Sistema HLA y factores farmacogenéticos en la evolución de la infección por VIH-1 en pacientes de Las Palmas de Gran Canaria

UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA PROGRAMA DE DOCTORADO: AVANCES EN MEDICINA INTERNA DEPARTAMENTO DE CIENCIAS MÉDICAS Y QUIRÚRGICAS SISTEMA HLA Y FACTORES FARMACOGENÉTICOS EN LA EVOLUCIÓN DE LA INFECCIÓN POR VIH-1 EN PACIENTES DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA Tesis Doctoral presentada por Dª Olga Montes Ares Dirigida por el Dr. D. José Luis Pérez Arellano Codirigida por el Dr. D. Alberto Torío Ruiz El Director El Codirector La Doctoranda Las Palmas de Gran Canaria, a 23 de Noviembre de 2015 ÍNDICE I ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Complejo Mayor de Histocompatibilidad 3 1.1.1. Estructura génica del HLA 3 1.1.2. Estructura y función de las moléculas HLA 6 1.2. Infección por el VIH-1 8 1.2.1. Breve historia de los retrovirus. 8 1.2.2. Origen de los virus de la inmunodeficiencia humana 9 1.2.3. VIH. Características generales 10 1.3. HLA y VIH 21 1.4. Farmacogenética y VIH 23 1.4.1. Reacciones de Hipersensibilidad a Abacavir y HLA-B*57:01. 24 1.4.2. Reacciones de Hipersensibilidad a Nevirapina/Efavirenz y HLA-DRB1*01:01 26 1.5. CCR5 28 1.5.1. Estructura y función. 28 1.5.2. VIH y CCR5. 30 1.6. CYP2B6 32 2. OBJETIVOS 37 3. PACIENTES Y MÉTODOS 3.1. Población de estudio 41 3.2. Diagnóstico Microbiológico 42 3.3. Recuento de linfocitos T CD4 45 3.4. Extracción ADN 46 3.5. Técnicas para el tipaje HLA-B y HLA-DRB1 47 3.6. Caracterización del genotipo CCR5 Δ 32 53 3.7. Determinación del polimorfismo CYP2B6 516>GT 54 3.8. Análisis Estadístico 56 ÍNDICE II 4. RESULTADOS 4.1. Características de la población estudiada 59 4.2. Frecuencias HLA-B 63 4.3. Frecuencias HLA-DRB1 67 4.4. Infecciones oportunistas y HLA 70 4.4.1. Candidosis 70 4.4.2. Neumonía por Pneumocystis jirovecii 71 4.4.3. Tuberculosis 74 4.4.4. Infección por citomegalovirus 76 4.4.5. Neumonías recurrentes 77 4.4.6. Otras Infecciones 79 4.5. Coinfecciones y HLA 80 4.5.1. Coinfección VIH/VHB -/ 80 4.5.2. Coinfección VIH/VHC 81 4.5.2. Coinfección VIH/VHB/VHC 83 4.6. Sarcoma de Kaposi y HLA 85 4.7. Evolución del recuento de linfocitos T CD4 y HLA 87 4.8. Caracterización del genotipo CCR5 ∆ 32 98 4.9. HLA-DRB1 y Reacciones de Hipersensibilidad a Nevirapina 99 4.10. CYP2B6 y Reacciones de Hipersensibilidad a Nevirapina 102 5. DISCUSIÓN 107 6. CONCLUSIONES 129 7. BIBLIOGRAFÍA 133 8. INDICE DE TABLAS 157 9. INDICE DE FIGURAS 161 ABREVIATURAS aas Aminoácidos ABC Abacavir Ac Anticuerpo AcMo Anticuerpo monoclonal ADN Ácido desoxirribonucleico Ag Antígeno APC Célula presentadora de antígeno ARN Ácido ribonucleico CD Cluster differentiation-grupo de diferenciación CHUIMI Complejo Hospitalario Universitario Insular Materno Infantil CMIA Inmunoensayo quimioluminiscente de micropartículas CRF Formas recombinantes circulantes CYP Citocromo P450 dNTPs Deoxinucleótidos trifosfato DRESS Drug Rash with Eosinophilia and Systemic Symtoms ECD Ficoeritrina-texas red EDTA Ácido etilendiaminotetraacético EFV Efavirenz ELISA Enzimo-inmunoanálisis FE Factor etiológico FITC Isotiocianato de fluoresceína FP Factor preventivo GWAS Genome-wide association studyestudio de asociación del genoma completo HLA Antígeno leucocitario humano HSP Heat shock protein-proteína de choque térmico Ig Inmunoglobulina IL Interleucina kDa Kilodalton kb Kilobase MHC Complejo principal de histocompatibilidad NF-kB Factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de células B activadas NK Natural killer-células asesinas naturales NNRTIs Inhibidores no nucleósidos de la transcriptasa inversa ns No significativo NVP Nevirapina Pb Pares de base PC5 Ficoeritrina-cianina-5 PCR Reacción en cadena de la polimerasa PE Ficoeritrina RD1 Ficoeritrina RHS Reacción de Hipersensibilidad RLUs Unidades relativas de luz RR Riesgo relativo RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction-reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa SIDA Síndrome de inmunodeficiencia adquirida SNP Single nucleotide polymorphismpolimorfismo de un solo nucleótido SSO Oligonucleótidos específicos de secuencia SSP Sequence specific priming-cebadores específicos de secuencia TNF Factor de necrosis tumoral UI Unidad internacional VHB Virus B de la hepatitis VHC Virus C de la hepatitis VIH Virus de la Inmunodeficiencia Humana WT Wild type-gen natural o silvestre 1. INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN 8 colaboradores CD4. Tomado de Elsevier.© Abbas, Lichtman, and Pillai. Cellular and Molecular Immunology, 7th ed.2012 Figura 1.3: Estructura de una molécula de HLA de clase II 1.2. INFECCION POR EL VIH-1 1.2.1. Breve historia de los retrovirus El primer miembro de los retrovirus fue descrito en 1911 por Rous como un agente filtrable, más pequeño que una bacteria, capaz de transmitir la producción de tumores en pollos: el virus del sarcoma de Rous. Posteriormente, en 1970 Howard Temin y David Baltimore (Baltimore D, 1970; Temin H y Mizutani S, 1970) realizaron independientemente el descubrimiento central del mecanismo de retro-transcripción. En los años posteriores se describieron numerosos agentes retrovirales relacionados en su mayoría con tumores en aves y ratones. En 1980 Robert Gallo y su grupo, en plena expansión de las teorías del origen vírico de los tumores, descubrieron el primer retrovirus humano, el HTLV-I, un agente relacionado inicialmente con la leucemia de células T del adulto y posteriormente con el cuadro neurológico conocido como paraparesia espástica tropical. Este mismo grupo describiría al año siguiente otro agente, el HTLV-II, que se relacionó con una rara leucemia de células peludas. INTRODUCCIÓN 9 El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) fue descubierto en 1983, a los dos años de la comunicación de los primeros casos de síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), por el grupo de Françoise Barré-Sinoussi y Luc Montagnier en el Instituto Pasteur de París (Barre-Sinoussi F, 1983) y posteriormente en 1984 por el propio grupo de Robert Gallo en el Instituto Nacional de Cáncer en Bethesda, EE.UU. (Popovic M y col., 1984). Después de una importante polémica sobre la autoría del descubrimiento, y la diferente nomenclatura propuesta por cada uno de los laboratorios, en 1986 se acordó la denominación de virus de la inmuno-deficiencia humana. 1.2.2. Origen de los virus de la inmunodeficiencia humana El VIH pertenece a la familia de los lentivirus y se clasifica en 2 tipos: VIH-1 y VIH-2, que tienen un 40-50% de homología genética y una organización genómica similar. El VIH-1 es el causante de la pandemia mundial de SIDA, mientras que el VIH-2, aunque también puede producir SIDA, se considera menos virulento y menos transmisible. El VIH-2 se encuentra confinado principalmente a zonas del África Occidental, aunque se han detectado algunos casos en Europa y EE.UU. Tanto el VIH-1 como el VIH-2 provienen de diferentes saltos interespecie de virus que infectan en la naturaleza a poblaciones de simios en África. El VIH-2 está muy cercano filogenéticamente al SIVsm, virus de la inmunodeficiencia del Sooty mangabey, una variedad de mono muy frecuente en África Occidental. El origen del VIH-1 ha sido mucho más laborioso de esclarecer, ya que proviene del agente que infecta en la naturaleza a la variedad de chimpancé Pan troglodytes troglodytes, que habita en zonas poco accesibles del sur de Camerún (SIVcpzPtt) (Keele BF y col., 2006; Gao F y col., 1999). Las cepas del VIH-1 se han clasificado en cuatro grandes grupos según su homología genética y se cree representan diferentes episodios de salto interespecies. Estos son el grupo M (main o principal), el grupo O (outlier), el grupo N y el grupo P. El grupo M se ha dividido en 9 subtipos (A, B, C, D, F, G, H, J, K) y en cepas recombinantes entre ellos, denominados CRF (formas recombinantes circulantes). Los CRF se forman por recombinación de fragmentos genómicos de distintos subtipos. Actualmente se han descrito más de 30 CRF y su número se incrementa constantemente. INTRODUCCIÓN 10 1.2.3. Virus de la inmunodeficiencia humana. Características generales Estructura El VIH-1 tiene forma de esfera con un diámetro de 100-120 nm. Al igual que todos los virus envueltos, su envoltura consiste en una bicapa lipídica tomada de la membrana de la célula humana durante el proceso de gemación de nuevas partículas. En esta envoltura se encuentran presentes algunas proteínas de la célula huésped y muy significativamente Env, la glicoproteína de envoltura del VIH. Env se encuentra anclada en la membrana y consiste en un heterotrímero formado por 3 moléculas llamadas glicoproteína 120 (gp120) en la zona más externa, y un tronco de una estructura transmembrana que consta a su vez de 3 moléculas llamadas glicoproteína 41 (gp41) (figura 1.4). El gen gag codifica las principales proteínas estructurales: la proteína de matriz p17, anclada en el interior de la membrana, y la proteína de la cápside p24, que forma por polimerización una estructura nuclear cónica que contiene en su interior un complejo proteína-ácido nucleíco formado por 2 copias del ARN genómico del VIH-1, la nucleoproteína p7 y la transcriptasa inversa p66 (RT). El gen pol codifica las 3 enzimas necesarias para el ciclo infectivo del virus: la proteasa (PR), la transcriptasa inversa (RT) y la integrasa (IN). Además, el VIH-1 contiene otros 6 genes denominados inicialmente accesorios: tat, rev, nef, vif, vpu y vpr, que dan lugar a sus correspondientes proteínas con un papel muy importante en el ciclo biológico del virus (Tabla 1.1). Tat y Rev son proteínas reguladoras que se acumulan en el núcleo y se unen a regiones específicas del ARN viral: TAR y RRE respectivamente. La proteína Tat es un potente activador de la transcripción y es esencial para la replicación del virus. Rev es un factor de exportación nuclear que facilita la salida al citoplasma de los ARN mensajeros largos antes de ser procesados en el núcleo y permite así la traducción y expresión de las proteínas estructurales. La proteína Nef ha sido objeto de numerosas investigaciones ya que participa en diversas funciones. Esta proteína induce regulación negativa de CD4 y moléculas HLA de clase I en la superficie de las células infectadas (Collins KL y col., 1998), lo INTRODUCCIÓN 11 que puede representar un mecanismo de escape importante al evadir el ataque mediado por linfocitos T CD8. Nef también parece interferir con la activación del linfocito T al unirse a varias proteínas que intervienen en las vías de transducción de señales intracelulares. Vpr es importante para el transporte al núcleo del complejo viral preintegración, inmediatamente después de la entrada del virus a la célula, lo que permite al VIH-1 infectar células que no estén activamente dividiéndose. Figura 1.4. Esquema general de la estructura de la partícula de VIH-1. ARN: genoma del virus; CA: cápside; ENV: envoltura; IN: integrasa; MA: matriz; NC: nucleocápside; PR: proteasa; RT: retrotranscriptasa . INTRODUCCIÓN 12 Nombre Tamaño Función Gag MA p17 Anclaje de la membrana. Transporte al núcleo CA p24 Cápside NC p7/p6 Nucleocápside, unión a ARN/Unión a Vpr Pol PR p15 Corte de Gag/Pol y maduración RT p66, p51 Retrotranscripción y actividad ARNsa H IN p31 Integración del provirus Env gp120/gp41 Glicoproteína de envoltura, unión a CD4 y correceptores Tat p16/p14 Transactivador transcripcional Rev p19 Transporte de ARN fuera del núcleo Vif p23 Infectividad Vpr p10-15 Transporte nuclear Vpu p16 Liberación de partículas en la membrana Nef p27-25 Inhibe la expresión de CD4 y HLA clase I Fuente: Modificado de Delgado R, 2011 Tabla 1.1. Tamaño y función de las proteínas que codifican los genes de VIH-1 Ciclo biológico del virus de la inmunodeficiencia humana La replicación del VIH en la célula comienza con la unión de las glucoproteínas gp120 y gp41 al receptor CD4 y los receptores de quimiocinas CCR5 y CXCR4 (figura 1.5). La primera interacción induce una serie de cambios conformacionales que exponen el dominio V3 y las regiones adyacentes que forman el dominio de unión de la gp120 a los receptores de quimiocinas (ArenzanaSeisdedos F, 2008; Zolla-Pazner S y Cardozo T, 2010). Esta segunda interacción da lugar a nuevos cambios en la estructura de la gp41 que expone en la región N-terminal un dominio altamente hidrofóbico que se ancla en la membrana plasmática. Esta estructura inestable genera un movimiento de unión de los dominios heptaméricos de la gp41, y durante este proceso de cierre o plegamiento, la membrana plasmática y la membrana viral se aproximan y fusionan. INTRODUCCIÓN 13 Una vez fusionadas las membranas viral y celular, se produce la internalización de la nucleocápside y la decapsidación del genoma vírico. En este proceso, las proteínas de la cápside se desensamblan y liberan el genoma viral. El proceso de retrotranscripción, síntesis de ADN a partir del ARN viral, es realizado por el complejo enzimático de la transcriptasa inversa. Una vez sintetizado, el ADN proviral se acopla a una serie de factores celulares y virales (Vpr) formando el complejo de preintegración. Este complejo es transportado al núcleo, donde se integra en el genoma del hospedador, constituyendo la forma proviral del VIH. El ADN no integrado representa el 90% del ADN viral existente en linfocitos circulantes y en su forma lineal constituye un reservorio susceptible de integración si la célula es adecuadamente activada. Una vez en el estado de integración, el VIH puede permanecer latente, replicarse de forma controlada o experimentar una replicación masiva con el consiguiente efecto citopático sobre la célula infectada. A partir del estado de provirus integrado, la replicación del VIH comienza mediante la transcripción del genoma viral. La parte inicial de este proceso, denominada iniciación de la transcripción, depende de factores celulares y se produce en ausencia de proteínas virales. El principal factor celular que interviene en el paso de la fase de latencia viral a la de reactivación es NF-kB, una familia de proteínas que regulan la expresión de múltiples genes celulares que participan en los procesos de reconocimiento y activación inmunitarios. Este factor no existe en forma activa en los linfocitos T CD4 en estado de reposo y es inducido en el curso de los procesos de activación inmunológica (Alcamí J y col., 1995), lo que explica que la replicación del VIH está estrechamente relacionada con el estado de activación de los linfocitos infectados. Una vez iniciada la síntesis del ARN viral, la expresión de la proteína viral Tat aumenta la tasa de transcripción del genoma del VIH y permite la elongación completa del ARN viral. El ARNm del VIH se sintetiza en forma de un único transcrito que debe ser transportado al citosol y procesado en ARN de distinto tamaño. Procesamiento y transporte son regulados por la proteína viral Rev, que tiene una localización preferentemente nuclear. Rev también participa en el acoplamiento de los distintos ARNm a la «maquinaria» de los ribosomas que sintetizarán las proteínas virales. Una vez sintetizadas, las proteínas virales deben INTRODUCCIÓN 14 ser procesadas antes de ensamblarse en lo que constituirán las partículas maduras. En este proceso participan proteínas del virus como Vif, Vpu y la proteasa viral. La maduración final de los viriones y el ensamblaje correcto de las proteínas virales se producen durante el proceso de gemación a través de la membrana celular mediante la acción de la proteasa viral que procesa las poliproteínas gag y gag-pol y permite formar partículas virales maduras. Una vez que se produce la gemación de los viriones, éstos son liberados al espacio extracelular gracias al bloqueo de una proteína de membrana, la tetherina, que actúa como un «secuestrador» de viriones en la membrana celular (Coiras M y col., 2010; Neil SJ y col., 2008). Fuente: Alcamí J and Coiras M, 2011 Figura 1.5. Ciclo biológico del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) Epidemiología de la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana La infección por el VIH y el diagnóstico del SIDAcontinúan siendo uno de los mayores problemas de salud pública en el mundo. Los distintos factores sociodemográficos, culturales, económicos y políticos de cada zona determinan la diferente evolución de la epidemia en las distintas áreas INTRODUCCIÓN 15 geográficas del planeta. La epidemia ha ido creciendo exponencialmente en muchos países, así como extendiéndose hacia áreas del planeta que en un principio no se habían visto afectadas, tal es así que actualmente podemos hablar de pandemia del VIH. Desde el inicio de la epidemia, casi 78 millones de personas han sido infectadas por el VIH, y aproximadamente unos 39 millones han muerto. Globalmente, a finales del año 2013, el número estimado de personas que conviven con el VIH en el mundo era de unos 35 millones, estimándose una prevalencia global del 0,8% en adultos con edades comprendidas entre 15-49 años (WHO, 2014). A pesar de que los límites de la epidemia continúan variando considerablemente entre países y regiones, el África subsahariana sigue siendo la región más severamente afectada, en la que 1 de cada 20 adultos esta infectado por el VIH, lo que concentra cerca del 71% de todas las personas que viven con VIH en el mundo (WHO, 2014) (Figura 1.6). Figura 1.6. Prevalencia del VIH en adultos según las regiones de la OMS en el año 2013 (WHO, 2014). INTRODUCCIÓN 16 Mecanismos de transmisión El VIH se transmite fundamentalmente por tres vías: • Vía sexual • Vía sanguínea • Vía materno-infantil La principal forma de contagio en el mundo es la relación sexual no protegida y entre los casos pediátricos (menores de 15 años) el 90% de las infecciones son atribuibles al contagio vertical. En España, la coincidencia en el tiempo del inicio de la epidemia del VIH con la del uso parenteral de drogas ilegales supuso la expansión del virus y el patrón epidemiológico observado, ya que la introducción del virus se produjo fundamentalmente por el uso compartido de material de inyección y, en menor medida, en hombres que tienen sexo con hombres (Ministerio de Sanidad y Consumo, 2008). En el último informe de Vigilancia epidemiológica del VIH/SIDAen España de junio de 2014, se observa como las tasas de nuevos diagnósticos de VIH son similares a las de otros países de Europa occidental, aunque superiores a la media del conjunto de la Unión Europea. La vía sexual continúa siendo la principal vía de transmisión en los nuevos diagnósticos de VIH, aumentando año tras año la transmisión entre hombres que tienen sexo con hombres. Las personas de otros países suponen una parte relevante de los nuevos diagnósticos, aunque su peso parece descender desde el año 2010. En cuanto a los casos de SIDA, desde el inicio de la epidemia en España (1993-2013) se han notificado un total de 84.043 casos. A pesar del marcado descenso de su incidencia desde la extensión de los nuevos tratamientos antirretrovirales, nuestro país sigue siendo uno de los que posee mayor incidencia en Europa Occidental. Hasta 1997, la proporción de casos de SIDAen personas cuyo país de origen no era España se situaba por debajo del 3%, pero a partir de 1998 esta cifra aumentó progresivamente hasta alcanzar el 28% en 2013. En este año, el 77,5% de INTRODUCCIÓN 17 casos recayeron en varones y la edad media al diagnóstico fue de 43 años. La proporción de casos pediátricos fue del 0,2%. En el último quinquenio la neumonía por Pneumocystis jirovecii y la tuberculosis de cualquier localización han sido las enfermedades indicativas de SIDA más frecuentes, afectando ambas al 24,6% de los casos, seguidos por la candidosis esofágica (12,7%). Marcadores inmunológicos y virológicos durante la infección A la hora de diagnosticar la infección y monitorizar el tratamiento, podemos utilizar diferentes marcadores virales en función del estadio de la infección en el que nos encontremos. La cinética y el momento de aparición de cada uno de los marcadores es diferente (figura 1.7), y la elección del marcador a detectar va a depender del objetivo del diagnóstico (Buttó S y col., 2010). El primer marcador que aparece tras la infección es el ARN-VIH; este marcador se puede detectar mediante técnicas de amplificación a las 2 semanas de la infección. Prácticamente al mismo tiempo que el ARN-VIH, se puede detectar el ADN del VIH integrado en el genoma celular (ADN proviral). El antígeno p24 suele aparecer en suero a los 11-13 días, y es posible detectarlo aproximadamente durante un mes y medio (Tebourski F y col., 2004). Los anticuerpos se detectan en el suero a las 3 o 4 semanas de la infección, alcanzando su concentración máxima a las 10-12 semanas (Fanales-Belasio E y col., 2010). Al aparecer los anticuerpos, disminuyen los niveles de viremia y desaparece el antígeno p24 como consecuencia de la formación de inmunocomplejos (Buttó S y col., 2010). El intervalo de tiempo entre la infección y la aparición de anticuerpos o seroconversión se conoce como período ventana, y se caracteriza por la presencia de ADN proviral, ARN-VIH, antígeno p24 y ausencia de anticuerpos específicos. INTRODUCCIÓN 24 1.4.1. REACCIÓN DE HIPERSENSIBILIDAD A ABACAVIR y HLA-B*57:01 En el ámbito de la infección por VIH y su tratamiento, la RHS que se produce en individuos tratados con Abacavir (ABC) ha sido ampliamente estudiada, y demostrada su asociación con el alelo HLA-B*57:01 del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (Mallal S y col, 2002). El ABC es un inhibidor de la transcriptasa inversa, análogo de los nucleósidos (guanosina), y se usa con eficacia en combinación con otros fármacos antirretrovirales desde 1988 (Hervey PS y Perry CM, 2000). Se han descrito evidencias de que la RHS producida por ABC, está restringida al HLA-B*57:01 y mediada por linfocitos T CD8 (Chessman D y col.,2008). Estudios cristalográficos han revelado que el ABC se une de forma no covalente al bolsillo de unión del HLA-B*57:01, modificando la forma de la hendidura de unión al antígeno (Figura 1.8). Esto altera el repertorio de péptidos propios del individuo que son presentados por el HLA-B*57:01, favoreciendo la presentación de péptidos que no fueron presentados durante el desarrollo tímico de las células T. Una considerable cantidad de péptidos propios “nuevos” son únicamente presentados en presencia de ABC. Estos péptidos por tanto no habían sufrido el proceso de selección que en el desarrollo de timo se lleva a cabo para eliminar linfocitos T autoreactivos y por tanto pueden ser reconocidos por los linfocitos T de pacientes “hipersensibles” (IIling PT y col., 2012; Ostrov DA y col. 2012; Norcross MA y col., 2012). La RHS se presenta en un 5-8% de pacientes que reciben el fármaco como tratamiento y se manifiesta como un cuadro multisistémico caracterizado por fiebre, malestar general, exantema, síntomas gastrointestinales y respiratorios. Estos signos y síntomas se suelen producir durante las primeras seis semanas tras el inicio del tratamiento y se resuelven rápidamente una vez se suspende el mismo. La reacción no obstante puede ser potencialmente mortal si se produce una reexposición al fármaco en pacientes que hayan desarrollado una RHS previa. Esta reacción es de tipo idiosincrásico por lo que no es posible determinar la probabilidad de que un individuo la pueda sufrir (Validación prospectiva de un test farmacogenético: Estudio PREDICT-1, Mallal S y col., 2008). INTRODUCCIÓN 25 Fuente: Modificado de Ostrov D y col., 2012 Figura 1.8 Estructura del complejo Abacavir-péptido-Sistema HLA. Se muestra el contacto molecular en el bolsillo de unión de HLA-B*57:01. El HLA-B*57 se representa en gris, el péptido presentado en azul cian. El Abacavir se representa como naranja para el carbono, azul marino para el nitrógeno y rojo para el oxigeno. Ser portador del alelo HLA-B*57:01 es una condición necesaria pero no suficiente para desarrollar RHS ya que los estudios realizados reflejan diferencias de entre un 48% y un 94% en el cálculo de la sensibilidad del alelo como predictivo de la reacción. Ha sido demostrado estadísticamente que la determinación prospectiva del HLA-B*57:01 reduce la incidencia de RHS evitando la administración de ABC en aquellos individuos que portan el alelo (Lucas A y col., 2007: Rauch A y col., 2006; Orkin C y col., 2010). Así mismo, su utilidad coste beneficio también ha sido demostrada, aunque las diferencias en la frecuencia de presentación del alelo entre diferentes grupos étnicos ha planteado controversias sobre el uso de la determinación (Nieves D y col., 2010; Schackman BR y col., 2008; Hughes DA y col, 2004). INTRODUCCIÓN 26 1.4.2. REACCIONES DE HIPERSENSIBILIDAD A NEVIRAPINA/EFAVIRENZ Y HLA-DRB*01:01 Prácticamente todos los inhibidores no nucleósidos de la transcriptasa inversa (NNRTIs) se han asociado a reacciones cutáneas leves y de manera menos frecuente a reacciones de hipersensibilidad con afectación multisistémica, y a reacciones cutáneas graves como el síndrome de Stevens Johnson. La epidemiología de estas reacciones más graves ha sido estudiada y comúnmente asociada a la Nevirapina (NVP). La NVP es un fármaco ampliamente utilizado en la infección VIH-1 especialmente en mujeres embarazadas y sus hijos, aunque su uso está limitado debido a los efectos adversos que produce. En la figura 1.9 se muestra su estructura y conformación tridimensional. La reacciones de hipersensibilidad a NVP se producen en cerca de un 5% de pacientes que comienzan su tratamiento. La reacción consiste en fiebre con hepatitis y/o exantema cutáneo y en ocasiones se pueden presentar síntomas multisistémicos. Los casos en los que los pacientes desarrollan reacciones que afectan solo a la piel pueden darse en un 20-35% de los individuos (Barner A, 1998) siendo el agente antirretroviral en el que se han descrito mayor número de reacciones cutáneas graves, como la necrolisis epidérmica tóxica y el síndrome de Stevens-Jonhson. Habitualmente toda la sintomatología se resuelve al cesar la administración del fármaco, pero se han descrito casos de reacciones letales. La reacción suele aparecer en la segunda-tercera semana de tratamiento y es más rápida y grave cuando se reintroduce el fármaco (Stern JO y col. 2003). Esta reacción no es dosis dependiente y tampoco se asocia a alteraciones enzimáticas del citocromo P450. Las características de la reacción sugieren una respuesta inmune dependiente de linfocitos T en individuos genéticamente susceptibles, de hecho se ha descrito que el poseer una cifra disminuida de linfocitos T CD4 en el momento de inicio del tratamiento parece tener un efecto protector (Martin AM y col., 2005). El aumento de la evidencia de la implicación genética en las RHS llevó al estudio de las producidas por la NVP. La primera asociación que se identificó fue la del alelo HLADRB1*01:01 entre paci pretratamiento (>25% del total de linfocitos T) y que presentaban reacciones hepáticas (definidas como aumentos en los niveles de transaminasas séricas) y multisistémicas (Martin AM y col., 2005). Tras la des asociación se han realizado trabajos que informan de múltiples asociaciones que parecen ser dependientes tanto del grupo étnico como del fenotipo de la reacción de hipersensibilidad. La informadas con más frecuencia han sido la aso C*08 en pacientes europeos y HLA asiáticos como caucásicos y en relación con reacciones cutáneas y col., 2009; Yuan J y col., 2011; Gatanaga H y col., 2007). Figura 1.9. Estructura química y conformación tridimensional de la Nevirapina El Efavirenz (EFV) produce reacciones cutáneas en un alto porcentaje de pacientes (1032%) pero no suele producir reacciones de hipersensibilidad sistémicas (Adkins JC y col.,1998). Estas demostrado asociadas a HLA cutáneas aisladas frente a NVP, la asociación parece independiente de otros factores como el recuento de linfocitos T CD4, algo que no ocurre en la sistémicas más graves (Vitezica ZG y col., 2008). DRB1*01:01 entre paci entes con recuentos de linfocitos T CD4 altos tratamiento (>25% del total de linfocitos T) y que presentaban reacciones hepáticas (definidas como aumentos en los niveles de transaminasas séricas) y multisistémicas (Martin AM y col., 2005). Tras la des cripción de esta primera asociación se han realizado trabajos que informan de múltiples asociaciones que parecen ser dependientes tanto del grupo étnico como del fenotipo de la reacción de hipersensibilidad. La informadas con más frecuencia han sido la aso C*08 en pacientes europeos y HLA -B*35:05 y HLAC*04:01 en pacientes tanto asiáticos como caucásicos y en relación con reacciones cutáneas y col., 2009; Yuan J y col., 2011; Gatanaga H y col., 2007). Estructura química y conformación tridimensional de la Nevirapina El Efavirenz (EFV) produce reacciones cutáneas en un alto porcentaje de 32%) pero no suele producir reacciones de hipersensibilidad sistémicas (Adkins JC y col.,1998). Estas reacciones cutáneas también se han demostrado asociadas a HLA - DRB1*01:01 y como en el caso de las reacciones cutáneas aisladas frente a NVP, la asociación parece independiente de otros factores como el recuento de linfocitos T CD4, algo que no ocurre en la sistémicas más graves (Vitezica ZG y col., 2008). INTRODUCCIÓN 27 entes con recuentos de linfocitos T CD4 altos tratamiento (>25% del total de linfocitos T) y que presentaban reacciones hepáticas (definidas como aumentos en los niveles de transaminasas séricas) y cripción de esta primera asociación se han realizado trabajos que informan de múltiples asociaciones que parecen ser dependientes tanto del grupo étnico como del fenotipo de la reacción de hipersensibilidad. La informadas con más frecuencia han sido la aso ciación del HLAC*04:01 en pacientes tanto asiáticos como caucásicos y en relación con reacciones cutáneas (Chantarangsu S Estructura química y conformación tridimensional de la Nevirapina El Efavirenz (EFV) produce reacciones cutáneas en un alto porcentaje de 32%) pero no suele producir reacciones de hipersensibilidad reacciones cutáneas también se han DRB1*01:01 y como en el caso de las reacciones cutáneas aisladas frente a NVP, la asociación parece independiente de otros factores como el recuento de linfocitos T CD4, algo que no ocurre en la s reacciones INTRODUCCIÓN 28 1.5. CCR5 Las citocinas son proteínas de pequeño tamaño secretadas por diferentes tipos celulares habitualmente en respuesta a estímulos activadores, e inducen respuestas a través de receptores específicos. Entre las citocinas liberadas en tejidos en fases iniciales de una infección se encuentran la familia de citocinas quimio-atrayentes que se denominan quimiocinas. Las quimiocinas se definen como mediadores inflamatorios que actúan en procesos de migración y activación leucocitaria. Los miembros de esta familia se clasifican en dos grandes grupos: 1Quimiocinas CC. Poseen dos cisteínas próximas al extremo aminoterminal. 2Quimiocinas CXC. Poseen las dos cisteínas equivalentes separadas por otro aminoácido. Los receptores de quimiocinas son moléculas de la superficie celular que se unen a sus ligandos induciendo los procesos de migración y activación de los leucocitos mediante los cuales son reclutados hacia las zonas de inflamación. Los dos grupos de quimiocinas se unen a diferentes receptores, los receptores CC de los que se conocen 9 (CCR1-9) y receptores CXC, de los que se conocen 5 (CCCR1-5). Estos receptores pertenecen a la superfamilia de la rodopsina y se distinguen por presentar 7 dominios trasmembrana y por su mecanismo de transducción acoplado a proteína-G (Janeway C. Inmunobiologia. 2Ed. 2003). 1.5.1. Estructura y función de CCR5 CCR5 se expresa en la superficie de células del sistema inmune. El gen que lo codifica se localiza en el cromosoma 3 (región p21.3) y contiene un único exón (Samson M y col., 1996). Presenta plegamiento general en α-hélice, su estructura se compone de 7 dominios transmembrana, 3 bucles extracelulares y 4 intracelulares, un dominio Nterminal extracelular y un dominio C-terminal intracelular (figura 1.10). Cuando un ligando se une a CCR5, el receptor parece que lleva a cabo un cambio conformacional que activa la proteína G que se encuentra ligada a los dominios intracelulares del receptor. La proteína G se disocia y activa la Fosfolipasa C que genera los segun dos mensajeros Inositol 1,4, lugar a la liberación intracelular de c unión de qu imiocina al CCR5 también puede activar independientes de la activación de la Proteína G inclu proteinquinasas activadas por mitó La fosforilación de las serinas en la receptor que llevan a cabo la proteinquinasa C dispara arrestinas. Las Beta arrestinas son proteínas multifuncionales que ayudan en la señalización no dependiente de Proteína G iniciar la endocitosis del receptor. dependie ntes de Caveolina se recicla volviendo a la superfi Figura 1.10. Varias quimiocinas pueden unirse al CCR5 y promover la internalización del receptor produciendo un efecto agonista (Proteína 3 quimioatrayente de monocitos) señalización y por tanto servir como antagonistas interfiriendo en la unión y activación de los ligandos agonistas ( dos mensajeros Inositol 1,4, 5Trifosfato y Diacilglicerol, é la liberación intracelular de c alcio y a la acti vación de la proteinquinasa C. imiocina al CCR5 también puede activar otras vía de la activación de la Proteína G inclu yendo vías mediadas por proteinquinasas activadas por mitó genos. La fosforilación de las serinas en la porción Cterminal intracitoplá receptor que llevan a cabo la proteinquinasa C dispara el reclutamiento arrestinas. Las Beta arrestinas son proteínas multifuncionales que ayudan en la señalización no dependiente de Proteína G y ayudan a unir CCR5 a Clatrina iniciar la endocitosis del receptor. A este hecho también contribuye ntes de Caveolina . Una vez dentro del endosoma el CCR5 se desfosforila y se recicla volviendo a la superfi cie celular. Figura 1.10. Estructura de la proteína CCR5 pueden unirse al CCR5 y promover la internalización del receptor produciendo un efecto agonista (Tabla 1.5). Otras quimiocinas como CCL7 (Proteína 3 quimioatrayente de monocitos) pueden unirse a CCR5 sin producir señalización y por tanto servir como antagonistas interfiriendo en la unión y de los ligandos agonistas ( Blanpain C y col., 1999). INTRODUCCIÓN 29 Trifosfato y Diacilglicerol, é sto da vación de la proteinquinasa C. La vía s intracelulares yendo vías mediadas por terminal intracitoplá smica del el reclutamiento de Beta arrestinas. Las Beta arrestinas son proteínas multifuncionales que ayudan en la y ayudan a unir CCR5 a Clatrina para también contribuye n mecanismos . Una vez dentro del endosoma el CCR5 se desfosforila y pueden unirse al CCR5 y promover la internalización del Otras quimiocinas como CCL7 pueden unirse a CCR5 sin producir señalización y por tanto servir como antagonistas interfiriendo en la unión y INTRODUCCIÓN 30 Quimiocina Acción CCL3 (MIP-1alfa) + CCL4 (MIP 1-beta) + CCL5 (RANTES) + CCL7 (MCP-3) - CCL8 (MCP-2) + CCL11 (Eotaxina) + CCL14 alfa (HCC-1) + CCL16 (HCC-4) + Tabla 1.5. Interacciones entre quimiocinas y CCR5. El signo + indica activación y el – inactivación. Muchas células del sistema inmune pueden expresar CCR5 (linfocitos T, células NK, células NKT, células de Langerhans, monocitos, macrófagos, células dendríticas inmaduras y basófilos). Cuando las quimiocinas se unen al CCR5 de estas células efectoras inmunes o células presentadoras de antígenos, se activan y se induce su migración. De entre estas células que expresan CCR5 tan solo aquellas que coexpresan CD4 son potencialmente susceptibles de sufrir infección por el VIH. 1.5.2. VIH y CCR5 El descubrimiento a mediados de los años 90 de que el VIH utilizaba el CCR5 para entrar en las células humanas condujo a que se convirtiera en objetivo en la investigación de la prevención y tratamiento de la infección por VIH. Poco después de este descubrimiento se identificó una deleción de 32 pares de bases en el gen del CCR5 en personas que aun teniendo un alto riesgo de infección por VIH permanecían libres de ella. Esta deleción se produce en la zona que codifica el segundo bucle extracelular, lo que ocasiona la síntesis de una proteína disfuncional que debido a la pérdida de sus 3 últimos segmentos transmembrana, se imposibilita su expresión en la superficie celular (Liu R y col., 1996). La infección en individuos homocigotos para el alelo CCR-delta 32 es extremadamente rara y cuando ocurre INTRODUCCIÓN 31 es causada por cepas virales que pueden utilizar el receptor CXCR4 para su entrada (Gorry PR y col., 2002; Michael NL y col., 1998). En la figura 1.11 se muestra un esquema de este mecanismo. En individuos heterocigotos el riesgo de infección es menor que el de la población general, pero cuando esta se produce su curso esta atenuado, con niveles de viremia plasmática bajos y progresión lenta de la enfermedad en pacientes sin tratamiento (Laurichesse J y col., 2010). Fuente: Modificado de Longo DL, Fauci AS, Kasper DL, Hauser SL, Jameson JL, Loscalzo J: Harrison´s Principles of Internal Medicine, 18th Edition. Figura 1.11. Modelo del papel de los co-receptores CXCR4 y CCR5. Se muestra el mecanismo de entrada de las cadenas X4 y R5 del VIH-1 en las células diana CD4. SDF-1 (stromal cell-derived factor) es el ligando para CXCR4. INTRODUCCIÓN 32 1.6. CYP2B6 El metabolismo de fármacos en el ser humano tiene en el citocromo p450 (CYP-450) una de sus principales enzimas. Este citocromo se identificó en 1958 por Martin Klingenberg como pigmentos hepáticos que absorbían luz a una longitud de onda de 450nm (Klingerberg M, 1958). El citocromo forma una superfamilia enzimática que está implicada en el metabolismo tanto de sustancias endógenas, como los ácidos grasos o las vitaminas liposolubles, como de compuestos exógenos (xenobióticos) como diferentes drogas, pesticidas y diferentes carcinógenos entre otros (Santiago C y col., 2002). En el ser humano hay descritas al menos 18 familias y 44 subfamilias de CYP-450 que metabolizan xenobióticos, pero aproximadamente el 80% de los fármacos utilizados habitualmente en clínica son metabolizados por componentes de las familias 1, 2 y 3 (Zanger UM y col., 2008). La familia 2 (CYP2) a la que originalmente se conocía como “inducible por fenobarbital” tiene a su vez al menos 5 subfamilias (A-E) (Santiago C y col., 2002). El CYP2B6 fue descrito por Yamano S y col. en 1989. Se expresa en el hígado (aunque a bajos niveles) y de menor manera en otros tejidos como endometrio, tracto respiratorio, riñón, intestino delgado, cerebro y piel. Está implicado en el metabolismo de importantes fármacos como el bupropion, ciclofosfamida y tamoxifeno. En el contexto del tratamiento antiretroviral es importante, ya que es la isoenzima que metaboliza el EFV, siendo responsable del 90% de su aclaramiento (Ward BA y col., 2003). El gen que codifica esta isoenzima se encuentra en el cromosoma 19 y presenta un considerable grado de polimorfismo (hasta el momento se han descrito 28 alelos). La variable que más afecta a la expresión del CYP2B6 en el hígado y que a su vez afecta al metabolismo que lleva a cabo, es un cambio G a T en el codón 516 (516G>T), marcador del alelo CYP2B6*6. Este polimorfismo da lugar a una proteína de menor actividad lo que lleva a un aumento de las concentraciones plasmáticas de los fármacos que metaboliza, entre ellos el EFV ( Haas DW y col., 2004). La efectividad de este fármaco antirretroviral así como su toxicidad depende de la actividad de esta enzima. El EFV es uno de los NNRTIs más utilizados como primera línea en la terapia de los pacientes con infección por VIH-1 y a su vez también se utiliza como tercer fármaco en pacientes que muestran tuberculosis como coinfección y que requieren rifampicina en del EFV es muy estrecho (1 caso de que las concentraciones en el caso opuesto (Barco EA sobre el sistema nervioso central aparecen durante los primeros días/semanas de tratamiento y suelen consistir en insomnio, m alteración de la capacidad de concentración. Estos síntomas no suelen ser invalidantes y suelen mejorar progresivamente, pero existen casos en los que se han descrito reacciones maniacas y paranoides, síndromes depresivo psicosis. Pacientes con el genotipo CYP2B6 presentan niveles plasmáticos más altos que aquellos con por tanto son más proclives a sufrir reacciones adversas de tipo neurológico. La prev alencia del genotipo TT varía según las diferentes etnias (20% en población negra, y 6% en caucásicos). Actualmente estudios más amplios de SNPs ( single nucleotide polymorphisms polimorfismo 516G>T colaboran en (Rotger M y col., 2005). Figura 1.12. Distribución de las concentraciones plasmáticas de Efavirenz con relevancia clínica y polimorfismo CYP2B6 y que requieren rifampicina en su tratamiento. El rango terapéutico del EFV es muy estrecho (1 - 4 µg/mL) y existe riesgo de fracaso virol las concentraciones sean infra terapéuticas y de toxicidad neurológ en el caso opuesto (Barco EA y col., 2013). Los síntomas de los efectos adversos sobre el sistema nervioso central aparecen durante los primeros días/semanas de tratamiento y suelen consistir en insomnio, m areos, somnolencia, inestabilidad y alteración de la capacidad de concentración. Estos síntomas no suelen ser invalidantes y suelen mejorar progresivamente, pero existen casos en los que se han descrito reacciones maniacas y paranoides, síndromes depresivo Pacientes con el genotipo CYP2B6 -516T/ T son metabolizadores lentos, presentan niveles plasmáticos más altos que aquellos con los g enotipos GG o GT y por tanto son más proclives a sufrir reacciones adversas de tipo neurológico. alencia del genotipo TT varía según las diferentes etnias (20% en población negra, y 6% en caucásicos). Actualmente estudios más amplios de SNPs single nucleotide polymorphisms ) han identificado más variantes que polimorfismo 516G>T colaboran en la variabilidad de la farmacocinética del EFV Distribución de las concentraciones plasmáticas de Efavirenz con relevancia clínica y polimorfismo CYP2B6 -516. (Tomado de RodríguezNovoa, CID, 2005 INTRODUCCIÓN 33 su tratamiento. El rango terapéutico g/mL) y existe riesgo de fracaso virol ógico en el terapéuticas y de toxicidad neurológ ica y col., 2013). Los síntomas de los efectos adversos sobre el sistema nervioso central aparecen durante los primeros días/semanas de areos, somnolencia, inestabilidad y alteración de la capacidad de concentración. Estos síntomas no suelen ser invalidantes y suelen mejorar progresivamente, pero existen casos en los que se han descrito reacciones maniacas y paranoides, síndromes depresivo s severos y T son metabolizadores lentos, enotipos GG o GT y por tanto son más proclives a sufrir reacciones adversas de tipo neurológico. alencia del genotipo TT varía según las diferentes etnias (20% en población negra, y 6% en caucásicos). Actualmente estudios más amplios de SNPs ) han identificado más variantes que unidas al la variabilidad de la farmacocinética del EFV Distribución de las concentraciones plasmáticas de Efavirenz con Novoa, CID, 2005 ) PACIENTES Y MÉTODOS 41 3.1. POBLACIÓN DE ESTUDIO Para la consecución de los distintos objetivos del trabajo se han analizado 1270 muestras de pacientes diagnosticados de infección por VIH-1. Estas muestras fueron remitidas desde la Unidad de Medicina Tropical y Enfermedades Infecciosas a la Unidad de Inmunología del Complejo Hospitalario Universitario Insular Materno Infantil (CHUIMI) durante un periodo de 6 años (2008-2014). El CHUIMI es un hospital de tercer nivel con 871 camas, que da servicio al área sur de la isla de Gran Canaria con una población de más de 350.000 habitantes. Para los objetivos específicos del trabajo la distribución de muestras estudiadas fue la siguiente: 3.1.1 Muestras empleadas en el tipaje HLA-B y análisis de frecuencias Se realizó el tipaje HLA-B en un total de 1391 muestras, de las cuales, 1270 pertenecían a pacientes remitidos para el estudio de la presencia del alelo HLAB*57:01, como screening previo a la administración de terapias antirretrovirales que contuvieran el fármaco Abacavir; y 121 muestras pertenecientes a individuos sanos empleados como grupo control. Este grupo control estaba compuesto por donantes sanos de la misma zona geográfica. 3.1.2 Muestras empleadas en el tipaje HLA-DRB1 y análisis de frecuencias Se realizó el tipaje HLA-DRB1 en un total de 1159 muestras, de las cuales 1038 pertenecían a pacientes remitidos para el estudio de la presencia del alelo DRB1*01:01, como screening previo a la administración de los fármacos NVP y/o EFV como parte de la terapia antirretroviral, y 121 muestras pertenecientes a individuos sanos empleados como grupo control. Este grupo control estaba compuesto por donantes sanos de la misma zona geográfica. 3.1.3 Muestras empleadas en la caracterización del genotipo CCR5 Δ 32 Se determinó el genotipo CCR5 Δ 32 en 324 muestras de pacientes. PACIENTES Y MÉTODOS 42 3.1.4 Muestras empleadas en la caracterización del polimorfismo CYP2B6 Se determinó el polimorfismo CYP2B6 en 161 muestras procedentes de pacientes que habían recibido en algún momento de su evolución tratamiento con NVP (datos suministrados por el Servicio de Farmacia del CHUIMI). Se recogió información sobre la aparición o no de efectos adversos, así como las características de los mismos. Mediante revisión de las historias clínicas y consulta del sistema Drago AE (Sistema de información para la gestión de pacientes e historia clínica electrónica de de Atención Especializada) se recogieron los datos disponibles de 483 pacientes. Se registraron datos sobre las características epidemiológicas, modo de transmisión del virus, coinfecciones (VHB y VHC), infecciones oportunistas y neoplasias asociadas al desarrollo de SIDA. La información relativa a los resultados microbiológicos se obtuvo a través de los datos registrados en el programa de gestión de laboratorio Modulab Gold (Werfen, España). Los datos de carácter personal recogidos durante el estudio fueron tratados con confidencialidad y seguridad, en cumplimiento de lo dispuesto en el artículo 5 de la Ley Orgánica 15/1999 de Protección de Datos de Carácter Personal, que regula el derecho de información en la recogida de los datos. 3.2. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO Las determinaciones para el diagnóstico de la infección por VIH-1 y de las coinfecciones por VHB y VHC se realizaron en el Servicio de Microbiología del CHUIMI mediante las siguientes técnicas: 3.2.1 Diagnóstico y detección de resistencias del VIH Para el diagnóstico de la infección por VIH, se empleó el ensayo ARCHITECT ® HIV Ag/Ab Combo (Abbott). Este es un inmunoensayo quimioluminiscente de micropartículas (CMIA) para la detección cualitativa simultánea del antígeno p24 del virus VIH-1 y de los anticuerpos frente a VIH-1 y PACIENTES Y MÉTODOS 43 VIH-2. Para este ensayo se emplean 5 proteínas recombinantes y 2 péptidos sintéticos derivados de secuencias de proteínas transmembranas nativas de los grupos M y O del VIH-1 y VIH-2. Sucintamente, se trata de un procedimiento que en un primer paso combina la muestra y el diluyente de la misma. Tras ésto, se mezcla con los antígenos recombinantes y sintéticos unidos a micropartículas magnéticas. Después de un lavado, se añaden anticuerpos murinos anti-IgG humana marcados con acridinio. Tras otro ciclo de lavado, se añaden las soluciones “pretrigger” y “trigger”. El resultado de la reacción quimioluminiscente se mide como unidades relativas de luz (RLUs). Existe una relación directa entre la cantidad de anticuerpos en la muestra y las RLUs detectadas. Los resultados son calculados automáticamente basándose en la comparación con el Índex Calibrator. Los resultados se representan como un ratio de la señal de la muestra (en RLUs) y el valor del punto de corte (S/CO). El inmunoensayo quimioluminiscente de micropartículas (CMIA) se realizó empleando el sistema ARCHITECT i2000 SR (Abbott). Para la confirmación de la infección por VIH se utilizó el ensayo INNO-LIA ® HIV I/II Score (Fujirebio). En este enzimo inmunoensayo se emplean proteínas recombinantes y péptidos sintéticos del VIH-1 y VIH-2 para confirmar la presencia de anticuerpos frente al virus. La determinación del subtipo y el estudio de resistencias frente a los antirretrovirales se realizó con el kit comercial TRUGENE ® HIV-1 Genotyping Kit (Siemens), que permite detectar mutaciones asociadas a resistencias en los genes proteasa y transcriptasa inversa del VIH-1. Para la lectura e interpretación del estudio se empleó el sistema de secuenciación OpenGene ® (Siemens). Brevemente, el ensayo consta de varios pasos: - Transcripción inversa del ARN problema para generar ADNc mediante RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction; reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa) usando cebadores específicos del VIH-1. PACIENTES Y MÉTODOS 44 - Secuenciación CLIP TM del producto de amplificación usando cebadores específicos del VIH-1. - Electroforesis de los productos de reacción CLIP TM en gel de poliacrilamida y detección de fluorescencia del colorante unido al ADN tras excitación con láser. - Análisis de las secuencias utilizando el software OpenGene. La interpretación genotípica y caracterización del subtipo se realizó siguiendo los criterios de la red de investigación en SIDA (RIS) y la base de datos de la Universidad de Stanford (http://hivdb.stanford.edu/). 3.2.2 Diagnóstico del virus B de la Hepatitis (VHB) Todas las determinaciones realizadas para el diagnóstico serológico del virus de la hepatitis B en sus diferentes fases se realizaron mediante CMIA, cuyo fundamento está descrito en el apartado 3.2.1. Los reactivos empleados fueron los siguientes:  HBsAg: ARCHITECT ® HBsAg Qualitative (Abbott)  Anti-HBc: ARCHITECT ® CORE (Abbott)  Anti-HBc IgM: ARCHITECT ® CORE-M (Abbott)  Anti-HBs: ARCHITECT ® Anti-HBs (Abbott)  HBeAg: ARCHITECT ® HBeAg (Abbott)  Anti-HBe: ARCHITECT ® Anti-HBe (Abbott) 3.2.3 Diagnóstico del virus C de la Hepatitis (VHC) La determinación de anticuerpos frente al virus de la hepatitis C se realizó mediante CMIA Anti-VHC ARCHITECT ® Anti-HCV (Abbott), cuyo fundamento está descrito en el apartado 3.2.1. Como prueba confirmatoria se usó el Inmunoensayo en tira (LIA: Line Inmuno Assay) INNO-LIA ® HCV Score (Fujirebio), que emplea antígenos derivados de la región core, de la región hipervariable E2, de la región de la helicasa (NS3), y regiones NS4A, NS4B y NS5A. PACIENTES Y MÉTODOS 45 3.3. RECUENTO DE LINFOCITOS CD4 Para el control y seguimiento de las subpoblaciones linfocitarias, el sistema empleado fue la citometría de flujo. Mediante esta técnica es posible determinar tanto el porcentaje, como el número absoluto de las subpoblaciones linfocitarias de interés. El citómetro de flujo utilizado fue el Cytomics FC500 (Beckman Coulter) y como anticuerpos monoclonales se empleó el reactivo TetraCHROMECD45FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5 (Beckman Coulter). Su composición se muestra en la tabla 3.1. CD45-FITC CD4-RD1 CD8-ECD CD3-PC5 Especificidad CD45 Ag panleucocitario CD4 Ag de L. cooperador CD8 Ag de L. citotóxico CD3 Ag de Linfocito T Especie Ratón B3821f4a NS-1x BALB/c Ratón SFCI12T4D11 NS-1x BALB/c Ratón SFCI21Thy2D3 NS-1x BALB/c Ratón UCHT1 NS-1x BALB7c Clon Hibridoma Conjugado FITC (Isotiocianato de Fluoresceína) RD1 (Ficoeritrina) ECD (FicoeritrinaTexas Red) PC5 (Ficoeritrina-Cy5) Fluorescencia Excitación:468-509nm Emisión: 504-541nm Excitación:486-580nm Emisión: 568-590nm Excitación:486-580nm Emisión: 610-635nm Excitación:486-580nm Emisión: 660-680nm Tabla 3.1. Composición de TetraCHROME CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5 (Beckman Coulter) Para el recuento del número absoluto de linfocitos se empleó el reactivo Flowcount (Beckman Coulter), que está formado de micro esferas fluorescentes de poliestireno de 10 µm de diámetro en una suspensión acuosa, que también contiene surfactante y 1% de formaldehído. Cada fluoroesfera contiene un marcador que posee una longitud de onda de emisión de 525-700 nm cuando se excita a 488nm. Estas fluoroesferas constituyen un método indirecto para obtener el número absoluto de linfocitos. Se dispensará la misma cantidad de muestra que de fluoroesferas (100µl) y al conocerse la concentración de fluoroesferas el recuento total se realiza automáticamente por el citómetro, que nos dará el número absoluto de células (cels/µl) utilizando la siguiente fórmula: PACIENTES Y MÉTODOS 46 Nº total de células detectadas --------------------------------------------------- X Concentración de fluroesferas Nº total de fluoroesferas detectadas Brevemente, el procedimiento que se siguió fue dispensar 100µl de la muestra de sangre anticoagulada con EDTA en tubos de propileno a los que se añadió 10µl del reactivo TetraCHROME CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5, a continuación se agitó suavemente en un vórtex y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación se lisaron los hematíes con el sistema de reactivos Coulter Immunoprep en la estación de trabajo TQ Prep y una vez lisados se añadió 100µl de Flowcount y se adquirió en el citómetro FC500. El análisis de las subpoblaciones para la obtención de porcentajes y números absolutos se realizó utilizando el software CXP (Beckman Coulter). El resultado se expresó como número absoluto de células por microlitro. 3.4. EXTRACCIÓN ADN La extracción de ADN genómico se realizó tanto en pacientes infectados por el VIH-1, como en individuos control a partir de sangre total anticoagulada con EDTA, para ello se utilizó el kit comercial QIAamp ADN Blood Mini Kit (Qiagen, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante: - Se pipetean 20 µl de QUIAGEN Proteinasa K en el fondo de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, se añaden 200 µl de la muestra de sangre periférica y 200 µl de Buffer AL. Se agita en vórtex durante 15 segundos. Se incuba a 56ºC durante 10 minutos en bloque calefactor. - Se centrifuga brevemente para eliminar las gotas de la cara interna de la tapa. A continuación se añaden 200 µl de etanol (96%-100%) y se agita de nuevo en el vórtex 15 segundos. La mezcla se pasa a una columna suministrada en el kit y se centrifuga a 8.000 rpm durante 1 minuto. A continuación se coloca la columna en un tubo limpio de recolección de 2 ml, se descarta el tubo que contiene el filtrado. PACIENTES Y MÉTODOS 47 - Se abre la columna y se añaden 500 µl de Buffer AW1 y se centrifuga a 8.000 rpm durante 1 minuto. De nuevo la columna se sitúa en un tubo limpio de recolección y se desecha el tubo con el filtrado. - Se abre la columna y se añaden 500 µl de Buffer AW2 y se centrifuga a 14.000 rpm durante 3 min. La columna se coloca en un tubo limpio de 1,2 ml y se desecha el filtrado. - Se abre la columna y se le añaden 200 µl de Buffer AE y se incuba a temperatura ambiente (15-25ºC) durante 5 minutos, tras ésto se centrifuga durante 1 minuto a 8.000 rpm, se desecha la columna y se recoge el filtrado. El ADN obtenido se almacena a -20ºC hasta su uso. 3.5. TÉCNICAS PARA EL TIPAJE HLA-B Y HLA-DRB1 La determinación de los alelos de ambos locus, se realizó mediante PCRSSO (polymerase chain reaction-sequence specific oligonucleotide probe), reacción en cadena de la polimerasa con hibridación posterior con sondas de oligonucleótidos de secuencia específica. A las muestras que presentaron los alelos HLA-B*57 y HLA-DRB1*01 se les realizó una PCR-SSP (polymerase chain reaction-sequence specific priming) para determinar los alelos de alta resolución. Tipaje (PCR-SSO) LIFECODES El procedimiento de tipaje de LIFECODES HLA-SSO ® (Immucor, EEUU) se basa en la hibridación con sondas específicas de secuencia del ADN monocatenario marcado obtenido por PCR realizada previamente. Para la amplificación del ADN se emplean cantidades equimolares del cebador directo y del inverso para generar un ADN bicatenario, pero si un cebador es más abundante que el otro, además de producto bicatenario, la reacción genera algo de ADN monocatenario. En los primeros ciclos de la amplificación se genera ADN bicatenario. Una vez agotado el cebador limitante, el cebador restante utiliza el producto bicatenario como molde para generar ADN monocatenario. Este método genera tanto productos bicatenarios como monocatenarios que, una vez PACIENTES Y MÉTODOS 48 desnaturalizados, participarán en la reacción de hibridación. Cada una de las distintas sondas puede ser homóloga de una secuencia del ADN amplificado exclusiva de un alelo o grupo de alelos, e hibridarán preferentemente con una región complementaria, que puede o no, estar presente en el ADN problema amplificado. El ADN amplificado hibrida también con una o más sondas de consenso, homólogas a secuencias presentes en todos los alelos de un locus. El análisis de los resultados de la tipificación con SSO puede aplicarse para determinar la presencia o ausencia de secuencias concretas de ADN en el producto amplificado e identificar así los alelos de la muestra analizada. En la tipificación por la técnica LIFECODES HLA-SSO ® las sondas se unen a microesferas de poliestireno diseñadas para utilizarse con el sistema Luminex Instrument ® . La tecnología Luminex se basa en los principios de la citometría de flujo, y en el uso de microesferas de poliestireno cada una de ellas marcadas con fluorocromos con espectro de emisión único, lo que permite la identificación simultánea de todas ellas. La amplificación del ADN genómico correspondiente a diferentes exones del gen HLA-B o HLA-DRB, se realiza utilizando cebadores biotinilados. Después de un marcado fluorescente específico del ADN amplificado, la especificidad de la hibridación se reconoce por la doble señal del ADN amplificado y la fluorescencia de la microesfera. La interpretación se hace mediante el software Match IT ® . En la figura 3.1 se muestra un ejemplo de tipaje HLA-B con Luminex y análisis. PACIENTES Y MÉTODOS 49 Figura 3.1. Ejemplo de tipaje HLA-B con tecnología Luminex Lifecodes Proceso de amplificación Brevemente, el proceso que se sigue es, atemperar la mezcla maestra (Master Mix) hasta que se iguale con la temperatura ambiente (18-30°C). Una vez atemperados se agitan suavemente los reactivos en vórtex durante 10 segundos aproximadamente y se centrifuga brevemente (5–10 segundos) en la microcentrífuga para que el contenido se desplace al fondo del tubo. Guiándose por la Tabla 3.2, se preparan los componentes para la amplificación para n+1 reacciones, utilizando de cada componente (excepto el ADN) la cantidad indicada por reacción y se agita suavemente en vórtex. Se pipetean 2 µl de ADN en tubos de PCR. Se distribuye alícuotas de la mezcla ampliada en los tubos de PCR que contienen el ADN genómico. (El volumen final será 25 µl para la reacción de cada muestra). PACIENTES Y MÉTODOS 56 3.8. ANÁLISIS ESTADÍSTICO El análisis estadístico se realizó con los programas estadísticos SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) versión 22.0 para Mac OS X (SPSS Inc., Chicago IL) y GraphPad Prism versión 5.0 para Mac OS X. Con respecto a las frecuencias alélicas, la significación estadística se estudió mediante el uso de tablas de contingencia 2 x 2 por el test de χ 2 de Pearson y el test de Mantel-Haenszel, con la corrección de Yates o con el test exacto de Fisher cuando el valor observado para un marcador HLA resultaba menor de cinco. Los valores p se corrigieron multiplicando por el número de alelos analizados de cada locus (corrección de Bonferroni) (Svejgaard A, 1994), considerándose significativos solamente los valores de p inferiores a 0,05. Para el análisis de la evolución de los valores de linfocitos T CD4 en el tiempo se utilizó la regresión lineal univariante. 4. RESULTADOS RESULTADOS 59 4.1. CARACTERISTICAS DE LA POBLACIÓN ESTUDIADA En la tabla 4.1 se muestran los datos demográficos de los pacientes estudiados. Pacientes con infección por VIH Género Femenino Masculino 194 (15,3 %) 1076 (84,7 %) Edad Media Rango 39 años 22-78 años Origen España Islas Canarias Resto España Europa/USA África América del Sur Asia 894 (70,4 %) 733 (57,7 %) 161 (12,7 %) 200 (15,7%) 78 (6,1%) 93 (7,3%) 5 (0,4%) Tabla 4.1. Características demográficas del grupo de estudio En las tablas 4.2 y 4.3 se muestran las distribuciones de pacientes según su país de origen y provincia de origen en los pacientes autóctonos (en los pacientes canarios no se ha diferenciado provincia de origen). RESULTADOS 60 Inmigrantes (n=376) EUROPA / EEUU ÁFRICA Guinea Ec uatorial 17 ( 4,5%) Alemania 58 (15,4%) Nigeria 15 (4,0%) Reino Unido 46 (12,2 %) Ghana 12 (3,2%) Italia 33 (8,8%) Marruecos 9 (2,4%) Francia 10 (2,7%) Sierra Leona 7 (1,9%) Holanda 9 (2,4%) Senegal 3 (0,8%) Rumanía 7 (1,9%) Mali 2 (0,5%) Austria 4 (1,1%) Liberia 2 (0,5%) Irlanda 4 (1,1%) Togo 1 (0,3%) Suecia 4 (1,1%) Tanzania 1 (0,3%) Portugal 4 (1,1%) Sudáfrica 1 (0,3%) Bélgica 3 (0,8%) Ruanda 1 (0,3%) Noruega 3 (0,8%) Mauritania 1 (0,3%) Rusia 3 (0,8%) Guinea Co nakry 1 (0,3%) Polonia 2 (0,5%) Guinea Bi ssau 1 (0,3%) EEUU 2 (0,5%) Costa de Marfil 1 (0,3%) Suiza 1 (0,3%) Camerún 1 (0,3%) Hungría 1 (0,3%) Cabo Verde 1 (0,3%) Eslovenia 1 (0,3%) Argelia 1 (0,3%) Dinamarca 1 (0,3%) Croacia 1 (0,3%) AMÉRICA DEL SUR Cuba 25 (6,6%) Rep. Checa 1 (0,3%) Colombia 20 (5,3%) Bulgaria 1 (0,3%) Venezuela 13 (3,5%) ASIA Argentina 8 (2,1%) Ecuador 7 (1,9%) India 1 (0,3%) Brasil 5 (1,3%) Tailandia 1 (0,3%) Uruguay 4 (1,1%) China 1 (0,3%) Chile 3 (0,8%) Filipinas 1 (0,3%) Perú 2 (0,5%) Vietnam 1 (0,3%) Surinam 1 (0,3%) Rep. Dominicana 1 (0,3%) Guatemala 1 (0,3%) Tabla 4.2. Origen de los pacientes inmigrantes RESULTADOS 61 Autóctonos ( n= 894 ) Canarias 733 (82%) León 2 (0,2%) Madrid 37 (4,1%) Melilla 2 (0,2%) Asturias 12 (1,3 %) Navarra 2 (0,2%) Barcelona 12 (1,3 %) Álava 1 (0,1%) Málaga 11 (1,2%) Albacete 1 (0,1%) Sevilla 10 (1,1%) Alicante 1 (0,1%) Baleares 9 (1,0%) Almería 1 (0,1%) Pontevedra 8 (0,9%) Burgos 1 (0,1%) Valencia 6 (0,7%) Cáceres 1 (0,1%) La Coruña 5 (0,6%) Ciudad Real 1 (0,1%) Guipúzcoa 5 (0,6%) Gerona 1 (0,1%) Valladolid 4 (0,4%) Huelva 1 (0,1%) Vizcaya 3 (0,3%) Huesca 1 (0,1%) Cádiz 4 (0,4%) La Rioja 1 (0,1%) Toledo 3 (0,3%) Lugo 1 (0,1%) Cantabria 3 (0,3%) Murcia 1 (0,1%) Badajoz 3 (0,3%) Palencia 1 (0,1%) Tarragona 2 (0,2%) Zamora 1 (0,1%) Córdoba 2 (0,2%) Zaragoza 1 (0,1%) Tabla 4.3. Origen de los pacientes autóctonos RESULTADOS 62 En la tabla 4.4 se muestra la vía de transmisión del VIH-1 en los 819 pacientes de los que se dispuso de datos. Vía de transmisión Frecuencia % HMX /BSX 523 41,2 HTX 187 14,7 U DVP 101 8,0 NO DETERMINADO 3 0,2 SANGUÍ NEA 3 0,2 VERTICAL 2 0,2 NO DATOS 451 35,5 Total 1270 100,0 Tabla 4.4. Vía de transmisión del VIH-1. HMX/BSX: Homosexual/Bisexual. HTX: Heterosexual. UDVP: Vía parenteral (usuarios de drogas vía parenteral) En la tabla 4.5 se encuentran los subtipos de VIH-1 en nuestra población de estudio. En 364 pacientes no se pudo obtener este dato y en 124 casos la muestra resultó no amplificable, por lo cual no se pudo llegar a la definición del subtipo de VIH-1. Subtipo Frecuencia % B 681 87,1 CRF02_AG 40 5,1 D 13 1,7 C 11 1,4 G 11 1,4 CRF01_AE 8 1 A 8 1 F 6 0,8 H 2 0,25 K 2 0,25 Total 782 100,0 Tabla 4.5. Subtipos de VIH-1 RESULTADOS 63 4.2. FRECUENCIAS HLA-B Para el estudio de los alelos HLA-B se valoraron las frecuencias alélicas de los diferentes grupos según su origen y las del grupo control. En la tabla 4.6 se muestran los resultados totales y en la tabla 4.7 las frecuencias del grupo español, distinguiendo entre los pacientes de origen canario y los del resto de España. Se encontraron 32 diferentes alelos HLA-B en la población estudiada. En el grupo español encontramos 29 alelos, 24 en el grupo Europa/EEUU, 21 en el grupo de África, y 25 en el grupo de América del Sur. El grupo de Asia se ha excluido de las comparaciones por el número tan pequeño de pacientes que entraron en el estudio (n=5). La prevalencia del alelo B*57:01 en el total de pacientes estudiados es del 5%, inferior a la encontrada en el grupo control (7,4%). Teniendo en cuenta el origen de los pacientes, esta prevalencia es menor en los no españoles ya que en ninguno de los tres grupos la frecuencia es superior al 2,6%. El reducido número de pacientes del grupo asiático no permite valorar la prevalencia del 20% del B*57:01 ya que se debe únicamente al resultado del tipaje de un paciente. En los pacientes autóctonos la prevalencia es del 6%, sin diferencias significativas entre canarios y no canarios (6,2% vs. 5,6%). En ningún caso la comparación de los resultados del B*57:01 entre pacientes y controles, o entre diferentes grupos de pacientes alcanzó significación estadística. Sí se aprecian diferencias significativas cuando se analizan las frecuencias de otros alelos HLA-B entre los diferentes grupos según su origen. RESULTADOS 64 Alelo B España 2n=1788 (%) Europa/EEUU 2n=400 (%) África 2n=156 (%) Sur América 2n=186 (%) Total 2n=2540 (%) Controles 2n=242 (%) B* 0 7 100 (11,2) 40 (20) 13 (16,7) 10 (10,8) 163 (12,8) 22 (18,2) B* 0 8 101 (11,3) 39 (19,5) 6 (7,7) 12 (12,9) 158 (12,4) 16 (13,2) B* 13 16 (1,8) 13 (6,5) 2 (2,6) 4 (4,3) 35 (2,8) 3 (2,4) B* 14 127 (14,2) 15 (7,5) 6 (7,7) 12 (12,9) 160 (12,6) 21 (17,4) B* 15 93 (10,4) 23 (11,5) 19 (24,4) 14 (15,1) 150 (11,8) 17 (14) B* 18 89 (10) 30 (15) 7 (9) 7 (7,5) 134 (10,6) 8 (6,6) B* 27 49 (5,5) 16 (8) 4 (5,1) 4 (4,3) 74 (5,8) 5 (4,2) B* 35 185 (20,7) 43 (21,5) 17 (21,8) 28 (30,1) 273 (21,4) 24 (19,8) B* 37 26 (2,9) 7 (3,5) 0 0 33 (2,6) 2 (1,6) B* 38 57 (6,4) 8 (4) 1 (1,3) 2 (2,2) 69 (5,4) 5 (4,2) B* 39 36 (4) 12 (6) 3 (3,8) 13 (14) 64 (5) 4 (3,4) B* 40 88 (9,8) 26 (13) 0 10 (10,8) 125 (9,8) 11 (9) B* 41 34 (3,8) 2 (1) 1 (1,3) 0 37 (2,8) 6 (5) B* 42 13 (1,5) 2 (1) 6 (7,7) 5 (5,4) 26 (2) 1 (0,8) B* 44 285 (31,9) 62 (31) 11 (14,1) 20 (21,5) 379 (29,8) 33 (27,4) B* 45 31 (3,5) 1 (0,5) 3 (3,8) 4 (4,3) 39 (3) 5 (4,2) B* 46 0 0 0 0 1 (0,1) 0 B* 47 7 (0,8) 0 0 1 (1,1) 8 (0,6) 2 (1,6) B* 48 1 (0,1) 0 0 2 (2,2) 3 (0,2) 0 B* 49 43 (4,8) 7 (3,5) 5 (6,4) 4 (4,3) 59 (4,6) 12 (10) B* 50 63 (7) 3 (1,5) 1 (1,3) 2 (2,2) 69 (5,4) 5 (4,2) B* 51 147 (16,4) 23 (11,5) 4 (5,1) 11 (11,8) 185 (14,6) 14 (11,6) B* 52 20 (2,2) 5 (2,5) 0 5 (5,4) 30 (0,2) 2 (1,6) B* 53 34 (3,8) 4 (2) 24 (30,8) 4 (4,3) 66 (5,2) 6 (5) B* 54 0 0 0 0 1 (0,1) 0 B* 55 23 (2,6) 5 (2,5) 0 2 (2,2) 30 (2,4) 0 B* 56 21 (2,3) 4 (2) 1 (1,3) 1 (1,1) 27 (2,2) 3 (2,4) B* 58 35 (3,9) 5 (2,5) 12 (15,4) 4 (4,3) 57 (4,4) 3 (2,4) B* 67 1 (0,1) 0 0 0 1 (0,1) 0 B* 73 1 (0,1) 0 0 0 1 (0,1) 0 B* 78 1 (0,1) 0 0 1 (1,1) 2 (0,2) 0 B* 81 0 0 2 (2,6) 0 2 (0,2) 0 B*57 61 (6,8) 5 (2,5) 8 (10,3) 4 (4,4) 78 (6,1) 10 (8,2) B* 57 : 01 54 (6) 5 (2,5) 2 (2,6) 2 (2,2) 64 (5) 9 (7,4) B* 57 : 02 3 (0,3) 0 2 (2,6) 0 5 (0,4) 0 B* 57 : 03 3 (0,3) 0 4 (5,1) 2 (2,2) 9 (0,6) 1 (0,8) B* 57 : 04 1 (0,1) 0 0 0 1 (0,1) 0 Tabla 4.6 Frecuencias alélicas HLA-B en el total de la población estudiada Los pacientes del grupo asiático no figuran en la tabla por ser solo cinco pacientes, sus alelos HLA-B fueron (B*15, B*54), (B*44, B*46), (B*18, B*38), (B*57:01, B*58) y (B*27, B*40). RESULTADOS 65 Alelo B Canarios 2n=1460 No canarios 2n=328 Alelo B Canarios 2n=1460 No canarios 2n=328 B*07 83 (11,4%) 17 (10,4%) B*48 1 (0,1%) 0 B*08 81 (11,1%) 20 (12,2%) B*49 38 (5,2%) 5 (3%) B*13 13 (1,8%) 3 (1,8%) B*50 54 (7,4%) 9 (5,5%) B*14 99 (13,6%) 28 (17,1%) B*51 121 (16,6%) 26 (15,9%) B*15 79 (10,8%) 14 (8,5%) B*52 14 (1,9%) 6 (3,7%) B*18 61 (8,4%) 28 (17,1%) B*53 31 (4,2%) 3 (1,8%) B*27 40 (5,5%) 9 (5,5%) B*55 19 (2,6%) 4 (2,4%) B*35 158 (21,6%) 27 (16,5%) B*56 20 (2,7%) 1 (0,6%) B*37 24 (3,3%) 2 (1,2%) B*58 27 (3,7%) 8 (4,9%) B*38 46 (6,3%) 11 (6,7%) B*67 1 (0,1%) 0 B*39 29 (4%) 7 (4,3%) B*73 0 1 (0,6%) B*40 72 (9,9%) 16 (9,8%) B*78 1 (0,1%) 0 B*41 17 (2,3%) 17 (10,4%) B*57 49 (6,7%) 12 (7,3%) B*42 13 (1,8%) 0 B*57:01 45 (6,2%) 9 (5,5%) B*44 232 (31,8%) 53 (32,3%) B*57:02 1 (0,1%) 2 (1,2%) B*45 30 (4,1%) 1 (0,6%) B*57:03 2 (0,3%) 1 (0,6%) B*47 7 (1%) 0 B*57:04 1 (0,1%) 0 Tabla 4.7 Frecuencias alélicas de HLA-B en el grupo autóctono (canarios/no canarios) En el grupo de África es donde se encuentra una menor diversidad alélica, tres alelos presentaron frecuencias superiores al 20% (HLA-B*15, HLA-B*35 y HLAB*53), y representan el 38,1% de la diversidad alélica observada. Al comparar el grupo español con el africano se encuentran diferencias significativas en esos tres alelos puesto que son menos frecuentes en la población española (B*15: 24,4% vs. 10,4%, p=0,0005, pc=0,016, OR=0,39; B*53: 30% vs 3,8%, p<0,000001, OR=0,10; y B*58: 15,4% vs. 4%, p<0,00001, OR=0,23). En sentido contrario, otros dos alelos son estadísticamente más frecuentes en la población española respecto a la africana (B*38: 6,4% vs 1,2%, p=0,0009, pc=0,028, OR=13,1; B*51: 16,4% vs 5,2%, p=0,011, pc=0,35, OR=0,29). El B*14 también es más frecuente pero su significación se pierde tras corrección (14,2% vs 7,4%, p=0,013, pc=0,41, OR=1,92). Con respecto a la comparación del grupo de pacientes españoles con el grupo europeo, se observa una disminución estadísticamente significativa en los RESULTADOS 72 Alelo B N. Pneumocystis SI 2n=116 N. Pneumocystis NO 2n=850 Alelo B N. Pneumocystis SI 2n=116 N. Pneumocystis NO 2n=850 HLA - B*07 9 (15,5%) 52 (12,2%) HLA - B*47 0 4 (0,9%) HLA - B*08 9 (15,5%) 43 (10,1%) HLA - B*48 0 1 (0,2%) HLA - B*13 1 (1,7%) 14 (3,3%) HLA - B*49 0 22 (5,2%) HLA - B*14 6 (10,3%) 57 (13,4%) HLA - B*50 3 (5,2%) 15 (3,5%) HLA - B*15 4 (6,9%) 50 (11,8%) HLA - B*51 8 (13,8%) 75 (17,6%) HLA - B*18 6 (10,3%) 43 (10,1%) HLA - B*52 1 (1,7%) 14 (3,3%) HLA - B*27 2 (3,4%) 32 (7,5%) HLA - B*53 1 (1,7%) 24 (5,6%) HLA - B*35 13 (22,4%) 100 (23,5%) HLA - B*55 1 (1,7%) 6 (1,4%) HLA - B*37 2 (3,4%) 8 (1,9%) HLA - B*56 0 9 (2,1%) HLA - B*38 6 (10,3%) 23 (5,4%) HLA - B*58 4 (6,9%) 19 (4,5%) HLA - B*39 4 (6,9%) 13 (3,1%) HLA - B*78 0 1 (0,2%) HLA - B*40 8 (13,8%) 39 (9,2%) HLA - B*81 0 1 (0,2%) HLA - B*41 0 11 (2,6%) HLA - B*57 2 (3,4%) 29 (6,8%) HLA - B*42 2 (3,4%) 9 (2,1%) HLA - B*57 : 01 2 (3,4%) 22 (5,2%) HLA - B*44 21 (36,2%) 124 (29,2%) HLA - B*57 : 02 0 3 (0,7%) HLA - B*45 2 (3,4%) 12 (2,8%) HLA - B*57 : 03 0 3 (0,7%) HLA - B*46 1 (1,7%) 0 HLA - B*57 : 04 0 1 (0,2%) Tabla 4.12. Frecuencias HLA-B y neumonía por Pneumocystis jirovecii Entre los alelos HLA-B no se encuentran diferencias estadísticamente significativas. Con respecto a los alelos HLA-DRB1 se encuentra una frecuencia aumentada de DRB1*03 en el grupo de pacientes que han sufrido neumonía por Pneumocystis jirovecii y disminuida de HLA-DRB1*07, aunque ambos sin significación estadística tras la corrección (HLA-DRB1*03: 34% frente 18,7%, p= 0,023; pc=ns), (HLA-DRB1*07: 12,8% frente a 27,6%, p=0,044; pc=ns). RESULTADOS 73 Alelo DRB1 N. Pneumocystis SI 2n=94 N. Pneumocystis NO 2n=738 HLA - DRB1*03 16 (34) 69 (18,7) HLA - DRB1* 04 15 (31,9) 98 (26,6) HLA - DRB1* 07 6 (12,8) 102 (27,6) HLA - DRB1* 08 4 (8,5) 23 (6,2) HLA - DRB1* 09 0 5 (1,4) HLA - DRB1* 10 1 (2,1) 12 (3,3) HLA - DRB1* 11 11 (23,4) 88 (23,8) HLA - DRB1* 12 0 11 (3) HLA - DRB1* 13 17 (36,2) 137 (37,1) HLA - DRB1* 14 3 (6,4) 16 (4,3) HLA - DRB1* 15 9 (19,1) 79 (21,4) HLA - DRB1* 16 2 (4,3) 14 (3,8) HLA - DRB1*01 10 (21,3) 84 (22,7) HLA - DRB1* 01 : 01 4 (8,5) 45 (12,2) HLA - DRB1* 01 : 02 6 (12,8) 32 (8,7) HLA - DRB1* 01 : 03 0 7 (1,9) Tabla 4.13. Frecuencias HLA-DRB1 y neumonía por Pneumocystis jirovecii Se analizó el recuento de linfocitos T CD4 de los pacientes de los que obtuvimos datos, y se distribuyeron en dos grupos dependiendo de si el recuento había bajado o no de 200 cel/µl en algún momento de su evolución. Se encontraron 14 pacientes que habían sufrido infección por P. jirovecii en los que en el periodo de estudio de este trabajo no se encontraron datos de cifras de linfocitos T CD4 inferiores a los 200 cel/µl. El aumento de la frecuencia de DRB1*03 es similar en ambos grupos, sin embargo la disminución de frecuencia de DRB1*07 en pacientes que han sufrido la infección afecta principalmente a aquellos en los que el recuento de linfocitos T CD4 ha estado en algún momento por debajo de los 200 cel/µl (tabla 4.14). RESULTADOS 74 PACIENTES CD4>200 Alelo DRB1 SI 2n=28 NO 2n=193 DRB1*03 5 (35,7%) 36 (18,7%) DRB1*04 5 (35,7%) 54 (28%) DRB1*07 3 (21,4%) 51 (26,4%) DRB1*08 3 (21,4%) 12 (6,2%) DRB1*09 0 4 (2,1%) DRB1*10 0 7 (3,6%) DRB1*11 2 (14,3%) 44 (22,8%) DRB1*12 0 5 (2,6%) DRB1*13 3 (21,4%) 76 (39,4%) DRB1*14 0 5 (2,6%) DRB1*15 3 (21,4%) 44 (22,8%) DRB1*16 1 (7,1%) 6 (3,1%) DRB1*01 3 (21,4%) 42 (21,8%) DRB1*01:01 1 (7,1%) 25 (13%) DRB1*01:02 2 (14,3%) 15 (7,8%) DRB1*01:03 0 2 (1%) PACIENTES CD4<200 Alelo DRB1 SI 2n=40 NO 2n=170 DRB1*03 6 (30%) 19 (22,4%) DRB1*04 5 (25%) 24 (28,2%) DRB1*07 3 (15%) 27 (31,8%) DRB1*08 1 (5%) 4 (4,7%) DRB1*09 0 1 (1,2%) DRB1*10 0 2 (2,4%) DRB1*11 6 (30%) 19 (22,4%) DRB1*12 0 2 (2,4%) DRB1*13 9 (45%) 27 (31,8%) DRB1*14 2 (10%) 6 (7,1%) DRB1*15 4 (20%) 20 (23,5%) DRB1*16 0 3 (3,5%) DRB1*01 4 (20%) 16 (18,8%) DRB1*01:01 2 (10%) 8 (9,4%) DRB1*01:02 2 (10%) 4 (4,7%) DRB1*01:03 0 4 (4,7%) Tabla 4.14. Frecuencias HLA-DRB1 según el recuento de linfocitos T CD4 4.4.3. Tuberculosis Se incluyó en este grupo a los pacientes que hubieran sufrido infecciones por Mycobacterium tuberculosis o Mycobacterium bovis en cualquier localización, pulmonar o extra pulmonar. El total de pacientes fue de 53 (13 mujeres, 40 hombres). En las tablas 4.15 y 4.16 se muestran los datos sobre las frecuencias HLA-B y HLA-DRB1. Tan solo se observan diferencias apreciables en la frecuencia de HLA-B*38 que se encuentra aumentada en pacientes que han padecido tuberculosis, pero sin significación estadística tras la corrección (13,2% frente a 5,1%, p=0,048; pc=ns). RESULTADOS 75 Alelo B TB SI 2n=106 TB NO 2n=860 Alelo B TB SI 2n=106 TB NO 2n=860 HLA - B*07 6 (11,3%) 55 (12,8) HLA - B*47 0 4 (0,9%) HLA - B*08 3 (5,7%) 49 (11,4%) HLA - B*48 0 1 (0,2%) HLA - B*13 1 (1,9%) 14 (3,3%) HLA - B*49 0 22 (5,1%) HLA - B*14 8 (15,1%) 55 (12,8%) HLA - B*50 4 (7,5%) 13 (3,3%) HLA - B*15 5 (9,4%) 49 (11,4%) HLA - B*51 9 (17%) 74 (17,2%) HLA - B*18 5 (9,4%) 44 (10,2%) HLA - B*52 1 (1,9%) 14 (3,3%) HLA - B*27 6 (11,3%) 28 (6,5%) HLA - B*53 3 (5,7%) 22 (5,1%) HLA - B*35 12 (22,6%) 101 (23,5%) HLA - B*55 0 7 (1,6%) HLA - B*37 3 (5,7%) 7 (1,6%) HLA - B*56 1 (1,9%) 8 (1,9%) HLA - B*38 7 (13,2%) 22 (5,1%) HLA - B*58 2 (3,8%) 21 (4,9%) HLA - B*39 1 (1,9%) 16 (3,7%) HLA - B*78 0 1 (0,2%) HLA - B*40 4 (7,5%) 43 (10%) HLA - B*81 0 1 (0,2%) HLA - B*41 1 (1,9%) 10 (2,3%) HLA - B*57 4 (7,5%) 27 (6,3%) HLA - B*42 2 (3,8%) 9 (2,1%) HLA - B*57 : 01 3 (5,7%) 21 (4,9%) HLA - B*44 17 (32,1%) 128 (29,8%) HLA - B*57 : 02 1 (1,9%) 2 (0,5%) HLA - B*45 1 (1,9%) 13 (3%) HLA - B*57 : 03 0 3 (0,7%) HLA - B*46 0 1 (0,2%) HLA - B*57 : 04 0 1 (0,2%) Tabla 4.15 Frecuencias HLA-B en Tuberculosis Alelo DRB1 TB SI 2n=96 TB NO 2n=736 HLA - DRB1* 03 9 (18,8%) 76 (20,7%) HLA - DRB1*0 4 14 (29,2%) 99 (26,9%) HLA - DRB1*0 7 15 (31,3%) 93 (25,3%) HLA - DRB1*0 8 0 27 (7,3%) HLA - DRB1*0 9 1 (2,1%) 4 (1,1%) HLA - DRB1* 10 2 (4,2%) 11 (3%) HLA - DRB1* 11 12 (25%) 87 (23,6%) HLA - DRB1* 12 0 11 (3%) HLA - DRB1* 13 20 (41,7%) 134 (36,4%) HLA - DRB1* 14 5 (10,4%) 14 (3,8%) HLA - DRB1* 15 9 (18,8%) 79 (21,5%) HLA - DRB1* 16 1 (2,1%) 15 (4,1%) HLA - DRB1*0 1 8 (16,6%) 86 (23,3%) HLA - DRB1*0 1:01 3 (6,3%) 46 (12,5%) HLA - DRB1*0 1:02 3 (6,3%) 35 (9,5%) HLA - DRB1*0 1:03 2 (4,2%) 5 (1,4%) Tabla 4.16 Frecuencias HLA-DRB1 en Tuberculosis RESULTADOS 76 4.4.4. Infección por citomegalovirus En 22 pacientes se encontraron enfermedades por CMV en órganos diferentes del hígado, bazo o ganglios linfáticos. Las frecuencias HLA se muestran en las tablas 4.17 y 4.18. Alelo B CMV SI 2n=44 CMV NO 2n=922 Alelo B CMV SI 2n=44 CMV NO 2n=922 HLA - B*07 4 (18,2%) 57 (12,4%) HLA - B*47 0 4 (0,9%) HLA - B*08 1 (4,5%) 51 (11,1%) HLA - B*48 0 1 (0,2%) HLA - B*13 0 15 (3,3%) HLA - B*49 1 (4,5%) 21 (4,6%) HLA - B*14 1 (4,5%) 62 (13,4%) HLA - B*50 1 (4,5%) 17 (3,7%) HLA - B*15 1 (4,5%) 53 (11,5%) HLA - B*51 1 (4,5%) 82 (17,8%) HLA - B*18 2 (9,1%) 47 (10,2%) HLA - B*52 0 15 (3,3%) HLA - B*27 3 (13,6%) 31 (6,7%) HLA - B*53 3 (13,6%) 22 (4,8%) HLA - B*35 3 (13,6%) 110 (23,9%) HLA - B*55 2 (9,1%) 5 (1,1%) HLA - B*37 0 10 (2,2%) HLA - B*56 2 (9,1%) 7 (1,5%) HLA - B*38 2 (9,1%) 27 (5,9%) HLA - B*58 1 (4,5%) 22 (4,8%) HLA - B*39 2 (9,1%) 15 (3,3%) HLA - B*78 0 1 (0,2%) HLA - B*40 2 (9,1%) 45 (9,8%) HLA - B*81 0 1 (0,2%) HLA - B*41 0 11 (2,4%) HLA - B*57 1 (4,5%) 29 (6,3%) HLA - B*42 1 (4,5%) 10 (2,2%) HLA - B*57 : 01 1 (4,5%) 23 (5%) HLA - B*44 6 (27,3%) 139 (30,2%) HLA - B*57 : 02 0 2 (0,5%) HLA - B*45 3 (13,6%) 11 (2,4%) HLA - B*57 : 03 0 3 (0,7%) HLA - B*46 1 (4,5%) 0 HLA - B*57 : 04 0 1 (0,2%) Tabla 4.17 Frecuencias HLA-B e infección por Citomegalovirus El alelo HLA-B*45 presentó una frecuencia aumentada en estos pacientes (13,6% frente a 2,4%, p=0,021, pc=ns) y también el alelo DRB1*08 (26,7% frente a 5,7%, p=0,007, pc=ns). Ambas asociaciones pierden la significación estadística tras la corrección por el número de alelos. RESULTADOS 77 Alelo DRB1 CMV SI 2n=30 CMV NO 2n=802 HLA - DRB1* 03 4 (26,7%) 81 (20,2%) HLA - DRB1*0 4 3 (20%) 110 (27,4%) HLA - DRB1*0 7 3 (20%) 105 (26,2%) HLA - DRB1*0 8 4 (26,7%) 23 (5,7%) HLA - DRB1*0 9 0 5 (1,2%) HLA - DRB1* 10 0 13 (3,2%) HLA - DRB1* 11 5 (33,3%) 94 (23,4%) HLA - DRB1* 12 0 11 (2,7%) HLA - DRB1* 13 5 (33,3%) 149 (37,2%) HLA - DRB1* 14 2 (13,3%) 17 (4,2%) HLA - DRB1* 15 2 (13,3%) 86 (21,4%) HLA - DRB1* 16 1 (6,7%) 15 (3,7%) HLA - DRB1*0 1 1 (6,7%) 93 (23,2%) HLA - DRB1*0 1:01 1 (6,7%) 48 (12%) HLA - DRB1*0 1:02 0 38 (9,5%) HLA - DRB1*0 1:03 0 7 (1,7%) Tabla 4.18. Frecuencias HLA-DRB1 e infección por Citomegalovirus 4.4.5. Neumonías recurrentes Comparando las frecuencias de los alelos HLA-B en pacientes con neumonías recurrentes se observó una frecuencia aumentada del alelo B*57 (16,7% frente a 5,4%, p=0,0099; pc=ns) que pierde la significación estadística al aplicar la corrección. Con respecto a HLA-DRB1 se encuentra una frecuencia aumentada de DRB1*07 (42,9% frente a 24,4%, p=0,017; pc=ns) y disminuida de DRB1*03 (2,9% frente a 22%, p=0,007; pc=ns) aunque ambas pierden la significación tras la corrección (tablas 4.19 y 4.20). RESULTADOS 78 Alelo B Neumonías SI 2n=72 Neumonías NO 2n=894 Alelo B Neumonías SI 2n=72 Neumonías NO 2n=894 HLA - B*07 6 (14,3%) 55 (12,5%) HLA - B*47 0 4 (0,9%) HLA - B*08 2 (4,8%) 50 (11,3%) HLA - B*48 0 1 (0,2%) HLA - B*13 2 (4,8%) 13 (2,9%) HLA - B*49 4 (9,5%) 18 (4,1%) HLA - B*14 4 (9,5%) 59 (13,4%) HLA - B*50 0 18 (4,1%) HLA - B*15 5 (11,9%) 49 (11,1%) HLA - B*51 9 (21,4%) 74 (16,8%) HLA - B*18 3 (7,1%) 46 (10,4%) HLA - B*52 1 (2,4%) 14 (3,2%) HLA - B*27 2 (4,8%) 32 (7,3%) HLA - B*53 3 (7,1%) 22 (5%) HLA - B*35 7 (16,7%) 106 (24%) HLA - B*55 0 7 (1,6%) HLA - B*37 1 (2,4%) 9 (2%) HLA - B*56 0 9 (2%) HLA - B*38 3 (7,1%) 26 (5,9%) HLA - B*58 5 (11,9%) 18 (4,1%) HLA - B*39 1 (2,4%) 16 (3,6%) HLA - B*78 0 1 (0,2%) HLA - B*40 2 (4,8%) 45 (10,2%) HLA - B*81 0 1 (0,2%) HLA - B*41 0 11 (2,5%) HLA - B*57 7 (16,7%) 24 (5,4%) HLA - B*42 1 (2,4%) 10 (2,3%) HLA - B*5701 7 17 (3,9%) HLA - B*44 14 (33,3%) 131 (29,7%) HLA - B*5702 0 3 (0,7%) HLA - B*45 2 (4,8%) 12 (2,7%) HLA - B*5703 0 3 (0,7%) HLA - B*46 0 1 (0,2%) HLA - B*5704 0 1 (0,2%) Tabla 4.19 Frecuencias HLA-B y neumonías recurrentes Alelo DRB1 Neumonías SI 2n=70 Neumonías NO 2n=762 HLA - DRB1*03 1 (2,9%) 84 (22%) HLA - DRB1* 04 10 (28,6%) 103 (27%) HLA - DRB1* 07 15 (42,9%) 93 (24,4%) HLA - DRB1* 08 3 (8,6%) 24 (6,3%) HLA - DRB1* 09 1 (2,9%) 4 (1%) HLA - DRB1* 10 0 13 (3,4%) HLA - DRB1* 11 8 (22,9%) 91 (23,9%) HLA - DRB1* 12 1 (2,9%) 10 (2,6%) HLA - DRB1* 13 16 (45,7%) 138 (36,2%) HLA - DRB1* 14 1 (2,9%) 18 (4,7%) HLA - DRB1* 15 6 (17,1%) 82 (21,5%) HLA - DRB1* 16 1 (2,9%) 15 (3,9%) HLA - DRB1*01 7 (20%) 87 (22,8 %) HLA - DRB1* 0101 6 (17,1%) 43 (11,3%) HLA - DRB1* 0102 1 (2,9%) 37 (9,7%) HLA - DRB1* 0103 0 7 (1,8%) Tabla 4.20 Frecuencias HLA-DRB1 y neumonías recurrentes RESULTADOS 79 4.4.6. Otras Infecciones Infecciones por otras Micobacterias. En este grupo se incluyó a pacientes con infecciones por otras especies de micobacterias distintas a las tuberculosas tanto pulmonares como extra pulmonares diseminadas. Se hallaron 10 pacientes con infecciones por otras micobacterias diferentes a las tuberculosas. Toxoplasmosis. Siete pacientes presentaron toxoplasmosis cerebral. Histoplasmosis. Se encontraron tres pacientes con histoplasmosis diseminada. Criptococosis. Se describieron cuatro pacientes con criptococosis extra pulmonar. Leucoencefalopatia multifocal progresiva. Nueve pacientes presentaron esta enfermedad. En ninguno de estos grupos se observaron asociaciones positivas o negativas que pudieran determinar la presencia de alelos de protección ni de susceptibilidad asociados a las infecciones estudiadas. Se analizaron las frecuencias de la deleción delta 32 de CCR5, la homocigosidad para HLA-B y los epítopos públicos Bw4/Bw6 en las infecciones descritas, no encontrándose asociación positiva o negativa con ninguna de ellas. RESULTADOS 80 4.5. COINFECCIONES Y HLA Se estudiaron las coinfecciones por virus B y C de la hepatitis (VHB, VHC). Se obtuvieron datos de 1191 pacientes para el VHB y de 1197 para el VHC. 4.5.1. Coinfección VIH/VHB-/VHB El total de pacientes coinfectados (infección actual o pasada) fue de 435. La distribución según origen y las frecuencias de los alelos HLA-B y HLA-DRB1 se muestran en las tablas 4.21, 4.22 y 4.23. España Europa /EEUU África Sur América Asia Total VHB SI 281 (33,7%) 76 (39,8%) 41 (57,7%) 36 (39,6%) 1 (20,0%) 435 (36,5%) NO 552 (66,3%) 115 (60,2%) 30 (42,3%) 55 (60,4%) 4 (80,0%) 756 (63,5%) Total 833 191 71 91 5 1191 Tabla 4.21. Distribución según origen en pacientes con coinfección VIH-VHB Alelo B VHB Alelo B VHB SI 2n=870 NO 2n=1512 SI 2n=870 NO 2n=1512 HLA - B*07 60 (13,8%) 91 (12%) HLA - B*48 1 (0,2%) 2 (0,3%) HLA - B*08 59 (13,6%) 91 (12%) HLA - B*49 25 (5,7%) 33 (4,4%) HLA - B*13 11 (2,5%) 22 (2,9%) HLA - B*50 23 (5,3%) 40 (5,3%) HLA - B*14 53 (12,2%) 94 (12,4%) HLA - B*51 54 (12,4%) 116 (15,3%) HLA - B*15 57 (13,1%) 86 (11,4%) HLA - B*52 7 (1,6%) 22 (2,9%) HLA - B*18 40 (9,2%) 84 (11,1%) HLA - B*53 26 (6%) 35 (4,6%) HLA - B*27 35 (8%) 35 (4,6%) HLA - B*55 12 (2,8%) 16 (2,1%) HLA - B*35 78 (17,9%) 173 (22,9%) HLA - B*56 13 (3%) 12 (1,6%) HLA - B*37 7 (1,6%) 24 (3,2%) HLA - B*58 19 (4,4%) 31 (4,1%) HLA - B*38 18 (4,1%) 50 (6,6%) HLA - B*67 1 (0,2%) 0 HLA - B*39 24 (5,5%) 39 (5,2%) HLA - B*78 1 (0,2%) 1 (0,1%) HLA - B*40 40 (9,2%) 79 (10,4%) HLA - B*81 1 (0,2%) 1 (0,1%) HLA - B*41 16 (3,7%) 18 (2,4%) HLA - B*57 25 (5,7%) 49 (6,4%) HLA - B*42 9 (2,1%) 14 (1,9%) HLA - B*44 135 (31%) 225 (29,8%) HLA - B*57:01 19 (4,4%) 40 (5,3%) HLA - B*45 18 (4,1%) 21(2,8%) HLA - B*57:02 1 (0,2%) 4 (0,5%) HLA - B*46 0 1 (0,1%) HLA - B*57:03 5 (1,1%) 4 (0,5%) HLA - B*47 2 (0,5%) 6 (0,8%) HLA - B*57:04 0 1 (0,1%) Tabla 4.22. Frecuencias de los alelos HLA-B en coinfección VIH-VHB RESULTADOS 81 Alelo DRB1 VHB SI 2n=722 NO 2n=1216 HLA - DRB1*03 90 (24,9%) 135 (22,2 %) HLA - DRB1*04 94 (26%) 154 (25,3%) HLA - DRB1*07 101 (28%) 164 (27%) HLA - DRB1*08 26 (7,2%) 35 (5,8%) HLA - DRB1*09 8 (2,2%) 14 (2,3%) HLA - DRB1*10 11 (3%) 18 (3%) HLA - DRB1*11 87 (24,1%) 125 (20,6%) HLA - DRB1*12 9 (2,5%) 14 (2,3%) HLA - DRB1*13 116 (32,1%) 232 (38,2%) HLA - DRB1*14 20 (5,5%) 33 (5,4%) HLA - DRB1*15 73 (20,2%) 115 (18,9%) HLA - DRB1*16 20 (5,5%) 26 (4,3%) HLA - DRB1*01 67 (18,5%) 151 (24,8%) HLA - DRB1*01:01 34 (9,4%) 86 (14,1%) HLA - DRB1*01:02 29 (8%) 50 (8,2%) HLA - DRB1*01:03 4 (1,1%) 15 (2,5%) Tabla 4.23. Frecuencias de los alelos HLA-DRB1 en coinfección VIH-VHB. No se encontraron diferencias significativas comparando las frecuencias de HLA-B y HLA-DRB1 de este grupo con las del total de pacientes VIH-1 y con las del grupo control. Sí se aprecia que la coinfección VIH-VHB es más frecuente en el grupo de pacientes de origen africano que en el resto de grupos. 4.5.2. Coinfección VIH/VHCEl total de pacientes coinfectados fue de 168. La distribución según origen y las frecuencias de los alelos HLA-B y DRB1 se muestran en las tablas 4.24, 4.25 y 4.26. RESULTADOS 88 linfocitos T CD4, mientras que el valor de la las variaciones. Se efectuaron tantas regresiones como alelos pres pacientes. Se obtuvieron valores de pendientes y valores de significación. Figura 4.3 Distribución de la muestra tras la corrección Valores de pendientes positivos significan elevaciones, que pueden ser significativas o no a lo largo del pendiente cercanos a cero nos indican mantenimiento sin aumentos ni disminuciones a lo largo del tiempo y valores de pendiente negativos indican disminuciones de los valores a lo largo del tiempo. pendientes de evolución de linfocitos T CD4 según el tipaje HLA Los pacientes que poseen los alelos HLA B*40, B*41, B*44, B*49, B*51 y B*58 presentaron pendientes negativas (disminuciones a lo lar go del tiempo). E pendiente mínima que se aproxima a cero, indicando un mantenimiento de los valores. De este grupo “descendente” tan só disminución significativa (p =0,003). linfocitos T CD4, mientras que el valor de la p indica la significación estadística de las variaciones. Se efectuaron tantas regresiones como alelos pres pacientes. Se obtuvieron valores de pendientes y valores de significación. Distribución de la muestra tras la corrección Valores de pendientes positivos significan elevaciones, que pueden ser significativas o no a lo largo del tiempo dependiendo de la p obtenida. Valores de pendiente cercanos a cero nos indican mantenimiento sin aumentos ni disminuciones a lo largo del tiempo y valores de pendiente negativos indican disminuciones de los valores a lo largo del tiempo. En la figur a 4.4 pendientes de evolución de linfocitos T CD4 según el tipaje HLA -B. Los pacientes que poseen los alelos HLA - B*07, B*08, B*13, B15, B*18, B*35, B*40, B*41, B*44, B*49, B*51 y B*58 presentaron pendientes negativas go del tiempo). E n los casos de B*18 y B*15 presentaron un pendiente mínima que se aproxima a cero, indicando un mantenimiento de los valores. De este grupo “descendente” tan só lo el alelo B*13 =0,003). indica la significación estadística de las variaciones. Se efectuaron tantas regresiones como alelos pres entaban los pacientes. Se obtuvieron valores de pendientes y valores de significación. Distribución de la muestra tras la corrección Valores de pendientes positivos significan elevaciones, que pueden ser tiempo dependiendo de la p obtenida. Valores de pendiente cercanos a cero nos indican mantenimiento sin aumentos ni disminuciones a lo largo del tiempo y valores de pendiente negativos indican a 4.4 se muestran las B*07, B*08, B*13, B15, B*18, B*35, B*40, B*41, B*44, B*49, B*51 y B*58 presentaron pendientes negativas B*18 y B*15 presentaron un a pendiente mínima que se aproxima a cero, indicando un mantenimiento de los lo el alelo B*13 presentó una RESULTADOS 89 Figura 4.4. Pendiente estimada de la evolución del recuento de linfocitos T CD4 para los pacientes con los distintos alelos HLA-B. El alelo B*42 (media pendiente =-0,950) se ha suprimido de la figura debido a que en su evolución solo se poseen datos de recuento de linfocitos T CD4 durante un año. Los pacientes con alelos B*14, B*27, B*38, B*39, B*45, B*50, B*53, B*56 y B*57 presentaron pendientes positivas, en los casos de B*57 y B*56 la pendiente era próxima a cero. De este grupo con pendiente ascendente, los pacientes con los alelos B*38 y B*39 presentaban aumentos significativos (p=0,008 y p=0,006). En la figura 4.5 muestran las pendientes de evolución de linfocitos T CD4 según los grupos Bw4/Bw6 y la homo/heterocigosidad en HLA-B. B*07 B*08 B*13 B*14 B*15 B*18 B*27 B*35 B*38 B*39 B*40 B*41 B*44 B*45 B*49 B*50 B*51 B*53 B*56 B*57 B*58 -6 -4 -2 0 2 4 B* 3 8 B* 1 3 B* 3 9 Pendiente √ CD4 RESULTADOS 90 Figura 4.5. Pendiente estimada de la evolución del recuento de linfocitos T CD4 para los pacientes según los grupos Bw4/Bw6 y Homocigotos/ Heterocigotos para HLA-B Los pacientes Bw4/Bw4 presentan una pendiente positiva (ascendente) mientras que los Bw4/Bw6 la pendiente es positiva pero prácticamente igual a cero y los Bw6/Bw6 pendiente negativa (descendente) pero también muy próxima a cero. Se analizaron los pacientes homocigotos/heterocigotos para HLA-B, apreciándose una pendiente negativa en el caso de los homocigotos, mientras que esta es positiva muy cercana a cero en los heterocigotos. En ninguno de estos casos los ascensos/disminuciones fueron significativos. También se obtuvieron datos del total de pacientes de los que obtuvimos recuentos de linfocitos T CD4 (siempre incluyendo los que tenían más de tres determinaciones y al menos una determinacion al año). Se realizó un análisis de la media de los recuentos de linfocitos T CD4 durante el tiempo del que poseemos datos de evolución, según sus tipajes HLA-B y HLA-DRB1. Se dividió el estudio entre el grupo de los asintomáticos sin tratamiento y el resto de pacientes. Los pacientes del grupo de asintomáticos sin tratamiento que presentaron una media de recuentos más elevados, fueron aquellos portadores de los alelos HLA-B*57 (B*57:03 y B*57:01) y B*07. Por el contrario los que presentaron medias más disminuidas fueron los portadores de los alelos HLA-B*40 y B*58. Bw4/Bw4 Bw4/Bw6 Bw6/Bw6 HOM HET -3 -2 -1 0 1 2 P e n d i e n t e √ C D 4 RESULTADOS 91 Con respecto al grupo restante de pacientes, los portadores de los alelos HLA-B*14, B*50 y B*48 tenían las medias más elevadas y los portadores de B*57:02 y B*57:04 las más disminuidas (En las figuras 4.6 y 4.7 se muestran los diagramas Box and whiskers con los datos). Figura 4.6. Recuentos de linfocitos T CD4 en pacientes asintomáticos sin tratamiento según su HLA-B El tamaño de la caja indica el recorrido intercuartílico, la línea media vertical indica la mediana, el símbolo “+” indica el valor de la media, las líneas exteriores indican los valores máximos y mínimos. RESULTADOS 92 Figura 4.7. Recuentos de linfocitos T CD4 en no pertenecientes al grupo de pacientes asintomáticos sin tratamiento según su HLA-B El tamaño de la caja indica el recorrido intercuartílico, la línea media vertical indica la mediana, el símbolo “+” indica el valor de la media, las líneas exteriores indican los valores máximos y mínimos. RESULTADOS 93 Las frecuencias alélicas del grupo de pacientes asintomáticos sin tratamiento se muestran en la tabla 4.32 y en la tabla 4.33 las del resto de pacientes (n=551). Pacientes asintomáticos sin tratamiento Alelo B 2n=82 Alelo B 2n=82 HLA-B*07 4 (9,8%) HLA-B*42 1 (2,4%) HLA-B*08 3 (7,3%) HLA-B*44 19 (46,3%) HLA-B*13 2 (4,9%) HLA-B*45 2 (4,9%) HLA-B*14 4 (9,8%) HLA-B*49 1 (2,4%) HLA-B*15 5 (12,2%) HLA-B*50 2 (4,9%) HLA-B*18 3 (7,3%) HLA-B*51 6 (14,6%) HLA-B*27 2 (4,9%) HLA-B*53 5 (12,2%) HLA-B*35 4 (9,8%) HLA-B*56 2 (4,9%) HLA-B*37 1 (2,4%) HLA-B*58 1 (2,4%) HLA-B*38 5 (12,2%) HLA-B*57 4 (9,7%) HLA-B*39 2 (4,9%) HLA-B*40 3 (7,3%) HLA-B*57:01 3 (7,3%) HLA-B*41 1 (2,4%) HLA-B*57:03 1 (2,4%) Tabla 4.32. Frecuencias de alelos HLA-B en grupo de pacientes asintomáticos sin tratamiento Resto de pacientes Alelos B 2n=1102 Alelos B 2n= 1102 HLA-B*07 76 (13,8%) HLA-B*48 1 (0,2%) HLA-B*08 60 (10,9%) HLA-B*49 31 (5,6%) HLA-B*13 15 (2,7%) HLA-B*50 29 (5,3%) HLA-B*14 69 (12,5%) HLA-B*51 89 (16,2%) HLA-B*15 65 (11,8%) HLA-B*52 14 (2,5%) HLA-B*18 58 (10,5%) HLA-B*53 26 (4,7%) HLA-B*27 37 (6,7%) HLA-B*55 11 (2,0%) HLA-B*35 112 (20,3%) HLA-B*56 10 (1,8%) HLA-B*37 16 (2,9%) HLA-B*58 25 (4,5%) HLA-B*38 31 (5,6%) HLA-B*67 1 (0,2%) HLA-B*39 26 (4,7%) HLA-B*78 2 (0,4%) HLA-B*40 58 (10,5%) HLA-B*81 2 (0,4%) HLA-B*41 16 (2,9%) HLA-B*57 26 (4,7%) HLA-B*42 12 (2,2%) HLA-B*57:01 20 (3,6%) HLA-B*44 164 (29,8%) HLA-B*57:02 1 (0,2%) HLA-B*45 18 (3,3%) HLA-B*57:03 4 (0,7%) HLA-B*47 2 (0,4%) HLA-B*57:04 1 (0,2%) Tabla 4.33. Frecuencias de alelos HLA-B en grupo de resto de pacientes RESULTADOS 94 La frecuencia del alelo B*44 es mayor en el grupo de pacientes asintomáticos sin tratamiento (46% vs 29,8%, p=0,045; pc=ns). También se encuentra una mayor frecuencia de HLA-B*53 (12,2% vs 4,7%) pero sin significación estadística. Con respecto a los alelos de clase II HLA-DRB1 se aprecian diferencias al analizar las pendientes en pacientes que portan el alelo HLA-DRB1*09, en los que la pendiente es ascendente, siendo este aumento significativo (p=0,020). En los pacientes que poseen el alelo HLA-DRB1*04 la pendiente es negativa y la disminución también fue significativa (p= 0,032). Con respecto a los portadores de resto de alelos existen pendientes tanto positivas como negativas muy próximas a cero (figura 4.8). Figura 4.8. Pendiente estimada de la evolución del recuento de linfocitos T CD4 para los pacientes con los distintos alelos HLA-DRB1 En el análisis de los recuentos de linfocitos T CD4 y HLA-DRB1, encontramos que en el grupo de pacientes asintomáticos sin tratamiento los pacientes con una media de CD4 más elevada fueron aquellos portadores de los alelos HLA-DRB1*15 y DRB1*09. Por el contrario los que presentaron medias menores fueron los portadores de los alelos HLADRB1*04, DRB1*01:01 y DRB1*08. Con respecto al grupo restante de pacientes, los portadores de los alelos HLA-DRB1*07, DRB1*11 y DRB1*13 tenían las medias de CD4 más elevadas y los DRB1*01 DRB1*03 DRB1*04 DRB1*07 DRB1*08 DRB1*09 DRB1*10 DRB1*11 DRB1*13 DRB1*14 DRB1*15 DRB1*16 -3 -2 -1 0 1 2 DRB 1 * 0 9 DRB 1 * 0 4 P e n d i e n t e √ C D 4 RESULTADOS 95 portadores de HLA-DRB1*01:03, DRB1*16 y B*57:04 las más disminuidas (en las figuras 4.9 y 4.10 se muestran los diagramas Box and whiskers con los datos). Figura 4.9. Recuentos de CD4 en pacientes asintomáticos sin tratamiento según su HLA-DRB1. El tamaño de la caja indica el recorrido intercuartílico, la línea media vertical indica la mediana, el símbolo “+” indica el valor de la media, las líneas exteriores indican los valores máximos y mínimos. 0 250 500 750 1000 1250 1500 16 03 04 11 07 01:01 15 13 01:02 08 09 14 10 CD4 cels/ µ l A l e l o s H L A - D R B 1 RESULTADOS 96 Figura 4.10. Recuentos de CD4 en no pertenecientes al grupo de asintomáticos sin tratamiento según su HLA-DRB1. El tamaño de la caja indica el recorrido intercuartílico, la línea media vertical indica la mediana, el símbolo “+” indica el valor de la media, las líneas exteriores indican los valores máximos y mínimos. Respecto al tipaje HLA-DRB1 en las tablas 4.34 y 4.35 se muestran las frecuencias alélicas del grupo de pacientes asintomáticos sin tratamiento frente al resto. La frecuencia de HLA-DRB*16 se encuentra aumentada en el grupo de pacientes asintomáticos sin tratamiento (15,8% vs 3,5%; p=0,0094, pc=ns) aunque la significación se pierde al corregir por el número de alelos. 0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 14 04 01:03 *03 11 10 07 08 15 16 01:01 13 09 01:02 12 CD4 cels/ µ l A l e l o s H L A - D R B 1 RESULTADOS 97 Pacientes asintomáticos sin tratamiento Alelos DRB1 2n=76 HLA-DRB1*03 10 (26,3%) HLA-DRB1*04 7 (18,4%) HLA-DRB1*07 10 (26,3%) HLA-DRB1*08 2 (5,3%) HLA-DRB1*09 2 (5,3%) HLA-DRB1*10 2 (5,3%) HLA-DRB1*11 5 (13,2%) HLA-DRB1*13 15 (39,5%) HLA-DRB1*14 1 (2,6%) HLA-DRB1*15 10 (26,3%) HLA-DRB1*16 6 (15,8%) HLA-DRB1*01 6 (5,8%) HLA-DRB1*01:01 4 (10,5%) HLA-DRB1*01:02 2 (5,3%) Tabla 4.34. Frecuencias del alelos HLA-B en el grupo de pacientes asintomáticos sin tratamiento Resto de pacientes Alelos DRB1 2n=960 HLA-DRB1*03 110 (22,9%) HLA-DRB1*04 131 (27,3%) HLA-DRB1*07 137 (28,5%) HLA-DRB1*08 30 (6,3%) HLA-DRB1*09 9 (1,9%) HLA-DRB1*10 15 (3,1%) HLA-DRB1*11 108 (22,5%) HLA-DRB1*12 14 (2,9%) HLA-DRB1*13 159 (33,1%) HLA-DRB1*14 23 (4,8%) HLA-DRB1*15 105 (21,9%) HLA-DRB1*16 17 (3,5%) HLA-DRB1*01 102 (21,3%) HLA-DRB1*01:01 57 (11,9%) HLA-DRB1*01:02 36 (7,5%) HLA-DRB1*01:03 9 (1,9%) Tabla 4.35. Frecuencia de alelos HLA-DRB1 en resto de pacientes RESULTADOS 104 España n=119 Europa/USA n=22 África n=8 Sur América n=12 Total n=161 G/G 56 (47,1%) 13 (59,1%) 4 (50%) 5 (41,7%) 78 (48,4%) G/T 57 (47,9%) 9 (40,9%) 3 (37,5%) 5 (41,7%) 74 (46%) T/T 6 (5 %) 0 1 (12,5%) 2 (16,7%) 9 (5,6%) Tabla 4.44. Frecuencias de los genotipos del CYP2B6 según el origen de los pacientes Canario n=98 No canario n=21 G/G 45 (45,9%) 11 (52,4%) G/T 47 (48%) 10 (47,6%) T/T 6 (6,1%) 0 Tabla 4.45. Frecuencias de los genotipos del CYP2B6 según el origen dentro del grupo español 5. DISCUSIÓN DISCUSIÓN 107 Este trabajo es fruto de la colaboración entre la Unidad de Inmunología y la Unidad de Enfermedades Infecciosas y Medicina Tropical del CHUIMI, que se inició en el año 2007 con la realización del tipaje HLA-B*57:01 en pacientes susceptibles de ser tratados con ABC. La realización de esta determinación se efectuaba mediante el tipaje completo del gen HLA-B. En la actualidad existen métodos más sencillos y económicos que informan tan solo la presencia o ausencia del alelo sin la información del tipaje completo. Gracias a la información adicional que nos proporcionó el tipaje HLA-B se proyectó el estudio del presente trabajo. Se planteó si la presencia de determinados alelos HLA-B podía estar asociada a ciertos patrones de progresión, a susceptibilidad/protección frente a las principales enfermedades infecciosas o neoplásicas asociadas a la infección por VIH-1 así como a las coinfecciones por VHB y VHC. Posteriormente se decidió ampliar el estudio con la determinación de la deleción delta 32 del CCR5. La asociación del desarrollo de reacciones de hipersensibilidad frente a EFV en pacientes que portaban el alelo HLA-DRB1*01:01 aunque estaba menos documentada que la reacción frente a ABC, empezó a adquirir interés con el paso del tiempo. En nuestra Unidad esta determinación se comenzó a realizar en el año 2008, lo que nos proporcionó información de las frecuencias totales de HLA-DRB1 en los pacientes. Los estudios sobre las asociaciones de alelos HLA y reacciones adversas producidas por fármacos antiretrovirales aumentaron y se describieron nuevas asociaciones en diferentes grupos geográficos o étnicos. La asociación del alelo HLA-DRB1*01:01 se extendió a reacciones producidas por la NVP. Este fármaco presenta efectos secundarios que, a lo largo del tiempo, han condicionado que su uso haya disminuido a pesar de su buena eficacia y precio muy asequible. Un aspecto adicional podría ser la presión de la industria farmacéutica para el empleo de nuevos fármacos. Los estudios farmacogenéticos sobre la NVP se han ido desarrollando en los últimos años, aunque aún se desconoce el mecanismo involucrado en el desarrollo de sus reacciones adversas. La investigación sobre los posibles mecanismos de acción de las reacciones llevaron al estudio de las vías de metabolización de los fármacos y a sus posibles variabilidades genéticas. Así, se describieron polimorfismos en los distintos citocromos que participan en los procesos de metabolización de los antiretrovirales, encontrándose asociaciones con los niveles de fármacos en plasma y con reacciones de hipersensibilidad. El polimorfismo del CYP2B6 516G>T ha sido uno de los que se ha relacionado de DISCUSIÓN 108 forma más clara con el desarrollo de RHS frente a NVP, por lo que se decidió investigar en un subgrupo de pacientes para evaluar su utilidad y la posibilidad de un futuro uso en la práctica clínica. La población de las Islas Canarias presenta un bagaje genético heterogéneo debido a la variedad del origen de sus pobladores fundacionales y al elevado porcentaje de población inmigrante residente. Existen datos arqueológicos que indican que las islas han estado habitadas desde hace más de 2.500 años (Tejera A, 1992), aunque el origen preciso de los primeros pobladores aun se desconoce. Diferentes estudios apuntan hacían una relación estrecha con la cultura bereber del noroeste de África. Tras un periodo en el que solo se produjeron contactos ocasionales, en el siglo XV se produjo la invasión de las islas por parte de europeos, principalmente de origen español y normando (Rando JC y col, 1999). Tras esta invasión, a las islas llegaron numerosas oleadas de inmigrantes españoles y portugueses, pero incluso después de siglos de estas migraciones, el origen genético aborigen aun se conserva en la actualidad (Flores C y col., 2003). Diferentes estudios coinciden en una combinación “genética” en la actualidad, del 60-70% de origen europeo, 20-30% de origen del norteafricano y un 5-10% de origen subsahariano (Pinto F y col., 1994; García-Laorden MI y col., 2001). Durante las últimas dos décadas se ha incrementado de forma notable la población residente en la isla de Gran Canaria procedente del Norte de Europa (especialmente de Alemania y Reino Unido) y,durante la ultima década, también se ha producido un importante flujo migratorio desde el África subsahariana. Por todo ello, esta agregación genética, hace que el estudio de la población considerada en este trabajo pueda presentar un interés especial. TIPAJE HLA-B Y B*57:01 EN PACIENTES VIH La prevalencia del HLA-B*57:01 en nuestra serie de pacientes fue del 5,0 %. Un estudio previo de tipo multicéntrico dentro de España, había descrito una prevalencia del alelo de 6,1%, aunque este trabajo incluía a 74 centros españoles ninguno de ellos estaba en la isla de Gran Canaria (Arrizabalaga J y col, 2009). Datos de trabajos realizados en diez países europeos, incluyendo a España, estimaban que la prevalencia de HLA-B*57:01 en el total de Europa era de 4,98%, DISCUSIÓN 109 siendo mayor su prevalencia en la población caucásica y menor en la población negra (Orkin C y col, 2010). Nuestros resultados son similares a los llevados a cabo en otros países como Reino Unido (4,77%), Francia (5,25%) o Irlanda (4,8%) con mayor prevalencia de pacientes de raza negra (Zucman D y col, 2007; Orkin C y col, 2010). Analizando las posibles diferencias entre los pacientes canarios y el resto de pacientes de origen español, no se observaron diferencias en lo que respecta a la prevalencia del HLA-B*57:01 (6,2% en canarios vs. 5,6% en no canarios). Las frecuencias de los grupos de origen no español son inferiores, no superando en ningún caso el 2,6%. En los pacientes cuyo origen fue Europa y Estados Unidos encontramos una inesperada baja frecuencia (2,6%) ya que la mayoría de los europeos que viven en Gran Canaria proceden de Alemania, Reino Unido e Italia y en estos países se han descrito frecuencias claramente superiores (6,3% en italianos y 7,2 en alemanes 7,9 %) (Orkin C y col., 2010). Existen pocos estudios que describan las frecuencias del alelo HLA-B*57:01 en países del centro y sur de América, pero se han informado de frecuencias del 2% en mestizos de México (Sánchez-Girón F y col., 2011), 2,2% en chilenos (Poggi H y col., 2010) y 3,1% en brasileños (Crovella S y col., 2011). En el presente estudio, la frecuencia encontrada en pacientes de América del Sur y Centro América fue del 2,2%. La mezcla de orígenes de la serie de nuestro hospital podría explicar las ligeras diferencias entre los estudios realizados en el resto de España y los de nuestro área. La elaboración de modelos coste efectivos en relación a la determinación del HLA-B*57:01, necesita del conocimiento previo de su prevalencia en las diferentes poblaciones. Tan solo en grupos donde la frecuencia de este alelo es muy baja la realización del test que informe de su presencia puede no ser coste-efectiva (Schackman BR y col., 2008; Hughes DA y col., 2004; Park WB y col., 2009). En nuestro trabajo se observa la existencia de una frecuencia alta en el grupo español y en el total de los pacientes analizados. La determinación, aun incluyendo los grupos con frecuencias más bajas, continuaría siendo coste efectiva tal y como se ha descrito en informes realizados en otros países europeos (Nieves D y col, 2010; Hughes DA y col., 2004; Wolf E y col., 2010). Un reciente meta-análisis demuestra la excelente exactitud de la determinación de HLA-B*57:01 para confirmar la DISCUSIÓN 110 hipersensibilidad a ABC corroborando las recomendaciones existentes sobre su realización (Cargnin S y col., 2014). La relativa complejidad y costo del tipaje HLA-B*57:01 llevó al desarrollo de alternativas como la descrita en 2008 por Colombo S y col., En su estudio describieron un polimorfismo en el complejo P5 del HLA (gen HCP5) que se encuentra en desequilibrio de ligamiento con HLA-B*57:01. En varios estudios posteriores se investigó el potencial de esta prueba, que resulta más sencilla de realizar y con un precio menor. Sin embargo el hecho de que el desequilibrio de ligamiento no sea completo y pueda variar según las distintas poblaciones hace reconsiderar su uso como sustituto de la determinación de B*57:01 (Sánchez-Girón F y col.; Galván CA y col., 2011). En un trabajo reciente realizado en población gallega se determinó este polimorfismo, observando una frecuencia del 7,6% (Rodríguez-Da Silva y col., 2015), superior a la descrita para el HLA-B*57:01 en el resto de población española. Esto podría deberse tanto a las características propias de la cohorte estudiada como al diferente método empleado. En las comparaciones entre grupos de distintos orígenes, encontramos diferencias significativas, previamente descritas en múltiples trabajos de genética comparativa poblacional. La única comparación adicional de interés seria dentro del grupo de pacientes españoles diferenciando entre los de origen canario y no canario. En nuestro estudio se aprecian diferencias significativas en los alelos B*18 y B*41, aunque al carecer datos sobre otros loci y haplotipos, no es posible sacar conclusiones, como sí se ha realizado en estudios de poblaciones de origen similar como las del archipiélago de Madeira (Arnáiz-Villena A y col., 2009). HLA E INFECCIONES Las infecciones han sido a lo largo de la evolución una de las principales causas de mortalidad y evolutivamente han ejercido una gran presión selectiva que ha provocado que los genes implicados en la respuesta inmune sean los más numerosos y polimórficos del genoma humano. La capacidad de los genes HLA de modular tanto la respuesta innata como la adaptativa, interaccionando tanto con los receptores de las células NK como con los receptores del linfocitos T, ha centrado el interés de múltiples estudios que describen numerosas asociaciones (Blackwell JM DISCUSIÓN 111 y col., 2009). En nuestro trabajo se han estudiado las posibles asociaciones con respecto a diez infecciones definitorias de SIDA. Candidosis La mayor frecuencia de HLA-B*14 encontrada en nuestro estudio en pacientes con candidosis debería tomarse con cautela ya que si se compara con la frecuencia de este alelo en el total de pacientes estudiados (12,6%) y en los controles sanos (17,4 %) esta se encuentra entre ambas. Excepto en estudios realizados en pacientes con síndrome poliendocrino autoinmune, uno de cuyos componentes principales es la candidosis mucocútanea crónica, no se encuentran trabajos en los que se describan frecuencias de HLA en pacientes con este diagnóstico tanto de forma aislada como dentro del contexto de la infección por VIH. En alguno de estos trabajos se muestra una mayor frecuencia del alelo HLA-DRB1*01 analizando la candidosis aisladamente dentro del contexto del síndrome autoinmune (Halonen M y col., 2002), asociación que no se reproduce en nuestra serie donde tan solo en clase II se encuentra un discreto aumento en la frecuencia de HLA-DRB1*07 pero sin significación estadística. Neumonía por Pneumocystis jirovecii La disminución del número absoluto de linfocitos T CD4 es el principal factor de riesgo para desarrollar una infección por Pneumocystis jirovecii. Aproximadamente el 90% de casos de esta enfermedad aparecen en pacientes en los que el recuento de linfocitos T CD4 es inferior a 200 cel/µl (Huang L y Crothers K, 2009). En nuestro trabajo se analizaron las frecuencias HLA-B y HLA-DRB1 de los pacientes que habían sufrido neumonía por Pneumocystis jirovecii en algún momento. Los datos sobre las frecuencias HLA-B no diferían entre los pacientes con y sin infección, pero sí se observaron diferencias con respecto a los alelos HLADRB1. Se investigó la frecuencia de infección en pacientes atendiendo a si habían tenido o no en algún momento de su evolución los niveles de linfocitos T CD4 por debajo del dintel de los 200 cel/µl. A destacar la disminución de la frecuencia de DISCUSIÓN 112 DRB1*07 en el grupo de pacientes infectados por P. jirovecii , que era aun mayor en los que en algún momento habían tenido un recuento de linfocitos T CD4 inferior a 200 cel/µl, lo que puede indicarnos que este alelo podría ser un factor protector frente al desarrollo de la infección. Tuberculosis Se observó un aumento de la frecuencia del alelo HLA-B*38 en pacientes con tuberculosis (13,2% frente a un 5,1%). Esta asociación aunque perdiendo la significación tras la corrección por el número de alelos podría resultar de interés ya que no parece haber sido descrita previamente. En un trabajo realizado en el sur de la India se encontró que el HLA-B*57 y el género influían en la aparición de tuberculosis en individuos infectados por el VIH. Así, la incidencia de tuberculosis fue significativamente menor entre mujeres (25,4% frente a 50,8%) (Jagannathan L y col., 2011). En nuestra serie esos datos no se reproducen y, de hecho, las frecuencias son las contrarias, encontrándose ligeramente elevada la frecuencia en mujeres (15,9% frente a 10% en varones) aunque sin significación estadística. Con respecto al alelo B*57 no se observaron diferencias significativas en nuestro estudio. Asociaciones encontradas con respecto a HLA clase II y la susceptibilidad y resistencia a la tuberculosis en la población general tampoco se encontraron en nuestra serie, refrendando la teoría de que las variaciones étnicas y/o geográficas juegan un papel primordial en las discrepancias que entre diferentes estudios se describen. (Duarte R y col., 2011; Delgado JC y col., 2002; Raghavan S y col., 2009). Citomegalovirus La infección por CMV está claramente asociada al aumento de la mortalidad en sujetos inmunocomprometidos. Se han realizado numerosos estudios sobre la influencia que el HLA podía tener en pacientes trasplantados, tanto de órgano sólido como de medula ósea. Diferentes estudios han descrito asociaciones con determinados alelos HLA de clase II como el DRB1*07 en el caso de los trasplantes renales, en los que se demostró que la compatibilidad entre donante y receptor de DISCUSIÓN 113 este alelo incrementaba el riesgo de enfermedad por CMV en el receptor (Blancho G y col., 1992; Kraat YJ y col., 1993). Por otro lado, en trasplante alogénico de progenitores hematopoyéticos se encontró que HLA-DR15 y HLA-DR7 incrementaban el riesgo de reactivación de CMV en pacientes que habían recibido trasplante con un estatus CMV+ previo a su realización mientras que el HLA-B*51 presentaba un efecto protector (Chen Y y col., 2001). Otros datos posteriores señalan, en pacientes chinos, la asociación de HLA-DRB1*09 con una incidencia aumentada de infección y enfermedad por CMV tras trasplante de progenitores hematopoyéticos (Du J y col., 2007), y, en pacientes turcos se describían los alelos HLA-B*14, HLA-DRB1*01 y HLA-DRB1*13 como significativamente más frecuentes en reactivaciones de CMV (Acar K y col., 2014). En nuestra serie con respecto a los alelos HLA-B encontramos que el alelo HLA-B*45 presentaba una frecuencia aumentada en pacientes con infección, esta asociación, aunque al corregir por el numero de alelos se perdía la significación estadística, indica una tendencia no encontrada en otras poblaciones. Con respecto al alelo B*51 descrito previamente como alelo protector, en nuestra serie también se muestra esa tendencia (4,5% en infección frente a 17,8% en los restantes) aunque no de forma significativa. El aumento de frecuencia del alelo HLA-DRB1*08 se ha encontrado en otros estudios sobre infecciones virales independientes de la infección por VIH-1 como el caso del virus del Dengue (Malavige GN y col., 2011), pero no se encuentra ninguna referencia con respecto al CMV. Neumonías recurrentes Se encontraron en el grupo de neumonías recurrentes asociaciones de riesgo y protección entre los alelos HLA-B y HLA-DRB1, aunque la interpretación de los mismos resulta difícil por la ya complicada entidad que constituye el criterio de SIDAde neumonías recurrentes, tanto por la diversidad de la que puede ser su etiología como en su definición como tal, ya que en esta categoría entra también el diagnostico de presunción. Aun así los datos podrían tomarse en consideración y ampliar el estudio con datos de la filiación de las neumonías. Los alelos HLA-B*57 y DISCUSIÓN 120 Las moléculas de HLA presentan epítopos (fragmentos de proteínas del VIH) necesarios para el reconocimiento inmunológico y posterior ataque de los linfocitos T CD8. Mutaciones en las zonas de los epítopos presentados por parte del virus representan la adaptación que el VIH realiza frente al HLA (Kawashima Y y col., 2009). Esto puede cambiar la visión que se tiene de la evolución del VIH y su dependencia del HLA. La adaptación del virus frente a las respuestas de los linfocitos T CD8 pueden cambiar las asociaciones actualmente establecidas entre determinados alelos HLA y la velocidad de progresión de la enfermedad. Existen datos que muestran que hace 25 años el alelo HLA-B*51 se mostraba como “protector” en pacientes de Japón (Kaslow RA y col., 1996; O’Brien y col., 2001) y actualmente esto ya no ocurre así (Kawashima Y y col,. 2009). A pesar de lo limitado del estudio, debido a su carácter retrospectivo y al reducido número de pacientes en el grupo seleccionado como individuos con una evolución lenta de la enfermedad, podemos concluir que los resultados son concordantes con los descritos en trabajos previos y refuerzan la utilidad que podría tener el conocer el tipaje HLA-B. Este dato podría ayudar a optimizar el seguimiento de la progresión de la infección sumándose a los ya claramente establecidos subgrupos de pacientes con mayor riesgo de progresión como son varones, pacientes de mayor edad, usuarios de drogas por vía parenteral, y pacientes que presentan coinfecciones por virus de la hepatitis C y B (Jaén A y col., 2008). HLA-DRB1*01 y CYP2B6 en las reacciones frente a NVP La NVP es un fármaco ampliamente empleado en el tratamiento de la infección por VIH-1, especialmente, en países en vías de desarrollo y en mujeres embarazadas. Sin embargo su uso se ha limitado mucho debido al alto porcentaje de efectos secundarios que presenta. El primer estudio que publicó una asociación del HLA con las reacciones producidas por la NVP fue realizado en Australia en el año 2005 y se describió la asociación con el alelo HLA-DRB1*01:01 (Martin AM y col., 2005). Trabajos posteriores confirmaron esta asociación pero también se describieron asociaciones con otros alelos de clase I como el HLA-B*14:02 y HLA-C*08 en población de la isla de Cerdeña (Littera R y col., 2006) y el HLA-B*35:05 y HLA-C*04 en Tailandia DISCUSIÓN 121 (Chantarangsu S y col., 2009; Likanonsakul S y col., 2009). Esta diversidad de resultados podría explicarse en cierto modo por el desequilibrio de ligamiento que dichos alelos presentan en forma de los haplotipos extendidos HLA-B*14-HLA-C*08HLADRB1*01 y HLA-B*35-HLA-C*04. Desde la descripción de las primeras asociaciones se produjo un interés creciente en confirmar los alelos asociados a las RHS frente a NVP. De especial interés fue es estudio llevado a cabo por la farmacéutica Boehringer-Ingelheim que comercializa el antirretroviral y que incluía 276 casos de RHS y 567 controles de distintas etnias y localizaciones (Yuan J y col., 2011) y que confirmó las asociaciones previamente descritas con HLA-C*04, B*35 y DRB1*01. Un reciente metanálisis que recopiló un total de 13 estudios, concluye que el alelo HLA-C*04 estaría asociado a RHS en poblaciones de diferente origen, mientras que el HLA-B*35 y HLA-DRB1*01 estarían asociados en población tailandesa y caucásica respectivamente (Cornejo Castro E y col., 2015). En nuestra cohorte no apreciamos asociación con los alelos HLA-B y tan solo se observó una frecuencia disminuida del alelo HLAB*15 en los pacientes con RHS, que aun sin poseer significación estadística, podría indicar una posible asociación protectora que debiera estudiarse en una cohorte de mayor tamaño. Un trabajo presentado en un congreso reciente (Pavlos R y col., 2014), que continúa el estudio iniciado por Yuan J y col., asoció el alelo HLA-B*15 a una protección frente a la RHS en pacientes caucásicos y asiáticos. Con respecto a los alelos HLA de clase II, en nuestro estudio encontramos una frecuencia aumentada del alelo HLA-DRB1*01 en pacientes con RHS, tanto DRB1*01:01 como DRB1*01:02. Teniendo en cuenta el tipo de reacción, se observa la tendencia ya descrita en los trabajos que asocian la presencia del alelo DRB1*01:01 con hepatitis (Philips E y col., 2010; Yuan J y col., 2011), sin embargo el reducido número de casos no nos permite encontrar significación en esta asociación. Existen otros estudios que, por el contrario, encuentran asociación entre las manifestaciones cutáneas de las RHS y el alelo DRB1*01 (Vitezica ZG y col., 2008). Los estudios sobre las vías de metabolización de la NVP y su relación con los efectos adversos fueron posteriores a los estudios sobre el HLA. En 2011, Yuan S y col. describieron que las variantes del CYP2B6 podían afectar al riesgo de efectos adversos a la NVP. El genotipo de metabolizador lento CYP2B6 516 G>T fue descrito como asociado en mayor medida a reacciones cutáneas. Este dato se DISCUSIÓN 122 confirma en nuestro estudio, donde encontramos mayor cantidad de reacciones cutáneas en los grupos de pacientes que portaban el alelo sobre todo cuando este se encontraba en homocigosis. La frecuencia del genotipo CYP2B6 516T/T en nuestra serie fue de 5,6%, pero varía notablemente según el origen de los pacientes. Así, en el grupo procedente de Europa no encontramos ningún individuo que lo presente y por el contrario encontramos hasta un 16,7% en el grupo de pacientes procedentes de América del Sur. Se ha descrito que el alelo 516T se encuentra con una alta frecuencia en poblaciones sub-saharianas (45,5%) y afro americanas (46,7%), en comparación con poblaciones de origen hispano (27,3%), europeas (21,4%) y asiáticas (17,4%) (Nyakutira C y col. 2008; Mehlotra RK y col, 2007; Rakhmanina NY y van den Anker JN, 2010). En la serie del presente trabajo la frecuencia total fue del 28,5%, encontrándose la mayor frecuencia en el grupo de América del sur (37,5%) y la menor en el grupo europeo (20,45%). Los pacientes de origen canario se encuentran en una situación intermedia entre estos grupos, ya que se encuentra una frecuencia total del alelo 516T del 30,1%, superior al 25% descrito en población española (Arenaz I y col., 2010). Sin embargo en nuestro grupo no se aprecian diferencias respecto a los pacientes homocigotos CYP2B6 516T/T, que tienen una frecuencia del 6,1% en los pacientes canarios, similar al 5,5% descrito en población española en el trabajo señalado. Se han descrito como riesgo adicional para el desarrollo de afectación hepática asociada con el tratamiento con NVP las coinfecciones por virus de la hepatitis B y C (Stern JO y col., 2003; Sanne I y col., 2005). En los pacientes que presentaron reacciones en nuestro estudio no encontramos un aumento significativo de afectación hepática en portadores del virus de la hepatitis C y/o B. Otras asociaciones con efectos adversos hepáticos han sido descritas, como el género femenino y los recuentos más elevados de linfocitos T CD4 (Stern JO y col., 2003). En nuestro grupo de estudio la distribución por género de los pacientes que habían sufrido algún tipo de reacción no presentó ninguna variación, tanto en el grupo general de reacciones como en las que incluían efectos adversos de tipo hepático. Con respecto al recuento de linfocitos T CD4 este punto no pudo ser confirmado al carecer de los datos exactos de los recuentos de los pacientes en el momento del inicio de la terapia con NVP. A diferencia de la RHS producida por el ABC que está asociada a un único alelo de clase I, la reacciones frente a NVP parecen ser inmunológicamente más DISCUSIÓN 123 complejas ya que sus manifestaciones tanto cutáneas como sistémicas se han asociado a diferentes alelos HLA tanto de clase I como de clase II así como a polimorfismos del CYP2B6. La aparición de la reacción cutánea parece requerir una acumulación de NVP, tal como sugiere el hecho de que estas reacciones estén asociadas con la presencia de genotipos metabolizadores lentos. El hecho de que el alelo HLA-C*04 haya sido frecuentemente asociado con la RHS en distintas poblaciones, indicaría que la reacción estaría mediada por linfocitos T CD8 que interaccionarían con las moléculas de HLA de clase I. En nuestra serie no se realizó el tipaje del locus HLA-C, pero a través del desequilibrio de ligamiento que existe entre el locus B y C, se podrían inferir los pacientes que portan el alelo HLA-C*04, ya que estos se encuentran en fuerte desequilibrio de ligamiento con el alelo HLAB*35, y así encontramos que el alelo HLA-B*35 está más elevado en los pacientes presentaron reacción cutánea frente los que presentaron reacción sistémica (40% frente a 10%). En el primer estudio GWAS (Genome-wide association study; estudio de asociación del genoma completo) realizado, se han descrito otros genes que podrían estar implicados en la RHS a NVP (Chantarangsu y col., 2011). En este estudio se encontró asociación con la región 6p21.3, que además de los genes HLA contiene el gen CCHR, que ha sido asociado a susceptibilidad a psoriasis y podría estar implicado en la proliferación de queratinocitos. Este hecho podría explicar la baja sensibilidad de las asociaciones HLA descritas (34% en caucásicos para el HLA-C*04) (Haas DW y col., 2012), ya que se estaría obviando el papel que otros genes pudieran tener y que serían también necesarios para que la reacción se produjera. Las reacciones sistémicas y hepáticas, es posible se produzcan por un mecanismo de acción diferente, a través de linfocitos T CD4+ y HLA de clase II. Se han realizado modelos de unión a NVP a los distintos alelos de HLA asociados a la RHS, y según éstos la NVP se uniría de forma no covalente tanto con DRB*01:01 como con DRB1*01:02, esta unión se realiza de forma más fuerte en ausencia de péptidos en el bolsillo de unión, sugiriendo un reconocimiento directo de la NVP por el TCR (Pavlos y col., 2014). A la vista de los resultados observados en el presente trabajo, se puede especular sobre el papel de los alelos DRB1*01:01 y DRB1*01:02 en la RHS, ya que ambos alelos presentan una alta homología y es posible que las escasas diferencias de secuencia entre ellos no lleguen a ser determinantes para permitir la unión de la DISCUSIÓN 124 NVP al bolsillo de presentación de péptidos. Los alelos DRB1*01:01 y DRB1*01:02 difieren tan sólo en 2 aas de toda su secuencia (DRB1*01:01 tiene un valina en la posición 85 y glicina en la 86, mientras que DRB1*01:02 tiene alanina en la posición 85 y valina en la 86), y difieren de todo el resto de alelos DRB1, excepto con DRB1*10:01 y con el alelo poco frecuente DRB1*11:30 (presumiblemente inexistente en la población española), en las posiciones 11, 13 y 31 que se encuentran en el bolsillo de unión a péptidos (Donfack J y col., 2000). Es posible que los aas presentes en estas tres posiciones, individualmente o en conjunto, sean determinantes para que se pueda dar la unión y presentación de los antígenos de la NVP tan solo en los alelos DRB1*01:01, DRB1*01:02 y DRB1*10:01 (aunque en nuestra serie tan sólo hemos encontrado un paciente con reacción con este último alelo, que tiene una frecuencia del 5% en pacientes con reacción frente al 1,6% en pacientes sin ella). Existe un conjunto de trabajos en los que el análisis de las posibles asociaciones HLA y enfermedad se realiza en base a una clasificación funcional de los alelos de DR, teniendo en cuenta el polimorfismo en los aas 70, 71 y 74 de la cadena β, presentes en el bolsillo 4 (Ou D y col., 1998). Este tipo de análisis se ha utilizado en estudios de asociación en enfermedades autoinmunes y alérgicas (Gibert M y col., 2003; Torres-Galván y col., 2000). Según esta clasificación, los alelos DRB1*01:01, DRB1*01:02, DRB1*04:01, DRB1*04:04, DRB1*04:05, DRB1*04:08, DRB1*10:01, DRB1*14:02 y los menos frecuentes DRB1*01:04 y DRB1*14:21 pertenecerían al mismo grupo funcional 'A', de los 7 grupos establecidos. En nuestra serie, además del aumento de DRB1*01, también se encuentra ligeramente aumentada la frecuencia de DRB1*04 y DRB*10. A pesar de que no se ha realizado el tipaje de alta resolución, se puede intuir que al pertenecer a este grupo funcional 'A' el 75% de los pacientes con reacción de hipersensibilidad frente a 43,5% de los pacientes sin reacción, un análisis realizado sobre la base de la clasificación funcional de los alelos HLA-DRB1 también detectaría una asociación significativa. Hasta el momento tan sólo existe un trabajo en la bibliografía que haya estudiado la respuesta celular in vitro provocada por NVP, y cuyos resultados confirmarían la implicación de tanto los linfocitos T CD4 como CD8, en las RHS DISCUSIÓN 125 determinadas por medio de la producción de interferón-gamma medido por ensayos Elispot y de citometría de flujo (Keane NM y col., 2014). El integrar la determinación de este polimorfismo en la práctica clínica en pacientes que vayan a iniciar tratamiento con EFV o NVP es un tema controvertido. En individuos CYP2B*6/*6 (516TT) homocigotos se ha planteado iniciar terapia con una dosis reducida de EFV, que podría eliminar muchos de los problemas que a nivel de sistema nervioso central este fármaco produce y también disminuiría el riesgo de desarrollar resistencias (Sukasem C, 2013). En el presente trabajo, a pesar de la reducida muestra de pacientes con reacciones adversas, encontramos una fuerte asociación a la hora de desarrollar efectos secundarios frente a la NVP en individuos portadores del polimorfismo 516G>T en homocigosis. Por ello, se debiera plantear la cuestión sobre si su determinación previa a la administración sería necesaria. La combinación de la determinación de HLA-DRB1*01 y CYP2B6*6 en nuestra serie nos informa de 14/20 pacientes con reacción frente a la NVP en los que con ambas determinaciones podríamos haber establecido el mayor riesgo de padecerlas. Aunque este trabajo se haya centrado en las reacciones frente a NVP, la implantación del polimorfismo CYP2B6 también beneficiaría a aquellos pacientes en tratamiento con EFV en los que ayudaría a la mejor dosificación de este fármaco como ya se ha descrito en estudios previos y que ha demostrado ser coste efectivo (Martín AS y col., 2014). 6. CONCLUSIONES CONCLUSIONES 129 1La prevalencia del alelo HLA-B*57:01 en los pacientes con infección por VIH-1 de Gran Canaria es del 5%. Teniendo en cuenta el origen de los pacientes, esta prevalencia es menor en los pacientes no españoles. En los pacientes de origen español la prevalencia es del 6%, muy similar a la publicada en pacientes de otras regiones de España (6,5%). 2Al analizar las frecuencias genotípicas de HLA-B y HLA-DRB1 en nuestra muestra de pacientes, no se encuentran asociaciones estadísticamente significativas con la susceptibilidad o protección frente a infecciones, sarcoma de Kaposi, y sí se encuentra el alelo HLA-B*27 en una frecuencia aumentada de forma estadísticamente significativa en pacientes con coinfección por virus VIH-1 y virus de la hepatitis C. 3Asociaciones previamente descritas de determinados alelos HLA con la progresión de la infección de VIH se reproducen en este estudio determinando la variación del número de linfocitos CD4 a lo largo del tiempo. 4Se ha encontrado una asociación cercana a la significación estadística del alelo DRB1*01 con la hipersensibilidad a la nevirapina, que se manifiesta preferentemente como reacciones sistémicas. 5El genotipo TT del polimorfismo CYP2B6-516 se encuentra asociado con alta significación con la hipersensibilidad a la nevirapina, especialmente con las reacciones cutáneas. 6De todo lo aquí expuesto, concluimos que la presencia del alelo HLADRB1*01 y especialmente el genotipo TT del polimorfismo CYP2B6-516, parecen jugar un papel relevante en la predisposición a reacciones de hipersensibilidad a la nevirapina en nuestra población. La alta frecuencia en que dichos alelos están presentes en la población de Gran Canaria, hace considerar que ambas determinaciones se deberían realizar en la práctica clínica previa al tratamiento antirretroviral en pacientes con infección por VIH, de la misma forma que ya se viene realizando de manera generalizada con la determinación del alelo HLA-B*57:01. BIBLIOGRAFIA 136 Rossjohn J, McCluskey J. Human leukocyte antigen class I-restricted activation of CD8+ T cells provides the immunogenetic basis of a systemic drug hypersensitivity. Immunity. 2008; 6:822-32. Coiras M, López-Huertas MR, Sánchez del Cojo M, Mateos E, Alcamí J. Dual role of host cell factors in HIV-1 replication: restriction and enhancement of the viral cycle. AIDS Rev. 2010; 12:103–12 Collins KL, Chen BK, Kalams SA, Walker BD, Baltimore D. HIV-1 Nef protein protects infected primary cells against killing by cytotoxic T lymphocytes. Nature. 1998; 391:397–401. 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