Estimación de parámetros genéticos en corvina, Argysomus regius, para caracteres de rendimiento y calidad de la carne y del pez.

GD DE '-'15 PAlMAS DE GRAN CANARIA lm~¡t1.l[(IUn¡l'enitario Sanid~'d Anim.d 5.<;:guridold Ahmcntiln<l Anexo I Da MARíA SaRA YA DÉNIZ SUÁREZ, SECRETARIA DEL INSTITUTO UNIVERSITARIO DE SANIDAD ANIMAL Y SEGURIDAD ALlMENTARIA DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA. CERTIFICA Que el Consejo de Doctores del Departamento en su sesión de fecha 31 de mayo de 2012 tomó el acuerdo de dar el consentimiento para su tramitación, a la tesis doctoral titulada: "Estimación de parámetros genéticos en corvina, Argyrosomus regius, para caracteres de crecimiento, rendimiento y calidad de la carne y del pez", presentada por el doctorando D. Mohamed Soula y dirigida por el Dr. Juan Manuel Afonso López yDra. María Jesús Zamorano Serrano. y para que así conste, y a efectos de lo previsto en el Art? 73.2 del reglamento de Estudios de Doctorado de esta Universidad, firmo la presente en Las Palmas de Gran Canaria, a uno de junio de dos mil doce. - - ---- Anexo II UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA Departamento: Instituto Universitario de Sanidad Animal y Seguridad Alimentaria Programa de Doctorado: Acuicultura: Producción controlada de animales acuáticos Título de la Tesis: “Estimación de parámetros genéticos en corvina, Argyrosomus regius, para caracteres de crecimiento, rendimiento y calidad de la carne y del pez” Tesis Doctoral presentada por D. Mohamed Soula Dirigida por el Dr. Juan Manuel Afonso López y por la Dra. María Jesús Zamorano Serrano El Director, La Directora, El Doctorando, Juan Manuel Afonso María Jesús Zamorano Mohamed Soula López Serrano Las Palmas de Gran Canaria, 01 de junio de 2012 Juan Manuel Afonso López, Profesor Titular de Universidad del departamento de Patología Animal, Producción Animal, Bromatología y Tecnología de los Alimentos de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, INFORMA: Que Mohamed Soula, Ingeniero en Acuicultura, ha realizado bajo mi dirección y asesoramiento, el presente trabajo titulado Estimación de parámetros genéticos en corvina, Argyrosomus regius, para caracteres de crecimiento, rendimiento y calidad de la carne y del pez, el cual considero reúne las condiciones y la calidad científica para optar al grado de Doctor. En Arucas, a día de 24 de Mayo de 2012. Fdo.: Juan Manuel Afonso López María Jesús Zamorano Serrrano, Profesora Contratada Doctora de Universidad del departamento de Patología Animal, Producción Animal, Bromatología y Tecnología de los Alimentos de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, INFORMA: Que Mohamed Soula, Ingeniero en Acuicultura, ha realizado bajo mi dirección y asesoramiento, el presente trabajo titulado Estimación de parámetros genéticos en corvina, Argyrosomus regius, para caracteres de crecimiento, rendimiento y calidad de la carne y del pez, el cual considero reúne las condiciones y la calidad científica para optar al grado de Doctor. En Arucas, a día de 24 de Mayo de 2012. Fdo: María Jesús Zamorano Serrrano A mi Madre, mi Padre, mis hermanos, mi cari a la memoria de mis abuelas y a todos lo que han muerto para sentirnos libres Dedicatoria! Ante todo querré agradecer a Dios, por estar conmigo en cada momento de mi vida, por ayudarme a terminar este trabajar, gracias por darme la fuerza, la paciencia y el coraje para hacer este sueño realidad. La presente Tesis es un esfuerzo en el cual, directa o indirectamente, participaron varias personas leyendo, opinando, corrigiendo, teniéndome paciencia, dando ánimo, acompañando en los momentos de crisis y en los momentos de felicidad por ello agradezco: A mi director y mi directora de tesis por haber confiado en mi persona, por la paciencia y por la dirección de este trabajo. Gracias Juanma por haber aguantado mi carácter durante estos años, por transmitirme mucho de lo que sabes, por estar cerca cuando las cosas se complicaban y por hacerme sentir uno de la familia. Gracias María Jesús por tu apoyo, tu disposición, tus consejos siempre que lo necesité, por respaldarme en los momentos críticos, y por ajustar siempre la balanza entre el optimismo (Juanma) y el pesimismo (yo). A Rafa, por apoyarme y dirigirme en todos los análisis “de calidad”, por estar fileteando y resolviendo problemas durante los muestreos. Gracias por darme este toque de confianza cada vez que pasas al laboratorio. A mis compañeros de laboratorio, o mejor dicho a mi segunda familia. Quiero que sepan lo bastante difícil expresar mis sentimiento a todos y cada uno de vosotros. Gracias Ana, por ser como es, dispuesta a ayudar, a estar cuando las cosas se ponen feas y por apoyarme durante cada una de las tareas. Gracias Davi, por darme este punto de alegría que me faltaba casi siempre, por la ayuda y el apoyo que me has transmito, claro a tu manera. Gracias Laura, por poner el laboratorio pata arriba cuando estás y por Agradecimientos ! ! transmitir a este grupo la energía y la alegría que necesita y ahora más con nuestra nueva alegría Iria. Gracias Manola, por ayudarme y apoyarme durante toda la parte del laboratorio, por tu forma de hacer que todo vaya más ordenado y con pautas, sin tu ayuda seguramente que esta tesis habría durado más. Gracias, Silvia H., Ivon, Guaci, Sara, Fefi, Mónica, Tibi, Juan, Fran, Fátima, Bruno, Moneiba por vuestra ayuda durante los muestreos y cada vez que os he necesitado. A Eyed, Rachid, Aymen, Khouloud, Fatima, Islam, Reda y a toda la comunidad Arabic que ha pasado por este grupo y que he tenido la oportunidad de conocer. Gracias a todos por hacer más fácil vivir lejos de nuestras familias y nuestra cultura. A Imed, Hatem, Kamilia, Wala y Imen por ser mis amigos, por apoyarme misma si las distancias nos separa. Espero que esta amistad dure muchísimo más hasta que nos encontraremos otra vez en nuestra tierra querida. A Alex y Silvia por su amistad, por su apoyo, por ser parte de mi familia aquí, por aguantarme durante mis periodos de crisis y por ser tan amables conmigo desde el primer dia que hemos compartido una clase de máster juntos. A Borja y Oscar por la amistad que nos une y por los momentos que pasamos juntos. A Samu por la ayuda que me ha aportado durante los muestreos, y a Pilu por aguantarnos en su casa durante las horas de correcciones. A todos los miembros del Grupo de Investigación en Acuicultura por aceptarme como uno de ellos. Un especial agradecimiento a los técnicos de la nave de cultivo del ICCM, a Ada, Dailos, Desiré, Emma, que me ayudaron durante el periodo de cultivo y que han mostrado siempre mucha disponibilidad. A Carmen y su pequeño grupo que me ha ayudado siempre y cuando lo pedía. A D. Javier Roo por proporcionarme los peces y por sus consejos para la cría de éstos. A todos los becarios del IUSA que en algún momento de estos 4 años hemos compartido buenos momentos. A todos los técnicos, conserjes y trabajadores del modulo 7 de la Facultad de Veterinaria, por su colaboración y disponibilidad. A todo el Grupo de Parasitología, los vecinos de al lado por dejarme usar los aparatos sin ninguna pega y por la amabilidad que transmiten. A todos los miembros del Grupo de Producción por aguantarnos y al olor del pescado durante el mes de muestreo. A todo el Grupo de Genética Forense, José Pestano, Nico, Monica, Yessi y a todos los técnicos y becarios que me facilitaron los resultados de las muestras de secuenciación y por haber sido muy amables y muy comprehensivos. A la empresa, CANEXMAR y especialmente a Rafa y su tripulación por hacernos un hueco dentro de su equipo cada vez que hemos necesitado su ayuda. A la empresa ADSA por su ayuda y por hacernos fácil nuestras tareas de trabajo. A la Agencia Española de Cooperación Internacional que ha confiado en mis posibilidades y me ha ofrecido la beca para realizar mi tesis durante estos cuatro años. También, al Proyecto ACISII-PI2007/052 y el proyecto ULPGC2010 que financiaron parte de esta tesis. Como empecé agradeciendo a mi familia, quería acabar agradeciendo a mi otra familia. A mi querida y amor Cris que me ha aguantado durante estos últimos años, que me hizo ver la vida desde un lado más alegre, que me ha animado cuando estaba de bajón y ha saltado conmigo de alegría con cada buena noticia que hemos recibido, espero que esta relación dure por toda la vida y seguiremos luchando juntos por nuestra felicidad. A Carmen, Kini, Miguel y Loles por abrirme las puertas de sus casas y para aceptarme como uno de la familia, espero no fallarles. ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! III! ÍNDICE DE TABLAS ! ! TABLA II.1. NOMBRE DE LOCUS, MOTIVO DE REPETICIÓN (M), FLUOROCROMOS (F), FORWARD Y REVERSE SECUENCIAS DE LOS CEBADORES Y REFERENCIAS DE CADA UNO DE LOS MICROSATÉLITES SELECCIONADOS INICIALMENTE. ........................................ 34! TABLA II.1. NOMBRE DE LOCUS, MOTIVO DE REPETICIÓN (M), FLUOROCROMOS (F), FORWARD Y REVERSE SECUENCIAS DE LOS CEBADORES Y REFERENCIAS DE CADA UNO DE LOS MICROSATÉLITES SELECCIONADOS INICIALMENTE (CONTINUACION). ............ 35! TABLA II.1. NOMBRE DE LOCUS, MOTIVO DE REPETICIÓN (M), FLUOROCROMOS (F), FORWARD Y REVERSE SECUENCIAS DE LOS CEBADORES Y REFERENCIAS DE CADA UNO DE LOS MICROSATÉLITES SELECCIONADOS INICIALMENTE (CONTINUACION). ............ 36! TABLA II.1. NOMBRE DE LOCUS, MOTIVO DE REPETICIÓN (M), FLUOROCROMOS (F), FORWARD Y REVERSE SECUENCIAS DE LOS CEBADORES Y REFERENCIAS DE CADA UNO DE LOS MICROSATÉLITES SELECCIONADOS INICIALMENTE (CONTINUACION). ............ 37! TABLA II.2. NOMBRE DE LOCUS, FLOROCROMOS (F), FORWAD Y REVERSE SECUENCIAS DE LOS CEBADORES, CONCENTRACIONES DE LOS CEBADORES (CP) (MM) EN LAS DOS PCR MULTIPLEX FINALES. ................................................................................................... 41! TABLA II.2. NOMBRE DE LOCUS, FLOROCROMOS (F), FORWAD Y REVERSE SECUENCIAS DE LOS CEBADORES, CONCENTRACIONES DE LOS CEBADORES (CP) (MM) EN LAS DOS PCR MULTIPLEX FINALES (CONTINUACION). ....................................................................... 42! TABLE III.1. SEQUENCE, TEMPERATURE ANNEALING (TM), ACCESSION NUMBER, EXPECTED SIZE (ES) AND FINAL CONCENTRATION (CF) IN RT REACTION SIZES OF AMPLICONS OF THE PRIMERS USED IN THIS STUDY. .............................................................................. 60! TABLE III.2. BODY WEIGHT (W), LENGTH (L) AND MORTALITY (M) IN TAGGED AND UNTAGGED FISH AT 0, 15 AND 30 DAYS FOR 2, 3 AND 4 G. EXPERIMENT IN MEAGRE. ... 62! TABLE III.3. WOUND HEALING RATE IN TAGGED MEAGRE AT 2, 3 AND 4 G. WEIGHT CLASSES. ..................................................................................................................... 63! TABLE IV.1. BODY WEIGHT. NUMBER OF ALLELES (K), ALLELE SIZE RANGE IN BP (RANGE), OBSERVED (HOBS), EXPECTED (HEXP) HETEROZYGOSITY, EXCLUSION PROBABILITY (EP) AND HARDY-WEINBERG EQUILIBRIUM TEST (HW) IN STRI AND STRS MULTIPLEX REACTIONS. ................................................................................................................. 84! ! TABLE IV.1. BODY WEIGHT. NUMBER OF ALLELES (K), ALLELE SIZE RANGE IN BP (RANGE), OBSERVED (HOBS), EXPECTED (HEXP) HETEROZYGOSITY, EXCLUSION PROBABILITY (EP) AND HARDY-WEINBERG EQUILIBRIUM TEST (HW) IN STRI AND STRS MULTIPLEX REACTIONS (CONTINUACION). .................................................................................... 85! TABLE IV.2. WEIGHT, LENGTH AND CONDITION FACTOR (K) FOR MEAGRE AT 4 DIFFERENT AGES FOR MEAGRE. ..................................................................................................... 86! TABLE V.3. HERITABILITIES (IN THE DIAGONAL, WITH ±STANDARD ERROR) PHENOTYPIC CORRELATIONS (ABOVE THE DIAGONAL) AND GENETIC CORRELATIONS (IN ITALICS BELOW THE DIAGONAL, WITH ±STANDARD ERROR) BETWEEN GROWTH AND IMAGE ANALYZED TRAITS FOR MEAGRE. .............................................................................. 107! TABLE V.4. CARDIO-RESPIRATORY TRAITS (MEAN ± STANDARD DEVIATION) IN THE THREE FACILITIES FOR ON-GROWING MEAGRE. ..................................................................... 110! TABLE V.5. HERITABILITIES (IN THE DIAGONAL, WITH ±STANDARD ERROR) PHENOTYPIC CORRELATIONS (ABOVE THE DIAGONAL) AND GENETIC CORRELATIONS (IN ITALICS BELOW THE DIAGONAL, WITH ±STANDARD ERROR) BETWEEN GROWTH AND CARDIORESPIRATORY TRAITS FOR MEAGRE. .......................................................................... 111! TABLE VI.1. PHENOTYPIC RESULTS OF GROWTH AND QUALITY TRAITS (± TYPIC ERROR) OF MEAGRE IN THE THREE DIFFERENT FACILITIES. .......................................................... 128! TABLE VI.2. HERITABILITIES (IN THE DIAGONAL, WITH ±STANDARD ERROR) PHENOTYPIC CORRELATIONS (ABOVE THE DIAGONAL) AND GENETIC CORRELATIONS (IN ITALICS BELOW THE DIAGONAL, WITH ±STANDARD ERROR) BETWEEN GROWTH TRAITS AND QUALITY FOR MEAGRE. ............................................................................................. 129! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! V! ! !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!VI! ! ! ! ! ! ! VII! RESUMEN En este trabajo, se realizó por primera vez en corvina (Argyrosomus regius) la estima de parámetros genéticos de caracteres de crecimiento, de rendimiento y de calidad del pez y de la carne bajo condiciones industriales. Para ello, se ha tenido que poner a punto tanto herramientas de marcaje físico individual (Passive Integrated Transporder–PIT) como genético (microsatélites mediante PCR multiplex), necesarios para el desarrollo de cualquier programa de selección futuro, trazando el bienestar de los peces a través de la expresión del gen CYP1A. Las condiciones óptimas de marcaje con el sistema de marcaje físico PIT, se estudiaron en tres clases de peso diferentes (2-3 g, 3-4 g y 4-5 g). Los peces de cada clases de peso se criaron en tres tanques diferentes y los caracteres de crecimiento, mortalidad y tasa de pérdida se analizaron a los 15 y 30 días post marcaje. Los resultados mostraron la ausencia de efecto del marcaje sobre el crecimiento en las tres clases de peso estudiadas. A su vez la tasa de mortalidad ha puesto de manifiesto una tendencia a la baja, inversamente proporcional al tamaño de peso (12,2%, 16% y 5% para las clases de peces 2-3g, 3-4g y 4-5g, respectivamente). La tasa de pérdida ha sido nula en todas las clases de peso. Estos datos sugieren que la talla apropiada para el marcaje del PIT en corvina es a partir de los 4 g. La expresión del gen CYP1A en las tres clases de peso a las 0 horas, 1 día y 7 días post marcaje mostraron que no hubo diferencias significativas entre individuos control y marcados excepto para la clase de peso 2-3g confirmando las conclusiones anteriores. Se desarrollaron dos PCR multiplex; una específica (STRs) y otra interespecífica (STRi) constituidas por 8 y 10 marcadores microsatélites, respectivamente. Las dos !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!VIII! ! multiplex mostraron que los reproductores del lote del Instituto Canario de Ciencias Marinas (ICCM) tienen una variabilidad genética baja, que se destaca por la baja media del número de alelos, la heterocigosidad observada y la alta coascendencia que existe entre los individuos del lote. Con esta baja variabilidad y alta consanguinidad de los reproductores se ha podido asignar el 82,8% de descendientes a una única pareja de padres con la formación de 59 familias y la contribución de 25 machos y 22 hembras. Usando los descendientes asignados a una pareja de padres y asignados a un único padre se ha podido utilizar una matriz de 1.070 peces en la estima de los parámetros genéticos. Las heredabilidades de peso, longitud y compacidad observadas en los peces del ICCM a varias edades ha sido baja. A su vez las correlaciones fenotípicas de estos caracteres aumentaron entre edades cercanas. En el caso de las correlaciones genéticas, éstas fueron altas independemente de las edades consideradas. Estos resultados sugieren que en corvina se pueden realizar programas de selección dirigidos a caracteres de crecimiento desde tallas pequeñas. Usando los datos al sacrificio de las instalaciones de cultivo del ICCM, y las empresas ADSA y CANEXMAR, los caracteres de crecimiento mostraron unas heredabilidades más elevadas que cuando sólo fueron considerados los descendientes del ICCM, ya que aumentó el número de familias contributivas (0,19±0,11 por la longitud y 0,22±0,12 para el peso). Tanto las correlaciones fenotípicas como las genéticas fueron muy altas entre peso y longitud, confirmando la teoría de que es suficiente el uso de sólo uno de estos dos caracteres en un esquema de selección genética dirigido al crecimiento. A su vez se ha detectado una alta correlación fenotípica entre los caracteres de crecimiento y los caracteres de rendimiento (peso filete y peso eviscerado). A estos resultados se unen las similares heredabilidades que hubo entre estos dos tipos de caracteres. En este trabajo se utilizó por primera vez el análisis de imagen para la estima genética ! ! ! ! IX! de caracteres morfológicos en peces. Los resultados han mostrado unas correlaciones genéticas y fenotípicas altas entre los caracteres muestreados (peso, longitud, peso filete y peso eviscerado) y los caracteres analizados vía imagen (áreas totales, longitudes total y anchuras máxima del filete), con valores cercanos a 0,9 en la mayoría de los casos, confirmando que éstos constituyen una vía a través de la cual llevar a cabo la selección sin tener que realizar procesos tediosos de valoración y permitiendo disminuir el tiempo de muestreo y hacer los procesos más eficientes. A su vez se estimaron las correlaciones genéticas y fenotípicas y las heredabilidades de caracteres cardio-respiratorios. Se ha detectado una relación muy estrecha entre los pesos del ventrículo y de las branquias entre sí, por una parte, y de estos dos con los caracteres de crecimiento por otra. Estos datos mostraron la alta relación fisiológica entre los diferentes órganos ligados al crecimiento y por tanto la no interacción entre ambos grupos de caracteres. En cuanto a los caracteres de calidad se han observado heredabilidades bastantes bajas para la humedad, la ceniza, los lípidos y el colágeno (entre 0 y 0,08). Y una heredabilidad moderada para la grasa evisceral (0,27±0,12). La humedad, la ceniza y el colágeno mostraron relación genética negativa con lípidos, grasas y caracteres de crecimiento. Todos estos resultados ponen de relieve que es posible estimar parámetros genéticos en corvina criadas y engordadas bajo condiciones industriales, a efectos que las empresas puedan obtener un valor añadido adicional de su producción a través de la selección directa para caracteres de crecimiento y rendimiento e indirecta para caracteres calidad. ! ! !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!X! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! XI! ABSTRACT In this study, for the first time, research of genetic parameters were conducted to estimate growth, carcass and quality processing trait in meagre (Argyrosomus regius), under industrial conditions. Therefore, it is necessary implant physical and genetic (microsatellites by multiplex PCR) tools for the development of any selection program. To establish the optimal conditions of the physical tagging system (PIT), we studied three different tagging sizes (2-3 g, 3-4 g 4-5 g). Fish for each size were reared in three different tanks. Growth, mortality and loss rates were analyzed after 15 and 30 days post tagging. The results showed no effect of tagging on growth in the three sizes studied. Although, the mortality rate has shown a downward trend inversely proportional to the size of fish (12.2%, 16% and 5% for fish classes 2-3g, 3-4g and 4-5g, respectively). The loss rate was null in all weight classes. These data suggest that the right size for tagging with PIT system in meagre is from 4 g. In order of optimized the fish welfare, molecular marker CYP 1A were assessed to evaluate the effect of this tagging system in fish welfare in the 3 weight classes at 0 hours, 1 day and 7 days post tagging. Data from this experiment showed that gene expression between controls and tagged fish is significant only for 2-3g tagged weight class. These data confirm previous suggestions. The development of this type of physical tagging system was necessary to monitor and control fish throughout the growing period. However, it was necessary to develop genetic tools for the characterisation of the Instituto Canarias de Ciencias Marinas ICCM breeder stock and for the assignation of their descendants. That’s why specific (STRs) and interspecific (STRi) multiplex PCR were developed. 8 and 10 microsatellite markers !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!XVIII! ! suggèrent de prendre en compte les caractéristiques physiologiques de maigres pour éliminer les problèmes dans la stabilité du produit final et, par conséquent, sa valeur commerciale et des effets néfastes de la santé des poissons et l'efficacité biologique. ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!INTRODUCCIÓN! ! 3! I. Introducción I.1. Acuicultura mundial En un contexto mundial caracterizado por la fuerte disminución en la producción de la pesca, frente a un aumento constante de la población y la demanda de productos provenientes del mar, la acuicultura se está consolidando como una alternativa prometedora que podría cerrar la brecha entre la oferta y la demanda mundial de pescado. Este sector es el que más crece dentro de los sectores alimenticios y está en camino de superar a la pesca extractiva, como principal fuente de pescado para el consumo humano (FAO, 2010). Aunque la acuicultura se ha practicado durante muchos siglos en algunos países, sigue siendo, en el contexto global, un sector joven en la producción de alimentos, que ha crecido rápidamente en los últimos 50 años. La producción mundial de la acuicultura se ha expandido significativamente, desde menos de 1 millón de toneladas en 1950 hasta 52,5 millones de toneladas en 2008, un aumento tres veces más rápido que la producción mundial de carne en el mismo período. Así, durante esta última década del siglo XXI, se ha visto un aumento importante de la producción acuícola frente a la de captura, con más de la mitad del conjunto de los productos acuáticos consumidos actualmente por la población mundial procedente de granjas acuícolas (APROMAR, 2011). Sin embargo, la tasa de crecimiento de la producción acuícola se está desacelerando bajo el impacto de diversos factores. Desde el año 2000, el crecimiento medio anual en la producción acuícola ha sufrido un importante descenso en Europa y América del Norte, alcanzando respectivamente el 1,7 y el 1,2 por ciento. La producción cayó en la última década en los países que fueron vanguardistas en el desarrollo de la acuicultura, como España, Francia y Japón. !!!!!INTRODUCCIÓN!!!!!!!!! !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!4! ! No obstante, aunque la mejora anual en producción no es muy importante, se ha producido una mejora debida al desarrollo de nuevas tecnologías de cultivo y al conocimiento de la biología de las nuevas especies integradas dentro de los productos de cultivo (Fotedar y Phillips, 2011). En el año 2009, se estaban produciendo en el mundo 450 especies diferentes pertenecientes a los grupos de peces, moluscos, crustáceos, algas y otros. De éstos, se pueden destacar más de 274 de especies de plantas y animales acuáticos producidos en cantidades significativas (más de 100 toneladas). Esta diversidad se debe al elevado número de organismos acuáticos que pueden adaptarse a los sistemas y condiciones de producción controlada. En los países europeos, el cultivo marino de peces se limita a 5 - 6 especies que representan más del 90 % de la producción. En el mar Mediterráneo, la producción acuícola marina está limitada a tres especies: la dorada (Sparus aurata) con 96.419 toneladas, la lubina (Dicentrachus labrax) con 57.004 toneladas y el rodaballo (Psetta maxima) 9.168 toneladas (APROMAR, 2011). La introducción de nuevas especies en el mercado Europeo y Mediterráneo servirá para la diversificación de la producción acuícola, además de para expandir y ampliar los mercados existentes, reduciendo el riesgo de la fluctuación de los ingresos y aumentando la eficiencia de uso de los recursos existentes (CIHEAM, 1999). Aunque el interés de introducir nuevas especies está probado y más de 20 nuevas especies con un importante valor económico y con un perfil prometedor han sido y están siendo estudiadas a nivel de investigación (Barbato y Corbri, 1995; Kentouri et al., 1995; Lensi, 1995; Kožul et al., 2001; Roo et al., 2010), la introducción a nivel industrial está siendo lenta y poco efectiva. Así, podemos nombrar como especies introducidas con éxito recientemente a nivel industrial, el sargo picudo (Puntazzo puntazzo) o la corvina (Argyrosomus regius). !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!INTRODUCCIÓN! ! 5! I.2. La corvina: Características morfológicas La corvina, Argyrosomus regius (Asso, 1801), es una especie de agua marina perteneciente a la familia de los Scianidos. Se caracteriza morfológicamente por una cabeza relativamente grande y un cuerpo alargado, una boca en posición terminal sin barbillas, dos ojos bastante pequeños, una línea lateral evidente que se extiende sobre la aleta caudal. Posee una segunda aleta dorsal mucho más larga que la primera. La aleta anal tiene un primer radio espinoso corto y un segundo muy delgado. Varios apéndices ramificados están presentes en la vejiga natatoria, que pueden vibrar produciendo un sonido típico conocido como 'ronquido' (Duhamel de Monceau, 1777; Dufosse, 1874). Además, se caracteriza por dos otolitos muy grandes, un color de cuerpo gris-plateado, con tintes bronceados dorsalmente, la base de las aletas café rojiza y la cavidad de la boca amarillo dorada y un color post mortem café (Figura I.1). Figura I.1. Fotografía de un espécimen de corvina de cultivo. !!!!!INTRODUCCIÓN!!!!!!!!! !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!6! ! I.3. Distribución geográfica La corvina se distribuye ampliamente por todo el Mar Mediterráneo, aunque no es muy habitual en las costas de Italia y Grecia. Es una especie común en el Atlántico desde las Costas noruegas por el norte hasta las Costas del Congo por el sur (Chao, 1986), y según Quéro y Vayne (1987), se encuentra en el Atlántico desde Islandia hasta el Golfo de Guinea. Los peces más grandes se encuentran a lo largo de la Costa oeste de África, donde grandes cardúmenes de corvina se encuentran alrededor de buques desechados en los que crean su hábitat varias especies comerciales. También se encuentra en la parte occidental del Mar Negro, en el Mar de Marmara, y en el Mar Rojo desde el Canal de Suez hasta el Océano Indico (Quéro, 1989). Al ser la corvina una especie semi-pelágica costera, con tendencia demersal (Quéro y Vayne, 1987), puede crecer hasta los 2 metros y alcanzar más de 50 kg. El crecimiento se logra principalmente durante el verano, ya que la actividad de alimentación se reduce substancialmente cuando las temperaturas del mar caen por debajo de 13-15°C (FAO, 2012). I.4. Reproducción y biología de la especie Durante la migración reproductiva a mediados de abril, las corvinas adultas se aproximan a la costa y éstas penetran en los estuarios a finales de mayo para desovar (migración anádroma) (Quémèner, 2002). Durante la estación de desove, los machos producen un sonido profundo típico, empujando sus músculos abdominales contra la vejiga natatoria. Desde mediados de junio hasta fines de julio abandonan los estuarios para alimentarse a lo largo de la costa. Ellas permanecen en aguas poco profundas hasta el comienzo del otoño. Durante el invierno, las corvinas retornan a aguas profundas. !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!INTRODUCCIÓN! ! 7! I.5. Historia y situación actual de la acuicultura La corvina, como otros miembros de la familia Scianidae es en este momento objeto de interés internacional de cara a su cría comercial, ya que presenta unas características biológicas excelentes permitiendo considerarla como una magnífica candidata para la diversificación productiva en acuicultura marina. Es una especie altamente fecunda, ampliamente distribuida, con unos precios de mercado medio-altos y con buena aceptación por parte de los consumidores (Jiménez et al., 2005). Además, presenta la ventaja añadida de que se trata de una especie eurihalina, con un amplio rango de tolerancia de salinidad, lo que permite su adaptación a ambientes muy diversos, incluso a la cría terrestre en aguas salobres. También tolera perfectamente la cautividad, como demuestra su presencia en grandes acuarios, y presenta unas elevadas tasas de crecimiento en engorde y unos buenos índices de conversión (Calderón et al., 1997; Pastor et al., 2002). Sus características organolépticas demuestran que las corvinas de engorde presentan unas cantidades inusualmente bajas de grasa mesentérica y muscular, en comparación con otras especies de granja, y un período de conservación largo en condiciones de refrigeración, características que permiten considerar a la corvina de granja como un producto de excelente calidad (Poli et al., 2003). La historia de la acuicultura de la corvina es bastante reciente. Los primeros ensayos con reproductores silvestres fueron conducidos en el sur de Francia, donde se pensó que algunos peces de la familia Scianidae tenían buen potencial para acuicultura. Comenzando en 1996, la producción de alevines ha sido muy limitada, con un solo criadero operando en Francia. La primera producción comercial en Francia fue registrada en 1997. Desde entonces, la producción se ha expandido lentamente a las regiones cercanas, especialmente en Italia, España, Egipto y otros países del Mediterráneo, lo que !!!!!INTRODUCCIÓN!!!!!!!!! !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!8! ! ha promovido su producción de alevines así como la investigación. La posible contribución a la diversificación de las especies actualmente producidas en el Mediterráneo, evitando con ello el estancamiento de las empresas del sector, hace que esté considerada como especie prioritaria a nivel europeo en los programas nacionales de investigación y desarrollo de los países mediterráneos (Mateos, 2007). En España, la Junta Nacional Asesora de Cultivos Marinos (JACUMAR), órgano constituido por el Ministerio de Medio Ambiente, Medio Rural y Marino, a través de su Secretaria General de Pesca unido a los Organismos Gestores de las CC. AA. y las asociaciones representantes del sector productivo acuícola, ha considerado esta especie como prioritaria y esta incluida en el Plan Nacional de Cultivos Marinos, siendo estudiada actualmente en diferentes centros de investigación con el objetivo de optimizar su cultivo. Así en la fase de estabulación y puesta de reproductores, la primera referencia fue de Calderón et al. (1997), realizándose con posterioridad la estabulación de 361 reproductores divididos en tres centros de investigación españoles como desarrollo del proyecto planes de cultivos marinos en la cría de corvina (PLANCOR) (Cárdenas, 2010). Uno de los tres centros anteriormente citados es el Instituto Canario de Ciencias Marinas (ICCM), del que se ha descrito la evolución de maduración de su stock de reproductores (Schuchardt et al., 2007). Así mismo, durante el desarrollo del citado proyecto se han obtenido las primeras puestas inducidas mediante tratamiento hormonal en España (Grau et al., 2007), manipulación que ha sido afinada y correlacionada con la calidad de la puesta (Duncan et al., 2008, Fernández-Palacios et al., 2009b). En cuanto a la cría larvaria de corvina se han realizado varios estudios del desarrollo morfológico y fisiológico de la especie (Jiménez et al., 2005; Cruz et al., 2007; Gamsliz y Neke, 2008; Abreu et al., 2009; Fernández-Palacios et al., 2009a), así como estudios !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!INTRODUCCIÓN! ! 9! nutricionales (Hernández-Cruz et al., 2007; Fernández-Palacios et al., 2009a). Sin embargo, el primer protocolo de alimentación larvaria a escala industrial fue publicado por Roo et al. (2010) en cuyo estudio se probaron 3 sistemas diferentes de cultivo larvario basado en alternancia de alimento vivo e inerte. Varios estudios se han realizado también en el pre-engorde y el engorde de corvina, tratando de analizar la cría en varias salinidades (Tinoco et al., 2009), en varias temperaturas (Lavié et al., 2008), en diferentes tipos de instalaciones (Jiménez et al., 2005), con alimentación en la que se valoraban diferentes niveles de lípidos (Chatzifotis et al., 2010), y también la valoración de varias concentraciones de proteínas de origen vegetal en el crecimiento de la corvina (Estévez et al., 2011). I.6. Producción mundial y situación del mercado La producción mundial de corvina fue nula hasta el año 1997, fecha en la cual se declararon 30 toneladas en la primera producción. Durante los siguientes 5 años la producción mundial de corvina se quedó estable en 30 toneladas, y desde el año 2003 se ha observado un aumento acelerado hasta el 2010 alcanzando una producción de 3.855 toneladas (Figura I.2). Esta producción estaba hasta hace escasos años limitada al sur de Francia e Italia proviniendo el 90% del cultivo de jaulas marinas. Sin embargo, estos últimos años se ha visto aumentada la producción por la entrada de España y Egipto en la producción (FAO, 2010). Atendiendo a los datos de la Federación Europea de los Productores en Acuicultura (FEAP), la producción de corvina en Europa en 2010 ascendió a 3.855 toneladas, un 77,7% más que en 2009, cuando se produjeron 2.178 toneladas. El primer país productor !!!!!INTRODUCCIÓN!!!!!!!!! !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!16! ! En corvina no existe ninguna publicación de estimas de parámetros genéticos como la heredabilidad o las correlaciones genéticas. Sin embargo, sí se han desarrollado trabajos dirigidos al estudio de la calidad del pez abordando caracteres de crecimiento y de calidad desde el punto de vista fenotípico, así como estudios comparativos de la corvina con otras especie de cultivo como la dorada y la lubina (Poli et al., 1999, 2001; Lanari et al., 1999), basados en caracteres de calidad, donde se concluye que se trata de una especie muy diferente de las otras especies de acuicultura. Dicha diferencia parece muy clara cuando se comparan la corvina y la lubina del mismo tamaño comercial, observando un 88% menos de grasa abdominal y 83% menos de grasa intramuscular en corvina; esto puede ser explicado, según Poli et al. (2003), por un uso diferente de la dieta, situando a la corvina más cerca del pez gato salvaje. Para Bykov (2000), la corvina tiene una posición intermedia respecto a su composición corporal dentro de las especies acuícolas de mayor relevancia como la dorada y la lubina. También, el análisis sensorial pone de relieve el mantenimiento del 94% del perfil corporal del pez y el 44% del rendimiento filete en corvina sin ninguna influencia del rango de peso (Poli et al., 2003; Grikorakis et al., 2011). Por otro lado, para establecer un programa de selección genética que aborde tanto caracteres de crecimiento como caracteres de calidad de los peces, se requiere del conocimiento de la genealogía de la descendencia. Sin embargo, en la mayoría de los casos este conocimiento no es posible por la técnica empleada en la obtención de huevos a escala industrial y que suele realizarse mediante puesta masal, la cual es la estrategia más extendida para garantizar los costes de producción en las empresas de cultivo y las necesidades de mercado. Desde el punto de vista genético, esta estrategia presenta la ventaja de que minimiza las fuentes de parecido por ambiente común entre los miembros !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!INTRODUCCIÓN! ! 17! de la misma familia (Herbinger et al., 1999), lo que proporciona una mayor exactitud de las estimas. Sin embargo, tiene el inconveniente de que imposibilita conocer la genealogía de los peces, que es un requisito indispensable para estimar parámetros genéticos. Bajo estas circunstancias, la trazabilidad de la genealogía a lo largo del desarrollo se puede realizar mediante la utilización conjunta del marcaje individual de los peces con sistemas físicos de marcaje como el Passive Integrated Transponder (PIT) y del análisis de un panel de marcadores moleculares como pueden ser los microsatélites. El PIT tiene la ventaja de ser un marcador de uso práctico, manejable, automatizable, con un amplio margen de códigos numéricos y que ofrece gran seguridad a la hora de marcar los peces respecto a supervivencia y crecimiento de los peces, y alta tasa de retención de la marca inclusive en tallas pequeñas (Navarro et al., 2006; Soula et al., 2012). Este marcaje, se ha empleado en la gestión de stocks en acuicultura, donde la mayoría de los trabajos están orientados a contrastar el efecto de esta técnica de marcaje sobre el crecimiento y la supervivencia de los peces (Prentice et al., 1990; Baras et al., 1999, 2000; Navarro et al., 2006; Soula et al., 2012). Puesto que cada especie tiene diferentes grados de aceptación de los PITs debido a sus condicionantes biológicos, es difícil la interpolación entre especies. Así, el sistema PIT ha sido utilizado en un gran número de peces y crustáceos como son los salmónidos (Gries y Letcher, 2002; Dare 2003; Sigourney y Horton, 2005; Acolas et al., 2007; Dieterman y Hoxmeier, 2009), la perca (Baras et al., 2000), la tilapia (Baras et al., 1999), el labeo roho o carpa hindú (Mahapatra et al., 2001; Bollan et al., 2009), el cavilat (Bruyndoncx et al., 2002; Knaepkens et al., 2007), el pargo (Quartararo y Bell, 1992), la dorada (Navarro et al., 2006) y el bocinegro (Soula et al., 2012). !!!!!INTRODUCCIÓN!!!!!!!!! !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!18! ! En cuanto a los marcadores moleculares, los microsatélites se han convertido en unos de los más utilizados para una amplia variedad de estudios genéticos (Liu y Cordes, 2004). Se ha desarrollado un gran número de microsatélites en varias especies acuícolas (Herbinger et al., 1999; Batargias et al., 1999; Pérez-Enríquez et al., 1999; Delghandi et al., 2003; Jackson et al., 2003; McDonald et al., 2004; Sekino et al., 2004; Chistiakov et al., 2005; Yutao et al., 2007; Navarro et al., 2008; Gheyes et al., 2009; Borrell et al., 2011). En la familia de los Scianidos, ha sido descrito un número significativo de microsatélites. En el corvinón ocelado (Sciaenops ocellatus) se han descrito 100, 38 y 30 microsatélites por Karlsson et al. (2008), O'Malley et al. (2003) y Turner et al. (1998), respectivamente. En la corvina japonesa (Pseudosciaena crocea) 36 microsatélites fueron publicados por Ning et al. (2007) y 11 por Chang et al. (2008). En la corvinata amarilla (Cynoscion acoupa) se han caracterizado 17 microsatélites (Farias et al., 2006). En mulloway (Argyrosomus japonicus) han sido descritos 15 marcadores microsatélites (Archangi et al., 2009). En Argyrosomus regius, recientemente han sido publicados en la base de datos del NCBI 23 marcadores microsatélites (Porta et al., 2010), lo que permite disponer de un número suficiente de microsatélites para inferir con éxito la genealogía. Sin embargo, el elevado número de microsatélites necesarios para inferir la genealogía de una población o conocer la diversidad genética de la misma aumenta los costes de la aplicación de la técnica (Liu y Cordes, 2004). Un método comúnmente utilizado para reducir costos y maximizar la eficiencia de la amplificación de microsatélites es la técnica de PCR Multiplex (Olsen et al., 1996; Neff et al., 2000; Wesmajervi et al., 2006; Navarro et al., 2008). Que consiste en la co-amplificación de múltiples marcadores de microsatélites en una sola reacción. !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!INTRODUCCIÓN! ! 19! I.8. Objetivos Considerando todo lo anteriormente expuesto, el objetivo general de este trabajo es desarrollar y conjugar metodología que permita desplegar e imbricar la mejora genética en el sistema de producción de corvina a escala industrial, sin que las empresas tengan que modificar su modelo de producción y negocio, dando así un valor añadido a su explotación comercial. Para llevarlo a cabo, han sido definidos varios objetivos específicos: 1. La puesta a punto de las condiciones óptimas para el marcaje físico de la corvina, desde tallas pequeñas, con el sistema de marcaje individual Passive Integrated Transponder (PIT). 2. La puesta a punto de dos PCRs multiplex con marcadores microsatélites específicos e ínterespecíficos que sean robustas, económicas y útiles para inferir las relaciones de parentesco entre stocks de reproductores y descendientes bajo condiciones industriales. 3. La estima de heredabilidades y correlaciones genéticas y fenotípicas para caracteres de interés comercial, con el fin de que el sector industrial disponga de información que le permita tomar decisiones más adecuadas de cara a explotar la rentabilidad de sus poblaciones sin modificar su idiosincrasia de producción. ! ! ! ! ! ! !!!!!INTRODUCCIÓN!!!!!!!!! !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!20! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!MATERIALES!Y!MÉTODOS! ! 23! II. Materiales y métodos El desarrollo de este trabajo se dividió en 3 experimentos diferentes y complementarios. El primer experimento tenía como objeto la puesta a punto del sistema de marcaje Passive Integrated Transponder (PIT) y la evaluación del estrés posterior al marcaje en los peces. Con el segundo experimento se puso a punto dos PCR multiplex, formadas por un total de 18 marcadores microsatélites específicos e interespecíficos, para la caracterización genética de los reproductores del lote perteneciente al Instituto Canario de Ciencias Marinas , así como para la reconstrucción de la matriz de parentesco de los descendientes de los mismos. En el tercer experimento, los datos del marcaje de los peces y las dos PCRs multiplex fueron utilizados para el seguimiento y la asignación de parentesco de tres lotes de corvina criados en diferentes ambientes (en el ICCM, en las empresas ADSA y CANEXMAR), con el fin de estimar las heredabilidades, correlaciones genéticas y para los caracteres de interés comercial (crecimiento, rendimiento, calidad del pez y de la carne). II.1. Marcaje en corvina II.1.1. Experimento marcaje con el sistema PIT Para conseguir el objetivo propuesto se llevaron a cabo tres experiencias a distintos pesos; 2, 3 y 4 gramos. En todas las experiencias se utilizaron corvinas procedentes de la cría intensiva realizada en las instalaciones de mesocosmos del Instituto Canario de Ciencias Marinas, en condiciones industriales. Los peces fueron aclimatados inicialmente a las condiciones experimentales durante 15 días en tanques de 1000 litros antes de ser utilizados para el marcaje. !!!!!!MATERIALES!Y!MÉTODOS!!!!!!!! ! 24! Todos los peces fueron capturados y tratados del mismo modo, tanto los peces marcados como los no marcados o control. Se anestesiaron con aceite de clavo en un cubo de 10 litros a una concentración del 4%, con componente activo el eugenol, a partir de un stock de clavo con las siguientes proporciones; 50% clavo y 50% etanol. Posteriormente, los peces fueron pesados y medidos. En cada uno de los tres grupos, se usaron 300 peces repartidos en tres tanques (100 peces por tanque). Dentro de cada tanque, 50 peces fueron utilizados como controles y marcados con el sistema de marcaje Visible Implant Elastomer (VIE) en la zona interorbital, tal y como ha sido descrito por Soula et al. (2012). La marca VIE permitió distinguir a los peces control de los peces marcados con PIT que hubieren perdido el mismo. Para marcar los peces escogidos según rango de peso, con el sistema PIT (0,1 gramo de peso y 12 mm de longitud; EID Ibérica SA – TROVAN, Madrid), los PITs fueron previamente reconocidos con el lector (AEG ID, ARE H5) y almacenados en tubos eppendorf con etanol hasta el momento de su uso (Figura II.1). Los PITs fueron introducidos en la parte abdominal de los peces usando unas jeringas específicas para marcaje de mamíferos. Al final del proceso las lesiones provocadas por el marcaje fueron cubiertas con gel antiséptico dermatológico (Povidona iodada) para evitar cualquier infección en el pez. El proceso de marcaje fue realizado siguiendo las recomendaciones de Navarro et al. (2006). Los peces se mantuvieron durante un periodo de 30 días con una tasa de alimentación del 7% de la biomasa corporal a razón de 3 tomas diarias con pienso de la empresa SKRETTING®. Las condiciones físico-químicas del cultivo durante estos 30 días fueron las siguientes: 22,75 ± 0,4 °C de temperatura media, 37 ‰ de salinidad, 5,64 ± 0,4 ppm de oxígeno y una renovación de agua por hora. !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!MATERIALES!Y!MÉTODOS! ! 25! Se realizaron muestreos a los 0, 15 y 30 días para el peso y la longitud. También diariamente se colectaron los peces muertos. Al final de los experimentos se valoró la mortalidad, la tasa de retención y los parámetros de crecimiento en cada categoría de peso. II.1.2. Valoración del estrés por marcaje II.1.2.1. Material biológico Con el fin de evaluar el efecto del sistema de marcaje PIT sobre el estrés en corvina, se analizó el marcador molecular CYP1A en cada categoría de peso (Figura II.2). Para lograr este objetivo, en cada experiencia, fueron utilizados 132 peces y fueron evaluados tres puntos de muestreo (0h, peces control, un día - 1d y siete días - 7d). El efecto sobre la expresión del CYP1A entre días se evitó con la cría de peces en tres tanques separados. Por lo tanto, fueron utilizados 60 peces en cada punto de muestreo (1d y 7d), donde cada tanque contenía 10 peces marcados y 10 peces control. Los peces fueron sacrificados con 2-fenoxietanol (1:1000 v/v) para evitar el estrés aditivo. Cuatro peces marcados y cuatro controles fueron extraídos de cada tanque, en cada punto de muestreo, y se colocaron en una bandeja de hielo y se procedió a la disección. Los hígados de cuatro peces de cada grupo se extrajeron y se mantuvieron en tubos con RNAlater (Sigma®), y se almacenaron a 4ºC durante 24 horas. A continuación, el RNAlater fue retirado y las muestras fueron almacenadas a -80 ° C hasta su análisis. !!!!!!MATERIALES!Y!MÉTODOS!!!!!!!! ! 32! muestras en las que evaluar el potencial informativo de los marcadores que amplificaron. Los genotipos se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 5% durante 2 horas (1,3 voltios/cm), y se revelaron mediante tinción de plata (SequenceTM de Sequencing DNA System, Promega), siguiendo las recomendaciones del fabricante. En segundo lugar, sólo los marcadores que amplificaron debidamente (21 interespecíficos y 15 específicos) fueron rediseñados, sus cebadores, para amplificación en multiplex, sintetizándose a su vez con diferentes fluorocromos predeterminados para su correcta conjunción en la multiplex. Con el total de microsatélites disponibles, se diseñaron 4 PCRs multiplex, dos interespecíficas (Meagre STRi_PLEX-A y Meagre STRi_PLEX-B) y dos multiplex específicas (Meagre STRs_PLEX-C y Meagre STRs_PLEX-D) (Tabla II.1). Finalmente, a partir de los 36 marcadores microsatélites inicialmente rediseñados, 18 fueron descartados por causas variadas como: amplificación pobre, rango de amplificación inadecuado, tamaño de los alelos o ausencia de polimorfismo. Los marcadores restantes se combinaron en dos reacciones multiplex robustas, en las que hubo que modificar algún fluorocromo y rediseñarse algún cebador; éstas quedaron compuestas por 10 microsatélites interespecíficos (STRi) y por 8 microsatélites específicos (STRs) (Tabla II.2). !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!MATERIALES!Y!MÉTODOS! ! 33! Figura II.3. Muestreos mensuales y final de corvina !!!!!!MATERIALES!Y!MÉTODOS!!!!!!!! ! 34! TABLA II.1. NOMBRE DE LOCUS, MOTIVO DE REPETICIÓN (M), FLUOROCROMOS (F), FORWARD Y REVERSE SECUENCIAS DE LOS CEBADORES Y REFERENCIAS DE CADA UNO DE LOS MICROSATÉLITES SELECCIONADOS INICIALMENTE. ! ! ! ! !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!MATERIALES!Y!MÉTODOS! ! 35! TABLA II.1. NOMBRE DE LOCUS, MOTIVO DE REPETICIÓN (M), FLUOROCROMOS (F), FORWARD Y REVERSE SECUENCIAS DE LOS CEBADORES Y REFERENCIAS DE CADA UNO DE LOS MICROSATÉLITES SELECCIONADOS INICIALMENTE (CONTINUACION). ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !!!!!!MATERIALES!Y!MÉTODOS!!!!!!!! ! 36! TABLA II.1. NOMBRE DE LOCUS, MOTIVO DE REPETICIÓN (M), FLUOROCROMOS (F), FORWARD Y REVERSE SECUENCIAS DE LOS CEBADORES Y REFERENCIAS DE CADA UNO DE LOS MICROSATÉLITES SELECCIONADOS INICIALMENTE (CONTINUACION). ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!MATERIALES!Y!MÉTODOS! ! 37! ! TABLA II.1. NOMBRE DE LOCUS, MOTIVO DE REPETICIÓN (M), FLUOROCROMOS (F), FORWARD Y REVERSE SECUENCIAS DE LOS CEBADORES Y REFERENCIAS DE CADA UNO DE LOS MICROSATÉLITES SELECCIONADOS INICIALMENTE (CONTINUACION). ! !!!!MATERIALES!Y!MÉTODOS! ! ! 38! II.2.3. Condiciones de las PCRs Los cebadores fueron rediseñados para obtener una amplificación en el rango de 70 a 154 pares de bases (pb). Las secuencias de alta complejidad fueron eludidas durante el rediseño para garantizar la sensibilidad y la especificidad del ensayo múltiple. El objetivo era obtener una temperatura de fusión teórica de 60°C±2°C a una concentración de sales (K+, Na+, Tris+ o NH4+) de 180 mM. Un 35-60% del contenido del GC de la secuencia del cebador se aseguró, para evitar la cartilla que se localiza en los palíndromos u homopolímeros como el poli (dT) de más de cinco bases. Todos los candidatos fueron analizados para la formación horquilla o estructuras secundarias utilizando el programa que se encuentra en Integrated DNA Technologies (http://www.idtdna.com/Scitools/Applications/mFold/). Las primeras estructuras secundarias estables entorno a cada región microsatélite fueron evitadas por debajo de los -13 kcal·mol-1 umbral de la energía libre (Yuryev et al., 2002). Las características de los cebadores han sido elegidas para garantizar la misma eficiencia de amplificación de la PCR para todos los fragmentos de ADN como se describió previamente (Sánchez et al., 2003). Inicialmente, cada grupo de cebadores fue probado individualmente en cinco muestras con el fin de corroborar una amplificación correcta con el cebador modificado, así como para detectar el tamaño de los alelos y la identificación de los microsatélites. Los marcadores de microsatélites sin amplificación individual fueron descartados de la reacción multiplex. Las PCRs multiplex fueron optimizadas siguiendo las recomendaciones de Navarro et al. (2008). Por ello, se utilizó una concentración inicial de 0,2 M de cada cebador y fueron modificadas las concentraciones de los cebadores para obtener alturas de pico en !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!MATERIALES!Y!MÉTODOS! ! 39! el electroferograma comprendidas entre 600 y 3000 Related Fluorescence Unit (RFU) para cada marcador microsatélite. En primer lugar, los pares de cebadores con amplificación RFU alta se redujeron y luego los de baja RFU se incrementaron. La concentración total utilizada se ajustó a 0,7 M al final del proceso. Las concentraciones y las características de los cebadores finales de la STRi y STRs se presentan en la Tabla II.2. Las condiciones de amplificación consistieron en una desnaturalización inicial a 94°C durante 10 minutos, seguido por 30 ciclos a 94°C durante 30 segundos, 60°C durante 1 minuto y 65°C durante 1 minuto, con una extensión final a 65°C durante 60 minutos. Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen final de 12,5 ml con las concentraciones de los siguientes componentes: 1X GeneAmp PCR Buffer II (100 mM Tris-HCl pH 8,3, KCl 500 mm) (Applied Biosystems®), 3 mM MgCl2, 0,2 mM de cada dNTP, 0,05 unidades Gold AmpliTaq ADN polimerasa (Applied Biosystems®), 12 ng de ADN molde, y entre 0,01-0,06 M de cada cebador. Después de obtener las concentraciones óptimas de los cebadores, todas las muestras fueron amplificadas con ambas multiplex, con el fin de confirmar la segregación de alelos de cada locus, conocer la variabilidad genética de todos los marcadores microsatélites y validar la eficacia de éstas en la determinación del parentesco entre peces. Antes de ejecutar las reacciones multiplex en el secuenciador automático, se verificaron los productos amplificados en gel de agarosa al 2% durante 30 minutos (8 v·cm-1) para evaluar la amplificación correcta de los amplicones. Más tarde, 1 µl de los productos amplificados se mezcló con 9,75 µl de formamida Hi-Di y 0,25 µl de 500 -250 LIZ GeneScan (Applied Biosystems®) como estándar de tamaño, y se procesaron en un analizador ABI Prisma-3130-XL Genetic (Applied Biosystems®) con 36 cm capilares y !!!!MATERIALES!Y!MÉTODOS! ! ! 40! usando el POP-4 como polímero (Applied Biosystems®) (60°C, 3000V, 1500). Los electrofenogramas y los genotipos fueron evaluados con los programas de GeneScan (v3.7) y Genotyper (v3.7) (Applied Biosystems, Inc.). II.2.4. Análisis de los datos El equilibrio de Hardy-Weinberg, la probabilidad de exclusión (PE) y la probabilidad de exclusión combinada (PEC) para la pareja de los padres posibles (Jamieson y Taylor, 1997), la heterocigosidad observada y esperada, el contenido de información polimórfica (PIC) y la frecuencia teórica de alelos nulos (Summers y Amos, 1996), se estimaron con el programa Cervus 3.0 (Kalinowski et al., 2007). Las asignaciones de los padres entre los reproductores y sus descendientes del lote del ICCM se determinaron utilizando el método de exclusión, con un programa no comercial proporcionado por Vandeputte et al. (2006). La coascendencia del stock se calculó utilizando el programa Sofsog (Fernández y González-Martínez, 2010). II.3. Estima de heridabilidades y correlaciones genéticas II.3.1. Material biológico En mayo del 2006, se adquirió un lote de corvinas de 140 individuos con un peso medio 1,5 kg a una empresa con jaulas situadas en la isla de Tenerife, desde donde fueron trasladadas a nuestras instalaciones del ICCM en la isla de Gran Canaria. Los reproductores se mantuvieron en tanques de 10 m3. Una vez trascurrido el periodo de adaptación, se procedió a un primer muestreo (julio del 2006) en el que se marcaron con PITa todos los individuos supervivientes. Los peces se alimentaron con una ración del 1% de su biomasa, con una dieta comercial (Proaqua®, 10 mm). !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!MATERIALES!Y!MÉTODOS! ! 41! TABLA II.2. NOMBRE DE LOCUS, FLOROCROMOS (F), FORWAD Y REVERSE SECUENCIAS DE LOS CEBADORES, CONCENTRACIONES DE LOS CEBADORES (CP) (MM) EN LAS DOS PCR MULTIPLEX FINALES. ! !!!!MATERIALES!Y!MÉTODOS! ! ! 48! II.3.3. Análisis de datos Todos los descendientes y los reproductores se genotiparon utilizando las dos PCRs múltiplex, la STRi y la STRs (apartado 3.2) y la asignación se realizó con el método de exclusión, utilizando el programa de Vandeputte et al. (2006). Los datos de todas las variables, previamente comprobada su normalidad y su homogeneidad de varianzas, se analizaron aplicando un modelo lineal general, para detectar la significación del efecto tanque y estación utilizando el programa SPSS (v 19.0) (SPSS, Chicago, IL, EE.UU.). En el caso de las variables de calidad, fue necesaria la transformación logarítmica. La repetibilidad de los caracteres de la composición de la carne se calculó usando el programa SPSS (v 19.0), mediante el siguiente modelo lineal: Yij = µ + Fi + εij donde Y es el dato del pez, µ es la media de la población, Fi es el efecto fijo del individuo y εij es el error residual (réplica). Las componentes de varianza de todos los caracteres considerados en este estudio se estimaron por máxima verosimilitud restringida (REML) utilizando el programa VCE (v 6.0) (Kovač et al., 2002), mediante el siguiente modelo lineal: y = Xβ + Zu + ε donde y es el dato del carácter, β los efectos fijos (estación y tanque), u es el efecto animal aleatorio y ε el error residual. Las magnitudes de las estimas de las heredabilidades se establecieron siguiendo la clasificación de Cardellino y Rovira (1987), en la que se consideran bajas entre 0,05 y 0,15, medias entre 0,20 y 0,40, altas entre 0,45 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!MATERIALES!Y!MÉTODOS!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ! 49! y 0,60 y muy altas las superiores a 0,65. Respecto a las correlaciones se clasificaron como bajas (0-0,40), medias (0,45-0,55) y altas (0,60-1), independientemente del signo. Figura II.5. Muestreo para los caracteres de la carcasa y de calidad analizados. Figura II.6. Detalles de los protocolos de trabajo para los caracteres de calidad analizados. !!!!MATERIALES!Y!MÉTODOS! ! ! 50! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!EVALUATION!OF!PIT!SYSTEM! ! 53! III. Evaluation of PIT tagging system as method to tag fingerlings of meagre (Argyrosomus regius); its effect on growth, survival, tag retention and fish stress. III.1. Abstract Meagre (Argyrosomus regius) is one of the new species in Mediterranean aquaculture. In this study, the optimal fish size for Passive Integrated Transponder tagging system (PIT) was examined, more concretely, its effect on fish growth, survival and tag loss rates. Fish of three weight classes (2-3 g, 3-4 g and 4-5 g) were studied. For each one, 300 fish (150 tagged and 150 untagged fish) were distributed in three tanks and used. Results showed that PIT tagging did not effect on fish growth in any weight class. The corrected mortality rate was 9.9%, 13.6% and 6.6% for weight classes 2-3g, 3-4g and 4-5g, respectively, and it was concentrated in the first days after tagging. Tag loss rate was null in all three weight classes. With respect to fish stress, CYP1A gene expression was evaluated at 0 hours, 1 day and 7 days after tagging (sampling points), for 2 g and 4 g weight classes. At 2 g weight class, an effect of tagging on CYP1A gene expression was detected. At 4 g weight class, not significant difference between tagged and untagged fish, at any sampling points, was detected. These results suggest that the most appropriate size for tagging meagre fingerlings is from 4 g onwards, with minimum effect on mortality and without effect on fish growth and tag loss rates and fish stress. Keywords: Meagre, Argyrosomus regius, Passive Integreted Transponder, PIT, stress, welfare, Cytochrome P450. !!!!EVALUATION!OF!PIT!SYSTEM! ! ! 54! III.2. Introduction Meagre (Argyrosomus regius), a marine Scianedae, is one of the most promising species for Mediterranean aquaculture due to its rapid growth rate, good quality and excellent conversion rate (Quéméner, 2002). These factors, taken together with wide saline range of meagre, had allowed its fast expansion in European and African aquaculture, with an exceptional production increase in the last 7 years (APROMAR, 2011). Even meagre production can be widely improved by development of its culture conditions in nutrition, engineering techniques, reproduction or genetics (Poli et al., 2003; Lagardère y Mariani 2006; Hernández et al., 2009; Roo et al., 2010). It is usually produced by mass spawning in order to have a high quality of eggs and rentability. Mass spawning reduces the common environmental sources of variation (Herbinger et al., 1999), but it also prevents the traceability of fish genealogy (Jennings et al., 2009). However, to introduce improving by genetic programs through the estimation of breeding values for economic traits, the coefficient of relatedness (between breeders and descendants) must be known. It can be achieved by combination of molecular genetic markers and physical tagging system (Navarro et al., 2009a, 2009b) Passive integrated transponder (PIT) is an individual and internal physical tagging system widely used in fish because it has a low effect on fish survival and growth and high retention rates at small sizes (Prentice et al., 1990; Nunnallee et al., 1998; Ombredane et al., 1998, Baras et al., 1999, 2000; Navarro et al., 2006; Soula et al., 2012). However, species show different PIT acceptance degrees due to biological characteristics of fish and welfare condition requirements, so is difficult to interpolate tagging conditions between species, and these have to set up for each species. !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!EVALUATION!OF!PIT!SYSTEM! ! 55! Nowadays, European (Council Directive 86/609/EEC), National (Royal Decree 1201/2005), and Regional (Decree 117/1995) legislations regulating the welfare experimental conditions, due to inappropriate breeding techniques so management produce fish stress and, consequently physiological equilibrium degradation (Barton and Iwama, 1991; Barcellos et al., 2001, 2004; Biswas, 2006). In this sense, to trace the fish welfare by stress is important. Many studies were realized to control the stress reaction caused by fish confinement and manipulation (Barton et al.,1998, Barton, 2000; Bayunova et al.,2002; Lankford et al., 2003, 2005; Wuertz et al., 2006; Webb et al., 2007). These studies used serum and plasma cortisol concentration (Barton, 2002), heat shock proteins (Iwama et al., 1998) and cytochrome P450 monooxygenase (Jørgensen et al., 2001; Gornati et al., 2004). The cytochrome P450 1A (CYP1A) is important in the biotransformation of xenobiotics (Andersson and Forlin, 1992, Goksøyr and Forlin, 1992; Stegman and Hahn, 1994), and it has also been used as biomarker in environmental biomonitoring studies (Goksøyr y Forlin 1992) due to its adaptative response (Ortíz de Montellano, 2005). However, only plasma cortisol and heat shock proteins have been measured as physiological factors for PIT tagging system in rainbow trout (Feldhaus et al., 2008). III.3. Materials and Methods III.3.2. Physical tagging experiments III.3.2.1. Design and conditions To achieve the proposed objectives of this study, three experiments were realized at different fish weights; 2, 3 and 4 g. In all experiments, meagre fingerlings from the mesocosm facility at Instituto Canario de Ciencias Marinas (ICCM) were used. Before !!!!EVALUATION!OF!PIT!SYSTEM! ! ! 56! tagging, fish were initially acclimated to the experimental conditions during 15 days in 1000 l tanks. Tagged and untagged fish were manipulated equally along experiments (capture, anesthetized and sampled). For anesthetized process, fish were subjected a 0.002% clove oil solution, from a stock of 50% clove oil and ethanol. In each experiment, 300 fish were used and distributed in three tanks, each one containing 100 fish, where 50 fish were tagged with tagging system Passive Integrated Transponder (PIT; 0.1 g and 12 mm in length, EID Ibérica SA-TROVAN), in the abdominal cavity, according to the tagging protocol previously reported by Navarro et al. (2006). The other 50 fish were used without tag, untagged or control fish. To distinguish between PIT tagged fish that there were lost tag and untagged fish within the same tank, control fish were previously tagged by tagging system VIE in the head between the eyes, to estimate exactly the PIT tag retention. In spite of that VIE tag has not effect on growth and survival for different species (Astorga et al., 2005; Soula et al., 2012), Previous experiments were carried out in order to check that there were no VIE tagging system effect on meagre growth and/or survival (unpublished data). Fish were reared during 30 days under the same temperature, salinity and dissolved oxygen of water conditions (22.5±0.35°C, 37‰ and 6.20±0.43 ppm, respectively). Fish were fed three times per day with a specific feed rate of 7% using a commercial diet (Skretting®, Spain). III.3.2.1. Growth, mortality and tag retention rates, and wound healing Samplings for weight and length were performed at 0 hours (0h), 15 and 30 days (15d and 30d, respectively). Concerning mortality and tag retention rates, fish were daily measured, being presented as accumulated data at 15 and 30 days. Wound healing was !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!EVALUATION!OF!PIT!SYSTEM! ! 57! visually evaluated at 15 and 30 days by a numeric scale (1, total healed; 2, partially healed; 3, not healed). III.3.3. Molecular stress experiments III.3.3.1. Fish rearing and sampling In order to precise the effect of tagging system on fish stress, the genetic expression of CYP1A molecular marker was quantified in each weight class,. To achieve it, 132 fish per weight class were used. Three sampling points were considered (0h, zero hours; 1d, one day; 7d, seven days). CYP1A expression influence on each other was avoided by rearing fish in three separated tanks. Thus, 60 fish were used in each sampling point (1d and 7d), each tank containing 10 tagged fish and 10 untagged fish (control). Fish were slaughtered with 2-phenoxyethanol (1:1000 v/v) to avoid additive stress. At each sampling point, four untagged and four tagged fish were slaughtered from each tank, and placed on ice and dissected. Livers from each group of four slaughtered fish were extracted and kept in tubes with RNAlaterTM (Sigma®), then, they were incubated at 4°C for 24 hours. Later, RNAlaterTM was removed and samples stored at -80°C. III.3.3.2. RNA extraction and cDNA synthesis After homogenization of, approximately, 100 mg of tissue with Tissuelyser (Quiagen®), 1 ml TRI Reagent (Sigma® Ambion) was added and total RNA was extracted, by adding. Then, chloroform and isopropanol were used to separate and precipite, respectively. Pellets were hydrated with 200 µl of Milli-Q sterile water, previously treated with 0.1% DEPC, and kept at -80ºC until analysis. Total RNA concentration, purity and quality were measured by NanoDrop 1000 Spectrophotometer !!!!EVALUATION!OF!PIT!SYSTEM! ! ! 64! III.5. Discussion III.5.1. Evaluation of tag system Tagging systems are an important research tool that permit to track fish migration, spawning behaviour, growth and survival. Fish farms also use tagging for selection and rearing to know fish traceability (Nielsen, 1992). Tagging systems need to be tested for every species because of their difference in susceptibility to anaesthesia and manipulation, capacity for recovery, growth rate and morphology (Navarro et al., 2006). In this sense, it is important that tagging systems do not interfere with long-term growth This study showed that there is no effect of PIT tagging system on growth from 2 g weight class (3 g weight class fishes do not corroborate this data because they suffered from bacterial infection during this experiment). At the same time, 4-g weight class tagged fish showed lower weights than untagged fish after the two first weeks, which was compensated at day 30. This PIT effect after tagging and compensatory growth has also been reported in other species like Nile tilapia (Baras et al., 1999), Eurasian perch (Baras et al., 2000), rainbow trout (Bateman and Gresswell, 2006), gilthead seabream (Navarro et al., 2006), brown trout (Acolas et al., 2007), olive flounder (Lee et al., 2009), juvenile pikeperch (Hopko et al., 2010), and red porgy (Soula et al., 2012). In this study, mortality reported an inverse correlation with weight class, where higher mortalities were presented for lower weight classes. This is in concordance with results of Mahapatra et al. (2001), who found mortality rates of 20%, 12%, 10% and 2% at 2–4 g, 4–6 g, 6–8 g and 8-15 g rohu carp (Labeo rohita) fish, respectively. Other authors described different mortalities depending on fish size for gilthead seabream fingerlings !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!EVALUATION!OF!PIT!SYSTEM! ! 65! (14.3% in 2-3 g fish, 3.4% in 3-4 g fish and 2.7%, in 4-8 g ) (Navarro et al., 2006), and in red porgy (45,7% and 14 % at weight classes 5-10 g and 10-20 g, respectively) (Soula et al., 2012). Moreover, Sigourney and Horton (2005) reported a positive correlation between fish survival and fish size on 2.5 g Atlantic salmon (Salmo salar). Pires et al. (2010) observed mortality rate ranged between 0 and 8% for 80 Iberians cyprinid fish with length between 66 mm and 124 mm. Although, in olive flounder, a mortality rate of 5% was detected in higher weight fish (502 g) (Lee et al., 2009). These results confirm that mortality, after PIT tagging, depends on each physiology species and stress caused by manipulation. In this study, retention rate was high and satisfactory. Data were in concordance with the majority of studies where retention rate ranged from 95% and 100%, as in juvenile chinoock salmon (Oncorhynchus tshawytscha) (Prentice et al., 1990), in Atlantic salmon (Zydlewski et al., 2009), in gilthead seabream (Navarro et al., 2006), in cyprinid fish (Bolland et al., 2009), in kelp grouper (Epinephelus bruneus) (Park y Park, 2009) and in red porgy (Soula et al., 2012). Wound healing rates were in concordance with Soula et al. (2012) for red porgy, and by Navarro et al. (2006) for 2-8 g for gilthead seabream. However, in this study, at day 15 after tagging, a higher wound healing was detected in higher weight size fish. This contrast with data reported by Knapkens et al. (2007) and Soula et al. (2012), who found a mean wound healing time lower for small size fish. Taken together, our results demonstrate that, from 2 g. weight, there is no tag effect on growth at long-term experiments. Furthermore, the higher tag retention rate and fast wound healing support the possibility to tag fish from 2 g weight. However, the higher !!!!EVALUATION!OF!PIT!SYSTEM! ! ! 66! mortalitiy for 2 g and 3 g weight classes respect to 4 g weight points out 4 g weight class as an ideal body weight to tag meagre fingerlings. III.5.2. Evaluation of PIT tagging system on fish stress. Understanding physiological fish reaction to PIT tagging system is an added value to adjust the optimum conditions and healthy behaviour of fish during and after tagging process. In this sense, Feldhaus et al. (2008) observed that handling and PIT tagging were stressful during the first 2 hours after tagging for rainbow trout, being cortisol a physiological indicator. Genetic expression of CYP1A gene may be too influenced by endogenous factors as cortisol (Quabius et al., 2005). This gene has mainly been used as xenobiotic biomarker in fish (Jönsson et al., 2010; Celander et al., 2011), and its derivated disease susceptibility (Bravo et al., 2011). Sampling and tagging represent stressful situations which cause an increase of plasma cortisol in fish (Jørgensen et al., 2001; Feldhaus et al., 2008), and can modulate the gene expression of several stress related genes. In this study, there is not any statistically significant difference of CYP1A gene expression between tagged and untagged fish, at any sampling point, confirming that PIT tagging system was not effect on that fish stress physiological marker. At the same time, a clear effect of the management process on CYP1A gene expression has been reported, at the lowest weight class. These data report that fish with low weight show a high sensitivity under manipulation. Using cortisol as indicator, the same tendency was observed in rainbow trout at first day after tagging. However, this increase was followed by a rapid recovery in subsequent days (Feldhaus et al., 2008). While, for 4 g weight class, there was not significant effect among sampling points, and comparing experiment 1 and experiment 3, these results prove that CYP1A gene expression, after PIT tagging, !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!EVALUATION!OF!PIT!SYSTEM! ! 67! has a clear relationship with fish weight. Higher weight meagres had more capacities to accept and to respond to the fish tagging system process manipulation. The lower genetic expression of CYP1A in the experiment 3 with respect to the experiment 1 confirms that 4 g is the best weight class for PIT tagging meagre without significant effects on fish behaviour and with lower stress response. These data confirm the role of CYP1A as a general stress protein (Morel and Barouki, 1999; Andrews, 2000). In fact, this gene have been used as indicator in the evaluation of the confinement process in fish (Gornati et al., 2004; Olsvik et al., 2006), as well as immunity response in human (Fujii-Kuriyama and Kawajiri, 2010). III.6. Conclusion In this study, data for growth, mortality and tag retention rates and fish stress showed that the optimum weight for meagre tagging with PIT tagging system is from 4 g weight. In addition, CYP1A has been reported as biomarker to evaluate meagre stress caused by PIT tagging process. III.7. Acknowledgment Authors wish to thank all technicians of Instituto Canario de Ciencias Marinas. This study has been supported by a Canary Government project (ACISII-PI 2007/052) and by a doctoral grant from the Agencia Española de Cooperación Internacional (AECID). !!!!EVALUATION!OF!PIT!SYSTEM! ! ! 68! ! ! ! * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!MICROSATELLITE!PCRs! ! 71! IV. Genetic variation for growth traits at different ages in meagre (Argyrosomus regius), under mass spawning determined parental assignment by using two multiplex PCRs. ! ! IV.1. Abstract In this study, for the first time on meagre (Argyrosomus regius), and under industrial conditions, heritabilities and genetic correlations among growth traits are reported. Two Multiplex PCRs (intra-specific or STRs and inter-specific or STRi) were used to determine genotypes for 17 microsatellites, to reconstruct genealogy and to estimate additive genetic variation at different growth ages. Breeders from different sources and 475 of their descendents were analyzed for validation purposes. On breeders, the number of alleles per marker ranged from 2 to 13, and the mean observed heterozygosis was 0.61 for STRi, and 0.59 for STRs. For each multiplex PCR, the a priori combined exclusion probability was higher than 0.99, and the mean value of polymorphic information content was 0.56 for STRi and STRs. These two new multiplexes allowed to successfully assign 77.7 % of descendents to a single pair parents from 76 breeders. Only 22 dams and 21 sires contributed to mass spawn. Heritabilies for weight and length at 120, 150, 296 and 446 days post hatch (DPH) were low and the correlation from phenotypic point of view with slaugthering weight trait, 446 DPH (0.45 to 0.7). Genetic correlations were high between weight and length at different ages. These data suggest that direct genetic selection on growth traits, from early life stages, is possible in meagre, under industrial culture conditions. !!!!MICROSATELLITE!PCRs! ! ! 72! Keywords: Meagre, Argyrosomus regius, microsatellites, multiplex, pedigree, heritability, genetic correlation, growth. !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!MICROSATELLITE!PCRs! ! 73! IV.2. Introduction Meagre (Argyrosomus regius) is a new emergent species in Mediterranean aquaculture due to its fast growth rate, adaptatability and facility to be handle during breeding period. It is a highly fecund species widely distributed with important market prices and is well accepted by consumers (Pastor et al., 2002; Quéméner, 2002). Its culture, reproduction and on-growing were initially developed in France at the beginning of 2000 (Poli et al., 2003). Thereafter, meagre production has considerably increased and its fry demand from the on-growing companies has doubled. At the same time, research studies on this species have increased and some studies concerning nutrition, larval rearing and its biochemical quality have been published (Roo et al., 2010). However, there are no studies about genetic variation determination of economic traits, as previous step to develop genetic selection schemes on meagre. Selection programs maximize the genetic response of different traits and farmers` benefits. However, there are few a selection schemes in fish in spite of their industrial production levels (Rye et al., 2010), where different traits are considered as selection goals (growth rate, carcass quality, sexual maturity, resistance disease, etc..). Growth rate is the most important trait in fish breeding programs, being studied in different species (Neira et al., 2004; Kolstad et al., 2006; Powell et al., 2008; Navarro et al., 2009a; Vandeputte et al., 2009; Saillant et al., 2009; Kuukka-Anttila et al., 2010; Nguyen et al., 2010; Kause et al., 2011). Growth rate is selected via weight at different ages, genetically correlated, allowing the possibility of early selection (O’Flynn et al., 1999), and increases the accuracy of selection indexes (Falconer and Mackay, 1996). Moreover, the aquaculture market demands imposes the estimation of genetic variation of some critic life stages during the rearing period. !!!!MICROSATELLITE!PCRs! ! ! 80! All the data were tested for normality and homogeneity of variances, and then analyzed by using a General Linear Model, in order to detect facility and tank fixed effects: The software was SPSS (v. 19.0) (SPSS, Chicago, IL, USA). Then, variance components for body weight, length, and condition factor were estimated by Restricted Maximum Likelihood (REML) according to the following linear model: y = Xβ + Zu + e Where y was the data recorded for the studied traits, β the fixed effect (tank) and u the random animal genetic effect. The model was resolved with the software package VCE (v. 6.2.0) (Kovač et al., 2002). The magnitude of the estimated heritability was established, according to the classification of Cardellino and Rovira (1987). !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!MICROSATELLITE!PCRs! ! 81! IV.4. Results IV.4.1. Multiplex PCRs In general allele assignment was easy to perform, specifically in the STRs multiplex. Only the UBA53 marker of the STRi multiplex was difficult to read due to its peak shape (Figure IV.1 and IV.2). Two small artifact peaks were detected in STRi multiplex, one in the blue line at 123 bp, and the other in the green line at 115 bp, but they do not interfere during genotyping process. Incompatibility and overlapping peaks between amplified alleles were not detected. IV.4.2. Genetic diversity parameters. The parameters of genetic diversity estimated as number and range of alleles, heterozygosity, exclusion probability and Hardy–Weinberg equilibrium test for each microsatellite marker, in both multiplex PCRs, are shown in the Table IV.1. The number of alleles in STRi and STRs multiplex ranged from 3 to 13, and the mean values of which were 6.6 for STRi and 7.6 for STRs. IRTA and wild group showed a higher mean number of allele (6.3 for STRs and 6.1 for STRi) than broodstock from ICCM (5.3 for STRs and 3.9 for STRi). STRi showed a mean expected heterozygosity of 0.61 and a combined exclusion probability (CEP) of 0.99. The highest heterozygosity of which was observed in CacMic14 locus, and the highest exclusion probability (EP) for UBA53 locus. In the STRs multiplex, mean expected heterozygosity and CEP were 0.60 and 0.99, respectively, with the highest heterozygosity and EP observed in GA2b locus. The mean values of polymorphic information content (PIC) were 0.56 for both multiplexes. For STRi, PIC values ranged between 0.24 (UBA853) and 0.79 (UBA53), while for STRs ranged between 0.25 (GCT15) and 0.83 (GA2b). !!!!MICROSATELLITE!PCRs! ! ! 82! Figure IV.1. Example of electropherogram for the inter-specific multiplex PCR (STRI). Figure IV.2. Example of electropherogram for the specific multiplex PCR (STRS). !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!MICROSATELLITE!PCRs! ! 83! Six loci in each multiplex were not in Hardy–Weinberg equilibrium, after the Bonferroni correction, and they had a high number of alleles. The theoretical frequencies of null alleles ranged from -0.14 (UBA6) to +0.17 (UBA54) (mean value 0.01) for STRi, and from -0.06 (GA2B) to 0.26 (GA16) (mean value -0.06) for STRs. The only locus where null alleles were detected by familial segregation in ICCM fish was UBA53 (with a real frequency of 0.19). The mean coancestry value among ICCM breeders was high (0.41), and ranged from 0.17 to 0.71 for each marker. IV.4.2. Parental assignment The pedigree reconstruction for breeders and descendants of ICCM fish was executed, and a low rate of parental assignment was achieved by using each multiplex PCR (12 % for STRi and 8.7 % for STRs) separately. Using both multiplex PCRs, 77.7 % of descendants was assigned to a single parental pair, 23.15% assigned to two pairs of potential parents and only 1.68% was not assigned. The same data showed that 22 dams and 21 sires, out of the 76 breeders, contributed to the spawn. A total of 44 full-sib families were represented in the 476 offspring sample. However, 423 descendents were used in the genetic analysis, 62 descendents with only one parent correctly assigned and 361 previously assigned to one parent pair. IV.4.2. Growth trait Growth rate was high during the first four months after tagging, and decreased considerably during winter period. Condition factor showed a decreasing tendency from 120 to 446 DPH (Table IV.2). !!!!MICROSATELLITE!PCRs! ! ! 84! TABLE IV.1. BODY WEIGHT. NUMBER OF ALLELES (K), ALLELE SIZE RANGE IN BP (RANGE), OBSERVED (HOBS), EXPECTED (HEXP) HETEROZYGOSITY, EXCLUSION PROBABILITY (EP) AND HARDY-WEINBERG EQUILIBRIUM TEST (HW) IN STRI AND STRS MULTIPLEX REACTIONS. !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!MICROSATELLITE!PCRs! ! 85! TABLE IV.1. BODY WEIGHT. NUMBER OF ALLELES (K), ALLELE SIZE RANGE IN BP (RANGE), OBSERVED (HOBS), EXPECTED (HEXP) HETEROZYGOSITY, EXCLUSION PROBABILITY (EP) AND HARDY-WEINBERG EQUILIBRIUM TEST (HW) IN STRI AND STRS MULTIPLEX REACTIONS (CONTINUATION). !!!!MICROSATELLITE!PCRs! ! ! 86! IV.4.2. Heritabilities and correlations Phenotypic correlation of weight between 446 DPH and different ages showed an increased correlation from 0.42 for 120 DPH to 0.78 for 296 DPH. The same tendency was detected with respect to different length correlation. However, genetic correlation between different weights and different lengths were high (> 0.75). Furthermore, phenotypic and genetic correlation between weight and length at each sampled point was high (> 0.88). Condition factors showed low phenotypic correlations with weight and length of its respective sampled points. This data contrast with the different genetic correlations reported in the Table IV.3. Heritabilities were low to moderate and ranged between 0.01 and 0,19. Higher heritabilities were observed in 296 and 446 DPH sampled points. Also, in the majority of cases, lower heritabilities were observed in condition factor respect to weight and length. TABLE IV.2. WEIGHT, LENGTH AND CONDITION FACTOR (K) FOR MEAGRE AT 4 DIFFERENT AGES FOR MEAGRE. DPH weight (g) length (cm) K (g cm-3) 120 14.31±7.38 10.00±1.57 1.36±0.17 150 29.14±0.52 12.98±1.73 1.27±0.17 296 190.69±75.64 24.85±3.52 1.17±0.09 446 583.98±180.71 37.04±4.3 1.11±0.12 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!MICROSATELITE!PCRs!! ! 87! TABLE IV.3. HERITABILITIES (IN THE DIAGONAL, WITH ±STANDARD ERROR) PHENOTYPIC CORRELATIONS (ABOVE THE DIAGONAL) AND GENETIC CORRELATIONS (IN ITALICS BELOW THE DIAGONAL, WITH ±STANDARD ERROR) BETWEEN BODY WEIGHT, FORK LENGTH AND CONDITION FACTOR (CF). !!!!MICROSATELLITE!PCRs! ! ! 88! IV.5. Discussion IV.5.1. Multiplex PCRs and genetic variation In this study, the cross-amplification of Scianidae family markers in multiplex PCRs showed that 71% of redesigned inter-specific microsatellites amplified in meagre and 53% of which were used in the STRi multiplex PCR. This data confirms that regions flanking microsatellite markers are conserved among these closely related species (Presa and Guyomard, 1996; Rogers et al., 2004). These results are in accordance with data published by Navarro et al. (2008), who redesigned two multiplex PCRs with interspecific microsatellites, the 85% of which successfully amplified in gilthead seabream, the 65% in redbanded seabream, and the 60% in red porgy. To reach a successful parental assignment at a low cost, we combined only half of the initial 36 redesigned microsatellites to construct the final multiplex assays. These data are comparable with results observed in brown trout, where 12 from 43 initial microsatellites were used (Lerceteau-Kohler and Weiss, 2006), and in Senegalese sole, where only five markers from 12 microsatellites were used in the multiplex Porta et al. (2006). Our multiplex assays included ten inter-specific microsatellites, and they are the first reported for meagre. In the majority of multiplex PCRs in fish, the mean number of markers is six (Delghandi et al., 2003; Porta et al., 2006; Lerceteau-Kohler and Weiss, 2006; Reanshwa et al., 2006; Johnson et al., 2007; Saillant et al., 2009; Gheyes et al., 2009), which is lower than the minimum number of markers included in each multiplex PCRs of this study. Regarding the fish groups studied, the high heterozygocity, PIC and number of alleles observed in the STRi and STRs multiplex PCRs, reveal an acceptable efficiency to assess genetic variability parameters in meagre. These data are consistent with those found in !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!MICROSATELITE!PCRs!! ! 89! broodstock of other aquaculture species (Launey et al., 2003; Brown et al., 2005; Navarro et al., 2008). The presence of a high number of markers in Hardy–Weinberg disequilibrium can be explained by the origin of both fish groups. In fact, the observed number of alleles and heterozygocity of the IRTA and wild groups were higher than the observed in the breeders of ICCM that were reared in captivity. Thus, Martínez-Rodríguez et al. (1998) observed a decreasing of polymorphism index up to 31% of heterozygocity in a seabass (Dicentrarchus labrax) broodstock coming from breeders reared in captivity. Similarly, Alarcón et al., (2004) observed a significant reduction in the number of alleles of genotyped microsatellites in farmed versus wild gilthead seabream. On the other hand, in the genetic characterization process, there are genotyping errors such as the incidence of null alleles due to mutations within a primer site (Wagner et al., 2006), which could be increased by using inter-specific markers (Primmer et al., 1995; Jarne and Lagoda, 1996; Navarro et al., 2008). In this study, the number of markers with positive theoretical frequency of null alleles was higher in the STRI multiplex than in STRS multiplex. In addition, this frequency was higher in markers with lower molecular weights. This can be explained by the differential amplification of size variant alleles (Wattier et al, 1998), due to the competitive nature of multiplex PCR, alleles of short length often amplify more efficiently than larger ones (Dakin and Avise, 2004). The presence of null alleles can produce a badly biased estimation of relatedness and parental assignments. Even when null alleles are at a low frequency, they can have a great impact. In fact, when the null allele detected in the UBA53 marker (STRI multiplex) was recognized and manually recoded, the parent assignment for this marker increased by 50%. ! !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!GROWTH!TRAITS!HERITABILITIES!! ! 97! V. Estimates of heritabilities and genetic correlations for growth and carcass traits in meagre (Argyrosomus regius), under industrial conditions V.1. Abstract In this study were estimated heritabilities and genetic correlation for and between morphologic traits (by using image analysis) and carcarss traits of commercial interest in meagre (Argyrosomus regius) cultured under industrial conditions and considering it is sold for weights higher than 1 kg. A total of 59 fullsib families from 25 males and 22 females of meagre were reared in different locations and under industrial conditions. For the first time heritabilities, phenotypic and genetic correlation for growth and carcass traits were estimated using 1185 fish from an industrial stock. Pedigrees were redrawn using two multiplex PCRs composed by 18 intra-specific and inter-specific microsatellites described by Soula et al. (2011). The heritability estimates at harvest were 0.22±0.12 for weight were, 0.19±0.11 for length, 0.09±0.08 for condition factor, 0.15±0.09 for fillet weight, 0.23±0.11 for gutted weight, low-medium for morphologic and cardio-respiratory traits. High and positive correlations between growth and carcass traits were observed. High and positive correlations were detected between growth and carcass traits versus morphologic traits analyzed by using MATLAB software. Additionally, a medium heritability of ventricular weight was observed (0.20±0.11). High and positive genetic correlations for the growth versus cardio-respiratory traits (ventricular and gill weights) were detected (> 0.9), while high and negative genetic correlations were estimated for growth traits versus both cardio-respiratory in percentage suggested correlated selection for the growth traits in this species. These data suggest that !!!!GROWTH!TRAITS!HERITABILITIES! ! ! 98! body weight and length can be improved by direct selection or indirect selection through morphologic traits by image process technique, due to the higher heritability of them. Furthermore, a positive and indirect selection of economic traits such as fillet weight and gutted body weight would be produced. Keywords: meagre, Argyrosomus regius, heritability, growth, carcass, morphologic, cardio-respiratory, image process. !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!GROWTH!TRAITS!HERITABILITIES!! ! 99! V.2. Introduction Nowadays, when the fragile economy forces factories to fight to escape from crisis, the continuity of aquaculture farms depends on getting the most profitability, so, they opt for different strategies, such as the use of advanced technologies and the introduction of new species (Fotedar and Philips, 2011). These two strategies aims are to get a rapid growth at the lowest cost, an acceptable morphology and a similar to wild fish or attractive colour. The rapid growth of meagre (Argyrosomus regius) makes that fish a potential alternative species for aquaculture diversity in the Mediterranean Sea (Pastor et al., 2002; Poli et al., 2003). The increases of meagre production during the last five years consolidate this alternative (APROMAR, 2011). Furthermore, the area of improvement of this specie is still very important, and many studies, including nutrition (Chatzifotis et al., 2010, Martínez-Llorens et al., 2011), reproduction and management (El-Shelby et al., 2007; Serezli et al., 2011), and breeding technique protocols (Roo et al., 2010) were developed. The domestication process is too important for the improvement and the increase of the production efficiency. Though, selective breeding can deliver a more remarkable gain and increase biological productivity (Fjalestad et al., 2003, Gjedrem and Baranski, 2008). In various species, results of selection response showed an increase of above 10% per generation (Gjedrem, 2000) and, most of these cases, growth traits improvement had been the initial focus. Moreover, meagre shows a good perspective in the processing industry due to the high percentage dressing and percentage fillet with respect to other aquaculture species (Poli et al., 2003, Grigorakis et al., 2011). To account for this potential future marketing strategy, !!!!GROWTH!TRAITS!HERITABILITIES! ! ! 100! it is necessary to evaluate the processed traits (gutted and fillet weights and percentages) in a selection program, as it has been previously realised in genetic studies of gilthead seabream (Navarro et al., 2009a), common carp (Kocour et al., 2007) and European whitefish (Kause et al., 2007). Furthermore, other traits like ventricular and gill weights may be estimated as they are closely related to growth traits. To ameliorate the hard and expensive technique involved for sampling methods, image analysis permits the recording of linear and area trait (dimensional measurements) of carcass in an objective and automated way, providing a fast and very reliable source of information for genetic improvement programs. This technique was successfully used in other animal breeding programs (Osawa et al., 2008; Rius-Vilarrasa et al., 2009, 2010). The estimation of genetic parameters can be especially difficult in fish species with a mass-spawning system and when individuals from all family are mixed in the same tanks to homogenize environmental conditions (Castro et al., 2008; Navarro et al., 2009a). Although the physical tag (Soula et al., 2009) and gene technology based on polymorphic microsatellites opens new opportunities to understand the nature of the genetic variation underlying production traits (Fjalestad et al., 2003). Combining physical tagging system and molecular marker, the aim of this study was to estimate heritabilities and genetic correlations for growth and carcass traits at harvest sizes from a commercial meagre broodstock, and to assess the usefulness of image analyses in genetic improvement. !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!GROWTH!TRAITS!HERITABILITIES!! ! 101! V.3. Materials and methods V.3.1. Breeding conditions and traits In May 2006, a stock of 140 meagre was acquired from an offshore farm located on the island of Tenerife (Canary Islands, Spain), then, they were transferred to facilities of the Instituto Canario de Ciencias Marinas (ICCM) (Gran Canaria, Canary Islands). Fishes were kept in 10 m3 tanks. Once acclimatized, on July 2006, fishes were identified with a microchip. Fish were fed a ration of 1% of their biomass, with a commercial diet (Proaqua S.A., 10 mm). In April 2008, 76 breeders were induced with 15 µg.kg-1 GnRH dose. Eggs from mass spawn were collected and larval rearing was conducted at ICCM in mesocosm facilities, following the protocol that had been previously predefined by Roo et al. (2010). At 150 days fingerlings were divided in three lots distributed in different sites in the offshore farm of the company Canarias de Explotaciones Marinas S.L. (CANEXMAR), in the up-growing installations of the company Alevines y Doradas S.A (ADSA) and 1000 fish in the facilities of ICCM. These fish were tagged with Passive Integrated Transponder (PIT) and reared until 446 days, sacrifice date. During this period, the density ranged between 6 and 13 kg/m3. Throughout the culture facilities, ICCM fish have been fed with Ecolife feed from Proaqua S.A. and following the table of that company with a variation of feed rate between 1.4 and 3% of the biomass. The stock was fed three times per day. At harvest size (446 days post-hatch), 477 fish from ICCM (477 fish), and samples from CANEXMAR (310 fish) and from ADSA (400 fish) were slaughtered. Digital photos were taken and some morphologic traits (Max head width, fin width, max dorsal !!!!GROWTH!TRAITS!HERITABILITIES! ! ! 102! width, max fillet width, max width, dorsal area, fillet area, total area, head length, dorsal length, fillet length and total length) were analyzed with MATLAB software (Figure V.1). Body weight, fork length and gutted body weight were measured. Fish were manually skinned and filleted without including the nape and the belly flap. Heart and gills were weighed. Both fillets were weighed together. Derived traits were also calculated as follows: condition factor (K) (100 x body weight x fork length−3), dressing percentage (100 x gutted body weight x body weight−1), fillet percentage (100 x fillet weight x body weight−1), heart percentage (100 x heart weight x body weight−1) and gills percentage (100 x gills weight x body weight−1). V.3.2. Genotyping and parental assignment 1185 offspring and 76 breeders were genetically characterized using 18 microsatellites markers designed in two multiplexes. A fragment of the caudal fin was preserved in 1 ml of absolute ethanol until DNA extractions. DNA was extracted by following the phenolchloroform method (Sambrook et al., 1989). DNA was stored at 4°C in 50 µl of TE 1X solution. Amplification, running and reading conditions for the microsatellite markers are described in Soula et al. (2011). Familial assignments for meagre broodstock of unknown gender were determined by the exclusion method using a non-commercial software provided by Vandeputte et al. (2006). V.3.2. Statistical model All data were tested for normality and homogeneity of variances, and analyzed using a General Linear Model, in order to detect the effects of facility and tank, using SPSS (v. 19.0) (SPSS, Chicago, IL, USA). Subsequently, variance components for body weight, fork length, condition factor, gutted body weight, fillet weight, dressing percentage, fillet !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!GROWTH!TRAITS!HERITABILITIES!! ! 103! percentage, heart weight, percentage and gill weight were estimated by Restricted Maximum Likelihood (REML) according to the following linear model: y = Xβ + Zu + e where y was the data recorded for the studied traits, β the fixed effects (facility and tank) and u the random animal genetic effect. The model was resolved with the software package VCE (v. 6.2.0) (Kovač et al., 2002). The magnitude of estimated heritability was established according to the classification of Cardellino and Rovira (1987). ! ! ! Figure V.1. Analyzed image traits for meagre (Argyrosomus regius) total area (1), total length (2a), dorsal length (2b), max dorsal width (3a), max width (3b), fin width (4), head-fin length (5), max head width (6), area fillet (7), standard length (8), max fillet length (9) and dorsal area (10). 2!a! 3a! 6! 4! 8! 9! 5! 2b! 3b! 10! 1! 7! !!!!GROWTH!TRAITS!HERITABILITIES! ! ! 104! V.4. Results V.4.1. Pedigree reconstruction In the parental assignment, using the exclusion method with no tolerated error parentage, the application of the two multiplex PCRs assigned 82.8% of descendants to single pair parents. The results showed the existence of 59 full-sib families, with 16.5 descendants per family and the contribution of 22 dams and 25 sires for the totality of the assigned fish. Among the 1185 offspring, 975 were assigned to a single parent pair, and 102 were assigned to several parental pairs. From this group, 95 unique parents were recovered for the analysis, so 1070 fishes were used to get estimates in VCE program. V.4.2. Growth and carcass traits Statistical differences in body weight, length, gutted weight and fillet weight, at harvest age, were found among the three facilities, being observed higher data in CANEXMAR (Table V.1). Condition factor was the only parameter that did not show any statistically significant difference among facilities. . Concerning morphologic traits, the total mean of total area, total length, max width, and filet area were 299.93±73.5, 41.53±5.11, 10.19±1.99 and 211.28±53, respectively. As expected, a significant statistical difference was stuck out in all of morphological data, thus, supporting the growth superiority aspect of CANEXMAR fish. All data of image traits are resumed in Table V.2. !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!GROWTH!TRAITS!HERITABILITIES!! ! 105! TABLE V.1. GROWTH AND CARCASS TRAITS (MEAN ± STANDARD DEVIATION) IN THE THREE FACILITIES FOR ON-GROWING MEAGRE. Trait ICCM ADSA CANEXMAR Body weight (g) 583.98±8.27a 817.33±10.42b 1105.53±18.39c Body length (cm) 37.04±0.19a 40.9±0.18b 45.68±0.29c Condition factor (g/cm3) 1.11±0.00 1.17±0.00 1.16±0.04 Gutted body weight (g) 519.9±7.34a 729.38±9.48b 970.78±14.39c Fillet weight (g) 219.53±3.48a 342.09±5.19b 436.25±7.94c Dressing percentage (%) 89.05±0.08 89.41±0.26 88.38±0.37 Fillet percentage (%) 37.23±0.15a 41.54±0.21c 39.37±0.21b Value within each row not sharing the same letter are significantly different (P<0.05). V.4.2. Heritabilities and correlations for growth and carcass traits All correlations and heritabilities are resumed in Table V.3. Heritabilities of weight, length, fillet weight and gutted weight were medium (ranged 0.15-0.23; Table 11). On the contrary, heritabilities of the condition factor, dressing percentage and fillet percentage were very low (less 0.09). As expected, the higher heritability for sampled data was observed in gutted weight and in body weight. The lower heritability was detected in fillet %. In general, heritabilities were moderate for morphologic traits and higher (0.14 and 0.26) than growth traits, except for dorsal length (0.08). !!!!GROWTH!TRAITS!HERITABILITIES! ! ! 112! V.5. Discussion V.5.2. Pedigree reconstruction The inclusion of microsatellite multiplex PCRs in a breeding program is a good solution to reduce the time and cost which are associated with molecular analysis. In fact, multiplex PCRs reduce samples number to be manipulated and errors risks (Delghandi et al., 2003; Porta et al., 2006; Navarro et al., 2008, Borrell et al., 2011). The use of two multiplex PCRs meagre interand intra-specific permits to assign each offspring to a single parent pair in a 82.8% of cases. The number of families that is established in this study is within the range that others studies of fish selection breeding programs (Gjerde et al., 2004; Kolstad et al., 2006; Castro et al., 2008; Navarro et al., 2009a; Kause et al., 2011). Furthermore, the contribution of a higher number of sires and dams provides a higher power and better quality results to our genetic variable evaluations. V.5.3. Phenotypic growth parameters Meagre reach a commercial weight of 800-1000 g at 430-500 DPH depending of breeding system and conditions (Muñoz et al., 2008; Cárdenas, 2010). In this study, fish attained this weight range at 446 DPH, showing significant differences in all growth traits and image analyzed traits among the three facilities. Being observed, higher growth parameters in fish reared offshore, which can be explained by the installation nature of the facilities. In fact, Pastor et al. (2002) observed a higher growth rate for meagre reared in offshore installations respect to tank one. Chatzifotis et al. (2010), in a nutritional study, detected a low growth for meagre in tanks. This discrepancy may be due to stress caused by the maladaptive process and to the dynamic nature of meagre (Jiménez et al., 2005). !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!GROWTH!TRAITS!HERITABILITIES!! ! 113! The mean of dressing rate described was similar to that observed by Grigorakis et al. (2011) and slightly lower than the described in meagre with the same weight profile (93.4% and 94.4%, respectively) (Poli et al., 2003; Piccolo et al.,2008). Furthermore, fillet rate, without skin, was higher rate than the observed by Poli et al. (2003) (34.6 %) and lower than the reported by Piccolo et al. (2008) and Grigorakis et al. (2011) (50% and 42 %, respectively) in meagre fillet with skin. This difference can be attributed to fish morphology, the method and material used during the process, and the staff filleting experience. Rutten et al. (2005) affirmed that the filleting method was probably the most likely cause for the increased fillet yield. When comparing dressing and fillet rates of this study with other aquaculture species such us sea bass (Poli et al., 2001) (89.4 and 36.8%, respectively) and gilthead sea bream (Navarro et al., 2009a) (92% and 35%, respectively) we suggest that meagre had a great potential to be commercialized as a fillet product due to its high fillet rate and volume at commercial weight respect to other species. These data corroborate the economic interests of both traits and the necessity of genetic estimations of fillet and gutted traits. V.5.2. Heritabilities and correlations In the present study, heritabilities for growth and carcass traits in meagre have been estimated. It is widely known that selective breeding exploits the substantial genetic variation available for the majority of desirable quality traits (Gjedrem and Baranski, 2008). This variation has been associated with economic traits like growth, flesh colour and disease resistance to improve the selection response in future generation. In this way, heritability estimation is necessary to know the selection response and can be used to establish and to improve meagre breeding programs. !!!!GROWTH!TRAITS!HERITABILITIES! ! ! 114! The growth traits heritabilities detected, especially in body weight and gutted weight, were the higher as those estimated by other authors in aquaculture species (Gjerde et al., 2004; Dupont-Nivet et al., 2008; Vandeputte et al., 2009; Navarro et al., 2009a; Kause et al., 2011). Body weight heritabilities in the present study are in the usual range described in other species such as common carp (Cyprinus carpio) or Atlantic salmon (Salmo salar) (0.21-0,44) (Gjedrem, 2000; Kocour et al., 2007) and in sea bass (Dicentrarchus labrax) (0.24-0.44) (Saillant et al., 2006; Dupont-Nivet et al., 2008). The obtained heritability values were within the range of 0.2 and 0.3, suggesting the possibility of large response and a rapid gain, which could be achieved via direct selection (Gjedrem, 2000). As expected, a high positive phenotypic and genetic correlation was observed between length and weight. These two traits are usually highly correlated (Dupont-Nivet et al., 2008; Navarro et al., 2009a; Saillant et al., 2009; Vandeputte et al., 2009; Kause et al., 2011). Furthermore, heritability was quite similar sustaining the possibility to use one of the two traits in the selection breeding scheme. Providing that neither of them could negatively affect other carcasses nor quality trait, like in sea bass, where both traits genetic correlations with factor condition were different, and selection based in these traits is not equivalent (Dupont-Nivet et al., 2008). At the present study, weight and length had a same moderate genetic correlation with the factor condition. However, phenotypic correlations were low and different. This can be explained by the specificity of the condition factors, which is representative of each species and can be varied within species, affected by fish morphology, maturity, age and environment (Navarro et al., 2009a). In addition, heritability was low (0.09) and similar to that previously observed in other species, (0.1) by Saillant et al. (2009) in sea bass and 0.13 by Navarro et al. (2009a) in gilthead sea bream. In other studies, condition factors were higher and ranged from !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!GROWTH!TRAITS!HERITABILITIES!! ! 115! 0.34 to 0.36 in seabass (Dupont-Nivet et al., 2008), from 0.47 to 0.65 in the rainbow trout (Kuukka-Anttila et al., 2010) and 0.49 in the european whitefish (Kause et al., 2011). In this work, growth traits had a high phenotypic and genetic correlation estimates with fillet weight. This correlation is typically highly positive in fish and is beneficial because fillet weight is economically the most valuable part in processed fish (Kause et al., 2007; Navarro et al., 2009b; Nguyen et al., 2010; Kause et al., 2011). Also, the heritability of fillet weight are moderate in meagre, which, taken together with the high genetic correlation with body weight, increased the probability to indirectly selection this trait via recorded harvest weight. However, in appearance, fillet percentage has low and negative genetic correlations with harvest weight, in accordance with estimations in gilthead seabream (Navarro et al., 2009a). This data suggests that fillet percentage improvement via growth selection may be difficult (Kause et al., 2007; Nguyen et al., 2010) and that it is less relevant (Rutten et al., 2005), but its inclusion in breeding program is recommended (Navarro et al., 2009a). The higher genetic and phenotypic correlations estimates of image traits with growth traits and the similar heritabilities estimated between both, confirm that image technology analysis could be a fast and no-invasive solution to substitute the hard and expensive collection data. Moreover, image analysis could provide a very accurate description of the body at a reasonable cost, even before slaughter. Also, it is a first step to use the image like a supporting technique to develop a selection breeding program in meagre; as it has been proposed for some species (Osawa et al., 2008, Rius-Vilarrasa et al., 2009, 2010) and for quality traits in rainbow trout (Kause et al., 2008). Furthermore, it is important to described, and validated, an image analysis method for recording traits, so that it can be used in the future like a substitute of standardly sampled traits. In meagre, total and fillet !!!!GROWTH!TRAITS!HERITABILITIES! ! ! 116! areas seem to be the two traits with the highest and similar heritabilities with the different sampled weights, and could be the legitimate substitute of these traits. Total length may be the analyzed trait, and can substitute the length in the same sense. Additionally, genetic selection can be executed with more success on traits highly heritable, such us max.-width and doral area versus weight and length. V.5.3. Cardio-respiratory heritabilities and correlations Study analyzing the morphologic relation between heart and gill are scared in scianedae fish (Fitzgibbon et al., 2007), and no existent in meagre. However, there is an affirmation that both have a common interaction point; the use and distribution of the oxygen throughout the fish organs (Brodeur et al., 2001). Growth, which is an energetically demanding process, depends on the availability of oxygen (Blier and Pelletier, 1997), so besides being related to the gill it also influences the cardiac activity (Millidine et al., 2008). The high phenotypic and genetic correlation that has been observed between heart and gill weight, and between both respect to fish weight and length, corroborate this theory. Moreover, these correlations associate the compensatory variation on heart (Goolish and Adelman, 1987) and gill weight (Hughes, 1972; Fernandes et al., 1994; Severi et al., 1997; Mazon et al., 1998) to the adaptation to a growth variation. However, the negative correlation between the of the cardio-respiratory traits percentage with the harvest weight shows that this adaptation is limited and that body weight increase is higher than gill and ventricular weight increases.The moderate heritability observed for ventricular weight, and the high genetic correlation with growth traits shows that a ventricular weight can be selected by indirect selection, especially because cardio-respiratory traits need sacrificing the fish, when, in addition, gill weight !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!GROWTH!TRAITS!HERITABILITIES!! ! 117! and ventricular and gill rates have low heritability, and, under these circumstances, are difficut to be selected by direct selection. V.6. Conclusion This study shows for the first time, the potential use of growth and carcass traits as tools for the improvement of meagre industrial production, once obtained some genetic parameter estimates tools in improvement for meagre knows the genetic parameter estimates (heritabilites and genetic and phenotypic correlations). Body weight as a parameter seems to be a direct way to improve productions and an indirect via to control other economic traits, such as fillet weight and gutted body weight. Furthermore, this work establishes a way to substitute the hard and expensive standard sampling fish method with image analysis process, the efficiency of which has been proved in the evaluation of the carcass traits. V.7. Acknowledgement Authors thank the help and the effort of all members of Grupo de Investigación en Acuiculturafor help during sampling days especially for Silvia H, Guaci, Manola, Ada, Fefy, Ivon, Alex, Silvia T, Juan, Tibi, Monica, Fran, Fatima, Islam and Dailos. A special thank to ICCM, CANEXMAR and ADSA Company and Staff for their help during the on-growing period. This study has been supported by project of the Canary Government (PI 2007/052) and a doctoral grant from he Agencia Española de Cooperacion Internacional (AECID). !!!!GROWTH!TRAITS!HERITABILITIES! ! ! 118! ! ! ! ! ! !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!QUALITY!TRAITS!HERITABILITIES!! ! 121! VI. Estimates of genetic and phenotypic parameters for body composition and quality traits in meagre (Argyrosomus regius). VI.1. Abstract Heritabilities, phenotypic and genetic correlations for growth traits and flesh quality traits (ash, moisture, flesh fat percentage, visceral fat weigh and percentage, Hue and collagen) were estimated in meagre (Argyrosomus regius). This study is carried out using 1183 fish from an industrial stock reared in three different facilities and constituted by 59 families that were produced by mass mating (25 sires plus 22 dams). Parental assignment was provided using two multiplex PCRs to do a screening of 18 microsatellites (Soula et al., 2011). The heritability estimates for quality traits were low or moderate and ranged from 0.00 to 0.27. Heritability estimates for ash (0.04±0.06), moisture (0.08±0.07), flesh fat percentage (0.02±0.02), skin color (Hue) (0.05±0.05) and collagen (0.00±0.01) were low. Heritability estimates for visceral fat weight (0.27±0.12) and visceral fat percentage (0.22±0.09) were medium. The genetic correlation between body weight and moisture was moderate negative and ash was high positively correlated with meat color. Furthermore, there were high and positive genetic correlations between body weight versus visceral fat weight and flesh fat percentage. Between quality traits, negative correlations were detected between visceral fat versus ash, moisture and collagen, such us flesh fat versus moisture and collagen. Also, high positive correlation of visceral fat weight and visceral percentage with gutted weight were observed. Meat color, evaluated like Hue parameter showed a moderate to high negative