Efecto de la suplementación materna con DHA durante la gestación y la lactancia sobre la señalización inflamatoria y el patrón de ácidos grasos en la madre, leche materna y el recién nacido

. Tesis Doctoral Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Facultad de Ciencias de la Salud. Departamento de Ciencias Clínicas. Perspectivas actuales en la investigación en Perinatología, Ginecología y Pediatría. EFECTO DE LA SUPLEMENTACIÓN MATERNA CON DHA DURANTE LA GESTACIÓN Y LA LACTANCIA SOBRE LA SEÑALIZACIÓN INFLAMATORIA Y EL PATRÓN DE ÁCIDOS GRASOS EN LA MADRE, LECHE MATERNA Y EL RECIÉN NACIDO Tesis doctoral presentada por Dña.Yéssica Rodríguez Santana para optar al grado de Doctor en Medicina. Dirigida por los doctores D. Luis Peña Quintana, D. Julio José Ochoa Herrera y D. Federico Lara-Villoslada Fdo. Los Directores Fdo. La Doctorando Fdo.: Luis Peña Quintana, Julio José Ochoa Herrera, Federico Lara-Villoslada, Yéssica Rodríguez Santana. Las Palmas de Gran Canaria, Junio de 2015. D. LUIS PEÑA QUINTANA, Profesor Titular de Pediatría de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria adscrito al Departamento de Ciencias Clínicas, Jefe de Sección de Pediatría y Jefe de la Unidad de Gastroenterología, Hepatología y Nutrición Pediátrica del Complejo Hospitalario Universitario Insular Materno-Infantil de Las Palmas, CERTIFICA: Que Dña. Yéssica Rodríguez Santana, licenciada en Medicina y especialista en Pediatría y sus Áreas Específicas, ha realizado bajo mi dirección y supervisión el trabajo de Tesis Doctoral titulado: “Efecto de la suplementación materna con DHA durante la gestación y la lactancia sobre la señalización inflamatoria y el patrón de ácidos grasos en la madre, leche materna y el recién nacido”. La aportación más relevante de dicho trabajo es su contribución al conocimiento de los efectos de la suplementación dietética con ácidos grasos de cadena larga omega-3 en etapas vulnerables de la vida como son el embarazo, el desarrollo fetal y la lactancia haciendo hincapié en su influencia sobre la señalización inflamatoria que puede acontecer en estas etapas fisiológicas y que es en parte responsable de la morbimortalidad asociada a las mismas. Dado que la presente memoria reúne las condiciones para ser defendida como Tesis Doctoral ante tribunal y, en cumplimiento de las disposiciones vigentes, firmo el presente certificado en Las Palmas, junio de 2015. Fdo.: Luis Peña Quintana D. JULIO JOSÉ OCHOA HERRERA, Profesor Titular de la Universidad de Granada, CERTIFICA: Que Dña. Yéssica Rodríguez Santana, licenciada en Medicina y especialista en Pediatría y sus Áreas Específicas, ha realizado bajo mi dirección y supervisión el trabajo de Tesis Doctoral titulado: “Efecto de la suplementación materna con DHA durante la gestación y la lactancia sobre la señalización inflamatoria y el patrón de ácidos grasos en la madre, leche materna y el recién nacido”. La aportación más relevante de dicho trabajo es su contribución al conocimiento de los efectos de la suplementación dietética con ácidos grasos de cadena larga omega-3 en etapas vulnerables de la vida como son el embarazo, el desarrollo fetal y la lactancia haciendo hincapié en su influencia sobre la señalización inflamatoria que puede acontecer en estas etapas fisiológicas y que es en parte responsable de la morbimortalidad asociada a las mismas. Dado que la presente memoria reúne las condiciones para ser defendida como Tesis Doctoral ante tribunal y, en cumplimiento de las disposiciones vigentes, firmo el presente certificado en Las Palmas, junio de 2015. Fdo.: Julio José Ochoa Herrera A mi compañero en este camino de la vida, mi soporte, que sabe de sobra lo que ha conllevado este trabajo estando ahí siempre. A mi familia política, por su cariño y ánimo. A mis sobrinos por evadirme de la rutina en esos pequeños pero intensos momentos que comparto con ellos. A mi compañera de batalla en esta etapa académica de nuestras vidas, gracias por tu ayuda. Gracias a todas las madres y niños participantes en el estudio y a todos los que de una forma u otra han puesto su granito de arena para que este proyecto se llevase a cabo. Finalmente, gracias a la Pediatría y a los niños por la energía que nos transmiten para seguir aprendiendo y por ayudarme a amar lo que hago día a día. ÍNDICE Índice I Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. ÍNDICE GENERAL…………………………………………………………………...I ÍNDICE DE TABLAS………………………………………………………………....V ÍNDICE DE FIGURAS……………………………………………………………….IX LISTADO DE ABREVIATURAS UTILIZADAS…………………………………XV ÍNDICE GENERAL 1. INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES……………………………………….....3 1.1. Ácido Docosahexaenoico (DHA). 1.1.1. Definición. 1.1.2. Síntesis de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga. 1.1.3. Fuentes de DHA e ingesta diaria recomendada. 1.1.4. Funciones de los ácidos grasos omega-3. 1.1.5. Interacciones del DHA y otros ácidos grasos. 1.1.6. DHA en la gestación y lactancia. 1.2 DHA e inflamación. 1.2.1 Citoquinas. 1.2.1.1. Concepto y funciones de las citoquinas. 1.2.1.2. Mecanismos de acción y funciones de las citoquinas. 1.2.1.3. Clasificación de la citoquinas. 1.2.2. Efecto de la suplementación del DHA en la inflamación. 1.2.3. Inflamación, DHA y gestación. 2. JUSTIFICACIÓN…………………………………………………………………..49 Índice II Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. 3. OBJETIVOS………………………………………………………………………..53 4. PACIENTES Y MÉTODOS……………………………………………………….57 4.1. PACIENTES 4.1.1. Pacientes y diseño del estudio. 4.1.2. Criterios de participación. 4.1.3. Diseño de los grupos e intervención. 4.2. MÉTODOS 4.2.1. Muestras para el análisis. 4.2.2. Análisis de ácidos grasos en leche materna, plasma y eritrocitos. 4.2.3. Análisis de citoquinas en plasma. 4.2.4. Análisis estadístico. 5. RESULTADOS……………………………………………………………………..83 5.1. Somatometría de las madres e hijos. 5.2. Determinación de la composición de ácidos grasos en plasma materno. 5.3. Determinación de la composición de ácidos grasos en membrana de eritrocitos materno. 5.4. Determinación de la composición de ácidos grasos en leche materna. 5.5. Determinación de la composición de ácidos grasos en plasma de hijo. 5.6. Determinación de la composición de ácidos grasos en membrana de eritrocitos de hijo. 5.7. Determinación de citoquinas en plasma de madre. 5.8. Determinación de citoquinas en plasma de hijo. 5.9. Relación entre el DHA del plasma y membrana de eritrocitos materno con las citoquinas. 5.10. Relación entre el DHA en leche materna y las citoquinas. 5.11. Relación entre el DHA en plasma y membrana de eritrocitos de hijo y las citoquinas. Índice III Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. 6. DISCUSIÓN……………………………………………………………………….135 7. CONCLUSIONES………………………………………………………………...151 8. BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………….155 9. ANEXOS I………………………………………………………………………....183 10. ANEXOS II……………………………………………………………………....205 Índice V Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Resumen de las recomendaciones de AGPI-CL en lactantes………………...12 Tabla 2. Composición de los productos lácteos utilizados en el estudio………………62 Tabla 3. Parámetros instrumentales para el patrón de ácidos grasos en plasma……….66 Tabla 4. Parámetros instrumentales para el análisis de ácidos grasos en eritrocitos…..69 Tabla 5. Parámetros instrumentales para el análisis de ácidos grasos en leche materna…………………………………………………………………………………71 Tabla 6. Ajustes del equipo Luminex®200, Luminex Corporation (Austin, EE.UU)…………………………………………………………………………….…...76 Tabla 7. Características de las madres e hijos…………………………………………84 Tabla 8. Medidas antropométricas de los hijos………………………………………. 85 Tabla 9a. Composición de los ácidos grasos en plasma materno (Resultados expresados %)…………………………………………………………………………………….....88 Tabla 9b. Continuación. Composición de los ácidos grasos en plasma materno…….. 89 Tabla 10a. Composición de los ácidos grasos en membrana de eritrocitos materno…………………………………………………………………………………93 Tabla 10b. Continuación. Composición de los ácidos grasos en membrana de eritrocitos materno………………………………………………………………………………....94 Tabla 11a. Composición de los ácidos grasos en leche materna………………………97 Índice VI Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. Tabla 11b. Continuación. Composición de los ácidos grasos en leche materna………98 Tabla 11c. Continuación. Composición de los ácidos grasos en leche materna………99 Tabla 12a. Composición de los ácidos grasos en plasma de hijo……………….……103 Tabla 12b. Continuación. Composición de los ácidos grasos en plasma de hijo…….104 Tabla 13. Comparación de los niveles de DHA según género del niño……………...104 Tabla 14a. Composición de los ácidos grasos en membrana de eritrocitos de hijo….107 Tabla 14b. Continuación. Composición de los ácidos grasos en membrana de eritrocitos de hijo……………………………………………………………………....................108 Tabla 15. Distribución de las citoquinas en plasma de madre………………………..111 Tabla 16. Distribución de las citoquinas en plasma de hijo………………………….114 Tabla 17. Correlaciones de Spearman entre el % de DHA en plasma materno y las citoquinas……………………………………………………………………………...117 Tabla 18. Correlaciones de Spearman entre el % de DHA en eritrocitos de la madre y las citoquinas………………………………………………………………………….120 Tabla 19. Correlaciones de Spearman entre el %DHA en leche materna y las citoquinas de los hijos…………………………………………………………………………….123 Tabla 20. Correlaciones de Spearman entre el DHA en plasma de los hijos y las citoquinas de los hijos…………………………………………………………………126 Índice VII Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. Tabla 21. Correlaciones de Spearman entre el DHA en eritrocitos de los hijos y las citoquinas de los hijos…………………………………………………………………129 Abreviaturas XV Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. LISTADO DE ABREVIATURAS AECOSAN: Agencia Española de Consumo, Seguridad Alimentaria y Nutrición. AGPI-CL: ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga. AHANC: Comité Nutricional de la Asociación Americana del Corazón. AKT: serina/treonina quinasa. AL: ácido linoleico. ALA: ácido linolénico. ARA: ácido araquidónico. BPCs: bifenilos policlorados COX: ciclooxigenasa. CSF: factor estimulante de colonias. DHA: ácido docosahexaenoico. DPA: ácido docosapentaenoico. DDT: Dicloro Difenil Tricloroetano. EFSA: Autoridad Europea para la Seguridad de los Alimentos. EPA: ácido eicosapentaenoico. Epo: Eritropoyetina. FAO: Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura. FFQ: cuestionario de frecuencia de consumo de alimentos. G-CSF: Factor estimulante de colonias de granulocitos. GM-CSF: factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos. ICAM: molécula de adhesión vascular intercelular. IFN: interferón. IL: interleuquina. IQR: rangos intercuartílicos. IST: ingesta semanal tolerable. JAK: Janus quinasa. LAK: células asesinas activadas por citoquinas. LC-PUFAs: long chain polyunsaturated fatty acids. LDL: lipoproteínas de baja densidad. Abreviaturas XVI Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. LOX: lipooxigenasas. LPS: lipopolisacárido. LTB4: leucotrieno B4. LTB5: leucotrieno B5. LTE4: leucotrieno E4. M-CSF: factor estimulante de colonias de macrófagos. mg: miligramos. MHC: Complejo Mayor de Histocompatibilidad. μg: microgramos μL: microlitros. NK: natural killer. OMS: Organización Mundial de la Salud. PBDEs: polibromodifenil éteres PCR: proteína C reactiva. PGE2: prostaglandina E2. PGE3: prostaglandina E3. PGI3: prostaglandina I3. PPARγ: receptor activado por proliferadores de peroxisomas. ROS: especies reactivas de oxígeno. SD: desviación estándar. S.E.G: semanas de edad gestacional. STAT: Signal Transducer and Activator of Transcription TAGs: triacilgliceroles. TGF: factor de crecimiento transformante. Th1: linfocitos T helper 1. Th2: linfocitos T helper 2. TNF: factor de necrosis tumoral. TXA3: tromboxano A3. INTRODUCCIÓN Introducción 3 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. 1. INTRODUCCIÓN 1.1. ÁCIDO DOCOSAHEXAENOICO (DHA) 1.1.1. Definición. El ácido docosahexaenoico (DHA) es un ácido graso poliinsaturado de cadena larga perteneciente a la serie omega-3. Los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (AGPI-CL), también conocidos con las siglas en inglés LC-PUFAs, son ácidos grasos constituidos por al menos 18-20 o más carbonos. Se clasifican en dos familias principales dependiendo de la posición de su primer doble enlace (1), la serie omega-3 y la serie omega-6. Los ácidos grasos de la serie omega-3 muestran su primer doble enlace entre los carbonos 3 y 4. Los principales ácidos grasos omega-3 de cadena larga son el ácido alfa linolénico (ALA) (18:3 Δ9, 12,15), el ácido docosahexaenoico (DHA) (22:6 Δ4, 7, 10, 13, 16, 19), el ácido eicosapentaenoico (EPA) (20:5 Δ5, 8, 11, 14,17), y el docosapentaenoico (DPA) (22:5 Δ7, 10, 13,16, 19). De la familia de los ácidos grasos de la serie omega-6 destacan el ácido linoleico (LA) (18:2 Δ9, 12) y el ácido araquidónico (ARA) (20:4 Δ5, 8,11, 14). La figura 1 muestra la fórmula estructural de los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (1). Introducción 4 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. Figura 1. Estructura de los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga 1.1.2. Síntesis de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga. Los ácidos grasos omega-3 y omega-6 son considerados esenciales puesto que su síntesis en el ser humano es limitada. Los ácidos linoleico (AL) y linolénico (ALA) son sintetizados en una gran cantidad de plantas pero no pueden ser producidos por los humanos ni otros mamíferos Serie omega-3 C=O OH ω-6 Ácido linoleico (AL) C18:2ω-6 C=O OH Á. Araquidónico (ARA) C20:4ω-6 C=O OH ω-3 Á. Linolénico (ALA) C18:3ω-3 C=O OH OH Á. Eicosapentaenoico (EPA) C20:5ω-3 C=O OH Á. Docosahexaenoico (DHA) C22:6ω-3 Serie omega-6 C=O OH Á. Docosapentaenoico (DPA) C22:5ω-3 Introducción 5 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. a partir de su precursor, el ácido oleico, al carecer de actividad de la enzima Δ-12 y Δ15 desaturasa (1). Sin embargo el ser humano puede sintetizar otros ácidos grasos de cadena larga como el ARA, el DHA y el EPA a partir del AL y el ALA, precursores de la serie omega-6 y omega-3 respectivamente. Aún así, la conversión eficiente de estos ácidos grasos hacia DHA, EPA y ARA en humanos es baja (2), por eso el aporte de estos ácidos grasos con la dieta es lo más eficiente. Se ha observado que la conversión a DHA varía entre sexos, siendo más eficiente en mujeres (3). Se incrementa durante el embarazo y se ve disminuida en recién nacidos (3) debido a una menor actividad enzimática. La síntesis de los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga, tanto de la serie omega-3 como omega-6 utilizan la misma vía de elongación, desaturación y retroconversión peroxisomal (4). Las enzimas más importantes en los procesos de desaturación son la Δ-5 y la Δ-6 desaturasa. El proceso de síntesis de estos ácidos grasos se inicia con la Δ-6 desaturasa, que introduce un doble enlace entre los carbonos 6 y 7 del AL y ALA. Ambos precursores compiten por esta enzima. La Figura 2 resume las principales etapas metabólicas de la biosíntesis de ácidos grasos omega-3 y omega6, y el efecto de competencia entre sus precursores (5). La afinidad de la Δ-6 desaturasa por el ALA es mucho mayor que por el AL (3). Por eso si el aporte de ALA es muy alto se ve disminuida la síntesis de derivados del AL. Por el contrario, si el aporte de AL es mayor en comparación con el de ALA, la conversión de ALA hacia sus derivados estará limitada. Este hecho ocurre en el mundo occidental ya que la dieta contiene de 10-20 veces más ácidos grasos omega-6 que omega-3 (4). Además hay que añadir el contenido de ácidos grasos del plasma y muchos otros tejidos donde también predominan los ácidos grasos de la serie omega-6, excepto el cerebro y la retina, que son tejidos ricos en omega-3 (4). Debido a la competencia enzimática, una ingesta elevada de EPA y DHA se traduce en un descenso de la concentración de ácido araquidónico y un aumento de la de EPA y DHA en los tejidos. Suplementar con DHA la dieta también va acompañado de un aumento de EPA, Introducción 6 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. lo cual se podría explicar por la retroconversión de DHA a EPA ó por la activación de la vía del ALA (6). Figura 2. Etapas metabólicas de la biosíntesis de ácidos grasos omega-6 y omega-3. 1.1.3. Fuentes de DHA e ingesta diaria recomendada. Los ácidos grasos poliinsaturados están presentes especialmente en el pescado graso y en los aceites de semillas. A este grupo pertenecen los ácidos grasos esenciales, como ya hemos mencionado. ÁCIDOS GRASOS ω6 Ác. linoleico (18:2) 18:3 20:3 Ác. araquidónico (20:4) 22:4 24:4 24:5 Ácido docosapentaenoico(22:5) ÁCIDOS GRASOS ω 3 Ác. linolénico (18:3) 18:4 20:4 Ác. eicosapentaenoico(20:5) 22:5 24:5 24:6 Ácido docosahexaenoico (22:6) Δ6 Desaturasa Elongasa Δ5 Desaturasa Elongasa Elongasa Δ6 Desaturasa Β-Oxidación Retroconversión peroxisomal Introducción 7 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. El ácido linoleico (AL), precursor de los ácidos grasos de la serie omega-6, se encuentra fundamentalmente en los aceites vegetales de soja, maíz y girasol. Mientras que el ácido linolénico (ALA), precursor de los de la serie omega-3, se encuentra en numerosos vegetales, como la linaza, la canola, las semillas de calabaza o las nueces. Las fuentes alimentarias de EPA y DHA se encuentran principalmente en peces azules y de agua fría (sardinas, salmón, caballas, arenques) (7). Figura 3. Fuentes de ácidos grasos poliinsaturados. Introducción 14 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. 1.1.4.2. Función visual y cerebral. El desarrollo y maduración del Sistema Nervioso tiene lugar en un espacio temporal muy amplio aunque muchos eventos cruciales de este ocurren durante el embarazo y los primeros años del bebé. El crecimiento del cerebro es muy rápido entre la semana 20 de gestación y los 2 años de edad. Aumenta en un 64% su tamaño durante los tres primeros meses de vida (29). En estas etapas hay un periodo llamado ventana de sensibilidad, en el cual la aportación de ciertos nutrientes o estímulos puede influenciar y promover el desarrollo neurológico y la capacidad funcional cerebral. Se han descrito diferentes nutrientes que tienen un papel crucial en el desarrollo del sistema nervioso dentro de los cuales destacan los ácidos grasos de cadena larga, como el ácido nervónico y el DHA, la colina, el hierro y el zinc. El DHA forma parte de los lípidos estructurales de las membranas celulares, especialmente de los fosfolípidos del tejido nervioso y la retina (1) donde se han determinado niveles elevados de DHA, especialmente en la materia gris y en los fotoreceptores, por ello se cree que es esencial para su desarrollo óptimo (20;30-33). De forma similar, se han registrado altos niveles de ácidos grasos poliinsaturados omega-3 en los ganglios basales, corteza frontal y occipital, hipocampo y tálamo en estudios realizados en crías de babuinos y ratas lo que sugiere que afecta a la integración sensorio-motora y a la memoria (34-36). El área cognitiva, social, el desarrollo motor y la comunicación dependen del desarrollo del cerebro. La estimulación y la nutrición óptima (37) resultan esenciales. Se ha demostrado que los bebés que reciben cantidades adecuadas de ácidos grasos de cadena larga omega-3, especialmente de DHA, muestran un mejor desarrollo en estas áreas (38-43). Por ello, se sugiere que el DHA es imprescindible para el crecimiento y la función del tejido neuronal, así como visual (44). Estos beneficios persisten más allá de la niñez (39;45), por eso que existan recomendaciones sobre el DHA como elemento fundamental de la dieta de los lactantes y niños con el fin de apoyar el desarrollo del cerebro (46). Introducción 15 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. A pesar de estos datos que destacan la importancia del DHA en el desarrollo del tejido cerebral, queda bastante por aclarar sobre los mecanismos celulares involucrados. El DHA influye directamente en la biosíntesis de neurotransmisores, en la transducción de señales, en la secreción de serotonina, en el ensamblaje de receptores betaadrenérgicos y serotoninérgicos y en la actividad mono-amino oxidasa (47). Parece tener importantes propiedades como capturador de radicales libres, protegiendo contra el daño oxidativo en cerebros tanto de adultos como en desarrollo. Destaca también su papel en la plasticidad neuronal, proceso que permite el reemplazo de circuitos neuronales dañados y la reorganización de los existentes. El DHA mediante su combinación con glicerofosfocolina y fosfatidilserina, favorece la formación de fosfolípidos de membrana para la expansión celular nerviosa (48). También se ha visto que el DHA juega un papel en la migración celular durante el desarrollo cerebral (49). Por otro lado, estudios en animales han demostrado que la administración de DHA durante la gestación y la lactancia se asocia a un aumento de la densidad de espinas dendríticas en el hipocampo (50) y de algunas proteínas sinápticas en el cerebro de ratas destetadas. Sin embargo su depleción se ha asociado con menor tamaño del soma de las neuronas (51) y a alteraciones en la densidad de las vesículas sinápticas, crecimiento y supervivencia de las neuronas. Otros estudios no sólo demuestran que la suplementación con DHA promueve significativamente el crecimiento neuronal y la sinaptogénesis sino que también incrementa el nivel de proteínas pre y postsinápticas involucradas en la transmisión sináptica y potenciación a largo plazo que está relacionada con una mejor función de la sinapsis (52). 1.1.4.3. Regulación de eicosanoides (1) y otros mecanismos antiinflamatorios. Los ácidos grasos omega-3 también regulan la producción de eicosanoides derivados del ácido araquidónico (ARA). Los eicosanoides son un grupo de sustancias biológicamente activas que incluyen prostaglandinas, prostaciclinas, tromboxanos y Introducción 16 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. leucotrienos. Participan en el control de la presión arterial, función renal, coagulación sanguínea y reacciones inflamatorias (53) e inmunológicas, entre otras. El EPA también puede producir eicosanoides. De él derivan los eicosanoides de la serie 3 que incluye la prostaglandina PGE3, la prostaciclina PGI3, el tromboxano TXA3 y el leucotrieno LTB5. La síntesis de estos eicosanoides requiere de la participación de diversas enzimas, ciclooxigenasas y lipoxigenasas, que carecen de especificidad por lo que puede existir competencia entre distintos sustratos para formar eicosanoides. El EPA compite con el ácido araquidónico (ARA) para estimular la producción de prostaglandinas de la serie 3 y leucotrienos de la serie 5 que tienen una menor acción inflamatoria que los eicosanoides derivados del ARA. La suplementación con DHA induce cambios en el metabolismo del ácido araquidónico y en el balance de los eicosanoides sintetizados a partir de los ácidos grasos omega-3 y omega-6. Por eso puede influir sobre las funciones que regulan estos eicosanoides (6). Una vez más el tipo de ácidos grasos que se consumen con la dieta puede influir sobre la producción de eicosanoides pro o antiinflamatorios (54-58). Figura 4. Eicosanoides derivados de los ácidos grasos de las familias ω-6 y ω-3. Introducción 17 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. La cantidad de ácido araquidónico contenido en las células inflamatorias se ve influenciado por la cantidad de ácido linoleico contenido en la dieta aunque la dosis a la que se establece esta relación no ha sido definida en humanos. No obstante, el papel del ácido araquidónico como precursor para la síntesis de eicosanoides proinflamatorios refleja la potente influencia de los ácidos grasos omega-6 de la dieta sobre los procesos inflamatorios (53). La incorporación de EPA y DHA en las células inflamatorias ocurre de un modo dosis dependiente y es parcialmente a expensas del ácido araquidónico. La suplementación con aceite de pescado ha demostrado una reducción de los eicosanoides de la serie 2 (PGE2, tromboxano B2, LTB4, ácido 5hidroxieicosatetraenoico y LTE4) por células inflamatorias debido a una reducción del sustrato disponible para la síntesis de eicosanoides a partir del ácido araquidónico. Aunque los ácidos grasos pueden modular la cantidad y tipo de eicosanoides producidos, también puede producir estos efectos por mecanismos independientes a los eicosanoides que incluyen la acción sobre receptores, sobre las vías de señalización intracelular y la actividad de factores de transcripción (28). También se ha demostrado que los ácidos grasos omega-3 pueden reducir la concentración de proteína C reactiva (PCR), citoquinas (53), quimioquinas y otros biomarcadores inflamatorios. Además el EPA y el DHA son productores de los mediadores lipídicos denominados resolvinas y protectinas que tienen efecto antiinflamatorio e inmunomodulador (7). Estos efectos se desarrollan más ampliamente en el apartado DHA e inflamación. 1.1.4.4. DHA y estrés oxidativo. Los ácidos grasos omega-3 se han considerado efectivos en la prevención de muchas enfermedades por sus efectos antioxidantes (59). Sin embargo, existe controversia al respecto. El DHA, al ser un ácido graso muy insaturado, es muy susceptible a la peroxidación lipídica. Por ello, hay que garantizar la seguridad al usar Introducción 18 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. suplementos con AGPI-CL, ya que se podrían generar radicales libres que afectaran a los tejidos. No obstante, tras diferentes estudios en niños, no se han detectado anomalías entre las concentraciones primitivas de lípidos peroxidados ni en la actividad enzimática antioxidante. Estudios randomizados en los que se ha administrado hasta 1g/d de DHA o 2-7 g/d de AGPI-CL omega-3 no observan efectos adversos, incluso tampoco en embarazadas (60). El embarazo es un estado en el que hay una alta demanda metabólica y aumento en la producción de radicales libres. Se ha observado mayor agresión por radicales libres en mujeres gestantes que en mujeres no gestantes. El parto es un momento en el que también se produce un mayor daño oxidativo tanto en la madre como en el recién nacido siendo mayor en el recién nacido prematuro (61;62). Estudios llevados a cabo en animales han puesto de manifiesto un aumento de la actividad de la enzima superóxido dismutasa (SOD), que tiene un papel importante como antioxidante, en cerebros de ratas tras ser suplementadas con DHA durante el desarrollo postnatal (63). En un estudio posterior en embarazadas, se ha sugerido que la ingesta de aceite de pescado durante el embarazo podría actuar como antioxidante en esta etapa aunque sin resultados del todo concluyentes (64). 1.1.4.5. Prevención y otros beneficios en diversas patologías. Estos hallazgos han hecho que diversos estudios hayan puesto de manifiesto el efecto beneficioso de los ácidos grasos en enfermedades inflamatorias (53;65) y autoinmunes como el Lupus Eritematoso (7), el Asma, la Fibrosis Quística (66), la enfermedad pulmonar obstructiva (1), la Artritis Reumatoide (53), la Esclerosis Múltiple (1;67-69), la Colitis Ulcerosa (70) y Enfermedad de Crohn (53) y la Diabetes Mellitus tipo 2 (67;71). Ampliamente conocidos también son los efectos beneficiosos que los ácidos grasos omega-3 han demostrado sobre enfermedades cardiovasculares (72) poniéndose de manifiesto en algunos estudios su potencial para disminuir el riesgo de mortalidad Introducción 19 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. cardiovascular (73). En una reciente revisión se ha puesto de manifiesto que los ácidos grasos libres omega-3 son eficaces en la reducción de los niveles de triglicéridos y otros lípidos en pacientes con hipertrigliceridemia y pacientes con riesgo cardiovascular elevado tratados con estatinas (74). Sin embargo en otros estudios sobre formulaciones de AGPI-CL y riesgo cardiovascular se ha concluido que formulaciones compuestas por EPA y DHA disminuyen los niveles de triglicéridos pero pueden aumentar los de LDL colesterol, no pasa esto con el EPA administrado en solitario (75-77). Además, ambas formulaciones a las dosis en las que disminuyen los niveles de triglicéridos han demostrado disminución de los eventos cardiovasculares con discrepancia en algunos estudios (75;76). Los AGPI-CL omega-3 no sólo reducen la concentración de triglicéridos también disminuyen la producción de agentes quimiotácticos, factores de crecimiento, moléculas de adhesión, eicosanoides inflamatorios y citoquinas inflamatorias, disminuyen la presión arterial, incrementan la producción de óxido nítrico, mejoran la relajación endotelial y compliance vascular, disminuyen la trombosis y arritmias cardiacas (55;78). Aunque aún no está del todo claro el mecanismo por el cual estos ácidos grasos ejercen su efecto protector, se han propuesto los mecanismos antiinflamatorios que estos ácidos grasos producen en la pared de los vasos sanguíneos (78), su ya comentado efecto hipolipemiante, la regulación sobre la producción de eicosanoides menos potentes y la inhibición de la producción de citoquinas proinflamatorias entre otros (55;73), por los que también han mostrado beneficios en la enfermedad vascular periférica (55). La suplementación con aceite de pescado también ha mostrado beneficios en procesos oncológicos (1), asociándose a reducción de la incidencia del cáncer de mama metastásico (67). En pacientes con cáncer colo-rectal (79) también se han puesto de manifiesto sus beneficios, objetivándose una reducción de marcadores inflamatorios como la IL-6 en pacientes suplementados con ácidos grasos omega-3, aunque estos beneficios dependían del tiempo de suplementación, dosis y vía de administración y tipo de tratamiento oncológico específico recibido. A parte de los ya comentados se han estudiado en la leucemia, cáncer de pulmón, cervical, neuroblastoma, linfoma, en el cáncer de páncreas, de vejiga urinaria, ovario y en el glioblastoma (80). Los Introducción 20 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. mecanismos por los que se han propuesto a los AGPI-CL como coadyuvantes en el tratamiento específico del cáncer son sus propiedades en la actividad antitumoral: antiinflamatorios (81), anti-proliferativos, pro-apoptóticos, anti-invasivos, antimetastásicos (82) y regulación epigenética (83). En una reciente revisión sistemática en pacientes oncológicos (cáncer de pulmón, mama, colo-rectal y gastrointestinal) tratados con quimioterapia y/o radioterapia se evidencia que la suplementación con ácidos grasos omega-3 puede aportar beneficios en cuanto al mantenimiento del peso corporal, disminución de la neuropatía periférica, en la inflamación con reducción de la proteína C reactiva, mejorando la calidad de vida sobre todo por la preservación de la condición física. No obstante, son necesarios futuros estudios para establecer las recomendaciones terapéuticas del EPA y DHA en los procesos oncológicos (80). Figura 5. Principales funciones de los AGPI-CL. Introducción 21 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. 1.1.5. Interacciones del DHA y otros ácidos grasos. Estudios de suplementación han demostrado que la intervención dietética con ácidos grasos omega-3 puede variar el patrón de ácidos grasos del plasma y membrana de eritrocitos (84). Se han demostrado cambios en el patrón lipídico de recién nacidos al añadir ácidos grasos de cadena larga, tanto omega-6 como omega-3 en las fórmulas infantiles (85). Además se ha visto que regulando el contenido de AL en las mismas se incrementa la incorporación celular de DHA (86). Los ácidos grasos del plasma y membrana de eritrocitos han sido elegidos como buenos marcadores de la ingesta de ácidos grasos aunque este último parece tener mayor valor (87;88). Diversos estudios han sugerido que el tipo de ácidos grasos consumidos con la dieta puede variar la composición de ácidos grasos de la membrana de los eritrocitos. Por ejemplo, estudios en animales han señalado que los niveles de AGPI-CL omega-3 en los tejidos pueden ser regulados alterando el balance de AL y ALA que se ingiere con la dieta. Una revisión reciente de estudios en esta línea pero en humanos sugiere que la mayoría de los estudios que incrementan la ingesta de ALA consiguen aumentar el estatus de EPA, mientras que sólo los estudios que reducen la ingesta de AL reportan aumentos del estatus de DHA (89) aunque en general los cambios no son tan potentes como los observados con la ingesta de AGPI-CL omega-3 (86). La ingesta de aceite de pescado se ha correlacionado especialmente bien con la concentración de EPA y DHA en membrana de eritrocitos (88;90;91), mientras que la ingesta de este tipo de aceites parece que se asocia inversamente con la cantidad de ARA (92). De forma similar la cantidad de ácido linolénico, ácido linoleico y ácidos grasos saturados en membrana de eritrocitos se ha asociado con la ingesta dietética de los mismos pero no demuestran que se vean influenciados por la ingesta de AGPI-CL omega-3 (91;93). También la ingesta de ácidos grasos de origen vegetal y derivados se asoció con mayor proporción en membrana de eritrocitos de ácido linoleico, linolénico y ácido nervónico que a su vez también se ve alterado en este caso de forma negativa por la ingesta de productos lácteos (90). Todos estos datos reflejan que la membrana de eritrocitos es un buen indicador de la ingesta dietética de ácidos grasos (88;90). Introducción 22 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. Takkunen y colaboradores ponen de manifiesto en su estudio que los ácidos grasos poliinstaurados del pescado y de suplementos enriquecidos con aceites de pescado se correlacionan positivamente sobre todo con la cantidad de EPA en eritrocitos, mientras que lo hace de forma negativa con los ácidos grasos de la serie omega-6. Por su parte los ácidos grasos contenidos en la carne de origen animal se asociaron con mayor proporción de ARA y menos de EPA y DHA (90). En otro estudio reciente de suplementación con ácidos grasos de cadena larga omega-3 (ALA, EPA y DHA) en niños se ha objetivado cambios en la composición de ácidos grasos de los eritrocitos. En concreto, se objetivan aumentos en la concentración de ALA, DHA y la suma total de ácidos grasos omega-3 mientras que se evidencia un descenso de las concentraciones de los ácidos grasos omega-6, ARA y C22:4 ω-6, de la suma total de ácidos grasos omega6, del ratio omega-6/omega-3 y ARA/DHA. Sin embargo, no se encontraron diferencias en los niveles de AL, EPA ni DPA (94). Así como la ingesta de EPA y DHA se traduce en cambios en la composición de los ácidos grasos del plasma y de la membrana de eritrocitos, la ingesta de ARA no parece correlacionarse con la composición de ARA en los fosfoslípidos (92). 1.1.6. DHA en el embarazo y la lactancia. Los ácidos grasos esenciales y los derivados del ácido linoleico, serie omega-6, y ácido linolénico, serie omega-3, juegan un papel importante en la gestación. Se han asociado a mayor prolongación de la gestación, retraso del parto espontáneo y reducción de la recurrencia de parto prematuro tanto en estudios animales y humanos, mejorando los resultados neonatales (95). También es conocido que los niveles de DHA en el plasma materno durante la gestación influyen en el desarrollo de las funciones cognitivas y neurológicas del neonato. En una reciente revisión sistemática (23) de estudios de suplementación con DHA durante la gestación se reporta en la mayoría, que los tests de evaluación de desarrollo neurológico en los hijos de madres suplementadas durante la gestación presentan mayor puntuación (96;97) en comparación con los del grupo control. También se ha demostrado una relación positiva entre los niveles de Introducción 23 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. DHA en plasma de cordón umbilical y el desarrollo de habilidades cognitivas de los niños. A pesar de estos resultados sigue existiendo mucha controversia al respecto. Hay estudios que no comparten estos resultados (84;98) y otros no demuestran que esos beneficios se mantengan a largo plazo, no encontrando diferencias significativas entre grupos suplementado y control en la primera infancia (99;100). Durante el embarazo hay una alta demanda tanto de ácidos grasos omega-6 como de omega-3 porque el feto los obtiene preferentemente de la transferencia placentaria (101), lo que condiciona que el almacén de estos ácidos grasos en el feto dependa de la ingesta materna de los mismos. La suplementación de gestantes con ácidos grasos poliinsaturados omega-3 se ha asociado a aumento de las concentraciones de DHA en plasma, placenta y sangre de cordón umbilical (102). La ingesta recomendada de AGPI-CL en el embarazo no ha sido establecida por unanimidad a pesar de los beneficios demostrados en el desarrollo neurológico del feto y neonato, la prolongación de la gestación, el peso al nacimiento y también sobre el proceso inflamatorio (95). De acuerdo a la EFSA se recomienda de 125 a 500 mg al día de DHA durante el embarazo para aumentar sus niveles y cubrir las necesidades ligadas a esta etapa. Para que la embarazada pueda suplir esas altas demandas es necesario el consumo de una gran variedad de fuentes dietéticas de ácidos grasos omega-3. De ahí que se recalque la importancia de una intervención dietética adecuada que asegure una gestación con resultados beneficiosos para la madre e hijo. La lactancia es otra etapa en la que la ingesta de DHA resulta beneficiosa para la madre y para el niño. El DHA también está presente en la leche materna, pero no en todas las fórmulas infantiles. Contiene ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga, omega-6 y omega-3, que constituyen el 2% del total de ácidos grasos. También, contiene componentes que juegan un papel inmunológico específico como son citoquinas, factores de crecimiento, leucocitos, inmunoglobulinas, proteínas como la lactoferrina y lisozimas. La presencia de citoquinas en la leche materna contribuye al desarrollo del sistema inmune neonatal y confiere protección al niño que en estas etapas carece de una red de citoquinas maduras (103). Aún en concentraciones fentomolares Introducción 30 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. determinada citoquina, sus funciones pueden ser reemplazadas total o parcialmente por otras. En este sentido suelen observarse efectos sinérgicos y antagónicos. El sinergismo hace referencia a cuando el efecto mediado por dos citoquinas, actuando de forma conjunta, es mayor que la suma de los efectos de las citoquinas actuando individualmente. Sin embargo, el antagonismo hace referencia a la capacidad de una citoquina en particular de inhibir la acción de una segunda citoquina. Muchos son los efectos biológicos de las citoquinas. Ejercen su función actuando sobre receptores específicos de membrana y contribuyen a la activación, blastogénesis y/o diferenciación en células efectoras, regulando también otros procesos como la apoptosis, adquisición de capacidad citotóxica y la recirculación de los leucocitos. Muchas son importantes reguladores, tanto positivos como negativos, de acontecimientos celulares como la mitosis, la diferenciación, la migración, la supervivencia e incluso, de su transformación maligna. Desempeñan un papel esencial en los mecanismos efectores e inmunorreguladores, tanto de la inmunidad innata como de la respuesta inmune adaptativa. También participan en la angiogénesis y se ha visto que desarrollan un papel clave en procesos neuroinmunes y neuroendocrinos. 1.2.1.3. Clasificación de las citoquinas. Como ya hemos comentado, las citoquinas se caracterizan por su pleiotropismo, lo cual dificulta la realización de una clasificación funcional. De un modo práctico, atendiendo a su función más relevante (120;121), podrían dividirse en los siguientes grupos: citoquinas mediadoras de la inmunidad adaptativa, mediadoras de la inmunidad innata, mediadoras de la hematopoyesis y citoquinas proinflamatorias e inmunosupresoras. Introducción 31 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos.  Citoquinas que participan en la inmunidad adaptativa. La activación de los linfocitos T y B en reposo requiere de una serie de señales mediadas por citoquinas para poder llevar a cabo sus acciones. En respuesta a una estimulación antigénica, los linfocitos T se activan, proliferan y se diferencian hacia células efectoras específicas. Estas células ejercen sus funciones produciendo una serie de moléculas solubles efectoras de la respuesta inmune adaptativa. Los linfocitos T CD4+, como consecuencia de una estimulación antigénica, pueden diferenciarse hacia linfocitos T cooperadores de tipo Th1 o Th2, estando esta diferenciación en parte condicionada por las citoquinas que se encuentran en el medio. Así, la presencia de IL-12 promueve la diferenciación hacia Th1, mientras que la IL-4 condiciona el desarrollo Th2. Los linfocitos Th1, en colaboración con los macrófagos, están implicados en la respuesta inmune celular, mientras que los Th2 promueven la respuesta inmune humoral. Para llevar a cabo su función los linfocitos Th1 secretan IL2, IFN- y TNF-α, mientras que los Th2 producen IL4, IL-5, IL-10 e IL-13. Los linfocitos T CD8+ se diferencian hacia linfocitos T citotóxicos como respuesta a la estimulación antigénica y a la presencia de citoquinas secretadas por otras células. Ejercen su función efectora mediante la secreción fundamentalmente de IL-2, IL-16, IFN-γ y TNF-α. Finalmente, hay una serie de citoquinas que pueden ser producidas por ambos tipos de linfocitos T, CD4+ y CD8+, tales como IL-2, GM-CSF y TGF-β. - Interleuquina 2 (IL-2): secretada por linfocitos T CD4+ y CD8+ activados en respuesta a un estímulo antigénico. Inicialmente se describió como factor de crecimiento de células T, ya que es el principal agente que controla su proliferación. Tiene un papel esencial en el desarrollo de las respuestas inflamatorias crónicas, tanto humorales como celulares. Es un factor estimulador del crecimiento de linfocitos T, B y células NK, promoviendo la actividad citotóxica mediada por linfocitos T y células NK, Introducción 32 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. así como el desarrollo de células LAK (células asesinas activadas por citocinas). Tras unirse a su receptor de los linfocitos T, activa la secreción de IFN-alfa, linfotoxina, IL4, IL-3, IL-5 y GM-CSF. Sobre los linfocitos B estimula su crecimiento y diferenciación e incrementa la expresión de moléculas de MHC (Complejo Mayor de Histocompatibilidad) de clase II. - Interleuquina 16 (IL-16): producida por los linfocitos T CD8+ donde se acumula y se secreta en respuesta a la estimulación con serotonina o histamina. Originariamente se identificó como factor quimiotáctico de linfocitos, recibiendo el nombre de linfotactina, debido a su efecto atrayente sobre los linfocitos T CD4+. - Interferón gamma (IFNγ): producido por linfocitos Th1, linfocitos T citotóxicos y por células NK. Es el principal factor activador de macrófagos en los que estimula la producción de IL-1 y TNF-α. Incrementa su capacidad lítica y de defensa contra las infecciones. Induce la expresión de moléculas de histocompatibilidad de clase I y II del MHC con lo que aumenta la presentación antigénica y la activación de linfocitos CD4+ y CD8+. Además posee una importante actividad inmunomoduladora. Inhibe la proliferación de los linfocitos Th2, de manera que su presencia durante la estimulación antigénica induce la diferenciación de linfocitos T hacia células efectoras tipo Th1 favoreciendo, por lo tanto, el desarrollo de las respuestas inflamatorias. - Interlequina 4 (IL-4): producida por linfocitos Th2, mastocitos, basófilos, células del estroma de la médula ósea y, posiblemente, por determinadas subpoblaciones de células NK. Es una citoquina muy pleiotrópica, ya que ejerce numerosos efectos en diferentes tipos celulares. Promueve la diferenciación de linfocitos T vírgenes hacia células de tipo Th2, inhibiendo la generación de células Th1. También, posee efectos inmunosupresores, ya que inhibe la producción de determinados mediadores inflamatorios de los macrófagos, inhibe la producción de prostaglandinas (122) e induce la producción de IL-1Ra, que bloquea la acción de la IL-1. También bloquea la producción de IL-6, IL-8 y TNF-α. Sobre los linfocitos T activados inhibe la Introducción 33 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. producción de IFN-γ, aumenta la capacidad lítica de los linfocitos T citotóxicos y sobre las células NK induce proliferación y actividad LAK, pero antagoniza los efectos de IL-2. - Factores transformadores del crecimiento (TGF): se diferencian dos tipos, el TGF-α y el TGF-β. No poseen ninguna similitud estructural ni comparten los mismos efectos. El TGF-β tiene efecto inmunomodulador. Es una de las citoquinas más abundantes en la leche materna (104). Tiene efectos pleiotrópicos. Es producido fundamentalmente por linfocitos T, plaquetas y otros muchos tipos celulares. Incrementa la proliferación de fibroblastos, osteoblastos y células musculares lisas e incrementa la síntesis de proteínas de la matriz extracelular, lo que favorece la curación de las heridas. Esta citoquina tiene también efectos inmunosupresores ya que se observó que inhibía el crecimiento y la función de muchos tipos celulares. Involucrada en la protección frente a agentes adversos relacionados con la alergia en la infancia, participando en el proceso de tolerancia a los alérgenos. Se ha visto un descenso de sus niveles en hijos de madres atópicas. Estudios de suplementación con DHA en embarazadas han demostrado aumento de los niveles de TGF-β no sólo en el plasma de la madre si no también en sangre de cordón umbilical (123), lo que puede sugerir un efecto beneficio de este ácido graso en las enfermedades alérgicas. En el sistema inmune inhibe la síntesis y/o el efecto del IFN-γ, TNF-, TNF–β, IL-1, IL-2 e IL-3, así como la citotoxicidad natural y específica.  Citoquinas producidas en las respuestas inmunes innatas. Estas citoquinas se producen de forma inmediata tras el contacto de las células implicadas en las respuestas inmunes innatas con un agente extraño. Actúan mediante mecanismos de acción directa frente al agente invasor ó mediante la movilización de mecanismos inmunorreguladores. Introducción 34 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. Las citoquinas que actúan en esta respuesta están producidas fundamentalmente por macrófagos, células NK, y por otras células no inmunes como fibroblastos y células endoteliales. Las principales citoquinas que intervienen en la respuesta innata son: IL-1, IL-6, IL-12, IL-16, Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-α) e Interferones alfa y gamma (IFN α e IFN-γ). - Interleuquina 1 (IL-1): la superfamilia IL-1 está compuesta por 11 miembros hasta la fecha. Son la IL-1α, IL-1β, IL-1Ra, IL-18, IL-33, y de la IL-1F5 a IL-1F10 (124). Parte de sus efectos proinflamatorios se debe a que inducen la liberación de histamina en los mastocitos, generando vasodilatación y aumento de la permeabilidad vascular en el lugar de la inflamación. Es el principal pirógeno endógeno, induciendo fiebre a través de la producción de prostaglandinas. Comparte muchos de los efectos proinflamatorios con el TNFalfa. También promueve la síntesis de proteínas de fase aguda por los hepatocitos y actúa sobre el sistema nervioso central induciendo anorexia, hipotensión, pérdida de peso, típicamente asociados con los procesos infecciosos. Está producida fundamentalmente por monocitos y macrófagos en respuesta a productos bacterianos tales como endotoxinas, inmunocomplejos, fragmentos moleculares de degradación del complemento, en particular C5a, y citocinas, como el M-CSF, el TNF-α y el IFN-γ. Sin embargo, también puede ser producida por linfocitos B, células endoteliales y queratinocitos. La IL-1 en bajas concentraciones tiene funciones inmunoreguladoras a nivel local actuando como coestímulo para la activación de las células T, incrementando la proliferación de los linfocitos CD4 y el crecimiento y la diferenciación de células B(125). Además induce el aumento de su propia síntesis y la producción de otras citoquinas, tales como IL-6 e IL8 por monocitos y células endoteliales, IL-6 por los fibroblastos o la IL-2 (125) por células T. Además, estimula la expresión de receptores de citoquinas en diferentes tipos celulares, incluyendo células hematopoyéticas y células T. También actúa sobre las células endoteliales promoviendo la coagulación y la adhesión linfocitaria. Introducción 35 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. A concentraciones mayores la IL-1 ejerce una acción endocrina y provoca, a nivel sistémico, algunos de los efectos que produce el TNF-α: fiebre, síntesis de proteínas de fase aguda y caquexia. Sin embargo, tiene efectos diferentes a los del TNFα ya que no produce daño tisular por sí misma. Tampoco incrementa la expresión de moléculas del MHC ni inhibe el crecimiento de las células hematopoyéticas de médula ósea sino que potencia las acciones de los CSF sobre estas células. Finalmente, la acción de la IL-1 es más potente que la del TNF-α como coestimulador de las respuestas de los linfocitos T. - Interleuquina 6 (IL-6): junto con la IL-1 es la principal inductora de la síntesis de proteínas de fase aguda, sobre todo de fibrinógeno. Es producida por monocitos y macrófagos en respuesta a la IL-1 y TNF-(125). Además de participar en la inflamación, promueve la diferenciación de linfocitos B hacia células plasmáticas, induciendo la producción de inmunoglobulinas. También puede aumentar la producción de IL-2 y el desarrollo de los precursores hematopoyéticos dependientes de la IL-3. - Interleuquina 12 (IL-12): se describió inicialmente como el factor estimulador de las células asesinas naturales (NK), pero la actual importancia deriva de su capacidad de dirigir la diferenciación de los linfocitos Th hacia células efectoras tipo Th1 de la hipersensibilidad retardada. Esta citoquina incrementa la actividad citotóxica de las células NK e induce células LAK. Incrementa la producción de IFN- por linfocitos T y células NK y activa a los linfocitos T citotóxicos. Recientemente se ha descrito un factor proteico denominado p19, sin actividad biológica por sí mismo, que se combina con la subunidad p40 de la IL-12 para dar lugar a una nueva citoquina biológicamente activa denominada IL-23. Esta citoquina es producida por células dendríticas activadas, se une al receptor de la IL-12 y comparte algunas de las funciones biológicas con ella. - Factor de necrosis tumoral alfa (TNF-): producido por células T activadas, mastocitos y macrófagos tras estimulación por endotoxinas bacterianas como el lipopolisacárido (LPS), factor estimulador de colonias de macrófago (M-CSF), IFN-γ, Introducción 36 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. IL-2 ó IL-15. Junto con la IL-1 está implicado en los procesos inflamatorios derivados de los procesos infecciosos, siendo responsable de los efectos sistémicos tales como la elevación de la temperatura corporal, caquexia y sueño al actuar sobre el SNC. La producción de pequeñas cantidades de TNF- es beneficioso en respuesta a una infección, pero la sobreproducción puede conducir a daños, como ocurre en el shock, en el síndrome de distrés respiratorio del adulto y otros procesos inflamatorios donde el TNF-α está implicado (125). Ejerce numerosos efectos que son muy dependientes de su concentración. A concentraciones bajas el TNF-α actúa localmente como un mediador paracrino que induce la expresión de moléculas de adhesión y estimula la producción de IL-8 por células del endotelio vascular, lo que contribuye a la extravasación de linfocitos, neutrófilos y monocitos. También provoca activación leucocitaria y estimulación de la producción de citoquinas proinflamatorias, como IL-1, IL-6 e IL-8 en los fagocitos mononucleares. También co-estimula la activación de linfocitos T y B. En células del endotelio vascular y fibroblastos, estimula la producción de CSFs y aumenta la expresión de moléculas del MHC de clase I. Cuando las cantidades de TNFα son mayores, éste actúa de modo endocrino y provoca acciones sistémicas: estimula la producción de reactantes de fase aguda por el hígado y la producción de IL-1 e IL-6 en células del endotelio vascular; activa el sistema de coagulación y suprime la proliferación de las células progenitoras hematopoyéticas de la médula ósea. - Interleuquina 10 (IL-10): Es producida por linfocitos del tipo Th2, así como también por monocitos, macrófagos, linfocitos B, queratinocitos y otros tipos celulares. Tiene efectos inmunosupresores y anti-inflamatorios. Es la citoquina inmunosupresora por excelencia, inhibiendo la síntesis de citoquinas proinflamatorias, entre las que podemos citar IFN-γ, IL-2 e IL-12. En los macrófagos inhibe la síntesis de IL-1, IL-6, IL-8, y el TNFα aumenta la producción de un agente anti-inflamatorio, el factor antagonista del receptor de IL-1 (IL-1Ra). También inhibe la expresión de MHC-tipo II y moléculas de adhesión en monocitos. Además, tiene efectos antiproliferativos sobre muchos tipos celulares. La IL-10 ejerce además múltiples actividades inmunomoduladoras. Se ha visto que es un cofactor para el crecimiento de líneas y colonias de células mastocíticas in vitro. Regula las funciones mediadas por linfocitos B Introducción 37 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. induciendo la síntesis de IgG, y por linfocitos T, influyendo en el desarrollo de timocitos y células T. También ejerce efectos reguladores sobre la angiogénesis. Relacionadas estructural y funcionalmente con la IL-10 se han descrito recientemente nuevas moléculas tales como la IL-19, IL-20 e IL-22, cuyas funciones son todavía poco conocidas. - Interferones alfa y beta (IFN α e IFN β): fueron inicialmente descritos como agentes producidos por células infectadas por virus. Posteriormente se descubrió que además de su capacidad antiviral ejercían efectos reguladores sobre la proliferación y la diferenciación de varios tipos celulares y tenían capacidad de modular el sistema inmune. Se clasificaron en dos grupos. Los interferones tipo I, que incluyen el IFN-α y el IFN-β, con capacidad principalmente antiviral y antiproliferativa, y el IFN-γ (tipo II), con un mayor efecto inmunomodulador. Los interferones α o leucocitarios son producidos preferentemente por fagocitos mononucleares. Los interferones β o fibroblastoideos son producidos preferentemente por fibroblastos. Ambos interferones interaccionan con un mismo receptor. Aumentan el potencial lítico de las células NK y de los monocitos y también aumentan la expresión de moléculas clase I e inhiben la expresión de moléculas de clase II. En algunos casos se ha observado que poseen actividad antitumoral, posiblemente debido a su efecto antiproliferativo sobre las células tumorales, y modulador sobre el sistema inmune.  Citoquinas implicadas en el crecimiento y la diferenciación hematopoyética. Estas citoquinas promueven el crecimiento y diferenciación de las células sanguíneas maduras a partir de células madre hematopoyéticas. Son producidas por células del estroma de la médula ósea o por linfocitos maduros activados. Algunas de estas citoquinas reciben el nombre genérico de factores estimuladores de la formación de colonias (CSF) por su capacidad para estimular la formación de colonias celulares en los cultivos de médula ósea. Introducción 38 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. Las más importantes son: el Factor Estimulador de Colonias de Granulocitos y Macrófagos (GM-CSF), Factor Estimulador de Células Precursoras, Factor Estimulador de Macrófagos (M-CSF), la IL-3, la IL7 y la Eritropoyetina (Epo). - Factor Estimulador de Colonias de Granulocitos y Macrófagos (GMCSF): producido por linfocitos T activados y por otras células como fibroblastos, células endoteliales y monocitos. Induce la proliferación de los progenitores de granulocitos y macrófagos, produciéndose en respuesta a estímulos específicos en situaciones que requieren una elevada producción de éstas células. También puede actuar sobre granulocitos y macrófagos maduros. - Factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF): producido por fibroblastos, células endoteliales y monocitos en respuesta a estímulos específicos. Actúa sobre los precursores hematopoyéticos de los granulocitos y sobre los granulocitos maduros. La granulocitosis asociada a ciertas infecciones se debe a que el LPS de las paredes bacterianas es un potente inductor de la producción de esta citocina. Se han descrito otras funciones de este factor, como la estimulación de la fagocitosis y de la citotoxicidad mediada por anticuerpos. - Factor Estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF): producido por monocitos y macrófagos maduros activados y está implicado en el desarrollo de las células progenitoras de los macrófagos. - Interleuquina 3 (IL-3): producida mayoritariamente por los linfocitos T activados y también por mastocitos. Induce la proliferación y diferenciación de progenitores hematopoyéticos tempranos de todas las series sanguíneas, por lo que también es conocida como multi-CSF. Induce fundamentalmente la hematopoyesis en situaciones de estrés que requieren una respuesta rápida, siendo menos claro su papel en la hematopoyesis constitutiva. Introducción 39 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. - Interleuquina 7 (IL-7): producida por células estromales de la médula ósea. Promueve la maduración de progenitores proy pre-B hacia linfocitos B maduros en la médula ósea y de linfocitos T inmaduros en el timo fetal y adulto. También actúa como factor de crecimiento para linfocitos T y B.  Citocinas proinflamatorias e inmunosupresoras. Las citoquinas con actividad anti-inflamatoria e inmunosupresora inhiben el crecimiento celular o suprimen la secreción de otras citoquinas. Entre ellas se encuentran la IL-4, IL-13 e IL-10, que activan las acciones de los linfocitos B a la vez que inhiben las respuestas inflamatorias. La IL-13 e IL-4 están relacionadas con los linfocitos Th2, participando en los procesos alérgicos. La suplementación de embarazadas con ácidos grasos omega-3 se ha asociado a disminución de niveles de RNAm de IL-4 e IL-13y descenso de células NK en sangre de cordón umbilical (123;126). También se incluye en este grupo el TGF-β que inhibe el crecimiento y la función de muchos tipos celulares, la síntesis de determinadas citoquinas y la actividad citotóxica natural y específica. Finalmente, los interferones tipo I (α y β), también se pueden considerar citoquinas supresoras debido a su capacidad antiproliferativa y a su efecto regulador de la producción de citoquinas proinflamatorias. En el grupo de las citoquinas con actividad proinflamatoria se incluyen las producidas por los monocitos y macrófagos activados durante las respuestas inmunes innatas, aunque también pueden ser producidas por linfocitos activados (Th1 o citotóxicos), y otras células no pertenecientes al sistema inmune. Las principales citoquinas que participan en los acontecimientos celulares y moleculares asociados con los fenómenos inflamatorios son la IL-1, IL-6, el TNF- y algunos miembros de la familia de las quimioquinas. Otra importante citoquina proinflamatoria es el IFN-γ, producido por linfocitos Th1 en las respuestas inmunes específicas y por células NK activadas. JUSTIFICACIÓN Justificación 49 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. 2. JUSTIFICACIÓN El interés terapéutico de los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga se despierta a principios de la década de los 80 (149), a medida que los estudios epidemiológicos revelan que el consumo de grandes cantidades de pescado rico en omega-3 se asocia a menor incidencia de enfermedades inflamatorias (31). A esto se suman otros estudios que revelan que los ácidos grasos de cadena larga, especialmente el ácido docosahexaenoico (DHA), tienen también un papel vital en el desarrollo fetal (134;150;151). El DHA y el ácido eicosapentaenoico (EPA) son dos ácidos grasos omega-3 nutricionalmente esenciales con la peculiaridad de que no son sintetizados en cantidades suficientes por el organismo y por eso deben obtenerse a través de la dieta (152). En etapas vulnerables como el embarazo y la lactancia se recomienda un alto consumo de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga omega-3 (AGPI-CL ω-3) ya que los niveles de DHA materno descienden durante el embarazo (23) y continúan descendiendo si el periodo de lactancia es largo (153). También se ha observado que los niveles de DHA materno descienden aún más en los embarazos múltiples y que son más bajos en mujeres multíparas que en primíparas (154) y cuando el periodo entre embarazos es muy estrecho. El estatus de DHA en el feto depende exclusivamente de la transferencia placentaria y por ende de su administración a través de la dieta materna (155). Por tanto, la alimentación juega un papel relevante en estas dos etapas ya que el desarrollo óptimo del feto y del recién nacido necesita asegurar un aporte materno adecuado de DHA. Parece razonable entonces la importancia de un suplemento dietético que se ajuste a las necesidades de estas etapas. La suplementación dietética con DHA ha demostrado que influye en la composición de ácidos grasos del organismo y fosfolípidos circulantes (156). Por eso, los ácidos grasos del plasma y de las membranas de eritrocitos han supuesto un índice útil para determinar el adecuado aporte de DHA de la dieta (157;158). En la mayoría de Justificación 50 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. estudios que han valorado cómo la ingesta dietética de ácidos grasos influye en la composición lipídica de los tejidos, se ha reportado que la ingesta de ácidos grasos omega-3 o su precursor el ácido linolénico puede variar la composición de EPA y DHA observando interacciones sobre todo con el ARA que disminuye tras la suplementación con aceite de pescado sin recogerse datos sobre otros ácidos grasos (88;90;91). Estudios en esta línea podrían determinar la ingesta óptima de DHA y tiempo necesario de suplementación para conseguir un estatus adecuado a las necesidades que conlleva el embarazo y la lactancia. La mayoría de los estudios publicados sobre la suplementación con DHA y sus efectos, se ha centrado en el desarrollo visual y neuronal del recién nacido. Además de estos efectos ampliamente conocidos, existe evidencia de los beneficios que el DHA parece tener sobre la respuesta inflamatoria. Tanto EPA como DHA influyen sobre la función de muchas células del sistema inmune aunque algunos estudios indican que difieren en sus efectos y mecanismos de actuación. Los datos son inconsistentes y poco se sabe sobre el mecanismo por el cual los AGPI-CL omega-3 podrían tener un efecto beneficioso en la prevención de enfermedades inflamatorias y las enfermedades inmunomediadas (136). Muchos datos son en relación a la producción de eicosanoides derivados de estos ácidos grasos y su acción sobre las propiedades de las membranas celulares en condiciones de enfermedad y pocos sobre la producción de citoquinas y sujetos sanos. Por tanto, resulta interesante establecer si existe relación entre la ingesta de DHA y la producción de citoquinas inflamatorias en etapas fisiológicas como el periodo perinatal y las primeras etapas del desarrollo del recién nacido, donde el organismo es más vulnerable y donde los ácidos grasos ya han demostrado amplios beneficios, aportando así algo más de conocimiento sobre los beneficios de una dieta rica en omega-3, sin necesidad de consumir suplementos farmacológicos. OBJETIVOS Objetivos 53 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. 3. OBJETIVOS 3.1. Objetivo principal: Analizar si la administración de un suplemento diario de un producto lácteo enriquecido con aceite de pescado (320 mg de DHA y 72 mg de EPA) a la mujer embarazada durante el último trimestre de gestación y el periodo de lactancia puede influir sobre la secreción de las siguientes citoquinas: GM-CSF, IL-2, IL4, IL-6, IL-10, INFγ y TNFα. 3.2 Objetivo secundario: Analizar el patrón de ácidos grasos de la madre, de la leche materna y del recién nacido tras la suplementación diaria de la madre con un producto lácteo enriquecido con aceite de pescado (320 mg de DHA y 72 mg de EPA) durante el último trimestre de gestación y el periodo de lactancia. PACIENTES Y MÉTODOS Pacientes y métodos 62 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. voluntaria. Igualmente, a cada gestante se le asignó una clave para garantizar la confidencialidad de sus valores analíticos. Tabla 2. Composición de los productos lácteos utilizados en el estudio. Producto lácteo DHA-EPA Producto lácteo control Energía (kcal-kJ/100 mL) 58-145 58-145 Proteínas (g/100 mL) 3.7 3.7 Carbohidratos (g/100 mL) 6.7 6.7 Grasas (g/100 mL) - Saturadas (g/100 mL) - Monoinsaturadas (g/100 mL) - Poliinsaturadas (g/100 mL) 1.8 0.32 1.06 0.42 1.8 0.36 1.10 0.34 EPA (mg/100ml) 18 --- DHA (mg/100mL) 80 ---- Ácido fólico (µg/100 mL) 80 80 Vitamina B12 (µg/100 mL) 0.4 0.4 Vitamina C (mg/100 mL) 9.0 9.0 Vitamina D (µg/100 mL) 0.75 0.75 Vitamina E (mg/100 mL) 1.5 1.5 Calcio (mg/100 mL) 160 160 Hierro (mg/100mL) 2.2 2.2 Yodo (µg/100mL) 23 23 Pacientes y métodos 63 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. 4.2. MÉTODOS 4.2.1. Muestras para el análisis Se obtuvo muestras de sangre de la madre, de sus hijos y de leche materna en diferentes momentos del estudio. 4.2.1.1. Muestras maternas: Las muestras de la madre se tomaron durante el embarazo en la consulta del Ginecólogo. En la sala de parto en el momento del alumbramiento y en la consulta del Pediatra durante el periodo de la lactancia. El esquema de recogida y las cantidades se resumen a continuación:  5 ml de sangre en el momento del reclutamiento (6º mes de embarazo) en la consulta del Ginecólogo que fueron designadas con el nombre SM0.  5 ml de sangre en el momento del parto en el paritorio, SM1.  5 ml durante el periodo de lactancia en la consulta del pediatra. A los dos meses y medio (2,5 m) tras el parto (SM2), y a los 4 meses post-parto (SM3), final de la intervención dietética. 4.2.1.2. Muestras de los hijos: Las muestras de sangre de los hijos se tomaron en el momento del nacimiento en el mismo paritorio y posteriormente una segunda muestra a los dos meses y medio de vida en la consulta del Pediatra.  5 ml de sangre de vena de cordón umbilical (SH0V) en el momento del parto.  5 ml de sangre del niño a los 2,5 meses de vida (SH1) Pacientes y métodos 64 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. 4.2.1.3. Muestras de leche materna: Las muestras de leche materna se tomaron en la consulta del Pediatra intentando siempre que fuese durante las primeras horas de la mañana y del pecho que no se hubiese ofrecido en la última toma. La cronología de la recogida de muestras de leche materna se resume a continuación:  Calostro (LM0), 2-3 días post-parto.  Leche de transición (LM1), 1 mes post-parto.  Leche madura a los 2,5 y 4 meses (LM2) y (LM3) respectivamente. Figura 10. Esquema cronológico de recogida de las muestras. Pacientes y métodos 65 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. Las muestras fueron conservadas a -80ºC y enviadas al laboratorio debidamente conservadas, preferentemente en hielo seco, para evitar romper la cadena de frío. De las muestras de sangre se aisló el plasma mediante proceso de centrifugación a 3000 r.p.m durante 15 minutos (3 eppendorf de 1,5ml). Se aislaron también las membranas de eritrocitos (2 eppendorf pequeños, de 0,5ml y 1 grande) y citosol (2 ependorff de citosol pequeños) siguiendo el método descrito por Hanahan y Ekholm (161) ligeramente modificado. Una vez separado el plasma por centrifugado, se procedió a la eliminación de los leucocitos de la muestra por medio de un lavado con tampón isotónico Tris 310imOSM de pH 7.6 y posterior centrifugación a 15000 r.p.m durante 20 minutos a 4ºC, eliminándose el sobrenadante y la capa superficial de células por medio de una pipeta Pasteur. Este procedimiento de lavado se repitió dos veces más. Posteriormente, a esta suspensión se le adicionó tampón Tris hipotónico 20imOSM de pH 7.6 en una proporción 1:5. Tras la centrifugación a 15000 r.p.m durante 15 minutos y a 4ºC, se obtuvo el citosol en el sobrenadante y se continuó con el lavado del precipitado, que se correspondía con las membranas eritrocitarias. La operación de lavado con tampón hipotónico se repitió tres veces más. Tras el último lavado, las membranas quedaron con una ligera tonalidad rosácea y el sobrenadante procedente de la hemólisis de los eritrocitos totalmente incoloro. Al finalizar el segundo lavado, se procedió al transvase de las membranas a otro tubo con objeto de dejar atrás el coágulo de pseudofibrina que aportaba a las membranas una coloración rojiza. Finalmente las muestras fueron alicuotadas y congeladas a -80ºC hasta el momento de ser analizadas. 4.2.2. Análisis de ácidos grasos en leche materna, plasma y eritrocitos. 4.2.2.1. Análisis de ácidos grasos en plasma - Condiciones instrumentales. Pacientes y métodos 66 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. El perfil de ácidos grasos del plasma materno y de hijo se determinó por cromatografía de gas líquido (GLC) según lo descrito por Lepage y Roy (162) mediante la cual se puede hacer en un solo paso la metilación y transesterificación de las muestras. A continuación se muestran las condiciones de análisis optimizadas para la determinación del compuesto en las muestras problema: Tabla 3.Parámetros instrumentales para el patrón de ácidos grasos en plasma. Fase Estacionaria Supelco SPTM 2380 Fused Silica Capillary Column 60m.x0.25mm.x0.2μm. Fase Móvil Helio Purísimo VINYECCIÓN (L) 2 L CG Horno To = 60 ºC (0.5 min) T1 = 150ºC (10ºC/min, 5 min) T2 = 220 ºC (2ºC/min, 1 min) Duración 50.50 min Inyector 250 ºC (50.50 min) Flujo 1mL/min. Gases para Quemar Aire e Hidrógeno. Modo de Medida Áreas Réplicas 1 Pacientes y métodos 67 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. - Preparación de patrones y muestras. Patrones: El patrón es una mezcla de ácidos grasos que viene preparado comercialmente. Su nombre comercial es el siguiente: FAME Standards Supelco 37 componet FAME Mix. Muestras: Las muestras se pesan de forma precisa en tubos de vidrio. En un tubo de ensayo pirex se vierten 300 μL de plasma humano y se añaden 2 mL de disolución metanol-tolueno 4:1. Se agitan en vortex durante 1 minuto a temperatura ambiente y a continuación se adicionan cuidadosamente y siempre en campana de absorción de gases y con medidas de protección ocular, los 200 μl de cloruro de acetilo. Es extremadamente importante, que mientras se esté adicionando dicho compuesto se mantenga la muestra en vigorosa agitación. Tras agitar con vortex durante 1 min a temperatura ambiente se gasea la muestra con nitrógeno o argón para evitar una oxidación de los ácidos grasos. A continuación se ponen dichas muestras en un bloque calefactor durante 1 hora a 100ºC. Una vez sacadas de éste se refrigeran en un baño de hielo hasta perder la temperatura alcanzada anteriormente, y se vierten con especial cuidado 5mL de carbonato potásico al 6 % que tiene por objeto parar la reacción y neutralizarla. A continuación se lleva a cabo una agitación rápida y se centrifuga a 3500 r.p.m. durante 10 minutos con el fin de separar las fases. La fase superior bencénica es retirada con pipeta pasteur y conservada con la fracción lipídica. Posteriormente se evapora bajo corriente de nitrógeno y los lípidos que quedan en el fondo del tubo son resuspendidos en 50 μl de hexano para ser analizados en el cromatógrafo de gases modelo HP-5890 Series II (Hewlett Packard, Palo Alto, CA, USA), equipado con un detector de ionización de llama, inyector automático Hewlett Packard 7673A y un integrador Hewlett Packard 3393A. Se emplea una columna SPTM 2330 F.S (Supelco Inc. Bellefonte, Palo Alto, CA, USA) de 60 m de longitud, 32 mm de i.d. y un grosor de 20 mm. El método tiene una duración de 40 minutos y la siguiente rampa de temperatura: 5 minutos a 160ºC; 6 ºC/min hasta alcanzar los 195ºC; 4 ºC/min hasta los 220ºC; 2 ºC/min hasta los 230ºC; 12 minutos a 230ºC y 14 ºC/min hasta 160ºC. Pacientes y métodos 68 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. Se realizó la determinación cualitativa de los lípidos de membrana, por lo que los resultados han sido expresados como porcentaje (%) del total de ácidos grasos detectados en el cromatograma (C12, C14, C15, C16, C16:1, C18, C18:1, C18:2, C18:3, C18:6, C20:4, C24:1, EPA (C20: 5 n-3), DPA (C22:5 n-3) y DHA). Cada ácido graso fue identificado mediante comparación con una mezcla de ésteres metílicos de ácidos grasos (Sigma, St Louis, MO, Estados Unidos). 4.2.2.2. Análisis de ácidos grasos en membrana de eritrocito. - Condiciones instrumentales. El perfil de ácidos grasos de la membrana del eritrocito se determinó por cromatografía de gas líquido (GLC) según lo descrito por Lepage y Roy (162) mediante la cual se puede hacer en un solo paso la metilación y transesterificación de las muestras. A continuación se muestran las condiciones de análisis optimizadas para la determinación del compuesto en las muestras problema: Pacientes y métodos 69 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. Tabla 4. Parámetros instrumentales para el análisis de ácidos grasos en eritrocitos. Fase Estacionaria Supelco SPTM 2380 Fused Silica Capillary Column 60m.x0.25mm.x0.2μm. Fase Móvil Helio Purísimo VINYECCIÓN (L) 1 L CG Horno To = 160 ºC (0.0 min) T1 = 177ºC (20.0ºC/min, 10 min) T2 = 177 ºC (1.1ºC/min, 1 min) T3 = 195 ºC (1.5ºC/min, 0 min) T4 = 230 ºC (15ºC/min, 7 min) Duración 33.18 min Inyector 250 ºC (33.18 min) Flujo 1mL/min. Gases para Quemar Aire e Hidrógeno. Modo de Medida Áreas cuya unidad de medida son las cuentas. Tª Detector. 260ºC Réplicas 1 - Preparación de patrones y muestras. Patrones: El patrón es una mezcla de ácidos grasos que viene preparado comercialmente. Su nombre comercial es el siguiente: FAME Standards Supelco 37 componet FAME Mix. Pacientes y métodos 70 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. Estándar Interno: El patrón comercial utilizado es el metil tricosanoato (C:23 metilado) a una concentración de 1mg/mL. A continuación se realiza una dilución 1/12 para que la concentración final quede a 0.083 mg/mL Muestras: En un tubo de ensayo pirex se vierten 500 μL de eritrocitos y se añade 1mL de PBS 10x. Se somete a continua agitación. Posteriormente se centrifuga durante 10min a 6000 r.p.m. y se elimina la fracción hemoglobínica (sobrenadante) evitando arrastrar el pelet de las membranas de los eritrocitos. Se añaden 200μL de C:23 a una concentración de 0,083mg/mL. Se agita suavemente y se añaden 2 mL de disolución metanol-tolueno 2:1. Agitación en vortex durante 1 minuto a temperatura ambiente y a continuación se añaden 200 μl de cloruro de acetilo. Es extremadamente importante, que mientras se esté adicionando dicho compuesto se mantenga la muestra en vigorosa agitación. Tras agitar con vortex durante 1 min a temperatura ambiente se gasea la muestra con nitrógeno o argón para evitar una oxidación de los ácidos grasos. A continuación se ponen dichas muestras en un bloque calefactor durante 1 hora a 100ºC. Una vez sacadas de éste se refrigeran en un baño de hielo hasta perder la temperatura alcanzada anteriormente, y se vierten con especial cuidado 5mL de carbonato potásico al 6 %. A continuación se lleva a cabo una agitación rápida y se centrifuga a 3500 r.p.m. durante 10 minutos. Se recoge con una pipeta pasteur el sobrenadante obtenido (tolueno) y se lleva a sequedad total con ayuda del speed vac. A continuación se resuspende el extracto seco obtenido en 50μL de tolueno. Se agita y se vierte al vial con inserto cromatográfico. Por último se inyecta 1μl en el cromatógrafo de gases con detector FID. Los resultados se expresan a una concentración μg/μL tras haberse calculado mediante la fórmula (señal (cuentas) de la muestra/ señal (cuentas) del SI) x concentración SI. La señal se obtendrá habiendo realizado una correcta integración de los picos anteriormente. Pacientes y métodos 71 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. 4.2.2.3. Análisis de ácidos grasos en leche materna. El perfil de ácidos grasos de la leche materna se determinó por cromatografía de gas líquido (GLC) según lo descrito por Lepage y Roy (162) mediante la cual se puede hacer en un solo paso la metilación y transesterificación de las muestras. A continuación se muestran las condiciones de análisis optimizadas para la determinación del compuesto en las muestras problema: Tabla 5. Parámetros instrumentales para el análisis de ácidos grasos en leche materna. Fase Estacionaria Supelco SPTM 2380 Fused Silica Capillary Column 60m.x0.25mm.x0.2μm. Fase Móvil Helio Purísimo VINYECCIÓN (L) 1 L CG Horno To = 62 ºC (0.5 min) T1 = 150ºC (15.5ºC/min, 5 min) T2 = 177 ºC (1.1ºC/min, 1.5 min) T3 = 195 ºC (1.5ºC/min, 0 min) T4 = 230 ºC (15ºC/min, 7 min) Duración 50.50 min Inyector 250 ºC (33.18 min) Flujo 1mL/min. Gases para Quemar Aire e Hidrógeno. Modo de Medida Áreas Tª Detector. 260ºC Réplicas 1 Pacientes y métodos 78 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. Cada ácido graso se resumió según fase (0, 1, 2 y 3) y tratamiento (Control y DHA) en mediana y rango intercuartílicos (IQR). En lo que sigue, omitimos en la notación el índice correspondiente a cada uno de los ácidos grasos (l). En cada fase, las medianas de ambos tratamientos se compararon con el test de Wilcoxon para datos independientes. En orden a realizar una comparación global entre las trayectorias de los ácidos grasos entre los grupos Control y DHA (evolución de los porcentajes de ácido graso) se consideró el siguiente modelo de análisis de efectos mixtos (163): (M) yi,j,k =  +  j +  i,j + bk + ei,j,k : i = Control, DHA; j = 0,1,2,3 donde  j es el efecto de fase (  0 = 0),  i,j es el efecto de grupo (tratamiento) según fase (  Control,j =  i,0 = 0*, para todo i, j), bk es el efecto aleatorio correspondiente al k-ésimo sujeto mientras que ei,j,k son variables aleatorias independientes N(0 ,  e) e independientes de bk. *Para la lactancia materna, no se impone que βDHA,0=0. La intervención con la suplementación de DHA se inicia desde el 6º mes de gestación, por lo que en las muestras de calostro (fase 0 para lactancia materna) se puede reflejar el efecto de la misma. En orden a contrastar el efecto de tratamiento, consideramos el modelo reducido: (M0) yi,j,k =  +  j + bk + ei,j,k : i = Control, DHA; j = 0,1,2,3 Ambos modelos se estimaron por el método de la máxima verosimilitud. El efecto de tratamiento se contrastó mediante el test de razón de verosimilitudes que compara los modelos M y M0. Pacientes y métodos 79 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. 4.2.4.3. Evolución de los ácidos grasos en niños (plasma y eritrocitos). Para los niños, las determinaciones de los ácidos grasos sólo se realizaron en las fases 0 y 1 (0= nacimiento; 1= 2.5 meses de vida). Por tal motivo, en cada fase y para cada tratamiento, los porcentajes se resumieron en medianas y rangos intercuartílicos. Las comparaciones entre tratamientos se llevaron a efecto utilizando el test de Wilcoxon para datos independientes. 4.2.4.4. Evolución de las citoquinas en madres. Para cada una de las citoquinas, representaremos por citoquinai,j,k su determinación en la gestante k perteneciente al grupo i-ésimo de tratamiento (i = DHA, control) en la fase j (j = 0, 1, 2). Las citoquinas se resumieron según fase (0, 1 y 2) y tratamiento (DHA, control) en medianas y rangos intercuartílicos (IQR). En orden a evaluar el efecto del DHA sobre las citoquinas se consideró el siguiente modelo de análisis de efectos mixtos (163): (M) citoquinai,j,k =  +  j +  i,j + madrek + ei,j,k : i = DHA, control ; j = 0,1,2 donde  j es el efecto de fase (  0 = 0),  i,j es el efecto de tratamiento según fase (  control,,j =  i,0 = 0, para todo i, j), madrek es el efecto aleatorio correspondiente a la k-ésima madre mientras que ei,j,k son variables aleatorias independientes N(0 ,  e) e independientes de madrek. En orden a contrastar el efecto de tratamiento, consideramos el modelo reducido: (M0) citoquinai,j,k =  +  j + madrek + ei,j,k : i = DHA, control; j = 0,1,2 Ambos modelos se estimaron por el método de la máxima verosimilitud. El efecto de tratamiento se contrastó mediante el test de razón de verosimilitudes que compara los modelos M y M0. Pacientes y métodos 80 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. 4.2.4.5. Evolución de las citoquinas en niño. Las citoquinas en niños sólo se determinaron en las fases 0 y 1 (0= nacimiento; 1= 2.5 meses de vida). Por tal motivo, en cada fase y para cada tratamiento, los datos se resumieron en medianas y rangos intercuartílicos. Las comparaciones entre tratamientos se llevaron a efecto utilizando el test de Wilcoxon para datos independientes. 4.2.4.6. Asociación del DHA con las citoquinas. Las asociaciones entre el DHA y las diferentes citoquinas se llevaron a efecto mediante el coeficiente de correlación de Spearman. En todos los análisis, un contraste de hipótesis se consideró estadísticamente significativo cuando los correspondientes p-valores fueron inferiores a .05. Todos los análisis de datos se llevaron a efecto utilizando el paquete estadístico R. RESULTADOS Resultados 83 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. 5. RESULTADOS 5.1. Somatometría de las madres e hijos. Analizamos las características antropométricas de las madres participantes en el estudio, como se muestran en la tabla 7. No encontramos diferencias estadísticamente significativas en cuanto a edad, peso, talla, tensión arterial y parámetros bioquímicos tales como perfil lipídico y glucemia. Lo que demuestra la homogeneidad basal entre grupos. Tampoco, encontramos diferencias en el curso del embarazo y parto, sin diferencias en la edad gestacional y la puntuación del Apgar en el recién nacido. La somatometría de los hijos tampoco muestra diferencias, siendo el peso, la talla y el perímetro craneal similar en ambos grupos como podemos ver en la tabla 8. La evolución de las características antropométricas en los niños tampoco fue diferente a lo largo del estudio, como se refleja en la figura 12. En el seguimiento realizado a lo largo del primer año de vida de los niños no detectamos diferencias significativas en cuanto a las variaciones de peso, talla y perímetro craneal entre grupos, siendo el crecimiento lineal y similar en ambos. Resultados 84 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. Tabla 7. Características de las madres e hijos Control (N = 70) DHA (N = 67) p Edad, años 30.3 ± 4.9 30.6 ± 5.4 .765 Peso, kg (6 meses) 72.1 ± 13.2 70.9 ± 11.0 .569 Talla, cm 163 ± 6.4 163 ± 6.4 .743 IMC, Kg/m2 (6 meses) 27.2 ± 5.0 26.5 ± 3.7 .406 Hijos: varones / mujeres, % 58.9 / 41.1 52.8 / 47.2 .522 Tensión arterial sistólica, mmHg 110 ± 13 107 ± 9 .169 Tensión arterial diastólica, mmHg 65.8 ± 8.3 64.3 ± 6.8 .273 Colesterol sérico total, mg/dL 257 ± 39 253 ± 41 .638 Triglicéridos, md/dL 152 (124 ; 195) 156 (124 ; 187) .875 Glucemia, mg/dL 97 (78 ; 112) 90 (77 ; 126) .927 Hemoglobina, g/dL 12 (11 ; 12) 12 (11 ; 12) .529 Hematocrito 35 (32 ; 36) 34 (33 ; 36) .849 Semana del parto 40 (39 ; 41) 39 (38 ; 40) .542 Apgar 1, % ≤ 8 9 27.1 72.9 17.0 83.0 .237 Apgar 5, % ≤ 8 9 10 10.4 75.0 14.6 6.4 74.5 19.1 .706 Los datos son medias ± SD, medianas (IQR) y porcentajes Resultados 85 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. Tabla 8. Medidas antropométricas de los hijos Fase Control (N = 56) DHA (N = 53) P Peso, Kg 0 3.15 ± 0.49 3.23 ± 0.53 .390 1 4.15 ± 0.63 4.27 ± 0.74 .411 Talla, cm 0 50.13 ± 2.87 50.12 ± 2.38 .978 1 54.26 ± 2.52 54.56 ± 2.80 .578 Perímetro cefálico, cm 0 34.20 ± 1.36 33.85 ±1.55 .285 1 37.27 ± 1.31 37.11 ± 1.66 .601 Los datos son medias (±SD) Resultados 86 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. Figura 12. Evolución de los valores esperados de peso, talla y perímetro craneal en el primer año de vida. Control —; Suplementado - - 0246810 12 3456789 Meses Peso (Kg) 0246810 12 50 55 60 65 70 75 Meses Talla (cm) 0246810 12 36 38 40 42 44 46 Meses Perímetro Craneal (cm) Grupo A Grupo B p = 0.137 Resultados 87 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. 5.2. Determinación de la composición de ácidos grasos en plasma materno. La evolución de los ácidos grasos en plasma materno a lo largo del tiempo de estudio se muestra en la figura 13 y los datos para cada ácido graso, fase y grupo se resumen en la tabla 9. En el momento basal (reclutamiento) no se encuentran diferencias significativas entre grupos para ninguno de los ácidos grasos analizados en plasma materno, siendo sus niveles similares en ambos grupos lo que manifiesta la homogeneidad entre ellos. Los ácidos grasos saturados aumentan en ambos grupos en el momento del parto, no detectando diferencias significativas, salvo para el ácido palmitoleico, cuyo aumento fue mayor en el grupo control. En general, en ambos grupos las concentraciones de los ácidos grasos saturados tienden a aumentar hasta el momento del parto disminuyendo de forma progresiva posteriormente. Sin embargo, los ácidos grasos insaturados parecen llevar una trayectoria inversa. Disminuyen en el momento del parto con tendencia a aumentar en los meses posteriores. No obstante, no se encuentran diferencias significativas entre grupos para esta fase. Destaca que las concentraciones del ácido nervónico, el EPA, el DPA y el DHA son mayores, aunque no estadísticamente significativas, en el grupo suplementado en el momento del parto. A los 2 meses y medio del mismo, este aumento se hace más evidente encontrando diferencias estadísticamente significativas entre grupos para los ácidos EPA (p<.001) y DHA (p <.001). También cabe señalar que el ácido graso gamma linolénico aumenta de forma significativa (p=.004) en este periodo en el grupo control respecto al suplementado. A los 4 meses post-parto encontramos nuevamente mayor concentración de estos ácidos grasos, EPA (p.001) y DHA (p.0042), en el grupo suplementado. El resto de ácidos grasos no muestran diferencias significativas entre ambos grupos. Resultados 94 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. Tabla 10b. Continuación. Composición de los ácidos grasos en membrana de eritrocito materno. Ácido Fase Control DHA p p global Ácido α linolénico (ALA) C18:3n-3 0 0 (0; 0.033) 0 (0 ; 0.085) 1 .446 1 0 (0; 0.065) 0.027 (0; 0.1) .82 2 0.065 (0.046; 0.087) 0.066 (0.052; 0.093) .99 3 0.068 (0; 0.111) 0.076 (0; 0.102) .112 Á.gamma-linolénico (GLA) C18:3n-6 0 0.223 (0; 0.473) 0 (0; 0.43) 1 .885 1 0 (0; 0) 0 (0; 0) .699 2 0 (0; 0.121) 0.092 (0; 0.139) .476 3 0.123 (0.068; 0.156) 0.13 (0.068; 0.162) .693 Ácido Araquidónico (ARA) C20:4n-6 0 13.202 (12.426; 14.46) 13.021 (11.837; 14.326) 1 .532 1 7.835 (4.104; 11.408) 7.997 (4.882; 11.626) .93 2 14.376 (13.092; 15.389) 13.651 (12.308; 14.114) .601 3 16.323 (14.939; 17.523) 15.039 (14.058; 15.982) .155 Ácido Nervónico C24:1n-9 0 7.792 (6.228; 8.498) 7.511(6.071; 8.304) 1 .289 1 6.763 (4.979; 7.608) 6.71 (6.033; 7.913) .37 2 4.123 (3.918; 4.91) 4.222 (3.905; 4.627) .754 3 4.75 (4.183; 5.758) 5.339 (4.874; 6.086) .091 Ácido Eicosapentaenoico (EPA) 20:5n-3 0 0.51 (0.315; 1.059) 0.463 (0.214; 1.068) 1 .468 1 0.155 (0; 0.346)a 0.297 (0.097 ; 0.52)b .039 2 0.438 (0.282; 0.62) 0.731 (0.55; 1.175) .178 3 0.531 (0.361; 0.694) 0.81 (0.464; 1.001) .95 Ácido Docosapentaenoico (DPA) 22:5n-3 0 1.201 (1.009; 1.427) 1.222 (1.053; 1.53) 1 .425 1 0.473 (0.223; 0.747) 0.567 (0.32; 1.234) .22 2 3 1.27 (1.153; 1.448) 1.332 (1.083; 1.787) 1.597 (1.297; 1.695) 1.663 (1.501; 1.935) .385 .485 Ácido docosahexaenoico (DHA) 22:6n-3 0 4.905 (4.227; 5.373) 4.77 (4.373; 5.748) 1 .004 1 2.004 (1.057; 4.052) 3.111 (1.642; 5.581) .058 2 4.091 (3.542; 4.711) a 5.343 (4.343; 5.798) b .01 3 3.733 (3.267; 5.002) a 5.313 (4.318; 5.871) b .007 Los datos son medianas (IQR).Diferentes superíndices indican diferencias significativas en fase. Resultados 95 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. Figura 14a. Evolución de los ácidos grasos en membrana de eritrocito materno Control —; Suplementado - - Resultados 96 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. Figura 14b. Continuación. Evolución de los ácidos grasos en membrana de eritrocito materno Control —; Suplementado- - Resultados 97 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. 5.4. Determinación de la composición de ácidos grasos en leche materna. Como se muestra en la tabla 11 y figura 15a y 15b, en el análisis del patrón lipídico de la leche materna, sólo se encuentra significación estadística para el DHA (p <.001) y el ácido pentadecílico (p=0.032). En el caso del ácido pentadecílico, las diferencias se deben al aumento de concentración de este ácido graso saturado en el grupo control respecto al suplementado, siendo más notable en la leche madura, a los 4 meses de la lactancia. Tabla 11a. Composición de los ácidos grasos en leche materna Ácido Fase Control Suplementado p p global Ácido Láurico C12:0 0 1.695 (0.653; 2.857) 1.423 (0.899 ; 2.442) .851 .926 1 3.101 (2.338; 4.888) 3.588 (2.355; 6.522) .61 2 2.524 (2.147; 4.011) 3.074 (2.176; 4.873) .437 3 4.58 (3.259; 6.818) 4.52 (2.823; 6.644) .73 Ácido Mirístico C14:0 0 3.81 (2.925; 5.129) 3.949 (3.015; 4.959) .824 .076 1 4.553 (3.262; 6.042) 4.726 (3.065; 7.205) .038 2 4.184 (3.331; 4.875) 4.727 (3.035; 6.27) .181 3 7.283 (4.36; 8.261) 4.245 (3.29; 6.974) .129 Ácido Pentadecílico C15:0 0 0.185 (0.138; 0.225) 0.184 (0.125; 0.234) .997 .032 1 0.204 (0.147; 0.256) 0.189 (0.128; 0.252) .98 2 0.133 (0.109; 0.202) 0.148 (0.036; 0.192) .958 3 0.237 (0.161; 0.304) a 0.159 (0.121; 0.257) b .001 Ácido Palmítico C16:0 0 22.44 (20.046; 24.073) 22.752 (19.811; 25.101) .51 .537 1 20.476 (17.637; 22.795) 20.046 (16.682; 20.991) .18 2 18.434 (15.31; 20.209) 17.377 (14.678; 20.081) .848 3 20.181 (19.133; 22.199) 18.073 (14.069; 21.495) .354 Ácido Palmitoleico C16:1n-7 0 2.136 (1.483; 5.944) 2.044 (1.546; 6.373) .342 .575 1 3.236 (1.839; 5.604) 2.97 (1.686; 6.371) .329 2 5.731 (1.198; 7.559) 5.316 (1.56; 7.28) .908 3 2.945 (1.422; 5.637) 1.777 (1.285; 6.066) .821 Los datos son medianas (IQR).Diferentes superíndices indican diferencias significativas en fase Resultados 98 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. Tabla 11b. Continuación. Composición de los ácidos grasos en leche materna. Ácido Fase Control Suplementado p p global Ácido Esteárico C18:0 0 5.371 (1.653; 7.046) 4.218 (1.417; 7.364) 584 .927 1 5.514 (1.712; 6.923) 3.585 (1.683; 6.551) .714 2 2.205 (1.534; 5.658) 2.555 (1.113; 6.553) .819 3 4.703 (2.201; 6.607) 4.315 (1.748; 6.632) .72 Ácido Oléico C18:1n-9 0 44.408 (41.899; 45.906) 42.808 (39.587; 46.141) .228 .281 1 42.108 (37.692; 46.799) 42.584 (38.313; 46.695) .486 2 46.614 (44.092; 51.346) 45.245 (40.636; 49.392) .18 3 44.227 (38.172; 47.546) 45.864 (38.09; 51.908) .277 Ácido Linoleico (LA) C18:2n-6 0 14.217 (12.794; 18.05) 14.71 (12.819; 18.505) .629 .688 1 18.026 (14.142; 20.273) 16.035 (13.315; 19.073) .356 2 16.066 (13.92; 19.542) 15.785 (14.506; 18.771) .696 3 15.403 (10.116; 17.663) 13.992 (10.826; 18.106) .413 Ácido α linolénico (ALA) C18:3n-3 0 0.487 (0.386; 0.657 ) 0.451 (0.394 ; 0.585) .972 .685 1 0.697 (0.484; 0.879) 0.6 (0.488; 0.747) .144 2 0.673 (0.554; 0.932) 0.633 (0.431; 0.862) .678 3 0.686 (0.481; 0.907) 0.647 (0.532; 0.867) .962 Á.gammalinolénico (GLA) C18:3n-6 0 0 (0; 0.034) 0 (0; 0) 975 .450 1 0.172 (0.107; 0.218) 0.141 (0.112; 0.175) .858 2 0.153 (0.119; 0.219) 0.116 (0; 0.147) .056 3 0.113 (0.077; 0.189) 0.103 (0.083; 0.155) .98 Los datos son medianas (IQR). Diferentes superíndices indican diferencias significativas en fase. La concentración de DHA fue significativamente mayor en la leche materna de las madres suplementadas en las siguientes fases del estudio: leche de transición, 2,5 y 4 meses tras el parto. La mayor diferencia entre grupos se registra en la leche de transición con una p <.001. Otros ácidos grasos como EPA y ARA también experimentan diferencias entre grupos aunque no significativamente de forma global. En leche de transición de las madres suplementadas se registra significativamente mayor concentración de EPA que en las del grupo control. Para el resto de las fases, aunque la concentración de EPA es Resultados 99 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. mayor en la leche de las madres del grupo DHA, no se registran diferencias estadísticas. Algo similar ocurre con la concentración de ARA, pero en el grupo control. En la leche materna del grupo control a los 2,5 meses de la lactancia se registra mayor concentración de ARA respecto al grupo DHA. En el resto de fases no se registran diferencias significativas. Tabla 11c. Continuación. Composición de los ácidos grasos en leche materna. Ácido Fase Control Suplementado p p global Ácido Araquidónico (ARA) C20:4n-6 0 1.093 (0.849; 1.503) 1.082 (0.916; 1.327) .499 .161 1 0.666 (0.535; 0.774) 0.539 (0.466; 0.65) .133 2 0.665 (0.549; 0.794)a 0.532 (0.423; 0.592)b .027 3 0.506 (0.405; 0.669) 0.552 (0.366; 0.642) .961 Ácido Nervónico C24:1n-9 0 0.946 (0.632; 1.302) 1.042(0.69; 1.319) .429 .870 1 0.125 (0.094; 0.174) 0.097 (0.085; 0.134) .45 2 0.128 (0.078; 0.148) 0.09 (0; 0.117) .791 3 0.05 (0.021; 0.074) 0.074 (0.033; 0.116) .984 Ácido Eicosapentaenoico (EPA) 20:5n-3 0 0.078 (0; 0.277) 0.119 (0; 0.255) .682 .151 1 0.066 (0.001; 0.102)a 0.135 (0.073; 0.199)b .021 2 0.052 (0; 0.1) 0.122 (0.008; 0.186) .209 3 0.049 (0.011; 0.098) 0.095 (0.037; 0.145) .268 Ácido Docosapentaenoico (DPA) 22:5n-3 0 0.337 (0.215; 0.436) 0.381 (0.32; 0.595) .061 .314 1 0.137 (0.106; 0.203) 0.182 (0.13; 0.234) .322 2 3 0.196(0.128; 0.215) 0.123 (0.106; 0.167) 0.203 (0.154; 0.268) 0.174 (0.13; 0.244) .714 .295 Ácido docosahexaenoico (DHA) 22:6n-3 0 0.767 (0.503; 1.166) 0.987 (0.836; 1.27) .1 <.001 1 0.382 (0.227; 0.486) a 0.707 (0.499; 0.872) b <.001 2 0.366 (0.243; 0.508) a 0.664 (0.605; 0.977) b .001 3 0.311 (0.226; 0.443) a 0.509 (0.39; 0.765) b .002 Los datos son medianas (IQR).Diferentes superíndices indican diferencias significativas en fase. Resultados 100 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. Figura 15a. Evolución de los ácidos grasos en leche materna (%) Control —; Suplementado - - Resultados 101 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. Figura 15b. Continuación. Evolución de los ácidos grasos en leche materna (%) Control —; Suplementado - - Resultados 102 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. 5.5. Determinación de ácidos grasos en plasma de hijo. Como se muestra en la tabla 12a y 12b, el DHA y otros ácidos grasos omega-3 de cadena larga como el EPA y el ácido nervónico, registraron concentraciones significativamente mayores en el plasma de los hijos del grupo DHA. Por su parte, la concentración de ARA fue significativamente mayor en sangre de cordón umbilical del grupo control respecto al suplementado. El ácido GLA también fue significativamente mayor en el plasma de los niños del grupo control a los dos meses y medio de vida. Una tendencia similar registraron los ácidos grasos saturados analizados aunque no se encuentran diferencias estadísticamente significativas, salvo para el ácido esteárico cuya concentración fue significativamente mayor en sangre de cordón umbilical de los niños del grupo control. La concentración de EPA fue significativamente mayor (p=0.013) en sangre de cordón umbilical de los niños cuyas madres fueron suplementadas con DHA. De hecho la media de concentración de EPA en sangre de cordón umbilical de los niños del grupo control fue cero. A los 2,5 meses de vida, la concentración de EPA sigue siendo significativamente mayor en el plasma de los niños del grupo suplementado (p=0.023). En el caso del DHA aunque las concentraciones fueron mayores en el grupo suplementado, no se hallan diferencias estadísticas en la sangre de cordón umbilical. A los 2,5 meses de vida, sí se registran concentraciones significativamente mayores en el plasma de los niños del grupo DHA. En el análisis destaca también el comportamiento del ácido nervónico. Los niños del grupo suplementado tenían mayor concentración del mismo en plasma a los dos meses y medio de vida, siendo la diferencia estadísticamente significativa (p=0.026). Resultados 103 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. Tabla 12a. Composición de los ácidos grasos en plasma de hijo. Ácido Fase Control Suplementado p valor Ácido Láurico C12:0 0 0 (0; 0) 0 (0; 0) 1 0 (0; 0.653) 0 (0; 0) .619 Ácido Mirístico C14:0 0 0.894 (0.697; 1.062) 0.893 (0.594; 1.022) .468 1 1.247 (0.828; 1.95) 0.96 (0.66; 1.881) .169 Á. Pentadecílico C15:0 0 0 (0; 0) 0 (0; 0.112) .178 1 0.057 (0; 0.149) 0.026 (0; 0.129) .517 Ácido Palmítico C16:0 0 29.74 (19.424; 31.166) 28.978 (20.734; 31.541) .793 1 18.402 (17.104; 25.016) 17.262 (16.117; 23.359) .36 Á. Palmitoleico C16:1n-7 0 3.147 (2.421; 3.872) 2.965 (2.149; 4.032) .498 1 0.847 (0.767; 1.107) 0.77 (0.692; 0.978) .215 Ácido Esteárico C18:0 0 11.154 (10.724; 11.689) a 10.641 (9.817; 11.492) b .05 1 9.377 (8.728; 10.009) 9.66 (9.25; 10.055) .321 Ácido Oleico C18:1n-9 0 18.874 (17.595; 20.643) 19.278 (17.319; 20.714) .793 1 29.04 (26.475; 31.35) 27.038 (24.421; 29.051) .075 Ácido Linoleico C18:2n-6 0 12.711 (11.029; 13.916) 12.748 (10.88; 14.122) .635 1 23.956 (21.688; 25.62) 24.928 (23.546; 26.385) .127 Ácido α Linolénico C18:3n-3 0 0 (0; 0) a 0 (0; 0) b .026 1 0.403 (0.266; 0.612) 0.289 (0.221; 0.554) .151 Á.gamma-linolénico C18:3n-6 0 0 (0; 0.473) 0 (0; 0.395) .86 1 0.207 (0.155; 0.256) a 0.136 (0; 0.185) b .002 Ác. Araquidónico C20:4n-6 0 15.692 (13.46; 19.472) a 13.898 (12.089; 16.958)b .044 1 7.109 (5.601; 9.112) 7.283 (6.342; 8.519) .503 Á. Nervónico C24:1n-9 0 2.39 (1.94; 3.747) 2.223 (1.973; 3.445) .641 1 1.801 (1.242; 3.628) a 3.788 (1.632; 4.524) b .026 Los datos son medianas (IQR). Diferentes superíndices indican diferencias significativas en fase. Resultados 110 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. que en el momento del parto, los niveles detectados entre ambos grupos presentan una diferencia no menospreciable, siendo mayores en el grupo control. Por el contrario, el INF-γ presenta mayores niveles en el grupo DHA pero las diferencias detectadas no son significativas en ninguna de las fases estudiadas. Por su parte, el GM-CSF aumenta de forma significativa en el momento del parto en el grupo DHA, experimentando un descenso a los 2 meses y medio post-parto. En el grupo control, el comportamiento del GM-CSF sigue un patrón lineal sin grandes cambios durante el tiempo del estudio, disminuyendo discretamente en el momento del parto, al contrario de lo que sucede en el grupo DHA donde se registra un aumento considerable de su concentración plasmática. Las diferencias detectadas entre ambos grupos son estadísticamente significativas. Resultados 111 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. Tabla 15. Distribución de las citoquinas en plasma de madre. Citoquina Fase Control DHA p p global GM-CSF 0 4.372 (1.345; 6.145) 5.406 (2.541; 10.048) 1 .030 1 3.862 (3.207; 8.66) a 10.825 (5.207; 14.491) b .013 2 4.677 (3.137; 7.335) 5.736 (4.575; 10.367) .109 IL-10 0 39.264 (23.086; 49.914) 36.248 (20.798; 68.83) 1 .060 1 27.201 (18.557; 34.114)a 46.585 (21.565; 62.406)b .046 2 56.416 (43.194; 66.41) 69.431 (51.098; 74.929) .185 IL-2 0 1.11 (0.892; 1.222) 1.447 (1.082; 1.668) 1 .150 1 1.704 (0.929; 3.304) 1.924 (0.617; 3.399) .776 2 1.428 (1.077; 2.234) 2.912 (1.566; 4.303) .06 IL-4 0 10.729 (7.076; 14.415) 12.251 (9.713; 17.486) 1 .009 1 7.668 (4.627; 9.275) 11.503 (8.359; 13.316) .091 2 14.057 (11.984; 21.587) a 24.023 (15.015; 28.847) b .007 IL-6 0 5.698 (4.904; 6.076) 5.655 (4.195; 8.313) 1 .001 1 42.3 (29.098; 63.343) a 25.131 (16.482; 48.538) b <.001 2 10.246 (5.151; 12.975) 8.688 (3.73; 10.331) .806 INF- 0 8.93 (4.714; 19.073) 12.036 (7.025; 16.04) 1 .989 1 4.161 (2.824; 10.112) 6.151 (1.706; 15.663) .994 2 19.266 (13.636; 28.733) 25.385 (16.507; 30.665) .883 TNF- 0 15.77 (12.568; 18.063) 14.886 (9.905; 23.113) 1 .085 1 11.901 (10.674; 15.139) 10.674 (8.349; 13.939) .055 2 24.505 (21.388; 26.077) 23.391 (17.844; 25.412) .262 Los datos son medianas (IQR).Diferentes superíndices indican diferencias significativas en fase. Resultados 112 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. Figura 17. Distribución de las citoquinas en plasma de madre. Control —; Suplementado - - Resultados 113 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. 5.8. Determinación de citoquinas en plasma de hijo. Las citoquinas en el plasma de los hijos presentan un patrón diferente al plasma materno. La IL-10 presenta niveles casi equitativos en ambos grupos, detectándose un discreto aumento en el grupo suplementado a los dos meses y medio de vida aunque no con significación estadística. La IL-2 y la IL-4 presentan mayores concentraciones en el grupo control aunque tampoco en este caso se detectan diferencias significativas. Por el contrario, sí se encuentran diferencias considerables para la IL-6 y el TNF- en el momento del nacimiento y para el TNF- también, a los 2 meses y medio de vida. Ambas citoquinas se encuentran en mayor concentración en el grupo control que en el DHA. El INF-γ se comporta prácticamente igual en ambos grupos en el momento del nacimiento. A los dos meses y medio de vida, aumenta y se registra mayor concentración en el grupo control, aunque no de forma estadísticamente significativa. Por el contrario el GM-CSF se detecta en mayor concentración en plasma de los hijos pertenecientes al grupo DHA a los dos meses y medio de vida con diferencias estadísticamente significativas. Sin embargo, al nacimiento las cifras son mayores en el grupo control aunque los datos no son consistentes. Los resultados se resumen en la tabla 16 y el comportamiento de las citoquinas a lo largo del tiempo en la figura 18. Resultados 114 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. Tabla 16. Distribución de las citoquinas en plasma de hijo. Citoquinas Fase Control Suplementado P GM-CSF 0 4.741 (2.514; 6.689) 3 (2.311; 4.235) .064 1 7.046 (4.918; 7.502) a 7.81 (5.41; 10.733) b .026 IL-10 0 37.657 (29.044; 50.904) 37.657 (31.233; 41.827) .528 1 110.324 (95.938; 133.966) 113.105 (92.191; 118.392) .657 IL-2 0 0.695 (0.259; 0.91) 0.78 (0.594; 1.017) .803 1 3.943 (2.456; 5.163) 2.767 (2.475; 5.927) .579 IL-4 0 9.713 (7.261; 13.91) 7.517 (6.079; 9.383) .589 1 49.455 (38.889; 66.351) 43.235 (33.27; 73.603) .779 IL-6 0 32.637 (24.449; 73.234) a 23.313 (18.936; 36.936) b .008 1 10.59 (7.99; 14.656) 10.59 (8.862; 16.634) .766 INF-γ 0 4.161 (3.482; 9.002) 4.161 (2.033; 6.812) .477 1 38.304 (31.97; 49.058) 37.521 (25.487; 42.192) .573 TNF-α 0 25.439 (19.654; 31.581) a 21.267 (17.155; 22.254) b .019 1 39.968 (33.973; 54.791) a 37.707 (28.346; 47.221) b .017 Los datos son medianas (IQR).Diferentes superíndices indican diferencias significativas en fase. Resultados 115 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. Figura 18. Distribución de las citoquinas en plasma de hijo. Control —; Suplementado - - Resultados 116 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. 5.9. Relación entre el DHA del plasma y membrana de eritrocitos materno con las citoquinas. Se analiza si existe relación entre las concentraciones de DHA acumuladas en el plasma y la membrana de eritrocitos de la madre con los niveles de citoquinas hallados en el momento del parto y dos meses y medio después en el plasma materno. 5.9.1 Relación entre el DHA plasmático y citoquinas. En el momento del parto no se hallan correlaciones significativas entre el DHA del plasma materno con los niveles de citoquinas en plasma. Sin embargo a los 2,5 meses tras el parto, que supone unos 5 meses y medio tras el inicio de la intervención dietética, se halla correlación inversa y estadísticamente significativa entre el DHA acumulado en el plasma materno y los niveles de IL-6. De manera que a mayor concentración de DHA, menores son los niveles detectados de IL-6 en el plasma de la madre. Los datos se muestran en la tabla 17 y figuras 19 y 20. 5.9.2 Relación entre el DHA de membrana de eritrocitos y citoquinas. Se encuentra correlación entre el DHA acumulado en la membrana de los eritrocitos materno y el factor estimulante de las colonias de macrógafos y granulocitos tanto en el momento del parto como tras 2,5 meses del mismo. Se relacionan de una forma directamente proporcional y estadísticamente significativa. De manera que a mayor concentración de DHA en la membrana de los eritrocitos, mayores son los niveles de GM-CSF en el plasma. Las asociaciones se muestran en la tabla 18 y figura 21 y 22. Resultados 117 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. Tabla 17. Correlaciones de Spearman % de DHA en plasma materno y citoquinas. Citoquina Reclutamiento Parto 2.5 m tras parto Rho P-valor Rho P-valor Rho P-valor GM-CSF 0,0577 0,7841 0,1701 0,3362 0,0782 0,6982 IL-10 0,0067 0,9727 0,2780 0,1114 0,0451 0,8163 IL-2 0,1552 0,4795 -0,0644 0,7650 -0,0474 0,8108 IL-4 -0,2060 0,3232 0,1000 0,6342 0,2502 0,1905 IL-6 -0,0939 0,6279 -0,1102 0,5350 -0,4691 0,0103 INF-γ 0,0328 0,8659 -0,0694 0,7207 -0,1632 0,3977 TNF-α -0,0520 0,7889 -0,0971 0,5849 -0,1338 0,4889 Rho = Coeficiente de correlación de Spearman; P H0: No hay correlación Resultados 118 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. Figura 19. Correlación entre el DHA en plasma materno con las citoquinas en el momento del parto. Resultados 119 Efecto de la suplementación materna gestante y lactante con DHA sobre la inflamación y el patrón de ácidos grasos. Figura 20. Correlación entre el DHA en plasma materno con las citoquinas a los 2,5 meses tras el parto.