Métodos de software libre para el análisis de imágenes biológicas

T R A B A J O F I N D E G R A D O Julián Román Camacho Tutor: Luis María Escudero Cuadrado Métodos de software libre para el análisis de imágenes biológicas Facultad de Biología Julio de 2023 Departamento de Biología Celular Índice 0. Resumen ............................................................................................................................. 1 1. Introducción ....................................................................................................................... 1 1.1. Historia y evolución del análisis de imágenes biológicas ............................................... 1 1.2. Concepto del análisis de imágenes digitales en biología ................................................ 2 1.3. Concepto de software para el análisis de imágenes ........................................................ 2 2. Análisis de imágenes en biología ....................................................................................... 3 2.1. Características del análisis de imágenes digitales ........................................................... 3 2.2. Usos del análisis de imágenes en biología ...................................................................... 6 2.3. Pasos para el análisis de una imagen biológica ............................................................... 8 2.3.1. Adquisición .............................................................................................................. 8 2.3.2. Procesamiento .......................................................................................................... 8 2.3.3. Segmentación ........................................................................................................... 9 2.3.4. Cuantificación ........................................................................................................ 10 3. Software libre para el análisis de imágenes biológicas .................................................... 10 3.1. Fiji ................................................................................................................................. 10 3.2. Funcionamiento de Fiji ................................................................................................. 12 3.2.1. Flujo de trabajo de un análisis en Fiji. ................................................................... 16 3.3. CellProfiler .................................................................................................................... 17 3.4. Funcionamiento de CellProfiler .................................................................................... 17 3.4.1. Flujo de trabajo de una pipeline en CellProfiler .................................................... 20 3.5. Comparativa entre Fiji y CellProfiler ........................................................................... 21 4. Ventajas y desventajas del software de uso libre respecto al software de propietarios ... 25 5. Conclusión ........................................................................................................................ 27 6. Referencias bibliográficas ................................................................................................ 28 1 MÉTODOS DE SOFTWARE LIBRE PARA EL ANÁLISIS DE IMÁGENES BIOLÓGICAS 0. Resumen Hoy en día, los métodos computacionales son indispensables para el análisis de imágenes biológicas. Gracias a ellos, es posible estudiar la información derivada de las imágenes de microscopía de muestras biológicas de una forma objetiva. En las últimas décadas, han surgido diferentes tecnologías que enriquecen y fomentan el desarrollo de este campo de investigación. En esta memoria, se presentarán algunos de los procesos clave que conforman el análisis de imagen en biología, sus características y su finalidad, centrándose en dos de los programas de libre acceso con mayor prestigio, Fiji y CellProfiler. Así, este trabajo podrá contribuir a obtener un mayor conocimiento tanto del funcionamiento general del análisis de imagen, como del manejo y la aplicabilidad que presentan ambos programas, justificando así el reconocimiento que han obtenido este tipo de programas por parte de la comunidad científica. 1. Introducción 1.1. Historia y evolución del análisis de imágenes biológicas Desde tiempos inmemoriales, el ser humano ha sentido la necesidad de explorar y descubrir cómo funciona su alrededor, es decir, cómo funciona la vida. El entorno visto a simple vista fue descrito para tratar de entender el complejo sistema donde vivimos, pero el ojo humano no tenía la capacidad suficiente para poder visualizar todo lo que le rodeaba. Debido a esto, surgieron diferentes instrumentos de observación, tanto a larga distancia como el telescopio y a corta distancia como el microscopio, convirtiéndose este último en una herramienta fundamental desde el siglo XVII para el descubrimiento y la comprensión de la biología, por su virtud para observar estructuras y organismos a tamaños muy por debajo de los 0,2 mm de resolución del ojo humano (Hogg, 1883; Swedlow et al., 2009). Como menciona en su artículo Lane (2015), Antonie van Leeuwenhoek es considerado uno de los primeros pioneros en investigación microscópica, ya que con su microscopio simple de una lente determinó manualmente muchos microorganismos, como bacterias y protozoos nunca antes vistos (Hogg, 1883; Lane, 2015). Las técnicas de óptica siguieron evolucionando dando lugar a nuevos tipos de microscopios como el compuesto, el electrónico, el de fluorescencia o el confocal, sin embargo, la capacidad de los científicos de interpretar y analizar el volumen y la complejidad 2 de los datos era limitada. Por esta razón, alrededor de la década de los 60-70 surgen los primeros programas específicos para analizar imágenes (Gonzalez & Woods, 2018; Mansfield & Pykett, 1978), unas herramientas digitales que resultaron en una mejora de la automatización, velocidad y precisión de los procesos biológicos estudiados (Eliceiri et al., 2012). 1.2. Concepto del análisis de imágenes digitales en biología El análisis de imágenes digitales tiene un significado amplio, por lo que se ha adaptado la definición de González & Woods (2018), esta expone que es un proceso de descubrimiento, identificación y comprensión de patrones que son relevantes para obtener datos para un estudio a partir de imágenes. El objetivo de este análisis en biología es extraer información cuantitativa y cualitativa de las imágenes obtenidas, para conocer mejor los procesos biológicos y conseguir descubrimientos científicos significativos (Campa Fernández, 2016; González & Woods, 2018). 1.3. Concepto de software para el análisis de imágenes Un software no es más que un conjunto de programas de ordenador que tiene asociado una información que contrasta para realizar un trabajo, en este caso, sirve para el análisis de imágenes (Real Academia Española, s.f.). Normalmente, existen dos tipos de software según el tipo de licencia, que es un acuerdo legal entre el titular de los derechos de autor del software y el usuario, que contiene información sobre los permisos y condiciones de uso del programa. Hay softwares de propietarios o privados y softwares de uso libre. Los softwares de propietarios, son desarrollados con el fin de obtener ganancias y poseen un código fuente protegido para evitar su distribución de manera ilegal. Por otro lado, los softwares de uso libre, son aquellos que se distribuyen de manera gratuita para los usuarios en la red puesto que su código no tiene restricciones (Eliceiri et al., 2012; Solomon, 2009). Las libertades básicas para considerar un software libre son: la capacidad de ejecutar, copiar, distribuir y modificar dicho software (Solomon, 2009). Estos programas se basan en el uso de scripts y macros, los scripts son los diferentes lenguajes de programación que existen como Java, Python y R. Los macros por otra parte, son la secuencia de comandos que se escriben para automatizar tareas repetitivas (Dobson et al., 2021). Muchos de los programas de uso libre tienen un añadido que es el uso de complementos o plugins, son una serie de modificaciones al programa para ampliar su función sin necesidad de modificar el código original del programa (Schindelin et al., 2012). 3 2. Análisis de imágenes en biología Aunque este trabajo se centra en los softwares específicos para analizar imágenes, se abordarán brevemente algunas características importantes del análisis de imagen, la utilidad que tienen hoy en día y se explicarán cuatro pasos generales para analizar una imagen digital. Antes que nada, es importante conocer el término imagen digital tal y como lo definen González & Woods (2018). Una imagen digital es una representación visual de una función bidimensional, ƒ (x,y), donde x e y son coordenadas espaciales y la amplitud de ƒ son los distintos valores de intensidad de la imagen. Estos valores deben ser finitos y discretos. (González & Woods, 2018). 2.1. Características del análisis de imágenes digitales Formato de la imagen El formato es el tipo de archivo digital que se utiliza para guardar una imagen, los formatos más recomendables en ciencia son aquellos que tienen compresión sin pérdida, esto significa que el tamaño del archivo no se reduce y los datos almacenados permanecen intactos, algunos formatos usuales son TIFF, PNG y BMP, el único inconveniente es que ocupan más espacio en el ordenador. Por otro lado, el formato compresión con pérdida, como los archivos JPEG o GIF, descartan información de la imagen para reducir su tamaño, esto puede resultar perjudicial debido a que se podría perder alguna información valiosa (Campa Fernández, 2016; Roeder et al., 2012). Píxeles y vóxeles Las imágenes digitales están constituidas principalmente por píxeles, un píxel, según la definición adaptada de Roeder et al. (2012), es la menor unidad homogénea en dos dimensiones (2D) que forma parte de una imagen digital, mientras que un vóxel, es la unidad tridimensional (3D) de la que se compone un volumen digital. Ambos tienen una posición definida en el espacio y valores de intensidad de color asociados (Roeder et al., 2012). Figura 1: en la imagen A se muestran los píxeles de una imagen del capullo de una flor, mientras que en la imagen B, es una representación 3D de la imagen A, donde se muestra un esquema de un vóxel. Fuente: adaptada de Roeder et al. (2012). 4 Stack Un stack es un conjunto de imágenes o fragmentos en dos dimensiones, normalmente ancho (x) y alto (y) de una única muestra biológica que se unen para formar una imagen tridimensional, añadiendo una nueva dimensión que puede ser la profundidad (z), el tiempo (t) o el color (ch) (Roeder et al., 2012). Esta construcción tridimensional permite mejorar la precisión del análisis visualizando características que en dos dimensiones no se aprecian. El stack permite trabajar individualmente con los diferentes planos en el espacio en un intervalo preciso con un valor z de profundidad asignado a cada imagen (Portiansky, 2018). Tipos de imágenes y profundidad de bits Existen tanto imágenes en escala de grises como a color. En la escala de grises, cada píxel representa un valor numérico asociado a la intensidad del color gris correspondiente. Frecuentemente, se utiliza el sistema de 8 bits, que sigue la regla matemática 2n, con 8 bits hay 28=256 intensidades de gris que se traducen en el valor 0 negro (sin intensidad), el valor 255 blanco (máxima intensidad) y los valores intermedios diferentes tonalidades de grises. Mientras más bits tenga la imagen se podrá distinguir una mejor definición de los colores, a esto se llama profundidad de bits (Jiang et al., 2015; Portiansky, 2018; Roeder et al., 2012). Figura 2: a la izquierda se muestra un esquema que muestra las diferencias de intensidad según la profundidad de bits y a la derecha una imagen de 8 bits donde se aprecian diferentes intensidades de gris. Fuente: elaboración propia a partir de Fiji. En el manejo de imágenes a color predomina el sistema RGB (Red, Green, Blue), que permite obtener cualquier color por la combinación de los tres colores primarios rojo, verde y 5 azul. Los canales son las diferentes capas de información que conforman una imagen. Mientras que en la escala de grises solo hay un canal que representa la intensidad de luz, las imágenes RGB utilizan tres canales asociados a un color primario cada uno y utilizan una codificación de al menos 24 bits, lo que significa que se asignan 8 bits a cada canal y esto se traduce en 256 tonalidades de colores diferentes por la mezcla de los tres primarios (Figura 3-A) (Portiansky, 2018). Al separar matemáticamente extrayendo el valor expresado en cada uno de los píxeles se obtienen tres imágenes monocromáticas correspondientes a cada canal (Figura 3-B). El sistema RGB es muy utilizado en imágenes multicanales, para poder etiquetar cada canal y estudiarlo por separado o tenerlo organizado y visualizarlo todo en una misma imagen, además el propio color sirve para destacar y diferenciar zonas de interés (Tsai et al., 2011). También existen otros sistemas de color como el CYMK (cyan, yellow, magenta, key) o el HSL (hue, saturation, lightness) (Jiang et al., 2015; Campa Fernández, 2016). Figura 3: la imagen A es una representación del color según el sistema RGB de 8 bits. La imagen B muestra una separación de cada uno de los canales RGB. R: rojo; G: verde; B: azul. Fuente: imagen 3-A elaboración propia. Imagen 3-B adaptada de Portiansky (2018). Resolución La resolución en el área del análisis digital se refiere a la cantidad de píxeles por unidad de longitud, es decir, la relación entre el tamaño de píxeles de una imagen y sus dimensiones físicas. Mientras más cantidad de píxeles tenga una imagen mayor será su resolución y por ende estará más definida. La resolución puede determinar la distancia mínima en la que se pueden diferenciar dos puntos, fundamental a la hora de identificar y delimitar objetos de interés en una muestra (Portiansky, 2018). 6 2.2. Usos del análisis de imágenes en biología En ciencia se cuenta con una amplia variedad de programas de análisis de imagen que brindan soluciones especializadas a una gran diversidad de disciplinas. En este caso, el enfoque se centrará en las aplicaciones generales en biología. Los programas de análisis de imagen normalmente incluyen una serie de herramientas de edición y procesamiento de imágenes, que serán explicadas en el siguiente apartado. Pero resumidamente, el propósito de ambos tipos de métodos es mejorar la calidad de la imagen y/o facilitar el estudio de acorde a lo que se quiere (Campa Fernández, 2016; Roeder et al., 2012). En biología, estos análisis sirven para estudiar muchos elementos y estructuras que van según su complejidad desde moléculas como proteínas y ácidos nucleicos hasta células, tejidos, órganos y organismos. Se pueden realizar análisis cuantitativos individuales o a gran escala, en los que se estudian diversos fenómenos como la localización, forma, tamaño, patrones, densidad, complejidad, organización, conteo, intensidad de la señal (Peng, 2008), es decir, una gran cantidad de procesos que se basan en comprender la morfología, detectar cambios en esta y ver cómo afecta a un proceso (Carpenter et al., 2012; González Bardeci et al., 2017). Además, permiten estudiar los procesos biológicos celulares en diferentes contextos experimentales ya sea in vivo, in vitro, in situ o ex vivo. Uno de los objetivos principales de estos análisis es examinar cualquier característica o rasgo observable de un organismo para determinar la función de los genes, señalizar vías celulares y proporcionar información detallada de las características celulares para ver su estado, y si presentan alguna enfermedad o se puede mejorar su función desarrollando así tratamientos más efectivos (Peng, 2008; Swedlow et al., 2009). Saber cómo interaccionan los distintos elementos biológicos entre sí, es una parte crucial del estudio, por ejemplo, células y moléculas entre sí, o proteínas con otras proteínas, esto muestra cómo funcionan las relaciones internas de los organismos y cómo se coordinan sus funciones (Eliceiri et al., 2012). Las células, tejidos y órganos de un organismo están en continuo movimiento y cambio, a esto se le conoce como dinámica celular y es muy útil para estudiar procesos vitales como la embriogénesis, la respuesta inmune, la migración, la proliferación celular o la regeneración de tejidos entre otros muchos procesos (González Bardeci et al., 2017; Peng, 2008). Un gran número de estos procedimientos dinámicos se pueden seguir en tiempo real mediante diferentes técnicas de microscopía, como el uso de marcadores con sondas fluorescentes específicas en nuestra región de interés para hacer un seguimiento de la vida de una célula, viendo como interacciona con el medio que le rodea, su crecimiento, su división y 7 su muerte (González Bardeci et al., 2017). Las imágenes normalmente están en una superficie plana (2D), pero para un mejor entendimiento estas pueden pasar a tener una dimensión tridimensional (3D) a la que se le añade profundidad, una dimensión temporal (4D) para ver los cambios en el tiempo, e incluso ampliar a una quinta dimensión (5D) que representa información adicional, como propiedades espectrales, características morfológicas, información contextual o información multimodal (Peng et al., 2014). La comprensión de las estructuras biológicas mejora mucho al tener más dimensiones y permite realizar análisis más sofisticados y precisos de patrones espaciales, que, en dos dimensiones no se pueden apreciar. Por otra parte, estos programas son fundamentales para el estudio y creación de atlas de organismos modelos, donde se encuentra una gran cantidad de información biológica de un organismo, un ejemplo de esto es el Allen Brain Atlas, que se centra en la organización y actividad del cerebro de humano y del ratón de laboratorio (Mus musculus) (Lein et al., 2007). En cuanto a los procesos de cuantificación y medición, estos utilizan diferentes algoritmos estadísticos y matemáticos incluidos en los programas para obtener información precisa y detallada de las muestras biológicas, que, sumado a herramientas de representación gráfica, permiten visualizar los datos adquiridos de diversas formas como histogramas, gráficos de barras y de líneas (Schroeder et al., 2021). Los datos se guardan para su posterior interpretación, comparación y resolución. Para finalizar, es conveniente destacar una disciplina recientemente emergente en este ámbito llamada machine learning, es un enfoque de la inteligencia artificial en el que se desarrollan algoritmos y modelos que pueden aprender y tomar decisiones usando datos y experiencias pasadas de otros análisis sin estar explícitamente programados. Ya se ha aplicado exitosamente a muchas tareas como la clasificación, segmentación, detección, reconocimiento de patrones y se sigue desarrollando para poder llevar a cabo análisis más complejos. El deep learning va un paso más allá, es un subcampo del machine learning basado en crear redes neuronales, similares a las de un cerebro humano, con capas de nodos interconectadas denominadas como neuronas artificiales para extraer características directamente de los datos, resultando en un rendimiento y capacidad aprendizaje mucho mayor que con los métodos de programación tradicionales (Rabbi et al., 2022). Toda esta plétora de opciones y muchas más, complementan la investigación de los biólogos (Carpenter et al., 2012; Peng, 2008; Roeder et al., 2012; Schneider et al., 2012; Schroeder et al., 2021; Swedlow et al., 2009). 14 están algunas de las herramientas ya mencionadas para modificar el ruido, el suavizado y múltiples filtros que cambian diversos aspectos de la imagen. El próximo menú y uno de los más importantes es “Analyze”, ya que contiene herramientas más dedicadas al análisis de imágenes, a continuación, se van a exponer algunas de sus opciones. La primera herramienta es “Measure”, su función es mostrar en una tabla de resultados las medidas de un área seleccionada o de la imagen completa. Otra opción disponible es “Analyze Particle”, permite contar y medir objetos de interés en imágenes binarias o umbralizadas y “Summarize”, calcula parámetros numéricos como la media, la desviación estándar, el máximo y mínimo del conjunto seleccionado. A partir de estos datos es posible generar gráficos como histogramas que representan la distribución de intensidad de píxeles en una imagen dándonos información sobre el brillo, el contraste, la saturación, la exposición y el rango dinámico de la imagen (Campa Fernández, 2016). Con “Set Scale” se hace un calibrado espacial de las imágenes relacionando los píxeles y las unidades de longitud, generando una barra de escala. Luego, la herramienta “ROI Manager”, es muy útil para agrupar regiones de interés, clasificarlas y posteriormente compararlas. Terminando con el menú “Analyze”, para cuantificar geles electroforéticos viene incluido un apartado llamado “Gels”, que permite hacer un cuantificado manual del área de cada banda electroforética (ImageJ Wiki, 2023). Figura 7: la primera imagen es un gel de electroforesis donde están seleccionadas las 3 zonas de estudio. La segunda imagen es el área gráfica de cada zona separada manualmente por las herramientas de selección. La tercera imagen corresponde a las medidas del área obtenida de cada banda. Fuente: elaboración propia a partir de Fiji. Para finalizar, Fiji trae incluido el menú “Plugins”, que contiene de forma predetermina muchos de los complementos utilizados para el análisis de imagen y un apartado dedicado a la 15 instalación de nuevos plugins. Se van a mencionar, como ejemplo, tres de ellos (ImageJ Wiki, 2023). El primero es “Bio-formats”, es primordial a la hora de importar, exportar y procesar muchos de los formatos de archivo de imagen que Fiji en un principio no podría analizar, así, amplia la posibilidad de leer nuevos archivos (Schroeder et al., 2021). El segundo plugin, ha tenido un gran reconocimiento científico, es SNT (“Simple Neurite Tracer”), está dedicado a la morfometría neuronal y a la conectómica del cerebro, lleva a cabo el rastreo, edición, visualización, cuantificación y modelado de la neuroanatomía, es un gran recurso para la neurociencia (Arshadi et al., 2021). El último, es un plugin muy interactivo conocido como “3D Viewer”, para visualizar datos e imágenes en tres dimensiones. Con herramientas para rotar, seleccionar canales y cuantificar las imágenes (Schmid et al., 2010). Figura 8: representación de un cerebro de mosca en Fiji usando el plugin “3D Viewer” para su análisis 3D. Fuente: adaptada de la página web Fiji. Una vez vista la interfaz, se van a explicar los parámetros más importantes que muestra Fiji al observar una imagen, utilizando de muestra la figura inferior (Figura 9) de un proceso de mitosis, algunos de estos parámetros pueden no aparecer ya que eso depende de la imagen a analizar. En la parte superior se muestra el logo del programa, el nombre del archivo y el tipo de archivo, en este caso es un archivo TIF y entre paréntesis el zoom que tiene aplicado la imagen (200%). Debajo del nombre, se dispone información sobre los canales, planos, fotogramas y formato de la imagen. La figura ejemplo muestra c:2/2 z:5/5 t:24,51; 15.14x17.35 µm (171x196); 16-bit; 33MB (Figura 9). Indica que se está viendo el segundo canal (verde), quinto plano, veinticuatroavo punto temporal de un stack de dos canales, cinco planos y cincuenta y un puntos temporales con un tamaño de imagen de 171x196 píxeles, que corresponden a 15.14x17.35 micras de la muestra, además, la imagen es de 16-bit y ocupa 33 megabytes (Campa Fernández, 2016). En la parte inferior de la imagen se puede cambiar de canal, de plano y visualizar en una animación cada punto temporal de la mitosis y pararlo en un punto concreto si es necesario (ImageJ Wiki, 2023). 16 Figura 9: imagen de un proceso de mitosis analizado mediante el software Fiji. Justo debajo ampliación de la parte superior de la interfaz. Fuente: elaboración propia a partir de Fiji. 3.2.1. Flujo de trabajo de un análisis en Fiji. Para ver un ejemplo de un análisis en Fiji, se ha realizado manualmente un dibujo de estructuras ramificadas simulando lo que podrían ser neuronas, vasos sanguíneos, glándulas, raíces de plantas y otras estructuras ramificadas filamentosas. Este dibujo original RGB se ha tenido que transformar en una imagen 8-bit para poder utilizar el plugin “Skeletonize (2D/3D)” que ha delimitado las estructuras ramificadas, posteriormente con la herramienta “Analyze Skeleton (2D/3D)” se ha llevado a cabo un análisis cuantitativo para ver entre otras medidas, el número de ramas, el número de uniones, la longitud de cada rama o la distancia euclídea. Figura 10: estructura ramificada en 2D (A) en la cual se ha aplicado el plugin “Skeletonize (2D/3D)” (B) y luego se ha analizado dicha figura con “Analyze Skeleton (2D/3D)” dando una imagen C que muestra las uniones y los vóxeles finales de cada rama. Justo debajo de las imágenes A, B y C se muestran dos tablas de resultados con datos obtenidos del análisis. Fuente: elaboración propia a través de Fiji. 17 3.3. CellProfiler CellProfiler, es un programa de uso libre, versátil y de código abierto para cuantificar automáticamente grandes cantidades de información sobre imágenes biológicas, especialmente experimentos de alto rendimiento (CellProfiler, 2023; Haase et al., 2022). Se lanzó en 2005 por el Instituto Whitehead de investigación biomédica en Cambridge y el Instituto Tecnológico de Massachusetts y actualmente lo mantiene el laboratorio Cimini, en el instituto Broad del MIT y Harvard (Carpenter et al., 2006). Fue desarrollado primeramente en el lenguaje de programación MATLAB, pero reescrito en Python. La propiedad principal de este programa es el uso de pipelines que son secuencias de módulos ordenadas. Cada uno de estos módulos está diseñado para realizar una tarea específica y en conjunto, forman una serie de pasos consecutivos que dan lugar a un flujo de trabajo para realizar un análisis continuo de una imagen, cada módulo es personalizable según lo que se busque analizar (Lamprecht et al., 2007; Stirling et al., 2021). Desde que entras en su página web (https://cellprofiler.org/) muestra que es un programa que se basa en su sencillez. En la web destaca la posibilidad de descargar una gran lista de pipelines, que se han utilizado en diferentes estudios, con una descripción de cómo usarlas (Carpenter et al., 2006; CellProfiler, 2023). Esto permite a los investigadores compartir sus datos fácilmente para que otros puedan usarlo libremente. Este software realiza los pasos comunes mencionados de un análisis de imagen, sirviendo así para identificar objetos de interés y luego medir sus propiedades, con métodos como la segmentación o la cuantificación en base a las pipelines diseñadas para ese estudio (Dobson et al., 2021). Con el tiempo han salido nuevas versiones del mismo con mejoras notables en velocidad de procesamiento y utilidad, la última gran actualización disponible es CellProfiler 4.0 (Stirling et al., 2021). Se ha convertido en un programa muy consolidado que ha logrado establecer una gran comunidad al igual que Fiji, donde ambos cuentan con más de 10000 citas anuales en diversos artículos científicos (Dobson et al., 2021; Rueden et al., 2019). 3.4. Funcionamiento de CellProfiler En este apartado también se empieza describiendo la interfaz y a partir de ella, se exploran las funciones disponibles del programa. Tomando la figura 11 como referencia, CellProfiler presenta una serie de menús en la parte superior izquierda al igual que Fiji, que ayudarán a analizar el conjunto de datos, estos menús son “File”, “Edit”, “Test”, y dos menús que proporcionan información de ayuda del programa “Windows” y “Help”. El menú “File”, brinda distintas posibilidades destinadas a abrir y guardar pipelines, y a dar comienzo al análisis. 18 El menú “Edit” muestra una lista de opciones para administrar los módulos disponibles, donde se puede agregar nuevos módulos, reorganizar su posición, copiarlos o eliminarlos. A su vez, el programa da la opción de ejecutar una pipeline en una vista previa antes de realizar el análisis para ajustar la configuración del módulo sobre la marcha, esto se hace con el menú “Test”, y además, proporciona diferentes opciones de selección para trabajar con el set de imágenes y módulos (CellProfiler, 2023; Stirling et al., 2021). Figura 11: interfaz inicial de CellProfiler. Fuente: elaboración propia a partir de CellProfiler. A la izquierda está el panel de la pipeline, en la figura 11 se presenta una pipeline a modo de ejemplo, compuesta de módulos en los que cada uno tiene su tarea específica. En la parte inferior izquierda hay dos opciones, la primera es “Start Test Mode” que inicia el modo test o vista previa mencionado anteriormente donde es posible ver y modificar cada módulo individualmente. La otra opción es “Analyze Images”, que efectúa el análisis completo sin pausas. Encima de la pipeline se visualizan una serie de apartados empezando por “Images” que es donde se almacenaran el conjunto de imágenes que se importan para el análisis y estas aparecerán en el panel central, por ejemplo, en la figura 11 hay una serie de imágenes en formato TIF. La casilla “Metadata” extrae información adicional de las imágenes y la almacena, la casilla “NamesandTypes” permite nombrar a nuestras imágenes y, por último, “Groups” agrupa las imágenes en subconjuntos (CellProfiler, 2023). Un apartado de especial importancia se localiza al clicar en la casilla “+” de “Adjust modules”, se abre una nueva ventana que presenta las categorías de módulos que existen en el 19 programa y los módulos ejecutables dentro de cada categoría, cada uno presenta unos ajustes propios y una serie de parámetros modificables (Figura 11) (Carpenter et al., 2006). La primera categoría es “File Processing”, al igual que menú “File” sirve para exportar y guardar datos de imágenes. La segunda categoría es “Image Processing”, donde cada módulo aplica una operación concreta sobre una imagen que la convierte en una nueva, entre sus distintas opciones se encuentran, por ejemplo, “ColorToGray”, para devolver a escala de grises una imagen a color, “GrayToColor” es su inverso, da color a una imagen. “Crop”, para recortar imágenes hasta obtener la zona que se desea, “EnhanceEdges” para identificar los bordes de una imagen, “Smooth” para suavizar una imagen o el ya nombrado “Threshold”. La siguiente categoría es “Objetc Processing”, se basa en módulos que se encargan de manipular objetos identificados en una imagen. Un objeto es cualquier característica identificable en una imagen, generalmente un organismo, célula o compartimento celular (núcleos, células, colonias). “ClassifyObjects” clasifica los objetos de acorde a unos valores numéricos que se elijan, “CombineObjects” une un set de dos objetos en un solo. También hay módulos de identificación de objetos, ya sea manualmente o automáticamente, por ejemplo, “IdentifyPrimaryObjects” detecta automáticamente los objetos biológicos de interés siempre que sean imágenes en escala de grises 2D con objetos brillantes sobre un fondo oscuro. La siguiente sección es “Measurement”, en ella hay módulos para medir diferentes procesos u objetos como la intensidad de píxeles de la imagen, medir el área que ocupa un objeto en una imagen, medir la forma y el tamaño de un objeto, determinar la colocalización entre dos objetos y otros procesos que aparecen en la figura 12 (CellProfiler, 2023). Figura 12: apartado de módulos de CellProfiler. La primera ventana muestra la categoría “Image Processing”, la segunda “Object Processing” y la tercera “Measurement”. Fuente: elaboración propia a partir de CellProfiler. 20 En la quinta categoría se encuentra “Data Tools”, son herramientas dedicadas a la ejecución de operaciones matemáticas y estadísticas, a su vez, permite generar diferentes figuras de análisis cuantitativo como histogramas o gráficos de dispersión. La próxima categoría es “Advanced”, y está destinada a hacer muchas de las técnicas ya nombradas de procesamiento como aplicar distintos filtros. Finalmente, también existe una categoría exclusiva dedicada al análisis de gusanos (CellProfiler, 2023). Cuando se analiza una imagen en CellProfiler, se encuentra la información que aparece en la figura inferior (Figura 13). Este programa, mide los ejes y la intensidad automáticamente, en la parte inferior de la ventana se aprecian unos valores concretos que son medidos por la posición en la que se mantiene el mouse en ese instante. Los valores de intensidad en CellProfiler a diferencia de otros programas que miden de 0 a 255, como Fiji, se miden de 0 a 1 porque la mayoría de algoritmos de umbralización trabajan mejor así, es la misma información, pero a escala (Carpenter et al. 2006). Hay herramientas como la casa, para volver a la imagen original, el zoom para ampliarla, las flechas para rehacer o deshacer un paso o la barra para medir longitudes y con clic derecho en la imagen se podrá ajustar el contraste u obtener un histograma de la intensidad de los píxeles (CellProfiler, 2023). Figura 13: proceso de análisis de imagen en CellProfiler con un archivo que muestra las células Kc167 de Drosophila melanogaster. Fuente: elaboración propia a partir de CellProfiler. 3.4.1. Flujo de trabajo de una pipeline en CellProfiler En la siguiente figura (Figura 14) se expone un modelo simple de una pipeline por defecto de CellProfiler con células Kc167 de Drosophila melanogaster. En las imágenes 1 y 2 se produce un crop o recorte para ampliar la sección que se quiere visualizar, luego se utiliza los módulos de identificación de objetos primarios, secundarios y terciarios (células, núcleos y citoplasma) que incluye un ajuste del contraste de la imagen y, por último, se mide la 21 información sobre el tamaño de los objetos identificados (CellProfiler, 2023; Stirling et al., 2021). Figura 14: pipeline en células Kc167 de Drosophila melanogaster usando CellProfiler. Fuente: elaboración propia a partir de CellProfiler. 3.5. Comparativa entre Fiji y CellProfiler Como ya se ha visto, Fiji destaca por su capacidad de implementar plugins en su algoritmo y CellProfiler está diseñado para configurar pipelines automatizadas en análisis a gran escala (Haase et al., 2022). Aunque ambos programas pueden realizar tareas similares y depende mucho del contexto y la complejidad del análisis, es importante resaltar algunos de los puntos de comparación entre ellos. 22 Al crear un experimento en el mismo ordenador se ha observado que, en muchos casos CellProfiler es más rápido en procesamiento de grandes conjuntos de imágenes, debido a que su arquitectura de módulos está diseñada para optimizar la eficiencia y escalabilidad (Dobson et al., 2021; Laghi et al., 2022). Los múltiples módulos ejecutan análisis en paralelo en los que se usan diferentes núcleos de CPU y GPU del ordenador para aprovechar al máximo la velocidad de procesamiento del ordenador. Fiji, sin embargo, no posee módulos y por eso es un poco menos eficiente, se basa en macros y en la capacidad de procesamiento del ordenador, aun así, tiene un rendimiento competitivo (Eliceiri et al., 2012). Una vez se observan las interfaces de ambos programas (Figura 5 y Figura 11), se puede conseguir mucha información de ellos. CellProfiler, es más orientativo, trata de ayudar al investigador en cada paso que da marcando cada herramienta o apartado con un símbolo de interrogación, que informa sobre cómo usarlo. Además, posee el manual online que explica cada apartado y también muestra un ejemplo de cómo sería el análisis usando una pipeline concreta (CellProfiler, 2023). Por otro lado, Fiji, solo tiene un menú de ayuda que envía a la página web del programa, donde sí hay información suficiente para saber cómo manejarlo, asimismo, posee muchas imágenes de ejemplo sencillas para familiarizarse con el análisis. Ambos programas destacan por su clara organización basada en menús ordenados con cada proceso que se puede ejecutar y se fundamentan en el uso de ventanas que cuando ejecutan alguna operación abren más ventanas que reflejan las nuevas modificaciones (ImageJ Wiki, 2023). Fiji, posee muchas más herramientas personalizadas de análisis que sumada a la gran cantidad de plugins, más de 1000 actualmente, lo hacen un programa más personalizable y flexible en cualquier campo de estudio. CellProfiler, presenta módulos bastante personalizables, pero no llegan a ser tantos como plugins tiene Fiji, que al tener una mayor comunidad pues muchos más científicos se han dedicado a programar complementos para mejorarlo (ImageJ Wiki, 2023; Schroeder et al., 2021). Un estudio llevado a cabo por Laghi et al. (2022), empleaba pipelines que crearon específicamente en CellProfiler para cuantificar parámetros musculares en ratón y para verificar que el estudio se realizaba correctamente, comprobaron manualmente mediante Fiji los resultados (Laghi et al., 2022). Como se aprecia en la figura inferior (Figura 15) las diferencias en los resultados eran ínfimas, de pocos decimales o incluso centésimas, esto es un claro ejemplo, de que, aunque sean programas diferentes los resultados de cada uno son muy similares. 23 Figura 15: medidas cuantitativas automáticas con CellProfiler y comparadas con Fiji. B) Cuantificación del diámetro mínimo de Feret (MFD) y distribución del tamaño de fibra de las miofibras. C) Cuantificación del número de núcleos. D) Cuantificación de fibras nucleadas centralmente (CNF) y periféricamente (PNF). Cuantificación del número de núcleos por CNF realizada por CellProfiler. F) Cuantificación del porcentaje de macrófagos. Fuente: adaptada de Laghi et al. (2022). Aparte de comparar ambos programas, es esencial hablar de ellos en conjunto puesto que así es cuando realmente le sacan partido al análisis, se retroalimentan tomando las ventajas de cada programa (Rueden et al., 2019). Para apoyar la cooperación entre ambos programas se han creado nuevos complementos como el módulo “RunImageJ Macro”, que permite a los usuarios intercambiar datos de una pipeline de CellProfiler a una macro de Fiji o ImageJ y al revés. También se ha desarrollado un nuevo lenguaje de programación mezcla de Python y Java llamado PyImageJ que ha resultado en una solución al gran obstáculo que tenían para crear flujos de trabajo entre ambos programas. En un artículo de Dobson et al. (2021), se utilizaron ambos programas para demostrar el beneficio que suponía la colaboración entre ambos. En el primer experimento, se utilizaba el plugin “TrackMate” de Fiji para el seguimiento de células, y CellProfiler para detectar y cuantificar la morfología celular. Y en el segundo protocolo, se hacía una segmentación cuantitativa de distintos fenotipos en CellProfiler, con ayuda de herramientas de manipulación de imágenes de Fiji para verificar los resultados. Concluyeron que, aunque a veces, haya que hacer comprobaciones manuales y estos programas funcionen perfectamente por separado, al hacerlo en colaboración han podido identificar fenotipos extraños que por separado en el análisis masivo no se detectaban, también resultó en una mejora en la calidad, la personalización de las imágenes y un ahorro de tiempo en cada proceso, ya que usaban la especialidad de cada programa (Dobson et al., 2021). 30 Rueden, C. T., Ackerman, J., Arena, E. T., Eglinger, J., Cimini, B. A., Goodman, A., Carpenter, A. E., & Eliceiri, K. W. (2019). Scientific Community Image Forum: A discussion forum for scientific image software. PLoS biology, 17(6), e3000340. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000340 Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., Preibisch, S., Rueden, C., Saalfeld, S., Schmid, B., Tinevez, J. Y., White, D. J., Hartenstein, V., Eliceiri, K., Tomancak, P., & Cardona, A. (2012). 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