Efecto de la ingesta de cinc en los niveles séricos-plasmáticos, en el crecimiento y en el desarrollo neurológico en los lactantes : metaanálisis

UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA DEPARTAMENTO DE CIENCIAS CLÍNICAS TESIS DOCTORAL Efecto de la ingesta de cinc en los niveles séricos/plasmáticos, en el crecimiento y en el desarrollo neurológico en los lactantes: Metaanálisis. Mariela Nissensohn Directores de Tesis: Prof. Dr. Lluis Serra-Majem Prof. Dra. Almudena Sánchez-Villegas Las Palmas de Gran Canaria, Diciembre de 2012 Agradecimientos Deseo expresar mi más profundo y sincero agradecimiento a todas aquellas personas que con su ayuda han colaborado en la realización del presente trabajo: En primer lugar agradezco a mi Director de Tesis, el Prof. Dr. Lluis Serra-Majem, por su orientación y supervisión, pero sobre todo por el apoyo recibido a lo largo de estos años, por enseñarme su calidad humana. Agradezco muy especialmente a mi directora de Tesis, la Prof. Almudena Sánchez Villegas, que ha sido sin lugar a dudas mi maestra, por su ayuda incondicional, su indispensable sabiduría, por el ánimo infundido y la confianza en mí depositada. Agradezco a mi amigo el Dr. Daniel Fuentes Lugo de la Universidad Autónoma del Carmen de México, pieza fundamental en mi camino, por su infinita ayuda. También quiero agradecer la ayuda recibida de los Profesores Patricia Henríquez, Luis Peña Quintana y Jorge Doreste por su afecto y apoyo constantes. Quiero hacer extensiva mi gratitud a mis compañeros del Departamento de Ciencias Clínicas de esta Universidad, muy especialmente, a mis amigas Cristina Ruano y Jacqueline Álvarez, con quienes compartí los buenos y no tan buenos momentos de este camino. Agradezco a toda la gente de EURRECA, que ha permitido que este trabajo se pueda realizar. Un agradecimiento muy especial merece la comprensión, paciencia y el ánimo recibidos de mi marido Jorge, al igual que de mis hijas Aitana y Maika: Gracias por ser mi motor, mi inspiración y mi todo. Gracias a mis hermanos Daniela y Diego por su amistad y por estar lejos pero siempre cerca. Gracias al resto de mi familia y amigos de Argentina, de México y de España, que directa o indirectamente me han apoyado y ayudado en esta gran andadura. Pero por sobre todo quiero agradecer y dedicar esta tesis a mis padres Liliana y Enrique, quienes, además de ser mi gran apoyo en esta tesis y en mi vida, han sido mi mejor ejemplo. A todos ellos, muchas gracias. A mis padres Liliana y Enrique Que me dejaron ser… Índices Índices 2 ÍNDICES Página ÍNDICE DE CONTENIDOS 3 ÍNDICE DE TABLAS 6 ÍNDICE DE FIGURAS 8 ABREVIATURAS 11 1. INTRODUCCIÓN 15 1.1 Red de Excelencia EURRECA 16 1.2 El Cinc – Generalidades 18 1.3 Metabolismo del Cinc 19 1.4 Biodisponibilidad y Fuentes alimentarias de Cinc 21 1.5 Recomendaciones existentes 24 1.6 Valoración de los niveles de cinc 25 1.7 Efectos del cinc sobre la Salud 27 1.7.1 Déficit de cinc 27 1.7.2 El Cinc en los niveles de suero/plasma 30 1.7.3 El Cinc en el Crecimiento 32 1.7.4 El Cinc en el Desarrollo Neurológico 35 1.8 Estrategias para prevenir deficiencia con cinc 37 1.8.1 La suplementación con cinc 37 1.8.2 Los cambios en la dieta 37 1.8.3 La fortificación de los alimentos 37 2. OBJETIVOS 41 2.1 Objetivo general 41 Abreviaturas 11 ABREVIATURAS EURRECA IZiNCG EURopean micronutrient RECommendations Aligned International Zinc Nutrition Consultative Group OMS Organización Mundial de la Salud NOAEL IGF-1 No Observed Adverse Effect Level (Nivel sin efecto adverso observado) Insulin-like growth factor-1 (Factor de crecimiento insulínico tipo 1) ADN Ácido desoxirribonucleico ARN Ácido ribonucleico IDR IC Β Zn Ingesta Diaria Recomendada Intervalo de Confianza Beta Cinc MUAC Circunferencia media del brazo WAZ LAZ WLZ MDI PDI DE EE BPN MEP Peso para la edad z-score Longitud para la edad z-score Peso para la Longitud z-score Índice de Desarrollo Mental Índice de Desarrollo Psicomotor Desviación estándar Error estándar Bajo peso al nacer Malnutrición energético - proteica Abreviaturas 12 1. Introducción Introducción 15 1. INTRODUCCIÓN Los micronutrientes, tales como las vitaminas y los minerales, son esenciales para un adecuado crecimiento y metabolismo en los seres humanos. Aunque sólo son necesarios en pequeñas cantidades, su falta puede tener consecuencias graves para la salud y el desarrollo de las poblaciones de todo el mundo (WHO/FAO, Génova 2004). La mayoría de los países de Europa, para evitar deficiencias en la población general aparentemente sana, realizan sus recomendaciones basándose en la composición de los micronutrientes de la dieta. Estas recomendaciones sirven de fundamento para desarrollar las políticas de nutrición nacional o regional, los programas de educación nutricional y la regulación alimentaria de cada país. Sin embargo, como cada país utiliza para establecer las recomendaciones, métodos y conceptos propios, hay una gran variación de la ingesta de micronutrientes recomendada entre países (King & Garza 2007; Pavlovic et al. 2007; Prentice et al. 2004). Estas diferentes recomendaciones pueden confundir a quienes evalúan y planifican la ingesta de micronutrientes, como son los consumidores, los productores y los responsables de las políticas de nutrición. La Red de Excelencia EURRECA (European Micronutrient Recommendations Aligned) se estableció a principios de 2007 con el objetivo de armonizar el proceso de establecimiento de las recomendaciones de micronutrientes en toda Europa, con especial atención a los grupos de la población más vulnerables, incluidos lactantes, embarazadas, población inmigrante y personas de edad avanzada (Gibson 2006; Junior et al. 2011). Esta tesis ha sido escrita en el marco de la red EURRECA e incluye una muestra de los métodos de revisión estandarizados, transparentes y objetivos que se utilizaron Introducción 16 para resumir y evaluar las evidencias existentes para el establecimiento de recomendaciones, utilizando el cinc (Zn) como un ejemplo de micronutriente. 1.1 RED DE EXCELENCIA EURRECA El objetivo general de la red de excelencia EURRECA fue la producción armonizada de directrices científicas para el desarrollo de las recomendaciones de micronutrientes, con el fin de avanzar hacia un proceso uniforme, transparente y basado en la evidencia que derivará en las ingestas de micronutrientes recomendadas (Matthys et al. 2011). Inicialmente se propuso un marco para describir el proceso para establecer las recomendaciones de micronutrientes, el cual poseía varios pasos. Los primeros pasos incluían la selección de los micronutrientes, la selección de los grupos de población y la definición de los objetivos de salud que requerían una revisión de las recomendaciones. Además, se formó un Comité de expertos cuya responsabilidad fue la de establecer las necesidades específicas de micronutrientes y/o recomendaciones. En el siguiente paso se debían recoger los datos científicos existentes sobre las necesidades de los micronutrientes específicos y grupos de población definidos, resumirlos e integrarlos de acuerdo con el mejor método predefinido. La hoja de ruta EURRECA (Roadmap) grafica los pasos que permitirán a EURRECA alcanzar su objetivo general. (Figura 1) En el contexto de la red EURRECA, se dio prioridad a varios micronutrientes para los cuales la evidencia disponible sobre los requerimientos fue revisada de forma sistemática. Estos micronutrientes fueron priorizados de acuerdo con: a) la cantidad de nuevos datos científicos de micronutrientes, disponibles para las diferentes etapas de vida, desde 2003, en particular, de ensayos aleatorizados controlados, Introducción 17 b) la relevancia de los micronutrientes en la salud pública, y c) las variaciones en las actuales recomendaciones de micronutrientes (Cavelaars et al. 2010). Uno de estos micronutrientes prioritarios fue el CINC. Figura 1: Hoja de ruta (Roadmap) para la Red de Excelencia EURRECA Visión general de las actividades de la Red de Excelencia EURRECA (Ashwell et al. 2008). Introducción 18 1.2 El CINC – GENERALIDADES Nuestra percepción del Zn ha progresado en un tiempo extraordinariamente corto, desde la de ser un mineral de dudosa significación para la salud humana, a la de ser un micronutriente excepcional para la salud pública. Esto es más evidente en relación con el desarrollo prenatal y postnatal (Hambidge & Krebs 2007). El Zn es un nutriente esencial, presente en todos los tejidos y fluidos corporales. La mayor proporción del Zn corporal está contenida en el músculo esquelético (50 – 60%), siendo apreciable también su contenido en el hueso (25 – 30% que puede llegar a 40% en el recién nacido a término). Sin embargo, hay otros órganos con concentraciones de Zn semejantes a los órganos mencionados (el hígado y el riñón, con 50 – 60 μg). Las mayores concentraciones de Zn se encuentran en coroides (250 – 280 μg/g) y secreciones prostáticas (300 – 400 μg/ml)(Olivares Grohnert et al. 2010). En el plasma representa alrededor del 0,1 por ciento del contenido total del Zn en el cuerpo. El Zn está presente en el organismo casi exclusivamente como Zn2 + unido a las proteínas celulares (Makonnen et al. 2003 b). El papel biológico del Zn conocido hasta el momento es el de formar parte de estructuras y funciones de las proteínas, incluyendo más de 300 enzimas, factores de transcripción, sitios de receptores hormonales y membranas biológicas. El Zn tiene muchas funciones importantes en el ADN y en el metabolismo del ARN (MacDonald 2000), y está implicado en la transducción de señales, la expresión génica, y la apoptosis. Está involucrado en el metabolismo del ácido nucleico, en la proliferación celular, en la diferenciación y en el crecimiento (Hambidge & Krebs 2007). Introducción 19 1.3 METABOLISMO DEL CINC La absorción y la excreción del Zn están controladas por mecanismos homeostáticos. Cuando la ingesta de Zn es pequeña, la absorción intestinal aumenta notablemente mientras que se reducen las pérdidas de este elemento por la orina y por el tracto intestinal. La absorción del Zn es similar a la del calcio y tiene lugar mediante dos mecanismos: un mecanismo saturable, mediado por transportadores, que funciona más eficientemente cuando las concentraciones de Zn en la luz intestinal son bajas, y un mecanismo de difusión pasiva que depende de las concentraciones del mineral. Como el Zn se encuentra, por lo general, unido a aminoácidos y a pequeños péptidos, los iones tienen que ser liberados en las proximidades de las vellosidades para que puedan ser absorbidos. En el hombre, se conocen al menos 14 transportadores de Zn que regulan la entrada y la salida de este elemento en las células, agrupados en dos familias: ZnT y Zip. Estas proteínas parecen tener funciones opuestas: los transportadores ZnT reducen el Zn intracelular favoreciendo su salida de la célula o almacenándolo en vesículas intracelulares, mientras que las proteínas Zip aumentan las concentraciones intracelulares promoviendo la entrada del Zn extracelular o su liberación desde las vesículas almacén. Una vez en el interior de la célula, el Zn se une a las metaloproteínas y otras proteínas del citoplasma celular. Mediante movimientos transcelulares, las metaloproteínas transportan el Zn hasta el extremo basolateral de las células enterohepáticas para su paso a la sangre. El paso a la sangre se realiza, también, mediante un mecanismo de transporte activo ya que las concentraciones de Zn plasmáticas son mayores que las concentraciones intracelulares. La cantidad de Zn que pasa a la sangre depende no Introducción 26 A pesar de ello, una revisión sistemática reciente concluyó que la concentración de Zn en suero o plasma era sensible a los suplementos de Zn. Por ello, es el biomarcador más utilizado para evaluar los niveles de este mineral (Lowe et al. 2009). Para los lactantes y los niños, no existe ningún método que sea completamente válido y fiable para diagnosticar los niveles de Zn:  Zn en suero o plasma es el método más común para diagnosticar los niveles de Zn. Se han llegado a definir los valores normales por encima de los 70 microgramos/dl (> 10,7 milimoles por litro). Sin embargo, para la determinación de Zn en la circulación es necesario obtener al menos 0,5 ml de plasma o suero libre de minerales, lo cual tiene implicaciones tanto para los recién nacidos como para los lactantes. El Zn no se puede determinar en muestras de sangre recogidas a través de los capilares, lo que limita su medición en los estudios de campo con niños. El Zn en suero y en plasma es un parámetro adecuado para el diagnóstico de deficiencia clínica severa, pero no para la identificación de la deficiencia marginal de Zn, lo que sería la aplicación principal en los estudios de nutrición a nivel poblacional (Aggett 1991; Haase et al. 2006). Además, existen varios factores que interfieren con la medición exacta de Zn en el plasma. La hemólisis de la muestra de sangre o la contaminación de la muestra pueden sobreestimar el valor real. Los niveles bajos de albúmina sérica, o la presencia de infección pueden disminuir, aunque solo en apariencia, los verdaderos valores de Zn. Por otra parte, a nivel individual, las concentraciones circulantes de Zn tienen una baja correlación con el Zn depositado en los tejidos como el hígado, el hueso o el músculo.  Otros elementos que circulan a nivel celular incluyendo glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas, también se han utilizado para evaluar la concentración de Zn en el organismo. Sin embargo, para esta medición, es necesario obtener muestras Introducción 27 adecuadas, y, por lo tanto, el alto volumen de sangre necesario limita su uso a nivel de población.  Zn en cabello: El cabello es un material atractivo para medir, en especial en niños, debido a la naturaleza no invasiva de la colección. Aunque no existen valores de corte universalmente aceptados para definir las concentraciones normales o anormales de Zn en el cabello humano, podría ser un método válido para determinar niveles de Zn a nivel de población. Sin embargo, a nivel individual, la concentración de Zn en pelo no refleja de manera fiel el estado nutricional de Zn, y por lo tanto este método no debe ser utilizado en un entorno clínico. Los avances más recientes en la tecnología biomédica ofrecen algunas perspectivas interesantes para mejorar la evaluación de los niveles del Zn a nivel individual:  Biología molecular: la disponibilidad del Zn puede ser evaluada a través de la regulación homeostática de la célula. En la actualidad se están desarrollando pruebas para medir la expresión génica de las proteínas que regulan el Zn en los monocitos circulantes.  Estudio del metabolismo del Zn: en este campo se ha realizado un progreso significativo. La absorción de Zn, su excreción y el total de Zn orgánico, se puede determinar en niños a través de la medición de isótopos no radiactivos estables. 1.7 EFECTOS DEL CINC SOBRE LA SALUD: 1.7.1 DEFICIT DE CINC: La prevalencia real de la deficiencia de Zn no se conoce con exactitud, ya que, a diferencia de lo que ocurre con el hierro, no se cuenta con indicadores de laboratorio de alta sensibilidad y fiabilidad. Sin embargo, la prevalencia estimada en población general es alta, con miles de millones de personas en riesgo, en particular en los Introducción 28 países en desarrollo (Maret & Sandstead 2006). Niveles bajos de Zn tal vez afecten a un 50% de la población mundial, que posean un estado nutricional deficiente (Alnwick et al. 1993; Gibson 1994; Brown et al. 2001). Aunque la deficiencia de Zn severa es poco común en las poblaciones europeas, la deficiencia marginal es probable que sea mucho más frecuente (Gibson 2008). Los grupos de población más vulnerables a la deficiencia de Zn son los lactantes, los preescolares, las mujeres embarazadas y las mujeres lactantes, debido a sus requisitos elevados de este nutriente. Desafortunadamente, se han llevado a cabo pocos estudios para determinar directamente el grado de deficiencia de Zn en las poblaciones mediante el uso de indicadores biológicos. Un factor importante asociado con el desarrollo de la deficiencia de Zn en las poblaciones es la ingesta inadecuada de Zn en la dieta. Sin embargo, existen otros factores agravantes tales como los depósitos reducidos al nacer (por prematuridad o por bajo peso al nacer), los altos requerimientos fisiológicos de Zn, por ejemplo, durante la infancia, la adolescencia, el embarazo y la lactancia (Black 1998), y / o por pérdidas excesivas como consecuencia de la diarrea o de enfermedades específicas como la enfermedad celíaca, la enfermedad de Crohn, el síndrome del intestino corto o la fibrosis quística. También, el tratamiento con ciertos medicamentos (por ejemplo, penicilamina, tiazidas y glucagón) pueden aumentar su deficiencia (Gibson 2005). A diferencia de muchos otros nutrientes, no hay reserva funcional de Zn disponible en el organismo. Sin embargo, los niños pueden ser capaces de aprovechar el Zn hepático acumulado durante la gestación (Zlotkin & Cherian 1988). Las consecuencias y manifestaciones de la deficiencia grave de Zn en niños puede ser retraso importante del crecimiento lineal y del desarrollo, falta de apetito, retraso en la maduración sexual e hipogonadismo, alopecia, dermatitis, retraso en la cicatrización de las heridas, diarrea, neumonía y malaria (Fischer Walker 2004), limitación en los sentidos del gusto y el olfato y ceguera nocturna. Además, la deficiencia de Zn puede disminuir la función inmune, dando lugar a una mayor susceptibilidad a las infecciones Introducción 29 (Maret & Sandstead 2006; Fraker & King 2004; Shankar & Prasad 1998; Wellinghausen et al. 1997). Diferentes mecanismos pueden explicar las consecuencias para la salud anteriormente mencionadas debidas a la deficiencia de Zn. Por ejemplo, la deficiencia de Zn eleva una hormona anorexígena, el neuropéptido Y, lo que explica la disminución del apetito. La ceguera nocturna es probablemente debida a la dependencia de una enzima que contiene Zn en el metabolismo del retinol en las varillas de la retina. El agotamiento de Zn metaloproteína en la lengua puede explicar la pérdida de la agudeza del gusto. Un estudio en India encontró una disminución en la mortalidad por enfermedades infecciosas en los niños nacidos a término y niños pequeños para la edad gestacional que recibieron suplementación con Zn entre los primeros meses y el noveno mes de edad (Sazawal et al. 2001). Resultados de varios estudios indican que la suplementación con Zn puede reducir significativamente las tasas de diarrea y de neumonía en niños pequeños (Bhutta et al. 1999; Brooks et al. 2005), y aumentar la tasa de crecimiento de los niños con retraso del crecimiento (Brown 2002). Durante la diarrea aguda, la suplementación con Zn reduce la duración y la severidad de la enfermedad, por lo que ahora la OMS recomienda la suplementación con Zn como un complemento a la terapia de rehidratación, para reemplazar las pérdidas excesivas de Zn durante los períodos de diarrea (WHO/Unicef 2004). La dosis recomendada para los suplementos en el tratamiento de la diarrea aguda es de 20 mg/día durante 10 a 14 días para los niños mayores de 12 meses, y la mitad de esta dosis (10 mg/d) para los niños de <12 meses. Específicamente, analizaremos cómo influye y cuál es la relación entre la ingesta de Zn y los niveles de Zn en suero o plasma, en el crecimiento y en el desarrollo neurológico: Introducción 30 1.7.2 El Cinc en los niveles de suero/plasma Tal y como hemos comentando, la evaluación de la ingesta de Zn en los individuos se complica por el hecho de que no existe ningún biomarcador aceptado, sensible y específico de los niveles de Zn existentes (King 1990). Si bien es cierto que el suero o plasma disminuyen las concentraciones de Zn después de varias semanas de introducción de una dieta que contenga una cantidad muy restrictiva de Zn (Baer et al. 1985), las concentraciones séricas de este mineral generalmente se mantienen dentro del rango normal cuando se producen reducciones pequeñas o moderadas en la ingesta de Zn. Con respecto a las evidencias disponibles de la relación ingesta – nivel sérico/plasmático de Zn, la mayoría de los estudios individuales en lactantes se han diseñado con otros objetivos distintos de la determinación en suero o plasma de este micronutriente. Por ejemplo, el estudio de Sazawal et al. (1996) en la India obtuvo un incremento en los niveles de Zn plasmático después de la suplementación con Zn, pero este estudio se centró básicamente en la evaluación del uso de suplementos de Zn para la reducción de la incidencia de la diarrea. En otros casos, no se analizó la contribución única del Zn, sino su posible interacción con otros nutrientes. Este es el caso de los estudios realizados en Thailandia por el grupo de Wasantwisut et al. (2006), en Bangladesh por Chang et al. (2010) y en Indonesia por Lind et al. (2003), los que mostraron resultados positivos de la suplementación con Zn en los niveles de Zn en suero, pero que referían a la comparación del efecto de la suplementación del Zn combinado o no con hierro, en relación con el crecimiento ponderal, con la reducción de la cantidad de hospitalizaciones de los niños, o simplemente con los niveles de hemoglobina o transferrina en suero. Además, las poblaciones de los estudios son variables. Algunos se llevaron a cabo en lactantes sanos de población rural como es el caso de Wasantwisut (2006), de Lind (2003), de Bates (1993) o de Umeta et al. (2000). Otros fueron realizados en poblaciones con malnutrición energético - proteica (MEP). Tal es el caso del estudio de Introducción 31 Makonnen et al. (2003) realizado en Lesotho. En este estudio se identificó la deficiencia de Zn como co-factor de la MEP pero, además, se observó que los incrementos en los niveles de Zn en suero recién se hicieron evidentes a los 60 días de la suplementación, lo que habla de un efecto del Zn a largo plazo. Umeta et al. (2000) en Etiopia incluyeron en su estudio niños con déficit de crecimiento. Estos, también encontraron un efecto positivo en los niveles de Zn en suero tras la suplementación. Concluyeron, además, que la suplementación con Zn es capaz de revertir la detención del crecimiento en estos niños debido, aparentemente, a la mejora del apetito y de la inmunidad, lo que repercute en la disminución de la morbilidad. En estos niños la suplementación con Zn es esencial para un adecuado “catch-up” en el crecimiento. Sin embargo dejaron claro que no es el único micronutriente necesario. El estudio de Osendrap et al. (2002) también realizado en Bangladesh se llevó a cabo en barrios marginales de la cuidad de Dhaka. Si bien en este estudio el objetivo principal fue evaluar la suplementación con Zn en el crecimiento, se observó un incremento en los niveles de Zn séricos solamente en aquellos lactantes con niveles de Zn basales bajos (>9,18 μmol/L), en los que, además, se observó un incremento de peso significativo. La misma línea siguió el estudio de Walravens et al. (1989), realizado en lactantes provenientes de familias pobres de la ciudad de Denver, USA. El enfoque principal de este estudio fue la evaluación del crecimiento, pero la evaluación de los niveles de Zn en plasma no encontró diferencias significativas entre los grupos suplementados y los controles. Está claro que todos los estudios incluidos son en países subdesarrollados o en población pobre y de bajos recursos, donde, seguramente, la dieta fue pobre en proteína animal, rica en fitatos; y donde las condiciones socio sanitarias colaboraron en el desarrollo de deficiencia de micronutrientes. A pesar de la existencia de todos estos estudios, hasta donde conocemos, no se ha realizado aún ningún metaanálisis que evalúe los niveles de Zn en suero o plasma en Introducción 32 función de los niveles de ingesta de Zn y que, además, lo evalúe en lactantes. Sólo existe un metaanálisis realizado en 2002 (Brown et al.) en 15 estudios que incluían niños prepúberes y que revelaron efectos positivos y estadísticamente significativos de la suplementación con Zn en las concentraciones séricas del micronutriente. Sin embargo, hubo gran heterogeneidad en los resultados. Comprender la relación entre la ingesta alimentaria de micronutrientes y sus niveles en suero o plasma en lactantes es esencial para derivar, entonces, las recomendaciones dietéticas. 1.7.3 El Cinc en el Crecimiento El Zn es un micronutriente esencial para el crecimiento normal durante la infancia. Los lactantes tienen un requerimiento relativamente alto de Zn por unidad de peso corporal durante un período sensible de rápido crecimiento y desarrollo (Hermoso et al. 2010). Consecuencias fisiológicas funcionales de la deficiencia de Zn leve (por ejemplo, retraso del crecimiento), a menudo, son evidentes antes de que las concentraciones de Zn en el plasma y / o en los tejidos se reduzcan significativamente (Gibson et al. 1989; Ruz et al. 1991). Una ingesta inadecuada de Zn es probable que sea un factor importante que contribuya a la falta de crecimiento en los niños que están desnutridos, ya que las dietas bajas en proteínas tienden a ser bajas en Zn (Golden & Golden 1981). El retraso del crecimiento comienza a los 6 meses de edad en los países menos desarrollados con una rápida progresión (The World Bank 2006) y coincide con un momento crítico en el suministro de Zn en la dieta, conocido por la OMS como “un problema en la alimentación complementaria” (Dewey & Brown 2003). Los estudios de suplementación con Zn en lactantes han obtenido diferentes efectos sobre el crecimiento. Algunos estudios no han encontrado diferencias significativas entre los grupos suplementados con Zn y los controles. Este es el caso del estudio de Introducción 33 Dijkhuizen et al. (2001), en el que se argumentó que suplementar con Zn no es suficiente para permitir un crecimiento óptimo en los lactantes que poseen un estado nutricional deficiente, y que existen otros factores subyacentes en la dieta o en las circunstancias de estos niños que efectivamente son los que afectan el crecimiento. Misma conclusión obtuvo Hamadani et al. (2001) quienes señalaron que el poco efecto hallado en su estudio en el grupo tratado con Zn se debió al desequilibrio de micronutrientes presente en los niños desnutridos que requieren otros nutrientes además de éste. Muller et al. (2003) también encontraron poco efecto en sus resultados, y, nuevamente, los niños incluidos en su estudio tenían un estado nutricional deficiente. Meeks Gardner et al. (1998) también mencionaron que la insuficiente ingesta energética y proteica podría afectar la falta de respuesta positiva observada en los parámetros de crecimiento, pero estos autores también argumentaron que el tiempo de suplementación fue insuficiente como para observar cambios en el crecimiento. Estos resultados van en concordancia con la evidencia existente de que el Zn es más efectivo en niños con relativamente mejor estado nutricional, mientras que entre aquellos cuyo estado nutricional es deficiente, la respuesta a dicha suplementación parece ser limitada (Kikafunda et al. 1998). Sin embargo, existen estudios en los que el efecto de la suplementación con Zn fue beneficioso, a pesar del estado nutricional deficiente del lactante. Por ejemplo, Rivera et al. (1998) en un estudio controlado doble ciego llevado a cabo en lactantes guatemaltecos con bajo peso y deficiencia de este micronutriente, confirmaron un efecto antropométrico positivo para la suplementación con Zn. Igualmente, Sur et al. (2003), encontraron diferencias significativas en el crecimiento lineal en niños con bajo peso al nacer suplementados con sulfato de Zn y no suplementados, y plantearon que las diferencias pueden hacerse más evidentes después del primer año de vida. Mismo resultado obtuvieron Ninh et al. (1996) los que demostraron que la suplementación con Zn de los niños vietnamitas con retraso del crecimiento, aumentaba las Introducción 34 concentraciones de IGF-1 (insulin-like growth factor-1) en plasma, así como el crecimiento propiamente dicho. Los efectos beneficiosos de la suplementación con Zn en el estudio de Osendrap et al. (2002) fueron significativamente mayores en los niños que tenían concentraciones séricas de Zn bajas al inicio del estudio. Por último, el estudio de Lind et al. (2004) también encontró efecto positivo de la suplementación con Zn en el crecimiento. Sin embargo, en este caso, los niños estudiados eran en su mayoría niños saludables que aún estaban siendo alimentados a pecho, que poseían acceso al agua potable, cuyas madres poseían un alto nivel educativo, lo que podría haber añadido un efecto protector. Con respecto a los metaanálisis llevados a cabo sobre esta asociación, destaca la aportación de Brown et al. (1998) que publicaron un metaanálisis de 25 ensayos clínicos aleatorizados, que investigaron el efecto de los suplementos de Zn en los niveles de Zn en plasma y en el crecimiento, en niños de entre 3,6 a 13 años en países en desarrollo. Los estudios incluidos fueron bastante heterogéneos (algunos incluían niños hospitalizados, con malnutrición y con retraso del crecimiento). Los resultados de su análisis indicaron que la suplementación con Zn mejoraba significativamente el peso para la edad (WAZ) y la talla para la edad z-score (LAZ) de los niños incluidos en los estudios, en especial en los niños con retraso del crecimiento o con desnutrición al inicio del estudio. En 2002, este mismo autor realizó una versión actualizada de ese mismo metaanálisis con 33 estudios que evaluaban nuevamente la suplementación con Zn en el crecimiento. Este nuevo estudio también se desarrollo en niños prepúberes y en países en desarrollo. Los resultados encontraron en este caso efectos significativos en el crecimiento tras la suplementación con Zn para el peso, aunque no hubo efecto positivo en el metaanálisis del WLZ. Si bien los metaanálisis de Brown se realizaron en niños prepúberes, sirven como antecedente y sientan las bases para la realización del presente metaanálisis realizado en lactantes. Hasta el momento, la información disponible no permite establecer Introducción 35 claramente cuál es la situación nutricional más beneficiosa para suplementar con Zn y obtener un efecto positivo en el crecimiento en este segmento etario. 1.7.4 El Cinc en el Desarrollo Neurológico El Zn está también presente en el cerebro y contribuye a su estructura y función. Las pruebas existentes de estudios en animales y en humanos sugieren que su deficiencia puede llevar a retrasos en el desarrollo cognitivo. La grave deficiencia de Zn en animales se ha asociado con malformaciones estructurales del cerebro, tales como la anencefalia, microcefalia e hidrocefalia, con problemas de conducta, como la reducción de la actividad y el déficit en la memoria a corto plazo y el aprendizaje espacial. En los seres humanos, la deficiencia severa de Zn puede causar función anormal del cerebelo y disminución de respuestas conductuales y emocionales (Black 1998). Aunque los mecanismos que vinculan la deficiencia de Zn con el desarrollo cognitivo no están claros, parece que ésta puede conducir a un déficit del funcionamiento neuropsicológico infantil, de la actividad, o del desarrollo motor, y por lo tanto interferir con el rendimiento cognitivo (Black 1998). Relativamente pocos estudios han examinado el efecto de la suplementación con Zn sobre el comportamiento y el desarrollo en los lactantes. Muchos de los estudios han sido realizados en niños con bajo peso al nacer. Tal es el caso del estudio de Friel et al. (2001) realizado en Canadá, en el que se observó que la suplementación con Zn mejoró el desarrollo motor en los recién nacidos. El estudio de Jiménez et al. (2007) también en niños con bajo peso al nacer concluyó que la suplementación con Zn influía de forma positiva en el desarrollo motor, pero no en el desarrollo mental de los niños. Uno de los motivos de este hallazgo podría ser el aporte de Zn por parte de la alimentación complementaria, sobre todo del tercero al Objetivos 42 3. Material y métodos Materiales y Métodos 45 3. MATERIALES Y MÉTODOS Esta investigación se llevó a cabo en el marco de EURRECA, Red de Excelencia cuyo objetivo fue identificar las necesidades de micronutrientes para la salud óptima en las poblaciones europeas y desarrollar metodologías para estandarizar el proceso de establecimiento de las recomendaciones de micronutrientes (www.eurreca.org). 3.1 Estrategia de búsqueda Se realizó una revisión sistemática de la bibliografía disponible. La búsqueda bibliográfica se llevó a cabo a través de una búsqueda electrónica realizada en Medline, Embase y Cochrane hasta febrero de 2010. (Anexos 1, 2 y 3) El procedimiento para la identificación, la selección de los artículos y la extracción de datos se ilustra en la Figura 3. Materiales y Métodos 46 Figura 3: Diagrama de flujo para la revisión sistemática. Títulos y resúmenes identificados a partir de la búsqueda electrónica y la selección. Biblioteca Principal del Cinc: n= 5500 Excluidos después de la primera selección: Criterios de Exclusión / Inclusión aplicados y eliminación de duplicados n = 3339 Exclusión de adultos & ancianos, niños, adolescentes y mujeres embarazadas n = 1817 Copias completas de las publicaciones de artículos de población LACTANTE, recuperación y evaluación para su elegibilidad n = 344 Aplicación de criterios de Inclusión / Exclusión adicionales (In /Out Form) Excluidos n = 318 26 Ensayos Clínicos Aleatorizados Artículos incluidos de Ingesta – Niveles – Salud (biblioteca final para metaanálisis y extracción de datos) RELACIÓN INGESTA –NIVELES 9 estudios (17 estimaciones) Incluyen: Cinc sérico/ plasmático RELACIÓN INGESTA –SALUD CRECIMIENTO 19 estudios (38 estimaciones) Incluyen: 11 Longitud 11 Peso 10 Peso para la edad z-score (WAZ) 9 Longitud para la edad z-score (LAZ) 8 Peso para la Longitud z score (WLZ) 4 Circunferencia de cabeza 7 Circunferencia media de brazo (MUAC) RELACIÓN INGESTA –SALUD NEURODESARROLLO 5 estudios (14 estimaciones) Incluyen: 14 Índice de Desarrollo Mental (MDI) 14 Índice de Desarrollo Psicomotor (PDI) Materiales y Métodos 47 Para identificar los estudios más relevantes en las bases de datos, se estableció una estrategia de búsqueda utilizando términos de texto con truncamiento apropiado e indexación de términos relevantes. Se utilizaron las siguientes palabras: “randomized controlled trial”, “double-blind procedure”, “human”, “zinc or zn or zinc sulphate or zinc gluconate or zinc acetate or methionine or zinc isotope”, “intake or diet or supplement or deplete or status or serum or plasma or leukocyte or concentration or fortify”, “Nutritional Support or Dietary Supplements or nutritional requirements or breast feeding or infant food or bottle feeding or infant formula”, “Nutritional Status or Deficiency Diseases or supplementation or diet supplementation or dietary intake or diet restriction or mineral intake or Diet or Food, Fortified or nutrition assessment or Nutritive Value”. Los idiomas incluidos se limitaron a los hablados en la Red EURRECA (inglés, holandés, francés, alemán, húngaro, italiano, noruego, polaco, español, griego y serbio.). Además, se comprobaron las listas de referencias de los artículos seleccionados y de revisiones relacionadas publicadas en la literatura. 3.2 Selección de artículos Los títulos de los artículos identificados en las búsquedas fueron introducidos en una biblioteca de EndNote versión X1, que fue el programa establecido por la red de excelencia EURRECA para crear la base de datos general con la que se trabajaría (www.endnote.com). 3.2.1 Criterios de inclusión y exclusión Los criterios de inclusión y exclusión fueron establecidos por el grupo de Eurreca y se resumen a continuación: Materiales y Métodos 48 Criterios de inclusión 1. Se incluyeron solamente ensayos aletorizados controlados. 2. Se incluyeron estudios realizados en lactantes humanos (0-12 meses). 3. Se incluyeron aquellos estudios que evaluaran el efecto de la ingesta de Zn en las concentraciones de Zn en el suero/plasma, en el crecimiento y en el desarrollo neurológico. 4. Se incluyeron aquellos estudios que señalaran la ingesta de Zn realizada a partir de la ingesta de alimentos naturales (leche materna, fórmula infantil), de alimentos fortificados (por ejemplo fórmula fortificada y cereales) o de suplementos. Criterios de exclusión 1. Se excluyeron los estudios realizados en animales. 2. Se excluyeron los estudios que realizaran intervenciones combinadas (> de 1 micronutriente o micronutrientes + intervención del estilo de vida que no estudiara el efecto de forma separada del micronutriente). 3. Se excluyeron los estudios que no fueran primarios (por ejemplo cartas y comentarios narrativos), y las publicaciones duplicadas. 4. Se excluyeron los estudios donde la relación ingesta de Zn - niveles de Zn en suero/plasma o ingesta de Zn – crecimiento o entre ingesta de Zn - desarrollo neurológico no fuera reportada o evaluada. Materiales y Métodos 49 Se seleccionaron los títulos y resúmenes del 10% del total de publicaciones de la biblioteca EndNote construida. Se eliminaron las publicaciones duplicadas y se verificaron las restantes por dos revisores. Sólo cuando ambos evaluadores coincidieron en que los títulos y resúmenes cumplían con los criterios de inclusión, los artículos fueron incluidos. Cuando un título y su resumen no permitían su inclusión con certeza, se obtenía el texto completo del artículo para su evaluación. El 90% restante de la biblioteca EndNote construida se distribuyó en partes iguales entre los revisores, para su evaluación y verificación. Tras el proceso inicial de selección, se realizó la agrupación de los artículos según los diferentes grupos de edad (adultos & ancianos, lactantes, niños, adolescentes y mujeres embarazadas). En este estudio solamente se trabajó con lactantes. Se obtuvieron los textos de los artículos completos para la aplicación de los criterios de selección adicionales (In/Out Form). 3.2.2 Criterios de inclusión y exclusión adicionales (In/Out Form) El grupo Eurreca estableció nuevos criterios de inclusión y exclusión adicionales (Anexo 4). Estos criterios fueron: Criterios de inclusión adicionales 1. Se incluyeron estudios en los que la duración de la intervención fuera de al menos 2 semanas. 2. Se incluyeron estudios que informaran datos iniciales o basales de todas las medidas analizadas. Criterios de exclusión adicionales 1. Se excluyeron los ensayos controlados no aleatorizados, los ensayos no controlados y los ensayos con datos insuficientes o poco claros. Materiales y Métodos 50 Los datos de cada estudio seleccionado fueron extraídos y organizados en una base de datos de Microsoft Access (Microsoft Corp, Redmond, WA). 3.3 Exposición, desenlace y evaluación de otras variables 3.3.1 Exposición Como exposición se consideró la influencia de la ingesta de Zn sobre los niveles de Zn en suero/plasma, los parámetros de crecimiento infantil y las medidas de desarrollo neurológico infantil. La ingesta de Zn debía ser realizada a partir de la ingesta de alimentos naturales (leche materna, fórmula infantil), de alimentos fortificados (por ejemplo fórmula fortificada y cereales) o de suplementos. Si los ensayos clínicos seleccionados no informaban sobre la ingesta de Zn de la dieta (además del de la suplementación), se les imputaba un valor de 1,3 mg/día que resultaba de promediar la ingesta alimentaria de Zn de los ensayos clínicos que sí informaban de dicha ingesta (según protocolo Eurreca: www.eurreca.org). 3.3.2 Desenlace Se midieron 3 posibles desenlaces: 1. Niveles séricos/plasmáticos de Zn: Los niveles de Zn en los estudios incluidos en el metaanálisis se evaluaron en suero o plasma. Inicialmente, se intentó incluir estudios que utilizaran Zn urinario o Zn en pelo como biomarcadores. Sin embargo, debido a la escasez de datos obtenidos, fueron excluidos de este estudio. Materiales y Métodos 51 2. Parámetros de Crecimiento: Los parámetros de crecimiento evaluados en los estudios incluidos en el metaanálisis fueron: peso, longitud, perímetro braquial (circunferencia media del brazo - MUAC), perímetro cefálico, WAZ (peso para la edad z-score), LAZ (longitud para la edad zscore) y WLZ (peso para la longitud z-score). En todos los estudios incluidos, los pesos, longitudes y circunferencias se midieron utilizando técnicas estándar de medición. Las puntuaciones z-score se calcularon mediante el uso de datos de referencia del NCHS (Centro Nacional de Estadísticas Sanitarias) (Hamill et al. 1977.) Éstas representan la distancia de un valor por encima o por debajo de la media de peso o longitud de los lactantes nacidos a término de cada edad expresado en unidades de desviación. Una puntuación z por debajo de - 2 se considera un valor bajo y por debajo - 3 como muy bajo. 3. Parámetros de Neurodesarrollo: Los parámetros evaluados en el desarrollo neurológico en los estudios incluidos en el metaanálisis fueron MDI (Índice de Desarrollo Mental) y PDI (Índice de Desarrollo Psicomotor). Ambos índices fueron medidos por la escala de Bayley de Desarrollo Infantil II en todos los estudios. La Escala de Desarrollo Infantil de Bayley fue diseñada y validada por Nancy Bayley de la Universidad de Berckeley en 1969 para evaluar niños de edades comprendidas entre el nacimiento y los 30 meses. En 1993 su rango de aplicación se extendió hasta los 42 meses. Es el instrumento más utilizado para evaluar el desarrollo mental y psicomotor de los bebés. Los diferentes parámetros que mide esta escala van de lo simple a lo más complejo, teniendo en cuenta la evolución y el desarrollo de los niños comprendidos en estas edades. Otra aportación importante de esta escala es precisamente el índice de Materiales y Métodos 58 El estudio de Osendrap et al. (2002) dividió la muestra en tres grupos (todos los lactantes, lactantes con bajos niveles séricos de Zn < 9,18 mmol/L, y lactantes con niveles normales de Zn sérico > 9,18 mmol/L). El estudio de Arsenault et al. (2008) evaluó la ingesta de Zn utilizando un suplemento líquido y una papilla fortificada con el micronutriente. 3.4.3 En el neurodesarrollo Cuando el desarrollo neurológico se midió en diferentes momentos en la misma población, cada medición se utilizó como un análisis o estimación diferente (Ashworth et al. 1998; Castillo-Durán et al. 2001; Hamadani et al. 2001; Jiménez et al. de 2007). En un estudio (Ashworth et al. 1998) las dosis de Zn y la duración de la intervención fueron diferentes, por lo que se dividió la muestra en dos grupos. 3.5 Análisis estadístico De cada estudio seleccionado se evaluaron las medidas finales de Zn en suero o plasma; las medidas finales del peso, longitud, perímetro braquial, perímetro cefálico, WAZ, LAZ y WLZ para el crecimiento y las medidas finales de los índices MDI y PDI para el neurodesarrollo, todas recogidas como media y desviación estándar (DE) o error estándar (EE). (ANEXO 6) A partir de la media y la DE de cada estudio se calcularon los coeficientes beta (β) y sus EE, debido a que el modelo estadístico utilizado para estimar la relación entre la ingesta de Zn (variable x) y el nivel de Zn en suero/plasma o el crecimiento o el neurodesarrollo (variable y) se basa en la suposición de que esta relación lineal (ingesta/niveles de Zn séricos/plasmáticos o ingesta/crecimiento o ingesta/desarrollo Materiales y Métodos 59 neurológico) es una función logarítmica y que tanto la ingesta como el nivel sérico/plasmático o el crecimiento o el desarrollo neurológico siguen una distribución logarítmica normal (es decir que el logaritmo natural de la ingesta y el Zn sérico/plasmático o el crecimiento o el desarrollo neurológico tienen una distribución normal). Así, el valor esperado para la puntuación niveles séricos/plasmáticos o crecimiento o neurodesarrollo se expresa como: μy = β * μx + intercepción donde μy representa la media del logaritmo natural de la variable y (= puntuación niveles séricos/plasmáticos o puntuación crecimiento o puntuación desarrollo neurológico), β representa el coeficiente de regresión, y μx representa la media del logaritmo natural de la variable x (= ingesta de Zn). Esta forma de relación lineal de escala loge–loge corresponde a una función monótona cóncava en la escala original para β <1. Esta forma se supone que es realista para la relación biológica entre la ingesta de Zn y los diferentes parámetros. Debido a que la verdadera curva dosis-respuesta es desconocida, esta aproximación proporciona una metodología práctica para estimar la relación dosis-respuesta. Se aplicaron procedimientos de metaanálisis formal para combinar los resultados de los estudios seleccionados, y así revisar sistemáticamente las diferencias en los parámetros medidos según la ingesta de Zn (Dickersin 2002, Greenland 1998). Se consideró un modelo de efectos aleatorios por ser más apropiado que un modelo de efectos fijos. Se utilizó el método de DerSimonian y Laird para combinar los resultados (β) de los diferentes estudios (DerSimonian & Laird 1986). Todos los coeficientes β proporcionados por los estudios, fueron combinados utilizando un criterio de ponderación wi. El inverso de la varianza fue el criterio de ponderación o peso aplicado. Materiales y Métodos 60 La fórmula utilizada para estimar el efecto ponderado fue (Hedges 1982): β ponderada = Σ βi wi / Σ wi donde β ponderada es la media ponderada de los coeficientes β de los niveles de Zn en suero/plasma, de los parámetros de crecimiento y de los parámetros de neurodesarrollo. el peso (wi) de cada estudio se calculó como: wi = 1 / Vi + ح ² donde V es la varianza de cada estudio y ح ² es la varianza entre estudios. Además de esto, se calculó un intervalo de confianza del 95% (IC95%) para la estimación del tamaño del efecto combinado: IC 95% = β ponderada ± (1,96 x EE ponderado) donde EE es el error estándar de la estimación ponderada (Greenland 1998). Se realizó además una prueba de heterogeneidad, estimando el valor del estadístico Q que sigue una distribución chi-cuadrado con n-1 grados de libertad, siendo n el número de estudios incluidos en el análisis. El índice I² expresa el grado de heterogeneidad, pues describe el porcentaje de la variación (de 0 a 100%) entre los estudios que es debida a la heterogeneidad y no al azar. El punto de corte para detectar heterogeneidad se sitúa en el 5% (p=0,05). Un valor de p por debajo de 0,05 para este índice, indica la presencia de heterogeneidad, y, de alguna manera, compromete la validez de las estimaciones combinadas (Takkouche et al. 1999). Cuando los estudios combinados en el metaanálisis fueron heterogéneos, se evaluaron posibles fuentes de heterogeneidad mediante meta-regresiones lineales (Greenland 1998). Materiales y Métodos 61 Se realizaron meta-regresiones utilizando la duración de la intervención, las dosis de ingesta de Zn, la situación nutricional y el riesgo de sesgo como variables independientes. Como variables dependientes se utilizaron los coeficientes beta obtenidos en cada estudio de niveles de Zn en suero/plasma, de los diferentes parámetros de crecimiento y de los diferentes parámetros de neurodesarrollo de acuerdo con la ingesta de Zn. La existencia de diferencias estadísticamente significativas en la media ajustada de los coeficientes β entre las diferentes categorías de cada variable modificadora del efecto fue valorada a través de pruebas de ANCOVA. Además se llevaron a cabo metaanálisis adicionales por subgrupos teniendo en cuenta sólo aquellos grupos que proporcionaron valores significativos en la meta-regresión. También se realizaron análisis de sensibilidad. En ellos se excluyeron los estudios considerados atípicos o con valores extremos y se recalcularon las estimaciones de las betas ponderadas en cada parámetro del crecimiento y del desarrollo neurológico. En los niveles de Zn en suero o plasma, el análisis de sensibilidad no se realizó debido a que ningún valor se consideró atípico o extremo. Por último, se estimó la relación dosis-respuesta en aquellos casos en los que la asociación entre la ingesta de Zn y los diferentes parámetros analizados resultara estadísticamente significativa y no se encontrara heterogeneidad en el metaanálisis. Para llevar a cabo los análisis estadísticos se utilizó la versión (7,0) de Microsoft Excel, SPSS 10.0 para Windows y Review Manager 5.1. Materiales y Métodos 62 4. Resultados Resultados 65 4. RESULTADOS Cinco mil quinientos artículos fueron identificados inicialmente: 5126 gracias a la estrategia de búsqueda electrónica y 374 mediante búsqueda manual y revisión de referencias. Después de aplicar los criterios de inclusión/exclusión, 344 artículos parecían ser potencialmente relevantes. Después de aplicar los criterios de inclusión/exclusión adicionales (In/Out Form) y de agrupar los estudios por desenlace, 9 ensayos controlados aleatorizados (17 estimaciones), se seleccionaron para evaluar los niveles de Zn en suero/plasma (Bates et al. 1993; Chang et al. 2010; Lind et al. 2003; Makonnen et al. 2003a; Makonnen et al. 2003b; Osendarp et al. 2002; Sazawal et al. 1996; Sazawal et al. 2004; Umeta et al. 2000; Walravens et al. 1989; Wasantwisut et al. 2006); 19 ensayos controlados aleatorizados (38 estimaciones) fueron seleccionados para evaluar el crecimiento (Arsenault et al. 2008; Bates et al. 1993; Berger et al. 2006; Dijkhuizen et al. 2001; Fischer Walker et al. 2009; Gardner et al. 2005; Hamadani et al. 2001; Heinig et al. 2006; Lind et al. 2004; Meeks Gardner et al. 1998; Muller et al. 2003; Ninh et al. 1996; Olney et al. 2006; Osendrap et al. 2002; Rivera et al. 1998; Sur et al. 2003; Umeta et al. 2000; Walravens et al. 1989; Wasantwisut et al. 2006) y 5 ensayos controlados aleatorizados (9 estimaciones) fueron seleccionados para el metaanálisis de desarrollo neurológico (Ashworth et al. 1998; Castillo-Duran et al. 2001; Hamadani et al. 2001; Jiménez et al. 2007; Lind et al. 2004). (Figura 1) Las características descriptivas de los estudios incluidos en los metaanálisis se presentan en las siguientes tablas: (Tablas 5, 6, 7) Resultados Tabla 5: Características de los 9 estudios (17 estimaciones) del nivel de cinc en suero o plasma incluidos en el metaanálisis ¹Zn: Grupo Intervención / C¹: Grupo Control (a - e): Estimaciones Autor Año del estudio País Muestra (rango de edad o media) Número de lactantes (n) Dosis de Cinc (mg) Semanas de intervención Desenlace Situación Nutricional Riesgo de sesgo Zn ¹ C¹ Bates (a) (b) 1993 Gambia 5,7 a 27 meses 30 46 28 44 20 2 8 Nivel en plasma Saludable Riesgo alto Chang 2010 Bangladesh 6 a 18 meses 85 89 2,5 24 Nivel en suero Con riesgo nutricional Riesgo bajo Lind 2003 Indonesia 6,1 (0,5) meses 134 143 10 24 Nivel en suero Saludable Riesgo bajo (a) Makonnen (b) (c) 2003 Lesotho 6 a 60 meses 142 141 138 121 119 116 10 4 8 12 Nivel en suero Estado nutricional deficiente Riesgo moderado Osendarp 2002 Bangladesh 3 a 5 semanas 138 133 5 20 Nivel en suero Saludable Riesgo moderado Sazawal (a) (b) (c) (d) (e) 19962004 India 6 a 35 meses 6 a 11 meses > 11 meses Niñas Niños 223 78 69 115 108 224 78 73 106 118 10 16 Nivel en plasma Con riesgo nutricional Riesgo moderado (a) Umeta (b) 2000 Etiopia Zn retraso crecim. 9,5 (2,0) me Control retraso crecim. 9,7 (2,0) me Zn s/ retraso crecim. 9,3 (2,1) me Control s/retraso crecim. 9,2(2,0) me 25 25 25 25 8,57 24 Nivel en suero Saludable Riesgo alto Walravens 1989 USA 8 a 27 meses 16 25 5,7 24 Nivel en plasma Con riesgo nutricional Riesgo bajo Wasantwisut 2006 Thailandia 4 a 6 meses 58 66 10 24 Nivel en suero Saludable Riesgo bajo Resultados Tabla 6: Características de los 19 estudios (38 estimaciones) de crecimiento incluidos en el metaanálisis Autor Año del estudio País Muestra (rango de edad o media) Número de lactantes (n) Dosis de Cinc (mg) Semanas de intervención Desenlace (Crecimiento) Situación Nutricional Riesgo de sesgo Zn¹ C¹ Arsenault (a) (b) 2008 Perú 6 to 8 meses 44 44 36 38 3 en suplemento líquido 3 en papilla fortificada 24 MUAC Con riesgo nutricional Riesgo alto Bates 1993 Gambia 5,7 to 27 meses 50 53 20 60 Peso – Longitud - MUAC Saludable Riesgo alto Berger 2006 Vietnam 4 to 7 meses 195 191 10 24 Peso - Longitud - WAZ – LAZ - WLZ Con riesgo nutricional Riesgo moderado Dijkhuizen 2001 Indonesia Mean 4,2 meses 90 98 7 24 Peso - Longitud - WAZ – LAZ – WLZ Estado nutricional deficiente Riesgo moderado Fischer Walker 2009 Bangladesh 6,3 ± 0,3 meses 140 141 2,8 24 Peso - Longitud Con riesgo nutricional Riesgo moderado Gardner 2005 Jamaica 9 to 30 meses 59 55 10 24 Peso - Longitud - WAZ – LAZ - WLZ Estado nutricional deficiente Riesgo moderado Hamadani (a) (b) 2001 Bangladesh 1 to 13 meses 109 101 103 97 5 28 52 WAZ – LAZ WLZ Estado nutricional deficiente Riesgo alto Heinig (a) (b) Para Perim.Cefálico 2006 USA 3 to 10 meses 37 37 37 33 33 33 5 16 40 24 Peso - Longitud - MUAC - Perímetro cefálico Saludable Riesgo bajo Lind 2004 Indonesia 6 to 12 meses 164 163 10 8 WAZ - LAZ-WLZ Saludable Riesgo bajo Meeks Gardner 1998 Jamaica 6 to 24 meses 24 31 5 12 Perímetro cefálico Estado nutricional deficiente Riesgo moderado Muller 2003 Burkina Faso Groupo Zn 18,7 ± 7,0 me Grupo Placebo: 17,6 ± 6,5 me 329 332 1,78 24 MUAC Con riesgo nutricional Riesgo bajo Resultados Tabla 9: Análisis de subgrupos. Efecto de la ingesta de Zn sobre los niveles de Zn en suero /plasma en cada categoría de las variables modificadoras del efecto (coeficiente β ponderado e IC 95%) Nivel de Zn en suero /plasma Coeficiente β ponderado Chi² (df, P) I² Todos los estudios (n=17) 0,09 (0,06 a 0,12) 315,81 (16, < 0,00001) 95% Por duración de la Intervención 1 a 3 semanas (n=1) 0 (-0,02 a 0,02) 4 a 20 semanas (n=10) 0,09 (0.06 a 0,13) 141,21 (9, < 0,00001) 94% > 20 semanas (n=6) 0,11 (0,05 a 0,17) 71,40 (5, < 0,00001) 93% Por dosis 1 a 4 mg (n=1) 0,04 (0,01 a 0,07) 4,1 a 8 mg (n=2) 0,04 (-0,17 a 0,25) 9,85 (1, 0,002) 90% 8,1 a 12 mg (n=12) 0,12 (0,08 a 0,15) 151,38 (11, < 0,00001) 93% > 12 mg (n=2) 0,02 (-0,01 a 0,05) 7,21 (1, 0,007) 86% Por Situación Nutricional Saludable (n=7) 0,11 (0,06 a 0,16) 215,29 (6, < 0,00001) 97% Con riesgo nutricional (n=7) 0,10 (0,05 a 0,14) 39,48 (6, < 0,00001) 85% Estado nutricional deficiente (n=3) 0,05 (-0,02 a 0,12) 39,26 (2, < 0,00001) 95% * I² Índice que mide el grado de heterogeneidad Resultados 75 Cuando las dosis de Zn variaron de 4,1 a 8 mg/día, no hubo efecto significativo de la ingesta de Zn en los niveles de Zn en suero/plasma, mientras que se observó un efecto positivo cuando las dosis oscilaron entre 8,1 a 12 mg/día (β = 0,12, IC 95%: 0,08 a 0,15). Para dosis superiores a 12 mg/día no se registró ningún efecto. Sin embargo, para dosis por encima de 8 mg/día se observó gran evidencia de heterogeneidad. Cuando los estudios se clasificaron según la situación nutricional, los estudios realizados en lactantes sanos y con riesgo nutricional, registraron una asociación positiva entre la ingesta de Zn en los niveles de Zn en suero/plasma ( = 0,11, IC 95%: 0,06 a 0,16 y = 0,10; IC 95%: 0,05 a 0,14), respectivamente. Sin embargo, no se encontró asociación cuando la situación nutricional de los niños fue deficiente ( = 0,05, IC 95% -0,02 a 0,12). Una vez más, el coeficiente β ponderado continuó mostrando gran evidencia de heterogeneidad (I² = 85 %, p= < 0,00001 a 97%, p= < 0,00001). Debido a la gran heterogeneidad encontrada en todos los análisis, se decidió no realizar el cálculo de la relación dosis-respuesta entre la ingesta de Zn y los niveles de Zn en suero o plasma. Resultados 76 4.2 Resultados para Crecimiento De los 19 estudios incluidos en el metaanálisis de crecimiento, sólo 12 cumplieron estrictamente con el rango de edad (0 a 12 meses) (Arsenault et al. 2008; Berger et al. 2006; Dijkhuizen et al. 2001; Fischer Walker et al. 2009; Heinig et al. 2006; Lind et al. 2004; Olney et al. 2006; Osendrap et al. 2002; Rivera et al. 1998; Sur et al. 2003; Umeta et al. 2000; Wasantwisut et al. 2006). Los otros 7 estudios incluían esta edad entre los niños, pero no detallaban cuántos eran en realidad de 0 a 12 meses (Bates et al. 1993; Gardner et al. 2005; Hamadani et al. 2001; Meeks Gardner et al. 1998; Muller et al. 2003; Ninh et al. 1996; Walravens et al. 1989). En ningún caso, las edades se extendieron más allá de los 27 meses, a excepción de Gardner y Ninh et al. (2005, 1996), que incluyeron niños de hasta 30 y 36 meses, respectivamente. Cuatro estudios fueron de América Latina y el Caribe, 2 de América del Norte, 9 de Asia y 4 de África. La duración de las intervenciones varió de 1 a 60 semanas. Las dosis de ingesta de Zn variaron desde 1,78 hasta 20 mg por día. La situación nutricional de los lactantes también varió: 6 estudios se realizaron en lactantes sanos (Bates et al. 1993; Heinig et al. 2006; Lind et al. 2004; Osendrap et al. 2002; Umeta et al. 2000; Wasantwisut et al. 2006), 6 estudios en lactantes con riesgo nutricional (Arsenault et al. 2008; Berger et al. 2006; Fischer Walker et al. 2009; Muller et al. 2003; Rivera et al. 1998; Walravens et al. 1989), y 7 estudios se llevaron a cabo en lactantes con estado nutricional deficiente (Dijkhuizen et al. 2001; Gardner et al. 2005; Hamadani et al. 2001; Meeks Gardner et al. 1998; Ninh et al. 1996; Olney et al. 2006; Sur et al. 2003). El riesgo de sesgo también varió entre los estudios: 6 tuvieron un alto riesgo de sesgo, 7 tuvieron un riesgo de sesgo moderado y 6 mostraron un riesgo de sesgo bajo. La mayoría de los ensayos clínicos no refirieron ninguna diferencia basal en las diferentes medidas de crecimiento (n = 16). Sin embargo, Arsenault y Rivera et al. Resultados 77 (2008; 1998) realizaron un ajuste por diferencias iniciales. Y sólo el estudio de Bates et al. (1993) no mencionó nada respecto de este asunto. Las diferencias entre los resultados de los diferentes parámetros de crecimiento evaluados (peso, talla, perímetro braquial, perímetro cefálico, WAZ, LAZ y WLZ) de acuerdo con la ingesta de Zn en cada estudio particular y en los análisis conjunto de todos los estudios incluidos se muestran en las figuras 5 a 11. Figura 5: Crecimiento – Peso – Study or Subgroup Bates, 1993 Berger, 2006 Dijkhuizen, 2001 Fisher Walker, 2009 Gardner, 2005 Heinig, 2006a Heinig, 2006b Ninh, 1996 Osendrap, 2002a Osendrap, 2002b Osendrap, 2002c Rivera, 1998 Walravens, 1989a Walravens, 1989b Wasantwisut, 2006 Total (95% CI) Heterogeneity: Tau² = 0.00; Chi² = 21.05, df = 14 (P = 0.10); I² = 33% Test for overall effect: Z = 0.96 (P = 0.34) BETA -0.0180475 0.00734628 0.01466152 -0.0096562 0.00137506 0.00337825 -0.0017323 0.02160029 0.01269063 0.1161805 -0.0053317 0.00850396 0.03174719 0.03205935 -0.0051551 SE 0.0084626 0.00497546 0.009437 0.01320046 0.00962667 0.01602506 0.01602044 0.0096471 0.01922087 0.05574056 0.0206321 0.0122653 0.03524854 0.03450242 0.00624515 Weight 10.7% 16.7% 9.5% 6.0% 9.2% 4.4% 4.4% 9.2% 3.3% 0.4% 2.9% 6.7% 1.1% 1.1% 14.3% 100.0% IV, Random, 95% CI -0.02 [-0.03, -0.00] 0.01 [-0.00, 0.02] 0.01 [-0.00, 0.03] -0.01 [-0.04, 0.02] 0.00 [-0.02, 0.02] 0.00 [-0.03, 0.03] -0.00 [-0.03, 0.03] 0.02 [0.00, 0.04] 0.01 [-0.02, 0.05] 0.12 [0.01, 0.23] -0.01 [-0.05, 0.04] 0.01 [-0.02, 0.03] 0.03 [-0.04, 0.10] 0.03 [-0.04, 0.10] -0.01 [-0.02, 0.01] 0.00 [-0.00, 0.01] BETA BETA IV, Random, 95% CI -0.05 -0.025 00.025 0.05 Figura 6: Crecimiento – Longitud – Study or Subgroup Bates, 1993 Berger, 2006 Dijkhuizen, 2001 Fisher Walker, 2009 Gardner, 2005 Heinig, 2006a Heinig, 2006b Ninh, 1996 Osendrap, 2002a Osendrap, 2002b Osendrap, 2002c Rivera, 1998 Walravens, 1989a Walravens, 1989b Wasantwisut, 2006 Total (95% CI) Heterogeneity: Tau² = 0.00; Chi² = 25.30, df = 14 (P = 0.03); I² = 45% Test for overall effect: Z = 0.68 (P = 0.50) BETA -0.00911733 0.00127531 0.00323455 -0.00132211 -0.00189339 0.00273816 0.00094092 0.00754716 0.0309756 0.02833152 0.0204524 0.00689355 0.03164554 0.00684012 -0.00263837 SE 0.00350464 0.00163496 0.00284444 0.00395489 0.00510542 0.00523651 0.00493665 0.00536704 0.01361784 0.03556728 0.01450255 0.00475003 0.0218218 0.02387138 0.00183544 Weight 10.1% 16.6% 12.2% 8.9% 6.5% 6.3% 6.8% 6.1% 1.3% 0.2% 1.1% 7.1% 0.5% 0.4% 15.9% 100.0% IV, Random, 95% CI -0.01 [-0.02, -0.00] 0.00 [-0.00, 0.00] 0.00 [-0.00, 0.01] -0.00 [-0.01, 0.01] -0.00 [-0.01, 0.01] 0.00 [-0.01, 0.01] 0.00 [-0.01, 0.01] 0.01 [-0.00, 0.02] 0.03 [0.00, 0.06] 0.03 [-0.04, 0.10] 0.02 [-0.01, 0.05] 0.01 [-0.00, 0.02] 0.03 [-0.01, 0.07] 0.01 [-0.04, 0.05] -0.00 [-0.01, 0.00] 0.00 [-0.00, 0.00] BETA BETA IV, Random, 95% CI -0.05 -0.025 0 0.025 0.05 Resultados 78 Figura 7: Crecimiento – Perímetro cefálico – Study or Subgroup Heinig, 2006 Meeks Gardner, 1998 Osendrap, 2002 Rivera, 1998 Total (95% CI) Heterogeneity: Tau² = 0.00; Chi² = 1.53, df = 3 (P = 0.68); I² = 0% Test for overall effect: Z = 0.19 (P = 0.85) BETA 0.00126049 0.00590717 -0.0016081 0.0028015 SE 0.00391991 0.00760938 0.00255384 0.00411737 Weight 22.1% 5.9% 52.0% 20.0% 100.0% IV, Random, 95% CI 0.00 [-0.01, 0.01] 0.01 [-0.01, 0.02] -0.00 [-0.01, 0.00] 0.00 [-0.01, 0.01] 0.00 [-0.00, 0.00] BETA BETA IV, Random, 95% CI -0.05 -0.025 0 0.025 0.05 Figura 8: Crecimiento – MUAC (Circunferencia Superior del Brazo) – Study or Subgroup Arsenault, 2008 a Arsenault, 2008 b Bates, 1993 Heinig, 2006 Muller, 2003 Osendrap, 2002 Rivera, 1998 Umeta, 2000 a Umeta, 2000 b Total (95% CI) Heterogeneity: Tau² = 0.00; Chi² = 6.91, df = 8 (P = 0.55); I² = 0% Test for overall effect: Z = 0.98 (P = 0.33) BETA -0.0065066 0.00743958 -0.0277362 0.0239698 0.0110113 -0.0049165 0.00328778 0.01146116 0.01285006 SE 0.01271913 0.01260497 0.04472781 0.01905093 0.00982811 0.00534505 0.00761011 0.00859427 0.01165681 Weight 6.2% 6.3% 0.5% 2.8% 10.4% 35.3% 17.4% 13.6% 7.4% 100.0% IV, Random, 95% CI -0.01 [-0.03, 0.02] 0.01 [-0.02, 0.03] -0.03 [-0.12, 0.06] 0.02 [-0.01, 0.06] 0.01 [-0.01, 0.03] -0.00 [-0.02, 0.01] 0.00 [-0.01, 0.02] 0.01 [-0.01, 0.03] 0.01 [-0.01, 0.04] 0.00 [-0.00, 0.01] BETA BETA IV, Random, 95% CI -0.05 -0.025 0 0.025 0.05 Figura 9: Crecimiento – WAZ (Peso para la edad Z – score) – Study or Subgroup Berger, 2006 Dijkhuizen, 2001 Gardner, 2005 Hamadani, 2001a Hamadani, 2001b Lind, 2004 Ninh, 1996 Olney, 2006 Rivera, 1998 Sur, 2003a Sur, 2003b Sur, 2003c Sur, 2003d Sur, 2003e Sur, 2003f Sur, 2003g Sur, 2003h Sur, 2003i Sur, 2003j Sur, 2003k Sur, 2003l Wasantwisut, 2006 Total (95% CI) Heterogeneity: Tau² = 0.00; Chi² = 31.14, df = 21 (P = 0.07); I² = 33% Test for overall effect: Z = 2.69 (P = 0.007) BETA 0.0647417 0.0593347 -0.018498 0 0.0633639 0.1202346 0.1387323 -0.032371 -0.018498 -0.045933 -0.053588 -0.038277 0.1071769 0.1454544 0.0535884 0.0688994 0.1913873 0.1531099 0.1531099 0.2526313 0.5511955 0 SE 0.0377112 0.0692402 0.0494441 0.0829569 0.0810719 0.0532252 0.0441472 0.041484 0.0843635 0.0859668 0.127849 0.1122829 0.1209568 0.1256994 0.1405654 0.1492998 0.1485245 0.1447394 0.1441267 0.1569395 0.1565394 0.0477421 Weight 10.6% 5.7% 8.4% 4.5% 4.6% 7.8% 9.4% 9.9% 4.4% 4.2% 2.2% 2.8% 2.5% 2.3% 1.9% 1.7% 1.7% 1.8% 1.8% 1.6% 1.6% 8.7% 100.0% IV, Random, 95% CI 0.06 [-0.01, 0.14] 0.06 [-0.08, 0.20] -0.02 [-0.12, 0.08] 0.00 [-0.16, 0.16] 0.06 [-0.10, 0.22] 0.12 [0.02, 0.22] 0.14 [0.05, 0.23] -0.03 [-0.11, 0.05] -0.02 [-0.18, 0.15] -0.05 [-0.21, 0.12] -0.05 [-0.30, 0.20] -0.04 [-0.26, 0.18] 0.11 [-0.13, 0.34] 0.15 [-0.10, 0.39] 0.05 [-0.22, 0.33] 0.07 [-0.22, 0.36] 0.19 [-0.10, 0.48] 0.15 [-0.13, 0.44] 0.15 [-0.13, 0.44] 0.25 [-0.05, 0.56] 0.55 [0.24, 0.86] 0.00 [-0.09, 0.09] 0.06 [0.02, 0.10] BETA BETA IV, Random, 95% CI -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 Resultados 79 Figura 10: Crecimiento – LAZ (Longitud para la edad Zscore) – Study or Subgroup Berger, 2006 Dijkhuizen, 2001 Gardner, 2005 Hamadani, 2001a Hamadani, 2001b Lind, 2004 Ninh, 1996 Olney, 2006 Rivera, 1998 Wasantwisut, 2006 Total (95% CI) Heterogeneity: Tau² = 0.00; Chi² = 10.27, df = 9 (P = 0.33); I² = 12% Test for overall effect: Z = 0.45 (P = 0.66) BETA 0.05549291 0.00539406 -0.0554929 0 0.06336391 0.01849764 0.13410786 -0.0369953 0.02774645 -0.0046244 SE 0.0388374 0.0657008 0.0656958 0.0870719 0.0900799 0.0455414 0.0637569 0.0240375 0.0991123 0.0466862 Weight 15.7% 6.3% 6.3% 3.7% 3.5% 12.1% 6.7% 31.2% 2.9% 11.6% 100.0% IV, Random, 95% CI 0.06 [-0.02, 0.13] 0.01 [-0.12, 0.13] -0.06 [-0.18, 0.07] 0.00 [-0.17, 0.17] 0.06 [-0.11, 0.24] 0.02 [-0.07, 0.11] 0.13 [0.01, 0.26] -0.04 [-0.08, 0.01] 0.03 [-0.17, 0.22] -0.00 [-0.10, 0.09] 0.01 [-0.03, 0.04] BETA BETA IV, Random, 95% CI -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 Figura 11: Crecimiento – WLZ (Peso para la Longitud Zscore) – Study or Subgroup Berger, 2006 Dijkhuizen, 2001 Gardner, 2005 Hamadani, 2001a Hamadani, 2001b Lind, 2004 Ninh, 1996 Rivera, 1998 Wasantwisut, 2006 Total (95% CI) Heterogeneity: Tau² = 0.00; Chi² = 9.09, df = 8 (P = 0.33); I² = 12% Test for overall effect: Z = 2.70 (P = 0.007) BETA 0.0647417 0.0431525 0.0924882 0 0.0633639 0.1433567 0.0416197 -0.087864 0 SE 0.0327174 0.0637599 0.045111 0.0790938 0.0638779 0.0568378 0.0503126 0.0764765 0.0398559 Weight 23.2% 7.5% 13.8% 5.0% 7.5% 9.2% 11.5% 5.3% 17.0% 100.0% IV, Random, 95% CI 0.06 [0.00, 0.13] 0.04 [-0.08, 0.17] 0.09 [0.00, 0.18] 0.00 [-0.16, 0.16] 0.06 [-0.06, 0.19] 0.14 [0.03, 0.25] 0.04 [-0.06, 0.14] -0.09 [-0.24, 0.06] 0.00 [-0.08, 0.08] 0.05 [0.01, 0.08] BETA BETA IV, Random, 95% CI -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 En los análisis combinados, la ingesta de Zn no se asoció con el peso, con la longitud, con el perímetro braquial, con el perímetro cefálico y con LAZ. Sin embargo, la ingesta de Zn tuvo un efecto positivo y estadísticamente significativo en WAZ (β = 0,06, IC 95%: 0,02 a 0,10) y en WLZ (β = 0,05, IC 95%: 0,01 a 0,08). Dado que se aplicó una transformación logarítmica de base-e en la ingesta de Zn y los parámetros de crecimiento antes del cálculo de los coeficientes β de cada estudio específico, el coeficiente β ponderado representa la diferencia en el valor pronosticado de WAZ y WLZ para cada diferencia de una unidad en la ingesta de Zn (en escala logarítmica de base e). Por lo tanto, un coeficiente β ponderado de 0,06 significa que si se dobla la ingesta de Zn (x2), la diferencia en WAZ es (20,06 = 1,04). Para un Resultados 80 coeficiente β ponderado de 0,05, la diferencia en WLZ es de 1,035. Esto significa que una persona con una doble ingesta de Zn tiene, aproximadamente, un 4% mayor valor en WAZ y en WLZ que una persona que ingiere la mitad. (Figura 12, 13) Figura 12: WAZ (Kg/edad z-score) en función de la ingesta de cinc en la dieta (mg/día), estimado en el metaanálisis. Figura 13: WLZ (Kg/Longitud z-score) en función de la ingesta de cinc en la dieta (mg/día), estimado en el metaanálisis. Resultados 81 Con excepción de la longitud (I² = 45%, p = 0,03), no hubo heterogeneidad en ningún otro análisis. Con el fin de investigar aquellas variables que pueden ser posibles modificadoras del efecto sobre la longitud, se realizó una meta-regresión (Tabla 10). El efecto de la ingesta de Zn en la longitud cambió dependiendo de la duración de la intervención y de la dosis (p ANCOVA = 0,008 y 0,023), respectivamente. Resultados Tabla 10: Meta-regresión. Efecto de la ingesta de Zn sobre el crecimiento de acuerdo con diferentes características de los estudios incluidos en el metaanálisis (Coeficiente β medio e IC 95%) Crecimiento: Longitud n Coeficiente β medio IC (95%) P Ancova* Por Tiempo 4 a 20 semanas 5 0,0113 0,008 a 0,0219 > 20 semanas 10 -0,0026 -0,0089 a 0,0037 0,008 Por Dosis 1 a 4 mg 1 -0,0058 -0,0245 a 0,0130 4,1 a 8 mg 8 0,0162 0,0078 a 0,0245 8,1 a 12 mg 5 0,0057 -0,0016 a 0,0130 > 12 mg 1 0,0014 -0,0200 a 0,0229 0,023 Por Situación Nutricional Saludable 7 0,0010 -0,0066 a 0,0086 Con riesgo nutricional 5 0,0128 0,0025 a 0,0230 Estado nutricional deficiente 3 -0,0006 -0,0122 a 0,0110 0,083 Por Riesgo de Sesgo Bajo 6 0,0016 -0,0084 a 0,0116 Moderado 7 0,0074 -0,0013 a 0,0161 Alto 2 0,0042 -0,0105 a 0,0189 0,409 * Valor p obtenido a través de ANCOVA Resultados 83 La Tabla 11 muestra los resultados de los análisis de longitud después de estratificar los estudios según las variables modificadoras del efecto señaladas en la metaregresión. Después de estratificar por la duración de la intervención y por la dosis, la heterogeneidad se atenuó. A corto plazo (de 4 a 20 semanas), la ingesta de Zn se asoció positivamente con los valores de longitud ( = 0,01, IC 95% 0 a 0,02). Sin embargo, no se encontró efecto cuando la suplementación se prolongó durante más de 20 semanas ( = -0,001; IC 95% -0,003 a 0,002). A dosis de Zn medias (4,1 a 8 mg/día), la ingesta de Zn se asoció positivamente con los valores de longitud ( = 0,003, IC 95% 0 a 0,01). No obstante, la magnitud del efecto fue pequeña. No se encontró efecto a dosis de Zn bajas o altas (1 a 4 o > 12 mg/día) ( = 0; IC 95% -0,01 a 0,004 y = 0,01, IC 95% -0,02 a 0), respectivamente. Resultados 90 El efecto de la ingesta de Zn en el MDI se modificó dependiendo de la dosis (p ANCOVA = 0,002). En cuanto al PDI, hubo un efecto diferencial de la ingesta de Zn en función de la duración de la intervención, la dosis, el estado nutricional y el riesgo de sesgo (p = ANCOVA <0,001, <0,001, <0,001, <0,002), respectivamente. La Tabla 14 muestra los resultados después de la estratificación de la muestra de acuerdo con los modificadores del efecto identificados en la meta-regresión. Después de estratificar por la dosis, el coeficiente β ponderado para el MDI todavía mostró heterogeneidad (I² = 87%, p= <0,00001) para dosis de Zn altas (8,1 a 12 mg/día), pero esta heterogeneidad desapareció en algunos estratos tales como dosis de Zn bajas y medias (de 1 a 4 mg/día y de 4,1 a 8 mg/día). Sin embargo, no hubo ningún efecto significativo en la ingesta de Zn en estas dosificaciones. En el caso del coeficiente β ponderado para el PDI, la heterogeneidad desapareció cuando los estudios se agruparon en un período de intervención de 4 a 20 semanas, con dosis bajas y medias de Zn (de 1 a 4 mg/día y de 4,1 a 8 mg/día) y en los estudios con riesgo de sesgo moderado o alto. La heterogeneidad se mantuvo en los estudios que tuvieron más de 20 semanas de intervención (I² = 88%, p= <0,00001), altas dosis de Zn (8,1 a 12 mg/día) (I² = 98%, p= <0,00001), lactantes con estado de nutrición saludable o deficiente (I² = 54%, p= 0,11 y 96 %, p= <0,00001) y para el riesgo de sesgo bajo (I² = 98%, p= <0,00001). La suplementación con Zn mostró un efecto negativo, débil y significativo en la puntuación PDI en los estudios con una duración de 4 a 20 semanas (β = -0,05, IC 95%: -0,06 a -0,04). Resultados Tabla 14: Análisis de subgrupos. Efecto de la ingesta de Zn sobre el neurodesarrollo (MDI, PDI) en cada categoría de las variables modificadoras del efecto (coeficiente β ponderado e IC 95%) Coeficiente β ponderado Chi² (df, P) I² * MDI Todos los estudios (n=14) -0,01 (-0,02 a 0) 47,20 (13, < 0,00001) 72% Por Dosis 1 a 4 mg (n=2) -0,04 (-0,08 a 0) 0 (1, 0,98) 0% 4,1 a 8 mg (n=6) -0,01 (-0,01 a 0) 6,43 (5, 0,27) 22% 8,1 a 12 mg (n=6) -0,01 (-0,02 a 0,01) 38,19 (5, <0,00001) 87% PDI Todos los estudios (n=14) 0 (-0,02 a 0,02) 289,41 (13, < 0,00001) 96% Por duración de la Intervención 4 a 20 semanas (n=2) -0,05 (-0,06 a -0,04) 0,40 (1, 0,52) 0% > 20 semanas (n=12) 0,01 (-0,01 a 0,02) 93,24 (11, < 0,00001) 88% Por Dosis 1 a 4 mg (n=2) -0,02 (-0,08 a 0,03) 1,49 (1, 0,22) 33% 4,1 a 8 mg (n=6) -0,01 (-0,02 a 0,01) 2,50 (5, 0,78) 0% 8,1 a 12 mg (n=6) 0 (-0,03 a 0,04) 268,60 (5, < 0,00001) 98% Por Situación Nutricional Saludable (n=3) 0 (-0,02 a 0,02) 4,36 (2, 0,11) 54% Estado nutricional deficiente (n=11) 0 (-0,03 a 0,02) 281,40 (10, < 0,00001) 96% Por Riesgo de Sesgo Bajo (n=6) 0 (-0,03 a 0,04) 268,60 (5, < 0,00001) 98% Moderado (n=2) -0.01 (-0,03 a 0,01) 1,26 (1, 0,26) 21% Alto (n=6) 0 (-0,02 a 0,01) 3,35 (5, 0,65) 0% * I² Índice que mide el grado de heterogeneidad Resultados 92 Los resultados de los análisis de sensibilidad se muestran en la Tabla 15. No se encontró una asociación significativa entre la ingesta de Zn y los índices MDI y PDI. La estimación de Ashworth et al. (b) (1998) se consideró como un valor atípico en el análisis de MDI porque los límites del coeficiente beta eran muy anchos (IC 95%= - 0,11 a 0,04). Cuando esta estimación se excluyó, la asociación persistió al igual que el grado de heterogeneidad. Lo mismo ocurrió cuando se excluyeron las estimaciones de Ashworth et al. (1998) (a) y (b) del metaanálisis del índice PDI. Debido a la gran heterogeneidad encontrada en la mayoría de los análisis del desarrollo neurológico, se decidió no realizar el cálculo de la relación dosis-respuesta. Resultados Tabla 15: Análisis de sensibilidad. Efecto de la ingesta de Zn sobre el neurodesarrollo (MDI, PDI), eliminando valores extremos (coeficiente β ponderado e IC 95%) Coeficiente β ponderado Chi² (dif, P) I² MDI Todos los estudios (n=14) -0,01 (-0,02 a 0) 47,20 (13, <0,00001) 72% Todos los estudios excluidos (n=1) -0,01 (-0,02 a 0) 46,60 (12, <0,00001) 74% Ashworth et al. 1998 b -0,04 (-0,11 a 0,04) PDI Todos los estudios (n=14) 0 (-0,02 a 0,02) 289,41 (13, <0,00001) 96% Todos los estudios excluidos (n=2) 0 (-0,02 a 0,02) 284,88 (11, <0,00001) 96% Ashworth et al. 1998 a -0,05 (-0,10 a 0,01) Ashworth et al. 1998 b 0,01 (-0,07 a 0,09) * I² Índice que mide el grado de heterogeneidad Resultados 5. Discusión Discusión 97 5. DISCUSIÓN Algunas consideraciones básicas e indispensables serán realizadas antes de centrarnos en la discusión formal de los resultados obtenidos para cada uno de los objetivos planteados en la presente memoria: 5.1 La heterogeneidad encontrada En la realización de este trabajo, la heterogeneidad encontrada en los estudios incluidos y su interpretación provocó un gran debate entre los integrantes del grupo EURRECA. Los estudios realizados en diferentes lugares y tiempos, sobre distintas poblaciones y con diseños diferentes, con frecuencia dan lugar a resultados que son diferentes entre sí. Esta heterogeneidad no puede ignorarse. Se debe indagar qué explicación pueden tener estas diferencias (fuentes de heterogeneidad). Más aún, a veces, la misión más importante de un metaanálsis no es hacer una síntesis unificadora, sino subrayar las diferencias entre los resultados de los distintos estudios disponibles. El metaanálisis sólo debe extraer un estimador común cuando de verdad pueda asumirse que existe un parámetro común, de lo contrario es preferible que sirva para dejar claro que no se puede combinar lo que es tan dispar (Delgado-Rodríguez & Sillero Arenas (en prensa) 2012). Esta situación fue la encontrada en gran parte de este trabajo. Y, es por esta razón también, por la que no se realizó el cálculo de la relación dosis – respuesta en aquellos metaanálisis cuyos índices de heterogeneidad tuvieron una p menor a 0,05 para ese índice y sólo se calculó en los metaanálisis de WAZ y WLZ medidos en los estudios de crecimiento. Sin embargo, otros grupos de EURRECA argumentaron que la heterogeneidad se justifica con la realización de un metaanálisis que asume un modelo de efectos aleatorios y no fijos. Su razonamiento se basó en que, en un modelo de efectos Discusión 98 aleatorios la inferencia asume que los diferentes estudios incluidos en el metaanálisis son una muestra aleatoria de varias poblaciones hipotéticas de estudios, asunción más realista que tener todo el universo de estudios como subyace en el modelo de efectos fijos. Sin embargo, esta aproximación debe emplearse cuando hay heterogeneidad pero no es la solución frente a ella. Además, el modelo de efectos aleatorios incluye una variabilidad adicional (tau) y, por lo tanto, produce un intervalo de confianza más amplio y de menor potencia. El presente trabajo también se realizó utilizando un modelo de efectos aleatorios pero hemos preferido no integrar los resultados. Los modelos de efectos aleatorios en los metaanálisis son temas muy discutidos en la comunidad científica que exceden los objetivos del presente trabajo. 5.2 Nuestros resultados Nuestros resultados indicaron que los suplementos de Zn aumentan los niveles de Zn en suero o plasma, favorecen algunos parámetros de crecimiento, pero no parecen influir en el desarrollo neurológico de los lactantes. 5.2.1 Niveles de Zn en suero/plasma: Tanto las concentraciones de Zn plasmáticas como séricas son los indicadores bioquímicos más utilizados para medir niveles de Zn, pero sus valores no son necesariamente idénticos. Estudios diseñados para comparar las concentraciones de Zn observaron niveles más altos de Zn en suero que en el plasma (Kasperek et al. 1981; English & Hambidge 1988). Estas diferencias pueden haber ocurrido debido a que las muestras de suero se separaron de las células de la sangre después de un período de tiempo mayor que las muestras de plasma. Al controlar tanto la cantidad de sangre recogida como el tiempo de separación de las células, no se encontraron diferencias en las concentraciones de Zn entre suero y plasma (English & Hambidge Discusión 99 1988). A fin de simplificar nuestro resultado, siempre nos hemos referido a " Zn en suero o plasma ", sin hacer distinción alguna entre ellos. Nuestros resultados indicaron que los suplementos de Zn aumentaban ligeramente los niveles de Zn en suero o plasma de los lactantes. Estos resultados coinciden con aquellos obtenidos en algunos estudios individuales. El estudio de Lind et al. 2003 por ejemplo, sugiere que tal vez sea necesario suplementar el Zn cada día o por un periodo más largo de tiempo para encontrar un efecto más significativo debido a que en el organismo no tenemos reservas de Zn y éste, además, tiene una circulación (turnover) muy rápida. Ellos observaron que en su curva dosis - respuesta nunca se logró generar un efecto meseta como resultado de la suplementación. Otra explicación posible de este ligero aumento en los niveles de Zn encontrado en nuestro análisis es la de una dosis insuficiente, tal y como menciona el estudio de Osendrap et al. (2002) Un metaanálisis similar a éste fue realizado por el grupo de Hall Moran et al. (2012) en Reino Unido pero en niños de 1 a 17 años. El coeficiente beta ponderado obtenido después del análisis de 18 ensayos aleatorizados fue de 0,12 (95% CI 0,04 a 0,20). Sin embargo obtuvo un I2 = 97.6% con una p = < 0.005, lo que indica heterogeneidad significativa. No obstante, este grupo propuso una relación dosis – respuesta, aunque aclara que debe considerársela cuidadosamente. En nuestro metaanálisis también se encontró gran evidencia de heterogeneidad. Después de realizar varios análisis de subgrupos, el coeficiente β ponderado para cada sub-análisis continuó mostrando la misma circunstancia. Y por esta razón se decidió no calcular la relación dosis – respuesta. Varios factores podrían explicar la presencia de heterogeneidad en nuestro análisis. Algunos autores señalan en sus estudios, el hecho de que las concentraciones séricas de Zn varían de acuerdo con la hora del día, con la proximidad de las comidas consumidas con anterioridad, y con la reciente actividad física u otras formas de estrés. Indican que estos factores podrían producir fluctuaciones de hasta un 20% Discusión 106 sensibilidad), una o más pueden alcanzar significación debido sólo al azar (Bland & Altman 1995). También es importante tener en cuenta la calidad científica de los estudios incluidos. A pesar de que los metaanálisis se utilizan cada vez más para consolidar los resultados de múltiples estudios sobre un mismo tema para poder desarrollar políticas basadas en la evidencia clínica y programas de salud pública; la fiabilidad de las conclusiones depende de la calidad metodológica de los estudios originales, de la conveniencia de los criterios de inclusión utilizados y de la minuciosidad de la revisión y de la síntesis de información (Brown et al. 2002). Si bien este metaanálisis se llevó a cabo siguiendo estrictos protocolos de revisión sistemática y adhiriéndose a los estándares de calidad desarrollados por EURRECA (Matthys et al. 2011), la evaluación del riesgo de sesgo de los estudios incluidos reveló que la mayoría (n = 5 para los niveles de Zn en suero o plasma; n= 13 para el crecimiento y n=3 para el neurodesarrollo) tenían un riesgo de sesgo moderado y alto. Algunas variables que podrían actuar como modificadores del efecto, factores de confusión o como ambas, también deben ser consideradas: el bajo peso al nacer, la lactancia materna, la pobreza y la privación social, y/o el contenido y la biodisponibilidad del Zn en la dieta local. Todos estos han sido factores importantes que contemplaron la mayoría de los estudios incluidos en nuestros metaanálisis. No obstante, es poco probable que los factores de confusión puedan haber afectado los resultados, ya que todos los estudios incluidos en los metaanálisis son ensayos clínicos aleatorizados. Sin embargo, solo en algunos estudios en los que se observó alguna diferencia inicial o existió algún fallo en el proceso de aleatorización, se realizó un ajuste de las diferencias iniciales. Como ya se mencionó anteriormente, para el metaanálisis de los niveles de Zn en suero o plasma todos los estudios incluidos asumieron que no había diferencias iniciales o basales en los niveles de Zn en suero o plasma. La única excepción fue Bates et al. (1993) quienes no mencionan nada respecto de este asunto. En el metaanálisis de crecimiento, Arsenault et al. y Rivera et Discusión 107 al. (2008; 1998) realizaron un ajuste de las diferencias iniciales. Los otros autores no encontraron diferencias iniciales. La única excepción fue Bates et al. (1993), quienes nuevamente en este caso no mencionan nada al respecto. Por último, para el metaanálisis de neurodesarrollo, Ashworth et al. (1998) realizaron un ajuste de las diferencias iniciales, mientras que Castillo Durán et al. 2001, Hamadani et al. 2001, Lind et al. 2004 no encontraron diferencias iniciales. Jiménez et al. 2007 no mencionaron nada con respecto a este tema. Algunos aspectos metodológicos de los estudios incluidos, tales como las variaciones en la dosis, la forma química del Zn utilizado, el método de administración de Zn y la duración de la suplementación también pueden haber influido en los resultados (Brown et al. 2002). Sin embargo, muchos de estos aspectos como la dosis o la duración de la suplementación son descritos al llevar a cabo análisis de subgrupos y/o meta regresiones. La edad de los niños es otro punto importante que se debe tener en cuenta. En nuestro metaanálisis se incluyeron, como se mencionó anteriormente, niños con edades comprendidas entre los 0 y los 60 meses (5 años) en el caso de niveles de Zn en suero o plasma; de 0 a 36 meses en el metaanálisis de crecimiento y de 1 a 13 meses en el de neurodesarrollo. Consideramos que no había razón para excluir del análisis a ningún estudio que no se hubiera ceñido exclusivamente al grupo de 0 a 12 meses de edad (lactantes), ya que, en el caso de los niveles de Zn en suero o plasma, de los 9 artículos incluidos, solo 4 cumplían estrictamente con la edad de 0 a 12 meses. Los otros 5 artículos incluían esta edad entre sus niños, pero no detallaban cuántos eran en realidad del grupo de 0 a 12 meses. Además, en una reciente publicación realizada por Hall Moran et al. 2012 en el marco del grupo EURRECA, y que se adjunta al final de esta memoria, se realizó un metaanálisis que evaluó los niveles de Zn en suero o plasma de niños y adolescentes. El rango de edad evaluado fue de 1 a 17 años. El coeficiente β ponderado obtenido en este trabajo fue de 0.12 Discusión 108 (95% CI 0.04, 0.20; p < 0.005; I² 97.6%). A la vista de este resultado, y dada la similitud de este valor con el hallado por nosotros, es poco probable que la edad en nuestro trabajo haya sesgado los resultados, ya que la magnitud del efecto encontrada para la ingesta de Zn fue similar, independientemente de la edad de los niños. Para el metaanálisis de crecimiento, de los 19 estudios incluidos, sólo 5 no se ciñen estrictamente a 0 a 12 meses de edad, aunque los incluyen en la edad de los niños estudiados. En este grupo se aplicó el mismo criterio que el considerado en la evaluación de los niveles de Zn en suero/plasma. En el metaanálisis de neurodesarrollo solo el estudio de Hamadani et al. incluyó niños de hasta 13 meses. 5.4 La finalidad de este estudio en España Encontrar información actualizada acerca de la ingesta de Zn en población española resulta tarea difícil. Algunos estudios indican deficiencias en los niveles de ingesta de este micronutriente. Por ejemplo, los datos de ingesta de Zn recogidos en la Encuesta Nacional de Ingesta Dietética (ENIDE) que se realizó entre 2009 – 2010 y que evaluó la situación nutricional de la dieta española, reveló que la ingesta de este mineral está por debajo del 80% de las IDRs en todos los grupos (por género y rango de edad), lo cual indica deficiencia. Con respecto a la proporción de la población con riesgo de ingesta inadecuada de Zn, en relación con los requerimientos medios estimados, se observó que era del 1,5% al 2,7% en mujeres y del 15 al 30% en hombres. Estos datos son acordes con los encontrados en otras poblaciones (Van Rossum et al., 2011). Si la búsqueda de información sobre ingesta de Zn se realiza en lactantes sanos, es decir, en niños de 0 a 12 meses, los datos encontrados todavía son más escasos. Salvo excepciones, desafortunadamente, no existen estudios epidemiológicos actualizados que informen sobre la situación nutricional o los niveles de ingesta de los lactantes, mucho menos que informen sobre este micronutriente en concreto. Discusión 109 Sabemos, además, que la población infantil española se ha modificado en los últimos años gracias a la inmigración existente y que la globalización ha contribuido a este hecho. Por lo tanto, pensar en una dieta y en una ingesta determinada basándonos en la típica dieta española sería una visión reduccionista de la cuestión. Una de estas excepciones es el estudio realizado en la Universidad de La Laguna en 2000 por Rodríguez et al., que evaluó la concentración media de Zn de fórmulas en polvo para lactantes y las comparó con las concentraciones de Zn encontradas en la leche materna. Además de observar que la fórmula tenía concentraciones de Zn significativamente mayores que las de la leche humana, observó una disminución progresiva de la concentración de Zn en la leche materna durante la lactancia. Además, encontró que la leche humana obtenida en la primavera tenía concentraciones de Zn más bajas que en otoño, lo que podría deberse a cambios estacionales en los hábitos nutricionales de las madres. Por otro lado, pocas son las evidencias que han relacionado la ingesta/niveles plasmáticos o séricos de Zn con diferentes parámetros de salud. En otro estudio realizado por Domenech et al. (2001) igualmente en la Universidad de La Laguna, que analizó la relación entre el Zn y algunos factores de crecimiento en recién nacidos, llegó a la conclusión de que durante las primeras semanas de vida había una disminución progresiva en los niveles séricos de Zn que afectaban evidentemente al crecimiento de los lactantes. En el estudio de Díaz-Gómez et al. 2003, también realizado en Canarias, se encontró un efecto positivo sobre el crecimiento lineal en niños prematuros suplementados con Zn. Evidentemente, el Zn aparece en forma discreta en la literatura científica española y europea. Se sabe que, en efecto, su ingesta y su suplementación producen determinados beneficios en los lactantes, pero es evidente que la gran mayoría de estudios existentes están realizados en contextos totalmente diferentes del europeo, en poblaciones con grandes carencias sociales y nutricionales como ya hemos puesto Discusión 110 de manifiesto a lo largo de esta memoria. Está claro que existe una gran dificultad en la extrapolación de esta información a poblaciones occidentales. También, es sabido que un gran porcentaje de la población no cubre los requerimientos de Zn. Estudios que examinen la respuesta a la suplementación o fortificación con Zn en poblaciones que son también deficientes en Zn, pero en ausencia de pobreza podrían ayudar a clarificar en gran manera los beneficios aportados por este micronutriente. Este hecho ha sido la esencia del grupo EURRECA y el objetivo final del presente trabajo. 6. Conclusiones Conclusiones 113 6. CONCLUSIONES PRIMERA: La asociación entre la ingesta de Zn en los lactantes y sus niveles de Zn en suero o plasma fue directa y estadísticamente significativa. La magnitud del efecto fue pequeña. Sobre la base de este grupo limitado de estudios y de su heterogeneidad, no se encontró información suficiente para sugerir que los suplementos de Zn tengan un efecto positivo en los niveles de Zn en suero o plasma de los lactantes. SEGUNDA: En el caso del crecimiento, se ha establecido una relación dosisrespuesta entre la ingesta de Zn y algunos parámetros de crecimiento (WAZ y WLZ) en lactantes. Para los demás parámetros de crecimiento, no se encontró efecto significativo. Estos datos pueden ser utilizados como prueba complementaria para respaldar los valores de referencia de ingesta de Zn, a pesar de que hay que reconocer las restricciones de la extrapolación de nuestros resultados a otras poblaciones, especialmente a poblaciones desarrolladas. TERCERA: No se encontró asociación estadísticamente significativa entre la ingesta de Zn y el desarrollo neurológico en los lactantes. Sobre la base de este grupo limitado de estudios y su heterogeneidad, no se encontró información suficiente para sugerir que los suplementos de Zn tienen un efecto positivo sobre el desarrollo neurológico de los lactantes. Conclusiones 114 CUARTA: Esta tesis ilustra que, hasta ahora, la evidencia disponible sobre los efectos de la ingesta de Zn en los lactantes es inconsistente, y que los efectos en los niveles de suero o plasma, en el crecimiento y en el desarrollo neurológico deben ser aún revisados. Se necesita más investigación estandarizada, de manera urgente, que permita obtener conclusiones con bases científicas para aclarar el papel de la suplementación con Zn en los lactantes, particularmente, en Europa y en otras sociedades desarrolladas. 7. Referencias Referencias 122 English JL, Hambidge KM. Plasma and serum zinc concentrations: effect of time between collection and separation. Clin Chim Acta. 1988; 175: 211–5. Fischer Walker C, Black, R.E. Zinc and the risk for infectious disease. Annu Rev Nutr. 2004; 24: 255–275. Fischer Walker CL, Ezzati M, Black RE. Global and regional child mortality and burden of disease attributable to zinc deficiency. Eur J Clin Nutr. 2009; 63(5): 591-7. Fraker PJ, King LE. Reprogramming of the immune system during zinc deficiency. Annu. Rev. Nutr. 2004; 24: 277–298. Friel JK, Andrews WL, Aziz K, Kwa PG, Lepage G, L'Abbe MR. A randomized trial of two levels of iron supplementation and developmental outcome in low birth weight infants. 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Ministry of Health, Welfare and Sports. 2011. 139 ANEXO I: Búsqueda electronica EMBASE No. Search term Results 1 random$.ti,ab. 389782 2 factorial$.ti,ab. 8131 3 (crossover$ or cross over$ or cross-over$).ti,ab. 39188 4 placebo$.ti,ab. 109036 5 (doubl$ adj blind$).ti,ab. 84173 6 (singl$ adj blind$).ti,ab. 7399 7 assign$.ti,ab. 107626 8 allocat$.ti,ab. 34034 9 volunteer$.ti,ab. 98427 10 crossover procedure.sh. 20937 11 double-blind procedure.sh. 71265 12 randomized controlled trial.sh. 165330 13 single blind procedure.sh. 7943 14 or/1-13 653981 15 animal/ or nonhuman/ or animal experiment/ 3415144 16 human/ 6387488 17 16 and 15 527284 18 15 not 17 2887860 19 14 not 18 569709 20 (cohort* or ''case control*'' or cross-sectional* or ''cross sectional'' or case-control* or prospective or ''systematic review*'').mp. 456251 21 epidemiologic studies/ or case-control studies/ or cohort studies/ or longitudinal studies/ or follow -up studies/ or prospective studies/ or cross-sectional studies/ or clinical trials as topic/ or intervention studies/ or pilot projects/ or Meta Analysis/ 521189 22 21 or 19 or 20 1226072 23 22 not 18 1202709 24 ((zinc or zn or zinc sulphate or zinc gluconate or zinc acetate or methionine or zinc isotope*) adj3 (intake* or diet* or supplement* or deplet* or status or serum or plasma or leukocyte or concentration* or expos* or fortif* or urine or hair)).mp. 20843 25 *zinc/ 19319 26 zinc blood level/ 2364 27 zinc deficiency/ 3138 28 supplementation/ or diet supplementation/ or dietary intake/ or exp diet restriction/ or exp mineral intake/ or Infant nutrition/ or artificial milk/ or breast milk/ or bottle feeding/ or breast feeding/ or lactation/ 128229 29 exp nutritional status/ or nutritional deficiency/ or exp zinc deficiency/ or trace metal blood level/ or exp zinc blood level/ 25790 140 30 (intake* or diet* or supplement* or deplet* or status or serum or plasma or leukocyte or concentration* or expos* or fortif* or urine or hair).mp. 2745875 31 28 or 30 or 29 2766626 32 25 and 31 12399 33 27 or 32 or 24 or 26 26275 34 33 and 23 2546 141 ANEXO II: Búsqueda electronica MEDLINE No. Search term Results 1 randomized controlled trial.pt. 280821 2 controlled clinical trial.pt. 79998 3 randomized.ab. 196604 4 placebo.ab. 117891 5 clinical trials as topic.sh. 146242 6 randomly.ab. 145491 7 trial.ab. 203467 8 randomised.ab. 38423 9 6 or 3 or 7 or 2 or 8 or 1 or 4 or 5 734511 10 (animals not (human and animals)).sh. 4482479 11 9 not 10 642665 12 (cohort* or ''case control*'' or cross-sectional* or ''cross sectional'' or case-control* or prospective or ''systematic review*'').mp. 768885 13 exp meta-analysis/ or expmulticenter study/ or follow-up studies/ or prospective studies/ or intervention studies/ or epidemiologic studies/ or case-control studies/ or exp cohort studies/ or longitudinal studies/ or cross-sectional studies/ 1013635 14 13 or 12 1203767 15 14 not 10 1154385 16 11 or 15 1599094 17 ((zinc or zn or zinc sulphate or zinc gluconate or zinc acetate or methionine or zinc isotope*) adj3 (intake* or diet* or supplement* or deplet* or status or serum or plasma or leukocyte or concentration* or expos* or fortif* or urine or hair)).ti,ab. 16681 18 Nutritional Support/ or Dietary Supplements/ or nutritional requirements/ or Breast feeding/ or exp infant food/ or bottle feeding/ or infant formula/ 63098 19 exp Nutritional Status/ or exp Deficiency Diseases/ or supplementation/ or diet supplementation/ or dietary intake/ or exp diet restriction/ or exp mineral intake/ or Diet/ or Food, Fortified/ or nutrition assessment/ or Nutritive Value/ 176014 20 (intake* or diet* or supplement* or deplet* or status or serum or plasma or leukocyte or concentration* or expos* or fortif* or urine or hair).ti,ab. 3166092 21 18 or 19 or 20 3263114 22 zinc/ 41027 23 22 and 21 20745 24 23 or 17 26943 25 24 and 16 2410 142 ANEXO III: Búsqueda electrónica COCHRANE No. Search term Results #1 (zinc or zn or methionine or ''zinc sulphate'' or ''zinc acetate'' or ''zinc gluconate'' or ''zinc isotope*''), from 2009 to 2010 197 #2 (MeSH descriptor Zinc explode all trees), from 2009 to 2010 15 #3 (#1 OR #2), from 2009 to 2010 197 #4 (deplet* or status* or expo* or plasma or serum or leukocyte or concentration* or fortif* or urine or hair), from 2009 to 2010 11139 #5 (supplement* or diet* or ''diet* restriction*'' or ''mineral intake*'' or intake* or ''infant nutrition'' or ''artificial milk'' or ''breast milk'' or ''bottle feeding'' or ''breast feeding'' or ''lactating''), from 2009 to 2010 3272 #6 (#4 OR #5), from 2009 to 2010 11847 #7 (#3 AND #6), from 2009 to 2010 170 Anexo IV: In / Out Form 145 Anexo IV: In / Out Form Intervention Studies Micronutrient: FOLATE / IRON / B12 / ZINC / IODINE Note 1: Minimum study duration: Iron: wks; Folate: wks; B12: 2 wks; Zinc: 2 wks, Iodine: 2 wks Note 2: Studies should only be included if answers to all applicable main questions are ‘YES’ Main question Subquestion Inclusion / Exclusion Criteria YES NO N/A 1 Study Population: Does this study use a human population? If YES, which population group(s)? 1a Infants: 0-1years 1b Children & adolescents: 1-18years 1c Adults & elderly: males & females 18years + 1d Pregnancy & lactation: pregnant or lactating women 2 Study Design: Is this a randomised controlled trial (RCT)? Exclude: non-randomised controlled trials, group randomised controlled trial (community trial), uncontrolled trials. 3 Type of intervention: Does the study investigate the effect of micronutrient intake from supplements or fortified food(s) or natural dietary sources, compared with placebo or untreated comparison group? Exclude: Combined interventions e.g. >1 micronutrient or micronutrient + lifestyle intervention which do not study the effect of the micronutrient separately 4 Intervention duration: Does the study last for the minimum specified duration? (refer to Note 1) 5 Study outcomes: Does the study report the relationship between at least two of the following types of outcome? (1) 146 health outcomes; (2) status measurements; (3) intake measurements If YES, which relationship(s)? 5a Status - Health 5b Intake - Health 5c Intake - Status 5d Intake - Status - Health 6 Status measures: If relevant, are the reported status measures included in Table RA2: Guidance Status Biomarkers for use in Systematic Reviews? http://www.eurreca.org/folders/6034 Exclude: Measures not included in Guidance document 7 Health outcomes: If relevant, are the reported health outcomes included in Deliverable RA2.x – 1 / 2. 7-3? http://www.eurreca.org/folders/6041 Exclude: Outcomes not included in above deliverable 8 Intake measures: Does the study report intake using at least one of the following methods (8a-c) OR report supplement intake (unless intentionally excluded)? Exclude: Other assessment methods If YES, which method(s)? 8a Validated FFQ / Dietary history 8b 24h recall / food records / diary measures for at least 3 days 8c 24h recall / food records / diary measure <3 days with adjustment for intra-individual variability 9 Baseline information: Does the study report baseline data for all outcome measures reported? Studies should only be included if answers to all applicable main questions are ‘YES’ Anexo V: Evaluación de la validez interna de los estudios aleatorizados según protocolo Eurreca Nutrients 2012, 4, 841-858; doi:10.3390/nu4080841 nutrients ISSN 2072-6643 www.mdpi.com/journal/nutrients Review The Relationship between Zinc Intake and Serum/Plasma Zinc Concentration in Children: A Systematic Review and Dose-Response Meta-Analysis Victoria Hall Moran 1, *, Anna-Louise Stammers 2 , Marisol Warthon Medina 2 , Sujata Patel 2 , Fiona Dykes 1 , Olga W. Souverein 3 , Carla Dullemeijer 3 , Carmen Pérez-Rodrigo 4 , Lluis Serra-Majem 5 , Mariela Nissensohn 5 and Nicola M. Lowe 2 1 Maternal & Infant Nutrition & Nurture Unit, University of Central Lancashire, Preston PR1 2HE, UK; E-Mail: [email protected] 2 International Institute of Nutritional Sciences and Food Safety Studies, University of Central Lancashire, Preston PR1 2HE, UK; E-Mails: [email protected] (A.-L.S.); [email protected] (M.W.M.); [email protected] (S.P.); [email protected] (N.M.L.) 3 Division of Human Nutrition, Wageningen University, PO Box 8129, 6700 EV Wageningen, The Netherlands; E-Mails: [email protected]l (O.W.S.); Carla.Dullem[email protected] (C.D.) 4 Community Nutrition Unit, Bilbao City Council, Bilbao 48001, Spain; E-Mail: [email protected] 5 Department of Clinical Sciences, University of Las Palmas de Gran Canaria, Las Palmas de Gran Canaria 35016, Spain; E-Mails: [email protected]pgc.es (L.S.-M.); [email protected] (M.N.) * Author to whom correspondence should be addressed; E-Mail: [email protected]; Tel.: +44-1772-893830; Fax: +44-1772-892998. Received: 4 May 2012; in revised form: 27 June 2012 / Accepted: 10 July 2012 / Published: 26 July 2012 Abstract: Recommendations for zinc intake during childhood vary widely across Europe. The EURRECA project attempts to consolidate the basis for the definition of micronutrient requirements, taking into account relationships among intake, status and health outcomes, in order to harmonise these recommendations. Data on zinc intake and biomarkers of zinc status reported in randomised controlled trials (RCTs) can provide estimates of dose-response relationships which may be used for underpinning zinc reference values. This systematic review included all RCTs of apparently healthy children aged 1–17 years published by February 2010 which provided data on zinc intake and biomarkers of zinc status. OPEN ACCESS Nutrients 2012, 4 842 An intake-status regression coefficient ( 󰆹) was calculated for each individual study and calculated the overall pooled  󰆹 and SE ( 󰆹) using random effects meta-analysis on a double log scale. The pooled dose-response relationship between zinc intake and zinc status indicated that a doubling of the zinc intake increased the serum/plasma zinc status by 9%. This evidence can be utilised, together with currently used balance studies and repletion/depletion studies, when setting zinc recommendations as a basis for nutrition policies. Keywords: zinc; children; serum zinc; systematic review; dose-response; dietary recommendations; EURRECA 1. Introduction Suboptimal dietary zinc intake is increasingly recognised as an important public health issue. Although the lack of generally accepted biomarkers of zinc status has impeded estimation of the global prevalence of zinc deficiency, based on information regarding the amount of zinc present in national food supplies, it has been estimated that the risk of low dietary intake of absorbable zinc and consequent zinc deficiency affects between one-third and one-half of the world’s population [1] and rates of deficiency may approach 73% in some regions [2]. Although severe zinc deficiency is uncommon in European populations, marginal deficiency is likely to be much more prevalent [3], with associations to immune system dysfunction and restricted physical development [4]. Children are particularly vulnerable to suboptimal zinc status during periods of rapid growth that create increased zinc needs that may not be met [5,6]. It is estimated that over 450,000 deaths per year (4.4% of all mortalities) among children between six months and five years of age are attributable to zinc deficiency [7]. Zinc deficiency also has an impact of child morbidity, impairing growth and contributing to childhood stunting [8,9]. Physiological requirements for zinc peak at the time of the pubertal growth spurt, the onset of which varies according to gender. In girls the onset of the growth spurt (OGS) occurs at 10.1 years and peak height velocity (PHV) occurs at 12.0 years. In boys OGS and PHV occur at 11.8 and 14.2 years, respectively [10]. Even after the growth spurt has ceased, adolescents may require additional zinc to replete tissue zinc pools depleted during puberty [11]. Marginal zinc status during the pubertal growth spurt has been associated with slower skeletal growth, maturation, and reduced bone mineralisation [12–14]. As nearly a third of total skeletal mineral is accumulated in the 3–4 year period immediately after the onset of puberty [15] suboptimal zinc intake may have long-term consequences on bone health. Although a sensitive and specific biomarker has yet to be identified, a recent systematic review concluded that plasma (or serum) zinc concentration was responsive to both zinc supplementation and depletion and is the most widely used biomarker for zinc [16]. However, meta-analytic methods have not yet been used to model zinc status as a function of zinc intake levels. Understanding the relationship between dietary intake and micronutrient status is essential for deriving dietary recommendations. The recommendations for zinc intake during childhood vary widely across Europe and comparisons are difficult due to differences in categorisation. For example between 4 and 6 age categories are used Nutrients 2012, 4 843 to describe micronutrient recommendations in childhood with different age cut-off points being used by different European countries [17,18]. Recommendations for zinc intake differ between males and females at the age of 15 years in most countries, but also differ at the age of 10 years in some countries. Zinc intake values range from 2.9 to 10.0 mg/day in children aged 5 years, 5.7 to 15.5 mg/day (boys) and 4.6 to 15.0 mg/day (girls) in children aged 10–15 years [17]. The EURRECA project attempts to consolidate the basis for the definition of micronutrient requirements across Europe, taking into account relationships among intake, status and health outcomes, in order to harmonise these recommendations [19]. This paper presents a systematic review of the data from all available randomised controlled trials (RCTs) meeting EURRECA’s quality standard [20], which investigated zinc intake and biomarkers of zinc status, and combines these studies in meta-analyses to model zinc concentrations in serum or plasma as a function of zinc intake. 2. Methods 2.1. Search Strategy This research was conducted within the framework of the European Micronutrient Recommendations Aligned (EURRECA) Network of Excellence that aims to identify the micronutrient requirements for optimal health in European populations (EURRECA [21]). This review was part of a wider review process to identify studies assessing the effect of zinc intake on different outcomes (biomarkers of zinc status and health outcomes). The wider searches were performed of literature published up to and including February 2010 using MEDLINE, Embase, and Cochrane using search terms for “study designs in humans” and “zinc” and “intake OR status”. Both indexing and text terms were used and languages included were restricted to those spoken in the EURRECA Network (English, Dutch, French, German, Hungarian, Italian, Norwegian, Polish, Spanish, Greek, and Serbian). The full Ovid MEDLINE search strategy can be found in Table 1. Reference lists of retrieved articles and published literature reviews were also checked for relevant studies. Authors were contacted to request missing data or clarify methods or results. The search process is illustrated in Figure 1. Table 1. Search strategy: MEDLINE February 2010 [22]. No. Search Term Results 1 randomised controlled trial.pt. 280,821 2 controlled clinical trial.pt. 79,998 3 randomised.ab. 196,604 4 placebo.ab. 117,891 5 clinical trials as topic.sh. 146,242 6 randomly.ab. 145,491 7 trial.ab. 203,467 8 randomised.ab. 38,423 9 6 or 3 or 7 or 2 or 8 or 1 or 4 or 5 734,511 10 (animals not (human and animals)).sh. 4,482,479 11 9 not 10 642,665 12 (cohort* or “case control*” or cross-sectional* or “cross sectional” or case-control* or prospective or “systematic review*”).mp. 768,885 Nutrients 2012, 4 844 Table 1. Cont. 13 exp meta-analysis/ or expmulticenter study/ or follow-up studies/ or prospective studies/ or intervention studies/ or epidemiologic studies/ or case-control studies/ or exp cohort studies/ or longitudinal studies/ or cross-sectional studies/ 1,013,635 14 13 or 12 1,203,767 15 14 not 10 1,154,385 16 11 or 15 1,599,094 17 ((zinc or Zn or zinc sulphate or zinc gluconate or zinc acetate or methionine or zinc isotope*) adj3 (intake* or diet* or supplement* or deplet* or status or serum or plasma or leukocyte or concentration* or expos* or fortif* or urine or hair)).ti,ab. 16,681 18 Nutritional Support/ or Dietary Supplements/ or nutritional requirements/ or Breast feeding/ or exp infant food/ or bottle feeding/ or infant formula/ 63,098 19 exp Nutritional Status/ or exp Deficiency Diseases/ or supplementation/ or diet supplementation/ or dietary intake/ or exp diet restriction/ or exp mineral intake/ or Diet/ or Food, Fortified/ or nutrition assessment/ or Nutritive Value/ 176,014 20 (intake* or diet* or supplement* or deplet* or status or serum or plasma or leukocyte or concentration* or expos* or fortif* or urine or hair).ti,ab. 3,166,092 21 18 or 19 or 20 3,263,114 22 zinc/ 41,027 23 22 and 21 20,745 24 23 or 17 26,943 25 24 and 16 2410 2.2. Criteria for the Consideration of Studies for This Review Included studies were RCTs in apparently healthy child (human) populations aged from 1 to 17 years that supplied zinc supplementation either as capsules or part of a fortified meal. If supplemental zinc was provided as a component of a fortified meal, studies were only considered acceptable if zinc was the only constituent that was different between treatment groups. Only studies that measured zinc status as serum or plasma zinc were included; and those that reported sufficient data or had sufficient data obtainable from the authors to estimate  󰆹 and SE ( 󰆹) for the assumed linear relation on the log e –log e scale. Studies were excluded if they were a group RCT (community trial), or were commentaries, reviews, or duplicate publications from the same study. Studies were excluded if children were hospitalised, had severe protein-energy malnutrition or a chronic disease or if supplemental zinc was provided for less than 6 weeks. 2.3. Selection of Articles Of 4719 identified articles in the wider search on zinc intake, status and priority health outcomes in all populations, 2557 were excluded based upon screening of the title and abstract. Two independent reviewers screened 10% of the abstracts in duplicate and any discrepancies were discussed before screening the remaining references. Following subdivision into appropriate population groups the full texts of the 328 manuscripts were assessed to determine inclusion and exclusion by two independent reviewers and disagreements rectified through discussion. 302 studies were excluded because they did not meet the inclusion criteria. Of the remaining 26 studies, 8 studies were excluded as they had not Nutrients 2012, 4 845 investigated the relation between zinc intake and zinc related biomarkers, but related either intake or status directly to a health endpoint. For the purpose of this paper, 18 RCTs remained. Table 2 presents the characteristics of the included studies. Figure 1. Study selection process for systematic review (* some papers reported more than one relationship). 2.4. Data Extraction For each of the identified manuscripts, data was extracted independently by two reviewers into a standardised database. Extracted data included population characteristics, dose of elemental zinc in intervention and placebo supplements, duration of the study, dietary intake of zinc, and mean concentration of zinc in plasma or serum at the end of the intervention period. Serum/plasma zinc concentrations were converted to µmol/L when applicable. Nutrients 2012, 4 846 Table 2. Summary of included trials reporting the effect of dietary zinc intake on serum/plasma zinc status in children. First Author, Year, Country Participants Treatment Groups (n) Mean Zn Intake (mg/day) Mean (SD) Plasma/Serum Zn (µmol/L) Duration Zinc Status Biomarker [Analytical Method] Main Results Mahloudji, 1975, Iran [23] Males & females aged 6–12 years Fe only (12); Fe + 20 mg/day Zn (13) 5.65; 25.65 8.95 (1.80) 8.50 (1.93) 8 months Plasma Zn [AAS] No significant difference between plasma Zn of the supplemented and placebo groups Hambidge, 1979, USA [24] Males & females aged 33–90 months Male placebo (15); Male Zn FM 2.57 mg/day (20); Female placebo (14); Female Zn FM 2.57 mg/day (11) 6.3; 9.27; 6.3; 9.27 11.06 (2.23) 11.85 (2.23) 10.61 (1.81) 11.96 (1.81) 9 months Plasma Zn [AES] Plasma Zn significantly higher in Zn supplemented compared to placebo (girls and combined sexes only p < 0.05) Walravens, 1983, USA [25] Males & females aged 2–6 years Placebo (16); 10 mg/day Zn (16) 4.6; 15.9 11.32 (2.14) 10.86 (2.14) 12 months Plasma Zn [AES] No significant difference between plasma Zn of the supplemented and placebo groups Gibson, 1989, Canada [26] Males aged 59–95 months Placebo (21); 10 mg Zn/day (18) 6.4; 16.7 15.8 (3.5) 17.9 (3.4) 6 months Serum Zn [AAS] No significant correlation between serum Zn and dietary Zn levels Cavan, 1993, Guatemala [27] Males & females, mean age 81.5 (±7.0) months 1 Placebo (74); 10 mg Zn/day (71) 5.65; 15.65 14.9 (2.1) 16.2 (2.9) 25 weeks Plasma Zn [AAS] Plasma Zn significantly higher in Zn supplemented compared to placebo (p < 0.01) Friis, 1997, Zimbabwe [28] Males and females aged 11–17 years Placebo (121); 30–50 mg/day Zn (122) 5.65; 45.65 2 10.89 (2.5) 11.71 (2.4) 12 months Serum Zn [AAS] The decline in zinc concentration was significantly lower in the Zn supplemented group compared to the placebo group (p < 0.02) Rosado, 1997, Mexico [29] Males & females aged 18–36 months Placebo (55); 20 mg Zn/day (54) 5.65; 25.65 14.4 (4.45) 16.8 (5.88) 12 months Plasma Zn [AAS] Plasma Zn increased significantly in the Zn supplemented group over the 12 months period (p < 0.01) Ruz, 1997, Chile [30] Males & females aged 27–50 months Placebo (33); 10 mg/day Zn (36) 6.4; 17.1 17.7 (1.9) 17.6 (2.2) 6 months Plasma Zn [AAS] No significant difference between plasma Zn of the supplemented and placebo groups Sandstead, 1998, China [31] (3 regions) Males & females aged 6–9 years Chonqing MN, no Zn (35); 20 mg/day Zn + MN (35); Quindgdao MN, no Zn (36); 20mg/day Zn + MN (36); Shanghai MN, no Zn (37); 20 mg/day Zn + MN (37) 5.65; 25.65; 5.65; 25.65; 5.65; 25.65 19.83 (4.12) 23.6 (4.12) 20.42 (4.08) 22.97 (4.08) 17.9 (2.75) 17.97 (2.75) 10 weeks Plasma Zn [AAS] Plasma Zn significantly higher in Zn supplemented compared to placebo (p < 0.05) in Chonqing and Quindgdao groups. Nutrients 2012, 4 847 Table 2. Cont. Clark, 1999, UK [32] Peripubertal females, mean age 12.2 (±0.3) years Placebo (19); 15 mg Zn/day (23) 6.6; 21.6 12.6 (1.0) 16.7 (4.9) 6 weeks Serum Zn [no method given] Serum Zn significantly higher in Zn supplemented compared to placebo (p < 0.001) Smith, 1999, Belize [33] Males & females aged 22–66 months Placebo (10); 70 mg Zn/day (12) 5.65; 75.65 11.7 (0.68) 13.5 (0.68) 6 months Serum Zn [AAS] Serum Zn significantly higher in Zn supplemented compared to placebo (p < 0.001) Munoz, 2000, Mexico [34] Males & females aged 18–36 months Placebo (54); 20 mg/day Zn (47) 5.65; 25.65 14.3 (4.7) 16.8 (5.6) 6 months Plasma Zn [AAS] Serum Zn significantly higher in Zn supplemented compared to placebo (p < 0.0001) Lopez de Romana, 2005, Peru [35] Males & females aged 3–4 years Fe FM (12); Fe + 3 mg/day Zn FM (10); Fe + 9 mg/day Zn FM (12); 4.71; 8.72; 15.7 11.87 (1.88) 11.65 (1.25) 12.60 (1.51) 70 days Plasma Zn [ICP-MS] No significant differences in plasma Zn were found between treatments Silva, 2006, Brazil [36] Males & females aged 12–59 months 3 Placebo (30); 10 mg/day Zn (28) 5.65; 15.65 8.0 (0.58) 13.4 (0.25) 4 months Serum Zn [AAS] Serum Zn significantly higher in Zn supplemented compared to placebo (p < 0.05) Sandstead, 2008, USA (Mexican Americans) [37] Males & females aged 6–7 years MN, no Zn (25); 20 mg/day Zn + MN (25) 5.65; 25.65 15.4 (1.5) 15.6 (1.2) 10 weeks Plasma Zn [AAS] Mean plasma Zn increased significantly in both groups compared to baseline (p < 0.05) Wuehler, 2008, Ecuador [38] Males & females aged 12–30 months Placebo (56); 3 mg Zn/day (50); 7 mg Zn/day (52); 10 mg Zn/day (54) 5.65; 8.65; 12.65; 15.65 10.6 (1.6) 12.3 (1.6) 13.3 (1.7) 14.0 (1.7) 4 6 months Plasma Zn [ICP-MS] The mean change in plasma zinc concentrations from baseline increased progressively with higher doses of supplemental Zn (p < 0.001) de Oliveira, 2009, Brazil [39] Pubescent males, mean age 13 ( ± 0.4) years Placebo (26); 22 mg Zn/day (21) 5.65; 27.65 16.9 (2.1) 18.7 (3.5) 12 weeks Plasma Zn [ICP-MS] Plasma Zn significantly higher in Zn supplemented compared to placebo (p < 0.05) Uckarde, 2009, Turkey [40] Males & females aged 8–9 years Placebo (109); 15 mg/day Zn (109) 5.65; 20.65 19.19 (1.80) 19.50 (2.41) 10 weeks Serum Zn [CS] Both supplemented and placebo groups had significantly higher serum Zn at follow up (p < 0.05) AAS, atomic absorption spectroscopy; AES, atomic emission spectroscopy; ICP-MS, inductively coupled plasma mass spectrometry; CS, caloric spectrophotometry; MN, micronutrients; FM, fortified meal; 1 all participants also received MN supplements; 2 children weighing <29.5 kg were given 30 mg Zn/day and those >29.5 kg were given 50 mg Zn/day, this figure is an average of the two doses; 3 all participants also received Fe fortified milk; 4 geometric means. Nutrients 2012, 4 848 2.5. Data Synthesis One study that included two zinc-treated groups and two control groups (males and females) was treated as two independent estimates in the analysis [24] and one study that included three zinc-treated groups and three control groups (from different regions of China) [31] and was treated as three independent estimates in the analysis. Where studies provided outcome data for two or more zinc-treated groups they were included as separate estimates in the meta-analysis [35,38]. In one study zinc status was measured at 6 months and 12 months in the same population [26] and only the measure at 6 months was used in the analysis (where n was the largest). If dietary intake of zinc (in addition to the intervention) was not reported we imputed a value of 5.65 mg/day, the mean dietary intake level of the RCTs (n = 7) that did report dietary zinc intake. As mean baseline serum/plasma zinc concentrations were infrequently reported, the serum/plasma zinc concentrations in the control group of the RCTs were used as a proxy of the baseline serum/plasma zinc concentrations for our analyses. 2.6. Pre-Specified Potential Factors Modifying the Association A pooled meta-analysis was performed combining the evidence from all the available RCTs. In addition, we investigated whether age, dose of zinc, duration of the supplementation, and type of supplement (zinc only vs. zinc with other micronutrients) were variables that modified the association. 2.7. Statistical Analyses As we wanted to estimate the dose-response relation between zinc intake and serum/plasma zinc, the data presented in the studies had to be transformed to a common statistic, namely a regression coefficient ( 󰆹) and the standard error (SE ( 󰆹)) of this regression coefficient. The transformations used to derive this common single-study estimate from the available summary statistics per study have been described elsewhere [41]. In short, we estimated an intake-status regression coefficient ( 󰆹) for each individual study, based on the assumption of a linear relation on the log e –log e -scale (natural logarithm of intake vs. natural logarithm of status). This shape of this linear relationship on the log e –log e -scale corresponds to a monotonic concave function on the original scale for β < 1. This shape is assumed to be realistic for the biological relationship between zinc intake and plasma/serum zinc concentrations. As the true dose-response curve is unknown, this approximation provides a practical methodology to estimate the dose-response relationship. We calculated the overall pooled  󰆹 and SE ( 󰆹) using random effects meta-analysis, which estimates the between-study variance using the method of DerSimonian and Laird and used this estimate to modify the weights used to calculate the summary estimate. Residual heterogeneity between studies was evaluated using the I 2 statistic. Pre-specified potential factors that could modify the association were explored using stratified random effects meta-analyses. The statistical transformations to obtain  󰆹’s and SE ( 󰆹)’s were performed using GenStat version 13-SP2 (VSN International Ltd. [42]) and the meta-analysis was performed using STATA version 11.0 (College Station, TX, USA), with statistical significance defined as p < 0.05. Nutrients 2012, 4 849 2.8. Assessment of Risk of Bias in Included Studies In order to assess the quality of the included studies and the risk of bias, indicators of internal validity were collected during data extraction (Table 2). Based on the indicators two independent reviewers assessed the overall risk of bias and disagreements resolved by discussion. The criteria for judging these indicators were adapted from the Cochrane Handbook for Systematic Reviews [43]. 3. Results Twenty-four estimates of zinc intake and serum/plasma zinc status in 18 RCTs with children were eligible for meta-analysis. All studies were RCTs published between 1975 and 2009 which reported zinc intake and plasma/serum zinc concentrations. The 24 estimates included 1722 participants in total with sample sizes ranging from 10 to 122. The median duration of the trials was 24 weeks (range 6–52 weeks). In 11 studies zinc was supplemented alone at doses ranging from 3 to 70 mg/day and in 7 studies participants also received other micronutrients. Zinc was provided with iron supplements [23] or iron fortified milk [36], as part of a fortified meal [24,35], and with other micronutrients [27,31,37]. The zinc dose ranged from 10 to 20 mg/day when combined with other vitamin/minerals and 2.57 to 9 mg/day when provided in fortified meals. Most studies (n = 7) provided the zinc supplements in the form of zinc sulphate, but others used zinc citrate [32], zinc gluconate [33], zinc carbonate [23], zinc methionine [29,34], amino acid chelate [27], and elemental zinc in a syrup [28,40]. Studies were conducted in Latin America (n = 9), North America (n = 4), Asia (n = 3), Africa (n = 1) and Europe (n = 1). Habitual zinc intakes ranged from 4.6 to 7.1 mg/day (where data was provided) and ages of children ranged from 2 to 17 years. Most studies included, but did not differentiate between, males and females, but one study provided separate male and female data [24], one included only females [32], and one only males [39]. The majority of studies (n = 13) reported that zinc supplementation significantly increased zinc plasma/serum status or significantly reduced the decline in zinc serum values compared to placebo. Of these, two studies also reported increased plasma/serum zinc concentrations in the placebo group. Five studies failed to find a significant relationship between zinc supplementation and zinc status [23,25,26,30,35], four of which provided zinc supplements or fortified meals with a zinc concentration of 10 mg/day or less. Our meta-analysis of available studies suggested that zinc supplementation was associated with increased serum/plasma zinc concentrations. Combining the 18 RCTs in one meta-analysis yielded an overall pooled β-coefficient of 0.12 (95% CI 0.04, 0.20; p < 0.005; I 2 97.6%) (Figure 2). Since we applied a base-e logarithmic transformation on the zinc intake and serum/plasma zinc concentration before calculation of the study-specific  󰆹’s, the overall  󰆹 represents the difference in the log e transformed predicted value of serum/plasma zinc status for each one-unit difference in the log e transformed value in zinc intake. Therefore, an overall  󰆹 of 0.12 means that for every doubling in zinc intake, the difference in zinc serum or plasma concentration is 2  (2 0.12 = 1.09), which is 9%. This means that a person with a zinc intake of 14 mg/day has a zinc serum/plasma concentration that is 9% higher than a person who has a zinc intake of 7 mg/day. Nutrients 2012, 4 856 20. Matthys, C.; van ’t Veer, P.; de Groot, L.; Hooper, L.; Cavelaars, A.E.J.M.; Collings, R.; Donutske-Rutten, R.; Harvey, L.J.; Casgrain, A.; Rollin, F.; et al. EURRECA’s approach for estimating micronutrient requirements. Int. J. Vitam. Nutr. Res. 2011, 81, 256–263. 21. EURRECA Home Page. Available online: http://www.eurreca.org (accessed on 18 July 2012). 22. MEDLINE Home Page. Available online: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ (accessed on 10 February 2010). 23. Mahloudji, M.; Reinhold, J.G.; Haghshenass, M.; Ronaghy, H.A.; Fox, M.R.; Halsted, J.A. Combined zinc and iron compared with iron supplementation of diets of 6to 12-year old village schoolchildren in southern Iran. Am. J. Clin. Nutr. 1975, 28, 721–725. 24. Hambidge, K.M.; Chavez, M.N.; Brown, R.M.; Walravens, P.A. Zinc nutritional status of young middle-income children and effects of consuming zinc-fortified breakfast cereals. Am. J. Clin. Nutr. 1979, 32, 2532–2539. 25. Walravens, P.A.; Krebs, N.F.; Hambidge, K.M. Linear growth of low income preschool children receiving a zinc supplement. Am. J. Clin. Nutr. 1983, 38, 195–201. 26. Gibson, R.S.; Smit Vanderkooy, P.D.; MacDonald, A.C.; Goldman, A.; Ryan, B.A.; Berry, M. 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A 1 systematic review and dose-response meta-analysis by the EURRECA Network 2 Nicola M Lowe1*, Marisol Warthon Medina1, Anna-Louise Stammers1, Sujata Patel1, Olga W Souverein2, Carla Dullemeijer2, Lluis Serra-Majem3, Mariela Nissensohn3,Victoria Hall Moran4 1 International Institute of Nutritional Sciences and Food Safety Studies, University of Central Lancashire, Preston PR1 2HE, UK ([email protected]; [email protected]; [email protected]; [email protected]) 2 Division of Human Nutrition, Wageningen University, P.O. Box 8129, 6700 EV, Wageningen, the Netherlands ( [email protected]; [email protected]) 3 Department of Clinical Sciences, University of Las Palmas de Gran Canaria, Spain 3 ([email protected]gc.es; [email protected]) 4 4 Maternal & Infant Nutrition & Nurture Unit, University of Central Lancashire, Preston PR1 2HE, UK. ([email protected]) Short title: Zinc intake and plasma zinc concentration 5 *Corresponding Author: 6 Nicola Lowe, Reader in Nutritional Science. International Institute of Nutritional Sciences 7 and Applied Food Safety Studies, Darwin Building, University of Central Lancashire, Preston 8 PR1 2HE, UK 9 phone: 01772 893599 10 fax 01772 892925 11 12 Key words 13 EURRECA, zinc, dose-response, systematic review, meta-analysis. 14 15 16 17 2 18 19 Abstract 20 Dietary zinc recommendations vary widely across Europe due to the heterogeneity of 21 approaches used by expert panels. Under the EURRECA consortium a protocol was designed 22 to systematically review and undertake meta-analyses of research data to create a database 23 that includes “best practice” guidelines which can be used as a resource by future panels 24 when setting micronutrient recommendations. As part of this process, the objective of the 25 present study was to undertake a systematic review and meta-analysis of previously published 26 data describing the relationship between zinc intake and status in adults. Searches were 27 performed of literature published up to February 2010 using MEDLINE, Embase, and 28 Cochrane Library. Data extracted included population characteristics, dose of zinc, duration 29 of study, dietary intake of zinc, and mean concentration of zinc in plasma or serum at the end 30 of the intervention period. An intake-status regression coefficient ( ) was estimated for each 31 individual study, and pooled meta-analysis undertaken. The overall pooled for zinc 32 supplementation on serum/plasma zinc concentrations from RCTs and observational studies 33 was 0.08 (95% CI 0.05, 0.11; p<0.0001; I2 84.5%). An overall of 0.08 means that for every 34 doubling in zinc intake, the difference in zinc serum or plasma concentration is (20.08 = 35 1.06), which is 6%. Whether the dose-response relationship, as provided in this paper, could 36 be used as either qualitative or quantitative evidence to substantiate the daily zinc intake dose 37 necessary to achieve normal or optimal levels of biomarkers for zinc status, remains a matter 38 of discussion. 39 40 41 42 43 44 45 3 46 Introduction 47 Dietary zinc recommendations vary widely across Europe due to the heterogeneity of 48 approaches used by expert panels (1). There is a need for a harmonised approach that is 49 transparent and based on the best quality data and methods available. Traditionally, the 50 factorial approach is used in the determination of zinc requirements. This method seeks to 51 estimate the zinc intake required to meet physiological requirements for growth, metabolism 52 and tissue repair while replacing obligatory losses. An alternative approach is to examine the 53 dose-response relationship between intake and biomarkers of status and also between intake 54 and health outcomes. This information could then be integrated using a mathematical model 55 to provide an insight into the level of zinc intake required for optimal health based on a range 56 of parameters and indices of health that are known to be dependent upon dietary zinc intake 57 (2). To this end, the members of the European Micronutrient Recommendations Aligned 58 (EURRECA) Network of Excellence have undertaken a series of systematic reviews of zinc-59 intake-status relationships, according to rigorous protocols defined by consortium members 60 and external experts (2) . This paper presents the results of the systematic review and meta-61 analysis of the dose response relationship between dietary zinc intake and zinc status using 62 novel methodology developed by members the EURRECA consortium. 63 The assessment of zinc status is notoriously problematic for zinc, as a sensitive, 64 specific biomarker for zinc has not yet been identified (3). A systematic review and meta-65 analysis of biomarkers of zinc status was undertaken in 2009 (4). For many putative 66 biomarkers (such as the zinc concentrations found in the cellular components of whole blood) 67 there were insufficient data to arrive at a definitive conclusion regarding their efficacy as a 68 biomarker of zinc status, however plasma (or serum) zinc concentration was responsive to 69 both zinc supplementation and zinc depletion and is the most widely reported biomarker for 70 zinc. Hair and urine zinc concentrations were also considered to be potentially useful 71 biomarkers in response to zinc supplementation. 72 The purpose of this study was to systematically and quantitatively assess the dose 73 response relationships relevant to deriving zinc recommendations based on intervention 74 studies, cohort (nested case control) studies and cross-sectional studies. The specific 75 questions to be addressed were; what is the effect of intake on indicators of exposure or body 76 stores (i.e. biomarkers)? What factors affect this relationship? 77 4 The data used in this meta-analysis were extracted from published studies (RCTs, 78 prospective cohort studies, nested case-control studies and cross-sectional), performed in 79 healthy adult and elderly populations, reporting the relationship between zinc status (plasma 80 or serum zinc, hair or urine zinc concentration) and intake from supplements, fortified diets 81 or natural food diets. 82 83 Methods 84 Search strategy 85 This research was conducted within the framework of the European Micronutrient 86 Recommendations Aligned (EURRECA) Network of Excellence that aims to identify the 87 micronutrient requirements for optimal health in European populations (www.eurreca.org). 88 This research was part of a wider review process to identify studies assessing the effect of 89 zinc intake on different outcomes (biomarkers of zinc status and health outcomes). The wider 90 searches were performed of literature published up to and including February 2010 using 91 Ovid MEDLINE, Embase (Ovid), and the Cochrane Library (CENTRAL) using search terms 92 for (‘study designs in humans’) AND (zinc) AND (intake OR status). Both indexing and text 93 terms were used and languages included were restricted to those spoken in the EURRECA 94 Network (English, Dutch, French, German, Hungarian, Italian, Norwegian, Polish, Spanish, 95 Greek, and Serbian.). The full Ovid MEDLINE search strategy can be found in Table 1. 96 Reference lists of retrieved articles and published literature reviews were also checked for 97 relevant studies. Authors were contacted to request missing data or clarify methods or results. 98 The search process is illustrated in Figure 1. 99 100 Criteria for the consideration of studies for this review 101 Included studies were RCTs, prospective cohort studies, nested case-control studies and 102 cross-sectional studies in healthy human populations that supplied zinc supplementation 103 (RCTs) or measured dietary zinc intake with either a validated food frequency questionnaire, 104 a dietary history method, a 24-hour recall method for at least 3 days, or a food record/diary 105 for at least 3 days (observational studies). Studies had to be conducted in apparently healthy 106 adult and elderly (human) populations aged ≥18 years and supplied zinc supplementation 107 either as capsules or part of a fortified meal. If supplemental zinc was provided as a 108 component of a fortified meal, studies were only considered acceptable if zinc was the only 109 5 constituent that was different between treatment groups. Biomarkers of zinc status included 110 plasma/serum, urine and hair zinc concentrations. Only studies that reported sufficient data or 111 had sufficient data obtainable from the authors to estimate and SE( ) for the assumed linear 112 relation on the loge-loge scale were included. Studies were excluded if they were a group 113 RCT (community trial), or were commentaries, reviews, or duplicate publications from the 114 same study. Studies were excluded if adults were hospitalised, had a chronic disease or if 115 supplemental zinc was provided for less than 2 weeks. 116 117 Selection of articles 118 Of 4719 identified articles in the wider search on zinc intake, status and priority health 119 outcomes in all populations, 2557 were excluded based upon screening of the title and 120 abstract. Two independent reviewers screened 10% of the abstracts in duplicate and any 121 discrepancies were discussed before screening the remaining references. Following 122 subdivision into appropriate population groups the full texts of the 1231 manuscripts were 123 assessed to determine inclusion and exclusion by two independent reviewers and 124 disagreements rectified through discussion. 1147 studies were excluded because they did not 125 meet the inclusion criteria. Of the remaining 84 studies, 54 studies were excluded as they 126 related either zinc intake or status directly to a health endpoint, but they had not investigated 127 the relationship between zinc intake and zinc related to biomarkers. A further 17 studies were 128 excluded from the meta-analysis because study participants were not healthy, insufficient data 129 was reported, data was duplicated, or the dosage and duration was unclear. For the purpose of 130 this meta-analysis, 10 RCTs and 3 observational studies remained. The characteristics of the 131 included studies are presented in Table 2 and Table 3 respectively. 132 133 Data extraction 134 For each of the identified manuscripts, data was extracted independently by two reviewers 135 into a standardized database. Extracted data included population characteristics, dose of zinc 136 in intervention and placebo supplements, duration of the study, dietary intake of zinc, and 137 mean concentration of zinc in plasma or serum at the end of the intervention period. 138 Serum/plasma zinc concentrations were converted to µmol/L when applicable. 139 140 Data synthesis 141 12 Communities, specific Research, Technology and Development (RTD) Programme Quality 341 of Life and Management of Living Resources, within the Sixth Framework Programme, 342 contract no. 036196. This report does not necessarily reflect the Commission’s views or its 343 future policy in this area. There are no conflicts of interest for any of the authors of the 344 present study. NL, MWM, S-LS, VM , MN collected and analysed the data, SP and LSM 345 were also involved in the data analysis. OS and CD developed the statistical techniques and 346 advised on their application to the present study. All authors were involved in writing the 347 manuscript. 348 The original conception of the systematic review was undertaken by the EURRECA Network 349 and coordinated by partners based at Wageningen University (WU), the Netherlands and the 350 University of East Anglia (UEA), United Kingdom. Susan Fairweather-Tait (UEA), Lisette 351 de Groot (WU), Pieter van’ t Veer (WU), Kate Ashton (UEA), Amélie Casgrain (UEA), 352 Adriënne Cavelaars (WU), Rachel Collings (UEA), Rosalie Dhonukshe-Rutten (WU), Esmée 353 Doets (WU), Linda Harvey (UEA) and Lee Hooper (UEA) designed and developed the 354 review protocol and search strategy. 355 The authors would also like to thank Joseph Saavedra, Nick Kenworthy, Sarah Richardson-356 Owen, Hannah Eichmann and Christine Cockburn for assistance with data extraction and 357 Fiona Dykes for helpful discussions. 358 359 360 References 361 1. Doets EL, de Wit LS, Dhonukshe-Rutten RAM et al. (2008) Current micronutrient 362 recommendations in Europe: towards understanding their differences and similarities. 363 European Journal of Nutrition 47, 17-40. 364 2. Matthys C vTVP, de Groot L, Hooper L, Cavelaars AE, Collings R, Donutske-Rutten R, 365 Harvey LJ, Casgrain A, Rollin F, Contor L. (2011) EURRECA’s Approach for Estimating 366 Micronutrient Requirements. Int J Vitam Nutr Res. 81, 256-263. 367 3. King JC (2011) Zinc: an essential but elusive nutrient. Am J Clin Nutr 94, 679S-684S. 368 4. Lowe NM, Fekete K & Decsi T (2009) Methods of assessment of zinc status in humans: a 369 systematic review. American Journal of Clinical Nutrition 89, 2040S-2051S. 370 13 5. Abdulla M & Svensson S (1979) Effect of oral zinc intake on delta-aminolaevulinic acid 371 dehydratase in red blood cells. Scandinavian Journal of Clinical & Laboratory Investigation 372 39, 31-36. 373 6. Boukaiba N, Flament C, Acher S et al. (1993) A physiological amount of zinc 374 supplementation: Effects on nutritional, lipid, and thymic status in an elderly population. 375 American Journal of Clinical Nutrition 57, 566-572. 376 7. Bogden JD, Oleske JM, Lavenhar MA et al. (1988) Zinc and immunocompetence in 377 elderly people: effects of zinc supplementation for 3 months. 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Dullemeijer C, Souverein O, Doets E et al. (Under review) Systematic review with dose-427 response meta-analyses between vitamin B12 intake and EURRECA's prioritized biomarkers 428 of vitamin B12 including randomized controlled trials and observational studies in adults and 429 elderly. 430 26. King JC (1990) Assessment of zinc status. Journal of Nutrition 120, 1474-9. 431 27. Prasad AS, Beck FW, Bao B et al. (2007) Zinc supplementation decreases incidence of 432 infections in the elderly: effect of zinc on generation of cytokines and oxidative stress. The 433 American journal of clinical nutrition 85, 837-44 434 28. Lowe NM, Woodhouse LR & King JC (1998) A comparison of the short-term kinetics of 435 zinc metabolism in women during fasting and following a breakfast meal. British Journal of 436 Nutrition 80, 363-370. 437 15 438 439 440 441 442 443 444 445 446 447 448 449 450 451 452 453 Figure Legends 454 Figure 1 Study selection process for systematic review 455 Figure 2 Random effects meta-analyses of RCTs and observational studies evaluating the 456 pooled effect of dietary zinc on serum/plasma zinc in adults. Beta values (♦) represent the 457 regression coefficients for the linear association between loge transformed zinc intake and 458 loge transformed serum/plasma zinc status. 459 Figure 3 Serum/plasma zinc concentration (µmol/L) as a function of dietary zinc intake 460 (mg/day), estimated by random-effects meta-analyses of RCTs of adults 461 462 463 16 464 465 466 467 468 469 470 471 472 473 474 475 476 477 478 479 17 Table 1. Ovid MEDLINE search strategy. No. Search term Results 1 randomized controlled trial.pt. 280821 2 controlled clinical trial.pt. 79998 3 randomized.ab. 196604 4 placebo.ab. 117891 5 clinical trials as topic.sh. 146242 6 randomly.ab. 145491 7 trial.ab. 203467 8 randomised.ab. 38423 9 6 or 3 or 7 or 2 or 8 or 1 or 4 or 5 734511 10 (animals not (human and animals)).sh. 4482479 11 9 not 10 642665 12 (cohort* or ''case control*'' or cross-sectional* or ''cross sectional'' or case-control* or prospective or ''systematic review*'').mp. 768885 13 exp meta-analysis/ or expmulticenter study/ or follow-up studies/ or prospective studies/ or intervention studies/ or epidemiologic studies/ or case-control studies/ or exp cohort studies/ or longitudinal studies/ or cross-sectional studies/ 1013635 14 13 or 12 1203767 15 14 not 10 1154385 16 11 or 15 1599094 17 ((zinc or zn or zinc sulphate or zinc gluconate or zinc acetate or methionine or zinc isotope*) adj3 (intake* or diet* or supplement* or deplet* or status or serum or plasma or leukocyte or concentration* or expos* or fortif* or urine or hair)).ti,ab. 16681 18 Nutritional Support/ or Dietary Supplements/ or nutritional requirements/ or Breast feeding/ or exp infant food/ or bottle feeding/ or infant formula/ 63098 19 exp Nutritional Status/ or exp Deficiency Diseases/ or supplementation/ or diet supplementation/ or dietary intake/ or exp diet restriction/ or exp mineral intake/ or Diet/ or Food, Fortified/ or nutrition assessment/ or Nutritive Value/ 176014 20 (intake* or diet* or supplement* or deplet* or status or serum or plasma or leukocyte or concentration* or expos* or fortif* or urine or hair).ti,ab. 3166092 21 18 or 19 or 20 3263114 22 zinc/ 41027 23 22 and 21 20745 24 23 or 17 26943 25 24 and 16 2410 18 Table 2: Randomised controlled trials (n=10) reporting the effect of dietary zinc intake on serum/plasma zinc status in adults. First author, year, country Gender, age Treatment groups Micronutrient type Duration Status marker reported [analytic method] Abdulla, 1979 Sweden (5) Mean age 25 y. SD, age range, gender not reported Study 1 Placebo (n=5) 135.3mg/d Zn (n=7) Study 2 Placebo (n=8) 45mg/d Zn (n=7) Zinc sulphate 12 wk Plasma Zn [AAS] Bodgen, 1988 USA (6) Males and females aged 6089 y Placebo (n=36) 15 mg/d Zn (n=36) 100 mg/d Zn (n=31) Zinc acetate 3 mo Plasma Zn [AAS] Boukaïba, 1993 Males and females aged 73-106 y BMI ≤ 21 Placebo (n=21) Zinc gluconate 8 wk Serum Zn [AAS] 19 France (4) 20mg/d Zn (n=21) BMI ≥ 24 Placebo (n=23) 20mg/d Zn (n=23) Preziosi, 1998 France (12) Males and females aged 35-60 y Placebo (n=200) Multi-micronutrient supplement (20mg/d Zn) (n=201) Zinc gluconate 3 & 6 mo Serum Zn [AAS] Sullivan, 1998 USA (11) Males aged 1935 y Placebo (n=13) 50mg/d Zn (n=13) Zinc gluconate 15 d Plasma Zn [AAS] FeilletCoudray, 2005 France (8) Males aged 58-68 y Placebo (n=16) 15 mg/d Zn (n=16) 30 mg/d Zn (n=16) Zinc gluconate 6 mo Plasma Zn [ICP-MS] FeilletCoudray, 2006 France (7) Females aged 55-70 y Placebo (n=16) 15 mg/d Zn (n=16) 30 mg/d Zn (n=15) Zinc gluconate 6 mo Serum Zn [ICP-MS] 20 HiningerFavier, 2007 France, UK, Italy (9) Males and females aged 55-85 y Age 55-70y Placebo (n=63) 15mg/d Zn (n=60) 30mg/d Zn (n=65) Age >70 y Placebo (n=67) 15 mg/d Zn (n=66) 30 mg/d Zn (n=66) Zinc gluconate 6 mo Serum Zn [AAS] Prasad, 2007 USA (21) Males and females aged 55-87 y Placebo (n=25) 45 mg/d Zn (n=24) Zinc gluconate 12 mo Plasma Zn [AAS] Sakagami, 2009 Japan (10) Males and females aged 21-77 y Placebo (n=28) 17 mg/d Zn (n=27) 34 mg/d Zn (n=26) 68 mg/d Zn (n=28) Zinc carnosine 12 wk Serum Zn [AAS] 21 AAS atomic absorption spectroscopy; ICP-MS inductively coupled plasma mass spectrometry Table 3: Observational studies (n=3) reporting the association between dietary zinc intake and serum/plasma zinc status in adults. First author, year, country N Mean (SD) zinc intake (mg/day) Mean (SD) plasma/serum zinc (µmol/L) Zinc intake (source) Zinc intake (assessment) Zinc status biomarker [analytical method] Gibson 2001 (New Zealand) (17) 330 females aged 18-40 y 10.44 (3.51) 12.00 (1.36) Diet FFQ & 24 hr recall Serum zinc [AAS] Chandyo, 2009 (Nepal) (16) 500 females aged 13-35 y 8.6 (3.3) 8.5 (2.4) Diet FFQ & 24 hr recall (2 days) Plasma zinc [ICPAES] Sánchez 2009 (Spain) (13) 170 males aged 12.24 (7.16) 17.48 (6.68) Diet 24 hr recall (2 Plasma zinc [AAS] EURRECA – Estimating zinc requirements for deriving dietary reference values Enviado a: Critical Reviews in Food Science and Nutrition Junio 2012 1 EURRECA – Estimating zinc requirements for deriving dietary reference values Authors: Nicola M Lowe1, Fiona C Dykes2, Anna-Louise Skinner1, Sujata Patel1, Marisol Warthon-Medina1, Tamás Decsi3, Katalin Fekete3, Olga W. Souverein4, Carla Dullemeijer4, Adriënne E. Cavelaars4, Lluis Serra-Majem5, Mariela Nissensohn5, Silvia Bel6, Luis A. Moreno6, Maria Hermoso7, Christiane Vollhardt7, Cristiana Berti8, Irene Cetin8, Mirjana Gurinovic9, Romana Novakovic9, Linda J. Harvey10, Rachel Collings10 Victoria HallMoran2. 1International Institute of Nutrition and Applied Food Safety Studies, University of Central Lancashire, Preston, UK 2Maternal & Infant Nutrition & Nurture Unit, University of Central Lancashire, Preston, UK 3 Department of Paediatrics, University of Pécs, Hungary 4 Division of Human Nutrition, Wageningen University, The Netherlands. 5 Department of Clinical Sciences, University of Las Palmas de Gran Canaria, Spain. 6Escuela Universitaria de Ciencias de la Salud, Universidad de Zaragoza C/Domingo Miral s/n,50009 Zaragoza, Spain. 7Ludwig-Maximilians-University of Munich, Dr. von Hauner Childrens Hospital, Div. Metabolic Diseases and Nutritional Medicine, Lindwurmstr. 4, D-80337, Munich, Germany. 8Department of Obstetrics and Gynecology, Ospedale San Paolo, Milan, Italy. 9Centre of Research Excellence in Nutrition and Metabolism, Institute for Medical Research, University of Belgrade, Serbia, Tadeusa Koscuska 1, PO BOX 102, 11000 Belgrade, Serbia 10Norwich Medical School, Norwich Research Park, University of East Anglia, Norwich, UK Corresponding author: Nicola M Lowe International Institute of Nutritional Sciences and Applied Food Safety Studies Darwin Building, Room 206 2 University of Central Lancashire Preston Lancashire PR1 2HE UNITED KINGDOM [email protected] Tel :0044 (0) 1772 893599 Fax: 0044 (0) 1772 892925 3 Abbreviations ACE Angiotensin-converting enzyme ApoE Apolipoprotein E EAR Estimated Average Requirement EURRECA European Micronutrient Recommendations Alligned DNA Deoxyribonucleic acid DRV Dietary Reference Value FFQ Food frequency questionnaire GDS Geriatric depression scale GST Glutathione S transferase HbH Haemoglobin H LBW Low birth weight MMSE Mini mental state examination PSS Perceived stress scale RA Research activity RCT Randomised controlled trials RNA Ribonucleic acid SES Socioeconomic status SNP Single nucleotide polymorphism WHO World Health Organisation 4 Abstract Zinc was selected as a priority micronutrient for EURRECA, because there is significant heterogeneity in the Dietary Reference Values (DRVs) across Europe. In addition, the prevalence of inadequate zinc intakes was thought to be high among all population groups worldwide, and the public health concern is considerable. In accordance with the EURRECA consortium principles and protocols, a series of literature reviews were undertaken in order to develop best practice guidelines for assessing dietary zinc intake and zinc status. These were incorporated into subsequent literature search strategies and protocols for studies investigating the relationships between zinc intake, status and health, as well as studies relating to the factorial approach (including bioavailability) for setting dietary recommendations. EMBASE (Ovid), Cochrane Library CENTRAL and MEDLINE (Ovid) databases were searched for studies published up to February 2010 and collated into a series of Endnote databases that are available for the use of future DRV panels. Meta-analyses of data extracted from these publications were performed where possible in order to address specific questions relating to factors affecting dietary recommendations. This review has highlighted the need for more high quality studies to address gaps in current knowledge, in particular the continued search for a reliable biomarker of zinc status and the influence of genetic polymorphisms on individual dietary requirements. In addition, there is a need to further develop models of the effect of dietary inhibitors of zinc absorption and their impact on population dietary zinc requirements. Key words: Zinc, Dietary recommendations, Zinc intake, systematic review, zinc status, zinc bioavailability, zinc requirements. 5 Introduction Zinc is well established as an essential micronutrient for human health, having numerous structural and biochemical functions at the cellular and sub-cellular level, including enzyme function, DNA and RNA metabolism, protein synthesis, gene expression, cell growth and differentiation, and cell mediated immunity. Inadequate zinc intake has profound consequences at all points of the human lifecycle from the point of conception through to old age. Zinc was selected as a priority micronutrient for EURRECA, because the prevalence of inadequate zinc intakes was thought to be high among all population groups, and the public health concern is considerable. In addition, new scientific evidence has recently become available that demonstrates a large heterogeneity among current recommendations on zinc intake across Europe (Cavelaars et al., 2010; Doets et al., 2008) (See Activity 1 in (Dhonukshe-Rutten et al., 2013). The total amount of zinc present in the adult human body ranges from 1.5 to 2.5mg, most of which is intracellular, within skeletal muscle tissue (57%), bone (29%) and other tissues including skin and organs (Jackson, 1989). The zinc located within these tissues has a relatively slow turnover rate and is not readily responsive to changes in dietary zinc intake. Kinetic studies suggest that only a small proportion of total body zinc (approximately 10%) represents the “functional pool” of zinc, which is comprised of zinc, located within the liver and other tissues, that exchanges rapidly with the plasma, and when this functional pool is depleted zinc deficiency ensues (King, 1990). Zinc deficiency in adults can lead to dermatitis, hair loss, diarrhoea, loss of appetite, reproductive failure, hypogeusia, loss of cognitive function, susceptibility to infections and depressed immune function (Shankar and Prasad, 1998), delayed wound healing and depression (Andrews and Gallagher-Allred, 1999). Zinc deficiency has also been associated with three major health diseases prevalent in Europe: Diabetes, cancer and coronary heart disease (Singh et al., 1998). Zinc deficiency may be a 6 serious public health problem that compromises the development of millions of children (Sandstead and Smith, 1996). The recent Lancet series on maternal and child under nutrition concluded that zinc deficiency is responsible for about 4% of child mortality and disabilityadjusted life-years (Black et al., 2008). The consequences and manifestations of severe zinc deficiency in infants and children and adolescents can be retardation of linear growth and development, poor appetite, delayed sexual maturation and hypogonadism, frequent infections (Maret and Sandstead, 2008), alopecia, dermatitis, delayed wound healing, diarrhoea, pneumonia, malaria (Fischer Walker et al., 2009), limitation on the senses of taste and smell, night blindness (Christian et al., 2001; Seiler et al., 2002). Zn deficiency may be associated with deficits in activity, attention, and motor development (Bhatnagar and Taneja, 2001). Results of several studies indicated that supplementation with zinc can significantly reduce the rates of diarrhoea and pneumonia in young children and increase the growth rate of stunted children (Brooks et al., 2005a; Brooks et al., 2005b; Brown et al., 2002). During the acute diarrhoea, zinc supplementation reduces the duration and severity of the disease, so that now the WHO recommends zinc supplementation as an adjunct to rehydration therapy, to replace the excessive losses of zinc during periods of diarrhoea (WHO). The involvement of maternal zinc status in pregnancy outcome is still unclear, animal models have shown that severe maternal zinc deficiency results in impaired implantation, abortions and foetal malformations (Keen et al., 2003). The consideration that zinc deficiency is a teratogenic risk in humans may be supported by the correlation of low plasma zinc concentrations in the first and third trimesters of pregnancy with an increased risk for malformations and low birth weight (LBW), respectively. Zinc deficiency is thought to influence embryonic and foetal development through reduced cell proliferation, or reduced protein synthesis or reductions in rates of tubulin polymerization rather than increased rates of cellular oxidative damage or increased rates of apoptosis and reduced binding of hormones and transcription factors 7 dependent on zinc-finger regions (Jankowski-Hennig et al., 2000; Mackenzie et al., 2002; WHO). Current dietary recommendations Dietary recommendations for zinc intake have been mainly based on balance studies focusing on the prevention of deficiency and use the factorial approach which assumes that the zinc requirement is the lowest intake which replaces obligatory zinc endogenous loss. The method computes the dietary zinc requirement by dividing the endogenous zinc loss by the fractional zinc absorption (King, 1986). In Europe and in other non-European countries, zinc recommendations for infants are generally set either based on zinc concentration of breast milk, using a factorial approach or extrapolating values from those given for adults. There is significant heterogeneity among current recommendations on zinc intake across Europe and worldwide (Doets et al., 2008). Table 1 illustrates the range of dietary zinc recommendations for various countries worldwide. This heterogeneity is due to a number of factors including the data used to derive the value, and differences in expert opinion between panels convened to review the data. Current European intakes As part of the EURRECA programme of work, Roman-Vinas et al undertook an analysis of population dietary surveys from across Europe in order to determine the prevalence of inadequate nutrient intake in Europe using the Nordic Nutritional Recommendations as the standard (Roman-Vinas et al., 2010). This study revealed that the failure to meet the EAR (estimated average requirement) of 6.4mg/day or 5.7mg/d for adult males and female respectively was greatest in Ireland with dietary zinc intakes falling below this cut off value 14 zinc absorption. Twenty four estimates from seventeen studies that investigated the effect of dietary phytate level on zinc absorption were combined in a random effects meta-analysis. A forest plot showing the overall effect size of high versus low dietary phytate intake on zinc absorption is shown in Figure 2. The mean difference in fractional zinc absorption between low and high phytate diets was 0.11 (95% CI: 0.07, 0.16) however there was a high degree of between study heterogeneity (I2 94% , P<0.0001). Further analysis of this data set is underway to examine the factors that contribute to this heterogeneity and the overall effect of phytate:zinc molar ratio on zinc absorption. The influence of gene polymorphisms zinc metabolism The primary aim of this activity was to generate a database containing relevant information related to the impact of functional gene polymorphisms on zinc metabolism. Specifically, this involved identifying data assessing the impact of functional polymorphisms (e.g. single nucleotide polymorphisms, or SNPs) on micronutrient status biomarkers and associated health outcomes. The research questions used to develop the search protocol were: How do genetic polymorphisms affect zinc status? Are there any interactions between functional polymorphisms which affect zinc status and various health outcomes? Information was collated from studies of individuals who are either homozygous, heterozygous or wild type for specific polymorphisms. Where data exists for zinc status, functional polymorphisms and linked health outcome, this information was also recorded. Data were collated from all population groups including infants, children, adolescents and adults including the elderly into a database that is available at www.eurreca.org. Of the 167 papers identified by the systematic search of the literature databases, 12 papers met the inclusion criteria and reported statistically significant results for altered zinc biomarker status in groups of people with differing gene variants. The gene interleukin 6 15 which regulates the amount of circulating proteins involved in inflammatory responses associated with hyperglycaemia and non-insulin dependent diabetes mellitus and coronary artery disease is thought to be influenced by zinc status (Giacconi et al., 2006; Giacconi et al., 2005). Two papers reported a relationship between SNP’s of the Interleukin 6 gene and plasma zinc concentration and health outcomes, including perceived stress scale (PSS), geriatric depression scale (GDS) and mini mental state examination (MMSE) (Mariani et al., 2008; Mocchegiani et al., 2008).. Another gene angiotensin-converting enzyme (ACE) was also reported. An impaired zinc status can alter enzyme activity, with adverse effects on angiotensinconversion from I to II affecting vasoconstriction and hypertension and subjects with the DD genotype polymorphism in the ACE gene have been shown to have the highest enzyme activity increasing the risk of hypertension (Tamura et al., 1996). Tamura et al found a significant correlation between plasma zinc concentration and ACE activity in pregnant women at 33 weeks of gestation. However as this was the only significant correlation found in this study, it was stated that the significant result may have occurred by chance. The metallothionine gene has been included in the zinc database. Some polymorphisms of the metallothionein gene have been correlated to chronic inflammation and may affect zinc release (Mocchegiani et al., 2006; Richards et al., 2002). Another gene reported in the zinc database was apolipoprotein E (ApoE). Gonzalez et al (1999), reported that serum zinc concentrations in epsilon 4 ApoE carriers were significantly higher in patients with Alzheimer’s disease than in healthy control patients. The TP53 mutation in exon 5 through to 8, found in esophageal squamous cell carcinoma tumours was reported in a paper by Dar et al (2008). There is a notion that an imbalance of copper and zinc levels may lead to a higher prevalence of TP53 tumour mutations. Dar et al 16 found that cancer patients with the TP53 tumour mutation had lower plasma zinc levels than those with no mutation. The glutathione S transferase (GST) gene was reported by 3 papers (Jin et al., 2011; Reszka et al., 2007; Reszka et al., 2005). The detoxifying enzyme GST metabolises tobacco smoke derived compounds; zinc deficiency therefore can increase the risk of mutations occurring and can decrease the activity of the antioxidant GST enzyme increasing the risk of some cancers including lung cancer. Some polymorphisms in the GST gene may be associated with an elevated risk of lung cancer and therefore the effect of zinc status on each variant allele needs to be investigated. The gene CYP1A1 was also investigated by Jin et al (2011). The CYP1A1 gene has a polymorphism at exon 7 where a new Mspl restriction site is introduced. The CYP1A1 gene is thought to influence metabolic activation and detoxification of some toxins and therefore can increase susceptibility to increasing risk of lung cancer. Jin et al reported that the risk of lung cancer decreased with a zinc level >1200ng/ml for both CYP1A1 variants and CYP1A1 carriers suggesting that a higher concentration of serum zinc may protect against lung cancer. Haemoglobin H disease (HbH) was also included in the database and was thought to influence zinc status. Zinc deficiency is thought to be involved with impaired growth and hypogonadism traits observed in patients with polymorphic diseases such as the thalassemic diseases (Ajayi, 1997; Kajanachumpol et al., 1997) and cystic fibrosis (Van Biervliet et al., 2007). The final gene reported as having a significant association with blood biomarker zinc status is SLC30A4 gene with a polymorphism on exon 5 915 T-C. The SLC30A4 gene encodes one of the zinc transport proteins and therefore it is thought that a polymorphism in this gene may 17 affect zinc absorption and foetal development. Akar et al (2006) studied this gene and zinc status association and found that three hours after a zinc tolerance test there was a significant difference in plasma zinc level for TT and CC carriers, indicating a functional property of this polymorphism. Table 5. Results of the systematic search for studies of the effect of gene polymorphisms on zinc metabolism. Intakestatus-health relationships EURRECA is developing a method for the quantitative integration of evidence for deriving nutrient intake recommendations using bivariate dose-response relationships for intake-health (I-H) as well as intake-status (I-S) and status-health (S-H) relationships. These data will be combined in a new integrated trivariate intake-status-health (I-S-H) dose-response model with data from classical nutrition studies and bioavailability factors (See Activity 6 in (Dhonukshe-Rutten et al., 2013). Search protocols were therefore designed to answer the following questions: What is the effect of zinc intake on functional or clinical outcomes (intake-health) and what factors affect this relationship? What is the effect of zinc intake on indicators of exposure or body stores/biomarkers (intake-status) and what factors affect this relationship? What is the effect of indicators of exposure or body stores (i.e. biomarkers) on functional or clinical outcome (status-health) and what factors affect this relationship? The result of the systematic search for studies addressing zinc intake status health relationships yielded over 1000 articles that were obtained in full text for eligibility evaluation. Due to the heterogeneity of the methodological approaches and outcome measures used in these studies, it is unlikely that meta-analysis of the data will be possible. 18 Intakestatus relationships Sufficient high quality RCT studies were identified to enable a meta-analysis of data describing the relationship between plasma zinc intake and plasma zinc concentration in each of the population categories. Units of measurement were converted to a standard form to facilitate comparison across studies. Intake-status regression coefficients ( ) were estimated for each individual study as described in detail elsewhere (Souverein et al., 2012). An overall pooled and SE( ) was calculated using random effects meta-analysis The statistical transformations to obtain s and SE( )’s were performed using GenStat version 13-SP2 (VSN International Ltd., http://www.vsni.co.uk/) and the meta-analysis was performed using STATA version 11.0 (College Station, TX), with statistical significance defined as P<0.05. For all population groups, with the exception of lactating women, the intake-status analyses revealed a positive and significant relationship between zinc intake and plasma zinc concentration, however a high degree of heterogeneity between the studies was observed (Table 4). Table 4: Results of the Meta-analysis of intake-status in all populations groups. Discussion The determination of dietary zinc recommendations has relied primarily on the factorial approach, with extrapolation to population groups for which data are limited or missing. A complementary approach involves examining the associations between dietary intake, status and health, to arrive at intakes that result in optimal status levels and are sufficient to prevent disease due to deficiency at one end of the spectrum, or toxic effects due to excess dietary 19 zinc at the other end of the spectrum. The difficulty of this approach for zinc is the lack of a reliable and sensitive marker of zinc status, and the non-specific nature of the diseases symptoms associated with sub-optimal zinc intake. However, one of the overarching aims guiding the work described in this review was to gather the best quality data using the most robust methodology to provide a database for future panels to use when setting recommendations. This included both a comprehensive review of the data available using both the classical factorial approach and a more novel intake-status-health association approach for zinc. Regarding the factorial approach, a key factor that has been highlighted in this review and in discussion with experts is the need to consider bioavailability more closely as a modifier of the amount of dietary zinc required to meet requirements (Hambidge, 2010). This review identified a broad range of dietary components that may impact on the amount of dietary zinc that is absorbed and utilised, the majority of which had a deleterious effect on zinc bioavailability (figure 1). Many of these food components require further studies to generate sufficient high quality data to enable conclusive evaluation of their effect at different levels of intake, however the most widely studied modifier of zinc absorption is dietary phytate. This systematic review and meta-analysis confirms that phytate is a potent modifier of zinc absorption and should be taken into consideration when using the factorial approach to setting dietary zinc recommendations for any given population. Mathematical models that combine the effects of varying levels of phytate and zinc intake on true zinc absorption are potentially valuable tools in this process. A trivariate model (zinc intake-absorption-phytate intake), published by Hambidge et al in 2010 has helped to explain much of the variability of zinc absorption from human diets (Hambidge et al., 2010). This mathematical model is based on the accepted view that zinc absorption is a carrier-mediated process, phytate inhibits absorption by binding with zinc in the gut to form an insoluble complex, and that dietary zinc 20 and phytate are the primary dietary factors determining zinc absorption. The model predicts that the quantity of zinc absorbed from 40 mg dietary zinc at zero phytate intake is 6.4 mg Zn/d and that the dietary zinc intake required to meet the requirements for zinc doubles with every 1000 mg phytate consumed in the diet per day (Hambidge et al., 2010). Another potential modifier of the amount of dietary zinc needed to meet the requirement is genotype (Hambidge, 2010). This has been shown to have profound effects on the bioavailability of some micronutrients such as folate and iron (Casgrain et al., 2010). Most ZnT and Zip families show evidence of polymorphisms, which could produce structurally different proteins and hence, transporter activity and /or specificity for zinc. Such polymorphisms could influence the amount of dietary zinc needed to meet the requirements and alter zinc metabolism (Cousins et al., 2006; Liuzzi and Cousins, 2004). The systematic search for studies on micronutrient metabolism yielded a very small number of relevant studies. This is clearly an important area for future research development. Investigation of the zinc intake-status relationships in some population groups yielded some potentially useful new data. A dose-response curve was constructed from the extracted data, where the slope was based on the pooled from the meta-analysis of the RCTs expressed on a loge-scale. Reported means and standard deviations of zinc intake and zinc status were extracted from the observational studies and was used to estimate the intercept of this curve (See Activity 6 in (Dhonukshe-Rutten et al., 2013). The dose response curves for the Adult and Elderly, and the Pregnant and Lactating women population groups are shown in Figure 3 and Figure 4 respectively. These data can be used as complementary evidence for underpinning zinc reference values, however, the limitations of serum/plasma zinc concentration as a biomarker for zinc status should be acknowledged. Serum/plasma zinc is recognised as being a relatively insensitive index of zinc nutritional status due to efficient 21 homeostatic regulation which responds to alterations in zinc intake, up-regulating absorption and conserving losses via the gastrointestinal tract and kidneys when intakes fall. In addition, whilst all studies included in the analysis were undertaken in apparently healthy individuals, factors such as stress, infection and inflammation, which are known to affect plasma zinc concentrations, may have gone unreported. Unfortunately, more sensitive indexes of zinc status have yet to be identified and plasma serum zinc remains by far the most commonly used biomarker of zinc status (Lowe et al., 2009). It is anticipated that this approach may be used to model the relationships between zinc intake or status with the health outcomes for zinc, and that these can be combined with the intake status relationships described above to form a trivariate model of intake status and health (See Activity 6 in (Dhonukshe-Rutten et al., 2013). It is unclear at the moment whether or not our systematic searches have yielded sufficient data to enable this but it is likely that further studies are required. This process has highlighted the need for more high quality studies to address gaps in current knowledge. Some of the key issues that came out of EURRECA workshops through discussion with experts external to the EURRECA Network focussed around zinc bioavailability and the need to model the effect of inhibitors of zinc absorption such as phytate, calcium and iron (Casgrain et al., 2010). Most current knowledge of zinc homeostasis is based on research in healthy adult males. In order to avoid scaling efforts should be made to obtain data on both genders at all ages, including pregnancy and lactation. In particular there is a paucity of data from studies in young children which necessitates the use of scaling to arrive at dietary recommendations, where this is the only option, there needs to be consensus regarding which growth/weight data to use. In summary, a series of systematic reviews and meta-analyses were conducted in accordance with the protocols and procedures developed by the EURRECA consortium. This process 22 has gathered together information relating to the setting dietary zinc recommendations which will be available as a valuable resource for future DRV panels. It has also generated new intake-status-health association data that may be used in combination with the classical factorial approach to model dietary zincs necessary to meet physiological requirements. This process has also highlighted the key areas for further research, in particular the urgent need for a reliable biomarker of zinc status, the further development of models of the impact of dietary factors on zinc bioavailability and the influence of genetic polymorphisms on individual dietary requirements. Acknowledgements The Authors would like to acknowledge the assistance of Joseph Saavedra, Sarah Richardson-Owen, Nick Kenworthy and Christine Cockburn with the data extraction and Lee Hooper for helpful advice. Our sincere thanks to Professor K Michael Hambidge for expert opinion and guidance throughout the EURRECA process. The preparation of this manuscript was coordinated by Rachel Collings from the University of East Anglia and the copy-editing by EUFIC. This review was carried out with partial financial support from the Commission of the European Communities, specific RTD Programme "Quality of Life and Management of Living Resources", within the 6th Framework Programme (Contract No. FP6-036196-2 EURRECA: EURopean micronutrient RECommendations Aligned). This review does not necessarily reflect the views of the Commission and in no way anticipates the future policy in this area.References 23 Adams, C. L., Hambidge, M., Raboy, V., Dorsch, J. A., Sian, L., Westcott, J. L., and Krebs, N. F. (2002). Zinc absorption from a low-phytic acid maize. Am J Clin Nutr. 76: 556559. Ajayi, G. (1997). Zinc, magnesium, and copper concentrations in serum, erythrocytes, and urine in sickle cell homozygotes and heterozygote Nigerian women. Trace Elements and Electrocytes. 14 (2): 69-71. Akar, N., Akar, E., Arac, B., Ulu, A., and Ekim, M. (2006). Does SLC30A4 (ZNT4) gene exon 5 915 T-C alteration play a role in neural tube defects? 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Flow diagram showing the results of the systematic review of studies investigating zinc bioavailablity. 87 Included Adult studies. 30 Phytate 16 Micronutrient Supplement 13 Protein 10 Zinc Supplement 7 High/Low Zinc diet 4 Usual diet 2 Formula milks 1 Maillard Browning 1 Dairy 1 Cholesterol 1 Tea 1 Oxalate 2 Pg and lactating studies 1 Fe supplement 1 Phytate (data also used for adult data) 14 Child and Adolescent studies 1 Low zinc diet 2 Protein 3 Phytate 1 Fe supplement 1 Ca supplement 3 Fe and Zn supplements 1 Fe and Zn and Folate supplements 1 Fe and Zn and vit C supplements 1 Multi supplement 17 Infant studies 1 High and low zinc formula 1 High and low calcium formula 1 High and low copper formula 2 Protein 2 Phytate 1 Fe supplement 1 Fe, ascorbic acid and NaFeEDTA supplements 1 Ascorbic acid supplement 3 Lactose 3 Formula and human milk (Pre term milks) 1 Formula and human milk (term milks) 3255 abstracts after duplicates removed 3255 of abstracts screened 294 of full-text articles assessed for eligibility 175 of full-text studies excluded. Not bioavailability 37 Review 55 Non food 10 No full text 5 No control group 47 Group Randomised 3 Book 2 Unhealthy participant 8 Non human 2 Companion paper 3 In vitro 2 Language 1 3321 abstracts identified though electronic searching of Medline, Embase and Cochrane libraries. 1 additional abstract identified through expert searches and review articles. 2263 Excluded 634 Identified as studies reporting iron bioavailability 64 Identified as studies reporting selenium bioavailability For meta analysis: 17 36 Figure 2 . Forest plot of high and low phytate meals and zinc absorption as % of the diet. 37 Figure 3. Serum/plasma zinc concentration (µmol/L) as a function of dietary zinc intake (mg/day), estimated by random-effects meta-analyses of RCTs. In figure 3a the data are presented on natural log scale, where Y=0.11*x+2.28. a b. 38 Figure 4 Serum/plasma zinc concentration (µmol/L) as a function of dietary zinc intake (mg/day), estimated by random-effects meta-analyses of RCTs of pregnant (solid line) and lactating (dashed line) women. In figure 4a the data are presented on natural log scale. 4a 4b. 39 Table 1. - Selected recommended intake levels for zinc (mg) DATA SOURCE Gender Special conditions POPULATION GROUP Infants Children Adolescents Adults Elderly Lactation Pregnancy WHO / FAO Male High bioavailability 0-6m 1.1 7-12m 0.8 1-3y 2.4 4-6y 2.9 7-9y 3.3 10-18y 5.1 19-65y 4.2 >65y 4.2 - - Female Low bioavailability 0-6m 6.6 7-12m 8.4 1-3y 8.3 4-6y 9.6 7-9y 11.2 10-18y 14.4 19-50y 9.8 >65y 9.8 0-3m 19 < 3m. 11 Nordic (Norway) Male - <6m NULL 6-11m 5 2-5y 6 6-9y 7 10-13y 11 14-17y 12 18-30y 9 31-60y 9 ≥75y 9 - - Female - <6m NULL 6-11m 5 2-5y 6 6-9y 7 10-13y 8 14-17y 9 18-30y 7 31-60y 7 ≥75y 7 - - Australia / NZ Male - 0-6m 2 7-12m 3 1-3y 3 4-8y 4 9-13y 6 14-18y 13 19-30y 14 31-50y 14 >70y 14 - - Female - 0-6m 2 7-12m 3 1-3y 3 4-8y 4 9-13y 6 14-18y 7 19-30y 8 31-50y 8 >70y 8 14-18y 11 19-50y 12 14-18y 10 19-30y 11 DACH (Germany) Male - 0-3m 1 4-11m 2 1-3y 3 4-6y 5 7-9y 7 10-12y 7 13-14y 9.5 15-18y 10 19-64y 10 ≥65y 10 - - Female - 0-3m 1 4-11m 2 1-3y 3 4-6y 5 7-9y 7 10-12y 7 13-14y 7 15-18y 7 19-64y 7 ≥65y 7 10 >4m 10 EC Male - 6-11m 4 1-3y 4 4-6y 6 7-10y 7 11-14y 9 15-17y 9 ≥18y 9.5 ≥18y 9.5 - - Female - 6-11m 4 1-3y 4 4-6y 6 7-10y 7 11-14y 9 15-17y 7 ≥18y 7 ≥18y 7 12 7 IOM (US/ Canada) Male - 0-6m 2 7-12m 3 1-3y 3 4-8y 5 9-13y 8 14-18y 11 19-70y 11 >70y 11 - - Female - 0-6m 2 7-12m 3 1-3y 3 4-8y 5 9-13y 8 14-18y 9 19-70y 8 >70y 8 14-18y 12 19-30y 12 19-30y 11 31-50y 11 United Kingdom Male - 0-3m 4 4-6m 4 1-3y 5 4-6y 6.5 7-10y 11-14y 9 19-50y 9.5 >50y 9.5 - - Female - 0-3m 4 4-6m 4 1-3y 5 4-6y 6.5 7-10y 7 14-18y 9 19-50y 7 >50y 7 NULL NULL Data presented in the Table was obtained from online EURRECA web resource NutriRecQuest: http://www.serbianfood.info/eurreca/ (Cavelaars et al., 2010) from original