La trombocitopenia como factor de riesgo en el ductus arteriosus persistente del recién nacido prematuro

UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD DEPARTAMENTO DE CIENCIAS CLÍNICAS Perspectivas actuales en la investigación en Perinatología, Ginecología y Pediatría LA TROMBOCITOPENIA COMO FACTOR DE RIESGO EN EL DUCTUS ARTERIOSUS PERSISTENTE DEL RECIÉN NACIDO PREMATURO Tesis doctoral presentada por Mª Pilar Bas Suárez para optar al grado de doctor en Medicina. Dirigida por los Doctores Dr. Luis Peña Quintana, Dr. Eduardo Villamor Zambrano y Dra. Gema E. González Luis. Fdo. Directores Fdo. Doctorando Las Palmas de Gran Canaria, 28 de septiembre de 2015 AYUDAS Esta tesis ha sido posible gracias a la aportación recibida por la Beca otorgada por el Colegio de Médicos de Las Palmas de Gran Canaria en el año 2011. A mi padre, por enseñarme a amar esta profesión A Javi por demostrarme que la paciencia abre puertas Agradecimientos: ¾ A mi madre, por ayudarme ser quien soy, por demostrarme que la entrega personalizada existe. Gracias por ponerme las metas bien altas, no conformarte nunca con nada y enseñarme a dar el máximo de mí. Tu espíritu de lucha y tu tesón ante la vida han sido la mayor enseñanza que me has aportado, mamá. GRACIAS. ¾ A mi padrino Pediátrico, Dr. Luis Peña, por su perseverancia y tesón. Gracias por apostar por esta tesis. Me enseñaste que lo que uno se propone, corre el riesgo de conseguirlo con un poco de esfuerzo y entrega. ¾ Al Dr. Eduardo Villamor, por su paciencia detrás de un teléfono a 4000 km de distancia. Por aceptar este proyecto con una canaria desconocida. Gracias por hacer realidad este proyecto plaquetario, una idea que no conseguía ver la luz. Tu fuiste esa linterna que iluminó el duro y oscuro camino en los momentos más duros. Gracias. ¾ A la Dra. Gema González-Luis, por ese espíritu positivo y alentador. Por enseñarme que sí se puede, por intentar ver color donde hay grises y poner una sonrisa y una carcajada donde las lágrimas afloran. Gracias. ¾ Al Dr. Saavedra, por ilustrarme en el mundo árido de la estadística y hacer realidad el primer proyecto de esta tesis. Gracias por su extrema paciencia y su entrega incondicional. ¾ A mis compañeros neonatólogos del CHUIMI de los que tanto he aprendido estos 9 años. Soy una parte de ustedes, una prolongación, y seguiré siendo uno más aunque no me encuentre entre ustedes. Les debo mi afán de superación y mis ganas de seguir aprendiendo y aportando algo a esta medicina. ¾ A mis prematuros y sus padres que han participado en este proyecto. Gracias por demostrarme que hasta en los momentos de mayor incertidumbre, siempre queda una esperanza. Por la resistencia que demuestran día a día, la entereza que le ponen a las desgracias y la fuerza que derrochan cada minuto de existencia. Porque los minutos hacen horas, y estos, a su vez, son días de vida. ¾ A Laura y Roque por esa búsqueda incesante de artículos que llegaban a mi bandeja de entrada en tiempo récord. Una parte de esta tesis les pertenece. ¾ A mi querida Loli y Alejandro por mostrarme una sonrisa diaria a pesar de sobrecargarles de trabajo. Por buscar ese informe perdido y esa información necesaria para esta tesis, MIL gracias por ser la cara amable de la neonatología grancanaria. ¾ A mi querida Dra. Díaz, por ser mi modelo a imitar. Gracias por haberme empujado a seguir con esta tesis en las horas bajas y enseñarme que el esfuerzo tiene recompensa. Me demostraste el amor al estudio, al aprender cada día algo nuevo, a la fuerza de voluntad sin medida. Tu prudencia es tu mayor fortaleza, y ese apego al trabajo que te hace invencible. Esta tesis también te pertenece. ¾ A las mejores compañeras de residencia Ana Bello y Olga Afonso. Con ustedes aprendí y seguiré aprendiendo. Gracias por hacerme disfrutar de este viaje, la aventura pediátrica que todavía continúa y continuará y de la que espero seguir sumando capítulos junto a ustedes…. y por muchos años…. ¾ A los Dr. Shah y cols., Dr. Fujioka y cols., Dr. Dani y cols. y Dr. Dizdar y cols. por contribuir con sus datos en esta Tesis Doctoral. ¾ A la Dra. Dimpna Calila Albert por su aportación visual ecográfica. ¾ A Juan Pablo por cuidar en todo detalle el diseño de esta tesis. ¾ Al Dr. Ronald I. Clyman, a la Dª Sorina R. Simon, al Dª Lieke van Zogchel y al Dr. Giacomo Cavarallo por su contribución a la publicación del metaanálisis. GLOSARIO DE ABREVIATURAS ADP: Adenosina difosfato AI/Ao: Cociente aurícula izquierda-aorta. AINEs: Antiinflamatorios no esteroideos AMPc: Adenosina 3’-5’- monofosfato cíclico ARNm: Ácido ribonucleico mensajero BNP: Péptido natriurético cerebral o de tipo B1 BPD: Displasia broncopulmonar1 CIR: Retraso crecimiento intrauterino COX: Ciclooxigenasa CPAP: Presión continua positiva en la vía aérea1 DA: Ductus arteriosus DAP-HS: Ductus arteriosus persistente hemodinámicamente significativo DAP: Ductus arteriosus persistente EG: Edad gestacional FvW: Factor de Von Willebrand Gp: Glicoproteína HIV: Hemorragia intraventricular MG: Megacariocito NEC: Enterocolitis necrotizante1 NO: Óxido nítrico NR-pro-BNP: Prohormona N-terminal del BNP nSMase: Esfingomielinasa neutra1 PaO2: Presión arterial de oxígeno PAR: Receptores activados por las proteasas1 PEEP: Presión positiva al final de la espiración1 PEG: Pequeño para la edad gestacional viii Factores de riesgo asociados a fracturas por fragilidad Resumen xvii Thrombocytopenia as risk factor for patent ductus arteriosus in preterm infants BACKGROUND: Despite decades of research, the persistence of a patent ductus arteriosus (PDA) in very preterm infants is still presenting challenges in terms of pathobiology and clinical implications. One of the most remarkable recent contributions to our knowledge of the pathobiology of PDA has been the elucidation by Echtler et al. of the role played by platelets in its closure (Echtler et al., 2010). These authors proposed a model of closure of the ductus arteriosus (DA) in mice, in which the initial constriction results in changes in the vascular wall, which adopts a prothrombotic phenotype. This triggers the accumulation of platelets, leading to the formation of a platelet plug that seals the lumen. The formation of this platelet plug is a critical step, linking the initial reversible constriction and final anatomic remodeling of the DA. Echtler et al. (2010) also performed a retrospective evaluation of the relationship between thrombocytopenia (defined as platelet count ζͳͷͲͳͲ 9/L) on the first day of life and DA closure on the third to fifth day of life in a group of infants born at 24-30 weeks gestation. In a logistic regression model, low platelet count was identified as an independent predictor of hemodynamically significant PDA (HSPDA). Since the publication of the above study, several additional studies in preterm infants have been performed. Some of these investigations (Dizdar y cols., 2012; Dani y cols., 2010) confirmed the findings of Echtler et al., whereas others (Fujioka y cols., 2011; Sallmon y cols., 2012; Shah et al., 2011) produced discordant observations and do not suggest that thrombocytopenia in the first days of life consistently results in HSPDA. Additional series of patients are required to resolve this controversy. The present Thesis reports on a new cohort of preterm infants in which the relationship between platelet counts and PDA was analyzed. In addition, we combined in a meta-analysis our results with those of previously published studies . Resumen xviii METHODS: The first study was a retrospective study that was aimed at evaluating platelet count in the first two days of life count and DA status in a cohort from 194 infants born at 24-30 weeks gestation in a tertiary hospital. The rate of response to the treatment of cyclooxygenase (COX) inhibitors was also evaluated. We used multivariable logistic regression modeling to determine whether there was an independent relationship between platelet count and the presence of HSPDA on day 3. The second part of this thesis consists of a meta-analysis, which combines our results with all the studies reported to date addressing the association between low platelet counts and the presence of a PDA/HSPDA. RESULTS: Median platelet count nadir and rate of thrombocytopenia-defined as platelet count < 150 x 109/L and graded as mild (100 x 109/L to < 150 x 109/L), moderate (50 to < 100 x 109/L) and severe (< 50 x 109/L)- within the first 2 days of life were not significantly associated with the presence of HSPDA on day 3. Moreover, low platelet counts, either on days 1-2 or 3-7, were not significantly associated with the rate of response to treatment with COX inhibitors. Meta-analysis showed a significant positive association between PDA and platelet counts <150 × 109/L [6 studies, risk ratio (RR) = 1.215, 95% CI: 1.027–1.436], between PDA and platelet counts <100 × 109/L (5 studies, RR = 1.255, 95% CI: 1.034– 1.525), and between HSPDA and platelet counts <100 × 109/L (5 studies, RR = 1.254, 95% CI: 1.021– 1.540). The association between HSPDA and platelet counts <150 × 109/L was not statistically significant (6 studies, RR = 1.289, 95% CI: 0.925–1.795). CONCLUSION: In our cohort, we could not demonstrate any significant association between platelet counts within the first days of life and either spontaneous or pharmacological closure of the DA in very preterm infants. Nevertheless the MetaAnalysis, reveals a marginal but significant association between low platelet counts in the first days of life and PDA/HSPDA in very preterm infants. Resumen xix Trombocitopenia como factor de riesgo del ductus arteriosus persistente del recien nacido pretérmino ANTECEDENTES: A pesar de los esfuerzos y las décadas de investigación, el ductus arteriosus del prematuro continúa siendo un desafío en términos de patobiología y consideraciones clínicas. Uno de las contribuciones más recientes e importantes al conocimiento de la biología del ductus arteriosus persistente (DAP) ha sido la aportación de Echtler y cols. sobre el papel de las plaquetas en su cierre (Echtler et al., 2010). Dichos autores proponen un modelo de cierre del ductus arteriosus en ratones, en los que la constricción inicial resulta en cambios en la pared que adopta un fenotipo protrombótico. Este proceso desencadena el reclutamiento, la acumulación y la activación de plaquetas circulantes en la luz residual del ductus arteriosus (DA) y la formación de un coágulo que sella el cierre de la luz residual del DA y supone un paso crucial en el cierre definitivo del DA. Echtler y cols. analizaron en el mismo estudio (2010) de forma retrospectiva la relación entre la trombocitopenia (definida como plaquetas ζͳͷͲͳͲ9/L ) en el primer día de vida y la presencia de un Ductus Arteriosus Persistente hemodinámicamente significativo (DAP-HS) entre el tercer y el quinto día de vida en una cohorte de 124 RNP entre 24 y 30 semanas de edad gestacional. En un modelo de regresión logística, se identificó la trombocitopenia como único factor de riesgo independiente para la presencia de DAP-HS. Desde la publicación de este trabajo, varias cohortes han sido publicadas. Aunque los resultados clínicos de Echtler han sido confirmados por unos autores (Dizdar y cols., 2012; Dani y cols., 2010), también han sido publicados otros estudios retrospectivos de cohortes que no encuentran tal asociación entre trombocitopenia en los primeros días y DAP-HS. (Fujioka y cols., 2011; Sallmon y cols., 2012; Shah y cols., 2011). Se precisa un mayor número de pacientes para resolver esta controversia. La presente Tesis muestra una nueva cohorte de Recien Nacidos Prematuros (RNP) en los que se analizó la relación entre recuentos plaquetarios y DAPHS. Además, se han combinado en un metaanálisis nuestros resultados con los publicados previamente por otros autores. Resumen xx MÉTODOS: El primer trabajo consiste en un estudio retrospectivo en el que se evalúan los recuentos plaquetarios en los primeros 2 días y el estado del DAP en una cohorte de 194 niños nacidos entre las 24 y 30 semanas de edad gestacional en un hospital terciario. También se evaluó el grado de respuesta al tratamiento con inhibidores de la ciclooxigenasa (COX). Se empleó un modelo logístico de regresión multivariable para determinar si la trombocitopenia era un factor independiente para la presencia de DAPHS al 3º día. La segunda parte de esta Tesis consiste en un metaanálisis en el que se combinan nuestros resultados con los de otras cohortes publicadas hasta la fecha, en las que se ha estudiado la relación entre recuentos bajos de plaquetas y DAP/DAP-HS. RESULTADOS: El nadir plaquetario y el riesgo de trombocitopenia –definida como recuento plaquetario <150 x 109/L y clasificada en leve (100 x 109/L a < 150 x 109/L), moderada (entre 50 y 100 x 109/L) y severa (< 50 x 109/L)- durante los 2 primeros días de vida no se asoció de forma estadísticamente significativa con la presencia de DAP-HS al 3º día. Del mismo modo, los recuentos de plaquetas, tanto en los días 1-2 como 3-7, no se asociaron de manera significativa a la respuesta al tratamiento con inhibidores de la COX. El metaanálisis que incluyó un total de 3479 RNP mostró una asociación positiva entre el DAP y los recuentos plaquetarios <150 × 109/L [6 estudios, riesgo relativo (RR) = 1.215, 95% CI: 1.027–1.436], entre DAP y recuentos plaquetarios <100 × 109/l (5 estudios, RR = 1.255, 95% CI: 1.034– 1.525), y entre DAP-HS y recuentos plaquetarios <100 × 109/L (5 estudios, RR = 1.254, 95% CI: 1.021–1.540). La asociación entre DAP-HS y recuentos plaquetarios <150 × 109/L no fue estadísticamente significativa (6 estudios, RR = 1.289, 95% CI: 0.925–1.795). CONCLUSIONES: En nuestra cohorte no pudimos demostrar asociación alguna entre recuento plaquetario en los primeros días de vida y el cierre tanto espontáneo como farmacológico del DAP en RNP. Sin embargo, el metaanálisis muestra que un recuento bajo de plaquetas en los primeros días aumenta de forma modesta, pero estadísticamente significativa, el riesgo de presentar tanto DAP como DAP-HS. INTRODUCCIÓN viii Factores de riesgo asociados a fracturas por fragilidad Introducción 23 II. INTRODUCCIÓN 1. El ductus arteriosus en la circulación fetal y neonatal. El ductus arteriosus (DA) es una importante estructura vascular fetal que comunica la primera parte de la aorta -5-10 mm distal al origen de la arteria subclavia izquierdacon la arteria pulmonar principal, cerca del origen de la rama pulmonar izquierda. El DA deriva de la porción dorsal del sexto arco aórtico, ejerciendo su función desde la 6º semana de gestación hasta el nacimiento, momento en el que se inicia su cierre (Stoller y cols., 2012; Bergwerff y cols., 1999, Dzialowski y cols., 2011) Durante la vida fetal, la función respiratoria y nutricional es llevada a cabo por la placenta. El patrón circulatorio fetal se caracteriza fundamentalmente por la existencia de cortocircuitos derecha-izquierda y una elevada resistencia vascular pulmonar (RVP) (Rudolph y Heymann, 1968; Cassin y cols., 1964). Como consecuencia, la sangre que llega al ventrículo derecho evita su entrada a las arterias pulmonares pasando a través del DA alcanzando así la aorta descendente. En el feto el DA es un vaso de vital importancia cuyo tamaño es similar al de la aorta y por el que pasa un 80-90% de la sangre de la circulación umbilico-placentaria (Heymann y Rudolph 1975, Rudolph AM., 2009). El patrón circulatorio fetal, caracterizado (Figura 1) por la presencia de una RVP elevada y cortocircuitos derecha-izquierda a través del foramen oval y el DA, es sustituido al nacimiento por el patrón circulatorio propio de la vida postnatal y que se caracteriza por una circulación en serie, con baja RVP y sin comunicaciones entre los lados derecho e izquierdo. El descenso de las RVP y el cierre del DA son, probablemente, los dos cambios más significativos en la transición circulatoria perinatal. (Rudolf y Heymann, 1968; Cassin y cols., 1964; Rudolph, 1970; Dzialowski y cols., 2011). Las alteraciones en el proceso de descenso de la RVP dan lugar al síndrome de hipertensión pulmonar persistente neonatal mientras que las alteraciones en el cierre del DA dan lugar al DA persistente (DAP). Introducción 24 Los términos DA (o conducto arterioso) persistente, persistencia del DA y DA permeable o patente se han utilizado indistintamente en la literatura científica para designar un DA que permanece abierto y presenta flujo a su través (Golombek y cols., 2008). En la presente Tesis utilizaremos el término DAP para designar todas las situaciones en el que el DA permanece abierto, independientemente de su posible significación patológica. Asimismo, utilizaremos el término DAP hemodinámicamente significativo (DAP-HS) para referirnos a aquellas situaciones en las que el DAP implica alteraciones fisiopatológicas o clínicas. En un 50% de los recién nacidos a término (RNT) sanos el cierre funcional del DA tiene lugar dentro de las primeras 24 horas y, prácticamente en el 90%, ya se encuentra cerrado al 3º día (Gentile y cols., 1981; Lim y cols., 1992). De ahí, que un DAP en los primeros 3 días de vida podría ser considerado un shunt fisiológico tanto en niños a término como en prematuros (Skinner, 2001). Cuando se considera el DAP como una entidad patológica, resulta fundamental diferenciar entre el DAP del RNT y el DAP del recién nacido prematuro (RNP). El primero es una consecuencia de una alteración -primaria o adquiridadel desarrollo. Es decir, el DAP del RNT es la consecuencia de un desarrollo anómalo. En estos casos, determinadas alteraciones genéticas o infecciones congénitas pueden encontrarse en la génesis del trastorno (Bökemkamp y cols., 2010). El DAP en niños mayores más allá de los 3 meses, se caracteriza histológicamente por una elevada cantidad de elastina y la presencia de una lámina elástica subendotelial anómalamente desarrollada. Por su parte, el DAP del RNP es la consecuencia de un desarrollo no anómalo sino insuficiente. El DA se prepara para su cierre mediante un delicado programa de desarrollo que le permite permanecer abierto durante la vida fetal y cerrarse al nacimiento. El nacimiento prematuro sorprende al DA con este programa aún Introducción 25 incompleto (Stoller y cols., 2012; Bergwerff y cols., 1999). A partir del momento del nacimiento el DA debe avanzar hacia su cierre con una maquinaria contráctil y proliferativa insuficientemente desarrollada y unas condiciones circulatorias y respiratorias muy diferentes a las fetales. La presente Tesis está exclusivamente centrada en el DAP del prematuro. Figura 1. Esquema de la circulación fetal. Introducción 32 control del tono ductal varía según la especie estudiada. Sin embargo, en general se puede apreciar un patrón de disminución progresiva con la edad fetal de la respuesta a los factores vasodilatadores y de aumento de la respuesta a los factores vasoconstrictores (Dzialowski y cols., 2011). No obstante, el papel de todos estos factores vasoactivos parece secundario cuando se comparan con oxígeno y PGs. Resulta interesante destacar que muchos de estos factores vasoactivos ven modificada su actividad por las tensiones de oxígeno. 1.1.2. El cierre del DA En el momento del nacimiento, al establecerse el patrón circulatorio postnatal, el DA ya no es necesario y se produce su cierre. Cuando se analiza el proceso de cierre del DA se diferencian, de modo clásico, dos etapas: el cierre funcional y el cierre anatómico del vaso. El cierre funcional es un proceso de vasoconstricción como resultado de un aumento de la tensión de oxígeno y una disminución de PGs circulantes y locales. Esta vasoconstricción provoca una profunda isquemia-hipoxia en la túnica media vascular que es el primer paso para el cierre anatómico permanente (Clyman 2006; Clyman y Chemtob 2010). La proliferación de células endoteliales, junto a una migración de las células musculares de la túnica media hacia la íntima, da lugar a la formación de una neoíntima. La hipoxia inhibe la producción de PGE2 y NO e induce la producción local de factores de crecimiento como el factor beta de crecimiento de transformación (TGF-Ⱦ) y factores de crecimiento vascular endotelial (VEGF) (Clyman y cols., 2006). Ambos factores y con más protagonismo éste último, jugarán un papel temprano en la remodelación ductal, estimulando la proliferación de células endoteliales a nivel de la íntima con la consiguiente oclusión de la luz del DA. Introducción 33 1.1.3. El DA del prematuro Como ya hemos mencionado anteriormente, el DA del prematuro es menos sensible a la acción vasoconstrictora del oxígeno y más sensible a la acción vasodilatadora de las PGs. Es más, en el prematuro (Figura 3), aún cuando exista una constricción del DA, el grado de hipoxia que se alcanza en la túnica media es inferior al presente en el RNT (Clyman 2006; Clyman y Chemtob 2010). Para comprender este fenómeno es preciso entender las diferencias estructurales del DA en el RNP y en el RNT. El DA del RNT está dotado de vasa vasorum. La contracción ductal ocluye estos vasos con lo que una importante parte de la media queda sometida al estímulo hipóxico. Aunque se mantenga una luz ductal residual, el oxígeno que difunde no alcanza distancias mayores de 400-500 µm de la luz (Hermes-DeSantis y cols., 2006). En el DA de un prematuro extremo (por ejemplo, 24 semanas de gestación), la pared ductal mide aproximadamente 200 µm de grosor. Los vasa vasorum finalizan en la adventicia y no penetran hasta la capa media, nutriéndose esta delgada pared vascular a través del lumen. Como consecuencia de estas diferencias estructurales, durante el cierre del DA en el RNP, no existe una zona vulnerable de isquemia en la pared ductal que suponga el nivel óptimo de hipoxia necesario para el inicio del remodelado que es esencial en el cierre definitivo del DA (Clyman 2006; Clyman y Chemtob 2010). Introducción 34 Figura 3. Esquema de cortes transversales de la pared del ductus arteriosus en el feto a término, en el RNT y en el RNP de 24 semanas de edad gestacional. Obsérvese como la constricción posnatal del ductus arteriosus en el RNT da lugar a una contracción de las células de la capa media musculares con la consiguiente compresión de los vasa vasorum. La hipoxia/isquemia del área ductal supone un estímulo para la proliferación de células endoteliales. 1.1.4. Plaquetas y DAP En el año 2010 Echtler y colaboradores publicaron una muy interesante aportación al conocimiento de la biología del DA, cuyo cierre se compara con un proceso trombótico. Los autores proponen un modelo del cierre del DA en el que la constricción inicial produce cambios en la pared que adopta un fenotipo protrombótico con activación endotelial y depósito de factor de von Willebrand y fibrinógeno. Las células endoteliales pueden separarse de la lámina elástica interna dejando expuestas las fibras de colágeno. Este proceso desencadena el reclutamiento, la acumulación y la activación de plaquetas circulantes en la luz residual del DA y la formación de un coágulo que sella dicha luz. Para demostrar su hipótesis Echtler y cols. (2010) utilizaron diversas aproximaciones experimentales. En primer lugar demostraron con técnicas de inmunohistoquímica en el DA del ratón, la presencia a las 1, 12 y 24 horas de células Introducción 35 que expresaban glicoproteínas (Gp) como la GpIIb-IIa y GpVI (ésta última exclusiva de la línea plaquetaria). También identificaron potenciales sustratos para la adhesión plaquetaria, entre los que se incluyeron fibrinógeno, colágeno y Factor de Von Willebrand (vWF). El wWF se encuentra de forma exclusiva en las células endoteliales disfuncionales, de ahí que concluyeran que el cierre del DA está asociado con una disfunción y denudación de las células endoteliales con la consecuente exposición luminal de las fibras de colágeno. En otra serie de experimentos in vivo utilizando microscopía intracavital confocal demostraron la adhesión plaquetaria a nivel de la pared endotelial. Los autores fueron más allá demostrando que alteraciones en las glicoproteínas plaquetarias encargadas de la adhesión plaquetaria, así como factores nucleares encargados de su biogénesis, pueden influir en el cierre del DA. De este modo, hicieron uso de ratones manipulados genéticamente en los que un déficit de GpIIb, GpVI (adhesión plaquetaria) y factor nuclear (derivado de eritroide 2 o Nfe2) producía una alteración en el remodelado del DA y fracaso del en el cierre del mismo. Todos los experimentos anteriormente referidos habían sido realizados en modelos murinos. Tratando de responder a la pregunta de la posible extrapolabilidad de sus resultados a los humanos, Echtler y cols. analizaron, de forma retrospectiva, la relación entre la trombocitopenia (definida como plaquetas ζͳͷͲͳͲ9/L ) en el primer día de vida y la presencia de un DAP-HS entre el tercer y el quinto día de vida en una cohorte de 124 RNP entre 24 y 30 semanas de edad gestacional. En un modelo de regresión logística, se identificó la trombocitopenia como único factor de riesgo independiente para la presencia de DAP-HS. Introducción 36 2. El DAP del prematuro como problema clínico 2.1 Incidencia El DAP en el RNP es inversamente proporcional a la edad gestacional y al peso al nacimiento, siendo más frecuente en aquellos prematuros que presentan distrés respiratorio y no han recibido corticoides prenatales (Lemmons y cols., 2001). En una primera publicación de la “Vermont Oxford Network” (1993) que incluía 36 centros hospitalarios y un total de 2961 RNP menores de 1500 g, la incidencia de DAP ascendía al 55-60%. En la actualidad un total de 850 hospitales de todo el mundo componen la red Vermont Oxford y según los datos del 2010 que incluía 53810 prematuros (datos no publicados), hasta un 64% de RNP entre 24 y 26 semanas presentaron DAP (Tablas 1 y 2). Tabla 1. Presentación de la incidencia de DAP (en porcentaje) en niños menores de 1500 gramos según la Vermont Oxford Network 2010 estratificado por peso al nacimiento. Todos <24 24-26 27-29 30-32 >32 PDA 37 (23-44) 61 (20-100) 64 (43-69) 38 (24-50) 16 (4-22) 8 (0-9) Tabla 2. Incidencia de DAP estratificado por edad gestacional según la Vermont Oxford Network 2010. Se expresan las medias (%) y entre paréntesis los percentiles 25 y 75. 501-600 601-700 701-800 801-900 901-1000 1001-1100 1101-1200 1201-1300 1301-1400 1401-1500 0 10 20 30 40 50 60 70 Introducción 37 2.2. Implicaciones hemodinámicas y consideraciones clínicas En el periodo fetal, las elevadas RPV permiten un “shunt” pulmonar-sistémico, mientras que en el periodo posnatal, tras descender las RPV, la persistencia del ductus conduce a un incremento del flujo sanguíneo desde la aorta a la arteria pulmonar. Este cortocircuito de sangre izquierda-derecha supondrá un incremento del flujo sanguíneo pulmonar y un secuestro de sangre de la circulación sistémica. Las consecuencias fisiológicas de este “robo ductal” dependerán del tamaño del shunt y de la respuesta del corazón, pulmones y otros órganos. A nivel pulmonar, el DAP incrementa el flujo sanguíneo favoreciendo el edema pulmonar y reduciendo la complianza. Con ello, el tiempo de ventilación mecánica se prolonga y aumentan las necesidades de oxígeno (De Felice y cols., 2009), incrementándose probablemente el riesgo de padecer enfermedad pulmonar crónica/displasia broncopulmonar (BPD). Asimismo, el riesgo de hemorragia pulmonar también se encuentra incrementado en prematuros con mayor tamaño ductal (Kluckow y cols., 2000). El descenso del gasto cardiaco secundario al cortocircuito izquierda – derecha lleva consigo una hipoperfusión a los órganos vitales. La disminución del flujo a nivel renal condiciona una hipoperfusión renal con la consecuente disminución del filtrado glomerular. Por otra parte, complicaciones gastrointestinales como la enterocolitis necrotizante (NEC) han sido frecuentemente asociados a la persistencia del DAP-HS (Wong y cols., 1990). A nivel cerebral es bien conocido que shunts importantes reducen el flujo y la oxigenación cerebral (Lemmers y cols., 2008), hecho que puede contribuir al incremento del riesgo de hemorragia intraventricular (HIV) y leucomalacia periventricular. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la evidencia para relacionar la presencia de patologías (HIV, NEC, BPD) con el DAP es controvertida ya que asociación no implica causalidad (Smith y cols., 2012). Cada vez más, se cuestionan los mecanismos que subyacen en la morbimortalidad atribuible al DA como la propia prematuridad, la redistribución Introducción 38 del flujo sanguíneo o el propio tratamiento administrado para su cierre (Chorne y cols., 2007). Las siguientes manifestaciones clínicas (Golombek y cols., 2008) pueden estar presentes en un ductus arterioso hemodinámicamente significativo (DAP-HS): x Taquicardia. x Precordio hiperdinámico. x Empeoramiento del estado respiratorio: taquipnea, episodios de apnea, aumento de los requerimientos de oxígeno, dependencia de CPAP o ventilación mecánica, edema pulmonar. x Cardiomegalia. x Caída o disminución de presión arterial media con incremento del gradiente de presión arterial (>25-30 mmHg) por disminución de presión arterial diastólica. x Oliguria. x Pulsos saltones. x Soplo sistólico in crescendo a nivel infraclavicular. x Acidosis metabólica. x Hepatomegalia. x Intolerancia digestiva. x Estancamiento ponderal. x Hipotensión arterial. Los prematuros, especialmente los menores de 1000 gramos, con un DAP-HS desarrollarán síntomas en los primeros 2 ó 3 días tras el nacimiento. Tales hallazgos clínicos pueden desarrollarse más tempranamente en los niños tratados con surfactante debido a la reducción de las resistencias vasculares pulmonares con la consiguiente mejoría de la función pulmonar y el incremento del cortocircuito izquierda-derecha. Los signos clínicos no son de gran valor para diagnosticar un DAP de forma precoz (Skelton y cols., 1994). De hecho, la Introducción 39 especificidad del soplo cardíaco supera el 90 % sólo después del 6º día, con una baja sensibilidad en los primeros tres días. Los RNP pueden presentar un DAP “silente”, en el que la ausencia de soplo es la característica a destacar. Además, la presión diferencial o de pulso no es diferente estadísticamente en los recién nacidos con DAP-HS (Ratner y cols., 1985; Evans y cols., 1992) y el deterioro de la patología respiratoria, a pesar de mostrar una alta sensibilidad, carece de especificidad. Estos datos demuestran que el diagnóstico de DAP dependiendo exclusivamente de los signos físicos, resultaría tardío; es decir cuando el impacto generado por la repercusión hemodinámica del DAP ya se ha instaurado. De ahí que en muchos centros hospitalarios la ecografía cardiaca se recomiende en las primeras 48-72 horas e incluso algunos autores (Evans N. 2011) han propugnado su realización más tempranamente. 2.3. Diagnóstico El diagnóstico del DAP-HS se realiza en base a la clínica y a los hallazgos ecográficos. El concepto de hemodinámicamente significativo es amplio y sujeto a continuo debate. (Golombek y cols., 2008). Como ya hemos mencionado, los hallazgos clínicos podrían ser de ayuda, pero tienen el inconveniente de presentar una baja sensibilidad para el diagnóstico de DAP-HS. Quizás la hipotensión arterial sistémica, con cifras más bajas de presiones tanto sistólicas como diastólicas, supone una de las características más específicas y sensibles a la hora de diagnosticar el DAP-HS (Evans y cols., 1992). El electrocardiograma no es de gran utilidad para el diagnóstico, ya que se encuentra normal en el 80% de los casos. Hallazgos como la hipertrofia ventricular derecha y la hipertrofia biventricular están presentes en el 17 y 6% respectivamente (Evans y cols., 2004). La radiografía de tórax tampoco presenta un patrón característico que nos ayude al diagnóstico, si bien la cardiomegalia con signos de edema pulmonar pueden ser sugestivos de esta patología. Introducción 40 La ecografía bi-dimensional Doppler color , ha demostrado ser el método más seguro para diagnosticar el DAP-HS en pacientes prematuros, incluso en aquellos que no han presentado clínica (DAP silente). La sensibilidad de este recurso diagnóstico se ha reportado de un 89% y una especificidad del 91% (Evans y cols., 2004). En la actualidad, existen numerosos datos que se emplean para diagnosticar el DAP-HS, pero ninguno totalmente válido de manera aislada. Se describen, a continuación los parámetros más utilizados para el diagnóstico ecográfico del DAPHS. a) Tamaño del ductus. El diámetro transductal es uno de los parámetros mayormente usado para determinar si un DAP es hemodinámicamente significativo o no. Presenta una alta sensibilidad (94%) y especificidad (90%) cuando se realiza por ecografía en 2 D, disminuyendo ligeramente si se realiza la medición de la estructura con Doppler color. Un diámetro mayor de 1.5 mm medido por Doppler color (Figura 4) es indicativo de DAP-HS, mientras que si la medición es por ecografía 2D la medida del DAP-HS debe ser > 1.4 mm/kg (El Hajjar y cols., 2005). Figura 4. Ductus arterioso de tamaño 3,1 mm de diámetro. (Imagen cedida por la Dra. Dimpna Calila Albert). Introducción 41 b) Relación aurícula izquierda/aorta (AI/Ao) La dilatación de cavidades izquierdas del corazón es, junto con el tamaño ductal, una de las medidas más usada para determinar un DAP-HS. Dicha medición se realiza en el plano longitudinal largo a nivel del anillo aórtico con el modo-M (Figura 5) y presenta una sensibilidad y especificidad similares al diámetro ductal. Ratio AI/Ao > 1.4 es sugestivo de DAP-HS. Figura 5. Corte ecográfico en plano longitudinal en modo M (A) y en modo 2D (B). El índice AI/Ao resulta de dividir las medidas o obtenidas en modo M (flechas rojas). Imagen cedida por la Dra. Dimpna Calila Albert. c) Flujo retrógrado holosistólico en la aorta descendente Es indicativo de un DAP amplio con robo sistémico a la circulación pulmonar. Cuanto mayor sea el flujo invertido más repercusión existirá. Introducción 48 contraindicado y el paciente se encuentre conectado a ventilación mecánica o precise drogas vasoactivas para mantener tensiones arteriales aceptables. En los últimos años se está generalizando el uso de toracoscopia videoasistida cerrando el DAP con clips (Mandhan y cols., 2006; Villa y cols., 2004) con el que se reduce el tiempo operatorio con una menor morbilidad acompañante y una menor incidencia de ductus residual frente a la ligadura clásica. 3. Las plaquetas. 3.1. Estructura de las plaquetas Las plaquetas son pequeños corpúsculos sin núcleo derivados de los megacariocitos de la médula ósea, heterogéneos en tamaño (2-3 µm) con una vida media de 7-10 días (Zucker-Franklin D, 1997). Circulan en la sangre en forma de disco biconvexo (discocito) con un volumen medio de 6-8 fl, y 10 pg de peso. Las plaquetas circulan en concentraciones de 150,000-450,000 células/ml (Zucker-Franklin D, 1997). De la cantidad total de plaquetas en el cuerpo, el 70% se mantiene en circulación, mientras que el restante 30% permanece de manera transitoria en el bazo. Tanto el bazo como el hígado se encargan de retirar a la mayoría de las plaquetas después de su senescencia, aunque una pequeña fracción se elimina constantemente como resultado de su participación en el mantenimiento de la integridad vascular. En condiciones fisiológicas, las plaquetas circulan en forma no activa y expresan en su superficie un número relativamente pequeño de moléculas que, en estado activado facilitan la interacción con otras plaquetas y células de su entorno (López y Macaya, 2013). Carecen de ADN, pero contienen ARN mensajero (ARNm) derivado de los megacariocitos y la maquinaria de transcripción necesaria para la síntesis de proteínas. Introducción 49 Las plaquetas poseen una estructura celular compleja (Figura 6) que incluye una membrana externa que constituye una bicapa lipoproteica con glicoproteínas que funcionan como receptores de los agonistas fisiológicos de las plaquetas (Adenosina Difosfato (ADP), Trombina, TXA2), proteínas adhesivas (fibrinógeno, fibronectina, laminina, vitronectina o factor de von Willebrand (vWF)) y para ligandos fibrosos como el colágeno (Klinger, 1996; Andrews y Berndt 2004). Las integrinas, ubicadas en la membrana externa, son responsables de la interacción de la célula con el medio externo a través de receptores. Las integrinas más estudiadas son la GPIIb-IIIa y la GPIb-IX (López y Macaya, 2013). La plaqueta presenta además un sistema de canales conectados a la superficie llamado sistema canalicular abierto , que no es más que un sistema que ofrece acceso a las sustancias plasmáticas al interior de la plaqueta y un canal de salida para productos plaquetarios (Morgorstern, 1997; Klinger, 1996). A la liberación de productos plaquetarios a través de este sistema canalicular abierto se denomina “reacción de liberación”. El citoesqueleto de la plaqueta se encuentra debajo de la zona periférica. Esta zona sol-gel constituye el sostén para el mantenimiento de la forma discoide de la plaqueta así como del sistema contráctil que, tras la activación plaquetaria, permite el cambio de forma con la prolongación pseudopódica, la contracción interna y la liberación de los constituyentes granulares (Zucker-Franklin D, 1997). Otra de las estructuras plaquetarias a destacar es el sistema tubular denso (García Mesa y Coma Alfonso, 2000), que consiste en un sistema de membranas que aparece en la vecindad de los microtúbulos y tiene como función regular la activación plaquetaria mediante el secuestro o liberación de calcio. Esta zona también posee sistemas enzimáticos para la síntesis de prostaglandinas (Klinger, 1996). Introducción 50 En el citoplasma plaquetario se encuentran componentes celulares como los lisosomas, las mitocondrias y gránulos de varios tipos (tabla 5): a) Son órganos esféricos (Figura 6) de 140 a 400 nm en diámetro que constituyen un 15% del volumen total de las células. Son reservorios de proteínas que van desde factores de crecimiento hasta moléculas de adhesión o receptores que utiliza la plaqueta para interaccionar con otras células (Zucker-Franklin, 1989; Klinger, 1996). Gránulos Ƚ b) Se caracterizan por su alta densidad electrónica que confieren el elevado contenido en calcio y fósforo inorgánico (Morgorstern, 1997). Su liberación ocurre por exocitosis. Gránulos densos Figura 6. Foto de microscopía electrónica de la ultraestructura plaquetaria . Mt: microtúbulos; M: mitocondria; SCCS: sistema canalicular conectado a la superficie; A: gránulos densos; Dg: gránulos ȽǢ Gl: glucógeno; Pm: membrana plasmática Introducción 51 c) Contienen elastasas y otras proteasas como las catepsinas o hidrolasas ácidas que facilitan la degradación de la matriz extracelular, además de crear un ambiente ácido que favorecerá la acción de estas enzimas. Lisosomas TIPOS DE GRÁNULOS CONTENIDO GRÁNULOS DENSOS Serotonina Adenosina Difosfato (ADP) Adenosina Trifosfato (ATP) Pirofosfato Calcio GRÁNULOS ɲ Fibrinógeno Factor de Von Willebrand PDGF, VDGF Beta-tromboglobulina Factor 4 plaquetario Trombospondina PAI-1 Albúmina Fibronectina Factor XI y V Tabla 5. Contenido de los gránulos citoplasmáticos de las plaquetas. Introducción 52 3.2 El papel de las plaquetas en la hemostasia primaria En condiciones fisiológicas, las plaquetas circulan sin adherirse al endotelio vascular. En este sentido, es bien sabido que el endotelio vascular sintetiza y libera una serie de factores antitrombóticos y protrombóticos que favorecen el equilibrio hemostático y regulan la formación del trombo (Andrews y Berndt, 2004). En situación quiescente, el endotelio vascular tiene una acción preponderantemente antitrombótica, pero cuando hay alteraciones en la integridad del endotelio vascular o en la fuerza de cizallamiento del flujo sanguíneo, las plaquetas se activan (Aznar y cols., 1991). El mecanismo de formación del trombo plaquetario puede dividirse en tres etapas que se desgranan a continuación: a) Frenado de las plaquetas circulantes sobre la pared vascular contra la corriente del flujo sanguíneo que las empuja. b) Activación y adhesión firme de la plaqueta al vaso. c) Agregación y estabilización del trombo. 3.3. Las plaquetas en el periodo neonatal. Diferencias en la producción y en la función. Las plaquetas aparecen en el feto por primera vez tras la concepción a las 5 semanas. El incremento del número se produce durante la vida fetal, alcanzando la de cifra de 150 x 109/L al final del primer trimestre (Pahal y cols., 2000) y los valores normales del adulto a las 22 semanas de gestación (Sola-Visner M, 2012). En el proceso de producción plaquetaria se distinguen varias fases: Introducción 53 a. Producción de factores trombopoyéticos (trombopoyetina). b. Proliferación de los progenitores megacariocíticos. c. Diferenciación y maduración de los megacariocitos d. Producción y salida de las plaquetas a la circulación. Es bien conocido desde hace varias décadas que la concentración de trombopoyetina (TPO) en recién nacidos de cualquier edad gestacional es significativamente mayor que en adultos, si bien en neonatos con trombocitopenia las cifras de TPO son más bajas. Varios trabajos (Ferrer-Marin y cols., 2013, Sola-Visner 2012, Olson y cols., 1992) han demostrado que los progenitores megacariocíticos (MG) presentan un alto nivel proliferativo a diferencia de los presentes en adultos, dando como resultado largas colonias de MGs. De hecho, progenitores hematopoyéticos (células CD34) procedentes de sangre de cordón generan aproximadamente unas 10 veces más MG que las células CD34 procedentes de sangre periférica de adultos (Liu y cols., 2011). Sin embargo, los MGs tanto fetales como neonatales presentan un menor tamaño y niveles más bajos de ploidía, dando como resultado un menor número de plaquetas que los MGs adultos (Olson y cols., 1992). Por todo ello los MGs neonatales/fetales han sido tradicionalmente considerados inmaduros comparados con los de adultos. 3.3.1. Función plaquetaria en recién nacidos sanos Una de las diferencias significativas entre las plaquetas de adultos y las de neonatos es la pobre respuesta a los distintos agonistas como el ADP, la trombina, los análogos del TXA2 o la epinefrina. Los mecanismos subyacentes a estas diferencias no se conocen en su totalidad, pero se ha sugerido que la hiporreactividad a la epinefrina se debe a la escasa p   Ƚʹ érgicos (Corbi y cols., 1981), mientras que la respuesta disminuida al TXA2 se deriva de diferencias en la Introducción 54 señalización de los receptores en las plaquetas neonatales (Israels y cols., 2003). A pesar de que existe una disminución de los agonistas (Sitaru y cols., 2005) que inducen la secreción de gránulos y, por ende un retraso en la activación plaquetaria, los distintos trabajos no han encontrado evidencia de una hemostasia alterada en neonatos a término (Andrew y cols.,1990 a y b; Israels y cols., 2001). De hecho, diversos test como el tiempo de sangrado o el PFA-100 nos revelan que la hemostasia primaria en recién nacidos sanos es más efectiva que en adultos, demostrando tiempos de sangrado más cortos. Ello se ha atribuido a la presencia de hematocritos más altos en la edad neonatal, elevados volúmenes corpusculares medios y altas concentraciones de polímeros de FvW. Todos ellos, factores que estimularían la hemostasia primaria y compensarían la menor función plaquetaria neonatal (Del Vecchio y cols., 2008). 3.3.2. Función plaquetaria en neonatos pretérminos A pesar del escaso número de estudios llevados a cabo en esta población, la citometría de flujo y la agregometría han confirmado la hiporreactividad de las plaquetas en este grupo comparado con los niños a término. De hecho, dicha hiporreactividad es más acuciada en RNP comparada con los recién nacidos a término, sugiriendo una correlación entre edad gestacional y reactividad plaquetaria. Linder y cols. demostraron que la adhesión plaquetaria a la matriz extracelular era más pobre en el RNP que en el RNT (Linder y col., 2002) y que dicha condición no se relacionaba con bajos niveles de FvW o ristocetina, sino a las propiedades intrínsecas de la plaqueta. Publicaciones más recientes (Wasiluk y cols., 2008) han demostrado que los prematuros extremos presentan menores niveles de CD62P (P-selectina) y PAC-1, ambas relacionadas con un defecto en la adhesión plaquetaria. De acuerdo con Introducción 55 tales hallazgos, los tiempos de sangrado y PFA-100 son más largos en esta población (Sallmon y cols., 2011). 3.3.3. Cambios postnatales en la función plaquetaria Estudios de la función plaquetaria utilizando citometría de flujo (Bednarek y cols., 2009) han demostrado que la hiporreactividad plaquetaria está todavía presente entre el 3º y 4º día de vida tanto en RNP como en RNT. El tiempo que se precisa para alcanzar niveles de adultos no está bien establecido, si bien, se han observado cambios significativos en la mejoría de la reactividad plaquetaria a partir de los 10-14 días de vida (Ferrer-Marin y cols., 2013). 3.4. Trombocitopenia 3.4.1. Definición de trombocitopenia en RNT y RNP La trombocitopenia es la condición hematológica más frecuente durante el periodo neonatal y está presente entre un 18% y un 25% de todos los ingresos de las Unidades de Cuidados Intensivos Neonatales (Chakravorty y cols., 2005). Distintos trabajos han demostrado que el número de plaquetas fetales alcanza la cifra de 150 x 109/L al final del primer trimestre (Van den Hof y Nicolaides, 1990; Pahal y cols., 2000). Clásicamente se ha mantenido la definición de trombocitopenia neonatal al recuento menor de 150 x 109/L en cualquier neonato sano a cualquier edad gestacional. Esta cifra es ciertamente válida para niños a término en referencia a los grandes estudios poblacionales que demuestran que >98% de los niños a término presentan un recuento plaquetario >150 x 109/L al nacimiento (Burrows & Introducción 56 Kelton, 1990a y b, 1993). Sin embargo, algunos autores (Wiedmeyer y cols., 2009; Christensen y cols., 2012) abogan por la revisión de los rangos de referencia que encuadran la definición de trombocitopenia en neonatos con edades gestaciones inferiores a 32 semanas. Wiedmeyer (2009) demostró en un estudio poblacional que incluyó 47.291 neonatos de todas las edades gestacionales y edades postnatales, que en aquellos nacidos < 32 semanas el valor de referencia por debajo del cual se situaba el percentil 5 era de 104 x 109 /L. En este mismo trabajo llevado a cabo en 18 centros hospitalarios, se observó un incremento de los recuentos plaquetarios conforme avanzaba la edad gestacional. Así, el análisis de regresión lineal puso en evidencia que por cada semana de vida, se producía un incremento del número de plaquetas en 2089 µ l-1. Sin embargo en prematuros nacidos con EG comprendidas entre 22 y 27, el incremento no se iniciaba hasta una vez alcanzada la edad corregida de 29 semanas. En vista a lo previamente expuesto, cuando se emplea la definición clásica de trombocitopenia, la prevalencia en RNP asciende al 70-80% (Sola-Visner 2012, Wiedmeyer y cols., 2009). Afortunadamente, la mayoría de los casos son leves, de ahí que muchos expertos prefieran referirse a trombocitopenia moderada (50-100 x 109/L) o severa (< 50 x 109/L) cuyas incidencias descienden entre un 2-4% a un 10% (Christensen y cols., 2012). 3.4.2. Causas de trombocitopenia La mayor parte de las causas de trombocitopenia pueden ser identificadas a través de una meticulosa historia clínica. La edad gestacional, la edad de presentación de la trombocitopenia o la historia materna y neonatal son piedras angulares a la hora de establecer una relación entre las distintas causas que subyacen a esta patología (FerrerMarin y cols., 2013). Introducción 57 La edad de presentación de la trombocitopenia es un importantísimo predictor de la etiología. Así, las causas más frecuentes que se presentan en las primeras 72 horas, obedecen a complicaciones del embarazo y del parto como la insuficiencia placentaria, la preeclampsia materna o la restricción del crecimiento intrauterino. Por el contrario, la gran mayoría de los neonatos que desarrollan trombocitopenia a partir de las 72 horas, suelen presentar infecciones bacterianas adquiridas (Goerge y cols., 2008) o una NEC en caso de ser un RNP (Chakravorty y col., 2005). En la tabla 6 se exponen las principales causas de trombocitopenia neonatal. Tiempo de presentación Causas < 72 horas x Hipoxia crónica fetal (preeclampsia, CIR, diabetes maternal) x Asfixia perinatal x Infección perinatal (E. coli, streptococo grupo B) x Coagulación vascular diseminada x Trombocitopenia neonatal alloimnune x Trombocitopenia neonatal autoimmune x Infección congenital (CMV, rubeola, toxoplasma) x Trombosis de la vena renal x Leucemia congénita x Síndrome de Kasabach-Merritt >72 horas x Sepsis tardía x Enterocolitis necrotizante x Infecciones congénitas (CMV, toxoplasma, rubeola, virus Coxsackie) x Autoinmune x Síndrome de Kasabach-Merritt x Enfermedad metabólica Tabla 6. Causas de trombocitopenia en función de los días de presentación. viii Factores de riesgo asociados a fracturas por fragilidad Pacientes y Métodos 65 ESTUDIO 1. Población El estudio se llevó a cabo en una cohorte de 238 recién nacidos prematuros con edad gestacional menor a 30 semanas y peso al nacimiento menor a 1500 gramos ingresados en el Complejo Hospitalario Insular Materno Infantil de Canarias (CHUIMI) entre Julio de 2007 y Marzo de 2012. Los pacientes habían sido previamente incluidos en el estudio “Carbamoyl-phosphate Synthase Gene Polymorphisms Influencing Plasma L-arginine Concentrations in Preterm Infants” que fue aprobado por la comisión ética del centro hospitalario y registrado en el “ClinicalTrials.gov Protocol Registration System” (NCT00554866). Se solicitó consentimiento informado por escrito a los padres de los niños incluidos en el estudio. Los criterios de exclusión del estudio fueron: x Fallecimiento antes de las 48 horas de vida. x Malformaciones cardiacas x Administración profiláctica de indometacina. Estudio y tratamiento del DAP-HS Según el protocolo de la Unidad de Neonatología del CHUIMI se realizó ecografía cardiaca (ecógrafo Hewlett Packard Sonos 5500) en todos aquellos prematuros que presentaron signos clínicos de sobrecarga pulmonar (incremento del trabajo respiratorio, problemas de oxigenación) entre el 2º y 3º día o de hipoperfusión sistémica (oliguria, distensión abdominal, mala perfusión periférica). Ocasionalmente, cuando el paciente no precisaba soporte respiratorio y en ausencia de inestabilidad hemodinámica, el neonatólogo podía obviar la realización de la ecografía. Dichos pacientes fueron excluidos del estudio (fig. 7). Pacientes y Métodos 66 Se definió DAP-HS si el DA presentaba ecográficamente: x Diámetro transductal >1.5 mm (medido en proyección paraesternal eje corto con Doppler-color). x Ratio aurícula izquierda/aorta >1.5mm (medido en modo M). x Presencia de Flujo retrógrado holosistólico en la aorta descendente (a nivel diafragmático). Figura 7. Organigrama en el que se detalla la pauta de tratamiento del DAP-HS llevada a cabo. El tratamiento del DAP-HS consistió en la administración de inhibidores de la COX. Durante el periodo comprendido entre Diciembre 2006 y Junio 2009, los pacientes fueron tratados con indometacina. A partir de Julio 2009 hasta Marzo 2012, el tratamiento se llevó a cabo con Ibuprofeno. Tras la administración de un Pacientes y Métodos 67 ciclo de tratamiento, se evaluó la respuesta mediante una nueva ecocardiografía. Ante la presencia de un DAP-HS, se inició un segundo ciclo de tratamiento (figura 7). La permanencia de un DAP-HS tras 2 ciclos de tratamiento se consideró una indicación para cirugía. También se consideró como indicación para el cierre quirúrgico la presencia de factores que contraindicaran el tratamiento médico tales como enterocolitis necrotizante, HIV o hemorragia activa. Variables estudiadas Se recogieron los siguientes datos maternos y/o perinatales x Diabetes materna. : x Preeclampsia. x Presencia o no de corioamnionitis materna definida como la presencia de fiebre materna acompañada de leucocitosis materna, taquicardia fetal (>180 latidos por minuto) y líquido amniótico maloliente. x Administración de corticoides prenatales (no, incompleta con 1 dosis o completa con 2 dosis). x Edad gestacional: Se obtuvo por cálculo de fecha de última regla contrastada con ecografía antes de las 20 semanas. x Sexo y datos antropométricos: peso (gr), talla (cm) y perímetro cefálico (cm). x Pequeño para edad gestacional (PEG) definido como la presencia de un peso al nacimiento por debajo del percentil 10 ajustado por sexo y según las gráficas consultadas (Carrascosa y cols., 2008). x Test de Apgar. x CRIB (Clinical Risk Índex for Babies): score o escala de gravedad que incluye la EG, el Peso al nacimiento, la máxima y la mínima FiO2, el mínimo exceso de base y la presencia o no de malformaciones. x Administración de surfactante. x Media de líquidos administrados al neonato durante los primeros 4 días de vida. Pacientes y Métodos 68 x Presencia de hipotensión arterial, definida como la necesidad de administración de inotrópicos. Se recogieron los siguientes datos clínicos x Displasia broncopulmonar (BPD), definida como dependencia de oxígeno a las 36 semanas de edad postconcepcional (Jobe y Bancalari, 2001). sobre la evolución de los prematuros: x Enterocolitis necrotizante (NEC), definida según la clasificación de Bell (Bell, 1978) Se incluyeron los grados 2 y 3. x Hemorragia intraventricular (HIV) utilizando la clasificación de los 4 grados (Papile y cols., 1978). Se incluyeron en el estudio los prematuros que presentaron HIV grados 3 y 4. x Fallecimiento. Recuentos plaquetarios Las muestras sanguíneas para determinación de recuento plaquetarios se recogieron en tubos con EDTA tripotásico como anticoagulante y se analizaron mediante un autoanalizador Coulter® LH 750 (Beckman Coulter, Inc, Brea, California). Los recuentos plaquetarios fueron evaluados a mano si el recuento automático era inferior a 100 x 109/L. Las muestras sanguíneas fueron tomadas al nacimiento y, posteriormente, según criterio del neonatólogo responsable del paciente. Sin embargo, en cada paciente con DAP-HS, al menos una determinación sanguínea, fue realizada antes y durante la administración del tratamiento con inhibidores de la COX. La recogida de muestras se dividió en 2 periodos (1-2 días y 3-7 días), eligiéndose el valor nadir si se disponía de más de 1 recuento plaquetario en dicho intervalo de tiempo. Se definió trombocitopenia como recuento plaquetario inferior a 150 x 109/L. Asimismo, se llevó a cabo una clasificación de la trombocitopenia en leve (100 a <150 x 109), moderada (entre 50 y 100 x 109) y severa (<50 x 109). Pacientes y Métodos 69 Análisis estadístico. El estudio estadístico fue realizado mediante el programa IBM SPSS Statistics software versión 19 (IBM Corp, Ar-monk, New York and SPSS Inc, Chicago, Illinois). Las variables categóricas se resumieron en frecuencias y porcentajes mientras que las numéricas en medias y desviaciones estándar (SD) o en medianas y rangos intercuartílicos (IQR) según se dieran o no los supuestos de normalidad (evaluada mediante el test de Kolmogoronov-Smirnow). Los porcentajes fueron comparados usando el test de la Chi-square (F2) mientras que para el análisis de las medias se empleó el test t-Student. El test de Wilcoxon se utilizó para comparar las medianas. Para cada uno de los periodos estudiados, aquellas variables que mostraron asociación significativa con el endpoint se introdujeron en un análisis de regresión logístico multidimensional. Se llevó a cabo una selección retrospectiva de variables basada en el criterio de Akaike (Bozdogan, 2000). El modelo logístico seleccionado se resume en p-valores (test de razón de verosimilitudes), oddratios ajustadas (OR) las cuales se estimaron mediante un intervalo de confianza al 95%, y valores AIC correspondientes a los modelos que resultarían de suprimir la variable examinada. Un test de hipótesis se consideró estadísticamente significativo cuando el correspondiente valor de la p fue inferior a 0.05. Pacientes y Métodos 70 ESTUDIO 2. Metaanálisis. Protocolo Se desarrolló un protocolo de forma prospectiva con objetivos específicos detallados entre los que se encontraban los criterios para la selección de los estudios y la valoración de la calidad de los mismos, así como la metodología estadística. Fuente de datos Se realizó una búsqueda de la literatura usando las bases de datos Pubmed/MEDLINE y EMBASE desde su comienzo hasta el 1 Diciembre de 2014. Se utilizaron los siguientes descriptores: “ductus arteriosus”, “patent ductus arteriosus”, “PDA”, “platelet(s)”, “platelet count(s)” y “thrombocytopenia”. Selección de estudios Tres investigadores evaluaron de forma independiente los estudios para su inclusión. Cualquier discrepancia se resolvió mediante la discusión de los mismos. Los estudios fueron seleccionados si evaluaban prematuros y presentaban un grupo de comparación, así como datos que podrían ser usados para medir la asociación entre DAP y recuentos plaquetarios. Extracción de datos y valoración de la calidad del estudio Dos autores de forma independiente valoraron datos del diseño y la calidad de los estudios, de los datos demográficos, el porcentaje de DAP y/o DAP HS y los recuentos plaquetarios. Pacientes y Métodos 71 Un tercer investigador comprobó la extracción de los datos para completar y valorar su precisión. En ocasiones, se contactó con los autores para solicitar información de datos que faltaban en algunos de los estudios seleccionados. Se valoró la calidad metodológica usando la escala de Newcastle-Ottawa (Wells y cols.,) para estudios de cohortes. Esta escala evalúa la calidad de estudios no aleatorizados buscando incorporar las evaluaciones de calidad en la interpretación de metaanálisis de los resultados obtenidos. La escala de Newcastle-Ottawa (NOS) evalúa la calidad a partir del contenido, diseño y facilidad de uso en la interpretación de los resultados. Está compuesta por 8 items (anexo I) y se clasifica empleando un sistema de valoración de estrellas (rango: 0-9 estrellas). Análisis estadístico Los distintos estudios seleccionados fueron analizados y combinados usando el software COMPREHENSIVE META-ANALISIS V2.0 (Biostat Inc, Englewood, NJ, USA). Las medidas de efecto global utilizadas fueron el riesgo relativo (RR) para las variables dicotómicas y la diferencia estándar de medias para las variables cuantitativas. Se empleó el método DerSimonian-Laird de efectos aleatorios (random-effects) para combinar los resultados y estimar el efecto global con un intervalo de confianza del 95%. Con el fin de identificar aquel estudio que pudiera ejercer una influencia desproporcionada en el efecto global, se llevó a cabo un análisis de sensibilidad. Dicho análisis consiste en replicar los resultados del metaanálisis excluyendo en cada paso uno de los estudios incluidos en la revisión. Si los resultados así obtenidos son similares, tanto en dirección como en magnitud del efecto y significación estadística, indica que el análisis es robusto. La posibilidad de sesgo de publicación se evaluó gráficamente mediante la construcción del gráfico de embudo (funnel plot) y estadísticamente mediante el test de Egger. La heterogeneidad fue medida utilizando el estadístico Q y cuantificada mediante la I2 (Higgins y cols., 2003). Con el fin de explorar las posibles fuentes de Pacientes y Métodos 72 heterogeneidad se llevó a cabo una meta-regresión usando el modelo de efectos aleatorios (random effects model). Las siguientes posibles fuentes de heterogeneidad fueron analizadas: x Número de pacientes. x Edad gestacional media. x Peso medio al nacimiento. x Porcentaje de varones. x Porcentaje de DAP/DAP-HS. x Intervalo de días en el que los recuentos plaquetarios fueron recogidos. x Grado de trombocitopenia x Año de publicación. Se consideró estadísticamente significativo un valor de probabilidad inferior a 0.05, excepto para los test de heterogeneidad, para el cual el grado de significación estadística aceptado fue de 0,10. RESULTADOS Resultados 80 Tabla 12. Trombocitopenia durante la primera semana de vida entre los RNP con o sin DAP-HS al 3º día y los respondedores y no respondedores al tratamiento con inhibidores de la COX. Los valores son número de pacientes con sus respectivos porcentajes. DAP-HS al 3º día Respuesta al tratamiento Si (n=105) No (n=89) P Si (n=79) No (n=22) p Día de vida 1-2 Recuento plaquetario <150 x 109 /L 10 (9,5) 12 (13,5) 0,386 8 (10,1) 3 (13,7) 0,640 Grado de trombocitopenia No Leve Moderada Severa 95 (90,5) 6 (5,7) 4 (3,8) 0 (0,0) 77 (86,5%) 3 (3,4%) 7 (7,9) 2 (2,2) 0,130 71 (89,9) 1 (3,4) 6 (7,9) 1 (2,2) 19 (86,3) 2 (9,1) 1 (4,6) 0 (0,0) 0,886 Día de vida 3-7 Recuento plaquetario <150 x 109 /L 23 (29,1) 8 (36,4) 0,514 Grado de trombocitopenia No Leve Moderada Severa 56 (70,9) 8 (10,1) 8 (10,1) 7 (8,9) 14 (63,6) 3 (13,7) 4 (18,2) 1 (4,6) 0,777 Resultados 81 1.6. Análisis multivariable. En el estudio de regresión multilogístico los factores de riesgo para el DAP-HS al 3º día que se identificaron fueron la edad gestacional, la presencia de SDR y la hipotensión arterial (tabla 13). Tabla 13. Análisis de regresión multidimensional de los factores de riesgo para la presencia de DAP-HS al 3º día. Los valores en paréntesis corresponden al intervalo de confianza al 95%. p valores: test de razón de verosimilitudes (likelihood ratio test). AIC: valor de AIC si la variable es eliminada del modelo (para el modelo completo, AIC: 234,3). 1.7 Respuesta al tratamiento con inhibidores de la COX En la tabla 14 se reflejan las características maternas, clínicas y demográficas de los pacientes respondedores y no respondedores al tratamiento con inhibidores de la COX. En el análisis univariable se observó que los pacientes que no respondieron al tratamiento médico presentaban de forma estadísticamente significativa una edad gestacional menor, un peso al nacimiento menor y un índice de CRIB mayor. El aporte total de líquidos en los primeros 4 días fue significativamente mayor en el grupo de los no respondedores, grupo en el que también se observó de forma significativa una mayor incidencia de hipotensión arterial (tabla 14). En cuanto al número de plaquetas (tabla 14), y los grados de trombocitopenia (tabla 12) durante los intervalos de días 1-2 y 3-7 no se observó una diferencia estadísticamente significativa entre respondedores y no respondedores. El análisis de regresión logístico multivariable demostró que la hipotensión arterial era un factor independiente para la falta de respuesta al tratamiento (OR= 4.550, 95% CI: 1.508-13.73, p= 0.005). P OR ajustada AIC Edad gestacional (semanas) 0.013 0.778 (0.633-0.951) 238.5 SDR 0.001 5.191 (1.764-15.27) 243.1 Hipotensión arterial 0.006 2.999 (1.338-6.721) 239.9 Resultados 82 Tabla 14. Características maternas y neonatales de los respondedores y no respondedores al tratamiento del DAP HS con inhibidores de la COX. Respuesta al tratamiento Si (n=79) No (n=22) p Corticoides prenatales n(%) Ciclo completo Ciclo parcial No 60 (75.9) 8 (10.1) 11 (13.9) 17 (77.3) 3 (13.6) 2 (10.1) 0.926 Preeclampsia, n (%) 15 (19) 4 (18.2) 0.932 Diabetes mellitus, n (%) 4 (5.1) 1 (4.5) 0.921 Corioamnionitis 5 (6.3) 0 (0.0) 0.226 Edad gestacional (semanas) 27 (26-29) 26 (25-27) 0.006 Peso al nacimiento (g) 994 ± 250 869 ± 181 0.003 Sexo masculino n (%) 42 (53.3) 10 (45.6) 0.522 PEG n (%) 13 (16.5) 4 (19.0) 0.848 CRIB 4 (1-6) 1 (1-3) < 0.001 Surfactante , n(%) 51 (64.6) 19 (86.4) 0.106 Líquidos administrados (ml/kg/d) 87 [8097] 94 [89-101] .009 Hipotensión Arterial, n (%) 27 (34.2) 14 (63.6) 0.013 SDR 74 (93.7) 22 (100) 0.226 BPD 15 (19.0) 8 (36.4) 0.085 NEC 6(7.6) 4 (18.2) 0.142 HIV 20 (25.3) 9 (40.9) 0.153 Nadir recuento plaquetario (x 109/L) Dias 1-2 221 (174-260) 210 (186-268) 0.764 Dias 3-7 151 (92-208) 166 (94-215) 0.633 Resultados 83 Estudio 2. Metaanálisis. Se identificaron 31 estudios potencialmente relevantes a través de los sistemas de búsqueda electrónica y manual. Tras una revisión cuidadosa, 8 estudios (Echtler y cols., 2010; Dizdar y cols., 2012; Dani y cols., 2013; Shah y cols., 2010; Sallmon y cols., 2012; Chen y cols., 2014; Bas-Suarez y cols., 2014; Brunner y cols., 2013), una carta al editor (Fujioka y cols., 2011) y 1 abstract (Dwarakanath y cols., 2011) fueron finalmente incluidos en el metaanálisis. Una cohorte adicional no publicada de 126 prematuros fue incluida en el metaanálisis. Los niños de esa cohorte habían participado en un estudio multicéntrico sobre la influencia de los polimorfismos genéticos de la Carbamil Fosfato Sintetasa (CPS) como factor de riesgo para la enterocolitis necrotizante. Los criterios de inclusión de dicho estudio fueron: edad gestacional menor a 30 semanas y peso al nacimiento menor o igual a 1500 gramos. La combinación de los 11 estudios supuso una muestra global de 3479 recién nacidos prematuros. Las principales características de los estudios están resumidas en la tabla 15. Todos los estudios fueron retrospectivos salvo uno (Brunner y cols., 2013) que fue prospectivo. Todos los trabajos presentaron una calidad alta y fueron evaluados con, al menos, 6 estrellas NOS. De los estudios incluidos en el metaanálisis, cuatro (Fujioka y cols., Shah cols., Brunner y cols. y Dwarakanath y cols.) comparaban niños con y sin DAP. Es decir, los pacientes con un DAP residual no HS se incluían en el grupo DAP. Por su parte otros 4 estudios (Dizdar y cols., Dani y cols., Chen y cols., y Bas-Suarez y cols.) comparaban niños con o sin DAP-HS. Es decir, los DAP pequeños eran incluidos en el grupo control. Finalmente, 2 estudios (Echtler y cols. y Sallmon y cols.) y la cohorte CPS, ofrecían datos sobre DAP cerrado, DAP no HS y DAP-HS. Dichos estudios se incluyeron en ambos análisis: DAP vs no DAP; DAP-HS vs no DAP-HS. Resultados 84 En la tabla 16 se muestran los factores de riesgo para DAP/ DAP-HS identificados mediante el análisis multivariable en los diferentes estudios. 1º autor del estudio Factores de riesgo significativos en el análisis multivariable (OR; 95% CI) Echtler y cols. Recuento plaquetario<150 x 109/L (13.13; 3.47-49.60) Shah y cols. Nadir plaquetario (0.73; 0.55-0.98), mayor quintil plaquetario (nadir) (0.43; 0.2-0.91), edad gestacional (0.84; 0.70-0.99); corticoides prenatales (0.52;0.34-0.81); preeclampsia (0.37; 0.140.99); SDR (2.73; 1.37-5.40); líquidos administrados (1.09;1.001.19). Dizdar y cols. Recuento plaquetario <150 x 109/L (2.083; 1.252-3.465); ancho de distribución plaquetaria > 17 (3.030; 1.571-5.847), SDR (2.534; 1.602-4.009); Sallmon y cols. Sexo masculino (1.64; 1.32-2.04)a; sepsis (2.82; 1.47-5.40)a; EG (OR no mostrado) Dani y cols. Recuento plaquetario <100 x 10 9 /L (4.50; 1.39-14.61); EG(1.25; 1.12-1.39); Bas-Suárez y cols. EG (OR, 0.778;0.633-0.951); SDR (5.19; 95% CI, 1.76-15.27); hipotensión arterial (2.99; 1.338-6.721) Tabla 16. Factores de riesgo para el desarrollo del DAP/DAP-HS. A OR univariable. OR: Odds ratio. CI: Intervalo de confianza. EG: edad gestacional. SDR: Síndrome distres respiratorio. 85 Tabla 15. Características de los estudios incluídos en el metaanálisis. En el estudio de Shah y cols (2011) todos los pacientes recibieron indometacina profilactica. En el studio de Echtler y cols (2010) un número no disponible de pacientes recibió indometacina profiláctica. EG: Edad gestacional de la cohorte (semanas, media o mediana); PN: peso al nacimiento de la cohorte (g, media o mediana); PL: plaquetas (x 109/L); NR: Datos no disponibles; DAP: ductus arteriosus persistente; DAP-HS: Ductus arteriosus persistente hemodinámicamente significativo aDatos que no aparecen en los artículos originales, pero facilitados por sus autores. bAbstract. cBasado en el número de pacientes tratados con inhibidores de la COX. dPacientes con recuentos de plaquetas <50 x 109/L excluídos. eEstudio multicéntrico no publicado hasta la fecha. Polimorfismos de la Carbamil Fosfato Sintetasa (CPS) como factor de riesgo de la NEC. 1º autor del estudio Año n EG cohorte (semanas) PN cohorte (g) % varones Días valoración plaquetas % DAP % DAPHS Rango de valoración PL (días) % PL<150 % PL<100 Echtler 2010 123 28.0 1036 48.8 3-5 70,7 23,6 1 15.4 0.0 Fujioka 2011 118 27.9 1059 57.6 3-5 29,7 23,7a 1 16.1 6.8a Shah 2011 497 25.8 825 52.6 3 34.0 NR 3 27.2 a 8.7 a Dwarakanathb 2011 148 26.0 733 50.0 NR 60,8 45,9 c 3 41.2 NR Dizdar 2012 361 28.6 1054 46.5 3-5 NR 42,7 3 23.82 5.5 a Sallmon 2012 1350 28.3 1060 48.7 4-5 56,3 26,7 1 16.44 3.4 Dani 2012 163 27.1 931 49.7 1-2 NR 82,8 1 32.5 19.6 a Brunner 2013 322 29.0 1170 50.6 2-7 50,9 47,2 1 NR 2.8 d Bas 2014 194 27.9 1008 55.7 2-4 NR 54,6 2 11.3 6.7 Chen 2014 77 29.5 1153 49.4 3-6 NR 44,2 1 NR NR CPSe 2015 126 28.4 1096 51.2 2-4 69,8 64,3 2 28.57 14.28 Resultados 86 2.1 Recuento plaquetario < 150 x 109/L y DAP. Los datos del porcentaje de DAP en los niños con recuentos plaquetarios inferiores o superiores a 150 x 109/L estaban disponibles en 6 estudios (figura 9). Figura 9. Forest plot de los estudios que examinan el efecto de las plaquetas por debajo de 150 x 109/L en los primeros días sobre el DAP. El riesgo relativo (RR) >1 significa incremento del riesgo de DAP. Los datos de Shah y cols. no se presentan en el artículo, pero fueron cedidos por el autor. Como se muestra en la figura 9, se detectó una asociación positiva estadísticamente significativa (RR: 1.215; CI 95% 1.027-1.436) entre el DAP y el número de plaquetas por debajo de 150 x 109/L. Dicho de otro modo, el hecho de presentar en los primeros de vidas postnatal un número de plaquetas <150 x 109/L incrementa el riesgo de presentar un DAP entre un 2.7% y un 43%. Para verificar la robustez de los resultados se llevó a cabo un análisis de sensibilidad excluyendo un estudio cada vez y calculando el nuevo efecto global y su intervalo de confianza. Cuando se excluyó el estudio de Echtler y cols. el RR se situó en 1.138 (95% CI 0.991-1.306, p=0.067), mientras que si se excluye el estudio de mayor peso, (Sallmon y cols.), el RR ascendió a 1,291 (95% CI 1.106-1.507; p=0,001). En la figura 10 se Resultados 87 representa gráficamente el resultado del análisis permitiendo visualizar cómo afecta la eliminación de cada estudio al resultado global. Figura 10. Forest plot tras análisis (sensibilidad) extrayendo uno a uno cada uno de los estudios. El análisis de metarregresión (modelo efectos aleatorios) demostró que aquellos estudios que incluían un mayor número de niños (figura 11) presentaban un riesgo relativo significativamente menor de DAP con recuentos plaquetarios por debajo de 150 x 109/L (Z= -2.460, p<0.014). No se observó ninguna otra correlación estadísticamente significativa con las otras variables estudiadas mediante metarregresión (porcentaje de varones, EG media, peso medio al nacimiento, rango de días de valoración de plaquetas, porcentaje de DAP y porcentaje de niños con plaquetas < 150 x 109/L. En el anexo III podemos encontrar las representaciones gráficas de dichas metarregresiones (Figuras 25-30). Resultados 88 Figura 11. Gráfico de burbujas que muestra el análisis de metarregresión (modelo de efectos aleatorios) entre el número de pacientes incluidos en el estudio y el riesgo de presentar un DAP con plaquetas < 150 x 109/L en los primeros días de vida. Cada uno de los círculos representa a uno de los estudios incluidos en el análisis. El área de los círculos representa el peso relativo de cada estudio. 2.2 Recuento plaquetarios < 100 x 109/L y DAP. Los datos del número de niños que presentaron DAP con recuentos plaquetarios inferiores o superiores a 100 x 109/L estaban disponibles en 5 estudios (figura 12). Ninguno de los niños que participaron en el estudio de Echtler y cols. presentaban un número de plaquetas inferior a 100 x 109/L. Se observó una asociación positiva estadísticamente significativa entre el DAP y los recuentos plaquetarios inferiores a 100 x 109/L (RR: 1.255; IC 95%: 1.034-1.525; p= 0.022. Figura 12). Resultados 89 Figura 12. Forest plot de los estudios que examinan el efecto de las plaquetas por debajo de 100 x 109/L en los primeros días sobre el DAP. El riesgo relativo (RR) > de 1 significa incremento del riesgo de DAP. Los datos de Shah y cols. y Fujioka y cols. no estaban disponibles en las publicaciones originales pero fueron amablemente cedidos por los autores. En el análisis de sensibilidad, excluyendo los estudios uno a uno (Figura 13) se observó que cuando se eliminaba el estudio de Sallmon el RR alcanzaba 1.220 (IC 95%: 0.886-1.681; p=0.223), mientras que si excluíamos el trabajo de Shah y cols. el RR se situaba en 1.327 (IC 95% :1.162-1.516, p<0.001). Por su parte, el análisis de metarregresión (modelo efectos aleatorios) puso de manifiesto una correlación positiva estadísticamente significativa entre la edad gestacional media (Z=2.550; p=0.010. Figura 15) y el peso medio al nacimiento (Z= 2.580, p=0.009. Figura 14) de los niños incluidos en cada estudio y el riesgo de presentar DAP con recuento de plaquetas < 100 x 109/L. Es decir, aquellos estudios que incluían grupos de niños más maduros y con mayor peso, presentaban mayor riesgo de DAP con plaquetas < 100 x 109/L (ver estadística más detallada en anexo II). No se observó ninguna otra correlación estadísticamente significativa con las otras variables Resultados 96 En el análisis de sensibilidad, excluyendo los estudios uno a uno (Figura 21), se observó que cuando se eliminaba el estudio de Dizdar y cols. el RR se situaba en 1.177, mientras que si se eliminaba el estudio de Bas cols. el RR ascendía a 1.302 con sus correspondientes intervalos de confianza que se muestran en la figura 21. Figura 21. Forest plot tras análisis extrayendo uno a uno cada uno de los estudios. El análisis de metarregresión (modelo efectos aleatorios) demostró una correlación negativa estadísticamente significativa entre el sexo masculino y el riesgo de presentar DAP-HS con recuentos plaquetarios por debajo 100 x 109/L (Z=- 1.976, p=0.048. Figura 22). Es decir, aquellos estudios que incluían un menor porcentaje de varones presentaban mayor riesgo de DAP-HS con plaquetas < 100 x 109/L (estadística más detallada en anexo II). No se observó ninguna otra correlación estadísticamente significativa con las otras variables estudiadas mediante metarregresión (edad gestacional, peso al nacimiento, porcentaje de DAP-HS, número de pacientes incluidos, porcentaje de niños con plaquetas <100 x 109/L y año de Resultados 97 publicación). En el apéndice VI se muestran las representaciones gráficas de dichas metarregresiones (anexo VI: fig. 43-47). Figura 22. Gráfico de burbujas que muestra el análisis de metarregresión (modelo efectos aleatorios) entre el porcentaje de varones incluidos en el estudio y el riesgo de presentar DAP-HS con recuento de plaquetas <100 x 109/L. Finalmente mediante el test de Egger se comprobó la ausencia de sesgo de publicación estadísticamente significativo. En el anexo VII (figura 49) se muestra el gráfico de embudo (gráfico de Light y Pillemer) y la estadística correspondiente. Resultados 98 2.5. Recuento plaquetario < 50 x 109/L y DAP HS Los datos de los niños cuyos recuentos plaquetarios eran inferiores a 50 x 109/L estaban disponibles en 3 cohortes (figura 23). El metaanálisis no pudo detectar asociación estadísticamente significativa entre el DAP y los recuentos plaquetarios < 50 x 109/L (RR: 1.123 IC 95%: 0.717-1.757, p= 0.613). Figura 23. Forest plot para los estudios que examinan el efecto de los recuentos plaquetarios por debajo de 50 x 109/L y la presencia de DAP-HS en los primeros días. Resultados 99 2.6. Diferencias en el recuento plaquetario medio en RN con o sin DAPHS La media de los recuentos plaquetarios en los niños que presentaron o no DAP-HS estaban disponibles en 5 estudios (Figura 24). El valor combinado de la diferencia estándar de las medias (no DAP-HS menos DAP-HS) incluye el valor 0 y, por tanto, no es estadísticamente significativo (11.69 x 109, IC95%:-16.23 - 39.62, p=0.412). Figura 24. Forest plot de los estudios que examinan las diferencias de medias. viii Factores de riesgo asociados a fracturas por fragilidad DISCUSIÓN viii Factores de riesgo asociados a fracturas por fragilidad Discusión 103 Estudios experimentales realizados en ratones han demostrado la importancia de la presencia de plaquetas normales en número y función para el cierre permanente anatómico del DA (Echtler y cols., 2010). Estos mismos autores han identificado la trombocitopenia leve al nacimiento como un factor de riesgo para el fracaso del cierre del DA en prematuros. Aunque los resultados clínicos de Echtler han sido confirmados por otros autores (Dizdar y cols., 2012; Dani y cols., 2013) también se han publicado otros estudios retrospectivos de cohortes que no encuentran esta asociación entre trombocitopenia y DAP (Fujioka y cols., 2011; Sallmon y cols., 2012; Shah y cols., 2011). Por tanto, la extrapolación de los hallazgos de Echtler en su modelo murino al RN humano resulta altamente controvertida. El objetivo de la presente tesis ha sido intentar ofrecer argumentos adicionales a esta discusión científica. Inicialmente intentamos analizar si en nuestra población de RNP se cumplía lo demostrado por Echtler; es decir, que un nivel de plaquetas menor de 150 x 109/L al nacimiento era un factor de riesgo independiente para presentar un DAP en RNP. La cohorte analizada por nosotros incluyó 194 prematuros (EG <30 semanas y peso al nacimiento inferior a 1500 g) ingresados en un único centro de nivel terciario. En este grupo de pacientes, no hemos encontrado ninguna asociación significativa entre el nadir plaquetario observado en los primeros dos días de vida y la presencia de DAP-HS en el tercer día de vida. Del mismo modo, el recuento plaquetario obtenido a lo largo de la primera semana de vida no influyó de manera significativa en la respuesta al tratamiento del DAP-HS con indometacina o ibuprofeno. Estos datos nos permiten concluir que, al menos en nuestra población, no existe evidencia de una asociación entre los niveles bajos de plaquetas y el DAP del RNP. Como ya hemos mencionado, nuestros resultados no coinciden con los de Echtler y cols. (2010), Dizdar y cols. (2012), y Dani y cols. (2013), pero si con los de Fujioka y cols. (2011), Sallmon y cols. (2012), y Shah y cols. (2011). Debido a estas disparidades, decidimos combinar todos los resultados publicados hasta la fecha en un metaanálisis. Discusión 104 Nuestro metaanálisis combinó 11 estudios de cohortes que incluían 3479 RNP y muestra que un recuento bajo de plaquetas en los primeros días de vida aumenta de una forma modesta, pero estadísticamente significativa, el riesgo de presentar tanto DAP como DAP-HS. Sin embargo, la baja robustez de la asociación y el alto nivel de heterogeneidad estadística entre los estudios nos lleva a sugerir que el nexo entre número de plaquetas y cierre del DAP probablemente carezca de relevancia clínica. Las diferencias en el diseño del estudio, las características de la población, etc. pueden llevar a resultados muy diferentes y comprometer los resultados de un metaanálisis. Nuestro metaanálisis incluye estudios relativamente homogéneos en cuanto a diseño y población; al menos en cuanto a edad gestacional y peso al nacimiento se refiere. A pesar de ello, cuando hemos analizado la relación entre trombocitopenia y DAP/DAP-HS, hemos observado una gran heterogeneidad estadística. La heterogeneidad estadística únicamente cuantifica la variabilidad entre los resultados de los estudios y puede ser debida a las diferencias reales de planteamiento y ejecución entre los estudios incluidos o a otras causas (Higgins y Thompson, 2002; Bowden y cols., 2011). La metarregresión sirve para investigar si la heterogeneidad entre los resultados de diferentes estudios está relacionada con características específicas de dichos estudios (Baker y cols., 2009). Esas características se incluyen en el modelo de metarregresión como covariable y son discutidas en diversos párrafos de este capítulo. Las alteraciones en el número o la función de las plaquetas no parecen ser ningún obstáculo para el cierre del DA en el RNT. Así lo demuestra el hecho de que los RN con trombocitopenia aloinmune, síndrome de Wiskott-Aldrich, o tromboastenia de Glanzman no presentan una mayor incidencia de DAP (Clyman y cols., 2010; Awidi, 1992; Bussel y cols., 2005; Ochs y cols., 2009). Este argumento ha sido utilizado para cuestionar si el modelo de Echtler de cierre trombótico del DA en ratones puede ser extrapolado a humanos. Un argumento en defensa del modelo de Echtler es la semejanza entre el DA murino y el DA del pretérmino humano. Como se ha comentado en la introducción, el cierre funcional del DA del RNT produce una Discusión 105 compresión de los vasa vasorum con el consiguiente estímulo hipóxico. En el RNP, al igual que ocurre en el ratón, el DA tiene paredes mucho más finas y carece de vasa vasorum. Por tanto, existiría la posibilidad de que el oxígeno presente en la sangre que circula por el lumen residual difundiera a la túnica media impidiendo el estímulo hipóxico que es fundamental para el cierre definitivo del DA (Clyman y cols., 2010; Goldbarg y cols., 2003; Kajino y cols., 2002). Siguiendo este razonamiento, la oclusión del lumen ductal por el trombo plaquetario resultaría relevante solamente en el RNP, al igual que ocurre en el ratón (Clyman and Chemtob 2010). Sin embargo, un argumento en contra de esta hipótesis la encontramos en nuestro estudio de metarregresión, en el que observamos una correlación positiva entre la edad gestacional de los niños y la asociación entre DAP y trombocitopenia (figura 14). Es decir, aquellas cohortes con una edad gestacional media mayor tendían a mostrar una mayor asociación entre DAP y trombocitopenia. Una de las mayores dificultades para entender la posible asociación entre trombocitopenia y DAP/DAP-HS es que se trata de correlacionar dos entidades cuya definición en el RNP es controvertida. La trombocitopenia neonatal ha sido clásicamente definida como un recuento inferior a 150 × 109/L. Esta definición es válida para neonatos a término ya que más del 98% presentan recuentos superiores a esta cifra al nacimiento (Chakravorty y cols., 2012). Sin embargo, no está claro si este límite es adecuado para RNP. En un estudio multicéntrico que incluyó 47.291 neonatos el percentil 5 de los recuentos plaquetarios fue 104 x 109/L (Wiedmeier y cols., 2009). Si usamos la definición clásica de trombocitopenia la incidencia de esta endidad en los niños de muy bajo peso al nacimiento alcanza el 70-80% (Sola-Visner, 2012; Chakravorty y Roberts, 2012). Sin embargo, en la mayor parte de los casos se trata de trombocitopenias leves o moderadas mientras que la prevalencia de la trombocitopenia grave (recuento plaquetario < 50 x 109/L) que se comunica en la mayoría de las series se mantiene entre el 2 y el 10% (Sola-Visner 2012). Por otra parte, la trombocitopenia leve, e incluso la moderada, no parecen tener una gran relevancia clínica (Sola-Visner 2012). En el único estudio aleatorizado prospectivo que abordó este tema, los investigadores encontraron que la transfusión de plaquetas para tratar la trombocitopenia leve o moderada no alteraba la incidencia Discusión 112 Finalmente una perspectiva experimental que nos gustaría sugerir es el estudio de la posible influencia de los factores vasoactivos que liberan las plaquetas en la contractilidad y el cierre del DA. Las plaquetas activadas liberan mediadores como serotonina, trombina, tromboxano A2 o factor activador de plaquetas. De alguna de ellas, principalmente del tromboxano A2, conocemos sus efectos ductales (Smith, 1998; Agren y cols., 2007; Schuurman y Villamor, 2010; van der Sterren y Villamor, 2011). Utilizando el embrión de pollo como modelo, el grupo del Dr. Villamor ha demostrado que tanto la serotonina (van Zogchel y Villamor, 2014) como la trombina (Kartal y cols., 2012) son vasoconstrictores específicos del DA. Además estos factores podrían no limitar su efecto al cierre funcional del DA sino que, a través de sus capacidades promitóticas (Coughlin 2000; Lesurtel y Clavien, 2010) participar en el cierre anatómico definitivo. CONCLUSIONES viii Factores de riesgo asociados a fracturas por fragilidad Conclusiones 115 En nuestra muestra formada por 194 prematuros con edad gestacional inferior a 30 semanas y peso al nacimiento inferior a 1500 g: 1. No se encontró una asociación estadísticamente significativa entre la presencia de un ductus arteriosus persistente hemodinámicamente significativo al tercer día de vida y el recuento de plaquetas en los dos primeros días de vida. 2. La presencia en los dos primeros días de vida de una trombocitopenia – definida como un recuento plaquetario inferior a 150 x 109/L y clasificada como leve (100 -150 x 109/L), moderada (50-100 x 109/L), o grave (<50 x 109/L)– no se asoció de forma estadísticamente significativa con la presencia de un ductus arteriosus persistente hemodinámicamente significativo al tercer día de vida. 3. La respuesta al tratamiento con indometacina o ibuprofeno no se vio afectada de forma estadísticamente significativa por la cifra de plaquetas o por la presencia de trombocitopenia leve, moderada o grave durante los siete primeros días de vida. 4. La presencia de un ductus arteriosus hemodinámicamente significativo en el tercer día de vida se asoció de forma independiente con la edad gestacional, la presencia de síndrome de distrés respiratorio y la hipotensión arterial. Conclusiones 116 En un metaanálisis que combinó nuestra muestra con otras once publicadas en la literatura para conseguir una muestra global de 3479 recién nacidos prematuros se observó: 1. Que la presencia de una trombocitopenia leve o moderada aumentaba de forma marginal, pero estadísticamente significativa, el riesgo de presentar un ductus arteriosus persistente. 2. Que la presencia de una trombocitopenia moderada aumentaba de forma marginal, pero estadísticamente significativa, el riesgo de presentar un ductus arteriosus persistente hemodinámicamente significativo Conclusiones 117 English In our cohort, which included 194 preterm infants with gestational age below 30 weeks and birth-weight below 1500 g: 1. The presence of hemodynamically significant patent ductus arteriosus on the third day of life was not significantly associated with the median platelet count nadir within the first two days of life. 2. The presence of hemodynamically significant patent ductus arteriosus on the third day of life was not significantly associated with the rate of thrombocytopenia –defined as platelet count <150 x 109/L and graded as mild (100 to <150 x 109/L), moderate (50 to <100 x 109/L), or severe (<50 x 109/L)– within the first 2 days of life. 3. The response of hemodynamically significant patent ductus arteriosus to treatment with indomethacin or ibuprofen was not significantly affected by platelet counts within the first seven days of life. 4. The presence of hemodynamically significant patent ductus arteriosus on the third day of life was independtly associated with gestational age, arterial hypotension, and respiratory distress syndrome. Conclusiones 118 In a meta-analysis, which combined our cohort with 10 previously published studies and included data from 3.479 preterm infants, it was observed that: 1. The presence of mild or moderate thrombocytopenia was marginally, but significantly, associated with patent ductus arteriosus. 2. The presence of moderate thrombocytopenia was marginally, but significantly, associated with hemodynamically significant patent ductus arteriosus. BIBLIOGRAFÍA viii Factores de riesgo asociados a fracturas por fragilidad Bibliografía 121 1. Agren P, Cogolludo AL, Kessels CG, Perez-Vizcaino F, De Mey JG, Blanco CE. et al. Ontogeny of chicken ductus arteriosus response to oxygen and vasoconstrictors. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2007;292:485-96. 2. Ahamed MF, Verma P, Lee S, Vega M, Wang D, Kim M et al. Predictors of successful closure of patent ductus arteriosus with indomethacin. J Perinatol 2015;35:72934. 3. Ahn HM, Park EA, Cho SJ, Kim YJ, Park HS. The association of histological chorioamnionitis and antenatal steroids on neonatal outcome in preterm infants born at less than thirty-four weeks' gestation. Neonatology 2012;102:259-64. 4. 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A maximum of two stars can be given for Comparability Selection 1) Representativeness of the exposed cohort a) truly representative of the average _______________ (describe) in the community Ø b) somewhat representative of the average ______________ in the community Ø c) selected group of users eg nurses, volunteers d) no description of the derivation of the cohort 2) Selection of the non exposed cohort a) drawn from the same community as the exposed cohort Ø b) drawn from a different source c) no description of the derivation of the non exposed cohort 3) Ascertainment of exposure a) secure record (eg surgical records) Ø b) structured interview Ø c) written self report d) no description 4) Demonstration that outcome of interest was not present at start of study a) yes Ø b) no Comparability 1) Comparability of cohorts on the basis of the design or analysis a) study controls for _____________ (select the most important factor) Ø b) study controls for any additional factor Ø (This criteria could be modified to indicate specific control for a second important factor.) Outcome 1) Assessment of outcome a) independent blind assessment Ø b) record linkage Ø c) self report d) no description 2) Was follow-up long enough for outcomes to occur a) yes (select an adequate follow up period for outcome of interest) Ø b) no 3) Adequacy of follow up of cohorts a) complete follow up - all subjects accounted for Ø b) subjects lost to follow up unlikely to introduce bias - small number lost - > ____ % (select an adequate %) follow up, or description provided of those lost)c) follow up rate < ____% (select an adequate %) and no description of those lost d) no statement Anexos 144 Figura 33. Gráfico de burbujas que muestra el análisis de metarregresión entre el porcentaje de varones y el riesgo de presentar un DAP con plaquetas < 150 x 109/L en los primeros días de vida. Figura 34. Gráficos de burbujas que muestra análisis de metarregresión de la relación entre el porcentaje de DAP y el riesgo de presentar DAP con plaquetas < 100 x 109/L en los primeros días de vida. Anexos 145 Figura 35. Gráfico de burbujas que muestra análisis de metarregresión de la relación entre el porcentaje de pacientes con plaquetas < 100 x 109/L y el riesgo de presentar DAP con plaquetas < 100 x 109/L en los primeros días. Figura 36. Gráfico de burbujas que analiza el rango de días para la valoración de los recuentos plaquetarios y el riesgo de presentar un DAP con plaquetas < 100 x 109/L en los primeros días de vida. Anexos 146 Anexo V. Figuras de las metarregresiones que analizan DAP-HS con plaquetas < 150 x 109/L Figura 37. Gráfico de burbujas que muestra análisis de metarregresión de la relación entre el porcentaje de pacientes con plaquetas < 150 x 109/L y el riesgo de presentar DAP HS con plaquetas < 150 x 109/L en los primeros días. Figura 38. Gráfico de burbujas que muestra análisis de metarregresión de la relación entre la media de días de valoración de los recuentos plaquetarios y el riesgo de presentar y el riesgo de presentar DAP-HS con plaquetas < 150 x 109/L en los primeros días. Anexos 147 Figura 39. Gráfico de burbujas que analiza porcentaje de pacientes con DAP-HS de la muestra y riesgo de presentar DAP-HS con plaquetas < 150 x 109/L en los primeros días de vida. Figura 40. Gráfico de burbujas que muestra análisis de metarregresión de la relación entre la media del peso al nacimiento de la muestra y el riesgo de presentar DAP-HS con plaquetas < 150 x 109/L en los primeros días de vida. Anexos 148 Figura 41. Gráficos de burbujas que muestra análisis de metarregresión de la relación entre la edad gestacional media de la muestra y el riesgo de presentar DAP-HS con plaquetas < 150 x 109/L en los primeros días de vida Figura 42.. Gráfico de burbujas que analiza porcentaje de varones incluidos en el estudio y el riesgo de presentar DAP-HS con plaquetas < 150 x 109/L en los primeros días de vida. Anexos 149 Anexo VI. Figuras de las metarregresiones que analizan DAPHS con plaquetas < 100 x 109/L Figura 43. Gráficos de burbujas que muestra análisis de metarregresión de la relación entre el peso medio de la muestra y el riesgo de presentar DAP-HS con plaquetas < 100 x 109/L en los primeros días de vida. Figura 44. Gráfico de burbujas que analiza el porcentaje de niños con plaquetas < 100 x 109/L frente a riesgo de presentar DAP-HS con plaquetas < 100 x 109/L en los primeros días de vida. Anexos 150 Figura 45. Gráficos de burbujas que muestra análisis de metarregresión de la relación entre la edad gestacional media de la muestra y el riesgo de presentar DAP HS con plaquetas < 100 x 109/L en los primeros días de vida. Figura 46. Gráfico de burbujas que muestra análisis de metarregresión de la relación entre el rango de días para la valoración de los recuentos plaquetarios y el riesgo de presentar DAP-HS con plaquetas < 100 x 109/L en los primeros días de vida. Anexos 151 Figura 47. Gráficos de burbujas que analiza porcentaje de pacientes con DAP-HS de la muestra y el riesgo de presentar DAP-HS con plaquetas < 100 x 109/L en los primeros días de vida. Anexos 152 ANEXO VII. Figura 48. Gráfico de embudo (funnel plot) que muestra la presentación de los artículos que relacionan DAP y trombocitopenia en forma de embudo invertido (gráfico de Light y Pillemer). Los círculos representan los artículos. Debajo se representa el estadístico test de Edger. Anexos 153 Figura 49. Gráfico de embudo (funnel plot) que muestra la presentación de los artículos que relacionan DAP-HS y trombocitopenia en forma de embudo invertido. Los círculos representan los artículos. Debajo se representa el estadístico test de Edger.