Regulación de la actividad AMPK en músculo esquelético humano por radicales libres e hipoxia

TESIS DOCTORAL Departamento: EDUCACIÓN FÍSICA Programa de Doctorado: “ACTIVIDAD FÍSICA, SALUD Y RENDIMIENTO DEPORTIVO” Título de la Tesis: “REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD AMPK EN MÚSCULO ESQUELÉTICO HUMANO POR RADICALES LIBRES E HIPOXIA.” Tesis Doctoral presentada por D. David Morales Álamo Dirigida por: Dr. D. José Antonio López Calbet (C.U.) Dra. Dª. Cecilia Dorado García (C.U.) Dra. Dª. C. Borja Guerra Hernández (Profesor Asociado Laboral) Los Directores El Doctorando En Las Palmas de Gran Canaria a 20 de Septiembre de 2012. Contenidos David Morales Álamo Página 7 CONTENIDOS Prólogo y agradecimientos………………...…………………………………..9 Lista de publicaciones originales…………………………………………….13 Fuentes de financiación………………………………………………………15 Abreviaturas……………………………………………………….…………...17 Resumen general………………….…………………………………………..21 Summary…………………..…………………………………………………...25 Introducción………………….…………………………………….…………..33 1.1 AMPK……………………………………….………………..…………….37 1.1.1 Mecanismos de activación de AMPK…………….………...……39 1.1.2 Posibles mecanismos de activación de AMPK por hipoxia……….42 1.1.3 Activación de AMPK por ejercicio físico………………….....43 1.1.4 La paradoja de ACCβ, ¿actúa o no como downstream de AMPK?..................................................................................................................49 1.1.5 Mecanismos de inhibición de la fosforilación Thr172-AMPKα…….52 1.2 Test de Wingate de 30 segundos…………..…………….……………..56 1.2.1 Test de Wingate de 30s en hipoxia aguda severa………...58 2. Objetivos……………………………….………………...………………….61 3. Hipótesis……….……………………………………………..……………..64 4. Metodología………………………………………….……………………...67 5. Resultados………………………….……………………………………….83 6. Discusión……………….…………………………………..……………….89 7. Conclusiones………………..…………………………………………….119 8. Conclussions………………………………………………………………125 Contenidos Página 8 David Morales Álamo 9. Bibliografía…………………..………………………......……….………131 10. Apéndices-estudios I-III………………….…………….………………143 Agradecimientos David Morales Álamo Página 9 AGRADECIMIENTOS A José Antonio López Calbet por abrir mi mente, abrirme las puertas del laboratorio de Rendimiento Humano. Podría gastar páginas escribiendo esta parte del agradecimiento porque te debo lo que soy como científico, pero tranquilo seré breve e intentaré ir al grano como a ti te gusta. Gracias por nunca parar de exigirme, para que mi mejora nunca se detenga. Pero sobre todo, por regalarme el más preciado de tus tesoros, tu tiempo. No sabes cómo valoro cada fin de semana o noche que trabajabas en corregir mis artículos, cada vez que bajabas de tu despacho y te sentabas a mi lado, compartiendo tu conocimiento. Después de esas horas, no era el mismo, sabía más, había aprendido de química, de estadística, de fisiología, de actitudes hacia la ciencia. Todavía queda en mi memoria grabado el día que leíste mi primera discusión de un artículo, y aunque lo que me dijiste queda para ti y para mí… no te puedes imaginar cuánto significó, pues no sabes cuántas discusiones de tus artículos o de Carsten había disfrutado antes. A Cecilia Dorado García por permitirme participar en sus estudios de Pilates, Kárate, polimorfismos del receptor de andrógenos… allá en mis inicios en el laboratorio. Por siempre estar dispuesta a ayudarnos. No sabes cómo a veces agradezco leer tus publicaciones sobre masa muscular y ejercicio. A Borja Guerra Hernández, gracias por llevarme de la mano al interior del músculo esquelético y mostrarme un mundo que aún hoy me deja pensando. Gracias por enseñarme el amor por la perfección en lo que uno hace, pero sobre todo, por trabajar fines de semana revisando mis trabajos, por ser un buen director de tesis desde el primer día hasta hoy (probablemente por siempre). A José Ricardo Navarro del Tuero por buena persona, siempre preocupado por nosotros y por los que vendrán en un futuro al laboratorio. Por haber sabido entenderme y ayudarme en todo momento cuando lo he necesitado, desde arreglar una pieza imposible de un aparato imprescindible hasta brindarme un comentario que necesitaba oír. Por ser esa persona que hace ese trabajo que nadie conoce, pero que sin él, nadie podría trabajar en nuestro laboratorio. A Hugo Olmedillas Fernández, por haber confiado en mí cuando ni yo mismo lo hacía. Me ayudaste a aprender de mis errores, a enseñarme a trabajar con meticulosidad, a fijarme en los pequeños detalles. A Amelia Guadalupe Grau, gracias por valorar mi trabajo y esfuerzo, por tus opiniones, por las técnicas que me has enseñado. Te deseo suerte donde trabajes, aunque tú y yo sabemos que en ciencia, salvo algunas excepciones, eso sirve de poco. Para Jesús Ponce González gracias por haber compartido éste camino a mi lado desde hace ya tanto tiempo. El poyo de este laboratorio no es el mismo Agradecimientos Página 10 David Morales Álamo desde que no trabajamos juntos en él. Pero sobre todo, por ser diferente y amenizarlo todo con una sonrisa, y por preocuparte por eso tan importante en un laboratorio, como es el concepto de equipo. A Lorena García Rodríguez, gracias por ponérmelo tan fácil todo, gracias por ayudarme. Por ser tan sincera y buena compañera, por siempre venir con la verdad por delante. Te tengo tanto que agradecer… A Rafael Sánchez de Torres Peralta, por manifestarme tus opiniones. Por compartir conmigo tus vivencias, tu inteligencia emocional, nuestras largas conversaciones de despacho. A José Losa Reyna gracias por trabajar duro, por ser honesto e ir siempre con la verdad por delante. Por amar tu trabajo como el que más. Eres la personificación de que el laboratorio mejora con los años. A María Carmen García Chicano (Macame) gracias por siempre estar dispuesta a ayudar a todos. Gracias también por compartir con nosotros todos tus conocimientos sobre las técnicas de laboratorio. A los que ya no están o apenas estuvieron cuando llegué, a Ignacio Ara, a Jorge Pérez a Germán Vicente, gracias porque todavía encuentro protocolos con vuestros nombres y, sobre todo, gracias por haber estado ahí cada vez que he tenido una duda con algo, demostrando que uno nunca debe olvidar de donde viene. A Roser Cussó por abrirme las puertas de su laboratorio y del CSID de Barcelona noche y día para que pudiera aprender las técnicas de bioquímica que atesoraba. Por siempre tener tiempo para reunirse conmigo y aportarme todo su conocimiento. Guardo muy buenos recuerdos de mi estancia en su grupo y su ayuda. A Mario Guerrero Grueso por estar codo con codo explicándome todos y cada uno de los misterios de la determinación de metabolitos en músculo esquelético. Por compartir conmigo tu sabiduría, y no sólo la del trabajo. A Ana Belén Sánchez García por compartir innumerables tardes en la unidad de bioquímica, por ayudarme a que el tiempo en Barcelona se pasara volando, por ser especial y diferente. To Professor Greenhaff thank you very much for allowing me in your laboratory, for your comments, for giving me the opportunity to learn from you. Thanks to Joanne Mallinson that always thought me with a big smile. To Beth Philips for trusting me, for giving me the opportunity to work independently in her project. To Chris Shannon, Ricardo Samms and Francis Stephens. Agradecimientos David Morales Álamo Página 11 Gracias a Javier Chavarren, Rafael Arteaga, José Antonio Serrano, Joaquín Sanchís Moysi, Juan José Gonzalez Henríquez, por toda la ayuda recibida. He de agradecer a la Universidad de Las Palmas de G.C. y especialmente al Departamento de Educación Física las facilidades que me ha brindado. A la Agencia Canaria de Investigación, Innovación y Sociedad de la Información (ACIISI) del Gobierno de Canarias por haber ofertado y gestionado no sólo la beca que me ha permitido centrar mis esfuerzos en la tesis doctoral, y por haber financiado las estancias de formación de las que he podido disfrutar. Especial agradecimiento a la Jefa de Negociado de Becas, Dña. Alicia Morales por su accesibilidad a la hora de abordar cualquier consulta o gestión. Gracias al personal de la Facultad, Vicky, Teresa, Mila, Julio, Carmen, Leo, Maribel, Julio Martínez, Yolanda, Maribel, Macu, Paola. A todos los sujetos de ese estudio que tanto me ha dado “HPX”, y que han hecho posible todo este trabajo. A mamá, porque crecí con el mejor modelo que alguien puede tener, mostrando tenacidad, entereza y una capacidad sobrehumana para al trabajo. Porque me enseñaste que cuando te gusta lo que haces y crees en tus proyectos, sólo te queda luchar por ellos. Porque me has enseñado lo que es la honradez y el sacrificio con el ejemplo de toda tu vida. Y porque no hay corazón más bueno y noble que el tuyo, ojalá algún día pueda ver el mundo a través de tus ojos, porque a veces me cuesta… A papá, por ser una de las personas más buenas y honradas que conozco, porque sé que tu mundo somos nosotros, tus hijos, porque, aunque adoro mi trabajo, en parte esto ha sido por buscar tu aprobación. Todavía recuerdo cuando me decías que lo primero que necesita una persona es educarse formarse y que ese es la mayor herencia que tú le podías dar a un hijo. Porque sé, que tu mayor deseo siempre fue que tus hijos estudiaran ya que tú no pudiste a pesar de tus aptitudes para ello. Mi mayor alegría es que tú veas esto. A Yeray, mi hermano, tu techo no tiene límites… con sacrificio y esfuerzo puedes conseguir cualquier cosa que te propongas. Gracias por ser un ejemplo en cuanto amor por el saber se refiere, pero gracias sobre todo por cada vez que llegabas a mi cuarto para hablar de nuestras cosas. Ojalá pudiéramos estar más tiempo juntos, porque disfruto como nadie de tu presencia. A vosotros tres, os quiero… Listado de Abreviaturas Página 18 David Morales Álamo Lac: (lactate), lactato LKB1: (Liver Kinase B1), proteína quinasa B1 de hígado. mA: Miliamperios MAPK: (Mitogen-Activated Protein Kinase), proteína quinasa activada por mitógenos. mTOR: mammalian target of rapamycin, proteína quinasa de mamíferos diana de la rapamicina. MPO: (Wingate Mean Power Output), Potencia media del Wingate. RPM: revoluciones por minuto. Ser: (Serine), residuo de aminoácido de serina. SIRT1: (Sirtuin 1), proteína deacetilasa sirtuína-1. TAK1: (Transforming Growth Factor-β-Activated Kinase-1), proteína quinasa 1 activada por el factor de crecimiento transformante de tipo β. Thr: (Threonin), residuo de aminoácido de treonina. Tyr: (Tyrosine), residuo de aminoácido de tirosina. p38 MAPK: (p38 Mitogen-Activated Protein Kinases), proteína quinasa activada por mitógenos p38. PFK2: (Phosphofructokinase 2), fosfofructoquinasa 2. PGC-1α: (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma Coactivator 1-alpha), co-activador transcripcional PGC-1α. PI3K: (Phosphatidylinositol 3-Kinase), fosfatidilinositol-3-quinasa. PKA: (Protein Kinase A), proteína quinasa A. PPO: (Peak Power Output), pico de potencia del Wingate. Listado de Abreviaturas David Morales Álamo Página 19 Pyr: (Pyruvate or Pyruvic acid), piruvato o ácido pirúvico. Rpm: revoluciones por minuto. VO2peak: pico de consumo pico de oxígeno. Wmax: vatios máximos en el test realizado para determinar el VO2max. RESUMEN GENERAL Resumen General David Morales Álamo Página 23 RESUMEN GENERAL La proteína quinasa activada por adenosin monofosfato (AMPK), es un enzima que activa varios procesos catabólicos e inhibe otra serie de procesos anabólicos. La AMPK es una de las principales enzimas involucradas en las adaptaciones al entrenamiento de resistencia. Recientemente se ha demostrado AMPK es activada por fosforilación en el residuo 172 del aminoácido treonina (pThr172-AMPKα ) tras ejercicio de sprint en cicloergometro, también se sabe que en cultivos celulares la actividad AMPK aumenta en hipoxia (por acción de los radicales libres). Para comprobar si el estrés oxidativo regula la actividad AMPK en ejercicio de sprint, reclutamos a 10 sujetos sanos (9 en el estudio II y III) que realizaron 4 test de Wingate combinando hipoxia, normoxia antioxidantes y placebo. En el estudio I demostramos que la combinación de ejercicio de sprint con hipoxia severa aguda no sólo no aumenta pThr172-AMPKα sino que la inhibe. Los mecanismos que parecen regular dicha inhibición son dos. Por un lado, la disminución de la cantidad de proteína total de SIRT1 (una proteína que regula positivamente la actividad AMPK) y su activación (via NAD+/NADH+). Por otro lado, el aumento en la fosforilación de residuos de serina de AMPK (un mecanismo inhibitorio ya conocido de pThr172-AMPKα) de manera dependiente de Akt. En el estudio II de la presente tesis se demostró que el aumento de la fosforilación de la Thr172-AMPK producido por el ejercicio de sprint no parece ser dependiente del nivel de radicales libres, pues al Resumen General Página 24 David Morales Álamo realizar el test de Wingate de 30 s tras la ingestión de antioxidantes se produjo una inhibición de la fosforilación en la Thr172-AMPKα. Dicha inhibición se explica por una disminución de la fosforilación en la Thr286CaMKII (una quinasa activadora de la proteína AMPK). Teniendo en cuenta que la fosforilación de Thr172-AMPK fue bloqueada al realizar el test de Wingate en hipoxia severa aguda, en el estudio III comparamos un test de Wingate de 30 s realizado en hipoxia severa aguda con otro en similar condición pero tras la ingesta previa de antioxidantes. La disminución del estrés oxidativo por parte de los antioxidantes no solventó el bloqueo de la fosforilación de la Thr172-AMPK. En ambas condiciones aumentó la fosforilación de de las serinas de la AMPK, coincidente con la fosforilación de Akt. Además, los antioxidantes produjeron una disminución en la fosforilación de CaMKII como en el estudio II. Los resultados demostraron que la activación de AMPK por ejercicio de sprint es altamente dependiente del nivel de estrés oxidativo generado en el músculo y que los mecanismos que la regulan actúan a varios niveles. SUMMARY Summary David Morales Álamo Página 27 SUMMARY The enzyme AMP-activated protein kinase (AMPK) is a metabolic master switch that turns on catabolic processes (that produce ATP) and turns of anabolic processes (that consume ATP). Since ATP is the main cell energy source, these actions performed by AMPK have been highly conserved throughout evolution. The human skeletal muscle is the tissue contributing the most to the whole-body energy expenditure. One of the main functions regulated by AMPK is the increase of fatty acid transport into the mitochondria through Carnitin-palmitoil transferasa I (CPT1), by ACCβ inhibition. Moreover, AMPK is also involved in the translocation of the glucose transporter GLUT4 to the sarcolemma, thereby producing an increased glucose transport into the muscle fiber. AMPK activation also stimulates the expression of genes regulating the energy homeostasis, induces mitochondrial biogenesis and a shift of the skeletal muscle fibers towards a more oxidative phenotype. Recent studies have shown that AMPK agonist can mimic some of the muscle adaptations to training (endurance training or high intensity interval training). The main stimulus that promotes AMPK activity is the increase on AMP/ATP ratio. AMP binds to γ subunit, which changes the conformational structure of AMPK showing the Thr172 residue of the α catalytic subunit to be phosphorylated by AMPK protein kinase (AMPKK). In skeletal muscle, it seems that LKB1 is the main AMPKK. The phosphorylation on Thr172 on AMPK α subunit produces its activation. One Introducción David Morales Álamo Página 35 INTRODUCCIÓN Hasta no mucho tiempo atrás, los antecedentes históricos de la fisiología del ejercicio o de la teoría del entrenamiento se basaban en el análisis de resultados, bien de rendimiento o morfológicos, de los seres humanos tras la realización de un ejercicio o programa de entrenamiento. Con el tiempo, se fue prestando cada vez más atención a los procesos de adaptación y a los mecanismos que los regulan. Atrás quedan los primeros pasos desentrañando la matriz de todo, la contracción muscular, y las fuentes de energía o rutas metabólicas que permitían que la contracción se prolongara durante el tiempo, la utilización del oxígeno, etc. En la actualidad, gran parte de los trabajos publicados se centran más en el detalle, es decir, en los mecanismos moleculares responsables de estos fenómenos, tratando de identificar las proteínas implicadas en las adaptaciones, en los estímulos que consiguen modular su actividad y pueden, por tanto, conseguir que antes y mejor los resultados deseados. Recientemente se ha demostrado que el sedentarismo produce más muertes que el tabaquismo, siendo una de las mayores causas de morbilidad a nivel mundial (Kohl et al., 2012; Lee et al., 2012). De esta forma, actualmente se considera que el sedentarismo es el punto de partida de numerosas patologías, como por ejemplo el síndrome metabólico, la diabetes tipo II, la obesidad y algunos tipos de cáncer. Teniendo en cuenta lo anteriormente comentado, no es de extrañar que muchos de los esfuerzos investigadores desarrollados por la fisiología del Introducción Página 36 David Morales Álamo ejercicio en los últimos años se hayan centrado en dilucidar los mecanismos moleculares inducidos por el sedentarismo e implicados en estas patologías, con el objetivo de tratar de prevenirlas y/o curarlas a través de práctica regular de actividad física. Uno de los principales efectos beneficiosos del ejercicio, en lo que se refiere a la prevención de las patologías anteriormente comentadas, es la estimulación de la oxidación muscular de ácidos grasos. Gracias a los estudios de calorimetría y metabolómica se sabe, desde hace décadas, que durante el ejercicio de intensidades bajas se oxida un mayor porcentaje de grasas (Krogh & Lindhard, 1920b). Sin embargo, también se sabe que después de ejercicios de alta intensidad, la recuperación es predominantemente aeróbica, aunque este tipo de ejercicio sea altamente dependiente de fuentes anaeróbicas (Krogh & Lindhard, 1920a; Hill et al., 1924). En cuanto a la diabetes tipo II, en la actualidad numerosas investigaciones se centran en los mecanismos y estímulos (ejercicio físico entre ellos) que regulan la sensibilidad muscular y del cuerpo entero a la insulina, que se traducen en un aumento de la translocación de GLUT4 hacia el sarcolema de la fibra muscular (Bienso et al., 2012). Por otro lado, algunos trabajos recientes centran su atención en la cantidad de mitocondrias como un factor determinante en la estimulación de la sensibilidad muscular a la insulina a través de Introducción David Morales Álamo Página 37 mecanismos moleculares donde los radicales libres podrían jugar un papel clave (Sebastian et al., 2012). 1.1 AMPK La proteína quinasa activada por adenosin monofosfato (AMPK), fue descubierta en primera instancia en 1973, como una proteína que inactivaba a la acetil coenzima A carboxilasa (ACC) a través de su fosforilación (Carlson & Kim, 1973). A pesar de esto, la caracterización precisa de esta enzima no se logró hasta una década después (Yeh et al., 1980). Hoy en día se sabe que la AMPK es un importante interruptor metabólico. Su principal función es la preservación de los niveles de energía celulares. La prueba biológica de su importancia reside en que es una enzima altamente conservada a lo largo de la evolución, al menos en las células eucariotas (Hardie et al., 2003). A nivel general, la activación de la AMPK induce la inhibición de varios procesos anabólicos (que consumen ATP) y la activación de procesos catabólicos (producen ATP). Entre los procesos anabólicos inhibidos por la AMPK activa se pueden citar la síntesis proteica, a través de la inhibición de la vía de mammalian target of rapamycin (mTOR) and Elongation Factor-2 kinase (eEF2 kinase) (Horman et al., 2002; Inoki et al., 2003), y la síntesis de glucógeno y ácidos grasos (Henin et al., 1995), procesos que llevan consigo un elevado coste energético para la célula. Por otro lado, entre los principales procesos catabólicos activados por la Introducción Página 38 David Morales Álamo AMPK se encuentran la estimulación del transporte de ácidos grasos hacia el interior de la mitocondria a través de la inhibición de la ACC (ACCβ en el músculo esquelético) (Merrill et al., 1997). Además, también se ha demostrado que la activación farmacológica directa de la AMPK inducida por 5-amino-1-β-ribofuranosil-imidazol-4-carboximida (AICAR) produce la translocación de GLUT4 al sarcolema de la fibra muscular (Merrill et al., 1997). Por último, la activación de la AMPK a largo plazo produce un aumento de la biogénesis mitocondrial a través de mecanismos moleculares mediados por el co-activador transcripcional PGC-1α (Winder et al., 2000; Zong et al., 2002). Lo anteriormente comentado pone de manifiesto que la actividad AMPK es capaz de mediar numerosas adaptaciones en los tejidos tanto a nivel agudo como a nivel crónico. Esta serie de adaptaciones están todas dirigidas a intentar preservar la homeostasis energética celular (niveles de ATP), lo cual demuestra bien a las claras la importancia de dicho sistema y explica su conservación a lo largo de la evolución (Mantovani & Roy, 2011). Además, el hecho de que la activación de la AMPK incremente agudamente el transporte de ácidos grasos al interior de la mitocondria, bloquee la síntesis de ácidos grasos y a largo plazo estimule la biogénesis mitocondrial, ha hecho que actualmente la AMPK sea una importante diana terapéutica para el tratamiento de la obesidad. Con respecto a la diabetes tipo II es tan importante el efecto agudo de translocación de GLUT4 al sarcolema como a nivel crónico la Introducción David Morales Álamo Página 39 estimulación de la biogénesis mitocondrial, ya que se ha demostrado que el número de mitocondrias está disminuido en sujetos con diabetes tipo II (Simoneau & Bouchard, 1995; Simoneau et al., 1995). Quizás, la AMPK pueda ser el nexo de unión entre ambas patologías, pues se ha demostrado que la diabetes tipo II está relacionada con el incorrecto funcionamiento de la señalización muscular activada por insulina debido a la mayor cantidad de grasa intramuscular acumulada (lipotoxicidad), y porque también se ha demostrado que la actividad AMPK es menor en sujetos con diabetes tipo II. 1.1.1 Mecanismos de Activación de AMPK La AMPK es una enzima heterotrímera compuesta de tres subunidades (α, β, γ). La subunidad α es la subunidad catalítica, mientras que las subunidades β y γ son reguladoras (Hardie & Hawley, 2001). La principal función de la AMPK es la conservación del contenido de ATP de la célula, como ya se hizo referencia en el apartado anterior. Por eso no es de extrañar que el principal mecanismo de regulación de la actividad AMPK esté relacionado directamente con los mecanismos modulados por los fosfágenos. El principal mecanismo de activación de la AMPK es dependiente de las concentraciones intracelulares de AMP (activador alostérico) en relación con el nivel de ATP (ratio AMP/ATP) (Richter & Ruderman, 2009). Cuando el AMP aumenta, éste se une a la subunidad γ, lo cual modifica la conformación estructural de la proteína. Dicho Introducción Página 40 David Morales Álamo cambio en la conformación estructural deja visible el residuo de aminoácido treonina172 localizado en la subunidad α, permitiendo de este modo que pueda ser fosforilado. Dicha fosforilación es imprescindible para producir un aumento en la actividad AMPK, no conociéndose hasta la fecha otro mecanismo independiente (Hardie et al., 2003). El principal mecanismo que se ha descrito para explicar la fosforilación de la Thr172-AMPKα es el dependiente de la AMPKK denominada LKB1. LKB1 fosforila a la Thr172 de la AMPKα cuando este residuo de aminoácido es accesible por la acción alostérica del AMP sobre la subunidad γ (Figura 1) (Hawley et al., 2003). Se sabe que la actividad LKB1 es regulada por la formación del complejo LKB1-STRADMO25 (Boudeau et al., 2003), el cual mantiene a LKB1 en el citoplasma. Aun así, no se han encontrado cambios en la actividad LKB1 producidos por factores como el ejercicio físico, por lo que se sospecha que la regulación de AMPK por LKB1 es alostérica (Richter & Ruderman, 2009). Introducción David Morales Álamo Página 41 Figura 1. Figura que muestra las diferentes subunidades de AMPK. La figura ha sido adaptada de Hardie et al. 2001. Recientemente, se ha demostrado que la activación de la proteína quinasa CaMKII a través de su fosforilación en Thr286 puede inducir un aumento en la fosforilación en la Thr172-AMPKα (Raney & Turcotte, 2008). Más recientemente, se ha observado que la fosforilación de la Thr286-CaMKII tiene gran importancia en la fosforilación de la Thr172AMPK, de una forma dependiente de la intensidad del esfuerzo físico (Egan et al., 2010). Por otro lado, se sabe que bloqueando la activación de la proteína TAK1, se produce un defecto en la activación de AMPK (Xie et al., 2006). A su vez, la activación de TAK1 produce un aumento de la fosforilación de la Thr172-AMPKα en levaduras (Momcilovic et al., 2006). Teniendo todo esto en consideración, actualmente se piensa que TAK1 puede también actuar como activador directo de AMPK o de LKB1 (Richter & Ruderman, 2009). Introducción Página 42 David Morales Álamo 1.1.2 Posibles mecanismos de activación de AMPK por hipoxia. En cultivos celulares se ha demostrado que la hipoxia produce un aumento de la fosforilación de la Thr172-AMPKα (Emerling et al., 2007). Este mismo grupo ha demostrado, también en cultivos celulares, que la activación de dicha fosforilación podría estar mediada por los radicales libres (Figura 2) (Emerling et al., 2009), si bien actualmente se desconoce el mecanismo exacto a través del cual la hipoxia estimularía la producción de estos radicales. Algunos trabajos proponen que la hipoxia (0.3-5% O2) podría producir una disminución del ratio AMP/ATP, pero lo cierto es que esto sólo ocurre en anoxia (0-0.3% O2) (Emerling et al., 2009). Esta última afirmación es de gran importancia para el modelo de activación de AMPK que vamos a utilizar en esta tesis doctoral, y será abordado en el siguiente apartado de la introducción. Por otro lado, se sabe que JNK puede activar a TAK1, al menos en miocitos cardiacos (Frazier et al., 2007), y tal como hemos comentando en el apartado anterior, TAK1 puede mediar la activación de AMPK. Entre los mecanismos que pueden producir una mayor activación de JNK se encuentra un aumento de la especies reactivas del oxígeno (ROS) (Frazier et al., 2007) Introducción David Morales Álamo Página 43 Figura 2. Figura que muestra, en cultivos celulares (fibroblastos embrionarios de ratón) como existe un aumento en la fosforilación de ACC (enzima downstream de AMPK) en respuesta a la hipoxia (1.5% O2) y a la exposición de las células a peróxido de hidrogeno (H2O2), el cual induce un considerable estrés oxidativo. Figura extraída de Emerling et al 2009. 1.1.3 Activación de AMPK por ejercicio físico. Como ya se ha comentado en el apartado 1.1, el principal factor que determina un aumento de la actividad AMPK es el incremento del ratio AMP/ATP (Hardie et al., 2003). Además, uno de los principales fenómenos que producen un aumento significativo del ratio AMP/ATP y que por tanto estimulan la actividad AMPK, es el ejercicio físico. Inicialmente, se demostró que la activación de la AMPK muscular se producía en roedores tras ejercicio prolongado en tapiz rodante, sin observar, sin embargo, ningún cambio en la cantidad de AMP intramuscular (Winder & Hardie, 1996). Más recientemente, se demostró en humanos la activación de la AMPKα, en concreto α2, tras la realización de un ejercicio prologado (60 minutos) al 75% del VO2max en Introducción Página 50 David Morales Álamo publicaron un gran número de trabajos mostrando incremento en la fosforilación de ACCβ, en respuesta a un aumento en la fosforilación (Thr172) o activación de la AMPK (Hutber et al., 1997; Merrill et al., 1997). Tal fue el cuerpo de conocimiento al respecto, que muchos trabajos comenzaron a utilizar la fosforilación en la Ser79-ACCβ (Ser221-ACCβ en humanos) como un marcador directo de la actividad AMPK (Emerling et al., 2009). En el año 2008, un estudio demostró que la enzima AMPK no es el único regulador de la fosforilación de ACC (Dzamko et al., 2008). Este estudio demostró, a través de un elegante experimento realizado con ratones “kinase dead” para AMPK, que si estos ratones eran estimulados farmacológicamente con AICAR o mecánicamente, a través de contracciones musculares inducidas (ambos estímulos capaces de activar la oxidación de grasas a través de la fosforilación e inhibición de la ACC mediada por la AMPK), la fosforilación se mantenía a pesar de no estar presente la actividad AMPK (Dzamko et al., 2008). En humanos, y en respuesta a ejercicio prolongado, también se ha demostrado que existe una disociación entre la fosforilación muscular de ACC y de la AMPK (Wojtaszewski et al., 2002). Sin embargo, esta disociación entre ambas fosforilaciones también ha sido demostrada en músculo esquelético humano en respuesta a modelos de ejercicio de corta duración, como es el test de Wingate. Así por ejemplo, Gibala y colaboradores investigaron la fosforilación de AMPK y ACC en respuesta a 4 test de Wingate Introducción David Morales Álamo Página 51 separados por periodos de reposo de 4 minutos (Gibala et al., 2009), poniendo de manifiesto que la fosforilación de la ACCβ (Ser221) se estimula ya inmediatamente después del primer sprint, mientras que la de la AMPKα no ocurre hasta la finalización del cuarto (Gibala et al., 2009). Más recientemente, un estudio publicado por nuestro grupo de investigación encontró dos niveles de disociación entre las fosforilaciones de la AMPK y la ACCβ tras la realización de un test de Wingate de 30s en diferentes condiciones (Guerra et al., 2010). En dicho trabajo se demuestra que tras la realización, en ayunas, de un solo test de Wingate la fosforilación de la Ser221-ACCβ aumenta justo después del test, manteniéndose elevada durante los 30 minutos siguientes a la finalización del test, mientras que la fosforilación de la Thr172-AMPKα sólo aumenta a los 30 minutos después del ejercicio, durante la recuperación (Figura 7A) (Guerra et al., 2010). Sin embargo, cuando el mismo test de Wingate fue realizado 1 hora después de la ingestión de 75 gramos de glucosa, la fosforilación de la ACCβ detectada fue muy similar a la observada en respuesta al ejercicio de sprint en ayunas, mientras que la fosforilación de la AMPKα no se vio estimulada hasta transcurridas 2 horas tras la finalización del test (Figura 7B) (Guerra et al., 2010). Los resultados aportados por este estudio ponen de manifiesto que al menos parte de la fosforilación de la ACCβ debe estar modulada por otras vías de señalización independientes de la AMPK en respuesta a este modelo de ejercicio. Sin embargo, se desconoce el efecto de la combinación de Introducción Página 52 David Morales Álamo un ejercicio de sprint en cicloergómetro de 30 segundos y la hipoxia, sobre la fosforilación de la ACCβ en músculo esquelético humano. De hecho, recientemente se ha propuesto de manifiesto que la activación de AMPK se traducirá en la modulación de una diana downstream o no, en función del tejido, las condiciones celulares y el estímulo (Mantovani & Roy, 2011). A B AA Figura 7. Niveles de fosforilacion de la Thr172-AMPKα (figura izquierda) y de la Ser221-ACCβ (figura derecha) en respuesta a un ejercicio de sprint de 30 s realizado en ayunas (barras grises) o 1 hora después de la ingestión de 75 g de glucosa (barras negras). Figuras tomadas de Guerra et al., 2010. 1.1.5 Mecanismos de inhibición de la fosforilación Thr172AMPKα. La enzima AMPK regula ciertos mecanismos musculares claves para una mayor utilización de las vías aeróbicas. Dada su tremenda Introducción David Morales Álamo Página 53 importancia, es una vía de señalización regulada por diversas señales, redundantes en algunos casos, que la activan o inactivan en función de las necesidades de la célula. El siguiente apartado de la introducción se centrará en desvelar los mecanismos conocidos que puedan tener alguna relación con la inhibición de la actividad AMPK normalmente estimulada en respuesta al ejercicio. La fosforilación de la Thr172-AMPKα no es la única fosforilación conocida de la subunidad α (catalítica). De hecho, en los últimos años se ha demostrado que existen otros residuos de aminoácido de la subunidad α que se fosforilan, pudiendo jugar un papel importante en la modulación de la actividad AMPK. En concreto, la fosforilación de la AMPKα en residuos alternativos de serina (Ser485-AMPKα1 y Ser491-AMPKα2) parece tener una importante función de regulación negativa de la actividad de la enzima. Estas fosforilaciones en residuos alternativos de serina fueron identificadas, a través de la espectrometría de masas, en el año 2003 (Woods et al., 2003). Tras este hallazgo, se demostró en corazón de rata perfundido con insulina, que la fosforilación de la AMPK en esos residuos alternativos de serina resulta en la inhibición de la enzima AMPK (Horman et al., 2006). Dicho efecto inhibitorio inducido por la insulina sobre la oxidación de ácidos grasos a través de la AMPK había sido demostrado anteriormente (Gamble & Lopaschuk, 1997). En la misma línea, la señalización por insulina en células cardiacas, induce un aumento en la fosforilación de la Akt (Thr308 y Ser473), el cual se relaciona Introducción Página 54 David Morales Álamo con un bloqueo de la fosforilación de la Thr172-AMPKα (Kovacic et al., 2003). Tomados en su conjunto, los resultados aportados por estos estudios han puesto de manifiesto que la fosforilación de la subunidad α AMPK en estos residuos alternativos de serina puede impedir, probablemente de manera estérica, la fosforilación en el residuo Thr172 de la misma subunidad de la enzima (Kovacic et al., 2003; Horman et al., 2006). Recientemente, un estudio publicado por nuestro grupo de investigación ha aportado un importante hallazgo en este sentido. En el mencionado estudio, Guerra y colaboradores demostraron en músculo esquelético humano que la fosforilación de la AMPKα en residuos alternativos de serina (Ser485-AMPKα1/Ser491-AMPKα2), inducida por la ingesta de 75 gramos de glucosa 1 hora antes de un test de Wingate de 30 segundos, bloquea la fosforilación de esta misma subunidad en el residuo de Thr172 (Figura 8) (Guerra et al., 2010). Además, el mencionado estudio sugiere que la estimulación de la fosforilación de la AMPKα en los residuos de serina podría estar producida por la activación de la Akt (Ser473-Akt) inducida por la insulina (Guerra et al., 2010). También se ha demostrado que una regulación negativa de las quinasas de proteína que se encuentran upstream de la AMPK, puede producir, como cabría esperar, una disminución de la activación de la AMPK. En concreto, en ratones knockout de LKB1, se ha demostrado que no se detecta la activación de AMPK normalmente inducida por el tratamiento farmacológico con AICAR o por la contracción muscular Introducción David Morales Álamo Página 55 (Sakamoto et al., 2005). Así que por ello en estos estudios también nos dispondremos a analizar las conocidas upstreams de AMPK (LKB1, Thr286-CaMKII, Thr184/187-TAK1) (Sakamoto et al., 2005; Momcilovic et al., 2006; Egan et al., 2010). Finalmente, evidencias recientes sugieren que un determinado nivel de estrés oxidativo es necesario para la correcta activación de diversas vías intramusculares de señalización (Powers et al., 2011). Se sabe que la contracción muscular produce estrés oxidativo, el cual tiene influencia en la contracción muscular (Reid et al., 1992), y que esta generación de radicales libres es tanto mayor cuanto mayor es la intensidad del ejercicio (Munoz Marin et al., 2010). Aunque en un principio se pensó que los radicales libres eran perjudiciales para la integridad de las células, las nuevas evidencias demuestran que, estos radicales libres intramusculares inducidos por el ejercicio son necesarios en un determinado nivel para una correcta activación de diversas vías de señalización (Powers et al., 2011). De hecho, diversos estudios han puesto de manifiesto que la suplementación con antioxidantes, como por ejemplo la vitamina C (conocido antioxidante), impide determinadas adaptaciones musculares que se producen en respuesta al entrenamiento de resistencia, presumiblemente a través de PGC-1α (Gomez-Cabrera et al., 2008). Introducción Página 56 David Morales Álamo Figura 8. Niveles de fosforilacion de la Thr172-AMPKα (figura izquierda) y de las Ser485-AMPKα1/Ser491-AMPKα2 (figura derecha) en respuesta a un ejercicio de sprint de 30 s realizado en ayunas (barras grises) o 1 hora después de la ingestión de 75 g de glucosa (barras negras). Figuras tomadas de Guerra et al., 2010. 1.2 Test de Wingate de 30 segundos. El test de Wingate de 30 s fue creado originariamente en el Instituto Wingate, en Israel. Dicho test consistía en un test en cicloergometro en el que se usaba el 7% del peso corporal del sujeto como resistencia de frenado y cuya duración era de 30 segundos (Bar-Or, 1987). Hay innumerables publicaciones que hablan sobre su enorme dependencia de las vías anaeróbicas debido a las características del esfuerzo, estando la intensidad de este ejercicio por encima del VO2max (supramáximo). El rendimiento en el test de Wingate ha sido relacionado Introducción David Morales Álamo Página 57 con el rendimiento en pruebas con un componente anaeróbico importante como los 400 metros lisos (van Ingen Schenau et al., 1994). De esta forma, se ha determinado que aproximadamente un 80% de la energía utilizada para la realización del test de Wingate de 30 s proviene de la vías anaeróbicas (Calbet et al., 1997). En la misma línea, muchas son las publicaciones que demuestran una alta acumulación de lactato intramuscular tras dicho test (Bogdanis et al., 1995; Parra et al., 2000). Además, la alta intensidad del test provoca un gran incremento del ratio muscular de AMP/ATP (3.2 veces) (Chen et al., 2000). Aun así, a pesar del alto porcentaje de predominio anaeróbico del test de Wingate existe un porcentaje de la energía que proviene de las vías aeróbicas durante el esfuerzo (Calbet et al., 1997; Calbet et al., 2003). El test de Wingate original presenta un problema. Se sabe que un mismo sujeto pedaleando a una misma intensidad (vatios), pero a diferentes revoluciones no tiene el mismo consumo de oxígeno (Dickinson, 1929; Coast & Welch, 1985; Chavarren & Calbet, 1999). Por ello para la mejor comparación entre sujetos, se ha desarrollado una variante del test original fijando las revoluciones por minuto (rpm), test denominado Wingate isocinético (Jones et al., 1985). La frecuencia de pedaleo óptima para una carga baja se encuentra en ~60 rpm (100 w), para una carga moderada de 300 w se estima que ronda los 80 rpm, mientras que para cargas elevadas se sitúa en unas 120 rpm (600 w) (Coast & Welch, 1985). Aun así, la acumulación de metabolitos y el pico Introducción Página 58 David Morales Álamo de potencia (Pmean) son similares en un rango entre 60 y 140 rpm (Jones et al., 1985), siendo éste el rango que se suele alcanzar en un test de Wingate clásico (Calbet et al., 2003). Teniendo en cuenta todo lo anteriormente comentado, y tras experimentos previos realizados en nuestro laboratorio, decidimos fijar las revoluciones óptimas para un test de Wingate isocinético en 100 rpm para los tres estudios que componen esta tesis doctoral. 1.2.1 Test de Wingate de 30s en hipoxia aguda severa. Debido al alto porcentaje de energía proveniente de las vías anaeróbicas en el test de Wingate (Calbet et al., 1997), se ha intentado en algunos trabajos determinar si la realización de dicho test en hipoxia aguda puede tener alguna incidencia en su rendimiento o en las vías metabólicas que se utilizan durante dicho esfuerzo (McLellan et al., 1990; Calbet et al., 2003). Gracias a esto, actualmente se sabe que la hipoxia leve aguda (FiO2: 0.13) a pesar de producir un descenso del 16% en la saturación de oxígeno, no produce ningún cambio en el Pico de Potencia del Wingate (PPO) o en la potencia media (MPO) (McLellan et al., 1990). A nivel de acumulación de metabolitos, comparado con el Wingate en normoxia, el test en hipoxia leve aguda produce una mayor acumulación de lactato intramuscular (McLellan et al., 1990), lo que sugiere una mayor dependencia de las vías anaeróbicas (McLellan et al., 1990). En esta misma línea, un trabajo previo de nuestro laboratorio, ha demostrado que Introducción David Morales Álamo Página 59 el déficit de oxígeno es mayor en la condiciones de hipoxia severa aguda (FiO2: 0.10), demostrando también una mayor dependencia de las vías anaeróbicas en el esfuerzo (Calbet et al., 2003). No obstante, sólo los ciclistas de pista especializados en pruebas de sprint experimentaron un deterioro de la potencia media del Wingate (MPO) (Calbet et al., 2003). Esto último demuestra que los deportistas cuyo sistema anaeróbico estaba llevado al límite ya en normoxia (sprinters), no pudieron compensar la ausencia de oxigeno a través de dicho sistema (Calbet et al., 2003). Finalmente, teniendo en cuenta que el test de Wingate es ya de por sí un ejercicio de intensidad muy elevada (lo cual hemos visto que es muy importante para activar la AMPK muscular), que la hipoxia potencia aún más la intensidad del esfuerzo y la dependencia anaeróbica del mismo, y que la hipoxia de por sí misma parece producir un aumento de la actividad AMPK, una de las hipótesis de partida de los estudios que componen esta tesis doctoral es que la combinación de ejercicio de sprint e hipoxia podría potenciar sinérgicamente la fosforilación (activación) de la AMPK en músculo esquelético humano. METODOLOGÍA Resumen de Métodos y Procedimientos David Morales Álamo Página 69 4. RESUMEN DE LOS METÓDOS Y PROCEDIMIENTOS UTILIZADOS 4.1 Sujetos y procedimientos generales Los valores medios de los parámetros edad, talla, peso corporal y porcentaje de grasa de los sujetos que participaron en los estudios realizados se describen en la Tabla 1. Todos los sujetos fueron informados, de forma oral y escrita, acerca de los procedimientos y objetivos del estudio así como de los posibles riesgos y beneficios, tras lo cual firmaron la correspondiente autorización. Además, todos los estudios fueron realizados de acuerdo a la Declaración de Helsinki y fueron aprobados por el Comité Ético de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria (CEIH-2010-01). Estudio I Estudio II y III N=10 N=9 Media ± DE Media ± DE Edad (años) 25.1 ± 4.5 25.2 ± 4.7 Altura (cm) 176.7 ± 5.3 176 ± 5.1 Peso (Kg) 80.2 ± 9.9 79.4 ± 10.1 Grasa Corporal (%) 18.2 ± 6.3 18.3 ± 6.7 Tabla 1. Características de los sujetos experimentales que participaron en los estudios I, II y II que componen esta Tesis Doctoral. Inicialmente se reclutaron 10 sujetos pero uno de ellos abandonó los experimentos tras el Estudio I. Resumen de Métodos y Procedimientos Página 70 David Morales Álamo Estudio I En este estudio participaron 10 sujetos sanos estudiantes de educación física. Los sujetos realizaron dos test isocinéticos de Wingate de 30 s (100 rpm), en orden randomizado y en días separados. Los voluntarios llegaron en ayunas al laboratorio y tras la ingesta de píldoras que contenían placebo (similares en textura y forma a las que contenían el coctel de antioxidantes (Estudios II y III)), y que fueron ingeridas en dos tomas, de la siguiente forma: 2 horas antes del ejercicio de sprint la primera toma y 1 hora y media antes del ejercicio la segunda dosis. Al llegar al laboratorio, se les colocó un catéter en una vena del antebrazo, se les extrajo una muestra de sangre y una biopsia del vasto lateral del cuádriceps mediante la técnica de Bergstrom con succión mientras permanecieron tumbados en la camilla. Posteriormente, los sujetos subieron al cicloergómetro Lode Excaliburt Sport 925900 (Groningen, Holanda) y respiraron durante 4 minutos la mezcla de gas correspondiente al test en normoxia (FiO2:0.21) o hipoxia (FiO2:0.10), con una boquilla conectada a un analizador de gases (Vmax N29; Sensormedics, California, USA) mientras respiraban el contenido aire de un saco de Douglas (en el caso del test de hipoxia). Tras estos 4 minutos, los sujetos realizaron un test de Wingate isocinético de 30s. Inmediatamente tras la finalización del test, se procedió a extraer una nueva biopsia del vasto lateral del cuádriceps y otra muestra de sangre. Esta toma de muestras fue repetida nuevamente a los 30 minutos y 2 Resumen de Métodos y Procedimientos David Morales Álamo Página 71 horas tras la finalización del ejercicio y durante la recuperación. Para más detalles consultar la sección de material y métodos del Estudio I anexado. Estudio II En este estudio participaron 9 de los 10 sujetos sanos estudiantes de educación física que también tomaron parte en el Estudio I. Los sujetos realizaron dos test de Wingate isocinéticos de 30 s (100 rpm), uno en cada sesión experimental, en orden randomizado y en días separados. Los voluntarios llegaron en ayunas al laboratorio y tras la ingesta de unas píldoras que contenían un coctel de antioxidantes o un placebo (éstas últimas similares en textura y forma a las que contenían el coctel de antioxidantes) y que fueron ingeridas en dos tomas, de la siguiente forma: 2 horas antes del ejercicio de sprint la primera toma (coctel de antioxidantes: ácido α-lipoico (300 mg), vitamina C (500 mg) y vitamina E (200 IU)) y 1 hora y media antes del ejercicio la segunda dosis. Al llegar al laboratorio, se procedió a colocar a los sujetos un catéter en una vena del antebrazo, se les extrajo una muestra de sangre y una biopsia del vasto lateral del cuádriceps mediante la técnica de Bergstrom con succión mientras permanecieron tumbados en la camilla. Posteriormente, los sujetos subieron al cicloergómetro Lode Excaliburt Sport 925900 (Groningen, Holanda) y respiraron durante 4 minutos en normoxia (FiO2:0.21) con una boquilla conectada a un analizador de gases (Vmax N29; Sensormedics, California, USA).Tras estos 4 minutos Resumen de Métodos y Procedimientos Página 72 David Morales Álamo de aclimatación, los sujetos realizaron un test de Wingate isocinetico de 30s. Inmediatamente tras la finalización del test, se obtuvo otra biopsia muscular y una nueva muestra de sangre. Esta toma de muestras fue repetida nuevamente a los 30 minutos y 2 horas tras la finalización del ejercicio y durante la recuperación. Para más detalles consultar la sección de material y métodos del Estudio II anexado. Estudio III En este estudio participaron los mismos 9 sujetos sanos estudiantes de educación física que participaron en el estudio II. Los sujetos realizaron dos test isocinéticos de Wingate de 30 s (100 rpm), en días diferentes y en orden randomizado. Los voluntarios llegaron en ayunas al laboratorio y tras la ingesta de píldoras que contenían antioxidantes o placebo de manera similar a lo explicado en el estudio II. Al llegar al laboratorio, a los sujetos se les colocó un catéter en una vena del antebrazo y se les extrajo una muestra de sangre y una biopsia del vasto lateral del cuádriceps mediante la técnica de Bergstrom con succión mientras permanecieron tumbados en la camilla. Posteriormente, los sujetos subieron al cicloergómetro Lode Excaliburt Sport 925900 (Groningen, Holanda) y respiraron durante 4 minutos la mezcla de gas correspondiente al experimento en hipoxia (FiO2:0.10) con una boquilla conectada a un analizador de gases (Vmax N29; Sensormedics, California, USA) mientras respiraban el contenido aire de un saco de Resumen de Métodos y Procedimientos David Morales Álamo Página 73 Douglas. Tras estos 4 minutos de aclimatación, los sujetos realizaron un test de Wingate isocinetico de 30s. Inmediatamente tras la finalización del test, se procedió a extraer una nueva biopsia del vasto lateral del cuádriceps y otra muestra de sangre. Esta toma de muestras fue repetida nuevamente a los 30 minutos y 2 horas tras la finalización del ejercicio y durante la recuperación. Para más detalles consultar la sección de material y métodos del Estudio III anexado. 4.2 Condición Física. 4.2.1 VO2pico. Cada uno de los sujetos realizó un test incremental en rampa hasta el agotamiento con una pendiente de (50W/min) empezando desde 0 vatios. En él se midió el VO2pico, la Frecuencia Cardiaca Máxima y la Potencia Máxima de cada sujeto en Normoxia. El mismo test con idéntica rampa (50W/min) fue repetido en hipoxia (FiO2:0.10) para medir los mismos parámetros en dicha condición. 4.2.2 Test de Economía de Pedaleo El test de economía de pedaleo fue realizado en dos días diferentes usando entre 8-11 intensidades de trabajo entre el 50% y 90% del VO2pico a 100 rpm. Las intensidades de las cargas fueron administradas en orden randomizado y separadas por periodos de descanso de 6 minutos cada uno. Para reducir el estrés térmico y minimizar la pérdida de agua debida a la sudoración, a los sujetos se les Resumen de Métodos y Procedimientos Página 74 David Morales Álamo permitió beber agua fresca “ad libitum“ durante los periodos de recuperación. La duración de cada carga fue de 10 minutos. Se tomó como representativa la media del consumo de oxígeno (VO2) durante los últimos 2 minutos de cada carga. Para relacionar el VO2 con la potencia se determinó el mejor ajuste lineal por mínimos cuadrados. 4.3 Composición Corporal. 4.3.1 Antropometría. La talla se midió en bipedestación con los talones, los glúteos la espalda y la región occipital en contacto con el plano del tallímetro. Estas medidas se efectuaron mediante un tallímetro de 1mm de precisión (Atlántida, Añó Sayol, Barcelona, España), manteniendo la cabeza en el plano de Francfort. La masa corporal se midió mediante una báscula (Atlántida, Añó Sayol, Barcelona, España) de 50 g de precisión, calibrada a 50.0, 70.0 ó 90.0 Kg, mediante masas patrón de la clase M1. 4.3.2 Masa muscular, masa ósea y porcentaje de masa grasa. La masa magra (masa corporal – [masa grasa + masa ósea]) se determinó mediante absorciometría fotónica dual de rayos X (DXA) (QDR-1500, Hologic Corp., Software versión 7.10, Waltham, MA). Los sujetos se escanearon tumbados en posición supina junto a una barra de calibración de diferentes grosores y densidades. A partir del análisis regional y de cuerpo entero se calculó la masa magra (g), la masa grasa (g), el área ósea total (cm2) y el contenido mineral óseo (BMC) (g) tal Resumen de Métodos y Procedimientos David Morales Álamo Página 75 como se ha hecho en trabajos previos de nuestro laboratorio (Ara et al., 2004; Ara et al., 2006). 4.4 Procesamiento de las muestras de sangre. Los sujetos fueron sometidos a una extracción de sangre periférica en ayunas que se dejó coagular en hielo durante 20 minutos. Las muestras fueron centrifugadas y el suero separado y almacenado en un congelador de -80ºC hasta su posterior análisis. En el suero de determinó: la glucosa a través del método hexoquinasa usando Glucoquat reagents (Roche/Hitachi 11876899216, Indianapolis, USA) y la insulina por medio de la técnica inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA), empleando para ello un analizador Modular Analytics E170 (Roche/Hitachi, Indianapolis, USA). 4.5 Biopsias musculares. Las biopsias musculares se obtuvieron por punción bajo anestesia local del vasto lateral del cuádriceps, tal como se ha realizado en el laboratorio de Rendimiento Humano de la ULPGC en numerosas ocasiones usando la técnica de Bergstrom, tras una noche de ayuno. Con esta técnica se pueden obtener 40-60 mg de músculo, pero como fueron realizadas con aspiración se consiguieron alrededor de 200 mg de músculo (Lundby et al., 2006). La biopsia muscular fue limpiada de tejido Resumen de Métodos y Procedimientos Página 82 David Morales Álamo 4.5.2.5 Análisis estadístico. Los datos cuantitativos están expresados como media ± error estándar (S.E.M). La normalidad de las variables fue comprobada mediante el test Kolmogorov-Smirnov corregido por Lilliefors para el estudio I, y mediante el test Shapiro Wilks para los estudios II y III. Cuando fue necesario, el análisis fue realizado con los datos transformados en logaritmos. Para la comparación entre experimentos, la respuesta individual fue normalizada por el nivel de fosforilación justo antes de comenzar el test de Wingate. El ANOVA de medidas repetidas fue realizado sobre tiempo y condición con dos niveles (Estudio I: Normoxia versus Hipoxia; Estudio II: Placebo versus Antioxidantes; Estudio III: Hipoxia-Placebo versus Hipoxia-Antioxidantes) y fue usada para comparar los valores post-ejercicio con respecto a los valores obtenidos en reposo. Cuando la ANOVA de medidas repetidas resultó significativa para el tiempo o para tiempo x condición, se procedió a realizar un ajuste por comparaciónes múltiples mediante el método de Holm-Bonferroni. La relación entre variables fue determinada usando análisis de regresión lineal. El área bajo la curva (ABC) fue determinada usando la regla trapezoidal. Las ABC de las distintas condiciones fueron comparadas entre sí mediante pruebas T de Student. Un valor de P ≤ 0.05 fue considerado significativo. El análisis estadístico se llevó a cabo mediante la utilización de la versión 15.0 del programa informático SPSS (SPSS,Chicago,IL). RESUMEN DE RESULTADOS Resumen de Resultados David Morales Álamo Página 85 5. RESUMEN DE RESULTADOS En el siguiente apartado se resumen los resultados más relevantes de cada uno de los artículos. La descripción detallada de los resultados se encuentra en las publicaciones anexas que forman parte de esta tesis doctoral. 5.1 Resumen de resultados artículo I (Morales-Alamo, D et al. 2012 JAP). David Morales-Alamo, Ponce-González, J. G., Guadalupe-Grau, A., Rodríguez-García, L., Santana, A., Cusso, R., Guerrero, M., Guerra, B., Dorado, C., Calbet, J. A. L. Increased oxidative stress and anaerobic energy release, but blunted Thr172-AMPKα phosphorylation in response to sprint exercise in severe acute hypoxia in man. J Appl Physiol 2012 Aug 2. La potencia media y el consumo de oxígeno durante el test de Wingate fueron un 6 y 37%, respectivamente menores en hipoxia (P ≤ 0.05). Por el contrario, en hipoxia, el déficit de oxígeno y la acumulación de lactato en el músculo fueron mayores que en normoxia (P ≤ 0.05). En hipoxia también se observó un aumento en las proteínas carboniladas en el músculo esquelético y en plasma después de realizar el test de Wingate (P ≤ 0.05). La fosforilación de la Thr172-AMPKα aumentó a los treinta minutos después del ejercicio de sprint y durante la recuperación del test realizado en normoxia, estando ésta bloqueada en hipoxia (P ≤ 0.05). El ratio NAD+/NADH.H+ se redujo tras la realización de ambos test de Wingate, pero su descenso fue mucho mayor en hipoxia que en normoxia (P ≤ Resumen de Resultados Página 86 David Morales Álamo 0.05). Del mismo modo, la cantidad total de la proteína SIRT1 se redujo un 53% después del test realizado en hipoxia. La fosforilación de Ser485-AMPKα1/ Ser491-AMPKα2, la cual es un conocido inhibidor de la fosforilación de la Thr172-AMPKα, se vio aumentada (60%) justo después del test realizado en hipoxia (P ≤ 0.05). Esto último coincidió, en tiempo y en condición, con un aumento de la fosforilación en la Thr308-Akt. Resumen de Resultados David Morales Álamo Página 87 5.2 Resumen de resultados artículo II (Morales-Alamo, D et al. 2012, Submitted). David Morales-Alamo, Ponce-González, J. G., Guadalupe-Grau, A, Rodríguez-García, L., Santana, A., Cusso, R., Guerrero, M., Dorado, C., Guerra, B., Calbet, J. A. L. Critical role for free radicals on sprint exercise-induced CaMKII and AMPKα phosphorylation in human skeletal muscle. (Submitted). La ingesta de antioxidantes no alteró el nivel basal de fosforilación de las diferentes proteínas quinasa determinadas en este estudio II. Tanto las variables ergométricas, como el metabolismo aeróbico y anaeróbico fueron similares en las dos condiciones experimentales estudiadas. Los ratios NAD+/NADH.H+ y AMP/ATP se vieron reducidos de manera independiente a la ingesta de antioxidantes (P ≤ 0.05). Las fosforilaciones de Thr286-CaMKII y de Thr172-AMPKα se incrementaron tras el sprint control (placebo), pero no tras el sprint de la condición de antioxidantes (P ≤ 0.05). Mientras que, el nivel de fosforilación de Ser485-AMPKα1/ Ser491-AMPKα2 se vio incrementado justo después del sprint realizado tras ingerir antioxidantes (P ≤ 0.05). Además, el nivel de fosforilación de TAK1 también fue mayor tras el test realizado después de la ingesta de antioxidantes (P ≤ 0.05). Resumen de Resultados Página 88 David Morales Álamo 5.3 Resumen de resultados artículo III (Morales-Alamo, D et al. Submitted). David Morales-Alamo, Jesús Gustavo Ponce-González, Amelia Guadalupe-Grau, Alfredo Santana, Roser Cusso, Joan Cadefau, Borja Guerra, Cecilia Dorado, José A.L. Calbet. Skeletal muscle signaling during sprint exercise in severe acute hypoxia: role of free radicals. (Submitted). La ingesta de antioxidantes no alteró el nivel basal de fosforilación de las diferentes proteínas quinasa determinadas en este estudio III. Las fosforilaciones de Thr172-AMPKα y de Thr184/187-TAK1 no aumentaron después de los sprints en ninguna condición (P ≤ 0.05). Mientras que la fosforilación de Thr286-CaMKII aumentó en respuesta al ejercicio de sprint, aunque la ingesta de antioxidantes previa bloqueó este efecto (P ≤ 0.05). Las fosforilación de Ser485-AMPKα1/ Ser491-AMPKα2 se vio incrementada tras ambos test de Wingate (P ≤ 0.05). Esto último coincidió con el aumento de la fosforilación de Akt (P ≤ 0.05). El descenso del ratio AMP/ATP fue menor después del ejercicio de sprint realizado tras la ingesta de antioxidantes (P ≤ 0.05). La velocidad glucolítica, la cual aumenta tras la realización de un test de Wingate, pero se exacerba si éste se realiza en condiciones de hipoxia severa aguda (Estudio I), se vio disminuida al realizar el test de Wingate en hipoxia tras la ingestión de antioxidantes (P ≤ 0.05). DISCUSIÓN GENERAL Discusión David Morales Álamo Página 91 DISCUSIÓN GENERAL Estudio I: Increased oxidative stress and anaerobic energy release, but blunted Thr172-AMPKα phosphorylation in response to sprint exercise in severe acute hypoxia in man. J Appl Physiol 2012 Aug 2. Este estudio examinó la influencia de la fracción inspiratoria de O2 en la regulación de la fosforilación de la AMPKα en músculo esquelético humano en respuesta a un ejercicio de sprint de 30 segundos. En contraste con nuestra hipótesis de partida, la hipoxia sumada al ejercicio de sprint, no sólo no potenció el incremento esperado de la fosforilación en la Thr172-AMPKα, y que se produce normalmente durante la recuperación (30 minutos tras el Wingate), sino que por el contrario bloqueó esta respuesta con una estimulación previa de la fosforilación Ser485-AMPKα1/Ser491-AMPKα2, siendo éste un conocido mecanismo inhibitorio de la fosforilación de la Thr172-AMPKα (Horman et al., 2006). La realización del sprint en hipoxia severa aguda provocó una mayor reducción del ratio NAD+/NADH.H+, combinado con un mayor velocidad glucolítica y estrés oxidativo, como reflejó el incremento en la acumulación de lactato intramuscular y los elevados niveles de proteínas carboniladas en el músculo y plasma, observados durante el periodo de recuperación. En este estudio también demostramos que el sprint en hipoxia reduce los niveles proteicos de SIRT1, lo cual combinado con el menor ratio NAD+/NADH.H+ observado al final del sprint, podría producir una menor activación de LKB1 por SIRT1 y, de este modo reducir la fosforilación en la Thr172-AMPKα. Discusión Página 98 David Morales Álamo ocurrió en presencia de cambios menores en los niveles plasmáticos de insulina. Por todo ello, los resultados aportados por el presente estudio sugieren que el efecto de la FiO2 sobre la fosforilación de la AMPK en los residuos alternativos de serina no puede ser atribuido a la insulina (aunque la fosforilación de la Thr308-Akt sí se vio aumentada) y requiere de futuras investigaciones. El aumento de los niveles intracelulares de AMP cíclico (AMPc) pueden producir un bloqueo de fosforilación de la AMPK en la Thr172AMPKα, a través de la inhibición de la CaMKKβ (una AMPK quinasa) (Hawley et al., 2005), pero no de la LKB1 (Hurley et al., 2006). Por otra parte, Hurley y colaboradores demostraron que la fosforilación Ser485AMPKα1/Ser491-AMPKα2 parece ser necesaria, pero no suficiente, para inhibir AMPK en condiciones donde los niveles de AMPc están elevados (Hurley et al., 2006). Sin embargo, se desconoce aún si los niveles de AMPc son modificados por el ejercicio de sprint de manera dependiente de la FiO2. TAK1 puede actuar como una AMPK quinasa (Xie et al., 2006) y su actividad puede ser estimulada por la hipoxia (Blanco et al., 2007; Melvin et al., 2011). Sin embargo, en el presente trabajo no se observó ningún cambio en los niveles de fosforilación de TAK1 en respuesta al ejercicio o a la FiO2. Por tanto, nuestros resultados no apoyan la idea de que TAK1 pueda haber influido en la activación de AMPK en el presente estudio. Discusión David Morales Álamo Página 99 Estudio II: Critical role for free radicals on sprint exercise-induced CaMKII and AMPKα phosphorylation in human skeletal muscle. (Submitted). En este estudio se examinó el papel de las especies reactivas del oxígeno (ROS) sobre la regulación de la fosforilación de la AMPK en músculo esquelético humano en respuesta a un ejercicio de sprint isocinético de 30 segundos. Los resultados aportados por la presente investigación demuestran que la suplementación con antioxidantes previa al ejercicio previene la fosforilación de la Thr172-AMPKα a través de dos potenciales mecanismos. Primero, la ingesta de antioxidantes inhibió la fosforilación de la Thr286-CaMKII, proteína quinasa que se encuentra upstream de la AMPK en esta vía de señalización muscular. En segundo lugar, la suplementación previa con antioxidantes produjo un aumento de la fosforilación de las Ser485-AMPKα1/Ser491-AMPKα2, inmediatamente después del sprint. Estos resultados sugieren que los ROS pueden jugar un papel clave en la modulación de la fosforilación de la Thr172-AMPKα en respuesta al ejercicio de sprint. Previamente, se ha demostrado que el coctel de antioxidantes empleado en el presente estudio, reduce el estrés oxidativo en reposo y en respuesta al ejercicio en humanos (Richardson et al., 2007). A pesar de ello, en la presente investigación los antioxidantes no produjeron una alteración del rendimiento, del metabolismo muscular aerobio o anaerobio, de los ratios AMP/ATP o NAD+/NADH.H+, o de la carbonilación proteica en musculo esquelético o en plasma. La carbonilación de proteínas es a la vez, irreversible e Discusión Página 100 David Morales Álamo irreparable (Barreiro & Hussain, 2010). Por lo tanto, el presente estudio II de esta tesis doctoral demuestra que un sprint de 30 s en humanos sanos no induce un incremento detectable de carbonilación proteica, posiblemente porque el nivel de carbonilación proteica de ambos sprints fue reducido o modesto. Lo cual no significa que no exista un aumento del estrés oxidativo ya que muchos radicales libres han podido ser captados por sistemas antioxidantes o por otras estructuras celulares. Regulación de AMPK por la fosforilación de la Thr286-CaMKII: posible papel de los radicales libres. Como ya comentamos en el estudio I, se ha demostrado que los radicales libres son inductores de la fosforilación en la Thr172-AMPKα por varios mecanismos (Song & Zou, 2012a), y que la hipoxia puede incrementar la fosforilación de Thr172-AMPKα por un mecanismo que requiere de las especies reactivas del oxígeno de origen mitocondrial, pero que es independiente del ratio AMP/ATP (Emerling et al., 2009). Por ello, la hipótesis de partida de este estudio II fue la siguiente: la ingestión de antioxidantes previa a la realización de un ejercicio de sprint puede mitigar la esperada fosforilación en Thr172-AMPKα normalmente observada en el vasto lateral del cuádriceps durante la recuperación tras único sprint (Guerra et al., 2010; Fuentes et al., 2012b). En relación directa con nuestros resultados, Gómez-Cabrera y colaboradores (2008) demostraron en ratas y humanos que la suplementación con vitamina C Discusión David Morales Álamo Página 101 bloquea las determinadas adaptaciones musculares al entrenamiento de resistencia, las cuales son en parte mediadas por AMPK (Narkar et al., 2008). Otros estudios han puesto de manifiesto que la administración de vitamina C y E produce, en humanos, un descenso de la sensibilidad a la insulina y bloquea determinadas adaptaciones musculares mediadas por PGC-1α (Ristow et al., 2009). En la presente investigación usamos el coctel de antioxidantes referido en el estudio I, para el cual se ha demostrado su efectividad reduciendo el estrés oxidativo (Richardson et al., 2007). Aunque en la discusión del estudio I ya hemos comentado que la carbonilación proteica es un marcador estable de estrés oxidativo, la ausencia de cambios en la carbonilación proteica, observada en el presente estudio en respuesta a un ejercicio de sprint, no implica la no producción de radicales libres. Esto puede indicar simplemente, que los radicales libres han sido capturados por otras moléculas y sistemas antioxidantes. De hecho, en el estudio I de la presente tesis doctoral se demuestra que el ejercicio de sprint en hipoxia severa aguda produce un incremento de las proteínas carboniladas en plasma y músculo (MoralesAlamo et al., 2012). Sin embargo, el nivel de proteínas carboniladas observado tras el ejercicio de sprint en normoxia podría ser demasiado bajo para que éstas puedan ser detectadas por medio de la técnica del Western blot en las muestras de plasma o músculo (Shacter, 2000). Además, el hecho de que la suplementación con antioxidantes empleada en el presente estudio II haya podido ser relacionada con una inhibición Discusión Página 102 David Morales Álamo de la las fosforilaciones Thr286-CaMKII /Thr172-AMPKα, sugiere que nuestra intervención disminuyó efectivamente la respuesta de señalización intramuscular activada por el ejercicio de sprint y mediada por los ROS. La activación de la CaMKII a través de su fosforilación en la Thr286, puede inducir la fosforilación de la AMPK en la Thr172. Este mecanismo ha demostrado tener relevancia en respuesta al ejercicio de alta intensidad (Egan et al., 2010). La fosforilación de la Thr286-CaMKII es regulada de una manera dependiente de la liberación de Ca2+ (Raney & Turcotte, 2008). Además, el incremento en la liberación del Ca2+ sarcoplasmático que se produce durante el ejercicio de sprint depende en gran medida del receptor de rianodina, el cual es activado por ROS y por cambios en el estatus antioxidante (Zima & Blatter, 2006). Sin embargo, el hecho de que el pico de potencia del Wingate no se viera afectado por la ingestión de antioxidantes, sugiere que, al menos en este modelo, la liberación de Ca2+ sarcoplasmático no está regulada de una manera muy importante por los ROS. Como se ha mencionado en la discusión del estudio I, los ROS pueden activar CaMKII a través de la modificación del par Met281/282 del dominio regulatorio de la enzima, de manera similar pero paralela a la autofosforilación de la Thr286 (Erickson et al., 2008). Esta evidencia sugiere que se pueden producir cambios en el nivel de actividad de la Discusión David Morales Álamo Página 103 CaMKII por mecanismos independientes de la liberación sarcoplasmática de Ca2+ y regulados de manera directa por el nivel del estrés oxidativo. En un estudio reciente de Wright y colaboradores (2009) se ha demostrado que las fosfatasas de serina/treonina pueden ser inhibidas por los ROS en músculo esquelético humano, de forma que la suplementación con antioxidantes puede bloquear este fenómeno. Si ese hubiera sido el principal mecanismo que hubiera modulado la fosforilaciones en Thr286-CaMKII /Thr172-AMPKα en el presente estudio II, la suplementación por antioxidantes debería haber producido una estimulación de las mencionadas fosforilaciones en respuesta al sprint. Sin embargo, los resultados aportados por la presente investigación apuntan en el sentido contrario, lo que sugiere que el efecto estimulador inducido por los ROS sobre las fosforilaciones Thr286-CaMKII /Thr172AMPKα en respuesta al ejercicio de sprint es mayor que su potencial efecto inhibitorio sobre las correspondientes fosfatasas. Las fosforilaciónes en las Ser485-AMPKα1/Ser491-AMPKα2 pueden mediar el efecto inhibidor que la ingestión de antioxidantes induce sobre la fosforilación de la Thr172-AMPKα en músculo esquelético. En este estudio observamos como la fosforilación de las Ser485AMPKα1/Ser491-AMPKα2 aumenta inmediatamente después del ejercicio de sprint, cuando éste fue realizado tras la ingesta del coctel de antioxidantes. Un mecanismo similar fue descrito en el estudio I tras la Discusión Página 104 David Morales Álamo realización del test en hipoxia (Morales-Alamo et al., 2012). Tal como comentamos en la discusión de dicho estudio, la estimulación de la fosforilación de la AMPK en los residuos alternativos de serina que se detecta a los 10 segundos después de la finalización del sprint, debe estar mediado por un mecanismo intracelular rápido no regulado por la insulina. Tal como también hemos comentado anteriormente, el ejercicio de sprint en hipoxia severa aguda produce una mayor velocidad glucolítica, un menor pH intramuscular y un mayor grado de carbonilación proteica, lo cual sugiere la existencia de un mayor estrés oxidativo en hipoxia en comparación con el mismo test realizado en normoxia (Morales-Alamo et al., 2012). Sin embargo, en el presente estudio II, hemos demostrado que si se reduce el estrés oxidativo causado por el ejercicio de sprint, mediante la suplementación con antioxidantes, se produce un aumento de los niveles de fosforilación de la AMPK en los residuos de serina alternativos. Por lo tanto, parece que un nivel de ROS excesivamente alto o bajo produce de igual manera una estimulación de la fosforilación de la AMPK en residuos de serina alternativos y una concomitante reducción de la fosforilación de la Thr172 de esta misma quinasa. Este efecto dual de los ROS no es nuevo. De hecho, se ha demostrado que tanto los niveles altos de ROS (Rudich et al., 1998; Houstis et al., 2006), como la reducción del estrés oxidativo causado por el ejercicio (Ristow et al., 2009), están asociados con la resistencia a la insulina. Por lo tanto, parece que un nivel óptimo de ROS es necesario Discusión David Morales Álamo Página 105 para que la fosforilación en la Thr172-AMPKα se estimule en respuesta a un ejercicio de sprint. Tal como comentamos en la discusión del estudio I, la fosforilación de la AMPK en los residuos de serina alternativos puede ser explicada por un aumento de la fosforilación de la Akt en la Thr308, fenómeno que ocurre con cambios ligeros en los niveles de insulina. En el presente estudio II, se observa que la fosforilación de la AMPK en los residuos de serina alternativos ocurre inmediatamente después del sprint realizado tras la ingesta del coctel de antioxidantes. Sin embargo, este fenómeno no parece estar mediado por la fosforilación de la Akt en la Thr308, ya que aunque ésta ocurre inmediatamente después del ejercicio de sprint, no se vio afectada por la ingestión previa del coctel de antioxidantes. Un mecanismo alternativo que podría explicar este fenómeno podría estar mediado por la PKA, ya que existen estudios que han mostrado que esta proteína quinasa puede fosforilar a la AMPK en los residuos de serina alternativos, bloqueando así su fosforilación en la Thr172 (Hurley et al., 2006). Además, el AMPc puede bloquear la fosforilación en la Thr172-AMPKα por inhibición de la CaMKKβ, pero no de la LKB1 (Hurley et al., 2006). Sin embargo, se desconoce si los niveles musculares de AMPc responden de manera diferente al ejercicio de sprint dependiendo del status antioxidante ofreciendo una respuesta diferente al ejercicio de sprint con diferentes niveles de estrés oxidativo. Discusión Página 106 David Morales Álamo Kinasa activada por el factor de crecimiento transformante β 1 (TAK1) Anteriormente hemos comentado la posibilidad de que TAK1 pudiera actuar como una proteína quinasa upstream de AMPK (Xie et al., 2006), si bien hasta que el estudio I de esta tesis doctoral no fue publicado, la respuesta de TAK1 muscular al ejercicio de sprint no había sido estudiada en humanos (Morales-Alamo et al., 2012). En cualquier caso, el ejercicio de sprint produce una rápida producción de radicales libres (Cuevas et al., 2005; Morales-Alamo et al., 2012), los cuales pueden influir en diferentes procesos de señalización (Powers et al., 2011). Entre las vías que pueden ser activadas por un aumento en los niveles de radicales libres se encuentran NF-κB, AP-1, y Nrf2, las cuales regulan la expresión de numerosas enzimas antioxidantes (Barbieri & Sestili, 2012). TAK1 es una de las principales quinasas activadoras de los factores de transcripción NF-κB, AP-1, y Nrf2, lo cual le confiere un papel clave en las respuestas adaptativas en respuesta a los incrementos de la producción de ROS (Omori et al., 2012). La fosforilación de TAK1 es un requisito indispensable para su actividad (Singhirunnusorn et al., 2005). De esta forma, en el presente estudio II la fosforilación de la Thr184/187TAK1 aumentó en respuesta al ejercicio de sprint realizado tras la ingesta de antioxidantes. Tal como hemos comentado en la discusión del estudio I, existen estudios que han sugerido que los ROS podrían inducir la inhibición de determinadas fosfatasas de tirosina y Discusión David Morales Álamo Página 107 serina/treonina, lo cual se podría traducir en la estimulación de la fosforilación de diversas quinasas (Wright et al., 2009), como por ejemplo TAK1. Sin embargo, este mecanismo parece no operar en este estudio II, ya que si lo hubiera hecho, debería haberse observado una reducción de la fosforilación de TAK1 inducida por la suplementación con antioxidantes. Del mismo modo, a pesar de que potencialmente TAK1 podría actuar como una AMPK quinasa, la ingestión de antioxidantes produjo una menor fosforilación de CaMKII y AMPK, lo cual sugiere que los cambios detectados en la fosforilación de TAK1 no median los efectos inhibitorios de los antioxidantes sobre el esperado incremento de la fosforilación de CaMKII y AMPK inducido por el ejercicio de sprint. El mecanismo de activación de AMPK por TAK1 necesariamente ha de ser objeto de estudio en futuras investigaciones para su mejor entendimiento. Los ratios Lac/Pyr y NAD+/NADH.H+ y la señalización activada por SIRT1/LKB1/AMPK Diversos estudios previos han obtenido, durante el test de Wingate, una velocidad de la glucólisis y cambios metabólicos similares a los observados en la presente investigación (Bogdanis et al., 1995; Parra et al., 2000). Como novedad, este estudio muestra que la administración previa de antioxidantes no parece modificar el metabolismo durante un sprint (30 s) y no tiene ningún impacto sobre la fatiga muscular. Este puede que no sea el caso durante un ejercicio submáximo, donde hay Discusión Página 114 David Morales Álamo residuos de serina alternativos. La fosforilación de Thr308-Akt , pero no de Ser473-Akt, volvieron a niveles basales a los 30 minutos de la recuperación. La fosforilación de Ser485-AMPKα1/Ser491-AMPKα2 volvió a niveles basales también a los 30 minutos de la recuperación, lo cual es compatible con que la fosforilación de la Thr308-Akt es necesaria para producir la fosforilación en Ser485-AMPKα1/Ser491-AMPKα2, lo cual confirma los resultados del estudio número I (Morales-Alamo et al., 2012). En el estudio I, demostramos que el ejercicio de sprint en hipoxia, comparado con el mismo test realizado en normoxia, produce un bloqueo en la fosforilación de Thr172-AMPKα, regulado a través de una reducción del ratio NAD+/NADH.H+ y de una disminución de la cantidad proteica total de SIRT1, todo ello parece que mediado por un mecanismo que dependería de un elevado estrés oxidativo (Morales-Alamo et al., 2012). Para profundizar en este aspecto, procedimos, en el presente estudio III, a determinar los niveles proteicos de SIRT1 con el objetivo de investigar los potenciales efectos del nivel de estrés oxidativo sobre los niveles intramusculares de esta importante de-acetilasa. El área bajo la curva de los niveles de expresión proteica de SIRT1 durante la recuperación después del ejercicio de sprint realizado tras la ingesta de antioxidantes, fue aproximadamente 2 veces mayor que el observado para el test realizado tras la ingesta de un placebo. Sin embargo, estas diferencias no alcanzaron significación estadística (P = 0.22), lo cual pudo deberse a un Discusión David Morales Álamo Página 115 error estadístico de tipo II debido a la elevada variabilidad observada en los ensayos de Western blot realizados para cuantificar la expresión proteica de SIRT1. Por otro lado, la ingesta de antioxidantes atenuó la reducción del ratio NAD+/NADH.H+ inducida por el ejercicio de sprint realizado en hipoxia, lo cual pudo haber facilitado una mayor actividad LKB1. Sin embargo, los resultados aportados por este estudio III sugieren que este fenómeno no se produjo, ya que esa menor reducción del ratio NAD+/NADH.H+ inducida por los antioxidantes no restableció la normal fosforilación de la Thr172-AMPKα en respuesta al ejercicio de sprint. Esto último podría ser explicado ya que el ratio AMP/ATP, el cual es considerado el principal mecanismo que regula la fosforilación de Thr172AMPKα vía LKB1, se vio menos incrementado tras la ingestión de los antioxidantes. Por todo ello, es muy posible que el efecto combinado de la menor reducción de ratio NAD+/NADH.H+ y el menor incremento en el ratio AMP/ATP, podría haber cancelado mutuamente su efecto sobre la actividad de la LKB1. Los antioxidantes atenúan la respuesta glucolítica al ejercicio de sprint en hipoxia. Diversos estudios han demostrado en cultivos celulares que la glucólisis puede ser activada por los ROS (Shi et al., 2009; Wu & Wei, 2012) y que esta respuesta puede ser bloqueada por el ácido α-lipoico y otros antioxidantes (Shi et al., 2009). En el presente estudio hemos Discusión Página 116 David Morales Álamo demostrado que el coctel de antioxidantes que contiene ácido α-lipico atenúa la respuesta glucolítica durante el ejercicio de sprint en hipoxia. Este fenómeno puede haber estado mediado por el bajo incremento en el ratio AMP/ATP después de la ingestión de antioxidantes. Un mecanismo alternativo que podría explicar la baja velocidad de la glucólisis observada después de la ingestión de antioxidantes, podría ser debido a una reducción en la producción de fructosa 2,6 bifosfato por parte de la fosfofructoquinasa 2 (PFK2) (dicho metabolito es el activador más potente de la fosfofructoquinasa 1, la cual es la principal enzima reguladora de la velocidad de la glucólisis). La isoforma de hígado PFK2, la cual también se expresa en el músculo esquelético, es una enzima bifuncional que cuando está fosforilada en la Ser32 cambia su actividad de quinasa a fosfatasa reduciendo la fructosa 2,6-bifosfato (Kurland et al., 1992; Rovira et al., 2012). Sin embargo, actualmente se desconoce si los antioxidantes son capaces de mediar dicha fosforilación en músculo esquelético humano. Aunque el ion lactato es antioxidante (Groussard et al., 2000), la producción de lactato durante el ejercicio está siempre asociada con acidosis, la cual es una condición potencialmente oxidativa (Siesjo et al., 1985; Rehncrona et al., 1989). Al respecto cabe destacar, que los resultados aportados por el presente estudio III demuestran que la suplementación con antioxidantes reduce la acumulación de lactato normalmente detectada tras el ejercicio de sprint en hipoxia, atenuando Discusión David Morales Álamo Página 117 así la acidificación del pH intramuscular. De esta forma, podemos afirmar que la ingesta de antioxidantes previa al ejercicio de sprint produce una reducción del estrés oxidativo (Richardson et al., 2007), de la velocidad de la glucólisis y de la caída del pH (Siesjo et al., 1985; Rehncrona et al., 1989). La fosforilación de la Ser221-ACCβ se ve incrementada en respuesta al ejercicio de sprint hipoxia, a pesar de la ausencia de fosforilación en la Thr172-AMPKα Tal como hemos comentado a lo largo de esta tesis doctoral, la ACCβ es una quinasa que se encuentra downstream de la AMPK en esta cascada de señalización (Steinberg et al., 2006). Sin embargo, el presente estudio III confirma los resultados obtenidos en estudios previos realizados en nuestro laboratorio que demuestran una disociación entre la fosforilación de la Thr172-AMPKα y la de la Ser221-ACCβ, inmediatamente después del ejercicio de sprint (Guerra et al., 2010; Fuentes et al., 2012a; Morales-Alamo et al., 2012). Del mismo modo, las evidencias parecen indicar que la fosforilación de Ser221-ACCβ no está regulada tampoco a los 30 minutos de la recuperación por la AMPK, ya que está perfectamente conservada en todas las condiciones en la que la fosforilación de la Thr172-AMPKα está inhibida. Por tanto, debe existir un mecanismo alternativo que explique por qué la fosforilación de la Ser221ACCβ inducida por el ejercicio de sprint puede ocurrir aunque la AMPK no Discusión Página 118 David Morales Álamo esté fosforilada (Dzamko et al., 2008). Como novedad, este estudio III demuestra que la fosforilación de la Ser221-ACCβ inducida por el ejercicio de sprint en hipoxia es independiente del nivel de estrés oxidativo, ya que no se ve afectada por la suplementación con antioxidantes. CONCLUSIONES Conclusiones David Morales Álamo Página 121 CONCLUSIONES Las siguientes conclusiones han sido extraídas de los resultados de los estudios experimentales incluidos en la tesis. 1/ El ejercicio de sprint en hipoxia severa aguda produce una mayor velocidad de la glucólisis, una mayor acumulación de lactato muscular, un aumento en el ratio Lac/Pyr y una reducción concomitante del ratio NAD+/NADH.H+. Además, la señalización activada en respuesta al ejercicio de sprint se ve modificada por la hipoxia severa aguda en el músculo esquelético humano 2/ La hipoxia severa aguda bloquea el esperado aumento de la fosforilación de la Thr172-AMPKα en respuesta al ejercicio de sprint a través de dos posibles mecanismos. Primero, el descenso del ratio NAD+/NADH.H+ combinado con la reducción de la cantidad de la proteína SIRT1 observada en hipoxia, podrían haber bloqueado la fosforilación de la Thr172-AMPKα mediada por SIRT1/LKB1. Segundo, el bloqueo de la fosforilación de la Thr172-AMPKα pudo haberse debido al incremento de la fosforilación de la AMPK en residuos alternativos de serina, siendo éste un conocido mecanismo inhibitorio de la fosforilación de la Thr172-AMPKα mediado por la Akt. 3/ La fosforilación de la proteína substrato de Akt, AS160, se ve incrementada durante la recuperación tras el ejercicio de sprint, Conclusiones Página 122 David Morales Álamo independientemente de la FiO2 y a pesar de los cambios observados en los niveles de fosforilación de la AMPK. 4/ La ingesta de un coctel de antioxidantes antes de un ejercicio de sprint realizado en normoxia bloquea el esperado incremento de la fosforilación de la Thr172-AMPKα observado durante la recuperación, sin afectar al rendimiento, al metabolismo aerobio y anaerobio, ni a los ratios AMP/ATP y NAD+/NADH.H+. Este fenómeno sugiere que la activación de la AMPKα, que se produce durante la recuperación tras un solo ejercicio de sprint, depende del nivel de radicales libres producidos durante el ejercicio. 5/ El efecto inhibitorio de la suplementación con antioxidantes sobre la fosforilación de la Thr172-AMPKα detectada durante la recuperación tras un ejercicio de sprint, puede deberse al bloqueo de la fosforilación de la Thr286-CaMKII (una proteína quinasa upstream de la AMPK) inducida por los antioxidantes y/o al efecto estimulante de éstos sobre los niveles de fosforilación de la AMPK en residuos alternativos de serina. 6/ La ingesta de antioxidantes reduce la velocidad de la glucólisis provocada normalmente en respuesta a un ejercicio de sprint realizado en Conclusiones David Morales Álamo Página 123 hipoxia severa aguda, atenuando el incremento en el ratio AMP/ATP, pero sin afectar al rendimiento. 7/ El bloqueo de la fosforilación en la Thr172-AMPKα producido por la hipoxia severa aguda en respuesta a un ejercicio de sprint, se produce a través de un mecanismo molecular independiente del estrés oxidativo, que posiblemente implica la fosforilación de la AMPK en residuos alternativos de serina de la AMPK mediada por la Akt, y que parece no estar gobernado ni por CaMKII ni por TAK1. 8/ El incremento de la fosforilación de la Thr286-CaMKII observado en respuesta al ejercicio de sprint parece ser dependiente, al menos en parte, de la producción de radicales libres durante el ejercicio. 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Physical characteristics and ergoespirometric variables during sprint exercise in hypoxia placebo and hypoxia antioxidants (mean±SD). Hypoxia Placebo Hypoxia Antioxidants Age (years) 25.2 ± 4.7 Height (cm) 176.0 ± 5.1 Weight (Kg) 79.4 ± 10.1 % body fat 18.3 ± 6.6 Two-Legs lean mass (K ) 19.73 ± 2.37 HRmax (Beats/min) 172.0 ± 9.7 VO 2 peak (L/min) 2.586 ± 0.208 Wmax (W) 285.2 ± 32.1 Wpeak (W) 944.3 ± 131.3 999.1 ± 129.0 Wpeak/Kg LLM (W/k ) 48.5 ± 3.7 51.6 ± 6.2 Wmean (W) 539.8 ± 69.0 546.5 ± 64.2 Wmean/Kg LLM (W/k ) 27.8 ± 1.9 28.1 ± 1.7 O 2 Demand (L/min) 7.830 ± 0.765 7.922 ± 0.762 Accumulated VO2 (L) 0.847 ± 0.123 0.830 ± 0.175 O2 deficit (L) 3.068 ± 0.399 3.131 ± 0.430 O2 deficit/Wmean 5.70 ± 0.45 6.09 ± 0.82 La peak (mmol/L) 11.9 ± 2.0 11.7 ± 1.5 Wingate SpO 2 80.9 ± 7.0 78.1 ± 6.1 Wingate PETO2 48.8 ± 3.3 49.4 ± 4.7 Wmax: maximal intensity during the incremental exercise test to exhaustion; Wpeak: peak power output during the Wingate test; LLM: lean mass of the lower extremities; Wmean: mean power output during the Wingate test; Accumulated VO2: amount of O2 consumed during the 30s Wingate test; SpO2: Hemoglobin saturation (pulsoximetry); PETO2: end tidal O2 pressure. Table 2. Glucose and Insulin concentrations prior to and during the recovery period after the sprint exercise in hypoxia placebo and hypoxia antioxidants (mean ± SD). R 0 min 30 min 120 min Mean±SD Mean±SD Mean±SD Mean±SD Interaction Glucose (mg/dL) Hyp. Placebo 88.3 ± 4.5 100.4±11.9 $ 102.8 ± 13.0 $ 87.9 ± 7.2 P=0.38 Hyp. Antioxidants 91.5 ± 6.9 99.0±7.3 $ 99.2 ± 10.7 $ 87.02 ± 7.2 Insulin (µIU/mL) Hyp. Placebo 5.4 ± 3.3 5.6 ± 3.0 11.5 ± 6.1 $ 6.1 ± 4.2 P= 0.07 Hyp. Antioxidants 6.2 ± 5.0 8.7 ± 5.3$ 14.8 ± 11.5 $ 6.2 ± 3.9 0 min corresponds to immediately after the Wingate test. $ P< 0.05 versus resting (R) values. Table 3. Muscle metabolites before and immediately after a 30-second sprint in hypoxia placebo and hypoxia antioxidants (mean ± SD). Hypoxia Placebo Hypoxia Antioxidants Resting Post-sprint Resting Post-sprint Mean ± SD Mean ± SD Mean ± SD Mean ± SD ATP (mmol/Kg) 4.84 ± 1.00 3.2 ± 1.63 $ 5.17 ± 1.17 3.11 ± 0.81 $ AMP/ATP (mmol/mol) bc 5.5 ± 2.3 184.2 ± 255.4 $ 3.7 ± 2.5 25.0 ± 16.6 e$ PCr (mmol/Kg) 16.50 ± 1.52 5.99 ± 3.32 $ 18.28 ± 2.28 8.26 ± 2.76 $ Cr (mmol/Kg) 11.92 ± 1.52 22.42 ± 3.32 $ 10.20 ± 2.28 21.61 ± 3.13 $ Pyruvate (mmol/Kg) b 0.14 ± 0.05 0.23 ± 0.07 $ 0.09 ± 0.04 0.17 ± 0.07 $a Lactate (mmol/Kg) b 2.1 ± 1.3 55.4 ± 20.1 $ 3.1 ± 2.0 38.3 ± 10.6 $ a Lac/Pyr b d 17.1 ± 14.3 258.4 ± 120.4 $ 38.6 ± 24.8 250.5 ± 110.1$ [NAD+]/([NADH.H+]) x107 bd 897 ± 667 42 ± 21 $ 339 ± 262 42 ± 16 $a $ Post-sprint vs. resting (same condition); a P<0.05 Post-sprint in hypoxia placebo versus hypoxia antioxidants. b P<0.05 for Antioxidants x time interaction; c AMP/ATP ratio calculated from the CK and AK apparent equilibrium constants for free AMP and ADP; d Statistical analysis performed with normalized values, taking the resting values as 100%; e Relative increase between Legends to figures Figure 1. Levels of carbonylated proteins in plasma (A) and skeletal muscle (B) before and after a single Wingate test performed in hypoxia placebo (open bars) or hypoxia antioxidants (solid bars). Values in both experimental conditions were normalized to those observed in the biopsies obtained immediately before the sprint exercise (R), which were assigned a value of 100%. A) Western blot and densitometry analysis (130 and 30 KDa) showing carbonylated proteins in plasma extracts. Statistical analysis performed with logarithmically transformed data. * P<0.05 Hypoxia placebo versus hypoxia antioxidants .B) Western blot and densitometry analysis (45 and 35 KDa) showing carbonylated proteins in skeletal muscle extracts. Statistical analysis performed with logarithmically transformed data. * P<0.05 Hypoxia placebo versus hypoxia antioxidants. N = 9 in both experimental conditions. Figure 2. Levels of Thr172-AMPKα (A), Ser221-ACCβ (B), Thr286CaMKII (C), and Thr184/187-TAK1 (D) before and after a single Wingate test performed in hypoxia placebo (open bars) or hypoxia antioxidants (solid bars). Values in both experimental conditions were normalized to those observed in the biopsies obtained immediately before the sprint exercise (R), which were assigned a value of 100%. A) Top panel: a representative western blot with antibodies against AMPKα, pThr172-AMPKα and α-Tubulin. Lower panel: pThr172-AMPKα densitometric values relative to total AMPKα. Statistical analysis performed with logarithmically transformed data. B) Top panel: a representative western blot with antibodies against ACCβ, phospho-ACCβ and α-Tubulin. Lower panel: ACCβ phosphorylation values relative to total ACCβ. $ P<0.05 versus R. Statistical analysis performed with logarithmically transformed data. C) Top panel: a representative western blot with antibodies against CaMKII, phospho-CaMKII and α-Tubulin. Lower panel: CaMKII phosphorylation values relative to total CaMKII. * P<0.05 Hypoxia placebo versus hypoxia antioxidants. Statistical analysis performed with logarithmically transformed data. D) Top panel: a representative western blot with antibodies against TAK1, phospho-TAK1 and α-Tubulin. Lower panel: TAK1 phosphorylation values relative to total TAK1. N = 9 in both experimental conditions. Figure 3. Levels of Ser485-AMPKα1/Ser491-AMPKα2 (A), Ser485AMPKα1 (B), and SIRT1 (C) before and after a single Wingate test performed in hypoxia placebo (open bars) or hypoxia antioxidants (solid bars). Values in both experimental conditions were normalized to those observed in the biopsies obtained immediately before the sprint exercise (R), which were assigned a value of 100%. A) Top panel: a representative western blot with antibodies against AMPKα, phospho-Ser485-α1/Ser491-α2 and α-Tubulin. Lower panel: Ser485-α1/Ser491-α2 phosphorylation values relative to total AMPKα. $P<0.05 versus R .Statistical analysis performed with logarithmically transformed data. B) Top panel: a representative western blot with antibodies against AMPKα, phospho-Ser485-α1 and α-Tubulin. Lower panel: Ser485-AMPKα1 phosphorylation values relative to total AMPKα1. Statistical analysis performed with logarithmically transformed data. C) Top panel: a representative western blot with antibodies against SIRT1 and α-Tubulin. Statistical analysis performed with logarithmically transformed data. Lower panel: SIRT1 values. N = 9 in both experimental conditions. Figure 4. Levels of Ser473-Akt (A), Thr308-Akt (B), and Thr642AS160 (C) before and after a single Wingate test performed in hypoxia placebo (open bars) or hypoxia antioxidants (solid bars).Values in both experimental conditions were normalized to those observed in the biopsies obtained immediately before the sprint exercise (R), which were assigned a value of 100%. A) Top panel: a representative western blot with antibodies against Akt, phospho-Ser473-Akt and α-Tubulin. Lower panel: Ser473-Akt phosphorylation values relative to total Akt. $P<0.05 versus R. Statistical analysis performed with logarithmically transformed data. B) Top panel: a representative western blot with antibodies against Akt, phospho-Thr308-Akt and α-Tubulin. Lower panel: Thr308-Akt phosphorylation densitometric values relative to total Akt. $ P<0.05 versus R.* P<0.05 Hypoxia placebo versus hypoxia antioxidants. Statistical analysis performed with logarithmically transformed data. (C) Top panel: a representative western blot with antibodies against AS160, phospho-Thr642-AS160 and α-Tubulin. Lower panel: Thr642-AS160 phosphorylation values relative to total AS160. $P<0.05 versus R . N = 9 in both experimental conditions. Figure 1. Figure 2.