurring divergence and admixture, and of inter-species hybridization and mitochondrial introgression (Babik et al. 2003; Zamudio & Savage 2003; Renoult et al. 2009; Liu et al. 2010; Komaki et al. 2012; Wielstra & Arntzen 2012; Singhal & Moritz 2012; Jezkova et al. 2013; Zielinski et al. 2013; Barrow et al. 2014). Ring species, such as North American Ensatina salamanders, also challenge classical species delimitation attempts (e.g., Wake 1997; Kuchta et al. 2009; Pereira et al. 2011; Devitt et al. 2011; Monahan et al. 2012), as do other cases of local speciation processes blurred by hybridization (e.g., MacLeod et al. 2015). Islands provide further examples of genealogical discordance where founder effects or rapid adaptation to new environmental conditions can lead to the coexistence of different entities in the absence of substantial genetic divergence and, often, in absence of evident reproductive barriers other than the sea (Grazziotin et al. 2006). Whether in such cases a species status is warranted or a renaissance of the subspecies category is needed remains a controversial topic (Hawlitschek et al. 2012). Leaving aside these borderline cases, it remains true that species diversity is often underestimated, especially in “non adaptive” or “cryptic” evolutionary scenarios (Bickford et al. 2007; Funk et al. 2012; Barley et al. 2013). Pelodytidae is a relatively ancient family of anurans with a scarce number of taxonomic representatives in a single described genus: Pelodytes Bonaparte, 1838. According to molecular timetrees, the divergence of pelodytids from their sister group (pelobatids+megophryids) took place more than 140 million years ago (mya) (Roelants et al. 2007), as reflected in deep differences in karyological characters (Morescalchi et al. 1977). Pelodytid morphology is characterized by several plesiomorphic character states (Sanchiz et al. 2002; Garriga & Llorente 2011) and some physiological characters are also interpreted as plesiomorphic (Cardellini & Sala 1987), in agreement with the placement of this family outside of the derived crown group of anurans (the neobatrachians) (Duellman & Trueb 1986; Ford & Cannatella 1993; Irisarri et al. 2012). Species of Pelodytidae are restricted to the Western Palearctic region; they occur in the north Mediterranean and Caucasus areas, occupying the mesothermal climate zone (Escoriza & Ruhí 2014). According to current taxonomy, they comprise three extant species: Pelodytes caucasicus Boulenger, 1896, with a patchy distribution of isolated and threatened populations extending from the eastern shores of the Black Sea to the northern slopes of the Caucasus, occurs in northwest Azerbaijan (in the Belokany part of Zakatala State Reserve), Georgia (southwest and South Ossetia), and Russia (Krasnodar district) to its southern limit in north Turkey (Steiner 1968; Darevsky et al. 1971; Kuzmin 1997; Iskanderov 2009; Iğci et al. 2013). Pelodytes ibericus Sánchez-Herráiz, Barbadillo, Machordom & Sanchiz 2000, is endemic to the HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 70 southern Iberian Peninsula (Portugal and Spain), occurring in populations associated with Mediterranean temporary ponds from Alentejo to Andalusia, occupying almost the entire region except the easternmost provinces (Crespo & Oliveira 1989; Barbadillo 2002a; Ceacero et al. 2007). Finally, Pelodytes punctatus (Daudin, 1802) is discontinuously distributed from the Iberian Peninsula, in central and southwestern Portugal, eastern and central Spain, to France and northwestern Italy (Barbadillo 2002b; Salvidio & Bologna 2007; Crespo et al. 2008; Denoël et al. 2009; Guyétant & Geniez 2013). The fossil record of Pelodytes documents the distribution of this genus in Europe from the Eocene to the Holocene (Roček & Rage 2000; Sanchiz 1998a; Lobo et al. 2016), and initial divergence among species of Pelodytes is ancient (Sánchez-Herráiz et al. 2000; García-París et al. 2003; Veith et al. 2006). The vicariance of Iberian and Caucasian Pelodytes, estimated around the Oligocene - Miocene boundary (about 24 mya) (Sánchez-Herráiz 2004; Veith et al. 2006), roughly coincides with splits in other similarly distributed amphibian taxa, like Chioglossa lusitanica and Mertensiella caucasica (Veith et al. 1998; Steinfartz et al. 2000). The fossil taxon Pelodytes arevacus, Sanchiz, 1978, considered an early extinct member of the western Pelodytes clade, has been recovered from the Miocene in the Iberian Peninsula (Sanchiz 1978, 1998b; Sanchiz et al. 2002). Additionally, fossils morphologically ascribed to modern Pelodytes have been reported from sites in southeastern France from 4.2–3.2 mya (Blain 2009). The genus was also present in the Miocene in other parts of Europe (Roček 2005) and one plausible biogeographical explanation is that the Iberian Peninsula has been a refugium and center of speciation for Pelodytidae since the Miocene (Sanchiz 1978), allowing for the recolonization of part of western Europe during the Pleistocene from the Iberian source (García-París et al. 2003). On the other hand, the absence of Pelodytes in north Africa (Mateo et al. 2003) supports the hypothesis that this genus colonized southern Spain when the Strait of Gibraltar was already a functional biogeographical barrier (Busack 1977). Until the late twentieth century, all Western European populations of the genus were assigned to a single species, i.e., the Common Parsley frog P. punctatus (Arnold et al. 1978). After the initial discovery of bioacoustic differences between French and Italian versus southern Iberian populations (Paillette et al. 1992), detailed comparisons of morphology, osteology and allozymes led to the description of southern Iberian Parsley frogs as a new species, P. ibericus (Sánchez-Herráiz et al. 2000). The distinctiveness of this species was subsequently confirmed by several additional studies (Pargana et al. 2003; García-París et al. 2003; Veith et al. 2006; Crespo et al. 2008; van de Vliet et al. 2012), although detailed analyses of contact zones between P. ibericus and P. punctatus were lacking until recently. Fine-scale genetic studies have revealed that the pattern of genetic differentiation in Parsley frogs in Iberia is more complex than previously thought, with two additional lineages, INTEGRACIÓN DE DATOS MOLECULARES, BIOACÚSTICOS Y MORFOLÓGICOS REVELAN DOS NUEVAS ESPECIES DE PELODYTES DE LA PENÍNSULA IBÉRICA 71 suggesting a history of allopatric differentiation in multiple refugia during the Plio-Pleistocene with recent secondary contact between them (Díaz-Rodríguez et al. 2015). In the present study, we examine the differentiation among western lineages of Parsley frogs in detail, integrating molecular, bioacoustic and morphological approaches. This complex of species poses important problems to taxonomists due to the apparent lack of clear-cut bioacoustic and morphological differences, combined with low mitochondrial divergences among lineages, which are however congruent with population assignments based on independent nuclear gene sequences. Considering all available evidences, we conclude that two undescribed species-level taxa of Pelodytes exist in the Iberian Peninsula; these are here described as new species. 2. Material and methods 2.1. Fieldwork, sampling and external morphological measurements For molecular purposes, 98 individuals of Pelodytes were sampled from a total of 45 localities distributed across the Western European range of the genus, including sites from the Iberian Peninsula, France and northern Italy (Fig. 1). Sample collection was completed in different fieldwork campaigns carried out from 2003 to 2014. Tadpoles were collected during the day by dipnetting in temporal ponds, following a protocol of asepsis to avoid biological contamination between sites. Adults were collected at night using torches and headlamps and frequently guided by the male advertisement call. We collected samples by tail– or toe–clipping from one to five individuals per population , releasing animals immediately in the place of capture (Supplementary Table S1). Tissue samples were preserved in ethanol or frozen. Morphometric measurements were taken from 185 ethanol-preserved specimens from 55 populations (Supplementary Table S2), including vouchers from the natural history museums in Pittsburgh (CM: Carnegie Museum), Lisboa (MUHNAC: Museu Nacional de História Natural e da Ciência), Madrid (MNCN: Museo Nacional de Ciencias Naturales-CSIC), Paris (MNHN: Muséum national d'Histoire naturelle), Bonn (ZFMK: Zoologisches Forschungsmuseum A. Koenig), München (ZSM: Zoologische Staatssammlung) and newly collected specimens deposited in Sevilla (EBD: Colección Científica de la Estación Biológica de Doñana-CSIC). Only specimens with complete datasets available (i.e., all measurements and reliable geographical information) were included in the morphometric analysis. The following morphological measurements were taken by JDR or MV with calipers to the nearest 0.1 mm: snout-vent length (SVL), maximum head width (HW), head length HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 78 adequate mixing and convergence of results across runs. We summarized the results in TreeAnnotator with 10% burn-in, and visualized them using FigTree v1.4.1 (<http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/>). 3. Results and Discussion 3.1. DNA sequences and genetic diversity Amplification of mtDNA (mt-CYB and mt-ND4) was successful in 90 from a total of 98 individuals selected for this study, yielding a mitochondrial DNA alignment of 1493 bp with 55 unique haplotypes (154 variable and 132 parsimony-informative sites). Additionally, a different number of individuals were sequenced for RAG1 (1309 bp), KIAA1239 (801 bp), β-fibint7 (752 bp), PPP3CAint4 (with a short fragment of 393 bp and a large fragment of 935 bp), RPL3int5 (637 bp) and Cherpint7 (676 bp). Supplementary Table S1 lists all the individuals sequenced for each marker. Genetic distances between lineages and estimates of genetic diversity are shown in Tables 1 and 2, respectively. The average number of pairwise sequence differences (percent of uncorrected pdistances) between the four major mtDNA clades in two mitochondrial gene segments, commonly used for DNA barcoding of amphibians, 16S and mt-CO1 (e.g., Vences et al. 2005) ranged from 0.8% to 1.7% for 16S, and from 4.1% to 6.7% for mt-CO1. Díaz-Rodríguez et al. (2015) reported interspecific pairwise sequence differences (p-distance values) from 3.3% to 4.5%, and intraspecific values from 0.1% to 0.6% for mt-CYB+mt-ND4. Haplotype diversity was higher in β-fibint7 than in the other nuclear loci and values of nucleotide diversity were low, especially in KIAA and RAG1; for the combined fragment of mt-CYB and mt-ND4 we found considerable levels of genetic diversity (Table 2). 3.2. Mitochondrial differentiation The geographical distribution of our sampling (Fig. 1) and the median-joining network for mtDNA haplotypes (Fig. 2) reveal that haplotypes clustered into four well-differentiated geographical groups, here named haplogroups A, B, C and D. These results fully correspond to the tree-based analysis of the previous study (Díaz-Rodríguez et al. 2015), which included a much larger set of mtDNA sequences from 384 individuals (excluding the outgroup). Pelodytes ibericus (haplogroup B) is distributed in southern Iberia, with a widespread central haplotype and a number of more geographically restricted haplotypes of which one differed by seven mutations and all others by 1-3 mutations from the central haplotype. Pelodytes punctatus sensu stricto (haplogroup D) includes two haplotype subgroups, one of which occurs from Catalonia to Northwestern France and a second one restricted to Southern France and Northwestern Italy. Haplogroup A occurs in localities scattered INTEGRACIÓN DE DATOS MOLECULARES, BIOACÚSTICOS Y MORFOLÓGICOS REVELAN DOS NUEVAS ESPECIES DE PELODYTES DE LA PENÍNSULA IBÉRICA 79 along the Atlantic coast of Portugal and its haplotypes showed some structure corresponding to populations from northern vs. southern Portugal. Haplogroup C occurred in the south, center and east of the Iberian Peninsula, intercalated between the distribution ranges of haplogroups B and D. In some populations, two different haplogroups were found (i.e., mitochondrial haplotypes of two lineages cooccurring in the same population), especially in areas of close geographic proximity between them (haplogroups A+B, populations 8, 9, 10, 11; and haplogroups B+C, populations 22 and 23). We did not find localities with mtDNA haplotypes of haplogroups C+D occurring in sympatry. Sequence divergence among these four haplogroups greatly exceeded within lineage divergence. In the mt-CYB+mt-ND4 segment, the minimum number of mutational steps between haplogroups was 45-73, whereas the maximum number of mutational steps within haplogroups was 9- 14 within clades A-C and slightly higher (22) within haplogroup D, reflecting its subdivision into two subgroups. 3.3. Molecular species delimitation based on nuclear DNA Haplotype networks based on nuclear sequences are shown in Fig. 2, with samples colored according to each of the four mtDNA haplogroups. Results were largely congruent but instances of cyto-nuclear discordance were observed. Individuals with mtDNA of one haplogroup and nuclear alleles of a different one occurred in essentially the same localities in which co-occurrence of different mtDNA haplogroups was also observed (Supplementary Table S1; Fig. 1). According to the population assignment analysis of Structure, the mean log-likelihood value and Delta K were clearly higher for K = 4, indicating that this is the optimal number of genetic clusters for the nuclear data. The four clusters match closely the four mtDNA haplogroups (Fig. 3). Concordant results were obtained in five independent replicates of the analysis. When running the analysis with K=5, 6, or 7, P. punctatus sensu stricto was divided into two clusters, corresponding to the two mitochondrial subgroups in this species (Fig. 2). In the K=4 analysis (Fig. 3), a number of individuals, belonging to putative secondary contact zones, had intermediate assignment probabilities to more than one genetic cluster, suggesting admixture/hybridization. These include localities with a considerable degree of admixture between adjacent lineages: 7 to 11 (lineages A+B), 23 (lineages B+C), and 36–37 (lineages C+D). Lower levels of admixture (less than 25%) were also observed in localities far from putative contact zones (localities 28 and 44), which are interpreted as uncertainty in population assignment resulting from incomplete lineage sorting. HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 80 Altogether 9–10 individuals could potentially represent hybrids based on these results, especially for one individual with nDNA and mtDNA discordance (blue with haplogroup B in figure 3) from Mestanza (locality 23), where individuals asigned to P. ibericus and lineage C were found in strict sympatry (Díaz-Rodríguez et. al 2015). Although this appears to be a high proportion, it needs to be emphasized that the specimens from putative contact zones included in the present study had a high representation (> 30%) because we were particularly interested in identifying the occurrence and extent of hybridization. Considering the entire range of the species, admixed populations and hybrid individuals are rare (Díaz-Rodríguez et al. 2015) and likely only present in contact zones. As suggested by Weisrock et al. (2010), concordant placement of individuals by (i) mitochondrial DNA phylogeny and (ii) Structure clustering results is an indication for evolutionary independence of lineages and, thus, of species status. The fact that the four clusters of Pelodytes can be reliably identified by nuclear gene sequences, except for a limited number of individuals from their geographical contact zones, suggests that they are good candidates for representing independent evolutionary lineages, justifying their recognition as distinct species below. 3.4. Species tree analysis The independent replicates of the species tree analysis produced convergent parameter estimates. Each replicate showed good chain mixing with high effective sample sizes for all parameters (> 500). Posterior probability values in the species tree estimated from mtDNA + nDNA sequences (Fig. 4) reached values at internal nodes of 0.82 and 0.93, supporting the same topology as the analysis based only on nuclear genes for splits among the Western Palearctic species.. Previous divergence estimates have recovered P. ibericus as the earliest split in the western species group, after the divergence of P. caucasicus (Sánchez-Herráiz et al. 2000; Sanchiz et al. 2002; García-París et al. 2003, Díaz-Rodríguez et al. 2015) with an average age between 3.3–3.7 mya. Our own divergence estimates agree with this estimate and date all splits within the western Pelodytes to either the Pliocene or the Pleistocene. Using a fossil calibration (former fossils morphologically ascribed to P. punctatus were reported in Sète, Cap de Lazaret, Hérault), we obtained an age around 3.8 mya (95% HPD: 3.5 – 4.6 mya) for the initial split among western Pelodytes lineages (Fig. 4) in the Iberian Peninsula (including P. ibericus) (PP = 1.00). The split of lineage A from the remaining lineages was recovered with a more recent age around 3 mya (95% HPD: 2.2 – 4.0 mya). Lineages C and D were recovered as sister lineages, with an age for their split around 2.3 mya (95% HPD: 1.1 – 3.4 mya), together forming the sister clade of the lineage A. The species tree estimated from nDNA sequences (Fig. 4) resulted in similar splits but with lower support values, placing P. ibericus as diverging from the rest of the Iberian Pelodytes around 3.7 mya, followed by lineage A, which again INTEGRACIÓN DE DATOS MOLECULARES, BIOACÚSTICOS Y MORFOLÓGICOS REVELAN DOS NUEVAS ESPECIES DE PELODYTES DE LA PENÍNSULA IBÉRICA 81 was recovered as sister group of the other two major lineages (C and D). This hypothesis suggests an eastwards expansion from southern Iberia, with stepwise differentiation during the Pliocene and upper Pleistocene. On the other hand, repeating the analysis calibrated with an average anuran mtDNA substitution rate (no node constraint; substitution rate prior for mtDNA set at 1%), as often reported in the literature, recovered instead very young ages (< 1 mya) for all splits. However, these young divergence dates might be underestimated. In fact, as with several other archaic frog lineages, Pelodytes are characterized by low mitochondrial substitution rates (e.g., Hoegg et al. 2004; Irisarri et al. 2012). Analyses assuming a slower rate (0.5% divergence per mya) result in divergence estimates of 1.7 mya for the initial split, and of 0.7 mya for the most recent split within the Western Palearctic Pelodytes (data not shown), thus still supporting Pleistocene divergences. A re-evaluation of Pelodytes fossils and the use of multiple such fossils for calibration, is needed to obtain a more robust timetree estimate of Pelodytes in future studies. 3.5. Morphological differentiation Careful examination of voucher specimens did not yield any reliable and fully diagnostic qualitative morphological difference between any of the cryptic species of Parsley frogs. The genetically divergent Pelodytes caucasicus is morphologically distinct from the western lineage, e.g. by larger body size (SVL 43.7–50.3 mm vs. 22.7–41.6 mm according to examined specimens) and by the presence of more continuous warty longitudinal ridges on the back, but this species is not further considered here. Among the western species, we focused on subarticular tubercles, which have been previously found to differ among species of Pelodytes (Sánchez-Herráiz et al. 2000). We noted a tendency for subarticular tubercles, being small and conical in lineages A and C, and in P. ibericus vs. more rounded in lineage D (P. punctatus sensu stricto), and for metacarpal tubercles, showing different relative sizes among individuals belonging to some of the different lineages. However, these differences were not obvious in all specimens and in a large series of specimens that we examined, a high amount of individual variation was noted (Fig. 5). Morphometric measurements were available from 133 males and 44 females of the four western lineages of Pelodytes (i.e., excluding P. caucasicus). Original measurements are included in Supplementary Table S2, while a summary of the original measurements and ratios is given in Table 3. For morphometric comparisons, we used a subset of specimens of P. punctatus (lineage D) measured by MV and of the rest of lineages only those specimens measured by JDR, thereby HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 82 maximizing the comparability among the three endemic Iberian lineages. It therefore needs to be taken into account that comparisons with lineage D (P. punctatus sensu stricto) might be compromised due to possible observer effects. Since our goal in this study is not a comprehensive morphometric comparison but, instead, the search for easily reproducible differences between species, we here rely mostly on simple comparisons of morphometric ratios against SVL. Pairwise univariate comparisons among the four western lineages of Pelodytes with Mann-Whitney U-tests (Table 4) revealed differences in numerous variables, but only a subset of these remained significant after Bonferroni correction. Comparisons were carried out separately in males and females and yielded overall congruent results. Considering Bonferroni-corrected results only, Lineage B (P. ibericus) and A were characterized by smaller body sizes than lineages C and D. Furthermore, Pelodytes ibericus differed from the other three lineages in having shorter limbs, affecting the majority of variables related to fore- and hindlimb length, and by a relatively larger tympanum in males (Fig. 6). A PCA on male values (including also P. caucasicus) found the first two PCs explaining over 80% of the variance (Table 5). A scatterplot of PC1 and PC2 separated P. caucasicus clearly from the western lineages along PC1, reflecting its larger body size (Fig. 6). Also lineage C and P. punctatus sensu stricto were weakly distinguished from lineages B (P. ibericus) and A along the size factor, whereas P. ibericus was the only species somewhat distinguishable from all others also along PC2, reflecting mostly differences in TD, ED, and limb length (Fig. 6; Table 5). 3.6. Bioacoustical differentiation Despite acoustical attributes reflecting the complex and elaborate mating calls in Parsley frogs, calls of all four western lineages of Pelodytes are structurally similar, without qualitative differences sensu Vieites et al. (2009). Detailed measurements of temporal and spectral parameters will be reported in forthcoming publications, but they did not yield strong differences between the species. In the field, we noticed apparent differences in note arrangements, previously reported in the literature, and thus we focused on the composition of A and B notes in a certain syntax or separately. Raw data are presented in Supplementary Table S3 (P. ibericus N=32; Lineage D N=13; lineage A N=39; lineage C N=16). A main difference was that specimens of lineage C typically emitted stereotyped advertisement calls consisting of AB, without additional B notes following the AB series, as were heard in the other lineages. These differences can be expressed statistically, as the average number of B notes following an A note in a series (Fig. 7). In this value, differences among species are highly significant in an ANOVA (F = 19.95, P < 0.001), and Tukey's post-hoc tests confirmed that lineage C differs from the other three lineages (P < 0.001 in all cases). Furthermore, P. ibericus differs weakly from lineage A by a larger average number of B notes in note series (Tukey's post-hoc test, P = INTEGRACIÓN DE DATOS MOLECULARES, BIOACÚSTICOS Y MORFOLÓGICOS REVELAN DOS NUEVAS ESPECIES DE PELODYTES DE LA PENÍNSULA IBÉRICA 83 0.022), and this difference might also hold in comparison to lineage D, with a P-value close to significance (P = 0.0565). Paillette et al. (1992) found differences in note arrangement among P. ibericus from Algarve and P. punctatus from France and Italy. According to these authors, the northern populations (P. punctatus) had a simple AB syntax, whereas P. ibericus emitted a variable number of B notes following A (see also Pargana et al. 2003). Although in our analysis the number of B notes repeated in calls of P. punctatus was lower than in P. ibericus (Fig. 7), this difference was not significant for lineage D, and we found the stereotyped AB calls rather typical for lineage C. Yet, calls heard (but not recorded) from specimens of P. punctatus near Vic (Girona, Spain) in March 2016 were composed of single A notes only (about 10 specimens heard calling during one hour). This lack of B notes in this P. punctatus population would rather be in agreement with the conclusion of a simple syntax in this species (Paillette et al. 1992), but it could also indicate intraspecific variation. Márquez et al. (2001) did not find evidence of an increment of the number of “B” notes or call matching through male-male acoustical interactions in P. ibericus, suggesting that social interactions are not the main cause of this variability. Phonotaxis tests, based on differences of the number of B notes in a sequence, did not detect significant responses for attraction in females of lineage C (Sánchez-Herráiz 2004). The role of these differences in the note arrangements is not clear, nevertheless it could also be related to an increase of informative content through redundancy or other different functions (see Narins & Capranica 1978). 3.7. Integrative species delimitation Although molecular, morphological and bioacoustical data revealed differences among the four western lineages of Pelodytes, the evidence is not fully conclusive. Molecular differentiation was congruent for mitochondrial and nuclear markers. Admixture and hybridization were observed in both sets of markers, but were apparently restricted to narrow contact zones, with no obvious introgression of nuclear or mitochondrial markers into the core ranges of each major lineage. Although the amount of mtDNA differentiation was low, the previous molecular species validation approach conducted by Díaz-Rodríguez et al (2015) also supported the separation of the group into four distinct clades. Moreover, on the basis of the allozyme dataset analyzed by Sanchez-Herráiz et al. (2000), populations of P. ibericus presented exclusive alleles at loci AAT, EST-2, GDH and LDH-2, and fixed differences at three loci (IDPH-1, ME-3, and MPI-2) with respect to the Spanish populations of lineages D (Barcelona) and C (Burgos, Valencia) analyzed. Pelodytes punctatus sensu stricto, represented on HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 84 Sanchez-Herráiz et al. (2000) by the population of Barcelona, presented exclusive alleles in two loci: ADH-2, and LDH-1, the latter in high frequency (91.7%), whereas lineage C, represented by populations of Burgos and Valencia, also presented exclusive alleles in loci ADH-2, EST-2, GDH (2 alleles), and HK-2. While sample sizes were relatively low, these results are consistent with our study, suggesting genetic differences across the four lineages. Morphological differentiation was limited to differences in size, limb length and tympanum diameter, with values overlapping among all lineages. In particular, P. ibericus differed morphometrically from the others, with some individuals, however, being less distinct (PCA, see Fig. 6); this agrees with the previously described morphological differentiation of P. ibericus (Sánchez- Herráiz et al. 2000). According to the osteological analyses conducted by Sanchiz et al. (2002) and Sánchez-Herráiz (2004), Pelodytes caucasicus retained the most plesiomorphic morphology, resembling in multiple character states the putative common ancestor of extant Pelodytes species occurring in Iberia. These authors, analysing a total of 38 characters in disarticulated skeletons of individuals representing all four lineages characterized herein, i.e., from populations of P. ibericus (28 individuals from Cádiz, Huelva and Córdoba), lineage A (six individuals from Porto Covo), lineage C (eight individuals from Burgos, Madrid, Segovia and Valencia) and lineage D (seven individuals from El Garraf, Barcelona), concluded that there was a relatively low degree of evolutionary transformation in Iberian populations when using P. caucasicus as the outgroup. However, interspecific differences in character states were found between P. ibericus and P. punctatus sensu lato (which grouped populations here ascribed to lineage A, C and D) in, at least, 38 characters analysed in different skeletal parts: premaxillary, maxillary, nasal, sphenethmoids, frontoparietal, prootic, ramus paroticus, pterygoid, vomer, parasphenoids, parahyoids, vertebrae, scapula, coracoid, clavicle, humerus, radioulna, ilium, ischium, femur, tibiofibula and tibiale-fibulare. In comparison to the other three western lineages, P. ibericus was characterized by several differences, especially at the cranial level: (i) frontoparietals narrower and the minimum distance between them larger; (ii) septum nasi proportionalIy wider and much shorter; (iii) sphenethmoids shorter; (iv) hyobranchial skeleton of parahyoid shape, with a wider angle between its anterior rods; and (v) compared to lineage C the cranium is shorter, wider, and more compact. On the other hand, the analysis of Pelodytes punctatus sensu stricto presented unique divergences in cranial ossification: greater robustness and ossification of most of the elements forming the cranial lid and greater compaction of skull. While new comparative osteological studies with increased sample sizes, explicitly comparing populations of the four western Pelodytes lineages, are needed, the levels of variation uncovered by Sanchiz et al. (2002) and Sánchez-Herráiz (2004) suggest that osteological characters may provide relevant taxonomic information and aid in species discrimination. INTEGRACIÓN DE DATOS MOLECULARES, BIOACÚSTICOS Y MORFOLÓGICOS REVELAN DOS NUEVAS ESPECIES DE PELODYTES DE LA PENÍNSULA IBÉRICA 85 Regarding mating call characteristics, Sánchez-Herráiz (2004) found additional differences in the percentage of B vs. A notes, dominant and fundamental frequency, duration of the call and number of pulses between lineage C individuals from Valencia and Burgos and lineage B (P. ibericus) from Córdoba. Similarly, Pargana (1998) found a strong correlation between molecular (allozymes) and acoustic divergence (especially temporal parameters of A and B notes) between populations of Pelodytes in Portugal, lineages A and B. According to our results, advertisement calls of all four lineages are characterized by an overall structural similarity but differ in details of note arrangements, distinguishing P. ibericus from lineage A, but especially from lineage C by the absence of repetition of B notes. This same feature might also distinguish some populations of Pelodytes punctatus according to Paillete et al. (1992) although, on the basis of available recordings, we could not prove these results herein, neither in calls heard (not analyzed) from P. punctatus specimens in Southern France. 3.8. Considering all the available evidence, should the lineages of Pelodytes occurring in the Iberian Peninsula be recognized as different species? Clearly, the amount of morphological and bioacoustical divergence among lineages is low. Despite the examination of a large number of specimens, we could not unambiguously identify any qualitative diagnostic external morphological character, as typically occurs in cryptic species, although differences in sizes of webbing fringes along the males from different lineages might exist (easily visible in live specimens). Bioacoustic differences were found, especially in the rareness of B note series in lineage C, although this is a quantitative character (sensu Vieites et al. 2009). Patterns of variation in the acoustic properties of mating calls are related to patterns of female choice (Gerhardt 1991) and phonotaxis playback tests should be conducted to determine the role of female discrimination among the calls of different species and to investigate the possibility of reproductive character displacement, with mating calls representing an effective prezygotic mating barrier in secondary contact zones. The similar levels of mtDNA divergence (see Fig. 2) with the full concordance of mitochondrial and nuclear differentiation of the four lineages is a substantial argument supporting their evolutionary independence. However, compared with the generally high mtDNA divergences observed among species-level lineages in anurans, the pairwise divergences among Pelodytes haplogroups were comparatively low: for the two genes typically used for DNA barcoding in anurans, between-lineage divergences ranged from 4.1–6.7% in mt-CO1 and from 0.8–1.7% in 16S (Table 1). This mitochondrial differentiation is much below the threshold of 3% 16S divergence suggested by Fouquet HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 86 et al. (2007) and Vieites et al. (2009) for preliminary recognition of candidate species. However, these divergence values need to be taken in context as the 3% threshold was based on empirical evidence from neobatrachian frogs that are characterized by a substantial acceleration of mitochondrial substitution rates, whereas Pelodytes belongs to an ancient anuran clade with lower substitution rates (Hoegg et al. 2004; Irisarri et al. 2012), estimated at 0.0065 site/mya (95% HPD: 0.0047 - 0.0083) for the mtDNA fragments used herein. Furthermore, even in neobatrachians, Malone & Fontenot (2008) found postzygotic isolation in bufonid toads starting at mitochondrial divergences < 2.5%, and several undisputed species with low mitochondrial differentiation have recently been described (e.g., Vences et al. 2012; Mo et al. 2013). A low level of mitochondrial differentiation among species appears to characterize numerous groups of non-neobatrachian anurans. In the Pelobatidae, the sister group of Pelodytidae, several established and universally recognized species have similarly low divergence values, e.g., Pelobates cultripes vs. P. varaldii (0.9% 16S/12S rRNA divergence; Veith et al. 2006), or Spea bombifrons vs. S. intermontana (2.3% mt-CO1 divergence) and S. bombifrons vs. S. hammondii (with values as low as 0.7% 16S divergence) (García-París et al. 2003). We conclude that, at the present, a species status for all four western lineages of Pelodytes is the hypothesis best fitting the available data, but we emphasize that future fine-scale studies, especially at putative secondary contact zones, are needed to better understand patterns of gene flow, as well as ecological differences between lineages. Although, based on current evidence and unpublished data on microsatellites, hybrid individuals are rare and limited to very narrow admixed populations, as in other pairs of taxa (e.g., Oliveira et al. 1991; Arntzen et al. 2009; Colliard et al. 2010), we cannot exclude that future studies may reveal wider patterns of introgression questioning species status. Names are available for two of the lineages (Pelodytes punctatus and Pelodytes ibericus), and the remaining two lineages are formally described as species in the taxonomic accounts below. However, we do not exclude that new studies might require adopting an alternative taxonomic scenario. 3.9. Evolution of western Palearctic Parsley frogs Our data confirm the existence of five independent evolutionary lineages of Parsley frogs and highlight the importance of the Iberian Peninsula as a refugium during climatic fluctuations specially in the Pleistocene. These climatic fluctuations may have consolidated a contemporary diversification process in western European Pelodytes, that probably started during the Pliocene (Sanchiz et al. 2002; García-París et al. 2003; Sánchez-Herráiz 2004; Díaz-Rodríguez et al. 2015). Previous osteological (including fossils) and genetic datasets (molecular clocks) provide a basic time frame for Pelodytes differentiation. The most recent common ancestor (MRCA) of Iberian INTEGRACIÓN DE DATOS MOLECULARES, BIOACÚSTICOS Y MORFOLÓGICOS REVELAN DOS NUEVAS ESPECIES DE PELODYTES DE LA PENÍNSULA IBÉRICA 87 Pelodytes probably lived between 3.3–3.8 mya (Sanchiz et al. 2002) according to allozymes and mtDNA (García-París et al. 2003; Sánchez-Herráiz 2004). Sanchiz et al. (2002), García-París et al. (2003) and Sánchez-Herráiz (2004) also indicated the existence of local differentiation within P. punctatus sensu lato, with Catalonian populations being clearly divergent from the rest of peninsular populations analysed (Burgos, Teruel, and Toledo, thus representing lineage C). The species tree analysis herein (Fig. 4), calibrated with fossils, recovered ages between 2.3–3.8 mya for the splits among the four lineages, with an estimated mtDNA rate (0.0065 site/mya; 95% HPD: 0.0047 - 0.0083) in agreement with the slow mitochondrial substitution rates typical of non-neobatrachian frogs. Our preferred species tree, based on mtDNA and nDNA markers, suggests an ancient colonization of the southern Iberian Peninsula in agreement with previous studies (e.g., García-París et al. 2003; Sánchez-Herráiz 2004; Veith et al. 2006; Díaz Rodríguez et al. 2015). Molecular data are in agreement with the fact that fossils of Pelodytes have been recovered in the Iberian Peninsula dating back to the Middle Pliocene, about 3.6 mya, and by their absence in Northern Africa (Busack 1977; Sanchiz et al. 2002; Martínez-Solano & Sanchiz 2005; Blain et al. 2008a, b; Blain et al. 2009). Our species tree based only on nuclear DNA sequences is also consistent with this biogeographic scenario, with a topology where P. ibericus splits from a lineage containing the rest of Iberian Pelodytes (Fig. 4), although fossils ascribed to P. ibericus do not date back further than the Pleistocene (Lobo et al. 2016). According to the current calibration, the inferred splitting times in Pelodytes would be linked to paleogeographic events along the Pliocene and Pleistocene. The geographical ranges of the different species probably underwent cycles of demographic expansion and contraction related to the succession of glacial and interglacial periods, as evidenced by the widespread presence of fossil remains in Western Europe, dating from the Middle and Upper Pleistocene (Holman 1998; Roček & Rage 2000; Delfino 2002; Blain & Bailon 2003; Delfino 2004). Considering the ages obtained in our analysis (e.g., Fig. 4) and the accumulating evidence for climate-related diversification processes in the Iberian Peninsula, especially in amphibians and water-dependent species (Gómez & Lunt 2007; Abellán & Svenning 2014), scenarios involving separate Iberian refugia during climatic oscillations provide good null hypotheses to be further tested in future studies. 4. Taxonomy 4.1. Pelodytes punctatus (Daudin, 1802) HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 94 FOTL, 25.4; TIL, 16.5. Body relatively slender; head dorsally flattened, slightly wider than longer, wider than body; snout slightly pointed in dorsal view, rounded and flattened in lateral view; nostrils directed dorsolaterally, slightly protuberant, nearer to tip of snout than to eye; canthus rostralis indistinct, straight; loreal region very slightly concave, almost flat; eye moderately large, notably protuberant dorsally; interocular distance slightly larger than horizontal eye diameter, larger than internarial and eye-nostril distance; pupil vertical; tympanum externally visible, distinct, oval, wider vertically than horizontally, its horizontal diameter being 68% of vertical eye diameter, positioned near corner of mouth; supratympanic fold distinct in its anterodorsal part running from posterior corner of eye to level of forelimb insertion; tongue free posteriorly, of truncated shape, vomerine teeth distinct, in two patches between and at the same level as choanae; choanae moderately sized, ovoid. Premaxillary and maxillary teeth present. Arms slender, webbing almost absent, very small rudiments recognizable; comparative finger length I<II<IV<III, fingers with dermal fringes. No enlarged finger disks. One large, conical subarticular tubercle present proximally on each finger; three flattened metacarpal tubercles; inner and outer metacarpal tubercles of different size (outer slightly larger than inner) and distinctly larger than central tubercle. Black nuptial pads on inner sides of first and second fingers, as one elongate patch on forearm, a second slightly bigger elongate patch on arm, and a small agglomeration on both sides of chest near axilla. Hindlimbs slender; tibiotarsal articulation reaches between eye and nostril when adpressed along body; inner metatarsal tubercle distinct but relatively small, outer metatarsal tubercle absent; proximal subarticular tubercles indistinct, remaining subarticular tubercles absent. Comparative toe length I<II<V<III<IV; third toe distinctly longer than fifth toe; toes with conspicuous dermal fringes to tip. Webbing between toes weakly expressed but clearly present and more than merely an extension of dermal fringes. Webbing formula difficult to determine due to absence of subarticular tubercles and presence of dermal fringes. Skin on the dorsal surface granular, with distinct warts; skin of throat, chest, and venter smooth except granular on posterior most part of belly; ventral surfaces of thighs and arms granular. Especially those warts that coincide with dark greenish spots on dorsum of slightly elongated shape and arranged in longitudinal rows. The anterodorsal part of supratympanic fold is continued into the inguinal region as a distinct row of small tubercles and ridges. Colour of the holotype: The skin colour is between dark gray to olive brown with drab green bands on the back and legs. The back is dotted with small round or oval prominences of olive colors. The ventral area, which is smooth or slightly rough, has a light colour from pale green to gray tones. Nuptial pads are grass green. Colour in life (Fig. 11) is more clear with light greenish spots on the back and a design of a drab olive line from the eye to the insertion of anterior legs. Distribution. – Pelodytes atlanticus is restricted to Portugal, comprising the central-eastern part of the country (Alto Alentejo), and coastal areas from Faro to Sagres in the Algarve, and from Cape of INTEGRACIÓN DE DATOS MOLECULARES, BIOACÚSTICOS Y MORFOLÓGICOS REVELAN DOS NUEVAS ESPECIES DE PELODYTES DE LA PENÍNSULA IBÉRICA 95 São Vicente to Cavado River, Esposende (Crespo et al. 2008; Matos et al. 2010). The ecological range is similar to that of P. ibericus with hybrids occurring in a long and narrow contact zone between this species and P. atlanticus (van de Vliet et al. 2012; Díaz-Rodríguez et al. 2015). Natural history. – Poorly known. Reproductive phenology is similar to P. ibericus and takes place early in the season, starting with the first rains at mid-autumn and extending into the winter. More detailed fieldwork is needed to determine the conservation status of populations in some regions (van de Vliet et al. 2012; Nunes et al. 2014). Given that suitable breeding habitats (i.e., temporary ponds in traditional Mediterranean farmland) are disappearing at an alarming rate in Portugal (Beja & Alcazar 2003) affecting overall Mediterranean biodiversity (Stoate et al. 2009), it is urgent to assess the conservation status of this species and possibly implement conservation measures. In the Natural Reserve of Paul do Boquilobo (central Portugal), the introduction of the American crayfish (Procambarus clarkii) resulted in the extinction of local populations of P. atlanticus eight years later (Cruz et al. 2008). Advertisement call and reproductive behavior. – The call is similar to that of other western Pelodytes lineages, consisting of two types of notes (A and B). The number of B notes in a call is on average lower than in P. ibericus, but higher than in P. hespericus sp. nov. (Fig. 7). Pargana (1998) found differences in call variables between Portuguese populations of P. atlanticus sp. nov.. from Lisboa, Alto Alentejo and Algarve, versus populations of P. ibericus from Baixo Alentejo and east Algarve. As with P. hespericus sp. nov., call parameters were not related to the size or age of the male. Tadpole. – We assessed morphological data in one tadpole in developmental stage 37 (field number ZCMV 14042 from Vila do Bispo, BL 25.9 mm, TL 49.4 mm). The external morphology of this tadpole and one other specimen has a close similarity to those of P. punctatus, except the LTRF 4(2-4)/4(1-2) and 4(3-4)/5(1-3) (Fig. 9c). 4.4. Pelodytes hespericus sp. nov. (Fig. 12) Identity and Diagnosis. – Populations of this species have been considered as P. punctatus by Sánchez-Herráiz et al. (2000), and as lineage C by Díaz-Rodríguez et al. (2015). Assigned to the genus Pelodytes based on high morphological similarity to P. punctatus, the type species of the genus; vertical pupil; network of dark lines in the skin of tadpoles; tadpoles with sinistral spiraculum; and molecular phylogenetic relationships. Of similar size as P. punctatus; mean SVL 35.3 mm (maximum HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 96 39.0 mm) in males, 39.8 mm (43.3 mm) in females. Morphologically similar to the other three western Pelodytes species, but distinguished from all of them by no repetitions of B notes in advertisement calls according to the recordings analyzed herein (Fig. 7), from P. ibericus by longer limbs and larger body size, and from P. atlanticus sp. nov. by larger body size (Fig. 6; Table 3). Furthermore, it is distinguished from all other Pelodytes species by concordant differences in mtDNA and nDNA sequences. Holotype. – EBD 34505 (JDR 2012-1), adult male collected by Jesús Díaz-Rodríguez on 9 April 2012 at Artunido (Casas de Carrasco), Sierra de Segura, Jaén province, Spain. Geo. coord: 38.119349º, -2.691951º. Paratypes. – EBD 34506 (JDR 2012-2), adult male, and EBD 34507 (JDR 2012-3), adult female, collected on 8 April 2012 by same collector and at same locality as holotype. Individuals deposited in Doñana Biological Station with numbers EBD 28169, 28170, 28171, 28172, 28173, 28174, 28175 collected from Soria; EBD 20440 collected from Huesca, EBD 33728 and EBD 26828 collected from Almería; and specimens deposited in National Museum of Natural Sciences with the numbers MNCN 667, MNCN 669, MNCN 670, MNCN 672, MNCN 673, MNCN 684, MNCN 686, MNCN 2720, MNCN 2721, MNCN 2722, MNCN 2723, MNCN 2724, MNCN 2725 collected from Valencia; MNCN 689 collected from Ciempozuelos (Madrid); MNCN 25023, MNCN 25024, MNCN 25025, MNCN 25026, MNCN 25027, MNCN 25028, MNCN 25029, MNCN 25032, MNCN 25033, MNCN 25034, MNCN 25035, MNCN 25036 collected from La Rioja; MNCN 41414, MNCN 41416 collected from Masa (Burgos) and MNCN 24489, MNCN 24490 from Merindad del Río Ubierna (Burgos); MNCN 25020 from Teruel, MNCN 25021, MNCN 25037 from Zaragoza, MNCN 41697 from Brea de Tajo (Madrid), MNCN 41698 from Corpa (Madrid), MNCN 377 from Almodóvar del Campo (Ciudad Real); MNCN 25022 collected from Palencia and MNCN 20783 collected from Castellón. Etymology. – The specific name is a latinized adjective derived from the name Hesperides (Ἑσπερίδες), Nymphs of the fading sun and daughters of the Titan Atlas, in allusion to an Iberian mythological garden. The Hesperian Massif also takes its name from the same etymology, meaning “western” in ancient greek, refering to its position in the Mediterranean sea. Description of the holotype. – Adult male in excellent state of preservation. Some tissue removed ventrally from right thigh for molecular analysis. Measurements: SVL, 36.6; HW, 12.7; HL, 13.3; TD, 2.7; ED, 4.0; END, 4.3; NSD, 3.0; NND, 3.6; HAL, 10.6; FORL, 23.2; HIL, 61.6; FOL, 18.4; FOTL, 28.5; TIL, 18.4. Body relatively slender; head dorsally flattened, slightly longer than wide, wider than body; snout slightly pointed in dorsal view, rounded in lateral view; nostrils directed dorsolaterally, not protuberant, nearer to tip of snout than to eye; canthus rostralis indistinct, straight; loreal region very slightly concave, almost flat; eye moderately large, notably protuberant dorsally; INTEGRACIÓN DE DATOS MOLECULARES, BIOACÚSTICOS Y MORFOLÓGICOS REVELAN DOS NUEVAS ESPECIES DE PELODYTES DE LA PENÍNSULA IBÉRICA 97 interocular distance slightly smaller than horizontal eye diameter, larger than internarial and slightly smaller than eye-nostril distance; pupil vertical; tympanum externally visible, distinct, oval, wider vertically than horizontally, its horizontal diameter is 68% of maximum eye diameter, positioned near corner of mouth; supratympanic fold moderately distinct in its anterodorsal part running from posterior corner of eye to posterior corner of tympanum, indistinct in its posteroventral part running from posterior corner of tympanum to insertion of forelimb; tongue free posteriorly, of truncate shape, vomerine teeth distinct, in two patches between and at the same level as choanae; choanae moderately sized, ovoid. Premaxillary and maxillary teeth present. Arms slender, webbing almost absent, very small rudiments recognizable; comparative finger length I<II<IV<III, fingers with dermal fringes (poorly recognizable on small fingers due to fixation). No enlarged finger disks. One large, rounded subarticular tubercle present proximally on each finger; three flattened metacarpal tubercles; inner and outer metacarpal tubercles of similar size and distinctly larger than central tubercle. Black nuptial pads on inner sides of first and second fingers, as one elongate patch on forearm, a second slightly smaller elongate patch on arm, and a small agglomeration on both sides of chest near axilla. Hindlimbs slender; tibiotarsal articulation reaches between eye and nostril when adpressed along body; inner metatarsal tubercle distinct but relatively small, outer metatarsal tubercle absent; proximal subarticular tubercles indistinct, remaining subarticular tubercles absent. Comparative toe length I<II<V<III<IV; third toe distinctly longer than fifth toe; toes with conspicuous dermal fringes to tip. Webbing between toes weakly expressed but clearly present and more than merely an extension of dermal fringes. Webbing formula difficult to determine due to absence of subarticular tubercles and presence of dermal fringes, but webbing almost complete between toes I and II, between second and third phalangeal joint of toe II between toes II and III. Skin on the dorsal surface granular, with distinct warts; skin of throat, chest, and venter smooth except granular on posteriormost part of belly; ventral surfaces of thighs and arms granular. Especially those warts that coincide with dark greeninsh spots on dorsum of slightly elongated shape and arranged in longitudinal rows. The anterodorsal part of the supratympanic fold is continued into the inguinal region as a distinct row of small tubercles and ridges, partly marked by greenish dots. Colour of the holotype. The skin colour is between dark green to olive drab with light olive bands on the back and legs. The back is dotted with a pattern of small oval and linear prominences of olive green. On the lateral side, a clear band is more or less visible, from the tympanum to the insertion of posterior limbs. The ventral area, which is smooth or slightly rough, has a light colour from pale green to yellow tones. Colour in life is similar, with light greenish spots on the back, instead of drab colors, and a design of two crossed bands clear without dots (Fig. 12). HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 98 Variation. – In the paratypes EBD 34506 and EBD 34507, the foot webbing is much less distinctly expressed. Distribution. – Pelodytes hespericus is distributed in the Iberian Peninsula and as far as known, restricted to Spain. Its range extends mainly in areas of low and mid-altitude mountains, from the sea level to 1,900 m in La Rioja (Zaldívar 2004), almost 2,000 m in Sierra Seca (Granada) and maybe higher at the locality of Castril, Granada (Fernández-Cardenete et al. 2000), but additional confirmation is required. It occupies most of the eastern and central parts of Spain (Lacomba & Sancho 1999; Barbadillo 2002b). The western range limits are in the southeast of Madrid (Martínez- Solano & García-París 2001; Martínez-Solano 2006), in the provinces of León and Zamora, and in the Montes de Toledo in Toledo and Ciudad Real. Southwards the species reaches the northern parts of Jaén and Granada provinces (Barbadillo 2002b; Ceacero et al. 2007) and coastal parts of Almería (González-Miras & Nevado 2008; Díaz-Rodríguez et al. 2015). Natural history. – Lizana et al. (1986) and Esteban et al. (2004) provided notes on the natural history of this species. Pelodytes hespericus is a generalist that tolerates a wide range of climatic conditions and diverse substrates. However, it seems to avoid siliceous and some types of acid soils (Sánchez-Herráiz 2004). It can be found in semi-arid steppes in the Ebro basin and the southeast, as well as in temperate forests of beech and oak, but usually avoids the densest forest formations. It is common in abandoned quarries and cattle ponds and tolerates high levels of salinity. Specimens can reach eight years (males) and 10 years (females) of age (Esteban et al. 2004; Sánchez-Herráiz 2004). Advertisement call and reproductive behavior. – The call is similar to that of other western Pelodytes lineages, consisting of two types of notes (A and B). In the recordings previously studied by Sánchez-Herráiz (2004) analyzed by us, and in numerous other individuals heard in the field, one call typically consists of one A note followed by a single B note (Fig. 7). Reciprocal calls of females have been reported (Sánchez-Herráiz 2004). Calling specimens are found at the edge or within water, with body temperatures between 10 ºC -17.5ºC (Sánchez-Herráiz 2004; Esteban et al. 2002). Call intensity and spectral frequency were not found to be related to the size or age of the male (Esteban et al. 2002). Acknowledgments We thank the editor and five anonymous reviewers for feedback on a previous draft. For technical support during lab work we thank Meike Kondermann, Ana Piriz, J. M. Gasent, and all members of lab team of LEM (Molecular Ecology Laboratory) in Doñana Biological Station, Seville. We thank E. Albert, F. Amat, J.W. Arntzen, J. A. M. Barnestein, D. Canestrelli, M.A. Carretero, F. Ceacero, A. Cordero, T. Couturier, P. A. Crochet, D. Donaire, H. Duarte, B. Estanque, L. García Cardenete, P. Geniez, E. Gomes, J.P. González de la Vega, M. Jowers, M. Katzenberger, A. Montori, N. Oromí, R. Rebelo, M. A. Romeo Lafuente, A. Sánchez, G. Schreur, J. Teixeira and W. de Vries for providing photos, samples or help during collection and fieldwork. R.D. Randrianiaina assisted with the tadpole descriptions. We also thank E. Matheu, Richard G. Bowker and A. González (Fonoteca Zoológica) for sharing recordings and especially M. Domínguez and L. Ceríaco for support at National Museum of Natural History, Madrid (MNCN) in Spain and Museu Nacional de História Natural e da INTEGRACIÓN DE DATOS MOLECULARES, BIOACÚSTICOS Y MORFOLÓGICOS REVELAN DOS NUEVAS ESPECIES DE PELODYTES DE LA PENÍNSULA IBÉRICA 99 Ciência, Lisboa (MUHNAC) in Portugal. W. Böhme (ZFMK), F. Glaw and M. Franzen (ZSM), Annemarie Ohler (MNHN), and J.M. Padial and S.D. Busack (CM) allowed examination of specimens held under their care. Special thanks also to contributions of Glenda and Graçaliz Dimuro for the comprehensive reading and design of this manuscript. Partial funding for acoustical analyses, sound editing and storage was provided by Ministerio de Ciencia e Innovación, Spain, projects TATANKA CGL2011-25062, CGL2010-09700 and ACOURA CGL2008- 04814 and Ministerio de Economía y Competitividad, Spain project CGL2011-16159-E. This work was supported through Project CGL2012-40246-C02-01 28300 (Ministerio de Economía y Competitividad Subdirección General de Proyectos de Investigación Dpto. Técnico de Medio Ambiente y Recursos Naturales, Spain) to MT; Project “Genomics and Evolutionary Biology” co-financed by North Portugal Regional Operational Programme 2007/2013 (ON.2 – O Novo Norte), under the National Strategic Reference Framework (NSRF), through the European Regional Development Fund (ERDF); by FEDER funds through the Operational Programme for Competitiveness Factors - COMPETE and by National Funds through FCT - Foundation for Science and Technology PTDC/BIA-BEC/099915/2008 and FCOMP-01-0124-FEDER-008915 to HG. JDR was supported by a PhD grant from FCT (SFRH/BD/70631/2010) and CGL2005-02931/BOS (Ministerio de Ciencia e Innovación, Spain). IMS and HG are currently supported by funding from the Spanish Severo Ochoa Program (SEV-2012-0262) and by a postdoctoral grant from FCT (SFRH/BPD/102966/2014), respectively. Additional funds were provided by grants: ‘‘Anfibios Endémicos de Andalucía’’ (Consejería de Medio Ambiente, Junta de Andalucía, Spain) to MT. References Abellán, P. & Svenning, J.C. (2014) Refugia within refugia–patterns in endemism and genetic divergence are linked to Late Quaternary climate stability in the Iberian Peninsula. Biological Journal of the Linnean Society, 113, 13–28. Andreone, F. & Sindaco, R. (1998) Erpetologia del Piemonte e della Valle d'Aosta. Atlante degli Anfibi e dei Rettili. Museo Regionale di Scienze Naturali, Torino, 283 pp. Arévalo, E., Davis, S. K., & Sites, J. W. 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All specimens of P. ibericus, P. atlanticus and P. hespericus were measured by JDR, whereas specimens of P. punctatus were measured by MV. ibericus atlanticus sp. nov. hespericus sp. nov. punctatus ibericus --- HAL**, FOL**, TIL*, FOTL**, HIL**, FORL* SVL*, TD***, HAL***, FOL*, TIL*, FOTL**, HIL***, FORL** HAL*, FOL*, FOTL*, HIL** atlanticus sp. nov. NSD*, HAL***, FOL***, TIL***, FOTL***, HIL***, FORL** --- SVL***, TD*, ED*, NSD*, FOL*, HIL* SVL*, NSD***, TIL*, FORL* hespericus sp. nov. SVL***, TD**, END***, NND*, HAL***, FOL**. TIL***, FOTL**, HIL***, FORL*** SVL***, HL*, ED***, END***, FOL* --- ED*, FORL*, HIL* punctatus SVL***, END*, HAL***, FOL***, TIL*, FOTL***, HIL***, FORL** SVL***, HW**, HL*, END*, NSD***, TIL*** HW*, TD*, ED*, END*, NSD**, HAL*, TIL** --- TABLE 5. Results from a PCA of morphometric measurements of male Pelodytes. Note that Principal Component (PC) 1 is mostly influenced by size effects and loadings are therefore of similar sign and dimension for all variables. Variables with loadings > 0.3 in bold. PC 1 PC 2 PC 3 SVL -0.95119 0.023754 0.074338 HW -0.93963 0.004191 0.030233 HL -0.94413 0.088085 0.035760 TD -0.67874 0.395073 -0.007625 ED -0.70407 0.371672 0.429603 END -0.85692 -0.026937 -0.075346 NSD -0.71148 0.177329 -0.587476 NND -0.74811 0.492479 -0.090643 HAL -0.94768 -0.145687 0.014595 FORL -0.87877 -0.377533 -0.002024 HIL -0.97427 -0.130951 0.070810 FOL -0.89800 -0.143823 0.005296 FOTL -0.96514 -0.142446 0.047457 TIL -0.93286 -0.264779 -0.012243 Eigenvalue 10.66331 0.86926 0.55902 % Total variance 76.16649 6.20898 3.99298 Cumulative Eigenvalue 10.66331 11.53257 12.09158 Cumulative % 76.16649 82.37547 86.36845 INTEGRACIÓN DE DATOS MOLECULARES, BIOACÚSTICOS Y MORFOLÓGICOS REVELAN DOS NUEVAS ESPECIES DE PELODYTES DE LA PENÍNSULA IBÉRICA 111 FIGURE 1. Location of 45 populations of Pelodytes sampled for molecular analysis (indicative map unscaled). Colored dots represent the four species described: green, lineage A (P. atlanticus sp. nov.); orange, lineage B (P. ibericus); blue, lineage C (P. hespericus sp. nov.); and purple, lineage D (P. punctatus). In some populations (7, 8, 9, 10, 11, 22, 23, 36 and 37) we found evidence for admixture (double-colored dots). Background colors represent the ranges of P. punctatus (blue) and P. ibericus (orange) according to current knowledge (www.iucn.org). HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 112 FIGURE 2. Median-joining networks of Western Palearctic Pelodytes based on six nuclear markers and mtDNA (mt-ND4+mt-CYB). Samples in the nDNA networks are colored according to their assignment to the four major clusters in the mtDNA network, corresponding to the species as color coded in Fig. 1. Each circle represents a different haplotype and its size is proportional to its relative frequency. Black dots represent inferred unsampled or extinct haplotypes. Markers RPL3 and Cherpint7 are represented at the same scale. INTEGRACIÓN DE DATOS MOLECULARES, BIOACÚSTICOS Y MORFOLÓGICOS REVELAN DOS NUEVAS ESPECIES DE PELODYTES DE LA PENÍNSULA IBÉRICA 113 FIGURE 3. Clustering results of Bayesian assignment analyses using Structure, based on nuclear DNA sequences with the number of clusters K ranging from 1 to 7. Each individual is represented as a vertical bar partitioned into K colored segments, whose length is proportional to the individual’s estimated group membership coefficient. The enlarged figure shows the results for K=4, with population numbers as in Fig. 1 and Supplementary Table 1. Population numbers on the top are shown to highlight individuals with mixed ancestry, and the mitochondrial haplogroup (A-D) for each included individual is shown in the bottom. Individuals in the graph are ordered as in Supplementary Table S1. Note that the comparatively large number of putative hybrids is due to the overrepresentation of populations in the contact zones in our analysis, as compared with Díaz- Rodríguez et al. (2015). HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 114 FIGURE 4. Species tree calculated from the analysis of DNA sequences of two mitochondrial and six nuclear gene segments (left), after exclusion of admixed/hybrid samples identified from the nDNA networks in Fig. 2 and Bayesian assignment analyses in Fig. 3. The tree on the right shows the same topology as recovered in a species tree analysis based only on the six nuclear gene segments. INTEGRACIÓN DE DATOS MOLECULARES, BIOACÚSTICOS Y MORFOLÓGICOS REVELAN DOS NUEVAS ESPECIES DE PELODYTES DE LA PENÍNSULA IBÉRICA 115 FIGURE 5. Ventral views of specimen hands (palmar surface) of the four western Pelodytes lineages. The pictures show variation in the size and arrangement of the subarticular and metacarpal tubercles within species and populations, suggesting that no fully diagnostic interspecific differences in this character exist. All photos from specimens in life. M, male, F, female. Asterisks denote mirrored images. Not to scale. HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 116 FIGURE 6. Morphometric differentiation among the four western Pelodytes lineages. The upper graph is a scatterplot of first and second principal components from a PCA of raw morphometric values in 117 male specimens of Pelodytes. Note that PC1 corresponds mostly to body size (Table 4). The lower graphs are boxplots of SVL, relative tympanum diameter and relative tibia length in male Pelodytes, with median (dot), 25% percentiles (box) and ranges, illustrating the smaller body size of P. atlanticus sp. nov. and P. ibericus, and larger tympanum and shorter limbs of P. ibericus. All specimens of P. ibericus, P. atlanticus, and P. hespericus were measured by JDR, and specimens of P. punctatus were measured by MV. INTEGRACIÓN DE DATOS MOLECULARES, BIOACÚSTICOS Y MORFOLÓGICOS REVELAN DOS NUEVAS ESPECIES DE PELODYTES DE LA PENÍNSULA IBÉRICA 117 FIGURE 7. Bioacoustic differences between lineages of Pelodytes occurring in the Iberian Peninsula. For raw data, see Supplementary Table S3. The boxplot shows the average number of B notes per call series, i.e, every call consisting of one A note and one or more B notes. Average values were first computed per individual, and then summarized across species. Differences are significant between P. hespericus sp. nov. and all other species, and between P. atlanticus sp. nov. and P. ibericus (ANOVA with Tukey's post-hoc test; see Results). HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 118 FIGURE 8. Comparative photos of Pelodytes punctatus in life. The upper two photos show a male and a female from near Montpellier, France; the lower two pictures show a male and a female from near Vic, Girona, Spain. Specimens not collected. Images not to scale. FIGURE 9. a-c, Mouthparts of preserved tadpoles of three species of Pelodytes. Note the absence of a central gap in the third anterior labial tooth row in P. ibericus. d, mouthpart, and e, lateral view of a living tadpole of P. ibericus from near Jerez de la Frontera. INTEGRACIÓN DE DATOS MOLECULARES, BIOACÚSTICOS Y MORFOLÓGICOS REVELAN DOS NUEVAS ESPECIES DE PELODYTES DE LA PENÍNSULA IBÉRICA 119 FIGURE 10. Comparative photos of Pelodytes ibericus in life, male above, female below, from near Jerez de la Frontera, Spain. Specimens not collected. Images not to scale. HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 126 25 49LORC C Pozo en Rambla de las Fuentes, Lorca Spain 37.7580 -1.9778 KP16658 2 KP16694 9 KX98419 1 KP165978- KP165979 KP16628 4- KP16628 5 26 FBell C Fuente Bella Spain 38.0385 -2.4586 KP16661 4 KP16698 1 KP165986- KP165987 26 FBell03 C Fuente Bella Spain 38.0385 -2.4586 KP16661 5 KP16698 2 26 FBell04 C Fuente Bella Spain 38.0385 -2.4586 KP16661 6 KP16698 3 KX98419 2 KX98422 8 KP165988- KP165989 KP16630 0- KP16630 1 GU1811 50 27 ACDC01 C Casas de Carrasco, Santiago de la Espada Spain 38.1252 -2.6900 KP16658 6 KP16695 3 KX98419 3 27 Pelhesp Casas de Carrasco, Santiago de la Espada Spain 38.1252 -2.6900 KX98422 9 28 SMA06 C Santa María Spain 38.7307 -2.7409 KP16671 9 KP16708 6 KX98423 0 KP166030- KP166031 KP16637 2- KP16637 3 28 SMA94 C Santa María Spain 38.7307 -2.7409 KP16672 0 KP16708 7 28 SMA95 C Santa María Spain 38.7307 -2.7409 KP16672 1 KP16708 8 29 57Ayhor C Arroyo Horcajos Spain 38.9275 -2.5803 KX98415 6 KX98423 1 KP166022- KP166023 KP16628 8- KP16628 9 30 MAL01 C Malagón Spain 39.1806 -3.9133 KP16667 8 KP16704 5 KX98419 4 KP166028- KP166029 KP16631 2- KP16631 3 GU1811 51 30 MAL02 C Malagón Spain 39.1806 -3.9133 KP16667 9 KP16704 6 31 PP21 C La Boyeriza, camino de Polvorines Spain 40.2604 -3.5605 KP16669 8 KP16706 5 KX98419 5 KX98423 2 KP166006- KP166007 KP16633 0- KP16633 1 31 PP22 C La Boyeriza, camino de Polvorines Spain 40.2604 -3.5605 KP16669 9 KP16706 6 KP166096- KP166097 32 BES01 El Perelló Spain 40.9167 0.7237 KX98419 6 KX98423 3 INTEGRACIÓN DE DATOS MOLECULARES, BIOACÚSTICOS Y MORFOLÓGICOS REVELAN DOS NUEVAS ESPECIES DE PELODYTES DE LA PENÍNSULA IBÉRICA 127 32 BES02 C El Perelló Spain 40.9167 0.7237 KX98415 7 KX98416 3 KX98423 4 33 FUEn01 C Fuendetodos Spain 41.3560 -0.9550 KX98415 8 KX98416 4 KX98419 7 KX98423 5 33 FUEn02 C Fuendetodos Spain 41.3560 -0.9550 KX98415 9 KX98416 5 34 ALCu01 C Alcubierre Spain 41.7314 -0.4853 KX98416 0 KX98416 6 KX98419 8 KX98423 6 34 ALCu02 C Alcubierre Spain 41.7314 -0.4853 KX98416 1 KX98416 7 35 BUR02 C Páramo de Masa Spain 42.6638 -3.7796 KP16659 8 KP16696 5 KX98419 9 KX98423 7 KP166026- KP166027 KP16629 8- KP16629 9 36 BAR01 D C/D Castellet i la Gornal Spain 41.2539 1.5925 KP16673 4 KP16710 1 KX98420 0 KP166112- KP166113 KP16638 2- KP16638 3 36 BAR02 D C/D Castellet i la Gornal Spain 41.2539 1.5925 KP16673 5 KP16710 2 KX98420 1 KP16638 4- KP16638 5 GU1811 55 GU1811 25 37 GAR01 D C/D El Garraf Spain 41.2736 1.8370 KP16674 1 KP16710 8 KP165990- KP165991 KP16630 4- KP16630 5 37 GAR02 D D El Garraf Spain 41.2736 1.8370 KP16674 2 KP16710 9 KP166074- KP166075 KP16630 2- KP16630 3 38 BRU06 D El Brull (Osona) Spain 41.8028 2.2636 KP16673 6 KP16710 3 KP165984- KP165985 KP16629 6- KP16629 7 38 BRU08 D El Brull (Osona) Spain 41.8028 2.2636 KP16673 7 KP16710 4 38 BRU28 D El Brull (Osona) Spain 41.8028 2.2636 KP16673 8 KP16710 5 KP166072- KP166073 KP16629 4- HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 128 KP16629 5 39 SOS04 D Solsona Spain 42.0984 1.6469 KP16676 5 KP16713 2 39 SOS05 D Solsona Spain 42.0984 1.6469 KP16676 6 KP16713 3 KX98420 2 KX98423 8 KP166032- KP166033 KP16635 6- KP16635 7 39 SOS06 D Solsona Spain 42.0984 1.6469 KP16676 7 KP16713 4 40 LLA01 D Llança Spain 42.3745 3.1553 KP16675 1 KP16711 8 KP166116- KP166117 KP16630 6- KP16630 7 40 LLA02 D Llança Spain 42.3745 3.1553 KP16675 2 KP16711 9 KX98420 3 41 Devois D Mare de Devois France 43.5652 3.6944 KP16674 0 KP16710 7 KX98420 4 KP166114- KP166115 KP16638 8- KP16638 9 42 Pataris D Mare de Pataris France 43.5694 3.6952 KP16675 5 KP16712 2 KX98420 5 KP166118- KP166119 KP16639 2- KP16639 3 GU1811 56 GU1811 24 43 SAV02 D Savona Italy 44.1833 8.3667 KP16675 8 KP16712 5 44 SBC01 D Saint-Bonnet-en- Champsaur France 44.6828 6.0777 KP16676 1 KP16712 8 KP16639 8- KP16639 9 44 SBC02 D Saint-Bonnet-en- Champsaur France 44.6828 6.0777 KP16676 2 KP16712 9 45 AMB01 D Ambleteuse France 50.7994 1.6186 KP16673 1 KP16709 8 KX98420 6 KX98423 9 KP166110- KP166111 KP16638 0- KP16638 1 45 AMB02 D Ambleteuse France 50.7994 1.6186 KX98416 2 KX98416 8 KX98420 7 45 AMB03 D Ambleteuse France 50.7994 1.6186 KP16673 2 KP16709 9 45 AMB04 D Ambleteuse France 50.7994 1.6186 KP16673 3 KP16710 0 INTEGRACIÓN DE DATOS MOLECULARES, BIOACÚSTICOS Y MORFOLÓGICOS REVELAN DOS NUEVAS ESPECIES DE PELODYTES DE LA PENÍNSULA IBÉRICA 129 Supplementary Table S2. Original morphometric measurements for species of Pelodytes. Abbreviations of variables as in Materials and Methods. JDR, J. Díaz-Rodríguez; MV, M. Vences. To minimize the observer effect, for morphometric analysis we only used specimens of P. atlanticus, P. hespericus and P. ibericus measured by JDR, and specimens of P. punctatus and P. caucasicus measured by MV. Scientific Name Voucher Locality Measured by Lineage Sex SVL HW HL TD ED END NSD NND HAL FORL HIL FOL FOTL TIL Males P. atlanticus ZSM 1/2011 Nives, north of Portimão JDR A M 37.8 13.2 13.4 2.4 4.0 3.6 3.0 3.1 9.4 20.5 54.4 17.2 25.8 16.5 P. atlanticus ZSM 1201/2012 1.6 km NNE Barão de São Miguel JDR A M 30.8 10.7 11.0 2.0 4.0 3.0 2.6 3.0 8.0 18.6 50.3 15.8 24.5 14.7 P. atlanticus MB 110 Cacém JDR A M 29.4 10.1 10.3 1.9 2.5 3.0 2.3 2.2 7.8 18.1 44.8 16.0 23.0 14.7 P. atlanticus MB 112 Cascais JDR A M 31.7 11.9 11.2 2.5 4.3 2.7 2.6 2.5 8.8 20.0 51.7 17.0 25.2 15.7 P. atlanticus MB 112 Cascais JDR A M 30.6 11.2 10.7 1.9 3.7 3.0 2.2 2.3 8.7 20.5 48.8 16.1 24.1 16.0 P. atlanticus MB 112 Cascais JDR A M 29.3 11.2 10.5 1.9 3.8 3.1 2.3 2.4 9.0 20.7 50.5 16.0 24.2 15.8 P. atlanticus MB 113 Cascais JDR A M 27.8 9.2 9.9 1.6 3.4 2.5 2.1 1.9 8.4 20.5 48.4 15.0 23.6 16.0 P. atlanticus MB04-113 Pedreira – Benfica JDR A M 31.2 12.0 11.5 1.6 3.7 2.7 2.3 2.2 8.8 20.7 51.4 15.8 23.8 16.4 P. atlanticus GLA01 - JDR 2015 (paratype) Reserva de Mindelo – Porto JDR A M 33.5 12.2 11.5 1.9 3.6 2.8 2.8 2.6 9.3 20.5 54.0 17.5 26.5 17.1 P. atlanticus GLA02 - JDR 2015 (paratype) Reserva de Mindelo – Porto JDR A M 31.0 11.1 10.5 2.0 3.7 2.8 2.8 2.8 8.7 19.4 49.0 16.5 24.7 15.6 P. atlanticus GLA03 - JDR 2015 (holotype) Reserva de Mindelo – Porto JDR A M 33.0 11.6 11.0 1.9 3.6 2.7 2.6 2.3 9.0 20.0 52.6 16.6 25.4 16.5 P. atlanticus MB 114 Cascais JDR A M 30.1 10.9 10.7 1.8 3.6 2.6 2.2 2.3 9.0 21.0 49.8 15.6 23.9 15.2 P. atlanticus MB 115 Cascais JDR A M 30.1 10.3 10.7 1.7 3.6 2.8 2.0 2.0 8.7 21.1 49.6 15.6 24.4 15.8 HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 130 P. atlanticus MB 116 Cascais JDR A M 30.1 10.9 10.6 1.8 3.6 2.7 1.9 2.1 8.5 20.9 51.7 17.0 25.5 15.8 P. atlanticus MB 118 Cascais JDR A M 30.6 10.2 10.4 2.0 3.6 2.5 2.3 2.1 8.9 21.0 50.6 16.1 24.6 15.4 P. atlanticus MB 113 Benfica, Pedreira (Cantera en Benfica) JDR A M 30.7 11.3 10.6 2.0 3.1 2.7 2.2 2.9 7.9 19.6 48.7 19.8 23.4 15.2 P. atlanticus MB 106 Benfica, Pedreira (Cantera en Benfica) JDR A M 31.0 11.6 11.7 2.1 4.0 2.8 2.2 2.2 8.9 21.3 51.0 16.8 25.2 16.2 P. atlanticus MB 107 Benfica, Pedreira (Cantera en Benfica) JDR A M 31.3 11.1 11.0 2.0 3.8 2.3 2.2 2.7 9.0 22.3 52.7 16.1 24.7 16.2 P. atlanticus MB 110 Benfica, Pedreira (Cantera en Benfica) JDR A M 30.8 11.6 11.5 1.4 3.6 2.3 2.0 1.8 8.4 20.8 48.8 15.2 22.7 15.2 P. atlanticus MB 111 Benfica, Pedreira (Cantera en Benfica) JDR A M 30.8 11.7 10.3 1.2 3.9 2.5 2.4 2.3 8.8 20.2 49.9 15.5 24.0 15.7 P. atlanticus MB 112 Benfica, Pedreira (Cantera en Benfica) JDR A M 32.6 10.7 11.2 1.8 3.8 2.9 2.1 2.5 9.4 22.9 55.5 17.6 27.2 17.9 P. atlanticus VDB_2012.C27 Vila do Bispo JDR A M 31.3 12.1 12.4 1.9 3.9 3.4 2.5 2.7 8.5 17.0 51.9 12.8 25.0 16.7 P. atlanticus VDB_2012.C28 Vila do Bispo JDR A M 22.7 9.3 9.7 1.4 2.9 2.4 2.1 2.2 7.2 15.2 40.0 12.7 20.3 13.3 P. atlanticus VDB_2012.C29 Vila do Bispo JDR A M 31.5 10.7 12.6 1.8 3.4 2.9 2.5 2.7 8.9 21.5 49.6 15.2 24.5 15.7 P. atlanticus VDB_2012.C30 Vila do Bispo JDR A M 30.6 11.4 12.0 1.8 3.8 3.0 2.4 2.8 8.5 19.8 49.5 16.3 23.8 16.0 P. atlanticus VDB_2012.C31 Vila do Bispo JDR A M 33.4 12.2 11.5 2.0 3.7 3.2 2.4 2.9 8.5 20.8 54.0 16.5 24.9 16.4 P. atlanticus VDB_2012.C33 Vila do Bispo JDR A M 32.1 11.0 10.9 1.7 3.4 2.7 2.4 2.8 7.9 20.0 47.2 15.4 23.1 15.1 P. atlanticus VDB_2012.C34 Vila do Bispo JDR A M 32.5 11.5 12.0 2.0 3.6 2.9 2.3 2.6 8.0 20.0 50.8 17.0 25.1 16.4 P. atlanticus VDB_2012.C35 Vila do Bispo JDR A M 32.2 11.4 11.2 2.8 3.8 2.7 2.1 2.8 8.5 19.5 48.6 15.7 24.0 15.4 P. atlanticus VDB_2012.C36 Vila do Bispo JDR A M 39.2 11.7 10.9 1.7 3.6 3.3 1.9 2.5 8.1 20.5 50.2 15.2 24.3 16.1 P. atlanticus VDB_2012.C37 Vila do Bispo JDR A M 34.0 12.2 11.9 1.5 4.0 2.8 2.3 2.7 8.6 20.3 54.2 16.5 25.9 17.2 P. atlanticus VDB_2012.C39 Vila do Bispo JDR A M 31.0 11.4 11.6 2.0 4.0 2.9 2.3 2.6 8.2 19.0 48.6 15.7 22.6 16.3 P. VDB_2012.C41 Vila do Bispo JDR A M 31.5 11.9 11.8 2.0 3.8 2.8 2.5 2.5 8.7 20.0 52.0 16.3 29.6 17.2 INTEGRACIÓN DE DATOS MOLECULARES, BIOACÚSTICOS Y MORFOLÓGICOS REVELAN DOS NUEVAS ESPECIES DE PELODYTES DE LA PENÍNSULA IBÉRICA 131 atlanticus P. atlanticus VDB_2012.C42 Vila do Bispo JDR A M 33.0 11.5 10.8 1.8 3.8 2.8 2.4 2.8 8.8 19.5 49.0 17.1 24.7 16.4 P. atlanticus VDB_2012.C43 Vila do Bispo JDR A M 31.3 11.9 11.0 1.6 4.1 2.9 2.1 2.5 8.5 20.8 49.4 16.8 24.0 16.7 P. atlanticus VDB_2012.C44 Vila do Bispo JDR A M 32.2 11.0 11.0 1.5 3.6 2.6 2.5 2.7 8.0 17.5 48.8 15.5 23.0 15.7 P. atlanticus VDB_2012.C44 Vila do Bispo JDR A M 30.5 11.2 10.7 2.4 3.8 2.7 2.5 2.5 8.9 21.4 50.7 15.6 24.6 16.0 P. ibericus EBD 29822 Paratype. Estación Biologica de Doñana. Huelva JDR B M 33.4 11.5 11.6 2.0 4.0 2.9 2.1 2.6 8.7 19.9 50.4 15.5 24.5 15.4 P. ibericus MB (Lisboa Museum - EBD 391) Paratype. Estación Biológica de Doñana JDR B M 30.0 11.1 10.1 1.9 3.2 2.6 2.2 2.5 7.6 19.0 47.0 14.7 22.9 14.9 P. ibericus EBD 596 Sevilla: Coripe JDR B M 35.4 12.2 12.2 2.3 4.1 3.2 2.2 3.5 9.1 19.3 52.3 17.3 25.9 15.1 P. ibericus EBD 586 Sierra de Algodonales. Cádiz JDR B M 34.6 12.5 12.5 2.0 4.0 3.0 2.3 3.3 8.9 19.1 52.4 16.5 25.0 15.6 P. ibericus EBD 590 Sierra de Algodonales. Cádiz JDR B M 37.2 13.3 13.0 2.4 4.7 3.2 2.8 3.1 9.7 22.4 57.7 18.0 28.0 16.8 P. ibericus MNCN23664 Doñana JDR B M 28.5 9.9 10.0 1.9 3.4 2.5 2.2 2.8 7.1 16.7 41.4 14.0 21.1 13.6 P. ibericus MNCN23665 Doñana JDR B M 29.2 11.2 10.4 1.9 3.6 2.8 2.0 2.6 7.6 17.8 46.9 15.0 22.8 15.7 P. ibericus MNCN23662 Holotype. Doñana JDR B M 29.3 10.4 10.3 1.6 3.4 2.9 2.1 2.4 7.5 15.0 44.1 14.0 21.8 14.3 P. ibericus MNCN24259 Cádiz JDR B M 32.1 10.7 10.5 1.9 2.9 2.6 2.1 2.3 7.4 18.9 46.9 13.8 21.7 15.0 P. ibericus MNCN2718 Sanlúcar-Jerez JDR B M 28.6 9.6 10.0 1.7 2.9 2.6 2.1 2.1 6.6 16.5 39.2 12.7 18.5 12.9 P. ibericus MAR01_A360 Ctra. A360. Marchena, Sevilla. JDR B M 31.6 11.2 10.9 2.3 3.5 2.6 2.1 2.6 7.7 19.7 46.2 14.3 22.2 13.9 P. ibericus CAMP04 La Campana, Sevilla. JDR B M 30.0 11.2 11.1 2.0 2.8 2.5 2.0 2.5 7.4 19.6 44.5 14.4 21.7 14.4 P. ibericus ZCMV 14096 near Jerez de la Frontera JDR B M 36.3 13.0 12.5 2.6 4.0 3.3 3.0 3.0 10.0 22.0 55.0 18.2 25.0 16.4 P. ibericus CM 52151-B near Medina-Sidonia MV B M 31.0 11.2 10.9 2.3 3.2 3.1 2.1 2.9 8.1 18.0 46.0 14.5 22.6 13.7 P. ibericus CM 52151-C near Medina-Sidonia MV B M 30.4 10.8 11.1 2.4 3.3 3.0 2.3 2.7 7.9 16.6 46.7 15.8 23.5 13.9 P. ibericus CM 52238 Rota-Chipiona MV B M 32.4 10.4 10.3 2.2 3.1 3.0 1.8 3.2 7.6 17.5 44.4 14.8 22.5 13.6 HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 132 P. ibericus CM 52238-B Rota-Chipiona MV B M 31.2 11.1 10.5 2.1 3.1 2.9 2.2 2.8 7.4 16.7 43.1 13.5 20.9 13.5 P. ibericus CM 52238-C Rota-Chipiona MV B M 32.4 10.5 10.5 2.1 3.0 2.9 1.8 2.7 7.3 15.3 43.8 14.4 21.9 13.1 P. ibericus CM 52238-D Rota-Chipiona MV B M 30.3 10.6 10.4 2.1 3.2 2.8 2.1 3.0 7.9 17.2 46.1 15.2 22.7 13.9 P. ibericus CM 52238-E Rota-Chipiona MV B M 31.3 11.8 11.1 2.1 3.4 3.0 2.3 3.2 7.8 17.3 47.4 14.3 22.4 14.3 P. ibericus CM 52238-F Rota-Chipiona MV B M 29.1 10.0 10.2 1.9 3.0 3.0 2.2 2.6 7.2 16.4 41.8 12.6 19.7 13.0 P. ibericus CM 52238-G Rota-Chipiona MV B M 28.7 10.4 10.3 1.9 3.1 3.1 2.0 2.5 7.2 15.6 40.7 13.2 19.6 13.3 P. ibericus CM 52238-I Rota-Chipiona MV B M 26.8 9.9 9.6 1.8 2.7 2.7 1.7 2.6 6.3 13.9 38.5 12.3 18.0 12.0 P. ibericus CM 52449-D Rota-Chipiona MV B M 31.7 10.3 10.3 2.3 3.1 3.4 2.2 2.8 7.3 15.9 43.1 14.1 21.1 13.2 P. ibericus CM 52449-H Rota-Chipiona MV B M 28.8 9.7 9.8 1.9 2.9 2.5 1.9 3.1 6.7 15.1 42.4 13.2 19.8 12.5 P. ibericus CM 52521-D Trebujena-Jerez MV B M 29.3 10.6 10.0 2.3 3.1 3.0 2.2 3.1 7.5 15.8 42.0 13.8 20.7 12.4 P. ibericus CM 54288 19 km from Puerto Real MV B M 30.6 11.4 10.9 2.1 3.2 2.8 2.2 3.2 8.0 18.1 50.1 15.9 23.6 14.3 P. ibericus CM 54288-B 19 km from Puerto Real MV B M 31.6 10.6 10.5 2.2 3.3 3.2 2.1 3.1 7.8 18.6 46.1 14.9 22.0 13.8 P. ibericus CM 54288-C 19 km from Puerto Real MV B M 29.6 10.9 10.9 2.0 3.5 2.7 2.0 2.9 7.7 17.2 46.3 15.0 22.7 14.2 P. ibericus CM 54288-F 19 km from Puerto Real MV B M 32.6 11.2 11.0 2.2 3.3 2.9 2.1 2.9 8.7 19.2 47.7 15.8 24.2 14.4 P. ibericus CM 54288-L 19 km from Puerto Real MV B M 34.0 12.4 11.8 2.2 3.7 2.9 2.3 3.1 8.4 19.1 49.0 16.1 24.2 15.5 P. hespericus JDR 2012-1 Artunido a Casas de Carrasco. Sierra de Segura JDR C M 36.0 13.3 13.0 2.1 3.8 4.0 2.4 3.2 9.9 20.9 56.3 16.7 26.4 17.2 P. hespericus JDR 2012-2 Artunido a Casas de Carrasco. Sierra de Segura (holotype) JDR C M 36.6 12.7 13.3 2.7 4.0 4.3 3.0 3.6 10.6 23.2 61.6 18.4 28.5 18.4 P. hespericus EBD 28174 Soria JDR C M 37.2 12.9 13.1 2.4 4.1 4.0 3.0 3.1 9.9 22.3 58.2 17.8 27.9 16.8 P. hespericus EBD 28172 Soria JDR C M 34.2 12.3 12.4 1.7 4.0 3.4 2.0 3.0 9.9 21.2 54.1 16.7 26.1 16.4 P. hespericus EBD 28169 Soria JDR C M 38.1 12.9 13.3 2.5 4.1 3.0 2.7 3.2 10.6 22.9 59.6 18.6 28.7 18.0 P. hespericus EBD 28170 Soria JDR C M 37.9 13.1 13.3 2.1 4.3 3.4 2.5 3.6 10.1 22.3 57.5 17.5 26.0 16.8 P. hespericus EBD 28171 Soria JDR C M 38.1 13.0 13.7 2.3 4.4 3.5 3.0 3.2 9.8 21.5 58.1 18.0 27.5 17.3 P. EBD 28173 Soria JDR C M 33.3 12.3 12.1 2.0 4.2 3.4 2.3 2.9 8.8 20.4 52.0 15.3 24.2 15.4 INTEGRACIÓN DE DATOS MOLECULARES, BIOACÚSTICOS Y MORFOLÓGICOS REVELAN DOS NUEVAS ESPECIES DE PELODYTES DE LA PENÍNSULA IBÉRICA 133 hespericus P. hespericus MNCN670 Valencia JDR C M 38.3 13.3 12.2 2.2 3.5 3.3 2.3 2.7 10.7 26.5 63.9 20.3 30.2 20.3 P. hespericus MNCN672 Valencia JDR C M 34.3 12.4 11.5 2.1 3.2 3.3 2.4 2.4 9.6 25.1 59.0 18.5 28.4 18.4 P. hespericus MNCN684 Valencia JDR C M 36.0 13.0 12.1 2.2 3.5 3.3 2.6 2.3 9.9 24.5 57.5 18.1 27.8 17.2 P. hespericus MNCN2720 Valencia JDR C M 36.7 12.6 12.2 2.0 3.8 3.5 2.3 2.7 10.3 23.3 57.3 18.6 28.5 18.4 P. hespericus MNCN2721 Valencia JDR C M 39.0 14.9 13.6 1.6 4.1 3.8 2.8 2.9 10.8 27.3 63.0 20.8 30.8 20.3 P. hespericus MNCN2722 Valencia JDR C M 33.2 12.8 11.3 2.0 3.6 3.4 3.0 3.2 10.4 25.0 55.4 19.2 27.5 18.2 P. hespericus MNCN2723 Valencia JDR C M 34.4 12.3 12.2 1.9 3.7 3.3 2.5 2.9 9.6 22.7 53.2 17.1 25.3 17.1 P. hespericus MNCN2724 Valencia JDR C M 33.5 12.0 11.7 1.9 3.6 3.9 2.6 2.9 9.7 22.5 57.7 18.2 28.1 18.6 P. hespericus MNCN2725 Valencia JDR C M 36.2 12.9 12.3 1.7 3.8 3.3 3.1 2.7 10.0 23.1 57.4 18.6 28.2 18.2 P. hespericus MNCN25032 La Rioja JDR C M 38.2 13.7 13.1 1.8 3.7 3.8 3.1 3.1 10.1 22.6 59.0 18.3 28.0 19.7 P. hespericus MNCN25034 La Rioja JDR C M 32.4 12.3 11.0 1.6 3.2 3.1 2.6 2.6 9.0 22.3 51.8 16.6 24.9 16.8 P. hespericus MNCN41414 Masa, Burgos JDR C M 37.1 13.0 12.9 1.8 3.6 3.6 2.2 2.6 10.6 27.4 61.4 18.6 29.5 19.7 P. hespericus MNCN41416 Masa, Burgos JDR C M 33.4 12.3 12.2 2.3 3.8 3.3 2.7 2.7 9.4 24.4 59.3 17.8 28.3 19.0 P. hespericus MNCN25020 Teruel JDR C M 32.5 11.3 11.0 1.4 3.5 3.3 1.9 2.5 8.1 20.7 48.2 14.3 23.3 15.9 P. hespericus MNCN41697 Brea de Tajo JDR C M 33.3 12.7 11.6 1.8 3.8 3.4 2.3 2.4 9.9 25.9 58.8 17.9 27.9 18.6 P. hespericus MNCN41698 Corpa JDR C M 30.7 10.9 10.2 1.4 3.7 3.2 2.2 2.5 8.2 19.7 47.6 14.9 22.7 15.3 P. MNCN377 Almodóvar del JDR C M 38.0 12.8 12.1 2.0 3.8 3.3 2.8 2.4 10.6 26.6 62.1 19.3 29.4 19.1 HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 134 hespericus Campo, Ciudad Real P. hespericus MNCN24490 Merindad de Rio Ubierna, Burgos JDR C M 32.9 11.9 11.2 1.6 3.6 3.4 2.2 2.4 9.0 23.0 53.5 16.9 25.4 17.2 P. hespericus MNCN25022 Palencia JDR C M 37.2 12.5 12.6 1.8 3.8 3.5 2.3 2.7 9.9 24.0 56.8 18.1 27.7 18.7 P. hespericus MNCN25026 La Rioja JDR C M 37.9 12.7 12.3 1.9 4.0 3.3 2.4 2.5 9.5 23.8 57.1 17.3 27.5 18.5 P. hespericus MNCN25023 La Rioja JDR C M 34.1 12.7 12.1 1.9 3.8 3.1 2.6 2.6 10.5 24.9 56.9 17.7 27.8 18.7 P. hespericus MNCN25024 La Rioja JDR C M 33.1 11.5 11.4 2.0 3.9 3.2 2.4 2.1 9.3 22.4 52.1 15.6 24.9 17.3 P. hespericus MNCN25028 La Rioja JDR C M 36.5 12.8 11.8 1.6 3.5 3.2 2.4 2.8 9.4 24.3 59.6 17.2 27.9 18.8 P. hespericus MNCN25029 La Rioja JDR C M 33.7 11.4 11.6 2.0 3.6 3.1 2.4 2.3 9.0 22.2 54.0 16.7 25.4 17.6 P. hespericus MNCN25025 La Rioja JDR C M 33.6 12.1 11.3 2.0 3.7 3.2 2.4 2.7 9.6 21.6 54.3 16.4 26.3 17.0 P. hespericus MNCN20783 Castellón JDR C M 30.1 11.1 11.2 1.8 4.0 2.8 2.4 2.5 9.5 23.1 53.9 17.7 26.3 18.3 P. hespericus MNCN673 Valencia JDR C M 37.9 13.0 12.8 2.1 3.7 3.8 2.7 2.8 10.8 27.2 65.0 20.1 31.0 19.7 P. punctatus JDR 2012-7 Serra de Busa. Solsona JDR D M 37.0 13.7 13.6 2.5 3.0 3.5 2.8 2.6 11.0 27.4 66.9 20.5 32.3 20.6 P. punctatus JDR 2012-8 El Brull. Osona JDR D M 36.5 12.7 12.6 2.2 3.0 3.3 2.2 2.8 9.4 25.0 62.0 18.5 28.9 19.6 P. punctatus MNCN42956 Berga, Barcelona MV D M 29.6 10.6 10.9 1.5 2.9 3.2 1.7 1.7 8.2 20.2 49.2 15.8 24.6 15.2 P. punctatus ZFMK 45091 Southern France MV D M 37.4 15.0 12.5 2.0 4.5 3.0 2.0 3.0 9.3 21.5 59.0 18.0 27.5 17.2 P. punctatus ZFMK 45095 Southern France MV D M 37.1 12.5 12.4 2.6 4.5 3.5 3.0 3.0 9.3 22.7 58.1 18.4 27.8 17.0 P. punctatus ZFMK 45088 Southern France MV D M 36.2 13.0 12.0 1.7 4.5 3.4 2.2 3.2 9.9 22.5 60.0 18.2 28.0 18.4 P. punctatus ZFMK 45101 Southern France MV D M 36.8 13.0 13.1 1.8 4.8 3.9 2.5 3.0 10.1 23.4 60.0 19.4 29.0 18.4 P. punctatus ZFMK 45085 Southern France MV D M 41.0 13.4 14.0 2.5 4.5 3.4 2.4 3.0 10.7 23.0 64.0 20.5 31.0 18.8 P. punctatus ZFMK 45099 Southern France MV D M 34.5 12.3 12.5 2.0 3.2 3.0 2.4 3.0 9.0 21.8 54.3 17.7 26.0 15.9 INTEGRACIÓN DE DATOS MOLECULARES, BIOACÚSTICOS Y MORFOLÓGICOS REVELAN DOS NUEVAS ESPECIES DE PELODYTES DE LA PENÍNSULA IBÉRICA 135 P. punctatus ZFMK 45090 Southern France MV D M 38.0 12.3 12.9 2.2 4.5 3.5 2.2 2.5 9.5 23.5 61.0 19.2 28.8 18.0 P. punctatus ZFMK 45092 Southern France MV D M 41.6 14.0 14.4 2.5 4.3 4.0 3.0 3.4 10.5 28.4 70.1 21.6 33.3 20.4 P. punctatus ZFMK 45086 Southern France MV D M 33.7 11.2 11.3 2.0 4.6 3.0 2.2 2.3 9.3 20.8 53.0 16.2 24.6 16.3 P. punctatus ZFMK 45102 Southern France MV D M 38.3 13.0 13.5 2.1 4.1 3.4 2.1 3.2 10.2 25.8 65.7 20.8 31.0 19.7 P. punctatus ZFMK 45097 Southern France MV D M 34.8 11.8 11.8 2.0 4.0 3.1 2.3 3.0 9.6 24.2 56.9 17.4 26.4 16.7 P. punctatus ZFMK 45100 Southern France MV D M 37.2 13.3 12.4 1.7 4.3 3.3 2.5 3.6 9.4 24.0 61.0 18.5 28.4 17.5 P. punctatus ZFMK 45096 Southern France MV D M 35.6 12.1 12.2 2.0 4.2 3.1 2.2 2.7 9.6 22.6 56.0 17.0 26.1 16.7 P. punctatus ZFMK 45094 Southern France MV D M 32.8 10.8 11.2 2.1 3.3 3.0 2.2 3.0 9.4 22.0 51.4 16.0 24.4 14.7 P. punctatus ZFMK 45089 Southern France MV D M 38.0 12.7 12.6 2.0 4.2 3.4 2.6 2.8 10.8 24.0 63.3 18.9 29.0 17.7 P. punctatus MNHN 1978.1322 Pertuis (Vaucluse) MV D M 34.1 12.6 11.6 2.3 4.1 3.2 2.2 2.7 9.6 24.4 56.0 18.1 27.4 16.4 P. punctatus MNHN 1978.1823 Pertuis (Vaucluse) MV D M 36.2 12.9 13.0 2.3 4.2 3.4 2.4 2.7 11.2 25.8 62.2 19.7 30.3 17.9 P. punctatus MNHN 1971.310 Rousset, bordes de l'Arc MV D M 35.7 13.1 12.2 2.2 4.4 3.5 2.6 2.8 10.2 23.9 59.6 17.1 27.6 17.0 P. punctatus MNHN 1971.312 Rousset, bordes de l'Arc MV D M 37.2 12.2 12.9 2.1 3.9 3.5 2.9 3.1 10.3 23.7 61.1 18.5 28.3 17.9 P. punctatus MNHN 1971.313 Rousset, bordes de l'Arc MV D M 34.2 11.8 12.6 2.0 3.8 3.5 2.2 2.5 9.9 24.0 56.6 18.3 27.0 16.7 P. punctatus MNHN 1980.1786 environs d'Argenton s/ Creuse MV D M 32.2 11.5 11.1 2.0 4.0 3.0 2.0 2.7 8.5 19.0 53.1 16.4 25.0 15.3 P. punctatus MNHN 1980.1785 environs d'Argenton s/ Creuse MV D M 34.2 11.6 12.0 2.1 4.1 3.7 2.5 2.6 9.4 22.4 58.9 18.9 28.1 17.2 P. punctatus MNHN 1988.6465 La Mailleterie MV D M 33.7 10.8 11.6 2.3 3.5 3.1 1.9 2.5 9.0 20.1 54.1 17.8 26.5 16.1 HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 142 Montellano 16.11.2014 19.4 1'28'' 0 8 5 1 0 0 0 Montellano 16.11.2014 19.0 1'18'' 2 2 4 1 0 0 0 Montellano 16.11.2014 19.0 1'18'' 2 1 3 1 1 1 0 Montellano 16.11.2014 19.1 2'02'' 0 2 4 7 1 0 0 Montellano 16.11.2014 19.1 2'02'' 2 3 5 2 0 1 0 Montellano 16.11.2014 19.4 1'13'' 0 0 0 16 0 0 0 Montellano 16.11.2014 19.1 1'13'' 0 3 4 0 0 0 0 Montellano 16.11.2014 19.0 1'13'' 0 2 2 3 2 0 0 Montellano 16.11.2014 19.4 1'11'' 0 0 5 3 0 0 0 Montellano 16.11.2014 19.4 1'11'' 0 0 1 3 0 0 0 Mértola 26.11.1997 0'56'' 0 0 1 5 3 5 1 Mértola 26.11.1997 0'56'' 0 0 1 0 2 0 0 Mértola 26.11.1997 2'08'' 0 0 7 14 1 1 0 Mértola 27.11.1997 14.4 1'35'' 0 0 2 1 2 0 0 Mértola 27.11.1997 15.2 3'26'' 0 0 21 15 0 1 0 Castro Verde NA 12.6 2'29'' 0 0 1 1 5 0 0 Mértola NA 15 2'48'' 0 0 12 7 6 0 0 Mértola NA 15 0 11 10 1 1 0 0 Mértola 01.01.2007 16 0 9 10 0 1 0 0 Mértola 01.01.2007 16 0 0 12 7 6 0 0 P. hespericus Ctra. Puerto Lumbreras 01.03.1991 11.0 1'17'' 0 11 0 0 0 0 0 Ctra. Puerto Lumbreras 01.03.1991 9.4 1'30'' 0 9 0 0 0 0 0 Ctra. Puerto Lumbreras 01.03.1991 9.4 0'27'' 0 6 0 0 0 0 0 Ctra. Puerto Lumbreras 01.03.1991 9.8 0'25'' 0 5 0 0 0 0 0 Ctra. Puerto Lumbreras 01.03.1991 9.8 0'25'' 0 5 0 0 0 0 0 Artunido – Casas de Carrasco 09.04.2014 NA 2'42'' 1 35 0 0 0 0 0 Artunido – Casas de Carrasco 09.04.2014 NA 2'42'' 1 24 0 0 0 0 0 Artunido – Casas de Carrasco 09.04.2014 NA 0'29'' 0 7 0 0 0 0 0 Artunido – Casas de Carrasco 09.04.2014 NA 0'29'' 0 4 1 0 0 0 0 INTEGRACIÓN DE DATOS MOLECULARES, BIOACÚSTICOS Y MORFOLÓGICOS REVELAN DOS NUEVAS ESPECIES DE PELODYTES DE LA PENÍNSULA IBÉRICA 143 Artunido – Casas de Carrasco 09.04.2014 NA 0'24'' 0 2 0 0 0 0 0 Artunido – Casas de Carrasco 09.04.2014 NA 0'24'' 1 6 0 0 0 0 0 Artunido – Casas de Carrasco 09.04.2014 NA 1'02'' 1 5 0 0 0 0 0 Artunido – Casas de Carrasco 09.04.2014 NA 1'02'' 3 5 0 0 0 0 0 Masa NA NA 0 18 0 0 0 0 0 Valencia NA NA 0 28 0 0 0 0 0 Vélez Rubio 01.01.1998 NA 53'' 0 11 0 0 0 0 0 P. punctatus NA NA NA 0'30'' 0 1 4 0 0 0 0 NA NA NA 0'30'' 0 1 3 2 0 0 0 NA NA NA 0'51'' 0 9 0 0 0 0 0 NA NA NA 0'39'' 0 1 3 2 0 0 0 NA NA NA 0'39'' 0 0 4 2 1 0 0 NA NA NA 1'51'' 0 18 6 6 0 0 0 NA NA NA 0 15 2 3 0 0 0 Can Catà, Parc Natural de Collserola 03.02.2009 NA 2'07'' 1 11 1 0 0 0 0 Can Catà, Parc Natural de Collserola 03.02.2009 NA 1'31'' 3 2 2 1 0 1 0 Can Catà, Parc Natural de Collserola 03.02.2009 NA 2'00'' 1 9 6 2 0 0 0 Can Catà, Parc Natural de Collserola 03.02.2009 NA 2'20'' 1 2 6 3 0 1 0 Can Catà, Parc Natural de Collserola 03.02.2009 NA 1'51'' 0 2 5 1 2 0 1 Can Catà, Parc Natural de Collserola 03.02.2009 NA 2'44'' 0 4 4 2 1 0 0 HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 144 ANÁLISIS GENÉTICO DE DOS ZONAS DE CONTACTO SECUNDARIO EN EL SUR DE LA PENÍNSULA 145 CAPÍTULO 3: Análisis genético de dos zonas de contacto secundario entre P. atlanticus, P. ibericus y P. hespericus en el sur de la Península Ibérica Genetic analysis of two secondary contact zones between P. atlanticus, P. ibericus and P. hespericus in Southern Iberian Peninsula Abstract The studies about the parsley frog, presented in our previous publications, support the genetic structure of the populations, the geographical diversification of the genus all over Western distribution range and the level of taxonomic complexity, higher than the one proposed nowadays. As in others Iberian taxa, the distribution of the molecular variation in the genus Pelodytes reflects a phylogeographical pattern, as a result of genetic divergences occurring in allopatric shelters during glacial periods. This old fragmentation process, probably occurring repeatedly throughout the Pliocene and Pleistocene, would be the origin of the separation among the different lineages in the Iberian Peninsula. Additionally, this process suggests independent evolutionary paths for a cryptic complex of four species: Pelodytes atlanticus, which is endemic in Portugal and distributed along the coast and the central region (Alto Alentejo); Pelodytes ibericus, which is endemic to the south of the peninsula (Algarve, Baixo Alentejo, Andalusia, Extremadura); Pelodytes hespéridus, distributed in the Spanish center and eastern area (Castilla-La Mancha, Madrid, Murcia, Comunidad Valenciana, Castilla y León, Navarra, La Rioja, Aragon); and Pelodytes punctatus, whose populations are distributed from the northeastern Spain to the rest of Europe (Catalonia, France and Italy). As results of this study, we found the existence of hybridization and cytonuclear discordance in presumed areas of secondary contact, suggesting a certain degree of admixure. In order to explore these patterns of admixture and evaluate the previous results, we analysed the levels of structure and gene flow of the populations through two very well differentiated areas of secondary contact between the mitochondrial clades of P. ibericus and the two new species proposed: P. atlanticus and P. hespericus. By using mtDNA and microsatellite data, a genetic analysis of both areas allowed us to clarify the mix level between the divergent lineages and to determine whether those lineages evolve independently. We tried to assess the population genetic structure within each lineage, with nuclear data and the estimates of inferred genetic diversity of the mitochondrial DNA. The overall coincidence of both analysis and the generality of clines, observed in relation to the dispersion, support the idea that both contact areas are acting as a barrier to gene flow showing, however, a clearly uneven pattern among the species. The inferred results prove a geographic pattern of introgression in the Portuguese contact zone, between the species P. ibericus and P. atlanticus. In contrast, the contact zone between P. ibericus and P. hespericus in Spain, compared with the previous one, showed a relatively low number of localities in HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 146 which some mixture was detected among the parental genotypes. The results at the level of mitochondrial DNA helped us to identify the lineages of each species, confirming the presence of different haplogroups with distinctive patterns of gene flow. The presence of individuals from different mitochondrial lineages in the absence of nuclear differentiation, especially in the western area of contact, and the pattern of introgression in the distribution range of P. atlanticus suggest, however, that: 1. there exists dispersion; 2. the effective reproductive isolation between the lineages has not been completed; 3. there are barriers to gene flow, mainly promoted by intrinsic factors that could be due to the barriers of both pre-zygotic and post-zygotic types. However, the relatively long evolutionary time elapsed between both species separately, can also be the source of this segregation. By contrast, in the contact zone between P. ibericus and P. hespericus, no similarity was detected in the allele frequencies between lineages, despite the low levels of introgression, suggesting that this is a significant barrier to gene flow mainly due to factors associated with the ecological habitat. Keywords: gene flow, hybrid zones, cryptic species, introgression, dispersion, clines, speciation Análisis genético de dos zonas de contacto secundário entre P. atlanticus, P. ibericus y P. hespericus en el sur de la Península Ibérica Resumen Los estudios en el sapillo moteado, presentados en nuestras publicaciones precedentes, apoyan la estructura genética de las poblaciones, la diversificación geográfica del género dentro del rango de distribución en la Península Ibérica y un nivel de complejidad taxonómica mayor que el propuesto en la actualidad. Cómo en otros taxones ibéricos, la distribución de la variación molecular en el género Pelodytes responde a un patrón filogeográfico, resultado de una divergencia genética ocurrida en refugios alopátricos durante largos periodos glaciares. Este proceso de fragmentación antiguo, sufrido probablemente en repetidas ocasiones a lo largo del Plioceno y Pleistoceno, sería el origen de la separación entre los distintos linajes en la península y sugiere, además, trayectorias evolutivas independientes para un complejo críptico de cuatro especies: Pelodytes atlanticus, endémico de Portugal y distribuido a lo largo de la costa y la región central (Alto Alentejo); Pelodytes ibericus, endemismo del sur de la península (Algarve, Baixo Alentejo, Andalucía, Extremadura); Pelodytes hespericus, distribuido por el área de centro y levante español (Castilla-La Mancha, Madrid, Murcia, Comunidad Valenciana, Castilla y León, Navarra, La Rioja y Aragon) y Pelodytes punctatus cuyas poblaciones se distribuyen desde el noreste peninsular al resto de Europa (Cataluña, Francia e Italia). Como resultados de este estudio, se encontró la existencia de hibridación y discordancia cito-nuclear en supuestas zonas de contacto secundario, que sugieren cierto grado de mezcla. Con el objetivo de ANÁLISIS GENÉTICO DE DOS ZONAS DE CONTACTO SECUNDARIO EN EL SUR DE LA PENÍNSULA 147 explorar estos patrones de mezcla y valorar los resultados anteriores, se analizaron los niveles de flujo y estructura génica de las poblaciones en dos áreas de contacto secundario bien diferenciadas, entre los clados mitocondriales de P. ibericus con las dos nuevas especies propuestas en esta tesis: P. atlanticus y P. hespericus. Mediante el uso de ADNmt y datos de microsatélites, un análisis genético de ambas zonas permitió aclarar el nivel de mezcla entre los linajes divergentes y determinar si evolucionan de forma independiente. Se trató de evaluar, por una parte, la estructura genética poblacional dentro de cada linaje con datos nucleares y las estimaciones de la diversidad genética inferidas del ADN mitocondrial. La coincidencia global de ambos análisis y la generalidad de las clinas observadas en relación a la dispersión, apoyan la idea de que ambas zonas de contacto están actuando como una barrera para el flujo de genes, observándose, sin embargo, un patrón claramente desigual entre unas especies y otras. Los resultados mostraron un patrón geográfico de introgresión en la zona de contacto portuguesa, entre las especies P. ibericus y P. atlanticus. Por el contrario, la zona de contacto entre P. ibericus y P. hespericus en España, en comparación con la anterior, mostró un número relativamente bajo de localidades en las que fue detectada mezcla entre los genotipos parentales. Los resultados a nivel de ADN mitocondrial, permitieron identificar los linajes de cada especie, corroborando la presencia de distintos haplogrupos con patrones distintivos de flujo génico. La presencia de individuos pertenecientes a distintos linajes mitocondriales en ausencia de diferenciación nuclear, especialmente en la zona de contacto occidental, y el patrón de introgresión en el rango de distribución de P. atlanticus sugieren, no obstante que: 1. existe dispersión; 2. el aislamiento reproductivo efectivo entre los linajes no se ha completado; 3. existen barreras al flujo génico de origen genético, promovidas por factores intrínsecos que podrían ser debidas tanto a barreras de tipo pre-cigótico como post-cigótico. No obstante, el relativo largo tiempo evolutivo transcurrido por separado entre ambas especies puede también estar en el origen de dicha segregación. Por el contrario, en la zona de contacto entre P. ibericus y P. hespericus, no se detectó similitud alguna en las frecuencias alélicas entre los linajes, a pesar de los bajos niveles de introgresión, lo que hace pensar que se trata de una barrera importante al flujo génico debida principalmente a factores asociados con el hábitat ecológico. Palabras clave: flujo de genes, zonas híbridas, especies crípticas, introgresión, dispersión, clinas, especiación HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 148 1. Introducción El estudio de los patrones de diversificación y flujo génico es fundamental para el conocimiento de las especies. La capacidad de que dos especies distintas permanezcan en simpatría es el único test objetivo de especiación (Jiggins & Mallet, 2000) pero encontrar esta situación en la naturaleza no siempre es sencillo. El interés evolutivo de las zonas híbridas se centra en que constituyen un auténtico laboratorio natural para el estudio de fenómenos y procesos relacionados con la especiación (ver por ejemplo Hewitt, 1988). Una zona híbrida es un área geográfica donde interactúan distintos linajes de individuos genéticamente diferenciados y que puede prolongarse en el tiempo mientras ocurra un cambio fenotípico y/o genotípico a través de ellas, produciéndose mezcla al menos en alguna parte de la descendencia (Barton & Hewitt 1985; Harrison 1990; Arnold 1997; Jiggins & Mallet, 2000). Las zonas de contacto secundario entre linajes diferenciados en refugios alopátricos son un claro ejemplo de zonas híbridas. Como veíamos en la introducción de esta tesis, de un número cada vez más amplio de estudios se extrae que las penínsulas del Mediterráneo (Ibérica, Itálica, Balcánica y Anatólica) así como áreas del Cáucaso y el mar Caspio, han funcionado como refugios glaciares en el pasado, permitiendo la supervivencia de numerosas especies durante condiciones climáticas adversas (Taberlet et al. 1998; Hewitt, 2000, 2004) y actuando a la vez, como reservorio u origen de endemismos, y como fuentes, desde las cuales, zonas anteriormente heladas fueron recolonizadas durante periodos interglaciares (Hewitt, 2001; Weiss & Ferrand 2007). Los periodos temporales cíclicos, con los procesos de contracción asociados hacia refugios del sur y expansión posterior hacia el norte, han dejado profundas huellas en la distribución geográfica de la diversidad genética (Taberlet et al. 1998; Hampe & Petit 2005). De acuerdo con el concepto de “refugios dentro de refugios” (Gómez & Lunt 2007), la Península Ibérica constituyó uno de los refugios glaciares más importantes en el sur de Europa (Hewitt 2000) donde las rutas de recolonización seguidas por diversos grupos taxonómicos encontraron paralelismo entre sí (Hewitt, 1996, 2004). Por una parte, el gradiente de variación genética junto al evidente nivel de diversidad y subestructura que se observa a bajas latitudes en una amplia variedad de taxones – patrón denominado “pureza del norte y riqueza del sur”– constituye una prueba de la existencia de múltiples subrefugios glaciares. A diferencia de las poblaciones nórdicas, típicamente menos diversas a consecuencia de la rápida expansión, la persistencia de poblaciones confinadas en diferentes refugios permitió la diferenciación en una amplia gama de linajes evolutivos. Por otra parte, este proceso de recolonización llevó a la creación de zonas híbridas, donde genomas de linajes divergentes entraron en contacto secundario (Hewitt, 1999; Taberlet et al., 1998). A diferencia de las zonas de contacto producidas por la recolonización de áreas del norte de Europa, la dinámica de flujo génico, los patrones de introgresión y estructura en el interior de zonas híbridas a latitudes bajas, donde se deduce una persistencia de las poblaciones a largo plazo, ofrecen un modelo de estudio más ANÁLISIS GENÉTICO DE DOS ZONAS DE CONTACTO SECUNDARIO EN EL SUR DE LA PENÍNSULA 149 complejo e interesante, especialmente para especies cuyos rangos de distribución abarcan regiones sujetas a fluctuaciones paleoclimáticas de gran amplitud (Weiss & Ferrand, 2007). Un ejemplo de especies con este tipo de distribución es el de los sapillos moteados (Pelodytes spp.), actualmente restringidos a Europa occidental que, en base al registro fósil, estuvieron ampliamente distribuidos en Europa en el pasado, con presencia documentada desde el Eoceno (Roček & Rage, 2000; Sanchíz, 1998a). En la actualidad, la familia Pelodytidae se encuentra representado únicamente por el género Pelodytes, con tres especies vivientes: Pelodytes caucasicus (Boulenger, 1896), que se extiende de manera fragmentada por la región del Cáucaso y la costa este del Mar Negro; Pelodytes ibericus (Sánchez-Herráiz, Barbadillo, Machordom & Sanchíz, 2000) especie endémica del sur de la península; y Pelodytes punctatus (Daudin, 1803) que según el estatus actual de la especie, se encuentra presente en gran parte de Europa Occidental. Sin embargo, los estudios filogeográficos previos, centrados en la Península Ibérica y detallados en los capítulos anteriores de esta tesis, sugieren que la diversidad en el interior del grupo se encuentra subestimada. El patrón de variación genética de las secuencias nucleares y mitocondriales, obtenidas a partir de localidades de todo el rango de distribución, concluye la existencia de, al menos, cuatro linajes evolutivos independientes en Europa Occidental (Díaz-Rodríguez et al. 2015). Los estudios filogenéticos de divergencia entre los clados apuntan a un origen Plio-Pleistocénico con edades para cada filogrupo estimadas en un rango entre 2,3 a 3,8 millones de años. La fuerte correlación entre la variación genética encontrada y la geografía, sugieren una historia evolutiva en refugios alopátricos, con la presencia, inicialmente propuesta, de dos especies candidatas, y descritas posteriormente como P. atlanticus y P. hespericus. Del resultado de este estudio se extrae un patrón, concordante con otros grupos taxonómicos, de expansión post-glacial hacia el norte, especialmente evidente en el interior de los linajes de P. ibericus, P. hespericus y P. punctatus, así como la detección de discordancia cito-nuclear y presencia de individuos con alelos nucleares y mitocondriales en estrechas zonas de simpatría, que permitieron la identificación de zonas de contacto secundario. En el presente capítulo se pretenden explorar los patrones de introgresión y flujo génico en el interior de dos zonas hibridas entre P. ibericus y las dos nuevas especies propuestas en la presente tesis: a) P. atlanticus, en el suroeste de Portugal; y b) P. hespericus, en el sureste de España. A través del uso de ADN mitocondrial– mediante análisis de secuencias de los genes mitocondriales mt-ND4, mt-CYB, del polimorfismo de fragmentos de restricción o RFLP– y de la variación nuclear en marcadores de evolución rápida– análisis de polimorfismo en 14 microsatélites desarrollados con éxito para P. ibericus y P. punctatus (van de Vliet et al. 2012; Jourdan-Pineau et al. 2012) se estudiaron ambas zonas de contacto de manera independiente, con el objetivo principal de evaluar su estructura geográfica y los posibles patrones de flujo génico, tratando específicamente de determinar los factores que influencian la estructura genética HISTORIA EVOLUTIVA DE LOS SAPILLOS MOTEADOS (Pelodytes spp.) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA 150 de estas zonas, sean intrísecos, debidos principalmente a barreras de aislamiento reproductivo pre y post-cigóticas, o extrínsecos, asociados a la adaptación ecológica diferencial al hábitat local. La existencia de dos áreas separadas de características ecológicas en apariencia muy diferentes, mostró entre P.atlanticus/P ibericus un ambiente ecológico homogéneo sin solución de continuidad y sin barrera ecológica apreciable y otra entre P ibericus/P.hespericus con una barrera orográfica que podría determinar parcialmente aislamiento entre las especies parentales. El presente estudio, nos permite el análisis a escala detallada de zonas híbridas surgidas del contacto secundario entre unidades evolutivas diferenciadas en refugios glaciares independientes del sur de Europa. Además adquiere un matiz especial dado el escaso conocimiento actual de los dos nuevos taxones (biología reproductiva, dispersión, etc.) que, en base a nuestra hipótesis, pertenecen a un complejo críptico de especies. 2. Material y métodos 2.1. Diseño de muestreo y trabajo de laboratorio Para el presente capítulo, en base a los resultados del análisis filogeográfico del género Pelodytes realizado previamente y presentado en los capítulos anteriores de esta tesis, se planificó el muestreo en áreas pertenecientes a las dos supuestas zonas de contacto secundario entre las dos especies, consideradas hasta ese momento, presentes en la Península Ibérica (P. ibericus y ambos linajes de P. punctatus) y que, solamente a posteriori, han podido ser descritas como dos nuevas especies. Se realizó un muestreo intenso durante la época de reproducción entre los años 2009 y 2012 en localidades dentro del hábitat reproductivo de las especies –charcas y arroyos temporales– en concreto: a) en la zona de contacto portuguesa en localidades claramente atribuidas a P. ibericus y P. atlanticus, desde el área de distribución de Andalucía occidental (provincias de Sevilla, Huelva y Cádiz) y sur de Portugal, hasta la costa portuguesa, incluyendo los distritos de Faro, Beja y Setúbal (Algarve y Alentejo); y b) entre P. ibericus y P. hespericus, desde el interior del límite de distribución de P. ibericus al este de Andalucía (en la provincia de Jaén) hasta Almería y por el noreste hasta las provincias de Castilla-La Mancha (Albacete y Ciudad Real). Además, se obtuvieron muestras procedentes de individuos conservados en alcohol en el Museo de Lisboa (MUHNAC: Museu Nacional de História Natural e da Ciência) capturadas por el Prof. Eduardo G. Crespo (FCUL), principalmente de poblaciones de P. atlanticus presentes en el interior del rango de distribución de la especie y alejadas de la zona de contacto. Con el fin de detectar el mayor número de localidades reproductivas, se intensificó el esfuerzo de muestreo en las supuestas zonas de contacto secundario entre las especies dentro de un rango de 200 km. Inicialmente para el presente estudio se tomaron de 10 a 25 muestras por localidad en el interior de la área de contacto y de 2 a 10 muestras por localidad en poblaciones alejadas de la zona de contacto, hasta un total de 850 muestras procedentes de 114 localidades. Posteriormente, se realizó un ANÁLISIS GENÉTICO DE DOS ZONAS DE CONTACTO SECUNDARIO EN EL SUR DE LA PENÍNSULA 151 “buffer” en ArcGis v10.3 para calcular exactamente la distancia entre cada una de las localidades. Teniendo en cuenta los patrones de dispersión de otras especies de anuros y el escaso número de sitios reproductivos encontrados, muchos de los cuales desaparecieron en el transcurso de nuestro estudio, (especialmente en Portugal) se consideró la misma localidad a las poblaciones situadas en un radio inferior a 5 km sin ningún tipo de barrera geográfica intermedia, accidente geográfico, río o población humana. Las localidades se etiquetaron con las tres primeras letras del municipio o población más cercana. En segundo lugar, se seleccionaron localidades distanciadas 10-25 km entre sí, a lo largo de la línea imaginaria de un transecto en ambas zonas de contacto, tratando de seguir la dirección noreste desde el suroeste de Portugal (Sagres) – Algarve, Baixo Alentejo, Extremadura – y en dirección noreste en España (Andalucía oriental)– incluyendo el suroeste de la comunidad autónoma de Castilla- La Mancha– Ver figura 1. El tejido utilizado para los análisis se obtuvo a partir de las colas de las larvas (corte del extremo distal de la cola < 1 cm) de individuos vivos y tejido muscular del interior de la extremidad posterior de individuos conservados en el Museo de Lisboa. Para evitar muestrear dos veces la misma larva en una localidad, todos los ejemplares fueron tomados al mismo tiempo y sólo se tomó tejido de colas intactas. Las larvas fueron puestas en libertad inmediatamente después de la extracción en el mismo lugar donde fueron capturadas. Los tejidos fueron conservados en Etanol al 70% y conservados a temperatura ambiente. La captura fue realizada con los permisos correspondientes mediante vadeadoras y mangas que se usaron desinfectadas con Virkon, junto con las botas, siguiendo un protocolo de limpieza entre una y otra localidad. La cantidad total de ADN fue extraída de estos tejidos siguiendo tres protocolos diferentes de extracción, dependiendo de la cantidad y la calidad del ADN disponible: para la mayoría de los tejidos obtenidos de individuos vivos, se usó el protocolo de lisis alcalina HotShot deTruett (2000) o el protocolo de extracción salina de Sambrook et al. (1989) y para los casos más complicados, a partir del tejido de ejemplares conservados en el museo de Lisboa, se usó el Kit de extracción Dneasy Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la obtención de los fragmentos RFLP a partir del ADN mitocondrial, se utilizaron los mapas de restricción del fragmento de 705 pb perteneciente al fragmento del gen Citocromo b (mt-CYB) que fue amplificado mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para todos los individuos de ambas zonas de contacto utilizando los siguientes cebadores y condiciones: L14724 (Irwin et al. 1991), y MVZ16 (Moritz et al. 1992), con una temperatura de desnaturalización inicial de 94ºC durante 180 s y 35 ciclos, compuestos por una fase de desnaturalización de 92ºC, durante 40 s; hibridación de 47ºC, durante 60 s; y elongación de 72ºC, durante 90 s; seguidos por una extensión final de 300 s a 72ºC. Una parte del producto de amplificación (2 µl) fue cargado y migrado en un gel de agarosa al 1% para testar el resultado de la reacción. El resto, fue incubado con las enzimas de restricción FOK-I y HPH-I