Apoptosis, proliferación y su regulación (P53, Bax, Bcl-2, IGF-1R, Ciclina D1) en cáncer de cérvix uterino: predicción de la toxicidad radioinducida del tejido sano

UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA SUBDIRECCION DE TERCER CICLO Y POSTGRADO Reunido el día de la fecha, el Tribunal nombrado por el Excmo. Sr. Magfco. de esta Universidad, y finalizada la defensa y discusión de esta tesis doctoral, los señores miembros del Tribunal, emite?, lq,siguiente ~alificaci$in global: Votos favorables: 2/ Canaria, a 15 de diciembre de 2006 El Presidente: '~r. D. Vic nte Pedraza Muriel i 4 La Secretaria: Dra. Da. Rosa María Apolinario Hidalgo - --" ,-y--'- 2 \b?, ik qu-&c+ k, C.... -.- w_ -- - > El Vocal: Dr. D. Claudio Otón ~áich&- El Vocal: Dr. D. Bonifacio ~icoiawhico La Vocal: Dra. Da Maria Isabe e&+ La Doctoranda: Da. Elisa de los Reyes Bordón Rodríguez DIDa ISABEL MARRERO ARENCIBIA SECRETARIO/A DEL DEPARTAMENTO DE BIOQUI~MICA Y BIOLOG~A MOLECULAR, FISIOLOG~A, GENÉTICA E INMUNOLOG~A DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA, CERTIFICA, Que el Consejo de Doctores del Departamento en su sesión de fecha 20 de octubre de 2006, tomó el acuerdo de dar el consentimiento para su tramitación, a la tesis doctoral titulada "APOPTOSIS, PROLIFERACIÓN Y SU REGULACI~N(P~~,BAX, BCL-2, IGF-IR, Ciclina DI) EN CANCER DE CÉRVIX UTERINO. PREDICCI~N DE LA TOXICIDAD RADIOINDUCIDA DEL TEJIDO SANO" presentada por el/la doctorandola D/Da Elisa Bordón Rodríguez y dirigida por ellla Doctorla Pedro Carlos Lara Jiménez. Y para que así conste, y a efectos de lo previsto en el Art. 73.2 del Reglamento de Estudios de Doctorado de esta Universidad, firmo la presente en Las Palmas de Gran Canaria, a veinte de octubre de dos mil seis. UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA FACULTAD DE CIENCIAS MEDICAS Y DE LA SALUD - Apoptosis, Proliferación y su regulación (P53, Bax, - Bcl-2, IGF-IR, Ciclina DI) en Cáncer de Cérvix uterino. - O O Predicción de la toxicidad radioinducida del tejido sano. Que, para optar al Grado de Doctor, presenta la Licenciada en Biología Da Elisa Bordón Rodríguez D. Pedro Carlos Lara Jiménez, Profesor Titular de Radiología y Medicina Física de la Facultad de Ciencias Médicas y de la Salud de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, CERTIFICA: Que Da Elisa Bordón Rodríguez, Licenciada en Ciencias Biológicas, ha realizado el trabajo de investigación correspondiente a la Tesis Doctoral Apoptosis, Proliferación y su regulación (P53, Bax, BCI-2, IGF-IR, Ciclina DI) en Cáncer de Céwix uterino. Predicción de la toxicidad radioinducida en el tejido sano, que ha finalizado con el mayor aprovechamiento. Revisado el presente trabajo, estima que corresponde fielmente a los resultados obtenidos y queda conforme con su presentación, para ser juzgado por la Comisión que sea designada para su lectura. Y para que conste y surta los efectos oportunos, en cumplimiento de las disposiciones vigentes, extiende y firma el presente Certificado en Las Palmas de Gran Canaria, a 15 de Octubre de 2006. Fdo: Prof. D. ~bdro C Lara Jiménez Director de la tesis Agradecimientos: Al Profesor Dr. Pedro C Lara Jiménez, por su dedicación en el desarrollo de esta tesis sin la cual no podría haberse llevado a cabo. Por una dirección exhaustiva, tanto de los contenidos como en el análisis de los datos. Por su paciencia y ánimo en todo momento y por la pasión a su trabajo que consigue transmitir a todos los que les rodea. A la Dra. Marta Lloret, con quien con su ayuda y conocimientos en cáncer de cérvix ha sido posible el seguimiento de las pacientes incluidas en este estudio y a la Dra. Beatriz Pinar por su ayuda y colaboración en la medida de la toxicidad clínica de las pacientes. Al Dr. Agustín Rey del Servicio de Anatomía Patológica del Hospital Dr. Negrín por su colaboración en los procedimientos histológicos utilizados, así como a Estibaliz Valdés por su colaboración en las técnicas de inmunohistoquímica. A Ana Manzanedo y Ma Teresa Martínez por sus esfuerzos iniciales en la puesta a punto de la técnica de apoptosis en linfocitos y a Carlos Rodríguez Gallego, de la Unidad de Inmunología del Hospital de Gran Canaria Dr. Negrín, por la transmisión de sus conocimientos en las técnicas de citometría de flujo. A Araceli, de la Unidad de Investigación del Hospital de Gran Canaria Dr. Negrín por su participación y consejos en el tratamiento de los análisis estadísticos. A todos mis compañeros del Servicio de inmunología: a Maika Alvarez-Santana y Esther santiago, de la sección de Biología celular, por toda la ayuda recibida en mis inicios facilitando la realización de este proyecto. Al Doctor Florentino Sánchez Jefe del Servicio de inmunología, por su simpatía y cariño facilitando las tareas realizadas en su Servicio. Al personal del Servicio de Oncología Radioterápica del Hospital de Gran Canaria Dr. Negrín por su amabilidad y colaboración desinteresada en todo momento. A todas las pacientes incluidas en este estudio por su apoyo a la investigación y solidaridad participando en un proyecto de mejora en el tratamiento de otros posibles pacientes. Finalmente, a mis amigas quien siempre me han animado a seguir adelante, a mi familia y sobre todo a mi madre sin cuyo sacrificio y apoyo no hubiera sido posible la evolución en mi carrera profesional. CAPITULO I Introducción CAPITULO II Objetivos Generales CAPITULO III Papel de la apoptosis y sus genes reguladores P53, Bax y BCI-2 en cáncer de Cérvix localizado con largo seguimiento. CAPITULO IV IGF-1 R y Ciclina DI en el estudio de la proliferación en el carcinoma de cérvix. Relación con la apoptosis y papel predictivo en pacientes con largo seguimiento. CAPITULO V Predicción de la toxicidad clínica radioinducida en pacientes con cáncer de cérvix localizado mediante el estudio de apoptosis radioinducida en linfocitos de sangre periférica (PBls). CAPITULO VI Predicción de la toxicidad clínica radioinducida en pacientes con cáncer de cérvix localizado mediante el estudio de apoptosis radioinducida en subpoblaciones de linfocitos de sangre periférica (PBls). CAPITULO VI1 Conclusiones Introducción El cáncer de cervix uterino es la sexta neoplasia más frecuente en la mujer, después del cáncer de mama, pulmón, colorecto, endometrio, y ovario. Los datos a nivel mundial indican que todos los años se producen unos 466.000 nuevos casos de cáncer de cérvix en mujeres de todo el mundo donde casi el 80% de ellos se produce en países subdesarrollados debido a que los programas de diagnóstico precoz de la enfermedad están poco extendidos en esos paises. La incidencia de cáncer de cérvix ocupa el segundo lugar, detrás del cáncer de mama, produciendo la muerte de 231.000 mujereslaño (Parking et al 2001). Las tasas de incidencia normalizadas por edad más elevadas se han registrado en Melanesia, África meridional, Centroamérica, África Oriental y América del Sur. En la Provincia de Las Palmas la incidencia de este tumor está por encima de la media nacional. Así en el año 2003, la incidencia del cáncer de cérvix fue similar a la del cáncer de endometrio, con una prevalencia de 10/100.000 mujereslaño (National Cancer institute 2003) El carcinoma de cérvix uterino es el más frecuente en mujeres que iniciaron relaciones sexuales a edad temprana, aquellas con historia de promiscuidad, o las que tuvieron un número elevado de gestaciones y en aquellas que han padecido otras enfermedades de transmisión sexual (Cannistra et al 1996). En un estudio realizado en la india (Agarwal et al, 1992), se analizaba la influencia del factor masculino, observándose que el riesgo de presentar carcinoma cervical era mayor cuando el marido había mantenido relaciones previas al matrimonio o extramaritales con 3 o más mujeres, y cuando tenia historia de enfermedades de transmisión sexual. Por otro lado, la circuncisión del varón está asociada con un bajo riesgo de que la pareja padezca cáncer cervical (Castellsague et al 2002). El cáncer de cérvix es relativamente frecuente en mujeres jóvenes, siendo la edad de mayor incidencia del tumor invasivo entre los 45 y 60 años. La edad media en 436 casos registrados entre 1994 a 2003 Introducción a los otros dos tipos morfológicos. El adenocarcinoma endometrioide representa el 30% de los adenocarcinomas cervicales. Histológicamente son similares al adenocarcinoma endometrial típico, por lo que se deberá hacer el diagnóstico diferencial con la invasión endocervical de este tumor. Otros tumores epiteliales son el adenoescamoso, el de células esmeriladas, mucoepidermoide, linfoepitelioma-like y neuroendocrino. 6. FACTORES PRONOSTICOS CLASICOS 6.1 Edad No se ha llegado a un acuerdo sobre el valor pronostico de la edad en el carcinoma de cérvix. En un estudio realizado en 1300 pacientes con carcinoma de cérvix el pronóstico era el mismo en mujeres menores que en pacientes mayores de 40 años (Berkowitz et al 1979, Kyriakos et a11 971 ). Otros autores han observado un descenso en la supervivencia en mujeres menores de 35 (Prempree et al 1983) o 40 años (Dattoli et al 1989) que tenían una mayor frecuencia de tumores pocos diferenciados. Esta contradicción puede explicarse por el análisis de Rutledge et al que demostró una interacción entre la edad y el estadío en 250 pacientes menores de 35 años elegidos al azar e individuos controles (Rutledge et al 1992). Mitchell et al 1998 evaluó 398 pacientes en estadío I y III de carcinoma cervical tratados con radioterapia. Los pacientes se dividían en dos grupos, uno con pacientes de 35 a 69 años y otro mayor de 70 años. Aunque la supervivencia libre de enfermedad a los 5 años y la supervivencia causa específica eran comparables en los dos grupos, la recidiva tumoral y muerte por cáncer era más frecuente en el segundo grupo de pacientes (Mitchell et al 1998) 6.2 Anemia. Diversos estudios han corroborado el impacto pronóstico de la anemia en cáncer cervical sin embargo, los mecanismos patofisiológicos son controvertidos. Algunas investigaciones han encontrado que la anemia tiene un impacto independiente en el pronóstico en el análisis multivariante (Petersen et Introducción al 1995, Grogan et al 1999, Caro et al 2001). Otros investigadores encuentran que la significancia pronóstica de la anemia resulta de una asociación entre la anemia y el volumen tumoral y que la anemia no ejerce un impacto independiente (Fyles et al 2000). En un estudio retrospectivo realizado en 7 centros de Canadá se observó que la anemia durante la radioterapia era más importante que los niveles de Hb pretratamiento y que no hay diferencias entre los niveles de Hb que aumentan espontáneamente y los niveles de Hb después de las transfusiones (Grogan et al 1999). En el estudio de Dunst et al 2003 en 87 pacientes con cáncer de cérvix, el nivel de hemoglobina durante la radioterapia fue el factor pronóstico más importante para la supervivencia y control local de la enfermedad (Grogan et al 1999).De todas formas, todavía no sabemos con exactitud como la anemia puede impactar en el pronóstico de la enfermedad. 6.3. Volumen tumoral. En general, el estadío clínico sigue siendo el factor pronóstico independiente más relevante en la mayoría de estudios realizados. Sin embargo, existen otros factores dependientes de las características del tumor, que están adquiriendo importancia en los últimos años y que están siendo objeto de estudio. Los más importantes son el volumen tumoral, grado histológico, la invasión estromal y la presencia o ausencia de ganglios afectos. El diámetro clínico del tumor está fuertemente correlacionado con el pronóstico en pacientes tratadas con radiación o cirugía. Son numerosos los estudios publicados que tratan de relacionar el tamaño y el volumen tumoral, con el pronóstico de la paciente (Dubben et al, 1998), mostrándose como factor independiente de supervivencia en el análisis multivariante en algunos de ellos (Landoni et al, 1995, Ogino et al, 1997). La importancia del tamaño tumoral motivó, que en la revisión de la clasificación de la FlGO de 1995, se subdividiera el estadío IB en función del tamaño del tumor debido a las implicaciones pronósticas, tanto por la mayor incidencia de metástasis ganglionares y extrapélvicas como por la menor supervivencia (Rotman et al, 1981 ; Álvarez et al, 1989). Introducción En un estudio reciente se analizaron 179 pacientes con carcinoma cervical avanzado tratados con radioterapia observándose que el volumen tumoral se asociaba de forma significativa con la supervivencia global en el análisis multivariante (P=0.004)( Narayan et al 2006) 6.4 Grado de Diferenciación. La relación entre la supervivencia y el grado de diferenciación en el carcinoma escamoso y el adenocarcinoma es controvertida. Aunque Swan y Roddick (1973), Reagan y Fu (1979) demostraron el valor pronóstico del grado histológico en pacientes tratados con irradiación, otros como Goelner et al (1976), y Crissman et al (1987) no observaron ninguna relación con la supervivencia. Alfsen et al analizaron 47 7 pacientes con adenocarcinomas y 88 con carcinoma , D de células no escamosas de cérvix observando que el carcinoma de células E pequeñas era el único subgrupo con importancia pronostica independiente en 3 - 0 pacientes con adenocarcinomas de cérvix uterino (P<O.OOl ) (Alfsen et al 2001 ) m O 4 6.5. Histología. Con la excepción de algún tipo morfológico específico los resultados sobre el - m O tipo histológico como factor pronóstico continúan siendo controvertidos. Normalmente se considera que los adenocarcinomas tienen un peor pronóstico que los carcinomas escamosos (Davy et al 2003). De igual forma, el carácter desfavorable adscrito a los tumores de tipo adenocarcinoma no ha podido ser unifomemente demostrado (Hopkins et al, 1991; Shingleton et al, 1995) sin embargo, en estadíos precoces 1-IIA parece existir unanimidad en cuanto a su valor pronóstico. 6.6. Afectación ganglionar. El estado de los ganglios linfáticos, tiene una importancia significativa en la progresión de la enfermedad y en la supervivencia (Stehman et al 1991). - Ganglios parametriales: la enfermedad parametrial con ausencia de ganglios pélvicos positivos tiene escasa repercusión en la supervivencia (72% a los 5 Introducción años) pero si se asocia a la afectación ganglionar pélvica la supervivencia se reduce en un 44%. La combinación de afectación parametrial y ganglios pélvicos positivos reduce la supervivencia alrededor de un 50% comparada con pacientes con ganglios negativos y sin afectación parametrial. - Ganglios pélvicos: En el estadío IB, la presencia de ganglios pélvicos afectados, reduce la supervivencia en un 32%, de una supervivencia media del 89% para los ganglios negativos a un 57% cuando son positivos. El impacto en la supervivencia depende prioritariamente del número, localización y resecabilidad de los ganglios. En el estudio realizado por Uno et al el estado de los ganglios pélvicos tuvo un impacto significativo en la supervivencia. La supervivencia global a los 5 años en pacientes con ganglios positivos y negativos fue de 52% y 89% respectivamente (P=0.0005). La supervivencia libre de enfermedad a los 5 años en pacientes con ganglios negativos, uno positivo y dos o más positivos fue de 83%, 61% y 31% respectivamente (P=0.0001) (Uno et al 2005) - Ganglios aórticos: la presencia de ganglios aórticos afectados ejerce un fuerte efecto en la supervivencia de forma más pronunciada que en el caso de ganglios pélvicos. La baja supervivencia de las pacientes está de algún modo relacionada con el tamaño del tumor pélvico. Fundamentalmente las metástasis paraórticas confieren un pronóstico desfavorable (supervivencia a 5 años 2040 '/o) 6.7. Afectación endometrial. Se ha encontrado que el carcinoma de cérvix se extiende dentro del segmento uterino inferior y la cavidad endometrial en el 10% a 30% de los pacientes (Mitani et al 1964, Pérez et al 1981). Pérez et al demostraron un descenso en la supervivencia y mayor incidencia de metástasis, en aquellas pacientes con afectación endometrial por invasión del estroma endometrial o reemplazamiento del endometrio normal por carcinoma cervical, confirmando las observaciones publicadas por Mitani et al en 1964. (Perez et al 1998) Introducción 6.8. Invasión estromal En el estudio de Delgado et al (1989) se observa relación entre la profundidad de la invasión estromal y la supervivencia, siendo del 86-94% en aquellos <lOmm, 71-75% entre 11-20mm y del 60% para los >20mm. Samlal et al (1997) confirmaban estos resultados en una serie de pacientes con estadíos IB-IIA con ganglios negativos (p<O.Ol). Sin embargo, cuando se analizaban las pacientes con ganglios positivos, la invasión estromal perdía significación en el análisis multivariante. 6.9. Invasión vascular linfática. No se considera un factor de gran relevancia pronóstica. En una revisión de 25 estudios evaluando un total de 6500 pacientes, solo tres de ellos pudieron demostrar que la invasión vascular linfática era un factor de riesgo independiente (Creasman et al 2004). La presencia o ausencia de dicho factor no implica a la metástasis linfática (Memarzadeh et al 2003). 7. FACTORES PRONOSTICOS BIOLÓGICOS 7.1 PROLIFERACI~N CELULAR El cáncer es una proliferación descontrolada de células con anomalías en su material genético. La proliferación celular está sometida en primer término a la presencia de factores externos (factores de crecimiento, interacciones con otras células, nutrientes). Los factores de crecimiento son generalmente proteínas que actúan mediante uniones de alta afinidad a receptores cuya función principal es la del control externo del ciclo celular, mediante el abandono de la quiescencia celular (Go) y la entrada en la fase Gl, pudiendo realizar su función como inductores (IGF-1) o supresores (TGFb) de la proliferación celular, a través de la promoción de la diferenciación celular, la movilidad y la adhesión celular entre otros. Estos factores actúan sobre otros elementos celulares por mecanismo endocrino, paracrino o autocrino. Una vez unido el factor de crecimiento a su receptor se inicia una cascada de procesos bioquimicos, denominados lntroduccion sistemas de transducción de señales, que permiten gracias a la actividad quinasa del receptor, la llegada de esta señal proliferativa hasta el núcleo, donde por inducción de la expresión de diversos mediadores incluidas las ciclinas especialmente la ciclina D, se favorece la proliferación celular. Sin embargo, cuando la señal proliferativa llega al níicleo, la división celular está regulada por los puntos de control o check-points del ciclo celular, que impiden la progresión de células dañadas y mantienen la homeostasis celular. El ciclo celular se divide en fases: La fase S y la fase M son fases que corresponden a la síntesis de DNA y mitosis que están separadas por la fase Gl (fase de crecimiento plástico de la célula) y G2 (fase de preparación para la división celular). Existe una gran variedad de proteínas que controlan y coordinan el ciclo celular. Las principales son las quinasas dependientes de ciclina (CDKs), que consisten en dos subunidades, una catalítica con actividad quinasa, que permite fosforilar proteínas produciéndose cambios en su actividad o estructura y una subunidad de unión al sustrato (Ciclinas). Las ciclinas son necesarias en diferentes momentos del ciclo celular, fluctuando sus niveles en las distintas fases. El proceso central en la regulación de este punto de control o "restriction checkpoint" es la fosforilación o desfosforilación de la proteína codificada por el gen retinoblastoma (Rb). Cuando Rb está hipofosforilada, inhibe a E2F, evitando que éste induzca la expresión de genes que regulan la síntesis de DNA. La fosforilación de Rb conlleva alteraciones, que impiden su unión y por tanto la inhibición de E2F, quedando esta libre para promover la síntesis de DNA. Este punto de restricción R está regulado por las CDKs, reguladadas a su vez por inhibidores (CDKls) y otros moduladores. p21 (WAFIICIP), p27 (KIPI) y p57 (KIP2) inhiben tanto los complejos ciclina D-CDk416 como a los complejos ciclina E-CDk2 y ciclina A-CDk2. p16 (INK4a), p15 (INK4b), p18 (INK4c) y pl9(INK4d), interfieren de forma más selectiva sobre los complejos ciclina D-CDK416. La síntesis de ciclina D es inducida por factores de crecimiento y disminuida por inhibidores de la proliferación. La formación del complejo ciclina D-CDK416 provoca la fosforilación de Rb (completada posteriormente por ciclina E-CDK2) liberando E2F. Además el complejo ciclina D-CDK416, secuestra a los inhibidores de CDK2, lo que reduce el efecto inhibidor de los inhibidores de Introducción ciclinas sobre la ciclina E-CDK2, incrementando la capacidad de fosforilación de CDK2 sobre Rb y favoreciendo la proliferación celular. 7.1.1 PROLIFERACION TUMORAL Y RADIOTERAPIA La proliferación celular durante la radioterapia provoca que la prolongación del tiempo de tratamiento global esté asociado con un peor control tumoral en carcinomas de cabeza y cuello (Withers et al 1988, Wilson et al 1995) y cérvix uterino (Fyles et al 1992, Lanciano et al 1993). La medida del índice de proliferación turnoral pretratamiento (Fowter et al 1992, Tsang et al 1995), como un parámetro que refleja la extensión de la repoblación tumoral durante la radioterapia fue propuesto para identificar pacientes que pueden ser tratados D con radioterapia acelerada (Tucker et al 1990). E La repoblación del tumor durante el tratamiento sadioterápico reduce la tasa de 3 - 0 control tumoral inducido por la irradiación, ya que hasta un tercio de la m O 4 radiación administrada en cada fracción de radioterapia se emplea en controlar la repoblación tumoral acaecida desde la fracción administrada el dia anterior; por ello en los tumores altamente proliferativos este fenómeno será más = m O relevante obteniéndose peor control tras irradiación. - La proliferación tumoral continúa durante la irradiación, siendo la tasa de a n - repoblación al menos tan rápida, corno la estimada antes de iniciar el O O tratamiento mediante Tpot (tiempo potencial de duplicación) (Durand, 1997). Se han desarrollado estudios sobre el índice de proliferación pretratamiento mediante diferentes técnicas: por citometría de flujo y marcaje con BrdUrd se analiza la ploidía, fracción de crecimiento tumoral (fracción de fase S), tiempo potencial de duplicación celular (Tpot); por inmunohistoquímica se detectan proteínas de proliferación endógenas como Ki67 , antígeno nuclear celular proliferante (PCNA) o mediante el uso de la tinción con hematoxilina-eosina (IM). En los estudios de Tsang et al y Bolger et al se demostró una tendencia a menor supervivencia y a recidiva local en aquellas pacientes con un Tpot corto (Tsang et al, 1995 y Bolger et al, 1996) sin embargo, en un estudio posterior en donde se midió la incorporación de bromodeoxiuridina y Tpot por citometría de flujo, en 101 pacientes con cáncer de cérvix, se observó que ninguno de los Introducción parámetros de proliferación pretratamiento tenía significancia pronóstica con la respuesta clínica en el análisis univariante y multivariante (Tsang et al 2003). Los estudios realizados mediante Tpot han resultado mayoritariamente ineficaces para predecir adecuadamente el curso clínico de los pacientes ya que la proliferación celular está equilibrada por la pérdida celular y esta medida no tiene en consideración las pérdidas celulares del tumor (streel et al 1977). Por otro lado la citometría de flujo dificulta el análisis de los resultados al no poder separarse adecuadamente las células pertenecientes al tejido sano de las células que componen el tumor (particularmente en tumores diploides) (Begg et al 1985, Tsang et al 1999, Bergstrom et al 1999). Los estudios de inmunohistoquímica, permiten el contaje de la proliferación exclusivamente en las células tumorales, bajo la visión directa de la preparación por el investigador. De este tipo de estudios la determinación de la proliferación celular mediante la determinación de la expresión de la proteína Ki67 es una de las mas exploradas. El antígeno Ki-67 es una proteína nuclear de 395 a 345 KD expresada en células en G1, S, G2 y M pero ausente en células en GO. Este hecho permite que tras su determinación en el tumor pueda ser estimada la fracción de crecimiento del tumor. Los pacientes que presentan un alto porcentaje de células tumorales proliferantes (Alto porcentaje de fase S combinado con una alta fracción de crecimiento medida por PCNA) tienen una peor respuesta a la radioterapia, particularmente si el tumor es lo suficientemente radioresistente como para que la proliferación se mantenga incluso durante el tratamiento (Durand et al 2004). La relación entre proliferación tumoral (medida mediante la expresión de ki67) extensión tumoral (local, ganglionar), y supervivencia, se ha estudiado mediante los anticuerpos frente a Ki67 en carcinoma de cérvix (Tabla 2) Introducción TABLA 2: Relación entre proliferación (estimada mediante ki67), factores pronósticos clásicos y supervivencia en carcinoma de cérvix. Grado 1 1 Histolóai Dos estudios han demostrado relación entre expresión de Ki67 y extensión local o ganglionar de la enfermedad (Garzetti et al, 1995, Lloret et al 2000). En relación a la supervivencia, los resultados no son concluyentes, ya que en cinco estudios los niveles elevados de Ki67 se asociaron a peor supervivencia (Garzetti et al, 1995; Chung et al, 1994,Padovan et al 2000, Ho et al 2000, Liu et al 2001), en tres la relación fue inversa (Nakano et al, 1998; Pillai et al, 1998, Suzuki et al 2000), y en la mayoría no se pudo demostrar relación entre Ki67 y supervivencia (Camacho et al 1997, Lloret 2000, Davidson et al 2000, Graflund et al 2002,Putte et al 2004 y otros). En el estudio de Oka et al, Ki67 a los 9 Gy se relacionaba con la supervivencia global (P=0.025) supervivencia libre de enfermedad (P=0.024) y metástasis libre de supervivencia (P=0.045) siendo Cole(l992) Garzetti (1 995) Levine(1995) Camacho(l997) Nakano (1 998) Pillai (1 998) Lloret (2000) Oka (2000) Padovan (2000) Davidson (2000) Ho (2000) Suzuki (2000) Liu (2000) Graflund (2002) Kamer (2003) Van de pute (2004) * a 9GY de dosis. (1) 28 57 66 35 64 152 65 75 86 49 97 67 124 141 23 221 Grado 2 No No Si (1) No vs 3 No Si N o Si No No No Peor No No Mejor Mejor No Mejor* Peor No Peor Mejor Peor No no Introducción Ki67 a los 9Gy un factor predictivo de buen pronóstico en pacientes con carcinoma de células escamosas. (Oka et al, 2000) En el estudio de Padovan et al se observó una relación entre el estadío y la expresión de Ki-67. La mayoría de los pacientes en estadío lb eran negativos para ki67 y por el contrario todos los casos con estadío IV eran positivos para Ki-67 (Padovan et al 2000). En el estudio preliminar de nuestro grupo (Camacho et al, 1997) sobre 35 pacientes con carcinoma de céwix observándose una tendencia a una correlación entre el grado histológico y la expresión de ki67, sobretodo entre los grados II vs grado III. El índice medio de expresión del marcador fue del 32.46% para los adenocarcinomas, significativamente más bajo que para los carcinomas epidermoides (48.4%), lo cual podría justificar la diferente conducta y respuesta a los tratamientos entre ambos tipos histológicos. En el estudio posterior de nuestro grupo (Lloret, 2000) sobre una serie de 65 casos los tumores epidermoides son más proliferativos y muestran menores tasas de apoptosis que los adenocarcinomas. Estos resultados son similares a los del estudio de Oka en 1996 (Oka et al, 1996). En el estudio de Lloret et al, en 65 pacientes con carcinoma de cervix, la proliferación tumoral estimada mediante Ki67 fue Útil, junto con el estadío, para predecir la respuesta a la irradiación y el control local de las pacientes (Lloret et a1,2000) demostrando ser un método fiable en la predicción de respuesta y control local para los tumores tratados con radioterapia. 7.1.2. PROTEINAS REGULADORAS DE LA PROLIFERACI~N CELULAR Son muchos los genes relacionados con la regulación de la proliferación celular en los proesos neoplásicos. En esta introducción nos centraremos en el análisis de dos modelos adecuados y poco estudiados en carcinoma de cervix uterino como son por un lado un receptor de un factor de crecimiento como es IGFI-r y por otro de I efector mas importante de esa cadena de transducción de señales desde el receptor hasta el núcleo que son las ciclinas pero especialmente la Ciclina DI. Introducción El fenómeno se puede observar con microscopio óptico con tinción de hematoxilina-eosina (Kerr et al, l972), aunque también se puede estudiar por métodos más complejos (microsocopio electrónico, citometría de flujo, ruptura de DNA). En la apoptosis la célula sufre el daño principalmente en el núcleo, sin producirse reacción inflamatoria, y ocurre generalmente de forma aislada, afectando a ciertas células de forma selectiva.(Mikulski, 1994). Se caracteriza por ser un proceso biológico ordenado que resulta necesario para evitar la sobreproducción celular siendo de vital importancia durante la morfogénesis. El término apoptosis y muerte celular programa son a menudo utilizados como sinónimos sin embargo, hay otros procesos de muerte celular como son la autofagia y la necrosis en los que se han identificado a nivel molecular componentes que justifican la existencia de un programa de ejecución. A pesar de la idea de que la muerte celular programada genéticamente requiere la síntesis proteica, todos estos programas (apoptosis, autofagia, necrosis) parecen estar ya listos para ser ejecutados, lo que sugiere que la definición de muerte celular programada englobaría todos los casos. (Lockshin 2001) Durante la necrosis, a diferencia de la apoptosis, la muerte va acompañada de un aumento del volumen celular, vacuolarización del citoplasma, aumento de la permeabilidad de la membrana plasmática y lisis nuclear sin fragmentación específica de la cromatina. Esta forma de muerte celular se produce en respuesta a daños importantes causados por isquemia e hipoxia severas, o por exposición a dosis elevadas de compuestos genotóxicos que afectan al metabolismo energético celular. La muerte celular por autofagia es un proceso menos estudiado que se caracteriza por la destrucción de componentes celulares dentro de la célula en vacuolas autofágicas. Las características morfológicas de la autofagia incluye vacuolarización, degradación de contenido citoplásmico y ligera condensación de la cromatina (Fink SL et al 2005) La apoptosis se puede iniciar en cualquier fase del ciclo, dependiendo de la célula y del tipo de estímulo. Introducción 7.2.1 APOPTOSIS Y PROTEINAS REGULADORAS El proceso de apoptosis tiene una regulación compleja. En principio, cualquier célula tiene potencialidad de sufrir apoptosis, produciéndose una interacción entre la célula y elementos externos o internos a la misma, cuyo resultado es la muerte celular. La pérdida de integridad de las uniones intercelulares, hormonas y factores de crecimiento, los impactos ambientales como agentes químicos, radiaciones ionizantes e isquemia, y el sistema inmune, son algunos de los desencadenantes extracelulares de apoptosis. Estos agentes actúan a través de receptores de membrana, receptores intracelulares o produciendo un daño directo nuclear, dando lugar a la liberación o inhibición de reacciones intracelulares que conducen a la fragmentación del material genético y a la muerte celular (Raff 1992). Existen decenas de genes implicados en la apoptosis, especialmente factores de transcripción, proteasas e inhibidores de proteasas. Los genes cuya expresión promueve la supervivencia celular, disminuyendo la susceptibilidad de apoptosis, se llaman oncogenes, destacando entre ellos BCL-2, y aquellos que inducen apoptosis, se les denomina genes supresores, entre los que destaca P53 y el gen del retinoblastorna (RB). La mutación, sobreexpresión o ausencia de estos genes, pueden provocar un desequilibrio en el destino celular, de forma que una célula sana podría ser eliminada erróneamente, mientras que una célula con aberraciones genéticas podría quedar protegida, perpetuándose en su descendencia las mutaciones, potencialmente carcinogénicas. Así, anomalías o ausencia de bcl-2 podrían dar como resultado un acortamiento inadecuado de la supervivencia celular, o su sobreexpresión un alargamiento de la misma, mientras que mutaciones o ausencia de p53 producirían una ausencia de muerte celular por apoptosis. De forma simple nos referiremos a continuación a los genes que regulan de forma mas inmediata el proceso de apoptosis inducido por la radiación y otros factores externos. Así el daño nuclear inducido detyerminará la expresiópn nde P553 y su mensaje apoptótico será alentado por BAX y contrarrestado por BCL-2. Introducción P53 . Es una de las principales proteínas relacionadas con los mecanismos de regulación de "puntos control" o Check-points del ciclo celular, que centraliza la coordinación de otros procesos relacionados con el daño celular como son, la reparación de daños en las bases o roturas dobles de cadena, la progresión del ciclo celular y la muerte por apoptosis. Es comúnmente denominado el "guardián del genoma" porque mantiene la estabilidad genética celular (Levine AJ et al 1997). Su relación con el cáncer es conocida por la alta frecuencia de alteraciones observadas (más del 50% de los tumores muestran alteraciones en p53), como por la frecuencia de aparición de tumores en personas con mutaciones germinales de p53 (Síndrome Lifraumeni). Además, en tumores que no muestran mutaciones del gen, la función de la proteína puede estar alterada debido a su secuestro citoplasmático por oncoproteinas virales (HPVE6) (Morris SM et al 2002). Es una proteína de 393 aminoácidos cuyo gen codificador se encuentra en el cromosoma 17. Puede ser dividida en varios dominios discretos (May P and May E, 1999). En el domino N-terminal se encuentran: 1 .- Dominio transactivador (TA) en el N-terminal, en el cual las interacciones entre proteínas, facilitan o bloquean la capacidad de transactivación de p53. 2.- Región poliprolina que podría mediar las funciones apoptóticas de p53 y la supresión de crecimiento celular independiente de transcripción. 3. - Nuclear Export Signal (NES) relacionada con el transporte de p53 desde el núcleo al citoplasma para su degradación mediada por MdM-2. El dominio central contiene la secuencia especifica de unión al DNA, que permite la unión de p53 con los sitios promotores de genes diana como p21 (WAFIlCipl). Además, aquí se encuentran las cuatro regiones conservadas que regulan las interacciones proteína-DNA. En esta región ocurren por encima del 90% de las mutaciones identificadas en cánceres humanos. Algunas mutaciones limitan la actividad de transcripción de p53 y otras tienen la capacidad de transactivar genes específicos como c-Myc, (proliferación celular), MDR-1 (resistencia a drogas), tolerancia al estrés celular, radioresistencia relacionada con mejoras en la capacidad de reparación del DNA o inhibición de la apoptosis (Sigal et al 2000) Introducción En este dominio, además se producen uniones a otras proteínas, bien inhibidoras de la acción de p53 (SV40 Large T antigen protein) favorecedoras de la misma (p53BPl12) o proteínas de reparación (BRCAI, BLM y Rad51) facilitando la reparación homóloga (HR) de las roturas dobles de cadena (dbs) del DNA inducidas por la irradiación. El dominio C-terminal, incluye un dominio de oligomerización que permite la óptima configuración de p53 en forma de tetrámeros, una región de señalización de localización nuclear (NLS) relacionada con la translocación de p53 desde el citoplasma al núcleo, tras la inducción de un daño en el DNA y una región de unión con secuencias no específicas de DNA y roturas dobles de cadena inducidas por radiación ionizante, permitiendo el reconocimiento del DNA dañado y favoreciendo su papel en la reparación del daño mediado por XPD, XPB, BLM, Rad51 etc (Cuddihy and Bristol, 2004) La regulación de p53 en condiciones basales, muestra bajos niveles de la proteína (denominada "salvaje", Wild-Type), con una vida media corta (10-20 minutos). Este rápido recambio, viene controlado por la proteolisis inducida por Mdm-2. En caso de daño al DNA, p53 se acumula y activa, desarrollándose un estrecho sistema de regulación (Ashcroft et al 1999) La proteína BCL-2 consta de 239 aminoácidos y su gen codificador está en el cromosoma 18.Contiene cuatro dominios de hornología estructuralmente conservados. BHI, BH2, y BH3 se requieren para interaccionar con otros miembros de la familia BCL-2, mientras que el dominio BH4 media las funciones de control del ciclo celular. El dominio transmembrana (TM) se requiere para la localización subcelular de BCL-2 y es de gran importancia para su función (Belka C and Budach W 2002). En condiciones normales, los niveles de BCL-2 descienden cuando las células están maduras o en situación de poder ser eliminadas, mientras que se expresa en células que deben sobrevivir, como las células hematopoyéticas precursoras y las células del sistema nervioso. BCL-2 tiene un importante papel en la embriogenesis, donde la mayoría de las células expresan niveles elevados de BCL-2 (Jacobson et al 1997).En general, las células que expresan BCL-2 bloquean la apoptosis, por lo tanto promueven la supervivencia celular, facilitando la adquisición de mutaciones y la transformación maligna (Vaux et al, 1988; Pezella y Gatter, Introducción 1995). Una característica de BCL-2 es que inhibe la apoptosis sin estimular la proliferación celular (Hockenbery et al, 7991) mediante el bloqueo del citocromo C liberado por la mitocondria durante la ruta de apoptosis mitocondrial (Brustugun et al, 1998) BAX (bcl-2 associated X protein) es una proteína cuyo gen codificador está en el cromosoma 19. Aunque posee una alta homología con la proteina BCL-2 carece del dominio BH4. Participa en la ruta de apoptosis mitocondrial induciendo la liberación del citocromo C. Se ha observado que BAX se asocia con el complejo del poro de la mitocondria (PT) que participa en la regulación del ca2'de la matriz, PH, potencial de membrana mitocondrial etc. La proteina BAX se une a un componente de este complejo (transportador nucleótido adenina, ANT) induciendo la apertura del poro con la consiguiente rotura del potencial de membrana mitocondrial y liberación de moléculas pro-apoptóticas como el citocromo C (Marzo et al 1998, Narita et al 1998, Susin et al 1999). BCL-2 interactua con BAX a nivel de la mitocondria modulando la inactivación de BAX a través de la heterodimerización. Cuando la proteína BCL-2 está en exceso, forma homodímeros BCL-2BCL-2 y heterodímeros de BCL-2 -BAX, estando la célula protegida de la apoptosis, pero cuando BAX está en exceso dominan los hornodimeros BAXBAX y la célula es susceptible de apoptosis (Petros et al 2004) I Introducción m mediante PCNADN A polimei m B Lloret 2000 7.2.2. APOPTOSIS Y CANCER Se puede establecer relación entre apoptosis y cáncer al menos en cuatro aspectos: oncogénesis, homeostasis tumoral, respuesta al tratamiento con iinterapia y pronóstico de la enfermedad. 9" '01 2.2.1 Apoptosis y Oncogénesis 3 i EI( crecimiento de una célula maligna se debe en parte a que los genes re~~uladores de la apoptosis se encuentran alterados. Las células con ad~ma~ías en su material hereditario, no pueden ser eliminadas por apoptosis, pepetuando en su descendencia. Estas células anómalas proliferan más de lo qub mueren, lo que da lugar al crecimiento tumoral. sdegusa et al (1995) observó una mayor expresión de la proteína BCL-2 en CI~ III que en ClNllll o carcinoma invasivo de células escamosas de cérvix. En 1 el ,estudio de Giarnieri et al (2000), se estudió los efectos de los distintos m+cadores genéticos por inmunohistoqulmica, en la progresión del carcinoma ddcelulas escamosas cervical. Se observó sobreexpresión de P53 en el 28.6% Introducción de los carcinomas no invasivos y 69.6% de los invasivos (P<0.02). La sobreexpresión de BCL-2 se detectó en 14.3% de los no invasivos y 65.2% de los invasivos (P<0.003). Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en la expresión de BAX en estos dos tipos de lesiones. En un estudio posterior realizado por Cheung et al (2002), no se encontró ninguna diferencia entre la expresión de la proteína BCL-2 y neoplasia cervical premaligna y maligna. Grace et al (2003) analizaron la coexpresión de las protehas P53 y BCI-2 en 105 pacientes con carcinoma de células escamosas de cérvix inducidos por HPV. El análisis estadístico mostró una correlación positiva y significante entre los niveles de expresión proteica y los diferentes estadíos, desde displasia media a cáncer invasivo (P=0.00001 respectivamente). Se observó una correlación positiva entre la expresión de P53 y BCL-2 y la infección por HPV además, el estudio mostró una correlación directa (P=0.00001) entre la expresión de P53 y BCL-2 sugiriendo que la co-sobreexpresión de estas proteínas en cáncer cervical estaba asociada al HPV. 7.2.2.2 Apoptosis y Homeostasis Tumoral. El crecimiento tumoral es el resultado del balance entre el número de células procedentes de la división celular y la pérdida celular, fundamentalmente por apoptosis o necrosis, debida a deprivación de oxígeno o nutrientes, muerte mitótica, muerte inmunológica, exfoliación o metástasis (Kerr et al, 1972; Wyllie et al, 1980; Fukuda et al, 1993, Levine et al, 1995). En general, el crecimiento tumoral se deberá a mitosis, mientras que la reducción tumosal será debida a apoptosis (Wheeler et al, 1995). Existe una relación directa entre proliferación y apoptosis en los tejidos neoplásicos. La relación apoptosis-mitosis se ha observado en carcinoma de cérvix (Levine et al, 1995; Isacson et al, 1996; Tsang et al, 1999). Se ha encontrado relación directa entre el índice de apoptosis (IA) y el índice de mitosis (IM), siendo el IA generalmente mayor o igual que el IM (tal vez porque la mitosis se completa antes que la apoptosis y por tanto se infracuantifican) (Stauton y Gaffney, 1995). La cuantía de la apoptosis también depende del patrón histológico. En Introducción los tumores de cérvix los adenocarcinomas presentan un mayor IA que los carcinomas epidermoides (Levine et al, 1995; Wheeler et a1,1995 ; Tsang et al, 1999). Nuestro grupo ha realizado estudios de apoptosis/proliferación en tumores de laringe, mama y vejiga, comprobando que los tumores altamente proliferativos tienen un índice elevado de apoptosis (Lera et al, 1998; Pérez et al, 1998; Lara et al, 1999). En el estudio de Lloret, se analizaron una serie de 65 pacientes con carcinoma de cérvix con distinto tipo histológico sin observarse relación directa entre apoptosis/proliferaciÓn aunque se observaron mayores tasas de apoptosis en los tumores con mayor extensión local (estadío clínico), de la misma forma a lo observado para la proliferación estimada mediante Ki67 (estadío clínico) o IM (tamaño tumoral) (Lloret, 2000). En los estudios recientes se observa una relación entre la tasa de proliferación y la tasa de apoptosis (Zanotti 2003, Reesink et al 2005). El papel que juega la apoptosis/proliferación durante la evolución desde displasia cervical a carcinoma invasivo, ha sido motivo de estudio. De forma general se aprecia que existe una relación directa entre apoptosis y grado de displasia de forma similar a la proliferación (Tabla 4). TABLA 4: Relación entre apoptosis, proliferación y grado de displasia cervical. Sheets (1 996) Levine (1 995) lsacson (1 996) Shoji (1996) - Zanotti (2003) I I I "Solo en lesiones CIN No Ptes 42 66 8 1 191 30 Reesink (2005) I I I Para Sheets et al(1996), el grado de displasia cervical se relacionaba de forma inversa con la apoptosis mientras que para la mayoría de los autores se producía una relación directa (lsacson 1996, Shoji 1996, Reesink 2005) . En Apoptosis/grado lesión Inversa (pc0.001) Directa Directa Directa Directa 1 79 Santoprieto (2006) Proliferación/grado lesión Directa Directa No Directa 232 Directa Directa Directa Directa* Introducción cuanto a la relación entre el grado de lesión y la tasa de proliferación, la mayoría de los estudios observan una relación directa (Isacson 1996, Zanotti 2003). En el estudio de Reesink, además de observarse una relación directa de los marcadores de apoptosis y proliferación con el grado de la lesión, se observa una baja tasa de células proliferativas en las lesiones de cáncer cervical comparado con las lesiones CIN III. Cuando la tasa apoptosis/proliferación se calculó de forma separada para cada una de las lesiones y cáncer cervical, el porcentaje era mayor en cáncer cervical que en las lesiones CIN (P<O.OOl) indicando que el desequilibrio producido entre la tasa de proliferación y apoptosis era menor en las muestras de cáncer cervical. Estos resultados sugieren que las lesiones de CIN mayores y las muestras de cáncer cervical, no han perdido su capacidad apoptótica sino que han ganado capacidad proliferativa (Reesink 2005) Santoprieto et al (2006) analizaron el IA y IM en 232 biopsias de pacientes con neoplasia intraepitelial cervical. Los valores de apoptosis y proliferación eran elevados en lesiones de alto grado, pero solo el IM era un predictor independiente de CIN III en el análisis multivariante 7.2.2.3Apoptosis y Radioterapia. - Apoptosis y pronóstico en cáncer cervical. La tasa de apoptosis inducida por una dosis de radiación ionizante está relacionada directamente con la apoptosis espontánea (Meyn et al, 1993). Existe además, una heterogeneidad de la respuesta apoptótica en los distintos tumores (Meyn et al, 1993). Kelland y Steel (1988) analizaron la respuesta a la irradiación de 5 líneas conocidas de carcinoma de cérvix, utilizando distintas tasas de dosis (1 6, 32 o 150 cGyImin), encontrando diferencias significativas en la radiosensibilidad de estas líneas celulares. La tasa de apoptosis de un tumor antes del tratamiento puede tener implicaciones importantes en la respuesta a la radioterapia y supervivencia a largo plazo. Introducción Los estudios realizados sobre apoptosis, proliferación y respuesta a la RT en diversos tumores, han mostrado distintos resultados (Tabla 5). De forma general en cáncer de cérvix, un alto índice apoptótico se asocia con una mejor respuesta a radioterapia en adenocarcinomas (Wheeler et al 1995,Sheridan et al 1999) mientras que en carcinomas epidermoides se asocia con una peor respuesta (Levine et al 1995,Tsang et al 1999). En cuanto a la relación entre la proliferación y respuesta a la raditerapia, la mayoría de los estudios no encuentran relación significante (Chung et al 1999, Kim et al 2001, Tsang et al 2003) TABLA 5: Apoptosis, proliferación y respuesta a Radioterapia en carcinoma de cérvix NO Pacientes Levine (1995) W heeler (1 995) Apoptosicl Control Local Sheridan(l999) Chung (1 999) Lloret(2000) Paxton (2000) 66 44(1) 1 1 I 1 Levine et al (1994,1995) en un grupo de pacientes compuesto Apoptosisl Supervivencia 39(7 48 65 146 Zaghloul (2000) 1 40 Kim (2001) Liu (2001) Tsang (2003) fundamentalmente por carcinomas epidermoides, confirmaron la relación entre Proliferación1 Supervivencia Peor (A.M) No Mejor apoptosis pretratamiento y supervivencia, observando que tumores con IA por Mejor (A.M) No 1: Tipo Histológico Adenocarcinoma. 2: Mejor supervivencia global. 3: Mejor supervivencia utilizando el cociente IAIIM, pe0.03. 4: Supervivencia libre de enfermedad AU: análisis invariante; A.0: análisis bivariante; AM: análisis multivariante. 42 1 24 1 O1 encima de la mediana (0.71%) tenían peor control local y supervivencia tras Peor (A.M) No (2) RT. En el estudio de Kim (2001) se obtienen resultados similares. El análisis No No (3) No No(4) Peor (A.B) No (AUIM) del IA tanto antes del tratamiento como después de 2 Gy de irradiación mostró No No que pacientes con un alto IA espontáneo mostraban una peor respuesta a corto Peor (A.B) Peor (A.M) No (AU/M)(4) plazo, peor control local (P=0.054) y peor supervivencia (P=0.013) y que un alto No No (AUIAM) IA se asociaba con un peor control local y pronóstico a largo plazo en carcinoma de células escarnosas avanzado de cervix. Introducción impidiendo la progresión de células dañadas y manteniendo la homeostasis celular. - Mecanismos efectores y proliferación Check-point Gl Una vez se ha producido un daño en el DNA, la detención en Gl genera tiempo para que la lesión pueda ser reparada, antes de entrar en la fase de síntesis. Esta decisión se lleva a cabo a través de la actividad transcripcional coordinada por el gen del retinoblastorna (Rb) y c-myc, La fosforilación de Rb por parte del complejo ciclinaD/CDK4, permite la liberación del factor transcripcional E2F y la progresión celular; y de una forma más tardía, la activación mediada por c-myc de ciclina E y la posterior activación de cdk2 es un prerrequisito para la iniciación de la replicación del DNA. La progresión a partir de G1 puede bloquearse previniendo la fosforilación de Rb y por interferencias en la actividad de la ciclina E-CDK2. (Bartek and Lukas 2001). En los Últimos años se consideró que P53 era una proteína central en el checkpoint G1 en respuesta a la radiación ionizante sin embargo, investigaciones recientes han sugerido la presencia de dos rutas diferentes aunque con regulación inicial similar: - El arresto inmediato, p53-independiente: se produce mediante la activación por ATM de Chk2, que inactiva a cdc25A. Esta situación, bloquea la fosforilación de CDK2 en el residuo tirosina 15, que es imprescindible para su unión a ciclina E, que a su vez es imprescindible para finalizar la fase Gl e iniciar la fase de síntesis. - El arresto lento, p53-dependiente: es más duradero, mantiene el arresto inicial, pudiendo ser irreversible y permitiendo el inicio de los procesos de reparación. Este hecho viene dado, por el tiempo que es necesario para que se hagan evidentes todas los mecanismos efectores regulados por p53 y que requieren la unión a secuencias DNA específicas y la transcripción de factores inhibidores de ciclo, reparadores o inductores de apoptosis (Ryan et al 2001). Así, ATM induce la estabilización y por tanto el incremento de la actividad de p53, de al menos tres formas: Introducción 1) Mediante fosforilación directa, de p53 en el residuo serina 15, estabilizando la proteína e impidiendo su translocación nuclear. 2) fosforilando Mdm2 e impidiendo así la degradación de p53. 3) fosforilación inducida por Chk2 def residuo serina 20 de p53, que impide la unión de mdm2 a p53, reduciendo su degradación. El resultado de estas acciones es el incremento de la activación transcripcional de p21 (WafllCipl), un inhibidor de las CDKs, en este caso bloqueando el complejo CDK2lciclina E y CDK4Iciclina D, manteniendo por tanto a Rb hipofosforilada e impidiendo la liberación de E2F. Inmediato Lento Fig 3. Wilson 2004 Transición Fase GIIS ATM es también, el principal iniciador de la cascada de eventos que se producen en esta ruta. Si bien en células normales se observa una disminución de la síntesis de DNA durante la irradiación de las células en fase S, en células deficientes en ATM, este hecho no se produce, objetivándose la Síntesis Radioresistente de DNA (RDS). Queda patente por tanto, el papel central de Introducción ATM en el correcto funcionamiento del check-point de fase S. Por un lado, se pone en marcha la ruta de señalización de arresto rápido, ya descrita en Gl, que conlleva la activación de Chk2 por ATM y la subsiguiente inactivación de cdc25A, por lo que CDK2 permanece inhibida y no puede formarse el complejo CDK21ciclina E ni el complejo CDK21ciclina A, imprescindibles para la progresión durante la fase S (Falck et al 2001).Por otro lado, existe otra vía, que mediante fosforilación mediada por ATM de Nbs-1 como parte del complejo MRN y de BRCA-1, induce la activación mediante fosforilación de proteínas SMC (structural maintenance of chromosomas), necesarias para la cohesión de las cromátidas. Parece existir un mecanismo de seguridad, que permite el cruzamiento de ambas vías ya que Nbs-1, como parte del complejo MRN, puede fosforilar directamente a Chk-2 iniciando el arresto de fase S vía cdc25A. Por otra parte Chk2 puede fosforilar BRCA-1 iniciando la vía ATMISMC-1 (Yazdi et al 2002). Degradación Progresión Fase S Fig 4. Wilson 2004 Introducción La entrada de las células dañadas en G2 supondría la permanencia de poblaciones genéticamente anómalas en el tejido, debido a la segregación aberrante de cromosomas durante la fase M. Resulta por tanto de gran importancia para la célula, asegurarse que las células hijas reciben copias adecuadas del material genético. Las ruta de señalización y efectoras de este check-point son muy complejas, de forma que parece que se ha puesto en marcha, un ultimo sistema de control lo mas completo posible. BRCA-1 parece tener un importante papel en este check-point, bien siendo imprescindible para la activación por ATMIATR de Chk2lChkl respectivamente, bien fosforilando directamente a Chkl . Dos vías principales y algunas accesorias, estarían involucradas en la regulación de este check-point (Xu et al 2002). Así, parecen existir dos diferentes check-points desde el punto de vista molecular, en esta transición G2lM. Este hecho tiene que ver con el momento en que se produce el daño en las células que se encuentran en fase G2. Así, el mecanismo de arresto en G2 de las células dañadas durante la fase S, será ATM independiente, dosis dependiente y representaría un check-point "tardío", mientras que el arresto en G2 de las células dañadas en esa fase es ATM-dependiente, dosis independiente y representaría un chekpoint "temprano". Así ATR fosforila Chkl que bloquea cdc25C impidiendo la acción activadora de cdc25C sobre CDKI, y por tanto impidiendo la formación del complejo CDKIlciclinaB. A su vez cdc25C es secuestrada en el citoplasma por 14-3-3, inactivada por Plk3 (un regulador negativo, similar a Chkl-2, y activada por ATM) y dejada de activar por el bloqueo inducido por ATMIATR sobre su activador Plkl. Pero CDKl tiene otros sitios regulados negativamente por WeellMikl y Mitl, que a su vez son defosforilados por cdc25C. Si esta se encuentra inactiva, como es el caso que nos ocupa, esa regulación negativa persistirá, entonces CDKI seguirá inactiva y no se formará el complejo CDKl/ciclinaB. Por otra parte, ATM activaría sus rutas ya conocidas de "arresto rápido" (ATMIChk2lcdc25Clinhibición CDKl /inhibición complejo CDKl lciclina B) y la Introducción - ruta de "arresto lentoJ' en el que los otros genes efectores de p53 a parte de p21 (14-3-3 y GADD45) parecen inhibir también CDKI ((ATM/p53/(p21-14-3-3GADD45)linhibición CDKI 1 inhibición complejo CDKI Iciclina B)). Esta última ruta significaría la salvaguarda del control del check-point en G2 independiente de cdc25C. Pero además existe una tercera vía de inhibición que tiene como diana a la propia ciclina B que queda secuestrada en el citoplasma durante S y G2, impidiendo la formación de complejos activos CDKlIciclinaB. Fig 5. Wilson 2004 Transición fase G21M Introducción - Mecanismos efectores y reparación del DNA La reparación del daño inducido en el DNA por la radiación incluye alteraciones en las bases, roturas simples o dobles de cadena (dsb), sitios locales de daño múltiple, entrecruzamientos intra e intercatenario de DNA o DNA-proteinas, etc. Existen complejos sensores del daño en el DNA, entre los que p53 podria coimnuoprecipitar incluidos el complejo DNA-PKclKU70180, BRCAI etc. Los efectores implicados en las rutas de reparación variarán según el tipo de lesión a reparar. Así, p53 parece estar implicado a través de interacciones con genes de XP, DNA-polimerasa delta o MSH2 en los procesos de reparación por excisión de nucleótidos (NER), reparación por excisión de bases (BER) y reparación inadecuada (Mismatch repair MMR). Por otra parte p53 está involucrado en la reparación de las roturas dobles de cadena mediante reparación homóloga (HR) y no homóloga (NHEJ). Estos, son los principales mecanismos por los que las dsb pueden ser reparadas. En ambos casos, el complejo MRN (Mre-1 1 -RadSO, NBScomplejo DNA-PKcIKU70180, el mas serían XRCC4 y ligasa IV, y BRCAI, relevantes para HR. l), podría estar relacionado, siendo el relevante para NHEJ, cuyos efectores Rad51, 52,XRCC2 y ligasa I los mas Por tanto, P53 podria tener un papel en la reparación de dsb, mediado por su diana p53R2, por su capacidad de unirse directamente al DNA dañado, promoviendo la alineación de cadenas simples de ácidos nucleicos, o a través de sus interacciones con RAD51 y BRCAI, así como con DNAPKc. Además el dominio carboxiterminal de p53, tiene actividad exonucleasa por si mismo, demostrando un papel en la re-unión de dsb. Quizás, sin embargo, el mayor papel que p53 tenga en la reparación del DNA, incluya su capacidad de disminuir la velocidad de progresión celular durante el ciclo, permitiendo el arresto celular duradero y la adecuada reparación del daño. Este efecto, parece estar influido directamente por BRCA-1, que estabiliza p53 favoreciendo estos fenómenos, mediados no solo por p21 sino también por XP y otros genes. Introducción - Mecanismos efectores y apoptosis El daño al DNA, especialmente dsb, que no ha sido reparado o está mal reparado lleva a la muerte celular por apoptosis. De tal forma, que el daño en el DNA, lleva a la acumulación y activación de p53, que induce una detención el ciclo celular que puede llevar a la reparación, y10 si esta no es posible, llevará a apoptosis. Hay una importante relación entre el nivel de p53 en diversos tejidos y la apoptosis inducida por radiación en los mismos. La apoptosis o muerte celular programada, representa el hecho final de una compleja ruta de señalización que activa unas proteasas, denominadas caspasas, que generan alteraciones celulares que llevan a la muerte de la célula. Se distinguen 2 grandes grupos de caspasas (cistein proteinasas que requieren substratos con residuos aspartato): caspasas iniciadoras (2, 8, 9,10 y N E 72) que actúan como transductores de la señal apoptótica inducida por los genes reguladores, ya que su activación autoproteolítica desencadena a la 3 - 0 m activación subsecuente de las caspasas efectoras (3,6 y 7), que interactúan O 4 con una gran variedad de substratos, llevando a la apoptosis. El bloqueo de n todas las caspasas, no evita por tanto la muerte celular, sino solo aquella en forma de apoptosis, así que la célula podría cambiar el fenotipo de muerte = m O hacia la necrosis. n - Rutas de apoptosis mitocondrial O O Clásicamente, la apoptosis mediada por P53 en respuesta al daño celular inducido por radiaciones ionizantes, esta mediada por la activación transcripcional de genes proapoptóticos de la familia BCL-2 que incluyen Bax, Bak, Noxa, y Puma. Estos genes, inducen el daño mitocondrial, mediante la rotura del potencial de su membrana con la liberación posterior de Citocromo C. Este, junto con Apaf-1 y ATP activan proteolíticamente a la caspasa 9, que activa de la misma forma a otras caspasas efectoras (3, 6, 7 ,8) responsables de la muerte celular. Sin embargo, este proceso esta estrechamente balanceado por la existencia de genes antiapoptóticos como BCL-2 o Bcl-xl, que pueden heterodimerizar con Bax u otros genes similares como Bcl-xs. El predominio de unos u otros establecerá la proclividad celular o no a sufrir apoptosis (Voudsen and Lu 2002, Belka and Budach 2002) Introducción Rutas de apoptosis mediadas por receptores Existen dos tipos de receptores que unidos a sus ligandos inducen la apoptosis celular: el receptor CD95IFaslApo y su ligando (CD95lFaslApol L) y el receptor de TNF-RI y su ligando (Tumor necrosis factor related apoptotic inducting ligando, TRAILIApo2). Esta unión receptor-ligando, lleva al reclutamiento de FADD que actúa como adaptador, que facilita que caspasa 8 se active proteolíticamente, activando a su vez caspasas efectoras (caspasa 3). Adicionalmente, caspasa 8 puede activar Bid, una proteína pro-apoptótica que desencadena la liberación de citocromo C de la mitocondria al citoplasma, activando la ruta de caspasa 9 y consecuentemente caspasas efectoras (caspasa 3) generalizando un modelo de auto activación (Belka et al 2000) Rutas de apoptosis mediadas por daño en la membrana La interacción de la radiación ionizante con la membrana celular induce la hidrólisis rápida de esfingomielina a ceramida (Haimovitz-Friedman et al 1994). Una vez formada la ceramida interacciona con una variedad de dianas intracelulares, incluyendo quinasas, fosfatasas, y proteasas, permitiendo la activación de la ruta SAPKIJNK (protein kinasa activada por estrés). Las fosfatasas PP2A y PP1 son activadas por ceramida y BCL-2 desfosforilato (Dobrowsky et al 1993, Wolff et al 1994) AKTI protein quinasa B, proteína RB, C-Jun y proteínas con dominio nuclear rico en argininalserina. La ceramida recluta PP2A a través de su subunidad B reguladora en la mitocondria donde se activa la BCL-2 fosfatasa que inactiva BCL-2 (Ruvolo et al 2002). La proteasa catepsina D está activada por ceramida y participa en la activación de caspasa 3 después de la translocación desde los lisosomas (De Stefanis et al 2002)(Modrak et al 2006). 5n dbs Introducción 8. TOXICIDAD DEL TEJIDO SANO SECUNDARIO AL TRATAMIENTO CON RADIOTERAPIA EN CÁNCER DE CÉRVIX 8.1 INTRODUCCION El control tumoral secundario a los tratamientos con radioterapia está determinado, entre otros factores, por la dosis máxima que pueda ser administrada con un riesgo aceptable de toxicidad en el tejido sano. De todos los pacientes tratados con intención radical, sólo algunos van a presentar reacciones agudas y tardías severas, este hecho condiciona la dosis de radioterapia a administrar ya que la dosis total va a estar limitada por la tolerancia de estos pacientes más radiosensibles. (Hellman et al 1985, Horwich et al 1990, Withers et al 1992). La posibilidad de determinar de antemano la radiosensibilidad del paciente, permitiría mejorar la calidad de un tratamiento radioterápico (Bentzen et al 1998, Mackay et al 1999). Para ello se han desarrollado ensayos predictivos que nos permitirían identificar aquellos pacientes más radiosensibles y de este modo podríamos reducir los efectos tanto agudos como tardíos en el tejido sano. Los estudios demuestran que el 90% de la variación de la radiosensibilidad puede explicarse por factores intrínsecos en el paciente, mientras que los otros factores explicarían solo un 10% de esta variación (Safwat et al 2002). Existe una variabilidad individual en la respuesta al tratamiento radioterápico, de tal forma, que incluso después de un tratamiento estandarizado en pacientes con factores de riesgo equiparables, los pacientes pueden presentar una gran variabilidad en la toxicidad del tejido sano. La existencia de una diferencia individual en la respuesta a la radiación en la piel humana fue documentada por Tucker et al (1992,1996), Turesson (1989,1990, 1996) y Bentzen (1998). En sus trabajos demuestran que los pacientes con similares factores de riesgo, presentan distinto nivel de toxicidad tanto aguda como crónica y que son las diferencias intrínsecas de cada paciente, las responsables de la variación que se observa en la aparición de dichas toxicidades. Introducción Toxicidad rectal Subjetivo: -Tenesmo - Perdida mucosa - Control esfinter - Frecuencia deposiciones Objetivo: - Sangrado - Ulceración - Estenosis Manejo: -Tenesmo/ frecuencia heces -Control esfinter Analítico: - Enema opaco - Rectoscopia - CT -RMN - Manometría anal - Ecografía Grado l Urgencia ocasional Ocasional Ocasional 2-4ldia Ocasional y mínimo Oculto Superficialc 1 cm >2/3 diametro normal con dilatación Ocasional,<2 Antidiarreicosl Semana No narcoticos Ocasional Laxantes,tto Hierro Modif dieta,laxantes Modif dieta Uso ocasional pañales Grado II Urgencia intermitente Intermitente intermitente 4-81dia Intermitente y tolerable Ocasional, >2lsem SuperficialW cm 113-213 Regular,>2 Antidiarreicosl Semana No narcoticos Regularmente Transfusión ocasional Corticoides ocasional Dilatación ocasional Uso intermitente pañales Grado III Urgencia Persistente Persistente Persistente Ndia Persiste intenso Persistente, Diaria Ulcera profunda 413 MÚltiple,rZ Antidiarreicosl Dia Narcoticos Regularmente Transfusión Frecuente Enema de esteroides, 02 hiperbarico Dilatación Regularmente Uso persistente Pañales Luz y peristaltismo Luz y superficie mucosa Grado de adelgazamiento de pared, senos y formación de fístulas Grado de adelgazamiento de pared, senos y formación de fistulas Estudio de funcionalidad rectal Grado de adelgazamiento de pared, senos y formación de fistulas Grado lV Refractario Refractaria Refractario Diarrea incontrolable Refractario y Excruciante Rectorragia Masiva Perforac, fistula Obstrucción Completa Cirugialcolosto mia Permanente Cirugialcolosto mia Permanente Cirugialcolosto mia Permanente Cirugialcolosto mia Permanente Cirugíalcolosto rnia Permanente Introducción Toxicidad vesicalluretral Subjetivo: - Frecuencia - Hematuria - lncontinencia -Disminución del chorro Objetivo: - Hematuria -Volumen máximo Volumen residual Manejo: . Disuria , Frecuencia , Hematurial elangiectasias lncontinencia Disminución jel chorro inalitico: Cistoscopia Análisis volumétrico Rx contraste Ecografia EMG Grado l Oasional y mínima Cada 3-4h Ocasional <episodio semanal Ocasionalmente dhbil Wofia parcheada 3 telangiectasias sin sangrado Vo narcoticos 3casional 4lcalinación Tto hierro Jso ocasional lañales Grado II Intermitente y tolerable Cada 2-3h intermitente <episodio diario Intermitente Macroscópica lntermit,<IO-20% Hb disminuida Atrofia confiu o Telangiectasias Con sangrado masivo 200-300~~ 25-1 OOCC No narcoticos Regularmente Espasmoliticos Ocasional Transfusión Ocasional o CauterizaciOn Uso intermitente Pañales Autosondaje diario Grado 111 Persistente e intensa Cada 1-2h Persistente <2 compresas/dia Persistente pero obstrucc incompl Macroscópica Persist,l O-20% Hb disminuida Uiceración de Mucosa 100-200cc > 1 oocc Narcoticos Regularmente Narcoticos Regularmente Transfusión Frecuente o Coagulación Uso persistente Pañales Dilatación, sl Autosondajeldia Superficie mucosa >apacidad vesical en cc Jlceras, capacidad y contractilidad 3ado de adelgazamiento de pared, senos y formacjón de fístulas istudio de actividad de esfinter con transductor de presión ntraluminai, presión de contracción y curvas de volumen Grado IV Refractaria y excruciante Horaria Refractaria Refractaria Obstrucción Completa Refractaria >20% Hb disminuida Perforación, flstula Cirugía Cistectom ia Cirugia Sondaje Permanente Cirugialsondaj e Dermanente Introducción 1 Toxicidad sexual Grado l Grado II Subjetivo: -Dispareunia - Sequedad -Deseo -Satisfacción Objetivo: - Estenosis vaginal Ilong - Sinequias - Frecuencia - Orgasmo Manejo: - Sequedad - Estenosis - Sinequia -Dispaurenia Ocasional Ocasional Ocasional Ocasional - >2/3 de normal Ocasional - - THS Dilatación Ocasional Crema hormonal ocasional Intermitente lntermitente Intermitente lntermitente Menor intermitente Lubricación artif Dilat intermitente Crema hormonal intermitente Refractaria Refractaria Nunca Nunca <1/3 Cleisis Total Parcial Completa Raro Nunca Muy ocasional Nunca Quirrjrgica Crema hormonal Analítico: - Psicosocial - Medida vaginal Evaluación calidad de vidalsatisfacción sexual Evaluación grado de estenosis vaginal En 1997, el NCI amplia el CTC con la intención de integrar agentes sistémicos, radiación y criterios quirúrgicos dentro de este sistema. Representantes de la RTOG participaron en este proceso en un esfuerzo de mejorar los criterios relacionados con la toxicidad aguda y conseguir una mejor claridad y consistencia entre las modalidades. CTC versión 2.0 reemplaza a la NCI CTC y la RTOG incluyendo más de 260 efectos adversos individuales siendo más de 100 de ellos aplicables a efectos agudos de la radiación (Trotti et al 2000). Posteriormente, en diciembre de 2003 se publicó la CTCAE ( Commom Terminology Criteria for Adverse Events versión 3.0), su objetivo era clasificar los efectos adversos en 5 grados: grado 1 efecto adverso leve, grado 2 efecto adverso moderado, grado 3 efecto adverso severo, grado 4 efecto adverso que Introducción compromete la vida y grado 5 muerte relacionada con el efecto adverso. La versión 3.0 intenta englobar la toxicidad producida por la cirugía, quimioterapia y radioterapia (Trotti et al 2003) En un estudio realizado por Anack et al en donde se correlaciona las escalas de toxicidad tardía RTOGIEORTC con la escala SOMNLENT respecto a irradiación pélvica en 116 pacientes con cáncer ginecológicos ( 64 casos con cáncer de cérvix uterino y 52 casos con cáncer de endometrio) se observó una buena correlación para recto (pcO.01) y vejiga (p<O.Ol) en las dos escalas; sin embargo, ciertas toxicidades estaban mejor analizadas en SOMA/LENT que en la RTOGIEORT como el sangrado rectal o la frecuencia urinaria (Anack et al 2001 ) En cáncer de cérvix el Glosario Franco-Italiano y el sistema AADK (Aarhus, Denmark) han mostrado ser Útiles en el estudio de la latencia y progresión del daño. En el estudio de Davidson et al (2003) donde se compararon los sistemas de medida de toxicidad LENTISOMA y Franco Italiano en pacientes con carcinoma de cérvix se pudo observar que la medida objetiva del LENTISOMA se correlacionaba con la establecida por el glosario Francoitaliano pero el primer sistema proporcionaba una información adicional en los efectos subjetivos del tratamiento Los estudios recientes parecen indicar un bajo porcentaje de toxicidad tardía grave en carcinoma de cérvix con las técnicas actuales de tratamiento. Ferrigno et al (2003) analizaron 190 pacientes con carcinoma de cérvix tratados con radioterapia externa seguido de una o dos aplicaciones de braquiterapia de baja dosis observando una incidencia global de toxicidad tardía según la RTOGIEORTC en el recto, intestino delgado y tracto urinario de 15.3%,4.2% y 6.8% respectivamente y una incidencia de toxicidad tardía a los 5 años de 16.1°/~,4.6% y 7.6% respectivamente. Las toxicidades severas tardías en recto, intestino delgado y tracto urinario fueron relativamente bajas con incidencias de 3.6%, 1 .O% y 1 .O% respectivamente Davidson et al (2003) analizaron el impacto de la radioterapia en la función sexual y vaginal en carcinoma de cérvix utilizando las escalas LENTISOMA a diferentes tiempos después del comienzo del tratamiento valorando la severidad de los síntomas desde 1 hasta 4. Se observó en 48 de los pacientes que la disfunción vaginal disminuía significativamente a los 70 días Introducción comparado con los valores pre-radioterapia, sin embargo no ocurría lo mismo para la disfunción sexual. Se producía una heterogeneidad en los cambios de los valores a lo largo del tiempo: para algunas pacientes no se producían cambios en los resultados de la subsección vaginal, para algunas aumentaba y para otras disminuía. Saibishkumar et al (2005) analizaron 105 pacientes con carcinoma cervical invasivo tratados con radioterapia externa con o sin radioterapia intracavitaria después de histerectomía, siendo el porcentaje de toxicidad tardía a los 5 años según la RTOGC de 19% en recto, 4.8% en vejiga, 24.8% en la piel y 14.3% en intestino delgado. En otro estudio realizado por el mismo autor se realizó un análisis retrospectivo de 1069 pacientes con carcinoma de cervix uterino tratados solo con radioterapia observándose que la incidencia de toxicidad tardía severa (314) medida segbn el criterio de la RTOG en recto, vejiga, intestino delgado y piel fue 1 .l %, 1.2%, 0.2% y 1.2% respectivamente) En un estudio reciente realizado por Brand et al (2006) se analizó la incidencia, severidad y momento en el que producía la estenosis vaginal en pacientes con carcinoma de cérvix que recibieron radioterapia pélvica o vaginal como parte de su tratamiento. 179 pacientes realizaron el seguimiento y se disponía del 98% de los datos de la toxicidad vaginal. 27% tuvo toxicidad de grado 1 (estenosis parcial o reducida pero sin oclusión completa) y 11% tuvo grado 2 (oclusión completa). Pacientes con edad superior a los 50 anos tenían un alto riesgo de sufrir estenosis vaginal. La estenosis vaginal ocurría en un 38% de los pacientes y con mayor frecuencia en el primer año después del tratamiento 8.3 PREDICCIÓN DE LA TOXICIDAD Actualmente, la prescripción de la dosis adecuada para cada paciente, obedece al principio de minimizar las complicaciones severas de los tejidos normales y maximizar la probabilidad de control tumoral local (Burnet et al, 1996). La existencia de una variabilidad inter-paciente en la radiosensibilidad, implica que la dosis utilizada en los tratamientos convencionales, está determinada fundamentalmente por esos pacientes más radiosensibles. Por ello, se han realizado ensayos predictivos que nos permiten identificar a aquellos pacientes Introducción más radiosensibles antes del tratamiento radioterápico. Esta identificación, nos permitiría ajustar de manera personalizada la dosis de radioterapia a administrar. En general, se acepta que la radiaciones ionizantes inducen la muerte de las células eucariotas por daño en la estructura y función del ADN genómico (Teoría de la diana). Se han propuesto principalmente dos hipótesis, que pueden operar de forma conjunta, para explicar las diferencias en radiosensibilidad entre las células: - Variación en la cantidad de daño inducido por una dosis dada de radiación (Ruiz de Almodóvar et al 1994) - Variación en la capacidad celular de reparar el daño del ADN radioinducido. (Núñez et al 1996, Powell et al 1998) 8.3 ENSAYOS PREDICTIVOS DE TOXICIDAD La individualización del tratamiento radioterápico basado en ensayos predictivos de radiosensibilidad del tejido normal, puede conducir a la mejora en los resultados del tratamiento. Un ensayo predictivo ideal debe ser barato, rápido, con poder predictivo independiente, con pocos falsos positivos o negativos y lo más inocuo posible para el paciente. El conocimiento de la radiosensibilidad del tejido normal antes del tratamiento radioterápico, podría identificar a aquellos pacientes con alto riesgo de toxicidad o por el contrario, pacientes relativamente radioresistentes, que podrían probablemente tolerar mayores dosis de radiación sin graves complicaciones. Durante la pasada década se han realizado estudios con fibroblastos y linfocitos de pacientes para analizar la posible relación entre la radiosensibilidad celular y la respuesta clínica, sin llegar a una evidencia clara que permita utilizar estos ensayos en la práctica clínica rutinaria (Dorr et al 2001). Introducción 8.3.1. FIBROBLASTOS 8.3.1.1 Cultivos celulares: Do o SF2 Los fibroblastos son utilizados frecuentemente como modelo experimental en el estudio de la radiosensibilidad del tejido normal. Una vez extraidos los fibroblastos del paciente, es necesario establecer una línea de cultivo que será sometida a distintas dosis de radiación. El número de colonias en cada frasco de cultivo nos dará una medida de la supervivencia celular (Do o SF2) que define la radiosensibilidad de los fibroblastos de cada paciente. Sin embargo, los resultados de los estudios sobre el valor predictivo de los fibroblastos en la radiosensibilidad es controvertido. Muchos estudios han encontrado una correlación entre reacciones del tejido normal tardías y radiosensibilidad de fibroblastos. Geara et al (1993) encontraron una correlación negativa significante (Pc 0.0001) entre la fracción de supervivencia de fibroblastos después de irradiación con 2GY (SF2) y complicaciones tardías en pacientes con cánceres de cabeza y cuello. Una correlación significante se observó también entre las fracciones de supervivencia de fibroblastos después de 3.5 Gy (SF3.5) y fibrosis subcutánea en pacientes con cáncer de mama, aunque no se encontró ninguna correlación entre SF3.5 y telangiectasia (Johasen et al 1996). El estudio retrospectivo de Peacock et al en 39 pacientes con cáncer de mama no mostró ninguna correlación entre la radiosensibilidad clonogénica de fibroblastos y la severidad de los efectos tardíos en pacientes con cáncer de mama (Peacock et al 2000) En cuanto a la toxicidad aguda o crónica, se ha observado que pacientes con cáncer de mama que desarrollaron reacciones agudas graves en la piel durante la radioterapia, se caracterizaban por una radiosensibilidad incrementada de sus fibroblastos (Loeffler et al 1990, Burnet et al 1996). Oppitz et al (2001) en un estudio retrospectivo mostró una correlación significante entre los pacientes con reacciones agudas en la piel y la radiosensibilidad de los fibroblastos estimado mediante supervivencia de células clonogénicas. Introducción 8.3.1.2 Daño del ADN Puede determinarse por distintas técnicas como son: la formación de micronúcleos inducida por la radiación, el comet assay o medida del daño inicial de ADN radioinducido estimado mediante roturas dobles de cadena por electroforesis en campo pulsado. El ensayo de formación de micronucleos mide el nivel de DNA o daño cromosómico producidos en cultivos in vitro. Los micronucleos se forman de fragmentos de cromosomas acéntricos o de cromosomas que se han perdido durante o después de la mitosis y se identifican como cuerpos extranucleares pequeños en células en interfase expuestas a la radiación ionizante. El comet assay es una técnica mediante la cual las células son suspendidas en geles de agarosa marcadas con un marcador fluorescente observándose la migración del DNA mediante microscopio fotométrico. El DNA migra hacia el ánodo y esta migración es más pronunciada en células irradiadas que en controles. Las diferencias de los patrones de migración se miden cuantitativamente. Las ventajas del comet assay es que nos permite utilizar un bajo numero de células pero no deja de ser una técnica que lleva un tiempo de ejecución largo y laborioso. La medida del daño inicial radioinducido estimado por el numero de rupturas dobles de cadena (dsb) en electroforesis de campo pulsado (PFGE) permite obtener resultados en 7 días aproximadamente. Mediante suspensiones de fibroblastos o queratinocitos se procede a irradiación a diferentes dosis. Posteriormente, se procesan las muestras para realizar una electroforesis de campo pulsado que permite movilizar fragmentos grandes de ADN, como son los producidos tras una rotura doble de la cadena del ADN. Los estudios que relacionan el daño del DNA con la toxicidad no han resultados concluyentes.En el estudio de Nachtrab et al (1998) en 10 controles , 10 pacientes hipersensibles y 2 con AT (ataxia telangiectasia) se observó que los fibroblastos de individuos hipersensibles y con AT mostraban una mayor inducción de micronucleos que los individuos con sensibilidad normal sin embargo, en un estudio realizado en 9 líneas de fibroblastos establecidas de Introducción biopsias vaginales de pacientes con carcinoma de cérvix pretratamiento y 1 linea de AT no se observó ninguna relación con la toxicidad y la formación de micronucleos (O'Driscoll et al 1998). En estudio de Oppitz en 1999 mediante comet assay se observó una relación con la toxicidad. Los individuos con AT mostraban un alto daño radioinducido y una baja reparación del daño comparado con individuos con reacciones tisulares normales. Los fibroblastos de pacientes con reacciones agudas y tardías incrementada tenían una lenta reparación del daño. En los estudios publicados mediante el análisis por PFGE (Núñez et a1,1998, Kiltie et al 1999) se demuestra una posible correlación entre los datos experimentales obtenidos "in vitro" y los datos clínicos sobre toxicidad en pacientes analizados. 8.3.1.3Diferenciación de fibroblastos La radiación ionizante induce cambios funcionales en los fibroblastos. Bayreuther et al en 1998 describieron como los sistemas de células fibroblásticas humanas podían divirse dentro de tres estadíos precursores activos mitóticamente (MFI,II,III) y tres estadíos post mitóticos (PMFIV,V,VI) (Bayreuther et al, 1998). Aunque no hay división, los fibroblastos postmitóticos son fiuncionalmente muy activos y producen grandes cantidades de colágeno y otras proteínas de la matriz extracelular (Rodemann et al 1991, Lara el at 1996). Se han realizado estudios que comparan la diferenciación de fibroblastos con la toxicidad en pacientes de cáncer pero los resultados han sido controvertidos. Lara et al 1996 encontraron un aumento en la producción de colágeno, medido por la incorporación de prolina tritiada en fibroblastos irradiados, pero sin embargo no encontró relación con la aparición de fibrosis clínica postradioterapia en un estudio posterior en donde se analizaban 79 pacientes con cáncer de mama (Russell, Lara et al 1998). Los estudios de Delanian et al y Herskind et al pudieron demostrar una correlación entre el cociente fibroblastos MF-III y MF-II tardíos frente a MF-I y II tempranos y el riesgo de fibrosis severa. (Delanian et al 1998 y Herskind et al 1998) Introducción Fig 7.Fibroblastos humanos en cultivo detectados por microscopía de fluorescencia @.Pinar 2002) ayoría de los estudios (Ramsay et al 1995, West et al 1998,2001) ran una relación entre los ensayos clonogénicos de supervivencia en tos tras radioterapia y la toxicidad radioinducida del paciente. Solo en un o realizado por Geara et al en 1993 no se observan resultados bles. En el estudio realizado por West et al 2001 en 174 pacientes con r de cérvix, se observó en 83 de ellos, que el SF2 en linfocitos era un pronóstico significante para la probabilidad de no desarrollar toxicidad na-yoduro para analizar la apoptosis radioinducida en PBls por ría de flujo, además de llegar a definir un modelo matemático al que ajustarse los incrementos de apoptosis observados a diversos niveles cis y a diversos tiempos de estudio. Este modelo matemAtico garítmico (MIR=P Ln (Gy)+u) nos proporciona una única medida ndiente de la curva) de la radiosensibilidad intrínseca individual que no llegado a proporcionar estudios anteriores, aportando una información I sobre la radiosensibilidad intrínseca del paciente (a una dosis y a un determinado). (Figura 1) Figura 9. Adaptación de las curvas de MIR por dosis de radiación, para 6 puntos de dosis, con 24 y 72 horas de incubación. m= m mn vow --LLDP.~R~w~~ E n - O O .4.2 Estudios de apoptosis radioinducida en subpoblaciones nfocitarias por citometría de flujo I estudio de la radiosensibilidad de las distintas subpoblaciones linfocitáhas D4, CD8, B, NK) nos podría ayudar a determinar qué población linfocitaria ría más útil para un tests predictivo de uso clínico habitual pre-radioterapia. e han realizado varios estudios sobre el efecto de la radiación ionizante en las stintas subpoblaciones de linfocitos de sangre periférica aunque sin llegar a sultados concluyentes. - ,v. Desde los años 1997 y 1999 los estudios de Ozsahin et al y cromptonl ét al ostraban que dentro de controles sanos e individuos con enfermedades Introducción genéticas, se producían claras diferencias entre la radiosensibilidad de las subpoblaciones linfocitarias CD3+CD4+ y CD3+CD8+. Stewart et al en 1988 utiliza un sistema de cultivo y medida por citometría de flujo para evaluar la radiosensibilidad de los linfocitos TCD4+,CD8+ y linfocitos B obtenidos de controles sanos. Los linfocitos CD8+ eran dos veces más radiosensibles que los CD4+ y los linfocitos B tenian una radiosensibilidad intermedia (Stewart et al 1988). Rana et al (1990) analizaron la sensibilidad de las células NK después de la exposición a diferentes dosis de radiación gamma. Las PBIs se irradiaron conjuntamente a bajas (2-6Gy) y altas dosis (10-30Gy) de radiación y se analizaron después de las 3 y 48 horas de incubación. Después de las 48 horas postirradiación se observaba un descenso en la actividad citotóxica de las PBls mientras que la actividad Iítica de las NK aumentaba. Las células NK tenian actividad citotóxica a bajas dosis sin embargo, a altas dosis se producía una pérdida de actividad. Por tanto, la radiación ionizante se encargaba de seleccionar aquellas subpoblaciones de células NK más citotóxicas o estimulaba la actividad citotóxica en células supervivientes. Seki et al 1995 estudió el posible efecto protector de varias citoquinas en la apoptosis radioinducida de subpoblaciones linfocitarias. La exposición a la irradiación gamma producía cambios apoptóticos en todas las subpoblaciones linfocitarias. Las células natural Killer (NK) eran las más radiosensibles, mientras que los linfocitos T CD8+ y B mostraban una débil susceptibilidad a la radiación y los CD4+ eran relativamente radioresistentes. La apoptosis inducida por radiación de los linfocitos NK y B estaba inhibida por 11-2 y IL-4 respectivamente y la de CD4+ y CD8+ por IL-2, 111-4, IL-7. Además el efecto protector de cada citoquina en la apoptosis radioinducida podría estar parcialmente atribuida al aumento de expresión de la proteína BCL-2 (Seki et al 1995). Ozsahin et al (1997) analizó la apoptosis radioinducida a los 2 y 8Gy para los linfocitos T CD4+ y CD8+ de 45 donantes sanos. Se observó una buena correlación entre la apoptosis a los 2 y 8Gy tanto para los CD4+ como para los CD8+(r=0.77). Sin embargo, se observaron correlaciones inferiores cuando se relacionaba la apoptosis observada entre ambos tipos celulares (r=0.63 para los 2Gy y r= 0.65 para los 8Gy). Esto sugiere que la muerte celular inducida Introducción dependía del tipo celular. La radiosensibilidad absoluta era también diferente entre los linfocitos T siendo los CD3+CD8+ más radiosensibles que los TCD3+CD4+. Crompton et al (1997). en 12 donantes sanos a dosis de 0,2,8Gy y 24 horas de incubación representaron el porcentaje de citotoxicidad radioinducida en 6 tipos celulares diferentes observándose que las células más sensibles a la citotoxicidad radioinducida eran los linfocitos T CD8 CD3+, seguido de los linfocitos B, NK, T CD4 CD3+, granulocitos y monocitos. Todos los tipos celulares excepto monocitos mostraron un claro aumento dosis dependiente en citotoxicidad Philippé et al (1997) realizaron el estudio en 6 donantes sanos a 2Gy de dosis y analizaron los resultados a las 24 horas de irradiación con Anexina V por citometría de flujo. Observaron que las células NK eran las más resistentes y que las B eran las más sensibles y que entre los linfocitos T, los CD4+ y CD45 RAeran más susceptibles a la apoptosis que los CD8+ y CD45RA+. Por otro lado, se observó que la apoptosis espontánea correlacionaba con la diferente radiosensibilidad a la apoptosis entre las subpoblaciones. Además se observó una relación con la vida media de los linfocitos in vivo. Así, poblaciones linfocitarias con una corta vida media in vivo eran más susceptibles a la apoptosis in vitro y viceversa . En un estudio más extenso, Schmitz et al (2003) analizaron 63 donantes sanos a dosis de 0,0.5, 1,2Gy a intervalos de 2 horas (8h-22h) utilizando Anexina V y Hoechst 33258 (marcador fluorescente que permite discriminar células necróticas) observándose como en estudios anteriores que dentro de los linfocitos T los CD4+ eran más resistentes que los CD8+ y que los linfocitos B eran los más sensibles. La apoptosis espontánea y apoptosis radioinducida estaban correlacionadas en todos los tipos celulares. Las radiosensibilidad de los linfocitos T CD4+ y CD8+ estaban estrechamente correlacionadas y ninguno de ellos se correlacionaba con la radiosensibilidad de los linfocitos B . Introducción TablalO. Radiosensibilidad de las distintas subpoblaciones linfocitarias No Stewart RADIOSENSIBILIDAD (1 988) Pacientes (1 995) Linfocitos TCD8+ más radiosensibles que CD4c.Linfocitos B 15 radioresistentes (1 997) radiosensibilidad intermedia Seki 45 (1 997) En un estudio reciente realizado por Ozhasin et al (2005) se correlacionó la modificación de la tasa de apoptosis radioinducida de cada subpoblación linfocitaria con la toxicidad de 399 pacientes con distintos tipos de cáncer. Se observó que la apoptosis radioinducida de linfocitos T predecían significativamente los efectos tardíos de grado 2 y grado 3 (P< 0.0001). Los pacientes con efectos tardíos de grado 3 mostraron una apoptosis radioinducida en CD3+CD4+ o CD3+CD8+ por debajo de la media (P< 0.0001) siendo los linfocitos CD3+CD8+ más sensibles y más específicos que la apoptosis de los linfocitos T CD3+CD4+ en el análisis multivariante. No se encontró asociación entre la toxicidad temprana y la apoptosis de los linfocitos T radioinducidos o entre la toxicidad temprana y tardía. 1 Nk más radiosensibles. T CD8+, B radiosensibilidad débil. CD4 más Ozsahin Crompton 1 1 De menor a mayor radiosensibilidad: Linfocitos TCD8+, 6, NK, TCD4+ 12 (1 997) A pesar de estos estudios, las bases moleculares de la diferente radiosensibilidad a la radiación ionizante permanece sin esclarecer. Así, SEKl et al (1994) mediante el análisis por Western Blot de la proteina p53 de distintas subpoblaciones linfocitarias observó una inducción por irradiación de la proteína en células CD4+, CD8+ y células B sin embargo, no se identificó ninguna banda se identificó en células NK irradiadas. Estos resultados sugieren que la síntesis de Novo de algunas proteínas incluyendo p53, es requerida para la apoptosis radioinducida en células T mientras que otros mecanismos independientes de P53 pueden estar operando en la iniciación de la apoptosis en células NK irradiadas. Linfocitos T CD8+ más radiosensibles que CD4+ Philippé 6 1 Linfocitos B más sensibles. Nk mas resistentes. Entre los linfocitos T CD4+CD45RAmás sensibles que CD8+ y CD45RA+ Schmitz De menor a mayor radiosensibilidad: TCD4+, TCD8+,B Introducción Por otro lado MULLER et al (1 998) analizaron por Western Blot el complejo DNA-PK que participa en la reparación de roturas dobles de cadena (dsb) en células de mamífero. El análisis reveló que las células B expresaban una forma variante de la proteina Ku-86 con un aparente peso molecular de 69 kDA y no la proteína de 86KDA. Esta forma alterada del heterodímero Ku tiene una capacidad menor para reclutar el componente catalítico del complejo DNAPKcs, el cual contribuye a una ausencia de actividad DNA-PK detectable en células B. Estos datos proporcionan unas bases moleculares para la explicar la sensibilidad incrementada de las células B ante la radiación ionizante. En un reciente estudio M Mori et al (2005) utilizando RT-PCR cuantitativa demostraron que los niveles de expresión de BAX aumentaban en linfocitos en correlación con la sensibilidad de las células (NKCD~~+<TCD~+CTCD€~+<BCDI~+) lo cual refleja su radiosensibilidad diferencial para el efecto de la muerte por radiación. En contraste, los niveles de expresión de otro gen proapoptótico TNFRSFIOB en células irradiadas no se diferenciaba significativamente entre las distintas subpoblaciones, sugiriendo que su expresión no podía relacionarse con la radiosensibilidad diferencial de los subtipos celulares. Estos resultados sugieren que la apoptosis radioinducida en linfocitos es disparada por al menos dos rutas dependientes de p53. La primera, a través de BAX induce la muerte celular actuando en la mitocondria, e influye en la radiosensibilidad diferencial entre las subpoblaciones celulares y la segunda, a través de TNFRSFIOB el cual media la apoptosis actuando a nivel de membrana plasmática vía interacción con su ligando TRAIL) Objetivos 1 .-Analizar la expresión del fenómeno apoptótico (IA) y las proteínas reguladoras P53, BAX, BCL-2 en el carcinoma invasivo de cérvix, la relación entre estas variables, su relación con factores clásicos de pronóstico (estadio, volumen tumoral, edad, grado y tipo histológico), y valorar su importancia como factores predictivos de respuesta inmediata a la radiación y la supervivencia en una cohorte de pacientes con largo seguimiento. 2.-Conocer la expresión de IGFI-r en pacientes de cáncer de cérvix y describir la posible relación con Ciclina DI y la proliferación estimada por el lndice MitÓtico(1.M.) y la expresión de Ki67. Profundizar en el conocimiento de la regulación por parte de IGFI-r de los procesos de apoptosis y expresión génica de P53,BAX y BCL-2. Definir el papel predictivo de respuesta tumoral y supervivencia que tienen la proliferación y sus genes reguladores. 3.-Analizar el proceso de apoptosis inducida por radiación en PBLs en pacientes con cáncer de cérvix, estudiar su ajuste a un modelo matemático semilogarítmico MIR = P.ln(Gy)+a, y conocer las relaciones que las constantes de definidas por el modelo tienen entre sí y definir su papel en la predicción de la toxicidad clínica tardía que presentan las enfermas tras ser tratadas con irradiación. 4.-Analizar el proceso de apoptosis inducida por radiación en PBLs en pacientes con cáncer de cérvix, estudiar su ajuste a un modelo matemático semilogaritmico MIR = P.ln(Gy)+a, y conocer las relaciones que las constantes definidas por el modelo tienen entre sí y definir su papel en la predicción de la toxicidad clínica tardía que presentan las enfermas tras ser tratadas con irradiación. PAPEL DE LA APOPTOSIS Y SUS GENES REGULADORES P53,BAX BCLP EN CÁNCER DE CÉRVIX OCALIZADO CON LARGO EGUIMIENTO. Capítulo III PAPEL DE LA APOPTOSIS Y SUS GENES REGULADORES P53, BAX Y BCL-2 EN CANCER DE CERVIX LOCALIZADO CON LARGO SEGUIMIENTO. RESUMEN Antecedentes: El cáncer de cérvix uterino es todavia una enfermedad frecuente en nuestro medio. La cirugía o la irradiación son los tratamientos adecuados para los estadios precoces. En los estadios mas avanzados la irradiación radical con quimioterapia concurrente parece la alternativa terapéutica mas adecuada. La posibilidad de predecir la respuesta de [os tumores a una u otra opción terapéutica que permitiera elegir el mejor tratamiento en cada caso, mediante estudios de la expresión del fenómeno de la apoptosis y sus genes reguladores P53,BAX y BCL-2 es una hipótesis atrayente. Objetivo: analizar la expresión del fenómeno apoptótcio (IA) y las proteínas reguladoras P53, BAX, BCL-2 en el carcinoma invasivo de cervix, la relación entre estas variables, su relación con factores clásicos de pronóstico (estadio, volumen tumoral, edad, grado y tipo histológico), y valorar su importancia como factores predictivos de respuesta inmediata a la radiación y lasupervivencia. Material y Métodos: En en este estudio hemos incluído 201 pacientes con carcinoma infiltrante localizado de cervix con un seguimiento medio de 84,74 meses (l.C.95%72,37-97,12 meses) máximo de 258 meses (21 ,5 años). Treinta y dos pacientes pacientes (1 5,9%) recibieron como tratamiento principal cirugía, y 151 (75,1%) radioterapia (RT). Dieciocho casos (9%) fueron tratados de forma paliativa por deterioro del estado general y progresión de la enfermedad. Se determinó mediante técnicas histológicas la apoptosis (IA) y genes reguladores (P53, BAX, BCL-2-2). Se utilizó tinción de hematoxilina-eosina (IA), y técnicas de inmunohistoquímica (IHQ) para la determinación de P53, BAX y BCL-2. Se analizó la relación entre estas variables, su relación con factores clásicos de pronóstico, y su valor como factores predictivos de respuesta, control local y supervivencia. Resultados: Observamos una estrecha relación entre apoptosis y la expresión de P53 y BAX. Además los tres genes reguladores estudiados se relacionaban estrechamente entre ellos. Además se observó una relación significativa entre la sobreexpresión de p53 y tumores indiferenciados (pc0.049) y entre mayor tasa de apoptosis y tipo adenocarcinoma(p<0,032). Se pudo valorar la respuesta en las 151 pacientes tratadas con RT radical, presentando remisión completa 110 de ellas (72.8%). Los tumores más avanzados (p<O.OOl), con baja expresión de BCL-2(pc0,013) y con baja apoptosis (pe0,087) obtuvieron peor tasa de respuesta inmediata de la enfermedad a la irradiación. La Supervivencia Libre de Enfermedad (SLE) de la serie a los 20 años fue del 52% y la Supervivencia Causa especifica(SCE) del 53% . Ni la apoptosis ni sus genes reguladores resultaron de utilidad para predecir la supervivencia. Solo el estadio clínico resultó definitorio de la supervivencia en análisis bivariante y multivariante. Marginalmente, la sobreexpresión de P53 mayor del 15% resultó predictiva para el control local (SLRLR) (p<0,058), SLE (~~0,038) y SCE (~~0,066) en el análisis univariante y multivariante para la supervivencia excepto Supervivencia Libre de Metástasis (SLM). Conclusión: En nuestra serie madura de casos con largo seguimiento, se ha podido objetivar una estrecha relación de la apoptosis y de sus genes reguladores P53, BAX y BCL-2 entre si. Además se demuestra la existencia de factores predictivos de carácter biológico para la obtención de respuesta inmediata a la irradiación (BCL-2). Marginalmente la expresión de P53 fue relevante en la predicción de las variables de supervivencia en pacientes con cáncer de cérvix con largo seguimiento. Capitulo 111 P INTRODUCCION El cáncer de cervix uterino es todavía una enfermedad frecuente en nuestro medio. El pronóstico de las pacientes que lo portan viene marcado por la extensión de la enfermedad al diagnóstico. Entre los factores más importantes están el estadío, el tamaño tumoral y la afectación ganglionar (Riou et al, 1990; Dellas et al, 1997). Sin embargo, no es raro ver en la práctica clínica que tumores con igual tamaño y estadío tengan evoluciones distintas. La cirugía o la irradiación son los tratamientos adecuados para los estadios precoces. En los estadios mas avanzados la irradiación radical con quimioterapia concurrente parece la alternativa terapéutica mas adecuada. La posibilidad de predecir la respuesta de los tumores a una u otra opción terapéutica que permitiera elegir el mejor tratamiento en cada caso, mediante estudios de la expresión de los fenómenos celulares y de su regulación génica es una hipótesis atrayente. Existe, por tanto, una necesidad de estudiar características biológicas de los tumores, que puedan ser Útiles en la identificación de pacientes con bajo riesgo, a los que en primer término se les pueda ofrecer un tratamiento más conservador evitando mutilaciones, y pacientes con alto riesgo a los que se les planteen tratamientos de combinación más intensivos (AvallLundqvist et al, 1997). El cáncer es la consecuencia de una proliferación incontrolada de células, con anomalías en su material genético. El fenómeno de la apoptosis está usualmente alterado en los tumores invasivos, reduciéndose frente al fenómeno de proliferación. Además, algunos de los genes que la regulan están también intimamente relacionados con el fenómeno de proliferación de esta célula anómala que se duplica a mayor velocidad de lo que muere, dando lugar al crecimiento tumoral. El estudio del valor pronóstico que el fenómeno de la apoptosis y sus genes reguladores P53, BAX y BCL-2 han mostrado previamente han sido descritos in Gapitulo IlI wariables categóricas BAX y BCL-2, han sido agrupadas en función de los ados en el intento de obtener grupos num6ricamente homog6neos que cien los subsiguientes análisis. Así BAX queda configurado en 2 grupos: voJdebilmente positivo 47 casos y positivo 102 casos. Bcl-2 queda urado en negativos 85 casos y positivos 65 casos. Como se ha descrito o se aprecia en el histograma (Figura 1). kpigura 1.- Hktograma de distribución de las variables LA., P53, BAX y BCL-2. kmos realizado un cuidadoso análisis de la posiMe relación que los NIct6lfisicos de pronóstico pudieran mostrar entre si, en nuestro grupo de pacientes. lernos observado una mayor proporción de estadios avanzadentre lea Qcientes de mayor edad (~4,029 (Figura 3) y tumores de estirpe - r gidemoide (~4,067). Capítulo III Fig D 70 Her apc des fact hist tum m a! (P<( ura 3.- Relación del estadio clínico con la edad de la paciente al diagnóstico. nos estudiado así mismo las relaciones que pudieran producirse entre la ~ptosis y sus genes reguladores y los factores clásicos de pronóstico ya mitos. En general, estos marcadores biológicos no se relacionaron con los ,ores definitorios de la extensión de la enfermedad o con las características ológicas. Es de resaltar la mayor tasa de apoptosis que presentaron los lores de estirpe adenocarcinoma frente a los epiderrnoides (~~0,032) y la ior expresión de P53 entre los tumores mas indiferenciados 3,049)(Figura 4). wa 4.- Relación entre a~o~tosis y P53 con características histológicas. Capítulo III Tabla 1.- Relación de la apoptosis y genes reguladores con los factores clásicos de pronóstico Estadio / Ganglios - [ 0,56 Histolog ia Grado Estadio (ATA: Anova Test (Ch ): Chi cuadrado (KW): Kruskall-Waliis (MW): Mann-Withney (TT): Ttest 0,14 ------ Edad Apoptosis P53 Bax Tanto la apoptosis como los genes reguladores estudiados se relacionaron estrechamente entre si, salvo la expresión de BAX y el índice apoptótico.(Tabla 4;Figura 5). Efectivamente la presencia de altos índices apoptóticos, se relacionó estrecha y directamente con la sobrexpresión de P53 y BCL-2. Además BCL-2 y BAX presentaron una estadísticamente significativa relación inversa en su expresión proteica. Histolog. 0,067(ch2) 0,40 0.28 Tabla 2.- Relaciones observadas entre la expresión de los genes reguladores entre si y con la apoptosis I I.A. I P53 I BAX I BCL-2 0,41 0,32 0,26 Grado O, 76 {ch2): Chi cuadrado (KW): Kruskall-Wallis (SR): Spearman Rho Edad 0,032(~~) 0,032(~w) 0,41 0,59 Apoptosis P53 Bax 0,18 O,O49(~w) 0,046(ch" Bcl-2 I I ------m O ,49 O, 1 O 0,19 0,000(~~:0,31) 0,80 O,OOO(MW) O,OO~(MW) 0,001 (MW) 0,048(ch2) Ira 5.- Relaciones observadas entre la expresión de los genes reguladore, e si y con la apoptosis. a respuesta a los tratamientos oncológicos, control locorregional ,a distancia 1 1 supervivencia absoluta y causa específica, observada en nuestra seric icluye exclusivamente a aquellas pacientes referidas a tratamiento: ncológico curativos, obviándose para este tipo de análisis las enfermas (1E asos) tratadas con medidas de intención paliativa . Capítulo 111 e entre las 151 enfermas referidas a tratamiento de irradiación radical mpleta al tratamiento (~~0,087). Del mismo modo, las pacientes con mores que expresaban BCL-2 tuvieron un mayor tasa de respuestas Figura 6.- Relación de la agoptosis con la respuesta a irradiación. relevancia de los diversos factores analizados en nuestra serie en la ' descripción de las variables respuesta a radioterapia. Solo el estadio clínico 'resultó predictivo en dicho análisis. tasa de supervivencia y supervivencia libre de recaída, bien local o a ra serie, podemos, que la Supervivencia Libre de Enfermedad o la ervivencia Globlal , se sitúan en torno al 50% a 20 años. Resulta evidente nuestro estudio, la moderada tendencia a la metastatización a distancia de tipo de tumores, pues el 78% de las enfermas estaban libres de recidiva I tras 20 años de seguimiento. 6.- Resultados generales de la serie. Capitulo 111 SLRLR:supervivencia libre de recidiva loco-regional SLM: supervivencia libre de metástasis SLE: supervivencia libre de enfermedad SCE: supervivencia causa especifica SG: supervivencia global En el análisis multivariante mediante el test de Cox se han incluido todas las variables descritas en el presente estudio. Solo el estadio clínico ha sido significativo en para la predicción de supervivencia, observándose una débil tendencia hacia la significación para los niveles de P53 en el estudio de la supervivencia absoluta (p<0,088) (Tabla 6). Tabla 5.- Análisis Multivariante de respuesta al tratamiento y supervivencia. SLRLR:supervivencia libre de recidiva loco-regional SLM: supervivencia libre de metástasis SLE: supervivencia libre de enfermedad SCE: supervivencia causa especifica SG: supervivencia global SLRLR SLM SLE SCE SG Hemos realizado un análisis marginal y complementario al aquí descrito, en el que hemos tratado de descubrir la existencia de un valor de IA y P53 que pudieran tener impacto en la supervivencia, convirtiendo las variables continuas en variables categóricas. Los puntos de corte utilizados para IA y P53, que son variables con distribución de sus valores no normales, fueron la mediana y los tertiles o cuartiles de la distribución. Ninguna de las dos variables alcanzó valor predictivo cuando fue segregado en dos grupos usando la mediana de la distribución. Se eligieron posteriormente como punto de corte el valor que separa el tertil o cuartil mas bajo del resto. El índice apoptótico mayor o menor de 1,15%, no resultó predictivo para ninguna variable de supervivencia. Sin embargo, en el conjunto de las P53 Estadio Estadio p<o,ooo OR:O,l7f(O,O74-0,393) p<0,020 O.R:0,091(0,012-0,683) p<o,ooo O.R:0,169(0,073-0,389) ~<O,OOO O.R:0,153(0,060-0,391) p<o,ooo , O.R:0,174(0,072-0,421) p<o,ooo O.R:0,255(0,127-0,515 p<0,005 O.R:0,102(0,021-0,505) p<o,ooo O.R:0,262(0,131-0,525) p<o,oo~ O.R:0,270(0,128-0,569) P<O,OOI , O.R:0,309(0,153-0,624) p<,088 , O.R:0,988(0,974-1,002) , Capítulo III ntes, una alta expresión de P53 por encima del 15%, se relacionó con res tasas de control loco-regional (p<0,058), de supervivencia libre de iva (~~0,038) y de supervivencia causa especifica (~~0,066). No se zó significación estadística en el estudio de la supervivencia libre de tasis (p<0,79) ni supervivencia global (p<0,12). 7.- P53 y resultados del tratamiento. - r R embargo, estos resultados fueron más relevantes cuando consideramas el tpel predictivo de P53 entre las pacientes estadio II y entre aquellas que eibieron como tratamiento principal irradiación exclusiva, asociada o no si dmioterapia (Tabla 6). Efectivamente, en estas situaciones de paciente8 &dios II y de aquellas sometidas a irradiación radical, los niveles d~ presión de P53 en el tumor fueron capaces de predecir no solo el control :o-regional (pc0,029 y ~~0,028, respectivamente), y la Supervivencia Libre 1 Enfermedad (p<0,011 y p<0,009, respectivamente), sino tambih la ipervivencia Causa Especifica (p<0,012 y p<0,016, respectivamente) y la a i~ervivencia Global (~~0,037 y p<0,030, respectivamente). Capítulo III Así mismo, hemos realizado un análisis de Cox para determinar los factores clásicos y los marcadores biológicos que se asocian a la supervivencia de los pacientes, incluyendo en este análisis todas las variables descritas en el presente estudio. En cuanto al análisis multivariante de Supervivencia Libre de Recidiva LocoRegional, el estadio clínico(p~0,0001) y la expresión de P53(segregada en 4 5% y >l S%)(p<0,056) resultaron las variables explicativas del modelo. Para la Supervivencia Libre de Metástasis solo el estadio clínico resultó relevante. Finalmente, tanto la Supervivencia Causa Especifica como la Supervivencia global estuvieron bien explicadas por el estadio y la expresión de P53. , Tabla 5.- Análisis Multivariante de respuesta al tratamiento y supervivencia. - SLRLR:supervivencia libre de recidiva loco-regional SLM: supervivencia libre de metástasis SLE: supervivencia libre de enfermedad SCE: supervivencia causa especifica SG: supervivencia global Estadio SLRLR SLM SLE SCE SG DlSCUSlON En la serie de pacientes aquí descrita encontramos características propias del tumor que reflejan la situación real de esta enfermedad neoplásica en nuestra Estadio I vs II p<o,ooo OR:0,176(0,077-0,406) p<0,022 O.R:0,097(0,013-0,710) p<o,ooo O.R:0,175(0,076-0,403) pco,ooo O.R:0,147(0,057-0,377) pco,ooo O.R:O,I 72(0,071-0,419) provincia. Efectivamente predominan los estadio 1-11, pero sigue existiendo una P53 proporción significativa de estadios avanzados (21%). La distribución por I vs 111 pco,ooo O.R:0,278(0,138-0,560) p<0,008 O.R:O,ll6(0,024-0,565) pco,ooo O.R:0,287(0,143-0,575) pco,oo~ O.R:0,291 (0,138-0,611) ~~0,002 ,332 O.R:0,332(0,165-0,670) tratamientos así mismo, refleja las tendencias terapéuticas y la extensión de la ~~0,056 0.R: 1,932(0,982-3,800) ~~0,043 O.R:2,002(1,023-3,196) p<0,014 O.R:2,556(2,210-5,400) ~~0,023 O.R:2,222(1 ,l 19-4,412) enfermedad que portan las pacientes que nos son referidas. Es de resaltar que a pesar de la cuidadosa selección de los casos remitidos a cirugía 24132(66%) recibieron RT postoperatoria. En el momento actual, nuestro grupo de estudio sería de los mas amplios publicados con respecto a la apoptosis con 201 pacientes, con un seguimiento medio de 7 años que en algunos casos llega a los 20 años de control clínico. Capítulo IV INTRODUCCION El IGF-IR, o receptor de lnsuline Like Growth Factor-? participa en el crecimiento celular además de jugar un papel importante en el proceso metastasico regulando la migración celular, invasión y angiogenesis. Es una molécula transmembrana con actividad tirosin kinasa que se expresa en muchos tipos celulares y presenta una alta secuencia de homología con el receptor de la insulina. Se expresa mayoritariamente en tejidos que juegan un rol en el crecimiento tisular, principalmente via hormona de crecimiento, la cual estimula la producción de IGF-1 para activar el IGF-IR. La unión de IGF-1 R a IGF-1 conducen a la activación de distintas rutas de señalización. Una de ellas activa Ras, Raf, y MAPK, la ruta principal de transducción mitógena, y la otra es responsable de la transducción de la señal antiapoptótica, implicando P13K (Lin J 1999). Su activación previene la apoptosis y estimula la proliferación celular o diferenciación (Navarro and Baserga 2001). Además, el IGF-1 R activado regula la adhesión, organización del citoesqueleto y migración a través de la interacción con moléculas de adhesión e integrinas (Gray et al, 2003). Por otro lado, IGF-IR parece ser crucial en el crecimiento independiente de anclaje, una propiedad única de las células tumorales. Además, estudios recientes han observado que la pérdida de oncogenes supresores, como de la activación de proto-oncogenes, está relacionada con la función y actividad de IGF-1 R (Werner et a1,2000;Girnita et a1,2003;Zhao et a1,2004). Estos estudios demuestran la existencia de una ruta p53lMDM21IGF-1 R en la cual las señales son propagadas en ambas direcciones. Cambios que conducen al aumento de distribución de MDM2 en el núcleo celular inactivando p53, pueden contribuir a un crecimiento avanzado de las células tumorales por sobreexpresión de IGF1 R. En los últimos años se ha observado que IGF-IR también juega un rol significante en la efectividad de la señalización intracelular. Hay estudios que han observado una interacción entre el IGF-1 R y el EGFR (Adams et a1,2004). En cultivos epiteliales humanos, hay un efecto sinergístico de IGF-1 y EGF o TGF-a en la promoción de la síntesis de DNA, aunque en la ausencia de IGF-1, EGF carece de efecto (Stull et a1,2002). Tanto IGF-1 como EGF inducen la expresión de ciclinas D, pero únicamente IGF-1 activa a la ciclina E, la cual se requiere para atravesar el checkpoint G1-S. De este modo, IGF-1 no solo Capítulo IV estimula la progresión del ciclo celular en células epiteliales humanas, sino que es esencial para que la progresión mediada por EGF atraviese el Checkpoint GI-S. Varios receptores de factores de crecimiento se han asociado con la radioresistencia de la célula tumoral. La transducción de la señal radioinducida interacciona con las rutas de señalización de IGF-1 R que siguen a la activación de P13K. Se han identificado a IGF-IR como una proteína capaz de inducir radioresistencia en cáncer de mama, ya que la inhibición de la función de IGF1 R incrementa la respuesta del tumor a la irradiación en cánceres de mama y colon (Wen B. et al 200l).En el estudio de Cosaceanu et al, (2005) se estudia la expresión de IGF-1 R en líneas de cáncer de pulmón no pequeñas (NSCLC). La inhibición de IGF-IR combinada con la irradiación da lugar a un descenso en la muerte celular radioinducida en 5 de 6 líneas de cáncer NSCLC, normalmente resistentes a la radiación ionizante. Entre los receptores tirosin kinasas, IGF-1 R es particularmente importante por su efecto anti-apoptótico frente a la radiación ( Kulik G et al 1997) .Un posible mecanismo que puede contribuir a la influencia de IGF-IR en el bloqueo de la radiosensibilidad incluye la ATM kinasa. Tanto Macaulay et al(2001) como Peretz et al (2001)han mostrado que la inhibición de IGF-IR incrementa la radiosensibilidad, una inhibición que está directamente conectada con la expresión y señalización de ATM (ataxia telangiectasia mutada). No se conoce muy bien los mecanismos biológicos por los cuales este tratamiento combinado induce un efecto antitumoral. Es también posible que otros mecanismos de IGF-1 R induzcan radioresistencia.(Cosaceanu et al 2005) Hay muy pocos estudios sobre la expresión de IGF-IR en carcinoma cervical. Steller et al(1996) observaron que la sobreexpresión de IGF-IR era un componente importante que controlaba la proliferación en células de carcinoma cervical. En el estudio de Hirano et al realizado en 32 pacientes con carcinoma de cérvix, no se observó ninguna relación entre una alta expresión de IGF-1 R y las características clínicas del paciente. (Hirano S. et al 2004) Capitulo IV Por tanto la relación de IGFI-r con la proliferación ha de ser estudiada a través de su relación con las ciclinas, pero también con la apoptosis y sus genes reguladores, que podrian estar implicados en su mecanismo de acción. El objetivo el presente estudio es conocer la expresión de IGFI-r en pacientes de cáncer de cervix y describir la posible relación con Ciclina DI y la proliferación estimada por el lndice Mitótico(1.M.) y la expresión de Ki67. Profundizar en el conocimiento de la regulación por parte de IGFI-r de los procesos de apoptosis y expresión génica de P53,BAX y BCL-2. Definir el papel predictivo de respuesta tumoral y supervivencia que tienen la proliferación y sus genes reguladores. MATERIAL Y METODOS Los datos con respecto a las características de las pacientes, de la extensión de sus tumores y de los tratamientos realizados son idénticas a las descritas en el capitulo 3 de esta obra. Se incluyen aquí nuevamente dichas características, en el intento de permitir la lectura y análisis del presente capítulo contando en el mismo con toda la información que pudiera resultar pertinente. Pacientes Se han incluido en este estudio 201 pacientes afectas de carcinoma localizado de cérvix uterino tratadas y seguidas por los Servicios de Ginecología Oncológica y Oncología Radioterápica, componentes del Comité de Tumores Ginecológicos de la Provincia de Las Palmas de Gran Canaria desde hasta Diciembre de 2004, con un seguimiento medio de 84,74 meses (l.C.95%72,3797,12 meses) máximo de 258 meses (21,5 años). En todos los casos se había realizado una biopsia para confirmación histológica del diagnóstico. Las características generales de las pacientes se detallan en la Tabla 1. La edad media fue de 53,34+1-13,48 años (rango 2689)(distribución norma1,test Kolmogorov-Smirnoff). Las pacientes se estadiaron siguiendo los criterios de la FIGO, realizándose exploración ginecológica y TAC abdomino-pélvico, y en los casos que fue preciso rectoscopia y cistoscopia. La mayoría portaban tumores epidermoides (173 casos,86,1%) en estadios mayoritariamente precoces (1(30,8%)-11(47,8%)). La afectación ganglionar fue Capítulo IV investigada bien por métodos de imagen o en el acto quirúrgico en 134 casos, clasificandose como positiva en 18 casos(13,4%). Los tratamientos realizados variaron segiin el estadio de la enfermedad y el estado general de la enferma, así como el devenir propio de los conocimientos científicos de cada época. Así, las pacientes con tumores precoces I-IIA fueron remitidas inicialmente a cirugía (32 casos,l5,9%) en 24 de ellos se indicó además irradiación postoperatoria, por la existencia de factores de riesgo de recurrencia local, como afectación ganglionar, bordes afectos o afectación parametrial. En las pacientes con tumores más avanzados o en enfermas no susceptibles de cirugía, el tratamiento prescrito fue la irradiación exclusiva(l51 casos, 75,1%,) asociada(65 casos) o no (86 casos) a quimioterapia. En pacientes con mal estado general y tumores muy avanzados (18 casos,9%) el tratamiento fue meramente paliativo, incluyendo la irradiación a dosis bajas como tratamiento del dolor, del sangrado etc. La cirugía practicada fue en todos los casos histerectomía radical tipo II-III con linfadenectomia pélvica en tiempos recientes (tipo Wertheim-Meigs), con preservación de ovarios en pacientes premenopaúsicas. La irradiación incluyó en todos los casos, tratamiento a pelvis total mediante técnica de cuatro campos en "box" con un fraccionamiento convencional de 1,8-2 Gy dia hasta una dosis total de 45-50,4 Gy, seguida de braquiterapia. En los casos de irradiación postoperatoria se realizaron mediante cilindro vaginal. Hasta el año 2000, se realizó una aplicación de braquiterapia de baja tasa hasta administrar 20 Gy a punto A. Apartir del año 2000 se realizaban 3 aplicaciones de 5 Gy cada una mediante un equipo de alta tasa. En los casos de irradiación exclusiva la braquiterapia se aplicó mediante colpostatos y tandem. Hasta el año 2000 mediante 2 aplicaciones de 20 Gy cada una a punto A con un equipo de baja tasa. A partir del año 2000 se realizaron 5 aplicaciones de 5 Gy con un equipo de alta tasa. En aquellos casos que lo requirieron, se realizó boost parametrial. La quimioterapia usada en nuestra serie de pacientes (65 casos) ha sido siempre concomitante con la irradiación, incluyendo Cisplatino a dosis de 40 mgrlm2 semanales, mediante infusión endovenosa durante el periodo de irradiación externa. 1 Tabla 1.- Características generales de las pacientes J Capitulo IV ( Casos 1 Porcentaje Estadio AJCC (2002). AJCC Cancer Staging Manual. Sjxth ed, Springer Verlag: New York. UCC (2002). TNM classification of malignan t tumors. SIxth ed. John Wiley & Sons: New York. III IVA Edad 82 a >S2 a Tipo Histológico Epidermoide Determinación de la apoptosis y de sus genes reguladores. La técnica para la determinación de mitosis ya ha sido descrita por nuestro grupo (Perez S, 1998). De forma concisa, se realizó sobre secciones tumorales con un grosor de 4 micras, fijadas en formalina y teñidas con 45 6 1 04 97 173 hematoxilina. Diez campos fueron analizados en cada sección tumoral, con objetivo de alto poder de aumento (400x), elegidos randomizadamente, aunque evitando las áreas de necrosis e inflamación. Los criterios para definir 18,4 38 51,7 48,3 86,1 Iasapoptosis o cuerpos apoptóticos han sido descritos previamente (Baak et al 1985). El lndice Mitótico (I.A.) fue definido como el cociente entre el número de figuras mitóticas y el número de células contabilizadas en cada tumor, expresado como porcentaje. Para el resto de técnicas(Rey et al 1998; Apolinario et al 1997) se desparafinan las laminillas, mediante pases de xylol y etanol a distintas concentraciones (100%, 70%, 50%), 10 minutos cada pase. Posteriormente se lavan en agua destilada, y se procede a la rehidratación de las muestras, sumergiéndolas en una solución citrato durante 3 minutos a partir de la ebullición de la solución. Tras el lavado de las muestras con agua destilada, se bloquea la peroxidasa endógena mediante H202 diluida en solución salina buffer fosfato (PBS), durante 10 minutos. Una vez desparafinadas, rehidratadas y bloqueada la Capitulo IV peroxidasa endógena, se procederá a la técnica de IHQ específica. En todas se utilizó el kit de detección de DAKO LSBA (Carpinteria, CA) que consta de: lo Blocking Reagent, que bloquea los anticuerpos no específicos (tiempo de incubación 5 minutos), 2' Ac secundario avidin-biotina (tiempo de incubación 30 minutos). El anticuerpo primario específico se pone después del blocking reagent. La dilución y el tiempo de incubación variará según el tipo de anticuerpo a estudio. En todos los procedimientos, se utilizó un control positivo, que correspondía a un tumor con elevada positividad para el anticuerpo a estudio, y un control negativo, en el que se omitia el anticuerpo primario y se ponía PBS. Para la detección de Ki67 se utilizó el Ac monoclonal de ratón anti-MI61 (clona 1001 ,Dianota, Germany), a una dilución 1:100, con un periodo de incubación de 24 horas a 4OC. Si es positivo, se observa tinción de los núcleos de las células tumorales. Para la determinación de Ciclina DI se utilizó el Ac monoclonal de ratón anti-Ciclina DI( AM29,Zymed), a una dilución 1:100, con un periodo de incubación de 24 horas a 4OC. La proteína IGFI-r se expresa en el citoplasma de las células tumorales. Para la detección de IGF-1 R se utilizó el anticuerpo monoclonal de ratón anti-IGF-1 R (Abl Clon 24-31, Neomarkers) en una dilución 1 :100. Las secciones se incubaron posteriormente con un anticuerpo secundario biotinado y posteriormente con un complejo preparado de peroxidasa estreptavidina-biotinada (Dako LSBA kit, Carpintería,CA) y se revelaron con un sustrato de tetrahidroclorhidro diaminobenzidina (Dako DAB Chromogen, Carpintería,CA) y finalmente ligeramente teñida con hematoxilina de Harris. Como control positivo se usaron muestras tisulares con intensa positividad para los marcadores estudiados. Como control negativo, una sección de cada tanda se procesó omitiendo el primer anticuerpo. La expresión proteica de los genes estudiados, fue estimada en las áreas de máxima expresión del marcador, en la menos diez campos con un objetivo de 400x. Cuando la expresión proteica era de localización fundamentalmente nuclear, se ha realizado una estimación cuantitativa del número de núcleos teñidos. La expresión de la oncoproteina estudiada, fue definido como el cociente entre el número de núcleos teñidos y el número de células contabilizadas en cada tumor, expresado como porcentaje En las tinciones de Capitulo IV localización citoplasmática se ha realizado una estimación semicuantitativa en la que en una gradación de negativo(-), débilmente positivo(+), moderadamente positivo (++) y fuertemente positivo(+++), se integran la intensidad de la tinción y la cantidad de células que expresan la proteína. La limitación impuesta por el pequeño tamaño de la pieza a estudiar (biopsia), explica que no hayan podido obtenerse tinciones adecuadas de todos los macadores en todos los casos. Los estudios estadísticos se realizaron mediante un programa inforrnático SPSS 13.0 licenciado a la unidad de estadística (Unidad de Investigación) del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr Negrín. Las variables codificadas como categóricas fueron contrastadas mediante el test de chi cuadrado. Las variables continuas fueron estudiadas para valorar su distribución normal versus no normal mediante el test de Kolmogorov-Smirnoff. Las variables codificadas como continuas fueron analizadas mediante estudios de correlación de Pearsons para variables con distribuciones normales y de Spearman para variables de distribución no normal. El análisis de relación entre variables categóricas y continuas se realizaron mediante análisis de Mann-Withney y Kruskall-Wallis en casos de distribución no normal y T test y análisis de Anova para variables de distribución normal. El análisis rnultivariante se ha realizado mediante test de regresión, lineal en caso de variables dependientes y binomial o polinomial en caso de variables categóricas. El fallo en el control locorregional a largo plazo incluye no solo aquellas enfermas que nunca estuvieron libres de enfermedad locorregional (respuesta no completa tras irradiación), sino aquellas que estando inicialmente libres de enfermedad por irradiación o cirugía recayeron de la enfermedad. El fallo en el control sistémico se definió como la presencia de enfermedad mas allá de la pelvis. Se definió también la supervivencia global, como la probabilidad de estar vivo al final del periodo de observación, cualquiera que fuera la causa y la supervivencia causa-especifica como la probabilidad de no morir de cáncer. La supervivencia actuarial para las variables categóricas se realiz~ mediante el log-rank test para el análisis bivariante. Para las variables Capítulo IV continuas se realizó un analisis bivariante mediante test de Cox simple. Para el análisis multivariante se usó el test de regresión de Cox. RESULTADOS. La expresión del fenómeno de proliferación y de su regulación génica se describen en la tabla 2. El lndice Mitótico (IM) fue estudiado en 200 casos, mostró una distribución no normal de los valores (test Kolmogorov-Srnirnoff) con una media de 1,24+/-0,87%, mediana 1,05(rango 0,04-6,IO). La estimación del fenómeno de la proliferación mediante la expresión de Ki67 fue posible en 164 casos (distribución normal, test Kolmogorov-Smirnoff) y mostró unos valores de 54,74+J-24,74%, mediana 57,42%(rango 0-98%). La expresión de la ciclina DI pudo ser analizada en 141 casos, mostrando una distribución no normal (test Kolmogorov-Smirnoff) con unos valores de 9,71+/-13,34%, mediana 5%, rango(0-70%). La expresión de IGFI-r pudo ser estimada en 138 casos, resultando negativa en solamente 8 casos (5,8%), débilmente positiva en 26(18,8%), moderadamentes positiva en 28 (20,3%) y fuertemente positiva en la mitad de los casos ( 55,1%;76 pacientes). La variable categórica IGFI-r, ha sido agrupada en función de los resultados en el intento de obtener grupos numéricamente homogéneos que potencien los subsiguientes análisis. Así IGFI -r queda configurado en fuertemente positivos 76 casos, frente a 62 casos de tinción menor. Capltulo IV ra 1.- Valores de proliferación (I.M. y W7), Ciclina D1 e IGF1-r. tmos realizado en primer lugar el análisis de la posible relación entre las riables clásicas de pronóstico y la proliferación y sus genes reguladores tudiados. 1 Estadio 1 Histologia 1 Grado 1 Edad tosis 0,54 0,33 0,24 0,66 57 0,98 0,l O 0,81 0,056 : Anova Test '1: Ch i cuadrado 1): Kruskail-Wallis J): Mann-Withney ): Correlación de Pearson ): Spearman-Rho '): Ttest sobreexpresión de ciclina DI está relacionada con estadios zados(p<O.O3O)(Figura 2). Este hecho conforma una estrecha relacióin niveles elevados de genes que regulan la proliferación con la extensión y progresid r Relación a DI con la extensión el tumor Capitulo IV Resulta por tanto relevante un estudio combinado de los procesos de apoptosis y proliferación, siendo fundamentalmente P53 y la Ciclina DI, de entre todas las oncoproteínas estudiadas, las que parecen predecir de forma mas adecuada el porvenir de las pacientes con cáncer de cervix localizado. Parece posible por tanto realizar una combinación de ambas variables que nos podría permitir una mejor definición del resultado terapéutico en nuestra serie de enfermas. La combinación de ambas variables resulta por tanto en cuatro grupos, que se describen en la Tabla 7. Como es evidente por la relación significativa entre P53 y Ciclina DI previamente descrita, la proporción de casos entre todos los grupos, varía en función de la coincidencia de la expresión de ambas oncoproteínas. 1 Tabla 8.- Combinación de las variables] La proporción de casos P53 - 1 ~53/~iclina DI 1 lCiclina DI + representa 1 Casos / Porcentaje 1 prácticamente la mitad de toda 1 1 P53 -1Ciclina DI - 1 37 1 26,2 la serie con 64 casos (45%), 1 1 1 1 casos (55%). Hemos repetido por lo que ha sido enfrentada 1 1 P53+/Ciclina DI - ?53+/CicIina DI + el análisis bivariante de P531Ciclina DI, para todos los parámetros de resultado P53 -1Ciclina DI + del tratamiento ya descritos. En primer término no se observó una relación 7 1 5,O 64 33 significativa con la respuesta a RT(p<O,l5). 45,4 23,4 con el resto de los subgrupos definidos que representan 77 ira 6.- Relación de la expresión de la variable combinada P5Wclina DI, con la '.,d etvivencía. o.W w:m im.w tm,m &,m &PO Supervivencia Cniu Especifica Capitulo IV v1___DISCUSION. La expresión de IGFI-r en pacientes con cáncer de cervix ha sido elevada teniendo en cuenta que mas de la mitad de 10s casos han tenido niveles de expresión fuertemente positivos y en solo 8 casos no se ha detectado epresion de la proteina. Además IGF3-r se relaciona con proliferación y apoptosis incrementada, as; como directamente con BCL-2 y P53 mutada e inversamente con BAX. Se confirman por tanto las estrechas relaciones observadas en estudios preclinicos entre IGFI-r y la regulación del fenómeno apoptótico. No hemos observado sin embargo relación alguna con la supervivencia en nuestra serie. Sin embargo, la Ciclina DI si ha resultado una variable de valor pronóstico relevante, si tenemos en cuenta que niveles elevados de la proteina han resultado predictivos en todas las variables de supervivencia, lo que viene a poner en claro que el estimulo inducido por ciclina en el sistema complejo de la progresión tumoral es evidente. De forma concomitante BCL-2 y Ki67 han resultado de utilidad en el análisis multivarinte en la predicción de la metastatización a distancia evidenciando un papel de primer orden para la proliferación y la inhibición de la apoptosis en este modelo tumoral. PREDICCIÓN DE LA TOXICIDAD CL~NICA RADIOINDUCIDA EN PACIENTES CON CÁNCER DE CERVIX LOCALIZADO MEDIANTE EL ESTUDIO DE APOPTOSIS RADIOINDUCIDA EN LINFOCITOS DE SANGRE PERIFÉRICA (PBLs) Capitulo V PREDICCIÓN DE LA TOXICIDAD CLlNlCA RADlOlNDUClDA EN PACIENTES CON CÁNCER DE CERVIX LOCALIZADO MEDIANTE EL ESTUDIO DE APOPTOSIS RADlOlNDUClDA EN LINFOCITOS DE SANGRE PERIFÉRICA(PLBS). RESUMEN: Antecedentes: El tratamiento del cáncer de cérvix incluye fa cirugia o la irradiación en estadios precoces. Si bien podemos desarrollar ensayos que predigan la respuesta tumoral a uno u otro tratamiento, resulta evidente que la predicción de la toxicidad inducida por los tratamientos sería de utilidad para elegir el tratamiento mas adecuado. La determinación de la radiosensibilidad celular podría ser útil para la predecir que pacientes tienen una sensibilidad exquisita a la radiación y por tanto se les debería ofrecer otro tratamiento. Un test predictivo pre-irradiación debería cumplir una serie de requisitos como son el ser barato, rápido, con pocos falsos negativos o positivos, accesible a cualquier centro donde se pueda realizar tratamientos con RT. Obietivos: Analizar el proceso de apoptosis inducida por radiación en PBLs en pacientes con cáncer de cervix, estudiar su ajuste a un modelo matemático semilogarítmico MIR = p.ln(Gy)+a, y conocer las relaciones que las constantes de definidas por el modelo tienen entre sí y definir su papel en la predicción de la toxicidad clínica que presentan las enfermas tras ser tratadas con irradiación. Métodos: Se incluyeron 99 pacientes afectas de carcinoma de cérvix localizado tratadas mediante cirugía +/-quimioterapia o con radioterapia radical +/-quimioterapia. Los PBLs se obtuvieron tras la centrifugación de las muestras de sangre periférica en un gradiente de densidad (Ficoll-Hipaque). La apoptosis se determinó tras marcaje con Annexina V y yoduro de propidio (IP). Se realizó un análisis por triplicado en todos los pacientes a dosis de 0,1,2 y 8 Gy en análisis a 24,48 y 72 horas. La toxicidad clínica de las pacientes se evaluó según el sistema Lent-Soma. Resultados: La muerte inducida por irradiación (MIR) aumentaron con la dosis de radiación y el tiempo de incubación. Los valores de las constantes a (valor de origen en abscisa) y p (incremento de la apoptosis debido al incremento de la dosis de radiación, pendiente de la curva sernilogaritmica) definidas por el modelo, se retacionaron estrechamente entre si y con el intervalo de tiempo entre el inicio del tratamiento y la determinación de la radiosensibilidad. Los valores de a y p se relacionaron con el daño inducido por la radiación en los tejidos sanos de las pacientes. En el análisis multivariante, solo la edad y los valores de a y p a 24h, resultaron junto con el tratamiento o la dosis de radiación administrada con la braquiterapia, predictivos de la toxicidad clínica observada. Conclusión: Es posible estimar la radiosensibilidad celular de los linfocitos de sangre periférica de una paciente mediante el estudio de la apoptosis radioinducida, con una técnica de AnexinallP que se ajusta a un modelo matemático semilogarítmico, que permite definir variables individuales de radiosensibilidad. Los valores de a y p observados en nuestras pacientes definen un "patrón de radiosensibilidad" individual que junto con la edad y el tratamiento recibido se han relacionado con la toxicidad clínica observada. Es necesario, sin embargo, profundizar en el conocimiento de este fenómeno en las diversas subpoblaciones linfocitarias que permitan ajustar mas adecuadamente el papel predictivo de toxicidad clínica de este tipo de ensayos. Capítulo V El tratamiento del cáncer de cérvix incluye la cirugía o la irradiación en estadios precoces. Si bien podemos desarrollar ensayos que predigan la respuesta tumoral a uno u otro tratamiento, resulta evidente que la predicción de la toxicidad inducida por los mismos sería de utilidad para elegir la opción terapéutica mas adecuada. El daño de los tejidos normales inducido por la radiación, es una de las mayores limitaciones para la curación de los tumores. Las dosis de irradiación están supeditadas a la tolerancia de los tejidos normales incluidos dentro del campo de tratamiento. Por tanto, las dosis máximas a administrar van a estar limitadas por la toxicidad mostrada por un número reducido de pacientes extremadamente radiosensibles. La determinación de la radiosensibilidad celular podría ser útil para la predecir que pacientes tienen una sensibilidad exquisita a la radiación y por tanto referirlos a otro tipo de tratamientos, incrementando la dosis de radiación en aquellos definidos como "radioresistentes". Un test predictivo pre-irradiación debería cumplir una serie de requisitos como son el ser barato, rápido, con pocos falsos negativos o positivos, accesible a cualquier centro donde se pueda realizar tratamientos con irradiación. Las células propuestas más frecuentemente para su utilización en estudios de radiosensibilidad intrínseca han sido los linfocitos de sangre periférica, dada su facilidad de obtención y en número suficiente para los ensayos. Si bien se han utilizado otras técnicas (Capitulo 1), la búsqueda de un método más sencillo y rápido de estimar la radiosensibilidad para su uso rutinario, ha conducido al desarrollo de la técnica de análisis de la apoptosis radioinducida en linfocitos de sangre periférica (PBLs) por citometría de flujo (Ozsahin et al, 1997; Crompton et al, 1999; Barber ef al, 2000; Crompton et al, 2001;0zsahin2005). Se ha descrito una amplia variación interindividual en la tasa de apoptosis radioinducida, que relaciona bajas tasas de apoptosis con mayor toxicidad clínica (Ozsahin et al 1997). Efectivamente existen diferencias estadísticamente significativas de las tasas de apoptosis radioinducida en pacientes normales, pacientes radiosensibles y homocigotos para la Ataxia-Telangiectasia (AT) (Crompton et al, 1999). Barber et al (2000), utilizando un método similar, con la Capitulo V estimación de la apoptosis por marcaje TUNEL, observó un porcentaje muy reducido de apoptosis radioinducida en homocigotos AT (4.7%) y moderadamente disminuido en heterocigotos AT (17.7%), comparado con los porcentajes en pacientes con cáncer de mama y controles sanos (21 -6% y 29.9% respectivamente), no demostraron relación con la toxicidad a dosis únicas de 4 Gy y 24 horas de incubación. Nuestro grupo utiliza una técnica de determinación de Annexina -loduro que permite la detección precoz de apoptosis, con la que hemos observado que la apoptosis radioinducida aumenta con la dosis administrada y el tiempo de incubación(Pinar 2000). Este aumento en la tasa de apoptosis dosisdependiente no sigue una función linear, de manera que aumentos de dosis administrada, no van acompañados de aumentos proporcionales en la muerte celular radioinducida. Nuestro grupo cuyos resultados vienen definidos por un modelo matemático, MIR = P.ln(Gy)+a, que permite obtener valores característicos únicos (a: origen en abscisas y p: pendiente de la curva) que define la radiosensibilidad intrínseca de un individuo. El objetivo de este estudio es analizar el proceso de apoptosis inducida por radiación en PBLs en pacientes con cáncer de cérvix, estudiar su ajuste a un modelo matemático semilogarítmico MIR = P.ln(Gy)+a, y conocer las relaciones que las constantes de definidas por el modelo tienen entre sí y definir su papel en la predicción de la toxicidad clínica tardía que presentan las enfermas tras ser tratadas con irradiación. MATERIAL Y MÉTODOS Pacientes Se han incluido en este estudio 94 pacientes afectas de carcinoma localizado de cérvix uterino tratadas y seguidas por los Servicios de Ginecologia Oncológica y Oncología Radioterápica, componentes del Comité de Tumores Ginecológicos de la Provincia de Las Palmas de Gran Canaria, y que aceptaron participar en este estudio. La obtención de la muestra y el desarrollo del proceso técnico de medida, comenzó en Abril de 2003 y finalizó en Marzo de 2004. La evaluación de la toxicidad clínica se realizó en la consulta de Capítulo V Oncología Radioterápica por parte de la Dra Pinar. El análisis de los resultados de la citometría,"gating" y construcción del modelo matemático para cada paciente se realizó aposteriori. El seguimiento medio fue de 26,07+1-17,69. mediana 23,OO rango 3-73. En todos los casos se había realizado una biopsia para confirmación histológica del diagnóstico. Las características generales de las pacientes se detallan en la Tabla 1. La edad media fue de 51,07+/-13,07, mediana 48 años (rango 26-89)(distribución normal,test Kolmogorov-Smirnoff). Las pacientes se estadiaron siguiendo los criterios de TNM. La mayoría portaban tumores epidermoides (71 casos,75,1%) en estadios mayoritariamente precoces (l(53,3%)-ll(40,2%)). Los tratamientos realizados variaron según el estadio de la enfermedad y el estado general de la enferma, así como el devenir propio de los conocimientos científicos de cada época. Así, las pacientes con tumores precoces 1-IIA fueron remitidas inicialmente a cirugia y radioterapia postoperatoria (25 casos) en 7 de ellos se indicó además quimioterapia adyuvante. En las pacientes con tumores más avanzados o en enfermas no susceptibles de cirugía, el tratamiento prescrito fue la irradiación exclusiva (69asos) asociada(51 casos) o no (18 casos) a quimioterapia. La cirugía practicada fue en todos los casos histerectomía radical tipo II-III con linfadenectomía pélvica en tiempos recientes (tipo Wertheim-Meigs), con preservación de ovarios en pacientes premenopaúsicas. La irradiación incluyó en todos los casos, tratamiento a pelvis total mediante técnica de cuatro campos en "box" con un fraccionamiento convencional de 1,8-2 Gy día hasta una dosis total de 45-50,4 Gy, seguida de braquiterapia. En los casos de irradiación postoperatoria se realizaron mediante cilindro vagina1 realizándose 3 aplicaciones de 5 Gy cada una medíante un equipo de alta tasa. En los casos de irradiación exclusiva, la braquiterapia se aplicó mediante colpostatos y tandem realizándose 5 aplicaciones de 5 Gy con un equipo de alta tasa. La dosis media de la irradiación externa fue de 48,84+/-7,64, mediana 506y (rango 0-60 Gy). La dosis media de braquiterapia fue de 22,47+/- 8,11, mediana 25 Gy rango 0-40 Gy. La combinación de ambas ha sido considerada la dosis total administrada con una media 70,34+1-12,37, mediana 75 Gy rango 16,50-90. Capítulo V La quimioterapia usada en nuestra serie de pacientes (58 casos) ha sido siempre concomitante con la irradiación externa, incluyendo Cisplatino a dosis de 40 mgr/m2 semanales, mediante infusión endovenosa durante el periodo de irradiación externa. AJCC (2002). NCC Cancer Staging Manual. Skth ed. Springer Verlag: UICC (2002). TNM classification of malignant tumors. Sixth ed. John Wiley & Sons: New York. New York. Para la estimación de la toxicidad radioinducida se utilizó la Clasificación LENTSOMA. Se clasificaron en toxicidad sexual, vaginal, intestinal, rectal y urinaria estratificadas de grado O (no toxicidad) a grado 4 (toxicidad grave). En nuestra serie de pacientes no se produjo ninguna muerte tóxica (grado 5). Obtención de muestras, irradiación y preparación de linfocitos Las muestras heparinizadas de 10 cc de sangre periférica se obtuvieron por venopunción periférica de donantes sanos y 99 pacientes tratadas por carcinoma de cérvix localizado. Los linfocitos fueron separados por centrifugación en un gradiente de densidad (Linfoprep, Gibco, Life Technologies). La capa mononuclear se extrajo y se resuspendió en medio RPMl 1640 (Biowhittaker), conteniendo penicilina, estreptomicina, glutamina y 25 mM Hepes, suplementado con 10% suero AB (Sigma), a una concentración de 2.10~ células ml". La suspensión celular separada fue posteriormente dividida en 4 frascos de cultivo de 25 cc, tres para Capitulo V ser irradiados y uno como control. Las células fueron irradiadas a temperatura y oxigenación ambiental, a dosis de O, 1, 2 y 8 Gy mediante fotones de 6 MV (Mevatron, Siemens), con una tasa de dosis de 50 c~y.min". Tras la irradiación, las muestras se incubaron a 37'~, 5% COZ, durante 24 y 72 horas. Después de 24 horas, el contenido de cada frasco se distribuyó en 3 tubos de 5 cc, conteniendo 150.000 células cada tubo, aproximadamente, y se centrifugó a 500 G durante 10 minutos en 3 ml de PBS libre de Ca" y Mg". Posteriormente se decantó la mayor parte del sobrenadante y el pellet celular se resuspendió en 100 pl de buffer del kit de Annexina V (Pharrningen, Becton Dickinson). Tras añadir 4 pl de Annexina-V-FITC y 10 yl de yoduro de propidio (IP), las células fueron sometidas a incubación en la oscuridad, a temperatura ambiente, durante 15 minutos. Previamente al análisís de citometría de flujo, se añadieron 400 pl de buffer del kit de Annexina V. El mismo proceso se repitió tras 72 horas de incubación. Todos los ensayos se analizaron por triplicado. Citometría de flujo La citometría de flujo, analizando tres parametros, se realizó mediante un citómetro de flujo FACScalibur (Becton Dickinson) con excitación mediante un láser de argón de 488 nm. Los datos fueron analizados mediante el programa BD CellQuest mediante un software Macintosh (Apple Computer, Inc., Cupertino, CA) y se calcularon los niveles de apoptosis temprana y tardía. Se adquirió un mínimo de 6000 eventos en la región seleccionada de cada muestra y se analizaron las fluorescencias específicas de la anexina V (FTIC, fluorescencia verde, canal FLI) y el IP (fluorescencia roja y tercer color, canales FL2 y FL3) mediante amplificación logarítmica. Teniendo en cuenta los parámetros de tamaño celular (forward scatter) y complejidad celular (side scatter) se seleccionó la población de linfocitos tanto vivos como apoptóticos, estos últimos se caracterizan por presentar menor tamaño y una complejidad ligeramente mayor que la población de células vivas (Figura 1). Capitulo V quimioterapia que construyen la variable tratamiento. Solo el intervalo temporal entre el tratamiento y la determinación de la apoptosis radioinducida fue capaz de definir adecuadamente las constantes de radiosensibilidad. 1 Tabla 5.- Análisis de regresión de variables a, B a 24,48 y 72 horas e Intervalo 1 ~ratamiento-~eterminaaón de radiosensibilidad. Valor de p 1 Riesgo Relativo 1 Intervalo de I - 1 Confianza (95%) 1 La toxicidad observada en nuestra serie de pacientes es descrita en la Tabla 6. Podemos observar que la mayoría de las enfermas no sufrieron toxicidad o lo hicieron de una forma leve, especialmente las referentes a la toxicidad gastrointestinal (70,8%), rectal (73,8%) y urinaria (70,7%). La mitad de las pacientes (48 casos;51,1%) seguían manteniendo relaciones sexuales en el momento del análisis de nuestra serie. Tabla 6.- Toxicidad clinica observada en la serie general de pacientes, Toxicidad 1 Ninguna 1 Grado 1 1 Grado 2 1 Grado 3 1 Grado 4 Analizando de forma "cruda" la relación entre las toxicidades clínicas observadas y las variables clásicas de pronóstico y las constantes del modelo de radiosensibilidad, observamos una estrecha relación para muchas de las variables dependientes del tratamiento con la toxicidad. También la edad avanzada se relacionó con la toxicidad rectal y menos relaciones sexuales. (Glosario ) Sexual Vaginal Intestinal Rectal Urinaria - 15 (1 6,0%) 13 (13,8%) 67 (71,3%) 70 (745%) 67(71,3%) 31 (33,0%) 35 (37,2%) 21 (22,3%) 1 11 7% 16 (17,0%) 32 (34,0%) 35(37,2%) 3 (3,2%) 9(9,6%) 8 (8,5%) 12 (1 4,9%) 1 1 (1 1 ,7%) 2 (234 3(3,2%) 2 (2,1%) 2(2,1%) O(O%) l(l,l%) l(l,l%) l(l,l%) Capitulo V Tabla 7.- Correlación entre la variables a, ,O a 24,48 y 72 y las variables dependientes del 1 huésped, tumor y tratamientos con la toxicidad clínica observada. 1 Toxicidad 1 Toxicidad 1 Toxicidad ( Toxicidad 1 Toxicidad 1 Relaciones 1 Sexual 1 vagina1 1 Intestinal 1 Rectal 1 Urinaria 1 Sexuales 1 De lo anteriormente expuesto se deduce que la toxicidad clínica observada se Edad Estadio Histología Grado Cirugía relaciona bien con las variables dependientes del tratamiento. Además podemos observar que existe una estrecha relación entre un mayor periodo de P<0,058 seguimiento y mayores tasas de toxicidad clínica tardía. Hemos realizado por tanto un análisis de Cox simple en que valoramos el riesgo (odd ratio) que P<0,038 comportan niveles crecientes de un factor en la probabilidad de padecer el evento problema a estudio. P<0,059 P<O,O11 Tabla 8.- Correlación entre la variables a, /3 a 24,48 y 72 y las variables dependientes del huésped, tumor y tratamientos con la toxicidad clínica obsewada. (O.R.:Odds rafios) P<O,OOOl P<0,048 Edad Estadio Histología Grado Tratamiento Dosis Total Relaciones Sexuales P-=O,OOO~ 0.R: 1,038 (1,018-1,058) Toxicidad Sexual # Toxicidad Intestinal * ~<0,060(3) O.R:0,296 (0,083-1,054) , Toxicidad vagina1 # Toxicidad Rectal * Toxicidad Urinaria * ~0,052 0.R: 1,047 (1,000-1,097) n la intención de mostrar gráficamente el impacto que las constantes de mplo algunas de las gráficas que han resultado significativas en el análisis . ariante mediante el lag-rank test. 6.- Relación de las constantes a y P con la toxicidad clínica .. Y 4emos realizado un análisis multivariante mediante regresión de Cox, para &!,, ,t "' mocer el impacto que las diversas variables estudiadas tienen en la ,. . S m i 0 redicción de la probabilidad de estar libre de toxicidad grave sexual y vaginal - grado3-4) y de sufrir toxicidad intestinal, rectal o urinaria (gradol-4). La rlección de este análisis tiene que ver con la relación que las toxicidades letectadas tienen con el tiempo de seguimiento de la enferma. Efectivamente 1 ser toxicidades crónicas las aquí estudiadas, estas serán menos frecuentes In las pacientes con seguimientos menores. De forma que hemos de tener en uenta no solo la relación entre toxicidades y variables pronósticas, sino spacio temporal en que se producen. !' L 1 Capitulo V Tabla 5.- Análisis multivariante mediante regresión de Cox, de la relación entre toxicidad clínica y variables pronósticas. 1 Toxicidad 1 Toxicidad 1 Edad I I Tratamiento Dosis RT externa Dosis Braquiterapia P<0,018 a 24 O.R:1,151 (1,024-1,294) P<0,040 ¿3 24 O.R:0,787 (0,627-0,989) Toxicidad Toxicidad Toxicidad Relaciones Intestinal Rectal Urinaria Sexuales P<0,0003 O.R:1,045 (1,015-1,075) RT/RT+QT(I ) P<0,070 O.R:0,213 (0,040-1,133) De forma general, parece que tanto la edad como el valor de a y ,8 a 24 horas, han resultado predictivas de algunas de las toxicidades presentes en nuestra serie clínica de pacientes. Los factores dependientes de la opción terapéutica elegida (tratamiento) o de la dosis de braquiterapia, están relacionadas con la toxicidad intestinal agravada por la quimioterapia(p<0,070) o la cirugía (p<0,039) y las relaciones sexuales (~~0,025) respectivamente. La írradiación es un tratamiento capital en la mayoría de los tumores, especialmente en el carcinoma cervical donde es el tratamiento de elección en los tumores localmente avanzados, compitiendo además con la cirugía en los tumores en estadios precoces. El daño inducido por la radiación en los tejidos normales, es un factor limitante para la curación por irradiación de un amplio panel de tumores. Es necesario por tanto el desarrollo de ensayos predictivos de toxicidad. El método por nosotros usado tiene algunas ventajas sobre otros publicados como son la mejor detección de la apoptosis precoz mediante el uso de annexina, y la modelización de los datos de MIR que se ajustan adecuadamente a un modelo semilogarítmico que define constantes con Capitulo V - valores individuales a cada paciente. Además este modelo permite integrar en un solo valor a, /? la apoptosis radioinducida a diversas dosis de radiación. Hemos observado en nuestra serie de pacientes que las variables a, p se relacionaban (salvo contadas excepciones) estrechamente entre sí. Este hecho parece confirmar que si bien los niveles de apoptosis a dosis O del modelo (constante u) aumentan su valor conforme se incrementa el periodo de incubación de los linfocitos, estos valores representan una condición intrínseca del paciente, como también sucede con los valores de B. Sin embargo los resultados del grupo suizo (Ozsahin 1997,2005 y Crompton 1997,2001 ) no han encontrado esta relación. Sin embargo (Schmitz et al 2003) usando una técnia similar a la nuestra (incluye marcaje con annexina) encontraron una estrecha relación entre la apoptosis espontánea y la radioinducida en todas las subpoblaciones estudiadas. Además la apoptosis espontánea era mas importante en las subpoblaciones mas radiosensibles. Además en algunas 3 series se encontró una estrecha relación de la apoptosis espontánea con la - 0 m edad de forma inversa (Crompton et al 2002) o entre apoptosis espontánea y O 4 radioinducida de forma inversa (Schmitz et al 2005) o ninguna relación (Barber n et al 2000). - El segundo hecho relevante de nuestro estudio es que los valores de las m O constantes del modelo se incrementan en función del periodo transcurrido entre e/ tratamiento con radiación y la realización del experimento. Descartamos en n O nuestro estudio la posibilidad de que los procedimientos para determinar la O apoptosis radioinducida pudieran estar subyacentes al resultado observado. Las enfermas fueron siendo incluidas en el estudio de forma aleatoria, la irradiación y marcaje se llevo a cabo durante aproximadamente un año y medio, el análisis de los datos de citometría de flujo y posteriormente la construcción del modelo matemático, se realizó de consecutivamente en todos los pacientes de forma anónima. Si bien el uso de quimioterapia podría potenciar este efecto, el hecho es que el intervalo entre el tratamiento indicado y la determinación de la apoptosis, es el factor que mejor explica el proceso. Este hecho podría venir explicado por la selección de subpoblaciones linfocitarias durante la misma irradiación que condicionaría radiosensibilidades distintas y la modificación del sistema linfocitario, que tras sufrir tratamientos Capítulo V que dañan el DNA (RT) modifica su equilibrio predominando subpoblaciones que confieren una cierta radioresistencia clínica (mas apoptosis menor toxicidad clínica). Efectivamente la linfopenia inducida por radiación puede persistir durante años tras la exposición, al contrario que la granulopenia que se normaliza en 1-3 meses. En un estudio reciente Louagie H et al (1999) demuestran en pacientes con cáncer de cérvix que tras tratamiento de irradiación, se producen cambios significativos en la proporción de subpoblaciones linfocitarias circulantes. Efectivamente este decremento afecta en primer término a los Linfocitos B (los mas radiosensibles) , seguidos de los T (tanto CD4 como CD8) y finalmente los NK. No resulta por tanto descabellado pensar que los hallazgos observados en nuestra seríe corresponden a cambios relativos en la proporción de subpoblaciones, pero también probablemente a modificaciones en las tasa de apoptosis mostrada por esas mismas estirpes % D linfocitarias tras la selección clonal que induce la radiación. Así ha sido descrito j que al menos el número de NK y su radiosensibilidad variaría con la irradiación - - 0 previa. Efectivamente Rana et al (1990) analizaron la sensibilidad de las células 8 4 NK después de la exposición a diferentes dosis de radiación gamma y - observaron que la radiación ionizante se encargaba de seleccionar - positivamente aquellas subpoblaciones de células NK más citotóxicas o i estimulaba la actividad citotóxica en células supervivientes. Además se observó - - una relación con la vida media de los linfocitos in vivo. Así, poblaciones n - linfocitarias con una corta vida media in vivo eran más susceptibles a la apoptosis in vitro y viceversa. De hecho tras irradiaciones totales a bajas dosis se produce una expansión de células NK en Ea sangre y bazo de ratones, mediada por IL12 e IL8 (Miller et al 2003). Esto significaría que modificaciones en la expresión y liberación de citoquinas, con la consiguiente influencia sobre la activación y proporción de las distintas subpoblaciones podría tener lugar. Efectivamente, este incremento de producción de citoquinas produce un efecto "by stander" en las células adyacentes no irradiadas, amplificando el efecto de la radiación. Sin olvidar que nuestra serie tiene ah un corto seguimiento, hecho relevante a la hora de analizar la toxicidad radioinducida, hemos observado una relación entre el valor de las constantes a, p con la toxicidad clínica observada en Capítulo V nuestras pacientes. Efectivamente además del impacto que los diversos tratamientos y la edad de las pacientes han tenido en la predicción de la toxicidad en análisis bivariantes, niveles progresivamente más elevados de U y B. En el momento actual, los resultados publicados son los de dos grupos europeos de investigación. Los estudios iniciales fueron realizados por el grupo suizo (Ozsahin ef al, 1997; Crompton et al, 1999 y 2001), analizando la apoptosis por tinción con IP y por tamaño celular. La radiosensibilidad intrínseca variaba entre los linfocitos CD4 y CD8, siendo la respuesta apoptótica diferente y progresivamente menor desde pacientes sanos a pacientes radiosensibles o con ataxia-telangiectasia (AT). Además, los pacientes con bajas tasas de apoptosis radioinducida mostraban toxicidades clínicas mas graves en los estudios antes citados salvo en el estudio de Barber (2000) r. D Este hecho que podríamos considerar sorprendente, ya que una mayor tasa de 3 apoptosis se relaciona con menor toxicjdad clínica, es un hallazgo constante en - e m las serie originales antes citadas, pero también en estudios recientes que O 4 incluyen análisis de las diversas subpoblaciones (Oszahin 2005). n Efectivamente, los linfocitos de pacientes que sufren el síndrome de ataxia = m teleangiectasia, tienen tasa de apoptosis menores, que los linfocitos de O pacientes heterocigóticos para AT y estos menos que los pacientes de cáncer y de la misma forma los últimos, menos que los linfocitos de controles sin cáncer. n - O O La explicación de este fenómeno no es sencilla, y tiene que ver con la elección de la vía de muerte que la célula elige una vez el daño inducido por la radiación es considerado irreparable. Así ha sido publicado que en pacientes con AT y otros síndromes de radiosensibilidad como síndrome de Bloom o anemia de Fanconi, los linfocitos no muestran una inducción de P53 tras el daño causado por radiación (Dachaud et al 1994,Roselli et al 1995). Esto determina una deficiente respuesta apotótica tras irradiación aunque con altos niveles de apoptosis espontánea (Dachaud et al 1994). De hecho las subpoblaciones linfocitarias con menos apoptosis muestran niveles bajos de BAX(Mori M y Desaintes C 2005). Para Ozsahin et al (2005) esta relación entre radiosensibilidad y apoptosis reducida aunque aún sin clarificar, podría estar en relación con la adecuación de la respuesta a irradiación que incia el linfocito. Capítulo V Por tanto la no inducción de apoptosis significaría una respuesta no adecuada, basada e alteraciones moleculares, que se asocian con toxicidad tardía grave. En nuestra opinión, es posible estimar la radiosensibilidad celular de los linfocitos de sangre periférica de una paciente mediante el estudio de la apoptosis radioinducida, con una técnica de AnexinaIlP que se ajusta a un modelo matemático semilogarítmico, que permite definir variables individuales de radiosensibilidad. Los valores de a y p observados en nuestras pacientes definen un "patrón de radiosensibilidad" individual que junto con la edad y el tratamiento recibido se han relacionado con la toxicidad clínica observada. Es necesario, sin embargo, profundizar en el conocimiento de este fenómeno en las diversas subpoblaciones linfocitarias que permitan ajustar mas adecuadamente el papel predictivo de toxicidad clínica de este tipo de ensayos. es posible estimar la radiosensibilidad celular de los linfocitos de sangre periférica de una paciente mediante el estudio de la apoptosis radioinducida, con una técnica de AnexinaIlP desarrollada a este efecto por nuestro grupo. De más hemos observado un importante papel predictivo de las constantes que definen el modelo de radiosensi bilidad la toxicidad generada por la radiación. PREDICCIÓN DE LA TOXICIDAD NlCA RADlOlNDUClDA EN PACIENTES CON CÁNCER DE CÉRVIX LOCALIZADO MEDIANTE EL ESTUDIO DE APOPTOSIS RADlOlNDUClDA EN SUBPOBLACIONES DE LINFOCITOS DE SANGRE PERIFÉRICA (PBLS)