Estudio del complejo de enfermedades respiratorias porcinas en una raza en peligro de extinción: el cerdo negro canario

i Estudio del Complejo de Enfermedades Respiratorias Porcinas en una Raza en Peligro de Extinción: El Cerdo Negro Canario. Tesis Doctoral Yania Paz Sánchez ULPGC-IUSA 2015 ii iii A Iván y a mis padres. "Todo camino, por largo que sea, comienza con un solo paso", Lao-Tse. v I NDICE Índice i Índice 1 INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS ..................................................................................................... 7 2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ......................................................................................................... 13 2.1 RAZA PORCINA NEGRO CANARIO .................................................................................................. 13 2.1.1 Definición de la raza y antecedentes históricos ................................................................. 13 2.1.2 Estado actual, distribución geográfica e importancia ........................................................ 14 2.1.3 Aspectos morfológicos y productivos del Cerdo Negro Canario ........................................ 15 2.2 APARATO RESPIRATORIO DEL PORCINO ....................................................................................... 19 2.2.1 Estructura normal del aparato respiratorio ....................................................................... 19 2.2.2 Función del aparato respiratorio ........................................................................................ 27 2.2.3 Mecanismos de defensa del aparato respiratorio ............................................................. 27 2.2.4 Respuesta a la injuria en el aparato respiratorio ............................................................... 35 2.3 COMPLEJO DE ENFERMEDADES RESPIRATORIAS PORCINAS (PRDC) ............................................ 39 2.3.1 Etiología .............................................................................................................................. 40 2.3.2 Prevalencia ......................................................................................................................... 41 2.3.3 Patogenia ............................................................................................................................ 43 2.3.4 Clínica ................................................................................................................................. 46 2.3.5 Lesiones macroscópicas y microscópicas ........................................................................... 47 2.3.6 Diagnóstico ......................................................................................................................... 50 2.4 PRINCIPALES AGENTES ETIOLÓGICOS INVOLUCRADOS EN EL PRDC ............................................ 54 2.4.1 Mycoplasma hyopneumoniae ............................................................................................ 54 2.4.2 Virus del Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino .................................................. 70 2.4.3 Circovirus Porcino tipo 2 .................................................................................................... 76 3 MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................................................ 97 3.1 MATERIAL ...................................................................................................................................... 99 3.1.1 Animales objeto de estudio ................................................................................................ 99 3.2 MÉTODOS .................................................................................................................................... 102 3.2.1 Diagnóstico anatomopatológico: diagnóstico morfológico macroscópico ...................... 102 3.2.2 Diagnóstico anatomopatológico: diagnóstico morfológico microscópico ....................... 106 3.2.3 Estudio inmunohistoquímico............................................................................................ 108 3.2.4 Diagnóstico microbiológico .............................................................................................. 110 3.2.5 Estudio serológico ............................................................................................................ 110 3.2.6 Análisis estadístico (Extractos pulmonares empleados en técnicas de ELISA) ................ 116 Índice ii 4 RESULTADOS .......................................................................................................................... 119 4.1 ESTUDIO 1: ESTUDIO DE CAUSAS DE MUERTE (2007-2012) ....................................................... 119 4.1.1 Animales objeto de estudio .............................................................................................. 119 4.1.2 Descripción de lesiones macroscópicas y diagnóstico morfológico ................................. 119 4.1.3 Descripción de lesiones microscópicas y diagnóstico morfológico .................................. 137 4.1.4 Estudio inmunohistoquímico ............................................................................................ 171 4.1.5 Estudio microbiológico. .................................................................................................... 176 4.1.6 Resumen ........................................................................................................................... 177 4.2 ESTUDIO 2: ESTUDIO ANATOMOPATOLÓGICO EN ANIMALES SACRIFICADOS EN MATADERO .. 179 4.2.1 Estudio macroscópico ....................................................................................................... 179 4.2.2 Estudio microscópico ........................................................................................................ 180 4.2.3 Estudio inmunohistoquímico ............................................................................................ 194 4.3 ESTUDIO 3: ESTUDIO DE PREVALENCIA DE MH, PRRSV Y PCV2 EN LA POBLACIÓN DE CNC ....... 197 4.3.1 Seroprevalencia de Mh, PRRSv y PCV2 en el Archipiélago Canario .................................. 197 4.3.2 Resumen de seroprevalencia de Mh, PRRSv y PCV2 y coinfecciones observadas ........... 206 4.3.3 Uso de extractos de tejido pulmonar en técnicas de ELISA ............................................. 206 5 DISCUSIÓN ............................................................................................................................. 211 5.1 Antecedentes y justificación del estudio ..................................................................................... 211 5.1.1 La Raza .............................................................................................................................. 211 5.1.2 Complejo de Enfermedades Respiratorias Porcinas ......................................................... 213 5.2 Estudio serológico ....................................................................................................................... 215 5.2.1 Seroprevalencia de Mh, PRRSv y PCV2 en el CNC, en el Archipiélago Canario ................ 216 5.2.2 Serología transversal en Gran Canaria. ............................................................................ 218 5.2.3 Serología longitudinal en Gran Canaria ............................................................................ 219 5.2.4 Coinfección entre los distintos agentes patógenos en el Archipiélago Canario .............. 220 5.2.5 Uso de extractos de tejido pulmonar en técnicas de ELISA ............................................. 221 5.3 Estudio Anatomopatológico en animales sacrificados en matadero .......................................... 223 5.3.1 Estudio anatomopatológico en pulmón ........................................................................... 223 5.3.2 Detección de Mh, PRRSv y PCV2 mediante IHQ en tejido pulmonar ............................... 228 5.3.3 Estudio anatomopatológico complementario (órganos hemolinfoides, hígado y riñón). 230 5.4 Estudio de causas de muertes en el CNC con procesos respiratorios asociados ........................ 234 5.4.1 Casos de enfermedad asociada a PCV2. ........................................................................... 235 5.4.2 Casos con Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino .............................................. 240 5.4.3 Coinfeccion Mycoplasma hyopneumoniae – Salmonella sp............................................. 242 5.4.4 Casos compatibles con infección por Haemophilus parasuis. .......................................... 244 Índice iii 6 CONCLUSIONES ...................................................................................................................... 249 7 RESUMEN .............................................................................................................................. 253 8 SUMMARY ............................................................................................................................. 257 9 ABREVIATURAS ...................................................................................................................... 261 10 ANEXOS ................................................................................................................................. 265 10.1 Serología en Gran Canaria ...................................................................................................... 265 10.1.1 Serología longitudinal en Gran Canaria ............................................................................ 270 10.2 ELISA frente a Mh, PRRSv y PCV2 empleando suero sanguíneo y extracto pulmonar ........... 271 10.3 Serología en Lanzarote ............................................................................................................ 272 10.4 Serología en Tenerife .............................................................................................................. 273 10.5 Serología en La Palma ............................................................................................................. 274 11 AGRADECIMIENTOS ............................................................................................................... 277 12 BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................................ 281 R RE EV VI IS SI IÓ ÓN N B BI IB BL LI IO OG GR RÁ ÁF FI IC CA A 2 . Revisión bibliográfica: Raza porcina Negro Canario 13 2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2.1 RAZA PORCINA NEGRO CANARIO 2.1.1 D EFINICIÓN DE LA RAZA Y ANTECEDENTES HISTÓRICOS El cerdo negro canario (CNC) es la única raza porcina autóctona del Archipiélago Canario, descrita por García y Capote (1982), en La Palma, como una raza poco evolucionada, de buen formato, perfil ultracóncavo y plisado, longilíneos y eumétricos, con capa negra, orejas extremadamente largas y arrugas repartidas por el cuerpo. El ganado porcino está presente en el Archipiélago Canario desde hace 2500 años, habiéndose encontrado restos en la mayoría de los yacimientos arqueológicos (Robert y cols., 2000). Los restos más antiguos proceden de los yacimientos de El Tendal y La Palmera, en la isla de La Palma, cuya ocupación fue datada mediante carbono catorce en 500 años a.C. Si bien los orígenes de la raza aún no han sido determinados, todo hace suponer su procedencia continental muy ligada a la llegada del hombre, teniendo en cuenta el aislamiento geográfico y el origen volcánico del archipiélago. Entre las sucecivas oleadas de poblamiento humano (Pérez de Barrada, 1939; Cuscoy, 1963; Schwidetzky, 1963), fueron llegando ejemplares de poblaciones porcinas de diferentes orígenes, especialmente del Norte de África, Mediterráneo Oriental, Península Ibérica (Chato Murciano, derivado del tronco ibérico y mejorado con el Berkshire y Large White) e Islas Británicas (Berkshire y Large Blake), conformando así un grupo multirracial diferenciado de los demás y perfectamente adaptado a un medio muy singular y variado (Robert y cols., 2000). Según García y Capote (1982), entre las razas inglesas de posible intervención tendríamos el Berkshire por su perfil, pigmentación de partes centrífugas y una cierta similitud en tamaño y posición de las orejas y el Large Blake, por su morfología y orejas. En cuanto a las razas españolas, cabría destacar al Chato Murciano, derivado del tronco ibérico y mejorado con el Berkshire y posteriormente con el Large White, por ciertas semejanzas genotípicas y su gran capacidad de asimilación de fibra. Recientemente, algunos autores han situado al CNC mediante estudios filogenéticos, dentro del grupo de razas celtas, junto con razas portuguesas como el Bísaro y el Malhado de Alcobaça, y otras razas españolas como el porco Celta y el Chato Murciano (Gama y cols., 2013). En 1982, el mayor número de animales se concentraban en las islas de La Gomera y La Palma (García y Capote, 1982) considerándose extinta en el resto del archipiélago. En la isla de La Palma, los reproductores se concentraban en las zonas norte y noroeste (Tijarafe) y en El Paso. Según Robert y cols., (2000), en el año 2000, el censo total del CNC en el archipiélago era de 283 ejemplares (182 hembras y 101 machos) (Ilustración 1); siendo en Tenerife de 173 ejemplares reproductores, con una relación de dos hembras por macho, y un núcleo controlado por los Servicios de Agricultura del Cabildo Insular de Tenerife, (14 hembras, 2 machos y reposición de 30 lechones). El censo de reproductores incluidos en el programa de conservación del Cabildo de Gran Canaria era de 71 ejemplares, con un núcleo controlado por el Aula de la Naturaleza de la Finca de Osorio (3 hembras y 1 macho), y bastantes ejemplares dispersos sin censar. En La Gomera se estimaba un total de 10-20 parejas de reproductores. En La Palma no existía censo actualizado en el año 2000, quedando algunos ejemplares dispersos en la zona de Garafía y un núcleo de 6 reproductores controlado por los Servicios de Agricultura del Cabildo de La Palma en Puntagorda. Finalmente, en el resto de las islas se consideraba extinto, incluida la isla de Lanzarote, donde quedaban solamente 2 hembras y 1 macho en la granja del Cabildo. Revisión bibliográfica: Raza porcina Negro Canario 14 Ilustración 1: Censo total de ejemplares reproductores de CNC en el Archipiélago Canario en el año 2000. Ext. extinto (Fuente; Servicios de Agricultura y/o Consejerías de Medio Ambiente de los Cabildos Insulares). Extraído de Robert y cols., 2000. En 2007, se realizó una caracterización genética de esta raza con microsatélites para conocer la situación genética de la población y los resultados obtenidos mostraron que esta población tiene una heterocigosidad y un número de alelos más bajos que otras poblaciones porcinas de la Península Ibérica, o lo que es lo mismo, una baja variabilidad genética que podría hacer peligrar este valioso recurso genético si no se toman medidas adecuadas para su conservación (Martínez y cols., 2007). 2.1.2 E STADO ACTUAL , DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA E IMPORTANCIA A mitad del pasado siglo, con el auge de los cruces comerciales con cerdos blancos y la aparición de los sistemas intensivos industriales, esta raza estuvo a punto de desaparecer, es por ello que actualmente se encuentra incluida en el Catálogo oficial de las Razas Ganaderas de España (Anexo I del Real Decreto 2129/2008.), dentro de las Razas Autóctonas Españolas como Raza de Protección Especial, o en grave peligro de extinción, por encontrase en grave regresión o en trance de desaparición, debido al reducido número de ejemplares reproductores existentes en aquel momento. Gracias al esfuerzo conjunto de diferentes instituciones públicas y de algunos ganaderos agrupados en la Asociación de Criadores de Cochino Negro Canario (ACCNC) el censo ha aumentado considerablemente en los últimos 10 años. Con el objetivo de recuperar esta raza, para preservar el patrimonio genético de la misma y producir productos genuinos de alta calidad muy valorados por el consumidor, se han creado programas para la conservación y mejora genética de la raza, que obliga al incremento de los censos mediante contratos de cesión de animales puros a nuevos ganaderos que se inician en esta actividad; así como del Libro Genealógico (LG) de la raza Porcina Negra Canaria (Orden de 27 de abril de 2007, por la que se reabre el Registro Fundacional del Libro Genealógico de la Raza Porcina Negra Canaria previsto en la Orden de 13 de agosto de 2001.), se pretende seleccionar y preservar el estándar racial al minimizar la consanguinidad. En el 2010, los ejemplares reproductores inscritos en el LG eran 418 (334 hembras y 84 machos); con mayor censo en Tenerife (183 ejemplares), seguido de Gran Canaria (135 ejemplares), La Palma (41 ejemplares) y Lanzarote (29 ejemplares), considerándose extinta en las islas de La Gomera y El Hierro (García y cols., 2011). Revisión bibliográfica: Raza porcina Negro Canario 15 Según datos censales oficiales, a fecha 31 de diciembre de 2014, se encuentran inscritos en los distintos registros del LG un total de 540 ejemplares, siendo 450 hembras reproductoras y 90 machos. De estos ejemplares, 305 reproductores se encuentran inscritos en el Registro Auxiliar (260 hembras, 45 machos) y 235 en el Registro Definitivo (190 hembras y 45 machos). Estos animales se encuentran repartidos por todo el archipiélago en un total de 66 explotaciones (Fuente, Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente, MAGRAMA). Los aborígenes canarios obtenían del cerdo el alimento, manteca para conservas, piel para vestimenta y huesos para la fabricación de útiles y adornos (Robert y cols., 2000). Desde siempre el CNC ha estado vinculado a explotaciones familiares como recurso para el autoconsumo. El CNC se presenta como una raza perfectamente adaptada al manejo extensivo y/o semiextensivo y cuya alimentación consiste en restos orgánicos sobrantes de la alimentación humana, restos vegetales y excedentes de la ganadería, soportando a menudo raciones de escasa palatabilidad, con altas concentraciones en fibra y deficiente valor nutritivo, abaratando de manera considerable el coste del alojamiento y alimentación, lo que supone en su conjunto un importante ahorro en los costes de producción (García y Capote, 1982). La producción de CNC debe orientarse a un mercado diferente teniendo en cuenta su elevado valor alimentario y medioambiental, debido al aprovechamiento sostenible de subproductos agrícolas y ganaderos, lo que supone un valor añadido para la economía rural. Algunas razas autóctonas, como el Chato Murciano, tienen rendimientos de la canal superiores (80,85%) a los descritos para las razas comerciales (Peinado y col., 2004; Infocarne, 2006; Peinado y cols., 2009). En cuanto a las cualidades diferenciadas de los productos cárnicos derivados de estas razas, se ha profundizado en el estudio de algunos indicadores de calidad. En los últimos años se han volcado todos los esfuerzos de las distintas organizaciones en el desarrollo de la industria cárnica del CNC, mediante la realización de estudios de los parámetros físico-químicos de su carne, en un intento de potenciar la comercialización y la realización de un correcto diseño en la transformación y la elaboración de los productos derivados del CNC. Estudios recientes realizados sobre la composición fibrilar del músculo longísimo lumbar del CNC, procedente de explotaciones de la Isla de Gran Canaria, describen un elevado porcentaje de fibras oxidativas respecto a otras razas autóctonas porcinas españolas, lo que puede favorecer el depósito de grasa intrafibrilar, influyendo a su vez en la jugosidad y en el color de la carne (Morales J. y cols., 2011). 2.1.3 A SPECTOS MORFOLÓGICOS Y PRODUCTIVOS DEL C ERDO N EGRO C ANARIO 2.1.3.1 C ARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS  Aspecto general. La población de CNC engloba a animales que se caracterizan por su rusticidad, resistencia al medio y temperamento muy tranquilo. El estándar racial de este cerdo es propio de animales muy poco evolucionados respecto a los cerdos más primitivos. Son animales eumétricos (hembras 130kg; verracos 170kg, alzada a la cruz entre 80-85 cm) (Fuente: Sociedad Española para los Recursos Genéticos Animales), brevilíneos y con un perfil ultracóncavo (López y cols., 1992) y plisado. Tiene una piel coriácea y escamosa, con abundantes cerdas fuertes y largas distribuidas por todo el cuerpo. Es de color negro, de ahí su nombre, aunque algunos ejemplares pueden llegar a presentar manchas en la partes distales de las extremidades, frente e incluso barriga debido a los cruces con razas porcinas foráneas en la antigüedad (Ilustración 2). Revisión bibliográfica: Raza porcina Negro Canario 16 • Características regionales.  Cabeza: de tamaño relativamente pequeño y corta, de perfil frontonasal ultracóncavo, siendo en su conjunto voluminosa. Poseen numerosas y profundas arrugas que aumentan con la edad, tanto que en los ejemplares más puros producen oclusión de las aperturas parpebrales. Presentan orejas extraordinariamente largas y caídas en pendiente, que sobrepasan en varios centímetros la parte externa del hocico. Jeta ancha y gruesa.  Cuello: es proporcionado y bien implantado en el tronco, con papada y sin mamellas.  Tórax: poco pronunciado, con costillares planos y gran profundidad torácica, y de aspecto fuerte.  Espaldas: alargada, con observable musculatura siendo más manifiesta en la parte anterior y ligera inclinación posterior.  Dorso y lomos: presenta una línea dorsolumbar rectilínea con una inclinación creciente hasta el límite de la grupa. Son alargados y relativamente anchos.  Grupa: tiende a ser derribada y pronunciada, denominándose “en pupitre”. Su cola es recta, de nacimiento bajo, cayendo sin retorcerse en dirección perpendicular al suelo.  Vientre y genitales externos: vientre paralelo a la línea dorsolumbar y ligeramente recogido, presentando normalmente seis pares de mamas, aunque pueden poseer más. Los machos presentan testículos con posición poco manifiesta, bien conformados, el prepucio está desarrollado. Las hembras por su parte, presentan una vulva con desarrollo normal.  Extremidades y marcha: los jamones se caracterizan por una nalga algo escurrida, poco aparente y piernas deprimidas, presentando en general extremidades finas y cortas. En estado adulto se mueven torpe y pesadamente.  Color y pelo: la piel, coriácea y escamosa, es oscura, sin manchas en la mayoría de los casos. Las cerdas son abundantes y fuertes, largas, distribuidas uniformemente por el cuerpo. Posee numerosas arrugas en la piel, especialmente apreciables en animales sin cebar, que forman plieges en las regiones de la cara, frontonasal, piernas y brazuelo. Ilustración 2: Ejemplar macho adulto de CNC. Piel coriácea y escamosa, de color negro, con abundantes cerdas fuertes y largas, marcada presencia de arrugas por todo el cuerpo, orejas extremadamente largas y caídas en pendiente y grupa derribada y cola recta de nacimiento bajo y caída perpendicular al suelo sin retorcerse. Revisión bibliográfica: Raza porcina Negro Canario 17 Según el Anexo III de la ORDEN de 13 de agosto de 2001, aquellos animales que no reúnan dichas características no serán inscritos en el LG, sin embargo existen ejemplares que aún presentando una serie de defectos, pueden ser incluidos en el LG, estos defectos reciben el nombre de defectos objetables, y son: a) Defectos de aplomos no muy destacables. b) Extremidades cortas y nalga aparente. c) Jeta poco desarrollada. d) Falta de arrugas características. e) Presentación de manchas de cierta consideración en partes distales de las extremidades, frente y abdomen. Por otro lado, y de acuerdo con la descripción del prototipo racial, se consideran como defectos descalificables los siguientes: a) Conformación general o regional defectuosa en grado acusado, con cabeza grande y larga, perfil convexo, orejas pequeñas, cortas y levantadas en punta, perfil rectilíneo, sin plieges o arrugas, grupa horizontal y muy musculosa, capa barcina (blanco con manchas negras aisladas o de otro color diferente al incluido en el estándar), cola o rabo retorcido en estado de reposo. b) Hernias. c) Anomalías en los genitales: monorquidia, criptorquidia e infantilismo genital. d) Desarrollo corporal no acorde con la edad. e) Pigmentación total o parcial de las pezuñas. 2.1.3.2 C ARACTERÍSTICAS PRODUCTIVAS Tradicionalmente la cría era estabulada en cochiqueras llamadas “goros”, cuyo destino era el autoconsumo de las familias rurales. Actualmente, la raza está muy adaptada al manejo extensivo y/o semiextensivo, lo que facilita su enfoque ecológico. Como se comentó anteriormente, su alimentación combina recursos agrarios y subproductos ganaderos con raciones de piensos. La capacidad de pastoreo es muy buena en presencia de pastos, y con ello solamente sería necesario suplementar a final de la gestación y durante la lactación, sin embargo existen limitaciones a la hora de localizar estas zonas con autorización administrativa (García y cols., 2011) Se realiza monta natural (relación macho/hembra de 1/10), destacando esta raza por su temprana precocidad sexual (7-8 meses), siendo recomendable la primera cubrición entre los 10-12 meses para que el animal logre una buena condición corporal. Las explotaciones tienen una media de 2 partos por cerda y año, siendo la prolificidad media de 8-10 lechones nacidos por parto, con un peso medio al nacimiento de 1,2kg. El destete suele realizarse entre 28-42 días de edad dependiendo de la explotación (muy próximo al tiempo mínimo de 40 días exigidos en la ganadería ecológica). La mortalidad desde el nacimiento hasta el destete está en torno al 20%, lo que establece una productividad media de 16 lechones destetados por hembra y año, llegando con un peso medio al destete de 6,5kg (hembras) - 6,7kg (machos). Revisión bibliográfica: Raza porcina Negro Canario 18 Presenta un crecimiento lento pesando alrededor de 60kg de peso vivo a los 6 meses, 100kg de PV a los 9-10 meses y 130-170kg a los 12-18 meses. Si bien estos datos pueden variar dependiendo de la dieta que reciba el animal (García y Capote, 1982; López y cols., 1992). Se le presupone un elevado índice de conversión, que si bien no es equiparable al de los cerdos comerciales, se puede considerar como bueno teniendo en cuenta el tipo de alimentación que reciben (García y Capote, 1982). La edad de sacrificio suele ser de 8-10 meses, con un peso al sacrificio recomendado para el despiece en torno a los 90-100kg, presentando un rendimiento canal del 83%. Las canales suelen ser de tipo graso, presentando un magro de excelente calidad, muy consistente y de color rojo intenso con abundante grasa infiltrada. La grasa de cobertura que se distribuye uniformemente, es fluida, blanquecina y de grano firme. La hostelería demanda principalmente cerdos de 45 kg y lechones de 7-9 kg al destete para obtener una canal de 6 kg (lechales) (López y cols., 1992; García y cols., 2011). Revisión bibliográfica: Aparato respiratorio del porcino 19 2.2 APARATO RESPIRATORIO DEL PORCINO 2.2.1 E STRUCTURA NORMAL DEL APARATO RESPIRATORIO 2.2.1.1 E STRUCTURA NORMAL DEL ÁRBOL BRONQUIAL El aparato respiratorio se divide morfológicamente en tres sistemas independientes pero continuos, estando cada sistema constituido por estructuras histológicas particulares (López 2006): a) Sistema de conducción b) Sistema de transición c) Sistema de intercambio  Sistema de conducción: tráquea y bronquios. El sistema de conducción está constituido por la cavidad nasal, laringe, tráquea y bronquios (López 2006) En función del contenido de esta tesis únicamente nos centraremos en el estudio de la tráquea y bronquios. • Tráquea: La tráquea es un tubo membranoso, flexible y cartilaginoso que forma la parte proximal del árbol traqueobronquial. En el porcino mide alrededor de 15-20 cm en animales adultos y se extiende desde la laringe, a nivel de la vértebra cervical IV-V, hasta la vértebra torácica V, donde se bifurca en bronquios principales derecho e izquierdo, dorsal a la base del corazón. La tráquea es más o menos medial en su posición excepto en su parte terminal, donde es empujada hacia la derecha por el arco aórtico. Presenta una parte cervical, que asienta en el cuello y una parte torácica, que asienta en la cavidad torácica. La pared de la tráquea está formada por cuatro capas: mucosa, submucosa, musculocartilaginosa y adventicia (Hare, 2001a). La mucosa da origen a numerosos pliegues longitudinales. Consta de un epitelio de revestimiento de tipo pseudoestratificado cilíndrico ciliado, constituido por células ciliadas, en cepillo; células secretoras, con predominio de células caliciformes; células exocrinas, basales y neuroendocrinas. Los cilios se dirigen cranealmente y llevan una doble capa de secreción mucosa a la que se adhieren las partículas extrañas que son vehiculadas por el aire inhalado. También se puede observar células migratorias como linfocitos, leucocitos globulares y mastocitos. Además, en la mucosa se puede ver tejido linfoide asociado (Hare, 2001a; Lopez, 2006; Dellmann y Brown., 2006). La submucosa está constituida por tejido conectivo laxo, con una capa de fibras elásticas orientadas longitudinalmente, y células entre las que se incluyen adipocitos, fibrocitos, linfocitos, células plasmáticas, leucocitos granulares y mastocitos. Además presentan glándulas seromucosas tubuloacinares que producen la mayor parte del material que recubre la superficie ciliada de la tráquea. Algunas de ellas se encuentran también en capas más profundas de la lámina propia y entre los anillos cartilaginosos de la capa musculocartilaginosa. Estas glándulas son más numerosas en la porción proximal a nivel ventrolateral de la tráquea (Hare, 2001a y b; Dellmann y Brown., 2006). Revisión bibliográfica: Aparato respiratorio del porcino 26 La rama bronquial impar (arteria que surge de la cara ventral de la aorta) junto con la arteria esofágica craneal, forman la arteria broncoesofágica. La rama bronquial pasa ventralmente sobre la superficie derecha del esófago para alcanzar la cara dorsal de la bifurcación traqueal. A este nivel se divide en ramas bronquiales derecha e izquierda; una rama bronquial va al lóbulo craneal derecho y las últimas ramas van a la tráquea. Dentro del pulmón, las ramas bronquiales se sitúan alrededor de los bronquios y proporcionan ramas a la pared bronquial y vasa vasorum de los vasos pulmonares. Las ramas bronquiales también proporcionan ramas que van al septo interlobular e irrigan la pleura pulmonar. Las ramas bronquiales terminan en los extremos distales de los bronquiolos terminales junto al lecho capilar (McLaughlin y cols., 1961; Hare, 2001a).  Linfonodos: Los linfonodos del pulmón o linfonodos traqueobronquiales están situados en la bifurcación de la tráquea. En el cerdo se describen los linfonodos traqueobronquiales craneales, derechos, izquierdos y medios (Ilustración 6) (König y Liebich, 2005). Existen dos juegos de vasos linfáticos que drenan los pulmones: los superficiales y los profundos. Los capilares linfáticos del drenaje superficial se originan en el tejido conjuntivo pleural y drenan hacia el hilio en el tabique interlobulillar. Los vasos profundos se originan a nivel de los bronquiolos terminales y siguen el patrón del árbol bronquial hacia el hilio del pulmón. Los vasos profundos se anastomosan con el drenaje superficial en los tabiques interlobulillares. No se han demostrado la existencia de vasos linfáticos interalveolares (Fawcett, 1995).  Inervación: La inervación pulmonar es vegetativa. Las fibras simpáticas del ganglio cervical medio y caudal irradian hacia el mediastino y a nivel de la base del corazón se unen con ramas parasimpáticas del nervio vago para formar el plexo cardiaco, desde el que parten fibras hacia el pulmón, para formar allí el plexo pulmonar. El pulmón es pobre en fibras simpáticas, la inervación vegetativa tiene a su cargo las glándulas bronquiales, los músculos de los bronquios y los vasos sanguíneos. Las fibras aferentes provienen de la mucosa bronquial y de receptores de estiramiento (König y Liebich, 2005). 2.2.1.3 P LEURA Es una fina capa de tejido conjuntivo con escasos fibroblastos, fibras de colágeno y varias capas de fibras elásticas. En su superficie interna está cubierta por una capa de células mesoteliales similar a la que reviste la cavidad peritoneal. La capa de mesotelio situada sobre la pared torácica es la pleura parietal y la que se dispone sobre la superficie pulmonar es la pleura visceral. Una característica especial de la pleura es el gran número de capilares y vasos linfáticos que contiene. En los porcinos, la pleura visceral se extiende en profundidad continuándose con el tejido conjuntivo interlobulillar que separa completamente los lobulillos pulmonares (Dellmann y Brown, 2006; Dungworth, 1993; Fawcett, 1995). Revisión bibliográfica: Aparato respiratorio del porcino 27 2.2.2 F UNCIÓN DEL APARATO RESPIRATORIO El aparato respiratorio está constituido por un conjunto de órganos cuya función es la de mediar en el intercambio gaseoso, permitiendo el paso del oxígeno inhalado a la sangre y del dióxido de carbono de la sangre al aire, regulando a su vez la temperatura corporal. La presencia de receptores sensoriales y una mucosa húmeda y cálida a nivel de las vías respiratorias altas permiten la filtración, humidificación y calentamiento del aire inhalado (Krejci, 2013). El intercambio gaseoso entre el aire inhalado y la sangre venosa presente en la arteria pulmonar tiene lugar a nivel alveolar. Con cada inspiración se renueva solo una pequeña parte del volumen total de aire alveolar. En un cerdo en reposo, se renueva el 10-15% del aire alveolar por inspiración. La frecuencia respiratoria normal (respiración/minuto) depende de la edad del animal así, lechones y animales en crecimiento presentan entre 25-40, los animales al final del cebo entre 25-35 y las cerdas en lactación entre 15-20 respiraciones por minuto (Sorensen y cols., 2006). 2.2.3 M ECANISMOS DE DEFENSA DEL APARATO RESPIRATORIO La superficie de la mucosa del tracto respiratorio proporciona una delgada barrera entre el animal y su entorno. Mientras que la piel está muy bien adaptada para prevenir la invasión de potenciales agentes nocivos, la superficie epitelial del tracto respiratorio sirve principalmente como una membrana de difusión. Para el intercambio gaseoso se necesita una superficie extensa, así que el aparato respiratorio dispone de un sistema de defensa potente y especializado. El sistema inmune de las vías respiratorias se puede dividir en dos partes morfológica y funcionalmente bien diferenciadas pero que actúan de forma coordinada como sigue: la inmunidad regulada por el sistema inmune propio de la mucosa y la inmunidad del parénquima pulmonar regulada por el sistema inmune local (Bienenstock y Clancy, 1994; Pabst, 1996; Brandtzaeg y cols., 1999). De esta manera, tenemos los mecanismos de defensa del tracto respiratorio y del parénquima pulmonar propiamente dicho, existiendo en ambos casos mecanismos de defensa de carácter inespecífico o no inmunológico y los mecanismos de defensa específicos o inmunológicos. 2.2.3.1 M ECANISMOS DE DEFENSA DEL TRACTO RESPIRATORIO  Mecanismos de defensa inespecíficos Estos mecanismos de defensa juegan un importante papel en la prevención de la infección sin necesidad de activar el sistema de defensa específico, eliminando cerca del 90% de los microorganismos que llegan a las vías aéreas vehiculados por el aire inhalado. Si bien algunos de sus componentes actúan como nexos de unión entre el sistema de defensa específico y el inespecífico (Krejci, 2013). Un componente muy importante del sistema de defensa inespecífico es la mucosa del tracto respiratorio y sus secreciones. La mucosa está limitada por el epitelio respiratorio y no sólo actúa como barrera mecánica sino que además presenta una actividad cinética y secretora muy importante (Krejci, 2013). Revisión bibliográfica: Aparato respiratorio del porcino (Mecanismos de defensa) 28 • Aparato mucociliar y epitelio ciliado. Está constituido por la mucosa y el moco que ésta produce. Es uno de los sistemas más importantes en la protección de las vías respiratorias. Su principal función es la de eliminar continuamente de la mucosa las partículas extrañas (polvo o microorganismos) que llegan a las vías aéreas en el aire inhalado. Debido a su extensión, el aparato mucociliar es una barrera casi insuperable por las partículas en condiciones fisiológicas (Krejci, 2013). El aclaramiento de la mucosa respiratoria resulta de la interacción entre el epitelio ciliar y la capa superior del moco secretado por la mucosa (Krejci, 2013). El epitelio ciliar recubre la mayor parte de la superficie mucosa de las vías respiratorias, desde la porción proximal de la cavidad nasal hasta los bronquiolos terminales donde se transforma en un epitelio columnar no ciliado (Baskerville, 1970). El epitelio ciliar está constituido por células columnares ciliadas. Se estima que cada célula ciliar posee alrededor de 200-300 cilios con una longitud de 6 µm aproximadamente que realizan unas 300-600 movimientos por minuto (Breeze, 1976; Reynolds, 1991; Chilvers y O’Callaghan, 2000). Los movimientos rítmicos de los cilios dan lugar a un flujo de aproximadamente 100-300 µm x s -1 (Nicod, 1999). Este movimiento se realiza en dos fases: una rápida que moviliza la capa “gel” y otra 3 veces más lenta o fase de reposo (Sleigh, 1977). El moco es uno de los componentes más importantes del aparato mucociliar. Su secreción es llevada a cabo por las células secretoras a lo largo de todo el tracto respiratorio. Sin embargo, su composición varía a lo largo del mismo, siendo moco propiamente dicho en los tramos más proximales y más seroso a medida que avanza hacia los bronquiolos terminales y alveolos (Cone, 1999). Además de actuar como barrera mecánica sobre la superficie del aparato respiratorio, el moco presenta una elevada cantidad de sustancias antimicrobianas no específicas (Ganz, 1999; Travis y cols., 1999; Zhang y cols., 2000; Schutte y McCray, 2002). El moco de las vías aéreas se estructura en dos capas que difieren en composición y viscosidad. Una capa más externa o capa “gel” con propiedades físicas viscoelásticas, cuya matriz está constituida por moléculas de glicoproteínas mucina (1-3%), que se desplaza sobre la capa mas interna transportando las partículas o patógenos adheridos. Su espesor varía entre los 2-20 µm. La capa más interna o “periciliar” es más serosa y mide entre 5-10 µm de espesor y permite el libre movimiento de los cilios (Cone, 1999; Chilvers y O’Callaghan, 2000; Krejci, 2013). El moco respiratorio protege, hidrata y humidifica las vías aéreas y está constituido por sales (1%), proteínas y glicoproteínas (mucinas) (2-4%) y agua (95%). Actúa como barrera de difusión y filtración del líquido de las vías respiratorias y está íntimamente involucrado en la defensa mucociliar local (Chilvers y O’Callaghan, 2000). Aproximadamente el 90% de las partículas inhaladas con un diámetro superior a 2-3 µm se depositan en el moco que recubre el epitelio ciliado. Estas partículas, junto con el moco, son transportadas desde los bronquiolos terminales hasta la tráquea mediante el movimiento de los cilios (Nicod, 1999). Casi todas las partículas de más de 10 µm quedan atrapadas en la cavidad nasal debido a la fuerza centrífuga generada por los cornetes nasales en el flujo del aire. Estas partículas impactan en la mucosa y quedan atrapadas en el moco. Solo las partículas menores de 10 µm logran pasar a través de la cavidad nasal y llegar a la tráquea y los bronquios (Sorensen y cols., 2006). Revisión bibliográfica: Aparato respiratorio del porcino (Mecanismos de defensa) 29 Aquellas partículas más pequeñas (2-10 µm) quedan atrapadas en las bifurcaciones bronquiales donde tiene lugar un cambio brusco en el flujo del aire provocando que las partículas suspendidas choquen contra las paredes y queden atrapadas en el moco. Estratégicamente localizadas a este nivel, se encuentran agregados de tejido linfoide asociado a los bronquios (bronchus-associated lymphoid tissue, BALT) (López, 2006; 2009). Solo las partículas de diámetro inferior a 2 µm logran atravesar el sistema de transición y llegar al sistema de intercambio. Los alveolos carecen de cilios y por tanto a este nivel no se produce atrapamiento mucociliar. El mecanismo de defensa principal a este nivel son los macrófagos pulmonares alveolares, como se comentará más adelante (López, 2006; 2009). El moco contiene numerosas sustancias que presentan una importante actividad antimicrobiana. Entre los elementos que contribuyen a la defensa pulmonar y que se encuentran en el moco están las inmunoglobilinas (Ig) de tipo IgA secretadas, lisozimas, lactoferrinas, defensinas y el interferón (Nicod, 1999; Zhang y cols., 2000). - IgA: secretadas por las células epiteliales son la primera línea de defensa de la inmunidad adaptativa. Son particularmente importantes, ya que neutralizan toxinas, virus y bloquean la entrada de bacterias a través del epitelio. Por otro lado, son pobres activadores de la vía clásica del complemento, pero pueden activar la vía alternativa que permite una mejor opsonización de las bacterias (Underdown y Schiff, 1986). - Lisozima: es una enzima producida por la mayoría de las células fagocíticas y en menor medida por las células epiteliales. Están involucradas en la digestión de las paredes celulares de las bacterias Gram-positivas. Y se trata de la enzima bactericida más comúnmente secretada de forma natural en el tracto respiratorio de la mayoría de los mamíferos (Travis y cols., 1999). - Lactoferrina: es una proteína que se encuentra en los gránulos específicos de los neutrófilos y tanto estructural como funcionalmente guarda una estrecha relación con la transferrina sérica. Es liberada por los neutrófilos y las células epiteliales secretoras a las vías aéreas y ejerce su acción gracias a la presencia del ión férrico necesario para el crecimiento de la mayorías de las bacterias patógenas (Euzeby, 1993; Pruitt, 1999; Adlerova, 2008) . - Defensinas: son relativamente abundantes en las vías aéreas. Al contrario que en el tracto digestivo donde predomina la defensina α, en el tracto respiratorio prevelece la presencia de defensina β, presentando ambas una considerable actividad antimicrobiana de amplio espectro (Zhang y cols., 2000), eficaz en la defensa frente a agentes bacterianos, fúngicos y víricos. Son expresadas por las células epiteliales y células mieloides, especialmente neutrófilos. Los niveles más altos de defensinas se producen en caso de infección. Su producción viene inducida por citoquinas inflamatorias y antiinflamatorias, factor de crecimiento y productos microbianos (Schutte y McCray, 2002; Hiemstra, 2007). Las defensinas incrementan la permeabilidad de la membrana. Además presentan una actividad quimiotáctica atrayendo a las células dendríticas inmaduras, monocitos y linfocitos T (Ganz, 1999; Schutte y McCray, 2002). - Interferón: participa en los mecanismos de defensa no específicos del sistema respiratorio. En caso de inflamación penetran en la mucosa del tracto respiratorio componentes de la sangre periférica y se desencadena una cascada inducida por el complemento (Euzeby, 1993). El interferón α y β son producidos principalmente por las células infectadas por virus, éstos se unen a los receptores de membrana de las células infectadas y no infectadas e inducen la síntesis de enzimas con actividad frente a la replicación viral. El interferón γ es Revisión bibliográfica: Aparato respiratorio del porcino (Mecanismos de defensa) 30 producido por las células Th1 con especificidad antigénica y las células NK (Natural Killer) y controlan varios aspectos de la respuesta inmune. Son esenciales en la supresión de infecciones intracelulares actuando como inductores de la inflamación, activadores de macrófagos, mastocitos y fibroblastos, y juegan un importante papel en la diferenciación de las células Th1 (Euzeby, 1993).  Mecanismos de defensa específicos • Componente humoral: El componente humoral de la respuesta inmune específica del tracto respiratorio del porcino comprende principalmente a los anticuerpos (Acs) de tipo IgA e IgG, y en menor medida a los de tipo IgM. La forma polimérica de la IgA, por lo general dímeros, y la IgM, están presentes en las secreciones de las vías aéreas. Estas Igs presentes en la mucosa del tracto respiratorio son sintetizadas localmente. La gran mayoría de las IgAs, presentes en las secreciones, son producidas por los agregados de linfocitos B dispersos por la lámina propia de la mucosa del tracto respiratorio (Bradley y cols., 1976a; Morgan y cols., 1980) y en menor medida, por los agregados organizados de tejido linfoide, incluyendo las tonsilas y el BALT (Bradley y cols., 1976b). Las IgAs producidas y liberadas por las células plasmáticas, se unen a los receptores de membrana y penetran en las células epiteliales, de aquí pasan a las células secretoras y finalmente alcanzan la luz de las vías aéreas. Cerca del 97% de los Acs de tipo IgA presentes en el tracto respiratorio de los cerdos, alcanzan la superficie mucosa por esta vía (Bradley y cols., 1976a; Morgan y cols., 1980; Mostov, 1999). El origen de los Acs de tipo IgG en las vías aéreas del porcino no es uniforme (Krejci J, 2013). Una parte se produce localmente, sin embargo la gran mayoría atraviesan la fina barrera hematogaseosa y llegan al tracto respiratorio junto con el líquido alveolar (Bradley y cols., 1976a; Morgan y cols., 1980; Reynolds y Merrill, 1981). En caso de inflamación pulmonar esta difusión se ve incrementada considerablemente. La entrada de Acs maternales a través de la mucosa nasal y bronquial ha sido descrita en lechones. Sin embargo, los Acs presentes en la circulación sistémica no atraviesan la mucosa sana de los lechones de mayor edad ni de los cerdos adultos (Mensik, 1971a; Mensik, 1971b; Bradley y cols., 1976a; Charley y Corthier, 1977; Nechvatalova y cols., 2011). La concentración de cada isotipo de Ig en cada una de las porciones del tracto respiratorio es distinta y depende del origen de cada uno de ellos, como ya se describió anteriormente. Así, en las secreciones de la parte proximal de las vías aéreas predominan los Acs de tipo IgA (Holmgren, 1973; Morgan y cols., 1980), mientras que la concentración de IgG es mayor en las regiones más distales (secreciones de los bronquiolos y alveolos). A su vez, la función que cada uno de ellos desempeña depende de la proporción en la que se encuentren en la mucosa. Las IgAs son difíciles de digerir por las proteasas y por lo tanto se convierten en importantes factores de defensa que protegen la mucosa respiratoria. Protegen el sistema respiratorio de la acción de los microorganismos que penetran por las vías aéreas junto al aire inhalado sin llegar a inducir una respuesta inflamatoria ni daño en la mucosa. Estos Acs actúan evitando la adhesión de los microorganismos a la superficie de las células, y junto con otros mecanismos de defensa inespecíficos (moco, aparato mucociliar y sistema antibacteriano) facilitan la eliminación de los mismos. Las IgAs no activan la vía del complemento, sin embargo tienen una ligera capacidad de opsonización, por lo que los complejos antígenos-IgA se unen a los receptores Fc de las células efectoras y son fagocitados, neutralizando y eliminando de esta manera a los microorganismos (Krejci, 2013; Russell, Revisión bibliográfica: Aparato respiratorio del porcino (Mecanismos de defensa) 31 1999). Sin embargo, los Acs de tipo IgG sí activan el complemento, actúan como opsoninas y facilitan la fagocitosis de los inmunocomplejos formados a partir de la unión de estos Acs a la superficie de los microorganismos (Huang y cols., 1990; Busse, 1991; Pabst y Binns, 1994; Tizard, 2000; Krejci, 2013). • Componente celular: El componente celular del mecanismo de defensa específico de las vías respiratorias comprende el tejido linfoide presente en la lámina propia de la mucosa y los linfonodos regionales. El tejido linfoide propio de la mucosa incluye dos partes morfológica y funcionalmente bien diferenciadas. El tejido linfoide no organizado es el más extenso, está compuesto por un elevado número de células y normalmente actúa de forma efectora. El tejido linfoide organizado es la zona inductora de la respuesta inmune. Se organiza en forma de agregados similares a los linfonodos en determinadas regiones de las vías aéreas. Al contrario que los linfonodos, estos agregados de tejido linfoide no poseen ni una envoltura ligamentosa ni vasos linfáticos aferentes (Krejci, 2013). Tejido linfoide no organizado Está constituido por linfocitos dispersos y pequeños agregados linfoides. En estos pequeños grupos prevalecen las células plasmáticas, los linfocitos B y linfocitos T, siendo los linfocitos T CD4+ los más abundantes en la lámina propia (Pabst, 1996). La proporción de estas células depende de la influencia antigénica o del desarrollo de algún proceso patológico en las vías respiratorias (Puci y cols., 1982). Además de los tipos celulares mencionados anteriormente, en el tejido linfoide también se observan macrófagos y en menor medida granulocitos y mastocitos. Así mismo, aparecen linfocitos intraepitelial en la mucosa del tracto respiratorio, de forma similar a lo que ocurre en el epitelio de otras mucosas (Fournier y cols., 1989; Hameleers y cols., 1989). En lechones neonatos, los linfocitos intraepiteliales no poseen antígenos (Ags) de superficie CD2, CD4 y CD8. Empiezan a expresar los Ags CD2 y CD8 en las primeras semanas de vida, de manera que ya a las 7 semanas presentan linfocitos T CD2+ y CD8+ (Whary y cols., 1995). En el epitelio bronquial, la proporción de linfocitos T CD8 es superior a la de los linfocitos T CD4 siendo la relación CD4/CD8 de 0,4 (Goto y cols., 2000). Se cree que estos linfocitos intraepiteliales participan en la inmunorregulación de la mucosa, manteniendo la integridad de la misma (Erle y Pabst, 2000). Las células dendríticas, al igual que los linfocitos B, juegan un papel importante como células presentadoras de Ags. Se han descrito dos fenotipos distintos de estas células en el tracto respiratorio del porcino, las células dendríticas mieloides y plasmocíticas (Summerfield y McCullough, 2009). Estas células tienen una familia especializada de receptores proteicos de superficie denominada complejo mayor de histocompatibilidad (mayor histocompatibility complex, MHC) de clase II (MHC II), que en los cerdos se denominan Ags Leucocitarios Porcinos (swine leucocyte antigens, SLA). El MHC II es una proteína de transporte que fijan fragmentos de Ag y los conducen hasta la superficie celular para presentarlo a los linfocitos T cooperadores. Además el linfocito T debe estar expuesto a la acción de proteínas secretadas por macrófagos (IL-1, entre otras) para que se desencadene la respuesta inmune (Marrack y Kappler, 1986; Banchereau y Steinman, 1998). Las células dendritas actúan de dos formas, en un animal que ha tenido contacto previo con el Ag, proporciona una superficie sobre la cual puede ser presentado el Ag junto al MHC II y en los animales con complejos Ag-Ac circulantes, las células son capaces de retener el Ag en su superficie durante más de 3 meses (Banchereau y Steinman, 1998). Revisión bibliográfica: Aparato respiratorio del porcino (Mecanismos de defensa) 32 Tejido linfoide organizado El tejido linfoide asociado a la mucosa (mucosa-associated lymphoid tissue, MALT) está estratégicamente ubicado en distintas localizaciones a lo largo del tracto respiratorio para detectar de forma eficaz la presencia de Ags. Basado en la localización anatómica, pueden subdividirse en tejido linfoide asociado a la cavidad nasal (nose-associated lymphoid tissue, NALT), el tejido linfoide del anillo de Waldeyer (tonsilas) localizado en la nasofaringe, el tejido linfoide asociado a la laringe y traquea (trachea and larynx-associated lymphoid tissue, LTALT) y el BALT, que se localiza en las ramificaciones bronquiales (Liebler-Tenorio y Pabst, 2006). Esta organización del tejido linfoide está especializada en el reconocimiento y tratamiento de Ags, y en la activación primaria de los linfocitos B. Estos agregados de tejido linfoide son similares a las placas de Peyer ubicadas en el íleon y ambos desempeñan un papel muy importante en la inducción del sistema inmune a nivel de la mucosa (Bienenstock y cols., 1999). El BALT es un tejido linforreticular que se encuentra localizado principalmente en el interior del ángulo formado por la bifurcación de los bronquios y bronquiolos (Huang y cols., 1990). Esta zona es especialmente importante dado que en ella impactan gran cantidad de partículas. La estructura histológica del tejido linfoide facilita el atrapamiento antigénico y tiene un papel similar en la inmunidad de las mucosas. Normalmente se encuentra compuesto por un único folículo linfoide que hace protuberancia hacia el tracto respiratorio y forma un nódulo. Este folículo linfoide se extiende desde la submucosa hasta la membrana basal del epitelio respiratorio y establece contacto directo con la misma. Los folículos se encuentran compuestos principalmente por linfocitos y pocas células reticuloendoteliales. Las partículas son fagocitadas y transportadas por los macrófagos y células dendríticas especializadas, lo que facilita que los linfocitos tomen contacto con los Ags potencialmente patógenos y reaccionen dando lugar a una hiperplasia muy marcada en las enfermedades respiratorias crónicas (Pabst y Binns 1994; Sánchez-Vizcaíno, 2006). Al contrario de lo que ocurre en otras especies, en el cerdo siempre se desarrolla el BALT, y su estructura y ubicación difieren en algunos aspectos. Así por ejemplo, las zonas donde se encuentran los linfocitos B y T no están tan claramente separadas entre sí como ocurre en otras especies (Delventhal y cols., 1992a). Algunos estudios revelan una presencia de BALT en el 33% de los cerdos sanos, entre el 80-100% de los animales SPF de 4 meses y en el 100% de los cerdos híbridos de cría convencional a las 11-13 semanas de edad (Liebler-Tenorio y Pabst, 2006). El 82% del BALT se localiza a nivel de los bronquiolos, un 10% en bronquiolos terminales y un 8% en los bronquios (Cho y Dee, 2006). En caso de infección del aparato respiratorio por algunos agentes patógenos, se produce un incremento significativo de la presencia del BALT en función del área del parénquima pulmonar analizado. Algunos autores describen un incremento significativo del BALT en casos de infección por Actinobacillus pleuropneumoniae, especialmente en inoculación vía oral y aerógena (Delventhal y cols., 1992b). En infecciones por Mycoplasma hyopneumoniae (Mh), la hiperplasia del BALT es el cambio más significativo (Livingston y cols., 1972). Además del BALT, existen otras áreas en la submucosa del tracto respiratorio donde se observa tejido linfoide, con estructura y función similar a la del BALT. Las tonsilas son agregados de tejido linfoide localizado en las vías respiratorias altas, donde se cruza con el aparato digestivo y se diferencia en tonsila del paladar blando y tonsila lingual (Liebler-Tenorio y Pabst, 2006). Mediante citometría de flujo se ha demostrado que las tonsilas presentan una cantidad importante de linfocitos B, tienen un número moderado de linfocitos αβ-T y bajo número de CD8+ y linfocitos T γδ en comparación a los linfonodos, el bazo y la sangre periférica (Yang y Parkhouse, 1996). Revisión bibliográfica: Aparato respiratorio del porcino (Mecanismos de defensa) 33 2.2.3.2 M ECANISMOS DE DEFENSA DEL PARÉNQUIMA PULMONAR ( CONDUCTOS Y SACOS ALVEOLARES )  Mecanismos de defensa inespecíficos • Componente humoral El líquido alveolar forma el componente humoral a nivel de los conductos y sacos alveolares. Su principal constituyente es el surfactante pulmonar, una película de fosfolípidos con una capa de polisacáridos proteicos que disminuyen la tensión en las superficies epiteliales. El surfactante no sólo facilita la respiración y previene el colapso pulmonar durante la expiración, sino que además modulan la respuesta inmune a nivel pulmonar (Pastva y cols., 2007; Haagsman y cols., 2008; Krejci, 2013). Presenta un grupo de proteínas que reciben el nombre de colectinas, éstas son la proteína surfactante (proteinsurfactant, SP) A (SP-A) y la proteína D (SP-D). Como colectinas, las SP-A y SP-D se unen y opsonizan virus, bacterias, alérgenos, y células apoptóticas, potencian la fagocitosis microbiana mediante la agregación de las bacterias y los virus, poseen efectos bactericidas directos y se unen a una gran variedad de receptores de citoquinas, para modular la acción de las células inmunes y la expresión de mediadores inflamatorios. Además, actúan como mediadores entre la inmunidad innata y adaptativa regulando la respuesta del hospedador. Aunque ambas colectinas pueden unirse a las células T e inhibir su proliferación, las SP-A pueden actuar también de forma indirecta al suprimir la maduración de las células dendríticas. Por otro lado, la SP-D facilita la captación y presentación de Ags. En conjunto, se ha demostrado que la acción combinada de ambas colectinas modula la inmunidad a nivel pulmonar, protegiendo a su vez de posibles respuestas inmunes exageradas que puedan llegar a producir daño en el parénquima, dificultando así el intercambio gaseoso (Pastva y cols., 2007). • Componente celular El componente celular de los mecanismos de defensa inespecífico está representada por una amplia red de macrófagos y células dendríticas. Éstos se clasifican en macrófagos alveolares pulmonares (pulmonary alveolar macrophages, PAMs), intersticiales y macrófagos alveolares intravasculares (pulmonary intravascular macrophages, PIMs). Macrófagos alveolares: Los macrófagos son células derivadas de la médula ósea que han migrado a la sangre, diferenciándose en monocitos sanguíneos, para posteriormente llegar hasta los distintos tejidos y convertirse en macrófagos. Así, los monocitos alcanzan el intersticio de los pulmones y se transforman en macrófagos que migran a la luz de los alveolos donde reciben el nombre de PAMs y son los encargados de neutralizar todas aquellas partículas extrañas que escapan del mecanismo de defensa mucociliar (Nicod, 1999; Sorensen y cols., 2006). Son células grandes, de alrededor de 15 µm de diámetro, que presentan gran cantidad de lisosomas muy ricos en enzimas hidrolíticas (lisozimas) y cuya función es, entre otras, actuar sobre los peptidoglicanos de la pared bacteriana. Mediante inmunohistoquímica (IHQ) es posible marcar esta enzima para determinar la presencia de macrófagos y neutrófilos (Álvarez y cols., 1997; Sánchez-Vizcaíno, 2006; Tizard, 2000). Se localizan sobre la superficie alveolar, quedando en contacto directo con las partículas de polvo y las bacterias inhaladas que han escapado al atrapamiento mucociliar en las porciones proximales de las vías respiratorias. Son continuamente eliminados y sustituidos. Muchos de ellos migran desde los alveolos hasta la superficie de los bronquios, y son transportados por el aparato mucociliar a través del sistema respiratorio superior hasta la faringe, en donde son deglutidos con la Revisión bibliográfica: Aparato respiratorio del porcino (Mecanismos de defensa) 34 saliva. Además se sabe que otros viajan nuevamente a través del parénquima y los vasos linfáticos hasta alcanzar los linfonodos bronquiales (Sibille y Reynolds, 1990; Nicod, 1999). Los PAMs tienen múltiples funciones que llevan a cabo a través de la liberación de mediadores químicos. Las partículas y microbios no patógenos son atrapados por fagocitosis y se eliminan en el flujo de moco o a través del sistema linfático. Los microorganismos patógenos son neutralizados con ayuda de lisozima, interferones, opsoninas, lactoferrinas, factores del complemento e inmunoglobulinas específicas presentes en el moco. Si el agente invasor no es neutralizado por los PAMs, se produce la inflamación. Los neutrófilos circulantes en la sangre acuden a los alveolos y ayudan a los macrófagos en la fagocitosis (López, 2009). En cerdos sanos, 85-90% de los elementos celulares presentes en el moco broncoalveolar son PAMs. Además encontramos linfocitos (5-8%) y neutrófilos (4-7%) (Jolie y cols., 2000; Krejci J, 2013). Estas células se pueden recolectar fácilmente mediante lavado broncoalveolar y las alteraciones en los valores absolutos, relativos y en la citomorfología son de gran valor diagnóstico en enfermedades respiratorias. Algunos agentes infecciosos, como Mh o el virus del Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSv), tienen a los PAMs como células diana. En la infección por Mh, suprime la función de los PAMs y producen un incremento en la concentración de los mediadores químicos de la inflamación en el líquido del lavado broncoalveolar, mientras que PRRSv se replica en estas células (Asai y cols., 1996; Mengeling y cols., 1996b; Pabst, 1996; Pijoan, 1996). El sistema de fagocitosis celular también compromete a los PIMs, que en el cerdo son particularmente numerosos a nivel pulmonar (Bertram, 1985; Ohgami y cols., 1989) y a los histiocitos con propiedades fagocíticas presentes en el tejido conectivo. La actividad de los fagocitos se ve altamente acelerada si los patógenos introducidos no son eliminados rápidamente o si se reconocen patógenos de infecciones anteriores. Se produce una respuesta inmune mediada por células, seguida por una producción local y sistémica de Acs o inmunoglobulinas específicas.  Mecanismos de defensa específicos • Componente humoral Está representado por los Acs presentes en el líquido alveolar y en los vasos pulmonares. Estos Acs son principalmente inmunoglobulinas del tipo IgG. La mayor parte de estos Acs se producen localmente en el tejido pulmonar sano, y solo una pequeña proporción penetran de forma pasiva a través de la barrera hematogaseosa (Charley y Corthier, 1977; Morgan y cols., 1980). Esta proporción se incrementa de forma significativa cuando tiene lugar una inflamación pulmonar (Krejci y cols., 2005). La inducción de una respuesta inmune rápida, limitada en el tiempo y en el espacio, y lo suficientemente intensa es el mecanismo de defensa más deseable. Además de las IgG, en el parénquima pulmonar también se presentan Acs de tipo IgA, aunque en menor medida, según Bradley y cols. en 1976, quienes encontraron agregados de células plasmáticas productoras de IgAs relativamente numerosas en el intersticio pulmonar (Bradley y cols., 1976a). Revisión bibliográfica: Aparato respiratorio del porcino (Mecanismos de defensa) 35 • Componente celular El componente celular de los mecanismos de defensa específicos a nivel alveolar está representado principalmente por linfocitos T (Krejci, 2013). Provienen de la médula ósea a partir de sus precursores hematopoyéticos, maduran en el timo y luego migran hasta el paracortex de los nódulos linfoides, la vaina linfoide periarteriolar del bazo, áreas interfoliculares de las placas de Peyer y áreas parafoliculares del tejido linfoide asociado al intestino y BALT, lugares donde se acumulan. Son los linfocitos predominantes (80% en sangre periférica) y son los responsables de los mecanismos de inmunidad celular. A nivel pulmonar estos linfocitos se pueden clasificar según su localización en: linfocitos intersticiales, intra-alveolares e intravasculares (Pabst, 1996). Además existe una población de linfocitos que no son T ni B de gran importancia en la respuesta inmune natural o innata, son las células NK. Probablemente comparten el origen celular con los linfocitos T pero no sufren el procesamiento tímico, se encuentran en todos los tejidos y son escasos en sangre (Tizard, 2000). En lavados broncoalveolares el recuento de linfocitos T a nivel alveolar es mayor que el de linfocitos B (80% vs 5%) y de células NK (10-15%). A su vez, dentro de los linfocitos T, la proporción de linfocitos T CD4+ es mayor que la de CD8+ (50% vs 30%) (Nicod, 1999) 2.2.4 R ESPUESTA A LA INJURIA EN EL APARATO RESPIRATORIO 2.2.4.1 I NJURIA Y RESPUESTA BRONQUIAL Como se comentó anteriormente, la mucosa bronquial está expuesta a una gran variedad de agentes químicos y biológicos. La superficie del epitelio bronquial está protegida por una fina capa de moco producido por las células caliciformes y las glándulas bronquiales. Este moco absorbe y neutraliza muchos de los agentes químicos comúnmente inhalados y también actúan como barrera física atrapando e impidiendo adherencia de agentes infecciosos como bacterias, micoplasmas o agentes víricos. Tanto las partículas como los gases atrapados en el moco son expulsados rápidamente al exterior mediante el constante movimiento de los cilios. Cuando tiene lugar un daño agudo del epitelio bronquial, el resultado puede ser degeneración, desprendimiento y exfoliación de las células ciliadas hacia la luz bronquial (López, 2006). En condiciones normales, la reparación de la mucosa bronquial en respuesta al daño agudo se lleva a cabo en cinco fases (López, 2009): Ilas células viables presentes en los bordes de la lesión migran a lo largo de la membrana basal para cubrir rápidamente esta zona. Histológicamente, se observa un epitelio aplanado cubriendo parte de la membrana basal. IIlas células basales y las células secretoras no ciliadas son las “células madres” encargadas de restituir a las células epiteliales dañadas. Estas células entran en mitosis y las células hijas aún sin diferenciar migran a través de la membrana basal hasta la zona lesionada del epitelio. Histológicamente en esta zona de restitución observamos figuras mitóticas en la mucosa bronquial en los bordes de lesión (Kim y cols., 2005). IIIlas células hijas o preciliares maduran y adoptan una forma cuboidal y se disponen en la pared bronquial para diferenciarse más tarde en células ciliadas o en caliciformes. Revisión bibliográfica: Complejo de enfermedades respiratorias porcinas (PRDC) 42 microorganismos, siendo las combinaciones más frecuentes PRRSv ó SIv asociado con algún agente bacteriano o vírico. En el caso de PRRSv, las combinaciones más frecuentes fueron: PRRSv-P multocida (10,4%), PRRSv-Mh (7%), PRRSv-App (6,2%), PRRSv-H. parasuis (6,1%) y PRRSv-PCV2 (2,3%). Por su parte SIv apareció en combinación con P multocida (5,2%), Mh (4,3%), PRRSv (3,8%) y PCV2 (1,9%), aislándose con mayor frecuencia el serotipo H3N2 (50,1%), seguido del H1N1 (47,8%) y H1N2 (1,7%) (Choi y cols., 2003). En estudios serológicos realizados en España entre 1997 y 2000, se describió la presencia de PRRSv mediante RT-PCR en un 47,3% y seropositividad frente al PRRSv en un 56,6% en cerdos que presentaban síndrome multisistémico de adelgazamiento post destete (post-weaning multisystemic wasting syndrome PMWS) (Segalés y cols., 2002). Además, se demostró la presencia de PCV2 en estos animales afectados con PMWS (100% mediante ISH) y una seroprevalencia del 73,9%, aunque también se ha descrito su presencia en explotaciones no afectadas (Segalés y cols., 2002; Sibila y cols., 2004). En 2010, se determinó la seroprevalencia para PRRSv y SIv en 44 explotaciones localizadas en Barcelona, Girona, Lleida, Aragón y Murcia, observándose de forma combinada en el 85% de los reproductoras, 50% verracos y 80% en porcinos de engorde, así como la presencia concurrente de Acs para PCV2, PRRSv y SIV en el 89% de las reproductoras y 66% de los animales de cebo (López-Soria y cols., 2010). Calsamiglia y Pijoan (2000) observaron que entre el 24 y el 56% de las reproductoras presentaban Acs para Mh en un sistema de tres fases, mientras que Sibila y cols., (2007) encontraron prevalencias menores al 11% no detectándose diferencias entre los sistemas de producción. Por otra parte, se han asociado algunas prácticas de manejo, como todo dentro-todo fuera en las salas de parto, a menores seroprevalencias de Mh (Grosse Beilage y cols., 2009). A nivel nacional se ha demostrado la presencia de Acs frente SIv en el 83% de explotaciones (explotaciones que no aplicaban vacunación) y en el 76% de los animales evaluados (Maldonado y cols., 2006). En los últimos 20 años, la cría intensiva de porcino se ha venido desarrollando en recintos cerrados, quedando estos animales expuestos continuamente a diversos contaminantes vehiculados por el aire, como el polvo, gases tóxicos, micotoxinas y endotoxinas que conducen a múltiples enfermedades respiratorias (Sorensen y cols., 2006). Sin embargo, en los animales criados al aire libre no parecen haberse resuelto estos problemas (Cabaret 2003; Risco y cols., 2015). Uno de los principales factores que se deben tener en cuenta en el CNC es la diversidad de la estructura de sus explotaciones, encontrándonos un amplio abanico que va desde explotaciones de carácter reducido o familiar, en ocasiones con unas instalaciones muy deficiente, hasta núcleos de producción más amplios y con un mejor diseño y manejo. Esta diversidad de la estructura de las explotaciones, con presencia de numerosas explotaciones de muy pequeño tamaño se traduce en diversidad de programas sanitarios y en la mayoría de las ocasiones los ganaderos no realizan un programa preventivo de vacunación a sus animales frente a ninguna enfermedad. Numerosos autores han intentado determinar la seroprevalencia frente a varios de los agentes involucrados en el PRDC (Mh, PRRSv y PCV2) en animales criados al aire libre como el jabalí presente fuera (Corn y cols., 2009; Baker y cols., 2011; Baroch y cols., 2015) y dentro de Europa (Vengust y cols., 2006; Reiner y cols., 2009; Hälli y cols., 2012; Hammer y cols., 2012; Marinou y cols., 2015; Stephenson y cols., 2015), incluida España (Vicente y cols., 2002; Ruiz-Fons y cols., 2006; Closa-Sebastià y cols., 2011; Boadella y cols., 2012), así como el cerdo ibérico criado en España. Estos animales podrían emplearse como modelos para el CNC, atendiendo a que también presentan una elevada rusticidad, encontrándose perfectamente adaptados a su entorno y que en algunos casos se crían en sistemas de producción en extensivo o semi-intensivo similares a los descritos para el CNC. En algunos de estos trabajos no fue posible la detección de varios agentes, aquellos en los que se observó seroprevalencia frente a varios agentes patógenos se resumen en la siguiente tabla: Tabla 1: Detección de varios agentes patógenos respiratorios en animales de vida libre (jabalí y cerdo ibérico). seroprevalencia realizados fuera de Europa (*) y en países europeos (**), incluid a Mh, PRRSv y PCV2. A GENTES PATÓGENOS DETECTADOS Mh / PRRSv / PCV2 Mh / PRRSv PRRSv / PCV2 2.3.3 P ATOGENIA Los mecanismos patogénicos del patógenos bacterianos y víricos primarios poseen sistema de defensa natural de las vías respiratorias y causar enfermedad por sí mismos. Algunos de los mecanismos mediante los cuales los agentes primarios alteran la defensa de las vías respiratorias incluyen (Ilustración 8)  daños en el epitelio ciliado de las vías respiratorias  alteración de la función de los macrófagos pulmonares  producción de adhesinas que pueden ser utilizadas por otras bacterias para unirse al epitelio respiratorio,  efectos inmuno moduladores. A demás, varios microorganismos pueden ejercer de manera conjunta su patogenia alterando las barreras de defensas y haciendo que las vías respiratorias sean susceptibles a la acción de otros organismos menos patógenos. Ilustración 8: Áreas y mecanismos de defensa que pueden verse afectados por los distintos agentes patógenos respiratorios. Traducido de Brockmeier Revisión bibliográfica: Complejo de enfermedades respiratorias p En algunos de estos trabajos no fue posible la detección de varios agentes, aquellos en los que se observó seroprevalencia frente a varios agentes patógenos se resumen en la siguiente tabla: Detección de varios agentes patógenos respiratorios en animales de vida libre (jabalí y cerdo ibérico). Europa (*) y en países europeos (**), incluid a España (***) para la detección de Ac R EFERENCIAS Baker y cols., 2011* Closa-Sebastià y cols., 2011*** Marinou y cols., 2015** Corn y cols., 2009* Stephenson y cols., 2015* Baroch y cols., 2015* Reiner y cols., 2009** Hammer y cols., 2012** Roic y cols., 2012** Boadella y cols., 2012*** Los mecanismos patogénicos del PRDC aún permanecen sin conocerse completamente. Los patógenos bacterianos y víricos primarios poseen factores de virulencia que les permiten superar el sistema de defensa natural de las vías respiratorias y causar enfermedad por sí mismos. Algunos de los mecanismos mediante los cuales los agentes primarios alteran la defensa de las (Ilustración 8) : daños en el epitelio ciliado de las vías respiratorias , alteración de la función de los macrófagos pulmonares , producción de adhesinas que pueden ser utilizadas por otras bacterias para unirse al moduladores. demás, varios microorganismos pueden ejercer de manera conjunta su patogenia alterando las barreras de defensas y haciendo que las vías respiratorias sean susceptibles a la acción de otros Áreas y mecanismos de defensa que pueden verse afectados por los distintos agentes patógenos Traducido de Brockmeier (2002). Complejo de enfermedades respiratorias p orcinas (PRDC) 43 En algunos de estos trabajos no fue posible la detección de varios agentes, aquellos en los que se observó seroprevalencia frente a varios agentes patógenos se resumen en la siguiente tabla: Detección de varios agentes patógenos respiratorios en animales de vida libre (jabalí y cerdo ibérico). Estudios de a España (***) para la detección de Ac s frente aún permanecen sin conocerse completamente. Los factores de virulencia que les permiten superar el sistema de defensa natural de las vías respiratorias y causar enfermedad por sí mismos. Algunos de los mecanismos mediante los cuales los agentes primarios alteran la defensa de las producción de adhesinas que pueden ser utilizadas por otras bacterias para unirse al demás, varios microorganismos pueden ejercer de manera conjunta su patogenia alterando las barreras de defensas y haciendo que las vías respiratorias sean susceptibles a la acción de otros Áreas y mecanismos de defensa que pueden verse afectados por los distintos agentes patógenos Revisión bibliográfica: Complejo de enfermedades respiratorias porcinas (PRDC) 44 Es importante recordar que la interacción entre los distintos agentes patógenos juega un importante papel a la hora de determinar la severidad de la enfermedad respiratoria. Los distintos modelos de interacción han sido estudiados empleando protocolos de inoculación experimental. A continuación se recogen algunos ejemplos, detallando la patogenia de los mismos: En la interacción entre Mh y P multocida, se observó como al inocular con Mh y posteriormente con P. multocida, las lesiones producidas por Mh se vieron potenciadas por P. multocida (Smith y cols., 1973; Ciprian y cols., 1988). El incremento de la susceptibilidad a P. multocida en cerdos infectados con Mh puede deberse a que Mh genera un proceso inflamatorio donde abunda la prostaglandina E2; prostaglandina que afecta la actividad de los polimorfonucleares, favoreciendo por tanto la proliferación de bacterias que pueden estar presentes en el aparato respiratorio (Asai y cols., 1996). En la interacción entre el PRRSv y App se observó como al inocular con PRRSv y posteriormente con App, las lesiones producidas por este último eran más severas, quedando rodeadas por tejido sano, en donde fue posible detectar macrófagos positivos a PRRSv. En contraposición, al inocular App y posteriormente PRRSv, no se apreciaron diferencias significativas en las lesiones presentes en los animales inoculados con ambos agentes y los inoculados únicamente con App (Pol y cols., 1997). En coinfecciones entre PRRSv y agentes bacterianos, PRRSv actúa como agente primario. Sin embargo, cuando se produce coinfección con un micoplasma, se ha evidenciado que éste último juega un importante papel como agente primario. Mh y PRRSv son dos de los agentes aislados con mayor frecuencia en animales con PRDC. Los mecanismos patogénicos de ambos son muy diferentes. Por una parte, Mh es un agente bacteriano extracelular, que ejercen su efecto patógeno adhiriéndose a los cilios de las células cilíndricas ciliadas del epitelio respiratorio dañando por tanto, el epitelio y el aparato mucociliar (DeBey y cols., 1992). Así, Mh induce una neumonía broncointersticial, localizada y crónica con proliferación de tejido linfoide peribronquial. En contraposición, PRRSv infecta y se replica en las células de la línea macrófagos/monocitos/células dendríticas; produciendo una neumonía intersticial difusa, aguda y severa (Rossow y cols., 1995; Halbur y cols., 1996b; Thanawongnuwech y cols., 1997). Como ya se comentó anteriormente, los PAMs y PIMs son las células primarias de replicación del PRRSv en el pulmón (Halbur y cols., 1996a; Thanawongnuwech y cols., 1997). La lisis de éstos, inducida por la infección por PRRSv, presumiblemente da como resultado una disminución de la capacidad de las vías respiratorias para defenderse de agentes patógenos respiratorios o sistémicos (Galina y cols., 1994). Además, Mh tiene un efecto inmunomodulador; estimula la proliferación de linfocitos, provocando una activación del sistema inmune y un reclutamiento de PAMs lo que contribuye, en caso de estar presente, a una mayor replicación del PRRSv, prolongando así la neumonía de origen viral (Thanawongnuwech y cols., 2001). En inoculaciones experimentales se han obtenido resultados muy diversos. Por un lado, Van Alstine y cols. (1996) reportaron que PRRSv no tenía efecto exacerbante en la coinfección con Mh al inocular Mh y posteriormente con PRRSv. Sin embargo, Thacker y cols. (1999), demostraron que, en cerdos de 6 semanas de edad inoculados con Mh y PRRSv, se vio potenciada la neumonía producida por éstos; manifestándose un incremento significativo de la clínica, las lesiones macroscópicas y microscópicas en los animales inoculados con ambos agentes en comparación con los inoculados sólo con uno de ellos. Revisión bibliográfica: Complejo de enfermedades respiratorias porcinas (PRDC) 45 Al inocular Mh y después PRRSv, la clínica y las lesiones inducidas por PRRSv, se vieron potenciadas, perdurando más en el tiempo en comparación con aquellos animales inoculados únicamente con PRRSv, en donde las lesiones se habían resuelto 4 semanas después de la inoculación. Por otro lado, se observó como al inocular primero PRRSv los cerdos desarrollaron antes las lesiones macroscópicas compatibles con Mh, pero no aumentó el porcentaje total de tejido pulmonar afectado; si bien, microscópicamente el daño inducido a nivel celular fue mayor, con lesiones más severas, mayor proliferación de tejido linfoide peribronquial y perivascular inducido por Mh y mayor grado de neumonía intersticial inducida por PRRSv; en comparación con las lesiones observadas en los animales inoculados con un único agente (Thacker y cols., 1999). La interacción entre Mh y PCV2 también ha sido estudiada. En infecciones únicas de PCV2 las lesiones microscópicas observadas con mayor frecuencia son depleción del tejido linfoide y linfadenitis granulomatosa en las que se puede apreciar la presencia de células gigantes multinucleadas e histiocitosis, así como cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos en los histiocitos infectados (Rosell y cols., 1999) (o ambas), así como la detección del Ags de PCV2 asociado a las lesiones linfoides (Sorden, 2000). Además produce una neumonía intersticial, hepatitis difusa y nefritis intersticial (Clark, 1997; Rosell y cols., 1999). Por su parte en infección por Mh, como ya se ha comentado anteriormente, las lesiones microscópicas fundamentalmente son proliferación o hiperplasia del tejido linfoide asociado a los bronquios, llegando esta a obliterar la luz de los bronquios. En estudios experimentales, se ha observado como en animales de 4 semanas de edad, al inocular Mh y luego PCV2, Mh potencia la severidad de las lesiones producidas por PCV2 en pulmón y linfonodos, presentándose una mayor depleción linfoide y linfadenitis granulomatosa en comparación con aquellos animales inoculados únicamente con PCV2. Además se detectó mediante inmunohistoquímica, la presencia de Ags de PCV2 en macrófagos y células dendríticas presentes en el tejido linfoide asociado a los bronquios, lesiones inducidas por Mh, lo que sugiere que este puede ser un lugar importante en la replicación de PCV2 en el pulmón (Opriessnig y cols., 2004). En la interacción entre Mh y SIv (Thacker y cols., 2001; Yazawa y cols., 2004), el SIv infecta únicamente a las células del epitelio respiratorio. Al inocular animales con Mh y posteriormente con SIv, se observó como Mh no alteró de forma significativa el curso de SIv; ya que, si bien al principio las lesiones macroscópicas (3-7 días post-inoculación) y las lesiones de neumonía (14 dpi) eran mayores en los animales inoculados con Mh y SIv, a los 21 dpi la neumonía inducida por SIV ya se había resuelto y los niveles de bronconeumonía producida por Mh en los animales inoculados con Mh y SIv eran similares a los inoculados únicamente con Mh. Ambos agentes comprometen el funcionamiento del aparato mucociliar y al epitelio respiratorio, lo que en condiciones de campo potenciaría el desarrollo de infecciones por otros patógenos respiratorios oportunistas (Thacker y cols., 2001). En otro estudio fue posible observar lesiones de color rojo a púrpura en los pulmones de todos los animales, siendo el porcentaje de parénquima pulmonar afectado mayor en aquellos animales inoculados con SIv y Mh, en comparación con aquellos inoculados únicamente con Mh. Microscópicamente, el daño en las células epiteliales bronquiales únicamente pudo ser observado en aquellos animales inoculados con ambos agentes (Yazawa y cols., 2004). Otra interacción observada con frecuencia es la producida entre PCV2 y PRRSv (Wellenberg y cols., 2003; Halbur y Opriesnig, 2004), produciéndose entre ellos una interacción de sinergismo (Harms y cols., 2001; Rovira y cols., 2002). PCV2, al igual que PRRSv, estimulan la producción de histiocitos y macrófagos dando lugar a una depleción linfocitaria en linfonodos y tonsila, acompañada probablemente de inmunosupresión (Krakowka y cols., 2002). La forma clínica más común de PCV2 es el Revisión bibliográfica: Complejo de enfermedades respiratorias porcinas (PRDC) 46 PMWS, observándose animales con disnea, linfadenomegalia generalizada, pérdida de peso, diarrea, entre otros sin acompañarse de fiebre y tos y afectando a animales más jóvenes (5-12 semanas) de lo que cabría esperar en los casos de PRDC (Harding y Clark, 1997; Allan y Ellis, 2000; Kim y cols., 2002). En Dinamarca, Vigre y cols. (2006), han establecido con mayor frecuencia la asociación de PCV2 con la forma americana de PRRSv, que con la forma europea. La interacción entre PRRSv y SIv también ha sido estudiada, observándose resultados muy diversos. Por un lado, Van Reeth (1996) observó, que al inocular cerdos con la cepa europea de PRRSv y SIv, éstos desarrollaron una clínica más severa, lo que hace pensar que PRRSv aumenta el impacto patogénico de ambos. Estos agentes muestran tropismo por células diferentes en el pulmón, de manera que, parecería lógico pensar que al existir mayor cantidad de tejido pulmonar dañado, la presentación clínica y el patrón lesional en este tipo de interacción serán más severos. Sin embargo, Brun y cols. (1994), no observaron un aumento de la clínica, pero sí una mayor seroconversión a SIv en el grupo inoculado con ambos agentes, en comparación con los inoculados únicamente con SIv. Por otro lado, Pol y cols. (1997), también obtuvieron resultados ambiguos; en los animales primoinfectados con PRRSv y luego con SIV no se agravó la infección pero se hizo más crónica, llegando a detectarse SIv, mediante técnicas de inmunoperoxidasa (immunoperoxidase monolayer assay, IPMA) en los PAMs de lavado pulmonar incluso a los 21 dpi. Sin embargo, al inocularse simultáneamente ambos agentes no se observó este efecto, detectándose el virus sólo hasta el día 14 pi. 2.3.4 C LÍNICA Al tratarse de una enfermedad compleja de carácter multietiológico, las manifestaciones clínicas son muy variadas y el periodo de incubación no está bien definido. A continuación se recoge de forma resumida, la clínica observada en los distintos estudios experimentales de los modelos de interacción comentados en el apartado de Patogenia. En la interacción entre Mh y P multocida, los animales inoculados con ambos agentes mostraron fiebre alta, tos severa y disnea, con tendencia a agravarse. Además, estos animales tuvieron un mayor consumo de pienso (60% más de comida que los inoculados con un único agente). Si bien los animales inoculados únicamente con Mh mostraron un pico de fiebre en el día 26 pi (39,6ºC), los animales inoculados con ambos agentes presentaron picos a los 24 dpi (39,3ºC) y a los 28 dpi (39,2ºC) y los inoculados únicamente con P multocida no presentaron fiebre. En el caso de la tos y disnea, se observó como los animales inoculados con Mh mostraron tos moderada hasta el día 28 con tendencia a resolverse, y disnea en periodos de esfuerzo, mientras que los inoculados con ambos agentes mostraron tos severa a partir del día 32 y disnea también en fases de reposo (Ciprian y cols., 1988). En estudios de interacción entre Mh y PRRSv, se observó como los animales inoculados con ambos patógenos mostraron clínica más severa. Así, entre los días 4-10 pi, estos animales mostraron leve disnea y/o taquipnea en reposo o moderada en estrés; mientras que en los inoculados únicamente con PRRSv la disnea y/o taquipnea fue leve e inexistente en los inoculados con Mh. Por otro lado, a los 14 dpi, aquellos animales inoculados con ambos agentes al mismo tiempo o primero con Mh mostraron una clínica más severa, presentando disnea y/o taquipnea moderada en reposo, en comparación con los inoculados primero con PRRSv donde la disnea y/o taquipnea fue moderada en periodos de estrés (Thacker y cols., 1999). Revisión bibliográfica: Complejo de enfermedades respiratorias porcinas (PRDC) 47 En la interacción entre Mh y PCV2, Opriessnig y cols. (2004), observaron como la presencia de Mh incrementó de forma significativa la severidad de la neumonía producida por PCV2, aumentando además la incidencia de PMWS. Los animales inoculados con ambos agentes mostraron una clínica respiratoria de leve a grave, caracterizada por un aumento significativo de la frecuencia respiratoria, letargia, tos y ocasionalmente estornudos en comparación con los animales inoculados únicamente con Mh. En los animales inoculados sólo con PCV2 no se observó tos. En el estudio de la interacción entre Mh y SIv, únicamente, se observó diferencia significativa en la presencia de tos, presentándose durante más días en los animales inoculados con ambos agentes en comparación con los animales inoculados solo con SIv o Mh. En relación a la ganancia de peso, esta fue significativamente menor en todos los grupos inoculados (SIv, Mh, Mh-SIv) en comparación con el grupo control. En cuanto a la fiebre, se observó que los animales inoculados con SIv (solo o con Mh) presentaron temperatura rectal ≥ 40ºC durante más tiempo que los animales del grupo control o los inoculados únicamente con Mh (Thacker y cols., 2001). En la interacción entre PRRSv y PCV2, los principales signos clínicos son la inactividad, anorexia y disnea, no observándose adelgazamiento (Harms y cols., 2002). En estudios experimentales, Rovira y cols. (2002) lograron reproducir la presentación de PMWS en animales de 5 semanas de edad mediante inoculación intranasal con PRRSv y PCV2, observando sintomatología de moderada a severa; con fiebre, retraso en el crecimiento y algunos casos de distrés respiratorio severo. La clínica fue mayor en los animales inoculados con PRRSv o PRRSv y PCV2, en comparación con el grupo control o los inoculados solo con PCV2. En otro estudio llevado a cabo por Harms y cols. (2001). Sin embargo, se observó sintomatología muy severa tanto en los animales inoculados con ambos agentes como en los inoculados únicamente con PCV2. 2.3.5 L ESIONES MACROSCÓPICAS Y MICROSCÓPICAS Las lesiones observadas en pulmón durante la necropsia de los animales con PRDC, son muy variables y dependen de los agentes involucrados en la presentación del complejo, siendo una combinación de los patrones morfológicos específicos provocados por cada patógeno. Debido al importante papel de los micoplasmas en la presentación de esta enfermedad, por lo general los cambios causados por los demás patógenos irán en función del daño inducidos por éstos (Schwartz, 2002). En infecciones puras de Mh los cambios macroscópicos principales son los de una bronconeumonía supurativa; caracterizada por consolidación craneoventral del parénquima pulmonar, principalmente en los lóbulos craneales y medio, adquiriendo una coloración que va del rojo-púrpura a rojo-marronáceo llegando a gris con áreas atelectásicas (Ross, 1999). Microscópicamente, se observa hiperplasia del BALT y neumonía broncointersticial caracterizada por la proliferación de neumocitos tipo II. Ocasionalmente, se observa edema alveolar y exudado de tipo purulento, con abundante presencia de infiltrado inflamatorio polimorfonuclear en vías aéreas y luz alveolar en las fases aguda de la infección. Las lesiones macroscópicas en las infecciones puras por SIV son similares a las de Mh (Schwartz, 2002; Thacker, B 2002), si bien microscópicamente en este caso observamos neumonía de tipo intersticial, con leve a moderado infiltrado linfocítico peribronquial y perivascular. Revisión bibliográfica: Complejo de enfermedades respiratorias porcinas (PRDC) 48 En infecciones puras causada por PRRSv, la superficie pulmonar aparece inicialmente con áreas oscuras de coloración marronácea y engrosamiento de los septos, lo que confiere a los pulmones mayor consistencia (neumonía intersticial). Microscópicamente, se observa hiperplasia e hipertrofia de los neumocitos tipo II, infiltrado inflamatorio en las paredes alveolares con células mononucleares y exudado en la luz alveolar constituido por un infiltrado inflamatorio mixto (Rossow y cols., 1995). En el caso de PCV2, las lesiones macroscópicas más características son linfadenomegalia generalizada y ausencia de colapso pulmonar, de consistencia firme y elástica a la palpación y áreas con una coloración que va de rojo a marrón en los casos más severos. Microscópicamente, estas lesiones se corresponden con depleción linfoide con histiocitosis; observando en ocasiones, infiltrado de células gigantes multinucleadas en el tejido linfoide, así como la presencia de cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos en los macrófagos. En los pulmones es frecuente observar neumonía intersticial difusa con infiltrado linfohistiocítico en los casos leves e infiltrado de células sincitiales multinucleadas en los casos tardíos o severos, con descamación parcial o completa del epitelio respiratorio y presencia de bronquiolitis obliterante, entre otras (Clark, 1997; Rosell y cols., 1999). En la interacción entre Mh y agentes bacterianos como P multocida, Ciprian y cols. (1988), observaron lesiones macroscópicas más extensas (22-26% del parénquima pulmonar afectado, con presencia de adherencias pleurales), en comparación con los inoculados únicamente con Mh (4-17% de parénquima pulmonar afectado) o con P multocida (3,3%). Microscópicamente, las lesiones observadas en los animales inoculados únicamente con Mh fueron más proliferativas, mientras que en aquellos animales inoculados con ambos agentes las lesiones fueron más exudativas, hallazgo comúnmente observado en el caso de infecciones secundarias (Morrison y cols., 1985); demostrándose una vez más que P multocida se comporta como un agente infeccioso secundario (Ciprian y cols., 1988). En coinfecciones donde Mh interactúa con algún agente viral se observa cómo, en el caso de PRRSv o PCV2, Mh potencia e incrementa la severidad de la neumonía intersticial inducida por éstos (Thacker y cols., 1999; Opriessnig y cols., 2004). Sin embargo, no ocurre lo mismo en el caso de la interacción entre Mh y SIv donde, si bien al principio de la infección las lesiones son mayores, éstas no se prolongan en el tiempo. Demostrándose por tanto que el grado de interacción entre Mh y un agente viral, variará en función de la naturaleza de este último (Thacker y cols., 2001). Así, en inoculaciones con Mh y PRRSv, la presencia de Mh potenció las lesiones de neumonía intersticial características de PRRSv. A los 28 dpi con PRRSv, se mantuvo un elevado porcentaje de parénquima pulmonar afectado de neumonía intersticial, siendo de un 42,9% en los animales inoculados con ambos patógenos al mismo tiempo y de 15,6% en los inoculados con Mh y luego con PRRSv, en comparación con los inoculados solo con PRRSv (0,8%). A los 10 dpi, las lesiones de bronconeumonía supurativa características de Mh afectaron un mayor porcentaje de parénquima pulmonar (4,1%) en los animales inoculados con ambos agentes, aunque a los 28 dpi no se observó diferencia significativa en comparación con los infectados únicamente con Mh. Microscópicamente, se observó que, al inocular ambos agentes conjuntamente o primero PRRSv, se potencia el daño a nivel celular. A los 28 dpi, las lesiones de neumonía intersticial y neumonía broncointersticial inducidas por PRRSv y Mh respectivamente, fueron más severas en estos animales, observándose neumonía de moderada difusa a severa multifocal y proliferación de tejido linfoide peribronquial y perivascular muy severa, en comparación con las lesiones observadas en los animales Revisión bibliográfica: Complejo de enfermedades respiratorias porcinas (PRDC) 49 inoculados con un único agente o primero con Mh y luego con PRRSv, donde las lesiones fueron leve neumonía multifocal y leve a moderada proliferación de tejido linfoide peribronquial y perivascular (Thacker y cols., 1999). En el estudio de la interacción entre Mh y PCV2, Opriessnig y cols. (2004), observaron a los 21 dpi, un mayor porcentaje de parénquima pulmonar con lesiones (consolidación creaneoventral bien delimitadas compatibles con Mh) en los animales inoculados con ambos agente (22,53%), en comparación con los inoculados únicamente con Mh (12,6%) o PCV2 (0,45%). Si bien a los 35 dpi no existía diferencia significativa entre el grupo inoculado con Mh y PCV2 y los inoculados únicamente con Mh. Además, observaron una mayor linfadenomegalia (linfonodos inguinal superficial, mediastínicos, traqueobronquial y mesentéricos) en los animales inoculados con ambos agentes (3 veces el tamaño normal), en comparación con los inoculados únicamente por PCV2 (2 veces el tamaño normal). Microscópicamente, también observaron un incremento de la severidad de las lesiones a nivel pulmonar. Si bien, todos los grupos inoculados presentaron neumonía intersticial con hiperplasia e hipertrofia de neumocitos tipo II y engrosamiento de las paredes alveolares con infiltrado de macrófagos y linfocitos, estas lesiones fueron de leves a moderadas en los inoculados con PCV2 y de leves a severas en los inoculados con ambos agentes. Las lesiones compatibles con Mh (infiltrado linfohistiocítico peribronquial y perivascular con formación de nódulos, exudado en la luz alveolar e infiltrado de células linfohistiocíticas en la lámina propia de las vías aéreas) fueron de moderadas a severas en todos los grupos inoculados con Mh (Mh, Mh-PCV2), sin existir diferencia significativa entre ellos (Opriessnig y cols., 2004). Las lesiones microscópicas observadas en tejido linfoide también fueron significativamente mayores en los animales inoculados con ambos agentes, observándose moderada depleción linfoide y moderada inflamación histiocítica a granulomatosa, acompañada de una mayor detección de Ags virales mediante inmunohistoquímica (IHQ) en aquellos animales inoculados con ambos agentes (Opriessnig y cols., 2004). En la interacción entre Mh y SIv pareció haber una mínima interacción entre ambos agentes a nivel macroscópico y microscópico, ya que; si bien a los 14 dpi, en los animales inoculados con ambos agentes las lesiones macroscópicas de neumonia fueron más extensas (11,4% del parénquima pulmonar afectado vs 3,3% en los animales inoculados con Mh o SIV), ya a los 21 dpi no se observaron diferencias significativas entre los grupos inoculados con Mh (7,6%) o SIV (1,1%) y el grupo inoculado con ambos (4,6%), siendo muy similares las lesiones inducidas por uno u otro agente. Microscópicamente, tampoco se observaron diferencias notables en la severidad de las lesiones entre los animales inoculados con ambos agentes y los inoculados sólo con uno de ellos (Thacker y cols., 2001). En coinfecciones entre PCV2 y PRRSv, Harms y cols. (2001), observaron en pulmones de animales inoculados con ambos agentes a los 21 dpi, lesiones macroscópicas similares, pero más extensas (8085% de parénquima pulmonar afectado), que las observadas en animales inoculados sólo con PRRSv (2025%) o PCV2 (<5%). Los pulmones más afectados presentaban coloración púrpura, ausencia de colapso, consistencia firme y aspecto carnoso al corte. Revisión bibliográfica: Complejo de enfermedades respiratorias porcinas (PRDC) 50 Microscópicamente, los animales inoculados con ambos agentes presentaban neumonía intersticial severa con desarrollo de bronquiolitis necrotizante. Esta combinación no se observó en los animales inoculados únicamente con PRRSv o PCV2, los cuales presentaban leve neumonía intersticial o bronquiolitis necrotizante, respectivamente. Además, los autores observaron severa depleción linfoide, necrosis hepatocelular e infiltrado de macrófagos en hígado, linfonodos, bazo, piel, riñones, estómago, íleon, yeyuno, duodeno y colon en los animales inoculados con PRRSv y PCV2; lesiones que no se observaron en los animales inoculados únicamente con PCV2, sugiriendo que PRRSv potencia la enfermedad inducida por PCV2. Rovira y cols. (2002), demostraron que la infección por PRRSv incrementa la replicación de PCV2, al detectar mediante hibridación in situ, una mayor cantidad de ácido nucleico de PCV2 en las células macrofágicas, endoteliales y mioepiteliales de los animales inoculados con ambos agentes que en los inoculados únicamente con PCV2. 2.3.6 D IAGNÓSTICO Debido a la clínica inespecífica y a los distintos patrones lesionales macroscópicos observados, el diagnóstico de los agentes etiológicos involucrados en la presentación del PRDC requiere de técnicas laboratoriales. El diagnóstico debe iniciarse con la recogida de todos los datos clínicos y epidemiológicos posible de la explotación, edad, origen de los animales, inmunidad de los reproductores, plan de vacunación, morbilidad y mortalidad, entre otros (Honnold, 1999). Los signos clínicos no pueden interpretarse, de manera independiente, con fines diagnósticos ya que, como se ha explicado anteriormente éstos son muy variables e inespecíficos debido a la naturaleza multietiológica de esta enfermedad. El diagnóstico macroscópico constituye la principal prueba diagnóstica no laboratorial. Los hallazgos macroscópicos obtenidos durante las necropsias, así como la inspección en matadero, son de gran utilidad en el diagnóstico de esta enfermedad (Bochev, 2008). El número de necropsias realizadas o de pulmones inspeccionados en matadero debe ser lo más representativo posible, en función del tamaño de la explotación y la prevalencia de la enfermedad, para poder comparar de resultados obtenidos (Thacker, B 2002). Si más del 15% de los pulmones inspeccionados durante las necropsias o en la inspección de matadero están afectados, la probabilidad de que la explotación esté afectada por neumonía enzoótica es considerable. Las explotaciones libres de Mh, rara vez presentarán lesiones neumónicas en más del 1% de los pulmones, y aún así, estás son insignificantes (Motovski, 2004). 2.3.6.1 D IAGNÓSTICO LABORATORIAL Dependiendo del método de diagnóstico laboratorial empleado, éste nos permitirá aislar y/o identificar a los agentes etiológicos involucrados en la presentación del complejo. En este caso se habla de métodos directos (cultivo, IHQ, PCR, etc). Por el contrario, los métodos empleados para demostrar la presencia de Acs específicos anti-(agente), para conocer así el estado inmunitario general de la explotación reciben el nombre de métodos indirectos. La decisión de qué método debe utilizarse, se establece a partir de los datos epizootiológicos y/o anatomopatológicos. Revisión bibliográfica: Complejo de enfermedades respiratorias porcinas (PRDC) 51 Ambos métodos tienen sus ventajas e inconvenientes: Las principales limitaciones que poseen las técnicas directas es la representatividad ya que, por un lado la obtención de la muestra requiere del sacrificio del animal o su recogida en matadero y por otro la dificultad para testar un gran número de animales. Por estas razones, se debe disponer de técnicas indirectas o serológicas que permiten realizar el diagnóstico en un gran número de animales (Sorensen y cols., 2006). Para conocer el estatus sanitario de una explotación de ganado porcino, los test utilizados con mayor frecuencia son los test serológicos. Las técnicas indirectas más utilizadas son: el enzimoinmunoensayo (ELISA) y menos frecuentemente, la inmunofluorescencia, IPMA y la prueba de hemaglutinación indirecta (HAI) (Bochev, 2008). Las serologías mediante ELISA se pueden realizar de forma simultánea a grupos de animales de diferentes edades, en sistemas de producción de ciclo cerrado, calculando el tamaño muestral en función del tamaño de la explotación, independientemente de su estado de salud (serología transversal) o bien, a un grupo de animales durante todo el ciclo productivo (seroperfil), definiendo su estado sanitario a través del tiempo, y aportando información fiable sobre la protección del individuo por inmunidad maternal o sobre una fase de infección, así como el tiempo que tarda en producirse la seroconversión. Conocer estos parámetros permite diseñar una estrategia de control y prevención de la enfermedad para cada explotación. Sin embargo, la toma de muestras para el estudio de poblaciones porcinas se sigue realizando a nivel individual, lo que supone un hándicap en la medida de la representatividad de la población, así como un elevado coste en diagnóstico y trabajo. Las muestras obtenidas de animales vivos pueden ser secreción nasal, hisopos traqueales, lavados traqueobronquiales, suero sanguíneo y calostro (Bochev, 2008). Otra muestra empleada para la detección de agentes patógenos o Acs desarrollados frente a estos es la saliva (Prickett y Zimmerman., 2010) (Tabla 2). Durante los últimos años ha aumentado el interés por desarrollar nuevas técnicas de muestreo y diagnóstico más rápidas, sencillas y menos costosas. Surge así, el empleo de fluidos orales obtenidos mediante cuerdas para la detección de Ags y Acs específicos frente a patógenos que forman parte del PRDC (Tabla 2). Estos Acs pueden ser producidos en tejidos linfoides asociados a la mucosa oral como la tonsila o pueden alcanzar la mucosa oral desde el sistema circulatorio. Diversos estudios experimentales han demostrado que el 75% de la población de un corral pueden ser muestreadas si la cuerda empleada para la toma de muestra de saliva se deja suspendida durante 20 min, aumentando hasta un 90% si durante el mismo tiempo suspendemos 2 cuerdas (Romagosa, 2011). Revisión bibliográfica: Principales agentes etiológicos involucrados en el PRDC. Mycoplasma hyopneumoniae 58  Factores de riesgo en la presentación de la enfermedad. En estudios de NEP, se ha demostrado que el riesgo de infección por Mh está asociado a numerosos factores de riesgo (Vangroenweghe y cols., 2015), tales como la distancia con explotaciones no SPF, el tamaño de las explotaciones, la densidad de la población porcina en áreas específicas (Stärk y cols., 1992), la estación en la cual se inicie el ciclo productivo, la presencia de reproductores en la explotación, la ausencia de programas de vacunación frente a Mh (Ostanello y cols., 2007), el periodo del año (temperatura y horas de luz) (Dee y cols., 2010) y los parámetros climatológicos (temperatura y precipitaciones medias diaria) (Segalés y cols., 2012), entre otros. La presencia de Mh está restringida al tracto respiratorio del cerdo, principalmente en pulmón, aislándose muy rara vez de la cavidad nasal. Por tanto, y debido a este neumotropismo, las condiciones que afectan directamente al aparato respiratorio influirán en el desarrollo de la enfermedad. En diversas experiencias los animales de 4 semanas de edad que no estuvieron sometidos a un medio ambiente muy desfavorable, incluyendo ventilación por debajo del mínimo (0,5 cfm/cerdo), temperaturas fluctuantes (15-27ºC), corrientes de aire frío (250 mt/min-13ºC) y mezcla continua de animales, no mostraron diferencias en su estado de salud con respecto a los controles, sometidos a un ambiente convencional, mostrando una ganancia de peso y conversión diarios semejantes (Noyes y cols., 1986; Noyes y cols., 1988). Clark y cols. (1993), tampoco encontraron diferencias lesionales, de seroconversión, ganancia o conversión alimenticia entre los lotes experimentales y control al investigar el efecto del medio ambiente en animales infectados con Mh usando temperaturas fluctuantes (18,321ºC) y amoníaco como agentes estresantes. Por otra parte, cuando Straw (1991) comparó animales con condiciones ambientales óptimas y desfavorables, observó una mayor ganancia (765 gr vs 639 gr) y conversión (3,31 vs 4,41) en las primeras. Sorprendentemente, no hubo diferencias en cuanto a las lesiones neumónicas al sacrificio. Debe señalarse, que la mayor diferencia en este trabajo fue el espacio por cerdo (1,11 m2/cerdo vs 0,52 m2/cerdo) y el número de cerdos por corral (5 vs 25) sugiriendo que estos factores podrían haber sido los responsables de las diferencias en la producción. Los parámetros climáticos que se evalúan en los diferentes trabajos, no tienen un efecto "per se", sino que son consecuencia del manejo. Así, la ventilación está asociada con los gases y éstos con la higiene, al igual que la humedad y el polvo y el microbismo. Un aumento en el flujo de aire no controlado provoca una disminución en la temperatura, humedad y gases (mayor en CO 2 que en amoníaco) e indica una elevación de polvillo-endotoxinas. Este ambiente seco favorece, a su vez, que el polvo se quede suspendido en el aire (Noyes y cols., 1986; Noyes y cols., 1988; Donham, 1991; Pijoan, 1994). Un estudio reciente, demuestra que las precipitaciones y la temperatura pueden tener un impacto significativo en la dinámica de la infección por Mh (Segalés y cols., 2012). En esta investigación, se demostró una asociación significativa (positiva) entre las precipitaciones semanales y la probabilidad de detectar Mh mediante mester-PCR y una asociación también significativa (negativa) entre las temperaturas semanales y el porcentaje de animales seropositivos. Otros factores predisponentes que influyen en la incidencia de la enfermedad, son todas aquellas situaciones de estrés, tales como el sistema de producción, momento del parto, destete, deficiencias nutricionales en el crecimiento y acabado, así como todas aquellas que puedan provocar una disminución o agotamiento de las defensas del animal. Revisión bibliográfica: Principales agentes etiológicos involucrados en el PRDC. Mycoplasma hyopneumoniae 59 2.4.1.3 P ATOGENIA Mh es un patógeno específico del hospedador que solo afecta al cerdo, la patogenia y especialmente los posibles factores de virulencia aún no se conocen totalmente (Simionatto y cols., 2013). El desarrollo o no de la enfermedad dependerá, en primer lugar, del micoplasma implicado y en segundo lugar, de la especie animal afectada así como del estado del animal en el momento de la exposición. - Factores dependientes de los micoplasmas: • Exposición. • Unión o adhesión de los micoplasmas a la superficie epitelial. • Producción de toxinas. - Factores dependientes del hospedador. • Interacción con el sistema defensivo primario (macrófagos y neutrófilos) y con el sistema inmune (celular y humoral) del hospedador. • Inducción de factores que esquivan la respuesta del organismo como son la síntesis de cápsulas, la inmunosupresión y la producción o adquisición de Ags del hospedador. • Inducción de una respuesta inmune específica. Según Gourlay y Howard (1982), la patogenia de las micoplasmosis respiratorias se puede dividir en las siguientes etapas y este modelo se ha tomado para desarrollar la patogenia de Mh en la NEP. El punto central sobre el que se orienta la mayoría de los estudios de patogenia es la interacción entre el micoplasma y la membrana citoplasmática de las células epiteliales de las vías respiratorias. Mh es un microorganismo extracelular cuya presencia sobre la mucosa del aparato respiratorio disminuye en el curso de la enfermedad, llegando prácticamente a desaparecer en las fases más avanzadas de la misma (Kobisch y Friis, 1996). Mh puede infectar a los animales por la inhalación de aerosoles contaminados que se producen durante los golpes de tos de otros animales infectados por Mh (Thacker y Minion, 2012). La infección se origina normalmente cuando los lechones que poseen Acs maternales son trasladados a las naves de engorde después del destete. Así, los lechones pasan inicialmente protegidos a estas naves, pero al perderlos quedan expuestos a estos aerosoles. Una vez que estos cerdos susceptibles se infectan con Mh, éste se adhiere al epitelio ciliado de las vías respiratorias. Con el tiempo, el agente causal se multiplica y avanza por el árbol bronquial. El grado de adhesión de Mh al epitelio respiratorio determina la patogenicidad de las diferentes cepas. La adhesión del micoplasma a los cilios de las células epiteliales provoca, por un lado, su pérdida, y por otro un efecto citopático sobre la célula lo que algunos autores atribuyen, no sólo a la capacidad de adhesión, sino también a una competencia metabólica entre el agente patógeno y la célula epitelial. La degeneración y necrosis celular consiguiente y su descamación provocan, como respuesta, una hiperplasia epitelial que intenta reparar la pérdida de las células (Kobisch y Friis, 1996). Se han descrito varios modelos in vitro para hacer posible el estudio de la colonización del epitelio del tracto respiratorio porcino (Jacques y cols., 1992; Zielinski y Ross, 1992; Zielinski y Ross, 1993; DeBey y Ross, 1994; Zhang y cols., 1995; Young y cols., 2000). Revisión bibliográfica: Principales agentes etiológicos involucrados en el PRDC. Mycoplasma hyopneumoniae 60 La adhesión del microorganismo al epitelio respiratorio, la estimulación de una respuesta inflamatoria prolongada, la supresión y modulación de una respuesta innata y adaptativa son pasos muy importantes en la colonización e infección de este patógeno (Thacker y Minion, 2012). En la adhesión del micoplasma a las células epiteliales ciliadas juegan un papel importante el material capsular y las fibrillas del micoplasma. La importancia de esta interacción micoplasma-célula es tal que una de las medidas preventivas que se pretenden alcanzar en el futuro es impedir, de algún modo, esa unión entre la membrana celular y la del micoplasma. El método exacto de adhesión de Mh a los cilios aún no se conoce totalmente. Se han descrito un elevado número de adhesinas expresadas en caldos de cultivos y en estudios in vivo en cerdos infectados experimentalmente (Simionatto y cols., 2013). La pérdida de los cilios del epitelio respiratorio compromete el sistema mucociliar, lo que favorece las infecciones secundarias por otros agentes infecciosos que no sólo agravan el cuadro neumónico, sino que incluso puede originar la muerte de los animales afectados. Se ha demostrado que Mh tiene un efecto modulador de la respuesta inmune, si bien no se conoce muy bien el efecto de esta modulación. Algunos autores sugieren que la respuesta inmune juega un papel importante en el desarrollo de las lesiones. Describen que los PAMs y linfocitos, estimulados por Mh, producen citoquinas proinflamatorias que son las responsables de las lesiones pulmonares y de la de hiperplasia del BALT (Rodríguez y cols., 2004). A medida que progresa la infección, aumenta la severidad de las lesiones y comienzan a aparecer los síntomas de la enfermedad. El tipo de consolidación pulmonar observado en la NEP refleja una distribución broncogénica que compromete la limpieza mucociliar. En realidad, la NEP es una neumonía broncointersticial, es decir, una bronconeumonía de características exudativa intersticial. Estas bronconeumonías exudativas se originan por infecciones que se producen por vías aéreas, y por lo tanto se inician con un cuadro bronconeumónico (afectación de lóbulos craneales) que dura apenas 24 a 48 horas, para transformarse rapidamente en neumonías intersticiales (o proliferativas). Los micoplasmas son, junto con algunos virus, los únicos agentes etiológicos que producen este tipo de neumonías broncointersticiales (Maes y cols., 1996). La hiperplasia del BALT que caracteriza lesionalmente a esta enfermedad, es atribuida a la conjunción de varios procesos. Por un lado, existe una respuesta celular inmune específica frente al Mh. Por otro, la membrana del Mh actúa como un mitógeno inespecífico para los linfocitos porcinos, sin que induzca una respuesta inmune específica frente a este agente patógeno. El significado biológico de este efecto mitogénico no ha sido aclarado. La necrosis de las células epiteliales también participa en la inducción de la hiperplasia del tejido linfoide. La estimulación de los linfocitos está acompañada de un "tráfico local" de estas células entre el pulmón y los ganglios mediastínicos, lo que explicaría la proliferación de tejido linfoide en estos ganglios, en los que no se detectan micoplasmas (Kobisch y Friis, 1996). Si bien, Mh es un patógeno primario de vías respiratorias, algunos estudios han descrito su aislamiento en otros órganos internos, sugiriendo una posible propagación del patógeno vía linfática o sanguínea. Éste ha sido aislado y se ha detectado su ADN en hígado, bazo y riñón de animales infectados experimentalmente y por contacto, sin embargo no se han visto involucrados en el desarrollo de la NEP (Marois y cols., 2007; Woolley y cols., 2012). Revisión bibliográfica: Principales agentes etiológicos involucrados en el PRDC. Mycoplasma hyopneumoniae 61 2.4.1.4 C LÍNICA La NEP tiene un periodo de incubación de 10 a 15 días. Sin embargo, el tiempo desde la primera entrada del microorganismo a una explotación hasta la primera presentación de los signos clínicos es muy variable. Es de destacar que, a pesar de ser detectado Mh en lechones de dos semanas de vida, las primeras manifestaciones clínicas se observan a partir de las cuatro semanas de edad, cuando los cerdos entran en las unidades de crecimiento-acabado y han perdido la protección materna (Kobisch y Friis, 1996). En condiciones naturales, la NEP es una enfermedad crónica que cursa con alta morbilidad y baja mortalidad. Las categorías más afectadas son los cerdos en etapa de crecimiento y engorde, dependiendo del estado inmune del animal y del manejo. En sistemas de producción todo dentro/todo fuera los síntomas pueden retrasarse hasta las 12-20 semanas de edad y afecta principalmente a animales de cebo en régimen de producción intensiva (Maes y cols., 1996). Los signos clínicos de la NEP son variables según la fase evolutiva de la enfermedad, pero siempre se observan en un grupo de animales y no de forma individual, la intensidad se exacerba por condiciones de estrés y/o por infecciones secundarias, pudiendo llegar estas complicaciones a originar la muerte de los animales afectados (Sorensen y cols., 1997). Los primeros signos clínicos que se observan en infecciones naturales son anorexia, respiración con soplo, hipertermia moderada e inapetencia, aunque en algunos casos la tos es posiblemente el único signo apreciable en las primeras fases de la enfermedad. Su aparición es lenta, comienza a partir de los 6 días postinfección, con un pico a los 27 días y prácticamente desaparece a los dos meses (Cowan y van Buren, 1986; Sorensen y cols., 1997). En otros casos, la tos aparece en la fase crónica de la enfermedad y se hace entonces persistente. Se trata de una tos seca e improductiva, puede estar acompañada por estornudos aunque los movimientos respiratorios sean normales. Para identificar a los animales con toses es importante observarlos durante un largo periodo de tiempo y resulta especialmente característica cuando se mueven los animales tras un período de reposo. La cuantificación del número de cerdos con toses ha sido utilizado en diferentes protocolos clínicos, pudiendo alcanzar hasta un 30 y 70% de los animales sometidos a estudios, tales como: • Estudios de transmisión (Meyns y cols., 2006; Marois y cols., 2007). • Estudios de patogenia (Morris y cols., 1995a; Vicca y cols., 2003). • Estudios de eficacia de las vacunas frente a Mh en condiciones de campo (Maes y cols., 1996; Moreau y cols., 2004). • Estudios con inoculaciones experimentales (Thacker y cols., 2000). Según evoluciona a su forma crónica los signos van desapareciendo, primero la hipertemia y en algunos casos la tos, observándose signos de retraso en el crecimiento, pelaje hirsuto y opaco con disminución de los índices de conversión alimenticia, pudiendo éstos ser los únicos indicadores de presencia de NEP (Dungworth, 1993). Revisión bibliográfica: Principales agentes etiológicos involucrados en el PRDC. Mycoplasma hyopneumoniae 62 La NEP se puede encontrar asociada a bacterias y/o virus que modifican la sintomatología. En estos casos, la tos es continua e intensa y puede estar acompañada de estornudos y descarga nasal, la respiración es forzada y jadeante, y los movimientos respiratorios son dificultosos. Los animales presentan decaimiento y fiebre alta, y hasta un 10% de los animales afectados pueden morir, particularmente cuando no se instaura el tratamiento adecuado (Amass y cols., 1994). Otros signos clínicos relacionados con la infección de Mh son poco frecuentes, aunque algunos trabajos hacen referencia, en inoculaciones con cepas de campo, a artritis, cojera y lesiones serofibrinosas relacionados con la virulencia de las cepas utilizadas (Lloyd y cols., 1989; Kobisch y Friis, 1996). 2.4.1.5 L ESIONES MACROSCÓPICAS Y MICROSCÓPICAS  Lesiones Macroscópicas. Las lesiones de la NEP varían al igual que los signos clínicos según la fase de la enfermedad y las posibles complicaciones secundarias en el momento de la inspección. Los cerdos desarrollan lesiones pulmonares evidentes a partir de los 7 a los 10 días después de la infección. En las fases iniciales (14 a 28 dpi) las lesiones más características están constituidas por áreas de consolidación de color rojo-violáceo del parénquima, de consistencia firme, carnosa y húmeda a la palpación, localizadas en los lóbulos craneales, medios, intermedio y porción craneal de los caudales, pudiendo estar delimitado del tejido pulmonar normal por áreas enfisematosas (Strasser y cols., 1992; Sorensen y cols., 1997). Al corte se puede observar un exudado catarro-purulento en la luz de los bronquios. Según evolucione la lesión, con o sin complicaciones secundarias bacterianas y/o virales el patrón macroscópico puede variar (Lium y Falk, 1991; Dungworth, 1993). En su forma crónica, el color varía a grisáceo, observándose además nódulos blanquecinos debidos a la hiperplasia del BALT en el centro de los lobulillos atelectásicos, acompañados de estrías blanquecinas dentro de las zonas afectadas. Según Strasser y cols. (1992) y Sorensen y cols. (1997), el porcentaje de lesión por lóbulo disminuye hacia el día 57 pi, afectando únicamente a los lóbulos medios, apareciendo completamente resueltas el día 85 pi. Como ya se comentó en el PRDC, dependiendo de la bacteria con la cual esté complicada, se puede observar una bronconeumonía supurativa, áreas de necrosis, formación de abscesos, pleuritis serofibrinosa o fibrinosa, que tienden a formar adherencias entre lóbulos pulmonares y la pared costal. En casos de complicaciones virales podemos encontrar lesiones de tipo predominantemente intersticial, pudiendo enmascarar parte del patrón típico de la NEP (Lium y Falk, 1991; Wallgren y cols., 1994). Los linfonodos mediastínicos se encuentran aumentados de tamaño, relacionándose directamente el tamaño con la extensión de las lesiones neumónicas (Lium y Falk, 1991). El pulmón derecho resulta siempre más afectado que el izquierdo al poseer una distribución broncogénica más abundante (bronquio traqueal). Maes (1996) y Sorensen y cols. (1997), observaron una mayor prevalencia de las lesiones en los lóbulos craneal derecho, medio derecho y medio izquierdo y sobre el día 28 pi las lesiones en estos tres lóbulos fue del 96%, 98% y 98%, respectivamente.En otro estudio realizado por Andrada (2001), se determinó el porcentaje de lesión pulmonar compatible con NEP en pulmones inspeccionados en Argentina y España. El 55% de los pulmones inspeccionados en Revisión bibliográfica: Principales agentes etiológicos involucrados en el PRDC. Mycoplasma hyopneumoniae 63 Argentina presentaron algún grado de lesión compatible con NEP; con un 4,7% del volumen pulmonar total comprometido y presentando mayor afección el pulmón derecho (3%) que el izquierdo. Del mismo modo, en España, el 54% de los pulmones inspeccionados presentó lesiones compatible con NEP, estando igualmente el pulmón derecho (5,5%) más afectado que el izquierdo (2,3%).  Lesiones Microscópicas. En las fases iniciales de la enfermedad (primera semana pi) se presenta pérdida de cilios y exfoliación de células ciliadas en las vías aéreas e hiperplasia de las células caliciformes en bronquios y bronquiolos y glándulas submucosas. Este incremento de las células secretoras es el responsable de la presencia de exudado catarral en las vías aéreas. Ackermann y cols. (1991), describieron cambios del epitelio bronquiolar de cúbico a pseudoestratificado (metaplasia epitelial), utilizando marcadores para lectinas sobre animales infectados experimentalmente. Las tráqueas de animales infectados mostraron una ligera traqueítis, constituida por hiperplasia epitelial e infiltrado de células linfoplasmocitarias en la lámina propia. En el parénquima pulmonar, en esta primera fase, se observa una bronconeumonía catarral, con edema alveolar y pequeños acúmulos de neutrófilos y macrófagos en vías respiratorias y en alvéolos. El infiltrado de neutrófilos es sustituido por linfocitos y, a partir de los 15-20 días de la infección se observan acúmulos de células mononucleares engrosando los septos interalveolares, momento en el que el patrón histológico va definiendo una neumonía broncointersticial con hiperplasia perivascular y peribronquial del BALT. Estos últimos, se corresponden con los nódulos blanquecinos descritos en las lesiones macroscópicas (Sorensen y cols., 1997). En el proceso evolutivo de la lesión hacia su forma crónica, las lesiones microscópicas se manifiestan por una extensa proliferación del BALT, engrosamiento de los septos con infiltrado celular constituido por linfocitos y células plasmáticas, pudiendo proliferar el tejido conectivo que determinará la fibrosis pulmonar de la zona afectada. Además, la pared de los alvéolos se encuentra tapizada por células cúbicas (neumocitos tipo II) que han sustituido a los neumocitos tipo I (Dungworth, 1993). La hiperplasia del BALT, sin duda es la lesión más característica de la NEP (Nogueira y cols., 1980), y puede llegar a afectar la pared bronquial, infiltrando hasta la muscular de la mucosa del bronquio, con la consiguiente oclusión parcial de su luz. Livingston y cols. (1972), propusieron la siguiente clasificación semi-cuantitativa de las lesiones observadas en los pulmones de cerdos al sacrificio: Lesiones (+): Presencia de infiltrado inflamatorio peribronquial formando uno o más folículos linfoides a nivel de la submucosa pero sin penetrar en la capa muscular de la mucosa. Lesiones (++): Uno o más folículos linfoides que se extienden a través de la muscular de la mucosa, y escaso infiltrado inflamatorio, tanto a nivel septal como en luces bronquiales y alveolares (leucocitos polimorfonucleares neutrófilos). La pared alveolar está, por lo general, poco engrosada. Lesiones (+++): Hiperplasia linfoide perivascular y peribronquiolar con numerosas células septales y leucocitos polimorfonucleares neutrófilos en las luces alveolares. En las áreas afectadas, el bronquio contiene, generalmente, un gran número de leucocitos polimorfonucleares neutrófilos en la luz. Lesiones (++++): Hiperplasia linfoide perivascular y peribronquiolar masivas en áreas extensas del parénquima pulmonar. El infiltrado septal e intraluminal (macrófagos, leucocitos polimorfonucleares neutrófilos) es escaso y se puede encontrar edema alveolar en las áreas afectadas. Revisión bibliográfica: Principales agentes etiológicos involucrados en el PRDC. Mycoplasma hyopneumoniae 64 Otros autores proponen graduaciones similares describiendo como (0) la ausencia de lesión; (+) la presencia de moderado infiltrado inflamatorio difuso de linfocitos a nivel peribronquial, peribronquiolar y perivascular, incluyendo la lámina propia; (++) moderado incremento del infiltrado de linfocitos y/o la presencia de algunos folículos linfoides; (+++) marcado número de folículos linfoides y (++++) extenso número de folículos linfoides afectando a más de una sección del pulmón (Ross, 1999). 2.4.1.6 D IAGNÓSTICO El diagnóstico de las infecciones por micoplasmas pueden abordarse desde varios puntos de vista (Sibila y cols., 2009), incluyendo signos clínicos, inspección en matadero de los pulmones afectados y estudios serológicos de grupos de animales representativos (Fraile y cols., 2010; Meyns y cols., 2011), identificación directa del patógeno mediante cultivo bacteriológico (Marois y cols., 2007) o técnicas de PCR (Calsamiglia y cols., 1999; Marois y cols., 2010). Se han empleado numerosos tipos de muestras, incluidos hisopos nasales (Calsamiglia y Pijoan, 2000; Fano y cols., 2007; Villarreal y cols., 2010), raspados tonsilares (Fablet y cols., 2010) y lavados traqueobronquiales (Meyns y cols., 2004, 2006; Fablet y cols., 2010; Vranckx y cols., 2012). Recientemente se han desarrollado y validado el uso de hisopos traqueobronquiales (Fablet y cols., 2010). El principal signo clínico de NEP es la presencia de tos, que evoluciona de forma gradual desde la etapa de crecimiento hasta hacerse crónica en animales en la etapa de terminación. El diagnóstico clínico de la enfermedad se realiza cuando se observan en el grupo completo de animales y no de forma individual, sabiendo que es una enfermedad de presentación enzoótica asociada a las condiciones ambientales de la explotación. Existen co-infecciones con otros patógenos como Pasteurella multocida, Actinobacillus pleuroneumoniae, Mycoplasma hyorhinis, Streptococcus suis, Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica y Arcanobacterium pyogenes que inducen otros síntomas como fiebre, anorexia y dificultad respiratoria (Thacker, 2006). Tal y como se ha explicado en apartados anteriores, Mh está íntimamente involucrado en la patogénesis del PRDC, enfermedad que incluye a las bacterias citadas anteriormente, así como a virus tales como: PRRSv, PCV2, el virus de la enfermedad de Aujeszky, SIv y el PRCv. EL PRDC afecta a cerdos en terminación entre las 14 a 22 semanas de edad y se caracteriza por disminución en la tasa de crecimiento, conversión alimenticia, fiebre, tos y disnea (Dee, 1996). Por lo expuesto, se pone en evidencia la necesidad de utilizar diferentes técnicas de diagnóstico, para la obtención de una mayor información en los diferentes campos de estudio de la enfermedad.  Valoración en Matadero Durante muchos años, se han seguido una serie de criterios para valorar adecuadamente la cantidad de parénquima pulmonar comprometido en los procesos neumónicos en inspecciones en matadero (Tabla 4). Aún así, en varios países con o sin planes de vacunación, se emplea este método como herramienta para evaluar y correlacionar el porcentaje de compromiso pulmonar con los índices productivos de las explotaciones, así como la estimación de las respectivas prevalencias para las diferentes enfermedades respiratorias. Revisión bibliográfica: Principales agentes etiológicos involucrados en el PRDC. Mycoplasma hyopneumoniae 65 Con estos precedentes, no existe un método universal para la evaluación de la cantidad de pulmón que se encuentra afectado por la NEP; además, resulta difícil establecer una relación entre la extensión de las lesiones neumónicas y los parámetros de producción. Goodwin (1976), describe un protocolo de puntuación en el que las lesiones pulmonares se clasificaron asignándole una puntuación a cada lóbulo con parénquima afectado. Así, se puede obtener una puntuación que va desde 0 a 55 puntos, siendo este último valor, el máximo porcentaje de parénquima afectado en la neumonía enzoótica: Ninguno, 0; grado medio, 1-10; grado moderado, 1130; grado severo, 31-55. Otro método de puntuación muy difundido es el publicado por Morrison y cols., (1985), en el que los lóbulos craneal derecho, medio derecho, caudal derecho, intermedio o accesorio, craneal izquierdo, medio izquierdo, y caudal izquierdo ocupan el 11,9; 7,5; 30; 4,5; 7,1; 6,9 y 31,6% respectivamente, en el pulmón neumónico. Otro criterio utilizado por Jericho y cols. (1975), se basa en la consolidación del parénquima. Así, puntúa los pulmones en cuatro categorías: sin consolidación, del 0 al 5% de consolidación, del 5 al 10% y más del 10% de consolidación. Por otra parte, se evaluó la extensión de las neumonías basándose en una escala de seis puntos, siendo el 0 indicativo de la no existencia de lesiones macroscópicas y el 6 de lesiones muy severas. Un método similar descrito por Straw y cols. (1986), cuantifica para cada lóbulo caudal el valor del 25% del total del pulmón y cada uno de los lóbulos restantes representa el 10%. Estos autores consideran que por cada 10% de pulmón afectado de NEP se produce con una disminución del 3,3 al 5,3% en el promedio de ganancia diario de peso. Según Goodwin (1965), se podría tener un indicador del grado de neumonía calculando el predominio de pulmones afectados en el momento del sacrificio. Una explotación con el 30% de pulmones neumónicos estaría ligeramente afectada, con un 40-50% estaría afectada, del 50 al 70% sería moderado, del 70 al 85% severo y más del 85% muy severo. En relación a los diferentes patrones morfológicos y su distribución, Buttenschon (1989), propuso cinco patrones de neumonías en porcino: bronconeumonías, pleuroneumonías, bronconeumonías diseminadas secundariamente, neumonías verminosas y neumonías por diseminación hematógena. En el caso de las pleuritis, éstas han sido valoradas por Christensen (1998), teniendo en cuenta la adherencia de la pleura parietal y visceral, la adherencia entre los lóbulos pulmonares y la pleuritis sobre la superficie lobular sin adherencias. Cada presentación se evaluó independientemente para luego aplicar una transformación logarítmica, y obtener una escala unificada considerándose también los procesos agudos y/o en fase de resolución. Algunos autores han utilizado inoculaciones experimentales con Mh, aplicando una escala del 0 al 4 para cuantificar el parénquima pulmonar comprometido, correlacionándolo además con parámetros productivos, encontrándose diferencias en los resultados medidos tanto en inoculaciones experimentales como en infecciones naturales (Zimmermann y Ross, 1982). Revisión bibliográfica: Principales agentes etiológicos involucrados en el PRDC. Mycoplasma hyopneumoniae 66 Tabla 4: Resumen de los distintos criterios de puntuación de las lesiones macroscópicas empleados en la valoración en matadero. (D, derecho; I, izquierdo) Para contrastar las diferencias entre extensión de lesión, patrones morfológicos y parámetros productivos, Morrison y cols., (1986), propuso obtener datos individuales de producción para cada uno de los animales, evaluar cada pulmón y cada uno de sus lóbulos; siempre con un mismo operario. Los resultados procedentes de la inspección macroscópica, según el uso de distintos métodos y su ambigua correlación con los parámetros productivos, podría además estar influenciado por el momento y período del año en el que se hace la inspección: la estacionalidad. Así, por ejemplo, Morrison y cols. (1986), citan que existe una mayor incidencia de NEP al sacrificio en Inglaterra durante las inspecciones realizadas en primavera y primavera-verano. En Argentina, estudios realizados en sistemas al aire libre determinaron la prevalencia estacional de patologías respiratorias, observándose que las neumonías compatibles con NEP presentaron un incremento sostenido durante el período de mayo, junio, julio, noviembre, diciembre y enero. Estos datos indicarían una mayor incidencia de la enfermedad en los meses de otoño a invierno, verificándose en matadero en los meses de primavera-verano (Riart y cols., 1996). R EFERENCIA P UNTUACIÓN F ACTOR DE CORRECCIÓN : RELATIVO AL PESO DE CADA LÓBULO P UNT . MÁX . A PICAL M EDIO D IAFRAG Accesorio D I D I D I Jericho y cols., 1975 Consolidación del parénquima. Extensión 0-6 puntos. Sin consolidación; 0-5% de consolidación, 5-10% de consolidación; >10% de consolidación. No existencia de lesiones: 0; presencia de lesiones muy severas: 6. 55 Goodwin, 1976 0-55 puntos. Lóbulos con parénquima afectado Ninguno: 0; grado medio: 1-10; grado moderado: 11-30; grado severo: 31-55 Hannan y cols., 1982 1-5 puntos por lóbulo 5/7 5/7 5/7 5/7 5/19 5/19 5/8 35 Madec y Kobisch, 1982 1-4 puntos por lóbulo dependiendo del porcentaje de lóbulo afectado Sin lesión: 0; <25% de lóbulo afectado: 1; 25-49% de lóbulo afectado: 2; 50-74% de lóbulo afectado: 3; >75% de lóbulo afectado: 4 puntos. 28 Morrison y cols., 1985 Porcentaje de lóbulo afectado 11,9 7,1 7,5 6,9 30 31,6 4,5 100 Straw y cols., 1983, 1984, 1986 Porcentaje de lóbulo afectado. Factor de corrección. 10 10 10 10 25 25 10 100 Christensen y cols., 1999 Porcentaje de lóbulo afectado 7 4 15 9 35 25 5 100 P ATRÓN MORFOLÓGICO Y SU DISTRIBUCIÓN : Buttenschon 1989 5 patrones de Neumonías Bronconeumonías; pleuroneumonías; bronconeumonías diseminadas secundariamente; neumonías verminosas; neumonías por diseminación hematógena. P LEURITIS : Christensen, 1998 Adherencia de la pleura parietal y visceral; adherencia entre lóbulos pulmonares y pleuritis sobre la superficie lobular sin adherencia. E XPLOTACIÓN : Goodwin, 1965 Porcentaje de pulmones afectados en Sacrificio Ligeramente afectada: <30%; afectada: 30-50%; moderadamente afectada: 50-70%; Severamente afectada: 70-85%; muy severamente afectada: >85%. 100 Revisión bibliográfica: Principales agentes etiológicos involucrados en el PRDC. Mycoplasma hyopneumoniae 67  Diagnóstico laboratorial. El diagnóstico laboratorial y definitivo de la NEP se establece mediante el aislamiento e identificación de Mh, y/o en la identificación del agente en tejidos, así como la identificación de porciones específicas de su genoma mediante el uso de diferentes técnicas; técnicas que se denominan métodos directos. Por el contrario, las que intentan demostrar Acs específicos anti-micoplasmas, constituyen los métodos indirectos. La decisión de qué técnica debe utilizarse se establece a partir de los datos epizootiológicos y/o anatomopatológicos. Mh es uno de los micoplasmas más difíciles de cultivar, por ser extraordinariamente exigente en cuanto a sus requerimientos de crecimiento y, además, porque Mycoplasma hyorhinis, otro micoplasma que se encuentra habitualmente en el tracto respiratorio de los cerdos, crece más rápidamente que él. Para la identificación de Ags de Mh se pueden emplear técnicas inmunohistoquímicas (IHQ) que combinan métodos anatomopatológicos, inmunológicos y bioquímicos, con el objetivo de localizar componentes del microorganismo en tejidos infectados, mediante el empleo de Acs específicos y moléculas marcadoras. Igualmente, permite caracterizar poblaciones celulares que participan en la respuesta celular y humoral en distintas patologías respiratorias porcinas (Fernández y cols., 1989; Haines DM, 1993; Perfumo y cols., 1993; Halbur y cols., 1994; Perez y cols., 1994; Segales y cols., 1997a; Segales y cols., 1997b; Halburg, 1998; Kiupel y cols., 1998) . Los protocolos han ido evolucionando en función de los avances de nuevos productos, especialmente con el desarrollo e incorporación de los Acs monoclonales que le confieren una mayor especificidad (Quezada y cols., 1990; Quezada y cols., 1993; Liu y cols., 1998) . Conjuntamente la realización de la técnica utilizando el complejo Avidina-Biotina-Peroxidasa (ABP), ofrece grandes ventajas al aumentar notablemente la sensibilidad de la técnica, pudiendo ser de 20 a 40 veces más que la técnica PAP (Peroxidasa anti-peroxidasa). La primera demostración de Ags bacterianos en cortes por congelación la realizo Bruggmann y cols., (1977), Giger y cols., (1977), y sus resultados en cuanto a sensibilidad y especificidad fueron similares a los obtenidos mediante la técnica de inmunofluorescencia. Posteriormente, Doster y Chang Lin (1988) utilizaron Acs policlonales y la técnica de IPMA indirecta en tejido pulmonar infectado natural y experimentalmente, fijado e incluido en parafina. Los microorganismos identificados en los cortes fueron estructuras pleomórficas de 0,3 a 0,5 µm de diámetro, localizados en la superficie del epitelio respiratorio de bronquios y bronquiolos, en el citoplasma de macrófagos y en la luz de bronquios y bronquiolos. La IHQ permite al patólogo correlacionar la presencia de Ags de micoplasmas con las lesiones de NEP, mediante el empleo de Acs monoclonales y policlonales en muestras fijadas en formaldehídos e incluidas en parafina (Sarradell y cols., 2003; Rodríguez, 2004). La IFA directa (Kobisch y cols., 1978) e indirecta (Piffer y Ross, 1985) se han usado para la localización de Ags de Mh en pulmones de cerdo. Los resultados obtenidos mediante IFA han sido comparados con los obtenidos por PCR en muchos estudios de patogenia y transmisión (Sorensen y cols., 1997; Vicca y cols., 2003; Meyns y cols., 2006). Una IFA positiva se asocia a una fase aguda de la enfermedad, cuando la carga bacteriana es elevada, en comparación con la baja sensibilidad que muestra esta técnica en las fases más crónicas de la enfermedad, donde la carga de Mycoplasma es baja (Ross, 1999). Revisión bibliográfica: Principales agentes etiológicos involucrados en el PRDC. PRRSv 74 2.4.2.5 L ESIONES MACROSCÓPICAS Y MICROSCÓPICAS  Lesiones macroscópicas Las lesiones macroscópicas asociadas a la infección producidas por PRRSv varían ampliamente y puede depender de la cepa del virus aislado, de la genética del hospedador y de los factores estresantes (Halbur y cols., 1995a; Halbur y cols., 1995c; Kristensen, 1995; Rossow y cols., 1995). Las lesiones en pulmones pueden variar, siendo en algunos casos imperceptibles macroscópicamente hasta presentar una consolidación difusa y, frecuentemente, complicadas secundariamente por otros agentes bacterianos y/virales (Collins y cols., 1992; Done y cols., 1992; Hopper y cols., 1992; Halbur y cols., 1993b; Done y Paton, 1995; Halbur y cols., 1995b). Los linfonodos afectados, frecuentemente en cerdos jóvenes, presentan linfoadenomegalia (Ohlinger y cols., 1991; Rossow y cols., 1994b; Done y Paton, 1995; Halbur y cols., 1995a; Halbur y cols., 1995b; Rossow y cols., 1995).  Lesiones microscópicas Se observan con mayor frecuencia en pulmón y tejido linfoide. Las lesiones en pulmón se caracterizan por engrosamiento de los septos, necrosis de los alvéolos con pérdida de la estructura normal y presencia de macrófagos y de forma ocasional algunas células sincitiales, hipertrofia e hiperplasia de neumocitos tipo II de las paredes alveolares, hiperplasia del BALT e infiltrado linfoplasmocitario perivascular, tanto en casos de infecciones experimentales como naturales (Collins y cols., 1992; Done y cols., 1992; Halbur y cols., 1993b; Cooper y cols., 1995; Done y Paton, 1995; Halbur y cols., 1995b; Kubo y cols., 1995; Rossow y cols., 1995). Las lesiones en tejido linfoide se caracterizan por presentar hiperplasia del centro germinativo con necrosis y espacios quísticos con policariocitos (Collins y cols., 1992; Rossow y cols., 1994b; Cooper y cols., 1995; Halbur y cols., 1995a; Halbur y cols., 1995c; Rossow y cols., 1995). En condiciones de campo, las lesiones producidas por PRRSv en los pulmones, frecuentemente aparecen asociadas y en ocasiones enmascaradas por lesiones de origen bacteriano; en estos casos debemos tener en cuenta que la infección por el PRRSv además puede generar lesiones en otros tejidos, siendo de utilidad para el diagnóstico en caso de existir lesiones bacterianas concomitantes en el pulmón. Así, se ha encontrado lesiones en vasos sanguíneos y linfáticos (Collins y cols., 1990; Done y cols., 1992; Goovaerts y Visser, 1992; Halbur y cols., 1993b; Paul y cols., 1993; Stockhoff-Zurwieden y cols., 1993; Rossow y cols., 1995; Rossow y cols., 1996b); en corazón (Halbur y cols., 1993b; Rossow y cols., 1994b; Cooper y cols., 1995; Halbur y cols., 1995b; Kubo y cols., 1995; Rossow y cols., 1995; Rossow y cols., 1996b; Rossow y cols., 1999); en cerebro, aunque no suelen ser muy frecuentes (Collins y cols., 1992; Rossow y cols., 1994b; Halbur y cols., 1995b; Kubo y cols., 1995; Rossow y cols., 1995); en cornetes nasales, en fases tardías de la infección (Rossow y cols., 1994b; Halbur y cols., 1995b; Kubo y cols., 1995; Rossow y cols., 1995; Rossow y cols., 1996a); es muy raro observar nefritis (Rossow y cols., 1995; Rossow y cols., 1996a) y se han descrito algunos casos de hepatitis inespecíficas en infecciones producidas por la cepa europea del PRRSV (Pol y cols., 1991) y lesiones en la capa muscular del estómago en cerdos gnotobiótico y en condiciones de campo (Rossow y cols., 1995; Rossow y cols., 1999). Revisión bibliográfica: Principales agentes etiológicos involucrados en el PRDC. PRRSv 75 2.4.2.6 D IAGNÓSTICO El diagnóstico de una infección de PRRSv se basa en los signos clínicos, las lesiones macroscópicas y el examen histopatológico de las lesiones observadas (Pol y cols., 1991; Dea y cols., 1992; Botner y cols., 1994). Sin embargo, el diagnóstico definitivo requiere la detección de PRRSv o de Acs en los animales infectados mediante la realización de diversas técnicas laboratoriales directas o indirectas. En los casos donde no se presentan fallos reproductivos, el pulmón es el órgano diana para la replicación del virus, permaneciendo en los PAMs y PIMs hasta las 9 semanas después de la infección (Rossow y cols., 1995; Mengeling y cols., 1996b). Para el aislamiento del virus se pueden emplear numerosas muestras de cerdos con diferentes edades, débiles o con sintomatología respiratoria (Pol y cols., 1991). El pulmón, bazo, linfonodos y suero son muestras válidas para el aislamiento. Los pulmones, bazo, sangre cardiaca y fluidos torácicos de recién nacidos y fetos abortados también son adecuados. El virus puede ser aislado de pulmón, suero, plasma y células leucocitarias a partir de la 6-8 semanas post-infección (Pol y cols., 1991; Ohlinger y cols., 1992) y de tejidos congelados durante 2-4 años (Frey y cols., 1992). La primera IHQ para la detección del PRRSv fue descrita en 1993 y desde entonces se han ido publicando otros métodos como el empleo del complejo Streptavidina Biotina inmunoperoxidasa, la Inmuno-tinción de oro y plata (IGSS), la ISH o el uso de oro coloidal en la IHQ (Magar y cols., 1993; Halbur y cols., 1994; Larochelle R, 1995; Rossow y cols., 1996a; Larochelle y Magar, 1997). Las lesiones de neumonías producidas por PRRSv son las muestras de elección, para detectar Ag del virus (Rossow y cols., 1995; Rossow y cols., 1996a). No obstante, también se ha demostrado en otros tejidos, como tejido linfoide, corazón, cerebro, cornetes nasales, conductos deferentes, epidídimo, próstata, testículo y glándulas bulbouretrales (Halbur y cols., 1995b; Christopher-Hennings y cols., 1996; Rossow y cols., 1996a; Shin y cols., 1996). Una aportación metodológica realizada por Rossow (comunicación personal, 1998), quién observó que aquellos tejidos fijados en formaldehído al 10%, a partir de las 48h empiezan a perder Ags de PRRSv detectables. Para muestras congeladas, la inmunofluorescencia directa es el método de elección para la detección del virus en muestras de pulmón (Meulenberg y cols., 1995; Rossow y cols., 1995). La PCR y más concretamente, la RT-PCR constituye una herramienta válida para la detección del virus en muestras con reducida carga infectiva (Suarez y cols., 1994; Van Woensel y cols., 1994), pudiendo diferenciar la cepa americana de la europea (Mardassi y cols., 1994). Por otro lado, el análisis serológico es el método empleado para evaluar de forma indirecta la presencia de PRRSv en una explotación. Los test serológicos para PRRSv no permiten diferenciar Acs vacunal de Acs por infección en aquellas explotaciones en las que se emplean vacunas con virus vivos modificados (Groschup y cols., 1993; Mengeling y cols., 1996a; Cheon y cols., 1997; Albina y cols., 2000; Stankeviciu y cols., 2011). La técnica serológica empleada con mayor frecuencia es el ELISA (HerdChekPRRSV, IDDEX Laboratories Inc., Westbrook, ME) (Collins y cols., 1996), pudiendo detectar Acs antiPRRSv entre los 9-13 días post-infección. En la realización de técnicas de PCR, técnicas serológicas y otras se han empleado numerosos tipos de muestra entre los que cabría destacar suero sanguíneo, fluidos orales y jugos de carne (Molina y cols., 2008a, Prickett y cols., 2008 a y b; Fabisiak y cols., 2013; Kittawornrat y cols., 2014). Revisión bibliográfica: Principales agentes etiológicos involucrados en el PRDC. PCV2 76 2.4.3 C IRCOVIRUS P ORCINO TIPO 2 2.4.3.1 E TIOLOGÍA Perteneciente a la familia Circoviridae, junto con el género Gyrovirus (gyrus: circuito o anillo), el género Circovirus se subdivide a su vez en distintas especies, entre ellas Circovirus porcino (PCV); PCV1 (apatógena) y PCV2 (patógena para el cerdo) (Meehan y cols., 1997; Niagro y cols., 1998). Presentan una simetría icosahédrica y carecen de envoltura, con un genoma circular de cadena simple de entre 1,8 y 2,3 kb dispuesto en ambos sentidos. Fue descrito por primera vez por Tischer y cols. (1974), como contaminante en una línea celular de riñón de porcino (PK-15). En condiciones experimentales, este Circovirus aislado a partir del PK-15 no producía enfermedad en el cerdo (Tischer y cols., 1986; Allan y cols., 1995; Krakowka y cols., 2000). En los años 90, se asoció PCV a una enfermedad emergente, conocida con el nombre de síndrome multisistémico de adelgazamiento post destete (post-weaning multisystemic wasting syndrome, PMWS) (Allan y cols., 1998; Meehan y cols., 1998; Choi y Chae, 1999; Choi y cols., 2000; Kim y cols., 2002; Kim y cols., 2001; Pallares y cols., 2002). El análisis de la secuencia del PCV asociado al PMWS reveló diferencias genéticas significativas al compararlo con el PCV asociado al PK-15 (Ellis y cols., 1998; Hamel y cols., 1998; Meehan y cols., 1998; Morozov y cols., 1998; Allan y cols., 1999b), por ello PCV se dividió en: PCV2, patógeno para el cerdo asociado al PMWS y PCV1, apatógeno para el cerdo, presentando una homología entre ambas secuencias del 68-76%. En trabajos retrospectivos realizados en distintos países se ha identificado tanto PCV1 como PCV2, tal y como queda resumido en la siguiente tabla: Tabla 6: Identificación de PCV (PCV1/PCV2) en estudios retrospectivos. R EFERENCIA P ERÍODO P AÍS M UESTRA (T ÉCNICA ) PCV Magar y cols., 2000b 1985-1997 Canadá Sueros (IFA) PCV1/PCV2 Walker y cols., 2000 1973-1999 Irlanda del Norte Sueros PCV2 Sanchez y cols., 2001 1969 1970 2000 Bélgica Sueros matadero (IPMA) PCV2 Grierson y cols., 2004 1970-1995 1995-1997 Reino Unido Tejidos PCV2 Staebler y cols., 2005 1976-2001 Suiza Tejidos (IHQ) PCV2 Ramirez-Mendoza y cols., 2009 1972-2000 México Sueros (IPAM) PCV2 Rodriguez-Arrioja y cols., 2003 1985-1997 España Tejidos (ISH) Sueros (IPAM) PCV2 Revisión bibliográfica: Principales agentes etiológicos involucrados en el PRDC. PCV2 77 2.4.3.2 E PIDEMIOLOGÍA La transmisión de PCV2 puede ocurrir por contacto directo vía oronasal, fecal y urinaria (Magar y cols., 2000a; Bolin SR, 2001), considerándose la vía oronasal como la vía más frecuente de trasmisión de PCV2, en relación a los resultados obtenidos de numerosos estudios experimentales (Allan y cols., 1999a; Balasch y cols., 1999; Ellis y cols., 1999; Krakowka y cols., 2000; Krakowka y cols., 2001; Rovira y cols., 2002). Para intentar reproducir experimentalmente el PMWS, también se ha utilizado la inoculación intranasal y subcutánea con PCV2 (Pogranichnyy y cols., 2000; Bolin SR, 2001). La inoculación del material genético de PCV2 vía intramuscular, intraperitoneal o directamente en hígado o nódulos linfáticos de cerdos ha inducido infección y lesiones histopatológicas compatibles con PMWS (Fenaux y cols., 2002; Roca y cols., 2004). La trasmisión transplacentaria se ha reproducido (transmisión vertical) mediante la inoculación intranasal de PCV2 en reproductoras (Park y cols., 2005). Sin embargo, la frecuencia de la transmisión vertical en condiciones naturales es muy variable, existiendo muy pocos casos descritos en Europa (Pensaert y cols., 2004; Maldonado y cols., 2005), en contraposición con los datos recogidos en Corea, que demuestran la presencia de PCV2 en un 13% de los fetos abortados y lechones nacidos muertos (Kim y cols., 2004b). También se ha identificado la presencia de PCV2 en muestras de semen de cerdos inoculados experimentalmente (Larochelle y cols., 2002). En relación a la transmisión horizontal en infecciones naturales, los cerdos seroconvierten a PCV2 entre las 2-4 semanas de edad, (Larochelle y cols., 2003; Sibila y cols., 2004) indicando que la transmisión horizontal de PCV2 entre los cerdos es muy eficiente. Esta transmisión horizontal se ha demostrado también en condiciones experimentales al poner en contacto cerdos susceptibles con cerdos infectados (Albina y cols., 2001; Bolin SR, 2001). PCV2 ha sido detectado mediante PCR en cavidad nasal, tonsilas, secreciones bronquiales, heces y orina de cerdos afectados y no afectados de PMWS de forma natural (Calsamiglia y cols., 2004; Sibila y cols., 2004), así como de exudados nasal, rectal, urinario, salivar, ocular y tonsilar en cerdos infectados experimentalmente (Krakowka y cols., 2000; Bolin SR, 2001; Shibata y cols., 2003), y mediante ISH de cavidad nasal y tonsila pero sin llegar a determinar si esta carga viral se debe a una secreción del virus o a la presencia del mismo formando parte de la flora “habitual” (Segalés y cols., 2004). Estudios retrospectivos han detectado la infección por PCV en cerdos desde 1962 (Jacobsen y cols., 2009), aunque posiblemente haya estado presente en la población porcina desde mucho antes (Opriessnig y Langohr, 2013). PCV es un virus ubicuo en la población porcina. PCV1 se ha detectado en poblaciones de cerdos salvajes (jabalíes). Igualmente, PCV2 también es ubicuo y tanto el cerdo salvaje como el doméstico son hospedadores naturales (Segalés, 2012). En España se describe una seroprevalencia del 70% en cerdos híbridos (Rodríguez-Arrioja y cols., 2003). Numerosos estudios recogen la prevalencia de PCV2 en jabalíes de todo el mundo (Tabla 7). Revisión bibliográfica: Principales agentes etiológicos involucrados en el PRDC. PCV2 78 Tabla 7: Estudios de prevalencia de PCV2 realizados en animales salvajes y cerdo ibérico. Descrito en animales salvajes de vida libre(*) o criados en explotaciones(**), así como en el cerdo ibérico (***).†Caso clínico. LnB/LnMs/LnIS, linfonodos bronquial, mesentéricos e inguinal superficial. R EFERENCIA P AÍS P ERIODO DE ESTUDIO N º M UESTRA P REVALENCIA T ÉCNICA DIAGNÓSTICA Vicente y cols., 2004 España 2002-2003 656* 56* Suero Pulmón, Ln, Hígado, Bazo y/o Riñón 47,9% 1,8% +/+ 3,6% -/+ IPMA H&E/ISH Knell y cols., 2005 Alemania 2003-2004 238* Bazo 18,1% PCR Csagola y cols., 2006 Hungría 2002-2003 307* Riñón Bazo Hígado Lns 20,5% PCR Ruiz-Fons y cols., 2006 España 2000-2003 272* Suero 51,8% IPMA Lipej y cols., 2007 Croacia 2004 8*† LnMs 100% PCR Sedlak y cols., 2008 Republica Checa 1999-2005 134* Suero 43% IFI Corn y cols., 2009 Carolina (Norte y Sur) 2006-2007 120* 49* Suero 72% 59% ELISA (Synbiotics Europe) Petrini y cols., 2009 Italia 2006 16*† Pulmón, LnB y tonsila 100% 6,23% (1 LnB) PCR IHQ Reiner y cols., 2010 Alemania 2004-2007 349* vs 348~ LnB y LnMs, Tonsila, Bazo y Pulmón 0,3 vs 8,7% 63,1 vs 100% 45,4 vs 98,8% Clínica/HE/IHQ nPCR qPCR Baker y cols., 2011 Texas Oklahoma Arkansas Louisiana sd 50* Suero 42% ELISA (Synbiotics) ClosaSebastià y cols., 2011 España 2004-2007 271* Suero 64,6% IPMA Turcitu y cols., 2011 Rumanía 2008-2009 212* Bazo 43,68% PCR Fabisiak y cols., 2012 Polonia 2006-2008 312* Tonsila 75,6% RT-PCR Hammer y cols., 2012 Alemania 2008-2009 203* Suero TonsilaPulmón (26% IgG 2% IgM) (56,4% IgG) 50,7% (103) ELISA (IgG/IgM) (IgG) qPCR Roic y cols., 2012 Croacia 2005-2006 2009-2010 359* 197* Suero 18,7% 8,6% ELISA (Ingenasa) (+) IgM>IgG Morandi y cols., 2012 Italia sd 72* LnIS 13,9% 15,3% IHQ PCR Sattler y cols.,2012 Alemania --- 94 Suero 16% (IgG) 3,2% (IgG+IgM) ELISA (Ingenasa) Halli y cols., 2012 Finlandia 2005-2008 294** Suero 51,1% IPMA Boadella y cols., 2012 España 2000-2008 818* Suero 51,3% IPMA Revisión bibliográfica: Principales agentes etiológicos involucrados en el PRDC. PCV2 79 Stephenson y cols., 2015 Oahu y Hawai 2007-2010 344 Suero 63% FMIA Baroch y cols., 2015 Estados Unidos 2011 y 2012 162* Suero 25,3% IF 2.4.3.3 P ATOGENIA La patogenia de la infección de PCV2 así como el tipo celular en el que tiene lugar la replicación del virus, aún no se conocen completamente. La depleción linfoide así como la linfopenia que tiene lugar en sangre periférica es un rasgo constante en los cerdos infectados, que desarrollan clínicamente dando lugar al desarrollo de enfermedades. Mediante el uso de técnicas de IHQ e ISH se ha demostrado grandes cantidades de Ags o material genético de PCV2 en el citoplasma de los macrófagos y en células dendríticas reemplazando a los linfocitos en los folículos deplecionados (Sorden, 2000; Allan y Ellis, 2000; Chianini y cols., 2001). Sin embargo, la presencia de Ags de PCV2 en linfocitos es esporádica (Chianini y cols., 2003), y aún se desconoce si la reducción de linfocitos en cerdos afectados por PCVD es debida a una producción reducida en la médula ósea, a una reducción de la proliferación en los tejidos linfoides secundarios o a un incremento de la pérdida de linfocitos en médula ósea, sangre periférica, o en tejidos linfoides secundarios vía necrosis o apoptosis inducida por el virus (Opriessnig y cols., 2007). A pesar de la presencia de PCV2 en macrófagos y células dendríticas, algunos autores sugieren que las células monocíticas no representan la célula blanco principal de la replicación del PCV2. En dicho estudio se analizó la capacidad de los monocitos y los macrófagos de mantener la replicación de PCV2 in vitro, y no se observó replicación en las mismas (Gilpin y cols., 2003). Otros autores no encontraron evidencia de replicación in vitro en células dendríticas. Sin embargo, el PCV2 persistía en estas células sin perder infectividad o inducir la muerte celular y sostienen la hipótesis de que debido a su capacidad migratoria, las células dendríticas podrían proporcionar un vehículo para el transporte del virus a través del hospedador (Vincent y cols., 2003). Otros trabajos realizados in vitro e in vivo sugieren que el PCV2 sí podría replicarse en macrófagos (Pérez-Martín y cols., 2007; Rodríguez-Cariño y Segalés, 2009). No se ha determinado aún cuál es la ruta de entrada del PCV2 en las células diana. Sin embargo, algunos resultados preliminares obtenidos in vitro han mostrado que el PCV2 entra en dichas células mediante endocitosis dependiente de clatrina en un ambiente ácido (Misinzo y cols., 2005). Además, se ha demostrado que las células dendríticas maduras e inmaduras permiten la internalización del PCV2 mediante micropinocitosis en ausencia de replicación vírica (Vincent y cols., 2005). Aunque muchos aspectos de la patogenia del PCV2 están aún pendientes de una confirmación e identificación definitiva, se ha propuesto un esquema de la patogenia de los cerdos que presentan enfermedad por PCV2 sistémica e infectados de forma subclínica por PCV2 en relación a los aspectos inmunológicos de la enfermedad (Darwich y cols., 2004). Para intentar esclarecer el papel que ejerce PCV2 en la presentación de la enfermedad y explicar algunas manifestaciones clínicas atribuidas únicamente a este virus, se intento reproducir la infección con ADN clonado de PCV2, inoculando cerdos libres de agentes patógenos (SPF), los cuales desarrollaron lesiones en órganos linfoides asociadas a PCV2, aunque no evidenciaron clínica (Fenaux y cols., 2002). Estudios similares se han desarrollados posteriormente por Grasland y cols., en el 2005. Todos estos Revisión bibliográfica: Principales agentes etiológicos involucrados en el PRDC. PCV2 80 trabajos sugieren la hipótesis de que PCV2 es esencial para el desarrollo de la enfermedad; sin embargo, la presencia de otros factores es imprescindible para poder explicar la gran variabilidad de signos clínicos y lesiones asociadas a los casos crónicos de animales infectados por PCV2 (Opriessing y cols., 2007). En estudios restrospectivos se ha observado que diversos factores, tales como la edad y el origen de los cerdos, condiciones ambientales, la genética de los animales y la naturaleza del inóculo de PCV2 pueden jugar un importante papel en la reproducibilidad experimental de la enfermedad (Segalés y cols., 2005a). Los factores que actualmente se piensa puedan influir en el desarrollo de enfermedades debidas a una infección por PCV2 pueden desglosarse en 4 grupos: virus, hospedador, coinfecciones y modulación inmune. Los trabajos experimentales han confirmado que al menos estos 4 componentes, identificados hasta la fecha, son claves en los distintos modelos etiopatogenicos (Opriessing y cols., 2007). 2.4.3.4 C LÍNICA Y L ESIONES El nombre de la enfermedad atribuida a la infección por PCV2 ha ido evolucionando conforme se ha profundizado en el conocimiento e identificación del virus, así como las diferentes presentaciones clínicas y cuadros lesionales. En 1996, se publicó la descripción de un síndrome de adelgazamiento o desmedro observado por primera vez en 1991, en explotaciones de alto estatus sanitario en Canadá (Clark, 1996; Harding, 1996). Se caracterizaba por la pérdida progresiva de la condición corporal junto con la presencia de lesiones en múltiples órganos y los autores propusieron el término PMWS. En las lesiones multisistémicas se detectó ácido nucleico y Ag de PCV2, consiguiendo aislar y caracterizar el virus (Ellis y cols., 1998). En California, se asoció PCV a la neumonía intersticial y linfadenopatía observadas en muestras de pulmón y linfonodos en un cerdo de 6 semanas de edad al detectarse, mediante ISH, ADN de PCV (Daft y cols., 1996). Demostrándose posteriormente, mediante aislamiento y caracterización del virus, que se trataba del PCV2 (Allan y cols., 1998). En Francia en 1996, se describió una enfermedad debilitante (Albina y cols., 1996), identificándose PCV2 en los animales afectados (Allan y cols., 1998). Un año más tarde en España, también fue descrita una enfermedad asociada al PCV2 que cursaba con adelgazamiento (Segalés y cols., 1997). Desde estos primeros casos descritos de PMWS asociado a PCV2, dicha enfermedad ha sido identificada en casi todos los países productores de porcino en el mundo (Clark, 1997; Harding, 1997; Segalés y cols., 1997; Kiupel y cols., 1998; Spillane y cols., 1998; Choi y Chae, 1999; Hinrichs y cols., 1999; Onuki y cols., 1999; Choi y cols., 2000; Kiss y cols., 2000; Vyt y cols., 2000; Wellenberg y cols., 2000; Borel y cols., 2001; Trujano y cols., 2001; Celer y Carasova, 2002; Sarradell y cols., 2002; Saoulidis y cols., 2002; Lawton y cols., 2004; Wallgren y cols., 2004). Estudios retrospectivos realizados en España, Reino Unido y Japón, en muestras de cerdos procedentes de archivos histológicos desde 1986 y 1989, en los cuales se diagnosticaron lesiones de PMWS, se detectó abundantes Ags de PCV2 (Mori y cols., 2000; Rodríguez-Arrioja y cols., 2003; Grierson y cols., 2004). En otros estudios se han encontrado evidencias de infección por PCV2 en cerdos desde 1969 (Sánchez y cols., 2001b). Revisión bibliográfica: Principales agentes etiológicos involucrados en el PRDC. PCV2 81 Dado que el PCV2 es ubicuo en la población porcina y la infección no equivale necesariamente a enfermedad, Sorden, en 2000, propuso una definición de caso de PMWS. Basándose en dicha definición, el diagnóstico de PMWS requiere 1) la presencia de signos clínicos tales como debilidad, perdida de peso, con o sin disnea o ictericia; 2) la presencia de lesiones microscópicas típicas asociadas a PCV2 (depleción linfoide y/o infiltrado histiocítico en tejidos linfoides u otros órganos), y 3) antígeno o ácido nucleico de PCV2 asociado a las lesiones microscópicas, detectado mediante IHQ o ISH (Sorden, 2000). En 2002, se propuso reemplazar todas las abreviaturas existentes que intentaban identificar a esta enfermedad emergente por “enfermedades por circovirus porcino (Porcine Circovirus Disease PCVD) para agrupar a todos los cuadros clínicos asociados con el PCV2 (Allan y cols., 2002). Esta nomenclatura también es usada en Europa (Segalés y cols., 2005a). En Norteamérica, en el año 2006, la Asociación Americana de Veterinarios de Porcino consideró que cualquier término nuevo usado en conexión con PCV2 debería incluir la palabra “asociado”, lo cual llevó a la creación e introducción del término “enfermedad asociada al circovirus porcino” (Porcine circovirus associated disease, PCVAD), y como referencia el Laboratorio de Diagnóstico Veterinario de la Universidad del Estado de Iowa las dividen en categorías dependiendo del sistema afectado. Así, PCVAD ahora incluye una infección sistémica (categoría que incluye el PMWS), neumonía asociada a PCV2, enteritis asociada a PCV2, fallos reproductivos asociados a PCV2, y al síndrome de dermatitis y nefropatía porcina asociado a PCV2. Los casos que son categorizados de esta forma, pueden tener lesiones asociadas a PCV2 que varíen en severidad de moderada a severa y tales descripciones son añadidas a los informes del caso (Opriessnig y cols., 2007). Así mismo, en 2012 se propuso una terminología para los diferentes síndromes o expresiones de PCVD (Segalés, 2012):  Infección subclínica (PCV2 subclinical infection, PCV2-SI).  Enfermedad sistémica (PCV2 systemic disease, PCV2-SD), que incluiría el PMWS.  Enfermedad respiratoria (PCV2 lung disease, PCV2-LD), que incluiría también la neumonía proliferativa necrotizante (Proliferative and necrotising Pneumonia, PNP).  Enfermedad entérica o enteritis (PCV2 enteric disease,PCV2-ED).  Enfermedad o fallo reproductivo (PCV2 reproductive disease, PCV2-RD).  Síndrome de dermatitis y nefropatía porcina (Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome, PDNS).  Encefalitis y temblor congénito. Además, como hemos referenciado anteriormente, PCV2 podría jugar un papel importante en la presentación del PRDC, asociada a múltiples patógenos respiratorios incluyendo el PRRSv, SIV y Mh. Afectando a cerdos de 14-22 semanas de edad (Harms y cols., 2002; Kim y cols., 2003a), y causando una reducción en la tasa de crecimiento, una reducción en la eficiencia alimentaria, anorexia, fiebre, tos, y disnea.  Infección subclínica por PCV2 La infección subclínica por PCV2 implica que, aunque el PCV2 está presente, no es el responsable de la enfermedad que padezca el cerdo (es decir, baja cantidad de antígeno de PCV2 asociada a lesiones mínimas o sin lesiones). Experimentalmente, se sabe que la infección y lesiones por PCV2 pueden estar limitadas a 1 o 2 linfonodos sin causar ningún signo clínico aparente (Opriessnig y cols., 2004 y 2006a). Por otro lado, se ha demostrado que la infección subclínica por PCV2 puede estar asociada a efectos indirectos, como la disminución en la eficacia de la vacunación frente a PRRSv (Opriessnig y cols., 2006b). Revisión bibliográfica: Principales agentes etiológicos involucrados en el PRDC. PCV2 82 También se ha descrito en cerdos clínicamente sanos, linfadenitis necrotizante asociada a PCV2 en linfonodos individuales. La principal lesión en esta forma de presentación es la presencia en 1 o 2 linfonodos aumentados de tamaño que histológicamente se corresponden con una linfadenitis necrotizante (Kim y Chae, 2005; Opriessnig y cols., 2006a).  Enfermedad sistémica asociada a PCV2 (PMWS) Los principales signos clínicos son pérdida de peso, disminución de la ganancia media diaria, animales pálidos o ictéricos, distrés respiratorio con tos, y diarrea con coloración oscura y en ocasiones ictericia, afectando a cerdos de 2-4 meses de edad en sistemas de producción out door e in door (Harding y Clark, 1997; Hirai y cols., 2001), con una morbilidad y mortalidad variable, dependiendo de la explotación, el sistema empleado, las prácticas de manejo, posible co-infección con otros agentes etiológicos, etc. Factores medioambientales tales como hacinamiento, aire de mal calidad, mezcla de grupos de diferentes edades, y otros factores estresantes podrían exacerbar la severidad de la infección (Harding y Clark, 1997). Las tasas de morbilidad observadas en las explotaciones afectadas varían de 4 a 30%, y las de mortalidad entre 4 y 20%, con tasas excepcionales de 50-60% de morbilidad y 70-80% de mortalidad (Segalés y Domingo, 2002; Segalés y cols., 2005a). Un resumen de las lesiones macroscópicas y microscópicas más frecuentes ha sido publicado por Segalés y Domingo, 2002. Las lesiones macroscópicas más importantes ocurren en el tejido linfoide, caracterizadas por linfoadenomegalia de linfonodos subcutáneos en fases tempranas (Clark, 1997; Rosell y cols., 1999), principalmente inguinal superficial, aunque no siempre se detecta (Segalés y cols., 2004). Este incremento en el tamaño también se distingue fácilmente en los linfonodos bronquial, mediastínicos y mesentéricos. Asimismo, otros linfonodos pueden estar comprometidos. Al corte, presentan una coloración de marronácea a blanquecina y ligeramente edematosa, observándose menos frecuentemente linfadenitis necrótica (Segalés y cols., 2004). En fases más avanzadas se puede apreciar atrofia de linfonodos y timo (Ladekjaer-Mikkelsen y cols., 2002; Darwich, 2003; Segales y cols., 2004), siendo un hallazgo muy significativo en timo la presencia de atrofia cortical (Darwich, 2003). Los pulmones se observan aumentados de tamaño con ausencia de colapso, consistencia elástica, de distribución difusa, irregular o multifocal, con septos distendidos por presencia de edema intersticial. Otro patrón morfológico frecuente en los pulmones es una bronconeumonía catarral-purulenta en los lóbulos anteriores o neumonías necróticas atribuidas a infecciones bacterianas secundarias (Segalés y cols., 2005a). El hígado rara vez aparece aumentado de tamaño, pálido, de consistencia firme y superficie granular (Rosell y cols., 1999; Rosell y cols., 2000a). En el riñón, algunos cerdos muestran un punteado blanquecino en la corteza renal (Segalés y cols., 2004b; Opriessnig y Langohr, 2013). La presencia de úlceras gástricas a nivel de la pars oesophagea también ha sido descrita frecuentemente en cerdos afectados de PCV2-SD/PMWS (Segalés y Domingo, 2002) aunque no se ha establecido relación directa entre la infección por PCV2 y estas lesiones. Las principales lesiones de PMWS a nivel microscópico tienen lugar en los tejidos linfoides aunque también se ha detectado infiltrado inflamatorio asociado a la infección por PCV2 en una gran variedad de tejidos afectados. Revisión bibliográfica: Principales agentes etiológicos involucrados en el PRDC. PCV2 83 Microscópicamente, las lesiones observadas en el tejido linfoide se caracteriza por infiltrado inflamatorio mononuclear histiocítico y células gigantes multinucleadas en senos subcapsulares seguida de depleción linfoide a nivel folicular (pérdida de células B) (Clark, 1997; Rosell y cols., 1999). Las células gigantes multinucleadas también pueden aparecer en los folículos linfoides y en la zona parafolicular, seguida por depleción de linfocitos en la zona parafolicular (celulas T) que puede variar en intensidad, desde leve a muy marcada (Clark, 1997; Rosell y cols., 1999). En el timo se ha descrito atrofia cortical (Darwich, 2003). En numerosas ocasiones se han observado cuerpos de inclusión citoplasmáticos en histiocitos y/o células dendríticas. Dichas inclusiones son basófilas o anfófilas, redondeas y de muy diferente tamaño. Estos cambios están asociados con, a menudo, grandes cantidades de antígeno PCV2 intracitoplasmático en células de la línea monocito-macrofágica incluyendo células dendríticas. Los estadios finales de depleción muestran un tejido linfoide vacío, con un estroma prominente y células accesorias (Rosell y cols., 1999; Segalés y cols., 2005a). En el aparato respiratorio se observa neumonía intersticial, con infiltrado mononuclear alveolar, peribronquiolar y peribronquial. No se observa un daño evidente en las células epiteliales que tapizan las vías aéreas o los alvéolos. En casos muy avanzados se puede apreciar fibrosis peribronquial y bronquiolitis fibrosa (Clark, 1997; Segalés y cols., 2004). Los septos interlobulillares suelen estar distendidos y con líquido (edema intersticial). Otras lesiones pulmonares frecuentes son bronconeumonía catarropurulenta de los lóbulos anteriores, o incluso neumonía necrotizante, atribuible a infecciones bacterianas secundarias (Segalés y cols., 2005a). En los casos atribuidos a infecciones bacterianas secundarias las lesiones microscópicas están asociados a la presencia de antígeno PCV2, el cual se encuentra a veces intranuclear en células epiteliales y principalmente intracitoplasmático en fagocitos mononucleares (Allan y Ellis, 2000). Las lesiones microscópicas observadas en hígado de los casos más avanzados se corresponden con pérdida marcada de hepatocitos, un aumento de la cantidad de tejido fibroso e infiltrado inflamatorio difuso (Rosell y cols., 1999; Krakowka y cols., 2000; Rosell y cols., 2000a). En función de la intensidad y distribución de las lesiones microscópicas, el daño hepático observado en animales infectados naturalmente por el PCV2 ha sido clasificado en 4 estadios (Rosell y cols., 2000a): I: leve infiltrado linfohistiocítico multifocal en torno a los espacios porta. II: moderado a intenso infiltrado linfohistiocítico en torno a espacios porta e infiltrado mononuclear en el parénquima hepático. Las células de Kupffer suelen estar aumentadas de tamaño y las apoptosis de hepatocitos son infrecuentes. III: severa inflamación linfohistiocítica en los espacios porta de forma generalizada, infiltrado mononuclear multifocal en el parénquima hepático y, desorganización de los cordones hepáticos. Se pueden observar hepatocitos aumentados de tamaño con cariomegalia. Es frecuente la presencia de cuerpos apoptóticos (Councilman bodies). IV: fibrosis perilobulillar generalizada, desorganización de los cordones hepáticos y pérdida masiva de hepatocitos con infiltrado mononuclear difuso. La severidad de los daños observados en los hígados clasificados en el estadio IV sugiere la existencia de un fallo hepático en los estadios finales de PCV2-SD/PMWS. En riñón las lesiones macroscópicas observadas, son indicativas de nefritis intersticial linfoplasmocitaria y/o granulomatosa a nivel microscópico (Segalés y cols., 2004b; Opriessnig y Langohr, 2013), lesión que, a esta edad, se encuentra principalmente en los casos de PCV2-SD/PMWS (Segalés y cols., 2005a). El PCV2 se localiza en el citoplasma de las células epiteliales tubulares (Segalés y Domingo, 2002; Opriessnig y Langohr, 2013). Revisión bibliográfica: Principales agentes etiológicos involucrados en el PRDC. PCV2 90 Por otro lado, otros estudios no han podido detectar PCV2 en animales con CT (Kennedy y cols., 2003; Ha y cols., 2005). Por lo tanto, la asociación entre PCV2 y CT es, hoy en dia, controvertida y son necesarios más estudios para aclarar el papel del PCV2 en CT. 2.4.3.5 D IAGNÓSTICO  Diagnóstico de PCVD El diagnóstico de PCVD a nivel de explotación tiene que tener en cuenta 1) el porcentaje de cerdos diagnosticados con PCVD de todos los remitidos y 2) un aumento de la mortalidad en la explotación estudiada. Por lo general, se considera al PCVD como un problema de explotación si se diagnostica PCVD en el 50% o más de los cerdos de una muestra representativa y si hay un aumento significativo de la mortalidad comparada con parámetros previos de la explotación. Se considera como PCVD esporádico si se diagnostica PCVD en menos del 50% de una muestra representativa, simultáneamente con un aumento de la mortalidad o si se diagnostica PCVD en más del 50% de una muestra representativa sin aumento de mortalidad de forma simultánea (Segalés, 2006). Para diferenciar las distintas manifestaciones clínicas de PCVD es importante evaluar las lesiones histopatológicas y la presencia de PCV2 en intestinos, pulmones y tejidos linfoides (Segalés, 2012). • Diagnóstico de enfermedades sistémicas asociadas a PCV2. PMWS Los criterios de diagnóstico de PMWS están muy bien definidos (Sorden, 2000; Segalés, 2002). Se considera que un cerdo o grupo de cerdos presentan PMWS si cumplen los siguientes criterios (Sorden, 2000): − Signos clínicos que incluyan retraso del crecimiento y adelgazamiento, frecuentemente con disnea y aumento del tamaño de los linfonodos inguinales, y ocasionalmente ictericia. − Presencia de lesiones histológicas características en los tejidos linfoides (depleción linfocitaria junto con inflamación granulomatosa-linfohistiocítica y presencia de cuerpos de inclusión en cierto número de cerdos afectados) y/o inflamación granulomatosa-linfohistiocítica en otros órganos (pulmón, hígado, riñón, intestino, páncreas, etc.). − Detección, de moderada a severa, de PCV2 en las lesiones histopatológicas presentes en los tejidos linfoides y otros tejidos de los cerdos afectados. Esta definición de caso no excluye la presencia concomitante de otras enfermedades o coinfecciones con PMWS. Esto también significa que ni los signos clínicos ni las lesiones macroscópicas observadas en cerdos sospechosos de estar afectados de PCVD son suficientes para diagnosticar la enfermedad, aunque si son indicativas. Sin embargo, la presencia de signos clínicos, lesiones macroscópicas compatibles con PCVD y la demostración de elevada cantidad de PCV2 por diferentes métodos (inmunocitoquímica, captura cuantitativa de antígenos o ELISA de captura o PCR cuantitativa) pueden ser consideradas diagnósticas en ausencia de acceso a un estudio histopatológico (Segalés y cols., 2005a). Revisión bibliográfica: Principales agentes etiológicos involucrados en el PRDC. PCV2 91 • Diagnóstico de enteritis asociada a PCV2 El diagnóstico de enteritis asociada a PCV2 se caracteriza solo: − si hay diarrea. − si las lesiones características están presentes en las placas de Peyer pero no en otros linfonodos. − si el antígeno o ácido nucleico de PCV2 está presente en las lesiones. Estos tres criterios por separado no son diagnósticos de enteritis asociada a PCV2 (Kim y cols., 2004a). • Diagnóstico de fallo reproductivo asociado a PCV2 La definición de caso para los problemas reproductivos asociados con la infección por PCV2 no ha sido establecida formalmente, pero teniendo en cuenta las características clínico-patológicas de los casos descritos (West y cols., 1999; O´Connor y cols., 2001; Brunborg y cols., 2007; Pittman, 2008), debería incluir tres criterios principales: − Abortos tardíos o a término y nacidos muertos, en ocasiones con una hipertrofia evidente del corazón de los fetos. − Presencia de lesiones cardiacas caracterizadas por una extensa miocarditis necrótica y/o fibrosa. − Presencia de gran cantidad de PCV2 en las lesiones miocárdicas y en otros tejidos fetales. • Diagnóstico de PDNS La definición de caso de PDNS es relativamente sencilla (Smith y cols., 1993; Helie y cols., 1995): − Presencia de lesiones necrotizantes y hemorrágicas en piel, localizadas principalmente en las extremidades posteriores y área perineal, y/o riñones pálidos y aumentados de tamaño, con petequias corticales generalizadas. − Presencia de vasculitis necrotizante sistémica, y de glomerulonefritis fibrinosa y necrotizante. Desde el punto de vista diagnóstico, actualmente, la detección de PCV2 no esta incluida dentro de los criterios diagnósticos para el PDNS.  Diagnóstico diferencial La lista de diagnósticos diferenciales para PCV2-SD/PMWS puede ser muy amplia dependiendo del signo clínico dominante en cada explotación. La primera y más importante entidad a incluir en esta lista es la forma respiratoria del PRRS. Sin embargo, la amplia distribución del PRRSv en la mayoría de los países hace que la diferenciación entre PMWS y PRRS sea muy difícil, a no ser que se use una adecuada batería de tests laboratoriales para PRRSv y PCV2 al mismo tiempo. Además, toda enfermedad que cause adelgazamiento debe ser incluida en la lista de diagnósticos diferenciales (Harding y Clark, 1997). Aparte del PRRS, deberían ser incluidas condiciones como PRDC, enfermedad de Glässer, peste porcina clásica (PPC), ADV, enfermedad del ojo azul (infección por Rubulavirus porcino), toxicidad por carbadox/olaquindox, colibacilosis postdestete, disenteria porcina, espiroquetosis colónica porcina, enteropatia proliferativa porcina, ulceración gástrica en la pars oesophagea, y eperitrozoonosis , dependiendo del país de origen (Segalés y cols., 2005a). Revisión bibliográfica: Principales agentes etiológicos involucrados en el PRDC. PCV2 92 Para el PDNS, se deben incluir aquellas enfermedades que causen una coloración de la piel de roja a roja oscura (peste porcina africana y clásica, erisipelas, salmonelosis septicémica, infección por Actinobacillus suis, síndrome de estrés porcino, viruela porcina, epidermitis exudativa, sarna sarcóptica, dermatofitosis, pitiriasis rosada y otras septicemias bacterianas), así como aquellas que causen hemorragias petequiales en los riñones como la peste porcina clasica/africana y salmonelosis septicémica (Segalés, 2002; Thomson y cols., 2002). Se debe hacer especial énfasis en diferenciar el PDNS de la peste porcina clasica en Europa y de la salmonelosis septicémica en Norte America (Segalés, 2002). La forma reproductiva asociada con el PCV2 puede ser indistinguible clínicamente de otras enfermedades porcinas que causen abortos tardíos o a término y nacidos muertos tales como PRRSv, ADV, PPV, influenza porcina, enfermedad del ojo azul, infecciones por enterovirus, virus de la encefalomiocarditis, peste porcina clásica, erisipelas y leptospirosis, entre otras (Segalés y cols., 2005a; Hansen y cols., 2010a).  Diagnóstico laboratorial Generalmente, el diagnóstico de las enfermedades virales en el cerdo se basa en la detección del virus mediante cultivo, PCR, IHQ, ISH y/o detección de Acs mediante serología. Sin embargo, es habitual encontrar PCV2 en grupos de cerdos sanos (Allan y Ellis, 2000; Kim y cols., 2001; Calsamiglia y cols., 2002), de manera que la detección de éste no confirma necesariamente el diagnóstico de PMWS. Para establecer un diagnostico etiológico, es necesario la realización de técnicas que demuestren la presencia del virus en las lesiones tisulares. Así, se han desarrollado numerosos métodos para la detección de PCV2 en tejidos, correlacionándolos con la presencia de lesiones. Entre ellos, ISH y la IHQ son los tests empleados con mayor frecuencia (McNeilly y cols., 1999; Rosell y cols., 1999) para el diagnóstico de PCVAD. La detección de PCV2 implica infección por este agente, pero no necesariamente la presentación clínica de PWMS. El material genético de PCV2 o Ags se ha identificado y descrito en el citoplasma de los histiocitos, células gigantes multinucleadas y otros monocitos o células de la línea macrofágica como los macrófagos alveolares, las células de Kupffer y células dendríticas del tejido linfoide (Rosell y cols., 1999; Allan y Ellis, 2000; Rosell y cols., 2000b). También se ha detectado en el citoplasma de las células de los epitelios renal y respiratorio, endotelio vascular, células de los acinos pancreáticos y en los núcleos de los monocitos, células de la musculatura lisa, hepatocitos y enterocitos (Kiupel y cols., 1999; McNeilly y cols., 1999; Rosell y cols., 1999; Rosell y cols., 2000b; Sirinarumitr y cols., 2000) e incluso en el endotelio vascular a nivel del sistema nervioso central (Correa, 2007). Particularmente la PCR se puede emplear como técnica complementaria en la detección de PCV2 en aquellos tejidos que presenten lesiones histológicas descritas en PWMS (Kim y Chae, 2001, 2003). Existen numerosos ensayos de PCR descritos para la detección de ácido nucleico específico de PCV2 (Morozov y cols., 1998; Hamel y cols., 2000; Larochelle y cols., 2000; Shibata y cols., 2003; Grierson y cols., 2004), habiéndose desarrollado numerosas variantes de la técnica convencional (PCR Multiplex, Anidada, Multiplex anidada, cuantitativa a tiempo real y transcriptasa inversa). Revisión bibliográfica: Principales agentes etiológicos involucrados en el PRDC. PCV2 93 Los estudios serológicos, técnicas de diagnóstico indirectas, son de gran utilidad para evaluar la dinámica de los Acs, así como la interferencia de los Acs maternales en la monitorización de planes de vacunación (Rodríguez-Arrioja y cols., 2000; Brunborg y cols., 2010; Podgórska y cols., 2011; Fablet y cols., 2012; Segalés, 2012). Para la detección de Acs anti-PCV2 se han desarrollado varias técnicas serológicas. Los más utilizados se basan en cultivo de células infectadas con PCV2 (IPMA/Inmunofluorescencia indirecta) o técnicas ELISA (placas antigenadas por PCV2 o baculovirus que expresan en su cápside proteínas de PCV2) (Walker y cols., 2000; Nawagitgul y cols., 2002; Blanchard y cols., 2003; McNair y cols., 2004) . Estas técnicas deben emplearse de forma conjunta ya que éste es un virus ubicuo y pueden obtenerse resultados positivos en ausencia de enfermedad clínica (Brunborg y cols., 2004; Turner y cols., 2009; Podgórska y Stadejek, 2011). Actualmente existe un kit de ELISA IgG e IgM para PCV2 que permite comparar los valores de IgG e IgM determinando la dinámica de la infección: valores de IgM superiores o iguales a los valores de IgG (inicio de una infección activa en los primeros 21 días postinoculación); valores de IgM inferiores a los de IgG (infección activa ya establecida aproximadamente entre los días 20-50 postinoculación), y por último, valores elevados de IgG y negativo para IgM (animales convaleciente en los que se resuelve la infección aproximadamente 2 meses después de la infección) (Segalés y cols., 2005b). M MA AT TE ER RI IA AL L Y Y M MÉ ÉT TO OD DO OS S 3 . 3 MATERIAL Y MÉTODOS En este apartado desglosaremos el objetivos específicos de la presente tesis, teniendo en cuenta que se podrán desarrollar los mismos métodos en más de un objetivo. en el CNC estudiando: 1. Las causas de muerte de los ejemplares que fueron remitidos desde 2007 a 2012 al Servicio de diagnóstico anatomopatalógico de la Facultad de Veterinaria histopatológico de las lesiones observadas. Se identificó aquellos ani proceso respiratorio, intentando determinar la participación de distintos agentes bacterianos y víricos involucrados en el desarrollo del PRDC (Mh, PRRSv y PCV2) mediante la realización de técnicas inmunohistoquímicas (IHQ). 2. La pr esencia de lesiones en pulmones y otros órganos en ejemplares sanos enviados al Matadero Insular del Cabildo de Gran Canaria, estableciendo la participación de Mh, PRRSv y PCV2 en el desarrollo de las lesiones mediante la realización de técnicas de IHQ. 3. E l contacto con estos agentes patógenos y el desarrollo de inmunidad en los ejemplares presentes en distintas explotaciones localizadas en el Archipiélago Canario, mediante la realización de técnicas serológicas, analizando además la viabilidad de los extra en técnicas de ELISA comerciales. Ilustración 9: Esquema resumen del material y métodos empleados para el desarrollo de los objetivos planteados. ESTUDIO 2 Matadero: 30 ejemplares de CNC (Pulmón, LNTb, tonsila, bazo, riñón e hígado) Diagn. anatomopatológico Est. macroscópico y microscópico Diagn. inmunohistoquímico (Mh, PRRSv y PCV2) MÉTODOS En este apartado desglosaremos el material y métodos empl eados para el desarrollo de los objetivos específicos de la presente tesis, teniendo en cuenta que se podrán desarrollar los mismos métodos en más de un objetivo. Se pretende conoce r en el desarrollo de las enfermedades respiratorias Las causas de muerte de los ejemplares que fueron remitidos desde 2007 a 2012 al Servicio de diagnóstico anatomopatalógico de la Facultad de Veterinaria mediante estudio macroscópico e histopatológico de las lesiones observadas. Se identificó aquellos ani males que sufrieron algún proceso respiratorio, intentando determinar la participación de distintos agentes bacterianos y víricos involucrados en el desarrollo del PRDC (Mh, PRRSv y PCV2) mediante la realización de técnicas inmunohistoquímicas (IHQ). esencia de lesiones en pulmones y otros órganos en ejemplares sanos enviados al Matadero Insular del Cabildo de Gran Canaria, estableciendo la participación de Mh, PRRSv y PCV2 en el desarrollo de las lesiones mediante la realización de técnicas de IHQ. l contacto con estos agentes patógenos y el desarrollo de inmunidad en los ejemplares presentes en distintas explotaciones localizadas en el Archipiélago Canario, mediante la realización de técnicas serológicas, analizando además la viabilidad de los extra ctos pulmonares como muestras en técnicas de ELISA comerciales. material y métodos empleados para el desarrollo de los objetivos planteados. ESTUDIO 1 Necropsias: 25 ejemplares de CNC Diagn. anatomopatológico Est. macroscópico y microscópicoo Diagn. inmunohistoquímico (Mh, PRRSv y PCV2) ESTUDIO 3 Explotaciones de GC, LZT, TF y LP 329 ejemp. de CNC (suero sanguíneo) Diagnóstico serológico (ELISA) (Mh, PRRSv y PCV2) ELISA suero sanguíneo/extracto pulmonar: 18 ejemplares de CNC 30 ejemplares de CNC (Pulmón, LNTb, tonsila, bazo, Diagn. anatomopatológico Est. macroscópico y microscópico inmunohistoquímico Material y Métodos 97 eados para el desarrollo de los objetivos específicos de la presente tesis, teniendo en cuenta que se podrán desarrollar los mismos r en el desarrollo de las enfermedades respiratorias Las causas de muerte de los ejemplares que fueron remitidos desde 2007 a 2012 al Servicio de mediante estudio macroscópico e males que sufrieron algún proceso respiratorio, intentando determinar la participación de distintos agentes bacterianos y víricos involucrados en el desarrollo del PRDC (Mh, PRRSv y PCV2) mediante la realización de esencia de lesiones en pulmones y otros órganos en ejemplares sanos enviados al Matadero Insular del Cabildo de Gran Canaria, estableciendo la participación de Mh, PRRSv y PCV2 en el l contacto con estos agentes patógenos y el desarrollo de inmunidad en los ejemplares presentes en distintas explotaciones localizadas en el Archipiélago Canario, mediante la realización de ctos pulmonares como muestras material y métodos empleados para el desarrollo de los objetivos planteados. ESTUDIO 3 Explotaciones de GC, LZT, TF y LP : 329 ejemp. de CNC (suero sanguíneo) Diagnóstico serológico (ELISA) (Mh, PRRSv y PCV2) ELISA suero sanguíneo/extracto 18 ejemplares de CNC Material y Métodos: Material 99 3.1 MATERIAL 3.1.1 A NIMALES OBJETO DE ESTUDIO 3.1.1.1 E STUDIO 1. Se realizó necropsia a 25 ejemplares muertos en distintas explotaciones de la isla de Gran Canaria y en una explotación de Lanzarote durante el periodo comprendido entre febrero de 2007 y enero de 2012. Las necropsias se realizaron en el Servicio de Diagnóstico Anatomopatológico de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. En la siguiente tabla se recoge la información (procedencia, año de necropsia, sexo y edad) correspondiente a los animales a los cuales se les realizó necropsia. Según la edad, los animales se clasificaron en 3 categorías: lechones, animales de cebo y reproductores. Tabla 8: Animales muertos durante el periodo de estudio (2007-2012). ID número de identificación, Nº número del caso, Exp. Explotación de procedencia, año de la muerte, sexo (♂,♀), edad de los animales y Cat. categoría de edad (L lechón, C cebo y R reproductor). ID N º E XP . A ÑO S EXO E DAD C AT . N1 76/07 GC13 2007 ♀ 2,5 meses L N2 77/07 GC13 2007 ♀ 2,5 meses L N3 230/07 GC6 2007 ♀ >1 año (13 meses) R N4 397/07 GC12 2007 ♂ 1,5-2 meses L N5 625/07 GC12 2007 ♂ 7 meses C N6 475/08 GC12 2008 ♀ 2,5 meses L N7 481/08 GC12 2008 ♂ 1,5-2 meses L N8 487/08 GC5 2008 ♀ 1,5 meses L N9 635/08 GC12 2008 ♀ 1,5-2 meses L N10 671/08 GC6 2008 ♀ 2,5 meses L N11 672/08 GC6 2008 ♀ 2,5 meses L N12 673/08 GC6 2008 ♂ 2,5 meses L N13 008/09 GC6 2009 ♂ >1 año R N14 131/09 GC6 2009 ♂ >1 año R N15 208/09 LZT8 2009 ♀ 1 mes L N16 265/09 GC3 2009 ♂ 1,5-2 meses L N17 I 55/10 GC9 2010 ♀ 1,5 meses L N18 I 60/10 GC9 2010 ♀ 1,5-2 meses L N19 535/10 GC6 2010 ♂ >1 año R N20 I 90/11 GC6 2011 ♂ 4 meses C N21 534/11 GC9 2011 ♀ >1 año (15 meses) R N22 596/11 GC11 2011 ♂ 2-3,5 meses L N23 597/11 GC11 2011 ♂ 2-3,5 meses L N24 I 373/11 GC9 2011 ♀ >1 año (15 meses) R N25 I 17/12 GC9 2012 ♀ >1 año (4 años) R Material y Métodos: Métodos. Estudio anatomopatológico 106  Estudio 2. En matadero se tomaron muestras de pulmón, LNTb, tonsila, bazo, hígado y riñón después de su examen macroscópico mediante inspección visual, palpación e incisión del parénquima. De pulmón se tomaron entre 3 y 4 muestras (con y sin lesiones), quedando representados los lóbulos craneal, medio y caudal, priorizando el lado derecho (Maes, 1996; Sorensen, 1997). Estas muestras fueron fijadas en formol tamponado al 10% a temperatura ambiente durante 24h para su posterior tallado e inclusión en parafina. 3.2.2 D IAGNÓSTICO ANATOMOPATOLÓGICO : DIAGNÓSTICO MORFOLÓGICO MICROSCÓPICO  Estudio 1 y 2. Las muestras fijadas en formol después de la realización de las necropsias del estudio 1 y de la inspección en matadero del estudio 2 fueron talladas y deshidratadas mediante una escala ascendente de alcoholes y aclaradas en xilol en un procesador automático de tejidos (Leica, TP-1050) 1 . A continuación, las muestras se incluyeron en parafina en un dispensador de parafina (Leica, EG-1160) 1 para la realización de los bloques, los cuales fueron cortados a 5 µm de grosor en un micrótomo (Leica, RM2135) 1 , para su posterior tinción mediante la técnica de rutina de H&E siguiendo el protocolo descrito a continuación: P ROTOCOLO DE DESPARAFINADO - Incubación de los cristales a 100ºC durante 30 minutos, favoreciendo la adhesión de tejido al portaobjetos y la fusión de la parafina circundante. - 2 pases de 2 minutos por xilol. - 2 pases de 2 minutos por alcohol de 100º. - 1 pase de 2 minutos por alcohol de 70º. - 3 pases de 2 minutos por agua destilada. B ATERÍA DE T INCIÓN - Hematoxilina de Harris durante 15 minutos. - Aclarado en agua corriente. - 4 pases rápidos por alcohol clorhídrico. - Aclarado en agua corriente. - 15 pases rápidos por agua amoniacal. - Lavado en agua corriente durante 15 minutos. - Eosina durante 4 minutos. - 2 pases de 2 minutos por alcohol de 96º. - 2 pases de 2 minutos por alcohol de 100º. - 3 pases de 2 minutos por xilol. - Montaje con resina DPX. Los distintos cortes histológicos fueron evaluados sistemáticamente. A nivel pulmonar, se examinaron bronquios, bronquiolos, alveolos, tejido conectivo peribronquial, peribronquiolar e interlobulillar y pleura. 1 Leica Instruments, Gmbh, Nussloch, Alemania Material y Métodos: Métodos. Estudio anatomopatológico 107 Las lesiones microscópicas de neumonía broncointersticial compatibles con infección por Mh se clasificaron en función de la hiperplasia del BALT siguiendo los criterios semicuantitativos descritos por Livingston y cols., en 1972, basados en un estudio experimental que se resume en la siguiente tabla: Tabla 10: Clasificación semicuantitativa de las lesiones histopatológicas compatibles con infección por Mh propuesta por Livingston y cols., (1972). Atendiendo a las lesiones observadas, según el tiempo transcurrido desde de la inoculación de Mh (dpi, días post-inoculación) las lesiones se clasifican en –, grado I, II, III y IV. G RADO ( DPI ) D ESCRIPCIÓN - 0 Ausencia de lesión. + (I) 10 Presencia de infiltrado linfocítico formando uno o más folículos linfoides en submucosa sin afectar a la muscular de la mucosa. ++ (II) 14 Presencia de uno o más folículos linfoides que invaden la muscular de la mucosa. Escasa presencia de neutrófilos en la luz de bronquios, bronquiolos y alveolos. Leve engrosamiento de paredes alveolares por la presencia de infiltrado inflamatorio. +++ (III) 37 Hiperplasia del tejido linfoide perivascular y peribronquial con presencia de numerosas células inflamatorias en paredes alveolares. Severa presencia de neutrófilos y eosinófilos en luz de bronquios, bronquiolos y alveolos. ++++ (IV) 42 Severa hiperplasia de tejido linfoide perivascular y peribronquial invadiendo extensas áreas del pulmón, comprometiendo la luz de las vías aéreas. Se pueden observar lóbulos completos invadidos por edema y gran cantidad de neutrófilos. Material y Métodos: Métodos. Estudio inmunohistoquímico 108 3.2.3 E STUDIO INMUNOHISTOQUÍMICO  Estudio 1 y 2. Se realizó técnicas IHQ utilizando un panel de Acs para determinar la presencia de Mh, PRRSv y/o PCV2 en los casos del estudio 1 donde se identificaron patologías respiratorias, para complementar el diagnóstico morfológico e histopatológico y determinar el diagnóstico etiológico. Y en todos los animales del estudio 2. Las muestras tisulares incluidas en parafina, fueron cortadas a 3 µm y recogidas en portaobjetos tratados con Poly-L-lysina 2 , para evitar el desprendimiento del tejido durante la realización de la técnica y se incubaron al menos durante 18 horas en estufa a 37ºC para lograr la mejor adherencia del corte al portaobjeto. Se incluyeron dos cortes de una muestra de la que se conocía con antelación la presencia del Ag correspondiente (control positivo). Uno de estos cortes siguió el mismo proceso que las muestras problema, mientras que en el segundo corte se sustituyó el Ac primario por suero normal de cabra al 10% en PBS (control negativo). La presencia de inmunorreacción en el primer corte indicaría un correcto desarrollo de la técnica, mientras que el segundo corte nos permitiría detectar posibles reacciones inespecíficas. Las muestras se desparafinaron y rehidrataron mediante pases sucesivos por xilol y alcoholes de graduación decreciente. Previo al inicio de la técnica, se llevó a cabo la inhibición de la peroxidasa endógena tisular, mediante la inmersión de los cortes en una solución de peróxido de hidrógeno en metanol al 3% durante 30 minutos. En función del Ag a detectar, se siguieron distintos métodos de desenmascaramiento antigénico y se utilizaron Acs primarios monoclonales (PRRSv y PCV2) y policlonal (Mh), y anticuerpos secundarios. La demostración de los Ags se realizó utilizando la técnica del Complejo Streptavidina-Biotina-Peroxidasa (SBP) 3 , siguiendo los métodos básicos descritos anteriormente por otros autores (Halbur et al. 1994; McNeilly et al., 2001). A continuación se detallan los pasos seguidos durante el desarrollo de la IHQ, indicando las especificaciones para la detección de cada uno de los agentes etiológicos: - Desparafinado mediante tres pase en xilol de 10, 5 y 5 minutos - Alcohol al 100% durante 5 minutos. - Inhibición de la peroxidasa endógena en una solución de peróxido de hidrógeno al 3% en metanol durante 30 minutos en agitación suave. - Rehidratación de la muestra mediante tres pases en alcohol al 100, 90 y 70% de 5 minutos cada uno. - Dos lavados en agua destilada de 5 minutos cada uno. - Lavado con PBS pH 7,2 durante 5 minutos en agitación. - Desenmascaramiento antigénico (específico para cada técnica):  Mh: Reacción enzimática con Proteasa al 0,1% durante 5 minutos a temperatura ambiente.  PRRSv: Reacción enzimática con Proteasa al 0,1% durante 8 minutos a 37ºC.  PCV2: Sin desenmascaramiento antigénico. 2 Sigma Chemical Company, St. Louis MO, USA 3 Vectastain® Elite ABC Kit, Vector Laboratories, Inc. Burlingame CA, USA Material y Métodos: Métodos. Estudio inmunohistoquímico 109 - Lavado con PBS, tres pases de 5 minutos. - Incubación con suero normal de cabra al 10% en PBS, en cámara húmeda a temperatura ambiente. - Incubación con el Ac primario específico en cámara húmeda durante 18 horas a 4ºC.  anti-Mh 4 a una dilución 1:600 en suero normal de cabra al 1% en PBS.  anti-PRRSv (1AC7 cepa europea) 5 a una dilución 1:250 en suero normal de cabra al 1% en PBS.  anti-PCV2 (36A9) 5 a una dilución 1:200 en suero normal de cabra al 1% en PBS. - Retirar la cámara húmeda de la nevera 1 hora antes para atemperar las muestras. - Lavado con PBS, 3 pases de 5 minutos. - Incubación con el Ac secundario biotinado 6 específico, a temperatura ambiente en cámara húmeda 30 minutos.  Mh: cerdo anti-conejo en una dilución 1:200 en suero normal de cabra al 1% en PBS.  PRRSv: conejo anti-ratón en una dilución 1:20 en suero normal de cabra al 1% en PBS.  PCV2: conejo anti-ratón en una dilución 1:20 en suero normal de cabra al 1% en PBS. - Lavado con PBS, 3 pases de 5 minutos. - Incubación con el Complejo SBP 3 a una dilución 1:50 en PBS durante 1 hora, en cámara húmeda en oscuridad. - Lavado con PBS, 3 pases de 5 minutos. - Revelado de la reacción por inmersión en 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) 2 , disolviendo 20 mg del revelador en 5 ml de N,N dimethylformamide 2 , 70 ml de tampón acetato sódico 0,1 M ph 5,2 y 75 µl de peróxido de hidrógeno al 30%. Filtración a través de papel de filtro doble e inmersión de los cortes observando el control positivo. - Lavado en agua corriente 5 minutos. - Contratinción con Hematoxilina de Mayer 5 minutos. - Lavado en agua corriente 10 minutos. - Montaje en medio acuoso. 4 Dr N.C. Feld, Danish Veterinary Diagnostic Laboratory, Copenhagen V, Denmark 5 Ingeniería y Genética Aplicada, SA, Madrid, España 6 DAKO, Glostrup, Denmark Material y Métodos: Métodos. Estudio inmunohistoquímico 110 Las especificaciones para cada una de las técnicas IHQs realizadas se resumen en la siguiente tabla: Tabla 11: Especificaciones del protocolo de IHQ para la detección de Ags de Mh, PRRSv y PCV2. Relación de Acs (primarios y secundarios biotinados), concentración [], tiempo y temperatura de incubación y tiempo de revelado específicos empleados en cada protocolo de IHQ. a Ac Policlonal, b Ac Monoclonal, c Ac estandarizado (Quesada-Canales, 2015). 1 Dr. Feld, Danish Veterinary Diagnostic Laboratory, Copenhagen V, Denmark 1 Ingeniería y Genética Aplicada, SA, Madrid, España. 3.2.4 D IAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO Se realizó estudio microbiológico del ejemplar N8 perteneciente al estudio 1, del cual se remitieron muestras de órganos con lesiones (intestino, hígado, tonsila y LNs mesentérico) conservadas en frascos estériles individuales refrigeradas a 4ºC. En el Servicio de Diagnóstico de Enfermedades Infecciosas de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria se llevó a cabo un análisis bacteriológico mediante bacterioscopía (tinción de Gram), cultivo y aislamiento (Agar Sangre, Agar Mac Conkey, Agar Sabouraud, Agar Baird-Parker y Agar Hektoen) e identificación de colonias bacterianas con el test API 20E Biomeriex. La tipificación de la cepa bacteriana se realizó en el Laboratorio Nacional de Referencia - Salmonelosis (Laboratorio Central de Veterinaria, MARM, Algete, Madrid). 3.2.5 E STUDIO SEROLÓGICO Para la realización del estudio 3 fue necesario la obtención de muestras séricas a partir de 1) muestras de sangre extraídas en los ejemplares presentes en las distintas explotaciones y 2) en el momento de la exanguinación de los ejemplares sacrificados en matadero (estudio 2). Además se conservaron muestras de pulmón en congelación para la posterior obtención de extractos pulmonares. 3.2.5.1 E XTRACCIÓN DE SANGRE EN EJEMPLARES VIVOS Los lugares de punción elegidos para realizar la extracción de sangre en este estudio fueron: la vena cava craneal o la vena yugular (Ilustración 10), siendo el método de sujeción y estabilización de los animales diferentes en función del tamaño (lechones, animales de cebo y reproductores). IHQ A NTÍGENOS Mh PRRSv PCV2 Desenmascaramiento antigénico Proteasa 0,1% (Tª ambiente) Proteasa 0,1% (8’ - 37ºC) --- Ac primario [] Dr. Feld 4 [1:600] a 1AC7 cepa europea 5 [1:250] b 36A9 5 c [1:200] b Ac secundario biotinado [] Cerdo anti-conejo [1:200] Conejo anti-ratón [1:20] Conejo anti-ratón [1:20] Tiempo de Revelado (Observando C+) 4-5’ 2-3’ 30’’-2’ Material y Métodos: Métodos. Estudio serológico y extractos pulmonares 111 Ilustración 10. Lugares de punción empleados para la extracción de sangre en porcino. Traducido de Straw y cols., (1999). Para la extracción de sangre a los lechones se inmovilizó a los animales en decúbito supino, con el cuello estirado, el cuerpo recto y sujetando las extremidades delanteras hacia caudal (Ilustración 11). Tomando como referencia el mango o manubrio del esternón y borde craneal de la primera costilla, para localizar la vena cava craneal (Ilustración 10). La aguja (20 G., 38 mm) se introdujo en el lugar de punción en dirección ventro-medio-caudal. Ilustración 11. Inmovilización y puntos de referencia para la extracción de sangre en lechones. Punción de la vena cava craneal (Straw y cols., 1999). Para la extracción de sangre a los animales de cebo y los reproductores, se inmovilizó a los animales con un lazo a nivel maxilar. La punción de la vena yugular externa o la vena cava craneal (Ilustración 10) se realizó tomando como puntos de referencia el manubrio del esternón, articulación del codo y el borde medial del músculo braquiocefálico (Ilustración 12). La aguja (18 G., 65 mm o 16G., 90mm) se introdujo en el lugar de punción en sentido dorso-medio-caudal. Ilustración 12. Inmovilización y puntos de referencia en animales de transición y cebo. Punción en vena yugular externa (círculo superior) y vena cava craneal (círculo inferior). (Straw y cols., 1999). En cualquier caso, la extracción de sangre siempre se intentó realizar en el lado derecho del animal, ya que el nervio vago derecho presenta una menor inervación hacia el corazón y diafragma que el izquierdo (VanAlstine, 2012). Vena yugular externa Vena yugular interna Vena cefálica Vena cubital medial Vena cava anterior Vena cefálica accesoria Material y Métodos: Métodos. Estudio serológico y extractos pulmonares 112 3.2.5.2 O BTENCIÓN DE SANGRE EN ANIMALES SACRIFICADOS EN MATADERO La obtención de sangre en los animales sacrificados en matadero se realizó en el momento de la exanguinación. Se evitó coger la sangre del tercio inicial del desangrado, para evitar así la posible contaminación con restos presentes en la piel de los animales o en el cuchillo del técnico. La muestra se obtuvo colocando el tubo vacutainer abierto en la línea del flujo de sangre. 3.2.5.3 O BTENCIÓN Y CONSERVACIÓN DEL SUERO SANGUÍNEO Las muestras de sangre de los animales vivos presentes en las explotaciones y sacrificados en matadero se recogieron en tubos vacutainers de 5 ml sin anticoagulante y se mantuvieron refrigeradas a 4-8ºC hasta su llegada al laboratorio, donde se procedió donde se procedió a la centrifugación de las muestras a 5000rpm durante 3 minutos. Posteriormente, se extravasó el sobrenadante (suero sanguíneo) a tubos eppendorf de 1,5 ml y se conservó en congelación a -80ºC hasta la realización de las diferentes técnicas serológicas. 3.2.5.4 O BTENCIÓN DE E XTRACTOS PULMONARES Para la realización de las técnicas de ELISA con extractos pulmonares fue necesaria la obtención del mismo a partir del tejido pulmonar recogido en matadero (durante el desarrollo del estudio 2). Los extractos pulmonares se obtuvieron siguiendo la técnica desarrollada por Ferroglio y cols., (2000). El protocolo seguido se describe a continuación (Ilustración 13):  Pesar 2,5 gr de tejido pulmonar fraccionándolo en varias piezas.  Dejar a temperatura ambiente 20 minutos en un vacutainer con 2 ml de PBS pH 7,2.  Dejar el tubo en agitación suave (100rpm) durante 4 minutos.  Centrifugar a 3000rpm durante 10 minutos.  Retirar las piezas de tejido del tubo y extraer el sobrenadante.  Almacenar el extracto pulmonar a -20ºC durante 24 horas.  Retirar de congelación y dejar atemperar.  Calentar el extracto durante 30 minutos a 56ºC en baño maría.  Centrifugar a 3000 rpm durante 10 minutos y retirar el sobrenadante que se usará durante la técnica de ELISA. Ilustración 13: Protocolo seguido para la obtención de extracto de tejido pulmonar. Material y Métodos: Métodos. Estudio serológico y extractos pulmonares 113 3.2.5.5 T ÉCNICAS DE ELISA En el estudio 3 se realizaron técnicas de ELISA empleando kits comerciales específicos para la detección de Acs frente a Mh, PRRSv, y PCV2. En el caso de PCV2, el kit comercial elegido permitió la detección de IgG e IgM pudiendo determinar así el momento de la infección. Para el estudio de seroprevalencia, las muestras de suero sanguíneo obtenidas de animales vivos fueron procesadas por duplicado, considerando la media aritmética de los valores de densidad óptica (DO) obtenidos. Igualmente, se realizó la media aritmética de los valores obtenidos en los dos pocillos para control positivo (C+) y los dos pocillos para el control negativo (C-). Para estudiar la viabilidad del uso de extractos pulmonares en técnicas de ELISA también se procesaron por duplicado las muestras de suero sanguíneo de animales sacrificados en matadero y sus correspondientes extractos pulmonares, considerando igualmente la media aritmética de los valores de densidad óptica (DO) obtenidos en cada caso. La lectura se realizó con un lector de ELISA (Anthos 2020 version 1.8 up) utilizando filtro de 450 nm. Los lavados de las placas se realizaron empleando un lavador automático (Anthos fluido).  Mycoplasma hyopneumoniae (Mh) Para la detección de Acs frente a Mh se utilizó el kit comercial de ELISA de bloqueo (INGEZIM M.HYO COMPAC Prod. Ref: 11.MHY.K3.). Se aplicó el protocolo siguiendo las recomendaciones del laboratorio que, de forma resumida, se expone a continuación: Sobre una placa de poliestireno, se fija los Ags de Mh. Al añadir las muestras de suero, en el caso de contener Acs específicos, estos se unirán al Ag. Tras eliminar el material no unido mediante lavados, se añade un conjugado específico marcado con peroxidasa (Ac monoclonal específico para Mh). En el caso de que las muestras presentaran Ac frente al Ag, estos no permitirían la unión del conjugado, mientras que si las muestras no contienen Ac, el conjugado se unirá libremente al Ag de la placa. Esta unión se detecta tras la adición de un sustrato adecuado que desarrolla color en presencia de peroxidasa. Así, la presencia de color indicará ausencia de Ac frente a Mh en la muestra, mientras que la ausencia de color revelará la presencia de Ac frente a Mh. - Validación de resultados:  DO C+ / DO C- < 0,25.  DO C- > 0,75. - Cálculo de punto de corte (PC):  PC (-) = 0,45 x C-.  PC (+) = 0,40 x C-. Material y Métodos: Métodos. Estudio serológico y extractos pulmonares 114 - Interpretación: Las muestras se consideraron POSITIVAS (presencia de anticuerpos frente a Mh), cuando su DO a 450 nm fue igual o inferior al PC positivo (40% del C-). Las muestras se consideraron NEGATIVAS (ausencia de anticuerpos frente a Mh), cuando su DO a 450 nm fue igual o superior al PC negativo (45% del C-). Las muestras que presentaron porcentajes de unión entre ambos valores se consideraron DUDOSAS y en estos casos la recomendación del laboratorio es testar de nuevo al animal transcurridas 2 semanas.  Virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSv) Para la detección de anticuerpos frente al PRRSv se utilizó el kit comercial de ELISA de doble reconocimiento para la detección temprana de anticuerpos (INGEZIM PRRS DR Prod. Ref: 11.PRS.K0.), kit diseñado para detectar niveles muy bajos de anticuerpos en suero o plasma de animales infectados y vacunados. Se aplicó el protocolo siguiendo las recomendaciones del laboratorio que, de forma resumida, se expone a continuación: En placas de poliestireno fijadas con el antígeno (Ag) de PRRS (proteína recombinante N) se dispensa el suero problema, en el caso de que existan anticuerpos (Ac) específicos frente a este antígeno, éstos quedarán fijados a la misma. Al añadir proteína N conjugada con peroxidasa, ésta quedará unida a los Ac fijados previamente. Esta unión se detecta tras la adición de un sustrato adecuado para desarrollar color en presencia de peroxidasa. - Validación del test:  DO a 450 nm del C+ superior a 1,4  DO a 450 nm del Cmenor de 0,25. - Cálculo PC: El PC se obtuvo al multiplicar la DO del C+ por 0,175. - Interpretación de los resultados: Las muestras con DO mayor al PC se consideraron positivas a Ac para PRRSv. Las muestras con DO menores de éste valor fueron consideradas negativas para PRRSv. Material y Métodos: Métodos. Estudio serológico y extractos pulmonares 115  Circovirus porcino tipo 2 (PCV2) En la detección de anticuerpos frente a PCV2 se utilizó el kit comercial de ELISA de captura que nos permitió la identificación y cuantificación de anticuerpos tipo IgM e IgG específicos (INGEZIM CIRCOVIRUS IgG/IgM Prod Ref: 11.PCV.K2.). Se aplicó el protocolo siguiendo las recomendaciones del laboratorio que, de forma resumida, se expone a continuación: Dos anticuerpos monoclonales (AcMs), uno específico de IgG de cerdo y otro específico de IgM son fijados a placas diferentes. Cuando las muestras se añaden a las placas los anticuerpos (Ac) IgM e IgG presentes en el suero problema serán capturados por el AcM de cada placa. Tras lavar para eliminar el material no unido, se añade el antígeno (Ag) (cápsidas vacías recombinantes de PCV) que quedará unido al pocillo solo si el suero problema contiene IgM y/o IgG específicas del PCV2. Tras sucesivos lavados para eliminar el material no adherido, se demuestra la presencia de éste Ag mediante la adición de un AcM específico del PCV conjugado con peroxidasa. Tras la adición del sustrato adecuado, los pocillos con el suero problema con Ac IgM y/o IgG específicos presentan una reacción coloreada, mientras que en los pocillos con sueros problemas negativos, no aparece reacción coloreada. - Validación del test:  DO del C+ en los pocillos de la IgG y la IgM es mayor que 0,7.  DO del Cen los pocillos de la IgG y la IgM es menor que 0,3. Resultados: Estudio de causas de muerte (2007-2012) - Estudio 1 122 Estos animales presentaron, además, lesiones en otros sistemas u órganos (Tabla 12 y 13), que serán descritas a continuación: Así, se observaron lesiones en tegumento en el 43% (6) de los animales. Se observaron lesiones multifocales en flancos y región del cuello de un animal, caracterizadas por alopecia, marcada hiperqueratosis y presencia de gruesas costras de color gris, de extensión variable, desde unos pocos centímetros hasta lesiones más extensas (dermatitis hiperplásica con hiperqueratosis) (Fig. 9A, N13). Otros hallazgos fueron áreas multifocales, localizadas en región inguinal, abdomen y tórax, algunas planas y otras levemente sobreelevadas, bien delimitadas de coloración rojiza (máculas y pápulas) (Fig. 8A, N5). En región abdominal de un animal se observó la presencia de lesiones multifocales, bien delimitadas, circulares, de 1cm de diámetro aproximadamente, sobreelevadas, de coloración rojiza y con presencia de exudado purulento (dermatitis pustular) (Fig. 10A, N14). En otro fue posible observar una intensa coloración amarillenta, tanto en región abdominal e inguinal como en mucosa oral y conjuntiva (ictericia). El tejido subcutáneo mostró, en ocasiones un aspecto gelatinoso traslúcido (edema subcutáneo). Así, se describió edema subcutáneo en un 14% (2), dermatitis hiperplásica con hiperqueratosis, máculas y pápulas, dermatitis pustular o ictericia, cada una en un 7% (1) de los animales (Tabla 12 y 13). En las cavidades corporales del 43% (6) de los animales, se observó presencia de trasudado seroso, traslúcido, amarillento en cavidad torácica (hidrotórax) (Fig. 6A, N17), saco pericárdico (hidropericardio) (Fig. 9B, N13) y cavidad abdominal (ascitis) (Fig. 6B, N17). Un 29% (4) de los animales presentó hidrotórax, un 43% (6) hidropericardio y finalmente, en un 29% (4) se observó ascitis (Tabla 12 y 13). Las serosas de los órganos alojados en las distintas cavidades presentaron lesiones macroscópicas en un 79% (11) de los animales. Se pudo observar, adherida a la serosa de los distintos órganos (asas intestinales, corazón, pulmón), la presencia de exudado blanquecino amarillento, variando su consistencia de lábil a filamentosa, formando en ocasiones flóculos dentro de las respectivas cavidades (exudado fibrinoso) acompañado por trasudado amarillento traslúcido, hasta organizarse formado tejido fibroso en los procesos más crónicos. De esta forma, se observó exudado fibrinoso en la serosa de asas intestinales, hígado, bazo, etc. alojados en cavidad abdominal (peritonitis fibrinosa) (Fig. 5E, N11), en saco pericárdico (pericarditis fibrinosa) (Fig. 5. A, N12), así como en pleura (pleuritis fibrinosa) (Fig. 1A, N4). En los casos más crónicos, se observó proliferación de tejido fibroso dando lugar a adherencias entre pericardio visceral y saco pericárdico (pericarditis fibrosa) (Fig. 2. B, N7); y en pulmones, en pleura visceral formando adherencias entre los distintos lóbulos o entre la pleura y la pared costal (pleuritis fibrosa) (Fig. 4A, N9). Así, del total de los animales se observó peritonitis fibrinosa leve a moderada en el 79% (11), pericarditis fibrinosa en un 14% (2) y evolucionando a pericarditis fibrosa en otro 14% (2); así como, pleuritis fibrinosa en un 29% (4) evolucionando a pleuritis fibrosa en otro 7% (1) de los casos (Tabla 12 y 13). El 43% (6) de los animales presentaba lesiones en hígado. Los principales hallazgos macroscópicos se correspondieron con lesiones multifocales, mal delimitadas, planas en superficie, de morfología irregular y tamaño variable, blanquecinas, identificadas como “manchas de leche” que al corte, se extendieron en profundidad, compatibles con migraciones parasitarias (Ascaris suum) de formas larvarias (hepatitis fibrosa parasitaria) (Fig. 1B, N16). En algunos casos, estas lesiones estuvieron acompañadas por áreas circulares, bien delimitadas, sobreelevadas, de pequeño tamaño (1-2mm aprox.), blanquecinas y de consistencia firme. También se pudo observar, en la cara visceral del lóbulo hepático lateral derecho, una lesión multifocal, coalescente, localmente extensa, pobremente Resultados: Estudio de causas de muerte (2007-2012) - Estudio 1 123 delimitada, plana, circular, de unos 5cm de diámetro aproximadamente, blanquecina, de consistencia blanda que al corte se extendía en profundidad (necrosis hepática) (Fig. 3D, N8). En este animal se observó, en vesícula biliar, distensión, leve engrosamiento de la pared por la presencia de edema y bilis de aspecto arenoso (Fig. 3D Inset, N8). En ocasiones, el hígado presentó severa congestión con marcado patrón lobulillar (Fig. 6A, N17). Se observó, por tanto, hepatitis fibrosa parasitaria en un 21% (3) de los animales, necrosis hepática en un 7% (1) y congestión en un 21% (3) (Tabla 12 y 13). En el sistema digestivo se observaron lesiones macroscópicas en el 43% (6) de los animales. A nivel gástrico, se pudo observar, en mucosa de la región fúndica glandular una lesión focal, bien delimitada, deprimida, lineal, de color rojo oscuro casi negro (úlcera gástrica) (Fig. 8D, N5) y congestión severa de mucosa y presencia de exudado catarral (gastritis catarral) (Fig. 9D, N13). Los principales hallazgos macroscópicos se encontraron a nivel intestinal en un 29% (4) de los animales afectando a los distintos tramos. En intestino fue posible observar la presencia de contenido seroso amarillento y congestión de la mucosa (enteritis catarral) (Fig. 2D, N7) o exudado blanquecino amarillento friable adherido a la mucosa (enteritis fibrinosa), con leve a moderada congestión de la mucosa. Se encontraron adultos de nematodos (Ascaris suum) en un reproductor. En un lechón se observó, en serosa de ciego y colon, la presencia de lesiones multifocales, sobreelevada, circulares principalmente, de 0,5-2cm de diámetro aproximadamente, de consistencia blanda-firme y blanquecinas, (Fig. 3B, N8) que, al corte e inspección de la luz intestinal, se extendían en todo el espesor de la pared (transmural) comprometiendo también la mucosa, observándose lesiones multifocales, bien delimitadas, con bordes sobreelevados, de morfología irregular, variando de 2mm a 2cm, con exudado de color blanquecino amarillento adherido en la región central de las lesiones (tiflitis y colitis fibrinonecrótica) (Fig. 3C, N8). Así, se observó la presencia de úlceras gástricas, gastritis catarral, enteritis catarral y enteritis fibrinonecrótica en un 7% (1) de los animales, cada una de ellas. En un 21% (3) de los casos fue posible observar enteritis fibrinosa (Tabla 12 y 13). En sistema urinario, se observaron lesiones en el 21% (3) de los animales. Los principales hallazgos macroscópicos se localizaban en corteza renal, observándose lesiones multifocales diseminadas, o localmente extensiva en los casos más crónicos (Fig. 10D, N14), levemente deprimidas, puntiforme en algunos casos (Fig. 8C, N5), de coloración blanquecinas, que al corte, se extendían en profundidad (nefritis intersticial) (Tabla 12 y 13). A nivel cardiovascular se observaron lesiones en un 29% (4) de los animales. Los hallazgos más relevantes fueron: en epicardio de orejuela de aurícula o surco interventricular, la presencia de hemorragias multifocales petequiales o equimosis. También se pudo observar la válvula mitral acortada y engrosada, con lesiones multifocales, nodulares, de tamaño variable, coloración blanquecina y consistencia firme (endocardiosis), acompañada por otras lesiones multifocales, nodulares, de 2-5mm de diámetro, de color rojo y de consistencia blanda fluctuante, que al corte rezumaban sangre (quistes hemáticos) (Fig. 9C, N13). Además, se observaron lesiones multifocales en epicardio de ventrículos, blanquecina a grisáceas, planas, moderadamente delimitadas, con bordes irregulares y consistencia blanda, que al corte se extendía a miocardio (necrosis de miocardio) (Fig. 6D Inset, N17) y un moderado aumento de tamaño del corazón de aspecto globoso, con moderada a severa dilatación de ambos ventrículos, severa disminución del grosor de la pared del ventrículo izquierdo y coloración blanquecina del endocardio (cardiomiopatía dilatada). Por tanto, un 14% (2) de los animales presentó hemorragias, un 7% (1) mostró endocardiosis y presencia de quistes hemáticos y otro 7% (1) cardiomiopatía dilatada y necrosis de miocardio (Tabla 12 y 13). Resultados: Estudio de causas de muerte (2007-2012) - Estudio 1 124 Los principales hallazgos observados en los órganos linfoides del 63% (9) de los animales fueron: el aumento de tamaño de los linfonodos (linfoadenomegalia) (Fig. 1C y D, N4 y N16), de forma generalizada o en alguno de los linfonodos inspeccionados (LN MS, IS, MD, PE y/o PF). Por otra parte, se detectaron lesiones en tonsila en un 14% (2) de los animales, observándose en criptas tonsilares, exudado blanquecino amarillento (tonsilitis supurativa) y ocasionalmente, la presencia de una lesión focal bilateral, bien delimitada, levemente sobreelevada, circular, de 5mm de diámetro aproximadamente, con halo negruzco y centro amarillento (tonsilitis fibrinonecrótica) (Fig. 3F, N8). Así, se observó linfoadenomegalia en el 63% (9) de los animales y tonsilitis supurativa o fibrinonecrótica en un 7% (1) de los casos, cada una (Tabla 12 y 13). El sistema músculo-esquelético se vio afectado en el 7% (1) de los animales, observándose a nivel articular en codo, rodilla y región tarsiana, tumefacción periarticular, firme a la palpación. Al corte se observó, en capsula articular, proliferación de tejido fibroso de moderada a severa (artritis fibrosa) (Fig. 2C, N7) (Tabla 12 y 13). Finalmente, el 43% (6) de los animales analizados presentaron lesiones macroscópicas en SNC. Se observó, en meninges, congestión de moderada a severa, acompañada ocasionalmente por hemorragia (Fig. 1E, N4). En cerebro, también se observaron hemorragias petequiales multifocales leves en sustancia blanca (Fig. 1F Inset, N16). En cerebelo, fue posible apreciar severas hemorragias petequiales y equimosis multifocal a difusa, a nivel cortical principalmente (Fig. 1F, N16). Así, se observó congestión en meninges en un 43% (6) de los animales, con hemorragia leve a moderada en un 7% (1). En cerebro y cerebelo, también presentó severas hemorragias petequiales y equimosis un 7% (1) de los animales (Tabla 12 y 13). De los 14 animales con procesos inflamatorios a nivel del sistema respiratorio, un 79% (11) eran lechones (69% de los lechones totales), un 7% (1) eran animales de cebo (50% de los totales) y el 14% restante eran reproductores (29% de los totales) (Tabla 13). Resultados: Estudio de causas de muerte (2007-2012) - Estudio 1 125 Tabla 12: Diagnóstico morfológico de las lesiones macroscópicas más relevantes, observadas en los distintos sistemas u órganos inspeccionados. Porcentaje de animales afectados sobre el total de 14 animales que presentaban lesiones de tipo inflamatorio a nivel pulmonar. S ISTEMAS U ÓRGANOS AFECT . % ( N ) D IAGNÓSTICO MORFOLÓGICO % ( N ) Tegumentos 43% (6) Dermatitis con hiperqueratosis 7% (1) Máculas y pápulas 7% (1) Dermatitis pustular 7% (1) Ictericia 7% (1) Edema subcutáneo 14% (2) Cavidades 43% (6) Ascitis 29% (4) Hidrotórax 29% (4) Hidropericardio 43% (6) Serosas 79% (11) Peritonitis fibrinosa 79% (11) Pleuritis fibrinosa 29% (4) Pleuritis fibrosa 7% (1) Pericarditis fibrinosa 14% (2) Pericarditis fibrosa 14% (2) Hígado 43% (6) Hepatitis fibrosa (manchas de leche) 21% (3) Necrosis hepática 7% (1) Sist. digestivo 43% (6) Úlceras gástricas 7% (1) Gastritis catarral 7% (1) Enteritis catarral 7% (1) Enteritis fibrinosa 21% (3) Enteritis fibrinonecrótica 7% (1) Sist. urinario 21% (3) Nefritis intersticial 21% (3) Sist. cardiovascular 29% (4) Hemorragias 14% (2) Endocardiosis/Quistes hemáticos 7% (1) Cardiomiopatía dilatada/ Necrosis de miocardio 7% (1) Sist. respiratorio 100% (14) Bronconeumonía supurativa (BNsup) 43% (6) Neumonía intersticial (NI) 21% (3) BNsup/NI 29% (4) BNsup/BN fibrinonecrótica 7% (1) Órganos linfoides 63% (9) Linfoadenomegalia 63% (9) Tonsilitis supurativa 7% (1) Tonsilitis fibrinonecrótica 7% (1) Sist. músculoesquelético 7% (1) Artritis fibrosa 7% (1) SNC 43% (6) Congestión en meninges 43% (6) Hemorragia en meninges 7% (1) Hemorragias petequiales/equimosis en cerebro y cerebelo 7% (1) Resultados: Estudio de causas de muerte (2007-2012) - Estudio 1 126 Tabla 13: Diagnóstico morfológico de las lesiones macroscópicas más relevantes, observadas en cada uno de los animales del estudio. Lesiones observadas en los distintos sistemas y órganos de los lechones, animales de cebo (Ceb.) y reproductores (Reprod.) que presentaban lesiones en el sistema respiratorio asociadas a procesos respiratorios (n=14). BNsup, bronconeumonía supurativa; BNfn, bronconeumonía fibrinonecrótica; NI, neumonía intesrticial. D IAGNÓSTICO MORFOLÓGICO L ECHONES C EB R EPROD N4 N7 N8 N9 N10 N11 N12 N16 N17 N22 N23 N5 N13 N14 Tegumentos Dermatitis con hiperqueratosis x Máculas y pápulas x Dermatitis pustular x Ictericia x Edema subcutáneo x x x Cavidades Ascitis x x x x Hidrotórax x x x x Hidropericardio x x x x x x Serosas Peritonitis fibrinosa x x x x x x x x x x x Pleuritis fibrinosa x x x Pleuritis fibrosa x x Pericarditis fibrinosa x x Pericarditis fibrosa x x Hígado Hepatitis fibrosa x x x Necrosis hepática x Digestivo Úlceras gástricas x Gastritis catarral x Enteritis catarral x Enteritis fibrinosa x x x Enteritis fibrinonecrótica x Urinario Nefritis intersticial x x x Cardiovascular Hemorragias x x Endocardiosis +Quistes x Cardiomiopatía dilatada+ Necrosis de miocardio x Respiratorio BNsup x x x x x x NI x x x BNsup+NI x x x x BNsup+BNfn x Órganos linfoides Linfoadenomegalia x x x x x x x x Tonsilitis supurativa x Tonsilitis fibrinonecrótica x Músc-esquel. Artritis fibrosa x SNC Congestión en meninges x x x x x x Hemorragias en meninges x Hemorragias en cerebro y cerebelo x Resultados: Estudio de causas de muerte (2007-2012) - Estudio 1 127 4.1.2.1 L ECHONES N4: Lechón macho de 1,5-2 meses. N16: Lechón macho de 1,5-2 meses. Camada de 8 lechones. Pérdida de apetito, retraso en el crecimiento y apatía. Tos y debilidad en las extremidades con incoordinación en los movimientos. Distrés respiratorio y muerte. Figura 1: Diagnóstico morfológico de las lesiones macroscópicas más relevantes observadas en los lechones N4 y N16. A. Cavidades y pulmón (N4). Moderado a severo hidrotórax. Pleuritis fibrinosa moderada. Bronconeumonía supurativa multifocal y severa neumonía intersticial. Severo edema intersticial. B. Pulmón e hígado (N16). Pulmón. Bronconeumonía supurativa, neumonía intersticial difusa y edema intersticial moderado a severo. Pleuritis fibrinosa leve-moderada. Hígado. Hepatitis fibrosa multifocal de origen parasitario (hígado en manchas de leche). C y D. Linfonodos preescapular (N4) e inguinal profundo (N16). Linfoadenomegalia generalizada de moderada a severa. E. Meninges (N4). Congestión severa generalizada y hemorragia focal en hemisferio derecho. F. SNC (N16). Hemorragias petequiales y equimosis severa en cerebelo. Inset. Hemorragias petequiales leves en sustancia blanca de cerebro. Resultados: Estudio de causas de muerte (2007-2012) - Estudio 1 128 N7: Lechón macho de 1,5-2 meses. Figura 2: Diagnóstico morfológico de las lesiones macroscópicas más relevantes observadas en el lechón N7. A. Pulmones. Atelectasia difusa severa del pulmón izquierdo. Bronconeumonía supurativa moderada en lóbulo caudal derecho. B. Corazón. Pericarditis fibrosa moderada. C. Articulaciones. Artritis fibrosa en cápsula articular de codo izquierdo y rodilla derecha (Inset). D. Intestino. Enteritis catarral moderada a severa en yeyuno. Inset. Apertura de yeyuno. Resultados: Estudio de causas de muerte (2007-2012) - Estudio 1 129 N8: Lechón hembra de 1,5 meses. Letargia, deshidratación, hipotermia, caquexia, vómito amarillo, exudado nasal mucopurulento, ictericia, pelo hirsuto, estertores respiratorios y muerte. Figura 3: Diagnóstico morfológico de las lesiones macroscópicas más relevantes observadas en el lechón N8. A Pulmón: Bronconeumonía supurativa focal leve en lóbulo medio derecho (*). B y C. Intestino grueso (ciego y colon). Tiflitis y colitis fibrinonecrótica difusa segmental severa. Contenido biliar de aspecto arenoso. (B, serosa. C, mucosa). D. Hígado. Necrosis hepática severa, multifocal coalescente, localmente extensa. Estasis de vesícula biliar. Inset. Edema de pared vesical leve y contenido biliar arenoso. E. Linfonodos mesentéricos. Linfoadenomegalia severa. F. Tonsila. Tonsilitis fibrinonecrótica focal bilateral. * * Resultados: Estudio de causas de muerte (2007-2012) - Estudio 1 130 N9: Lechón hembra de 1,5-2 meses. Figura 4: Diagnóstico morfológico de las lesiones macroscópicas más relevantes observadas en el lechón N9. A. Cavidad torácica. Pleuritis fibrosa multifocal moderada-severa. B. Pulmón. Bronconeumonía supurativa subaguda-crónica en lóbulos craneal, medio y caudal derecho. Bronconeumonía fibrinonecrótica focal aguda-subaguda en lóbulo caudal derecho. B y C. Pericarditis fibrosa moderada-severa. Bronconeumonía supurativa en lóbulo craneal izquierdo (porción craneal y caudal) y lóbulo caudal. D. Linfonodos. Linfoadenomegalia moderada de linfonodo preescapular. Resultados: Estudio de causas de muerte (2007-2012) - Estudio 1 131 N10, N11 y N12. Lechones hembras (N10 y N11) y macho (N12) de 2,5 meses. Figura 5: Diagnóstico morfológico de las lesiones macroscópicas más relevantes observadas en los ejemplares N10, N11 y N12. A. Corazón y saco pericárdico (N12). Pericarditis fibrinosa moderada. B. Pulmón (N11). Pleuritis fibrinosa moderada. C. Pulmón (N10). Bronconeumonía supurativa crónica. D. Pulmón (N12). Bronconeumonía supurativa subaguda-crónica y neumonía intersticial. E. Cavidad abdominal (N11). Peritonitis fibrinosa moderada. F. Hígado (N10). Moderada congestión hepática. Inset. Hepatitis fibrosa leve. Resultados: Estudio de causas de muerte (2007-2012) - Estudio 1 138 A nivel cutáneo se observaron lesiones en epidermis, caracterizadas por la presencia de pústulas intraepidérmicas con severo infiltrado inflamatorio de tipo polimorfonuclear eosinofílico y detritus celulares (dermatitis pustular) con estructuras parasitarias compatibles con Sarcoptes scabiei en estrato córneo de la epidermis y paraqueratosis ocasional (Fig. 32B, N13 y Fig. 28D, N5). Además, se observó presencia de infiltrado inflamatorio en epidermis con pérdida de continuidad y exudado inflamatorio polimorfonuclear y detritus celulares (dermatitis ulcerativa). En dermis, los principales hallazgos microscópicos observados fueron: la presencia de infiltrado inflamatorio de tipo polimorfonuclear eosinofílico perivascular y/o intersticial (dermatitis eosinofílica) (Fig. 33C, N14). Otra lesión observada en dermis fue daño de pared de los vasos sanguíneos, con infiltrado inflamatorio de tipo polimorfonuclear, exudado fibrinoide y necrosis de capilares y arteriolas (vasculitis necrotizante) con necrosis multifocales de la dermis, asociadas a los procesos de vasculitis (Fig. 28A y B, N5). También se observó severo infiltrado inflamatorio de tipo polimorfonuclear y mononuclear intersticial en dermis, extendiéndose hasta epidermis, asociado a severa destrucción de la estructura normal de los folículos pilosos (furunculosis) (Fig. 33D, N14). Así, se observó dermatitis pustular parasitaria en el 14% (2) de los animales, asociado a paraqueratosis en un caso (N13) y dermatitis ulcerativa en un 7% (1). En un 21% (3) de los casos se observó dermatitis eosinofílica perivascular o difusa. Finalmente, un 7% (1) presentó además severa vasculitis necrotizante (Tabla 14 y 15). A nivel de serosa se observó en pleura, la presencia de exudado fibrinoso e infiltrado inflamatorio polimorfonuclear acompañado en algunos casos por dilatación de vasos sanguíneos (pleuritis fibrinosa/fibrinopurulenta), y en casos subagudos-crónicos acompañados de discreta proliferación de tejido conectivo (Fig. 19B, N11). En casos crónicos el exudado fibrinoso fue sustituido por moderada a severa proliferación de tejido conectivo (pleuritis fibrosa) (Fig. 20D, N12). En pericardio también fue posible observar la presencia de exudado fibrinoso acompañado de infiltrado inflamatorio de tipo polimorfonuclear (pericarditis fibrinosa/fibrinosupurativa) con escasa proliferación de tejido conectivo en caso subagudos crónicos (Fig. 19C, N11). En casos crónicos se observó moderada a severa proliferación de tejido conectivo acompañado de infiltrado inflamatorio linfoplasmocitario (pericarditis fibrosa) (Fig. 17C, N9). En cápsula hepática también fue posible observar exudado fibrinoso acompañado por infiltrado inflamatorio polimorfonuclear neutrofílico (perihepatitis fibrinopurulenta) (Fig. 19D, N11). Además, se observó exudado fibrinoso e infiltrado inflamatorio en serosa de estómago e intestino (serositis fibrinosa) (Fig. 17E y F, N9) y en mesenterio (peritonitis fibrinosa) (Fig. 19E, N11). Así, se observó en cavidad torácica, presencia de pleuritis fibrinosa/fibrinopurulenta en un 14% (2) de los animales, pleuritis fibrosa en un 29% (4), pericarditis fibrinosa/fibrinopurulenta en un 14% (2), pericarditis fibrosa en un 21% (3). En cavidad abdominal fue posible encontrar perihepatitis fibrinopurulenta en un 14% (2), serositis fibrinosa en estómago e intestino de un 7% (1) y peritonitis fibrinosa en otro 14% (2) (Tabla 14 y 15). A nivel hepático, los hallazgos microscópicos observados fueron la proliferación de tejido conectivo a nivel de septos interlobulillares y espacios portas (hepatitis fibrosa), en ocasiones acompañado por infiltrado inflamatorio de tipo polimorfonuclear eosinófilos (hepatitis fibrosa eosinofílica) (Fig. 26D, N23). En un algunos casos, se observaron lesiones multifocales de necrosis de hepatocitos a nivel centrolobulillar con congestión severa en sinusoides hepáticos (necrosis hepática centrolobulillar) (Fig. 24D, N17) y ocasionalmente se observó en un animal, necrosis hepática con severo infiltrado inflamatorio mixto de tipo polimorfonuclear neutrófilos y mononuclear macrofágico, con detritus celulares en la región central (hepatitis necrótica) (Fig. 16E y F, N8). También se observó en algunos casos, a nivel periportal, la presencia de infiltrado inflamatorio mononuclear linfohistiocítico Resultados: Estudio de causas de muerte (2007-2012) - Estudio 1 139 (hepatitis linfohistiocítica) con células gigantes multinucleadas aisladas (Fig. 29E y F, N5) y en un caso infiltrado mononuclear linfocítico en espacios porta acompañada de moderada-severa congestión y proliferación de tejido conectivo (hepatitis linfocítica periportal). El 21% (3) de los animales presentó hepatitis fibrosa, en un 21% (3) se observó necrosis hepática centrolobulillar y en un 7% (1) hepatitis necrótica. En otro 21% aparecieron lesiones de hepatitis linfohistiocíticas y en un 7% (1) hepatitis linfocítica periportal subaguda crónica (Tabla 14 y 15). En el sistema digestivo se apreciaron lesiones de tipo inflamatorio a nivel de estómago y con mayor frecuencia a nivel intestinal. A nivel gástrico se observó con frecuencia, infiltrado inflamatorio de tipo polimorfonuclear eosinofílico (gastritis eosinofílica) o mononuclear linfoplasmocitario (gastritis linfoplasmocitaria) (Fig. 24I, N17), observándose también en algún caso, la presencia de células inflamatorias, epiteliales, moco y fibrina en la superficie gástrica (gastritis fibrinosa). También se pudo apreciar áreas multifocales de necrosis de la mucosa gástrica, con pérdida del epitelio (gastritis ulcerativa) acompañado, en un caso, por áreas multifocales de congestión severa a nivel de mucosa y submucosa, así como por fibrina y células epiteliales e inflamatorias en la luz (Fig. 31A, N13). Así, en un 7% (1) se observó gastritis linfoplasmocitaria, un 14% (2) de los animales presentaron gastritis eosinofílica, un 7% (1) gastritis fibrinosa y otro 14% (2) presentó gastritis ulcerativa (Tabla 14 y 15). A nivel intestinal se observó infiltrado inflamatorio principalmente en mucosa/submucosa, de tipo polimorfonuclear eosinofílico (enteritis eosinofílica) (Fig. 33F, N14) o de tipo mononuclear linfoplasmocitario (enteritis linfoplasmocitaria) (Fig. 25E, N22) o linfohistiocítico (enteritis linfohistiocítica) (Fig. 29D, N5). En ocasiones, este infiltrado se vio acompañado por la presencia de elevado contenido seroso o mucoso (intestino delgado o grueso) (enteritis catarral) (Fig. 14F, N7), fibrina, epitelio desprendido e incluso bacterias en la luz intestinal con acortamiento de vellosidades intestinales (enteritis fibrinonecrótica). En uno de los animales se observó una severa necrosis afectando a mucosa y submucosa y extendiéndose hasta la capa muscular a nivel de intestino grueso (Fig. 16C, N8). En otros casos sólo se observaron procesos de necrosis de leve a moderado sin presencia de exudado fibrinoso (enteritis necrótica) (Fig. 24J, N17). Así, de los animales estudiados, se observó enteritis eosinofílica en un 21% (3), enteritis linfoplasmocitaria o linfohistiocítica en un 29% (4), enteritis catarral en un 14% (2), fibrinonecrótica en otro 14% (2) y necrótica en un 14% (2) (Tabla 14 y 15). A nivel renal, las lesiones microscópicas observadas con mayor frecuencia en corteza, médula y/o pelvis renal fue: la presencia de infiltrado inflamatorio principalmente de tipo mononuclear linfocítico/linfoplasmocitario de distribución multifocal a nivel intersticial (nefritis intersticial) (Fig. 28F, N5). También se observó moderada-severa proliferación de tejido conectivo en corteza a nivel intersticial con atrofia de túbulos renales y presencia de infiltrado inflamatorio de tipo mononuclear linfoplasmocitario multifocal (nefritis intersticial crónica) (Fig. 33E, N14). En un caso se observó severa presencia de fibrina, sangre e infiltrado inflamatorio de tipo mononuclear linfocítico en espacio glomerular de distribución difusa (glomerulonefritis fibrinonecrotizante) (Fig. 28E, N5) conjuntamente con nefritis intersticial linfoplasmocitaria multifocal y cambios degenerativos con material proteináceo en la luz de los túbulos renales y glóbulos hialinos intracitoplasmáticos en epitelio tubular (tubulonefrosis) (Fig. 28E y F, N5). En el total de animales estudiados, se observó nefritis intersticial en un 64% (8), asociada a fibrosis renal en uno 7% (1) y combinada con glomerulonefritis fibrinonecrotizante y tubulonefrosis en otro 7% (1) (Tabla 14 y 15). Resultados: Estudio de causas de muerte (2007-2012) - Estudio 1 140 A nivel cardiaco, las lesiones más frecuentes fueron infiltrado inflamatorio de tipo polimorfonuclear neutrofílico en miocardio subepicárdico (miocarditis supurativa subepicárdica) (Fig. 19C Inset, N11) o infiltrado multifocal de tipo mononuclear linfocítico/macrofágico (miocarditis no supurativa), asociado ocasionalmente con áreas de necrosis de miocardiocitos (Fig. 24C, N17) También fue posible observar cambios degenerativos en el endocardio caracterizados por el engrosamiento de éste a nivel valvular por la proliferación de fibroblastos (endocardiosis). Así, fue posible observar miocarditis supurativa subepicardica asociada a proceso de pericarditis fibrinopurulenta en un 7% (1), miocarditis no supurativa en un 29% (4) de los casos, asociada a necrosis de miocardio en un 7% (1). Otro 7% (1). Finalmente, se observó endocardiosis en otro 7% (1) (Tabla 14 y 15). A nivel pulmonar, las lesiones microscópicas observadas con mayor frecuencia fueron: la presencia de infiltrado inflamatorio en la luz de bronquios, bronquiolos y alveolos, constituido mayoritariamente por polimorfonucleares neutrófilos, macrófagos, con presencia, en ocasiones, de leucocitos degenerados (bronconeumonía purulenta) (Fig. 19A, N11), y en los casos más severos fue posible observar además la presencia de exudado fibrinoso (membranas hialinas) en la luz alveolar (bronconeumonía fibrinopurulenta) (Fig. 15A, N8). Este patrón de bronconeumonía se vio acompañado en uno de los animales por áreas multifocales de severa congestión y hemorragia con necrosis de leucocitos (bronconeumonía necróticohemorrágica) (Fig. 17B, N9). Otras lesiones asociadas a los procesos de bronconeumonía fue la hiperplasia del BALT y el engrosamiento de las paredes alveolares por la hiperplasia de neumocitos tipo II (neumonía broncointersticial) (Fig. 18A y B, N10). Además se pudo observar engrosamiento de las paredes alveolares por la presencia de infiltrado inflamatorio de tipo polimorfonuclear neutrofílico en los casos más agudos o mononuclear linfoplasmocitarias, así como la hiperplasia de neumocitos tipo II (neumonía intersticial) (Fig. 15D, N8). En procesos de neumonía intersticial más crónicas se observó además exudado inflamatorio mononuclear linfocítico, macrófagos alveolares espumosos y presencia de células gigantes multinucleadas (sincitios) en la luz de las vías aéreas (Fig. 11E Inset, N4 y Fig. 27C, N5). Así mismo, se observó asociado a neumonía intersticial, la presencia de infiltrado inflamatorio de tipo mononuclear linfoplasmocitario en pared bronquial afectando a la lámina propia, con necrosis y pérdida de epitelio respiratorio, así como severo exudado inflamatorio de tipo mononuclear linfohistiocítico y polimorfonuclear neutrófilos, moco y epitelio desprendido en vías aéreas dando lugar a procesos de bronquitis (Fig. 27D, N5). Finalmente, en uno de los animales se observó severo trasudado en la luz alveolar (edema) y una lesión focal de proliferación de tejido conectivo (fibrosis) con presencia de luces vasculares (Fig. 33A, N14). Se observó la presencia de lesiones puras de bronconeumonía purulenta en un 14% (2), neumonía broncointersticial en un 21% (2) y procesos de neumonía intersticial en un 7% (1). Además, un 36% (5) de los animales presentaron lesiones de neumonía intersticial asociadas a neumonía broncointersticial, en un 7% (1) de los casos a bronconeumonía purulenta y en un 7% (1) a bronconeumonía fibrinopurulenta. Otras lesiones que se observaron de forma combinada en otro 7% (1) de los animales fueron procesos de neumonía broncointersticial y bronconeumonía necroticohemorrágica (Tabla 14 y 15). A nivel de los órganos hemolinfoides se observó lesiones en bazo, linfonodos, timo y en tejido linfoide asociado a las mucosas (tonsila y placas de Peyer) A nivel esplénico, fue posible observar pérdida de celularidad a nivel de folículos linfoides y vainas linfoides periarteriolares (depleción linfoide) (Fig. 12D, N4; Fig. 22D, N5). Algunos animales presentaron infiltrado inflamatorio mononuclear difuso de células histiocíticas (histiocitosis) (Fig. 29A, N5), donde fue frecuente observar la presencia de cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos así como Resultados: Estudio de causas de muerte (2007-2012) - Estudio 1 141 infiltrado de células gigantes multinucleadas (sincitios). En algunos animales se observó infiltrado inflamatorio mononuclear histiocítico y abundante presencia de megacariocitos (Fig. 14C, N7). Así, se observó depleción linfoide esplénica en un 50% (7) de los animales; histiocitosis, acompañada en ocasiones por sincitios, en un 29% (4) (Tabla 14 y 15). A nivel de linfonodos, también fue posible observar depleción linfoide e histiocitosis. Otro hallazgo histopatológico, observado con frecuencia fue: el aumento del número de folículos linfoides y de centros germinativos, con un incremento en el número de células de naturaleza linfoide, tanto a nivel de folículos linfoides como en tejido difuso (hiperplasia linfoide) (Fig. 26C, N23). En algunos casos se observó infiltrado inflamatorio de tipo polimorfonuclear neutrofílico (linfadenitis purulenta) o eosinofílico (linfadenitis eosinofílica). En un caso fue posible observar áreas de necrosis con infiltrado inflamatorio y exudado fibrinoso (linfadenitis fibrinonecrótica). Así, en linfonodos, un 29% (4) de los animales presentó depleción linfoide, un 14% (2) presentó histiocitosis, un 50% (7) presentó hiperplasia linfoide a nivel de folículos y/o tejido difuso, y en menor medida, un 7% (1) presentó linfadenitis purulenta, otro 7% (1) linfadenitis eosinofílica, y finalmente, en otro 7% (1) se observó linfadenitis fibrinonecrótica (Tabla 14 y 15). En tonsila también se observó depleción linfoide e histiocitosis (Fig. 12C, N4) o hiperplasia linfoide. Además, otros hallazgos fueron: la presencia de infiltrado inflamatorio de tipo polimorfonuclear neutrofílico (tonsilitis purulenta), ocasionalmente con áreas de necrosis (tonsilitis necrótica) y exudado fibrinoso (tonsilitis fibrinonecrótica). Así, un 14% (2) presentó depleción linfoide en tonsila, uno de ellos (7%, 1) presentado además histiocitosis con cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos basófilos. Otro 14% (2) mostró hiperplasia linfoide. La tonsilitis purulenta se observó en un 14% (2) de los animales, la tonsilitis necrótica estuvo presente en un 7% (1) y en otro 7% (1) se observó tonsilitis fibrinonecrótica (Tabla 14 y 15). En timo se observó histiocitosis a nivel medular, caracterizada por la presencia de infiltrado inflamatorio de tipo mononuclear histiocítico con cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos basófilos y abundante presencia de células gigantes multinucleadas (sincitios) (Fig. 12E, N4; Fig. 22E, N16). Estas lesiones se observaron en un 14% (2) de los animales (Tabla 14 y 15). Finalmente, en placas de Peyer también se observó depleción linfoide e histiocitosis con cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos basófilos y presencia de células gigantes multinucleadas (sincitios) (Fig. 12F, N4; Fig. 22F, N16). La depleción linfoide fue observada en un 21% (3) y la histiocitosis en un 14% (2) de los animales estudiados (Tabla 14 y 15). A nivel articular, se observó engrosamiento a nivel de la membrana sinovial debido a la proliferación de sinoviocitos y de tejido fibroso, con infiltrado inflamatorio de tipo mononuclear linfoplasmocitario y exudación de fibrina, escasos neutrófilos y presencia de bacterias (artritis fibrinosa subaguda-crónica) (Fig. 14A y B, N7). Esta lesión se observó en un 7% (1) de los animales (Tabla 14 y 15). En SNC se observó, a nivel de meninges, la presencia de infiltrado inflamatorio de tipo mononuclear linfocítico, linfocitoplasmático y/o macrofágico de distribución perivascular o difusa (meningitis no supurativa) (Fig. 17G, N9; Fig. 30A, N5). A nivel de encéfalo, el hallazgo histopatológico más frecuentemente observado fue la presencia de infiltrado inflamatorio de tipo mononuclear linfocítico (encefalitis no supurativa) (Fig. 23C, N16) o polimorfonuclear neutrofílico (encefalitis supurativa). El infiltrado inflamatorio a nivel del parénquima nervioso tuvo una distribución predominantemente perivascular. Además, tanto en meninges como en encéfalo fue posible observar Resultados: Estudio de causas de muerte (2007-2012) - Estudio 1 142 vasculitis (Fig. 13C, N4). También se observaron cambios vasculares, como edema y hemorragias perivasculares (Fig. 18H, N9) o difusas, afectando áreas más extensas en parénquima nervioso (Fig. 23D y F, N16), tanto cerebral como cerebelar. Así, se detectó meningitis no supurativa en un 29% (4) de los animales. Un 14% (2) presentó encefalitis no supurativa y un 7% (1) encefalitis supurativas. En un 14% (2) de los casos, estas lesiones estuvieron acompañadas por vasculitis, y en un 7% (1) por edema y hemorragia perivascular y difusa (Tabla 14 y 15). Tabla 14: Diagnóstico morfológico de las lesiones microscópicas más relevantes, observadas en los distintos sistemas u órganos estudiados. Porcentaje de animales afectados (número de animales). (CGMN, células gigantes multinucleadas; CII, cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos). S ISTEMAS U ÓRGANOS AFECT . % ( N ) D IAGNÓSTICO MORFOLÓGICO MICROSCÓPICO % ( N ) Cutáneo 29% (4) Dermatitis pustular 14% (2) Dermatitis ulcerativa 7% (1) Dermatitis eosinofílica 21% (3) Vasculitis necrotizante 7% (1) Furunculosis 7% (1) Serosas 57% (8) Pleuritis fibrinosa / fibrinopurulenta 14% (2) Pleuritis fibrosa 29% (4) Pericarditis fibrinosa / fibrinopurulenta 14% (2) Pericarditis fibrosa 21% (3) Perihepatitis fibrinopurulenta 7% (1) Serositis en estómago e intestino 7% (1) Peritonitis fibrinosa 14% (2) Hígado 78% (11) Hepatitis fibrosa (eosinofílica) 29% (4) Necrosis hepática centrolobulillar 50% (7) Hepatitis necrótica 7% (1) Hepatitis linfohistiocítica 21% (3) Hepatitis linfocítica periportal 7% (1) Sist. digestivo 86% (12) Gastritis linfoplasmocitaria 14% (2) Gastritis eosinofílica 14% (2) Gastritis fibrinosa 7% (1) Gastritis ulcerativa 14% (2) Enteritis linfoplasmocitaria/linfohistiocítica 29% (4) Enteritis eosinofílica 21% (3) Enteritis catarral 14% (2) Enteritis necrótica 14% (2) Enteritis fibrinonecrótica 14% (2) Sist. urinario 64% (9) Nefritis intersticial 57% (8) Nefritis intersticial crónica 7% (1) Glomerulonefritis fibrinonecrótica 7% (1) Tubulonefrosis 7% (1) Sist. cardiovascular 36% (5) Miocarditis supurativa subepicárdica 7% (1) Miocarditis no supurativa 29% (4) Endocardiosis 7% (1) Resultados: Estudio de causas de muerte (2007-2012) - Estudio 1 143 continuación : Sist. respiratorio 100% (14) Bronconeumonía purulenta 21% (3) Bronconeumonía fibrinopurulenta 7% (1) Bronconeumonía necroticohemorrágica 7% (1) Neumonía broncointersticial 57% (8) Neumonía intersticial 57% (8) Fibrosis y edema pulmonar 7% (1) Órganos linfoides 100% (14%) Bazo Depleción linfoide 50% (7) Histiocitosis (CGMN/CII) 29% (4) Linfonodos Depleción linfoide 29% (4) Histiocitosis (CGMN/CII) 14% (2) Hiperplasia linfoide 50% (7) Linfadenitis purulenta 14% (2) Linfadenitis fibrinonecrótica 7% (1) Timo Histiocitosis (CGMN/CII) 14% (2) Tonsila Depleción linfoide 14% (2) Histiocitosis 7% (1) Hiperplasia linfoide 14% (2) Tonsilitis purulenta 14% (2) Tonsilitis necrótica 7% (1) Tonsilitis fibrinonecrótica 7% (1) Placas de Peyer Depleción linfoide 21% (3) Histiocitosis (CGMN/CII) 14% (2) Sist. músculoesquelético 7% (1) Artritis fibrinosa 7% (1) SNC 36% (5) Encefalitis supurativa 7% (1) Encefalitis no supurativa 14% (2) Meningitis no supurativa 29% (4) Vasculitis 14% (2) Hemorragia 7% (1) Resultados: Estudio de causas de muerte (2007-2012) - Estudio 1 144 Tabla 15: Diagnóstico morfológico de las lesiones microscópicas más relevantes, observadas en en los distintos sistemas u órganos, en cada uno de los animales estudiados. (CGMN, células gigantes multinucleadas; CII, cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos). D IAGNÓSTICO MORFOLÓGICO HISTOPATOLÓGICO L ECHONES C EB . R EPROD . N4 N7 N8 N9 N10 N11 N12 N16 N17 N22 N23 N5 N13 N14 Cutáneo Dermatitis pustular x x Dermatitis ulcerativa x Dermatitis eosinofílica x x x Vasculitis necrotizante x Furunculosis x Serosa Pleuritis fibrinosa/fib-pur. x x Pleuritis fibrosa x x x x Pericarditis fibrinosa/fib-pur. x x Pericarditis fibrosa x x x Perihepatitis fibrinopurulenta x x Serositis estómago e intestino x Peritonitis fibrinosa x x Hepático Hepatitis fibrosa (eosinofílica) x x x x Necrosis hepática centrolob. x x x Hepatitis necrótica x Hepatitis linfohistiocítica x x x Hepatitis linfocítica periportal x Digestivo Gastritis linfoplasmocitaria x Gastritis eosinofílica x x Gastritis fibrinosa x Gastritis ulcerativa x x Enteritis linfoplasm./linfohist. x x x x Enteritis eosinofílica x x x Enteritis catarral x x Enteritis necrótica x x Enteritis fibrinonecrótica x x Renal Nefritis intersticial x x x x x x x x Nefritis intersticial crónica x Glomerulonefritis fib-necrót. x Tubulonefrosis x Cardiaco Miocarditis supurativa subep. x Miocarditis no supurativa x x x x Endocardiosis x Pulmonar BN purulenta x x x BN fibrinopurulenta x BN necroticohemorrágica x Neumonía broncointersticial x x x x x x x x Neumonía intersticial x x x x x x x x Fibrosis y edema pulmonar x Resultados: Estudio de causas de muerte (2007-2012) - Estudio 1 145 continuación: D IAGNÓSTICO MORFOLÓGICO HISTOPATOLÓGICO L ECHONES C EB . R EPROD . N4 N7 N8 N9 N10 N11 N12 N16 N17 N22 N23 N5 N13 N14 Órganos linfoides Bazo Depleción linfoide x x x x x x x Histiocitosis (CGMN/CII) x x x Histiocitosis (megacariocitos) x x Linfonodos Depleción linfoide x x x x Histiocitosis (CGMN/CII) x x Hiperplasia linfoide x x x x x x x Linfadenitis purulenta x x Linfadenitis fibrinonecrótica x Timo Histiocitosis (CGMN/CII) x x Tonsila Depleción linfoide x x Histiocitosis x Hiperplasia linfoide x x Tonsilitis purulenta x x Tonsilitis necrótica x Tonsilitis fibrinonecrótica x Placas de Peyer Depleción linfoide x x x Histiocitosis (CGMN/CII) x x Articular Artritis fibrinosa x Nervioso Encefalitis supurativa x Encefalitis no supurativa x x Meningitis no supurativa x x x x Vasculitis x x Hemorragia x Resultados: Estudio de causas de muerte (2007-2012) - Estudio 1 146 4.1.3.1 L ECHONES N4: Lechón macho de 1,5-2 meses. Diagn. morf. macroscópico: Bronconeumonía supurativa leve a moderada y severa neumonía intersticial. Severo edema intersticial. Leve a moderada ascitis, hidrotórax e hidropericárdio. Pleuritis fibrinosa moderada. Peritonitis fibrinosa leve a moderada. Hepatitis fibrosa leve multifocal. Hemorragias multifocales moderadas en aurículas. Linfoadenomegalia generalizada de moderada a severa. Congestión severa generalizada y hemorragia focal de meninge en hemisferio derecho. Figura 11: Diagnóstico morfológico de las lesiones microscópicas más relevantes observadas en corazón y pulmón del ejemplar N4. A. Pericarditis fibrosa. Engrosamiento de epicardio con proliferación de tejido conectivo y escaso exudado de fibrina. Infiltrado inflamatorio linfoplasmocitario (20x). Inset. Vasos sanguíneos con células endoteliales reactivas. B. Miocarditis no supurativa. Infiltrado inflamatorio linfoplasmocitario multifocal perivascular en perimisio. (40x). C-E. Neumonía intersticial severa. C. Septos interlobulillares con abundante edema, fibrina e infiltrado inflamatorio mixto. D. Severa vasculitis con infiltrado inflamatorio mixto, degeneración hialina de paredes vasculares y trombosis. E. Paredes alveolares con hiperplasia de neumocitos tipo II y congestión en capilares. Exudado de fibrina, linfocitos, macrófagos activados y sincitios en luz alveolar (40x). Inset. Detalle de sincitios. F. Neumonía broncointersticial leve. Hiperplasia del BALT (grado I) (F 10x). (H&E). Resultados: Estudio de causas de muerte (2007-2012) - Estudio 1 147 Figura 12: Diagnóstico morfológico de las lesiones microscópicas más relevantes observadas en órganos y tejido linfoide del ejemplar N4. A. Severa depleción linfoide en LN inguinal superficial. Pérdida de celularidad a nivel de folículos linfoides. Hemorragias multifocales (4x). Inset. Paredes vasculares con células endoteliales reactivas. B. Severa Linfocitolisis en folículos linfoides de LN inguinal superficial. Células histiocíticas con cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos basófilos. Infiltrado inflamatorio eosinófilos (40x). Inset. Sincitios. C. Severa depleción linfoide en tonsila. Escasa celularidad en folículos linfoides y zona parafolicular (4x). D. Moderada-severa depleción linfoide esplénica e histiocitosis. Pérdida de celularidad en pulpa esplénica blanca a nivel de folículos linfoides y vainas linfoides periarteriolares (4x). Inset. Infiltrado inflamatorio histiocítico. E. Histiocitosis en médula del timo. Presencia de abundantes sincitios (20x). F. Depleción linfoide e histiocitosis en placa de Peyer. Linfocitólisis e histiocitosis (20x). (H&E). R RE ES SU UM ME EN N 7 . Resumen 253 7 RESUMEN El Cerdo Negro Canario (CNC) es la única raza porcina autóctona en Canarias, descrita por García y Capote en 1982. Son animales rústicos, bien adaptados al medioambiente y al clima de las islas. Se cree que deriva de otras poblaciones porcinas, dando origen a un grupo multirracial diferenciado de gran valor genético mundial, medioambiental y sociocultural. Actualmente está incluida en el Catálogo oficial de las Razas de Ganado de España (Real Decreto 1682/1997), como Raza Autóctona en Peligro de Extinción. En este contexto, para preservar el estándar racial, se ha creado un Libro Genealógico, conjuntamente con un Programa de conservación para su selección. El CNC podría verse amenazado por el desarrollo de enfermedades ampliamente descritas en el cerdo híbrido, condicionando de esta manera su preservación y/o recuperación. El Complejo de Enfermedades Respiratorias del Porcino (PRDC) es considerado en la actualidad como uno de los principales problemas de salud que afectan a las explotaciones porcinas en todo el mundo. Su presentación es multifactorial y va a estar influenciada por la participación de numerosos agentes etiológicos que participan en la patogénesis, así como por las condiciones ambientales, de manejo y factores genéticos. Afecta a animales de 14-22 semanas de edad, produciendo disminución de peso y eficacia de la conversión alimentaria, anorexia, letargia, fiebre, tos y disnea; observándose rangos de morbilidad del 10-40% y mortalidad del 2-10%. Los patógenos involucrados en el desarrollo del PRDC suelen ser agentes víricos primarios (virus del Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRSv), Circovirus porcino tipo 2 (PCV2), virus de la peste porcina clásica, virus de Influenza porcina, virus de la enfermedad de Aujeszky, virus de la Pseudorrabia o Torqueteno virus), agentes bacterianos primarios (Mycoplasma hyopneumoniae (Mh) o Actinobacillus pleuropneumoniae) y agentes bacterianos secundarios (M. hyorhinis, Pasteurella multocida o Haemophilus parasuis, entre otras. El PRDC se ha descrito como una neumonía enzoótica, donde la acción de Mh se ve agravada por virus respiratorios y bacterias oportunistas. Macroscópicamente es frecuente observar bronconeumonía supurativa con áreas de consolidación craneoventral, pálidas grisáceas y atelectásicas. Microscópicamente, se puede presentar neumonía broncointersticial, con exudado en vías aéreas y luz alveolar, infiltrado inflamatorio peribronquial y peribronquiolar, hiperplasia del tejido linfoide asociado a los bronquios (BALT), en ocasiones acompañadas por infiltrado inflamatorio en paredes alveolares e hiperplasia de neumocitos tipo II, dependiendo de los agentes etiológicos involucrados. El conocimiento de los problemas de salud en la población porcina mundial, como una de las misiones de la OIE, representa uno de los aspectos básicos para el control y prevención de las enfermedades. Dada la importancia del PRDC, nos planteamos, conocer la situación epidemiológica del PRDC en CNC y la participación de Mh, PRRSv y PCV2 como agentes patógenos utilizando diferentes métodos de diagnóstico. En el presente trabajo, se realizó necropsia a 25 ejemplares (2007 a 2012), para estudiar las causas de muerte más frecuentes, identificando aquellas asociadas a enfermedades respiratorias. Además, se realizó estudio en matadero en 30 ejemplares sanos, analizando tejido pulmonar y otros órganos (linfoides, renal y hepático) por los cuales tienen tropismo los patógenos involucrados en el PRDC, para evaluar el desarrollo de cuadros subclínicos de enfermedades respiratorias. Y por último, se determinó la prevalencia, mediante análisis serológicos, para cada uno de estos agentes en 329 ejemplares de CNC pertenecientes a 35 explotaciones. Resumen 254 En los casos de necropsias y en los tejidos procedentes de animales sacrificados en matadero, se llevó a cabo un diagnóstico anatomopatógico, así como inmunohistoquímico (IHQ), para la detección de Mh, PRRSv y PCV2. Mediante serología, se analizó la presencia de anticuerpos (Acs) frente a Mh, PRRSv y PCV2, empleando kits de comerciales de inmunoensayo ligado a enzima (ELISA). Además, se evaluó la viabilidad de los extractos de tejido pulmonar, como muestra alternativa al suero sanguíneo para la detección de anticuerpos frente a Mh, PRRSv y PCV2 mediante ELISA. En la población de CNC analizada fue posible detectar Acs frente a Mh (11,2%), PRRSv (4%) y PCV2 (57%), detectándose infección activa o reciente por PCV2 en un 5% de los animales. Se observó coinfección entre estos patógenos en el 51% de las explotaciones analizadas, siendo más frecuente la participación conjunta de Mh, PCV2 y PRRSv (25%), seguida por Mh y PCV2 (20%). Solo fue posible observar coinfección entre Mh y PRRSv en un 3% de las explotaciones. En relación a los extractos pulmonares, se observó una buena correlación entre los resultados obtenidos con extractos pulmonares y suero sanguíneo en el ELISA frente a PCV2 y PRRSv, indicando que ésta podría ser una buena muestra alternativa en la realización de técnicas de ELISA. En el estudio en matadero, se observó macroscópicamente, bronconeumonía supurativa (10%), detectándose a nivel microscópico, neumonía broncointersticial (47%) e hiperplasia del BALT (77%) compatibles con infección por Mh, neumonía intersticial (67%) compatibles con infecciones víricas y la combinación de éstas (37%). Mediante IHQ fue posible la detección de Mh en un 50% de los animales. En los otros órganos evaluados se observó hepatitis fibrosa parasitaria y nefritis intersticial, macroscópicamente, confirmándose a nivel microscópico la presencia de hepatitis fibrosa eosinofílica de origen parasitario (Ascaris suum), y nefritis intersticial compatible con infecciones víricas. En órganos linfoides se observó, principalmente, depleción linfoide o hiperplasia linfoide reactiva. Mediante IHQ sólo fue posible detectar PCV2 en tejido linfoide y riñón (7%). En cuanto a las causas de muerte asociadas a cuadros respiratorios en esta raza, se observaron lesiones macroscópicas de tipo inflamatorio a nivel pulmonar en un 54% de los animales, describiéndose principalmente bronconeumonía supurativa (43%), neumonía intersticial (21%) o la combinación de ambas. Microscópicamente se observó bronconeumonía purulenta, neumonía broncointersticial y neumonía intersticial y ocasionalmente, bronconeumonía fibrinopurulenta. Mediante IHQ fue posible detectar la presencia de Mh (7%), PRRSv (14%) y PCV2 (14%). Por la clínica presentada, las lesiones macroscópicas y microscópicas observadas y la detección del agente patógeno, fue posible describir casos de enfermedad asociadas a PCV2 (Síndrome Multisistémico de Adelgazamiento Post-destete (PMWS) y de Dermatitis y Nefropatía Porcina (PDNS)) y casos de Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRS). También se observó coinfección entre Mh y Salmonella sp. identificada mediante estudio microbiológico, en un caso de salmonelosis septicémica con afectación pulmonar. Además se describieron casos compatibles con infección por Haemophilus parasuis, aunque no fue posible dar un diagnostico etiológico definitivo. Queda demostrado el desarrollo de inmunidad en estos animales frente a agentes patógenos involucrados en el PRDC, detectándose un mayor contacto con PCV2 y Mh. La presencia de lesiones, a nivel pulmonar, en animales sanos sacrificados en matadero; así como, la detección mediante IHQ de estos patógenos, puso en evidencia el desarrollo de infecciones subclínicas. Finalmente, la capacidad de producir enfermedad y causar la muerte de los animales, descrita para estos agentes primarios, así como para agentes secundarios (Salmonella spp. o H. parasuis), se hizo evidente en el estudio de casos donde el sistema respiratorio se vio seriamente afectado. S SU UM MM MA AR RY Y 8 . Summary 257 8 SUMMARY The Canary Black Pig (CBP) is the only native pig breed in the Canary Islands, described by Garcia and Capote in 1982. They are rustic animals, well adapted to the environment and climate of the Islands. It is believed that derives from other pig populations, giving rise to a multiracial group of great importance within the world's genetic heritage, environmental and socio-cultural value. It is currently included in the Official Catalog of the Livestock Breeds of Spain, as Specially-Protected Local Breed Endangered (RD 1682/1997). For preserve the racial standard, a Studbook and active conservation programme of the breed was created. The CBP may be threatened by the development of widely described diseases in pig crossbreed, conditioning the recovery of this endangered breed. Porcine Respiratory Diseases Complex (PRDC) is currently considered wordwide as one of the main health problems affecting pig farms. This syndrome is the result of the interaction between numerous etiological agents involved in the pathogenesis, the immune status of the host and the environment. PRDC affects pigs from 14-22 weeks of age and is characterized by slow growth, decreased feed efficiency, lethargy, anorexia, fever, cough, and dyspnea. Morbidity ranges from 10% to 40% and mortality from 2% to 20%. The pathogens involved in the development of the PRDC are typically classified as primary viral agents (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus (PRRSv), Porcine circovirus type 2 (PCV2), Classical swine fever virus, Swine influenza virus, Aujeszky disease virus, Pseudorabia virus or Torqueteno virus), primary bacterial agents (Mycoplasma hyopneumoniae or Actinobacillus pleuropneumoniae) and secondary bacterial agents (Mycoplasma hyorhinis, Pasteurella multocida or Haemophilus parasuis, among others). The PRDC has been described as an enzootic pneumonia, where the pathogenic action of Mh is aggravated by respiratory viruses and opportunistic bacteria. Pathological findings may vary according to the pathogens involved. Gross lesions are primarily located in the cranioventral areas of the lung, where consolidation, discoloration and failure of the lung tissue to collapse may be observed. Microscopically, bronchopneumonia, sometimes in combination with interstitial pneumonia is often reported, characterized by presence of exudates within airways and alveolar spaces, peribronchial and peribronchioliolar inflammatory infiltration, and bronchus-associated lymphoid tissue (BALT) hyperplasia, occasionally in combination with infiltration of alveolar septae with monocytes and of type II pneumocytes hyperplasia. Knowledge of health problems in the swine population, as one of the missions of the OIE, represents one of the basic aspects for the control and prevention of diseases. Considering the importance of the PRDC, the main objective of the present study was to value the epidemiologic situation of the PRDC for CNC and the participation of Mh, PRRSv and PCV2 as pathogenic agents using different diagnosis methods. Necropsy to 25 animals (2007 to 2012) was performed, to study the causes of death more frequent, identifying those associated to respiratory diseases. In addition, 30 healthy individuals was studied at slaughter, analyzing lung and other tissues (lymphoid, renal and hepatic) for which the pathogens involved in the PRDC have tropism, to evaluate the development of subclinical respiratory disease. Finally, the prevalence for each pathogenic agents in 329 sera samples of animals in 35 herds was determined. Summary 258 Pathological diagnosis of the lesions, as well as immunohistochemical studies (IHC), for the detection of Mh, PRRSv and PCV2 was performed, in those animals who were necropsied and tissues of slaughtered animals. Antibodies against PRRS, PCV2 and Mh were measured using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) comercial kits. In addition, the viability of extracts of lung tissue, as an alternative to blood serum for the detection of antibodies to Mh, PRRSv and PCV2 by ELISA, were evaluated. Titres of antibodies against Mh were found in 11.2% of analyzed sera samples, only 4% was positive for PRRSv and 57% were positive for IgG against PCV2 (late infection). Early infection of PCV2 was observed at 5% of analyzed serum samples. Fifty-one percent of herds showed coinfection between these pathogens, being more frequent co-participation of Mh , PCV2 and PRRSV ( 25%), followed by Mh and PCV2 (20 %). It was only possible to observe coinfection between Mh and PRRSV in 3% of herds. As regards to lung extracts, it was observed a good correlation between the results obtained by those and blood serum using ELISA commercial kits against PCV2 and PRRSv, indicating that this could be a good alternative sample in performing of ELISA techniques. The main pathological findings observed in slaughtered animals were, macroscopically, a suppurative bronchopneumonia (10%), detecting microscopically, broncointersticial pneumonia (47%) and BALT hyperplasia (77%) compatible with Mh infection, as well as interstitial pneumonia (67%) compatible with viral infections and the combination of them (37%). By IHC, detection of Mh was possible in 50% of animals. In other tissues evaluated were observed gross lesions of parasitic fibrous hepatitis and interstitial nephritis. The presence of parasitic eosinophilic fibrous hepatitis (Ascaris suum) and interstitial nephritis viral infections-compatible were confirmed microscopically. Lymphoid tissues mainly showed lymphoid depletion or reactive lymphoid hyperplasia. By IHC, it was only possible to detect PCV2 in kidney (7%) and lymphoid tissue (7%). Regards to causes of death associated with respiratory symptoms in this breed, gross inflammatory lesions in lungs were observed in 54% of animals, mainly describing suppurative bronchopneumonia (43%), interstitial pneumonia (21%) or combination of them. Microscopically, purulent bronchopneumonia, bronchointerstitial pneumonia and interstitial pneumonia, and occasionally fibrinopurulent bronchopneumonia was observed. By IHC was possible to detect the presence of Mh (7%), PRRSV (14%) and PCV2 (14%). Based on the clinical signs, gross and microscopic lesions and the detection of the pathogen, it was possible to describe cases of PCV2-associated diseases (Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome (PMWS) and porcine dermatitis and nephropathy syndrome (PDNS)) and cases of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS). Coinfection between Mh and Salmonella sp, identified by microbiological study, was also observed, in a case of septicemic salmonellosis with pulmonary involvement. Besides cases compatible with H. parasuis were described, although it was not possible to give a definitive etiologic diagnosis. According to the results, we conclude that, although Black Canary Pig is a breed perfectly adapted to the environment, is susceptible to respiratory diseases described in the crossbreeds pigs, like other rustic breeds. The development of immunity in these animals against pathogens involved in PRDC is demonstrated, detecting more contact with PCV2 and Mh. The presence of lesions in the lungs in healthy animals slaughtered, as well as the detection of these pathogens, by IHC, suggest the development of subclinical infections. Finally, the ability to produce disease and cause death of animals, described for these primary pathogens, as well as secondary agents (Salmonella sp. or H. parasuis), it became clear in the study of cases where the respiratory system was seriously affected. ABREVIATURAS 9 . Anexos 266 Tabla 20: Continuación. GC3 continuación GC3 l3 1,04 0,10 0,43 0,18 GC3 l4 0,88 0,11 0,32 0,17 GC3 l5 0,96 0,14 0,41 0,22 GC3 l6 0,89 0,11 0,29 0,22 GC3 l7 0,92 0,13 0,56 0,20 GC3 l8 0,89 0,13 0,47 0,21 GC3 l9 1,00 0,14 0,34 0,23 GC3 l10 0,77 0,11 0,59 0,19 GC3 l11 0,85 0,13 0,56 0,20 GC3 l12 0,97 0,14 0,28 0,20 GC3 l13 0,94 0,17 0,28 0,26 GC3 l14 0,91 0,15 0,46 0,21 GC3 l15 0,84 0,08 0,17 0,21 GC3 l16 0,57 0,08 0,17 0,20 GC3 l17 0,84 0,07 0,15 0,18 GC3 l18 0,88 0,07 0,19 0,42 GC3 l19 0,63 0,08 0,18 0,19 GC3 l20 0,72 0,09 0,17 0,21 GC3 l21 0,66 0,07 0,16 0,33 GC3 l22 0,62 0,08 0,17 0,17 GC3 l23 0,63 0,07 0,17 0,20 GC3 l24 0,83 0,08 0,17 0,23 GC3 c1 0,91 0,16 0,54 0,19 GC3 c2 0,75 0,14 1,92 0,29 GC3 c3 0,80 0,14 1,53 0,22 GC3 c4 0,81 0,12 1,76 0,45 GC3 c5 0,83 0,15 1,48 0,22 GC3 c6 0,79 0,13 1,73 0,23 GC3 c7 0,91 0,13 1,61 0,26 GC3 c8 0,99 0,30 1,80 0,52 GC3 c9 0,83 0,15 1,56 0,27 GC4 GC4 r1 0,59 0,12 0,48 0,25 GC4 r2 0,30 0,18 0,25 0,34 GC4 r3 0,49 0,34 0,35 0,06 GC4 r4 0,44 0,13 1,43 0,34 GC4 r5 0,47 0,10 1,00 0,25 GC4 r6 0,48 0,13 1,51 0,26 GC4 l1 0,46 0,13 0,20 0,23 GC4 c1 0,42 0,17 0,17 0,08 GC4 c2 0,64 0,14 0,16 0,19 GC4 c3 0,45 0,14 0,16 0,24 GC4 c4 0,49 0,13 0,17 0,24 Mh. Muestras positivas: muestras con valores de DO menores al PC +. Muestras negativas: muestras con valores de DO mayores al PC -. PRRSv. Muestras positivas: muestras con valores de DO mayores al PC. PCV2. Muestras positivas: muestras con valores de DO mayores al PC. PCV2 Mh PRRSv IgG IgM DO C+ 0,21 2,54 1,61 1,25 DO C1,23 0,23 0,16 0,22 PC + 0,49 0,38 0,48 0,50 PC - 0,55 Anexos 267 Tabla 20: Continuación. GC5 GC5 r1 0,58 0,08 0,79 0,28 GC5 r2 0,80 0,10 1,38 0,31 GC5 r3 0,52 0,13 0,47 0,29 GC5 r4 0,75 0,11 0,45 0,38 GC5 r5 0,70 0,13 0,37 0,34 GC5 r6 0,55 0,11 0,91 0,30 GC5 r7 0,72 0,53 1,96 0,34 GC5 r8 0,57 0,09 0,94 0,37 GC5 r9 0,65 0,23 1,77 0,35 GC5 r10 0,56 0,10 0,56 0,46 GC5 r11 0,55 0,14 0,72 0,33 GC5 r12 0,60 0,19 0,78 0,29 GC5 r13 0,59 0,09 0,78 0,33 GC5 r14 0,37 0,21 0,46 0,57 GC5 r15 0,67 0,12 0,86 0,35 GC5 r16 0,65 0,11 0,31 0,32 GC5 r17 0,48 0,13 0,75 0,30 GC5 r18 0,49 0,10 1,13 0,25 GC5 r19 0,49 0,09 0,32 0,26 GC5 r20 0,51 0,08 0,58 0,32 GC5 r21 0,80 0,07 0,47 0,27 GC5 r22 0,81 0,12 1,31 0,39 GC5 r23 0,77 0,08 0,31 0,48 GC5 r24 0,59 0,10 0,31 0,23 GC5 r25 0,87 0,08 0,34 0,28 GC5 r26 0,71 0,11 1,26 0,43 GC5 r27 0,88 0,11 1,18 0,39 GC5 r28 0,80 0,08 1,43 0,38 GC5 r29 0,67 0,08 1,32 0,35 GC5 r30 0,70 0,08 1,21 0,37 GC5 r31 0,67 0,08 1,07 0,30 GC5 r32 0,52 0,07 0,83 0,19 GC5 r33 0,48 0,09 0,78 0,33 GC5 l1 0,85 0,18 0,18 2,05 GC5 l2 0,81 0,10 0,18 0,21 GC5 l3 0,65 0,13 0,67 0,23 GC5 l4 0,75 0,10 0,20 0,22 GC5 l5 0,84 0,21 1,64 1,45 GC5 l6 0,96 0,08 0,20 0,24 GC5 l7 0,79 0,09 0,80 0,94 GC5 l8 0,82 0,09 0,24 0,26 GC5 l9 0,74 0,08 0,75 1,41 GC5 l10 0,88 0,06 1,43 1,92 GC5 l11 0,88 0,09 0,19 0,23 GC5 l12 0,64 0,09 1,83 1,87 GC5 l13 0,76 0,11 0,19 0,83 GC5 l14 0,67 0,09 0,23 0,19 GC5 l15 0,74 0,13 0,41 0,21 GC5 l16 0,87 0,12 0,24 0,23 GC5 l17 0,63 0,04 0,24 0,19 GC5 l18 0,72 0,12 0,59 0,19 GC5 l19 0,89 0,10 0,24 0,22 GC5 l20 0,68 0,09 0,47 0,18 GC5 l21 0,86 0,12 0,22 0,22 GC5 l22 0,82 0,10 0,49 0,18 GC5 l23 0,73 0,09 0,20 0,21 GC5 l24 0,71 0,09 0,20 0,20 GC5 l25 0,80 0,07 0,16 0,19 GC5 l26 0,89 0,09 0,64 1,93 GC5 l27 0,83 0,07 0,75 0,22 GC5 l28 0,91 0,07 1,12 0,16 GC5 l29 0,81 0,07 0,79 0,21 Anexos 268 Tabla 20: Continuación. GC5 continuación GC5 c1 0,78 0,11 2,08 0,32 GC5 c2 0,75 0,11 1,87 0,38 GC5 c3 0,79 0,11 1,94 0,31 GC5 c4 0,69 0,12 1,85 0,26 GC5 c5 0,88 0,11 1,70 0,31 GC5 c6 0,80 0,09 1,35 0,27 GC5 c7 0,69 0,10 1,40 0,27 GC5 c8 0,64 0,10 1,91 0,28 GC5 c9 0,90 0,09 1,57 0,26 GC5 c10 0,56 0,11 1,87 0,70 GC5 c11 0,80 0,09 1,97 0,34 GC5 c12 0,92 0,11 2,07 0,31 GC5 c13 0,64 0,12 1,80 0,30 GC5 c14 0,84 0,09 1,28 0,27 GC5 c15 0,81 0,11 1,84 0,56 GC5 c16 0,87 0,17 1,58 0,22 GC5 c17 0,97 0,15 1,27 0,27 GC5 c18 0,76 0,17 1,55 0,31 GC5 c19 0,93 0,08 1,58 0,26 GC5 c20 0,32 0,07 1,93 0,27 GC5 c21 0,67 0,12 2,16 0,32 GC5 c22 0,65 0,07 2,03 0,78 GC5 c23 0,64 0,07 1,12 0,20 GC5 c24 0,73 0,08 1,88 0,36 GC5 c25 0,78 0,09 1,18 0,98 GC5 c26 0,68 0,07 1,86 0,40 GC5 c27 0,66 0,13 1,92 0,34 GC5 c28 0,69 0,09 2,11 0,30 GC5 c29 0,54 0,07 1,99 0,35 GC5 c30 0,64 0,08 1,62 0,30 GC5 c31 0,55 0,07 1,91 0,34 GC5 c32 0,57 0,08 1,90 0,21 GC5 c33 0,54 0,08 2,10 0,32 GC5 c34 0,39 0,09 1,64 0,24 GC5 c35 0,87 0,10 2,04 0,29 GC5 c36 0,74 0,08 2,01 0,41 GC5 c37 0,63 0,08 1,47 0,22 GC5 c38 0,76 0,08 1,96 0,29 Mh. Muestras positivas: muestras con valores de DO menores al PC +. Muestras negativas: muestras con valores de DO mayores al PC -. PRRSv. Muestras positivas: muestras con valores de DO mayores al PC. PCV2. Muestras positivas: muestras con valores de DO mayores al PC. PCV2 Mh PRRSv IgG IgM DO C+ 0,16 2,00 1,91 2,00 DO C1,01 0,10 0,18 0,21 PC + 0,40 0,30 0,57 0,80 PC - 0,45 Anexos 269 Tabla 20: Continuación GC6 GC6 r1 0,48 0,09 0,77 0,20 GC6 r2 0,84 0,11 0,23 0,23 GC6 r3 0,84 0,08 1,27 0,23 GC6 r4 0,55 0,08 0,19 0,30 GC6 r5 0,63 0,09 0,19 0,21 GC6 r6 0,50 0,09 0,28 0,40 GC6 r7 0,65 0,09 1,65 0,41 GC6 r8 0,68 0,09 0,35 0,19 GC6 r9 0,69 0,09 0,36 0,21 GC6 r10 0,93 0,08 1,09 0,40 GC6 r11 0,37 0,08 0,16 0,32 GC6 l1 0,33 0,14 0,22 0,24 GC6 l2 0,96 0,10 0,25 0,21 GC6 l3 0,87 0,09 0,17 0,21 GC6 l4 0,75 0,10 0,14 0,21 GC6 l5 0,57 0,08 0,16 0,21 GC6 l6 0,71 0,11 0,15 0,24 GC6 l7 0,79 0,08 0,14 0,20 GC6 l8 0,89 0,07 0,15 0,50 GC6 l9 0,39 0,08 0,15 0,17 GC6 l10 0,88 0,14 0,13 0,24 GC7 GC7 r1 0,72 0,08 1,06 0,38 GC7 r2 0,76 0,09 0,39 0,24 GC7 l1 1,07 0,14 0,15 0,16 GC7 l2 0,99 0,09 0,16 0,14 GC7 l3 1,06 0,09 0,73 0,71 GC7 l4 1,03 0,10 0,74 0,70 GC7 l5 1,04 0,13 0,17 0,18 GC7 l6 0,97 0,14 0,15 0,17 GC7 l7 1,04 0,11 0,14 0,19 GC7 l8 1,08 0,23 0,13 0,53 GC7 l9 0,88 0,08 0,18 0,22 GC7 c1 0,77 0,09 0,14 0,25 GC7 c2 0,68 0,08 0,13 0,30 GC8 GC8 r1 0,33 0,36 0,60 0,34 GC8 r2 0,73 0,21 1,38 0,27 GC9 GC9 r1 0,75 0,08 2,08 0,51 GC9 r2 0,61 0,13 2,12 0,32 GC10 GC10 r1 0,48 0,08 0,16 0,47 GC10 r2 0,87 0,08 0,16 0,25 Mh. Muestras positivas: muestras con valores de DO menores al PC +. Muestras negativas: muestras con valores de DO mayores al PC -. PRRSv. Muestras positivas: muestras con valores de DO mayores al PC. PCV2. Muestras positivas: muestras con valores de DO mayores al PC. PCV2 Mh PRRSv IgG IgM DO C+ 0,16 2,00 1,91 1,75 DO C1,01 0,10 0,18 0,18 PC + 0,40 0,30 0,57 0,70 PC - 0,45 Anexos 270 10.1.1 S EROLOGÍA LONGITUDINAL EN G RAN C ANARIA Tabla 21: DOs obtenidas para los 32 reproductores en las dos serologías realizadas frente a Mh, PRRSv y PCV2. Indicando, para categoría de reproductores (r), en rojo los valores de DO positivos y negro los negativos. En la serología de PCV2 quedarían sombreados en amarillo aquellos animales con Infección Reciente (uno o dos meses) ( DO de IgG > IgM, siendo DO de IgM positiva) y en naranja aquellos con Infección Activa (DOs de IgM>IgG, siendo los valores de DO positivos). ID Explot. ID Anim. Mh PRRSv PCV2 (IgG) PCV2 (IgM) 1ª Ser. 2ª Ser. 1ª Ser. 2ª Ser. 1ª Ser. 2ª Ser. 1ª Ser. 2ª Ser. GC2** GC2 r1 0,56 0,35 0,15 0,07 0,59 0,93 0,20 0,19 GC2 r2 0,57 0,14 0,16 0,08 1,45 1,68 0,24 0,25 GC2 r3 0,48 0,41 0,14 0,08 0,86 1,25 0,08 0,19 GC2 r5 0,46 0,65 0,15 0,08 1,67 2,05 0,23 0,20 GC2 r7 0,47 0,52 0,18 0,08 0,19 0,17 0,24 0,22 GC3** GC3 r2 0,38 0,58 0,15 0,07 1,40 1,51 0,31 0,25 GC3 r3 0,45 0,61 0,15 0,11 1,22 1,50 0,28 0,27 GC3 r4 0,48 0,52 0,15 0,07 1,48 1,97 0,37 0,43 GC3 r5 0,45 0,61 0,16 0,08 1,24 1,51 0,08 0,19 GC3 r8 0,48 0,70 0,18 0,08 1,06 1,12 0,32 0,21 GC3 r9 0,57 0,38 0,24 0,09 0,28 0,95 0,35 0,15 GC3 r12 0,80 0,65 0,12 0,08 1,94 1,93 0,33 0,41 GC3 r13 0,48 0,70 0,18 0,09 0,34 0,40 0,25 0,16 GC3 r14 0,37 0,50 0,26 0,09 1,32 1,75 0,33 0,32 GC3 r16 0,44 0,66 0,15 0,08 2,01 2,27 0,35 0,24 GC3 r17 0,46 0,37 0,17 0,08 1,86 1,42 0,29 0,19 GC3 r18 0,72 0,60 0,24 0,18 1,13 1,39 0,20 0,18 GC3 r19 0,47 0,97 0,27 0,10 0,92 1,52 0,26 0,26 GC5** GC5 r7 0,72 0,75 0,53 0,08 1,96 1,87 0,34 0,26 GC5 r9 0,65 0,66 0,23 0,18 1,77 1,75 0,35 0,25 GC5 r15 0,67 0,82 0,12 0,07 0,86 1,05 0,35 0,26 GC5 r17 0,48 0,48 0,13 0,08 0,75 0,86 0,30 0,22 GC5 r21 0,80 0,72 0,07 0,08 0,47 0,51 0,27 0,23 GC6** GC6 r1 0,48 0,42 0,09 0,08 0,77 1,00 0,20 0,27 GC6 r2 0,84 0,66 0,11 0,08 0,23 0,17 0,23 0,20 GC6 r3 0,84 0,75 0,08 0,08 1,27 1,30 0,23 0,20 GC6 r4 0,55 0,62 0,08 0,07 0,19 0,15 0,30 0,27 GC6 r5 0,63 0,52 0,09 0,08 0,19 0,15 0,21 0,20 GC6 r6 0,50 0,59 0,09 0,08 0,28 0,24 0,40 0,44 GC10** GC10 r1 0,48 0,63 0,08 0,07 0,16 0,14 0,47 0,33 GC10 r2 0,87 0,76 0,08 0,07 0,16 0,14 0,25 0,23 Mh. Muestras positivas: muestras con valores de DO menores al PC +. Muestras negativas: muestras con valores de DO mayores al PC -. PRRSv. Muestras positivas: muestras con valores de DO mayores al PC. PCV2. Muestras positivas: muestras con valores de DO mayores al PC 2ª serología PCV2 Mh PRRSv IgG IgM DO C+ 0,15 2,03 1,98 2,08 DO C0,98 0,11 0,16 0,17 PC + 0,39 0,30 0,59 0,83 PC - 0,44 Anexos 271 10.2 ELISA FRENTE A M H , PRRS V Y PCV2 EMPLEANDO SUERO SANGUÍNEO Y EXTRACTO PULMONAR Tabla 22: DOs de las distintas muestras para ELISA frente a Mh, PRRVs y PCV2 (IgG/IgM) empleando suero sanguíneo (Suero) y extracto pulmonar (EP). Indicando, en rojo los valores de DO positivos y negro los negativos. En la serología de PCV2 quedarían sombreados en amarillo aquellos animales con Infección Reciente (uno o dos meses) ( DO de IgG > IgM, siendo DO de IgM positiva) y en naranja aquellos con Infección Activa (DOs de IgM>IgG, siendo los valores de DO positivos). sd, animales no analizados. Mh PRRSv PCV2 IgG IgM Suero EP Suero EP Ser.IgG EP Ser.IgM EP Ejemplar 1 0,52 0,84 0,08 0,14 1,15 1,31 0,24 0,07 Ejemplar 2 0,36 0,75 0,09 0,24 1,25 1,63 0,16 0,09 Ejemplar 3 0,45 0,79 0,11 0,13 1,27 1,66 0,60 0,12 Ejemplar 4 0,54 0,91 0,07 0,10 1,17 1,43 0,25 0,08 Ejemplar 5 0,57 0,86 0,07 0,09 1,36 1,66 0,24 0,07 Ejemplar 6 0,52 1,00 0,07 0,11 1,61 1,39 0,17 0,09 Ejemplar 7 sd sd 0,11 0,10 1,52 1,74 0,16 0,12 Ejemplar 8 0,53 0,88 2,48 1,09 1,35 1,47 0,17 0,08 Ejemplar 9 0,51 0,92 0,07 0,13 1,02 1,11 0,13 0,05 Ejemplar 10 0,55 0,99 0,06 0,13 1,26 1,38 0,06 0,06 Ejemplar 11 0,50 0,91 0,10 0,13 1,57 1,64 0,20 0,11 Ejemplar 12 0,61 0,98 0,10 0,11 1,40 1,55 0,18 0,06 Ejemplar 13 0,65 0,88 0,08 0,10 0,63 0,86 0,18 0,07 Ejemplar 14 0,56 1,02 0,09 0,30 0,36 0,61 0,08 0,07 Ejemplar 15 0,55 0,96 0,16 0,14 1,14 1,41 0,44 0,14 Ejemplar 16 sd sd 0,63 0,21 1,40 1,55 0,18 0,13 Ejemplar 17 0,50 0,90 0,10 0,12 1,31 1,41 0,36 0,13 Ejemplar 18 0,57 0,96 0,06 0,09 0,41 0,75 0,13 0,08 Mh. Muestras positivas: muestras con valores de DO menores al PC +. Muestras negativas: muestras con valores de DO mayores al PC -. PRRSv. Muestras positivas: muestras con valores de DO mayores al PC. PCV2. Muestras positivas: muestras con valores de DO mayores al PC. PCV2 Mh PRRSv IgG IgM DO C+ 0,16 2,03 1,46 1,26 DO C1,02 0,13 0,05 0,07 PC + 0,41 0,36 0,44 0,58 PC - 0,46 Anexos 272 10.3 S EROLOGÍA EN L ANZAROTE Tabla 23 : DOs de las distintas muestras para el ELISA frente a Mh, PRRVs y PCV2 (IgG/IgM) en cada explotación de Lanzarote. Indicando, en rojo los valores de DO positivos y negro los negativos. En la serología de PCV2 quedarían sombreados en amarillo aquellos animales con Infección Reciente (uno o dos meses) ( DO de IgG > IgM, siendo DO de IgM positiva) y en naranja aquellos con Infección Activa (DOs de IgM>IgG, siendo los valores de DO positivos). ID Exp ID Anim Mh PRRS PCV2 IgG IgM LZT1 LZT1 1 0,59 0,10 0,52 0,20 LZT2 LZT2 1 0,62 0,08 0,14 0,22 LZT3 LZT3 1 0,69 0,20 0,12 0,20 LZT3 2 0,63 0,10 1,00 0,25 LZT3 3 0,64 0,11 1,11 0,21 LZT3 4 0,68 0,10 1,09 0,17 LZT3 5 0,38 0,09 0,11 0,19 LZT3 6 0,55 0,08 0,05 0,68 LZT3 7 0,65 0,07 0,05 0,24 LZT4 LZT4 1 0,29 0,08 0,14 0,17 LZT4 2 0,41 0,07 0,63 0,18 LZT4 3 0,53 0,12 0,24 0,25 LZT4 4 0,62 0,07 0,59 0,25 LZT4 5 0,50 0,09 0,21 0,15 LZT4 6 0,59 0,07 0,19 0,28 LZT4 7 0,44 0,07 0,64 0,18 LZT4 8 0,43 0,11 0,35 0,27 LZT4 9 0,41 0,23 0,29 0,39 LZT4 10 0,26 0,11 0,05 0,18 LZT4 11 0,19 0,07 0,06 0,22 LZT4 12 0,19 0,14 0,05 0,17 LZT4 13 0,23 0,06 0,05 0,25 LZT4 14 0,48 0,11 0,06 0,21 LZT4 15 0,44 0,07 0,05 0,17 LZT4 16 0,42 0,08 0,05 0,27 LZT4 17 0,37 0,08 0,05 0,11 LZT4 18 0,22 0,08 0,05 0,15 LZT5 LZT5 1 0,60 0,38 1,49 0,18 LZT5 2 0,46 0,12 0,05 0,13 LZT6 LZT6 1 0,54 0,07 1,20 0,36 LZT6 2 0,63 0,09 1,45 0,21 LZT6 3 0,68 0,12 1,45 0,26 LZT7 LZT7 1 0,30 0,75 1,40 0,16 LZT7 2 0,42 2,90 1,46 0,16 LZT7 3 0,42 2,91 1,31 0,14 LZT8 LZT8 1 0,55 0,10 0,06 0,27 LZT8 2 0,45 0,09 0,05 0,44 LZT8 3 0,31 0,28 0,05 0,13 LZT8 4 0,45 0,07 0,06 0,19 Mh. Muestras positivas: muestras con valores de DO menores al PC +. Muestras negativas: muestras con valores de DO mayores al PC -. PRRSv. Muestras positivas: muestras con valores de DO mayores al PC. PCV2. Muestras positivas: muestras con valores de DO mayores al PC. PCV2 Mh PRRSv IgG IgM DO C+ 0,17 1,59 1,43 1,19 DO C0,81 0,12 0,08 0,10 PC + 0,32 0,26 0,43 0,48 PC - 0,36 Anexos 273 10.4 S EROLOGÍA EN T ENERIFE Tabla 24: DOs de las distintas muestras para el ELISA frente a Mh, PRRVs y PCV2 (IgG/IgM) en cada explotación de Tenerife. Indicando, en rojo los valores de DO positivos y negro los negativos. En la serología de PCV2 quedarían sombreados en amarillo aquellos animales con Infección Reciente (uno o dos meses) ( DO de IgG > IgM, siendo DO de IgM positiva) y en naranja aquellos con Infección Activa (DOs de IgM>IgG, siendo los valores de DO positivos). ID Exp ID Anim Mh PRRSv PCV2 IgG IgM TF1 TF1 1 0,40 0,25 1,10 0,12 TF2 TF2 1 0,62 0,10 1,75 0,23 TF2 2 0,62 0,10 1,18 0,13 TF2 3 0,65 0,08 1,64 0,25 TF3 TF3 1 0,62 0,12 1,72 0,33 TF4 TF4 1 0,62 0,14 0,05 0,21 TF4 2 0,76 0,30 0,06 0,19 TF4 3 0,81 0,22 0,72 0,22 TF4 4 0,68 0,11 0,96 0,34 TF4 5 0,54 0,12 1,61 0,28 TF5 TF5 1 0,49 0,07 0,44 0,18 TF5 2 0,39 0,08 1,41 0,22 TF5 3 0,53 0,12 1,63 0,84 TF5 4 0,54 0,21 1,64 0,41 TF5 5 0,58 0,14 1,25 0,42 TF5 6 0,53 0,09 1,37 0,28 TF5 7 0,53 0,38 0,97 0,11 TF5 8 0,50 0,09 0,63 0,21 TF5 9 0,52 0,09 1,15 0,13 TF5 10 0,49 0,10 0,53 0,16 TF6 TF6 1 0,29 2,34 1,60 0,32 TF6 2 0,57 0,09 1,48 0,59 TF6 3 0,78 0,07 0,72 0,11 TF6 4 0,19 0,26 1,42 0,17 TF6 5 0,08 2,29 1,36 0,26 TF7 TF7 1 0,67 0,54 1,35 0,17 TF7 2 0,58 0,07 1,15 0,23 TF7 3 0,90 0,08 0,93 0,11 TF7 4 0,68 0,08 1,61 0,13 TF8 TF8 1 0,55 0,25 1,70 0,17 TF8 2 0,43 0,19 1,41 0,57 TF8 3 0,57 0,19 0,05 0,18 TF9 TF9 1 0,49 0,27 0,77 0,23 TF9 2 0,54 0,08 1,20 0,15 TF9 3 0,64 0,17 0,36 0,10 TF10 TF10 1 0,49 0,28 1,59 0,11 TF10 2 0,79 0,20 0,08 0,15 TF11 TF11 1 0,64 0,28 1,39 0,14 TF11 2 0,63 0,27 1,18 0,35 TF11 3 0,61 0,26 1,59 0,14 TF11 4 0,62 0,19 1,58 0,12 Mh. Muestras positivas: muestras con valores de DO menores al PC +. Muestras negativas: muestras con valores de DO mayores al PC -. PRRSv. Muestras positivas: muestras con valores de DO mayores al PC. PCV2. Muestras positivas: muestras con valores de DO mayores al PC. PCV2 Mh TF1-TF4/TF6-TF10 Mh TF5 PRRSv IgG IgM DO C+ 0,21 0,18 1,85 1,59 1,44 DO C1,06 0,76 0,18 0,04 0,07 PC + 0,42 0,30 0,32 0,48 0,58 PC - 0,48 0,34 Anexos 274 10.5 S EROLOGÍA EN L A P ALMA Tabla 25: DOs de las distintas muestras para ELISA frente a Mh, PRRVs y PCV2 (IgG/IgM) en cada explotación de La Palma. Indicando, en rojo los valores de DO positivos y negro los negativos. En la serología de PCV2 quedarían sombreados en amarillo aquellos animales con Infección Reciente (uno o dos meses) (DO de IgG > IgM, siendo DO de IgM positiva) y en naranja aquellos con Infección Activa (DOs de IgM>IgG, siendo los valores de DO positivos). ID Explot ID Animal Mh PRRSv PCV2 IgG IgM LP1 LP1 1 0,61 0,11 1,38 0,19 LP1 2 0,42 0,10 0,73 0,23 LP1 3 0,56 0,07 1,39 0,15 LP1 4 0,48 0,08 1,32 0,19 LP1 5 0,55 0,07 1,37 0,47 LP1 6 0,54 0,08 1,45 0,19 LP1 7 0,55 0,08 1,16 0,19 LP1 8 0,63 0,16 0,90 0,15 LP2 LP2 1 0,53 0,18 1,31 0,15 LP2 2 0,58 0,10 1,54 0,11 LP3 LP3 1 0,10 0,10 1,44 0,40 LP4 LP4 1 0,58 0,08 0,63 1,37 LP4 2 0,58 0,08 1,76 1,17 LP5 LP5 1 0,32 0,09 0,06 0,45 LP6 LP6 1 0,18 0,12 0,06 0,13 LP6 2 0,41 2,28 1,23 0,13 LP6 3 0,53 0,09 1,27 0,11 LP6 4 0,57 0,09 1,24 0,12 Mh. Muestras positivas: muestras con valores de DO menores al PC +. Muestras negativas: muestras con valores de DO mayores al PC -. PRRSv. Muestras positivas: muestras con valores de DO mayores al PC. PCV2. Muestras positivas: muestras con valores de DO mayores al PC PCV2 Mh PRRSv IgG IgM DO C+ 0,18 1,55 1,49 1,44 DO C0,79 0,16 0,058 0,08 PC + 0,32 0,27 0,45 0,58 PC - 0,35 A AG GR RA AD DE EC CI IM MI IE EN NT TO OS S "El agradecimiento es la memoria del corazón", Lao-Tse. Bibliografía 282 Ameri, M., Zhou, E.M., & Hsu, W.H. (2006). Western blot immunoassay as a confirmatory test for the presence of anti-Mycoplasma hyopneumoniae antibodies in swine serum. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 18(2), 198-201. Andrada, M. (2001). Estudio etiopatogénico de la Neumonía Enzoótica Porcina (NEP). Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, Las Palmas de Gran Canaria. Andrada, M. (2008). Perfil serológico del Cochino Negro Canario aplicado al intercambio de animales entre islas para la mejora genética. Beca de Investigación Simón Benítez Padilla-2008: Biología de Canarias. Andrada, M., Sarradell, J. Ramírez, A. S. Segalés, J. Rodríguez, F., & Fernández, A. (2000). 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