Caracterización físico-química de los lixiviados del cacao y café del litoral ecuatoriano, como potenciales fuentes de producción de bioetanol

D. ANTONIO NIZARDO BENÍTEZ VEGA, EN CALIDAD DE SECREATRIO DEL DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA DE PROCESOS DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA. CERTIFICA Que la Comisión de Doctores del Departamento de Ingeniería de Procesos, en su sesión de fecha de 23/11/2015, tomó el acuerdo de dar consentimiento para su tramitación, a la Tesis Doctoral Titulada, “Caracterización físico – química de los lixiviados de cacao y café del litoral ecuatoriano, como potenciales fuentes de producción de bioetanol”, presentada por el Doctorando, D. Carlos Alejandro Balladares Grazzo y dirigida por la Dra. Patricia Isabel Manzano Santana, el Dr. Sebastián Ovidio Pérez Báez y el Dr. Juan Emilio González González. Y para que así conste a efecto de lo previsto en el Art. 6.2 del Reglamento para la elaboración, tribunal, defensa y evaluación de tesis doctorales de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, firmo la presente en Las Palmas de Gran Canaria, a los veintitrés días de noviembre de dos mil quince. UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA DEPARTAMENTO DE INGENIERIA DE PROCESOS Programa de Doctorado en Ingeniería Ambiental y Desalinización Título de la Tesis “CARACTERIZACIÓN FÍSICO - QUÍMICA DE LOS LIXIVIADOS DEL CACAO Y CAFÉ DEL LITORAL ECUATORIANO, COMO POTENCIALES FUENTES DE PRODUCCIÓN DE BIOETANOL” Tesis Doctoral presentada por: D. Carlos Balladares Grazzo Dirigida por los Doctores D.a Patricia Manzano Santana D. Sebastián Pérez Báez D. Juan González González El Director El Director El Director El Doctorando Las Palmas de Gran Canaria, a Noviembre de 2015    ABREVIATURAS  FAO Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura. Food and Agriculture Organization of the United Nations FDA Agencia de Alimentos y Medicamentos Food and Drug Administration OMS Organización Mundial de la Salud OMM Organización Meteorológica Mundial ANECAFE Asociación Nacional de Exportadores de Café COFENAC Consejo Cafetalero Nacional ANECACAO Asociación Nacional de Exportadores de Cacao INEN Instituto Ecuatoriano de Normalización MAGAP Ministerio de Agricultura, Ganadería y Pesca ANDES Agencia Pública de Noticias del Ecuador y Suramérica MEER Ministerio de Electricidad y Energías Renovables DBO Demanda Bioquímica de Oxígeno   DQO Demanda Química de Oxígeno FDT Fibra Dietaria Total FDS Fracciones Dietaria Soluble FDI Fracciones Dietaria Insoluble BRAC Biomasa Residual Agrícola AAS Espectrometría de Absorción Atómica                 SIMBOLOGÍA  °C Grados centígrados Na Sodio CO2 Dióxido de Carbono K Potasio Ca Calcio Mg Magnesio Fe Hierro mg Miligramo g Gramo Kg Kilogramo ml Mililitros L Litros pH Potencial de Hidrógeno rpm Revoluciones por minuto H2O Agua CaCl2 Cloruro de Calcio Ca(OH) 2 Hidróxido de Calcio Al2(SO4) 3 Sulfato de Aluminio lb Libra h Hora C12H22O11 Sacarosa   C12H22O11 Maltosa C12H22O11·H2O Lactosa C6H12O6 Glucosa C6H12O6 Fructosa                    GLOSARIO DE TÉRMINOS Alcaloides: compuesto químico que contiene nitrógeno de gusto amargo. Biofertilizantes: organismos vivos que son usados en la agricultura como fertilizantes de las plantas. Su uso está muy extendido en la agricultura ecología, al no poder utilizar en ellos fertilizantes sintéticos. Biomasa: es la única energía renovable de la cual se pueden obtener combustibles líquidos de alta densidad energética para sustituir a combustibles fósiles en transporte terrestre, aéreo y marítimo. Biopolímeros: son macromoléculas presentes en los seres vivos. Una definición de los mismo que considera materiales poliméricos o macromoleculares, sintetizados por los seres vivos. Boyado: es previo al despulpado y consiste en sumergir los frutos de café en recipientes plásticos o estanques de cemento, para eliminar por flotación residuos de cosecha como hojas, tallos, materia extraña y frutos en mal estado. CCN51: es un cacao clonado de origen ecuatoriano, reconocido por su alta producción. Cromatografía: método de análisis que permite la separación de gases o líquidos de una mezcla por adsorción selectiva, produciendo mancha diferentemente coloreada en medio adsorbente; está basado en la diferente velocidad con la que se mueve cada fluido a través de una sustancia porosa. Desmucilaginado: es el proceso por el cual se desprende la mucosidad que se encuentra entre el grano y la cereza de café, este proceso se ha realizado de manera química y artesanal, basada en la fermentación del grano después del despulpado. Endocarpio: es la capa interior del fruto, aquella que rodea a las semillas.   Epicarpio: capa externa de las tres que forman el pericarpio de los frutos, como la piel del melocotón. Estabilidad organoléptica: son todas aquellas descripciones de la características físicas que tiene la materia en general, según la pueden percibir los sentidos, por ejemplo su sabor, textura, olor y color. Gases de efecto invernadero: componentes gaseosos de la atmosfera que permiten que la radiación solar, penetre hacia la superficie de la Tierra y que absorben la radiación infrarroja que emana, contribuyendo de esta manera al efecto invernadero. Lípidos: conjunto de moléculas orgánicas compuestas principalmente por carbono e hidrogeno y en menor medida oxigeno, aunque también pueden contener fósforo, azufre y nitrógeno. Mesocarpio: parte intermedia del pericarpio en los frutos carnosos. Polifenoles: son compuestos bioactivos con capacidad antioxidante. En los últimos años, se le han atribuido efectos beneficiosos frente al desarrollo de diversas enfermedades. Polisacáridos: son moléculas formadas por la unión de una gran cantidad de monosacáridos. Se encuentran entre los glúcidos, y cumplen funciones diversas, sobre todo de reservas energéticas y estructurales. Índice General   INDICE GENERAL Pág. 1.0 Introducción. 01 CAPITULO 1. 09 1.1 Introducción. 11 1.2 Agricultura exportable de Ecuador. 12 1.3 Superficie, producción y variedades de cacao. 14 1.3.1 Cacao. 14 1.3.2 Café. 20 1.4 Cosecha del Caco y Café. 24 1.4.1 Cacao. 24 1.4.2 Café. 26 1.5 Métodos de Beneficio del Caco y Café. 28 1.5.1 Beneficio del Café. 28 1.5.1.1 Beneficio por vía seca. 29 1.5.1.2 Beneficio por vía húmeda. 30 1.5.1.3 Beneficio semihúmedo. 34 1.5.1.4 Beneficio ecológico. 35 1.5.1.5 Beneficio húmedo enzimático. 35 1.5.2 Beneficio del Cacao. 36 1.6 Residuos del beneficio del cacao y café. 35 1.6.1 Características principales de los Residuos de los residuos del Beneficio del Cacao. 38 1.6.2 Características principales de los Residuos del Beneficio del Café. 41 CAPITULO 2. 45 2.1 Biocombustibles de segunda generación. 48 2.2 Antecedentes de investigaciones. 52 2.3 Métodos de análisis avanzados. 65 2.3.1 Cromatografía de Gases acoplado a Espectrometría de masa GC-MS 66 2.3.2 Cromatografía líquida de alta resolución HPLC 67 2.3.3 Espectrometría de Absorción atómica AAS 67 2.4 Planteamiento del problema. 68 2.5 Justificación de la investigación 73 2.6 Hipótesis. 79 2.7 Objetivos. 79 2.7.1 Objetivo General. 79 2.7.2 Objetivo Específico. 79 CAPITULO 3 81 3.1 Metodología de la investigación. 85 Índice General   3.2 Recolección y selección del material vegetal. 85 3.3 Evaluación macromorfológica de los frutos de Café y mazorca de Cacao. 89 3.4 Obtención de lixiviados de Café y Caco. 93 3.4.1 Obtención de lixiviados de Cacao. 93 3.4.2 Obtención de lixiviados de Café. 93 3.5 Análisis físico-químicos. 94 3.5.1 Tamizaje fitoquímico. 97 3.6 Preparación y deshidratación de las muestras. 100 3.7 Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de masas. 101 3.7.1 Silanización de muestras deshidratadas. 101 3.7.2 Análisis cromatográfico. 102 3.8 Absorción atómica. 103 3.8.1 Digestión de la muestra. 103 3.8.2 Lectura en el Espectrofotómetro de la Absorción Atómica. 104 3.9 Esquema metodológico 104 CAPITULO 4 107 4.1 Introducción 109 4.2 Caracterización macromorfológica de los frutos del café y cacao y sus lixiviados. 109 4.3 Identificación de metabolitos secundarios por tamizaje fitoquímico. 124 4.4 Contenido de azúcares totales, azúcares reductores y perfil de azúcares. 127 4.5 Identificación de compuestos por CG-EM de los lixiviados de Theobroma cacao L., y Coffea canephora L. 129 4.6 Cuantificación de microelementos por Espectroscopia de Absorción Atómica y otras especies presentes en los lixiviados de Theobroma cacao L., y Coffea canephora L. 144 CAPITULO 5 147 5.1 Conclusiones 149 BIBLIOGRAFÍA 153 Índice de Gráfico   INDICE DE GRÁFICOS Pág. Gráfico 1.1 Superficie plantada según cultivos permanentes 13 Gráfico 1.2 Volúmenes de exportación de cacao (2011 – 2014) 19 Gráfico 1.3 Porcentaje de producción de grano de cacao fino de aroma a nivel mundial. 19 Gráfico 1.4 Porcentaje de área cultivada por provincia del total nacional. 20 Gráfico 1.5 Esquema del proceso de beneficio por vía seca:Café natural de alta calidad 29 Gráfico 1.6 Esquema del proceso de beneficio por vía seca:Café natural corriente. 30 Gráfico 1.7 Esquema de los métodos de beneficio para preparar cafés lavados 31 Gráfico 4.1 Composición porcentual del fruto de Coffea canephora L. 111 Gráfico 4.2 Evaluación del número necesario de componentes principales 114 Gráfico 4.3 Composición porcentual del fruto de Theobroma cacao L 117 Gráfico 4.4 Composición de la almendra húmeda de Theobroma cacao L, antes de la fermentación. 118 Gráfica 4.5 Rendimiento de lixiviado de Theobroma cacao L., no asociado a la fermentación. 119 Gráfico 4.6 Gráfica de cargas de componentes principales 123 Introducción 2 energía y que promueva el desarrollo sostenible sobre bases de equidad y justicia social (Lescaroux, 2011). En este marco, la generación de fuentes de energía amigables con la naturaleza está tomando una gran responsabilidad mundial y los países dirigen sus investigaciones y desarrollo tecnológico, en la búsqueda de energías a partir de recursos renovables (Twewrgy, 2012). El casi perfecto ciclo natural de los recursos renovables, da origen a la biomasa y en particular a la biomasa lignocelulósica, que se revela como una prometedora fuente de energía renovable y generación de químicos (Astor, y otros, 2013). Está demostrado que la biomasa mediante procesos físicos, químicos y biológicos, junto con el empleo de bacterias naturales o modificadas, permiten fermentar los azúcares que contienen y convertirlos en alcoholes. La biomasa, es la única energía renovable de la cual se pueden obtener combustibles líquidos de alta densidad energética para sustituir a combustibles fósiles en transporte terrestre, aéreo y marítimo (Lescaroux, 2011). De los principales componentes de la biomasa, la celulosa es uno de los biopolímeros más abundantes en la naturaleza y su biosíntesis química y estructura, aún permanecen activos como campo de investigación. En las últimas décadas ha habido un creciente interés por desarrollar proyectos sostenibles basados en la química verde, lo que ha conducido a la generación de materiales y compuestos celulósicos novedosos (Gradwell, 2004). En la actualidad los biocombustibles han recibido una principal atención mundial, debido a su potencial uso como complemento y/o sustitutos de los combustibles de fuentes fósiles (Leyva & Gonzaga, 2011). Introducción 3 Los volúmenes promedio de producción de cacao y café en el 2014 en Ecuador fueron de; 230.000 toneladas métricas de cacao (ANDES, 2014) y para el café, la Asociación Nacional de Exportadores de Café, (ANECAFÉ) reporta que el país exportó 1.131.190,84 sacos de 60kg (67.871 TM) de café. (ANECAFE, 2014). Según Duicela, (Duicela, Guamán, & Farfán, 2015) en promedio, solo el 10% del cacao y el 20% del café se aprovechan como producto final. Es decir, el 90% de la cosecha del cacao y el 80 % de la cosecha del café en base seca, constituyen residuos agrícolas y agroindustriales, que tienen un mínimo aprovechamiento en nuestro país. Los desechos agrícolas en el 2014, de estos dos productos tradicionales de Ecuador están en el orden de: 180.000 Tm de desechos de cacao y 54.297 Tm de desechos del café. De esas considerables cantidades de desechos, los lixiviados constituyen para el caso del cacao, entre el 40 % al 50 % del peso del grano seco y para el café, del 15,5 % al 22,0 % del peso del fruto (Puerta & Ríos, 2011). Esta realidad nos motivó a realizar la presente investigación, con el propósito de encontrar en los lixiviados principalmente, fuentes de energías renovables que, a más de darle un valor agregado a los desechos, contribuyan notablemente a mitigar el impacto ambiental. La investigación muestra que los azúcares presentes en los lixiviados obtenidos de los desechos agrícolas y agroindustriales del cacao y café, constituyen una interesante fuente de materia prima para la fabricación de bioetanol de segunda generación que, puede ser empleado como combustible amigable con la naturaleza (Leyva & Gonzaga, 2011). El bioetanol obtenido, puede reemplazar en los volúmenes correspondientes, al alcohol de primera generación proveniente de la Introducción 4 caña de azúcar, que hoy estamos usando para mezclar con naftas importadas para fabricar un combustible de 87 octanos, obteniendo con ello una disminución apreciable de CO2, así como un considerable ahorro de divisas en la importación de naftas que no producimos. Las políticas del gobierno en esta área, están basadas expresamente en artículo 413 de la Constitución de la República. (Registro Oficial No. 449 de 20 de octubre de 2008). “El Estado promoverá la eficiencia energética, el desarrollo y uso de prácticas y tecnologías ambientalmente limpias y sanas, así como de energías renovables, diversificadas, de bajo impacto y que no pongan en riesgo la soberanía alimentaria, el equilibrio ecológico de los ecosistemas ni el derecho al agua.” Este principio de soberanía energética del país, sumado a la limitada investigación científica y escaso desarrollo de proyectos de inversión para el aprovechamiento de la biomasas, fue la motivación para realizar una detallada caracterización de las propiedades físico – químicas de los lixiviados agrícolas del cacao y café principalmente, dos de nuestros productos emblemáticos del agro, y comprobar la potencialidad de su biomasa, como fuentes de energía limpia (Rodriguez V., 2011). El lixiviado del cacao se obtendrá de la etapa de fermentación, mientras que de la etapa de lavado se obtendrá el lixiviado del café. Esta investigación logra su objetivo central, cuando determina cualitativa y cuantitativamente las características físico–químicas de los lixiviados, del cacao y café, que pueden por fermentación asistida, convertirse en bioetanol. La detallada caracterización de las propiedades físico-químicas y biológicas de los residuos agrícolas y agroindustriales del cacao y café del litoral ecuatoriano, obtenidas en el presente trabajo, se Introducción 5 constituirá en el marco referencial para futuras acciones en proyectos de aprovechamiento de éstas biomasas, como potenciales fuentes alternativas de energía renovable para el país, a más de reducir el impacto ambiental (contaminación de suelos y cuerpos hídricos) que ocasionan esos desechos en su deposición final, principalmente los provenientes del café. El proceso para obtención del fruto del café, se realiza con grandes consumos de agua durante el llamado “beneficio húmedo del café”, que se vierten como desechos, contaminando suelos y por infiltración los cuerpos hídricos cercanos, lo que origina serios problemas en el entorno (Boada, 2002). Adicionalmente, el desarrollo de proyectos socio económicos que pueden implantarse alrededor de ellos, favorecerá sustancialmente al mejoramiento de las comunidades afincadas en el agro, habida cuenta que el estado garantiza la compra del alcohol que actualmente se produce, para mezclarlo con naftas y producir la gasolina Ecopaís (EP Petroecuador: Gasolina Ecopaís, 2014). El presente trabajo está estructurado para ir describiendo de manera ordenada los objetivos y logros de la investigación, a saber: El primer capítulo muestra la situación actual del sector café y cacao en Ecuador, indicando los volúmenes de producción, variedades de cacao y café en el país, climas, recursos hídricos, industrialización y generación de desechos. El segundo capítulo nos define el marco referencial o teórico de la investigación, señalando estudios similares en nuestro país y en el mundo sobre el tema, plantea la justificación del mismo y establece los objetivos específicos a lograr. El tercer capítulo demuestra en forma organizada, clara y precisa, la manera en que se alcanzarán cada uno de los objetivos Introducción 6 específicos propuestos. Contendrá el tipo de investigación, técnicas empleadas y protocolos de análisis. El cuarto capítulo tabula, realiza análisis estadísticos, analiza y discute esos resultados, en base al orden de los objetivos planteados en la investigación y los contrasta con las teorías empleadas. El capítulo cinco, describirá los logros obtenidos en la investigación y formulará conclusiones partiendo de las ideas iniciales del estudio y destacará la parte relevante que haya surgido. Visión general del sector cacao y café en Ecuador  7  CAPÍTULO 1 VISIÓN GENERAL DEL SECTOR CACAO Y CAFÉ EN ECUADOR Visión general del sector cacao y café en Ecuador  8   Visión general del sector cacao y café en Ecuador  9   CAPÍTULO 1 VISIÓN GENERAL DEL SECTOR CACAO Y CAFÉ EN ECUADOR 1.1 Introducción 1.2 Agricultura exportable de Ecuador 1.3 Superficie, producción y variedades de cacao y café cultivadas en Ecuador 1.3.1 Cacao 1.3.2 Café 1.4 Cosecha del Cacao y Café 1.4.1 Cacao 1.4.2 Café 1.5 Métodos de Beneficio del Cacao y Café 1.5.1 Beneficio del Café 1.5.1.1 Beneficio por vía seca 1.5.1.2 Beneficio por vía húmeda 1.5.1.3 Beneficio semihúmedo 1.5.1.4 Beneficio ecológico 1.5.1.5 Beneficio húmedo enzimático 1.5.2 Beneficio del Cacao 1.6 Residuos del Beneficio del Cacao y Café 1.6.1 Características principales de los Residuos del Beneficio del cacao 1.6.2 Características principales de los Residuos del Beneficio del Café Visión general del sector cacao y café en Ecuador  10   Visión general del sector cacao y café en Ecuador  11   1.1. Introducción La República del Ecuador está situada en la costa noroccidental de América del Sur, ubicada entre los paralelos 01°30’ N y 03°23.5’ S y los meridianos 75°12’ W y 81°00’ W (INOCAR, 2012), ocupa una extensión territorial de 256.370 Km² incluida la Región Insular de Galápagos (8.010 Km²) y tiene una población estimada de 14,4 millones de habitantes. Limita al norte con Colombia, al sur y al este con Perú y al oeste con el Océano Pacífico. La división política de la Nación está conformada por 24 Provincias (Mapas, 2014). A pesar de su pequeño territorio, el país cuenta con tres regiones continentales bien definidas y una insular integrada por el Archipiélago de las Galápagos, que lo hacen único en el mundo por la confluencia de climas y sistemas hidrográficos que, dan origen a una gran diversidad de flora y fauna en cada una de ellas. La Región Central la constituye el macizo volcánico de los Andes con sus altos nevados, desde cuyas cúspides se originan dos grandes vertientes; la occidental del Pacífico, formada por 72 Cuencas hidrográficas en un área de 124.563,86 Km² y la oriental o de la Amazonía, con 7 Cuencas y una extensión de 131.806,17 Km². Estas dos vertientes generan en condiciones de régimen natural, una disponibilidad promedio de 20.700 m³ /hab-año de agua superficial (SENAGUA, 2009). Su vasto recurso hídrico sumado a la bondad de los climas de sus regiones, hacen de Ecuador un país privilegiado en recursos naturales (ANDES, País más mega diverso del mundo, 2010). Visión general del sector cacao y café en Ecuador  18   Figura 1.3. Planta de cacao fino de aroma Fuente: Instituto Nacional de investigaciones Agropecuarias. INIAP – Ecuador En Ecuador también se produce la variedad CCN-51 (Figura 1.4) conocida como Colección Castro Naranjal. Esta variedad cuyo color característico es el rojo, fue desarrollada por el científico ecuatoriano, Homero Castro Zurita en 1965. (UNIVERSO, 2005). Esta variedad es reconocida por su alto rendimiento (40 a 50 quintales por hectárea – año) para la extracción de semielaborados, ingredientes esenciales para la producción a escala de chocolates y otros. Además, es moderadamente resistente a enfermedades (monilla y escoba de la bruja) (El cacaotero. Portal informativo, 2013). Figura 1.4. Planta de cacao CCN-51 Fuente: Instituto Nacional de investigaciones Agropecuarias. INIAP – Ecuador Visión general del sector cacao y café en Ecuador  19   ANECACAO informa que, las exportaciones de cacao en el 2014 superaron las 235 mil toneladas métricas, por un monto total de 700 millones de USD (Gráfico 1.2). De ese total, el 85 % es cacao en grano, 14,2 % semielaborados y menos del 1 % chocolates. Gráfico 1.2. Volúmenes de exportación de cacao (2011 – 2014) Fuente: Asociación Nacional de Exportadores de cacao. ANECACAO Por datos estadísticos se observa que el Ecuador es el principal exportador mundial de la variedad ``Nacional´´, conocida internacionalmente como ‘’Cacao fino de aroma’’ o “Cacao Arriba” con más del 60% del mercado total (Gráfico 1.3) y la provincia de Los Rios como la zona de más alta producción de esta variedad (Gráfico 1.4). Grafico 1.3. Porcentaje de producción de grano de cacao fino de aroma a nivel mundial. Fuente: Sánchez J. (2013). Evaluación energética de la cascara de cacao nacional ccn51. Universidad de Cuenca. Visión general del sector cacao y café en Ecuador  20   Grafico 1.4. Porcentaje de área cultivada por provincia del total nacional. Fuente: Sánchez J. (2013). Evaluación energética de la cascara de cacao CCN-51. 1.3.2. Café El café (Coffea) es el género más importante de la familia de las rubiáceas y está formado por numerosas especies. Solo dos son las especies de importancia económica: Coffea arábica L. conocida como café arábica (65% de la producción mundial), y Coffea canephora P., llamada café robusta (33% de la producción mundial) (COFENAC, 2010). El término café se emplea para el fruto y/o granos provenientes de las plantas del género Coffea, así como para los productos del procesamiento del grano destinados al consumo humano (INEN, 2006). Las condiciones climáticas y los diferentes ecosistemas, permiten que el Ecuador sea uno de pocos países en el mundo que producen y exportan los 3 tipos de café en grano; arábigo lavado, robusta y arábigo natural, el cual se cultiva en todas las regiones (PROECUADOR, 2013). Comúnmente se conocen dos formas de café, natural y lavado. El café natural, es el producto obtenido a través de los métodos de beneficio por vía seca, mientras que el café lavado, es el producto obtenido de beneficios por vía húmeda, beneficio Visión general del sector cacao y café en Ecuador  21   húmedo enzimático, beneficio ecológico o subhúmedo y beneficio semihúmedo. Los atributos físicos y organolépticos del café, dependen del ambiente donde se cultiva (suelo, clima, altitud entre otros) y del eficiente manejo en pre y pos cosecha (INEN, 2006). El Consejo Cafetalero Nacional (COFENAC) con la información del Instituto Nacional de Meteorología e Hidrología (INAMHI), destaca que las zonas apropiadas para el cultivo de café arábigo (figura 1.5) son las provincias de Manabí y Guayas, que se localizan sobre el sistema montañoso Chongón y Colonche, entre los 300 y 700 metros de altitud. En las estribaciones occidentales de los Andes, incluyendo Loja y El Oro, las altitudes apropiadas se localizan de 500 a 1.800 metros de altura. En las estribaciones orientales del sur oriente, en el Cantón Chinchipe, las altitudes adecuadas se ubican de 1.000 a 1.800 msnm. (Duicela, Corral, & Farfán, El clima en las zonas de producción de café arábigo, 2002). Figura 1.5. Planta de café arábigo Fuente: Consejo Cafetalero Nacional (COFENAC) Visión general del sector cacao y café en Ecuador  22   El café robusta (Figura 1.6) en cambio, requiere de un clima tropical con altas precipitaciones o riego. Tradicionalmente en las provincias del Norte Amazónico han cultivado café robusta (PROECUADOR, 2013). Figura 1.6. Planta de café robusta Fuente: Consejo Cafetalero Nacional (COFENAC) Según la Asociación Nacional de Exportadores de Café (ANECAFE), Ecuador exportó en el 2014 alrededor de 1.131.190,84 sacos de 60kg de café, (67.871 toneladas métricas) que representó un valor de 178.387.941,88 millones USD por concepto de ventas, constituyéndose como uno de los productos de mayor exportación del agro ecuatoriano. El total de la exportación del 2014, se descompone en: 3.815 TM de café arábigo, 5.248 TM de café robusta y 58.808 TM de café industrializado (ANECAFE, 2014). La superficie cultivada de café en el país, se estima en unas 215.000 Ha. La provincia de Manabí ocupa el 38.6% del total de superficie de cultivos de café en el Ecuador y sus cosechas son hasta la actualidad las de mejor calidad, concentrándose las plantaciones en el Cantón Jipijapa, al sur de la provincia. Visión general del sector cacao y café en Ecuador  23   La provincia de Sucumbíos es la segunda más productora con 17.36% y a continuación, Orellana 11.89%, El Oro 7.67% (ANECAFE, 2014) (Figura 1.7). Figura 1.7. Zonas cafeteras de Ecuador Fuente: Consejo Cafetero Nacional (COFENAC) La situación caficultura del país hasta diciembre del 2012 según investigaciones y encuestas realizadas por el Consejo Cafetalero Nacional COFENAC, se desarrolló como se detalla en la Tabla 1.1 Tabla 1.1 Situación caficultora del país a Diciembre de 2012 Superficie Total 199,215 hectáreas Área de café arábigo 136,385 hectáreas Área de café robusta 62,830 hectáreas Área cosechada 149,411 hectáreas Unidades de producción cafetalera 105,000 UPA´s Producción nacional 650.000 sacos de 60 kilos Producción de café arábigo (%) 62% Producción de café robusta (%) 38% Consumo interno 150.000 sacos de 60 kilos Producción exportable: 400.000 sacos de 60 kilos Capacidad instalada de la industria: 1’200,000 sacos de 60 kilos Capacidad instalada de exportadores 800,000 sacos de 60 kilos Fuente: Especialista sectorial de café y elaborados – Dirección de Promoción de Exportaciones. (2013). Análisis sectorial de café. PRO ECUADOR. Visión general del sector cacao y café en Ecuador  24   1.4. Cosecha del cacao y café 1.4.1. Cacao El cacao según la calidad exportada clasificada en la Norma ecuatoriana INEN 176 (ASE, ASS, ASSS, ASSPS o CCN51), recibe premios en el mercado internacional, por lo que la cosecha y el tratamiento post cosecha de este producto juega un rol importante en la determinación de la calidad, debiendo cosechar, fermentar, secar y clasificar, correctamente el grano, evitar las mezclas entre el Nacional fino de aroma y el CCN-51, y no permitir la contaminación con otros productos que se encuentran en el entorno (INEN, 2006). Por otro lado, el cacao dependiendo de las condiciones climáticas del sector, es capaz de producir flores y mazorcas a lo largo de todo el año, pero generalmente hay épocas de producción alta por región en las que se procede a recolectar los frutos. Estando la mazorca lista para la cosecha, esta se ejecuta de forma manual, usando de preferencia las tijeras podadoras que no lastiman el fruto. Por ningún motivo se debe arrancar las mazorcas con la mano (halándolas), porque destruye completamente el cojín floral y causa heridas peligrosas para el tronco. Es muy importante para asegurar la calidad en cuanto al sabor, que el fruto sea cortado justo a tiempo y que el Ministerio de Agricultura Ganadería Acuacultura y Pesca (MAGAP) ha dictado normas para buenas prácticas de manufactura para el cacao, las mismas que deben ser cumplidas por los agricultores. Se indica además en esta norma que, se deben cosechar únicamente frutos maduros, porque el grano sin madurez origina un producto de sabor amargo, ya que las sustancias azucaradas que Visión general del sector cacao y café en Ecuador  25   recubren el grano, aún no se encuentran en óptimas condiciones para el desarrollo de los procesos bioquímicos de fermentación. Norma para la recolección de los frutos (AGROCALIDAD, 2012).  La recolección debe hacerse cada ocho días en temporada de máxima producción y cada quince o veinte días cuando disminuye la cosecha.  El sitio donde se recolectan y parten las mazorcas, debe ser de preferencia dentro de la misma huerta.  Las fincas que posean las dos variedades de cacao, Nacional o fino de aroma y CCN-51, deberán cosechar, fermentar, secar y transportar por separado el cacao  El corte con la tijera debe hacerse cerca de la mazorca, sobre la base de ésta y no sobre el cojín floral, pues también puede dañarlo.  Retirada las pepas de la mazorca, se desprende la placenta  Las almendras deben ser colocadas en recipientes limpios y libres de contaminantes.  Las almendras deben ser transportadas en sacos o recipientes de plástico, yute o cabuya, totalmente limpios.  Los residuos de esta actividad pueden ser empleados en proceso de compostaje y ser devueltos al suelo mediante procesos de fertilización.  Es aconsejable que las almendras pasen inmediatamente a beneficiado. Visión general del sector cacao y café en Ecuador  26   1.4.2. Café Recolección de los frutos La cosecha de café consiste en recolectar selectivamente solo las cerezas maduras, evitando el quiebre de las ramas y la destrucción de las yemas florales y las hojas. La cosecha de café arábigo y robusta debe realizarse en estado de cereza madura, evitando cosechar los frutos verdes o inmaduros, porque tienen bajo rendimiento. (Duicela & Sotomayor, 1993). Para la recolección de los frutos deben observarse las siguientes particularidades (Duicela, Guamán, & Farfán, 2015):  Determinar el estado de madurez de los frutos por la intensidad de la coloración. Básicamente hay cultivares de frutos rojos y amarillos.  Conocer que los frutos amarillos tienden a desprenderse más fácilmente que los frutos rojos. En los cafés arábigos, las variedades Villalobos y San Salvador se desprenden con mayor facilidad.  Evitar que los frutos cosechados entren en contacto con el suelo por el riesgo de contaminaciones físicas y biológicas.  Colocar las cerezas cosechadas en sacos de yute o cabuya limpios  Separar m anualmente los frutos maduros de los verdes, pintones, sobre maduros y secos.  Considerar que la cosecha de frutos inmaduros reduce el peso de la producción potencial y causa un detrimento en la calidad de la bebida de taza.  Reconocer que una cosecha del 100% de frutos inmaduros causa una reducción del 33% del peso al ser transformado a café oro, comparado con el 100% de cerezas maduras. Visión general del sector cacao y café en Ecuador  27   Acopio interno El acopio interno del café cosechado se refiere a la movilización del producto desde el cafetal hasta el punto de recepción dentro de la finca. En esta labor hay que considerar lo siguiente:  Receptar el café cosechado sobre lonas, tendales de cemento o entablillados de madera o caña guadua.  No amontonar café cosechado por más de tres horas.  Asegurar la limpieza del lugar; evitando el contacto del café con basuras, piedras, vidrios y otros contaminantes físicos y con agroquímicos.  Procurar que las personas encargadas del procesamiento se encuentren en buen estado de salud. Clasificación del café cosechado El café cosechado para la preparación de cafés de alta calidad, debe ser clasificado manualmente o mediante el boyado. Mediante el boyado se logran separar por flotación hojas, pedazos de ramas, frutos tiernos y secos. Para la realización de este proceso hay que tomar en cuenta los siguientes aspectos (Duicela, Guamán, & Farfán, 2015):  Garantizar la limpieza de los recipientes plásticos o tanques de madera o cemento.  Usar agua limpia llenando los depósitos hasta la mitad o máximo 2/3 de su capacidad.  Introducir en los recipientes con agua, una cantidad adecuada del café cosechado y agitar la masa total de frutos  Retirar manualmente con la ayuda de un tamiz, las impurezas que se encuentran flotando Visión general del sector cacao y café en Ecuador  34   El producto que resulta de la trilla es el café oro, café verde o café en grano. Un café oro obtenido mediante los métodos de vía húmeda, se conoce como café lavado (Haarer, 1984). 1.5.1.3 Beneficio semihúmedo Es un proceso de transformación del café cereza a café pergamino seco “con miel”, que involucra el despulpado y secado del café con todo el mucílago, “café con baba” que luego es trillado da como producto final el café semilavado. En el secado del café con mucílago se deben considerar ciertos procedimientos, a saber (Duicela, Guamán, & Farfán, 2015):  El café despulpado debe colocarse en tendales de cemento, secadores solares, zarandas de malla plástica o en secadoras artificiales.  El secado debe hacerse esparciendo los granos en capas delgadas de 3 centímetros de espesor y removiéndolo de 8 a 10 veces al día.  Nunca mezclar granos con diferentes contenidos de humedad en ninguna etapa del secado.  El secado artificial debe hacerse siguiendo rigurosamente las instrucciones sobre volumen por remesa, temperatura máxima de 45°C, tiempo de secado y control de humedad.  Recordar que el café con mucílago es muy vulnerable al ataque de hongos durante el secado, por lo que debe tenerse un estricto control de la humedad.  El tiempo de secado varía en función de las horas sol, de la temperatura del espesor de la capa y de la frecuencia de remoción del grano. Visión general del sector cacao y café en Ecuador  35   1.5.1.4 Beneficio ecológico Llamado también beneficio subhúmedo, es el proceso de transformación del café cereza a café pergamino húmedo usando un equipo especial llamado módulo de beneficio ecológico que está integrado por la despulpadora, desmucilaginador mecánico y sistema de lavado. Mediante este método de beneficio, no hay el proceso de fermentación (Roa & at., 1999). Esta tecnología ofrece ventajas ecológicas, debido a que el consumo de agua en el proceso de desmucilaginado y lavado es de 1 litro por kilogramo de café pergamino seco (Roa & at., 1999). En este beneficio hay que tomar en cuenta lo siguiente:  Es importante la calibración y el buen funcionamiento del desmucilaginador, de lo contrario se pueden originar granos mordidos o quedar restos de mucílago en el pergamino, lo que deteriora la calidad del producto final (Duicela & otros, 2010).  Se debe beneficiar solo café maduro.  La cantidad de agua durante el desmucilaginado debe estar en el volumen recomendado. El exceso de agua provoca una demora del proceso y una falta de agua puede originar un deficiente lavado (Duicela, Guamán, & Farfán, 2015). 1.5.1.5 Beneficio húmedo enzimático Este es un proceso de transformación de café cereza a café pergamino húmedo, utilizando enzimas pectolíticas (moléculas de proteínas) para acelerar la fermentación del mucílago del café despulpado. Este método de beneficio permite lavar el café el mismo día de haber sido cosechado. El café cereza maduro se despulpa y Visión general del sector cacao y café en Ecuador  36   sobre el café despulpado se añade el producto enzimático (COFENACSICA, 2010). En la adición del producto enzimático a la masa de café despulpado, considerar lo siguiente.  Las enzimas tienen la capacidad de acelerar las reacciones químicas disminuyendo el nivel de energía de activación necesaria (calor, electricidad) para que las moléculas colisionen y se produzca la reacción entre ellas (Las enzimas, 2015).  El producto enzimático (Granozime-café 100) se usa en dosis de 5 ml por cada 100 libras de café cereza. Esto significa que con un litro de producto enzimático, se puede acelerar la fermentación de 200 quintales de café cereza (Duicela, Guamán, & Farfán, 2015).  El tiempo de fermentación usando las enzimas puede variar de 20 a 30 minutos, tanto en café arábigo como en robusta (COFENAC-SICA, 2010).  Secar el café pergamino húmedo de forma natural o en secadoras de granos hasta un 12 – 12,5% en arábigo y 1013% en robusta. 1.5.2 Beneficio del cacao La fermentación del cacao se lleva a cabo de diferentes formas que varían de acuerdo con las prácticas agrícolas de cada zona del país, sin embargo todo tratamiento especial poscosecha debe ser evaluado por AGROCALIDAD, que en su Guía de buenas prácticas agrícolas para cacao, recomienda (AGROCALIDAD, 2012): Visión general del sector cacao y café en Ecuador  37    Usar para la fermentación cajones de madera, tendal y sacos.  Las maderas recomendadas son el laurel, pechiche y chanul.  En este sistema, el tiempo de fermentación recomendado es 48 horas, luego remover y dejarlo otras 48 horas para el cacao nacional y 48 horas más para el CCN-51.  Observar que la almendra siguió un buen proceso de fermentación. Cuando la temperatura empieza a descender, el grano se hincha y la almendra es de color lila pálido.  Para la fermentación en tendales, estos deben ser sobre caña o madera. Para proteger a la almendra de la lluvia y el viento, esta debe cubrirse con hojas de plátano, banano o bijao. La fermentación también se la hace con los mismos tiempos que el anterior, pero haciendo una remoción del montón después de las primeras 48 horas.  Cuando la fermentación es en sacos, se debe remover cada 48 horas para airear el caco. Para el cacao nacional dos veces y para el CCN-51 tres. El cacao ya fermentado es secado por medio natural o en secadoras de granos, hasta una humedad residual de 7 a 8 %. 1.6 Residuos del beneficio del cacao y café La actividad agrícola y agroindustrial con estos productos, genera una gran cantidad de residuos, si consideramos que solo se aprovecha económicamente el 10 % del peso del grano fresco del cacao y el 20% del café, constituyendo el restante 90 y 80% respectivamente en desechos orgánicos de finca y de industrias de procesamiento (Barazarte & Sangranis, 2008). Esta circunstancia se ha traducido en serios problemas ambientales y también paisajísticos, que no han sido resueltos en la proporción de su generación. Existen algunos estudios y análisis Visión general del sector cacao y café en Ecuador  38   físico-químicos al respecto, para el aprovechamiento en parte de estos residuos, pero en general, está muy limitada en nuestro país la utilización práctica de los desechos del beneficio en finca del cacao y café. 1.6.1. Características principales de los residuos del beneficio del cacao Según Barazarte y Sangranis (2008), los granos de caco que se recuperan como producto de las mazorcas, solo representan el 10 % del peso total, lo que nos indica que el cultivo del cacao produce desde la etapa de recolección hasta la de procesamiento, una gran cantidad de desechos. Otros investigadores aseguran que 10 toneladas de desechos frescos se producen por cada tonelada de semillas secas (Figueira, 1993). Estos desechos están constituidos básicamente por la cáscara del fruto y la pulpa de las semillas, los cuales son ricos en taninos, polifenoles, alcaloides, azúcares y polisacáridos. (Albornoz, 1980). Los residuos del caco provienen principalmente de la cáscara, mucílago y cascarilla (residuo industrial). En las siguientes Tablas (1.3. a 1.6.) se muestran algunos resultados obtenidos de investigaciones con la cáscara y mucílago del cacao. Visión general del sector cacao y café en Ecuador  39   Tabla 1.3. Composición proximal de algunas propiedades físicas de los residuos del cacao. Producto Variedad Residuos Parámetros en porcentaje CACAO Theobroma cacao L Trinitario Hm P G Cz Fc ELN Cáscara 6,72 4,52 2,40 8,92 33.26 44,18 Cascarilla 7,80 17,13 2,22 7,33 21.38 44,14 Mucílago 9,27 6.13 2,11 8,46 0,41 73,62 Nacional Cáscara 6,53 4.50 2,5 9,01 33,78 43,68 Cascarilla 7,31 17,1 2,18 7,93 21,41 44,07 Mucílago 9,48 6,05 2,13 8,31 0,43 73,44 Hm: Humedad, P: Proteínas, G: Grasas Cz: Cenizas, Fc: Fibra Cruda, ELN: Extracto libre de nitrógeno. Fuente: (Tuchan, 2014). Tabla 1.4. Análisis Químico de la cáscara del café proveniente de la Península de Paria, estado de Sucre, Venezuela. Contenido de Resultado (%) Proteínas 8,69 Nitrógeno total 1,39 Materia orgánica 60,10 Grasas 1,40 Humedad 15,25 Potasio 4,70 Sodio 0,05 Fósforo 0,15 Magnesio 0,22 Calcio 1,12 Zn, Mn, Co, Cu, Fe Trazas Fuente: (Crescente & al, 1999) Visión general del sector cacao y café en Ecuador  40   Tabla 1.5. Contenido de K, Ca y Mg de las cáscaras de Cacao Nacional y CCN-51. Elementos Cacao Nacional % CCN-51 % Potasio 4,98 5,16 Calcio 0,33 0,40 Magnesio 0,27 0,30 Fuente: Tesis Grado. (Sánchez, 2013) Tabla 1.6. Composición proximal de la cascarilla de cacao. Parámetro % Materia seca 88,4 ± 3,2 Proteína cruda 9,3 ± 1,9 Fibra cruda 37,2 7,6 Cenizas 6,5 ± 2,1 Fuente: (Bouafou, Konan, Zannou, Choko, & Kati-Coulibally, 2011) Como se puede observar de los resultados mostrados por estas investigaciones y que ampliaremos en los siguientes capítulos, existe un potencial empleo de la biomasa residual del cacao tanto en su cáscara, cascarilla y lixiviados. La cáscara básicamente es una alternativa importante como fuente de fibra diaria para alimento animal y también como combustible sólido. Los lixiviados, ricos en azúcares pueden ser fermentados y convertidos en alcoholes, como ya ha sido demostrado en estudios anteriores y que precisaremos con esta investigación. Visión general del sector cacao y café en Ecuador  41   1.6.2. Características principales de los residuos del beneficio del café Los subproductos del café que resultan del proceso de beneficio por cualquiera de los métodos descritos, no son aprovechados y generalmente se vierten sin ningún tratamiento al suelo y por infiltración llegan a los ríos, manantiales y quebradas, ocasionando peligrosas contaminaciones ambientales. De la información sobre estos desechos, sabemos que de 500 libras de café cereza se obtienen en promedio 100 libras de café oro, al 12 % de humedad. Esto significa que solo el 20 % del peso del café maduro constituye café oro y el 80 % restante son subproductos (Duicela, Guamán, & Farfán, 2015). El beneficio del café a diferencia del cacao, da varios subproductos, a saber: Cáscara seca, cáscara fresca, pulpa, mucílago, agua mieles y pergamino (Duicela, Guamán, & Farfán, 2015).  Cáscara seca. Constituida por las envolturas del café bola seca (epicarpio, mesocarpio y endocarpio deshidratados)  Cáscara fresca. Es el epicarpio del fruto  Mucílago. Es el mesocarpio del fruto y representa del 15,5 al 22 % del peso del fruto. En base húmeda está constituido por el 8,55 % de carbohidratos, 0.93 % de proteínas, 0,12 % de lípidos, 0,17 % de ácidos orgánicos, 0,12 % de alcohol y entre 85 y 91 % de agua (Puerta G. , 1999).  Aguas mieles. Es el agua que arrastra el mucílago disuelto en el proceso de lavado del café fermentado. Cuando, además del Visión general del sector cacao y café en Ecuador  42   mucílago, lleva otros residuos del beneficio del café y de otros procesos agroindustriales, se conoce como aguas residuales.  Pergamino. Es el endocarpio del fruto, tiene la forma de una cápsula que recubre el grano y resulta de la eliminación del mucílago mediante la trilla. Las tablas 1.7 y 1.8, nos muestran algunas de las características más relevantes de los subproductos del beneficio del café. Tabla 1.7. Residuos obtenidos en el proceso de beneficio e Industrialización de 1 Kg café cereza. Proceso Residuo obtenido Pérdida(gramos) Despulpado Pulpa fresca 436 Desmucilaginado Mucílago 149 Secado Agua 171 Trilla Pergamino 42 Torrefacción Película plateada Volátiles 22 Preparación bebida Borra 104 Pérdida acumulada 924 Fuente: (Calle V, 1977). CENICAFÉ Marzo de 2010. Visión general del sector cacao y café en Ecuador  43   Tabla 1.8. Bioetanol obtenido por cada millón de sacos de café verde producidos. Subproduc to Toneladas generadas Litros etanol / Tonelada Galones U.S Pulpa fresca 162.900 25,17 1.083.274 Mucílago fresco 15.500 58,37 855.888 Galones U.S etanol / millón sacos café verde 1.939.162 Fuente: (Rodríguez & Zambrano, 2010). CENICAFÉ. Análisis de carácter químico realizados a muestras de mucílagos, para conocer los contenidos de azúcares que puedan convertirse en alcohol, muestran cifras realmente interesantes, que esta investigación corrobora con los resultados obtenidos, para muestras de cacao nacional en sus dos variedades. La pulpa y el mucílago pueden usarse en la elaboración de bebidas alcohólicas o refrescantes aprovechando el contenido de cafeína y azúcares (Rajkumar & Graziosi, 2005). Los mismos investigadores en esa publicación, indican que el mucílago puede reemplazar hasta en un 20 % a los concentrados comerciales empleados para alimentación de bovinos, cerdos, peces, pollos y corderos. Los altos contenidos de azúcares (energía) y nutrientes, convierten a la cáscara seca, cáscara fresca, pulpa y mucílago pueden ser aprovechados para la elaboración de abonos orgánicos, tipo compost (Duicela, Guamán, & Farfán, 2015) Marco teórico  50   bioetanol. Ambas fuentes primarias de energía están ampliamente desarrolladas en muchos países, constituyendo un importante aporte energético, principalmente como combustibles para uso del transporte. En la figura 2.2 se presenta el porcentaje de consumo total de biocombustibles en el sector transporte1 Figura 2.2. Consumo de biocombustibles, como porcentaje del consumo total de combustibles en el sector transporte. Debemos estar conscientes de que no existen al momento, salvo rarísimas excepciones, cultivos específicos con fines energéticos exclusivamente. En nuestro país, una de esas excepciones lo constituye el aceite del piñón (Jatropha curcas) que se emplea en cierta escala para producir energía eléctrica en las islas Floreana e Isabel en Galápagos (MAGAP, 2012). Por otro lado, los biocombustibles de segunda generación se obtienen a partir de biomasa lignocelulósica (celulosa, hemicelulosa y lignina) obtenida de residuos de cultivos, y de subproductos de la industria alimentaria y forestal. Esta biomasa caracterizada por su  1http://nmrlab.yo‐que.ch/controversia/doku.php?id=c3:l1:biocombustible  Marco teórico  51   alta densidad energética almacenada en la celulosa, la cual libera mucha energía al romper sus enlaces químicos, y que además, por ser un polímero de la glucosa, sufre procesos de fermentación en la que se obtiene etanol o butanol, atributos que la hacen muy interesante para utilizarla como combustibles líquidos (López, 2013). A diferencia de los biocombustibles de primera generación, los residuos agrícolas y agroindustriales, no sólo que tienen escaso o nulo valor económico, sino que suelen provocar varios y serios problemas ambientales durante su eliminación, por lo que, en la medida en que puedan ser reciclados, se logra el doble efecto de, darle un valor agregado a los desechos y reducir considerablemente la emisión de gases de efecto invernadero. Es importante anotar que la mayor parte de los estudios científicos coinciden en que los biocarburantes suponen menores emisiones de gases de efecto invernadero (entre un 35 y un 50%) y que, el uso de etanol celulósico en lugar del bioetanol convencional reduciría las emisiones netas de CO2 entre 70 y 90 por ciento, cuyo nivel de reducción se debe sobre todo al hecho de que no se usan energías fósiles en el procesamiento del etanol. Sin embargo, el estudio realizado por Hackenberg en el 2008, señala que existen enormes diferencias en cuanto a la reducción de CO2 así como en los costos de ésta (Hackenberg, 2008). Estas premisas de alto rendimiento energético y bajas emisiones de gases de efecto invernadero de los biocombustibles de segunda generación, motivaron al autor a explorar en detalle las características físico químicas de los desechos del caco y café del litoral ecuatoriano, principalmente los lixiviados, para cuantificar su potencial uso como fuentes de energías limpias y dejar abierta una posterior investigación socio económica en términos comerciales. Marco teórico  52   2.2 Antecedentes de investigaciones La revisión bibliográfica sobre estudios anteriores para el aprovechamiento de la biomasa obtenida por los procesos de beneficio del cacao y café, muestran información muy amplia en términos de descripción conceptual de los residuos obtenidos, considerando la amplia gama de ellos. En el caso de los residuos agrícolas del cacao, los usos que se le dan en nuestro país, están relacionados principalmente a la cáscara del fruto, que en finca se emplea como fertilizante para plantas y algo para dietas de animales. Actualmente han surgido nuevas propuestas sobre otras formas de uso, tales como la formulación de dietas experimentales con diferentes niveles de cáscara de cacao para la alimentación de pequeños mamíferos (Murillo & Quilambaqui, 2008) o aprovechando el potencial energético de estos residuos como material combustible para la alimentación de calderas en la producción de energía y en las fábricas de semielaborados y elaborados finales a partir del cacao, se obtiene como subproducto del tostado, la cascarilla de cacao, que se emplea como complemento de dietas mezclada con harina de trigo(Sanchez, 2013). Para el aprovechamiento de los lixiviados, se han desarrollado estudios para la obtención de vinos y vinagre a partir del mucílago del cacao (Marcillo & Meza, 2010). En este contexto, entre las principales investigaciones realizadas en los últimos años con relación al aprovechamiento de los residuos agrícolas y agroindustriales del cacao y café, podemos mencionar las siguientes. Marco teórico  53   Cacao  Estudios experimentales realizados en el mucílago de cacao a nivel de laboratorio, para definir las condiciones óptimas de fermentación de los azúcares presentes y su conversión en alcohol, fueron realizados por Marcillo y otros (Marcillo & Meza, 2010). En este estudio, los autores no definen el tipo de cacao utilizado ni realizan análisis completos de caracterización físico química ni biológicos, como: sólidos totales, sólidos suspendidos, sólidos disueltos, resistividad, tamizaje químico entre otros.  Villagómez (Villagómez, 2013),informa de los resultados obtenidos en un acetificador piloto, en cuyo proceso convierte el exudado de la almendra fresca del cacao CCN 51 en vinagre como valor agregado, mediante dos procesos microbianos separados, primero una fermentación alcohólica de los azúcares naturales presentes en el mucilago de cacao en un rango del 10-13%, adicionando sacarosa para rectificar el contenido de sólidos solubles para la acción y conversión de las levaduras gel género saccharomyces cerevisiae; y en segundo lugar la llamada fermentación oxidativa del alcohol obtenido.  La revista Tecnológica ESPOL, publica un artículo de (Abarca, 2010) sobre trabajos de investigación reportada en los residuos del pergamino y pulpa de café, cáscara, cascarilla y mucilago de cacao; cáscara, pulpa y residuo de extracción de gel del cladodio generados por varias empresas privadas y organizaciones, con la finalidad de determinar sus contenidos de Fibra dietaria Total (FDT), y sus fracciones Soluble (FDS) e Insoluble (FDI). Entre sus conclusiones indican que son buenas fuentes de FDI el pergamino de café, cáscara de cacao Marco teórico  54   y cáscara de cladodio. El estudio no abarca análisis químicos de perfiles de azúcares, tamizaje químico ni cromatografía en fase gaseosa.  La Tesis de Maestría de (Sanchez, 2013), en la que se evalúa las cáscaras del cacao nacional y CCN-51 como fuentes de energía. En este estudio se determinó que la biomasa residual agrícola BRAC aprovechable en Ecuador es del orden de 144.320 TM/año, que generarían 42688 Tep/año (Tonelada equivalente de petróleo/año), equivalentes a 215.477 MJ.  El estudio sobre la actividad antibacteriana de diferentes fracciones de la cáscara de cacao y empleando cepas autóctonas y su correspondiente análisis por cromatografía líquida de alta eficiencia y CG-EM de estas fracciones fueron reportadas por Cuéllar, (Cuéllar & Guerrero, 2012). El resultado mostró que, la fracción clorofórmica presentó actividad antibacteriana frente a Bacillus cereus ATCC 11778 y Streptococcus agalactiae (autóctona), con porcentajes de inhibición de 34.90% (100 µg/µl) y 52.40% (100 µg/µl) respectivamente.  D. Bravo, (Bravo, 2010) al estudiar el beneficio del cacao, evaluó la influencia del almacenamiento del fruto previo a la fermentación, el tiempo de fermentación y el tiempo de secado, sobre las características del cacao fermentado y seco. El estudio lo hizo con los clones de la variedad trinitario (CCN 51, UF 613, ICS 1, ICS 95 y THS 565), clon de la variedad forastero (IMC 67) y el cacao de la variedad criollo de la Región San Martín (Perú). Los resultados revelaron que los clones de la variedad trinitarios presentaron los contenidos más altos de temperatura, humedad, acidez, pH y sólidos solubles; los cacaos cosechados y almacenados durante tres días (AM3) de Marco teórico  55   humedad en la pulpa + testa, acidez y sólidos solubles durante el tiempo de fermentación y los cacaos recién cosechados (AM0) de humedad y acidez durante el tiempo de secado. Además, al clon UF 613 de la variedad trinitario le correspondió la mayor cantidad de granos fermentados, el AM3 de granos negros y al AM0 mayor peso de grano y porcentaje de cascarilla.  En la planta de chocolates Más choco (Ecuador), V. López, (López, 2014) realizó un estudio sobre el aprovechamiento de la cascarilla de cacao generada por esa empresa, para emplearla como relleno parcial en la elaboración de chocolates, cumpliendo con la norma ecuatoriana INEN 621. Mediante el análisis sensorial, reporta que pudo establecer como mejores tratamientos; a1b0 (80% chocolate líquido+20% cascarilla de cacao) en bombón negro; a1b (80% chocolate líquido+20% cascarilla de cacao) en bombón blanco. Los resultados de los análisis determinaron que los bombones con chocolate negro contienen: 1.63% de Cenizas, 4.52% de Proteína, 2.12% de Humedad, 32.3% de Grasa, y 7.98% de Fibra dietaria total y los bombones con chocolate blanco: 1.93% de Cenizas, 5.12% de Proteína, 3.37% de Humedad, 32% de Grasa, y 7.98% de Fibra dietaria total.  H. Brarazarte, (Barazarte & Sangronis, 2008) reportan un estudio para la extracción de pectinas de la cáscara de cacao a diferentes condiciones de pH y temperatura y se evaluaron sus principales características químicas. Para la extracción se usó EDTA al 0,5% a pHs 3, 4 y 5 y temperaturas de 60, 75 y 90ºC, bajo diseño factorial 3^2. Las variables respuestas fueron: rendimiento, contenido de ácido anhidro galacturónico (AGA), contenido de metoxilo, grado de Marco teórico  56   esterificación y peso equivalente delas pectinas extraídas. Se determinó la fuerza del gel péctico con un texturómetro TA – X  Empleando cáscaras de cacao de Cuba y Ecuador, R. Bermúdez, (Bermúdez & at, 2002) realizaron la fermentación en estado sólido mediante el hongo de pudrición blanca Pleurotus ostreatus, variedad Florida. Se estudian en ambos sustratos las influencias del tamaño de la partícula, las condiciones de fermentación, preparación del sustrato, propagación del inóculo, temperatura y porcentaje de humedad. Los parámetros determinados fueron: rendimiento, precocidad y biodegradación del sustrato, comparándose estos con los obtenidos en pulpa de café. Se demuestra la efectividad de la fermentación en estado sólido al reducir más del 50 % de la materia orgánica de ambos sustratos en un mes aproximadamente. La investigación concluye señalando que se logra obtener un sustrato remanente con características que le permiten ser utilizado como abono orgánico y alimento animal.  (Baena, 2012) , obtuvo y caracterizó la fibra dietaría de la cascarilla de Theobroma Cacao L. procedente de una industria chocolatera colombiana, por tratamiento enzimático (αamilasa, proteasa y amiloglucosidasa). la cascarilla presentó un 67.11% de fibra insoluble y 8,66% de fibra soluble y contiene un porcentaje de celulosa, Hemicelulosa y lignina de 17.39%, 6.38% y 32.40% respectivamente. Se evaluó las propiedades funcionales (capacidad de retención de agua, capacidad de absorción de moléculas orgánicas y capacidad de hinchamiento).  En la Península de Paria (Venezuela), O. Crescente, (Crescente & al, 1999) analizaron químicamente las cáscaras de frutos de cacao provenientes de la Península de Paria, con la finalidad Marco teórico  57   de desarrollar técnicas y procedimientos que permitan la utilización comercial de estos desechos, y evaluar su posible uso en la elaboración de piensos para la alimentación de animales de corral. Los análisis realizados (proteínas (8,69 %), grasas (1 ,40 %), materia orgánica (60,1 4 %) y minerales) revelan el uso potencial de estos desechos agrícolas en la elaboración de dietas para animales y como fertilizante orgánico de numerosos cultivos.  El trabajo de (Aguavil, 2011) destaca el aprovechamiento de la placenta del cacao para la obtención de harina, con la que se logró elaborar galletas. Las mejores condiciones se dieron con el secado de la harina a 70 °C. CAFÉ  Para determinar las degradaciones y estabilidad del mucílago de café hasta su posible uso y disposición, G. Puerta y otros, (Puerta & Ríos, 2011) cuantificaron los contenidos de agua, cenizas, lípidos, proteínas, azúcares totales, azúcares reductores, fibra, alcohol, acidez total y el aporte calórico del material fresco, fermentado a temperatura promedio de 20,5°C y conservado en refrigeración, a 6,6°C, hasta por 74 horas. El mucílago fresco presentó entre 85% a 91% de agua y entre 6,2% y 7,4% de azúcares, constituidos por 63% de azúcares reductores. Durante la fermentación a temperatura ambiente, los azúcares totales y reductores del mucílago de café disminuyeron, aumentó la acidez, se formó el etanol y se degradaron los lípidos. En refrigeración estos cambios fueron más lentos y se retrasaron las fermentaciones alcohólica y láctica, y se conservaron hasta por 24 horas las características del mucílago de café. Marco teórico  58    La invención de A. Vélez (Vélez & López, 2011) registrada en la patente WO2013088203 A1, se relaciona con un proceso para el aprovechamiento de los subproductos del café en la producción de proteínas, polifenoles, vitaminas y minerales, bajo procesos de concentración y conservación del mucílago y la pulpa (cáscara) para obtener miel y/o harina de pulpa (cáscara) del café. Estos subproductos pueden ser transformados industrialmente según su patente, para obtener consumo humano, animal, medicamentos, cosméticos o como materia prima para la producción de alcohol carburante (etanol).  El Programa Regional del Medio Ambiente en Honduras, aprobó impulsar el diseño y validación de un prototipo para la producción de bioetanol, biogás y biofertilizantes a partir de desechos del beneficiado húmedo del café, como complemento ideal para cerrar el ciclo productivo de ecoempresas y mitigar los efectos medioambientales negativos de este rubro productivo. En este marco, N. Fernández, (Nernández, 2010) preparó un proyecto que abarca de manera integral, desde la etapa de beneficio del café hasta los detalles de construcción de la planta. Los balances de materia del proceso dan los siguientes resultados: Producción diaria de aproximadamente 500 litros de bioetanol/6250 litros de mucílago, 23 metros cúbicos de biogás/500 litros de bioetanol y 75 kilogramos de biofertilizantes/500 litros de bioetanol.  El estudio realizado por (Rathinavelu & Graziosi, 2005) de la Universidad de Trieste – Italia, plantea muchos usos alternativos de los desechos del beneficio del café, a saber: Pulpa. Los resultados generales de los estudios de alimentación realizados con cerdos indicaron que el grano de Marco teórico  59   cereales puede ser sustituido por pulpa deshidratada de café en hasta un 16% de la ración total, sin ningún efecto perjudicial con respecto al aumento de peso o a la conversión del pienso. Además de hacerse con cerdos, los experimentos de alimentación con pulpa de café se hicieron con peces, pollos, corderos y conejos. En esos experimentos de alimentación se determinó el aumento diario del peso corporal y se midieron la toma diaria de materia seca y la eficiencia de conversión de la alimentación. Biogás del agua residual del café. La producción de CO2 por la fermentación, hace posible la producción posterior de un biogás de metano altamente enriquecido que tiene únicamente la mitad del nivel habitual de CO2 inerte. La mejor manera de usar el biogás que se produce es haciendo funcionar con él un motor para generar electricidad, y todo el calor residual de grado más bajo proveniente de la refrigeración y el escape puede todavía usarse para secar café. Cáscara de café como combustible. La cáscara del café es prácticamente pura lignocelulosa y no tiene ningún valor como fertilizante. Puede quemarse la cáscara en un generador de gas pobre y después accionar un motor sobre ese gas pobre para producir electricidad. Al igual que con el biogás, el calor residual procedente del generador de gas y del motor puede usarse para calentar una corriente de aire limpio, y eso puede todavía usarse para secar aún más café.  Una investigación para producir alcohol a partir del despulpado del café sin agua, ha sido publicado por N. Rodríguez (Rodríguez, 2013). En su investigación la hidrólisis ácida se realizó con ácido sulfúrico concentrado, la hidrólisis alcalina Marco teórico  66   2.3.1 Cromato g rafía de g ases acoplado a espectrometría de masa GC-MS La Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas (GC/MS, por sus siglas en inglés) es una técnica analítica dedicada a la separación, identificación y cuantificación de mezclas de sustancias volátiles y semivolátiles. La separación de dichas sustancias depende de la diferente distribución de las sustancias estudiadas entre las fases móvil y estacionaria que conforman el sistema. Una vez separadas las sustancias son fragmentadas y analizadas en función de su patrón de fragmentación, el cual puede ser comparado con información contenida en una base de datos de espectros de masas para su identificación preliminar. La identificación definitiva, así como la cuantificación de cada sustancia debe hacerse mediante el empleo de sustancia de referencia (Universidad.Veracruzana, 2015). La cromatografía de gases en la actualidad es ampliamente empleada por su gran capacidad de separación y su alta sensibilidad al momento de analizar compuestos de bajo peso molecular. La cromatografía de gases y espectrometría de masas son en muchos sentidos, técnicas altamente compatibles, en cuyo análisis utilizan la misma cantidad de muestra (Hites, 1997). Derivatización en Cromatografía En cromatografía es preferible separar y detectar compuestos en su estado nativo. Sin embargo, ciertos compuestos pueden ser inestables a ciertas temperaturas o no poseen un cromóforo detectable para la detección ultravioleta en el HPLC. En este estudio, se precisó por su naturaleza polar, derivatizar muestras liofilizadas de los lixiviados de café y cacao para su correspondiente caracterización química por cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de Marco teórico  67   masas (CG-EM), con el objetivo de cambiar las propiedades físicas y químicas de los analitos y aumentar la estabilidad térmica de los compuestos que podrían no ser detectados o adecuados en el análisis de cromatografía de gases (Hites, 1997). 2.3.2 Cromatografía Líquida de Alta Resolución HPLC Otro método analítico utilizado fue la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), ampliamente aceptada y usada como técnica de separación purificación y análisis de diferentes compuestos en diversas áreas incluyendo la farmacéutica, biotecnológica, ambiental, polímeros e industria de alimentos (Hites, 1997). Esta técnica fue usada para analizar la composición porcentual de los principales glucósidos presentes en los lixiviados de café y cacao, expresados como; Glucosa, fructosa, Sacarosa y maltosa. Estudios se han realizado anteriormente en la pulpa de cacao mediante métodos colorimétricos y electroforesis capilar por (Romero & Zambrano, 2012). 2.3.3 Espectrometría de Absorción Atómica AAS El análisis de los micro elementos presentes en las muestras, se realizó por espectrometría de absorción atómica (AAS) que es ampliamente usada y aceptada por ser una técnica capaz de determinar niveles de trazas (ug/ml) y ultratrazas (sub-ug/ml) de elementos o metales en una amplia variedad de muestras, incluyendo muestras biológicas, clínicas, ambientales, alimenticias, hasta muestras geológicas, con una buena exactitud y precisión. Podría decirse que ésta es la técnica predominante en análisis elemental aunque tenga algunas limitaciones (Hites, 1997). Los análisis se los realizo a los lixiviados de café y cacao para cuantificar la presencia de los micro nutrientes Mg, Na, Fe, K, Ca y estudiar así junto con el Marco teórico  68   contenido de nitrógeno realizado por kjeldahl las características químicas del medio para el desarrollo de microorganismos saccharomyces cerevisiae usadas en los procesos de fermentación alcohólica. Estudios similares se han realizado en ambas especies según lo reportado por (Federación Nacional de Cafeteros de Colombia, 2003) para el café y (Ohene Afoakwa, 2014) en el caso del cacao. 2.4 Planteamiento del problema Los volúmenes promedio de producción de cacao y café en nuestro país correspondientes a los últimos cuatro años, con base a los reportes de las Asociaciones Nacionales de Exportadores de esos productos han tenido un incremento sostenido. En el 2014 la producción total de cacao fue de 240.000 toneladas, de las cuales 230.000 toneladas fueron de exportación (ANDES, 2014). Ecuador desplazó del quinto lugar a Camerún (África) y por segundo año consecutivo, avanzó posiciones en el mercado global de exportaciones, pues ya en el 2013 había superado a Brasil, uno de los productores más fuertes de América Latina. En el caso del café, la Asociación Nacional de Exportadores de Café, (ANECAFÉ) indica que el país exportó 1.131.190,84 sacos de 60kg (67.871 TM) de café. (ANECAFE, 2014). Estas cifras de producción de granos secos como materias primas para su industrialización, representan en promedio el 10 % y 20 % respectivamente del total de la materia cosechada (Duicela, Guamán, & Farfán, 2015). Esto significa, que el 90% de la cosecha del cacao y el 80 % de la cosecha del café en base húmeda, constituyen residuos agrícolas y agroindustriales, que tienen un mínimo aprovechamiento en nuestro país. Marco teórico  69   De esas considerables cantidades de desechos, los lixiviados constituyen para el caso del cacao, entre el 40 % al 50 % del peso del grano seco y para el café, del 15,5 % al 22,0 % del peso del fruto (Puerta & Ríos, 2011). Estos autores además informan que, en base húmeda, el lixiviado de café está constituido por: 8,55 % de carbohidratos, 0,93 % de proteínas, 0,12 % de lípidos, 0,17 % de ácidos orgánicos, 0,12 % de alcohol y entre el 81 y 91 % de agua. En cuanto al beneficio del café por vía húmeda, que es el método más frecuentemente usado, se emplean grandes volúmenes de agua limpia y se contaminan cantidades equivalentes de ella. De acuerdo con el Manual del Cafetero Colombiano – CENICAFÉen el lavado y clasificación se consumen en promedio 20 litros de agua limpia por Kilogramo de café pergamino seco e igual volumen en el despulpado y transporte (Zuloaga & ZAmbrano, 1993). La pulpa del café es el desecho más importante del beneficiado, pues representa aproximadamente del peso total del fruto fresco, alrededor del 40% (López & Castlo, 2011), 42% (Gómez & Adalid, 2006) y de 43.58% (Montilla, 2006). Su poder contaminante es muy alto al separarla por vía húmeda, debido a su composición química. Ver Cuadro 2.1 Se indica además, que por cada millón de sacos de 60 kg de café almendra producido (300.000 toneladas de fruto fresco) se generan, 120.000 toneladas de pulpa fresca, la cual si no se utiliza adecuadamente produciría una contaminación equivalente a la generada durante un año, en excretas y orina, por una población de 868 736 habitantes en términos de DBO (Rodriguez, 2009) (Tesis doctoral). Marco teórico  70   Tabla 2.1. Composición química de la pulpa de café. Compuesto Base seca (%) Taninos 1,8 a 8,56 Sustancias péctidas totales 6,5 Azúcares reductores 12,4 Azúcares no reductores 2,0 Cafeína 1,3 Ácido clorogénico 2,6 Ácido cafeico total 1,6 Celulosa 27,6 Fuente: (Elías, 1978). Tradicionalmente la pulpa del café que resulta del beneficio ha sido depositada a las corrientes de agua, lo que genera un aumento considerable de la demanda bioquímica de oxígeno (DBO), aumento de la carga de sólidos totales, incremento en la temperatura del agua, generación de olores y pérdida paisajística. Se trata de una forma de contaminación severa del agua que se da en las épocas de cosecha y que imposibilita su aprovechamiento para acueductos, afecta la fauna acuática y limita los usos recreativos. Otro importante subproducto del beneficio del café es el mucílago. El mucílago de café se genera en la etapa del desmucilaginado y según algunos investigadores representa entre el 14 % y 16 % del peso del fruto fresco de café (Gómez & Adalid, Marco teórico  71   2006) y (Montilla, 2006). En términos de volumen, por cada kg de café cereza se producen 91 ml de mucílago puro (Zambrano, 1994). El mucílago es uno de los residuos que genera una altísima contaminación; en promedio por cada millón de sacos de 60 kg de café almendra, se generan 50.000 toneladas métricas de mucílago fresco que, si no se utiliza adecuadamente, produciría una contaminación equivalente a la generada durante un año, por excretas y orina, de una población de 310 000 habitantes en términos de DBO(Rodriguez, 2009) (Tesis doctoral). La contaminación ocasionada por la industria cafetalera en el proceso de beneficio húmedo, constituye un serio problema en los países productores de café. Sotolongo J, junto a otros investigadores (Sotolongo & al, 2000) presentan un informe detallado (y muy preocupante) de los principales impactos detectados en la provincia de Guantánamo – Cuba, por los residuales del proceso del beneficiado húmedo del café, a saber:  Creación de aguas ácidas (pH < 7)  Malos olores  Aguas coloreadas, de aspecto estético desagradable.  Imposibilidad del uso del agua para consumo humano, la ganadería e irrigación.  Destrucción de ecosistemas acuáticos.  Afectación de los suelos irrigados por esta agua Elevación del % de metano en el agua.   Modificaciones paisajísticas.  Aumento de la concentración de Ca, K, Mg y P en el agua.  Aumento de la carga orgánica y del consumo de O2 en el agua.  Sólidos en suspensión. Marco teórico  72    Aumento de la Demanda Bioquímica de Oxígeno (DBO) y de la Demanda Química de Oxígeno (DQO) por encima de 2 500 y 3 000 mg/L respectivamente. El vertido directo a los cuerpos de agua de los desechos del beneficio del café sin ningún tratamiento, perjudica directamente la flora y fauna acuática, alterando el equilibrio biológico y proliferando la fauna nociva con alto potencial de ser vector de enfermedades (Galindo, 1998). Con base a las cifras que manifiestan las investigaciones sobre la generación de pulpa y mucílago de café, en comparación con los volúmenes de café pergamino seco producido, que para Ecuador en el 2014 fue de 1.131.000 sacos de 60 Kg, la contaminación que originaron esos residuos es realmente alarmante en términos de DBO y DQO. En la Norma Técnica, (INEN, 1998) (Instituto Ecuatoriano de Normalización), los máximos valores permitidos son: Norma de calidad ambiental y descarga de efluentes: Recurso agua Demanda Bioquímica de Oxígeno (5 días) D B O5. mg/l 250 Demanda Química de Oxígeno D Q O mg/l 500 Fuente: INEN - 1998 Los lixiviados del café principalmente, desbordan con creces esas cifras, constituyendo un severo impacto ambiental, como ya lo han reportado las investigaciones citadas. Esta evidente realidad de daño ambiental, que producen los lixiviados del café principalmente, más las esperanzadoras Marco teórico  73   alternativas como fuentes de energía renovables de segunda generación que ofrecen la biomasa residual del beneficio del caco y café, constituyen los puntos centrales de análisis y discusión, que la presente investigación aspira a determinar su magnitud cualitativa y cuantitativa. 2.5 Justificación de la investigación En nuestro país, los estudios para el aprovechamiento final de los desechos agrícolas del cacao y café, han sido escasos y fundamentalmente no han tenido una rigurosa investigación de sus características químicas – biológicas, que permitan determinar el valor real de los residuos que se desechan como resultado de los procesos de beneficios de estos productos. Este trabajo se propone investigar en amplio espectro y empleando técnicas modernas de análisis instrumental, las características fisicoquímicas y biológicas de los desechos agrícolas y agroindustriales del cacao y café, para evaluar el potencial valor agregado que poseen como fuentes de energías limpias de segunda generación. De igual manera, el estudio determinará que estas considerables cifras de desperdicios agrícolas y agroindustriales, al no tener un aprovechado uso de aplicación, se convierten en peligrosos contaminantes ambientales, al ser vertidos sin ningún tratamiento previo a los terrenos agrícolas, manantiales, ríos y quebradas. El estado actual de la situación del manejo de esos desechos, nos brinda la oportunidad de aportar al país con un estudio serio y riguroso, que va a servir de base a las Instituciones del estado y empresas privadas, como una guía documentada, para estudios posteriores de investigación socio económica, que permitan Marco teórico  74   desarrollar proyectos agroindustriales que vayan en beneficio del medio ambiente y mejoramiento de la calidad de vida de las poblaciones afincadas en las áreas de cultivo y cosecha de estos dos productos agrícolas emblemáticos de nuestro país y con reconocido prestigio internacional. Las cifras mostradas anteriormente como volúmenes de desechos agrícolas del cacao y café y la confirmada identificación de muchos estudios anteriores, a más del presente, de que los lixiviados obtenidos del beneficio de esos productos, presentan cantidades considerables de materiales orgánicos como carbohidratos y azúcares, que pueden ser transformados en alcoholes, justifican una investigación que determine cualitativa y cuantitativamente, el aprovechamiento de esa biomasa residual como potenciales fuentes de energías limpias de segunda generación. La presente investigación está en concordancia con el marco Constitucional y legal del Ecuador sobre energías renovables, que procura establecer políticas, estrategias, proyectos y acciones, tendientes a aplicar planes y programas de uso eficiente de estas formas de energía en todo el país. El objetivo de las políticas sobre energías renovables, procura incluir a estas formas de energía, como fundamentales en el cambio de la matriz productiva del país, sustentado en el aprovechamiento de sus recursos renovables. En este ámbito, la Constitución de la República del Ecuador, tiene algunos artículos especialmente consagrados a este campo, que han dado origen a leyes muy importantes sobre gestión ambiental, soberanía alimentaria y soberanía energética, que el Estado está obligado a cumplir y hacerlas cumplir. Veamos lo que dicen nuestra Constitución y leyes vigentes en todo el territorio nacional, sobre estos importantes campos del buen vivir: Marco teórico  75   Constitución de la República del Ecuador. (R.O., 2008) “Artículo 15.- El Estado promoverá, en el sector público y privado, el uso de tecnologías ambientalmente limpias y de energías alternativas no contaminantes y de bajo impacto. La soberanía energética no se alcanzará en detrimento de la soberanía alimentaria, ni afectará el derecho al agua.” “Artículo 313.- El Estado se reserva el derecho de administrar, regular, controlar y gestionar los sectores estratégicos, de conformidad con los principios de sostenibilidad ambiental, precaución, prevención y eficiencia.” “Artículo 395.- la Constitución reconoce los siguientes principios ambientales: 2. Las políticas de gestión ambiental se aplicarán de manera transversal y serán de obligatorio cumplimiento por parte del Estado en todos sus niveles y por todas las personas naturales o jurídicas en el territorio nacional. “Artículo 396.- El Estado adoptará las políticas y medidas oportunas que eviten los impactos ambientales negativos, cuando exista certidumbre de daño. En caso de duda sobre el impacto ambiental de alguna acción u omisión, aunque no exista evidencia científica del daño. El Estado adoptará medidas protectoras eficaces y oportunas”. “Artículo 413.- El Estado promoverá la eficiencia energética, el desarrollo y uso de prácticas y tecnologías ambientalmente limpias y sanas, así como de energías renovables, diversificadas, de bajo impacto y que no pongan en riesgo la soberanía alimentaria, el equilibrio ecológico de los ecosistemas ni el derecho al agua”. Metodología de la investigación  82  Metodología de la investigación  83  CAPÍTULO 3 Metodología de la investigación 3.1. Metodología de la investigación 3.2. Recolección y selección del material vegetal 3.3. Evaluación macromorfológica de los frutos de café y mazorca de cacao 3.4. Obtención de lixiviados de café y cacao 3.4.1 Obtención de lixiviados de cacao 3.4.2 Obtención de lixiviados de café 3.5. Análisis físico-químicos 3.5.1 Tamizaje fitoquímico 3.6. Preparación y deshidratación de las muestras 3.7. Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de masas 3.7.1 Silanización de muestras deshidratadas 3.7.2 Análisis cromatográfico 3.8. Absorción Atómica 3.8.1 Digestión de la muestra 3.8.2 Lectura en el Espectrofotómetro de Absorción Atómica Metodología de la investigación  84  Metodología de la investigación  85  3.1. Metodología de la investigación El trabajo investigativo experimental se realizó en las instalaciones del LABORATORIO DE BIOPRODUCTOS DEL CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOTECNOLÓGICAS DEL ECUADOR (CIBE), perteneciente a la Escuela Superior Politécnica del Litoral (ESPOL), en el Campus “Gustavo Galindo” de la ciudad de Guayaquil, Ecuador. 3.2. Recolección y selección del material vegetal Los materiales vegetales utilizados fueron de las especies, Theobroma cacao L. de la variedad CCN-51 y Coffea canephora L., de la variedad sarchimor, ambos recolectados entre los meses de Septiembre y Octubre de 2015 en las Provincias de Los Ríos, Guayas y Manabí, como se describe en la Tabla 3.1. Tabla 3.1.- Ubicación geográfica de las provincias en las que se recolectaron las muestras vegetales. Especie Provincia Cantón Coordenadas msnm Theobrom a cacao L. Los Ríos Mocache 1°11′07,26″S 79°30′23,71″O 34 Guayas San Francisco de Milagro 2°08′05″S 79°35′14″O 11 Coffea canephor a L. Guayas General Antonio Elizalde 2°12′16.34’’S 79°10’29.75’’ O 255 Manabí Jipijapa 1°09′01.72’’S 80°16’56.41’’ O 380 Elaborado por: Autor, 2015 Metodología de la investigación  86  Según el Instituto Nacional de Meteorología e Hidrología del Ecuador (INAMHI) en los meses de recolección de las muestras hubo déficit hídrico consecutivo, lo que significó que el gasto por efecto de la evapotranspiración y necesidades hídricas no fueran cubiertas para que haya un desarrollado normal de las plantaciones (INAMHI, 2015). Las mazorcas de cacao fueron recolectadas al azar por la mañana, acompañando a los agricultores en sus faenas de cosecha rutinaria. Las muestras tomadas no tenían presencia aparente de patógenos como: escoba de bruja, monilla, o Phytophthora, principales enfermedades presentes en el cacao. La cosecha se almacenó en sacos de polipropileno con una temperatura promedio de bulbo seco del aire de 26ºC en ambas Provincias. En esas condiciones las muestras fueron trasladadas a los laboratorios del CIBE. Fotografía: Mazorcas de cacao Metodología de la investigación  87  Fotografía: Mazorcas de cacao recolectadas El café fue recolectado según el método PICKING, que consiste en recoger solo las cerezas maduras (de color vino o similares) de forma manual una a una. Al igual que con el cacao, se acompañó a los agricultores en cosechas realizadas por la mañana. Las cerezas (frutos maduros de café) fueron recolectadas en tachos plásticos y luego colocadas en bolsas de papel para su posterior traslado al laboratorio, la temperatura de bulbo seco promedio del aire fue de 28ºC en la provincia del Guayas y 25ºC en la provincia de Manabí. Metodología de la investigación  88  Fotografías: Planta de Coffea canephora, variedad Sarchimor. Metodología de la investigación  89  Fotografía: Café cereza donde se observan cerezas maduras 3.3. Evaluación macromorfológica de los frutos de café y mazorca de cacao Para realizar las evaluaciones macromorfológicas, se procedió a diferenciar las partes de la mazorca de cacao y fruto de café, como se detallan en las Imágenes 3.1 y 3.2. Metodología de la investigación  90  Figura 3.1. Partes medidas, pesadas y observadas en las mazorcas de cacao. Elaborado por: Autor, 2015 El propósito de la evaluación es reportar su forma, así como los pesos asociados a sus partes, que nos permitirán evaluar el rendimiento de los lixiviados en ambos frutos y conocer el estado en el cual fueron recolectados. Los parámetros evaluados se muestran en la Tabla 3.2 donde se consideró la parte externa e interna de los frutos Las partes del fruto del café se detallan en la Imagen 3.2. Espesor del Caballete Profundidad de Surco Mazorca Color de la mazorca Cáscara Almendras de cacao Mucílago Metodología de la investigación  91  Imagen 3.2: Partes del fruto y del grano de un cafeto2 Elaborado por el autor Tabla 3.2.- Mediciones tomadas a la mazorca de cacao y cerezas de café Coffea canephora L. Unidad de medida Unidad Instrumento de medición Observación Color más representativo MUNSELL, Color charts for plant tissues Se seleccionaron 340 frutos de café de diferentes localidades del cantón General Antonio Elizalde de la provincia del Guayas Diámetro ecuatorial cm Vernier (marca Chicago Brand) Diámetro polar cm Vernier (marca Chicago Brand)   2Disponibleen:https://commons.wikimedia.org/wiki/File%3ACoffee_Bean_Structure.svg 1: Corte central 2: Grano de café (endosperma) 3: Piel plateada (tegumento) 4: Pergamino (endocarpio) 5: Capa de pectina 6: Pulpa (mesocarpio) 7: Piel exterior (epicarpio). Metodología de la investigación  98  Fotografía: Análisis de tamizaje fitoquímico practicado a lixiviados Figura 3.3. Esquema de tamizaje fitoquímico en extracto alcohólicos.  Fuente: (Miranda & Cuellar, Farmacognasia y productos naturales, 2001) Metodología de la investigación  99  Fotografía: Reacción química de grupos químicos con reactivo reveladores Figura 3.4.- Esquema de tamizaje fitoquímico en extracto alcohólicos. Fuente: (Miranda & Cuellar, Farmacognasia y productos naturales, 2001) Metodología de la investigación  100  Fotografía: Resultados cualitativos de tamizaje fitoquímico 3.6. Preparación y deshidratación de las muestras Los lixiviados obtenidos fueron filtrados y congelados a -80ºC para posterior liofilización. Se usó un equipo LABCONCO a una presión de vacío de 150x10-3 MBAR y temperatura del colector - 46ºC. El liofilizado obtenido se pulverizó en un mortero y se colocaron en botellas de vidrio color ámbar de 10ml en un desecador para su posterior análisis. Fotografía: Lixiviados liofilizados Metodología de la investigación  101  Fotografía: Equipo liofilizador empleado 3.7. Cromatografía de Gases - Espectrometría de Masa 3.7.1. Silanización de muestras deshidratadas Previo al análisis de las muestras liofilizadas, estas fueron derivatizadas con el objetivo de modificar químicamente los compuestos, mejorar su estabilidad térmica, volatilidad y detectabilidad de los analitos en GC-MS. La derivatización se realizó con el reactivo Bis (trimethylsilyl)- trifluoroacetamide de marca Sigma-Aldrich mezclando 2mg de muestra liofilizada con 200 µl del agente derivatizante. El procedimiento empleado para este proceso fue adaptado a partir de la metodología descrita por (Yougen, Xianchao, Dongmei, & Xinwen, 2013), La mezcla se agitó en vortex y se incubó en baño María a 80°C durante 2 horas, se enfriaron a temperatura ambiente y se centrifugaron a 10500 rpm, la mezcla sin solidos suspendidos (sobrenadante) fue separada y trasvasada en insertos cónicos de Metodología de la investigación  102  175µL. Los insertos fueron puestos dentro viales de 2ml para el posterior análisis en GC-MS. Fotografía: Cromatografo de Gases-Masas 3.7.2. Análisis cromatográfico La identificación de los compuestos se realizó en un cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de masas, marca Agilent Technologies. Se usó una columna capilar HP-5MS (30 x 0,25mm) con fenil dimetilpolisiloxano como fase estacionaria (0,25 micras de espesor de película) y helio como fase móvil (1 mL/min). Las condiciones de trabajo del cromatógrafo se detallan en la Tabla 3.6. Metodología de la investigación  103  Tabla 3.6.- Condiciones de trabajo del GC-MS Condición Unidad Modo de inyección Splitless Temperatura de inyección 250ºC Temperatura de detector 280ºC Temperatura inicial del horno 80ºC (durante 1 minuto) Tasa de cambio 3ºC/min Temperatura final del horno 300ºC Elaborado por: Auto, 2015. La identificación de los compuestos se realizó por comparación espectral con los compuestos de referencia existentes en la biblioteca WILEY 9TH WITH NIST 2011 instalada en el GC-MS. 3.8. Absorción atómica Para la determinación de Na, K, Fe, Mg, Ca se empleó un espectrómetro de absorción atómica marca Thermo Scientific iCE3000 y un horno microondas Milestone modelo Start D. según metodología descrita en Standard Methods SM 3111B. 3.8.1. Digestión de la muestra Las muestras previamente fueron filtradas con papel filtro de 0,45µm. Posteriormente se realizó una mezcla de HNO3, H2O2 en relación 4:1 con 0,3g de muestra, que se calentó a una temperatura máxima de 120°C en el digestor de microondas Milestone durante 40 minutos. La mezcla final fue filtrada y enrasada a 25 ml. Metodología de la investigación  104  3.8.2. Lectura en el Espectrofotómetro de Absorción Atómica El método usado para la determinación de los elementos fue el de LLAMA. Para ello se utilizaron lámparas de cátodo hueco específicas para cada uno, cuyos modelos, longitudes de onda y fuentes de gas se detallan en Tabla 3.7 Tabla 3.7.- Modelo de Lámpara y condiciones de trabajo usados en equipo de AA Elaborado por: Autor, 2015. 3.9. Esquema metodológico El Esquema metodológico integral aplicado en este trabajo investigativo, se describe en la Figura 3.3 lemento Longitud de onda (nm) Lámpara Fuente de gas Mg 285,2 Modelo: 942339030121 Fabricante: Thermo Scientific Aire/acetile no Na 589 Modelo: 942339030111 Fabricante: Thermo Scientific Aire/acetile no Fe 248,3 Modelo: 94233902026V Fabricante: Thermo Scientific Aire/acetile no K 766,5 Modelo: 942339030191 Fabricante: Thermo Scientific Aire/acetile no Ca 422,7 Modelo: 942339030201 Fabricante: Thermo Scientific Acetileno/ó xido nitroso Metodología de la investigación  105  Figura 3.5. Esquema Metodológico Elaborado por: Autor, 2015. Semillas Caracterización Físico-química Parámetros Análisis químico  Grados Brix  Características macro morfológicas  Conductividad  Solidos totales  Solidos suspendidos  Solidos disueltos  Densidad  Salinidad  Resistividad  Rendimientos de lixiviados  pH  Tensión superficial  Tamizaje químico  Determinación de Na, K, Fe, Mg, Ca, mediante A.A.  Perfil de azúcares por HPLC  DQO  Azucares totales  Azucares reductores  Determinación de nitrógeno y potasio Coffea canephora L. Theobroma cacao L Descascarado de cacao RECOLECCIÓN DE MUESTRAS VEGETALES EN CAMPO Desmucilaginado Cáscara Fermentación de cacao en sacos de p oli p ro p ileno Desechos Lixiviado Nueces de cacao fermentado Lixiviado Filtrado Liofilización Derivatización Identificación de monosacáridos y disacáridos por GC-MS Filtrado Liofilización Derivatización Identificación de monosacáridos y disacáridos por GC-MS Lavado Macerado Metodología de la investigación  106  Análisis y discusión de resultados  107  CAPÍTULO 4 ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS Análisis y discusión de resultados  114  987654321 6 5 4 3 2 1 0 Número de componente Valor propio 13.5% 6.8% 5.9% 4.0% 65.5% 2.3% 1.1% 0.7% 0.1% Análisis Estadístico de los datos macromorfológicos La gráfica de sedimentación 4.2., muestra que el número de valores propios es mayor que 1 (eje y) para los dos primeros componentes (perímetro ecuatorial y diámetro polar) según criterio de Káiser (Kaiser, 1958), que juntos proporcionan el 79% de los dos componentes principales, 65.5% y 13.5% respectivamente, lo que sugiere que estos dos componentes explican adecuadamente la variación en los datos de las características macromorfológicas de las mazorcas de cacao. Los otros componentes son el ruido. Gráfica 4.2. Evaluación del número necesario de componentes principales (Gráfico de sedimentación) Elaborado por: Autor, 2015. Análisis y discusión de resultados  115  De acuerdo a la Tabla 4.6., para los datos sobre los rasgos morfológicos, las primeras puntuaciones del componente principal se calculan a partir de los datos originales utilizando los coeficientes que se muestran a continuación: CP1= 0.378 Perímetro ecuatorial + 0.360 Diámetro polar + 0.401 Peso de la mazorca + 0.398 Peso de la cáscara + 0.330 Peso de la almendra húmeda + 0.228 Número de Almendras + 0.287 Espesor de caballete + 0.204 Profundidad del surco + 0.352 Peso de placenta. CP2 = -0.005 Perímetro ecuatorial + 0.027 Diámetro polar - 0.008 Peso de la mazorca – 0.016 Peso de la cáscara + 0.232 Peso de la almendra húmeda + 0.587 Número de Almendras - 0.467 Espesor de caballete -0.603 Profundidad del surco + 0.138 Peso de placenta. A partir de esta información, se obtiene que los factores más relevantes, corresponden al peso de la mazorca y de la cáscara, los cuales se encuentran positivamente asociados a la variabilidad morfológica del cacao, mientras que la profundidad del surco tiene cargas negativas grandes sobre el componente 2. Análisis y discusión de resultados  116  Tabla 4.6. Vectores propios de los rasgos morfológicos más descriptivos medidos en mazorcas de cacao. Factor Componente Principal 1 2 Perímetro ecuatorial (cm) 0.378 -0.005 Diámetro polar (cm) 0.360 0.027 Peso de la mazorca (g) 0.401* -0.008 Peso cáscara (g) 0.398* -0.016 Peso de la almendra húmeda (g) 0.330 0.232 Número de almendras 0.228 0.587 Espesor de caballete (cm) 0.287 -0.467 Profundidad del surco (cm) 0.204 -0.603* Peso de placenta (g) 0.352 0.138 Valores con asteriscos indican los factores más descriptivos. Elaborado por: Autor, 2015.  La Gráfica 4.3 representa las composiciones porcentuales de los constituyentes de la mazorca de cacao. En ella se observa que la almendra seca, que es el producto final de interés comercial, representa apenas el 6,2% en base seca del peso total de la mazorca, mientras que la considerable diferencia lo constituyen los desechos agrícolas que en nuestro país poco o nulo aprovechamiento tienen. Análisis y discusión de resultados  117  Gráfica 4.3. Composición porcentual del fruto de Theobroma cacao L. Elaborado por: Autor, 2015. En referencia al mucílago, que representa el 21% del peso total de la mazorca, debemos indicar que una porción de el utiliza la propia almendra para su fermentación natural y el excedente es el lixiviado que se pierde en campo (Gráfica 4.4.). En la presente investigación se determinó por balance de materia basado en la información expuesta, que por cada kilogramo de almendra seca lo acompañaron 0,59 kilogramos de lixiviado. Tabla 4.6. Análisis y discusión de resultados  118  Gráfica 4.4. Composición de la almendra húmeda de Theobroma cacao L, antes de la fermentación. Elaborado por: Autor, 2015. Tabla 4.7. Rendimiento de lixiviado de Theobroma cacao L., no asociado a la fermentación. Magnitud Unidad Rendimiento de lixiviado 0,59 Kg Lixiviado/Kg almendra (BS) BS= Base seca. Elaborado por: Autor, 2015. Análisis y discusión de resultados  119  Gráfica 4.5. Rendimiento de lixiviado de Theobroma cacao L., no asociado a la fermentación. Elaborado por: Autor, 2015. Con base a la relación del peso de lixiviado por unidad de peso de cacao seco, la gráfica 4.5., lo extrapola por tonelada métrica de caco producto final, que es las unidad internacional de comercio, observando que por cada tonelada métrica de cacao seco, 590 kilogramos de lixiviados se quedan en campo. Dando continuidad a la caracterización de los lixiviados de Theobroma cacao L., y Coffea canephora L., en la tabla 4.8 se muestran los resultados de nueve parámetros físicos estudiados, los mismos que abarcan un amplio espectro de análisis para poder describir la naturaleza física de esos exudados. Para el presente trabajo investigativo, cuya finalidad es explorar el potencial empleo de los lixiviados del cacao y café como fuentes de producción de bioetanol, sin lugar a dudas que los ºBrix y el potencial de hidrógeno (pH) constituyen importantes indicadores hacia ese propósito. Análisis y discusión de resultados  120  Tabla 4.8. Características físicas de los lixiviados de Theobroma cacao L., y Coffea arábica L. Parámetro (Unidad) Cacao Café Cáscara de café Densidad (g/ml) 1,10 1,10 1,03 0,01 0,01 0,01 °Brix 19,60 4,2 3,25 0,57 0,8 0,25 pH 3,58 3,83 4,05 0,07 0,09 0,05 Sólidos suspendido totales (mg/l) 9711,00 2598,00 867,50 685,89 483,66 114,50 Sólidos totales (mg/l) 192154,00 23605,00 11813,50 6683,57 8379,22 1171,50 Conductividad (mS/cm) 3,29 3,39 4,29 0,06 0,32 0,97 Salinidad (ppt) 1,71 1,79 2,26 0,03 0,20 0,53 Resistividad (Ω-cm) 0,02 0,01 0,02 Tensión superficial (N) 52,65 54,68 53,75 1,91 1,39 0,65 Valores promedios obtenidos de muestras provenientes de las localidades de Milagro y Los Ríos (Cacao), Manabí y Bucay (Café). Valores sombreados corresponden a la desviación estándar. Elaborado por: Autor, 2015. Los valores de la densidad reportados en el presente estudio, 1,10 g/ml para el café y 1,10 g/ml para el cacao, son similares a los expuestos en un estudio realizado por CENICAFÉ (Cenicafé, 2012) y (Cedeño, 2013), con valores de 1, 38 y 1,076 g/ml para café y cacao respectivamente. Análisis y discusión de resultados  121  Sin embargo es muy importante destacar que, CENICAFÉ reporta la densidad y grados Brix del mucílago puro (sin adición de agua), mientras que en este trabajo, el mucílago fue extraído con agua en una relación 1:1 p/p, y a pesar de esta notable diferencia, los resultados de densidad son cercanos. Los valores de ºBrix para el café, difieren significativamente con respecto a los reportados por CENICAFÉ, mientras que para el exudado de cacao se observa una diferencia de 2 Brix en comparación con lo reportado por (Cedeño, 2013). Uno de los parámetros físicos importantes de analizar es el pH, pues, según CENICAFÉ, (Cenicafé, 2012), su valor indica la madurez del fruto. Cedeño, (Cedeño, 2013), reporta un valor 3,7 para el lixiviado de cacao, mientras que en este estudio se determinó un valor 3,58. La importancia del valor del pH encontrado, radica en que su concentración afecta el crecimiento celular y la producción de metabolitos secundarios (Buzas, 1988). Estudios realizados por Buzas en 1988 determinaron que pHs entre 3,5 y 5,0 son valores óptimos en donde hubo un mayor desarrollo de levaduras de pan. Dadas estas características, los lixiviados de café y cacao poseen un potencial de hidrógeno favorable para el desarrollo de microorganismos capaces de desdoblar azucares y convertirlos en bioetanol. A manera de aporte a la investigación, se evaluó las características de la cascara de café, encontrándose que sus propiedades son similares a las de los lixiviados. Análisis y discusión de resultados  122  Análisis Estadístico de los datos físicos La Tabla 4.9 muestra que no hay una diferencia significativa en los valores del pH de las muestras de cacao de las provincias de Guayas y Los Ríos. De igual forma, las muestras de café de las provincias de Manabí y Guayas, no muestran diferencias apreciables con respecto al pH, sin embargo, el pH de la cáscara del café de Manabí, muestra un valor mayor al pH del grano de café. Con respecto a la conductividad, se encontraron diferencias significativas en las muestras, con excepción del cacao del Guayas y la cáscara de café del Guayas. Resultados similares se observan en el parámetro de salinidad. Los valores de resistividad no fueron significativos para el cacao de Los Ríos. En el Gráfico 4.6, se muestran los valores de resistividad asociados a los de conductividad. En lo referente a la tensión superficial, el cacao de Los Ríos, el café del Guayas y la cáscara del café del Guayas no mostraron diferencias significativas. Tabla 4.9. Características físicas de los lixiviados de Theobroma cacao L., y Coffea arábica L. pH Conductividad (mS/cm) Salinidad (ppt) Resistividad (Ω-cm) Tensión superficial Cacao Guayas (Milagro) 3.53 ± 0.01 A 3.33 ± 0.02 A 1.73 ± 0.00 A 3.00 ± 0.02 A 51.33 ± 0.57 A Cacao Los Ríos 3.63 ± 0.01 A 3.24 ± 0.03 B 1.69 ± 0.02 AB 3.08 ± 0.03 B 54.00 ± 0.00 BC Café Manabí 3.89 ± 0.01 BC 3.61 ± 0.01 C 1.92 ± 0.03 B 2.76 ± 0.01 C 55.67 ± 0.57 D Café Guayas (Bucay) 3.77 ± 0.11 C 3.15 ± 0.01 D 1.65 ± 0.01 C 3.17 ± 0.01 D 53.67 ± 0.57 B Café Manabí CASCARA 4.10 ± 0.01 D 5.26 ± 0.05 E 2.79 ± 0.02 D 1.91 ± 0.02 E 53.00 ± 0.50 C Café Guayas (Bucay) CASCARA 4.00 ± 0.02 BD 3.32 ± 0.01 A 1.72 ± 0.01 A 3.00 ± 0.00 A 54.33 ± 0.29 BC Letras diferentes en la misma columna indican diferencia significativa (p<0,05) Elaborado por: Autor, 2015. Análisis y discusión de resultados  123  0,500,250,00-0,25-0,50 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Primer componente Segundo componente Tensión superficial Resistividad (O-cm) Salinidad (ppt) Conductividad (mS/cm) pH Gráfica 4.6. Gráfica de cargas de componentes principales Elaborado por: Autor, 2015. Asimismo se procedió a realizar un análisis estadístico de los datos obtenidos, empleando el análisis de varianza obteniéndose los siguientes resultados: ANOVA unidireccional: pH vs. Variedad Fuente GL SC CM F P Variedad 5 0,71429 0,14286 60,36 0,000 Error 12 0,02840 0,00237 Total 17 0,74269 S = 0,04865 R-cuad. = 96,18% R-cuad.(ajustado) = 94,58% ANOVA unidireccional: Conductividad (mS/cm) vs. Variedad Fuente GL SC CM F P Variedad 5 9,595044 1,919009 2808,31 0,000 Error 12 0,008200 0,000683 Total 17 9,603244 S = 0,02614 R-cuad. = 99,91% R-cuad.(ajustado) = 99,88%