El biodeterioro en edificios del patrimonio cultural: metodología de evaluación de tratamientos biocidas.

EL BIODETERIORO EN EDIFICIOS DEL PATRIMONIO CULTURAL. METODOLOGÍA DE EVALUACIÓN DE TRATAMIENTOS BIOCIDAS Tesis Doctoral Marta Sameño Puerto Sevilla 2018 EL BIODETERIORO EN EDIFICIOS DEL PATRIMONIO CULTURAL. METODOLOGÍA DE EVALUACIÓN DE TRATAMIENTOS BIOCIDAS TESIS DOCTORAL Marta Sameño Puerto Dpto. Ingeniería Química y Ambiental. ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIERÍA (US) Instituto Andaluz del Patrimonio Histórico (IAPH). JUNTA DE ANDALUCÍA Dirigida por las doctoras: Dra. Rosario Villegas Sánchez (Tutora) Dra. Lourdes Martín García Sevilla, 2018 Este trabajo de Tesis Doctoral comenzó a desarrollarse hace muchos años. Por circunstancias laborales y personales, la velocidad de realización no ha sido la deseada, pero en la mente de la doctoranda siempre ha estado presente el deseo de investigar y sistematizar sobre los estudios de biodeterioro que el IAPH había incorporado de manera rutinaria en sus proyectos de intervención. Es por ello que en la mayoría de los trabajos que la doctoranda ha llevado a cabo, además de los estudios que obligatoriamente debían efectuarse (identificación de especies, propuesta de tratamientos), ha ido añadiendo tareas de investigación (esencialmente en lo referido a las interacciones de los biocidas con los materiales del sustrato o con otros tratamientos, o la puesta a punto de distintas técnicas de análisis) que han ido dando contenido a esta propuesta de tesis. A Manolo. Mi niño, mi ángel, mi inspiración. La belleza perece en la vida, pero es inmortal en el arte. Leonardo Da Vinci out using X-ray dispersive energy in order to detect possible changes in the chemical compositions, as well as morphology at microscopic level. Also in some cases, when it was possible, tests were also carried out to quantify possible variations suffered in the different physical properties of the materials (colorimetry, open porosity, surface hardness, atmospheric moisture absorption, ultrasound speed, etc.). The Biotin R has proved to be the most suitable in eliminating biodeterioration in the stone of the atauriques in the Rico Salon in Medina Azahara, as much for its effectiveness as for its low level of/scarce interaction with the constituent material, however, in the case of the ceramic materials in Santa Paula, the most sutable turned out to be Preventol Ri80. In turn, it was determined that Biotin T is completely unsuitable or eliminatomg biodeteriogens from the atauriques, due to a level of high disintegration of the material detected when it was applied by immersion. In general, all these biocidal products increase, albeit very slightly, the porosity of the geomaterials analyzed. With respect to the paintings on leather in the Hall of the Kings in the Alhambra and the wood and wall paintings of the Macsura of the Mosque of Córdoba, all the biocides tested proved effective in reducing the proliferation of fungal species. The treatment with CuO nanoparticles, although it is the most effective, caused a very significant color change in all the materials it was tested on, ie wood and pictorial materials, by darkening them, so their use is not indicated in historical heritage. The pigments that were the most altered after the applying the biocides are red and blue. Thiabendazole is the fungicide that causes the least chromatic change in all cases. The study carried out by SEM-EDX, shows that there are no significant chemical or morphological changes in the surface of the samples after being treated with the products. The combination of all these studies has made it possible to determine which biocidal product is the most suitable for each case, eliminating the biological agents responsible for the deterioration of the constituent materials. Likewise, it has become clear that it is always necessary to perform preliminary characterization studies on the materials, to determine biological species and to evaluate the treatments, both with regard to how effective they are and how compatibile they are with the materials that are part of the cultural assets in study, since the effects that these treatments produce on them vary depending on their nature. Key words: Biocide, Biodeterioration, Compatibility, Effectiveness, Geomaterial, Wood, Pictorial materials ÍNDICE JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS 1 BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 7 1. EL BIODETERIORO DEL PATRIMONIO CULTURAL 9 1.1 DEFINICIÓN Y MECANISMOS DE LOS PROCESOS 10 1.2 FACTORES ECOLÓGICOS 10 Condiciones necesarias para el crecimiento de organismos 12 1.3 FACTORES BIOLÓGICOS DE DETERIORO 13 Principales grupos de organismos 13 1.4 MECANISMOS Y ASPECTOS MORFOLÓGICOS DEL BIODETERIORO 22 1.4.1 Procesos físicos o mecánicos (disgregación o fracturación) 22 1.4.2 Procesos químicos (descomposición) 23 1.4.3 Daños estéticos 23 1.4.4 Aspecto morfológico de las alteraciones biológicas 24 1.5 LOS PROCESOS DE BIODETERIORO EN FUNCIÓN DE LOS MATERIALES DE LOS BIENES CULTURALES 27 1.5.1 Materiales orgánicos de origen vegetal 27 1.5.2 Materiales orgánicos de origen animal 30 1.5.3 Materiales pictóricos 31 1.5.4 Materiales inorgánicos: materiales pétreos 33 2. LA CONSERVACIÓN DEL PATRIMONIO CULTURAL 39 2.1 METODOLOGÍA DE ESTUDIO DEL BIODETERIORO Y TÉCNICAS DE ANÁLISIS 39 2.1.1 Toma de muestras 39 2.1.2 Estimación directa de organismos 40 2.1.3 Estimación indirecta de organismos 42 2.1.4 Diagnóstico de la actividad biodeteriorante de los organismos sobre el material 43 2.2 MÉTODOS DE PREVENCIÓN Y CONTROL DEL BIODETERIORO. BIOCIDAS 44 2.2.1 Métodos indirectos 44 2.2.2 Métodos directos 45 2.3 OTROS TRATAMIENTOS: CONSOLIDANTES E HIDRÓFUGOS 52 2.4 EVALUACIÓN DE TRATAMIENTOS DE CONSERVACIÓN 56 2.4.1 Evaluación de la eficacia de tratamientos para erradicar el biodeterioro 59 2.4.2 Evaluación de la compatibilidad de los tratamientos 62 BLOQUE II. METODOLOGÍA DE TRABAJO 65 1. TÉCNICAS EMPLEADAS EN EL ESTUDIO 68 1.1 MICROSCOPÍA ESTEREOSCÓPICA 68 1.2 MICROSCOPÍA ÓPTICA DE LUZ TRANSMITIDA Y REFLEJADA (MO) Y MICROSCOPÍA ÓPTICA DE POLARIZACIÓN (MOP) 68 1.3 MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO (SEM) Y MICROANÁLISIS ELEMENTAL MEDIANTE ENERGÍA DISPERSIVA DE RAYOS X (EDX) 69 1.4 DIFRACCIÓN DE RAYOS X (DRX) 71 1.5 ESPECTROSCOPÍA INFRARROJA POR TRANSFORMADA DE FOURIER (FTIR)- CROMATOGRAFÍA DE GASES (GC) 71 1.6 REACCIÓN DE TINCIÓN CON HIDRÓXIDO DE POTASIO (KOH) 71 1.7 TÉCNICAS DE CULTIVO. CRECIMIENTO BIOLÓGICO EN LABORATORIO 72 1.8 TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR 73 1.9 ESPECTROFOTOMETRÍA UV-VISIBLE 77 1.10 COLORIMETRÍA 78 1.11 POROSIDAD 79 1.12 VELOCIDAD DE PROPAGACIÓN POR ULTRASONIDOS 80 1.13 DUREZA SUPERFICIAL 80 2. METODOLOGÍA DE CARACTERIZACIÓN DE MATERIALES 81 2.1 MATERIALES PÉTREOS 81 2.2 MATERIALES DE ORIGEN BIOLOGICO: MADERA Y CUERO 81 2.3 MATERIALES PICTÓRICOS 83 3. METODOLOGÍA DE ESTUDIOS DE BIODETERIORO. DETERMINACIÓN DE ESPECIES 84 3.1 IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS HETERÓTROFOS: BACTERIAS, HONGOS FILAMENTOSOS Y DE PUDRICIÓN. IDENTIFICACIÓN DE INSECTOS. 85 3.2 IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS FOTOAUTÓTROFOS: CIANOBACTERIAS Y ALGAS 86 3.3 IDENTIFICACIÓN DE LÍQUENES 87 3.4 IDENTIFICACIÓN DE BRIOFITOS 87 3.5 IDENTIFICACIÓN DE PLANTAS SUPERIORES 87 4. METODOLOGÍA DE EVALUACIÓN DE TRATAMIENTOS 88 4.1 MATERIALES 89 4.2 TRATAMIENTOS 89 4.3 ENSAYOS DE EFECTIVIDAD 95 4.3.1 Estudio de la vitalidad de microorganismos fotótrofos al microscopio óptico 96 4.3.2 Estudio de la interfase liquen-sustrato al microscopio electrónico de barrido 96 4.3.3 Estimación de biomasa fotosintética por espectrofotometría UV-visible. 96 4.3.4 Capacidad de eliminación o reducción del crecimiento de especies de hongos filamentosos y de pudrición. 98 4.4 ENSAYOS DE COMPATIBILIDAD. ENSAYOS DE INTERFERENCIA PRODUCTOSUSTRATO 102 4.4.1 Estudio al SEM-EDX 102 4.4.2 Colorimetría 103 4.4.3 Porosidad 103 4.4.4 Velocidad de propagación por ultrasonidos 104 4.4.5 Absorción de agua por higroscopicidad 104 4.4.6 Dureza superficial 105 4.4.7 Envejecimiento acelerado 105 BLOQUE III. ESTUDIO EXPERIMENTAL 107 CAPÍTULO 1. PORTADA DE LA IGLESIA DEL CONVENTO DE SANTA PAULA (SEVILLA) 109 1. INTRODUCCIÓN 111 1.1 HISTORIA Y ESTADO ACTUAL 111 1.2 PLAN DE TRABAJO 113 1.3 CARACTERIZACIÓN DE MATERIALES 114 2. ESTUDIOS DE BIODETERIORO 115 2.1 IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS FOTÓTROFOS 119 2.2 IDENTIFICACIÓN DE LÍQUENES 123 2.3 IDENTIFICACIÓN DE BRIOFITOS 132 2.4 IDENTIFICACIÓN DE PLANTAS SUPERIORES 134 3. EVALUACIÓN DE TRATAMIENTOS 138 3.1 MATERIALES 138 3.2 TRATAMIENTOS 138 3.3 ENSAYOS DE EFICACIA BIOCIDA 138 3.3.1 Estudio de la vitalidad de microorganismos fotótrofos al microscopio óptico 138 3.3.2 Estudio de la interfase liquen-sustrato al microscopio electrónico de barrido 140 3.4 ENSAYOS DE INTERFERENCIA BIOCIDA-SUSTRATO 145 Estudio al microscopio electrónico de barrido (SEM-EDX) 146 4. CONCLUSIONES 151 CAPÍTULO 2. ATAURIQUES DEL SALÓN DE ABD AL-RAHAMAN III DEL CONJUNTO ARQUEOLÓGICO MEDINA AZAHARA (CÓRDOBA) 155 1. INTRODUCCIÓN 157 1.1 HISTORIA Y ESTADO ACTUAL 157 1.2 PLAN DE TRABAJO 159 1.3 CARACTERIZACIÓN DE MATERIALES 160 2. ESTUDIOS DE BIODETERIORO 160 2.1 IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS FOTÓTROFOS 160 2.2 IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS HETERÓTROFOS 162 2.3 IDENTIFICACIÓN DE LÍQUENES 162 2.4 IDENTIFICACIÓN DE BRIOFITOS 164 3. EVALUACIÓN DE TRATAMIENTOS 166 3.1 MATERIALES 166 3.2 TRATAMIENTOS 167 3.3 ENSAYOS DE EFICACIA BIOCIDA 167 3.3.1 Estimación de biomasa fotosintética por espectrofotometría UV-visible 167 3.3.2 Estudio de la interfase liquen-sustrato al SEM 169 3.4 ENSAYOS DE INTERFERENCIA BIOCIDA-SUSTRATO 174 3.4.1 Estudio al SEM-EDX 174 3.4.2 Colorimetría 184 3.4.3 Porosidad 184 4. CONCLUSIONES 185 CAPÍTULO 3. PINTURAS DE LA SALA DE LOS REYES DE LA ALHAMBRA (GRANADA) 187 1. INTRODUCCIÓN 189 1.1 HISTORIA Y ESTADO ACTUAL 189 1.2 PLAN DE TRABAJO 194 1.3 CARACTERIZACIÓN DE MATERIALES 195 1.3.1 Madera 195 1.3.2 Cuero 199 1.3.3 Capas pictóricas 201 2. ESTUDIOS DE BIODETERIORO 206 IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS: HONGOS FILAMENTOSOS Y DE PUDRCIÓN 209 3. EVALUACIÓN DE TRATAMIENTOS 217 3.1 MATERIALES 217 3.2 TRATAMIENTOS 221 3.3 ENSAYOS DE EFICACIA BIOCIDA 221 Capacidad de eliminación o reducción del crecimiento de especies de hongos filamentosos y de pudrición. 221 3.4 ENSAYOS DE COMPATIBILIDAD TRATAMIENTOS-SUSTRATOS 231 3.4.1 Colorimetría 231 3.4.2 Estudio de capas pictóricas 236 4. CONCLUSIONES 242 CAPÍTULO 4. CÚPULAS DE LA MAQSURA DE LA MEZQUITA-CATEDRAL (CÓRDOBA) 245 1. INTRODUCCIÓN 247 1.1 HISTORIA Y ESTADO ACTUAL 247 1.2 PLAN DE TRABAJO 251 1.3 CARACTERIZACIÓN DE MATERIALES 252 1.3.1 Madera 252 1.3.2 Capas pictóricas 255 2. ESTUDIOS DE BIODETERIORO 260 2.1 INTERIOR DE LAS CÚPULAS 266 Identificación de microorganismos: bacterias y hongos 266 2.2 TRASDÓS DE LA CUPULA CENTRAL 271 2.2.1 Identificación de microorganismos: hongos filamentosos y de pudrición 271 2.2.2 Análisis entomológico:Insectos 276 2.3 EXTERIOR DE LAS CÚPULAS 277 2.3.1 Identificación de microorganismos fotótrofos 277 2.3.2 Identificación de líquenes 280 2.3.3 Identificación de briofitos 283 2.3.4 Identificación de plantas superiores 284 3. EVALUACIÓN DE TRATAMIENTOS 287 3.1 MATERIALES 287 3.2 TRATAMIENTOS 289 3.3 ENSAYOS DE EFICACIA BIOCIDA 291 Capacidad de eliminación o reducción del crecimiento de especies de hongos filamentosos y de pudrición. 291 3.4 ENSAYOS DE COMPATIBILIDAD TRATAMIENTOS-SUSTRATOS Y DURABILIDAD 293 3.4.1 Compatibilidad de tratamientos en madera 293 Estudio al SEM-EDX 294 Colorimetría 298 Velocidad de ultrasonido 300 Absorción de agua por higroscopicidad 303 Dureza superficial 305 Ensayo de alteración acelerada 307 3.4.2 Compatibilidad con materiales pictóricos. Réplicas de las pinturas murales 309 Colorimetría 309 Estudio de capas pictóricas 310 4. CONCLUSIONES 314 CONCLUSIONES GENERALES 319 BIBLIOGRAFÍA 325 JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS 3 Aunque la ciencia y la tecnología han estado siempre presentes, como componentes del desarrollo humano, las relaciones existentes entre las disciplinas científicas y humanísticas, particularmente en el campo de la conservación/restauración, se han consolidado en las últimas décadas. La investigación científica, propiamente dicha, aplicada al campo del Patrimonio Cultural comienza a jugar un papel sistemático en Europa a partir de fines del siglo XVIII y principios del XIX. Desde ese momento, la inserción de la investigación científica en este campo no ha parado de crecer (De Tagle, 2008). Los proyectos de investigación en ciencias del patrimonio juegan un papel fundamental en el ámbito actual de la cultura occidental. Así como la formación académica universitaria de los profesionales encargados de estas ciencias y la integración de comunidades de investigación científica que incluyen diferentes áreas del conocimiento en los proyectos de conservación del patrimonio cultural (De Tagle, 2008). En un proyecto de conservación-restauración de un bien cultural, resulta fundamental realizar un estudio previo del mismo, sobre todo de su estado de conservación y de las causas del deterioro que presenta. Sólo así es posible conocer los distintos factores de alteración y los métodos para combatirlos, con la finalidad de garantizar la conservación material del monumento. A nivel nacional e internacional diversos organismos han realizado recomendaciones sobre criterios de intervención en Patrimonio Histórico, entre los que se recogen los estudios relacionados con el biodeterioro. El Instituto del Patrimonio Histórico Español publicó un documento (IPHE, 2003) en el que se recoge la necesidad de considerar los factores biológicos de alteración y los tratamientos biocidas. El Istituto Centrale per il Restauro (Roma), una de las entidades pioneras en este campo a nivel mundial, publicó dentro de los documentos NORMAL las recomendaciones para la investigación del biodeterioro (Doc. NORMAL 9/82, Doc. NORMAL 19/85, Doc. NORMAL 24/86). Diferentes investigadores han incidido también sobre la necesidad de contemplar los estudios sobre los organismos vivos y sus efectos en el patrimonio inmueble (Lazzarini &Tabasso, 1986; Doehne & Price, 2010) En Andalucía existe, desde 1989, un organismo, el Instituto Andaluz del Patrimonio Histórico de la Junta de Andalucía (IAPH), que tiene entre sus fines generales, establecidos en sus estatutos, la intervención, investigación, conservación y valorización del patrimonio cultural andaluz, así como la innovación, la transferencia de conocimiento y el establecimiento de pautas para la tutela del patrimonio cultural. El trabajo de investigación que se presenta a la consideración del Tribunal como tesis doctoral, se ha desarrollado en el Laboratorio de Biología del Instituto Andaluz del Patrimonio Histórico (IAPH). Ha contado también para su realización con la colaboración de la Escuela Técnica Superior de Ingeniería (ETSI) de la Universidad de Sevilla, institución a la que pertenece una de las directoras de esta tesis, así como la del Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis (IBVF) del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) de Sevilla. Además, este estudio ha sido posible gracias a las colaboraciones y convenios suscritos con la Dirección General de Bienes Culturales de la Junta de Andalucía, el Patronato de la Alhambra y el Generalife de Granada y el Cabildo de la Mezquita Catedral de Córdoba. La posibilidad de trabajar sobre obras reales del patrimonio histórico andaluz, en varias ocasiones consideradas por la Unesco como Patrimonio Mundial (Mezquita de Córdoba, Alhambra de Granada, Medina Azahara de Córdoba) ha permitido desarrollar estudios sobre aspectos poco investigados y elaborar un protocolo de trabajo que incluye todas las áreas relacionadas con el biodeterioro dentro de un proyecto interdisciplinar de conservación-restauración. BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 10 mecánico (Ortega-Calvo, 1991) como la presión que ejercen sobre el material debido a la contracción y la dilatación de las estructuras biológicas, lo que podría causar un mayor debilitamiento del material constitutivo y su consecuente caída; y también pueden ocasionar alteraciones mediantes procesos físicos y químicos (Ortega-Calvo, 1994). 1.1 DEFINICIÓN Y MECANISMOS DE LOS PROCESOS DE BIODETERIORO ¿Qué es el biodeterioro? Este término puede ser definido como cualquier cambio indeseable en las propiedades de un material causado por la actividad vital de los organismos (Allsopp et al., 2004). El biodeterioro de las obras de arte se entiende como una alteración de los materiales que las constituyen debido a la actividad metabólica de una o más poblaciones de microorganismos u organismos. Los monumentos, esculturas y otras obras de arte expuestas a la intemperie se han deteriorado a través de los siglos por causas naturales. El sol, las heladas, el viento, la lluvia, etc., contribuyen al proceso gradual de envejecimiento y deterioro. Este deterioro que experimentan los materiales ha aumentado progresivamente (Allsopp & Seal, 1986), mucho más rápidamente desde el siglo pasado, especialmente debido a la creciente contaminación atmosférica. La mayoría de los organismos que crecen sobre los monumentos son capaces de generar sustancias que alteran irreversiblemente el material constitutivo, lo cual acelera el proceso de destrucción de dicho monumento. Es algo similar a lo que ocurre en el proceso de formación de suelos, pero en el caso anterior supone una pérdida irreparable. Así pues, se puede decir que cualquier tipo de alteración irreversible, consecuencia de la actividad metabólica de una o más poblaciones de organismos vivos, cualquiera que sea el tamaño de éstos, es lo que actualmente se entiende por biodeterioro. Sin embargo, la mera presencia de un organismo sobre un material no es suficiente para determinar que aquél sea el que ha causado el daño. Para poder probar este biodeterioro es necesario comprobar que ha cambiado alguna propiedad esencial del material en estudio. Por otro lado, los fenómenos de biodeterioro no pueden ser considerados de manera aislada, sino que siempre aparecen asociados a procesos de alteración físicos y químicos. Algunos autores (Krumbein, 1988) consideran que la superficie de un monumento es colonizada por ciertos organismos vivos si previamente ésta sufre un proceso degradativo debido a la exposición al ambiente. La lluvia, el viento, el sol, el hielo y los contaminantes atmosféricos provocan un aumento de la superficie específica del material pétreo, por formación de macro y microfisuras y de rugosidades, lo que favorece la acumulación de partículas atmosféricas y la colonización por parte de organismos vivos (García Murillo, 1995). 1.2 FACTORES ECOLÓGICOS La ecología es la ciencia que estudia las relaciones entre los organismos y el ambiente. La unidad base de un estudio ecológico está representada por el ecosistema. Con este término se define una unidad que incluye todos los organismos que, en un área determinada, interaccionan entre ellos y con el ambiente físico, de modo que el flujo de energía se da en una estructura trófica bien definida, con una equilibrada diversidad biótica y una transformación de la materia (Caneva et al., 1994). Si se aplican estos conceptos ecológicos al estudio de una obra de arte, la cual representa el “sustrato”, ésta sería la materia que entra en el ciclo biogeoquímico, expuesta a la acción de los BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 11 factores ambientales y al ataque potencial por parte de diversas poblaciones biológicas (figura I.1). Generalmente estas poblaciones representan los agentes biodeteriorantes, que son aquellos organismos que causan daños a la obra de arte. Sin embargo, la presencia de un factor biológico (organismo o microorganismo) no siempre es negativa, también puede influir positivamente mejorando, a veces, la conservación de la obra en cuestión, como es el caso de los líquenes que colonizan los muros de un edificio. Respecto a las cadenas tróficas, que ponen de manifiesto la posición nutricional de un organismo en el sistema, los organismos presentes sobre una obra de arte, como en todos los ecosistemas, pueden ser tanto productores (autótrofos), como predadores o consumidores (heterótrofos). Desde el punto de vista energético esta cadena trófica da lugar a una pirámide ecológica; en cada nivel se produce una dispersión de energía y un aumento de entropía, de acuerdo a la segunda ley de la termodinámica. Por esta razón quizá sea imposible la conservación del material por un tiempo infinito, en cuanto que la materia tiende siempre a adquirir una estructura más simple y con ello más estable (Caneva et al., 2005). Figura I.1. Esquema de un bien cultural en clave ecosistémica (basado en el realizado por Caneva et al., 2005). Escultura de fuente de Plaza de la República, en Roma. BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 12 Condiciones necesarias para el crecimiento de organismos Cada grupo biológico puede iniciar su desarrollo y después seguir su crecimiento sólo si se dan determinadas condiciones ambientales. Con respecto a estas variables, existen límites de tolerancia (valores máximos y mínimos) que presentan los organismos. El espacio que existe entre estos valores extremos es la amplitud de tolerancia de una determinada especie. Se denomina factor limitante el factor ambiental que sobrepasa la amplitud de tolerancia de un individuo (Sameño Puerto, 2003). Los parámetros que condicionan la colonización y el posterior crecimiento de los organismos, son entre otros: - la luz: imprescindible para la fotosíntesis y con ello un factor limitante para organismos autótrofos. La fuente puede provenir no sólo del sol como más común, sino de fuentes artificiales, de distintos tipos e intensidades; - el oxígeno: aunque no es un factor limitante, pues existen organismos anaerobios implicados en los procesos de biodeterioro, la mayoría de los organismos toman oxígeno (para la respiración celular). Con respecto a los microorganismos, las bacterias se clasifican en aerobias, que utilizan el oxígeno libre como aceptor final del hidrógeno (o electrones), y anaerobias, que utilizan como aceptores compuestos orgánicos o inorgánicos. La mayoría de los hongos necesitan oxígeno; - el carbono: es un elemento indispensable para el desarrollo de todos los organismos, ya que forma parte de los polímeros que componen la estructura celular (polisacáridos, proteínas, enzimas, etc.). Puede ser asimilado por los organismos autótrofos (algas y ciertas bacterias) como dióxido de carbono, procedente del aire, a través de mecanismos asociados a procesos fotosintéticos y quimiosintéticos (según el grupo al que pertenezcan los organismos). Los heterótrofos lo asimilan bajo forma orgánica; - el nitrógeno: posee la misma importancia que el elemento anterior. Sólo algunas bacterias y algas son capaces de fijarlo directamente de la atmósfera, el resto lo absorben en forma de sales inorgánicas; - el agua: es indispensable para las funciones vitales de todos los organismos ya que constituye la mayor parte de la célula y es indispensable para los cambios metabólicos con el medio ambiente externo, aunque determinados grupos estén muy bien adaptados a la sequía. Puede ser absorbida directamente de la superficie de los monumentos (organismos sustrato-higrófilos), de la humedad atmosférica (organismos aerohigrófilos), o bien de la lluvia. La presencia de humedad predispone a las superficies de las obras de arte al biodeterioro. Los valores críticos de humedad relativa son del 60-65 %, por debajo de éstos se dificulta la proliferación de microorganismos; - la temperatura y el pH: son parámetros importantes, aunque existen amplios rangos de tolerancia dependiendo del tipo de organismos. En el caso concreto de la temperatura, más que ser un factor limitante, afecta sólo a la velocidad de crecimiento. Los microorganismos pueden vivir en una amplia gama de valores, aunque tienen sus rangos de temperaturas óptimas. Esto permite clasificarlos en criófilos, mesófilos y termófilos. Son los mesófilos los que suelen atacar las obras de arte, retardándose su crecimiento por el frío. En cuanto al pH, también existe un amplio rango de valores, que van desde 2,8 a 8,5. La mayoría de las bacterias crecen mejor a pH próximos a la neutralidad, mientras que un pH ácido tiende a favorecer a los hongos. BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 13 Así pues, se puede observar que existen distintos factores para los cuales los organismos pueden crecer en determinados intervalos de tolerancia. Por lo tanto la presencia de un determinado organismo puede indicar que se hallan alrededor de un cierto valor concreto, información que puede ser útil cuando el rango de tolerancia es estrecho, porque permite utilizar este organismo como bioindicador (Sameño Puerto, 2003) . Por otro lado, ciertas condiciones extremas pueden suponer un cese en la actividad de algunos organismos, pero no necesariamente la desaparición de los mismos. Éstos pueden permanecer en estados latentes (estados de actividad metabólica mínima) durante cierto tiempo, de manera que sobre un determinado monumento siempre se puede encontrar una cierta población de organismos potencialmente dañinos. Con respecto a la influencia que puede ejercer la contaminación atmosférica sobre la conservación de los monumentos, se puede decir que, evidentemente ésta es directa y negativa. Se denominan contaminantes atmosféricos todas aquellas sustancias que no entran en la composición natural de la atmósfera o que se encuentran presentes a concentraciones superiores a lo normal (Caneva et al., 2005). Los contaminantes pueden aparecer en forma de partículas atmosféricas (hidrocarburos, silicatos, esporas, pólenes) o en forma de compuestos gaseosos (SO2, H2S, NO, NO2, CO, CO2, HF, HCl, O3). Los contaminantes relacionados con el tráfico de vehículos, con las emisiones industriales y con los sistemas de calefacción, ejercen un efecto muy agresivo sobre los materiales constitutivos de los bienes culturales. Sin embargo, en el caso de los organismos biológicos, sus efectos son diferentes dependiendo de la naturaleza del contaminante y del tipo de organismo involucrado. En lo que respecta a los efectos tóxicos de los contaminantes químicos, no todos los organismos poseen la misma sensibilidad. Las especies más susceptibles son aquellas que no poseen mecanismos de protección pasiva o de excreción, en particular los briofitos y los líquenes. De hecho, ambos organismos son frecuentemente utilizados como bioindicadores de la contaminación ambiental, ya que su frecuencia y cobertura disminuyen notablemente en relación a estos parámetros (Nimis et al., 2002). 1.3 FACTORES BIOLÓGICOS DE DETERIORO El estudio del biodeterioro en España se ha abordado más tarde y con menos intensidad que la investigación sobre otros procesos de alteración de los monumentos (García Murillo, 1995; Sáiz Jimenez, 1982; Casas Sicart & Sáiz Jiménez, 1982; Rowe et al., 1991; Ariño et al., 1995; Vaillant Callol & Valentín Rodrigo, 1996). Durante mucho tiempo se ha tenido muy poco en cuenta la influencia de ciertos organismos sobre el estado de conservación de los materiales pétreos. Sin embargo, estudios llevados a cabo más recientemente ponen de manifiesto la importancia de tales organismos en los procesos de alteración de dichos materiales. Principales grupos de organismos Los diferentes organismos pueden ser agrupados (Caneva et al., 1994) en base a la forma química con la que asimilan el carbono (C), en base al tipo de reacción que proporciona la energía (E) necesaria para el metabolismo, y según el tipo de donadores de electrones (e-). Así pues, los organismos se subdividen en 4 categorías nutricionales (ver tabla I.1). BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 14 Tabla I.1. Clasificación de los organismos vivos en grupos nutricionales. Tipo de organismo Fuente de C Fuente de E Donadores de e- Ejemplos Fotoautótrofo o fotolitótrofos CO2 Luz Compuestos inorgánicos H2O, H2S, S Plantas vasculares, algas, líquenes, cianobacterias y otras bacterias Fotoheterótrofos o fotoorganotrofos Sustancias orgánicas Luz Compuestos orgánicos Bacterias rojas no sulfurosas Quimioautótrofos o quimiosintéticos o quimiolitótrofos CO2 Reacciones de óxidoreducción Compuestos inorgánicos, H2S, S, H2, H3Fe. Hidrogenobacterias, bacterias del azufre, ferrobacterias, b.denitrificantes Quimioheterótrofos o quimioorganotrofos Sustancias orgánicas Reacciones de óxidoreducción Compuestos orgánicos Animales, protozoos, hongos, bacterias Muchos organismos tienen la capacidad de concentrar moléculas del ambiente para poder crecer, de forma que posteriormente en ese lugar puede crecer otro organismo que no tenga esta capacidad. Esto es lo que se denomina concepto de sucesión. Los organismos que mayoritariamente intervienen en los procesos de biodeterioro sobre materiales pétreos, se pueden agrupar, según el concepto de sucesión, de la siguiente manera: ➀ Microflora autótrofa: bacterias autótrofas (quimiosintéticas), algas y líquenes ➁ Microflora heterótrofa: bacterias heterótrofas, actinomicetos y hongos ➂ Macroflora autótrofa: briofitos y plantas superiores (vasculares) Se hace esta distinción para hablar de la sucesión en monumentos, es decir la secuencia en el tiempo en la que van a aparecer esos organismos (➀ → ➁ → ➂). Así, mientras que en ➀ se puede encontrar un microorganismo, en ➂ está presente una higuera. Por otro lado, la fauna biodeteriorante se puede subdividir en Microfauna - insectos, arácnidos, etc. – y Macrofauna - mamíferos y aves. En general, se puede afirmar que son los organismos autótrofos los que colonizan el sustrato en primer lugar, mientras que los heterótrofos, al necesitar materia orgánica para su crecimiento, aprovechan la presencia de los primeros para desarrollarse en este tipo de sustrato. Las algas y las cianobacterias son las que generalmente inician la secuencia de la sucesión. Poseen la capacidad de instalarse sobre los sustratos pétreos resistiendo condiciones ambientales extremas. Los restos orgánicos, el polvo, las esporas, etc., pueden depositarse sobre este revestimiento de las algas. Esta capa, rica en sustancias nitrogenadas, constituye un medio ideal para las bacterias, hongos y líquenes. Y éstos, a su vez, facilitan la instalación de otros organismos, como los musgos, lo que suministra el suelo necesario para las plantas vasculares, cuyas raíces provocarán una degradación importante (Sameño Puerto, 2003). BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 15 A. Cianobacterias y algas verdes Sobre la piedra o en el interior de ésta se pueden localizar algas microscópicas que pertenecen a dos grupos sistemáticos: las Cianofíceas o Cianobacterias (en el pasado llamadas algas azules) y las Clorofíceas (algas verdes). Ocasionalmente, pueden ser encontradas también otro tipo de algas (por ejemplo, las diatomeas). Las algas son microscópicas, unicelulares, aisladas o agrupadas en colonias más o menos compactas o formando filamentos. Los daños causados por las algas sobre las piedras son esencialmente de naturaleza estética. Sin embargo, según su forma de colonizar el sustrato las algas pueden dividirse en: o algas recubridoras, que ejercen su acción recubriendo el sustrato, y por tanto, reteniendo polvo y suciedad sobre éste, lo que favorece el asentamiento de otros organismos; o algas perforantes y corrosivas, que ejercen su acción sobre el material que colonizan mediante mecanismos químicos y físicos. Otros autores las clasifican en epilíticas, que crecen sobre la superficie y endolíticas, que colonizan en profundidad rocas semitranslúcidas o translúcidas (Caneva et al., 1994). Los factores ambientales más importantes que condicionan el crecimiento de las algas son la intensidad luminosa, la humedad, la temperatura y el pH. Las algas verdes y, más comúnmente las cianobacterias, son los primeros colonizadores de la piedra, puesto que necesitan luz, agua, algunos compuestos orgánicos y, preferiblemente, un sustrato ligeramente alcalino (pH= 7-8). Así, generalmente las piedras calcáreas (Tiano, 1986) son colonizadas más frecuentemente respecto a otros tipos de piedras como el granito. Por otro lado, algunas cianobacterias están rodeadas de una vaina mucilaginosa y coloreada, capaz de absorber y retener el agua por mucho tiempo. Esto hace que logren sobrevivir en condiciones ambientales adversas, como una sequía prolongada. Así pues, en respuesta a las condiciones ambientales, las cianobacterias pueden activar o desactivar su metabolismo. Debido a esta característica, se puede decir que son las primeras en implantarse sobre el sustrato, mientras que las algas verdes llegarían a dominar sólo después de que la retención de agua por el sustrato estuviera favorecida por la presencia de las anteriores. Con respecto a la luz, en grutas u otros ambientes subterráneos, el desarrollo algal es debido al gradiente luminoso (natural o artificial). Las diatomeas (Bacillariophyceae) requieren ambientes con elevado índice hídrico. En climas templados están presentes sólo en las fuentes y en zonas tropicales se han detectado cubiertas de diatomeas sobre areniscas, rocas deterioradas y edificios. B. Líquenes Los líquenes son organismos capaces de ser activos o sobrevivir con diversas concentraciones de agua, gracias a esto es posible encontrarlos en ambientes muy extremos. Junto a las cianobacterias, los líquenes juegan un papel importante como organismos pioneros en la colonización de las rocas. Son asociaciones simbióticas entre hongos y algas o cianobacterias. Pueden desarrollarse sobre piedras desnudas. Los talos superficiales contienen al alga, pero las hifas del hongo pueden penetrar profundamente en la piedra. Se desarrollan muy lentamente y ocupan ambientes BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 16 hostiles para la mayoría de las demás formas de vida vegetal (García-Rowe & Sáiz Jiménez, 1991). Los líquenes que crecen sobre la piedra se llaman saxícolas y su presencia se manifiesta en forma de polvo y fragmentos del organismo (talos pulverulentos). Son sobre todo crustáceos, epilíticos o endolíticos (Normal 19/85, 1985), aunque también aparecen foliáceos, escuamulosos o fruticulosos. Los líquenes se pueden clasificar según su biotipo en (Tiano, 1986; García-Rowe & Sáiz Jiménez, 1991; Sameño Puerto et al., 1996): o Crustáceo. Talo fuertemente adherido al sustrato por toda su superficie, normalmente carece de córtex inferior y se fija a través de las hifas del hongo (médula) que penetran en el sustrato. El talo puede desarrollarse totalmente incrustado en rocas (endolítico) o bien sobre el sustrato (epilítico). Desde el punto de vista de la erosión química y mecánica del sustrato, son los talos que presentan un mayor efecto negativo. o Una variante del biotipo crustáceo se denomina leprarióide: talo enteramente pulverulento o granuloso-pulverulento, cuya superficie es irregular y no lisa. o Foliáceo. El talo presenta un córtex inferior bien definido y se adhiere al sustrato mediante ricinas producidas por el hongo del liquen. La erosión química es menos acusada, si bien la erosión mecánica producida por las ricinas puede ser mayor que en el caso anterior (Tiano, 1986). o Escuamuloso. Talo formado por escamas con los bordes laxamente adheridos al sustrato, a veces superpuestas. Algunos no tienen córtex inferior, otros sí. o Fruticuloso. Talo formado por lacinias erectas o pendientes y que se fija al sustrato por un punto (disco de fijación), por lo cual la erosión química es mucho menos acusada, pero la erosión mecánica es igual o superior que en el caso de los foliáceos. Las ramificaciones pueden ser cilíndricas o aplanadas. Es posible que la secuencia de sucesión de los líquenes comience por los crustáceos, que actuarían como pioneros, seguidos por los foliáceos y los fruticulosos (García-Rowe & Sáiz Jiménez, 1991). Con respecto a las condiciones ambientales, se pueden diferenciar claramente dos tipos de bioalteración en base a la humedad del sustrato: cuando ésta es continua predominan las cianobacterias, algas y briofitos (Caneva et al., 1994); sin embargo si la humedad no es permanente se observa la presencia de líquenes de biotipo (tipo ecológico) crustáceo, los cuales incrementan la alteración del sustrato. Los líquenes tienen una amplia distribución ecológica. Esta distribución está influenciada por los gradientes ambientales y la distribución de nutrientes y minerales: depósitos salinos, restos de palomas (alto contenido en N y P). En este último caso se habla de flora ornitocoprófila. Sobre piedra caliza, sustrato más invadido por los líquenes, el biotipo dominante es el crustáceo, aunque también se observan algunos biotipos foliáceos y escuamulosos. También, sobre un mismo monumento, la diferente exposición a la lluvia o a la luz solar, unida a las distintas características arquitectónicas, causan colonizaciones variadas y muy particulares de especies con distinta ecología. BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 17 Son organismos de crecimiento lento, con pocos requerimientos ecológicos y muy resistentes a las condiciones extremas de temperatura y humedad. Sin embargo, poseen una elevada sensibilidad a la contaminación atmosférica. En aquellos lugares donde la contaminación atmosférica es muy alta, los monumentos constituidos por materiales pétreos están completamente libres de colonización. C. Bacterias y actinomicetos Las bacterias atacan la piedra por vía química. Las que juegan un papel importante en la degradación de las rocas y los minerales son autótrofas, pero también quimiolitotrófas facultativas (que usan indiferentemente sustratos orgánicos y/o inorgánicos) y heterótrofas. Las alteraciones producidas por las bacterias no son diferentes de aquellas puramente químicas: costras negras, pulverizaciones, exfoliaciones. Generalmente los procesos abióticos son considerados más importantes y el papel que juegan las bacterias en el deterioro sólo se considera si, mediante los análisis, se demuestra una presencia consistente. Los procesos de solubilización del sustrato, causados por microorganismos, van siempre acompañados de una acidificación del medio (producción de ácido) y de una pérdida de material lítico (Caneva et al., 1994). Por otro lado, en el caso de las pinturas murales, las bacterias pueden causar también la variación de color de los pigmentos de aquellas. Sin embargo, los pigmentos a base de metales pesados pueden inhibir el crecimiento de muchos microorganismos por su efecto tóxico. Para las bacterias, como para todos los microorganismos, el aspecto cuantitativo es fundamental para valorar su importancia en los procesos de degradación. No obstante, dependiendo de los distintos métodos utilizados para extraer las bacterias de la piedra, para cultivarlas y realizar conteos, se pueden obtener resultados muy diversos. Las bacterias que se establecen sobre la superficie de los monumentos se pueden dividir en las llamadas quimioautótrofas o quimiosintéticas, que comprenden las bacterias del ciclo del azufre (sulfatorreductoras y sulfooxidantes), las bacterias del ciclo del nitrógeno y las ferrobacterias y, por otro lado, las bacterias heterótrofas y los actinomicetos. C.1. Bacterias del ciclo del azufre La colonización y proliferación de estas bacterias es consecuencia de los procesos de alteración físico-químicos que haya sufrido el sustrato, así como de las condiciones ambientales. La contaminación atmosférica deteriora el material original, formando nuevas sales, frecuentemente sulfatos. El dióxido de azufre junto con el ácido sulfhídrico, además del efecto agresivo que provocan, son los responsables de la presencia de compuestos azufrados sobre el sustrato, lo cual favorece la implantación de una flora bacteriana que utiliza tales compuestos.  Bacterias sulfooxidantes. La formación biológica de yeso, casi siempre presente entre los productos de degradación de la piedra calcárea, es debida a la acción de estas bacterias, las cuales utilizan varios compuestos reducidos del azufre (Caneva et al., 1994). Sólo con la oxidación del azufre reducido obtienen la energía necesaria para la síntesis de su materia celular. La fuente de carbono que utilizan es el dióxido de carbono del aire, y la fuente de nitrógeno los nitratos o el amonio. Oxidan el ácido sulfhídrico, el azufre elemental, etc., para dar sulfatos mediante la reacción: BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 18 SH2 + CO2 + O2 SO4= + H2O + Materia orgánica ATP Así, las alteraciones son debidas a oxidaciones enzimáticas de sustancias sulfuradas y a la producción de ácido sulfúrico y/o sulfatos.  Bacterias sulforreductoras. Cuando se produce una reducción de sulfato a sulfuro es obra de estas bacterias. En la reacción anterior, el ácido sulfhídrico existente puede provenir tanto de la contaminación ambiental como de la reducción de sulfatos por estas bacterias según la ecuación: SO4= + Materia orgánica SH2 + CO2 ATP Numerosos estudios prueban la presencia de bacterias del ciclo del azufre sobre monumentos pétreos en ciudades y en áreas rurales donde la polución atmosférica no puede ser la causa de la presencia de sulfatos. C.2. Bacterias del ciclo del nitrógeno (nitrificantes y nitritooxidantes) Estas bacterias son capaces de acelerar la alteración de la piedra mediante procesos de oxidación, de los cuales obtienen su energía. Parte de esta energía la utilizan para obtener el carbono que necesitan. Las primeras oxidan el amoniaco que transforman en ácido nitroso, y las segundas transforman el ácido nitroso en ácido nítrico (Caneva et al., 1994). El nitrógeno atmosférico puede ser fijado por bacterias aerobias y anaerobias. Esto puede dar lugar a la formación de compuestos orgánicos nitrogenados lo que favorece el desarrollo de organismos heterótrofos (García Murillo, 1995). Estos compuestos pueden ser descompuestos en amoniaco por bacterias amonificantes (denitrificación), y este amoniaco, a su vez, puede ser oxidado a nitritos y nitratos por las bacterias nitrificantes y nitrooxidantes. El papel de las bacterias nitrificantes es determinante en los procesos de biodeterioro de los materiales pétreos, porque el ácido así formado ataca los carbonatos produciendo nitrato de calcio, el cual es eliminado por las aguas de lluvia. La roca se disgrega y se vuelve pulverulenta. El aporte de amoniaco puede provenir tanto de la contaminación atmosférica como de la ascensión capilar de agua desde el suelo a los muros (García Murillo, 1995). C.3. Ferrobacterias Entre las bacterias autótrofas se encuentran también las ferrobacterias que toman energía de la oxidación de los iones ferrosos a iones férricos y además pueden oxidar algunos minerales que contienen hierro como la pirita. C.4. Bacterias heterótrofas Las bacterias heterótrofas juegan también un papel muy importante en la degradación de la piedra. Pueden ejercer su acción mediante formación de dióxido de carbono y de ácidos orgánicos que, aunque sean muy débiles, pueden actuar sobre el carbonato cálcico que constituye el sustrato. BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 19 En cuanto a los soportes orgánicos, atacan la celulosa de la madera transformándola, por medio de enzimas, sucesivamente en celobiosa, dióxido de carbono y ácidos grasos. C.5. Actinomicetos Con respecto a los actinomicetos, la frecuencia con que se encuentran sobre frescos y piedras deterioradas, especialmente en condiciones de elevada humedad y abundante materia orgánica, es considerable. Su presencia se manifiesta en forma de pátina blanquecina o blanco-grisácea, por lo que a veces se confunden con eflorescencias salinas. Su capacidad de utilizar nitritos y nitratos y de reducir los sulfatos se ha demostrado experimentalmente. Con sus productos metabólicos (ácido carbónico, nítrico, sulfúrico y otros ácidos orgánicos más débiles) pueden atacar la piedra calcárea y algunos minerales (mica y ortoclasa) (Caneva et al., 1994). Entre estos microorganismos, los Streptomyces son aquellos más frecuentemente aislados de pinturas murales en criptas, grutas y tumbas. A menudo se encuentran con otras bacterias, hongos y algas y se desarrollan en ambientes que se caracterizan por tener una alta y constante humedad relativa (85-100%). D. Hongos Los hongos, a pesar de ser organismos heterótrofos, a veces se pueden encontrar en materiales pétreos alterados, especialmente en las regiones tropicales (Caneva et al., 1994) o cuando las condiciones de humedad relativa y temperatura son elevadas. Aunque la composición inorgánica de la piedra no ofrece un sustrato favorable para el crecimiento de estos microorganismos, existen residuos orgánicos de distinta naturaleza que casi siempre están presentes sobre la piedra y sobre pinturas murales, permitiendo el crecimiento de especies fúngicas con limitadas exigencias nutricionales (Caneva et al., 1994). Así pues, desde el punto de vista morfológico, la presencia de hongos se reconoce por la formación de manchas debidas a sus pigmentos o a la presencia del micelio. Las manchas son más o menos superficiales y, a menudo, de color oscuro. La penetración del micelio fúngico puede ser profunda, por ejemplo en el revoco de la pintura mural, y causar pérdida de cohesión del estrato pictórico. En la piedra dolomítica y calcárea las hifas penetran los cristales de calcita. Algunos hongos son endolíticos y producen fenómenos de pitting. Los hongos están presentes sobre todo en los materiales orgánicos que forman parte de muchos edificios. Se alimentan de la madera descomponiéndola, mediante enzimas, en sustancias más simples y fácilmente asimilables. Según el deterioro que producen se dividen: D.1. Mohos Son hongos microscópicos que se alimentan de las sustancias de reserva de la madera. Su presencia se pone de manifiesto cuando aparecen las hifas (micelio) y esporas en la superficie de la madera. Su ataque es superficial, no afecta a las propiedades físico-mecánicas de la madera. D.2. Hongos de pudrición Son hongos que atacan la pared celular de la madera, alimentándose de la celulosa o de la lignina según los casos. Es un ataque destructivo puesto que las piezas pierden rápidamente sus propiedades físico-mecánicas. BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 26 Tabla I.3. Fenomenología de las alteraciones biológicas. MADERA PAPEL TEJIDO PIEL MATERIALES PÉTREOS VIDRIO METAL Bacterias autótrofas Nd Nd Nd Nd Costras negras, pátinas negras, exfoliación, pulverización Pitting, oscurecimiento manchas negras, ennegrecimiento de materiales sumergidos Corrosión Bacterias heterótrofas Variación de características mecánicas Manchas, variación de las caract. mecánicas (afelpado y frágil) Manchas, cambios de color, pérdidas de resistencia Manchas, pérdidas de resistencia a la tensión, reblandecimiento Costras negras, pátinas negras, exfoliación, cambios de color, manchas Pitting, oscurecimiento manchas negras, ennegrecimiento de materiales sumergidos Corrosión Actinomicetos Variación de características mecánicas Manchas, variación de las caract. mecánicas (afelpado y frágil) Manchas, cambios de color, pérdidas de resistencia Manchas, pintas blancas, pérdida de resistencia a la tensión Pátinas y polvo blancogrisáceo, eflorescencias blancas Nd Nd Hongos Manchas, cambios de color, reblandecimientos , fisuras, cambio caract. mecánicas Manchas, variación de las caract. mecánicas (afelpado y frágil) Manchas, cambios de color, pérdida de resistencia Manchas, pérdidas de resistencia a la tensión, rigidez Manchas, exfoliación, pitting Oscurecimiento, manchas negras Nd Cianobacterias y algas Pátinas de distintos colores (sobre todo verdes) Nd Pátinas Nd Pátinas y películas de distinto color y consistencia Nd Nd Líquenes Incrustaciones, parches Nd Nd Nd Incrustaciones, parches, pitting Pitting, oscurecimiento Nd Briófitos Talos verdesgrises Nd Nd Nd Talos verdesgrises Nd Nd Plantas superiores Nd Nd Nd Nd Hierbas, arbustos y especies leñosas provocan fracturas, colapsos y desprendimient os de material Nd Nd Animales insectos Galerías, orificios, serrín Abrasión superficial, erosión, orificios, galerías Erosión, orificios, pérdida de material Orificios de forma típica Perforadores marinos, caracoles Erosiones profundas, galerías Pájaros Deposición de excrementos con efectos corrosivos, orificios, rayados Nd Nd = No descrita (porque los microorganismos y organismos desempeñan un papel secundario en el deterioro de las obras de arte o se encuentran muy raramente en estos materiales en las condiciones normales de conservación). BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 27 1.5 LOS PROCESOS DE BIODETERIORO EN FUNCIÓN DE LOS MATERIALES DE LOS BIENES CULTURALES. Los bienes culturales constituidos por materiales de naturaleza orgánica pueden ser alterados por organismos heterótrofos si las condiciones ambientales resultan favorables para su crecimiento. La susceptibilidad al biodeterioro de estos materiales también está ligada a su composición química. Se pueden dividir en materiales de origen vegetal (papel, madera, algodón, lino, cáñamo) y materiales de origen animal (cuero, pergamino, seda, lana), que presentan composiciones químicas muy diferentes (Caneva et al., 1994). En este trabajo sólo se describen los procesos de biodeterioro que tienen lugar en aquellos materiales que es posible encontrar en inmuebles. Los sustratos inorgánicos, como los materiales pétreos, son colonizados por organismos autótrofos, sin embargo, algunos de estos materiales pueden poseer sustancias orgánicas que favorecen el desarrollo de una microflora heterótrofa. Los materiales pétreos artificiales, es decir, aquellos producidos por el hombre (estucos, morteros, materiales cerámicos, pinturas murales), son alterados por los mismos organismos que crecen en la piedra natural. Sin embargo, las diferentes características físicas que presentan estos materiales, como la porosidad, las diferencias de composición química, como la presencia de pigmentos y aglutinantes, pueden influir en su susceptibilidad al biodeterioro. 1.5.1 Materiales orgánicos de origen vegetal  Características generales: composición química y susceptibilidad al biodeterioro La celulosa, la lignina y la hemicelulosa son los principales compuestos de los materiales vegetales. La celulosa es el polímero más importante de la pared de las células vegetales, aunque su porcentaje varía según la especie vegetal y el tejido de que se trate (la parte de la planta utilizada en la elaboración de materiales). Desde el punto de vista químico, la celulosa es un polisacárido lineal formado por carbono, hidrógeno y oxígeno, constituido por moléculas de D-glucosa unidas por enlaces β-1,4 glucosídicos. Las cadenas de celulosa se disponen paralelamente en fibras llamadas microfibrillas. En algunas zonas, estas cadenas celulósicas están dispuestas en un retículo cristalino con una estructura definida (áreas cristalinas). En otras partes, las cadenas están dispuestas de forma desordenada y menos compacta (áreas amorfas). Las zonas cristalinas son muy resistentes a la hidrólisis enzimática, mientras que las zonas amorfas son más susceptibles a la degradación por parte de microorganismos celulosolíticos capaces de producir un sistema de enzimas extra e intracelulares llamado complejo de celulasas. La lignina es un polímero tridimensional muy complejo compuesto por alcoholes aromáticos. Posee una estructura amorfa y es insoluble en agua. La lignina es especialmente resistente a la degradación causada por microorganismos, solo algunos hongos (Basidiomicetos, algunos Ascomicetos y Deuteromicetos), bacterias aeróbicas (entre ellas los Actinomicetos) y algunas bacterias y hongos anaeróbicos son capaces de descomponerla (Durrant, 1996). Las hemicelulosas están localizadas entre las fibras de celulosa y la lignina. Son heteropolímeros, lineales o ramificados, solubles en álcalis. Son hidrolizadas por la mayor parte de bacterias y hongos mediante la producción de enzimas extracelulares llamadas hemicelulasas. BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 28  Madera: Estructura y composición Desde un punto de vista histológico, la madera está formada por un sistema de tejidos con función de conducción o vascular (vasos o traqueidas), de sostén o mecánica (fibras y fibrotraqueidas) y células vivas con función de reserva (radios medulares, parénquima axial) o secretora (canales resiníferos o gomíferos). La madera o xilema se produce por la actividad y la proliferación de un tejido indiferenciado llamado cambium que por su cara externa produce floema (corteza interna) y por su parte interna el xilema o madera. La parte externa del xilema se llama albura y es fisiológicamente activa, mientras que la parte interna se llama duramen y está fisiológicamente muerta. Con el paso del tiempo, en el interior de estas células más viejas, se depositan ciertas sustancias, como los taninos, que proporcionan a la madera una mayor resistencia mecánica y durabilidad. La durabilidad indica la capacidad que tiene una madera de resistir el ataque de los agentes biodeteriorantes. El cambium es el responsable del crecimiento radial de la planta (crecimiento secundario), produciendo cada año un nuevo estrato de madera llamado anillo de crecimiento. Las características de estos estratos o anillos de crecimiento (color, espesor y densidad) varían en función del período de crecimiento (primavera u otoño), de la especie y de la edad de la planta, así como de la composición del suelo y de las condiciones climáticas (Caneva et al., 1994). A través del estudio de la evolución de los anillos de crecimiento se pueden datar los materiales lignarios (dendrocronología). Existen dos tipos de madera, dependiendo de la planta leñosa de la que se extraiga. La madera de gimnospermas (coníferas), por ejemplo las pertenecientes a las familias Cupressaceae, Pinaceae y Taxodiaceae; y la madera de angiospermas (latifolias), con muchas especies de porte arbóreo como las de las familias Fagaceae, Juglandaceae, Populaceae, Tiliaceae, etc. A nivel anatómico, las diferentes células que forman la madera pueden dar lugar a una estructura más o menos homogénea (madera homóxila de las gimnospermas o softwood) o heterogénea (madera heteróxila de las angiospermas o hardwood).  Mecanismos de acción de los distintos organismos sobre la madera A. Bacterias Las bacterias participan en menor medida que los hongos en el deterioro de la madera, ya que para su desarrollo necesitan materiales con alto contenido de agua. Por este motivo sí pueden tener importancia en la degradación de maderas subterráneas o sumergidas. Las bacterias atacan la celulosa de la madera transformándola, por medio de enzimas, sucesivamente en celobiosa, dióxido de carbono y ácidos grasos. Entre ellas, los actinomicetos, son organismos unicelulares filamentosos que destruyen la celulosa. Aparecen en zonas donde existe una contaminación con la tierra (Caneva et al., 1994). B. Hongos Los hongos causan un daño químico a los soportes en los que se desarrollan debido a las sustancias que excretan, así como una acidificación del material. Por otro lado, también pueden ocasionar un daño mecánico por la penetración de las hifas en el sustrato, lo cual produce una disgregación del material. Por último, debido a la emisión de pigmentos, estos microorganismos pueden provocar también un deterioro estético de la obra. BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 29 Así pues, la madera, al ser un material higroscópico, es alterada principalmente por los hongos. Éstos son capaces de desarrollarse tanto en la superficie de la misma (los mohos), como en el interior de sus estructuras (pudrición). En el caso de las pudriciones, el aspecto y el color de la madera varían como consecuencia de una acción preferencial sobre sus distintos componentes. Se pueden distinguir tres tipos: Pudrición blanca. La madera atacada por esta pudrición se vuelve blanca. Los hongos responsables de esta alteración son capaces de destruir tanto la celulosa y hemicelulosa como la lignina, dejando la madera blanquecina, ligera y, en ocasiones con aspecto fibroso e incluso harinoso, con poca densidad. Pudrición parda. Es aquella en la que el hongo se alimenta de celulosa e hidratos de carbono, pero no de lignina (color pardo). La madera adquiere, por tanto, una coloración oscura debido a los residuos pardos de lignina. Por otro lado, la madera, al secarse se disgrega en forma de cubos, por lo que también recibe el nombre de pudrición cubica. Estos cubos se disgregan fácilmente en polvo, es un ataque muy destructivo. Pudrición blanda. Es producida por hongos inferiores que atacan la celulosa de la pared secundaria de la célula en el sentido longitudinal de la misma, dando a la madera, cuando el grado de humedad es elevado, una consistencia blanda. C. Insectos En el caso de la madera, son los insectos xilófagos los que ocasionan los daños más graves en los soportes que infestan. Cuatro son las funciones principales en que se ocupan los insectos a lo largo de su ciclo vital: alimentación, refugio, reproducción y dispersión (Southwood, 1978; Gullan, 1994). Es al satisfacer alguna de ellas cuando pueden producir los tipos fundamentales de daño. Sin duda, las actividades relacionadas con la alimentación son las principales causantes de biodeterioro, que puede ser producido mecánicamente, al arrancar el animal con las mandíbulas parte del material atacado; o químicamente, por efecto de sustancias presentes tanto en la saliva y otras secreciones bucales, como en los excrementos. La búsqueda de refugio tiene un papel algo menor en el biodeterioro y, junto a la actividad reproductora, produce alteraciones de naturaleza fundamentalmente mecánica, por ejemplo, al horadar cavidades o remodelar materiales donde protegerse, o al construir "nidos" donde llevar a cabo la cópula o la puesta. Los materiales de origen vegetal, como la madera (vigas, marcos, mobiliario, techos, suelos y tallas) son atacados básicamente por escarabajos (Orden Coleoptera), de entre los cuales el "gusano de la madera" o "carcoma común de los muebles" Anobium punctatum (Anobiidae) es con gran diferencia el "insecto estrella" (Bletchly, 1967). Existen otras especies de coleópteros que, bajo las condiciones ambientales que se dan en Andalucía, pueden causar desperfectos notables, en especial Lyctus brunneus, L. linearis (Lyctidae) e Hylotrupes bajulus (Cerambycidae). Sin embargo, es A. punctatum el que ocasiona la mayor parte de los daños al excavar sus larvas galerías en la madera, pudiendo reducir techumbres, muebles y suelos enteros a serrín en relativamente poco tiempo (Chinery, 1977; Bletchly, 1967; Bernis Mateu, 1974). Entre los restos de serrín se observan sus excrementos que tienen una forma característica. La mayoría de los restantes insectos de interés en el deterioro de maderas sólo tiene importancia puntual; entre ellos se pueden citar las termitas (Isoptera), que construyen sus nidos en la madera vieja, pudiendo llegar en algunos casos a producir un daño irreversible en vigas de madera; ciertas cucarachas (Dictyoptera), cuyos daños suelen ser superficiales y debidos al efecto de la BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 30 masticación de madera humedecida; y algunas avispas (Hymenoptera), que arrancan trozos de madera para hacer una pasta junto a su saliva con la cual fabricar el papel de sus nidos, pero cuyos daños hay que catalogar también de escasos. 1.5.2 Materiales orgánicos de origen animal  Características generales: composición química y susceptibilidad al biodeterioro Los componentes químicos de los materiales de origen animal que se recogen en este estudio (cuero, pergamino), son las proteínas o prótidos. Las proteínas son moléculas complejas compuestas fundamentalmente por cuatro elementos: carbono, hidrogeno, oxígeno y nitrógeno (a veces contienen también azufre, hierro, magnesio, etc.). Son largos polímeros no ramificados de alto peso molecular cuya unidad base son los aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos. Las secuencias de aminoácidos dan origen a cadenas más o menos largas denominadas péptidos. La sucesión de aminoácidos constituye la estructura primaria. La estructura secundaria se refiere al modo en que la cadena polipeptídica está enrollada o extendida, por ejemplo, la estructura helicoidal de la α-queratina del pelo. La estructura terciaria representa la forma tridimensional típica de las proteínas globulares y, finalmente, la estructura cuaternaria hace referencia a las relaciones entre múltiples cadenas polipeptídicas de una proteína. Todas ellas poseen diferente funciones dependiendo de su estructura: proteínas estructurales con función de sostén, proteínas funcionales, etc. Las proteínas constituyen un sustrato nutricional (fuente de nitrógeno o carbono) para múltiples organismos heterótrofos. Sin embargo, el biodeterioro de los materiales proteicos está condicionado a la actividad de algunos microorganismos con capacidad de metabolizar las proteínas mediante enzimas proteolíticos extracelulares que pueden romper los enlaces peptídicos por hidrólisis enzimática. Los microoganismos que poseen capacidad proteolítica son las bacterias, entre ellas los actinomicetos y algunos hongos, Ascomicetos y Deuteromicetos (Aspergillus flavus, A. niger, algunas especies de Penicillium). En el caso de la piel (cuero y pergamino) la susceptibilidad al biodeterioro depende de numerosos factores como son la procedencia, los procesos de fabricación, las sustancias utilizadas en la elaboración, la presencia de decoraciones pictóricas, pero sobre todo del estado de conservación y de las características del ambiente en que se encuentra la obra.  Cuero y pergamino: Estructura y composición En el ámbito de las artes decorativas, las pieles se emplearon en diversas épocas para distintas aplicaciones (Caneva et al., 2005). El cuero y el pergamino son materiales derivados de las pieles de oveja y cabra, preferentemente; aunque también se pueden utilizar embriones de cordero o ternero, en el caso del pergamino o pieles de bovinos, en el caso del cuero. El proceso de elaboración de las pieles varía notablemente en relación a la época de manufactura y el área geográfica de procedencia. Las principales fases de la producción son: maceración, raspado, tensado, secado y pulido. Para el cuero, el tratamiento fundamental es el curtido que consiste en una serie de procesos químicos y mecánicos cuya finalidad es que la piel se transforme en cuero imputrescible e impermeable. El curtido se lleva a cabo utilizando distintas técnicas: ahumado de la piel o su tratamiento con sustancias vegetales o minerales, de estas últimas la más BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 31 empleada es el cromo. Todo ello con objeto de evitar fenómenos de la putrefacción debida al ataque microbiológico. Los principales componentes químicos del cuero y del pergamino son el colágeno, la queratina, la elastina y en menor cantidad albúmina, globulinas y sustancias lipídicas. El colágeno es una proteína estructural fibrosa cuyas moléculas poseen una estructura casi cristalina. Las propiedades mecánicas del cuero y el pergamino son debidas a esta organización tridimensional de las fibras proteicas. La queratina, es una proteína estructural rica en azufre y la elastina, químicamente similar al colágeno, es una proteína componente fundamental del tejido conectivo elástico. Así pues, cualquier alteración de estas estructuras puede ocasionar cambios en las propiedades mecánicas de este material.  Mecanismos de acción de los distintos organismos A. Bacterias El colágeno puede ser hidrolizado por enzimas proteolíticas específicas (colagenasas) producidas por algunas bacterias anaerobias del género Clostridium. Algunos tratamientos durante la manufactura de la piel para convertirla en pergamino, despolimerizan el colágeno pudiendo ser éste, entonces, descompuesto por enzimas proteolíticas no específicas producidas por muchas bacterias en aerobiosis como las pertenecientes a los géneros Bacillus, Pseudomonas, Sarcina. Estudios posteriores han puesto en evidencia que la producción de colagenasas también es propia de estas especies de bacterias aeróbicas, pertenecientes a los géneros Vibrio, Bacteroides, Pseudomonas, Bacillus y Cytophaga, así como de diversas especies de actinomicetos del género Streptomyces (Karbowska-Berent & Strzelczyk, 2000). Algunos factores ambientales, como la temperatura, humedad, valores de pH y radiación UV, influyen en la estabilidad del colágeno provocando cambios en su estructura molecular y ocasionando, por tanto, una disminución de su resistencia al biodeterioro. B. Hongos Algunos hongos de los géneros Cladosporium, Fusarium, Aspergillus, Trichoderma, etc. pueden atacar los pergaminos antiguos. Tras un ataque fúngico el pergamino pierde sus propiedades volviéndose duro y frágil e incluso deformándose. Pueden aparecer manchas de distintos colores, pátinas blanquecinas y disoluciones de textos escritos. C. Insectos En el caso de los materiales de origen animal, como el cuero, pergamino, pelo, piel o plumas, el principal enemigo son los escarabajos derméstidos, cuya presencia se manifiesta como erosiones superficiales o profundas, orificios y pérdidas de fragmentos, sin embargo también pueden llegar a hacer desaparecer el material original y dejarlo reducido a un fino polvo ocráceo (compuesto por sus excrementos). En ocasiones, algunos insectos que, generalmente, atacan materiales celulósicos pueden ocasionar también daños a los materiales proteicos. 1.5.3 Materiales pictóricos  Características generales: composición química y susceptibilidad al biodeterioro Generalmente, un bien cultural no está constituido por un único material, lo habitual es que coexistan materiales tanto orgánicos como inorgánicos. Es muy difícil definir el grado de BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 32 susceptibilidad de cada material al deterioro biológico, pero se puede decir que el riesgo de biodeterioro depende de aquél más vulnerable. Una pintura, está constituida, generalmente, por un soporte, una capa preparatoria y una película pictórica cuya composición varía en función de la técnica pictórica empleada (óleo, témpera, acuarela, etc.), la época de elaboración de la obra o el autor. La película pictórica, a su vez, se compone de uno o más estratos de color que consisten en pigmentos mezclados con aglutinantes, distintos según la técnica empleada. Finalmente, la superficie pintada se cubre con una fina capa de barniz. El biodeterioro de las obras pintadas puede afectar solo a unos componentes o a la obra en su totalidad, pero solamente se produce cuando las condiciones ambientales son favorables, es decir, cuando la temperatura y la humedad propician el desarrollo de los organismos. Los compuestos orgánicos presentes en estos materiales representan una fuente de nutrición para un amplio rango de organismos heterótrofos. El soporte se ve afectado, en función de sus materiales, por las mismas especies microbianas mencionadas anteriormente. Sin embargo, la película pictórica está menos expuesta al biodeterioro por microorganismos ya que sus distintos componentes (aglutinantes y pigmentos) se ven afectados de manera particular. Los aglutinantes pictóricos más susceptibles al biodeterioro son las témperas a la caseína o al huevo, las emulsiones de témpera y los aceites de linaza. También son especialmente susceptibles los pigmentos a base de tierra de siena, tierra de sombra y bol arménico (utilizado en preparaciones para los dorados). Sin embargo, la presencia de metales pesados, como el blanco de plomo o el óxido de zinc, aumenta la resistencia al ataque microbiológico por su toxicidad. Por otro lado, el barniz de acabado protege a la película pictórica frente al biodeterioro debido a sus propiedades hidrorrepelentes (Caneva et al. 2000).  Mecanismos de acción de los distintos organismos A. Hongos Entre los hongos implicados en la degradación de las pinturas, en algunos estudios se han aislado especies de los géneros: Penicillium, Aspergillus, Trichoderma y la especie Phoma pigmentovora, capaz de degradar los pigmentos al óleo y a la témpera, mientras que Aerobasidium descompone sólo los aglutinantes de los pigmentos al óleo. Mucor y Rhizopus atacan las colas (Ionita, 1971; Strzelczyk, 1981). Estos microorganismos causan daños tanto mecánicos como químicos en las superficies pintadas. En su fase inicial de desarrollo, el micelio se extiende sobre la pintura, enmascarando el dibujo y los colores, en forma de veladuras blanquecinas. En algunos casos, si el desarrollo es más avanzado, con producción de abundante micelio y de cuerpos fructíferos, se observan grandes manchas coloreadas. La penetración de las hifas en el interior del soporte causa daños mecánicos: fisuras y desprendimiento de la película pictórica. Los productos de su metabolismo, como los ácidos orgánicos, provocan transformaciones químicas en los materiales que forman parte de la obra. La producción y la actividad de las exoenzimas, causan daños químicos provocando la descomposición de los constituyentes de la pintura o del soporte. La emisión por parte de los hongos de pigmentos, normalmente muy coloreados, causan manchas indelebles en todos los materiales. BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 33 B. Insectos El ataque por parte de insectos a los materiales pictóricos está, normalmente, ligado a los soportes (madera, tejidos, cuero), pero se pueden observar los daños indirectos ocasionados por los orificios de salida en la pintura. Las especies implicadas son las mismas, por tanto, que se han mencionado para otros materiales orgánicos. 1.5.4 Materiales inorgánicos: materiales pétreos  Características generales: composición química y susceptibilidad al biodeterioro Los sustratos inorgánicos, concretamente los materiales pétreos o geomateriales son principalmente piedras, así como estucos, morteros, yesos y productos cerámicos (ladrillos y azulejos). Todos estos materiales, tanto naturales (rocas) como artificiales (obtenidos por transformación de las rocas con diversos métodos), presentan analogías composicionales y estructurales (Caneva et al., 2005). Las rocas son agregaciones de uno o más minerales que pueden clasificarse, según su génesis, en rocas ígneas o magmáticas, sedimentarias y metamórficas. Cada roca se caracteriza por poseer una composición mineralógica, una estructura petrográfica y una composición química. Las características físicas de las rocas que se pueden observar al microscopio son la estructura y la textura. La porosidad de una piedra está constituida por los poros abiertos, que se comunican con el exterior, y por los poros cerrados. Además del valor total de la porosidad, es importante conocer la forma y las dimensiones de los poros ya que influyen en los procesos de absorción de agua y en los mecanismos de alteración, por ejemplo, por cristalización de sales, hielo-deshielo, biodeterioro (Caneva et al., 2005). Su susceptibilidad al biodeterioro está condicionada por su naturaleza química, su estructura física y origen geológico y los factores ambientales a los que están sometidos estos materiales. Así pues, resulta de suma importancia la cantidad de minerales deteriorables que presenten (feldespatos, minerales arcillosos y ferruginosos), la porosidad y la rugosidad superficial. Son colonizados predominantemente por organismos autótrofos. Sin embargo, en estos sustratos es muy común la presencia de materia orgánica: restos de colonizaciones biológicas, contaminación atmosférica, pólenes, tratamientos de restauración (ceras, aceites, consolidantes, etc.), excrementos de aves. Todo ello favorece el desarrollo de una microflora heterótrofa (Caneva et al. 2000). Con respecto a los materiales pétreos producidos por el hombre (estucos, morteros, frescos y productos cerámicos), estos son alterados por los mismos organismos que los de la piedra natural. Su composición química generalmente está enriquecida con aglutinantes y pigmentos, los cuales influyen en su susceptibilidad al biodeterioro.  Mecanismos de acción de los distintos organismos A. Cianobacterias y algas verdes El crecimiento de las algas está promovido por un alto grado de humedad en el sustrato que colonizan y forman una pátina superficial que, a su vez, puede mantener la humedad del material favoreciendo su disolución por agua. BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 34 Así, el deterioro causado por algas, o ficodeterioro, puede ser en un primer momento de tipo estético. En este caso las intensas coloraciones y los cambios texturales que producen las algas dan lugar a alteraciones de distinta naturaleza y repercusión (Bolívar & Sánchez-Castillo, 1998): Por un lado se observa un deterioro funcional (soiling), por absorción de polvo atmosférico, material particulado, etc. y, por otro lado, una interferencia en la lectura de la obra. Esto último pasa a ser considerado un problema cuando el estado de alteración del sustrato y la contaminación del agua favorecen una proliferación excesiva de estos organismos y una rápida deposición de costras carbonatadas. Otras alteraciones consideradas también de tipo estético son la formación de pátinas de diversa gama cromática, según la época del año, y la formación de concreciones/acreciones, comprobándose experimentalmente (Bolívar & Sánchez-Castillo, 1997) que muchas especies algales condicionan la estructura de las deposiciones minerales. Por otro lado, existen estudios, en diversos monumentos (Ortega-Calvo et al., 1992, Bolívar & Sánchez-Castillo, 1997, Bolívar & Sánchez-Castillo, 1998, 49, 50), sobre ciertas especies que presentan una vaina con gran capacidad para retener agua. Estos organismos, mediante contracciones y dilataciones, pueden provocar alteraciones físicas en el sustrato (Jaton, 1986). Así, con respecto a las alteraciones de tipo físico, además de la mencionada anteriormente, se ha comprobado que las algas pueden actuar mecánicamente sobre el material que colonizan favoreciendo la gelifracción (Bolívar & Sánchez-Castillo, 1998). Esto sucede en aquellos lugares donde se produzcan heladas en invierno. En cuanto a la acción química de las algas sobre los monumentos, éstas además pueden ejercer una acción de corrosión, así como una acción perforante (por ejemplo, las algas endolíticas). Así, el deterioro químico se produce como consecuencia de las reacciones bioquímicas y fisiológicas de las algas (Bolívar & Sánchez-Castillo, 1998). Excretan ácidos orgánicos (pirúvico, glicólico, láctico, acético, etc.) como consecuencia de los procesos de respiración y con finalidad penetrante en las especies endolíticas. Por otro lado excretan polisacáridos de acción quelante y provocan la precipitación y agregación de partículas de carbonato cálcico mediante la variación del pH causada por el metabolismo fotosintético y el incremento de la concentración de dióxido de carbono. Así pues, la pátina algal, además de causar un daño estético, favorece la deposición y adhesión de polvo, semillas, esporas, etc., y por consiguiente el crecimiento de otros organismos (Ortega- Calvo et al., 1992; Bolívar & Sánchez-Castillo, 1998). Además, las variaciones en la tasa de gas carbónico ligada a su respiración y a su fotosíntesis traen consigo modificaciones de las capas superficiales de carbonato cálcico del material pétreo (Jaton, 1986). B. Líquenes Los líquenes ejercen un daño estético y físico sobre el sustrato, pero aún más importante es el producido químicamente (Sáiz Jiménez, 1981; Seaward & Giacobini, 1988; García-Rowe &Sáiz- Jiménez, 1991; Sameño Puerto & García Rowe, 1995; García & Martín, 1996; Griffin et al., 1991). Un elevado desarrollo de colonias liquénicas, que puede dar lugar a un depósito de material así como a la producción de pigmentos, supone que se den mecanismos estéticos de biodeterioro. La descomposición mecánica del sustrato se produce porque los líquenes incrementan su masa conforme crecen y, por otro lado, cambian de volumen según el período sea húmedo o seco. Por BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 35 tanto, el deterioro se produce por la penetración de las ricinas en el sustrato y la acción física ejercida por la alternancia de expansión en estado hidratado y contracción en estado seco de la gelatina himenal. Además, la presencia de los líquenes favorece la condensación de agua y su retención sobre la superficie pétrea. Con respecto a la acción química que los líquenes ejercen sobre el sustrato, éstos pueden provocar una desestabilización química del mismo debido a los productos de su metabolismo. Los líquenes excretan ácidos orgánicos, entre ellos el ácido oxálico, el cual es responsable de la quelación de la superficie, lo que explica su acción degradativa. Sin embargo, aunque existen muchos estudios que ponen de manifiesto el deterioro causado por estos organismos, éste continua siendo discutido debido a la doble acción que ejercen los líquenes sobre estos materiales: por un lado como organismos deteriorantes y, por otro lado, como agentes protectores del sustrato frente a factores ambientales (Barquín Sainz de la Maza & Terrón Alfonso, 1997). Los líquenes pueden, por tanto, ejercer un efecto protector contra agentes degradativos. Causan modificaciones morfológicas y físicas sobre la superficie de la piedra, formando un revestimiento cuyo espesor es del orden de milímetros. Así, al erradicar los líquenes de la piedra, ésta puede ser atacada mucho más drásticamente. C. Bacterias Los mecanismos bacterianos de ataque a superficies pétreas son de dos tipos: en primer lugar, una fase reversible inicial que incluye atracciones electrostáticas y fuerzas de Van der Waals y, en segundo lugar, una fase irreversible dependiendo del tiempo y la velocidad de crecimiento (Kormondy, 1973). Al estudiar las causas de alteración de la piedra, se observa la presencia de sales solubles, principalmente sulfatos y nitratos. Esto puede ser causado por reacciones químicas producidas entre agentes químicos del aire y el material pétreo, o por reacciones enzimáticas de microorganismos específicos. Por tanto, ha sido necesario establecer el papel que juegan en este proceso las bacterias del ciclo del azufre y del nitrógeno (Barcellona-Vero et al., 1976). Las bacterias del ciclo del azufre participan en el fenómeno de alteración de la piedra mediante oxidaciones enzimáticas de sustancias sulfuradas y la producción de ácido sulfúrico y/o sulfatos. Las bacterias nitrificantes atacan la piedra utilizándola como fuente de carbono y produciendo ácidos nítrico y nitroso a partir de amoníaco. El proceso de nitrificación comprende dos oxidaciones biológicas, la oxidación del amoníaco a ácido nitroso (bacterias nitrificantes) y la del ácido nitroso a nítrico (bacterias nitrosantes). Así pues, son los sulfatos y los nitratos los productos de alteración (Caneva et al., 1994). La actividad biodeteriorante de las bacterias heterótrofas viene determinada por la producción de agentes complejantes, ácidos orgánicos e inorgánicos y álcalis (García Murillo, 1995; Caneva et al., 1994). Además, estas bacterias producen pigmentos que se extienden, desde las zonas profundas, donde crecen, hasta la superficie, dando lugar a alteraciones cromáticas antiestéticas (García Murillo, 1995). Los actinomicetos, de los cuales los más frecuentes pertenecen al subgrupo de los Estreptomicetos, género Streptomyces, son microorganismos capaces de utilizar nitritos y nitratos y de reducir sulfatos. Además, atacan las piedras calizas y los minerales silíceos con sus BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 42 2.1.3 Estimación indirecta de organismos La determinación cuantitativa o cualitativa de microorganismos tras el crecimiento en los cultivos no significa necesariamente que se esté produciendo un fenómeno de bioalteración. Estos microoganismos solamente representan un daño potencial, ya que muchos de ellos permanecen en estado de quiescencia y únicamente se activan cuando las condiciones son favorables. Así pues, solo mediante la utilización de métodos indirectos se puede obtener información sobre su patogenicidad (García y Martin, 1996 b). Para la obtención de resultados que permitan estimar el biodeterioro más rápidamente que con el estudio microbiológico, se recurre a otro tipo de ensayos (bioquímicos, químicos y fisicoquímicos). Métodos bioquímicos Permiten determinar cuantitativamente los productos del metabolismo de los microorganismos que están causando biodeterioro, así como obtener algunos parámetros para evaluar ese daño. - Determinación de ATP (Adenosín trifosfato) por bioluminiscencia Todas las células vivas poseen ATP, el cual puede ser fácilmente extraído de una muestra biológica y hacer reaccionar con el reactivo luminiscente luciferin/luciferasa para determinar la cantidad de ATP presente en dicha muestra. Como el número de microorganismos presentes es proporcional a la cantidad de ATP hallada, se puede estimar el grado de desarrollo de estos microorganismos sobre el material en estudio. - Determinación de la DBO5 Es una modificación del método usado para determinar la demanda bioquímica de oxígeno a los cinco días en aguas residuales. Permite valorar la cantidad de materia orgánica existente en los materiales. Se mide la cantidad de oxígeno consumido por los microorganismos al descomponer compuestos orgánicos. Métodos químicos y fisicoquímicos Mediante el estudio de diferentes sustancias químicas, resultado de la acción de determinados organismos o de productos de su metabolismo, se puede poner de manifiesto la presencia de materia viva sobre los materiales alterados. - Determinación de compuestos orgánicos por cromatografía Consiste en la extracción de los compuestos orgánicos de la muestra con distintas mezclas de solventes y posterior concentración y desarrollo del cromatograma. Se utiliza la cromatografía en capa fina (TLC), para la identificación de lípidos; cromatografía gaseosa (CG) para fraccionamiento de triglicéridos e identificación de ésteres metílicos, y cromatografía gaseosaespectrometría de masas (GC-MS) para análisis directo de los extractos. También se utiliza HPLC para la determinación cualitativa y cuantitativa de ácidos orgánicos producidos por los microorganismos. BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 43 - Identificación de pigmentos fotosintéticos por espectrometría visible La presencia de pigmentos sobre el sustrato está ligada a la existencia de ciertos organismos autótrofos. La estimación cuantitativa de los pigmentos es proporcional al número de microorganismos fotosintéticos. Para ello se somete la muestra a la extracción de los pigmentos mediante acetona o dimetil sulfóxido (DMS), manteniéndola en oscuridad. Una vez realizada la extracción se centrifuga para eliminar los restos sólidos y, con un espectrofotómetro visible, se realiza un barrido del espectro de absorción (Martín, 1990; Pietrini et al., 1985; Tomaselli et al., 2002). - Determinación de ácidos nucleicos y proteínas La determinación de estos compuestos representa una medida de la biomasa presente en el sustrato. Los ácidos nucleicos son las biomoléculas portadoras de la información genética. Desde el punto de vista químico, son macromoléculas formadas por polímeros lineales de nucleótidos, unidos por enlaces éster-fosfato, sin periodicidad aparente. De igual forma, las proteínas son polímeros lineales aperiódicos de aminoácidos. La aperiodicidad de la secuencia de nucleótidos implica la existencia de información. De hecho, los ácidos nucleicos constituyen el depósito de información de todas las secuencias de aminoácidos de todas las proteínas de la célula. Existe una correlación entre ambas secuencias, lo que se expresa diciendo que ácidos nucleicos y proteínas son colineares; la descripción de esta correlación es el Código Genético, establecido de forma que a una secuencia de tres nucleótidos en un ácido nucleico corresponde un aminoácido en una proteína. De acuerdo a la composición química, los ácidos nucleicos se clasifican en Ácidos Desoxirribonucleicos (ADN), que se encuentran en el núcleo celular y algunos orgánulos, y en Ácidos Ribonucleicos (ARN) que actúan en el citoplasma. Para extraer el ADN de las células, hay que eliminar los restos minerales, romper esas células y eliminar los restos celulares por centrifugación. Sobre una alícuota de este extracto se digieren enzimáticamente las proteínas y, posteriormente, los ácidos nucleicos se determinan en función de la densidad óptica a una determinada longitud de onda. Sobre otra alícuota se determinan las proteínas también por densidad óptica a otra longitud de onda (García y Martín, 1996). El ADN genómico suele extraerse para su uso en procesos como una PCR cualitativa que identifica y determina los organismos en estudio. 2.1.4 Diagnóstico de la actividad biodeteriorante de los organismos sobre el material Técnicas de microscopía Tras la determinación de los organismos que colonizan los materiales, es necesario conocer que alteraciones están teniendo lugar en el sustrato e identificar cuál de estos organismos es el causante principal. Así se puede determinar cuáles son los organismos más agresivos y sus mecanismos de alteración para, posteriormente, planificar los tratamientos más eficaces (De los Ríos, 2008). Los microoganismos más agresivos suelen ser los hongos (en forma liquenizada o de vida libre) ya que su interacción con el sustrato es muy estrecha. En el caso de los materiales pétreos, su colonización endolítica puede observarse mediante la microscopía láser confocal que ofrece BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 44 imágenes tridimensionales. El grado y el tipo de alteración dependen de muchos factores, por ejemplo las características texturales de la roca (Cámara et al., 2008). La acción alterante de los organismos sobre el sustrato puede ser de dos tipos: una acción química, causada por los compuestos que producen estos organismos y que generan alteración química de los minerales; y una acción mecánica que puede provocar ruptura y desprendimiento de los materiales. Mediante el uso de técnicas como la microscopía electrónica de barrido (SEM) combinada con microanálisis por espectroscopía de energía dispersiva de rayos X (EDS), se puede realizar el estudio de la alteración química de los minerales y de la acción mecánica que ejercen los microorganismos sobre un material. Por tanto, esta técnica es una herramienta muy eficaz a la hora de realizar el estudio de biodeterioro de un sustrato pétreo o un material orgánico y así establecer un diagnóstico acertado. 2.2 MÉTODOS DE PREVENCIÓN Y CONTROL DEL BIODETERIORO. BIOCIDAS Los criterios de conservación del patrimonio cultural deben contemplar siempre un programa de mantenimiento y control de los fenómenos de biodeterioro de un bien cultural, lo cual requiere prestar una atención especial a las condiciones ambientales que rodean dicho bien. Durante mucho tiempo, las intervenciones de restauración se habían centrado exclusivamente en el estudio de las superficies y sus alteraciones. La Carta del Restauro (1987), recoge el concepto de la conservación preventiva sobre una obra y sobre el ambiente en el que se encuentra, lo que supuso un cambio fundamental a la hora de proyectar una intervención de restauración de una obra de arte. A partir de aquí, se efectúa un diagnóstico y un tratamiento de limpieza, así como el control del ambiente en el que se encuentra la obra. El control del crecimiento de los agentes biológicos responsables del biodeterioro de las obras de arte se encuentra dentro de las operaciones que se suelen realizar en las intervenciones de restauración. La eficacia de estos tratamientos depende del método y de los productos empleados, sin embargo, es necesario recalcar que los organismos volverán a crecer si las condiciones ambientales son favorables. Es por ello que los métodos de prevención, llamados también métodos indirectos, inhiben o ralentizan el desarrollo biológico operando, no directamente sobre los agentes biológicos, sino sobre las causas es decir, sobre los factores que pueden condicionar la presencia de organismos. Los métodos de control incluyen las medidas utilizadas para eliminar el deterioro de los bienes culturales y los organismos que lo causan. Se denominan métodos directos de eliminación del crecimiento biológico a la aplicación de sistemas mecánicos, físicos y químicos, que intervienen directamente sobre los agentes biológicos. 2.2.1 Métodos indirectos Suponen una inhibición o disminución del crecimiento biológico por modificación de los parámetros ambientales (como humedad o temperatura) o de los factores físico-químicos del sustrato (nutrientes). Son consecuencia de los estudios efectuados sobre el ambiente (monitorización microclimática y aerobiológica) y sobre el sustrato (materiales constitutivos, productos de alteración, etc.), pero sobre todo de aquellos estudios realizados sobre el conocimiento de las exigencias ecológicas de los distintos grupos sistemáticos a los que pertenecen los organismos responsables del deterioro. BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 45 Sin embargo, no siempre es posible realizar la aplicación de este tipo de métodos, puesto que raras veces se puede provocar un cambio en las condiciones ambientales y llevar a cabo un control estricto de estos parámetros. En ambientes internos es necesario controlar una serie de factores como son la alta temperatura, la elevada humedad relativa, la escasa ventilación, la presencia de suciedad (partículas orgánicas, polvo) y la ausencia o presencia de luz. Para ello, es necesario un mantenimiento periódico con sistemas de acondicionamiento de aire. No obstante, resulta imposible generalizar, por lo que es fundamental estudiar cada caso considerando cada situación de manera independiente. En cada intervención debe realizarse un estudio preliminar acerca de las características microclimáticas del ambiente considerado, de las características estructurales y del estado de conservación en materia de biodeterioro de la obra en estudio. Los análisis de la composición del aire, tanto de los contaminantes químicos atmosféricos como de los biológicos, contribuyen a definir situaciones de riesgo para los bienes culturales. Con respecto a estos últimos, hay que tener en cuenta que no todos los microorganismos presentes en el aire tienen potencial biodeteriógeno, por tanto, es indispensable conocer las distintas especies que son capaces de dañar los diferentes materiales que forman parte de los bienes culturales. Por lo que respecta al patrimonio histórico-artístico y documental, actualmente no están disponibles los valores límite recomendados para la contaminación biológica, sin embargo sí existe un decreto para definir los niveles de riesgo biológico higiénico-sanitario (Real Decreto 664/1997, de 12 de mayo, sobre la protección de los trabajadores contra los riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos durante el trabajo. Ministerio de la Presidencia. «BOE» núm. 124, de 24 de mayo de 1997. Referencia: BOE-A-1997-11144). Además se han realizado estudios acerca de los niveles de riesgo biológico para las distintas categorías de los bienes culturales (Pasquariello et al., 2000; Valentín, 2007). Una correcta ventilación de los ambientes constituye uno de los sistemas de control más válidos a la hora de limitar el riesgo de biodeterioro. La circulación del aire en ambientes internos disminuye sensiblemente la deposición de esporas y propágulos microbianos sobre los materiales constitutivos de los bienes culturales. Con respecto a los ambientes externos, el control de los factores ambientales no siempre es posible o, si lo es, tiene un efecto muy limitado reduciendo levemente el crecimiento de ciertas especies. La causa principal para que se origine el crecimiento de organismos es la humedad elevada, pero es prácticamente imposible reducir el contenido de agua de los materiales expuestos a la intemperie. Se pueden proteger las obras de la lluvia mediante estructuras de protección, pero no se puede garantizar la reducción de la humedad que asciende por capilaridad desde el suelo (Caneva et al., 2000). Por otro lado, se puede incrementar la cohesión y la hidrorrepelencia de los materiales mediante tratamientos consolidantes y protectores o hidrófugos. Estos tratamientos pueden prevenir o retrasar la colonización microbiana de un sustrato, pero algunos pueden resultar un sustrato de crecimiento para muchos organismos heterótrofos (Salvadori & Nugari, 1987). Por tanto, estos tratamientos deben ser efectuados inmediatamente después de la aplicación de biocidas sobre materiales biodeteriorados. En conclusión, las labores de mantenimiento periódico son el único modo de prevenir el biodeterioro en un ambiente externo. 2.2.2 Métodos directos Suponen una acción directa sobre los organismos responsables del biodeterioro, es decir, la aplicación de un tratamiento que consista en esterilización y/o erradicación de los organismos. BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 46 Sin embargo, con el tiempo los materiales pueden ser nuevamente colonizados, por lo tanto estos métodos resultan útiles, únicamente, durante un cierto período (Caneva et al., 1994). Previamente a la aplicación de una metodología de intervención correcta, existen algunos aspectos que deben ser tomados en consideración algunos aspectos de la cuestión (Caneva et al., 1994, 1996, Koestler et al., 1997). Los principales elementos a valorar son: - Conocer, en primer lugar, si el deterioro es de naturaleza biológica, es decir, si realmente existe un problema de biodeterioro. La respuesta en este caso no siempre es fácil, ya que el ataque biológico no tiene por qué ser macroscópicamente visible, por lo que es necesario detectar e identificar los organismos responsables de la alteración. - Saber cuándo es oportuno intervenir, ya que algunas veces, aunque exista un problema de biodeterioro, hay ciertos riesgos relacionados con la intervención. Es importante valorar el daño existente y cuantificarlo, teniendo en cuenta las características ecológicas, fisiológicas y morfológico-estructurales de las especies implicadas, porque esto permitirá comprender cuales son las condiciones que favorecen su desarrollo, su crecimiento, su relación con el sustrato y sus mecanismos de alteración. Otro aspecto a tener en cuenta es la duración de los efectos del tratamiento. En el caso de que las alteraciones sean graves, es necesario, además de realizar un tratamiento, planificar paralelamente un mantenimiento periódico. Si éste no va a ser posible, el tratamiento resultaría inútil. Además, las consecuencias de un tratamiento a nivel ecosistémico deben ser valoradas ya que, si es específico contra algunas especies, la eliminación de éstas puede favorecer la proliferación de otras especies más agresivas por ausencia de competencia, provocando así efectos colaterales más graves que los preexistentes. - Por último, si existen riesgos para el bien cultural, es importante valorar la necesidad de aplicar o no un tratamiento. A veces no es posible realizar una remoción o eliminación de los organismos sin alterar gravemente el material constitutivo de la obra, por ello se debe evitar la intervención adoptando otras medidas. Sin embargo, en ocasiones el tratamiento es inevitable aunque el estado de conservación y las condiciones físico-químicas del material que constituye la obra sean críticos. En estos casos es necesario realizar intervenciones preliminares de conservación, así como estudios previos de evaluación de tratamientos. Una vez que se ha decidido intervenir, es necesario elegir el método más adecuado para el control biológico entre los métodos mecánicos, físicos o químicos. Se seleccionará en función del tipo de organismo, de los materiales constitutivos de la obra y de su estado de conservación. Las características de las distintas metodologías que se pueden emplear deben ser estudiadas experimentalmente para poder establecer: la eficacia, la posible interacción con el sustrato, el método de aplicación, los efectos a largo plazo y la posible interacción con otros productos usados en la restauración.  Métodos mecánicos Estos métodos se basan en la remoción física de los agentes biodeteriorantes con instrumentos manuales como bisturí, espátula, cepillo, aspirador, etc. Por su simplicidad son empleados frecuentemente, sin embargo tienen la desventaja de no dar resultados de larga duración, puesto que resulta muy difícil obtener una eliminación completa de la estructura vegetativa o BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 47 reproductiva de la especie presente, a menos que se dañe gravemente el sustrato. Los métodos mecánicos pueden resultar muy útiles sobre todo si se combinan con métodos químicos.  Métodos físicos Los métodos físicos se basan en una actividad biocida directa sobre los organismos mediante interacción con su material genético, como es el caso de las radiaciones ionizantes, o mediante otros procesos de alteración física de las células, como el calentamiento o la congelación; o en una acción biocida indirecta mediante la reducción de elementos de la atmósfera, como el oxígeno, esencial para la supervivencia de los organismos aerobios, por ejemplo, la aplicación de atmósferas transformadas en un sistema herméticamente cerrado donde se deposita el objeto a tratar. Estos métodos, con actividad biocida directa, emplean principalmente radiaciones electromagnéticas (ultravioleta, gamma, beta) y eléctricas con acción biocida o nociva para los organismos tratados (Caneva et al., 1996). La radiación ultravioleta muestra una gran actividad germicida y es muy utilizada para la esterilización de superficies, utensilios y objetos. Los rayos gamma son radiaciones electromagnéticas con una frecuencia más elevada que los ultravioleta y, por tanto, con una mayor actividad biocida. Su aplicación se limita al tratamiento de materiales orgánicos (papel, pergamino y madera). El uso de altas y bajas temperaturas también está restringido al caso de materiales orgánicos. El tratamiento con ultrasonidos, empleado para la limpieza de objetos arqueológicos, madera mojada y tejidos modernos, puede tener analogías con los efectos biocidas. Otro método físico empleado actualmente es el tratamiento con láser, llevado a cabo con diferentes condiciones (duración del pulso y longitud de onda), sobre líquenes como Verrucaria niegrescens (Osticioli et al., 2015). Así mismo, se ha comprobado la efectividad de las microondas en el tratamiento de agentes biológicos que infestan tanto objetos de madera como de piedra, comprobándose una baja interacción con estos materiales gracias a su acción selectiva (Riminesi y Olmi, 2016). Sin embargo, el uso de estos métodos físicos no está muy difundido debido a su difícil aplicación, su alto coste, el riesgo para los operarios y los posibles fenómenos de interferencia con los materiales constitutivos de la obra tratada. Además, es necesario advertir que las obras tratadas pueden ser recolonizadas inmediatamente después de la aplicación de estos tratamientos si no se conservan en el ambiente adecuado. Los métodos con actividad biocida indirecta son, para el caso de materiales orgánicos, el uso de atmósferas transformadas mediante gases inertes para la eliminación de organismos por anoxia. La aplicación de productos biocidas, como la fumigación con gases (óxido de etileno, bromuro de metilo, fosfinas, etc.), puede ocasionar graves problemas de toxicidad en las personas que los usan y alteraciones en las propiedades físico químicas de los materiales que constituyen las obras de arte. Como tratamiento alternativo, se propone la aplicación de un gas inerte (argón o nitrógeno) en un sistema herméticamente cerrado, en cuyo interior se deposita el objeto infestado. Es necesario llevar el control de ciertos factores ambientales: temperatura, humedad relativa y concentración de oxígeno. Se han realizado investigaciones en laboratorio que indican que una atmósfera de gas inerte, aplicada a baja concentración de oxígeno, produce una anoxia completa en todas las fases del ciclo biológico de especies de insectos destructores de bienes culturales (Valentín et al., 1990; Valentín, 1994). El objetivo es eliminar por completo cualquier plaga de insectos y disminuir el desarrollo de microorganismos aerobios que se encuentren alterando las obras de arte. El gas descrito no es BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 48 tóxico, tiene un bajo coste y es estable por lo que no produce alteraciones físico-químicas en los objetos tratados (Sameño Puerto y Martín García, 2014). En el caso de los materiales inorgánicos, los organismos fotosintéticos necesitan una fuente luminosa para poder vivir, por lo que para reducir su actividad se puede proceder a recubrir el material sustrato con tejidos que no dejen pasar la luz durante un corto periodo de tiempo (Caneva et al. 2005). La duración de este tratamiento varía dependiendo de la especie presente y de la intensidad de su desarrollo. Por ejemplo, sobre los líquenes se han obtenido buenos resultados en cuanto al efecto biocida de dos meses de oscuridad (Pietro et al., 1996). Las comunidades que forman algas y cianobacterias, llamadas biofilms, presentan diversas respuestas fisiológicas a las distintas variables ambientales (Del Rosal, 2014). Se han realizado estudios para conocer el efecto de la intensidad luminosa (irradiancia) sobre la fotosíntesis de las especies que forman los biofilms (Álvarez et al., 2015). Especialmente, en el caso de las cuevas turísticas o rupestres, la reducción de los periodos de iluminación puede reducir la proliferación de algas, aunque no impide su desarrollo puesto que la iluminación no se elimina del todo. Como alternativa se ha estudiado la posibilidad de aplicar una fuente de luz que reduzca la actividad fotosintética y que produzca un estrés fisiológico en los organismos presentes (Figueroa et al., 2015). En este estudio, los autores presentan un procedimiento que permite adaptar la calidad e intensidad de la luz utilizando combinaciones de fuentes LEDs de distinta composición espectral, activándose sólo aquellos LEDs que tengan menos efectividad fotosintética (teniendo en cuenta la composición de los biofilms).  Métodos biológicos Estos métodos son aquellos que utilizan especies parásitas o antagonistas para limitar el crecimiento de otras especies animales o vegetales (Caneva et al., 2000). En el caso de las plantas superiores, por ejemplo la flora vascular ruderal, se puede pensar en el empleo de insectos fitófagos especializados, pero en la práctica existen numerosas dificultades y contraindicaciones. En el caso de animales, sobre todo contra la avifauna, se han empleado especies antagonistas (predadores de pollos o de huevos) que reducen la densidad de población de las especies dañinas. En el contexto de los bienes culturales son necesarios mayores conocimientos acerca del comportamiento de los insectos en relación a sus enemigos naturales. La principal desventaja es su escasa eficacia al no erradicar completamente las plagas. Las feromonas constituyen un método no tóxico de control que está siendo bastante investigado. Son sustancias muy específicas que intervienen en el apareamiento atrayendo al sexo contrario. Actualmente son sintetizadas químicamente y se aplican en trampas para atrapar al mayor número de insectos, erradicándolos posteriormente con un insecticida.  Métodos químicos El control del biodeterioro sufrido por los distintos materiales que componen los bienes culturales (orgánicos e inorgánicos), se ha realizado principalmente mediante el uso de biocidas o pesticidas. Se denominan pesticidas o biocidas las sustancias químicas utilizadas para tratar las especies biológicas a eliminar. La acción biocida contra microorganismos se llama desinfección y contra BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 49 organismos macroscópicos como insectos y plantas se llama desinfestación. Los biocidas pueden ser clasificados en distintas categorías (Caneva et al., 1994, 2005) dependiendo de: - su naturaleza química (orgánicos o inorgánicos); - el tipo de organismo que elimina (existen diversos productos, pero en el caso del biodeterioro de los bienes culturales, se emplean bactericidas, fungicidas, alguicidas, herbicidas e insecticidas); - el estado de agregación (compuestos líquidos, sólidos o gaseosos); - el mecanismo de actuación (agentes oxidantes, tensioactivos, etc.). Los microbiocidas se dividen en dos categorías principales: los que actúan por contacto (agentes oxidantes como el hipoclorito, o por interacción con las membranas, como las sales de amonio cuaternario) y los que inhiben alguna actividad metabólica específica. En algunos productos comerciales, el principio activo, que indica la actividad biocida, aparece unido a otros aditivos que mejoran la eficacia del producto. Así pues, el mismo principio activo puede ser vendido en distintas formulaciones o mezclas con distintos nombres comerciales. Los requisitos de los productos que se emplean en la conservación de los bienes culturales deben ser por una parte de tipo técnico y por otra de tipo sanitario (Caneva et al., 2000): - elevada eficacia contra los agentes que causan biodeterioro, - nula interferencia con los materiales constitutivos de la obra en estudio, - baja toxicidad para la salud humana y - bajo riesgo de contaminación ambiental. La eficacia de un producto va en función de la actividad biocida que realiza contra los organismos a eliminar. Se define teniendo en cuenta la dosis necesaria (cantidad de biocida/unidad de superficie o volumen de aire), el espectro de acción (amplia actividad contra los organismos) y la persistencia de acción (duración del tratamiento en función de la permanencia de residuos tóxicos). Existen una serie de factores que normalmente incrementan la eficacia de un tratamiento (Caneva et a., 1996): - concentración empleada - duración de la aplicación - estabilidad del producto - temperatura ambiental - entidad de la colonización - presencia de materiales orgánicos - presencia de fisuras en el sustrato - viento y lluvia durante el tratamiento - contenido de agua del sustrato - tipo de sustrato - tipo de disolvente - pH de la solución - intensidad luminosa y - lluvia posterior al tratamiento. La ausencia de interferencia con el material es de suma importancia. Dependerá de la capacidad de reacción química que tenga el biocida y de la presencia o no de sustancias coloreadas presentes en la formulación del producto comercial. Por lo tanto es necesario verificar que el producto sea químicamente neutro, estable e incoloro. Actualmente, las distintas técnicas y metodologías de investigación científicas han permitido poner de manifiesto como muchos biocidas han causado efectos colaterales negativos, aunque éstos no siempre son apreciables a simple vista (Nugari & Salvadori, 2003a, 2003b). Sin embargo, la interacción biocida-sustrato no sólo depende de algunas características químicas del principio activo, sino también de la concentración empleada, del tiempo de contacto, de la metodología de aplicación y del tipo de sustrato (composición y porosidad). BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 50 Además, es necesario tener en cuenta que los biocidas pueden también interaccionar con otros productos usados previa o simultáneamente en la intervención, como los consolidantes o los hidrófugos. La toxicidad de un producto se define como su capacidad de producir lesiones o la muerte. Para cuantificar la toxicidad de un producto se usa un índice referido a la cantidad de principio activo (suministrado por vía oral o por vía cutánea) que resulta letal para el 50% de los animales usados en ensayos experimentales. Se indica con las siglas DL50 (Dosis Letal) y se mide en mg de producto/Kg de peso del animal. El valor que define la DL50 está condicionado por diversos factores: especie animal, variabilidad genética, edad, condiciones fisiológicas, factores ambientales, sustancias asociadas y degradación de la sustancia. Considerando esto, se establecen las clases toxicológicas (en orden decreciente de toxicidad) de las formulaciones comerciales, de acuerdo con la normativa comunitaria (Dir. 92/32/CEE). Todas las sustancias con actividad biocida utilizadas en el sector agrícola y civil-sanitario, deben ser registradas por la institución correspondiente, documentando los datos toxicológicos y la eficacia contra las distintas especies. Sobre esta base, las autoridades competentes clasifican las sustancias y les asignan la clase toxicológica, indicando las precauciones que deben ser tenidas en cuenta a la hora de manipular el producto. El riesgo de contaminación ambiental es otro de los factores que debe ser tenido en cuenta. A veces, es posible que una dosis más o menos elevada del producto aplicado se disperse en el ambiente. Los biocidas pueden ser aplicados de diferente manera dependiendo del material constitutivo de la obra, de su estado de conservación, del organismo a eliminar, de la entidad y difusión del ataque y del producto elegido. Los tratamientos pueden hacerse mediante pinceladas, aplicación de compresas, inyección, fumigación, etc. Los productos vienen en formulaciones líquidas o sólidas y se disuelven o dispersan en agua o en disolventes orgánicos a distintas concentraciones. A veces, en función del tipo de organismo, tras la aplicación del biocida, se puede efectuar una remoción parcial y suave de la biomasa mediante el uso de instrumentos adecuados. La pulverización y la aplicación mediante pincel del producto diluido son los métodos de tratamiento más comunes. En el caso de materiales que presenten un estado de conservación muy deteriorado, es preferible utilizar el sistema de pulverización. La aplicación de compresas se realiza sobre todo en el caso de organismos que están en estrecho contacto con el sustrato, como los líquenes, con el fin de incrementar el tiempo de contacto de la solución biocida con el organismo. La inyección de biocidas se puede efectuar en el caso de materiales leñosos deteriorados por insectos, aprovechando los orificios y galerías que han dejado en la madera. La fumigación o dispersión de un biocida gaseoso en el aire y en los materiales se emplea en el caso de materiales orgánicos. Este método tiene como ventajas una alta eficacia y una penetración más profunda en el material constitutivo. Sin embargo, debido a la alta toxicidad que presentan las sustancias usadas como fumigantes, el tratamiento debe realizarse en cámara de fumigación u otro ambiente perfectamente sellado. Estos gases pueden ocasionar graves problemas de toxicidad en las personas que los usan y alteraciones en las propiedades físico químicas de los materiales que constituyen las obras de arte. BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 51 Las sustancias químicas usadas más frecuentemente en conservación de bienes culturales varían según las leyes vigentes en los distintos países. Muchos de los productos usados en el pasado (por ejemplo óxido de etileno, bromuro de metilo, pentaclorofenol, formaldehido, etc.), están ahora prohibidos o tienen un uso limitado (Nugari & Salvadori, 2003b). Los biocidas más habitualmente utilizados en la restauración de los bienes culturales se muestran en la tabla I.4. Tabla I.4. Biocidas frecuentemente usados en conservación. Organismo Clasificación química Nombre químico Nombre comercial Bactericidas, fungicidas, alguicidas, liquenicidas Compuestos inorgánicos Hipoclorito de calcio y de sodio Peróxido de hidrógeno Amoniaco Alcoholes Etanol Derivados del fenol Timol o-fenil-fenol p-cloro-m-cresol Lysol Compuestos fenólicos clorados Panacide, Halophane Pentaclorofenato de sodio Sales de amonio cuaternario Cloruro de alquil-bencil-dimetil- amonio Preventol R50, R80, Neo Des, Hyamina Cloruro de dodecil-dioxietil-bencil amonio Bradophen Cloruro de bencil-dimetil- tetrametilbutilfenoxi-etoxi etilamonio Hyamine 1622 Organometálicos Óxido de tri-n-butil-estaño TBTO, Thaltox Naftenato de tri-n-butil-estaño Metatin N58-10 Piridinas 2,3,5,6 Tetracloro-4-metil sulfonil piridina Algophase Mezclas Sales de amonio cuaternario + Naftenato de tri-n-butil-estaño Metatin N58-10 101 Sales de amonio cuaternario + óxido de tri-n-butil-estaño Thaltox Q Dimetil-tiocarbamato de sodio+ 2 mercaptobenzotiazol Vancide 51 Organismo Clasificación química Nombre químico Nombre comercial Insecticidas Compuestos inorgánicos Fluoruro de sulfurilo Vikane-Dow Chemical Organofosforados Malathion Cythion-American Cyanamid Carbamatos Propoxur Baygon-Bayer Carbaryl Sevin-Union Carbide Compuestos organoclorados Lindano Piretroides y piretrinas BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 58 óxido de etileno y el formaldehido (algunos ya prohibidos en diversos países), poseen un alto grado de toxicidad por lo que deben ser utilizados únicamente por personal especializado. Un problema importante relacionado con el deterioro de las obras de naturaleza orgánica es aquel debido al ataque de insectos, por ello los biocidas mayormente utilizados son aquellos que poseen una doble acción microbicida e insecticida. Por lo que respecta a la aplicación de biocidas sobre obras de naturaleza orgánica, hay muy pocos estudios considerando la eficacia y la interferencia con el material. Por ejemplo, la actividad microbicida de algunos de estos productos como el timol o el bromuro de metilo no está comprobada (Sclocchi, 2002). MATERIALES PÉTREOS El tratamiento con sustancias químicas es el método más frecuentemente empleado para la eliminación de los organismos presentes en una obra de naturaleza pétrea (Caneva et al., 2005). Con objeto de seleccionar los biocidas más idóneos para este tipo de materiales, se han llevado a cabo numerosos estudios sobre productos comerciales para comprobar su eficacia y su posible interacción con la superficie pétrea. La metodología de estudio aplicada puede influir bastante en los resultados, es decir, si se comparan los datos de laboratorio con los obtenidos en el exterior es muy frecuente encontrar discrepancias. Por ejemplo, los microorganismos utilizados en los ensayos de eficacia en el laboratorio son más sensibles que aquellos presentes en un biofilm sobre la superficie pétrea, estos últimos mucho más resistentes a la acción de los biocidas (Young et al., 2008). Los estudios de laboratorio pueden, por tanto, tener una validez limitada en relación a la actividad biocida de los productos sobre los organismos a eliminar (Skipper et al., 2016). Por otro lado, el tiempo de acción del biocida varía en relación al producto seleccionado y a los organismos que deben ser eliminados. Otros factores que pueden influir en la eficacia de los mismos sobre los materiales pétreos son: - el tipo de sustrato, por ejemplo la porosidad de la piedra y la presencia de algunos minerales, - la presencia de material orgánico como polvo, polen, etc. o de contaminantes atmosféricos sobre la superficie, - el tiempo de contacto, - las condiciones meteorológicas: temperatura, viento, lluvia e intensidad luminosa. Algunas de estas condiciones pueden ser simuladas en el laboratorio pero es imposible recrear un ecosistema complejo como el de una piedra colonizada expuesta a la intemperie. Los ensayos preliminares in situ son por tanto extremadamente útiles para estudiar la interacción biocidamicroorganismo y biocida-material pétreo a corto y largo plazo. Muchos factores pueden determinar una interacción negativa entre el biocida y el material pétreo. Los más significativos, como en el caso de la eficacia, son la naturaleza química del producto, las condiciones de empleo (concentración, método y duración de la aplicación), las características mineralógicas y petrográficas del sustrato y las condiciones ambientales. BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 59 2.4.1 Evaluación de la eficacia de tratamientos para erradicar el biodeterioro Materiales orgánicos Debido a que los agentes biológicos que deterioran los materiales orgánicos son principalmente hongos y bacterias, la búsqueda de productos desinfectantes en este ámbito está relacionada con las estrategias usadas en el caso de los microrganismos fitopatógenos (patógenos de las plantas) y los que causan enfermedades dermatológicas (hongos dermatofitos u hongos de la piel), que se dirigen contra estos microorganismos y no interfieren con los materiales alterados. Por ejemplo, en el caso de los hongos fitopatógenos, algunas sustancias pueden tener efecto biocida al inhibir la síntesis de ciertos compuestos específicos de su pared celular (constituida por quitina) sin interaccionar con las plantas cuya pared celular posee una estructura diferente. Al igual que las sustancias inhibidoras de la síntesis de quitina, existen sustancias específicamente activas en los procesos de síntesis de otras moléculas peculiares de los hongos, como el ergosterol, el esterol más abundante de las membranas fúngicas. Se han ensayado algunos compuestos biocidas con esta actividad (econazol, triazina, flouridina) sobre diversas cepas fúngicas que deterioran el papel. La evaluación de la eficacia del tratamiento dio como resultado que la triazina era el mejor tratamiento (Ricelli et al., 1999; Fanelli et al. 2001). Recientemente, se han realizado estudios para seleccionar los productos más adecuados. Se están estudiando azoles (Voriconazol y Tiabendazol) y nanocompuestos (nanopartículas de óxido de cobre, nanopartículas de óxido de zinc y nanopartículas de óxido de Titanio) que, por su eficacia, están indicados para la eliminación de los hongos filamentosos y de pudrición encontrados en los materiales orgánicos que forman parte de los bienes culturales (Terzi et al., 2016). Para su estudio, Clausen y Yang (2007) usaron una base de borato, voriconazol, tiabendazol, thujaplicin, y combinaciones de borato base con: A, 0’1% de voriconazol; B, 0’1% de tiabendazol en 70% de etanol; C, 0’5% de tuyaplicina en 70% etanol. En este estudio explican que los biocidas destinados a su uso en interiores no deben ser tóxicos, ni volátiles, sino inodoros e hipoalergénicos y capaces de proporcionar una protección prolongada en condiciones de alta humedad. Los sistemas multicomponentes funcionaron bien contra los hongos de pudrición parda (Postia placenta y Gloeophyllum trabeum) y blanca (Coriolus versicolor), contra tres clases de moho (Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum, y Trichoderma viride) y las termitas subterráneas (Reticulitermes flavipes). Se determinó que, para las aplicaciones en interiores, los biocidas multicomponentes pueden proteger la madera de la pudrición, del moho, y las termitas; y que los sistemas que contienen Tiabendazol proporcionan una protección más lenta que los otros biocidas en este estudio. Se observó una mejora en la aplicación conjunta de compuestos a base de boro y el voriconazol. También se puede destacar el estudio de De Filpo et al. (2013), en el que se habla de la prevención del crecimiento de hongos en madera mediante nanopartículas de dióxido de titanio (TiO2). Los hongos juegan un papel considerable en el deterioro del patrimonio cultural, ya que su contaminación favorece la descomposición de los materiales empleados en obras de arte históricas. La prevención del crecimiento fúngico, el tratamiento de objetos contaminados y su posterior conservación, son actividades importantes para los restauradores. En la pasada década, se ha aplicado la nanotecnología en numerosos campos de la conservación del patrimonio cultural para prevenir, por ejemplo, la alteración química de pintura mural y la acidez del papel. Los nanomateriales aún no han sido usados como fungicidas y biocidas para los BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 60 objetos de madera. En este estudio se han tratado ocho tipos de madera diferentes, algunas de las cuales son comúnmente usadas en el campo del patrimonio cultural, con soluciones de nanopartículas de TiO2 y se han puesto en contacto con dos tipos de hongos, Hypocrea y Mucor circinelloides, los cuales son conocidos por ser responsables de la rápida descomposición de la madera. Los resultados muestran que la actividad fotocatalítica de las nanopartículas del TiO2 previene la colonización de los hongos de las muestras de madera durante un largo tiempo, en comparación con las maderas no tratadas. En otro estudio de Shabir Mahr et al. (2013) se ha investigado la protección de la madera contra hongos de pudrición parda por impregnación con TiO2. La resistencia a la descomposición del pino tratado con soluciones de TiO2 fue probada con el hongo Coniophora puteana y Poria placenta con unas exposiciones de 10 a 16 semanas. En el ensayo las muestras de madera fueron impregnadas con soluciones de TiO2 con concentraciones de entre 5 al 16% (p/p) y posteriormente tratadas bajo distintas condiciones de humedad. Los resultados muestran que la madera tratada en comparación con la no tratada se ha deteriorado un 38% y 50% menos respectivamente contra ambos tipos de hongos. La mayor protección se consiguió con una disolución de TiO2 al 5%. Con el aumento de la concentración, la resistencia fungicida disminuye levemente, lo que se refleja con más fisuras e imperfecciones formadas en las capas que contienen dióxido de titanio en la matriz de la madera. Con respecto a las nanopartículas de zinc y cobre, existen algunas investigaciones sobre el efecto de soluciones y suspensiones a base de nanopartículas de cobre y zinc, con o sin la adición de algún tipo de surfactante, orientadas a proteger la madera de microorganismos, insectos xilófagos y el desgaste por condiciones ambientales naturales. Goddio et al., (2013) desarrollaron un preservante nanoformulado a base de óxidos de cinc y cobre y evaluaron la capacidad de protección de maderas de pino. El Zn actúa como inhibidor de la colonización fúngica, mientras que el Cu permite preservar las maderas de organismos más complejos, como las termitas. En el estudio de Kartal et al. (2015) se trata la biorremediación y descomposición de la madera con tres conservantes a base de cobre: cobre alcalino cuaternario en base acuosa, nano óxido de cobre, y arseniato cromato de cobre. La pudrición por hongos de la madera se estudió en relación a la cantidad de cobre aplicado inicialmente, y también la cantidad eliminada en las pruebas de biorremediación de hongos. Otro estudio sobre maderas es el de Koziróg et al. (2014), centrado en el primer campo de concentración de Auschwitz, el cual está bajo el cuidado del museo estatal de Auschwitz Birknay en Oswiecim, Polonia. Consta de edificios históricos y objetos conmemorando los trágicos eventos de la segunda guerra mundial, incluyendo cuarteles de madera además de otros elementos: puentes, puertas, suelos, cabañas, marcos de puertas y ventanas, muros estructurales y vigas, los cuales, tras exponerse a condiciones climatológicas variables, pueden sufrir biodegradación. El objetivo del estudio era determinar la invasión de las superficies de madera por distintos organismos e identificar las especies dominantes. El cómputo total de bacterias en las superficies de madera era alto, siendo Bacillus sp. la especie más dominante, mientras la cantidad de hongos estaba en un rango menor, siendo los más comunes Cladosporium sp., Alternaria sp. y Penicillium sp. En la madera de las cabañas y suelos se identificó ataque de hongos como Poria vaporaria y Serpula lacrymans. La identificación de los organismos hace posible la selección de los biocidas adecuados para proteger objetos históricos contra el proceso natural de la biodegradación gradual. BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 61 Salem et al. (2016) utilizan dos aceites esenciales como tratamiento antifúngico en tres maderas comerciales (Pinus sylvestries, Pinus rigida y Fagus sylvatica) deterioradas por cinco hongos de moho comunes. Se han usado aceites esenciales de P. rigida y Eucalyptus camaldulensis, aplicándolos con el método de vapor y después se midió la inhibición del crecimiento del moho, siendo completa contra el crecimiento de A. alternata, F. subglutinans, C. globosum y A. niger excepto a T. viride en la aplicación de P. rigida. Se concluyó buena inhibición contra C.globosum a 5000 ppm y 156.25 ppm, ninguna inhibición contra A. niger y T. viride y poca inhibición contra F. subglutinans. En Monroy et al. (2011) se estudian los efectos de pretratamientos biológicos en Pinus radiata y Eucalyuptus globulus, los cuales se evaluaron después de exponerse a dos hongos de pudrición parda, Gloephylum trabeum y Laetoporeus sulphureus, además del análisis de los cambios en la composición química, modificaciones estructurales y susceptibilidad a la degeneración de la madera. Materiales Pétreos La efectividad de los biocidas sobre las distintas especies de organismos ha sido ampliamente estudiada. Los métodos más utilizados para probar los efectos de los biocidas han sido los que se basan en la detección de cambios en las propiedades cromáticas y/o físico-químicas de la superficie del material o mediante la identificación de la actividad de los microorganismos que lo colonizan, la cual tras la aplicación de los tratamientos, se supone menor (Monte y Nichi, 1997; Prieto et al., 2004; Tretiach et al., 2007, 2010; Sanmartín et al., 2010). En general, la biomasa algal puede estimarse utilizando técnicas de cuantificación de la clorofila a basado en la extracción del fotopigmento de las células o mediante la detección de su fluorescencia natural (Tomaselli et al., 2002), la cual, al no necesitarse muestreo, resulta útil para detectar microorganismos fototrófos y monitorizar tratamientos preventivos (Eyssautier- Chuine et al., 2015; Urzi et al., 2016). Actualmente, la cuantificación y monitorización de biopelículas superficiales puede también llevarse a cabo mediante técnicas de análisis digital de imágenes (DIA), que se basan en el carácter matricial de las imágenes digitales (Rogerio-Candelera et al., 2012). Además, para el estudio de la efectividad biocida, también se ha extendido la técnica de microscopía electrónica de barrido en el modo de electrones retrodispersados, SEM-BSE, la cual permite la evaluación de los efectos del tratamiento en organismos fotosintéticos o no fotosintéticos, tanto dentro del sustrato como en la superficie del mismo (Ascaso et al., 2002; Cámara et al., 2011). Los biocidas empleados en este trabajo han sido extensamente estudiados. La efectividad comparativa de los biocidas como el Biotin T y Biotin R, ampliamente empleados en restauración-conservación, ha sido analizada (de los Ríos, et al. 2012) al eliminar líquenes y cianobacterias de la Catedral de Segovia (España). Ambos tratamientos resultaron eficaces erradicando los líquenes y cianobacterias epilíticos pero mostraron diferentes efectos en los organismos endolíticos. El Biotin T resultó ser un buen limpiador de la superficie pétrea, la cual quedó prácticamente libre de restos de líquenes, pero se detectó la presencia de hifas fúngicas en las fisuras de la piedra transcurridos dos meses de la aplicación del tratamiento. Por su parte, el Biotin R dejó restos de líquenes superficiales, pero era mejor eliminando las hifas que penetran en la piedra, así como las cianobacterias endolíticas. BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 62 En el estudio del monasterio de San Jerónimo (Lisboa) llevado a cabo por Ascaso y de los Ríos, 2005, se aplicó Preventol Ri80, resultando responsable de la plasmólisis y pérdida de estructura celular de cianobacterias, y confirmando así su capacidad biocida. Para la evaluación del efecto real de los tratamientos sobre la fisiología de los organismos sin extraerlos del material que colonizan, en varios intervalos de tiempo, se recurre al uso de técnicas como la microscopía óptica (OM) y la microscopía láser confocal (CSLM), que permiten valorar la vitalidad de los microorganismos tras los tratamientos; mientras que con la microscopía electrónica de barrido (SEM-BSE), se obtienen imágenes claras de los efectos de los biocidas sobre las células. Por último, la microscopía electrónica de transmisión (TEM) permite conocer detalles precisos sobre la acción concreta de los productos en la ultraestructura celular. Los biocidas de mayor efectividad son aquellos que producen el colapsamiento celular y la pérdida de estructura interna (De los Ríos, 2008). La estimación de la eficacia de los tratamientos elegidos permite aplicar en los bienes culturales los productos más indicados para el control o la eliminación de la colonización de los organismos causantes del biodeterioro diagnosticado. 2.4.2 Evaluación de la compatibilidad de los tratamientos Como ya se ha indicado, la efectividad de los biocidas ha sido ampliamente estudiada pero no así el efecto que estos productos generan sobre los materiales sobre los que se aplican. Estos estudios (Nugari et al., 1993; Sameño et al., 1996) son fundamentales, ya que sería completamente desaconsejable aplicar un biocida que dañara los materiales constitutivos de los Bienes Culturales aunque tuviera una alta eficacia en la eliminación de organismos. Esto justifica que uno de los objetivos de este trabajo sea determinar el efecto que los tratamientos biocidas ocasionan sobre los materiales, utilizando diversos ensayos y métodos de aplicación de los productos. En el caso del estudio de posibles interferencias de los tratamientos con los materiales que constituyen los bienes en estudio, el objetivo es verificar el efecto de estos productos biocidas utilizando diversos ensayos y métodos de aplicación. Las características de estos materiales se determinan antes y después del tratamiento biocida: absorción de agua por capilaridad, alteración cromática, ensayos de alteración acelerada, observación mediante microscopía óptica y microscopía electrónica de barrido (SEM-EDS), etc. Con respecto a la compatibilidad de estos productos biocidas con otros tratamientos de conservación (consolidantes e hidrófugos) hay muy pocos estudios realizados. Por ejemplo, hay distintos estudios sobre el efecto conjunto de consolidantes y biocidas en los que se analizan la protección de la madera contra el moho, la pudrición o las termitas, es decir, contra hongos e insectos. Pero también en otros se investiga sobre la compatibilidad de estos productos con el sustrato y con ellos mismos. Los productos ensayados en todos estos estudios son distintos. Mansour y Salem (2015) han investigado la inhibición in vitro del crecimiento del hongo Tricoderma harzanium con diferentes extractos metanólicos de especies de árboles seleccionados. Han observado el crecimiento de hifas mediante el microscopio electrónico ambiental (ESEM) y han evaluado los cambios en la composición elemental mediante espectroscopía dispersiva de rayos X. Extractos metanólicos del duramen de Morus alba y de la corteza de Macluas pomifera tenían efectos significativos en el crecimiento lineal de T. harzanium. Las muestras de madera de Acacia saligna tratadas con extracto metanólico de BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 63 madera de Cupresus sempervirens mostraron una zona de inhibición del crecimiento de T. harzanium alrededor de maderas tratadas a concentraciones de 5, 10 y 20%. Sin embargo, los análisis efectuados al SEM-EDX de la madera tratada demostraron que la combinación de Paraloid B-72 y extracto metanólico de madera de C. sempervirens, podría usarse como un potente biocida contra el hongo T. harzanium. En el estudio de Clausi et al., (2011), se analiza la acción protectora contra el crecimiento fúngico de dos productos consolidantes, ambos aplicados a la madera. Se examinaron los efectos producidos por los hongos de pudrición blanca y pudrición parda en madera y se trataron con dos consolidantes, Paraloid B-72 y Regalrez 1126, aplicados individualmente y juntos. El objetivo de este estudio era evaluar los diferentes niveles de penetración y localización en la madera, pero sobre todo comprobar si estos productos, muy usados en restauración, actuaban contra el crecimiento del hongo en maderas o incrementaban el ataque biológico. Se observaron cambios tanto morfológicos como químicos provocados por la colonización biológica del hongo y se comprobó la eficacia de protección. Numerosas muestras de madera tratadas con los productos descritos se dispusieron en placas de Petri con medio de cultivo y se inocularon con dos especies de hongos, Fomitopsis palustris y Trametes versicolor, observándose el crecimiento durante dos meses. Los resultados de las muestras de madera de Norway spruce, el pino nórdico, mostraron un desarrollo selectivo de una de las dos pudriciones debido a la aplicación del producto: ambos productos aplicados a la vez causan una diminución del crecimiento de ambas especies de hongos. Las muestras de T. versicolor tratadas con los consolidantes, tanto separados como juntos, muestran un comportamiento similar. También se llevó a cabo un análisis mediante el microscopio electrónico de barrido (SEM) para observar cambios en la microestructura de la madera. La descontaminación y la desconsolidación de los conservantes históricos de la madera y los consolidantes en el patrimonio cultural se tratan en el artículo de Unger (2012), en el que se puede leer que en el pasado, los objetos de madera eran tratados con una variedad de conservantes de la madera formulados con una base de biocidas inorgánicos y orgánicos. La mayoría de estos biocidas son altamente tóxicos para el ser humano y contaminan el medio ambiente, algunos de ellos incluso causan daños a los objetos que debían conservar. Esto supone un considerable reto para manejar la exhibición, almacenaje y restauración de dichas obras de arte de madera. Además, el biocida contenido en los elementos estructurales de madera en edificios históricos, contamina el aire en su interior y representa un riesgo constante para la salud. Los objetos de madera dañados anteriormente por organismos y, preservados y consolidados con mezclas de aceite vegetal y resinas naturales, ahora muestran una nueva alteración. Una condición importante para volver a tratar dichos objetos es la identificación exacta de las sustancias utilizadas originalmente para su conservación. Las medidas no destructivas realizadas in situ, tienen prioridad por encima de los métodos analíticos. Los distintos procesos de descontaminación usados actualmente son clasificados en función de su modo de operación. Incluyen limpiezas mecánicas, desorción térmica, lavados con agua y desintoxicantes, y lavados y extracciones con líquidos o dióxido de carbono. La aplicación de varios selladores para prevenir la evaporación del biocida en el aire del interior de los inmuebles se limita a los elementos estructurales de madera. Henriques et al. (2014), estudian la consolidación de madera tratada con conservante. Cuando los elementos de madera en edificios patrimoniales están deteriorados por hongos, una vez que los problemas de humedad en las capas inferiores han sido resueltos, se pueden llevar a cabo dos acciones: usar biocidas para frenar la actividad del hongo o identificar los elementos deteriorados y reemplazarlos. El objetivo de este trabajo era investigar el rendimiento mecánico BLOQUE I. ASPECTOS GENERALES. ESTADO DE LA CUESTIÓN 64 de la madera de pino marítimo deteriorado por hongos una vez que ha sido tratado con biocidas seguido por la impregnación con productos consolidantes. Se utilizaron tres productos disponibles comercialmente: un biocida con base acuosa, un consolidante acrílico y un consolidante epoxídico. Las especies tratadas y conservadas se expusieron a ensayos mecánicos: compresión axial, dureza superficial estática y resistencia a flexión. Un conjunto de réplicas se sometieron a un ensayo de evaporación después de la aplicación del producto y también un ensayo para estudiar su comportamiento mecánico. Se observó un aumento de la resistencia mecánica con ambos consolidantes sin influencia significativa de los productos biocidas anteriores. Estas especies sometidas a envejecimiento mostraron una pequeña mejora general en su rendimiento mecánico. Por otro lado, con respecto a la compatibilidad de los productos biocidas con los materiales pictóricos, Nugari et al. (2009), realizaron un estudio sobre evaluación de biocidas en la pinturas murales de la Cripta del Pecado Original (Matera, Italia). Ensayaron los productos Umonium 38, Preventol R80 y Rocima 110 contra algas y cianobacterias. BLOQUE II. METODOLOGÍA DE TRABAJO BLOQUE II. METODOLOGÍA DE TRABAJO 67 Este bloque recoge la metodología general que se ha empleado en todos los casos en estudio. El bloque siguiente se ha estructurado en capítulos para tratar cada caso de estudio con identidad propia y para presentar sus resultados de una manera más clara y comprensible. Por último, un apartado final abarca las conclusiones extraídas de todo el proceso de investigación. En concreto, aquí se describe la metodología llevada a cabo en los estudios de biodeterioro y en la evaluación de los tratamientos biocidas aplicados a los distintos materiales constituyentes de los bienes culturales objeto de estudio. En el bloque experimental, cada capítulo, que corresponde a un caso de estudio concreto, recoge la metodología empleada de forma más detallada y específica para ese bien. Se han realizado estos estudios en cuatro bienes culturales de Andalucía, en Sevilla, Córdoba y Granada:  Portada de la iglesia del monasterio de Santa Paula (Sevilla)  Atauriques del Salón Rico de Abd Al-Rahman III del conjunto arqueológico de Medina Azahara (Córdoba)  Pinturas de la Sala de los Reyes de la Alhambra (Granada)  Maqsura de la Mezquita de Córdoba En cada ámbito de estudio se ha realizado una primera fase de identificación de especies biológicas presentes, concretamente plantas superiores, briofitos, líquenes y microorganismos como hongos, algas y cianobacterias. Para ello, se han usado diversas técnicas y métodos de análisis como la inspección visual, la microscopía estereoscópica, la microscopía óptica y la microscopía electrónica de barrido, reacciones de tinción con potasa (KOH), técnicas de cultivo y técnicas de biología molecular (PCR, reacción en cadena de la polimerasa). Una vez identificados los agentes biológicos con la máxima exactitud posible, intentando determinar la especie o en su defecto la familia taxonómica a la que pertenece, se han realizado diversos ensayos con productos biocidas sobre los materiales constitutivos de estos bienes culturales. Estos estudios se pueden englobar en dos líneas de investigación: Por una parte, se han llevado a cabo diversos estudios comparativos para comprobar la eficacia de diversos biocidas al aplicar estos productos sobre los organismos biológicos localizados en estos bienes inmuebles. Para ello, se ha estudiado la vitalidad de los microorganismos fotótrofos al microscopio óptico, la interfase de estructuras liquénicas con el sustrato mediante observación al microscopio electrónico de barrido, la estimación de biomasa fotosintética por espectrofotometría ultravioleta-visible o la capacidad de eliminación o reducción del crecimiento de especies de hongos filamentosos y de pudrición. Por otra parte, se han realizado ensayos para analizar la interacción o interferencia que estos productos biocidas presentan con los materiales constitutivos de cada monumento y/o con otros tratamientos. Para ello, tras la aplicación de los biocidas, se han observado los materiales al microscopio electrónico de barrido (SEM) y se ha efectuado microanálisis elemental mediante EDX (energía dispersiva de RX). Además, cuando ha sido posible, se han realizado ensayos de colorimetría y de medida de porosidad abierta para comprobar si estos productos afectan de alguna manera al color y a la porosidad de los materiales, una de las características fundamentales de los materiales de construcción. Por otro lado, en el caso de la madera, también se han medido la velocidad de ultrasonido y la dureza superficial y se han efectuado ensayos de alteración acelerada. BLOQUE II. METODOLOGÍA DE TRABAJO 74  Extracción de ADN El método de extracción de ADN (Figura II.2) tiene que ser lo suficientemente agresivo para romper las células y/o tejidos, pero lo suficientemente delicado como para preservar la molécula de interés (ADN). Se realiza por medios físicos (molienda en morteros, perlas de vidrio…) y/o químicos (uso de detergentes como el SDS, dodecilsulfato sódico) (Baridon, 2012). Para la extracción de ADN de cianobacterias y algas verdes se añadieron a las muestras (resuspendidas en tampón TE) perlas de vidrio estériles de 0,25 mm de diámetro, SDS al 10% y fenol-cloroformo (1:1). Después se sometieron a agitación en vórtex y centrifugado para extraer el sobrenadante que contiene el ADN. Por otro lado, se extrajo el ADN de bacterias y hongos a partir de las colonias obtenidas en cultivos puros, realizados previamente en placa, usando el kit comercial de extracción ZymoResearchFungal/Bacterial DNA, siguiendo el protocolo del fabricante. Se obtuvo así una solución de 100 µl que contenía el ADN, que se utilizó como ADN molde para la amplificación. La identificación de hongos de pudrición es bastante difícil ya que no suelen propagarse fuera de la madera, así que se intentó aislar ADN directamente de ésta, lo cual supone un serio problema metodológico por la resistencia mecánica de este material a romperse y por la contaminación de las muestras con ácidos húmicos, que hubieron de ser separados mediante electroforesis. Además de aplicar protocolos obtenidos de la literatura se intentó hacer crecer hongos introduciendo fragmentos de madera en medio YPD (estándar para crecimiento de hongos microscópicos) líquido e incubando a 30ºC durante varios días en la oscuridad y sin agitación. Al cabo de dicho tiempo crecieron microorganismos que se visualizaron al microscopio óptico y cuyo ADN se aisló por métodos estándar. La extracción de ADN fue verificada mediante electroforesis, de 5 µl de cada solución obtenida, en gel de agarosa al 0,7% en tampón TBE ½ y teñido con bromuro de etidio, a 120 V, durante 30 minutos, usando como patrón ADN de fago λ (Promega) digerido con las endonucleasas de restricción HindIII y EcoRI con un patrón de bandas en un rango de 564 a 21226 pb.  Amplificación por PCR (Polymerase Chain Reaction). La detección de microorganismos se basa en la amplificación y secuenciación de genes (o de fragmentos de los mismos) que codifican alguna de las moléculas de ARN ribosómico (ARNr): 16S en procariotas, 18S y/o 28S en eucariotas. Estas secuencias se consideran universales y presentan bajo polimorfismo, es decir, poca variación dentro de una misma especie, aun así, presentan ciertas divergencias que permiten identificar con bastante fiabilidad a los distintos organismos. La amplificación de los genes ADNr (que codifican los ARNr) se consigue en un termociclador mediante la reacción en cadena de la polimerasa, utilizando como molde el ADN genómico previamente extraído y purificado del microorganismo a identificar. Para el ADNr 16S de procariotas se utilizaron como cebadores para la reacción de amplificación el par de oligonucleótidos 5'-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3' y 5'-ACCTTGTTACGACTT-3'; mientras que en el caso del ADNr 28S de eucariotas las secuencias de los oligonucleótidos fueron: 5'- ACCCGCTGAATTTAAGCAT-3' y 5'-TCCGTGTTTCAAGACGG-3'. Estos oligonucleótidos corresponden a secuencias especialmente conservadas dentro de los genes ADNr y son utilizados convencionalmente para su amplificación y secuenciación. Fueron sintetizados por la empresa Eurofins MWG Operon. De esta forma se amplificaron fragmentos de ADN de unas 1.500 pares BLOQUE II. METODOLOGÍA DE TRABAJO 75 de bases (pb) en el caso de procariotas, y de unas 600 pares de bases (pb) en el caso de eucariotas. Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en un termociclador My Cycler y se realizaron en un volumen final de 50 μl y contenían: 2 μl de la solución de ADN obtenida durante la extracción (ADN molde), 5 μl de tampón Taq DNA polimerasa, 1 μl de Taq DNA polimerasa (5 U), 2 μl de mezcla de dNTP’s 10 mM cada uno, 50 pmol de cada uno de los dos oligonucleótidos utilizados como cebadores, completando con agua Milli-Q estéril (Sigma W4502). Tabla II.1. Tabla II.1. Componentes necesarios para la PCR. Añadir en orden Volumen (µL) ADN molde 1 2 3 4 5 10 20 40 Oligo FW 1 1 1 1 1 1 1 1 Oligo RW 1 1 1 1 1 1 1 1 dNTP’s 2 2 2 2 2 2 2 2 Tampón TAQ 5 5 5 5 5 5 5 5 TAQ polimerasa 1 1 1 1 1 1 1 1 H2O mQ 39 38 37 36 35 30 20 0 El termociclador en el que se introdujo la mezcla anterior para que se produjese la amplificación, se programó con las siguientes condiciones: 2 minutos a 95 C para la desnaturalización del ADN molde, seguido de 30 ciclos de 1 minuto de desnaturalización a 95 C, 1 minuto de hibridación de cebadores a 55 C y 5 minutos de elongación a 72 C, con un paso de extensión final de 10 minutos a 72 C. Para comprobar la efectiva amplificación de los fragmentos de ADN, los productos resultantes de la PCR se analizaron, junto con un marcador de peso molecular, mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% (p/v) en 50 ml de tampón TBE ½ teñido con solución de tinción de ácidos nucleicos RedSafe o bromuro de etidio, a 100 V, durante 40 minutos, usando como patrón ADN de fago λ (Promega) digerido con las endonucleasas de restricción HindIII y EcoRI con un patrón de bandas en un rango de 564 a 21226 pb. Tras la electroforesis, se visualizó el gel bajo luz ultravioleta, viéndose las bandas correspondientes al ADN amplificado y al marcador de peso molecular (para la estimación del tamaño de las bandas, se utilizó el marcador comercial Hyperladder II de Bioline). Elaboración del gel de agarosa al 0,7% .Para elaborar 50ml de gel es necesario:  0,35 g agarosa.  50 ml de tampón TBE ½ (2,5 ml TBE 10X + 47,5 ml H2O destilada)  2,5 µL de colorante RedSafe. En la elaboración del gel, la agarosa junto con el tampón TBE ½ se calienta a ebullición en el microondas, es decir, hasta que empiecen a formarse burbujas de gran tamaño, para disolverla. Posteriormente, tras enfriar la solución de agarosa, se le añade el colorante, el cual es de un tono rojizo y que se utiliza en sustitución del más común bromuro de etidio (BrEt) debido a su menor toxicidad. Se deja que el gel se solidifique. BLOQUE II. METODOLOGÍA DE TRABAJO 76 Electroforesis en gel de agarosa: Se analizaron las muestras originales obtenidas con los oligos 16S y 28S por PCR así como una preparación comercial (“escalera”) con fragmentos de ADN de tamaño conocido. En cada pocillo se cargaron 5 µL de las muestras mezcladas previamente con 1 µL de tampón de carga. Al gel de agarosa, inmerso en 100 ml de tampón TBE ½, se le aplica una corriente de 100 voltios durante 40 minutos. El tampón sirve como conductor de la electricidad y controla el pH, lo cual es importante para la estabilidad de las moléculas biológicas. Como el ADN tiene una carga negativa a pH neutro, migrará a través del gel hacia el electrodo positivo durante la electroforesis. Las bandas correspondientes a los fragmentos de ADN amplificados que se encuentran a la misma altura contienen moléculas que han atravesado el gel a la misma velocidad y, por tanto, tienen un tamaño similar. Agregar una calle con marcadores de peso molecular conocido, permite determinar el tamaño de los fragmentos de ADN obtenidos (Figura II.3). Figura II.3. Ejemplo de electroforesis en gel de agarosa donde se observan las bandas de ADN. Purificación de ADN de los productos de PCR: Una vez que se comprueba la correcta amplificación de ADN de las distintas muestras, se procede a purificarlo para poder secuenciarlo posteriormente. Para la purificación de material genético se ha utilizado un kit comercial de purificación BiolineIsolate PCR and Gel Kit, que dispone de los materiales necesarios para la misma y con el que se sigue un protocolo de actuación simple que incluye los siguientes pasos: 1. Colocar el tubo Columna A en un tubo colector con un volumen de 2 ml. 2. Añadir 500 l de Binding Buffer A. 3. Añadir 50 l de la muestra, es decir, del ADN junto a los productos de la PCR, y mezclar cuidadosamente con la pipeta. 4. Centrifugar a 10000xg durante 2 minutos. 5. Desechar el tubo colector y colocar la Columna A en un tubo de elución (tubo eppendorf). 6. Añadir 15 l de agua mQ. 7. Incubar a temperatura ambiente durante 1 minuto. 8. Centrifugar 1 minuto a 6000xg para eluir los productos de la PCR. 16 S 28 S Marcador BLOQUE II. METODOLOGÍA DE TRABAJO 77 Con estos pasos se obtiene el ADN purificado.  Cuantificación de las muestras de ADN Se necesita conocer la concentración de ADN purificado que está presente en las muestras, ya que cada laboratorio requiere de cantidades de ADN concretas para poder secuenciarlo. La cuantificación de material genético se obtiene por dos métodos diferentes para poder, posteriormente, realizar una comparación de los resultados obtenidos y probar, así, la veracidad de los mismos.  Método nº 1. Electroforesis Este método consiste en hacer correr las muestras ya purificadas en un gel de agarosa, en el que también se hace correr un marcador de peso molecular: DNA Ladder 100-1000pb MBL020 (50 g, 0,1 g/L). Este marcador es ideal para determinar el tamaño de ADN de doble cadena desde 100 hasta 1000 pb. Las bandas de las muestras se comparan con la escalera por brillo.  Método nº 2. NanoDrop El equipo NanoDrop es una técnica con la que a partir de una pequeña gota de muestra (2 L) se puede obtener la concentración de material genético presente en la misma. Además se mide la absorbancia a 260 y 280 nm, estableciendo una relación entre tales medidas, con la que se obtiene información acerca de la degradación de proteínas. Así, si la relación Abs260/Abs280=1,5-1,7 quiere decir que el ADN no está contaminado de proteínas.  Secuenciación del ADN amplificado. Las muestras, una vez purificadas, son preparadas para su secuenciación, obteniendo así el orden de nucleótidos que compone su material genético. Una vez cuantificadas las muestras de ADN amplificado, éstas se prepararon y enviaron para su secuenciación al Instituto de Parasitología y Biomedicina “López-Neyra” (CSIC) de Granada.  Análisis de la secuencia. Consiste en la comparación de la secuencia de ADNr obtenida, con las depositadas en bases de datos, mediante el análisis Blast. Actualmente existen diversas bases de datos, algunas públicas y de acceso libre a través de internet. La más utilizada es GenBank, del NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA). https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi La homología de la secuencia con las existentes en la base de datos proporciona la identificación taxonómica del microorganismo, permitiendo también un análisis filogenético que refleja, de forma esquemática, el grado de parentesco genético entre los microorganismos comparados. Lo ideal sería una afinidad mayor al 97% para poder afirmar casi con total seguridad que la secuencia de ADN se corresponde con el organismo indicado en la base de datos. 1.9 ESPECTROSCOPÍA UV-VISIBLE La espectroscopia UV-visible se utiliza de manera general en la determinación cuantitativa de ciertas sustancias como los componentes de soluciones de iones de metales de transición y compuestos orgánicos altamente conjugados. El principio de la espectroscopía ultravioleta-visible involucra la absorción de radiación ultravioleta–visible (200-800 nm) por una molécula, causando la promoción de un electrón de un BLOQUE II. METODOLOGÍA DE TRABAJO 78 estado basal a un estado excitado. Al absorber radiación electromagnética de una frecuencia correcta, ocurre una transición desde uno de estos orbitales a un orbital vacío. Las diferencias entre energías varían entre los diversos orbitales. El instrumento utilizado, espectrofotómetro UV-Vis, mide la intensidad de luz después de haber atravesado una muestra (I), y la compara con la intensidad de luz antes de pasar a través de ella (Io). Cuando un haz de radiación UV-Vis atraviesa una disolución conteniendo un analito absorbente, la intensidad incidente del haz (Io) es atenuada hasta I. Esta fracción de radiación que ha logrado traspasar la muestra se denomina transmitancia (T = I/Io). Por aspectos prácticos, se utiliza la absorbancia (A=-logT) en lugar de ésta por estar relacionada linealmente con la concentración de la especie absorbente (Ecuación II.1) según la Ley de Lambert-Beer (Jentoft, 2004): A = ε·C·l Ec II.1 A absorbancia medida. ε coeficiente de absortividad molar. l longitud de la cubeta, el camino óptico (cm). C concentración de la especie absorbente (moles/l). Para cada especie y longitud de onda, ε es una constante conocida como absortividad molar o coeficiente de extinción. Esta constante es una propiedad fundamental molecular en un solvente dado, a una temperatura y presión particular. Otra expresión para la ecuación de Beer-Lambert es la siguiente (Ecuación II.2): Ec II.2 It intensidad de transmisión. I0 intensidad de la luz incidente a una determinada longitud de onda. k capacidad de captación del haz del campo electromagnético. l longitud del tubo de fotocolorimetría (cm). c concentración de la muestra (mol/l). El instrumento empleado en este estudio es un espectrofotómetro UV/Vis marca JASCO V650, de JASCO Analytical Instruments. 1.10 COLORIMETRÍA La colorimetría permite determinar las variaciones de color que se producen en los distintos materiales. Para evaluar los posibles cambios de color en los materiales tras los tratamientos con biocidas se sigue lo indicado en las normas Normal 43/93 (1994) y UNE-EN 15886 (2011), empleando un colorímetro Minolta modelo Chroma meter CR-210, que caracteriza el color en forma de coordenadas tridimensionales en el sólido cromático CIE-lab (Figura II.4). Este sistema de medición proporciona los parámetros cromáticos L* a* b* y la diferencia entre los valores iniciales y los valores después del tratamiento permiten calcular la variación global en el color (Ecuaciones II.3, 4 y 5): • ΔL*=L*t-L*o Ec II.3 que aporta información sobre un cambio en la luminosidad. • Δa*=a*t-a*o y Δb*=b*t-b*o Ec II.4 que aporta información del cambio de tono. • ΔE*= (ΔL*2 + Δa*2+ Δb*2)1/2 Ec II.5 que mide la alteración cromática total. BLOQUE II. METODOLOGÍA DE TRABAJO 79 Figura II.4. Representación del CIE-Lab. El eje vertical 'L' representa la luminosidad, el eje horizontal 'a' es el rango rojo-verde y el eje horizontal 'b' el rango amarillo-azul. Fuente: Naturpixel.com Si ΔE* es igual a cero significa que no se ha producido ningún cambio de color entre la muestra y la superficie de referencia (en este caso, antes del tratamiento biocida). Es a partir de un E* mayor de 5 cuando se considera que existe un cambio significativo en el color (Delgado- Rodrigues y Grossi, 2007). 1.11 POROSIDAD Una manera de comprobar si el biocida ataca a la integridad de la piedra es calculando su porosidad abierta, la cual se conoce también como porosidad accesible o comunicada, y se define como el volumen de poros abiertos o comunicados entre sí y con el exterior (accesibles al agua normalmente) por unidad de volumen total de roca (Alonso Rodriguez, 2010). Esta porosidad presenta gran interés en la caracterización de geomateriales, ya que está relacionada con su capacidad de absorber de agua y su comportamiento frente al deterioro. La porosidad abierta se determina mediante técnicas experimentales, basadas en introducir un fluido en los poros y cuantificar su volumen. El procedimiento más común es el método de la saturación de agua a vacío. En dicho ensayo se saturan los poros con agua, normalmente al vacío para asegurar el llenado completo, y se obtiene la porosidad abierta “accesible al agua”. Para ello se sigue la norma UNE-EN 1936 (2007), realizando en las muestras pesadas tanto del peso seco, como del peso saturado e hidrostático antes y después de aplicarles los biocidas. Para medir la porosidad, se mide el peso seco de las muestras, luego se someten a vacío y se sumergen en agua desaireada durante 72 horas. Transcurrido este tiempo se toman el peso saturado y el peso hidrostático (sumergido en agua). Determinación de la porosidad abierta (PA): La porosidad abierta se calcula por medio de la relación (en porcentaje) entre el volumen de los poros abiertos y el volumen aparente de la probeta, mediante la Ecuación II.6: BLOQUE II. METODOLOGÍA DE TRABAJO 80 𝑃 = 𝑚𝑠− 𝑚𝑑 𝑚𝑠− 𝑚ℎ ·100 Ec II.6 P porosidad abierta (%) md masa de la probeta seca (g). ms masa de la probeta saturada (g). mh masa de la probeta sumergida (g). Tras la aplicación de los tratamientos biocidas y su completo secado se determina nuevamente la porosidad. 1.12 VELOCIDAD DE PROPAGACIÓN DE ULTRASONIDOS La velocidad de trasmisión de ultrasonidos en un material está relacionada directamente con la compacidad del mismo, por lo que es una técnica que se utiliza para obtener indirectamente una medida de las características mecánicas del mismo o para detectar la presencia de discontinuidades y defectos internos. El ensayo se puede realizar de distintas formas; dependiendo de la forma de emisión y recepción de las ondas puede clasificarse como método de reflexión por eco o método de transmisión o transparencia. Este último procedimiento es el más utilizado, se trabaja con un emisor y un receptor a frecuencias bajas, para conseguir una atenuación lo suficientemente pequeña y un mayor alcance de los impulsos ultrasónicos en el material (Villegas, 1989). Para la realización de este estudio se dispuso de un equipo STEINKAMP BP5 (KRAUFTKRAMER) de escala entre 0,1 y 999,9 microsegundos, cuya precisión es de ±1 microsegundo. El equipo incluye dos parejas de palpadores distintos, cónicos y cilíndricos que contienen cristales piezoeléctricos de circonato de plomo-titanio y cuya frecuencia de trabajo es de 20 a 500 KHz. La velocidad de pulso en el elemento sobre el que se va a realizar la medición se expresa como (Ecuación II.7): 𝑉 = 𝑑 𝑡 Ec II.7 V velocidad (m/s). d distancia recorrida entre palpadores (m). t tiempo de transmisión de la señal (s). 1.13 DUREZA SUPERFICIAL La dureza es la resistencia que ofrece un material a ser penetrado por elementos de distinta morfología. La dureza aumenta con la densidad de la madera. Para la madera existen tres métodos de medir la dureza: el ensayo Brinell, el ensayo Janka y el ensayo Monnin o Chaláis- Meudon. El ensayo de dureza Brinell está basado en la aplicación de una carga concentrada en un punto. La carga se aplicará durante unos 8-10 segundos en una punta que incidirá sobre la superficie del material. Esta punta tiene forma de bola de 5mm de diámetro y la escala que se utiliza es la Brinell. Tras la aplicación de la carga el equipo mide la profundidad de penetración de la bola en la probeta y proporciona el valor de la dureza como el cociente entre la fuerza aplicada entre el área resultante de la penetración. BLOQUE II. METODOLOGÍA DE TRABAJO 81 2. METODOLOGÍA DE CARACTERIZACIÓN DE MATERIALES 2.1 MATERIALES PÉTREOS Los estudios de identificación y caracterización de los materiales pétreos o geomateriales, tanto la piedra natural como otros tipos de materiales manufacturados (morteros, yeserías, revestimientos, enlucidos, ladrillos), así como los productos de alteración físico-químicos observados sobre ellos (eflorescencias, concreciones, etc.), incluyen distintas técnicas de análisis petrológico (DRX, MOP, SEM-EDX). La difracción de rayos X (DRX) es una técnica que permite la identificación de los compuestos cristalinos (minerales) presentes en la muestra en estudio. La microscopía óptica de polarización (MOP) permite identificar minerales mayoritarios y minoritarios en una muestra mediante sus propiedades ópticas. Para la observación de los materiales con esta técnica se requiere la preparación de láminas delgadas obtenidas por corte y métodos de abrasión hasta alcanzar un espesor de 30 μm. Mediante la microscopía electrónica de barrido con EDX (SEM-EDX) se pueden observar las muestras a mayores aumentos que con microscopio óptico y, en combinación con los datos obtenidos mediante MOP, permite el estudio puntual de algunas estructuras cristalinas en detalle. Además se identifica la composición química elemental empleando la espectroscopía de energía dispersiva de rayos X acoplada al microscopio (SEM-EDX). Se ha utilizado en algunas muestras puntuales el equipo JEOL modelo JSM-5600 LV con espectrometría de energía dispersiva de rayos X INCA X-sight. Para poder ser analizadas las muestras deben cumplir el requisito de ser conductoras, por este motivo se metalizaron con carbón. 2.2 MATERIALES DE ORIGEN BIOLÓGICO: MADERA Y CUERO MADERA La madera es un material orgánico natural con estructura celular, que tiene muy buenas características para su empleo como material estructural, por lo que se ha usado desde los inicios de la civilización. La identificación taxonómica de las maderas se ha llevado a cabo mediante el estudio de sus características macroscópicas y de su anatomía microscópica La identificación de las especies de madera se ha realizado mediante técnicas de microscopía estereoscópica y microscopía óptica. Para ello, fue necesario tomar micromuestras del orden de 3-5 mm3, en las que se estudió también el grado de biodeterioro que poseían. Se practicaron cortes transversales y longitudinales en las muestras mediante un micrótomo de deslizamiento, el cual permite la realización de láminas muy finas (del orden de 20-30 µm), y, en ocasiones, manualmente mediante el uso de una hoja de cuchilla de uso industrial, obteniendo láminas lo suficientemente delgadas para la observación e identificación al microscopio óptico con luz transmitida. Se estudiaron las tres secciones de la madera: transversal (perpendicular al eje longitudinal del árbol), longitudinal tangencial (paralela a un plano tangente al anillo de crecimiento) y longitudinal radial (que pasa por el eje longitudinal del árbol e incluye a uno o varios radios leñosos). Para la identificación de especies se han utilizado criterios morfológicos de identificación de madera, por lo que las muestras se visualizaron al microscopio óptico y, posteriormente, se BLOQUE II. METODOLOGÍA DE TRABAJO 82 utilizó una clave taxonómica para su determinación. (García Esteban et al., 1996; García Esteban et al., 2003; Peraza, 1964; Schoch et al., 2004; Schweingruber, 1990a; Schweingruber, 1990b). Además de las maderas que forman parte de los bienes culturales en estudio, en este trabajo se han ensayado probetas de cuatro tipos: pino, olmo, cedrela y roble, todas ellas maderas habitualmente usadas en patrimonio histórico. CUERO El estudio de los cueros empleados en las pinturas de la Sala de los Reyes de la Alhambra se llevó a cabo mediante diferentes ensayos que permitieron determinar el pH y el tipo de curtido utilizado así como su estado de conservación y, por último, identificar el animal de procedencia. La medida del pH se ha realizado sobre un extracto acuoso de los cueros. Dicho extracto está definido internacionalmente como 5 g de cuero en 100 ml de agua destilada (Norma UNE-EN ISO 4044). Dado que ninguna de las muestras contiene la cantidad de cuero necesaria, los extractos se han realizado con 0,25 g de cuero y 5 ml de agua destilada, manteniendo la proporción. Se cortaron mediante cuchilla 0,25 g de fragmentos de cuero a modo de virutas (ver Figura II.5). Se le añadieron 5 ml de agua destilada y se tuvieron en agitación mecánica durante 6 horas. Se determinó el valor de pH de los extractos mediante pHmetro convencional con electrodo de vidrio. (UNE-EN ISO 4044; UNE-EN ISO 4045:1999). Figura II.5. Muestras de cuero cortadas en forma de virutas en vasos de precipitado. Para la determinación del tipo de curtido, se realizaron diferentes análisis. Teniendo en cuenta diversos estudios previos existentes (Sánchez Romero, 2007), se parte de la hipótesis de que el curtido de la piel se ha realizado con alumbre (sulfato doble de aluminio y potasio). No obstante, al tratarse de distintas muestras, se han llevado a cabo ensayos para determinar si el curtido se ha realizado con taninos vegetales, además de con alumbre, así como estudios mediante microscopía electrónica de barrido y microanálisis por energía dispersiva de rayos X (SEM/EDX). (UNE 59021/1988). El ensayo de determinación de taninos vegetales en extracto acuoso está basado en la especificidad de la gelatina por los taninos. Las soluciones de taninos precipitan una solución de gelatina al 1% que contenga un 10% de cloruro sódico. Por tanto debe prepararse una solución de extracto de las muestras de cuero en agua destilada, cortándolo en virutas y manteniéndolo 6 horas en agitación magnética. Posteriormente, se vierte la solución del extracto de cuero sobre la mencionada solución de gelatina. El ensayo de determinación de taninos condensados (un tipo de taninos vegetales) se basa en la sensibilidad de los taninos a la oxidación, especialmente en medio ácido. Al calentarlos en medio BLOQUE II. METODOLOGÍA DE TRABAJO 83 ácido, dan color rojo por la formación de antocianidinas, y un precipitado de flobofeno también de color rojo. Se preparó una disolución de ácido clorhídrico al 5% en agua destilada, en la que se introdujo el cuero objeto de estudio cortado a modo de virutas y se calentó a 100 ºC en placa calefactora con agitación magnética. El estudio mediante microscopía electrónica de barrido y microanálisis por energía dispersiva de rayos X (SEM/EDX) proporciona un análisis elemental de gran utilidad para determinar el tipo de curtido. Una pequeña parte de cada muestra de cuero fue embutida en una resina y cortada perpendicularmente para obtener su sección transversal. Dichas secciones fueron convenientemente preparadas para analizarlas al microscopio electrónico. Dado que el análisis químico por EDX es muy puntual, se realizaron varios análisis por zona para obtener resultados más representativos. La presencia de azufre, aluminio y potasio indica que el curtido fue realizado con alumbre. Para la determinación de la especie de la que procede el cuero, se recurrió al estudio morfológico mediante la observación de la disposición de los folículos pilosos al estereomicroscopio y al análisis de ADN antiguo mediante extracción del ADN. 2.3 MATERIALES PICTÓRICOS Para el estudio de capas pictóricas ha sido necesario realizar una extracción de micromuestras de los diferentes elementos pictóricos de los inmuebles en estudio. Para realizar dicha extracción es necesario hacer una incisión lo más profunda y vertical posible, con el fin de conseguir todas las capas o estratos de pintura. Las muestras se toman aprovechando siempre el craquelado, lagunas, grietas, zonas ocultas o bordes y evitando siempre la extracción en zonas comprometidas para el mensaje de la obra. En la elección de los puntos de muestreo se intentó compaginar siempre el hecho de la representatividad de la muestra con su situación en lugar no estratégico. Con objeto de efectuar el estudio estratigráfico de capas pictóricas, los pequeños fragmentos de pintura se han embutido en una resina de metacrilato y se han desbastado y pulido perpendicularmente hasta obtener la sección transversal (estratigrafía). En estas secciones se han analizado las diferentes capas pictóricas e identificado los materiales presentes mediante la siguiente metodología: - Examen preliminar con el microscopio estereoscópico. - Observación al microscopio óptico con luz reflejada de las estratigrafías, con el fin de determinar la secuencia de estratos así como el espesor de los mismos. - Estudio al microscopio electrónico de barrido (SEM) y microanálisis elemental mediante energía dispersiva de Rayos X (EDX) de las estratigrafías, para la determinación de la composición elemental de los pigmentos y cargas. - Espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR por transmisión y FTIR-ATR) y Cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) para la determinación de compuestos orgánicos. BLOQUE II. METODOLOGÍA DE TRABAJO 90 Criterios específicos (para biocidas):  Gran poder biocida en bajas concentraciones  No debe modificar ninguna de las características de los materiales constitutivos a tratar.  Si está prevista una desinfección a largo plazo, el producto debe ser poco volátil.  No debe producir compuestos secundarios nocivos.  No debe poder ser neutralizado por ninguno de los componentes de otro tipo de tratamientos.  Sus propiedades no deben verse alteradas por la acción del agua.  Baja toxicidad para el ser humano.  Su composición química y propiedades deben ser conocidas.  Bajo riesgo de contaminación ambiental. Los biocidas se encuentran regulados a nivel Europeo por la Directiva 98/8/CE del Parlamento Europeo y del Consejo de 16 de enero de 1998 relativa a la comercialización de biocidas, transpuesta al ordenamiento jurídico mediante el Real Decreto 1054/2002 de 11 de octubre, por el que se regula el proceso de evaluación para el registro, autorización y comercialización de biocidas. Esta normativa se refiere a:  La autorización y puesta en el mercado de biocidas en los Estados miembros.  El reconocimiento mutuo de las autorizaciones en la Comunidad.  El establecimiento a nivel comunitario de una lista de sustancias activas que pueden utilizarse en los biocidas. La inclusión de una sustancia activa en las listas así como la autorización y puesta en el mercado de los productos biocidas están condicionadas a una evaluación previa de los riesgos para la salud y el medio ambiente derivados de su utilización. Los biocidas usados en este estudio han sido de dos tipos. Por un lado, se han ensayado productos alguicidas, que son compuestos de amonio cuaternario (ver figura II.8). Las ventajas con las que cuentan este tipo de producto es su efectividad a bajas concentraciones, ausencia de olor y color, alta estabilidad y su doble acción biocida y detergente. Las desventajas son la baja actividad a largo plazo y que no matan a las esporas. Además, su actividad se ve reducida ante la presencia de sales o de cationes (Caneva et al., 2000). Estos biocidas son empleados con asiduidad en restauración (De los Ríos et al., 2012; http://geiic.com). (Ver anexos, fichas de seguridad de los biocidas). Por otro lado, se han utilizado fungicidas para el caso de los materiales orgánicos afectados fundamentalmente por hongos (mohos y hongos de pudrición). Se han ensayado azoles y nanocompuestos. Por último, se ha estudiado también la posible interferencia con la aplicación de otros tratamientos a emplear en la intervención en los sustratos o soportes y en las pinturas. Así, en este estudio se han tratado distintos tipos de madera con biocidas y consolidantes para ver sus efectos en las características del material, así como su eficacia y durabilidad (Figura II.9). Las características de los productos se describen a continuación: BLOQUE II. METODOLOGÍA DE TRABAJO 91 BIOCIDAS Preventol Ri80 Es un preparado concentrado líquido de sales de amonio cuaternario con amplio espectro de actividad contra hongos, bacterias y algas. Se emplea para la producción de soluciones acuosas en concentraciones variables del 2 al 10% para desinfección de materiales pétreos, madera, cerámica, etc. Corrosivo y Peligroso para el medio ambiente. El Preventol Ri80 empleado en el estudio está disuelto al 2% en agua. El método de aplicación ha sido mediante pincel o por inmersión, dependiendo del tipo de ensayo. Características fisicoquímicas: - Principio activo: Cloruro de Alquildimetilbenzilamonio, dipropilenglicolmetileter - Aspecto: Líquido, incoloro a color amarillo, olor similar a almendra. - Densidad: 0,97 kg/L a 20 OC. - pH: 7 – 9. New Des 50 Es una sal de amonio cuaternario diluida, efectiva frente a bacterias, hongos, algas y líquenes. En el presente estudio se ha empleado disuelto al 2% en agua. El método de aplicación ha sido mediante pincel o por inmersión, dependiendo del tipo de ensayo. Características fisicoquímicas: - Principio activo: Cloruro de N,N-didecil-N,N-dimetilamonio al 50% en solución acuosa - Aspecto: Líquido transparente, de incoloro a color amarillo, inodoro - Densidad: 0,92 g/ml a 20 ºC. - pH: 6,5 – 8,0. Biotin T Es un concentrado que debe diluirse en agua entre el 1-3% y según la tipología y la naturaleza del biodeterioro. Se usa para la preservación y la reparación de la contaminación microbiológica de superficies con materiales como piedras, morteros y estucados, frescos, granitos, etc. Se diluye en alcohol e hidrocarburos aromáticos, pero no en acetona, hidrocarburos alifáticos ni clorados. Entre sus inconvenientes se encuentra que, debido a la presencia de la sal de amonio, deben evitarse los tensoactivos aniónicos y las aguas demasiado duras. Para diluir BIOTIN T debe de usarse siempre agua desmineralizada, en cuanto la dureza de las aguas de red puede llevar a la reducción de la eficacia. El Biotin T empleado está disuelto al 2% en agua destilada. El método de aplicación ha sido mediante pincel o brocha o por inmersión, dependiendo del tipo de ensayo. Características fisicoquímicas: - Principio activo: 2-octil-2H-isotiazol-3-ona (OIT), sales de amonio cuaternario (Cloruro de didecildimetilamonio), 2-propanol y ácido fórmico - Aspecto: Líquido, transparente de incoloro a color amarillento, olor de alcohol. - Densidad: 0,938 kg/L a 20 ºC. BLOQUE II. METODOLOGÍA DE TRABAJO 92 Biotin R Compuesto por dos moléculas, la IPBC (yodopropinilbutilcarbamato) y la OIT (N- octilisotiazolinona), las dos con una solubilidad baja en agua (156 ppm y 480 ppm). Es un concentrado que debe diluirse al 3-5% dependiendo del biodeterioro. Puede disolverse en la mayor parte de los disolventes orgánicos (acetona, “whitespirit” y disolventes aromáticos). Tiene alto poder bactericida y antifúngico. Debido a su baja solubilidad en agua se utiliza para el exterior, o para aquellos casos en interiores con materiales sensibles al agua, como por ejemplo piedra o pintura mural con sales que puedan aflorar a la superficie después de un tratamiento acuoso o para madera o pintura. En el estudio se ha empleado Biotin R disuelto al 3% en alcohol isopropílico. El método de aplicación ha sido mediante pincel o por impregnación, dependiendo del tipo de ensayo. Características fisicoquímicas: - Principio activo: 2-(2-butoxietoxi) etanol, 3- yodo-2-propinilbutilcarbamato, 2-octil-2H-isotiazol- 3-ona (OIT) - Aspecto: Líquido, transparente y color amarillento, olor leve. - Densidad: 1,067 kg/L a 20 oC. Figura II. 8. Productos biocidas, A: Preventol Ri80, B: New Des 50, C: Biotin T, D: Biotin R. Voriconazol Es un compuesto antifúngico de amplio espectro, del grupo de los derivados triazólicos. Actúa eliminando o impidiendo el crecimiento de los hongos que provocan infecciones. Se emplea en la industria farmacéutica. Inhibe la 14-alfa-esterol desmetilasa fúngica, enzima esencial en la biosíntesis de ergosterol. Fungicida frente a Aspergillus, Scedosporium o Fusarium. Nombre (IUPAC) sistemático: (2R,3S)-2-(2,4-difluorofenil)-3-(5-fluoropirimidin-4-il) -1-(1,2,4- triazol-1-il)butan-2-ol Fórmula: C16H14F3N5O BLOQUE II. METODOLOGÍA DE TRABAJO 93 Tiabendazol Es un fungicida sistémico de amplio espectro del grupo de los Bencimidazoles, que puede ser utilizado para tratamientos preventivos y/o curativos. Puede aplicarse mediante aspersión o inmersión. Usado como producto fitosanitario, como conservante en la industria alimentaria. Se absorbe por raíces y hojas e impide la mitosis al unirse a la tubulina, por lo que se altera el crecimiento del hongo. Nombre sistemático: 2-(4-Tiazolil) benzimidazol Fórmula: C10H7N3S Nano Óxido de cobre Las nanopartículas de cobre y de óxido de cobre, se sintetizan, como la mayoría de metales a escala nanométrica, a partir de reacciones redox en disolución. Ambos productos, las nanopartículas de cobre y las nanopartículas de óxido de cobre, poseen una apariencia rojiza cuando se presentan en estado sólido. Durante los últimos años, los estudios de eficacia antimicrobiana en distintas superficies de contacto han demostrado claramente que el cobre y ciertas aleaciones de cobre inactivan fácilmente varios de los tipos más potentes de microbios (Fages Santana, 2013). En base a sus propiedades antifúngicas, las nanopartículas de cobre encuentran aplicación como aditivo de matrices poliméricas, pinturas, barnices, etc. Nano Óxido de Zinc Nanopartículas que poseen efectos microbicidas, hechas a base de óxido de zinc. Estos nuevos biocidas inorgánicos no causan efectos adversos en la salud o el medioambiente y no crean problemas de resistencia antimicrobiana. Su aplicación estaría en sectores como sistemas de purificación del agua, entorno médico, envases de alimentos o productos textiles. Nano Dióxido de Titanio El dióxido de titanio es un material semiconductor, con propiedades fotocatalíticas. El dióxido de titanio al ser expuesto a la luz reacciona de la siguiente manera: los fotones con igual o mayor energía que el hueco existente entre las bandas de conducción y de valencia del material son absorbidos por el material, excitando electrones procedentes de la capa de valencia. Estos electrones reaccionan con las moléculas de oxígeno presentes en el aire, favoreciendo la formación de radicales oxígeno, los cuales actúan como agente oxidante. Los radicales oxígeno pueden romper cadenas carbonadas mediante reacciones de oxidación-reducción, es decir, los compuestos orgánicos (suciedad, microorganismos, etc.) son transformados en dióxido de carbono y agua por estos radicales oxígeno. El dióxido de titanio se produce en dos formas. La forma principal, que comprende más del 98 por ciento de la producción total, es el pigmento de dióxido de titanio. La forma pigmentaria hace uso de las excelentes propiedades de dispersión de la luz del dióxido de titanio en aplicaciones que requieren brillo y opacidad de blanco. La otra forma en la que se produce el dióxido de titanio es como un producto ultrafino (nanomaterial). Esta forma se selecciona cuando se requieren diferentes propiedades, como la transparencia y la máxima absorción de la luz ultravioleta, por ejemplo, en los protectores solares cosméticos, así como eficacia como un producto de protección contra los organismos fotótrofos en patrimonio histórico. BLOQUE II. METODOLOGÍA DE TRABAJO 94 CONSOLIDANTES Paraloid B-72 El Paraloid B-72 es una resina acrílica (metilacrilato-etilmetacrilato) sólida, suministrada en forma de pequeñas esferas que disuelta en disolventes adecuados puede ser empleada como consolidante además de para usos tradicionales como adhesivo o fijativo. El Paraloid B-72 es soluble en varios tipos de disolventes:  Cetonas (acetona, etilmetilcetona)  Ésteres y éteres (acetato de etilo, acetato de butilo, cellosolve (2-etoxi etanol), dowanol PM (1-metoxi, 2 propanol), etc)  Hidrocarburos aromáticos (tolueno, xileno y mezclas como el disolvente nitro)  Hidrocarburos clorurados (cloruro de metileno, cloroetano) Es insoluble en agua y muy poco en alcohol etílico e hidrocarburos alifáticos. Los disolventes aconsejados, por su baja toxicidad, son acetona (que es muy volátil), acetato de butilo, en caso de que se requiera un bajo nivel aromático se aconseja dowanol PM. La solución se prepara normalmente con una concentración entre el 2% y el 10% de Paraloid B- 72. El disolvente se pone primero en el recipiente y mientras se agita, se le añade la resina hasta obtener una perfecta disolución. Un ligero aumento de la temperatura (hasta 50/60 ºC, compatible con el punto de ebullición del disolvente), favorece la solubilización. La aplicación de la solución de Paraloid B-72 sobre los objetos a consolidar puede hacerse con los sistemas normales usados para barnices como pulverización o brocha. Los mejores resultados se obtienen por inmersión lenta del objeto a consolidar en la solución. De ese modo el consolidante es absorbido por capilaridad del soporte poroso penetrando también en las partes más internas, consolidando el objeto de manera completa y uniforme. Para eliminar el exceso de resina en la superficie se aconseja siempre dar disolvente puro después de la aplicación, antes del secado. Esto reducirá el riesgo de formación de película y de efecto brillante. Regalrez 1126 Estudios recientes realizados sobre posibles sustitutos de las resinas naturales se han centrado en los polímeros de bajo peso molecular, y en particular en las resinas Regalrez, por sus buenas características de resistencia al envejecimiento y de reversibilidad (Clausi et al., 2011). Se trata de resinas alifáticas resultantes de la hidrogenación de los oligómeros obtenidos del viniltolueno y alfa-metil-estireno, es justamente con la hidrogenación con la que se estabiliza el producto, reduciendo los dobles enlaces que son los “puntos débiles” de las moléculas, desde donde parte el envejecimiento. Además, la resina no necesita disolventes aromáticos para disolverse, y puede disolverse en mezcla de hidrocarburos desaromatizados como el whitespirit D40 o la esencia de petróleo, característica que no poseen otras resinas acrílicas como el Paraloid B-72. El Regalrez 1126 no es soluble en agua y en disolventes polares como la acetona o los alcoholes. La consolidación que proporciona el Regalrez 1126 a la madera degradada es menor que la producida con el Paraloid B-72, pero puede ser suficiente para piezas que no necesiten un BLOQUE II. METODOLOGÍA DE TRABAJO 95 elevado refuerzo. Además, su uso puede ser preferible por las propiedades que posee este consolidante de elevada estabilidad y de facilidad de eliminación. La característica más interesante del Regalrez 1126 es la posibilidad de obtener soluciones con bajísima viscosidad, incluso con concentraciones de resina del 20%. Para obtener una solución de excepcional penetración, se puede diluir Regalrez 1126 en whitespirit D40 o en esencia de petróleo, en concentraciones variables entre el 10 y el 20%. Un tratamiento con Regalrez 1126 puede ir seguido de un tratamiento con Paraloid B-72. Figura II.9. Tratamientos aplicados. 4.3 ENSAYOS DE EFECTIVIDAD La eficacia de cualquier tipo de tratamiento se determina a través de la medida de alguna característica que sea significativa del objetivo que se quiere conseguir. A la hora de estudiar la eficacia biocida hay que tener en cuenta que esta va a depender de diversas variables (Warscheid, 2000), tales como: -La especie biológica a tratar. -El tipo de material sobre el que se aplica. -La presencia de materiales orgánicos o contaminantes en la superficie. -El disolvente usado. -El método de aplicación del biocida. -La duración del tratamiento -Las condiciones ambientales (clima, iluminación, temperatura…) La eficacia de los distintos tratamientos se ha estudiado mediante inspección visual de los organismos en distintos intervalos de tiempo. Se han aplicado una serie de tratamientos biocidas in situ y, posteriormente, se han tomado muestras de estas zonas tratadas que se han estudiado en el laboratorio mediante observación de la interfase liquen-sustrato y otras estructuras biológicas por microscopía óptica y electrónica de barrido, estimación de la biomasa fotosintética mediante espectrometría UV-visible, etc. BLOQUE II. METODOLOGÍA DE TRABAJO 96 Para realizar un estudio comparativo de los productos ensayados, se realizaron diferentes ensayos en distintas zonas de la superficie y se analizó la eficacia de los biocidas frente al organismo que se quería eliminar utilizando como parámetro el grado de desaparición de dicho organismo. Los estudios realizados se describen a continuación. 4.3.1 Estudio de la vitalidad de microorganismos fotótrofos al microscopio óptico (OM) Para este ensayo, se aplicaron los distintos biocidas in situ sobre los organismos a eliminar y, posteriormente, se tomaron muestras para ser observadas al microscopio óptico con el fin de comprobar visualmente el efecto que estos productos provocaban en la vitalidad de las algas y cianobacterias, líquenes, hongos, etc. 4.3.2 Estudio de la interfase liquen-sustrato al microscopio electrónico de barrido (SEM-EDX) Para estudiar la eficacia comparativa de los biocidas ensayados sobre las especies biológicas, se tomaron pequeñas muestras de sustrato colonizado por líquenes. Estas muestras se dispusieron de manera oportuna de tal manera que la superficie liquénica quedara en contacto directo con el biocida, durante 30 minutos. El objetivo era simular las papetas, impregnadas del producto, que se aplican comúnmente en restauración a la hora de eliminar líquenes crustáceos, tarea bastante difícil debido a la fuerte adhesión que presentan con el sustrato. Al microscopio electrónico de barrido (SEM) se observaron la características de las hifas de los líquenes, correspondientes a su parte fúngica, como método para determinar la eficacia de los productos estudiados. La observación de este material biológico al SEM requiere llevar a cabo un proceso de fijación de la muestra que evita que las células se colapsen, es decir, que mantiene las estructuras turgentes. Por ello, las muestras, antes de la metalización, fueron fijadas y deshidratadas con el fin de evitar modificaciones morfológicas irreversibles (ver apartado 1.3). Una vez realizada esta preparación, se puede observar la interfase del liquen con el sustrato pétreo, previamente tratado, y ver en qué medida afecta el biocida a las hifas del liquen. Las muestras tratadas con los distintos biocidas se compararon con la muestra control tratada con agua destilada. 4.3.3 Estimación de biomasa fotosintética por espectrofotometría UV-visible. Una forma de analizar la efectividad de los biocidas es comparando la cantidad de biomasa antes y después de su aplicación. La cantidad de biomasa se mide indirectamente mediante la cantidad de clorofila presente gracias a la espectrofotometría UV-Visible. Para ello, se realiza la extracción de clorofila  con dimetilsulfóxido (DMSO) tras la aplicación de los biocidas y se compara con la de un blanco, en el que se aplica agua destilada. Para poner a punto esta metodología era necesario estudiar cuál era la relación óptima del volumen de extractante con la cantidad de biomasa. Para comprobar en qué medida afecta la cantidad de DMSO en la extracción de la clorofila, se llevaron a cabo dos extracciones por cada muestra, una con un volumen de extractante de 50ml y otra con uno de 100ml. Estos ensayos previos se realizaron en la superficie de un ladrillo 14cm x 28cm cubierto de biomasa fotosintética, proveniente del suelo de los jardines del Instituto Andaluz del Patrimonio Histórico. Se preparó una zona de estudio con cuadrados de superficie 4cm2 y cada tratamiento biocida se aplicó en dos de ellos, además de las muestras sin tratar (blanco) (Figura II.10). BLOQUE II. METODOLOGÍA DE TRABAJO 97 Figura II. 10. Esquema seguido en la aplicación de biocidas. El procedimiento seguido para la puesta a punto del método fue el siguiente: 1. Aplicación de los tratamientos biocidas con pincel. Al cabo de una semana se recogen las muestras de la superficie pétrea de manera mecánica y con cuidado de arrastrar el mínimo sustrato posible, pesándolas. 2. Extracción de la clorofila. Para cada tratamiento biocida, a una de las muestras se le añaden 50 ml de DMSO y a la otra 100 ml. De manera que se obtienen 5 muestras con 50 ml de DMSO y otras 5 con 100 ml del solvente. Se calienta a 65 oC durante 1 hora y se filtra con filtros ALBET 145 el tiempo necesario. 3. Cuantificación de la clorofila. Para calcular la cantidad de clorofila  presente en una muestra se utiliza la fórmula de Wollemweider, la cual requiere de mediciones de absorbancia. El procedimiento para medir la clorofila  es el siguiente:  Medir absorbancia del extracto obtenido a 665 nm y 750 nm.  Acidificar con HCl en la relación: 5 µl HCl / 1 ml muestra.  Esperar 10 minutos y volver a medir absorbancia a 665 nm y 750 nm.  Aplicar la fórmula de Wollemweider según la Ecuación II.8 (Aira, 2007): masa Clorofila  (µg) = 28'917 * V *(ΔAbs – ΔAbs’) / L Ec. II.8 V Volumen del extractante usado ΔAbs (Abs665 – Abs750) antes de acidificar ΔAbs’ (Abs665’ – Abs750’) después de acidificar L longitud de la cubeta de medida en centímetros. Normalmente es 1 cm. Tras evaluar el efecto que la cantidad de volumen de DMSO produce en la extracción de clorofila, comparando resultados con 50 ml y 100 ml de este extractante, se obtienen los resultados mostrados en la Tabla II.2. Se observa que, modificando solo el volumen de extractante, los resultados no son fiables. Es necesario relacionar la cantidad de DMSO con la cantidad de biomasa de la muestra. Se considera que aplicar 2 ml DMSO/mg de muestra es lo más oportuno, es decir, el volumen del extractante es diferente en cada caso. Por lo tanto, por cada mg de muestra biológica, previamente triturada, se le añaden 2 ml de DMSO. BLOQUE II. METODOLOGÍA DE TRABAJO 98 Tabla II.2. Estudio de la influencia del volumen de DMSO en el cálculo de clorofila  para evaluación de efectividad biocida. Muestra V DMSO A665 A750 Abs A’665 A’750 Abs’ Abs- Abs’ g Chl Preventol Ri80 50 ml 0,0746 0 0,0746 0,0554 0,0158 0,0396 0,035 50,60 100 ml 0,0683 0 0,0683 0,0781 0,0621 0,016 0,0523 151,24 New Des 50 ml 0,1641 0,0054 0,1587 0,0759 0 0,0759 0,0828 119,72 100 ml 0,1221 0,0105 0,1116 0,0636 0,0073 0,0563 0,0553 159,91 Biotin T 50 ml 0,1481 0,0056 0,1425 0,0825 0,0039 0,0786 0,0639 92,39 100 ml 0,1262 0 0,1262 0,062 0,0018 0,0602 0,066 190,85 Biotin R 50 ml 0,1511 0 0,1511 0,07 0,0014 0,0686 0,0825 119,28 100 ml 0,0563 0 0,0563 0,0213 0 0,0213 0,035 101,21 Agua destilada 50 ml 0,3194 0,0116 0,3078 0,1538 0,0119 0,1419 0,1659 239,87 100 ml 0,1719 0 0,1719 0,0769 0 0,0769 0,095 274,71 4.3.4 Capacidad de eliminación o reducción del crecimiento de especies de hongos filamentosos y de pudrición. Para comprobar la eficacia de los biocidas para la eliminación de los hongos filamentosos y de pudrición se ha realizado el siguiente estudio. Se han inoculado probetas, de distintas especies de madera, con una suspensión de microorganismos procedentes de maderas constituyentes de dos de los bienes culturales objeto de estudio, las bóvedas de la Sala de los Reyes de la Alhambra de Granada y el trasdós de la cúpula central de la Maqsura de la Mezquita de Córdoba. Dichas muestras de madera han permanecido en desecador a una humedad relativa del 90%, controlada por medio de una disolución saturada de cloruro de bario, lo que ha favorecido la aparición y desarrollo de hongos de pudrición y hongos filamentosos. Las muestras de madera de la Alhambra estuvieron en el desecador durante siete años y las de la Mezquita durante un año. Se han realizado dos estudios: uno de carácter preventivo, con aplicación de los biocidas previamente a la inoculación, cuyo propósito es estudiar el posible carácter preventivo de los mismos; y otro con aplicación de los biocidas tras la inoculación con especies fúngicas, para analizar su poder de erradicación. Identificación de hongos filamentosos y de pudrición. El primer paso es identificar las especies de hongos de pudrición y hongos filamentosos que han crecido en las muestras de madera de la Sala de los Reyes de la Alhambra. Para ello, estos hongos obtenidos se han cultivado en placas de Petri con un medio de Glucosa Sabouraud Agar durante siete días, en una cámara climática a 27 ºC (figura II.11). Así mismo, una de las placas de cultivo se ha mantenido a temperatura ambiente (aproximadamente 22 ºC), a una humedad relativa del 90%, durante el mismo tiempo. Para la identificación de las especies fúngicas se han usado diversas técnicas como la estereomicroscopía, la microscopía óptica y la microscopía electrónica de barrido. Además, para completar el estudio, estos microorganismos se identificaron mediante técnicas de biología molecular. BLOQUE II. METODOLOGÍA DE TRABAJO 99 Figura II.11 Crecimiento de hongos en placas de Petri para posterior identificación. Probetas de maderas de estudio. Se han empleado probetas de cuatro especies de maderas diferentes (Figura II.12), las previamente identificadas como Cedrela sp., Pinus sp., Quercus sp. y Ulmus sp., sin que hayan recibido ningún tipo de tratamiento previo. Figura II.12 Fotografía de las maderas en estudio. Eficacia de tratamientos biocidas. Carácter preventivo. En este estudio se ha analizado la eficacia de cuatro fungicidas diferentes: los azoles Voriconazol y Tiabendazol, y las nanopartículas de óxido de cobre (CuO) y óxido de zinc (ZnO). Las probetas de madera han sido tratadas con los biocidas y posteriormente inoculadas con una solución elaborada mediante agua esterilizada y la mezcla de las especies fúngicas encontradas. BLOQUE II. METODOLOGÍA DE TRABAJO 106 Durante el ensayo se controla el peso de las probetas en cada ciclo y se observa visualmente si aparecen alteraciones, como roturas, hinchazón, grietas, desprendimientos, etc. Figura II.19. Probetas de madera durante el ensayo de alteración: fases de humectación y secado. BIBLIOGRAFÍA BIBLIOGRAFÍA 327 AGAROSSI, G.; FERRARI, R.; DEL MONTE, M. (1984). La Basilica di St. Clemente: Studi sul biodeterioramento. Scientific Methodologies Applied to Works of Art: 52-56. AIRA, N. (2007). Pátinas oscuras sobre rocas graníticas: Génesis y composición. Universidade de Santiago de Compostela. Servizo de publicacións e intercambio científico. ALCALDE MORENO, M.; MARTÍN PÉREZ, A. (1996). Indicadores de alteración de los materiales pétreos. Propuesta de una terminología. Boletín del Instituto Andaluz del Patrimonio Histórico, 15: 68. ALCALDE, M.; VILLEGAS, R.; VALE, J.; MARTÍN, A. (1990). Diagnosis y Tratamiento de la Piedra. I. La alteración de la piedra en los monumentos. II. Consolidantes e hidrófugos. Productos para el tratamiento de materiales pétreos. ICC E. Torroja (CSIC), Monog. nº 400, Madrid. 87 pp. ALEJANDRE, F.J.; VILLEGAS, R. (2009). Estudio de la alterabilidad y efecto de tratamientos de conservación para los ladrillos de la portada de la iglesia de Santa María de Jesús (Sevilla). Materiales de Construcción. Vol. 59, 293: 85-103. ALLSOPP, D.; SEAL, K. (1986). Introduction to biodeterioration. Edward Arnold, London. ALLSOPP, D; SEAL, K; GAYLARDE, C. (2004). Introduction to biodeterioration. Cambridge University Press. ALONSO RODRÍGUEZ, F.J. (2010). Propiedades físicas: densidad y porosidad. Departamento de Geología (Petrología y Geoquímica). Universidad de Oviedo. ÁLVAREZ, F.; GONZÁLEZ, G.; GUZMÁN, R.; MOHAMED, S.; MERINO, S.; FIGUEROA, F. L. (2015). Utilización de distintas combinaciones espectrales e intensidades lumínicas de lámparas LEDs para el estudio de la actividad fotosintética en algas que pueden producir biodeterioro del Patrimonio Cultural. Estudio y Conservación del Patrimonio Cultural. Actas, Málaga: 179-183. AMADOR DE LOS RIOS J.; AMADOR DE LOS RIOS, R. (1879). Monumentos latino-bizantinos de Córdoba, (Madrid: 1879). ARIÑO, X.; ORTEGA-CALVO, J. J.; GÓMEZ-BOLEA, A.; SÁIZ-JIMÉNEZ, C. (1995). Lichen colonization of the Roman pavement at Baelo Claudia (Cádiz, Spain): biodeterioration vs. bioprotection. The Science of the Total Environment, 167: 353-363. ASCASO, C.; OLLACARIZQUETA, M. A. (1991). Structural relationship between lichens and carved stonework of Silos monastery, Burgos, Spain. International Biodeterioration, 21: 337-349. ASCASO, C.; WIERZCHOS, J.; SOUZA-EGIPSY, V., DE LOS RÍOS, A.; DELGADO RODRIGUEZ, J. (2002). In situ evaluation of the biodeteriorating action of microorganisms and the effects of biocides on carbonate rock of the Jerónimos Monastery (Lisbon). International Biodeterioration and Biodegradation, 49: 1-12. ASCASO. C.; GARCÍA DEL CURA, MA.; DE LOS RÍOS, A. (2004). Microbial biofilms on carbonated rocks from a quarry and monuments in Novelda (Alicante, Spain). In: L.L. St. Clair, M.R.D. Seaward (Eds.). Biodeterioration of stone surfaces. Lichens and biofilms as weathering agents of rocks and cultural heritage, 79-98. Dordrecht: Kluwer Academic Press. BIBLIOGRAFÍA 328 ASHURST, J. 1998. The cleaning and treatment of limestone by the lime method. In Conservation of Building and Decorative Stone, ed. J. Ashurst and F. G. Dimes, vol. 2, 169-76. Butterworth- Heinemann Series in Conservation and Museology. London and Boston: Butterworth-Heinemann. BAGLIONI, R. (2014). Las Pinturas de la Sala de los Reyes: Preparación de probetas para el ensayo de los productos de tratamiento. Informe IAPH. BARCELLONA-VERO, L.; BETTINI, C.; MONTE SILA, M. (1976). Chemoautotrophic microorganisms in semi-insulated environment. Proceedings of 2nd International Symposium on the Deterioration of Building Stones, Athens, 61-65. BARCELLONA-VERO, L.; TABASSO LAURENZI, M. (1982). La fontana del Tritone di L. Bernini a Roma: Un esempio di alterazione legato a fattori chimici, biologici e ambientali. Deterioration and Preservation of Stone, Proceeding of the 3rd International Congress: 511-516. BARIDON, M.A. (2012). Métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicos. Laboratorio de Virología y Biología Molecular. HIGA Rossi La Plata. BARQUÍN SAINZ DE LA MAZA, P.; TERRÓN ALFONSO, A. (1997). Lichen communities in the cathedral of Leon. Aerobiologia 13: 191-197. BARTOLINI, M.; PIETRINI, A.M.; RICCI, S. (2007). Valutazione dell’eficacia di alcuni nuovi biocidi per il tratamento di microflora fotosintética e di briofite su materiali lapidei. Bolletino ICR. Nuova Serie 14, 101-111. BERNIS MATEU, J. (1974). Principales insectos xilófagos de la Península. Reconocimiento y prevención. De re restauratoria, vol. 2. IV y V cursos de conservación y restauración de monumentos y ambientes. Universidad Poliltécnica de Barcelona, Barcelona. BLANCA, G.; CABEZUDO, B.; CUETO, M.; FERNÁNDEZ LÓPEZ, C.; MORALES TORRES, C. (2009, eds.). Flora Vascular de Andalucía Oriental, 4 vols. Consejería de Medio Ambiente, Junta de Andalucía, Sevilla. ISBN obra completa: 978–84–92807–12–3. BLETCHLY, J. D. (1967). Insect and marine borer damage to timber and woodwork. Recognition, prevention and erradication. Her Majesty's Stationery Office, London. BLOOM, J.M. (1988). The Revival of Early Islamic Architecture by the Umayyads of Spain, The Medieval Mediterranean. Cross-Cultural Contacts, Minnesota: 35-41. BOLÍVAR, F.; SÁNCHEZ-CASTILLO, P.M. (1997). Biomineralization processes in the Fountains of the Alhambra (Granada, Spain). International Biodeterioration & Biodegradation: 205-215. BOLÍVAR, F.; SÁNCHEZ-CASTILLO, P.M. (1998). Biodeterioro del Patrimonio artístico por cianobacterias, algas verdes y diatomeas. Boletín del Instituto Andaluz del Patrimonio Histórico, 24: 52-53. CAI, Y.P.; WOLK C.P. (1990). Use of a conditionally lethal gene in Anabaena sp. strain PCC 7120 to select for double recombinants and to entrap insertion sequences. Journal of Bacteriology, 172(6):3138-3145. CÁMARA, B; DE LOS RÍOS, A; GARCÍA-DEL-CURA, M. A.; GALVÁN, V.; ASCASO, C. (2008). Biorreceptividad de las dolomías a la colonización fúngica. Materiales de construcción, 58: 289- 290. BIBLIOGRAFÍA 329 CÁMARA, B; DE LOS RÍOS, A; URIZAL, M; ÁLVAREZ DE BUERGO, M; VARAS, M.J; FORT, R; ASCASO, C. (2011). Characterizing the microbial colonisation of a dolostone quarr: Implications for Stone biodeterioration and response to biocide treatment. Microbial Ecology, 62: 299-313. CANEVA, G.; DE MARCO, G.; PONTRANDOLFI, M.A. (1993). Plant communities on the walls of Venosa castle (Basilicata, Italy) as biodeteriogens and bioindicators. Conservation of stone and other materials, 1: 263-270. (M.J.Thiel). Rilem, London. CANEVA, G.; NUGARI, M. P.; SALVADORI, O. (1994). La biologia nel Restauro. Nardini Editore, Firenze. CANEVA, G.; NUGARI M.P.; SALVADORI, O. (1996). Il controllo del degrado biologico. Nardini Editore , Firenze. CANEVA, G; NUGARI, M.P.; SALVADORI, O. (2000). La biología en la restauración. Editorial NEREA. CANEVA, G.; NUGARI, M.P.; SALVADORI, O. (2005). La biologia Vegetale per i beni culturali. Biodeterioramento e Conservazione. Nardini Editore , Firenze. CANEVA, G.; NUGARI, M.P.; RICCI, S.; SALVADORI, O. (1992). Pitting of marble Roman Monuments and the related microflora. 7th International Congress on Deterioration and Conservation of Stone: 521-530. CARRILLO-GONZALEZ, R.; MARTINEZ-GOMEZ, M.A.; GONZALEZ-CHAVEZ, M.D.A.; HERNANDEZ, J.C.M. (2016). Inhibition of microorganisms involved in deterioration of an archaeological site by silver nanoparticles produced by a green synthesis method. Science of the Total Environment, 565: 872-881. CASAS SICART, C.; SAIZ JIMÉNEZ, C. (1982). Los briofitos de la Catedral de Sevilla. Collectanea Botanica, 13 (1): 163-175. CIARALLO, A.; FESTA, L.; PICCIOLI, C.; RANIELLO, M. (1985). Microflora action in the decay of stone monuments. Vth International Congress on Deterioration and Conservation of Stone, Lausanne, 2: 607-615. CHINERY, M. (1977). Guía de campo de los insectos de España y de Europa. Omega, Barcelona. CLAUSEN, C.A.; YANG, V. (2007). Protecting wood from mould, decay, and termites with multicomponent biocide systems. International Biodeterioration & Biodegradation, 59: 20-24. CLAUSI, M.; CRISCI, G. M.; LA RUSSA, M. F.; MALAGODI, M.; PALERMO, A.; RUFFOLO, S. A. (2011). Protective Action agoinst fungal growth of two consolidating products applied to wood. International Biodeterioration & Biodegradation, 12: 28-33. CRISCI, G.M.; La Russa, M.F.; MALAGODI, M.; RUFFOLO, S.A. (2010). Consolidating properties of Regalrez 1126 and Paraloid B72 applied to Wood. Journal of Cultural Heritage 11: 304-308. CONTRERAS, R. (1875). Ligero Estudio sobre las pinturas de la Alhambra. Imprenta de S. Noguera a cargo de M. Martínez. Madrid. DANIELE, V.; TAGLIERI, G. (2010). Nanolime suspensions applied on natural lithotypes: The influence of concentration and residual water content on carbonatation process and on treatment effectiveness. Journal of Cultural Heritage 11 (1): 102–6. BIBLIOGRAFÍA 330 DE FILPO, G.; PALERMO, A.M.; RACHIELE, F.; NICOLETTA, F. P. (2013). Preventing fungal growth in wood by titanium dioxide nanoparticles. International Biodeterioration & Biodegradation, 85: 217-222. DE LOS RÍOS, A.; ASCASO, C. (2005). Contribution of in situ microscopy to current understanding of stone biodeterioration process. International Microbiology, 8: 181-188. DE LOS RÍOS, A; CÁMARA, B; WIERZCHOS, J; ASCASO, C. (2008). Diagnóstico de procesos de biodeterioro por combinación de microscopía in situ y técnicas de biología molecular. In: Saíz Jiménez y Rogelio Candelera (Eds). La investigación sobre Patrimonio Cultural: 183-195. DE LOS RÍOS, A.; CÁMARA, B; DEL CURA, M; A, RICO, V; GALVÁN, V; ASCASO, C. (2009). Deteriorating effects of lichen and microbial colonization of carbonate building rocks in the Romanesque churches of Segovia, Spain. Science of the Total Environment, 407: 1123-1134. DE LOS RÍOS, A.; PÉREZ-ORTEGA, S; WIERZCHOS, J; ASCASO, C. (2012). Differential effects of biocide treatments on saxicolous communities: Case study of the Segovia cathedral cloister (Spain). International Biodeterioration and Biodegradation, 67: 64-72. Elsevier. DE TAGLE, A. (2008). El papel de las ciencias en la preservación del patrimonio cultural: la situación en Europa. Bienes culturales: Revista del Instituto de Patrimonio Histórico Español, Nº 8: 27-36. DEL ROSAL PADIAL, Y.; BAENA, C.; HERNÁNDEZ MARINÉ, M.; ROLDÁN MOLINA, M. (2014). Phototrophic microorganism in the touristic cave of Nerja. Proceedings of International Congress on Cultural Heritage, Science and Technology, Seville: 71. DELGADO-RODRIGUES, J.; GROSSI, A. (2007). Indicators and ratings for the compatibility assessment of conservation actions. Journal of Cultural Heritage 8: 32-43. DOEHNE, E.; PRICE, C.A. (2010). Stone conservation. An overview of current research. 2nd ed. The Getty Conservation Institute. Los Angeles. 158 pp. DURRANT L.R. (1996). Biodegradation of lignocellulosic materials by soil fungi isolated under unaerobic conditions. International biodeterioration and biodegradation, 37: 189-195. DURRELL, L. W. (1959). Some Studies of Emericellopsis. Mycologia, 51, No. 1: 31-43. ELOSEGI, A; SABATER, S. (EDS) (2009). Conceptos y técnicas de ecología fluvial. Fundación BBVA. ERNIZ MADRAZO, C. (1982). Las pinturas de la Sala de los Reyes de la Alhambra de Granada: los asuntos, los trajes, las fechas. Cuad. Alhambra 18: 21–50. ESBERT, R.M.; ORDAZ, J.; ALONSO, F.J.; MONTOTO, M. (1997). Manual de diagnosis y tratamiento de materiales pétreos y cerámicos. Collegi d´Aparelladors i Arquitectes Técnics de Barcelona. 126 ESPINOSA, J; GUTIERREZ, F; VILLEGAS-SÁNCHEZ, R. (1996). Estudio de indicadores y mecanismos de alteración de los atauriques del muro de fondo del Salón Rico de Medinat Al-zahra. Córdoba. Actas del III Congreso Internacional de Rehabilitación del Patrimonio Arquitectónico. Congreso Internacional de Rehabilitación del Patrimonio Arquitectónico y Edificación: 530-533. Granada. BIBLIOGRAFÍA 331 ESPINOSA, J. (2015). Informe: Caracterización de materiales cerámicos de la portada de Niculoso Pisano del convento de Santa Paula (Sevilla). Área de Laboratorios. Instituto Andaluz del Patrimonio Histórico. EYSSAUTIER-CHUINE, S.; VAILLANT-GAVEAU, N.; GOMMEAUX, M.; THOMACHOT-SCHNEIDER, C.; FLECK, J.; FRONTEAU, G. (2015). Efficacy of different chemical mixtures against green algal growth on limestone: A case study with Chlorella vulgaris. International Biodeterioration & Biodegradation, 103: 59-68. FAGES SANTANA, E. (2013). Investigación de fibras de polipropileno aditivadas con nanopartículas de plata para la mejora de propiedades bioactivas en el sector textil. Tesis doctoral, Universitat Politècnica de Valencia. FANELLI, C.; FABRI, A.A.; RICCELLI, A.; CARPITA, A.; ROSSI, R. (2001). Effect of new synthetic antifungal compounds on the growth of fungi wich are responsable for paper deterioration. In: Metodi Chimici, Fisici e Biologici per la salvaguardia dei beni culturali, AICAT & GICAT, Roma: 105- 111. FAVERO-LONGO, S. E.; BENESPERI, R.; BERTUZZI, S.; BIANCHI, E.; BUFFA, G.; GIORDANI, P.; LOPPI, S.; MALASPINA, P.; MATTEUCCI, E.; PAOLI, L.; RAVERA, S.; ROCCARDI, A.; SEGIMIRO, A.; VANNINI, A. (2017). Species-and site-specific efficacy of commercial biocides and application solvents against lichens. International Biodeterioration & Biodegradation, 123: 127-137. FIGUEROA, F.L.; GUZMÁN, R.; ÁLVAREZ-GÓMEZ, F.; GONZÁLEZ, G.; MOHAMED, S.; CELIS PLA, P.; DEL ROSAL, Y., HERNÁNDEZ-MARINÉ, M.; MERINO, S. (2015). Procedimiento bio-óptico basado en los espectros de acción de la fotosíntesis y lámparas LEDs para el control del biodeterioro por biofilms de algas y cianobacterias. Estudio y Conservación del Patrimonio Cultural. Actas, Málaga: 174-178. FRANQUELO ZOFFMANN, M. L. (2008). Informe: Caracterización de materiales constitutivos de las pinturas sobre cuero de la Bóveda 2. Instituto Andaluz del Patrimonio Histórico. FRECKMAN, D.W; MANKAU, R; FERRIS, H. (1975). Nematode Community Structure in Desert Soils: Nematode Recovery. Journal of Nematology, 7(4): 343- 346. FRECKMAN, D.W. (1978). Ecology of anhydro-biotic soil nematodes. Dried biological systems. Academic Press, New York: 345- 357. FUENTES-GONZÁLEZ, P. (2013). Bóvedas de arcos entrecruzados entre los siglos X y XVI. Geometría, construcción y estabilidad. Tesis. Univ. Politécnica de Madrid. GALVÁN, V; DE LOS RÍOS, A; ASCASO, C. (2006): Reevaluating the cultural value of Segovia’s Romasnesque churchs. In: Fort, R, Álvarez de Buergo, M; Gómez Heras, M; Vázquez-Calvo, C. (Eds) Heritage, Weathering and Conservation, London: 305-310. Taylor and Francis. GARCÍA, S.; MARTÍN, A. (1996 a). Los organismos vivos como factores que contribuyen activamente al deterioro de nuestros monumentos. Boletín del Instituto Andaluz del Patrimonio Histórico, 14: 67-74. GARCÍA, S.; A. MARTÍN (1996 b). Metodología para la evaluación del estado de conservación de obras monumentales en piedra en relación a fenómenos de bioalteración. Boletín del Instituto Andaluz del Patrimonio Histórico, 16: 38-47. BIBLIOGRAFÍA 332 GARCÍA ESTEBAN, L., GUINDEO CASASÚS, A.; DE PALACIOS DE PALACIOS, P. (1996). Maderas de coníferas: anatomía de géneros. Fundación Conde del Valle de Salazar. GARCÍA MURILLO, S. (1995). Estudio de los procesos de bioalteración de la piedra en la catedral de Pamplona. Tesis Doctoral. Universidad de Navarra. Pamplona. GARCIA ORTEGA, R.; VALENTÍN RODRIGO, N. (1997). La cigüeña blanca y el Patrimonio Arquitectónico. Boletín del Instituto Andaluz del Patrimonio Histórico, 18: 26-32. GARCÍA-ROWE, J.; SAIZ-JIMÉNEZ, C. (1991). Lichens an bryophytes as agents of deterioration of building material in Spanish Cathedrals. International Biodeterioration, 28: 151-163. GARCÍA ROWE, J.; SÁIZ JIMÉNEZ, C. (1991). Colonización y alteración de la piedra por líquenes, briofitos y plantas superiores en las catedrales de Salamanca, Sevilla y Toledo. Jornadas sobre restauración y conservación de monumentos (1989-Madrid). Ministerio de Cultura. Dirección General de Bellas Artes y Archivos. Instituto de Conservación y Restauración de Bienes Culturales: 71-79. GAYLARD, C.C.; MORTON, L.H.G.; LOH, K.; SHIRAKAWA, M.A. (2011). Biodeterioration of external architectural paint films-A review. International Biodeterioration, 65: 1189-1198. GIACOBINI, C.; M. P. NUGARI; M. P. MICHELI; B. MAZZONE; M. R. D. SEAWARD (1986). Lichenology and the conservation of ancient monuments: An interdisciplinary study. Biodeterioration 6: papers presented the 6th International Biodeterioration Symposium: 386-392. GIACOBINI, C.; PIETRINI, A. M.; RICCI, S.; ROCCARDI, A. (1987). Problemi di biodeterioramento. Bolletino d’Arte, suplemento al n. 41, Materiali Lapidei, vol. 1: 53-64. GIL, J.A.; SAIZ-JIMENEZ, C. (1992). Biodeterioration of Roman Mosaics by Bryophytes. 7th International Congress on Deterioration and Conservation of Stone: 511-519. GIORGI, R. L. DEI; BAGLIONI, P. (2000). A new method for consolidating wall paintings based on dispersions of lime in alcohol. Studies in Conservation 45 (3): 154–61. GIORGI, R.; BOZZI, C.; DEI, L.; GABBIANI, CH.; NINHAM, BW.; BAGLIONI, P. (2005): Nanoparticles of Mg(OH)2: Synthesis and application to paper conservation. Langmuir 21: 8495-8500 GODDIO, F.; MANCINI, S. I.; GERVASIO, S.; LÓPEZ, G. (2013). Nanotecnología Aplicada a la preservación de la Madera. Universidad Tecnológica Nacional. Simposio Internacional sobre Materiales Lignocelulosicos, Facultad Regional Santa Fe. Santa Fe, Argentina: Lavaise 610 (S3004EWB). GOLUBI, S; PIETRINI A.M; RICCI, S. (2015). Euendolithic activity of the cyanobacterium Chroococcus lithophilus Erc. In biodeterioration of the Pyramid of Caius Cestius, Rome, Italy. International Biodeterioration and Biodegradation, 100: 7-16. GÓMEZ GONZALEZ, M. L. (1994). Examen científico aplicado a la conservación de obras de arte. Ministerio de Cultura. Instituto de Conservación y Restauración de Bienes Culturales. GÓMEZ, A.; POLVORINOS, A.; CASTAING, J.; PLEGUEZUELO, A. (2013). Cerámicas de Niculoso Pisano y análisis cuantitativo de vidriados por FRX portátil. PH investigación, 1:17-39. [en línea]. BIBLIOGRAFÍA 333 GÓMEZ MORENO, M. (1911). Alhambra. En El arte en España. Comisaría Regia del Turismo y Cultura Artística, Barcelona. GÓMEZ-MORÓN, M.A.; ORTIZ, P.; MARTÍN-RAMÍREZ, J.M.; ORTIZ, R. CASTAIGN, J. (2016). A new insight into the vaults of the kings in the Alhambra (Granada, Spain) by combination of portable XRD and XRF. Michrochemical Journal 125: 260-265. GÓMEZ-VILLALBA, L.S.; LÓPEZ-ARCE, P.; FORT, R.; ÁLVAREZ DE BUERGO, M.; (2010). La aportación de la nanociencia a la conservación de bienes del patrimonio cultural. Ministerio de Cultura. 43- 56 GONZÁLEZ ALFARO, J. GONZÁLEZ GONZÁLEZ, B; BARRIAL GONZÁLEZ ROSA T. (2004). Laboratorio de Microbiología: Instrumentación y principios básicos. La Habana: Editorial Ciencias Médicas. GONZÁLEZ-BALLESTER, D., DE MONTAIGU, A., HIGUERA, J. J., GALVÁN, A., & FERNÁNDEZ, E. (2005). Functional Genomics of the Regulation of the Nitrate Assimilation Pathway in Chlamydomonas. Plant Physiology, 137(2), 522–533. http://doi.org/10.1104/pp.104.050914 GONZÁLEZ LÓPEZ, M.J.; MONTERO MORENO, A.; BAGLIONI, R. 2012. Las pinturas de la Sala de los Reyes de la Alhambra de Granada. Un proyecto, un método, una intervención. Revista PH, 83, Instituto Andaluz del Patrimonio Histórico, 74–89. GORBUSHINA, A.A.; HEYRMAN, J.; DORNIEDEN, T.;GONZALEZ-DELVALLE, M.; KRUMBEIN, W.E.; LAIZ, L.; SAIZ-JIMENEZ,C.; SWINGS, J. (2004). Bacterial and fungal diversity and biodeterioration problems in mural painting environments of St. Martin’s church (Greene-Kreiensen, Germany). International Biodeterioration and Biodegradation, 53: 13-24. GRAN ENCICLOPEDIA DE ANDALUCÍA, vol 2 (1979). Promociones Culturales Andaluzas, S.A, Tierras del Sur, Cultura Viva, Ediciones Anel: 721-722 GRAN ENCICLOPEDIA DE ANDALUCÍA, vol 6 (1979). Promociones Culturales Andaluzas, S.A, Tierras del Sur, Cultura Viva, Ediciones Anel: 2417-2418. GRIFFIN, P.S.; INDICTOR, N.; KOESTLER, R.J. (1991). The biodeterioration of stone: a review of deterioration mechanisms, conservation case histories and treatment. International Biodeterioration, 28: 187-207. Biodeterioration of Cultural Property (Ed. Robert J. Koestler). Elsevier, London and New York. GUILLLAUME-CHAVANNES, G. (1988). Peintures et moisissures:une approche originale du problème par le “Conservation Department” de la Tate Gallery à Londres. Patrimoine culturel et alterations biologiques. Actes des journées d´études de la SFIIC: 217-226. GULLAN, P. (1994). The insects: an outline of Entomology. Chapman & Hall, London. HANSEN, E.; DOEHNE, E.; FIDLER, J.; LARSON, J.; MARTIN, B.; MATTEINI, M.; RODRÍGUEZNAVARRO, C.; SEBASTIÁN-PARDO, E.; PRICE, C.; DE TAGLE, A.; TEUTONICO, J.M.; WEISS, N.R. (2003). A review of selected inorganic consolidants and protective treatments for porous calcareous materials. Reviews in Conservation 4: 13–25. HEDGES, S.A.; LACEY. M.S. (2002). A Field Guide for the Management of Structure-Infesting Beetles. Cleveland, OH: G.I.E Inc. Publishers, BIBLIOGRAFÍA 340 RIMINESI, C.; OLMI, R. (2016). Localized microwave heating for controlling biodeteriogens on cultural heritage assets. International Journal of Conservation Science, 7, Número especial 1: 281-294 RIPPKA, R.; DERUELLES, J.; WATERBURY, J.B.; HERDMAN, M.; STANIER, R.Y. (1979). Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria. J. Gen. Microbiol. 111: 1-61. RODRIGUEZ DE LOS SANTOS, M. (1996). Patrimonio arquitectónico y patrimonio natural. Boletín del Instituto Andaluz del Patrimonio Histórico, 14: 96-97. RODRIGUEZ-NAVARRO, C.; RUIZ-AGURDO, E.; ORTEGA-HUERTAS, M.; HANSEN, E. (2005). Nanostructure and Irreversible Colloidal Behavior of Ca(OH)2 : Implications in Cultural Heritage Conservation. Langmuir 21(24), 10948-57. RODRIGUEZ-TROBAJO, E. (2017). Informe: Estudio dendrocronológico y constructivo de la Mezquita de Córdoba. INIA-IAPH. ROGERIO-CANDELERA, M.A.; MILLER, A.Z.; DIONÍSIO, A.; MACEDO, M.F.; SAIZ-JIMÉNEZ, C. (2012). Técnicas no destructivas para la monitorización cuantitativa y cualitativa de procesos de biodeterioro en materiales pétreos. Estudos Arqueológicos de Oeiras, 19: 287-294. ROWE, J. G., A. APARICIO & C. SAIZ JIMÉNEZ (1991). Weeds settling in Spanish cathedrals (Salamanca, Seville and Toledo), in N. S. BAER, C. SABBIONI & A. I. SORS (eds.). Science, Technology and European Cultural Heritage. Bologna. RUFFOLO, S. A.; DE LEO, F.; RICCA, M.; ARCUDI, A.; SILVESTRI, C.; BRUNO, L.; URZI, C.; LA RUSSA, M. F. (2017). Medium-term in situ experiment by using organic biocides and titanium dioxide for the mitigation of microbial colonization on stone surfaces. INTERNATIONAL BIODETERIORATION & BIODEGRADATION, 123: 17-26. SAIZ JIMÉNEZ, C. (1982). Causas del deterioro de los murales de Vázquez Díaz, Monasterio de Santa María de la Rábida, Huelva. Mundo Científico, 18: 1007- 1011. SAIZ JIMÉNEZ, C.; SAMSON, R.A. (1981). Micoorganisms and enviromental pollution as deteriorating agents of the frescoes of the Monastery of Santa María de la Rábida, Huelva, Spain. 6th Triennal Meeting of ICOM Commitee for Conservation, 1-14. SAIZ JIMÉNEZ, C. (1981). Weathering of building materials of the Giralda (Seville, Spain) by lichens. 6th Triennial Meeting ICOM, Committee for Conservation, Ottawa, paper 81/10/4. SAIZ JIMÉNEZ, C. (1984). Weathering and colonization of limestones in an urban enviroment. Soil Biology and Conservation of the Biosphere (ed. J. Szegi), pp. 757-767. Akamemiai Kiado. Budapest. SAIZ JIMÉNEZ, C. (1991). Characterization of organic compounds in weathered stones, in N. S. BAER, C. SABBIONI & A. I. SORS (eds.). Science, Technology and European Cultural Heritage. Bologna. SAIZ JIMÉNEZ, C.; ROWE, J. G.; GARCÍA DEL CURA, M. A.; ORTEGA CALVO, J. J.; ROEKENS, E.; VAN GRIEKEN, R. (1990). Endolithic cyanobacteria in Maastricht limestone. The Science of the Total Environment, 94: 209-220. BIBLIOGRAFÍA 341 SÁIZ JIMÉNEZ, C.; VIDELA, H.A (EDS) (2002). Biodeterioro de Monumentos de Iberoamérica. CYTED: 11-12. SALEM, MOHAMED Z.M.; ZIDAN, YASSIN E.; MANSOUR, MAISA M.A.; EL HADIDI, NESRIN M.N.; ABO ELGAT, WAEL A.A. (2016). Antifungal activities of two essential oils used in the treatment of three commercial woods deteriorated by five common mold fungi. International Biodeterioration & Biodegradation, 106: 88-96. SALVADORI, O.; NUGARI, M.P. (1987). The effect of microbial growth on synthetic polymers use don Works of art, Biodeterioration 7: 424-427 D.R. Houghton, R.N. Smith, H.O.W. Eggings, Elsevier Applied Science, Londres & New York. SAMEÑO PUERTO, M. (2003). Factores biológicos de alteración. Cuadernos técnicos. Metodología de diagnóstico y evaluación de tratamientos para la conservación de los edificios históricos: 72- 93. Comares. SAMEÑO PUERTO, M. (2007-2008) Estudios de biodeterioro y propuesta de tratamiento. Cuadernos de Arqueología de Ronda: 521-260. SAMEÑO PUERTO, M. (2008). Informe: Estudio biológico. Estudios de biodeterioro. Identificación de factores biológicos de alteración en las Pinturas de la Sala de los Reyes de la Alhambra de Granada. Instituto Andaluz del Patrimonio Histórico SAMEÑO PUERTO, M.; GARCÍA ROWE, J. (1995). Biodeterioro. Alteración Biológica de Monumentos y Obras de Arte. Boletín Informativo, I.A.P.H., 10: 26-27. SAMEÑO PUERTO, M.; MARTÍN GARCÍA, L. (2014). Analysis of materials and biodeterioration study on corn cane sculpture: “Crucificado del Capítulo de Bornos (Cádiz)”. II International congress "Science and Technology for the Conservation of Cultural Heritage": 251-256. Sevilla. ISBN: 978-1-138-02744-2 (Hbk). ISBN: 978-1-315-71242-0 (eBook). SAMEÑO PUERTO, M.; MENGUIANO CHAPARRO, V. M. (2008). Informe: Pinturas de la Sala de los Reyes. Alhambra, Granada. Proyecto de intervención en el reverso de las bóvedas. Caracterización de materiales: identificación de madera. Instituto Andaluz del Patrimonio Histórico. SAMEÑO PUERTO, M.; MENGUIANO CHAPARRO, V. M. (2017). Informe: Estudios científicotécnicos para el conocimiento, diagnóstico y conservación de la Maqsura de la Mezquita-Catedral de Córdoba. Estudio biológico: Estudios de biodeterioro y análisis de factores de alteración biológicos. Identificación de maderas y evaluación de tratamiento. Instituto Andaluz del Patrimonio Histórico. SAMEÑO PUERTO, M.; VILLEGAS SÁNCHEZ, R.; GARCÍA ROWE, J. (1996). Inventario de la Vegetación y Estudio de la Interferencia Biocida con los Materiales Pétreos del Yacimiento del Cerro de la Plaza de Armas de Puente Tablas (Jaén). Boletín del Instituto Andaluz del Patrimonio Histórico, 14: 67-74. SAMEÑO PUERTO, M.; VILLEGAS SÁNCHEZ, R.; GARCÍA ROWE, J. (1996). Estudio de la interacción de los biocidas con los materiales pétreos del yacimiento del cerro de la plaza de armas de Puente Tablas (Jaén). III Congreso Internacional de Rehabilitación del Patrimonio Arquitectónico y Edificación, Granada: 520-524 BIBLIOGRAFÍA 342 SÁNCHEZ ROMERO, I. (2007). Informe: Determinación del curtido de los cueros. Fase: ejecución proyecto de intervención de urgencia: fijación preliminar y facing de protección. Pinturas de la Sala de los Reyes. Alhambra, Granada. Instituto Andaluz del Patrimonio Histórico. SANMARTÍN, P; VILLA, F; SILVA, B; CAPITELLI, F; PRIETO, B. (2010). Color measurement as a reliable method for estimating chlorophyll degradation to phaeopigments. Biodegradation, 22: 763-771. SARRÓ, M.I.; GARCÍA, A.M.; RIVALTA, V.M.; MORENO, D.A.; ARROYO, I. (2006). Biodeterioration of the Lions Fountain at the Alhambra Palace, Granada (Spain). Building and Environment 41: 1811–1820. SCHNABEL, L. (1991). The treatment of biological growths on stone: A conservator's viewpoint. International Biodeterioration, 28: 125-131. Biodeterioration of Cultural Property (Ed. Robert J. Koestler). Elsevier, London and New York. SCHOCH, W.; HELLER, I.; SCHWEINGRUBER, F.H.; KIENAST, F. (2004) Wood Anatomy of Central European Species. (Online Version). SCHWEINGRUBER, F.H. (1990a). Microscopic Wood Anatomy (Swiss Federal Institute for Forest, Snow and Landscape Research). SCHWEINGRUBER, F.H. (1990b) Anatomy of European Woods (Swiss Federal Institute for Forest, Snow and Landscape Research,). SCLOCCHI, C. (2002). La disinifezione e la disinfestazione dei supporti archivistici. In: Chimica e biologia applicate alla conservazione degli archive, Ministero per I Beni e le Attività Culturali, Direzione generale degli archivi dei stato. Union Pringting, Roma: 557-575 SEAWARD M. D.; GIACOBINI, C. (1988). Lichen-induced biodeterioration of italian monuments, frescoes and other archaeological materials. Lichens and monuments. C.N.R. Centro di studio. Cause di deperimento e metodi di conservazione delle opere d'arte.- Roma. P. L. Nimis & M. Monte, Trieste. SHABIR MAHR, M.; HÜBERT, T.; STEPHAN, I.; MILITZ, H. (2013). Decay protection of wood against brown-rot fungi by titanium alkoxide impregnations. International Biodeterioration & Biodegradation, 77: 56-72 SILVA, M.; SALVADOR, C.; CANDEIAS, M. F.; TEIXEIRA, D. ; CANDEIAS, A. ; CALDEIRA, A.T. (2016). Toxicological assessment of novel green biocides for cultural heritage. INTERNATIONAL JOURNAL OF CONSERVATION SCIENCE, 7, Número especial 1: 265-272. SKIPPER, P.J.A.; SCHULZE, H.; WILLIAMS, D.R.; DIXON, R.A. (2016). Biodeterioration of limestone built heritage: A multidisciplinary challenge. Hughes, J., & Howind, T. (Eds.) (2016). Science and Art: A Future for Stone: Proceedings of the 13th International Congress on the Deterioration and Conservation of Stone, Volume 1. Paisley: University of the West of Scotland. SORLINI, C. (1984). Il ruolo degli inquinanti atmosferici nel deterioramento chimico e microbiologico dei manufatti artistici e edifizi. Acqua Aria, 2: 181-188. SOUTHWOOD, T. R. E. (1978). The components of diversity. The diversity of insect faunas (ed. L. A. Mound & N. Waloff), pp. 19-40. Blackwell Scientific Publications, London. BIBLIOGRAFÍA 343 STUPAR, M.; GRBIC, M. L.; DZAMIC, A.; UNKOVIC, N.; RISTIC, M.; JELIKIC, A.; VUKOJEVIC, J. (2014). Antifungal activity of selected essential oils and biocide benzalkonium chloride against the fungi isolated from cultural heritage objects. South African Journal of Botany, 93: 118-124. TERZI, E.; KARTAL, S. N.; YILGÖR, N.; RAUTKARI, L.; YOSHIMURA, T. (2016). Role of various nanoparticles in prevention of fungal decay, mold growth and termite attack in wood, and their effect on weathering properties and water repellency. International Biodeterioration & Biodegradation, 107: 77-87. TIANO, P.; BIANCHI, R.; VANNUCI, S. (1975). Researches on the presence of sulphur cycle bacteria in the Stone of some ancient buildings of Florence. Plant and Soil, 43, 211-217. TIANO, P. (1986). Problemi biologici nella conservazione del materiale lapideo esposto. La Prefabbricazione anno 22, Num. 4: 261-272. TIRADO HERNÁNDEZ, A. M. (2015). Estudio de biodeterioro y tratamientos biocidas sobre diversos geomateriales de bienes culturales. Trabajo Fin de Máster. Máster de Diagnóstico del Estado de conservación del Patrimonio Histórico. Universidad Pablo de Olavide (UPO). Sevilla TIRADO HERNÁNDEZ, A.M.; SAMEÑO PUERTO, M.; VELÁZQUEZ JIMÉNEZ; J.M. (2015). Estimación de la biomasa fotosintética en el estudio de la eficiencia de tratamientos biocidas sobre sustratos pétreos. Congreso Nacional: Estudio y Conservación del Patrimonio Cultural – Noviembre 2015, Málaga TOMASELLI, L.; LAMENTI, G.; TIANO, P. (2002). Chlorophyll fluorescence for evaluating biocide treatments against phototrophic biodeteriogens. Annals of Microbiology, 52: 197-206. TORRES BALBÁS, L. (1946). Bóvedas romanas sobre arcos de resalto, Archivo Español de Arte, 19: 173-208, p. 175 TRETIACH, M. CRISAFULLI, P; IMAI, N; KASHIWADANI, H; HEE MOON, K; WADA, H; SALVADORI, O. (2007). Efficacy os a biocide tested on selected lichens and its effects on their substrata. International Biodeterioration and Biodegradation, 59: 44-54. TRETIACH, M.; STEFANO BERTUZZI, S.; SALVADORI, O. (2010). Chlorophyll a fluorescence as a practical tool for checking the effects of biocide treatments on endolithic lichens. International Biodeterioration & Biodegradation, 64: 452–460. UNE-EN 15886:2011. Conservación del patrimonio cultural. Métodos de ensayo. Medición del color de superficies. UNE-EN 1936:2007. Métodos de ensayo para piedra natural. Determinación de la densidad real y aparente y de la porosidad abierta y total. UNE-EN ISO 4044. Cuero. Preparación de muestras para ensayos químicos. UNE-EN ISO 4045:1999. Cuero. Determinación del pH. UNGER, A. (2012). Decontamination and "deconsolidation" of historical wood preservatives and wood consolidants in cultural heritage. Journal of Cultural Heritage, 13, Número 3: S196-S202. URZI, C.; DE LEO, F.; KRAKOVA, L.; PANGALLO, D.; BRUNO, L. (2016). Effects of biocide treatments on the biofilm community in Domitilla's catacombs in Rome. Science of the Total Environment , 572: 252-262 BIBLIOGRAFÍA 344 VAILLANT CALLOL, M.; VALENTÍN RODRIGO, N. (1996). Principios básicos de la Conservación Documental y Causas de su Deterioro. Ministerio de Educación y Cultura. Instituto de Patrimonio Histórico Español. VALDÉS CASTRILLÓN, B.; TALAVERA LOZANO, S., FERNÁNDEZ-GALIANO FERNÁNDEZ, E. (eds.) (1987). Flora vascular de Andalucía Occidental, 3 volúmenes. Ketres Editora S.A. Barcelona. ISBN: 84-85256-63-8. VALENTÍN, N., M. LIDSTROM Y F. PREUSER (1990). Microbial control by low oxygen and low relative humidity environment. Studies in Conservation, 35: 222-230. VALENTÍN, N. (1994). Comparative Analysis of Insect Control by Nitrogen, Argon and Carbon Dioxide in Museum, Archive and Herbarium Collections. International Biodeterioration & Biodegradation 32. Elsevier, Science Limited, England: 263-278. VALENTÍN, N. (2007). Microbial Contamination in Archives and Museums: Health Hazards and Preventive Strategies Using Air Ventilation Systems. In Contribution to the Experts, Roundtable on Sustainable Climate Management Strategies. Tenerife. Spain. VÍLCHEZ VÍLCHEZ, C. (2006). Granada en tus manos. Alhambra y Generalife. Ideal. VILLEGAS SÁNCHEZ, R. (2003). Metodología para la evaluación y estudio previo de tratamientos. Cuadernos técnicos. Metodología de diagnóstico y evaluación de tratamientos para la conservación de los edificios históricos: 194-207. Comares. VILLEGAS, R.; BAGLIONI, R.; SAMEÑO, M. (2003). Tipología de materiales para tratamiento. Cuadernos técnicos. Metodología de diagnóstico y evaluación de tratamientos para la conservación de los edificios históricos: 168-193. Comares. WARSCHEID, T; BRAAMS, J. (2000). Biodeterioration of stone: a review. International Biodeterioration and Biodegradation, 46: 343-368. WARSCHEID, TH. (2002). The evaluation of biodeterioration processes on cultural objects and approaches for their effective control” Art, biology, and conservation: biodeterioration of works of art. Editores, Koestler, R; Koestler,V; Charola, A; Nieto-Fernandez,F. The Metropolitan Museum of Art. WELSCH, U.; SOBOTTA, J. (2009). Histología. 2ª edición. Editorial médica Panamericana. WIRTH, V.; DÜLL, R.; LLIMONA, X.; ROS, R.; WERNER, O. (2004). Guía de campo de los líquenes, musgos y hepáticas. Ediciones Omega. YELA, J.L.; SAMEÑO, M. (1995). Los insectos y el biodeterioro del Patrimonio Histórico Cultural. PH. Boletín del IAPH, 18: 67-76. Sevilla. YOUNG, M.E.; ALAKOMI, H.L.; FORTUNE, I.; GORBUSHINA, A.A.; KRUMBEIN, W. E.; MAXWELL, I.; MCCULLAGH, C.; ROBERTSON, P.; SAARELA, M.; VALERO, J.; VENDRELL, M. (2008). Development of a biocidal treatment regime to inhibit biological growths on cultural heritage: BIODAM. ENVIRONMENTAL GEOLOGY, 56 (3-4): 631-641. ZELITCH, I. (1973). Plant Productivity and the Control of Photorespiration. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, vol.70 (2): 579–584. BIBLIOGRAFÍA 345 Electrónica: Aula virtual. Universidad de Salamanca. (http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/curso/UNI_02/u2c5s2.ht m) GRUPO ESPAÑOL DE CONSERVACIÓN. International Institute for conservation of historic and artistic works. http://geiic.com/index.php?option=com_fichast&Itemid=83&tasko=viewlso&task=view&id=14 HERBARIO VIRTUAL del Mediterráneo Occidental. Àrea de botànica, departament de biologia, Universitat de les Illes Balears, Universitat de Barcelona, Universitat de Valencia. http://herbarivirtual.uib.es/cas-med/ http://herbarivirtual.uib.es/cas-ub/especie/4709.html Instituto Andaluz del Patrimonio Histórico. Consejería de Cultura, Junta de Andalucía. http://www.iaph.es/patrimonio-inmueble-andalucia/resumen.do?id=i2764 Martí Solé, María del Carmen (1999). NTP 299: Método para el recuento de bacterias y hongos en aire. Instituto nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo. Ministerio de Trabajo y Asuntos Sociales. España. http://www.insht.es/InshtWeb/Contenidos/Documentacion/FichasTecnicas/NTP/Ficheros/201a3 00/ntp_299.pdf http://es.slideshare.net/BiocientificaSA/mara-ngeles-baridon-mtodos-de-extraccin-y-purificacin- de-cidos-nucleicos Portal de museos de Andalucía. Consejería de Cultura, Junta de Andalucía http://www.museosdeandalucia.es/culturaydeporte/museos/CAMA “Técnicas de tinción. Fundamentos.” Seminario, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. www.microinmuno.qb.fcen.uva.ar/SeminarioTinciones.htm GenBank, del National Center for Biotechnology Information (NCBI), USA. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi Universidad Nacional del Litoral, Argentina http://nematode.unl.edu/cephasp.htm Sun Chlorella < http://www.chlorella.es/que-es-chlorella/> http://www.monografias.com/docs111/nanoparticulas-preservado-madera/nanoparticulaspreservado-madera2.shtml#ixzz5CNvyK7RQ http://www.alhambradegranada.org/historia/alhambraSReyes.asp http://es.wikipedia.org/wiki/Alhambra#Sala_de_los_Reyes http://legadoandalusi.es/legado/contenido/rutas/obras/21681.htm https://es.wikipedia.org/wiki/Mezquita-catedral_de_C%C3%B3rdoba https://es.wikipedia.org/wiki/Macsura BIBLIOGRAFÍA 346 http://blogarteehistoria.blogspot.com/2010/12/comentario-maxura-de-la-mezquita-de.html http://microbiology.ucdavis.edu/meeks/allenarnon.htm